MXPA04010603A - Metodos mejorados de purificacion viral. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un metodo mejorado de purificacion de virus, particularmente reovirus. Los virus infecciosos se pueden extraer de un cultivo celular con un detergente para producir titulos altos de virus y el virus despues se puede purificar por etapas sencillas tales como filtracion y cromatografia en columna. Los virus y las composiciones que comprenden los virus preparados de acuerdo con la presente invencion tambien se proporcionan.

Description

METODOS MEJORADOS DE PURIFICACION VIRAL CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con un método para extraer virus de un cultivo celular. En particular, el método es útil para extraer virus infeccioso el cual es adecuado para administración clínica a mamíferos, incluyendo el humano . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Debido a la gran. cantidad de enfermedades causadas por virus, la virología ha sido un campo estudiado intensamente. Siempre ha existido la demanda de producir virus eficazmente con el fin de aislar y purificar proteínas virales, para generar vacunas o para producir virus infecciosos para estudios de laboratorio. Recientemente el nuevo~ desarrollo ' del"---tratamiento_ para virus ha necesitado adicionalmente de una ~ "producción— -eficiente _ _.de virus' infecciosos. El tratamiento para reovirus es un ejemplo de tratamiento para virus. El reovirus es un ARN virus de cadena doble capaz de unirse a una multitud de células. No obstante, la mayor parte de las células no son susceptibles a infección por reovirus y la unión de reovirus a su receptor celular resulta en que no hay replicación viral o producción de partículas de virus en estas células. Esta es probablemente Ref . :159379 la razón por la cual el reovirus no se conoce como asociado con alguna enfermedad particular. Recientemente se ha descubierto que las células transformadas con el oncogen ras se vuelven susceptibles a infección por reovirus, mientras que sus contrapartes no transformadas no (Strong et al., 1998). Por ejemplo, cuando las células NIH 3T3 resistentes a reovirus se transforman con las formas activadas de Ras o Sos, una proteína la cual activa Ras, se incrementa la infección por reovirus. De manera similar, los fibriblastos de ratón que son resistentes a infección por reovirus se vuelven susceptibles después de transfección con el gen receptor de EGF o el oncogen v-erbB, ambos los cuales activa la vía Ras (Strong et al., 1993; Strong et al., 1996). Por lo tanto, los reovirus pueden infectar de manera selectiva y replicarse en células con una vía Ras "áctiváclav^ . El oncogen ras constituye'' un gran -porcentaje de los" tumores de mamíferos. Las mutaciones de activación del gen ras en sí mismas se producen en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas pancreáticos (90%) , colorrectales esporádicos (50%) y pulmonares (40%) , así como en leucemia mieloide (30%) . La activación de factores corriente arriba o corriente debajo de ras en la vía de ras también se relaciona con el tumor. Por ejemplo, la expresión excesiva de HER2/Neu/ErbB2 o el receptor de f ctor de crecimiento epidérmico (EGF) es común en cáncer de mama (25-30%) y la sobreexpresión de receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por sus siglas en inglés) o el receptor EGF es prevalente en gliomas y glioblastomas (40-50%). Se. sabe que el receptor EGF y el receptor PDGF activan ras cuando se unen a su ligando respectivo, y v-erbB codifica un receptor activado de manera constitutiva que carece del dominio extracelular . Dado que una gran cantidad de tumores humanos se han tomado en cuenta para la alteración genética del proto- oncogen ras o una actividad elevada de Ras, el tratamiento con reovirus es un tratamiento nuevo y promisorio para tales condiciones (Coffey et al., 1998). El tratamiento para reovirus es altamente selectivo para células tumorales asociadas a Ras y deja a las células normales no infectadas.

Para producir reovirus adecuado para administración clínica, se necesitan métodos rápidos y eficaces para producir reovirus en células cultivadas. Además el método tradicional de purificar virus a partir de células cultivadas es tedioso y consume tiempo, lo que vuelve el costo de la producción de virus demasiado elevados. Por lo tanto, también se necesita un método mejorado para purificación de virus.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método mejorado para extraer y purificar virus de un cultivo celular que se puede aplicar a la producción de virus a escala tanto pequeña como grande . El método involucra una etapa de extracción sencilla en la cual se agrega directamente detergente al cultivo celular. Posteriormente se pueden separar los residuos celulares de la mezcla de extracción, pro ejemplo, por filtración o centrifugación. La suspensión resultante . de virus se puede concentrar o enriquecer adicionalmente por métodos cromatográficos . El virus preparado de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para cualquier propósito, que incluye purificación de proteínas virales, vacunación, infección de células hospedadoras y administración clínica. ~~" Én~~ "~cónsecuencia, _ .. un aspecto de la presente invención proporciona un método' para- producir_ virus a partir de un cultivo de células, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un cultivo de células las cuales han sido infectadas por el virus; (b) extraer el virus de las células al agregar un detergente al cultivo e incubar durante un período de tiempo lo que resulta en un lisado celular; (c) separar el residuo celular; y (d) recolectar el virus.

Se puede utilizar cualquier método para separar los residuos celulares (es decir, clarificación del lisado celular) en la etapa (c) . El método preferiblemente es un método sencillo que se basa en el tamaño o diferencias de densidad entre el" virus y los otros constituyentes en el lisado celular, tales como filtración o centrifugación. De manera más preferible, se utiliza filtración, particularmente filtración paulatina. Una filtración paulatina apropiada comprende un prefiltro que tiene un tamaño de . poro más grande, seguido por al menos un filtro con un tamaño de poro más pequeño que el del prefiltro. En una modalidad preferida, los residuos celulares se separan por filtración paulatina, que comprende : (1) filtrar a través de un prefiltro que tiene un El lisado celular opcionalmente se puede tratar con benzonasa u otra enzima que separa ADN para descomponer ADN celular viscoso grande. Después de separar los residuos celulares por filtración, el filtrado opcionalmente se puede concentrar para reducir el volumen por la suspensión viral. Se puede utilizar cualquier método adecuado para concentración viral, preferiblemente ultrafiltración , o diafiltración, que incluye filtración de flujo tangencial. Los métodos ejemplares incluyen el sistema de placa y armazón y el sistema de fibra hueca. De manera más preferible se utiliza el sistema de fibra hueca. El presente método se puede aplicar en la producción de cualquier virus, preferiblemente un virus no envuelto, y de manera más preferible un reovirus. El reovirus preferiblemente es reovirus de mamífero, de manera más preferible un reovirus humano, y de manera aún más preferible un reovirus serotipo 3 y de manera mucho más preferible un reovirus de la cepa Dearing. El reovirus puede ser un reovirus recombinante . El reovirus recombinante se puede generar por infección conjunta de células, tales como células cepas de reovirus, particularmente dos o más cepas de reovirus que se seleccionan del grupo que consiste de la cepa Dearing, la cepa Abney, la cepa Jones y la cepa Lang. El reovirus recombinante también puede resultar de reasignación de reovirus de serotipos diferentes, tales como los que se seleccionan del grupo que consiste de reovirus serotipo 1, reovirus serotipo 2 y reovirus serotipo 3. Los reovirus recombinantes pueden comprender secuencias codificantes de proteína de recubrimiento variante que se presenten de manera natural o secuencias codificantes de proteína de recubrimiento mutada. El cultivo celular utilizado en la presente invención puede comprender cualquier célula apropiada para la producción del virus deseado. Para reovirus, las células preferiblemente son células 293 de riñon de embrión humano (HEK 293) o células derivadas de las mismas, particularmente células HEK 293 que se han adaptado para crecer en cultivos en suspensión. El método puede comprender opcionalmente una etapa de cromatografía de intercambio iónico, en donde el virus se enriquece por unión a una resina de intercambio iónico bajo unión y condiciones apropiadas . Los virus después eluyen del intercambiador iónico utilizando una solución de elusión adecuada'. ''¾a- -selección ...del intercambiador de iones y las condiciones de unión/éTusión variarán con el virus' qué—se-purifique. Para reovirus, un intercambiador de aniones y un pH de aproximadamente 7.0-9.0 son los más eficaces. El pH es de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.5 y de manera más preferible de aproximadamente 8.0. El virus también se puede purificar utilizando cromatografía de exclusión de tamaño. En particular se puede utilizar una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión de tamaño.

Otro aspecto de la presente invenció proporciona una composición que comprende el virus purificado de acuerdo con cualquiera de los métodos que se describe en la presente. La composición preferiblemente es adecuada para administración " clínica, particularmente administración clínica a un humano. De manera más preferible, la composición comprende un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir reovirus infeccioso, que comprende: (a) proporcionar un cultivo de células HEK 293 que han sido infectadas por reovirus; (b) extraer el virus de las células al agregar Tritón X-100 al cultivo e incubar de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C; (c) tratar la mezcla de la etapa (b) con benzonasa; ' ~~"~~;(d)-- separar, los residuos celulares por filtración; (e) concentrar el-- filtrado_ per ultrafi'ltración-"-o: diafiltración; (f) purificar el reovirus por una combinación de cromatografía de intercambio iónico y exclusión de tamaño; y (g) recolectar el reovirus. También se proporcionan composiciones que comprenden el reovirus recolectado de acuerdo con este método, particularmente composiciones que comprenden además un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método mejorado para extraer y purificar .virus a partir de un cultivo celular que se puede aplicar a la producción de virus tanto escala pequeña como grande . El método involucra una etapa de extracción sencilla en el cual se agrega directamente detergente al cultivo celular. Posteriormente, se pueden separar los residuos celulares de la mezcla de extracción, por ejemplo, mediante filtración o centrif gación. La suspensión resultante de virus se puede concentrar o enriquecer adicionalmente por métodos cromatográficos . El virus preparado de acuerdo con la presente invención se puede utilizar para cualquier propósito, que incluye la purificación de proteínas virales, vacunación, infección de células hospedadoras y administración--clínica ... Antes de ' describir la invención "'" con-"" detalle , adicional, se definen como sigue los términos que se utilizan en esta solicitud, a menos que se indique de otra manera. DEFINICIONES Como se utiliza en la presente, "infección viral" se refiere a la entrada de un virus dentro de una célula y la replicación subsecuente del virus en la célula. Como se utiliza en la presente, el término "multiplicidad de infección" se refiere a la relación del número de virus respecto al número de células cuando se utiliza un virus que se pone en contacto con las células. Como se utiliza en la presente, el término lisis celular" se refiere a la ruptura de la membrana celular de una , célula y la liberación subsecuente de la totalidad o parte del contenido de la célula. Como se utiliza en la presente, "condiciones de cultivo" se refiere a las condiciones utilizadas en un cultivo celular que incluyen, pero que no se limitan a la temperatura, tipo de recipientes de cultivo, humedad, concentración de CO2 o cualquier otro gas utilizado en los recipientes de cultivo, tipo.de medio de cultivo, la densidad inicial de las células cultivadas y si las células están infectadas con un virus, la multiplicidad de infección inicial . cultivo. En particular, un cultivo de células incluyen las células y al medio de cultivo. Las células que se ha sedimentado no se consideran un cultivo celular a menos que se coloquen en un medio de cultivo bajo condiciones de cultivo nuevamente. Como se utiliza en la presente, un virus que está "asociado a células" se refiere a un virus el cual está unido o atrapado en parte de una célula en la cual se ha producido el virus. De esta manera, un virus se asocia a una célula antes de que la célula hospedadora sea alisada. Cuando comienza la lisis celular, un virus aún puede estar unido o atrapado en parte de la célula rota y permanecer asociado a la célula. No obstante, cuando el virus se libera libremente al medio, ya no se encuentra asociado más. Un "virus libre de células" es un virus el cual no está asociado a una célula. Como se utiliza en la presente, "extraer" un virus se refiere al acto de convertir un virus asociado a una célula en un virus libre de células. Como se utiliza en la presente, un "detergente" es una sustancia que tiene un extremo hidrofílico y un extremo hidrofóbico. El detergente preferiblemente es un compuesto químico sintético y de manera más preferible un compuesto químico ' sintético' - biodegradable . El detergente útil en la presente invención mej ora-- -la -interrupción de ~ las '- membranas_ celulares para facilitar la liberación del contenido de las" células rotas. Como se utiliza en la presente, el término "incubar" después de la adición de un detergente a un cultivo ¦ celular se refiere al acto de permitir que el cultivo celular se mezcle con el detergente durante cierto período de tiempo. Como se utiliza en la presente, el término "recolectar" el virus se refiere al acto de recolectar el virus producido de un cultivo celular el cual previamente se ha infectado con el virus. El virus típicamente se recolecta al separar residuos celulares del virus y cosechar la porción la cual comprende al virus. Opcionalmente, el virus puede ser separado adicionalmente de las sustancias solubles, por ejemplo por centrifugación. Como se utiliza en la presente, el término "temperatura ambiente" se refiere a una temperatura entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 30°C. La temperatura ambiente preferiblemente está entre aproximadamente 15°C y aproximadamente 30 °C, de manera más preferible entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 25 °C, y de manera mucho más preferible a aproximadamente 25°C. Como se utiliza en la presente, el término "efecto citopático" se indica por las células que se hinchan y la ápári:éhci'a--granular__así como los grupos de células que se descomponen. Las células .las cuales muestran —un- -efecto citopático también captan el colorante de tinsión en' úna~ cuenta de células viable. Como se utiliza en la presente, el término "células adherentes" se refiere a células las cuales se adhieren a los recipientes de cultivo en un cultivo celular. Los ejemplos de células adherentes incluyen células en monocapa, las cuales son células que forman una capa única de células sobre la superficie de un recipiente de cultivo. Los términos "células en suspensión" o "células suspendidas" se refieren a células las cuales no se adhieren a los recipientes de cultivo en un cultivo celular. Las células en suspensión pueden crecer en un "cultivo rotatorio", el cual es un cultivo en el cual el medio de cultivo se hace girar continuamente durante el procedimiento de cultivo. Como se utiliza en la presente, una célula se "rompe" cuando la membrana celular se rompe y por lo menos parte del contenido de la célula es liberado desde la célula. Una célula se puede romper, por ejemplo, por congelamiento, recalentamiento, sonicación o tratamientos con detergente. Como se utiliza en la presente, el término "viabilidad de las células" o "porcentaje de las células que permanecen viables" es el porcentaje de las células las cuales no muestran un efecto citopático en una población. se....utiliza en la presente, un "virus no envuelto" es un virus- -el -cual no^ tiene" *üná~ "envoltura . _.P_ r _ ejemplo, un virus no envuelto puede ser cualquier virus que - pertenezca a la familia de Adenoviridae (por ejemplo adenovirus) , Picornaviridae (por ejemplo virus de la polio), Reovirudae (por ejemplo reovirus) , Papovarviridae (por ejemplo virus de papiloma), Parvoviridae (por ejemplo virus de rata Kilham) o Iridoviridae (por ejemplo virus de Típula iridescent) . Como se utiliza en la presente, el término "reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el género reovirus, ya sea que se presente de manera natural, modificado o recombinante . Los reovirus son virus con un genoma de ARN segmentado de cadena doble. Los viriones miden 60-80 nm de diámetro y poseen dos cubiertas de capsida concéntricas, cada una de las cuales es icosaédrica. El genoma consiste de ARN de cadena doble en 10-12 segmentos separados con un tamaño total de genoma de 16-27 kpb. Los segmentos de ARN individuales varían en tamaño. Se han recuperado de muchas especies tres tipos distintos de reovirus, aunque relacionados entre sí. La totalidad de los tres tipos comparten un antígeno común fijador de complemento . El reovirus humano consiste de los tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o TIL) , tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D) . Los tres serotipos son El reovirus puede ser uno que se presente de manera natural o puede ser uno modificado. El reovirus es del tipo "que se presenta de manera natural" cuando se puede aislar de ¦una fuente en la naturaleza que no ha sido modificada intencionalmente por humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente de campo", es decir, de un humano quien ha sido infectado con el reovirus.

El reovirus puede ser modificado pero aún ser capaz de infectar líticamente a una célula de mamífero que tenga una vía ras activa. El reovirus puede ser pretratado química o bioquímicamente (por ejemplo, por tratamiento con una proteasa, tal como quimiotripsina o tripsina) , antes de la administración a las células proliferantes. El pretratamiento con una proteasa elimina la cubierta exterior o cápside del virus y puede incrementar la infectividad del virus. Los reovirus se pueden recubrir en un liposoma o micela (Chandron and Nibert, 1998) . Por ejemplo, el virión puede ser tratado con quimiotripsina en presencia de concentraciones formadoras de micelas de detergentes de sulfato de alquilo para generar una partícula infecciona nueva de subvirión. El reovirus puede ser un reovirus recombinante que de un organismo huésped con por lo menos dos reovirus genéticamente distintos. Los viriones recombinantes también se pueden generar en el cultivo celular, por ejemplo, por infección conjunta de células hospedadoras permicibas con reovirus genéticamente distintos (Nibert et al. 1995) . En consecuencia, la invención contempla al reovirus recombinante que resulta de la reasignación de segmentos de genoma a partir de dos reovirus o más, genéticamente distintos, que incluye, pero que no se limita a reovirus humano, tal como el tipo 1 (por ejemplo, la cepa Lang) , el tipo 2 (por ejemplo la cepa Jones) y el tipo 3 (por ejemplo la cepa Dearing o la cepa Abney) , los reovirus de mamífero no humanos o reovirus aviares. La invención contempla además reovirus recombinantes que resultan de la reasignación de segmentos de genoma a partir de dos o más reovirus genéticamente distintos, en donde por lo menos un virus original es sometido a ingeniería genética, que comprende uno o más segmentos genómicos sintetizados químicamente, que ha sido tratado con mutágenos químicos o físicos o que en sí mismo es el resultado de un suceso de recombinación. La invención contempla además un reovirus recombinante que ha experimentado recombinación en presencia de mutágenos químicos - que incluyen pero que no se limitan a sulfato de dimetilo y bromuro " de - etidio, ,, o _mutágenos~""físrcos . ;que, incluyen pero que no se limitan a luz ultravioleta y otras formas de radiación. La invención contempla además reovirus recombinantes que comprenden supresiones o duplicaciones en uno o más segmentos de genoma, que comprenden información genética adicional como resultado de recombinación con el genoma de la célula hospedadora o que comprenden genes sintéticos .

Los reovirus se pueden modificar por incorporación de proteínas mutadas de recubrimiento, tales como, por ejemplo, s 1, dentro de la cápside exterior del virión. Las proteínas se pueden mutar por sustitución, inserción o supresión. La sustitución incluye la inserción de aminoácidos diferentes . en lugar de aminoácidos originales. Las inserciones incluyen la inserción de residuos aminoácidos adicionales en la proteína en uno o más lugares . Las supresiones incluyen supresiones de uno o más residuos aminoácidos en la proteína. Tales mutaciones se pueden generar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio oligonucleotídico de un gen que codifica para una de las proteínas de recubrimiento puede resultar en la generación de la proteína mutante deseada de recubrimiento. La expresión de la proteína mutada en reovirus infe¾ta~a~"cél-ulas_de jnamífero in vitro tales como las células COSI resultará en "la- -incorporación de Ta" "próteína- mutada dentro de la partícula del virión del reovirus (Turner and Duncan, 1992; Duncan et al., 1991; Mah et al., 1990). Como se utiliza en la presente, "células HEK 293" se refiere a la línea de células de riñon de embrión humano denominada 293 (ATCC Número CRL-1573) o sus derivados. Por ejemplo, las células 293/SF (ATCC Número CRL-1573.1) son células HEK 293 las cuales se han adaptado para crecer en medio sin suero. En esta invención también se contemplan las células HEK 293 adaptadas para crecer en otras condiciones de cultivo, o cualquier clase de células HEK 293 o derivados los cuales se transforman con un ADN exógeno, con la condición de que esta transformación no perjudique la capacidad de las células para soportar producción eficaz de reovirus, como se describe en esta invención. Como se describe en la presente, el término "administración clínica" de un sustrato se refiere a poner en contacto cualquier parte del cuerpo de uno organismo vivo con la sustancia con el fin de mejorar o mantener las condiciones de salud del organismo. MÉTODOS Previamente hemos desarrollado un método para hacer crecer reovirus en células HEK 293 (Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20020037576) . El reovirus se. replica en"~cérul"'ás-"?????29.3.¿-para _ roporcionar un título alto de virus en las células poco después de la infección por "el Virus, -por— lo que se proporciona un - método sencillo y eficaz para producir reovirus. Además, las. células HEK 293 se han adaptado para crecer en suspensión las cuales se pueden cultivar en grandes cantidades y hemos desarrollado un método de producción a gran escala. Para aislar reovirus del cultivo de suspensión, inicialmente seguimos los métodos tradicionales de extraer y purificar partículas virales. Brevemente, las células se rompen por congelamiento y recalentamiento y se extraen por Freon tres veces. Las partículas virales después se purifican con un gradiente de CsCl y ultracentrifugación. No obstante, este protocolo es demasiado tedioso y consume tiempo para la producción de virus a gran escala. Por lo tanto desarrollamos un método simplificado para extraer el reovirus . Se descubrió que al incubar el cultivo de células HEK 293 con un detergente por un período de tiempo breve, se liberan al extracto altas concentraciones de reovirus infeccioso. El virus después se puede separar de los residuos celulares con un método de separación sencillo que se base en diferencias en tamaño o densidad, tal como filtración, diafiltración o exclusión por tamaño y el virus resultante se puede utilizar para tratamiento de reovirus. El reovirus producido de acuerdo con la presente invención es adecuado -~para.- administración a humanos y este protocolo concuerda con la recomendación de. la FDA de romper- células .en presencia de un detergente. En un experimento preliminar probamos cuatro detergentes, los detergentes no iónicos Tritón X-100, NP-40 y Tween 20, así como el detergente iónico desoxicolato de sodio. Los cuatro detergentes fueron capaz de lisar las células y liberar las partículas virales infecciosas por encima del nivel de fondo, y el más eficaz fue Tritón X-100. Se contempla que otros detergentes, particularmente aquellos utilizados habi ualmente para romper células se pueden utilizar también en la presente invención. Los ejemplos de estos detergentes adicionales incluyen los otros detergentes Tritón, los otros detergentes Tween (por ejemplo Tween-80) , dodecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de litio y cloruro de dodeciltrimetilamonio . Los resultados también indican que la extracción de detergente puede ser más eficaz que el congelamiento, recalentamiento, procedimiento estándar para extracción de virus. Además, se ha informado que para extraer reovirus aviar de células Vero en las cuales el reovirus se ha asociado fuertemente a las células, el agua desionizada destilada es más eficaz que el congelamiento-recalentamiento, la extracción con freon o el tratamiento con tripsina (Drastini et al., 1992). La presente invención proporciona uña' "soliTcrón -más -rápida ...y. conveniente así como eficaz, debido a' que no hay necesidad" de' sedimentar_y„ después resúsperidér¦ las células, como se requiere por el método de agua destilada. Se contempla que concentraciones altas de sal, tales como cloruro de guanidina - se pueden utilizar en la presente invención para sustituir a los detergentes. No obstante, es preferible utilizar detergentes en vez de concentraciones elevadas de sal. La presente invención por lo tanto proporciona un método rápido y sencillo para extraer virus de un cultivo celular. El detergente se puede agregar directamente a un cultivo de suspensión o al medio de células adherentes. En cualquier caso, el medio no necesita ser separado primero. Además, no son necesarios otros medios para romper células o extraer virus, tales como congelamiento-recalentamiento o sonicación. Una característica importante de la presente invención es que el procedimiento de extracción se puede llevar a cabo a la temperatura ambiente o a una temperatura superior. Tradicionalmente , la extracción y purificación de virus se lleva a cabo a una baja temperatura, típicamente 0-4°C, para conservar las estructuras y funciones de las proteínas. Por la misma razón, habitualmente también se incluyen en , las soluciones de extracción inhibidores de prbte~asá.- --Por:~._lo;~,tanto, es sorprendente que el presente protocolo se pueda*" llevar a- -cabo a una .temperatura 'superior.-sin ningún inhibidor de proteasa. De hecho, una temperatura tan elevada como 37°C resulta en aproximadamente la misma cantidad de virus infeccioso que 25 °C. En consecuencia, la extracción de virus se puede llevar a cabo al agregar un detergente directamente al cultivo celular y continuar agitando el cultivo con el fin de liberar al virus sin tener que cambiar la temperatura. De manera alternativa, dado que no hay necesidad para mantener una temperatura constante para la extracción del virus de acuerdo con la presente invención, el procedimiento se puede llevar a cabo a temperatura ambiente aunque la temperatura ambiente pueda variar de un lugar a otro o con el tiempo en el mismo lugar. Posterior a la extracción, el virus se puede purificar en base, por ejemplo, en el tamaño o diferencia de densidad entre el virus y los demás constituyentes del extracto. Particularmente se puede utilizar filtración' o centrifugación para separar los residuos de célula del virus. Para optimizar las condiciones de filtración, probamos el efecto de diversos filtros en presencia de varios detergentes de extracción diferentes (ejemplo 1) . Un protocolo de filtración paulatina demostró ser el más eficaz. Por lo tanto, un prefiltrado que tiene un tamaño de poro relativamente grande (por ejemplo 5 µ? u 8 µ?) se utilizó primero "-para.—.separar piezas grandes de la mezcla de extracción, seguido por- filtros..con tamaños" de poro-pequeños, tales como una unidad de filtro combinado que contiene un" filtro de 3 µ? y un' filtro de 0.8 µ?. En presencia de los prefiltros, la mezcla de extracción puede atorar el filtro rápidamente, y de esta manera desperdiciar tanto material como tiempo. En base en el volumen recolectado después de la filtración, como se muestra en el ejemplo 1, es preferible utilizar Tritón X-100 1% para extracción de virus. Además, los filtros de membrana de acetato de celulosa son mejores que los filtros de membrana de fibra de vidrio, debido a que el filtro de membrana de acetato de celulosa permite que se filtre un volumen mayor de mezcla de extracción, lo que lo vuelve más adecuado para producción a gran escala. Dependiendo del propósito de la producción de. virus, puede ser deseable concentrar el filtrado que contiene virus. En el ejemplo 2 se demuestra una etapa de concentración utilizando ultrafiltración/diafiltración. Se prueban dos sistemas de ultrafiltración/diafiltración, el sistema de placa y cásete bastidor de Pall Filtron y el cartucho de fibra hueca A/G Technology. Los resultados muestran que los dos sistemas son comparables en su velocidad tienen diferentes proteínas de superficie, las cuales establecen su carga de superficie en cualquier pH dado, se necesita decidir para cada virus la condición apropiada para purificación. El ejemplo 3 ilustra una determinación de las condiciones óptimas de intercambio iónico para reovirus. Por lo tanto, se utilizaron columnas de intercambio iónico que contienen diferentes resinas a pH diferente para purificar una preparación de reovirus que ha sido extraída, filtrada y concentrada como se describe en lo anterior. Los resultados indican que una columna de anión débil que contiene A X Sepharose a pH 7.0-8.5 es la más eficaz. El pH de manera más preferible es de aproximadamente 7.5 u 8.0, y de manera mucho más preferible aproximadamente 8.0. El virus también se puede purificar en base en la diferencia en tamaño, por ejemplo, con cromatografía de exclusión de tamaño. Para reovirus, es particularmente eficaz una combinación de intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño. También se pueden utilizar cuando sea apropiado otros métodos cromatográficos tales como los basados en afinidad o interacción hidrofóbica. Por lo tanto, se puede adoptar la cromatografía en columna como una alternativa eficaz a una ultracentrifugación de gradiente de densidad de CsCl para obtener un buen rendimiento, pureza y reovirus utilizando células diferentes a las células HEK 293, que incluyen pero que no se limitan a ratón L929, células Vero y de ovario de hámster chino. Se contempla que el presente método se aplique también a otros virus, particularmente otros virus sin envoltura. Las condiciones apropiadas para la purificación de otros virus se pueden determinar por una persona habitualmente experta en la técnica en base en la descripción en la presente. Los virus que se pueden preparar utilizando el presente método incluyen, pero no se limitan a los virus de las familias de myoviridae, siphoviridae , podpviridae, teciviridae, corticoviridae , plasmaviridae , lipothrixviridae , fuselloviridae , poxviridae, iridoviridae , phicodnaviridae , baculoviridae , herpesviridae , adenoviridae , papovaviridae , polydnaviridae , inoviridae, microviridae , geminiviridae , circoviridae , parvoviridae , hepadnaviridae, retroviridae , cyctoviridae, reoviridae, birnaviridae, paramyxoviridae , rhabdoviridae, filoviridae, orthomyxoviridae, bunyaviridae , arenaviridae, leviviridae, picornaviridae , sequiviridae , comoviridae, potyviridae, caliciviridae , astroviridae , nodaviridae, tetraviridae, tombusviridae , coronaviridae , glaviviridae, togaviridae, y barnaviridae . COMPOSICIONES ~ -"También - se_ proporcionan composiciones que comprenden el virus preparado - de . acuerdo con métodos- de .. la presente invención. Estas composiciones se pueden utilizar en el aislamiento y caracterización de proteínas virales, producción de vacunas o, cuando la composición contiene un virus infeccioso, como concentrados de virus o en administración clínica. Para el propósito de administración clínica, la composición habitualmente se mezcla con un excipiente, se diluye por un excipiente o se encierra dentro de un portador el cual puede estar en forma de una cápsula, saco, papel u otro recipiente (WO99/08692A1) como una composición farmacéutica. Cuando el excipiente farmacéuticamente aceptable sirve - como un diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido el cual actúa como un vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. Por lo tanto, las composiciones pueden estar en forma de tabletas, pildoras, polvos, grageas, sacos, obleas, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido) , ungüentos que contienen, por ejemplo, hasta 10% en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina suave y dura, supositorios, soluciones inyectables estériles y polvos empacados estériles. Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosav-*~¾extros sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma acacia, fosfato"" de- -calcio, alginatb's," ''tragacantos-gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, " polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, solución salina estéril, jarabe y metilcelulosa . Las formulaciones pueden incluir adicionalmente : agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsificantes y que mejoren la suspensión; agentes conservadores tales como metil- y propilhidroxi-benzoatos ; agentes edulcorantes y agentes saborizantes . Las composiciones de la invención se pueden formular de manera que proporcionen liberación rápida, sostenida o retrasada del ingrediente activo después de la administración al paciente mediante la utilización de procedimientos conocidos en la técnica. La vía mediante la cual se administra el reovirus, así como la formulación, portador o vehículo dependerán del lugar así como del tipo de las células objetivo. Se puede utilizar una amplia variedad de rutas de administración. Por ejemplo, para un neoplasma sólido que es accesible, el reovirus se puede administrar por inyección directamente en el neoplasma. Para un neoplasma hematopoyético , por ejemplo, el reovirus se puede administrar por vía intravenosa o intravascular . Para neoplasmas que no son accesibles fácilmente dentro del cuerpo, tales como metástasis, el reovirus~~se- administra de una manera tal que puede ser transportado sistémicamente-- por., el^ cuerpo del"~mamífero y_.de esta manera llegar al neoplasma (por ejemplo por vía intravenosa o intramuscular) . De manera alternativa, el reovirus se puede administrar directamente a un neoplasma sólido único, en donde después es transportado sistémicamente a través del cuerpo hacia las metástasis. El reovirus también se puede administrar por vía subcutánea, intraperitoneal , intratecal (por ejemplo para tumor cerebral) , tópica (por ejemplo para melanoma) , oral (por ejemplo para un neoplasma oral o esof gico), rectal (por ejemplo para neoplasma colorrectal) , vaginal (por ejemplo para neoplasma cervical o vaginal) , nasalmente o por aspersión por inhalación (por ejemplo, para un neoplasma pulmonar) . Preferiblemente, el reovirus se administra por inyección. Las formas líquidas en las cuales las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden incorporar para administración oralmente o por inyección incluyen soluciones acuosas, de manera adecuada jarabes con sabores, suspensiones acuosas u oleosas y emulsiones con sabor, con aceites comestibles tales como aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de coco o aceite de cacahuate, así como elíxires y vehículos farmacéuticos similares. Para preparar composiciones sólidas tales como tabletas", el --"ingrediente activo principal/reovirus se mezcla con un excipiente farmacéutico para conformar lana-composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea" de' un compuesto de la presente, invención. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, se quiere significar que el ingrediente activo está disperso uniformemente a través de la composición de manera que la composición se puede subdividir fácilmente en formas de dosificación unitaria igualmente eficaces tales como tabletas, pildoras y cápsulas.

Las tabletas o pildoras de la presente invención se pueden recubrir o puede formar compuestos de alguna otra manera para proporcionar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender un componente de dosificación interior y un componente de dosificación exterior. Este último está en forma de una envoltura sobre la primera . Los dos componentes se pueden separar por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permitir que el componente interior pase intacto al duodeno o que se retrace en su liberación. Se puede utilizar una variedad de materiales para tales capas o recubrimientos entéricos, tales materiales incluyen muchos ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con tales materiales, tales como laca, alcohol cetilico y acetato de orgánicos farmacéuticamente aceptables o mezclas de los mismos, y en polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se describe en la presente. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía respiratoria oral o nasal para efecto local o sistémico. Las composiciones en solventes farmacéuticamente aceptables preferiblemente se pueden nebulizar mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas se pueden inhalar directamente del dispositivo nebulizante o el dispositivo nebulizante se puede unir a una prótesis (adaptador) de máscara facial, o una máquina de respiración con presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo se pueden administrar preferiblemente por vía oral o nasal, a partir de dispositivos los cuales suministren la formulación de una manera apropiada. Otra formulación preferida utilizada en los métodos de la presente invención utiliza dispositivos de administración transdérmica ("parches"). Tales parches transdérmicos se pueden utilizar para proporcionar infusión continua o discontinua del reovirus de la presente invención referencia. Tales parches se pueden construir para suministro continuo, pulsátil o en base en la demanda, de agentes farmacéuticos. Otras formulaciones adecuadas para uso en la presente invención se pueden encontrar en Remington ' s Pharmace tical Seienees . Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar esta invención y no se deben considerar como limitantes del alcance de la presente invención, de manera alguna . EJEMPLOS En los ejemplos siguientes, las siguientes abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas tienen el significado aceptado de manera general . CI = Intervalo de Confianza TCID50 = Dosis Infecciosa de Cultivo de Tejido 50 µ? = micromolar mM = millimolar M = molar mi = mililitro ' ~ ··µ! ·. _ = microlitro mg ' =.. . mi ?gramo"-- . pg = microgamo " - — g/1 = gramos por litro rpm = revoluciones por minuto FBS = suero bovino fetal DTT = ditiotrietol NP-40 = Nonidet P-40 (octilfenoxipolietoxietanol) SDS = dodecilsulfato de- sodio PBS solución salina amortiguada con fosfato ß?? ß-mercaptoetanol MOI o m. o . i . multiplicidad de infección PFU unidades formadoras de} placa hr hora °C grados celsius MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES Células y Virus Se proporcionan células de riñon de embrión humano 293 (HEK 293) y fibroblastos de ratón L-929 por el fabricante BioReliance Corporation (Rockville, Maryland) . Se hacen crecer las células HEK 293 en un medio de cultivo que contiene suero de caballo inactivado por calor, 10%, y 90% de la~ ~sigüiente t__;mezcla : medio esencial mínimo de Eagle con L-glutamina 2 mM "y '-solución^ salina "~balanceada _~ de „ Earle ajustada para contener 1.5 g/1 de bicarbonato ^de "sodio, aminoácidos no esenciales 0.1 mM y piruvato de sodio 1.0 mM. Las células de ratón L-929 se propagan en un medio de cultivo que contiene FBS 10% y 90% de la siguiente mezcla: medio esencial mínimo de Eagle con L-glutamina 2 mM y solución salina balanceada de Eagle ajustada para contener 1.5 g/1 de bicarbonato de sodio, aminoácidos no esenciales 0.1 mM y piruvato de sodio 1.0 mM.

La células 293/SF se hacen crecer en medio libre de suero 293 (Life Technologies, Rockville, Maryland) suplementado con L-glutamina 4 mM a 36 °C ± 2°C, 6% ± 2%, y • humedad relativa de 80% ± 5% en matraces sometidos a agitación giratoria a una velocidad de impulsor de 35-40 rpm. La cepa Dearing de reovirus serotipo 3 utilizada en esos estudios se propagó primero en cultivos de suspensión de células L-929 purificadas de acuerdo con Smith (Smith et al., 1969) , con la excepción de que se suprime ß-mercaptoetanol (ß-??) del amortiguador de extracción. La proporción de partícula/UFP para reovirus purificado típicamente es de 100/1. Se determinaron títulos virales por titulación en placa sobre - células L-929 y se expresó como el logaritmo natural de TCID50/ml. El virus después 'se produce a gran escala en células 293/SF. Infec'cióhr'de-Células en Suspensión Se hacen' crecer -„ células 2937SF -a- A05./.ml _y__ se infectan con el reovirus. Se permite que el cultivo crezca hasta que el color del medio cambia de rojo a naranja o hasta que la viabilidad de las células desciende al nivel deseado, como se vuelve evidente por la cuenta de células viables. Las cuentas de células viables se pueden realizar bajo el microscopio para células que no muestren un efecto citopático, el cual está indicado porque las células se hinchan y presentan una apariencia granular y los grupos de células se separan. Las cuentas de células viables también se pueden realizar por una tinción viable como se utiliza habitualmente en la técnica. Método Tradicional de Extracción y Purificación de Virus Cuando se alcanza el nivel de viabilidad de células que se desea, las células se sedimentan en una centrífuga y se resuspenden en Tris 10 mM, pH 7.4, NaCl 250 mM y tritón X-100 0.1%. Después las células se lisan por congelamiento-recalentamiento y se mantienen en hielo durante 20-40 minutos con agitación periódica en remolino para mezclar y lisar las células. La suspensión se extrae con un volumen igual de FreonMR ( 1 , 1 , 2 -tricloro-1 , 1 , 2 -trifluoroetano) previamente enfriado al someter a remolino durante 10 minutos, seguido por centrifugación a 2500 rpm durante 10 minutos a 4°C para separar las fases por diferencia. La fase acuosa (superior) se separa'-y'-se: -vuelve a extraer dos veces como se describe en lo anterior y el virus" se sedimenta por' "ül't'facent ifligación a 25,000 rpm durante una hora a 4°C. "' - El sedimento se resuspende en PBS y el virus se purifica por ingrediente paulatino de cloruro de cesio. El gradiente contiene dos capas de soluciones de CsCl (1.20 g/ml y 1.4 g/ml, respectivamente) preparado en Tris 10 mM (pH 7.4) . La suspensión de virus se carga en la parte superior del gradiente y se centrifuga en un rotor SW 28.1 a 26,000 rpm durante 2 horas a 4°C. La banda viral (la inferior de las dos bandas, debido a que la banda superior contiene cápsides vacías) se cosecha y dializa contra PBS estéril. Tratamiento con Benzonasa Después de lisar las células con un detergente, se agrega una solución de MgCl2 50 mM al lisado crudo hasta una concentración final de MgCl2 1 mM. Después se agrega benzonasa (250,000 unidades/ml, EM Industries catálogo No. 1016979M) a aproximadamente 10 unidades/ml. El lisado se agita en una incubadora 36°C durante una hora. EJEMPLO 1 Clarificación: eliminación de residuos celulares El propósito de este ejemplo es desarrollar un procedimiento de clarificación adecuado que sea compatible con el protocolo utilizando detergentes para lisar las células y susceptible de aumento en la escala y elaboración futuras". ""Enseste-ejemplo, el lisado se filtra ya sea a través de un filtro de cápsula .de _3 µ?/? .8 ~µp?'~ O"- se^hace pasar a través de una combinación de un prefiltro (5 jim ux '8 ~µp?) ...y después a través de un filtro de cápsula de 3 µ??/0.8 µ? . Todos los filtros utilizados en este estudio presentan un área superficial de 14 cm2 (0.015 pies2) . En base en el volumen filtrado a través de la membrana de 14 cm2 (0.015 pies2) , se determina la capacidad de las membranas para filtración a gran escala. Además, se compara la eficiencia de filtración para dos materiales de membrana diferentes: membrana de acetato de celulosa y de fibra de vidrio para el filtro de cápsula de 3 ym/0.8 µG?. Se probaron tres detergentes. Las células que albergan reovirus se dividen por igual en tres frascos estériles de 1 1 marcados para los tres diferentes agentes de lisis que se van a probar: Tritón X-100 1%, Tritón X-100 0.3% y Na-DOC 0.1%. Se agrega a las botellas 1 y 2 un volumen de 92 mi y 28 mi de Tritón X-100 10% de manera que las concentraciones de trabajo en estas botellas es de Tritón X-100 1% y 0.3%, respectivamente. Se agrega un volumen de 9.2 mi de Na-DOC 10% a la tercera botella a una concentración de trabajo de 0.1%. Las tres botellas se colocan en una placa de agitación y se agitan a 160 ± 20 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se toma una muestra posterior a la lisis para cada condición de lisis para análisis de título. Se agrega "aproximadamente ~ ~ 20:"-ml ~ de- -MgCl-2 "50-^mM-. al. lisado crudo en cada una de las botellas a una concentración de trabajo de aproximadamente MgCl2 1 mM. Esto es seguido por la adición de 40 µ? de benzonasa (250, 000 unidades /mi) a una concentración de trabajo de aproximadamente 10 unidades/ml . El lisado crudo se agita a un ajuste de 5 en una incubadora a 36°C durante una hora. Estas etapas se incluyen para eliminar el ADN de la célula hospedadora y para reducir la viscosidad del lisado y de esta manera facilitar el procesamiento posterior .

Se calibra una bomba atson-marlow (505U) para relacionar el caudal con la velocidad de la bomba. De acuerdo con las sugerencias del fabricante, se utiliza una velocidad de bomba de 5 rpm (caudal de 40 ml/min) a través del estudio de clarificación. El lisado de cada condición de tratamiento se hace pasar a través de uno de los siguientes filtros: 1) filtro de cápsula de 3 µ?/0.8 pm; 2) un prefiltro de tamaño de 5 µ? ¦) filtro de cápsula de 3 µp?/0.8 µ?? conectado en serie; y 3) un prefiltro de tamaño de poro de membrana de 8 µ? -> filtro de cápsula de 3 µta/0.8 \im conectado en serie. Los filtros de cápsula de 3 µ?t?/0.8 µp? tienen una construcción de membrana heterogénea de capa doble que permite una alta capacidad de carga de residuos y un rendimiento incrementado*". ?G primer 'filtróles-de -un tamaño -de poro más grande (3 µp?) que el segundo filtro (0.8 µp?) . Los prefiltros combinan capas múltiples de material de filtro de profundidad de polipropileno no tejido plisado progresivamente más fino. Todos los filtros utilizados en este estudio tienen un área superficial de 14 cm2 (0.015 pies2). Los dos materiales de membrana, específicamente acetato de celulosa y fibra de vidrio, se prueban para los filtros de cápsula de 3 µp?/0.8 µp?. La mejor combinación de agente de lisis y condiciones de filtro se determina en base en los valores de título y los volúmenes que pasan a través de los filtros. Se monitorea la caída de presión a través de las membranas para determinar el momento en el que se produce obturación de la membrana. La indicación de obturación de la membrana es una caída de presión de 172 kPa (25 psi) , más allá de lo cual el filtro se puede romper. Cuando el filtro de cápsula de. 3 µp?/0.8 µp? se utiliza solo, un máximo de 35 mi pasan a través de estos filtros de cápsula antes de que la membrana se obture. El tamaño de membrana de 3/0.8 µp? se obtura a los 5 minutos, lo que sugiere que el uso de un prefiltro es necesario para eliminar el atoramiento de las membranas con residuos celulares. El uso de un prefiltro de 5 µp? antes del filtro de cápsula de 3/0.8 µp? incrementa de manera significativa "la cantidad de filtrado obtenido, mientras qué la filtración a través de un prefiltro de 8 µ? seguido por una filtración en~cápsu a "de" 3 ~ m/0.'8"'µ.t."-proporciona -la-mayor-, capacidad de la membrana en términos de volumen que pasa a través de los filtros (un promedio de 200 mi recolectados por 14 cm2 (0.015 pies2) del área superficial del filtro). Tritón X-100 al 1% proporciona los mejores resultados en comparación con las otras dos .condiciones de lisis.' Los resultados también muestran que el material de membrana de acetato de celulosa trabaja mejor que la membrana de fibra de vidrio, en base en el volumen filtrado a través de estas membranas. No se observa pérdida significativa de infectividad en cualquier etapa de filtración cuando se compara con infectividad del cosechado en volumen (el cultivo celular antes de la lisis y filtración) . En base en los resultados de este estudio, un volumen de 20 1 de cosechado requiere 1394 cm2 (1.5 pies2) de área superficial de membrana para filtración. EJEMPLO 2 Concentración Para seleccionar un sistema adecuado para concentrado y diafiltrado del lisado clarificado, se comparan los sistemas de cásete de placa y armazón de Pall Filtron (www.pall.com) y el cartucho de fibra hueca de A/G Technology (www.agtech.com) . Se utiliza el mismo material de membrana de polietersulfona en ambos sistemas. El criterio para selección, es la facilidad de uso, el grado de concentración que se obtiene y el título de~Vifús" del producto. El cásete de plata y armazón utilizado en este estudio es el sistema MINIM de Pall, el cual es una unidad de gabinete de laboratorio y el equipo LV Centramate que contiene dos cribas suspendidas en canal de membranas de ultrafijación de 300 kD (de 186 cm2 (0.2 pies2) cada una). Antes de concentrar el lisado clarificado, el aparato se enjuaga con 2 1 de agua para Osmosis inversa (RO) (grado USP) para eliminar por descarga el gel de almacenamiento. Los casetes se sanitizan con 2 1 de NaOH 0.1 N calentado. El sistema después se drena, se enjuaga con 2 1 de agua RO y se acondiciona con el medio de crecimiento para el virus. El sistema completo se drena y el volumen de retención del sistema y la tubería se determina que es de 6 mi . El cartucho de fibra hueca probado en este estudio es el sistema QuixStand Benchtop de A/G Technology, tamaño 4M con columna de cartucho de ultrafij ación (650 cm2 de área superficial) . Al igual que con el cásete de placa y armazón, el aparato " primero se somete a descarga con 2 1 de agua de Osmosis inversa (RO) (grado USP) para descargar el gel de almacenamiento. Los casetes se sanitizan con 2 1 de NaOH 0.1N calentada. Él sistema después se agrega, se enjuaga con 2 1 de agua RO y se acondiciona por descarga con el medio de crecimiento del virus. Se utiliza un. caudal del suministro constante de 600 ml/min a través del experimento. „ ?ara am os sistemas, el iisado clarificado se hace recircular hasta que el material se concentra a -250 mi (concentración de 10X) y se toma una muestra para análisis del título (Post I -concentración) . El concentrado (retenido) se somete a diafiltración contra 1 1 (5 volúmenes de diafiltración) de amortiguador de diafiltración (Tris 20 mM + NaCl 0.2 M + MgCl2 1 mM, pH 8.0 ± 0.1), y otra muestra se toma para análisis de título (Post-diafiltración) . El retenido se concentra adicionalmente a aproximadamente 120 mi. Después de la concentración final, el producto se drena del sistema y se recolecta en un recipiente estéril único (concentración posterior a la final). El sistema después se enjuaga con 40 mi de amortiguador de diafiltración para asegurar recuperación máxima del producto. Los parámetros de procedimiento monitoreados durante el procedimiento de concentración con los sistemas tanto de fibra hueca como de placa y armazón se muestran en la tabla 1. Tabla 1. Comparación de Parámetros de Procedimiento para los Sistemas de Fibra Hueca y de Placa y Armazón . TMP. = [(Presión de Suministro" +""' Presión"" *dé Retenido) /2 - Presión de Permedado] La presión transmembranal (TMP) sé establece en menos de 55 kPa (8 ps) a través, del procedimiento en fibra hueca, mientras que TMP se incrementó a 207 kPa (30 psi) con el procedimiento de placa y armazón. El uso de un área superficial de membrana mayor para el sistema de fibra hueca probablemente resulta en menos obturación del cartucho. Se obtiene aproximadamente una concentración de 20 veces con el cásete de placa y armazón en 4 horas, mientras que se obtiene un incremento de concentración de 14' veces utilizando el cartucho de fibra hueca en 3 horas y nosotros hemos obtenido una concentración de 20 veces en otros 30 minutos. Existe una pérdida de 45-50% del producto cuando se 5 compara o los valores posteriores a lisis en cualquiera de los sistemas. La instalación del cartucho de fibra hueca es más fácil que el cásete de placa y armazón. Por lo tanto, el cartucho de fibra hueca es el sistema adecuado para las etapas de ultrafiltración y diafiltración en base en la 0 facilidad- de manejo. EJEMPLO 3 Intercambio iónico Los virus presentan diferentes cargas superficiales debido a sus moléculas superficiales. Por lo tanto, es 5 posible purificar virus - utilizando cromatografía de _ ^ intercambio iónico, y las condiciones variarán dependiendo de la naturaleza del virus. En consecuencia, probamos las condiciones de cromatografía de intercambio iónico de diversos pH para reovirus. El reovirus se somete a 0 cromatografía a diferentes pH. El título después de cada etapa se determina y se incluye en lo siguiente.

Tabla 2. Efectos de la Cromatografía de Intercambio Iónico a Diversos pH Muestra Título ± 95% Corrección Título corregido ± de CI de 95% de Cl (logaritmo Volumen2 (logaritmo decimal de la decimal de TCIDso/ml) TCIDso/ml) Aplicando una Concentración Conocida de 8.05 ± 0.47 Virus Control, 10/30/01 Título Certificado de RE3013101 P 8.35 + 0.27 - - Control Negativo No se detecta virus ONC 101 , Cocecha a granel ** - - ONC 102, Post filtración 9.18 + 0.36 - 9.19 ± 0.36 ONC 103, Post columna, catión fuerte pH 4.0 5.93 ± 0.24 1.02 5.94 + 0.24 ONC 104, Post columna, catión fuerte pH 5.0 8.93 ± 0.42 1.01 8.93 ± 0.42 ONC 105, Post columna, catión fuerte pH 6.0 9.18 + 0.40 - 9.18 ± 0.40 ONC 106, Post columna, catión fuerte pH 7.0 9.30 ± 0.37 - 9.30 ± 0.37 ONC 107, Post columna, catión fuerte pH 8.0 '9.55 + 0.32 - 9.55 ± 0.32 ONC 108, Post columna, catión débil pH 4.0 8.93 + 0.40 1.01 8.93 + 0.40 ONC -109, .Post columna, catión débil pH 5.0 _ _ ONC .110, .Post columna, . catión débil pH 6.0 ....... .8.68 ± 0.40 _ .. „ 8.68 ± 0.40 ONC 111 , Post columna, catión débil pH 7.0 9.30 ± 0.37 - 9.30 ± 0.37 ONC 112, Post columna, catión débil pH 8.0 8.18 ± 0.36 1.02 8.19 ± 0.36 ONC 1 3, Post columna, anión fuerte pH 5.0 5.30 ± 0.37 1.02 5.30 ± 0.37 ONC 114, Post columna, anión fuerte pH 6.0 4.80 ± 0.00 - 4.80 ± 0.00 ONC 1 5, Post columna, anión fuerte pH 7.0 7.80 ± 0.35 - 7.80 ± 0.35 ONC 116, Post columna, anión fuerte pH 8.0 10.18 ± 0.36 1.01 10.18 ± 0.36 ONC 117, Post columna, anión fuerte pH 9.0 8.55 ± 0.32 - 8.55 ± 0.32 ONC 118, Post columna, anión débil pH 5.0 7.93 ± 0.40 - 7.93 ± 0.40 ONC 119, Post columna, anión débil pH 6.0 6.68 + 0.40 - 6.68 ± 0.40 ONC 120, Post columna, anión débil pH 7.0 8.30 ± 0.37 1.02 8.31 ± 0.37 ONC 121 , Post columna, anión débil pH 8.0 10.53 + 0.36 1.03 10.54 ± 0.36 ONC 122, Post columna, anión débil pH 9.0 8.93 ± 0.24 1.03 8.94 ± 0.24 En consecuencia, a pH de 7.0-9.0 se obtiene un mayor rendimiento de reovirus en comparación con otros pH. El pH utilizado en ésta etapa preferiblemente es de 7.5-8.5, particularmente un pH de 8.0. Aunque funcionaron ambos intercambiadores, catiónicos y . aniónicos, los intercambiadores aniónicos generalmente fueron más eficaces. REFERENCIAS Publicación de Solicitud de Patente de E.U.A. No. 20020037576, publicado el 28 de marzo del 2002. WO99/08692A1, publicado el 25 de febrero de 1999. Patente Japonesa 63044532A, publicada el 25 de febrero de 1988. Berry et al., Biotechnology and Bioengineering, "Production of Reovirus Type-1 and Type-3 from Vero Cells Grown on Solid and Macroporous Microcarriers " , Biotechnology and_ Bioengineering 62: 12-19 (1999) . Bos, J.L., "Ras Oncogenes in Human Cáncer; A Review", Canc . Res. 49(17): 4682-4689 (1989). Chandron and Nibert, "Protease cleavage of reovirus capsid protein muí and mulC is blocked by alkyl sulfate detergente, yielding a new type of infectious subvirion particle", J. of Virology 72 (1) : 467-75 (1998). Coffey, .C., et al., "Reovirus therapy of tumors with activated Ras pathway" , Science 282: 1332-1334 (1998). Davis, et al., Microbiology, Lippincott, Philadelphia (1990) . Drastini, Y. et al., "Comparison of eight different procedures for harvesting avian reoviruses grown in Vero cells", J. Virological Methods 39: 269-278 (1992) . Duncan et al., "Conformational and functional analysis of the C-terminal globular head of the reovirus cell attachment protein", Virology 182 (2) : 810-9 (1991) . Fields,, B.N. et al., Fundamental Virology, 3rd Edition, Lippincott -Raven (1996) . Mah et al., "The N-terminal quarter of reovirus cell attachment protein sigma 1 possesses intrinsic virion- anchoring function", Virology 179(1) : 95-103 (1990). cRae, M.A. and Joklik, W.K., "The nature of the polypeptide encoded by each of the 10 double-stranded RNA segments of reovirus type 3", Vilorogy, 89:578-593 (1979) . ... . . Nibert . et al.,, ^Reovirus and jtheir replication" , in Fields et al., Fundamental Virology, 3rd Edition, Lippincott-Raven (1996). Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia PA 19th ed. (1995) . Smith, R.E., et al., "Polypeptide components of virions, top component and cores of reovirus type 3", Virology, 39:791-800 (1969) . Strong, J.E. and P. . Lee, "The v-erbV oncogene confers enhanced cellular susceptibility to reovirus infection", J. Virol. 70: 612-616 (1996) .

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Claims (12)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para producir virus a partir de un cultivo de células, caracterizado porque comprende las etapas de: . (a) proporcionar un cultivo de células las cuales han sido infectadas por el virus; (b) extraer el virus de las células al agregar un detergente al cultivo e incubar durante un período de tiempo lo que resulta en un lisado celular; (c) separar el residuo celular; y (d) recolectar el virus.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación I - caracterizado-- porque —el .- .residuo _ celular se separa por filtración .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo celular se separa mediante filtración paulatina que comprende: (1) filtrar a través de un prefiltro que tiene un tamaño de poro de 5 µ? u 8 µ?, y (2) filtrar después de la etapa (1) a través de un filtro de combinación que tiene tamaños de poro de 3 µ? y 0.8 µ?.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además tratar el lisado celular con benzonasa.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además concentrar el filtrado .
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el filtrado se concentra por diafiltración.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el virus es un virus no envuelto.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque el virus es un reovirus.
9. 9. El método de conformidád con la reivindicación 8, caracterizado porque el reovirus es. un reovirus de. mamífero" "~ " " ~~~
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el reovirus de mamífero es un reovirus humano.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el reovirus humano es un virus serotipo 3. . i
12. 12. El método de conformidad, con la reivindicación II, caracterizado porque el reovirus serotipo 3 es de la cepa Dearing. : ¦· infeccioso, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un cultivo de células HEK 293 que ha sido infectado por reovirus; (b) extraer el virus de las células al agregar Tritón X-100 al cultivo e incubar de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C; (c) tratar la mezcla de la etapa (b) con benzonasa; (d) separar los residuos celulares por filtración; (e) concentrar el filtrado por ultrafiltración o diafilt ación; (f) purificar el reovirus por una combinación de cromatografía de intercambio iónico y exclusión de tamaño; y (g) recolectar el reovirus. 22. Una composición caracterizado porque comprende el reovirus prep_arado___.de_ conformidad^ con__el_ .método r .de...la-reivindicación 211' — — " ~ """ " " - - --- - 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque comprende además un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable.