KR20090014364A - 암 치료용 점액종 바이러스 변이종 - Google Patents

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Abstract

M11L, M063, M 136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 점액종 바이러스는 암 치료에 유용하다.
점액종 바이러스, 암, 신경아교종

Description

암 치료용 점액종 바이러스 변이종{MYXOMA VIRUS MUTANTS FOR CANCER TREATMENT}
유전적으로 변형된 점액종 바이러스의, 암 치료에 사용되는 용도는 WO 04/078206 (로바츠 리서치 인스티튜트)에 개시되어 있다.
발명의 요약
본 발명은 M11L, M063, Ml36, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 점액종 바이러스 (MV)에 관한 것이다. 그러한 바이러스는 암 세포 억제 방법 및 암 세포 억제용 약물의 제조 방법에 사용되는데, 이러한 방법에는 점액종 바이러스의 유효량을 상기 세포에 투여하는 것이 포함된다. 또한, 상기 바이러스는 암을 앓고 있는 인간 환자 치료 방법 및 암을 앓고 있는 인간 환자 치료용 약물의 제조 방법에 사용되는데, 이러한 방법에는 점액종 바이러스의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것이 포함된다. 또한, 본 발명은 상기 점액종 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물을 비롯하여 상기 점액종 바이러스 및 암 환자 치료용 사용 지시서를 포함하는 키트를 제공한다.
발명의 상세한 설명
WO 04/078206 (로바츠 리서치 인스티튜트)에는 암 치료용의, 어떤 유전적으로 변형된 점액종 바이러스의 용도에 관하여 개시되어 있다. 본 발명은 그러한 용도에 있어서 보다 특정된 변형 점액종 바이러스를 제공함으로써 진보된 측면을 제시한다. 상기 국제 출원에 개시된 기술은 본 발명의 점액종 바이러스에 일반적으로 적용될 수 있고, WO 04/078206의 내용은 참조로 본 명세서에 병합되어 있다.
본 명세서에서 사용되는, 주어진 점액종 바이러스 단백질의 "활성이 결핍된"이라는 표현은 해당 바이러스의 활성이 야생형 점액종 바이러스보다 떨어지는 것을 의미한다. 주어진 바이러스 단백질의 "활성이 실질적으로 없는"이라는 표현은 바이러스가 그러한 활성의 면에서 탐지될 수 없는 수치를 보이는 것을 의미한다. 주어진 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 점액종 바이러스의 예에는 그러한 단백질 유전자가 소실되었거나, 그렇지 않다면 낙아웃된 변이종이 있다.
본 발명에 따르면, 어떠한 종류의 암 또는 암 세포도 억제하거나 치료할 수 있다. 본 발명의 구체 실시 상태에 있어서, 암 세포는 포유동물 암 세포이다. 보다 특정된 구체 실시 상태에 있어서, 암 세포는 인간 암 세포이다. 그러한 인간 암 세포의 예에는 신경아교종이 있다.
야생형 점액종 바이러스 (vMyxgfp)는 생산적이고, 장기 지속성인 감염을 일으키고, 뮤린 (murine) 뇌에 이식된 인간 신경아교종 내로 종양 내 주입될 때, 이식된 종양 조직을 파괴하고 제거할 수 있다고 설명되어 왔다 (Lun 등, 2005 Cancer Research 65:9982-9990). 또한, NCI-60 레퍼런스 콜렉션을 조사한 결과는, MV가 시험된 인간 종양 세포의 대부분 (15/21)을 생산적으로 감염시킨다는 것을 보였다 (Sypula 등. 2004 Gene Ther. MoI. Biol. 8:103-114). 암 세포 내에서의 MV 친화성 (tropism)에 관한 이해를 넓히기 위하여, 이전에 야생형 MV 증식 허용 (permissiveness)에 관하여 시험된, 일련의 인간 신경아교종 세포 (U87, Ul 18, U251, U343, U73)를 조사하였다. 여기서 밝혀진 것은 토끼 세포에 있어서의 MV 친화성을 정의하는 데에 중요한 역할을 하는 것으로 확인된, 특정 숙주 범위 유전자가 소실된, 몇몇의 MV 바이러스의 감염 및 복제를 시험함으로써 다음의 실시예에까지 확장되었다. 이들 바이러스는 숙주 범위 낙아웃 (vMyx-hrKO)으로서 통칭된다. 인간 신경아교종 세포에 있어서의 복제 및 확산되는 다양한 vMyx-hrKO의 능력에 있어 변화가 관찰되었다. vMyxT2 (U251), vMyxT4K0 (U87, Ul 18, U251 및 U373) 및 vMyxT5K0 (U251, U373)는 특정 인간 신경아교종에 있어 어떠한 제한을 보였다. 반대로, vMyx63KO 및 vMyxl35KO는 몇몇의 신경아교종에 있어 더 효율적으로 복제 및 사멸시키는 것으로 나타났다.
본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 더 잘 이해될 것이고, 이러한 실시예는 본 명세서에 개시된 본 발명을 설명할 뿐 제한하지 않는다.
도 1. 인간 신경아교종 세포에서의 내인성 활성 Akt 수치.
도 2a 및 도 2b. 인간 신경아교종 세포주에서의 다양한 vMyx-hrKO 및 대조군의 바이러스 복제 효율.
도 3a 및 도 3b. 초기 및 말기 분비 바이러스 유전자 발현은 vMyx-hrKO의 일부가 초기 유전자 발현에서 말기 유전자 발현으로 전이될 수 없다는 것을 나타낸 다.
도 4a 내지 도 4c. 선택된 일단 성장 곡선.
도 5a 내지 도 5f. 세포-기재 (cell-based) 세포 독성 분석.
실시예 1
트레오닌 308 (P-Akt T308) 및 세린 473 (P-Akt S473) 위치에서 인산화된 Akt 또는 총 Akt에 대한 항체로 전체 세포 용해물 50 마이크로그램을 탐지하였다. 활성 Akt U87 및 U343의 수치에 기초하여 감염될 수 있고, Ul18, U251 및 U373은 MV 감염에 더 내성이 있는 것으로 예상되었다. (도 1).
실시예 2
바이러스 스톡을 다양한 신경아교종 세포 및 대조군 BGMK 또는 RKl3 세포에 적정하였다. 신경아교종으로부터 유래된 바이러스 적정량을 대조군 수치와 비교하였고, 바이러스 복제 효능의 수치를 추정하였다. 이러한 결과에 기초할 때, 신경아교종 중 어느 것도 대조군 주에서 관찰된 수치까지의 바이러스 성장을 뒷받침하지 않았다. 그러나, 일부 바이러스 (vMyxl35KO, vMyx63KO 및 vMyxl36KO)는 기타의 낙아웃의 경우보다 더욱 효율적이었다. 또한, 일부 신경아교종 주에서는 복제가 더 많이 됨을 보여주었다 (U87, U343 및 U373). (도 2a 및 도 2b)
실시예 3
다양한 인간 신경아교종을 일단의 vMyx-hrKO로 감염시켰다. 20 hpi 감염 상청액을 모아 10x으로 농축시켰다. 농축 상청액 15 마이크로리터를 12 % SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였고, 항-Serpl (mAB; 말기 MV 유전자 생성물)로 탐지하였다. 블롯을 (겔로부터) 벗겨내고, 항-M-T7 (pAB; 초기 MV 유전자 생성물)로 초기 유전자 발현을 탐지하였다. 그 결과는 vMyxT2K0, vMyxT4KO 및 vMyxT5K0을 포함하는 몇몇의 vMyx-hrKO이 그들의 초기 유전자 발현으로부터 말기 유전자 발현으로의 전이를 제한한다는 것을 제시한다. 그리고, 2개의 신경아교종 주 (U87 및 U37)에 있어서, vMyxT4KO는 초기 유전자 발현 조차도 진행하지 않는다. (도 3a 및 도 3b).
실시예 4
세포를 48 웰 접시에 심고, 감염된 세포를 해당 일정 시간에 모았다. 모은 세포 펠릿으로부터 바이러스를 방출시키고, BGMK 세포 상에서 역으로 적정하였다. 시험 바이러스의 복제가 있었지만, 최대의 증폭은 U87 및 U343 세포에서 발생하는 것으로 보였다. (도 4a 내지 도 4c).
실시예 5
세포 독성 분석을 통하여 다양한 vMyx-hrKO 및 대조군 바이러스가 갖는 인간 신경아교종의 패널에서의 사멸 효과를 측정하였다. 적절한 세포를 96 웰 접시에 심고, 24 시간 후 다양한 MOI의 바이러스로 감염시켰다. 감염 72 시간 후에, 감염 세포를 WTS 시약 (Roche)으로 처리하여 세포 생존력 (viability)을 측정하였다. 색상 변화는 4 시간 동안 매 60 분 마다 450 nm에서 측정하였다. 감염되지 않은 대조군 웰을 사용하여 정상 증식을 결정하였고, 빈 웰은 배경 대조군으로 사용하였다. (도 5a 내지 도 5f).
M11L, M063, M 136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 점액종 바이러스는 암 치료에 유용하다.

Claims (23)

  1. M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 점액종 바이러스의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하는 암 세포 억제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 암 세포인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포는 인간 암 세포인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 세포는 신경아교종 세포인 것인 방법.
  6. 암을 앓고 있는 인간 환자의 치료 방법으로서, M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7으로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 점액종 바이러스의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 점액종 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 암은 신경아교종인 것인 방법.
  9. 암 세포를 억제하기 위한, 유효량의 점액종 바이러스의 용도로서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 것인 용도.
  10. 암 세포를 억제하기 위한 약물의 제조 방법에 있어서, 유효량의 점액종 바이러스의 용도로서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 것인 용도.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 것인 용도.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 암 세포인 것인 용도.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 인간 암 세포인 것인 용도.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포는 신경아교종 세포인 것인 용도.
  15. 암을 앓고 있는 인간 환자를 치료하기 위한, 유효량의 점액종 바이러스의 용도로서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 것인 용도.
  16. 암을 앓고 있는 인간 환자 치료용 약물의 제조 방법에 있어서, 유효량의 점액종 바이러스의 용도로서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 것인 용도.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 것인 용도.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 암은 신경아교종인 것인 용도.
  19. 점액종 바이러스 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는, 암 치료용 약 학 조성물로서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 것인 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 것인 약학 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 암은 신경아교종인 것인 약학 조성물.
  22. 점액종 바이러스 및 암을 앓고 있는 환자 치료용 사용 지시서를 포함하는 키트로서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 결핍된 것인 키트.
  23. 제22항에 있어서, 상기 점액종 바이러스는 M11L, M063, M136, M-T4 및 M-T7로 이루어진 군 중에서 선택되는 점액종 바이러스 단백질의 활성이 실질적으로 없는 것인 키트.
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