CN102225201A - 糖酵解抑制剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种糖酵解抑制剂的新用途。本发明基于雷帕霉素靶蛋白高度活化细胞中的糖酵解水平升高，应用糖酵解抑制剂能够使mTOR活化细胞的生长明显受到抑制，从而提供了糖酵解抑制剂在制备用于治疗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化导致的哺乳动物肿瘤或疾病的药物中的用途。糖酵解抑制剂由于能特异性抑制糖酵解途径，有针对性的治疗mTOR活化所导致的肿瘤，毒副反应较小，因此能取得更好的疗效。

Description

糖酵解抑制剂的新用途

技术领域

本发明涉及糖酵解抑制剂的新用途。具体的，本发明涉及糖酵解抑制剂在治疗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及其上游通路异常活化导致的哺乳动物肿瘤或其它疾病中的新用途。

背景技术

糖代谢异常是肿瘤细胞的一个重要特征，大多数正常细胞在氧气存在时是通过糖的有氧氧化来获得能量，只有在缺氧时才通过糖酵解进行代谢。而肿瘤细胞则无论氧气存在与否都主要依赖糖酵解来进行葡萄糖的代谢，并伴有大量乳酸的产生，称为有氧糖酵解。这一现象最早由OttoWarburg发现，也称为Warburg效应(参见，Warburg，O.，On the origin ofcancer cells.Science，1956.123(3191)：p.309-14)。糖酵解的许多中间产物被肿瘤细胞利用合成蛋白质、核酸及脂类，从而为其本身的生长和增殖提供了必需的物质基础，然而这种代谢特征究竟是癌症产生的原因还是癌细胞代谢改变的结果，则是长期困扰医学界的难题。

信号转导通路异常是肿瘤的重要特征。其中，膜受体酪氨酸激酶(RTKs)-PI3K/PTEN-AKT-TSC1/2-mTOR信号通路在控制细胞的生长、增殖等生命过程中起着重要作用，该通路包含有很多原癌基因如RTKs、PI3K、AKT和mTOR，抑癌基因如PTEN和TSC1/TSC2，这些上游因子的异常激活或失活都将导致mTOR信号通路的过度活化而引起各种疾病，尤其是肿瘤的发生，在多种肿瘤组织中发现有mTOR信号通路的异常激活(参见，Chen，Y.L.，P.Y.Law，and H.H.Loh，Inhibition of PI3K/Akt signaling：an emerging paradigm for targeted cancer therapy.Curr Med Chem AnticancerAgents，2005.5(6)：p.575-89)，但其失调导致疾病发生的具体机制还不是很清楚，因此近年来对该通路的研究已成为疾病靶向治疗及药物研发的焦点(参见，Manning，B.D.and L.C.Cantley，AKT/PKB signaling：navigatingdownstream.Cell，2007.129(7)：p.1261-74；Sabatini，D.M.，mTOR and cancer：insights into a complex relationship.Nat Rev Cancer，2006.6(9)：p.729-34；Hennessy，B.T.，et al.，Exploiting the PI3K/AKT pathway for cancer drugdiscovery.Nat Rev Drug Discov，2005.4(12)：p.988-1004)。

mTOR(Gene ID：2475)是一种重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，在感受营养和能量信号，调节蛋白合成和自噬水平，进而调控细胞生长和代谢方面起着关键性的作用，与很多癌症的发病与治疗有着密切的关系。

mTOR通路抑制剂是雷帕霉素(Rapamycin，R)，又名西罗莫司(Sirolimus)，分子式为C51H79NO13。其衍生有RAD001(Everolimus)，CCI779(Temsirolimus)，ridaforolimus等。雷帕霉素是大环内酯抗生素，具有免疫抑制剂和抗癌作用。当它与FKBP12构成复合体后可与mTOR结合并抑制mTOR活性，同时雷帕霉素有将细胞周期阻断在G1期的作用。在实际应用过程中，雷帕霉素作为一种免疫抑制剂，在用于治疗mTOR活化导致的肿瘤如TSC突变引起的肺淋巴管肌瘤病、结节硬化症等的过程中，雷帕霉素的不良反应比较多，停药后也会有不同程度的复发现象，因此成为限制其使用的一个重要原因。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种糖酵解抑制剂的新用途，糖酵解抑制剂由于能特异性抑制糖酵解途径，有针对性的治疗mTOR活化所导致的肿瘤，毒副反应较小，能够取得更好的疗效。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供了糖酵解抑制剂在制备用于治疗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)及其上游通路异常活化导致的哺乳动物肿瘤或其它疾病的药物中的用途。

优选地，所述糖酵解抑制剂选自3-溴丙酮酸(3-bromopyruvate，3-BrPA)、二氯乙酸(Dichloroacetate，DCA)、氯尼达明(lonidamine)、2-脱氧-D-葡萄糖(2-deoxyglucose)、siRNA、microRNA，多肽和抗体。

优选地，所述糖酵解抑制剂与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂联合用药。

优选地，所述哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂为雷帕霉素或其衍生物。

优选地，所述哺乳动物包括人。

优选地，所述雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化导致的哺乳动物肿瘤或疾病选自：成神经管细胞瘤；肺癌；白血病；多发性错构瘤综合症或Bannayan-Zonana综合症、前列腺癌、子宫内膜癌和晚期胶质瘤；肺淋巴管肌瘤病、结节硬化症、或结节硬化症相关的皮肤病变；纤维神经瘤病、肾错构瘤、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑变性；多囊性肾病、前列腺癌；黑斑息肉综合症、家族心脏肥大和肺癌；肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等。

优选地，所述结节硬化症相关的皮肤病变包括面部血管纤维瘤(皮脂腺瘤)和色素脱失斑。

由此可见，本发明在探讨糖酵解抑制剂在mTOR通路活化导致的肿瘤的作用方式的基础上，提出了利用该作用方式在mTOR通路活化导致的肿瘤中的用途。本发明提供了应用糖酵解抑制剂如3-BrPA和DCA等治疗由于mTOR活化导致的肿瘤或其他疾病，或联合应用糖酵解抑制剂和mTOR信号通路抑制剂进行治疗，可能成为达到更好疗效的一种新的用途。

TSC1/TSC2蛋白复合体是mTOR信号通路的主要负调节因子(参见，Kwiatkowski，D.J.，et al.，A mouse model of TSC1 reveals sex-dependentlethality from liver hemangiomas，and up-regulation of p70S6kinase activityin Tsc1null cells.Hum Mol Genet，2002.11(5)：p.525-34；Potter，C.J.，L.G.Pedraza，and T.Xu，Akt regulates growth by directly phosphorylating Tsc2.Nat Cell Biol，2002.4(9)：p.658-65)。我们的实验发现，由TSC1或TSC2敲除导致的mTOR功能亢进会促进细胞糖酵解水平的增加，mTOR活化的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast，MEF)细胞中，其葡萄糖消耗和乳酸产生显著高于野生型细胞，因此推断mTOR活化致瘤的机制之一可能是通过增强细胞糖酵解来实现的。因此，mTOR与肿瘤糖酵解之间潜在的功能性联系可能对肿瘤生长起重要作用，特异性干预肿瘤细胞有氧糖代谢，如阻抑糖酵解通路中若干关键酶，以及糖酵解抑制剂与mTOR通路抑制剂的联合用药等，可能为mTOR过度活化所致肿瘤或其它疾病的治疗提供新的策略。

本发明明确了mTOR和糖酵解之间的关系，首先通过检测多种具有特定遗传背景的野生型和TSC1、TSC2以及PTEN突变导致mTOR高度活化的小鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，发现mTOR高度活化后细胞的葡萄糖消耗水平和乳酸产生水明显高于野生型细胞，即mTOR活化可以导致糖酵解上调。其次，应用糖酵解抑制剂3-BrPA可使mTOR活化细胞的生长明显受到抑制，同时，联合应用3-BrPA和mTOR通路抑制剂雷帕霉素后可显著降低细胞的增殖，具有协同作用的效应。

本发明证实了mTOR高度活化细胞中的糖酵解水平升高，应用糖酵解抑制剂能够使mTOR活化细胞的生长明显受到抑制，从而推断mTOR活化致瘤的机制可能是通过增强细胞糖酵解来实现的。因此，特异性干预肿瘤细胞有氧糖代谢，如应用糖酵解抑制剂，阻抑糖酵解通路中若干关键酶，以及一些药物与mTOR通路抑制剂的联合用药等，都可能为mTOR过度活化所致肿瘤的治疗提供新的策略，具有广泛的应用前景。

本发明中所使用的糖酵解抑制剂，如3-BrPA、DCA等制剂，由于能特异性抑制糖酵解途径，有针对性的治疗mTOR活化所导致的肿瘤，毒副反应较小，因此取得更好的疗效。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表示多种人类疾病与mTOR及其上游通路的关系示意图，图中框线里的字体代表疾病名称，从框线引出的直线指向其相关的蛋白；

图2表示mTOR活化促进糖酵解上调的实验结果示意图。图中A为Tsc1基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(以Tsc1-/-表示)和相应的野生型细胞(以Tsc1+/+表示)，R+表示添加雷帕霉素，R-表示未添加雷帕霉素，纵坐标为培养液中葡萄糖消耗和乳酸生成水平；图中B为Tsc2基因敲除的MEF细胞(以Tsc2-/-表示)和相应的野生型细胞(以Tsc2+/+表示)，R+表示添加雷帕霉素，R-表示未添加雷帕霉素，纵坐标为培养液中葡萄糖消耗和乳酸生成水平；图中C为Pten基因敲除的MEF细胞(以Pten-/-表示)和相应的野生型细胞(以Pten+/+表示)，R+表示添加雷帕霉素，R-表示未添加雷帕霉素，纵坐标为培养液中葡萄糖消耗和乳酸生成水平；误差线代表三次实验的平均值±标准差，P＜0.05；

图3表示3-BrPA阻断糖酵解通路可抑制mTOR活化细胞增殖的实验结果图；误差线代表三次实验的平均值±标准差，P＜0.05。

图4表示相对于野生型细胞，不同浓度的3-BrPA阻断糖酵解通路可更有效地抑制mTOR活化细胞增殖的实验结果示意图，Tsc2-/-表示Tsc2基因敲除的MEF细胞，即Tsc2-/-MEF细胞，wt表示相应的野生型细胞；纵坐标为细胞存活率；误差线代表三次实验的平均值±标准差，P＜0.05；

图5表示糖酵解通路抑制剂3-BrPA与mTOR通路抑制剂联合应用可显著降低mTOR活化细胞增殖的实验结果示意图，图中R+代表添加雷帕霉素的Tsc2-/-MEF细胞，R-代表未添加雷帕霉素的Tsc2-/-MEF细胞，3-BrPA+代表添加3-BrPA的Tsc2-/-MEF细胞，3-BrPA-代表未添加3-BrPA的Tsc2-/-MEF细胞；纵坐标为细胞存活率；误差线代表三次实验的平均值±标准差，P＜0.05；

图6表示3-BrPA与Rapamycin联合应用可协同抑制mTOR活化细胞PC3在裸鼠体内的成瘤能力的实验结果示意图；纵坐标为相对肿瘤体积；

图7表示RTK-PI3K-AKT-mTOR通路通过促进糖酵解调节细胞增殖和肿瘤发生的示意图。当受体酪氨酸激酶被激活，PI3K活化AKT，AKT磷酸化TSC2，同时减少TSC1/TSC2复合物对Rheb-GTP的GAP活性，提高Rheb-GTP水平。Rheb-GTP活化mTOR，随之mTOR通过促进糖酵解调节细胞增殖和肿瘤发生。

具体实施方式

实施例1：mTOR信号通路和糖酵解之间的关系

为明确mTOR信号通路和糖酵解之间的关系，我们首先收集了正常培养和加入mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素(Rapamycin，购自sigma公司，货号为R0395)培养的PTEN，TSC1，TSC2基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(参见，Kwiatkowski，D.J.，et al.，A mouse model of TSC1 revealssex-dependent lethality from liver hemangiomas，and up-regulation of p70S6kinase activity in Tsc1null cells.Hum Mol Genet，2002.11(5)：p.525-34；Zhang，H.，et al.，Loss of Tsc1/Tsc2 activates mTOR and disrupts PI3K-Aktsignaling through downregulation of PDGFR.J Clin Invest，2003.112(8)：p.1223-33.)(MEF，Pten-/-，Tsc1-/-，Tsc2-/-)和相应野生型细胞(wt)的上清液，之后用EKF-diagnostic公司的乳酸分析仪(BIOSEN C line，Clinic)检测了培养液中葡萄糖和乳酸水平，如图2所示，结果显示mTOR高度活化的细胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量均高于野生型细胞，经Rapamycin处理之后可降低二者的水平，说明mTOR功能亢进会促进细胞糖酵解水平的增加。

实施例2：糖酵解抑制剂能够阻碍mTOR活化细胞的增殖

由于mTOR过度活化可导致糖酵解水平上调，因此我们推断mTOR活化致瘤的机制可能是通过增强细胞糖酵解来实现的，因此应用糖酵解抑制剂可能会阻碍mTOR活化细胞的增殖。将生长状态良好的3-5×10³个Tsc2-/-MEF细胞分别接种于4个96孔板，待细胞贴壁后加入20μM3-BrPA(3-溴丙酮酸)处理24h、48h和72h后，MTT法检测细胞增殖，每组3个复孔，以未加药物组为对照，如图3所示，添加3-BrPA的Tsc2-/-MEF细胞相比未添加3-BrPA的Tsc2-/-MEF细胞的增长明显受到抑制。此外，我们将3×10³～5×10³个wt和Tsc2-/-MEF细胞(Tsc2基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞)分别接种于96孔培养板，待细胞贴壁后用不同浓度的糖酵解抑制剂3-BrPA(浓度范围从0μM到40μM)分别处理细胞后培养48小时，MTT比色法检测细胞的增殖情况。如图4所示，结果显示Tsc2-/-细胞对3-BrPA的敏感性显著高于野生型细胞，即糖酵解抑制剂可使mTOR活化细胞的生长明显受到抑制。同时，用3-BrPA和mTOR抑制剂Rapamycin联合处理Tsc2-/-细胞，如图5所示，表明3-BrPA和mTOR抑制剂Rapamycin可对细胞的增殖产生协同抑制效应。

实施例3：糖酵解抑制剂可用于mTOR过度活化所致肿瘤的治疗

为进一步研究糖酵解抑制剂可用于mTOR过度活化所致肿瘤的治疗，我们采用了裸鼠成瘤模型进行药物治疗的体内实验。首先将PTEN缺失的人前列腺癌细胞系PC3细胞(购自ATCC)以1×10⁶皮下接种于4-6周龄裸鼠，当肿瘤体积为60-100mm³时将裸鼠分为四组，分别应用3-BrPA(6mg/kg)和Rapamycin(0.02mg/kg)进行单药治疗和联合治疗，每周两次。结果如图6所示，两种药物的小剂量联合应用能明显抑制肿瘤的生长，在体内同样产生了协同效应。为糖酵解抑制剂与雷帕霉素联合治疗mTOR过度活化所致疾病提供了理论基础。

以上结果表明，糖酵解抑制剂如3-BrPA以及与雷帕霉素的联合用药可以成为RTK-PI3K-AKT-mTOR通路过度活化所导致疾病的新的治疗方法。本发明通过实验证实，可以使用糖酵解抑制剂，如3-BrPA、DCA等制剂，以及对糖酵解通路有抑制作用的siRNA、microRNA，多肽和抗体等治疗可以使用mTOR抑制剂雷帕霉素治疗的肿瘤和其它疾病，同时，糖酵解抑制剂与雷帕霉素的联合用药也可能对疾病的治疗达到更好的效果。

综上所述，mTOR与糖酵解通路潜在的功能性相互作用可能对肿瘤生长起重要作用，因此，在证实糖酵解通路的抑制剂可以抑制mTOR活化细胞的增殖之后，则由于mTOR活化导致的肿瘤或其他疾病均可以被糖酵解通路抑制剂所治疗。换言之，现有mTOR抑制剂雷帕霉素可以治疗的肿瘤或其他疾病均可以被糖酵解通路抑制剂所治疗，或联合应用糖酵解抑制剂和mTOR信号通路抑制剂进行治疗，从而为mTOR活化导致的肿瘤或其他疾病的治疗提供一条新的途径。

本发明的应用范围主要是mTOR及其上游通路活化导致的哺乳动物包括人的肿瘤，包括：PDGFR突变引起的成神经管细胞瘤，EGFR突变引起的肺癌、AKT突变引起的肺癌，PI3K突变引起的白血病，PTEN突变引起的多发性错构瘤综合症或Bannayan-Zonana综合症、前列腺癌、子宫内膜癌和晚期胶质瘤，TSC1或TSC2突变引起的肺淋巴管肌瘤病、结节硬化症、或结节硬化症相关的皮肤病变如面部血管纤维瘤(皮脂腺瘤)、色素脱失斑，NF1突变引起的纤维神经瘤病、肾错构瘤、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑变性，PKHD1突变引起的多囊性肾病、前列腺癌，LKB 1突变引起黑斑息肉综合症、家族心脏肥大和肺癌，GOLPH3突变引起的肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤等。

Claims (7)

1.糖酵解抑制剂在制备用于治疗哺乳动物雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化导致的哺乳动物肿瘤或疾病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述糖酵解抑制剂选自3-溴丙酮酸、二氯乙酸、氯尼达明、2-脱氧-D-葡萄糖、siRNA、microRNA、多肽和抗体。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述糖酵解抑制剂与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂联合用药。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂为雷帕霉素或其衍生物。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物包括人。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其特征在于，所述雷帕霉素靶蛋白及其上游通路活化导致的哺乳动物肿瘤或疾病选自：成神经管细胞瘤；肺癌；白血病；多发性错构瘤综合症或Bannayan-Zonana综合症、前列腺癌、子宫内膜癌和晚期胶质瘤；肺淋巴管肌瘤病、结节硬化症、或结节硬化症相关的皮肤病变；纤维神经瘤病、肾错构瘤、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑变性；多囊性肾病、前列腺癌；黑斑息肉综合症、家族心脏肥大和肺癌；肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其特征在于，所述结节硬化症相关的皮肤病变包括面部血管纤维瘤/皮脂腺瘤和色素脱失斑。

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