WO2005089799A1 - Fam3dに対する抗体のエフェクター機能による細胞障害方法 - Google Patents

Fam3dに対する抗体のエフェクター機能による細胞障害方法 Download PDF

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WO2005089799A1
WO2005089799A1 PCT/JP2004/004057 JP2004004057W WO2005089799A1 WO 2005089799 A1 WO2005089799 A1 WO 2005089799A1 JP 2004004057 W JP2004004057 W JP 2004004057W WO 2005089799 A1 WO2005089799 A1 WO 2005089799A1
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antibody
fam3d
cells
cell
effector function
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PCT/JP2004/004057
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Yusuke Nakamura
Yataro Daigo
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Oncotherapy Science, Inc.
The University Of Tokyo
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Publication date
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023Lung
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    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a method for cytotoxicity by an effector function of an antibody against FAM3D, or a composition therefor.
  • Non-small cell lung cancer accounts for nearly 80% of lung tumors and is the most common form (American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2001 (Am. Chem. So Atlanta). 2001). Because most NSCLCs are not diagnosed until advanced stages, overall 10-year survival rates remain low at 10% despite recent advances in multimodality therapy (Fry et al.). 86: 1867-76, 1999).
  • platinum-based chemotherapy is considered the cornerstone of treatment for NSCLC.
  • the therapeutic effect of the drug is currently limited to prolonging the survival of patients with advanced NSCLC to some extent (Chemotherapy in awake-small cell lung cancer: a metaanalysis using updated data on individual patients from 52 randomized clinical trials.
  • FTI huanesyltransferase
  • Combined administration of the anti-HER2 monoclonal antibody trastuzumab and an anticancer drug, aimed at antagonizing the proto-oncogene HER2 / neu, has been shown in clinical trials in humans to improve clinical response and A significant improvement in survival has been achieved (Lin et al., Cancer Res 61: 6345-9 (2001)).
  • the tyrosine kinase inhibitor ST 1-571 selectively inactivates ber-ab1 fusion proteins. This drug was developed to treat chronic myeloid leukemia in which constitutive activation of ber-ab 1 tyrosine kinase plays an important role in leukocyte transformation.
  • antibodies that bind to cancer cells are used as one of cancer treatment strategies.
  • the typical mechanism of cancer treatment using antibodies is shown below.
  • Missile therapy An attempt to bind a drug to an antibody that specifically binds to cancer cells and cause the drug to act specifically on cancer cells. Even a drug with strong side effects can be concentrated on cancer cells. In addition to drugs, attempts have been made to bind antibodies to their precursors or enzymes that metabolize the precursors to the active form.
  • Antibody cytotoxicity Antibodies that bind to certain antigens can damage cancer cells May have an effect. In such an antibody, the antibody molecule itself has a direct antitumor effect. Antibodies that exhibit cytotoxicity against cancer are attracting attention as antibody drugs that can be expected to have high antitumor effects. Disclosure of the invention
  • the present inventors have searched for an antibody capable of inducing a cell-damaging effect by targeting a gene whose expression is increased in cells. As a result, it has been clarified that when an antibody recognizing FAM3D is brought into contact with a FAM3D-expressing cell, a strong cytotoxic effect on the cell is induced, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to the following pharmaceutical composition or method.
  • FAM3D or an immunologically active fragment thereof or A method for inducing an antibody having an effector function against a cell that expresses FAM3D, comprising a step of administering a DNA or a cell that can be produced by the method.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing an antibody that binds to FAM3D as an active ingredient for damaging cells that express FAM3D by one effector function of the antibody.
  • the present invention relates to the use of an antibody that binds to FAM3D in the manufacture of a pharmaceutical composition for damaging cells that express FAM3D by the effector function of the antibody.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains an antibody that binds to FAM3D and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present inventors attempted gene expression analysis by cDNA microarray between lung cancer cells collected from lung cancer patients and normal cells.
  • FAM3D added with c-myc-His tag at the forced onset current system, cytoplasmic granules (cytoplasmic Granules), Golgi (g olgi), and cell Shitsumaku (cytoplasmic Localization to the membrane) was observed. Furthermore, the secretion of FAM3D into the culture solution was confirmed by Western plotting, indicating that FAM3D was a secretory protein.
  • the FAM3D gene encoded an amino acid sequence predicted to be a signal peptide at the N-terminus. As mentioned earlier, this protein is considered to be a secretory protein in cells, mainly because localization to cytoplasmic granules and golgi was observed. Was done. In addition, the normal tissue of this gene Low expression levels in cells and high expression in multiple non-small cell cancer cells suggested that FAM3D was useful as a diagnostic marker or therapeutic target. However, at present, it is not known that an antibody against FAM3D exhibits an effector function in cells expressing FAM3D.
  • Antigen bound to one antibody stays on the cell surface for a long time
  • the antigen recognized by the antibody needs to be expressed on the cell membrane surface.
  • the proportion of antigen-positive cells in the cells constituting the cancer tissue be as high as possible.
  • all cancer cells should be antigen-positive.
  • a stronger effector function can be expected when as many molecules as possible are expressed on the cell surface. It is also important that the antibody bound to the antigen is not taken up by the cells. Some receptors may be endocytosed after binding to a ligand. Similarly, antibodies that bind to cell surface antigens may be taken up into cells. The uptake of antibodies into cells by such a phenomenon is called internalization. When the internalization occurs, the Fc region of the antibody is taken into cells. On the other hand, molecules or cells required for effector function are outside the cells expressing the antigen. In other words, as a result of the internalization, the effector function of the antibody is inhibited. Therefore, when expecting the effector function of an antibody, it is important to select an antigen that is unlikely to cause internalization of the antibody.
  • FAM3D is a target antigen having such characteristics. It was revealed for the first time.
  • the effector function refers to a cytotoxic effect involving the constant region (Fc) of an antibody.
  • Fc constant region
  • the function of the Fc of the antibody bound to the antigen to drive the action of damaging cells having the antigen can also be referred to as the effector function of the antibody. More specifically, antibody-dependent cytotoxicity (Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC), complement-dependent cytotoxicity (compliment dependent
  • Cytotoxicity (CDC) and neutralize activity are known as one function of antibody antibody. Each function will be described below.
  • I Takeno globulin I g G, IgE or Fc region of the I Takeno globulins IgA class, has cells with Fc receptors specific to each resides. Cells having the corresponding Fc receptor recognize and bind to the antibody bound to the cell membrane and the like. For example, antibodies of the IgG class are recognized by Fc receptors on T cells, NK cells, neutrophils, and macrophages. These cells are activated by binding to the Fc region of an IgG class antibody, and exert a damaging effect on the cells to which the antibody is bound. A group of cells that acquire a cytotoxic effect via the effector function of an antibody is called an effector cell. Based on the type of effector cells, ADCC may be distinguished as follows.
  • ADMC Macrophage activation function by IgG antibody
  • ADCC NK cell activation function by IgG antibody
  • ADCC effector cells of ADCC in the present invention
  • ADMC using macrophages as effector cells is included in the ADCC of the present invention.
  • ADCC of antibodies constitutes an important mechanism of antitumor effect in the treatment of cancer using antibodies (Nature Med., 6: 443-446, 2000).
  • a close relationship between the therapeutic effect of an anti-CD20 antibody chimeric antibody and ADCC was reported (Blood, 99: 754-758, 2002). Therefore, in the present invention, too, ADCC is particularly important among the functions.
  • ADCC is thought to be one of the major mechanisms for the antitumor effect of Herceptin (Rituxan), which has already begun clinical application.
  • the former is for the treatment of metastatic breast cancer, and the latter is for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma.
  • ADCC the mechanism of cytotoxic action by ADCC is roughly described as follows. In other words, it is thought that the effector cells cross-linked to the target cell via the antibody bound to the cell surface transmit some lethal signal to the target cell, thereby inducing the cell death of the target cell. I have. In any case, an antibody that induces a cytotoxic effect by an effector cell is included in the antibody having one effector function in the present invention.
  • the Fc region of immunoglobulin bound to an antigen activates the complement pathway. It has also been shown that the activation pathway may differ depending on the class of immunoglobulin. For example, in human antibodies, IgM and IgG activate the classical pathway. IgA, IgD, and IgE, on the other hand, do not activate the classical pathway. Activated complement undergoes several reactions to produce the membrane attack complex C5b-9 (membrane attack complex! MAC), which has cell membrane-damaging activity. The resulting MAC is thought to damage cell membranes and virions independently of effector cells. Cell injury due to MAC is based on the following mechanism.
  • MAC has strong binding affinity for cell membranes. MAC bound to the cell membrane punctures the cell membrane. The holes facilitate entry and exit of water. As a result, the cell membrane is destabilized or the osmotic pressure changes, and the cells are destroyed.
  • the cytotoxic effect of complement activation is said to extend only to the membrane near the antibody bound to the antigen. Therefore, the cytotoxic effect of MAC depends on the specificity of the antibody. ADCC and CDC can exert cytotoxic effects independently of each other. Wear. However, in vivo, it is considered that these cytotoxic effects may actually act in combination.
  • Some antibodies have the function of detoxifying the activity of the toxin or the ability to infect pathogens. It is known that neutralization with an antibody may be achieved by binding of the variable region to an antigen or may require the intervention of complement. For example, antibodies to a virus may require the presence of complement for loss of viral infectivity. The involvement of complement requires the Fc region. That is, such an antibody is an antibody having an effector function requiring Fc to neutralize cells or viruses.
  • the effector function can also be said to be a role of determining the biological activity that is triggered by antigen recognition of an antibody.
  • Preferred target cells in the present invention are cancer cells.
  • the function of the Fc region of various antibodies is highly dependent on the antibody class.
  • the Fc regions of IgG, IgE, and IgA class antibodies bind to specific Fc receptors, activate cells having Fc receptors, and act on intercellular transport of antibodies.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity refers to the activation of these effector cells by the IgG class antibody through the Fc receptor on Fefecta cells, and the killing of the target cells bound to the antibody variable region.
  • ADCC T cells, NK cells, neutrophils, or macrophages function as effector cells.
  • the function of activating complement is limited to IgM and IgG class antibodies, and the function of lysing cells to which the variable region of the antibody is bound is specifically called CDC (complement-dependent cytotoxicity).
  • a preferable effector function is one or both of ADCC and CDC.
  • the present invention also relates to a method for damaging a cell expressing a FAM3D cell, comprising the following steps.
  • the cell expressing FAM3D can be any cell.
  • lung cancer cells are suitable as cells that express FAM3D in the present invention.
  • non-small cell lung cancer NSCLC
  • Cells and antibodies are either in vivo (nw o) or in vitro
  • the method of the present invention is nothing less than a method for treating or preventing lung cancer. That is, the present invention provides a method for treating lung cancer, comprising the following steps.
  • FAM3D identified by the present inventors as a gene that is overexpressed in lung cancer, has little expression in cells of vital organs and has been confirmed to be specifically expressed on the surface of lung cancer cells. .
  • Antibodies to FAM3D are thought to specifically recognize antigens on the surface of lung cancer cells, and to induce cancer cytotoxicity to immune cells by their effector functions.
  • the present inventors have confirmed that an antibody that binds to FAM3D effectively impairs a cell that expresses FAM3D, particularly a lung cancer cell, due to its effector function. Furthermore, the present inventors have shown that FAM3D is highly expressed in lung cancer cells with a high probability. I have confirmed. In addition, the expression level of FAM3D in normal tissues is low. Taken together, this information suggests that treatment of lung cancer with FAM3D is an effective treatment with a low risk of side effects.
  • the antibody is not limited as long as it has a desired effector function.
  • an antibody having an Fc region of IgA, IgE, or IgG is required.
  • Fc area of the antibody is preferably an IgM or I g G. Therefore, antibodies belonging to these human-derived classes are preferred antibodies in the present invention.
  • Human antibodies can be obtained using antibody-producing cells collected from humans or chimeric animals (Cloning and Stem Cells., 4: 8595, 2002) transplanted with human antibody genes.
  • the Fc region of the antibody can be conjugated to any variable region. That is, a chimeric antibody in which a human constant region is conjugated to a variable region of a heterologous animal is known. Alternatively, an arbitrary constant region can be conjugated to a human-derived variable region to obtain a human-human chimeric antibody. Furthermore, a technique (CDR graft) for replacing CDRs constituting the variable region of a human antibody with CDRs of a different antibody is also known ("Immunoglobulin genes", Academic Press (London), pp. 260-274, 1989; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 969-973, 1994). Substitution of the CDR will displace the binding specificity of the antibody.
  • a humanized antibody grafted with a CDR of an antibody that binds to human FAM3D recognizes human FAM3D.
  • the transplanted antibody is also called a humanized antibody.
  • the antibody having the Fc required for the effector function which can be obtained in this manner, is useful as the antibody in the present invention regardless of the origin of the variable region.
  • an antibody having an Fc of human IgG, even if the variable region contains an amino acid sequence derived from another class or another species of immunoglobulin is a preferred antibody in the present invention.
  • the antibody in the present invention may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. It may be a body. Even in the case of administration to humans, human polyclonal antibodies can be obtained using animals transplanted with the aforementioned human antibody genes. Alternatively, immunoglobulins constructed by genetic engineering techniques, such as humanized antibodies, human-heterologous chimeric antibodies, and human-human chimeric antibodies, can also be used. Furthermore, a method for obtaining a human monoclonal antibody by cloning human antibody-producing cells is also known.
  • a fragment comprising FAM3D or a partial peptide thereof is used as an immunogen.
  • the origin of FAM3D in the present invention can be any species. Preferably, it is derived from a mammal such as a human, mouse, or rat, and more preferably, it is derived from a human.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of human FAM3D are known (NM-138805).
  • the nucleotide sequence of FAM3D cDNA is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2. It is a routine matter for those skilled in the art to isolate a gene having a given nucleotide sequence, prepare a fragment thereof as necessary, and obtain a protein having an intended amino acid sequence.
  • a gene encoding the FAM3D protein or a fragment thereof can be inserted into a known expression vector and then used to transform host cells.
  • the desired protein, or a fragment thereof can be recovered from inside or outside the host cell by any standard method, and can then be used as an antigen.
  • a protein or a lysate thereof, or a chemically synthesized protein can be used as the antigen.
  • cells expressing the FAM3D protein or a fragment thereof can be used as an immunogen.
  • a partial peptide is used as an immunogen of FAM3D, it is particularly desirable to select an amino acid sequence constituting a region predicted to be an extracellular domain.
  • the presence of a signal peptide at the N-terminal 1-16 of FAM3D is predicted. Therefore, for example, the region excluding the N-terminal signal peptide (16 amino acid residues) is preferable as an immunogen for obtaining the antibody in the present invention. That is, an antibody that binds to the extracellular domain of FAM3D is preferable as the antibody in the present invention. Therefore, an antibody having a variable region capable of binding to the extracellular domain of FAM3D and an Fc required for effector functions is a preferred antibody in the present invention. For administration to humans, it is desirable to have IgG Fc.
  • Any mammal can be immunized with this antigen, but preferably takes into account compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, use rodent, apocyde, or primate animals.
  • Rodents include, for example, mice, rats, and Hamichi Yuichi.
  • Animals of the order Egret include, for example, egrets.
  • Primate animals include, for example, macaques (Macaca fascicularis), rhesus monkeys, baboons (sacred baboon), and nasal monkeys (Old World monkeys) such as chimpanzees.
  • the antigen can be diluted and suspended with an appropriate amount of phosphate buffered saline (PBS) or physiological saline.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the antigen suspension can be mixed with an appropriate amount of a standard adjuvant, such as Freund's complete adjuvant, made into an emulsion and then administered to the mammal.
  • a standard adjuvant such as Freund's complete adjuvant
  • Suitable carriers can also be used for immunization.
  • the serum is examined by standard methods for increasing the amount of antibody desired.
  • Polyclonal antibodies against the protein of FAM3D can be obtained by collecting blood from immunized mammals that have been tested for increases in the desired antibody in serum, and optionally. It can be prepared by separating serum from blood by the conventional method described in the above.
  • the polyclonal antibody includes a serum containing the polyclonal antibody, and a fraction containing the polyclonal antibody that can be isolated from the serum.
  • IgG or IgM can be prepared from a fraction that recognizes the FAM3D protein by further purifying the fraction with a protein A or protein G column using, for example, an affinity column to which the FAM3D protein is bound. it can.
  • the polyclonal antibody can be used as antiserum.
  • purified IgG or IgM can be used.
  • immune cells are collected from mammals immunized with the antigen, examined for increased levels of the desired antibody in serum as described above, and used for cell fusion.
  • the immune cells used for cell fusion are preferably obtained from the spleen.
  • Other preferred parent cells to be fused with the above immune cells include, for example, mammalian myeloma cells, and more preferably, myeloma cells that have acquired the property of selecting a fused cell by an agent.
  • the above-mentioned immune cells and myeoma cells can be fused according to a known method, for example, the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C., Methods. Enzymol. (1981), 73, 3- 46).
  • the hybridoma obtained by cell fusion can be selected by culturing it in a standard selection medium such as HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). Cell culture is usually continued in HAT medium for several days to several weeks, for a period of time sufficient to kill all other cells (unfused cells) except the desired hybridoma. Next, standard limiting dilution is performed to screen and clone hybridoma cells producing the desired antibody.
  • HAT medium medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • human lymphocytes such as cells infected with Epstein-Barr virus, The protein-expressing cells, or lysates thereof, can be used to immunize in vitro.
  • the immunized lymphocytes are fused with human myeloma cells (such as U266) that can divide indefinitely, thereby obtaining a hybridoma that produces the desired human antibody capable of binding to the protein.
  • Kaisho 63-17688 human myeloma cells
  • the obtained hybridoma is subsequently transplanted into the peritoneal cavity of a mouse to extract ascites.
  • the obtained monoclonal antibody can be purified by, for example, ammonium sulfate precipitation, a protein A or protein G column, DEAE ion exchange chromatography, or an affinity column to which the protein of the present invention is bound.
  • the antibodies of the present invention can be used not only for purification and detection of the proteins of the present invention, but also as candidates for agonists and antagonists of the proteins of the present invention.
  • this antibody can be applied to antibody therapy for diseases related to the protein of the present invention.
  • a human antibody or a humanized antibody is preferred because it reduces immunogenicity.
  • a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes can be immunized with an antigen selected from proteins, protein-expressing cells, or lysates thereof.
  • antibody-producing cells are recovered from the animal, fused with myeloma cells to obtain a hybridoma, and a human antibody against a protein can be prepared from the hybridoma (WO 92-03918, published internationally).
  • immune cells such as immunized lymphocytes
  • immune cells that produce antibodies can be immortalized by oncogenes and used to prepare monoclonal antibodies.
  • the monoclonal antibody thus obtained can also be prepared using genetic engineering techniques (for example, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers (UK,
  • a recombinant antibody is prepared by cloning DNA encoding the antibody from an immune cell such as a hybridoma or an immunized lymphocyte that produces the antibody, inserting it into an appropriate vector, and introducing it into a host cell. be able to.
  • the recombinant antibody prepared as described above can also be used.
  • Antibodies can be modified by conjugation with a variety of molecules, such as polyethylene glycol (PEG). Such modified antibodies can also be used in the present invention.
  • a modified antibody is obtained by chemically modifying an antibody. Such modifications are conventional in the art.
  • Antibodies can be modified by other protein molecules. Antibodies modified with protein molecules can be engineered.
  • the desired protein can be expressed by fusion of the antibody gene and the gene encoding the modified protein molecule.
  • the effector function of the antibody will be enhanced by binding to cytokin or chemokine.
  • enhanced effector functions of antibodies have been confirmed in fusion proteins with IL-2 and GM-CSF (Human Antibody, 10: 43-49, 2000).
  • IL-2, IL12, GM-CSF, TNF, or eosinophil chemotactic substances as cytokines or chemokines that enhance effector functions
  • RANTES can be indicated.
  • the antibody of the present invention can be used as a chimeric antibody comprising a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody, or a complementarity-determining region (CDR) derived from a non-human antibody, a framework region derived from a human antibody ( FR) and a humanized antibody comprising the constant region.
  • CDR complementarity-determining region
  • Such an antibody can be prepared by a known technique.
  • the antibodies obtained as described above can be purified to homogeneity. For example, antibody separation and purification can be performed according to separation and purification methods used for general proteins.
  • Antibodies include, for example, affinity chromatography, filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, and SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Exemplary chromatography includes, for example, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc.
  • the chromatography procedure can be performed by liquid phase chromatography such as HPLC or FPLC.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA the antibody of the present invention is immobilized on a plate
  • the protein of the present invention is added to a plate
  • a sample containing a desired antibody such as a culture supernatant of antibody-producing cells or a purified antibody is added.
  • a secondary antibody that recognizes the primary antibody and is labeled with an enzyme such as alkaline phosphatase is added, and the plate is incubated.
  • an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate is added to the plate, and the absorbance is measured to evaluate the antigen binding activity of the sample.
  • Protein fragments (such as C-terminal or N-terminal fragments) can be used as well as proteins.
  • the binding activity of the antibody according to the present invention can be evaluated using BIAcore (Pharmacia).
  • the effector function of an antibody can be evaluated, for example, according to the method described in the Examples. For example, a target cell expressing FAM3D and an effector cell are incubated in the presence of an antibody whose effector function is to be evaluated. If the destruction of the target cell is detected, it can be confirmed that the antibody has an effect of inducing ADCC.
  • the level of effector function can be compared to the level of target cell destruction observed under conditions without either antibody or effector cells as a control.
  • a target cell a cell that clearly expresses FAM3D can be used.
  • various cell lines in which the expression of FAM3D has been confirmed in the Examples can be used. These cell lines can be obtained from Cell Bank. Then, a monoclonal antibody having a stronger effector function is selected.
  • an antibody against FAM3D is administered as a drug to humans or other animals.
  • animals other than humans to which the antibody is administered include mice, rats, guinea pigs, rabbits, chickens, cats, dogs, sheep, pigs, birds, monkeys, baboons, chimpanzees, and the like.
  • the antibody can be directly administered to a subject, or can be formulated into a dosage form using a known pharmaceutical preparation method. For example, if desired, it can be administered parenterally in the form of an injection as a sterile solution or suspension in water or any other pharmaceutically acceptable liquid.
  • such a compound may be a pharmaceutically acceptable carrier or solvent, specifically sterile water, saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, flavor, excipient. It can be mixed with the solvents, preservatives, binders and the like into the unit doses required for generally accepted drug use.
  • isotonic solutions including saline, glucose, and adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, and sodium chloride, can be used as aqueous solutions for injection.
  • saline aqueous solutions for injection.
  • these include alcohols, specifically ethanol, polyalcohols (eg, propylene glycol and polyethylene). It can be used with suitable solubilizing agents such as lenglycol), non-ionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM or HCO-50).
  • Sesame oil or soybean oil can be used as an oily solution, can be used with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent, and can also contain buffers (such as phosphate buffer and sodium acetate buffer); It can be formulated using analgesics (such as procarin hydrochloride); stabilizers (such as benzyl alcohol and phenol); and antioxidants.
  • the prepared injection solution can be filled into an appropriate ampoule.
  • an antibody against FAM3D can be administered to a patient by, for example, intraarterial injection, intravenous injection, or percutaneous injection, or by intranasal administration, transbronchial administration, topical administration, or intramuscular administration. it can.
  • intravenous administration intravenous
  • intravenous by infusion or injection is a common method for systemic administration of antibodies to lung cancer patients.
  • Methods of accumulating antibody drugs locally in the primary lung cancer or in the lung metastases include local injection using bronchoscopy, local injection under CT guidance, or local injection under thoracoscopy. or with thoracoscopy).
  • a method of inserting an intra-arterial force catheter into the vicinity of an artery supplying nutrients to cancer cells and locally injecting a pile cancer drug such as an antibody drug is a local control treatment for not only lung cancer primary lesions but also metastatic lesions. It is also effective.
  • the dose and administration method will vary depending on the weight and age of the patient and the administration method, and those skilled in the art can routinely select them. Further, DNA encoding the antibody can be inserted into a vector for gene therapy, and the vector can be administered for therapy. The dose and the method of administration vary depending on the weight, age, and condition of the patient, and those skilled in the art can appropriately select these.
  • FAM3D antibody is an effector mechanism against FAM3D-expressing cells in vivo.
  • An amount that can confirm cytotoxicity based on the activity is administered.
  • the dose of the FAM3D antibody ranges from 0.1 to 250 mg / kg per day, depending on the symptoms.
  • the dosage per adult is 5 mg to: 17.5 g / day, preferably 5 mg to: 10 g / day, more preferably 100 mg to 3 g / day.
  • the administration schedule is 1 to 10 times, for example, 3 to 6 times, every 2 to 10 days, and the progress is observed.
  • the present invention provides an antibody having an effector function against a cell expressing FAM3D, which comprises FAM3D or an immunologically active fragment thereof, or DNA or a cell capable of expressing them as an active ingredient.
  • An immunogenic composition is provided.
  • the present invention relates to an immunogenic composition for inducing an antibody having an effector function against FAM3D-expressing cells, of FAM3D or an immunologically active fragment thereof, or DNA or cells capable of expressing them. For use in manufacturing.
  • FAM3D antibody damages cancer cells by its effector function. Therefore, if a FAM3D antibody can be induced in a living body, the same therapeutic effect as the administration of the antibody can be achieved.
  • an immunogenic composition containing an antigen By administering an immunogenic composition containing an antigen, a desired antibody can be induced in vivo.
  • the immunogenic composition of the present invention allows for vaccination against cells expressing FAM3D. Therefore, the immunogenic composition of the present invention is useful, for example, as a vaccine composition for treating lung cancer.
  • the immunogenic composition of the present invention can contain FAM3D or an immunologically active fragment thereof as an active ingredient.
  • An immunologically active fragment of FAM3D refers to a fragment that recognizes FAM3D and can induce an antibody having an effector function. Less than
  • FAM3D and its immunologically active fragments are referred to as immunogenic proteins. Whether a fragment induces the desired antibody can be determined by actually immunizing an animal and confirming the activity of the induced antibody. Induction of antibodies and their activities Confirmation of sex can be carried out, for example, by a method as described in Examples. For example, a fragment comprising an amino acid sequence corresponding to positions 28-172 or 69-208 of FAM3D is useful as an immunogen in the present invention.
  • the immunogenic composition of the present invention contains a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient immunogenic protein.
  • Adjuvants can be combined as needed.
  • tuberculosis-killed bacteria, diphtheria toxoid, saponin, or the like can be used as an adjuvant.
  • a DNA encoding an immunogenic protein or a cell retaining the DNA so that it can be expressed, can be used as the immunogenic composition.
  • a technique of a so-called DNA vaccine using DNA expressing an antigen of interest as an immunogen is known.
  • a DNA vaccine can be obtained by incorporating a DNA encoding FAM3D or a fragment thereof into an appropriate expression vector.
  • a retrovirus vector an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a Sendai virus vector, or the like can be used.
  • the naked DNA can be introduced into cells by encapsulating it in ribosomes or viral envelope vectors.
  • an immunogenic protein-expressing cell into which a vector or DNA capable of expressing the immunogenic protein has been introduced can also be used as the immunogenic composition in the present invention.
  • a patient's blood cells can be collected, transformed with a vector capable of expressing the immunogenic protein, and returned to the patient.
  • the transformed blood cells produce immunogenic proteins in the patient's body and induce the desired antibodies.
  • the DNA When DNA encoding the immunogenic protein or cells transformed with the DNA is used as the immunogenic composition of the present invention, the DNA may be used together with the immunogenic protein. In addition, a carrier protein that enhances its immunogenicity can be used in combination.
  • the present invention induces an antibody having an effector function against a cell that expresses FAM3D, which comprises a step of administering FAM3D or an immunologically active fragment thereof, or DNA or a cell capable of expressing them.
  • an antibody having one effector function that impairs FAM3D-expressing cells such as lung cancer is induced. As a result, therapeutic effects such as lung cancer can be obtained.
  • the immunogenic composition of the present invention can be administered orally or parenterally, for example, from 0.1 to 250 mg kg / day.
  • Parenteral administration includes, for example, subcutaneous injection or intravenous injection.
  • the dose per adult is usually 5 mg to 17.5 g / day, preferably 5 mg to 10 g / day, more preferably 100 mg to 3 g / day.
  • FIG. 1 is a view showing the results of ADCC assay using an anti-FAM3D antibody.
  • the vertical axis shows the cytotoxic activity (%), and the horizontal axis shows the effector cell: target cell ratio (E: T ratio).
  • the human lung cancer cell line was grown as a monolayer in an appropriate medium supplemented with 10% fetal serum.
  • Table 1 shows the cell lines used in the experiment.
  • SCLC Small cell lung cancer
  • Cancer cells (1 ⁇ 10 6 ) were incubated with purified polyclonal antibody (pAb) or egret IgG (control) at 4 for 1 hour. After washing the cells with phosphate buffered saline (PBS), they were incubated for 30 minutes at 4 in FITC-labeled Alexa Flour 488. The cells were washed with PBS, analyzed with a flow cytometer (FACScan, Becton Dickinson), and analyzed with ModFi ⁇ software (Verity Software House, Inc.). Mean fluorescence intensity (MFI) was defined as the ratio of flow cytometer intensity (intensity due to each protein-specific antibody / intensity due to egret IgG).
  • pAb polyclonal antibody
  • egret IgG control
  • target cells After labeling target cells with 51 Cr 100pCi for 1 hour at 37t :, the cells were mixed every 10 minutes and kept in suspension. The target cancer cells were washed twice before being added for Atsusi was then seeded in 96 Ueru U-bottom plates (2 x l0 4 fine ⁇ Ueru). Human peripheral blood mononuclear cells (PMBC) were collected from healthy individuals and analyzed by Ficoll-Paque (Amersham).
  • PMBC Human peripheral blood mononuclear cells
  • the ADCC effect of the anti-FAM3D antibody (BB016) on SBC-5 cells was evaluated based on the radioactivity of the supernatant (70 ⁇ l) measured with a gamma counter.
  • Formula:% Specific lysis 100 ⁇ (experimental cpm-spontaneous cpm) The percentage of specific lysis was calculated according to I (maximum cpm-spontaneous cpm).
  • the target cells were incubated with anti-FAM3D antibody BB016 alone or effector cells only to serve as control assy. Herceptin was used as a control in some experiments. Although direct cytotoxicity of SBC-5 cells by the anti-FAM3D antibody BB016 itself was not observed, BB016 induced ADCC on FAM3D overexpressing SBC-5 cells (FIG. 1). Industrial potential
  • the present invention has revealed that cells expressing FAM3D can be damaged by the cytotoxic effect of antibodies.
  • FAM3D is a gene identified by the present inventors as a gene highly expressed in lung cancer. Therefore, antibodies that bind to FAM3D can treat lung cancer. In fact, according to the results confirmed by the present inventors, cell damage due to the ADCC effect in the presence of the FAM3D antibody was confirmed in the lung cancer cell line.

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Abstract

 本発明は、FAM3Dを認識する抗体のエフェクター機能に基づく細胞障害作用の利用に関する。すなわち本発明は、FAM3Dを認識する抗体を有効成分として含有する、FAM3D発現細胞を抗体のエフェクター機能によって障害するための医薬組成物、あるいは方法を提供する。FAM3Dは肺がん細胞において高発現しているので、本発明は肺がんの治療に有用である。

Description

明細書
FAM3Dに対する抗体のエフェクター機能による細胞障害方法 技術分野
本発明は、 FAM3Dに対する抗体のエフェクター機能による細胞障害方法、 あ るいはそのための組成物に関する。 背景技術
肺癌は、 最もよく見られる致死的なヒトの腫瘍の一つである。 非小細胞肺癌 (NSCLC) は、 肺腫瘍の 80%近くを占め、 最もよく見られる形態である(American Cancer Society. Cancer Facts and Figures 2001 (Am. Chem. So Atlanta). 2001)。 大半の NSCLCは進行期まで診断されないため、 近年の多様式療法 (multi- modality therapy) の進歩にもかかわらず、 全体的な 10年生存率は 10%と低くとど まったままである(Fryら, Cancer. 86: 1867-76, 1999)。 現在、 プラチナを用い た化学療法は NSCLCの治療の基本であると考えられている。 しかし薬剤による治療 効果は、 現在のところ、 進行 NSCLC患者の生存をある程度延ばすことができる程度 に留まってレ る (Chemotherapy in 醒- small cell lung cancer: a metaanalysis using updated data on individual patients from 52 randomised clinical trials. Non-smal 1 Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj.
311: 899-909, 1995)。 肺がんに関して、 チロシンキナーゼ阻害剤を含む多数の標 的療法が研究されている。 しかしこれまでに、 望ましい治療効果が達成された患 者の数は多くない。 また一部の患者においては、 治療効果とともに重篤な副作用 をともなう場合もあった(Krisら, Proc Am Soc Clin Oncol. 21: 292a(A1166), 2002)
発癌機構の解明を目的とする研究により、 すでに多くの抗腫瘍剤の分子標的候 補が見出されている。 例えば、 フアルネシルトランスフェラ一ゼ (FTI) の阻害剤 は、 動物モデルにおいて Ras依存性腫瘍の治療に有効である (Heら、 Cel l 99 : 335- 45 (1999) ) 。 この薬剤は、 転写後のフアルネシル化に依存する Rasに関連する増 殖シグナル経路を阻害するために開発された。 原癌遺伝子 HER2/neuを拮抗する目 的のために行われた、 抗 HER2モノクローナル抗体であるトラスッズマブと抗癌剤 の併用投与は、 ヒ卜での臨床試験において、 臨床反応の改善および乳癌患者の全 体的な生存率の改善が達成されている (Linら、 Cancer Res 61 : 6345-9 (2001) ) 。 チロシンキナーゼ阻害剤 ST 1-571は be r- ab 1融合夕ンパク質を選択的に不活性化す るものである。 この薬剤は be r-ab 1チロシンキナーゼの恒常的な活性化が白血球の 形質転換において重要な役割を果たす慢性骨髄性白血病を治療するために開発さ れた。 これらの種類の薬剤は、 特異的な遺伝子産物の発癌活性を抑制するように デザインされている (Fuj i taら、 Cancer Res 61 : 7722-6 (2001) ) 。 したがって、 通常、 癌細胞において発現が促進される遺伝子産物は、 新規抗癌剤を開発するた めの潜在的標的となる可能性がある。
一方、 がんの治療戦略の一つとして、 がん細胞に結合する抗体が利用されてい る。 抗体によるがん治療の代表的なメカニズムを次に示す。
ミサイル療法:がん細胞に特異的に結合する抗体に薬剤を結合し、 薬剤をがん 細胞に特異的に作用させる試みである。 副作用が強い薬剤であっても、 がん細胞 に集中的に作用させることができる。 薬剤のほか、 その前駆体、 あるいは前駆体 を活性型に代謝する酵素などを抗体に結合する試みも報告されている。
機能性分子を標的とする抗体の利用:たとえば増殖因子やその受容体に結合す る抗体によって、 がん細胞と増殖因子との結合を阻害する試みである。 がん細胞 には、 増殖因子に依存して増殖するものがある。 たとえば、 上皮細胞増殖因子
(EGF)、 あるいは血管内皮細胞 (VEGF)依存性のがんが知られている。 この種のが んにおいては、 増殖因子と細胞の結合を阻害することで治療効果を期待できる。 抗体の細胞障害作用:ある種の抗原に結合する抗体は、 がん細胞に対して障害 作用を有する場合がある。 このような抗体は、 抗体分子そのものが、 直接的な抗 腫瘍効果を有することになる。 がんに対して細胞障害作用を示す抗体は、 高い抗 腫瘍効果を期待できる抗体医薬として注目されている。 発明の開示
本発明者らは、 細胞において発現上昇が見られる遺伝子を標的として、 細胞の 障害作用を誘導することができる抗体を探索した。 その結果、 FAM3Dを認識す る抗体を FAM3D発現細胞に接触させたときに、 当該細胞に対する強力な細胞障 害作用が誘導されることを明らかにして本発明を完成した。
すなわち本発明は、 以下の医薬組成物、 あるいは方法に関する。
〔1〕 FAM3Dに結合する抗体を有効成分として含有する、 抗体のエフヱクタ一 機能によって FAM3Dを発現する細胞を障害するための医薬組成物。
〔2〕 FAM3Dを発現する細胞が肺がん細胞である 〔1〕 に記載の医薬組成物。 〔3〕 FAM3Dに結合する抗体が、 モノクローナル抗体である 〔1〕 に記載の医 薬組成物。
〔4〕 抗体のエフェクター機能が、 抗体依存性細胞障害作用、 および補体依存性 細胞障害作用のいずれか、 または両方である 〔1〕 に記載の医薬組成物。 〔5〕 次の工程を含む、 FAM3Dを発現する細胞を障害するための方法。
1) FAM3Dに結合する抗体を前記 FAM3Dを発現する細胞に接触させる工程、 および
2) 前記 FAM3Dを発現する細胞に結合した前記抗体のエフェクター機能に よつて前記細胞を障害する工程
〔6〕 FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれらを発現するこ とができる DNAを有効成分として含有する、 FAM3Dを発現する細胞に対す るエフェクター機能を有する抗体を誘導するための免疫原組成物。
〔7〕 FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれらを発現するこ とができる DNAまたは細胞を投与する工程を含む、 FAM3Dを発現する細胞 に対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための方法。
本発明は、 FAM3Dに結合する抗体を有効成分として含有する、 抗体のェフエ クタ一機能によって FAM3Dを発現する細胞を障害するための医薬組成物に関す る。 あるいは本発明は、 FAM3Dに結合する抗体の、 抗体のエフェクター機能に よって FAM3Dを発現する細胞を障害するための医薬組成物の製造における使用 に関する。 本発明における医薬組成物は、 FAM3Dに結合する抗体と薬学的に許 容される担体を含む。 本発明者らは、 肺がん患者から採取された肺がん細胞と正 常細胞の間で c DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を試みた。
そして肺がん細胞において、 特異的に発現上昇している複数の遺伝子を同定し た。 更に、 これら肺がん細胞において発現が変化していた遺伝子のうち、 主要臓 器における発現レベルが低い遺伝子を肺がんの治療標的の候補遺伝子として選択 した。 主要臓器における発現レベルが低い遺伝子を選択することによって、 副作 用の危険を避けることができると考えた。 こうして選択されたいくつかの遺伝子 によってコードされるタンパク質のうち、 FAM3Dを認識する抗体が FAM3Dを発 現している細胞に対するエフェクター機能を示すことを確認し、 本発明を完成し た。
本発明者らが得た知見によれば、 c-myc-Hisタグを付加した FAM3Dは、 強制発 現系においては、 細胞質顆粒 (cytoplasmic granules)、 ゴルジ (golgi)、 および細胞 質膜 (cytoplasmic membrane)への局在が観察された。 更に培養液中への FAM3D の分泌がウエスタンプロッティングによって確認されたことから、 FAM3Dは分 泌夕ンパク質であると考えられた。
FAM3D遺伝子は、 N末端にシグナルべプチドと予想されるアミノ酸配列をコー ドしていた。 このタンパク質は、 先に述べたように、 細胞においては、 主に細胞 質顆粒 (cytoplasmic granules), およびゴルジ (golgi)への局在が観察されたことか ら、 分泌タンパク質である可能性が考えられた。 更にこの遺伝子の正常組織にお ける低い発現レベルと、 複数の非小細胞がん細胞における高発現は、 FAM3Dが 診断マーカーや治療標的として有用であることを示唆した。 しかし現在のところ、 FAM3Dを発現する細胞において、 FAM3Dに対する抗体がエフェクター機能を示 すことは知られていない。
エフェクター機能でがん細胞を破壊するには、 たとえば次のような条件が求め られる。
一がん細胞の膜上に発現している抗原分子数が多いこと
一抗原の分布ががん組織内で一様であること
一抗体と結合した抗原が長く細胞表面にとどまつていること
より具体的には、 たとえば、 抗体が認識する抗原が細胞膜表面に発現している 必要がある。 加えて、 がん組織を構成する細胞における抗原陽性細胞の割合がで きるだけ高いことが望まれる。 全ての癌細胞が抗原陽性であることが理想的な条 件である。 がん細胞集団の中で、 抗原陽性細胞と陰性細胞が混在する場合には、 抗体の臨床的な治療効果は望めない。
また、 通常、 できるだけたくさんの分子が細胞表面に発現しているほうが、 強 力なエフェクター機能を期待できる。 更に抗原に結合した抗体が細胞内に取り込 まれないことが重要である。 一部の受容体は、 リガンドとの結合の後に細胞内に 取り込まれる (endocytosis)場合がある。 抗体においても同様に、 細胞表面抗原に 結合した抗体が細胞内に取り込まれる場合がある。 このような現象によって抗体 が細胞内に取り込まれることを、 インターナリゼーシヨンと呼んでいる。 インタ ーナリゼーシヨンが起きると、 抗体の Fc領域が細胞内に取り込まれてしまう。 一 方、 エフヱクタ一機能に必要な分子あるいは細胞は、 抗原を発現している細胞の 外にある。 つまり、 インターナリゼーシヨンの結果、 抗体のエフェクター機能が 阻害されることになる。 したがって、 抗体のエフェクター機能を期待するときに は、 抗体のインターナリゼーシヨンを起こしにくい抗原を選ぶことが重要である。
FAM3Dがこのような特徵を備えた標的抗原であることは、 本発明者らによって 始めて明らかにされた。
本発明においてエフェク夕一機能とは、 抗体の定常領域 (Fc)が関与する細胞障 害作用を指す。 あるいは、 抗原に結合した抗体の Fcが、 その抗原を有する細胞を 障害する作用を駆動する機能を、 抗体のエフェクター機能と呼ぶこともできる。 より具体的には、 抗体依存性細胞障害作用 (Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity; ADCC)、 補体依存性細胞障害作用 (compliment dependent
Cytotoxicity; CDC) および中和活性 (neutralize activity)が、 抗体のェフエクタ 一機能として知られている。 各機能について以下に説明する。
抗体依存性細胞障害作用 (Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity;
ADCC):
ィムノグロブリンのうち、 IgG、 IgE、 あるいは IgAクラスのィムノグロブリン の Fc領域は、 それぞれに特異的な Fc受容体を持つ細胞が存在する。 対応する Fc受 容体を有する細胞は、 細胞膜などに結合した抗体を認識して結合する。 たとえば、 IgGクラスの抗体は、 T細胞、 NK細胞、 好中球、 およびマクロファージ上の Fc受 容体に認識される。 これらの細胞は、 IgGクラスの抗体の Fc領域に結合して活性 化され、 抗体が結合した細胞に対する障害作用を発現する。 抗体のエフェクター 機能を介して細胞障害作用を獲得する細胞群は、 エフェクター細胞と呼ばれる。 エフェクター細胞の種類に基づいて、 ADCCを次のように区別する場合がある。
ADMC: IgG抗体によるマクロファージの活性化機能、 および
ADCC: IgG抗体による NK細胞の活性化機能
本発明における ADCCのエフェクター細胞の種類は限定されない。 すなわち、 マクロファージをエフェクター細胞とする ADMCは本発明の ADCCに含まれる。 特に抗体を用いたがんの治療においては、 抗体の ADCCが抗腫瘍効果の重要な メカニズムを構成していることが指摘されている (Nature Med., 6: 443-446, 2000)。 たとえば抗 CD20抗体キメラ抗体の治療効果と ADCCとの密接な関係が報 告された (Blood, 99: 754-758, 2002)。 したがって、 本発明においても、 抗体のェ フエクタ一機能の中で ADCCは特に重要である。
たとえば既に臨床応用を開始しているハーセプチン (Hercept in) ゃリツキサン (Ri tuxan) の抗腫瘍効果の主要なメカニズムの一つは ADCCであると考えられてい る。 なお前者は転移性乳がんの、 また後者は非ホジキンリンパ腫 (non-Hodgkin' s ly即 homa) の治療薬である。
現在のところ、 ADCCによる細胞障害作用メカニズムは、 およそ次のように説 明されている。 すなわち、 細胞表面に結合した抗体を介して標的細胞と架橋され たエフェクター細胞が、 標的細胞に対して何らかの致死性のシグナルを伝達する ことによって、 標的細胞の細胞死が誘導されると考えられている。 いずれにせよ、 エフェクター細胞による細胞障害作用を誘導する抗体は、 本発明におけるェフエ クタ一機能を有する抗体に含まれる。
補体依存性細胞障害作用 (compliment dependent Cytotoxicity; CDC):
抗原と結合したィムノグロブリンの Fc領域は、 補体系路を活性化することが知 られている。 ィムノグロブリンのクラスにより、 活性化経路が異なる場合がある ことも明らかにされている。 たとえばヒト抗体においては、 IgMと IgGが古典経路 を活性化する。 一方、 IgA、 IgD、 および IgEは、 古典経路を活性化しない。 活性 化された補体は、 いくつかの反応を経て、 細胞膜障害活性を有する膜侵襲複合体 C5b-9(membrane attack complex! MAC)を生成する。 こうして生成された MAC は、 エフェクター細胞に依存することなく細胞膜やウィルス粒子を障害すると考 えられている。 MACによる細胞障害は次のようなメカニズムに基づいている。
MACは細胞膜に対する強い結合親和性を有する。 細胞膜に結合した MACは細胞 膜に穴をあける。 この穴によって水の出入りが容易となる。 その結果、 細胞膜の 不安定化、 あるいは浸透圧の変化などがもたらされ、 細胞が破壊される。 補体の 活性化による細胞障害作用は、 抗原に結合した抗体の近くにある膜にしか及ばな いとされている。 そのため、 MACによる細胞障害作用は抗体の特異性に依存して いる。 ADCCと CDCは相互に依存することなく細胞障害作用を発現することがで きる。 しかし、 生体内においては、 実際には、 これらの細胞障害作用が、 複合的 に作用している場合もあると考えられている。
中和活性 (neutralize activityノ:
抗体の中には、 毒素の活性や病原体の感染能力を奪う機能を有する抗体が存在 する。 抗体による中和は、 可変領域の抗原への結合によって達成される場合と、 補体の介在を必要とする場合があることが知られている。 たとえばウィルスに対 する抗体には、 ウィルスの感染能の喪失のために補体の存在を要求する場合があ る。 補体が関与するためには、 Fc領域が必要である。 すなわちこのような抗体は、 細胞やウィルスの中和のために Fcを必要とするエフェクター機能を有する抗体で ある。
本発明において、 エフェクター機能とは、 抗体の抗原認識が引き金となって発 現する生物活性を決定する役割、 ということもできる。 本発明における好ましい 標的細胞はがん細胞である。 そしてェフエクタ一細胞は各種抗体の Fc領域が担う 機能で, 抗体クラスに大きく依存している。 IgG、 IgE、 IgAクラスの抗体の Fc領 域はそれぞれに特異的な Fc受容体に結合し、 Fc受容体をもつ細胞を活性化したり, 抗体の細胞間トランスポートに働く。 特に IgGクラス抗体がェフエクタ一細胞上 の Fc受容体を介して、 これらのエフェクター細胞を活性化し、 抗体の可変領域が 結合した標的細胞を殺すことを ADCC (抗体依存性細胞障害) とよぶ。 ADCCに おいては、 T細胞、 NK細胞、 好中球、 あるいはマクロファージなどがェフエクタ —細胞として機能する。 一方、 補体を活性化する機能は IgMと IgGクラスの抗体に 限られ, 抗体の可変領域が結合した細胞を溶解させる機能を特に CDC (補体依存 性細胞障害) と呼ぶ。
これらのエフェクター機能の中で、 本発明において、 好ましいエフェクター機 能は、 ADCC、 および CDCのいずれか、 あるいは両方である。 本発明は、
FAM3Dを認識する抗体が、 FAM3Dを発現する細胞に結合してエフェクター機能 を発現することを明らかにしたことに基づいている。 また本発明は、 次の工程を含む FAM3D細胞を発現する細胞を障害するための 方法に関する。
FAM3Dに結合する抗体を前記 FAM3Dを発現する細胞に接触させる工程、 および
2) 前記 FAM3Dを発現する細胞に結合した前記抗体のエフェクター機能に よつて前記細胞を障害する工程
本発明の医薬組成物あるいは細胞を障害するための方法において、 FAM3Dを 発現する細胞は、 任意の細胞であることができる。 たとえば肺がん細胞は、 本発 明における FAM3Dを発現する細胞として好適である。 中でも、 非小細胞性肺が ん細胞 (non-small cell lung cancer; NSCLC) は、 本発明における FAM3D発現細 胞として好ましい。 細胞と抗体とは、 生体内 n w o)で、 あるいは生体外
vitro)において接触させられる。 FAM3Dを発現する細胞として生体内にある肺が ん細胞を対象とする場合には、 本発明の方法は肺がんの治療方法あるいは予防方 法に他ならない。 すなわち本発明は、 次の工程を含む、 肺がんの治療方法を提供 する。
1) FAM3Dに結合する抗体を肺がん患者に投与する工程、 および
2) 肺がん細胞に結合した前記抗体のェフエクタ一機能によつて前記細胞を 障害する工程
肺がんにおいて過剰発現している遺伝子として本発明者らが同定した FAM3D は、 生命維持に重要な臓器の細胞での発現がほとんどなく、 肺がん細胞表面に特 異的に発現することを確認している。 そして FAM3Dに対する抗体は、 肺がん細 胞表面の抗原を特異的に認識し、 そのエフェクター機能によりがん細胞障害活性 を免疫系細胞に誘導しうると考えられる。
FAM3Dに結合する抗体が、 そのエフェクタ一機能によつて FAM3Dを発現する 細胞、 特に肺がん細胞を効果的に障害することを本発明者らは確認している。 更 に本発明者らは、 FAM3Dが高い確率で肺がん細胞で高度に発現していることを 確認している。 加えて、 FAM3Dの正常組織における発現レベルは低い。 これら の情報を総合すれば、 FAM3Dの投与による肺がんの治療方法は、 副作用の危険 が小さい、 効果的な治療方法であると言うことができる。
本発明において、 抗体は、 目的とするエフェクター機能を有する限り、 限定 されない。 たとえば ADCCを発現するためには、 IgA、 IgE、 あるいは IgGの Fc 領域を有する抗体が必要である。 また CDCを発現するためには、 抗体の Fc領 域は、 IgMまたは IgGであることが望ましい。 したがって、 ヒ卜に由来するこ れらのクラスに属する抗体は、 本発明における好ましい抗体である。 ヒト抗体 は、 ヒトから採取された抗体産生細胞、 あるいはヒトの抗体遺伝子を移植され たキメラ動物 (Cloning and Stem Cells., 4: 85 95, 2002)などを利用して得るこ とができる。
また、 抗体の Fc領域は任意の可変領域に接合することができる。 すなわち、 異種の動物の可変領域にヒ卜の定常領域を接合したキメラ抗体が公知である。 あるいはヒト由来の可変領域に、 任意の定常領域を接合して、 ヒトーヒトキメ ラ抗体を得ることもできる。 更に、 ヒト抗体の可変領域を構成する CDRを異 種の抗体の CDRで置換する技術 (CDR graft)も公知である ("Immunoglobulin genes", Academic Press(London), pp260-274, 1989; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 969-973, 1994)。 CDRの置換により、 抗体の結合特異性が置換され る。 すなわち、 ヒトの FAM3Dに結合する抗体の CDRを移植されたヒト化抗体 は、 ヒトの FAM3Dを認識する。 移植された抗体は、 ヒト化抗体 (humanized antibody)とも呼ばれる。 このようにして得ることができる、 エフェクター機 能に必要な Fcを備えた抗体は、 可変領域の由来に関わらず、 本発明における抗 体として有用である。 たとえば、 可変領域として他のクラス、 あるいは他の種 のィムノグロプリンに由来するアミノ酸配列を含んでいても、 ヒト IgGの Fcを 有する抗体は、 本発明における好ましい抗体である。
本発明における抗体は、 モノクローナル抗体であっても、 ポリクローナル抗 体であってもよい。 ヒトに投与する場合であっても、 先に述べたヒトの抗体遺 伝子を移植された動物を用いて、 ヒトポリクローナル抗体を得ることもできる。 あるいはヒト化抗体、 ヒト—異種動物キメラ抗体、 ヒトーヒ卜キメラ抗体など の遺伝子工学的手法によって構築されたィムノグロブリンを用いることもでき る。 更に、 ヒト抗体産生細胞をクローン化することによって、 ヒトモノクロ一 ナル抗体を得る方法も知られている。
本発明の抗体を得るためには、 FAM3Dまたはその部分べプチドからなる断 片が免疫原として利用される。 本発明における FAM3Dの由来は、 任意の種で あることができる。 好ましくはヒト、 マウス、 またはラットなどの哺乳類に由 来し、 より好ましくはヒトに由来する。 ヒト FAM3Dの塩基配列、 並びにアミ ノ酸配列は公知である(NM— 138805)。 FAM3Dの cDNAの塩基配列を配列番 号: 1に、 その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号: 2に 示した。 与えられた塩基配列を有する遺伝子を単離し、 必要に応じてその断片 を調製し、 目的とするアミノ酸配列を有するタンパク質を得ることは当業者が 日常的に行っていることである。
たとえば FAM3Dタンパク質またはその断片をコードする遺伝子を、 公知の 発現ベクターに挿入した後に、 宿主細胞を形質転換するために使用することが できる。 所望のタンパク質、 またはその断片は、 宿主細胞の内外から任意の標 準的な方法により回収することができ、 またその後、 抗原として使用すること ができる。 または、 タンパク質もしくはその溶解物、 または化学的に合成され たタンパク質を、 抗原として使用することができる。 更に、 FAM3Dタンパク 質またはその断片を発現する細胞そのものを免疫原として利用することもでき る。
FAM3Dの免疫原として部分ペプチドを用いる場合には、 特に細胞外ドメイ ンと予測される領域を構成するアミノ酸配列を選択するのが望ましい。
FAM3Dの N末端 1-16にシグナルべプチドの存在が予測される。 したがって、 たとえば N末端側のシグナルペプチド (1 6アミノ酸残基) を除く領域は、 本 発明における抗体を得るための免疫原として好ましい。 すなわち、 FAM3Dの 細胞外ドメインに結合する抗体は、 本発明における抗体として好ましい。 . したがって、 FAM3Dの細胞外ドメインに結合することができる可変領域と、 エフェクター機能に必要な Fcを備えた抗体が、 本発明における好ましい抗体で ある。 ヒトに投与することを目的とする場合には、 IgGの Fcを備えることが望 ましい。
任意の哺乳動物をこの抗原で免疫化することができるが、 好ましくは、 細胞 融合に用いる親細胞との適合性を考慮に入れる。 一般に、 げっ歯類、 ゥサギ目、 または霊長類の動物を使用する。
げっ歯類の動物には、 例えばマウス、 ラット、 およびハムス夕一などが含ま れる。 ゥサギ目の動物には、 例えばゥサギが含まれる。 霊長類の動物には、 例 えば力二クイザル (Macaca fascicularis) 、 ァカゲザル、 マントヒヒ (sacred baboon) 、 およびチンパンジーなどの狭鼻猿類のサル (旧世界ザル) が含ま れる。
動物を抗原で免疫化する方法は当技術分野で公知である。 抗原の腹腔内注射 または皮下注射は、 哺乳類を免疫化する標準的な方法である。 具体的には、 抗 原は適量のリン酸緩衝食塩水 (PBS) や生理食塩水などで希釈および懸濁する ことができる。 所望ならば、 抗原懸濁物を、 フロイント完全アジュバントなど の適量の標準的なアジュバントと混合し、 乳濁液にした後、 哺乳動物に投与す ることができる。 好ましくは、 これに続いて、 適量のフロイント不完全アジュ バン卜と混合した抗原を、 4〜21日毎に複数回投与する。 適切な担体を免疫化 に使用することもできる。 上記のように免疫化を行った後に、 所望の抗体量の 増加に関して、 標準的な方法で血清を調べる。
FAM3Dのタンパク質に対するポリクローナル抗体は、 血清中の所望の抗体 の増加を調べた免疫化した哺乳類から血液を回収することにより、 および任意 の従来の方法で血清を血液から分離することにより、 調製することができる。 ポリクローナル抗体は、 ポリクローナル抗体を含む血清、 ならびに血清から単 離可能なポリクローナル抗体を含む画分を含む。 IgGまたは IgMは、 FAM3D タンパク質を認識する画分から、 例えば FAM3Dタンパク質を結合させたァフ ィニティカラムを用いて、 この画分をプロテイン Aまたはプロテイン Gのカラ ムでさらに精製することにより、 調製することができる。 本発明において、 ポ リクローナル抗体は、 抗血清のまま用いることもできる。 あるいは、 精製され た IgGや IgMを用いることもできる。
モノクローナル抗体を調製するため、 抗原で免疫化した哺乳類から免疫細胞 を回収し、 上述のように血清中の所望の抗体レベルの増加を調べ、 細胞融合に 使用する。 細胞融合に使用する免疫細胞は、 好ましくは脾臓から得られる。 上 記の免疫細胞と融合される他の好ましい親細胞には、 例えば哺乳類のミエロー マ細胞、 およびより好ましくは、 薬剤によって融合細胞を選択するための性質 を獲得したミエローマ細胞などが含まれる。
上記の免疫細胞およびミエ口一マ細胞は、 公知の方法、 例えば Milsteinらの 方法に従って融合することができる (Galfre, G.および Milstein, C.、 Methods. Enzymol. (1981) 、 73、 3-46) 。
細胞融合によって得られるハイプリドーマを、 HAT培地 (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 およびチミジンを含む培地) などの標準的な選択培地で培養 することにより、 選択することができる。 細胞培養は通常、 HAT培地中で数 日から数週間、 所望のハイプリドーマを除く他のすべての細胞 (融合していな い細胞) を死滅させるのに十分な期間、 継続する。 次に、 標準的な限界希釈を 行い、 所望の抗体を産生するハイプリドーマ細胞のスクリーニングおよびクロ 一二ングを行う。
ハイプリドーマを調製するための抗原で非ヒト動物を免疫化する上記の方法 に加えて、 EBウィルスに感染させた細胞などのヒトリンパ球を、 タンパク質、 タンパク質発現細胞、 またはこれらの溶解物を用いてインビトロで免疫化する ことができる。 次に、 免疫化されたリンパ球を、 無制限に分裂可能なヒト由来 のミエローマ細胞 (U266など) と融合させることにより、 タンパク質に結合 可能な所望のヒト抗体を産生するハイプリドーマが得られる (特開昭 63- 17688号) 。
得られたハイプリドーマを、 続いてマウスの腹腔に移植して腹水を抽出する。 得られたモノクローナル抗体を、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿、 プロテイン Aもしくはプロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、 また は本発明のタンパク質を結合させたァフィ二ティカラムによって精製すること ができる。 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質の精製および検出だけでなく、 本発明のタンパク質の作用物質および拮抗物質の候補として使用することもで きる。 また、 この抗体を、 本発明のタンパク質に関連する疾患の抗体療法に応 用することができる。 得られた抗体をヒトの身体に投与する場合 (抗体療法) は、 ヒト抗体またはヒト化抗体は免疫原性を低下させるために好ましい。
例えば、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジエニック動物を、 タンパク質、 タンパク質発現細胞、 またはこれらの溶解物から選択される抗原 で免疫化することができる。 次に抗体産生細胞を動物から回収し、 ミエローマ 細胞と融合させてハイプリドーマを得て、 このハイプリドーマからタンパク質 に対するヒト抗体を調製することができる (国際公開公報第 92-03918号、 国 際公開公報第 93-2227号、 国際公開公報第 94·02602号、 国際公開公報第 94- 25585号、 国際公開公報第 96-33735号、 および国際公開公報第 96-34096号を 参照) 。
または、 抗体を産生する免疫化されたリンパ球などの免疫細胞を、 癌遺伝子 によって不死化して、 モノクローナル抗体の調製に使用することができる。 このようにして得られたモノクローナル抗体は、 遺伝子工学的手法を用いて 調製することもできる (例えば、 Borrebaeck, C.A.K.および Larrick, J.W.、 Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers社 (英国、
1990) を参照) 。 例えば抗体をコードする DNAを、 ハイプリドーマまたは抗 体を産生する免疫化されたリンパ球などの免疫細胞からクローニングし、 適切 なベクターに挿入し、 宿主細胞に導入して、 組換え抗体を調製することができ る。 本発明には、 上述のように調製された組換え抗体を利用することもできる。 抗体は、 ポリエチレングリコール (PEG) などの様々な分子との結合によつ て修飾することができる。 このような修飾抗体を本発明に利用することもでき る。 修飾抗体は、 抗体を化学的に修飾することにより得られる。 このような修 飾法は当技術分野で常套的なものである。 抗体を他のタンパク質分子によって 修飾することもできる。 タンパク質分子で修飾された抗体は、 遺伝子工学的に 作成することができる。 すなわち、 抗体遺伝子と修飾タンパク質分子をコード する遺伝子の融合により、 目的とするタンパク質を発現させることができる。 たとえば、 サイト力インあるいはケモカインとの結合によって、 抗体のェフエ クタ一機能の強化が期待される。 実際、 IL-2や GM-CSFとの融合タンパク質に おいて、 抗体のエフェクター機能の強化が確認されている (Human Antibody, 10: 43-49, 2000)。 エフェクター機能を強化するサイトカインあるいはケモカ インとして、 IL-2、 IL 12, GM-CSF, TNF、 あるいは好酸球走化性物質
(RANTES)などを示すことができる。
または本発明の抗体は、 非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領 域とのキメラ抗体として、 または非ヒト抗体由来の相補性決定領域 (CDR) 、 ヒト抗体由来のフレームワーク領域 (FR) 、 および定常領域を含むヒト化抗 体として得られる。 このような抗体は、 公知の手法で調製することができる。 上述のように得られた抗体を均一になるまで精製することができる。 例えば、 抗体の分離および精製は、 一般的なタンパク質に関して用いられる分離法およ び精製法に従って実施することができる。 例えば抗体は、 ァフィ二テイクロマ トグラフィー、 濾過、 限外濾過、 塩析、 透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電 気泳動、 等電点電気泳動などを含むがこれらに限定されないカラムクロマトグ ラフィーを、 適切に選択し組み合わせることによって、 分離および単離するこ と力できる 、 「Antibodies: A Laboratory ManualJ 、 Harlowおよび David Lane i、 Cold Spring Harbor Laboratory、 1988) 。 使用することができる。 使用される例示的なプロテイン Aカラムには、 例えば Hyper D、 POROS, および Sepharose F.F. (Pharmacia) が含まれる。
例示的なクロマトグラフィー (ァフィニティクロマトグラフィーを除く) に は、 例えばイオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ゲル 濾過、 逆相クロマトグラフィー、 吸着クロマトグラフィーなどがある
( 「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course ManualJ 、 Daniel R. Marshakら編、 Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996) 。 クロマトグラフィーの手順は、 HPLCや FPLCな どの液相クロマトグラフィーにより実施することができる。
例えば、 吸光度の測定、 酵素結合免疫吸着アツセィ法 (ELISA) 、 酵素免疫 アツセィ法 (EIA) 、 放射免疫アツセィ法 (RIA) 、 および/または免疫蛍光法 を用いて、 本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。 ELISAでは、 本発明の抗体をプレー卜上に固定し、 本発明のタンパク質をプレート上に添加 した後に、 抗体産生細胞の培養上清または精製抗体などの所望の抗体を含む試 料を添加する。 次に、 一次抗体を認識しアルカリホスファターゼなどの酵素で 標識された二次抗体を添加し、 プレートをインキュベートする。 続いて洗浄後 に、 P-ニトロフエニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、 吸光度を測 定して、 試料の抗原結合活性を評価する。 タンパク質の断片 (C末端または N 末端の断片など) もタンパク質と同様に使用することができる。 BIAcore (Pharmacia) を用いて、 本発明に係る抗体の結合活性を評価することができ る。 更に、 たとえば実施例に示すような方法にしたがって、 抗体のエフェクター 機能を評価することもできる。 たとえば、 エフェクター機能を評価すべき抗体 の存在下で、 FAM3Dを発現する標的細胞とエフェクター細胞とをインキュべ —卜する。 標的細胞の破壊が検出されれば、 その抗体は ADCCを誘導するエフ ェク夕一機能を有していることが確認できる。 エフェクター機能のレベルは、 抗体またはエフェクター細胞のいずれかが無い条件下で観察される標的細胞の 破壊のレベルを対照として比較することができる。 標的細胞には、 FAM3Dを 発現していることが明らかな細胞を利用することができる。 具体的には、 実施 例において FAM3Dの発現が確認された各種の細胞株を用いることができる。 これらの細胞株は、 セルバンクから入手することができる。 そして、 より強力 なエフェクター機能を有するモノクローナル抗体が選択される。
本発明においては、 ヒトあるいは他の動物に FAM3Dに対する抗体を薬剤と して投与する。 本発明において、 抗体を投与するヒト以外の動物としては、 マ ウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ニヮトリ、 ネコ、 ィヌ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 サル、 ヒヒ、 チンパンジーなどを示すことができる。 抗体は、 対象に対 して直接投与することができるほか、 公知の薬学的調製法を用いて投与剤型に 製剤化することができる。 例えば必要に応じて、 水または他の任意の薬学的に 許容される液体との無菌性溶液もしくは懸濁液の注射液の形状で非経口的に投 与することができる。 例えば、 このような化合物は、 薬学的に許容される担体 または溶媒、 具体的には滅菌水、 生理食塩水、 植物油、 乳化剤、 懸濁剤、 界面 活性剤、 安定剤、 香味剤、 賦形剤、 溶剤、 保存剤、 結合剤などと共に、 一般に 容認された薬剤使用に必要な単位用量中に混合することができる。
生理食塩水、 グルコース、 およびアジュバント (D-ソルビトール、 D-マン ノース、 D-マンニトール、 および塩化ナトリウムなど) を含む他の等張性溶液 を、 注射用水溶液として使用することができる。 これらは、 アルコール、 具体 的にはエタノール、 ポリアルコール (例えばプロピレングリコールやポリェチ レングリコール) 、 非イオン性界面活性剤 (例えばポリソルベート 80 (商標) や HCO-50) ) などの適切な可溶化剤とともに使用することができる。
ゴマ油またはダイズ油を油性溶液として使用することができ、 可溶化剤とし て安息香酸ベンジルまたはべンジルアルコールとともに使用することができ、 また緩衝液 (リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液など) ;鎮痛薬 (塩酸 プロ力インなど) ;安定剤 (ベンジルアルコール、 フエノールなど) ;ならび に抗酸化剤を用いて製剤化することができる。 調製した注射液は適切なアンプ ルに充填することができる。
本発明において、 FAM3Dに対する抗体は、 例えば動脈内注射、 静脈内注射、 経皮内注射として、 また鼻腔内投与、 経気管支投与、 局所投与、 あるいは筋肉 内投与などの方法で患者に投与することができる。 たとえば肺がん患者に抗体 を全身投与する方法としては、 点滴あるいは注射による血管内投与 (静脈) が 一般的である。 抗体薬を肺がん原発巣もしくは肺内転移巣局所に集積させる方 法としては気管支鏡 (bronchoscopy)を用いた局所注入、 CTガイド下の局所注 入、 もしくは胸腔鏡下の局所注入 (Injection under CT guidance or with thoracoscopy) 等を利用することもできる。 更に、 動脈内力テ一テルをがん細 胞に栄養を供給する動脈付近まで挿入し、 抗体薬等の杭がん剤を局所注入する 方法は、 肺がん原発巣のみならず転移巣の局所コントロール治療にも有効であ る。
用量および投与方法は、 患者の体重および年齢ならびに投与方法に応じて変 化するが、 当業者であればこれらを慣例的に選択することができる。 更に抗体 をコードする DNAを遺伝子治療用のベクタ一に挿入し、 ベクタ一を治療のた めに投与することができる。 用量および投与方法は、 患者の体重、 年齢、 およ び症状に応じて変化するが、 当業者であればこれらを適切に選択することがで さる。
FAM3D抗体は、 生体において、 FAM3D発現細胞に対するエフェクター機 能に基づく細胞障害作用が確認できる量が投与される。 例えば、 症状によって ある程度の差があるものの、 FAM3D抗体の用量は、 1日当たり、 0.1 〜 250 mg/kgである。 通常、 成人 (体重 60kg) 1人当たりの投与量は、 5 mg〜: 17.5 g/day、 好ましくは 5 mg〜: I0 g/day、 より好ましくは 100 mg〜3 g/dayである。 投 与スケジュールとしては、 2日〜 1 0日間隔で、 1〜 1 0回、 たとえば 3〜6 回の投与を試みて経過が観察される。
加えて本発明は、 FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれら を発現することができる DNAまたは細胞を有効成分として含有する、 FAM3Dを 発現する細胞に対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための免疫原組 成物を提供する。 あるいは本発明は、 FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれらを発現することができる DNAまたは細胞の、 FAM3Dを発現する 細胞に対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための免疫原組成物の製 造における使用に関する。
FAM3D抗体の投与は、 そのエフェクター機能によってがん細胞を障害する。 したがって、 FAM3D抗体を生体内に誘導することができれば、 抗体の投与と同 等の治療効果を達成することができる。 抗原を含む免疫原組成物を投与すれば、 生体内において、 目的とする抗体を誘導することができる。 本発明の免疫原組成 物は、 FAM 3 Dを発現する細胞に対するワクチン療法を可能とする。 したがって、 本発明の免疫原組成物は、 たとえば肺がんの治療のためのワクチン組成物として 有用である。
本発明の免疫原組成物は、 FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片を有効成 分として含有することができる。 FAM3Dの免疫学的に活性な断片とは、 FAM3D を認識し、 かつエフェクター機能を有する抗体を誘導しうる断片を言う。 以下
FAM3Dおよびその免疫学的に活性な断片を、 免疫原タンパク質と記載する。 あ る断片が目的とする抗体を誘導するかどうかは、 実際に動物に免疫し、 誘導され る抗体の活性を確認することによって知ることができる。 抗体の誘導と、 その活 性の確認は、 たとえば実施例に記載したような方法によって実施することができ る。 たとえば、 FAM3Dの 28-172位あるいは 69-208位に相当するアミノ酸配列か らなる断片は、 本発明における免疫原として有用である。
本発明の免疫原組成物は、 有効成分である免疫原タンパク質に加えて、 薬学的 に許容される担体を含む。 更に必要に応じて、 アジュバントを組み合わせること ができる。 アジュバントとしては、 結核死菌、 ジフテリアトキソイド、 あるいは サポニンなどを利用することができる。
あるいは、 免疫原タンパク質をコードする DNA、 もしくは当該 DNAを発現可 能に保持した細胞を、 免疫原組成物として利用することもできる。 目的とする抗 原を発現する DNAを免疫原として用いる、 いわゆる DNAワクチンの手法は公知 である。 DNAワクチンは、 FAM3Dまたはその断片をコードする DNAを適当な発 現ベクターに組み込むことにより、 得ることができる。
ベクターには、 レトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノ随 伴ウィルスベクター、 並びにセンダイウィルスベクターなどを利用することがで きる。 更に、 免疫原タンパク質をコードする DNAをプロモーターの下流に機能的 に連結した DNAをネーキッド DNAとして直接細胞に導入し、 発現させることも 可能である。 ネ一キッド DNAは、 リボソームやウィルスエンベロープベクターな どに封入して細胞に導入することができる。
更に、 免疫原タンパク質を発現することができるベクターあるいは DNAを導入 した免疫原タンパク質発現細胞を、 本発明における免疫原組成物として利用する こともできる。 たとえば患者の血液細胞を回収し、 免疫原タンパク質を発現する ことができるベクターで形質転換し、 患者に戻すことができる。 形質転換された 血液細胞は、 患者の体内において免疫原タンパク質を産生し、 目的とする抗体を 誘導する。
免疫原タンパク質をコードする DNA、 あるいはそれによつて形質転換された細 胞を、 本発明の免疫原組成物として利用する場合には、 免疫原タンパク質ととも に、 その免疫原性を強化するキャリアータンパク質を併用することができる。 あるいは本発明は、 FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれ らを発現することができる DNAまたは細胞を投与する工程を含む、 FAM3Dを発 現する細胞に対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための方法を提供 する。 本発明の方法によって、 肺がんなどの FAM3D発現細胞を障害するェフエ クタ一機能を有する抗体が誘導される。 その結果、 肺がんなどの治療効果を得る ことができる。
本発明における免疫原組成物は、 経口、 あるいは非経口的に、 たとえば 0.1〜 250 mg kg/day投与することができる。 非経口的な投与には、 たとえば皮下注射、 あるいは静脈注射などが含まれる。 成人 1人あたりの投与量は、 通常、 5 mg 〜 17.5 g/day, 好ましくは 5 mg〜 10 g/day, より好ましくは 100 mg〜3 g/dayで ある。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、 参照として本明細書 に組み入れられる。 図面の簡単な説明
図 1は、 抗 FAM3D抗体を用いた ADCCアツセィの結果を示す図である。 図中、 縦軸は細胞障害活性 (%)、 横軸はエフェクター細胞:標的細胞比 (E:T比)を示す。 細胞障害活性は、 % specific lysis (特異的溶解) = 100 x (experimental cpm - spontaneous cpmノ /(maximum cpm - spontaneous。 111) {こより求め/こ。
experimental cpm: (実験的 cpm) 各条件において測定された上清の計数値 spontaneous cpm: (自発的 cpm) ノ ックグランドの計数値
maximum cpm: (最大計数値) 標識された標的細胞の計数値 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明する。 〔細胞株〕
ヒト肺癌細胞株は、 10¾ゥシ胎仔血清を添加した適切な培地中で、 単層として増 殖させた。 実験に用いた細胞株を表 1に示した。 表 1
Figure imgf000024_0001
更に、 抗 FAM3D抗体による ADCCアツセィに以下の細胞株を用いた。 :
肺腺癌 (ADC) ; LC319、 PC-14, NCI-H1373
肺扁平上皮癌 (SCO ; RERF-LC-AK EBC-K NCI-H2170, NCL-H226
小細胞肺癌 (SCLC) ; DMS114, SBC - 3、 SBC- 5。
〔抗体の作製〕
個々のタンパク質特異的抗体は、 標準の手順に従い、 細菌内で発現させた Hi s夕 グ融合夕ンパク質を免疫原として産生させた。 融合夕ンパク質には夕ンパク質の 一部 (28〜172残基および 69〜208残基) に相当するタンパク質の部分を組み入れ た。
〔フローサイトメトリー解析〕
癌細胞 (1 X 106個) を精製ポリクローナル抗体 (pAb) またはゥサギ IgG (対 照) とともに、 4でで 1時間インキュベートした。 細胞をリン酸緩衝食塩水 (PBS) で洗浄した後、 FITC標識 Alexa Flour 488中で 4 で 30分間インキュベートした。 細胞を PBSで洗浄し、 フローサイトメーター (FACScan、 Bec ton Dickinson) で分 析して ModFiぃノフトウエア (Ver i ty Sof tware House, Inc. ) により解析した。 平 均蛍光強度 (MFI) は、 フローサイトメーター強度の比率 (各タンパク質特異的抗 体による強度/ゥサギ IgGによる強度) として定義した。
抗 FAM3D抗体 BB016を用いて、 LC319、 PC- 14、 NCI- H1373、 RERF-LC-AK EBC_1、 NCI- H2170、 NCL-H226、 DMS114, SBC - 3、 および SBC-5細胞上の FAM3D発現を検査し た。 その結果、 抗 FAM3D抗体 (BB016) は、 ゥサギ IgG (対照) が結合するよりも高 い比率で全細胞に結合した (表 2 ) 。
表 2
Figure imgf000025_0001
a平均蛍光強度
b肺腺癌
c肺扁平上皮癌
d 小細胞肺癌
〔ADCCアツセィ法〕
標的細胞を51 Cr 100pCiとともに 37t:で 1時間標識した後、 これらの細胞を 10 分ごとに混合して懸濁状態を保った。 アツセィ用に添加する前に標的癌細胞を 2回 洗浄し、 その後 96ゥエル U底プレートに播種した (2 x l04細 ^ゥエル) 。 ヒト末 梢血単核細胞 (PMBC) を健常人から採取し、 Ficoll-Paque (Amersham
Biosciences) 密度勾配遠心分離により分離し、 エフェクター細胞として使用した。 様々な E:T比 (50:1、 25:1、 12.5:1、 および 6.25:1) の標的癌細胞 (T)およびェフエ クタ一細胞 (E)を、 抗 FAM3D抗体 BB016 (2pg/ゥエル) または対照抗体ハーセプ チン (2pg/ゥエル; Roche) とともに、 96ゥエル U底プレートで AIM-V培地
(Life Technologies, Inc.) 200μ1中、 3連で、 37 にて 6時間インキュベートした。
SBC-5細胞に対する抗 FAM3D抗体 (BB016) の ADCC効果は、 上清 (70μ1) の 放射能をガンマカウンターで測定した場合の測定値に基づいて評価した。 式:% 特異的溶解 = 100 χ (実験的 cpm - 自発的 cpm) I (最大 cpm - 自発的 cpm) に 従い、 特異的溶解の割合を算出した。 抗 FAM3D抗体 BB016のみまたはエフェク ター細胞のみと標的細胞をインキュベーションして対照アツセィとした。 ハーセ プチンは、 いくつかの実験において対照として用いた。 抗 FAM3D抗体 BB016自 体による SBC-5細胞に対する直接的な細胞障害は認められなかったが、 BB016は FAM3Dを過剰発現する SBC-5細胞に対して ADCCを誘導した (図 1 ) 。 産業上の利用の可能性
本発明によって、 FAM3Dを発現する細胞を抗体の細胞障害作用によって障害 できることが明らかにされた。 FAM3Dは肺がんで高発現している遺伝子として 本発明者らが同定した遺伝子である。 したがって、 FAM3Dに結合する抗体によ つて、 肺がんの治療が可能である。 実際本発明者らが確認した結果によれば、 肺 癌細胞株において、 FAM3D抗体存在下での ADCC効果による細胞障害が確認され た。

Claims

請求の範囲
1 . FAM3Dに結合する抗体を有効成分として含有する、 抗体のエフェクター機 能によつて FAM3Dを発現する細胞を障害するための医薬組成物。
2 . FAM3Dを発現する細胞が肺がん細胞である請求項 1に記載の医薬組成物。
3 . FAM3Dに結合する抗体が、 モノクローナル抗体である請求項 1に記載の医 薬組成物。
4. 抗体のエフェクター機能が、 抗体依存性細胞障害作用、 および補体依存性細 胞障害作用のいずれか、 または両方である請求項 1に記載の医薬組成物。 5 . 次の工程を含む、 FAM3Dを発現する細胞を障害するための方法。
FAM3Dに結合する抗体を前記 FAM3Dを発現する細胞に接触させる工程、 および
2) 前記 FAM3Dを発現する細胞に結合した前記抗体のエフェクター機能に よつて前記細胞を障害する工程 6 . FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれらを発現すること ができる DNAを有効成分として含有する、 FAM3Dを発現する細胞に対する エフェクター機能を有する抗体を誘導するための免疫原組成物。
7 . FAM3Dまたはその免疫学的に活性な断片、 もしくはそれらを発現すること ができる DNAまたは細胞を投与する工程を含む、 FAM3Dを発現する細胞に 対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための方法。
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