ES2323454T3 - Metodos de purificacion viral mejorados. - Google Patents
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Abstract
Un método para producir virus a partir de un cultivo de células, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un cultivo de células que se han infectado con el virus; (b) extraer el virus de las células añadiendo un detergente al cultivo de células e incubando durante un periodo de tiempo para producir un lisado celular; y (c) retirar los residuos celulares; (d) purificar el virus mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular; (e) recoger el virus.
Description
Métodos de purificación viral mejorados.
Esta solicitud reivindica el beneficio de las
solicitudes provisionales de EEUU nº de serie 60/377.273, presentada
el 30 de abril, 2002; y nº de serie 60/443.176, presentada el 29 de
enero, 2003.
Este invención se refiere a un método para
extraer virus a partir de un cultivo celular. En particular, el
método resulta útil para extraer virus infecciosos que es adecuado
para la administración clínica a mamíferos, incluyendo el ser
humano.
Solicitud de patente de EEUU nº de publicación
20020037576, publicada el 28 de marzo, 2002.
Documento WO99/08692A1, publicado el 25 de
febrero, 1999.
Patente japonesa 63044532A, publicada el 25 de
febrero, 1988.
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\newpage
Debido a la vasta cantidad de enfermedades
provocadas por virus, la virología es un campo que se ha estudiado
a fondo. Siempre ha existido la demanda de producir virus con
eficacia para aislar y purificar proteínas víricas, para generar
vacunas o para proporcionar virus infecciosos para estudios de
laboratorio. En fechas recientes, los nuevos desarrollos en terapia
vírica han aumentado aún más la necesidad de una producción eficaz
de virus
infecciosos.
infecciosos.
La terapia de reovirus es un ejemplo de terapia
vírica. El reovirus es un virus de ARN bicatenario capaz de unirse
a una multitud de células. Sin embargo, la mayoría de las células no
son susceptibles a una infección por reovirus, y la unión del
reovirus a su receptor celular no produce replicación vírica ni
producción de partículas víricas en estas células. Probablemente
ésta sea la razón de por qué no se conoce que el reovirus esté
asociado a ninguna enfermedad concreta.
En fechas recientes se ha descubierto que las
células transformadas con el oncogén ras se convierten en
susceptibles a la infección por reovirus, mientras que sus
homólogas no transformadas no son susceptibles (Strong et
al., 1998). Por ejemplo, cuando células NIH 3T3 resistentes a
reovirus se transforman con Ras activado o con Sos, una proteína
que activa a Ras, se potenció la infección por reovirus. De forma
similar, fibroblastos de ratón que son resistentes a una infección
por reovirus se hacen susceptibles después de su transfección con el
gen receptor del EGF o el oncogén v-erbB, que
activan ambos la vía de ras (Strong et al., 1993; Strong
et al., 1996). Por tanto, el reovirus puede infectar y
replicarse selectivamente en células con una vía de Ras
activada.
El oncogén ras es el responsable de un gran
porcentaje de tumores de mamífero. Se producen mutaciones
activadoras del propio gen ras en aproximadamente 30% de todos los
tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas
pancreáticos (90%), colorrectales esporádicos (50%) y pulmonares
(40%), así como en la leucemia mieloide (30%). La activación de
factores cadena arriba o cadena abajo del ras en la vía de ras
también está asociada a los tumores. Por ejemplo, la sobreexpresión
de HER2/Neu/ErbB2 o del receptor del factor del crecimiento
epidérmico (EGF) es común en el cáncer de mama
(25-30%), y la sobreexpresión del receptor del
factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del receptor
de EGF predomina en gliomas y glioblastomas
(40-50%). Se sabe que el receptor de EGF y el
receptor de PDGF activan ambos a ras tras su unión a sus respectivos
ligandos, y que v-erbB codifica un receptor
constitutivamente activado que carece de dominio extracelular.
Puesto que la alteración genética del
protooncogén ras o una alta actividad Ras es responsable de un gran
número de tumores humanos, la terapia de reovirus es una terapia
nueva y prometedora para estas afecciones (Coffey et al.,
1998). La terapia de reovirus es muy selectiva para células
tumorales asociadas a Ras y no infecta a las células normales. Esta
terapia tiene amplias aplicaciones y puede utilizarse en seres
humanos y en animales no humanos.
Para producir reovirus adecuados para la
administración clínica se necesitan métodos rápidos y eficaces para
producir reovirus en células cultivadas. Además, el método
tradicional para purificar virus a partir de células cultivadas es
tedioso y largo, y hace que el coste de la producción de virus sea
demasiado elevado. Por tanto, también se necesita un método
mejorado para la purificación de virus.
La presente invención se refiere a un método
mejorado para extraer y purificar virus a partir de cultivos
celulares que puede aplicarse a la producción de virus a pequeña y a
gran escala. El método implica una etapa de extracción sencilla en
la que un detergente se añade directamente al cultivo celular.
Después pueden retirarse los residuos celulares de la mezcla de
extracción, por ejemplo mediante filtración o centrifugación. La
suspensión de virus resultante puede concentrarse aún más y/o
enriquecerse mediante métodos cromatográficos. El virus preparado
según la presente invención puede utilizarse para cualquier fin,
incluyendo la purificación de proteínas víricas, la vacunación, la
infección de células hospedantes y la administración clínica.
Por consiguiente, un aspecto de la presente
invención proporciona un método para producir virus a partir de un
cultivo de células, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un cultivo de células que se
han infectado con el virus;
(b) extraer el virus de las células añadiendo un
detergente al cultivo e incubando durante un periodo de tiempo para
producir un lisado celular;
(c) retirar los residuos celulares;
(d) purificar el virus mediante una combinación
de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular;
y
(e) recoger el virus.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede utilizarse cualquier método para retirar
los residuos celulares (es decir, para aclarar el lisado celular)
en la etapa (c). El método es preferiblemente un método sencillo
basado en las diferencias de tamaño o de densidad entre el virus y
los otros constituyentes del lisado celular, tal como filtración o
centrifugación. Más preferiblemente, se emplea la filtración, en
particular la filtración discontinua. Una filtración discontinua
apropiada comprende un prefiltro que tiene un tamaño de poro mayor,
seguido de al menos otro filtro con un tamaño de poro menor que el
del prefiltro. En una realización preferida, los residuos celulares
se retiran mediante una filtración discontinua, que comprende:
(1) filtrar a través de un prefiltro que tiene
un tamaño de poro de 5 \muM u 8 \muM, y
(2) filtrar, después de la etapa (1), a través
de un filtro combinado que tiene unos tamaños de poro de 3 \muM
y
0,8 \muM.
0,8 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
El lisado celular puede tratarse opcionalmente
con benzonasa u otra enzima de ruptura del ADN para romper ADN
celular largo y viscoso.
Después de retirar los residuos celulares
mediante filtración, el filtrado puede concentrarse opcionalmente
para reducir el volumen de la suspensión vírica. Puede emplearse
cualquier método adecuado para la concentración vírica,
preferiblemente ultrafiltración o diafiltración, incluyendo
filtración de flujo tangencial. Los ejemplos de métodos incluyen el
sistema de placa y marco, y el sistema de fibras huecas. Más
preferiblemente se emplea el sistema de fibras huecas.
El presente método puede aplicarse a la
producción de cualquier virus, preferiblemente un virus sin
envuelta, y más preferiblemente un reovirus. El reovirus es
preferiblemente un reovirus de mamífero, más preferiblemente un
reovirus humano, aún más preferiblemente un reovirus de serotipo 3,
y lo más preferiblemente un reovirus de la cepa Dearing. El
reovirus puede ser un reovirus recombinante. El reovirus
recombinante puede generarse mediante coinfección de células, tales
como células de mamífero o células aviares, con diferentes subtipos
de reovirus. Los reovirus recombinantes pueden ser naturales o no
naturales. El reovirus recombinante puede proceder de dos o más
cepas de reovirus, en particular de dos o más cepas de reovirus
seleccionadas del grupo que consiste en la cepa Dearing, la cepa
Abney, la cepa Jones y la cepa Lang. El reovirus recombinante
también puede proceder de la reordenación de reovirus de diferentes
serotipos, como los seleccionados del grupo que consiste en
reovirus de serotipo 1, reovirus de serotipo 2 y reovirus de
serotipo 3. El reovirus recombinante pueden comprender variantes de
secuencias codificadoras de proteínas de la envuelta naturales o
secuencias codificadoras de proteínas de la envuelta mutadas.
El cultivo celular utilizado en la presente
invención puede comprende cualquier célula apropiada para la
producción del virus deseado. Para los reovirus, las células son
preferiblemente células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293) o
células derivadas de éstas, en particular células HEK 293 que se han
adaptado para su crecimiento en cultivos en suspensión.
El método comprende una etapa de cromatografía
de intercambio iónico, en la que el virus se enriquece mediante la
unión a una resina de intercambio iónico bajo condiciones de unión
apropiadas. El virus entonces se eluye del intercambiador iónico
utilizando una disolución de elución adecuada. La elección del
intercambiador iónico y de las condiciones de unión/elución variará
según el virus que se está purificando. Para los reovirus, un
intercambiador aniónico y un pH de aproximadamente
7,0-9,0 es lo más eficaz. El pH es preferiblemente
de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, y más preferiblemente
de aproximadamente 8,0.
El virus se purifica aún más utilizando una
cromatografía de exclusión molecular. De forma específica, puede
emplearse una combinación de cromatografía de intercambio iónico y
de exclusión molecular.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona un método para producir reovirus infecciosos, que
comprende:
(a) proporcionar un cultivo de células HEK 293
que se han infectado con el reovirus;
(b) extraer el virus de las células añadiendo
Triton X-100 al cultivo e incubando de
aproximadamente 25ºC a aproximadamente 37ºC;
(c) tratar la mezcla de la etapa (b) con una
enzima de ruptura del ADN;
(d) retirar los residuos celulares mediante
filtración;
(e) concentrar el filtrado mediante
ultrafiltración o diafiltración;
(f) purificar el reovirus mediante una
combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión
molecular; y
(g) recoger el virus.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un método
mejorado para extraer y purificar virus a partir de un cultivo
celular que puede aplicarse a la producción de virus a pequeña y a
gran escala. El método implica una sencilla etapa de extracción en
la que un detergente se añade directamente al cultivo celular.
Después se retiran los residuos celulares de la mezcla de
extracción, por ejemplo mediante filtración o centrifugación. La
suspensión de virus resultante puede concentrarse aún más y/o
enriquecerse mediante métodos cromatográficos. El virus preparado
según la presente invención puede utilizarse para cualquier fin,
incluyendo la purificación de proteínas víricas, la vacunación, la
infección de células hospedantes y la administración clínica.
Antes de describir con más detalle la invención
se definen los términos y las expresiones utilizados en esta
solicitud como se muestra a continuación, a menos que se indique lo
contrario.
Tal como se emplea en la presente, una
"infección vírica" se refiere a la entrada de un virus en una
célula y a la posterior replicación del virus en la célula.
Tal como se emplea en la presente, la
"multiplicidad de infección" se refiere a la proporción entre
el número de virus al número de células cuando se utiliza un virus
para que se ponga en contacto con células.
Tal como se emplea en la presente, la "lisis
celular" se refiere a la ruptura de la membrana celular de una
célula y a la posterior liberación de todo o parte del contenido de
la célula.
Tal como se emplea en la presente, las
"condiciones de cultivo" se refieren a las condiciones
utilizadas en un cultivo celular, que incluyen pero no se limitan a
la temperatura, el tipo de recipientes de cultivo, la humedad, la
concentración de CO_{2} o de cualquier otro gas utilizado en los
recipientes de cultivo, el tipo de medio de cultivo, la densidad
inicial de las células cultivadas, y si las células están infectadas
por un virus, la multiplicidad de infección inicial.
Tal como se emplea en la presente, un "cultivo
celular" o un "cultivo de células" significa una población
de células cultivadas tal como se encuentran en sus condiciones de
cultivo. En particular, un cultivo celular incluye las células y el
medio de cultivo. Las células que se han sedimentado no se
consideran un cultivo celular a menos que se coloquen de nuevo en
un medio de cultivo bajo las condiciones de cultivo.
Tal como se emplea en la presente, un virus que
está "asociado a una célula" se refiere a un virus que está
unido a una célula o atrapado en parte de una célula en la que se ha
producido el virus. Por tanto, un virus está asociado a una célula
antes de que se lise la célula hospedante. Cuando comienza la lisis
celular, un virus puede permanecer unido a la célula rota o
atrapado en parte de la célula rota y sigue estando asociado a una
célula. Sin embargo, cuando el virus se libera hacia el medio ya no
está asociado a una célula. Un "virus exento de células" es un
virus que no está asociado a una célula.
Tal como se emplea en la presente,
"extraer" un virus se refiere al acto de convertir un virus
asociado a una célula en un virus exento de células.
Tal como se emplea en la presente, un
"detergente" es una sustancia que tiene un extremo hidrófilo y
un extremo hidrófobo. El detergente es preferiblemente un compuesto
químico sintético, y más preferiblemente es un compuesto químico
sintético biodegradable. El detergente útil en la presente invención
potencia la ruptura de las membranas celulares para facilitar la
liberación del contenido de las células rotas.
Tal como se emplea en la presente,
"incubar" después de la adición de un detergente a un cultivo
celular se refiere al acto de permitir que el cultivo celular se
mezcle con el detergente durante un periodo de tiempo.
Tal como se emplea en la presente,
"recoger" el virus se refiere al acto de recoger el virus
producido a partir de un cultivo celular que se ha infectado
previamente con el virus. El virus se recoge, de forma típica,
separando los residuos celulares del virus y recolectando la
porción que comprende el virus. Opcionalmente, el virus puede
separarse aún más de las sustancias solubles, por ejemplo mediante
centrifugación.
Tal como se emplea en la presente, la
"temperatura ambiente" se refiere a una temperatura entre
aproximadamente 10ºC y aproximadamente 30ºC. La temperatura
ambiente es preferiblemente entre aproximadamente 15ºC y
aproximadamente 30ºC, más preferiblemente entre aproximadamente
20ºC y aproximadamente 25ºC, y lo más preferiblemente de
aproximadamente 25ºC.
Tal como se emplea en la presente, un "efecto
citopático" viene indicado porque las células se hinchan y toman
un aspecto granular y las agrupaciones celulares se rompen. Las
células que muestran un efecto citopático también captan el tinte
de tinción en un recuente de células viables.
Tal como se emplea en la presente, las
"células adherentes" se refieren a células que se adhieren a
los recipientes de cultivo en un cultivo celular. Los ejemplos de
células adherentes incluyen células en monocapa, que son células
que forman una única capa de células sobre la superficie de un
recipiente de cultivo. Las "células en suspensión" o las
"células suspendidas" se refieren a células que no se adhieren
a los recipientes de cultivo en un cultivo celular. Las células en
suspensión pueden cultivarse en un "cultivo agitado", que es un
cultivo en que el medio de cultivo se agita continuamente durante
el proceso de cultivo.
Tal como se emplea en la presente, una células
se "rompe" cuando la membrana celular se rompe y al menos una
parte del contenido celular se libera de la célula. Una célula puede
romperse, por ejemplo, mediante congelación - descongelación,
mediante sonicación o mediante tratamientos con detergentes.
Tal como se emplea en la presente, la
"viabilidad de las células" o el "porcentaje de células que
siguen siendo viables" es el porcentaje de células que no
muestran un efecto citopático en una población.
Tal como se emplea en la presente, un "virus
sin envuelta" es un virus que no tiene una envuelta. Por ejemplo,
un virus sin envuelta puede ser cualquier virus que pertenezca a la
familia Adenoviridae (por ejemplo, adenovirus), Picornaviridae (por
ejemplo, el virus de la polio), Reoviridae (por ejemplo, reovirus),
Papovarviridae (por ejemplo, el virus del papiloma), Parvoviridae
(por ejemplo, el virus Kilham de la rata) o Iridoviridae (por
ejemplo, virus iridiscente de la típula).
Tal como se emplea en la presente, un
"reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el
género de los reovirus, natural, modificado o recombinante. Los
reovirus son virus con un genoma de ARN bicatenario segmentado. Los
viriones tienen un diámetro de 60-80 nm y poseen dos
cubiertas de cápsida concéntricas, cada una de las cuales es
icosahédrica. El genoma consiste en ARN bicatenario en
10-12 segmentos discretos con un tamaño total del
genoma de 16-27 kpb. Los segmentos de ARN
individuales varían en tamaño. Se han recuperado tres tipos de
reovirus diferenciados pero relacionados procedentes de muchas
especies. Los tres tipos comparten un antígeno común de fijación
del complemento.
Los reovirus humanos consisten en tres
serotipos: el tipo 1 (cepa Lang o T1L), el tipo 2 (cepa Jones, T2J)
y el tipo tres (cepa Dearing o cepa Abney, T3D). Los tres serotipos
pueden identificarse con facilidad basándose en ensayos de
neutralización e inhibición de hemaglutinina (véase, por ejemplo,
Fields, B.N. et al., 1996).
El reovirus puede ser natural o puede estar
modificado. El reovirus es "natural" cuando puede aislarse a
partir de una fuente en la naturaleza y no ha sido modificado
intencionadamente en el laboratorio por seres humanos. Por ejemplo,
el reovirus puede prodecer de una "fuente de campo", es decir,
de un ser humano que ha sido infectado por el reovirus.
Los reovirus pueden modificarse pero pueden
mantener la capacidad de infectar líticamente a una célula de
mamífero que tenga una vía de ras activa. El reovirus puede ser
química o bioquímicamente pretratado (por ejemplo, mediante el
tratamiento con una proteasa, tal como quimotripsina o tripsina)
antes de la administración a las células en proliferación. El
pretratamiento con una proteasa elimina la envuelta externa o la
cápsida de los virus y puede aumentar la infectividad del virus. El
reovirus puede revestirse sobre un liposoma o una micela (Chandron
y Nibert, 1998). Por ejemplo, el virión puede tratarse con
quimotripsina en presencia de concentraciones formadoras de micelas
de detergentes de sulfato de alquilo para generar una nueva
partícula infecciosa de subvirión.
El reovirus puede ser un reovirus recombinante
que surge de la recombinación/reordenación de segmentos genómicos
procedentes de dos o más reovirus genéticamente diferenciados. La
recombinación/reordenación de segmentos genómicos de reovirus puede
producirse en la naturaleza tras la infección de un organismo
hospedante por al menos dos reovirus genéticamente diferenciados.
También pueden generarse viriones recombinantes en un cultivo
celular, por ejemplo mediante coinfección de células hospedantes
permisivas con reovirus genéticamente diferenciados (Nibert et
al., 1995).
Por consiguiente, la invención contempla los
reovirus recombinantes que surgen de la reordenación de segmentos
del genoma procedentes de dos o más reovirus genéticamente
diferenciados que incluyen, pero no se limitan a reovirus humanos,
tales como el tipo 1 (por ejemplo, cepa Lang), tipo 2 (por ejemplo,
cepa Jones) y tipo 3 (por ejemplo, cepa Dearing o cepa Abney),
reovirus de mamíferos no humanos, o reovirus aviares. La invención
contempla también reovirus recombinantes que surgen de la
reordenación de segmentos del genoma procedentes de dos o más
reovirus genéticamente diferenciados, en los que al menos un virus
de origen está modificado genéticamente, comprende uno o más
segmentos genómicos sintetizados de modo químico, se ha tratado con
mutágenos químicos o físicos, o en sí mismo es el resultado de un
acontecimiento de recombinación. La invención contempla también el
reovirus recombinante que ha sufrido recombinación en presencia de
mutágenos químicos que incluyen, pero no se limitan a sulfato de
dimetilo y bromuro de etidio, o mutágenos físicos que incluyen, pero
no se limitan a luz ultravioleta y otras formas de radiación.
La invención contempla además reovirus
recombinantes que comprenden deleciones o duplicaciones en uno o más
segmentos del genoma, que comprenden información genética adicional
como resultado de una recombinación con el genoma de una célula
hospedante, o que comprenden genes sintéticos.
El reovirus puede modificarse mediante la
incorporación de proteínas de la envuelta mutadas tales como, por
ejemplo \sigma1, en la cápsida externa del virión. Las proteínas
pueden mutarse mediante sustitución, inserción o deleción. La
sustitución incluye la inserción de diferentes aminoácidos en lugar
de los aminoácidos nativos. Las inserciones incluyen la inserción
de otros restos aminoácidos en la proteína en uno o más
emplazamientos. Las deleciones incluyen deleciones de uno o más
restos aminoácidos en la proteína. Estas mutaciones pueden
generarse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la
mutagénesis dirigida específica de sitio oligonucleotídico del gen
que codifica una de las proteínas de la envuelta puede producir la
generación de la proteína de la envuelta mutante deseada. La
expresión de la proteína mutada en células de mamífero infectadas
por reovirus in vitro, tales como células COS1, da como
resultado la incorporación de la proteína mutada en la partícula
del virión del reovirus (Turner y Duncan, 1992; Duncan et
al., 1991; Mah et al., 1990).
Tal como se emplea en la presente, "células
HEK 293" se refiere a la línea celular de riñón embrionario
humano denominada 293 (nº de ATCC CRL-1573) o sus
derivados. Por ejemplo, las células 293/SF (nº de ATCC
CRL-1573.1) son células HEK 293 que se han adaptado
para crecer en un medio exento de suero. También se contemplan en
esta invención las células HEK 293 adaptadas para crecer en otras
condiciones de cultivo, o cualquier tipo de células HEK 293 o sus
derivados que se transforman con ADN exógeno, con la condición de
que esta transformación no perjudique la capacidad de las células
para sostener una producción eficaz de reovirus según se describe
en esta invención.
Tal como se emplea en la presente,
"administración clínica" de una sustancia se refiere a poner en
contacto cualquier parte del cuerpo de un organismo vivo con la
sustancia para mejorar o mantener las condiciones de salud del
organismo.
Los inventores han desarrollado previamente un
método para cultivar reovirus en células HEK 293 (solicitud de
patente de EEUU nº de publicación 20020037576). Los reovirus se
replican en células HEK 293 para producir una alta valoración de
virus en las células poco tiempo después de la infección vírica
proporcionando, con ello, un método sencillo y eficaz para producir
reovirus. Además, las células HEK 293 se han adaptado para que
crezcan en suspensión, lo cual hace que puedan cultivarse en grandes
cantidades, y los inventores han desarrollado un método de
producción a gran escala. Para aislar los reovirus del cultivo en
suspensión, los inventores inicialmente siguieron métodos
tradicionales para extraer y para purificar partículas víricas.
Brevemente, las células se rompieron mediante
congelación-descongelación y se extrajeron con
Freon® tres veces. Las partículas víricas entonces se purificaron
con un gradiente de CsCl y se sometieron a una ultracentrifugación.
Sin embargo, este protocolo resultaba demasiado tedioso y largo para
la producción de virus a gran escala.
Por tanto, los inventores desarrollaron un
método simplificado para extraer los reovirus. Se descubrió que
incubando el cultivo de células HEK 293 con un detergente durante un
corto periodo de tiempo se liberaban altos niveles de reovirus
infecciosos hacia el extracto. Los virus entonces pueden separarse
de los residuos celulares con un sencillo método de separación
basado en las diferencias de tamaño o de densidad, tal como
filtración, diafiltración o exclusión molecular, y el virus
resultante puede utilizarse para la terapia con reovirus. El
reovirus producido según la presente invención es adecuado para su
administración a seres humanos, y este protocolo resulta coherente
con la recomendación de la FDA para romper células en presencia de
un detergente.
Los inventores ensayaron cuatro detergentes en
un experimento preliminar, los detergentes no iónicos Triton
X-100, NP-40 y
Tween-20, así como el detergente iónico desoxicolato
de sodio. Los cuatro detergentes fueron capaces de lisar las
células y de liberar las partículas víricas infecciosas por encima
del nivel de fondo, y el Triton X-100 fue el más
eficaz. Se contempla que otros detergentes, en particular aquellos
que se emplean habitualmente para romper células, puedan utilizarse
también en la presente invención. Los ejemplos de estos otros
detergentes incluye los otros detergentes Triton, los otros
detergentes Tween (por ejemplo, Tween-80),
dodecilsulfato de sodio, dodecilsulfato de litio, y cloruro de
dodeciltrimetilamonio.
Los resultados también indican que la extracción
con detergentes puede ser más eficaz que la
congelación-descongelación, que es el procedimiento
convencional para la extracción de virus. Además, se ha indicado que
para extraer reovirus aviares de células Vero, en las que el
reovirus está fuertemente asociados a las células, el agua
desionizada destilada resulta más eficaz que la
congelación-descongelación, la extracción con Freon®
o el tratamiento con tripsina (Drastini et al., 1992). La
presente invención proporciona un enfoque más rápido y conveniente,
aunque eficaz, porque no es necesario sedimentar y después
resuspender las células como se requiere en el método del agua
destilada.
Se contempla que puedan utilizarse altas
concentraciones de sales, tales como cloruro de guanidina, en la
presente invención para sustituir a los detergentes. Sin embargo, es
preferible utilizar detergentes en lugar de altas concentraciones
de sales.
Por tanto, la presente invención proporciona un
método rápido y sencillo para extraer virus de un cultivo celular.
El detergente puede añadirse directamente al cultivo en suspensión o
al medio de las células adherentes. En cualquiera de estos casos,
no es necesario que el medio se retire primero. Además, no son
necesarios otros medios para romper las células o para extraer los
virus, tales como congelación-descongelación o
sonicación.
Una característica importante de la presente
invención es que el procedimiento de extracción puede realizarse a
la temperatura ambiente o por encima de ésta. De modo tradicional,
la extracción y la purificación de virus se realiza a baja
temperatura, de forma típica a 0-4ºC, para conservar
las estructuras y las funciones de las proteínas. Por la misma
razón también se incluyen habitualmente inhibidores de proteasas en
las disoluciones de extracción. Por tanto, resulta sorprendente que
el presente protocolo pueda realizarse a una temperatura mayor sin
inhibidores de proteasas. De hecho, una temperatura tan elevada como
37ºC produjo aproximadamente la misma cantidad de virus infecciosos
que a 25ºC. Por consiguiente, la extracción de los virus puede
realizarse añadiendo un detergente directamente al cultivo celular
y después agitando el cultivo para liberar los virus sin tener que
cambiar de temperatura. Como alternativa, puesto que no es necesario
mantener una temperatura constante para la extracción de virus
según la presente invención, el procedimiento puede realizarse a
temperatura ambiente incluso aunque la temperatura ambiente puede
variar de un lugar a otro o puede variar con el tiempo en el mismo
lugar.
Después de la extracción, el virus se purifica
basándose, por ejemplo, en las diferencias de tamaño o de densidad
entre los virus y los otros constituyentes del extracto. En
particular puede emplearse una filtración o una centrifugación para
eliminar los residuos celulares del virus. Para optimizar las
condiciones de filtración, los inventores ensayaron el efecto de
diversos filtros en presencia de varios detergentes de extracción
diferentes (ejemplo 1). Un protocolo de filtración discontinuo
demostró ser lo más eficaz. Por tanto, se emplea primero un
prefiltro que tiene un tamaño de poro relativamente grande (por
ejemplo, 5 \muM u 8 \muM) para retirar los trozos grandes de la
mezcla de extracción, seguido de filtros con unos tamaños de poro
menores, tal como una unidad de filtros combinados que contenga un
filtro de 3 \muM y un filtro de 0,8 \muM. En ausencia de
prefiltros, la mezcla de extracción obturaría el filtro con rapidez
gastando, con ello, material y tiempo.
Basándose en el volumen recogido después de la
filtración, como se muestra en el ejemplo 1, es preferible utilizar
Triton X-100 al 1% para la extracción de los virus.
Además, los filtros de membrana de acetato de celulosa son mejores
que los filtros de membrana de fibra de vidrio, porque el filtro de
membrana de acetato de celulosa permite filtrar un volumen mayor de
mezcla de extracción, haciendo que sea más adecuado para una
producción a gran escala.
Dependiendo del objetivo de la producción de
virus, puede resultar deseable concentrar el filtrado que contiene
los virus. En el ejemplo 2 se muestra una etapa de concentración que
emplea ultrafiltración/diafiltración. Se ensayaron dos sistemas de
ultrafiltración/diafiltración, el módulo de placa y marco de Pall
Filtron, y el cartucho de fibras huecas de A/G Technology. Los
resultados demuestran que los dos sistemas son comparables en su
velocidad de funcionamiento o en su grado de pérdida de volumen,
pero el cartucho de fibras huecas es más fácil de manipular.
El virus se purifica basándose en su carga sobre
la superficie. Puesto que diferentes virus tienen diferentes
proteínas de la superficie, las cuales dictan su carga sobre la
superficie a cualquier pH dado, las condiciones apropiadas para la
purificación deben decidirse para cada virus. El ejemplo 3 ilustra
la determinación de la condiciones de intercambió iónico óptimas
para los reovirus. Así, se utilizaron columnas de intercambio
iónico que contenían diferentes resinas a diferente pH para
purificar una preparación de reovirus que se había extraído,
filtrado y concentrado como se describió anteriormente. Los
resultados indican que una columna aniónica débil que contenía ANX
Sepharose a pH 7,0-8,5 era lo más eficaz. El pH es
más preferiblemente de aproximadamente 7,5 u 8,0, y es lo más
preferiblemente de aproximadamente 8,0.
Además, el virus se purifica basándose en las
diferencias de tamaño con una cromatografía de exclusión molecular.
Para los reovirus, una combinación de cromatografía de intercambio
iónico y de exclusión molecular es particularmente eficaz.
Adicionalmente, también pueden utilizarse otros métodos
cromatográficos, tales como los basados en la afinidad o la
interacción hidrófoba, cuando resulte apropiado. Por tanto, puede
adoptarse una cromatografía en columna como alternativa eficaz a
una ultracentrifugación en gradiente de densidad de CsCl para lograr
un buen rendimiento, pureza y adaptación a escala.
El presente método puede aplicarse a la
producción de reovirus utilizando células distintas de las células
HEK 293 incluyendo, pero sin limitarse a células L929 de ratón,
células Vero y células de ovario de hámster chino. Se contempla que
el presente método pueda aplicarse también a otros virus, en
particular otros virus sin envuelta. Los expertos en la técnica
pueden determinar las condiciones apropiadas para la purificación
de otros virus basándose en la presente descripción. Los virus que
pueden prepararse en el presente método incluyen, pero no se
limitan a los virus de las familias Myoviridae, Siphoviridae,
Podpviridae, Teciviridae, Corticoviridae, Plasmaviridae,
Lipothrixviridae, Fuselloviridae, Poxviridae, Iridoviridae,
Phycodnaviridae, Baculoviridae, Herpesviridae, Adnoviridae,
Papovaviridae, Polydnaviridae, Inoviridae, Microviridae,
Geminiviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Hepadnaviridae,
Retroviridae, Cictoviridae, Reoviridae, Birnaviridae,
Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae,
Bunyaviridae, Arenaviridae, Leviviridae, Picornaviridae,
Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Caliciviridae,
Astroviridae, Nodaviridae, Tetraviridae, Tombusviridae,
Coronaviridae, Glaviviridae, Togaviridae y Barnaviridae.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente memoria descriptiva describe
composiciones que comprenden los virus preparados según los métodos
de la presente invención. Estas composiciones pueden utilizarse para
el aislamiento y la caracterización de proteínas víricas, la
producción de vacunas o, cuando la composición contiene virus
infecciosos, como reservorios de virus, o en la administración
clínica. Sin embargo, las composiciones no son un tema de la
invención.
Para los objetivos de la administración clínica,
la composición normalmente se mezcla con un excipiente, se diluye
con un excipiente, o se encierra dentro de un vehículo que puede
estar en forma de una cápsula, un sobre, un papel u otro recipiente
(documento WO99/08692A1) como composición farmacéutica. Cuando el
excipiente farmacéuticamente aceptable actúa como diluyente puede
ser un material sólido, semisólido o líquido, que actúa como
vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. Por tanto,
las composiciones pueden estar en forma de comprimidos, píldoras,
polvos, pastillas, sobres, sellos, elixires, suspensiones,
emulsiones, disoluciones, jarabes, aerosoles (como un sólido o en
un medio líquido), ungüentos que contienen, por ejemplo hasta 10%
en peso del compuesto activo, cápsulas de gelatina blanda y dura,
supositorios, disoluciones inyectables estériles, y polvos
envasados
estériles.
estériles.
\newpage
Algunos ejemplos de excipientes adecuados
incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones,
goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina,
silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona,
celulosa, agua estéril, disolución salina estéril, jarabe y
metilcelulosa. Las formulaciones también pueden incluir agentes
lubricantes, como talco, estearato de magnesio y aceite mineral;
agentes humectantes; agentes emulsionantes y suspensores; agentes
conservantes, como metil- y propilhidroxibenzoatos; agentes
edulcorantes; y agentes aromatizantes. Las composiciones de la
invención pueden formularse para proporcionar una liberación
rápida, sostenida o retrasada del ingrediente activo después de su
administración a un paciente empleando procedimientos conocidos en
la técnica.
La vía mediante la cual se administra el
reovirus, así como la formulación, el portador o el vehículo,
dependerá del emplazamiento así como del tipo de células diana.
Puede emplearse una amplia variedad de vías de administración. Por
ejemplo, para un neoplasma sólido que sea accesible, el reovirus
puede administrarse mediante inyección directamente al neoplasma.
Para un neoplasma hematopoyético, por ejemplo, el reovirus puede
administrarse por vía intravenosa o intravascular. Para los
neoplasmas que no sean fácilmente accesibles dentro del cuerpo,
como metástasis, el reovirus se administra de tal manera que pueda
transportarse sistémicamente a través del cuerpo del mamífero y, de
ese modo, alcance el neoplasma (por ejemplo, por vía intravenosa o
intramuscular). Como alternativa, el reovirus puede administrarse
directamente a un único neoplasma sólido, desde donde se transporta
sistémicamente a través del cuerpo hasta las metástasis. El reovirus
también puede administrarse por vía subcutánea, intraperitoneal,
intratecal (por ejemplo, para un tumor cerebral), tópica (por
ejemplo, para un melanoma), oral (por ejemplo, para un neoplasma
oral o esofágico), rectal (por ejemplo, para un neoplasma
colorrectal), vaginal (por ejemplo, para un neoplasma cervical o
vaginal), nasal o mediante un pulverizado para inhalación (por
ejemplo, para un neoplasma pulmonar). Preferiblemente, el reovirus
se administra mediante inyección.
Las formas líquidas en que las composiciones
farmacéuticas descritas en la presente invención pueden incorporarse
para la administración oral o mediante inyección incluyen
disoluciones acuosas, jarabes aromatizados de forma adecuada,
suspensiones acuosas u oleosas, y emulsiones aromatizadas con
aceites comestibles, tal como aceite de maíz, aceite de algodonero,
aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, así como
elixires y vehículos farmacéuticos similares.
Para preparar composiciones sólidas, tales como
comprimidos, el principal ingrediente activo/reovirus se mezcla con
un excipiente farmacéutico para formar una preformulación sólida que
contenga una mezcla homogénea de un compuesto de la presente
invención. Cuando se indica que estas composiciones de
preformulación son homogéneas significa que el ingrediente activo
está disperso de manera uniforme a través de la composición, de
manera que la composición puede dividirse con facilidad en formas
de dosificación unitaria igualmente eficaces, como comprimidos,
píldoras y cápsulas.
Los comprimidos o las píldoras puede estar
revestidos o pueden componerse de otra forma para proporcionar una
forma de dosificación que presente la ventaja de una acción
prolongada. Por ejemplo, el comprimido o la píldora puede
comprender un componente de disoficación interna y un componente de
dosificación externa, estando este último en forma de una envuelta
sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una
capa entérica que actúa para resistir a la disgregación en el
estómago y permite que el componente interno pase intacto hacia el
duodeno o pueda liberarse con retraso. Puede utilizarse una
diversidad de materiales para estos revestimientos o capas
entéricas, y estos materiales incluyen una serie de ácidos
poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales como
goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.
Las composiciones para inhalación o insuflación
incluyen disoluciones y suspensiones en disolventes
farmacéuticamente aceptables, acuosos u orgánicos, o sus mezclas, y
polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener
excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se describe
en la presente. Preferiblemente, las composiciones se administran
por la vía respiratoria nasal u oral para un efecto local o
sistémico. Las composiciones preferiblemente en disolventes
farmacéuticamente aceptables pueden nebulizarse con el uso de gases
inertes. Las disoluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente
del dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador puede
unirse a una mascarilla o a una máquina respiradora de presión
positiva intermitente. Las composiciones en disolución, suspensión
o polvo pueden administrarse, preferiblemente por vía oral o nasal,
desde dispositivos que administren la formulación de una manera
apropiada.
Otra formulación preferida empleada para las
composiciones descritas en la presente invención emplea dispositivos
de administración transdérmica ("parches"). Estos parches
transdérmicos pueden utilizarse para proporcionar una infusión
continua o discontinua del reovirus de la presente invención en
cantidades controladas. La construcción y el uso de parches
transdérmicos para la administración de agentes farmacéuticos son
muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU
5.032.525, incorporada en la presente como referencia. Estos
parches pueden construirse para la administración continua, pulsátil
o a petición de agentes farmacéuticos.
Otras formulaciones adecuadas para las
composiciones descritas en la presente invención pueden encontrarse
en Remington's Pharmaceutical Sciences.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar
la invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la
presente invención de ninguna manera.
En los ejemplos a continuación, las siguientes
abreviaturas tienen los siguientes significados. Las abreviaturas
no definidas tienen el significado que se acepta de modo
general.
CI = intervalo de confianza
TCID_{50} = dosis infecciosa del cultivo de
tejido_{50}
\muM = micromolar
mM = milimolar
M = molar
ml = mililitro
\mul = microlitro
mg = miligramo
\mug = microgramo
g/l = gramos por litro
rpm = revoluciones por minuto
FBS = suero bovino fetal
DTT = ditiotrietol
NP-40 = Nonidet
P-40 (octilfenoxipolietoxietanol)
SDS = dodecilsulfato de sodio
PBS = disolución salina tamponada con
fosfato
\beta-ME =
\beta-mercaptoetanol
MOI o m.o.i. = multiplicidad de infección
PFU = unidades formadoras de placa
h = hora
ºC = grados Celsius
Las células de riñón embrionario humano 293 (HEK
293) y las células de fibroblastos de ratón L-929
fueron suministradas por el fabricante BioReliance Corporation
(Rockville, Maryland). Las células HEK 293 se cultivaron en un
medio de cultivo que contenía 10% de suero de caballo inactivado por
calor y 90% de la siguiente mezcla: medio esencial mínimo de Eagle
con L-glutamina 2 mM y disolución salina equilibrada
de Earle ajustada para que contuviese bicarbonato de sodio 1,5 g/l,
aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y piruvato de sodio 1,0 mM. Las
células de ratón L-929 se propagaron en un medio de
cultivo que contenía 10% de FBS y 90% de la siguiente mezcla: medio
esencial mínimo de Eagle con L-glutamina 2 mM y
disolución salina equilibrada de Earle ajustada para que contuviese
bicarbonato de sodio 1,5 g/l, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y
piruvato de sodio 1,0 mM.
Las células 293/SF se cultivaron en medio exento
de suero 293 (Life Technologies, Rockville, Maryland) suplementado
con L-glutamina 4 mM a 36ºC\pm2ºC, 6%\pm2% de
CO_{2}, y 80%\pm5% de humedad relativa en matraces de agitación
a una velocidad del impulsor de 35-40 rpm.
La cepa Dearing del reovirus de serotipo 3
utilizada en estos estudios primero se propagó en cultivos en
suspensión de células L-292 purificadas según Smith
(Smith et al., 1969) con la excepción de que el
\beta-mercaptoetanol (\beta-ME)
se omitió del tampón de extracción. La proporción de partículas/PFU
para los reovirus purificados fue, de forma típica, de 100/1. Se
determinaron las valoraciones víricas mediante valoración de placas
de células L-929 y se expresaron como
log_{10}TICD_{50}/ml. Entonces se produjeron los virus a gran
escala en células 293/SF.
Las células 293/SF se cultivaron hasta
10^{6}/ml y se infectaron con el reovirus. Se dejó que el cultivo
creciese hasta que el color del medio cambió de rojo a naranja, o
hasta que la viabilidad de las células cayó hasta el nivel deseado,
según se evidencia por un recuento de células viables. Los recuentos
de células viables pueden realizarse bajo el microscopio para las
células que no muestren un efecto citopático, lo cual viene
indicado porque las células se hinchan y toman un aspecto granular y
las agrupaciones celulares se rompen. Los recuentos de células
viables también pueden realizarse mediante una tinción viable tal
como se utiliza habitualmente en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se alcanza el nivel de viabilidad celular
deseado, las células se sedimentan en una centrífuga y se
resuspenden en Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 250 mM y Triton
X-100 al 0,1%. Las células entonces se lisan
mediante congelación-descongelación y se mantienen
en hielo durante 20-40 minutos con agitación en
vórtice periódica para mezclar y lisar las células. La suspensión
se extrajo con un volumen igual de Freon®
(1,1,2-tricloro-1,1,2-trifluoroetano)
preenfriado, mediante agitación en vórtice durante 10 minutos,
seguido de una centrifugación a 2500 rpm durante 10 minutos a 4ºC
para separar las diferentes fases. La fase acuosa (superior) se
retiró y se reextrajo dos veces como se describió anteriormente, y
el virus se sedimentó mediante ultracentrifugación a 25.000 rpm
durante una hora a 4ºC.
El sedimento se resuspendió en PBS y el virus se
purificó mediante un gradiente discontinuo de cloruro de cesio. El
gradiente contenía dos capas de disoluciones de CsCl (1,20 g/ml y
1,4 g/ml, respectivamente) preparadas en Tris 10 mM (pH 7,4). La
suspensión vírica se cargó sobre la parte superior del gradiente y
se centrifugó en un rotor SW 28.1 a 26.000 rpm durante 2 horas a
4ºC. La banda vírica (la banda inferior de las dos bandas, porque
la banda superior contiene cápsidas vacías) se recolectó y se
dializó contra PBS estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de lisar las células con un detergente
se añadió una disolución de MgCl_{2} 50 mM al lisado bruto hasta
una concentración final de MgCl_{2} 1 mM. Entonces se añadió
benzonasa (250.000 unidades, EM Industries, nº de catálogo
1016979M) hasta aproximadamente 10 unidades/ml. El lisado se agitó
en un incubador a 36ºC durante una hora.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El objetivo de este ejemplo es desarrollar un
procedimiento de clarificación adecuado que sea compatible con el
protocolo que utiliza detergentes para lisar células y que sea
susceptible al ajuste a escala y a la fabricación futuros. En este
ejemplo, el lisado se filtró a través de un filtro de cápsula de 3
\mum/0,8 \mum, o se hace pasar a través de una combinación de
un prefiltro (5 \mum u 8 \mum) y después a través de un filtro
de cápsula de 3 \mum/0,8 \mum. Todos los filtros utilizados en
este estudio tenían una superficie específica de 13,95 cm^{2}.
Basándose en el volumen filtrado a través de la membrana de 13,95
cm^{2} se determinó la capacidad de las membranas para una
filtración a gran escala. Además se comparó la eficacia de
filtración para dos materiales de membrana diferentes, la membrana
de acetato de celulosa y la membrana de fibra de vidrio, para el
filtro de cápsula de 3 \mum/0,8 \mum.
Se ensayaron tres detergentes. Las células que
portaban los reovirus se dividieron en partes iguales en tres
botellas estériles de 1 l rotuladas con los tres agentes de lisis
diferentes que se van a ensayar: Triton X-100 al
1%, Triton X-100 al 0,3%, y Na-DOC
al 0,1%. Se añadió un volumen de 92 ml y 82 ml de Triton
X-100 al 10% a las botellas 1 y 2, de forma que las
concentraciones de trabajo en estas botellas fueron de Triton
X-10 al 1% y al 0,3%, respectivamente. Se añadió un
volumen de 9,2 ml de Na-DOC al 10% a la tercera
botella hasta una concentración de trabajo de 0,1%. Las tres
botellas se colocaron en una placa de agitación y se agitaron a
160\pm20 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se tomó
una muestra post-lisis para cada condición de
lisis para el análisis de las valoraciones.
Se añadieron aproximadamente 20 ml de MgCl_{2}
50 mM al lisado bruto en cada una de las botellas hasta una
concentración de trabajo de aproximadamente MgCl_{2} 1 mM. A esto
le siguió la adición de 40 \mul de benzonasa (250.000
unidades/ml) hasta una concentración de trabajo de aproximadamente
10 unidades/ml. El lisado bruto se agitó en el ajuste 5 en un
incubador a 36ºC durante una hora. Estas etapas se incluyeron para
eliminar el ADN de la célula hospedante y para reducir la
viscosidad del lisado favoreciendo, con ello, la facilidad del
procesamiento
posterior.
posterior.
Se calibró una bomba
Watson-Marlow (505U) para relacionar el caudal con
la velocidad de la bomba. Según las sugerencias del vendedor, se
empleó una velocidad de la bomba de 5 rpm (caudal de 40 ml/min) a lo
largo del estudio de clarificación.
\newpage
El lisado procedente de cada condición de
tratamiento se hizo pasar a través de uno de los siguientes
filtros:
1) un filtro de cápsula de 3 \mum/0,8
\mum;
2) un prefiltro con un tamaño de 5 \mum
\rightarrow un filtro de cápsula de 3 \mum/0,8 \mum
conectados en serie; y
3) un prefiltro con un tamaño de poro de la
membrana de 8 \mum \rightarrow un filtro de cápsula de 3
\mum/0,8 \mum conectados en serie.
Los filtros de cápsula de 3 \mum/0,8 \mum
tienen una construcción de doble capa de membranas heterogéneas que
permite una capacidad de carga con una gran cantidad de suciedad y
un mayor capacidad de procesamiento. El primer filtro tiene un
tamaño de poro mayor (3 \mum) que el segundo filtro (0,8 \mum).
Los prefiltros combinan múltiples capas de material de filtro de
profundidad de polipropileno no tejido trenzado progresivamente más
fino. Todos los filtros utilizados en este estudio tenían una
superficie específica de 13,95 cm^{2}. Se ensayaron dos
materiales de membranas, a saber, el acetato de celulosa y la fibra
de vidrio, para los filtros de cápsula de 3 \mum/0,8 \mum.
Se determinó la mejor combinación de agente de
lisis y de condiciones del filtro basándose en los valores de la
valoración y en los volúmenes que pasan a través del filtro. Se
controló la presión de goteo a través de las membranas para
determinar si se ensuciaban las membranas. La indicación de la
suciedad de las membranas es una presión de goteo de 172,37 kPa,
por encima de ésta el filtro se puede romper. Cuando se utilizó un
único filtro de cápsula de 3 \mum/0,8 \mum, no más de 35 ml
pasaron a través de estos filtros de cápsula antes de que la
membrana se ensuciase. Los tamaños de membrana de 3/0,8 \mum se
ensuciaron en 5 minutos, lo cual sugiere que el uso de un prefiltro
es necesario para eliminar la obturación de las membranas por los
residuos celulares. El uso de un prefiltro de 5 \mum antes del
filtro de cápsula de 3/0,8 \mum aumentó significativamente la
cantidad de filtrado obtenida, mientras que la filtración a través
de un prefiltro de 8 \mum, seguido de la filtración en la cápsula
de 3 \mum/0,8 \mum, produjo la mayor capacidad de membrana en
términos del volumen que pasa a través de los filtros (se recogió
una media de 200 ml por 13,95 cm^{2} de superficie específica del
filtro). El Triton X-100 al 1% produjo los mejores
resultados comparado con las otras dos condiciones de lisis.
Los resultados también demuestran que el
material de membrana de acetato de celulosa actúa mejor que la
membrana de fibra de vidrio, basándose en el volumen filtrado a
través de estas membranas. No se observó una pérdida significativa
de infectividad en ninguna etapa de la filtración cuando se compara
con la infectividad de la masa del cultivo (el cultivo celular
antes de la lisis y de la filtración). Basándose en los resultados
de este estudio, una masa de cultivo de 20 l requeriría una
superficie específica de la membrana de 1395 cm^{2} para su
filtración.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para seleccionar un sistema adecuado para
concentrar y diafiltrar el lisado aclarado, se comparó el módulo de
placa y marco de Pall Filtron (www.pall.com) y el cartucho de fibras
huecas de A/G Technology (www.agtech.com). Se empleó el mismo
material de membrana de polietersulfona en ambos sistemas. El
criterio para la selección fue la facilidad de uso, el grado de
concentración logrado y la valoración vírica del producto.
El módulo de placa y marco utilizado en este
estudio fue el sistema MINIM de Pall, que es una unidad de mesa de
laboratorio, y el LV Centramate, que contiene dos canales de barrido
suspendidos de membranas de ultrafiltración de 300 kD (186 cm^{2}
cada una). Antes de concentrar el lisado aclarado, el aparato se
enjuagó con 2 l de agua de ósmosis inversa (RO) (calidad USP) para
eliminar el gel de conservación. Los módulos se sanearon con 2 l de
NaOH 0,1 N calentado. El sistema entonces se drenó, se enjuagó con 2
l de agua RO y se acondicionó con el medio de crecimiento para el
virus. El sistema completo se drenó y se determinó que el volumen de
contención del sistema y de los tubos era de 6 ml.
El cartucho de fibras huecas ensayado en este
estudio fue un sistema de mesa QuixStand de A/G Technology, con un
cartucho de ultrafiltración de columna de tamaño 4 M (superficie
específica de 650 cm^{2}). Al igual que con el módulo de placa y
marco, el aparato primero se enjuagó con 2 l de agua de ósmosis
inversa (RO) (calidad USP) para enjuagar el gel de conservación.
Los módulos se sanearon con 2 l NaOH 0,1 N calentado. El sistema
entonces se drenó, se enjuagó con 2 l de agua RO y se acondicionó
enjuagando con el medio de crecimiento para el virus. Se utilizó un
caudal de entrada constante de 600 ml/min a lo largo del
experimento.
Para ambos sistemas, el lisado aclarado se
recirculó hasta que el material se concentró hasta aproximadamente
250 ml (concentración 10x), y se tomó una muestra para el análisis
de la valoración (concentración post-I). El
concentrado (retenido) se diafiltró contra 1 l (5 volúmenes de
diafiltración) de tampón de diafiltración (Tris 20 mM + NaCl 0,2 M
+ MgCl_{2} 1 mM, pH 8,0\pm0,1) y se tomó otra muestra para el
análisis de la valoración (post-diafiltración). El
retenido se concentró aún más hasta aproximadamente 120 ml. Después
de la concentración final, el producto se drenó del sistema y se
recogió en un único recipiente estéril (concentración
post-final). El sistema entonces se enjuagó con 40
ml de tampón de diafiltración para asegurar la máxima recuperación
del producto.
Los parámetros del proceso controlados durante
el proceso de concentración con el sistema de fibras huecas y el
sistema de placa y marco se muestran en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La presión transmembrana (TMP) se mantuvo por
debajo de 55,16 kPa a lo largo del proceso de fibras huecas,
mientras que la TMP aumentó hasta 206,84 kPa con el proceso de placa
y marco. El uso de una mayor superficie específica de la membrana
en el sistema de fibras huecas probablemente ensució menos la
membrana.
Se logró una concentración en aproximadamente
20X veces con el módulo de placa y marco en 4 horas, mientras que
se obtuvo una concentración en 14X veces utilizando el cartucho de
fibras huecas en 3 horas, y se pudo haber obtenido una
concentración de 20X en otros 30 minutos. Se produjo una pérdida del
producto de 45-50% cuando se compara con los
valores de post-lisis en los dos sistemas. El
montaje del cartucho de fibras huecas fue más sencillo que el del
módulo de placa y marco. Por tanto, el cartucho de fibras huecas es
el sistema adecuado para las etapas de ultrafiltración y de
diafiltración basándose en la facilidad de manipulación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Los virus tienen diferentes cargas en su
superficie debido a las moléculas presentes en su superficie. Por
tanto, es posible purificar virus utilizando una cromatografía de
intercambio iónico, y las condiciones variarán dependiendo de la
naturaleza de los virus. Por consiguiente, los inventores ensayaron
las condiciones de una cromatografía de intercambio iónico a
diversos pH para los reovirus. El reovirus se cromatografió a
diferentes pH. Se determinó la valoración después de cada etapa y
se lista a continuación.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Por consiguiente, un pH de
7,0-9,0 produjo un mayor rendimiento de reovirus que
otros pH. El pH utilizado en esta etapa es preferiblemente de
7,5-8,5, en particular pH 8,0. Aunque los
intercambiadores catiónicos y aniónicos funcionaron ambos, los
intercambiadores aniónicos fueron en general más eficaces.
Claims (17)
1. Un método para producir virus a partir de un
cultivo de células, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un cultivo de células que se
han infectado con el virus;
(b) extraer el virus de las células añadiendo un
detergente al cultivo de células e incubando durante un periodo de
tiempo para producir un lisado celular;
(c) retirar los residuos celulares;
(d) purificar el virus mediante una combinación
de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular;
y
(e) recoger el virus.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en el que
los residuos celulares se retiran mediante filtración.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
los residuos celulares se retiran mediante una filtración
discontinua, que comprende:
(1) filtrar a través de un prefiltro que tiene
un tamaño de poro de 5 \muM u 8 \muM, y
(2) filtrar, después de la etapa (1), a través
de un filtro combinado que tiene unos tamaños de poro de 3 \muM
y
0,8 \muM.
0,8 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
4. El método de la reivindicación 1, que
comprende además tratar el lisado celular con una enzima de ruptura
del ADN.
5. El método de la reivindicación 2, que
comprende además concentrar el filtrado.
6. El método de la reivindicación 5, en el que
el filtrado se concentra mediante diafiltración.
7. El método de la reivindicación 1, en el que
el virus es un virus sin envuelta.
8. El método de la reivindicación 1, en el que
el virus es un reovirus.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
el reovirus es un reovirus de mamífero.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
el reovirus de mamífero es un reovirus humano.
11. El método de la reivindicación 10, en el que
el reovirus humano es un virus de serotipo 3.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
el reovirus de serotipo 3 es la cepa Dearing.
13. El método de la reivindicación 8, en el que
el reovirus es un reovirus recombinante.
14. El método de la reivindicación 1, en el que
las células son células de riñón embrionario humano 293 (HEK
293).
15. El método de la reivindicación 14, en el que
las células HEK 293 se cultivan en suspensión.
16. El método de la reivindicación 1, que
comprende además purificar el virus mediante una cromatografía de
intercambio aniónico.
17. Un método para producir reovirus
infecciosos, que comprende:
(a) proporcionar un cultivo de células HEK 293
que se han infectado con reovirus;
(b) extraer el virus de las células añadiendo
Triton X-100 al cultivo de células HEK 293 e
incubando de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 37ºC;
(c) tratar la mezcla de la etapa (b) con una
enzima de ruptura del ADN;
(d) retirar los residuos celulares mediante
filtración;
(e) concentrar el filtrado mediante
ultrafiltración o diafiltración;
(f) purificar el reovirus mediante una
combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión
molecular; y
(g) recoger el virus.
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