ES2283114T3 - Anticuerpo con capacidad de produccion mejorada. - Google Patents

Abstract

Una proteína anticuerpo que tiene las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal F19 (Nº de acceso ATCC HB 8269), uniéndose de forma específica dicha proteína anticuerpo a proteína activadora de fibroblastos, caracterizada porque contiene la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6.

Description

Anticuerpo con capacidad de producción mejorada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas anticuerpos que se unen específicamente a la proteína de activación de fibroblasto alfa (FAP\alpha). La invención también se refiere al uso de dichos anticuerpos con fines diagnósticos y terapéuticos y a procedimientos para la producción de dichos anticuerpos.

Antecedentes de la invención

El crecimiento invasivo de cánceres epiteliales está asociado con una serie de cambios celulares y moleculares característicos en el estroma de soporte. Un rasgo molecular altamente coherente del estroma reactivo de muchos tipos de cánceres epiteliales es la inducción de la proteína de activación de fibroblasto alfa (en lo sucesivo denominada FAP), una molécula de la superficie celular de fibroblastos estromales reactivos identificada originalmente con anticuerpos monoclonales F19 (Garin-Chesa P., Old L. J. and Rettig W. J. (1990) Cell surface glycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epithelial cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 7235). Puesto que el antígeno FAP se expresa selectivamente en el estroma de una gama de carcinomas epiteliales, independiente de la localización y tipo histológico, se ha desarrollado un concepto dirigido a FAP para la visualización, diagnóstico y tratamiento de cánceres epiteliales y otros estados patológicos determinados. Para este propósito, se desarrolló un anticuerpo denominado monoclonal F19 que se une de forma específica a FAP y se describe en la patente US 5.059.523 y en el documento WO 93/05804.

Un problema importante que se presenta cuando se usan anticuerpos no humanos para aplicaciones in vivo en seres humanos es que éstos producen rápidamente una respuesta de anticuerpos humanos frente a anticuerpos no humanos que reduce la eficacia del anticuerpo en pacientes e impide la administración continuada. La humanización de anticuerpos no humanos se consigue corrientemente de dos formas: (1) construyendo anticuerpos quiméricos no-humanos/humanos, en los que regiones variables o humanas están unidos a regiones constantes humanas (Boulianne G. L., Hozumi N. and Shulman, M.J. (1984) Production of functional chimeric mouse/human antibody Nature 312: 643) o (2) injertando las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las regiones variables no humanas en las regiones variables humanas y luego uniendo estas regiones variables "humanas remodeladas" a regiones constantes humanas (Riechmann L., Clark M., Waldmann H. and Winter G. (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332: 323). Chimeric antibodies, although significantly better than mouse antibodies, can still elicit an anti-mouse response in humans (LoBuglio A. F., Wheeler R. H., Trang J., Haynes A., Rogers K., Harvey E. B., Sun L., Ghrayeb J. and Khazaeli M. B. (1989) Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: Kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 4220). Los anticuerpos humanos injertados con CDR o remodelados contienen pocas o ninguna secuencia de proteína que puedan identificarse por derivarse de anticuerpos de ratón. Aunque un anticuerpo humanizado por injerto de CDR puede todavía ser capaz de inducir algunas reacciones inmunes, tales como una respuesta anti-alotipo o anti-idiotípica, como se aprecia incluso con anticuerpos humanos naturales, los anticuerpos injertados con CDR serán significativamente menos inmunógenos que un anticuerpo de ratón y de este modo posibilitarán un tratamiento más prolongado de pacientes.

Otra limitación importante en relación con el uso comercial de anticuerpos para diagnóstico, visualización y terapia es su capacidad de producción en grandes cantidades. En muchos casos la expresión recombinante de anticuerpos nativos, quiméricos y/o injertados con CDR en sistemas de cultivo de células es baja. Factores que contribuyen a una baja capacidad de producción pueden incluir la elección de secuencias guía y la elección de células hospedadoras para la producción, así como un plegamiento inapropiado y una secreción reducida. El plegamiento inapropiado puede conducir a un mal ensamblaje de cadenas pesadas y ligeras o una conformación incompetente que olvide la secreción de una o de ambas cadenas. Por lo general está aceptado que la cadena L confiere la capacidad de secreción de la proteína ensamblada. En algunos casos sustituciones múltiples o incluso sencillas pueden dar lugar a una mayor producción de anticuerpos.

Debido a la importancia clínica de localización inmunológica específica in vitro e in vivo de antígenos específicos relacionados con enfermedades para diagnóstico y terapia en seres humanos, existe una necesidad creciente de anticuerpos que combinan las características de especificidad antigénica, baja inmunogenicidad y alta capacidad de producción.

Por tanto, el problema subyacente de la presente invención fue proporcionar proteínas anticuerpos que combinen las propiedades de unión específica a FAP, baja inmunogenicidad en seres humanos y alta capacidad de producción en sistemas recombinantes.

Descripción de la invención

El problema técnico se soluciona por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona nuevas proteínas anticuerpos que tienen las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal F19 (nº de acceso ATCC HB 8269), uniéndose dichas proteínas anticuerpo de forma específica a proteína activadora de fibroblasto (FAP), caracterizadas porque tienen modificaciones en el marco conservado que dan lugar a una capacidad de producción mejorada en células hospedadoras al compararla con un anticuerpo quimérico que tiene las regiones variables de F19 y regiones constantes foráneas.

Tal y como se usa en la presente memoria, una "proteína anticuerpo" es una proteína con la especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal.

"Regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo monoclonal" se sobreentiende que son aquellas secuencias de aminoácidos implicadas en la unión específica de antígenos según Kabat (Kabat E. A., Wu T. T., Perry H. M., Gottesman K. S. and Foeller C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5ª Ed.). Nº de publicación NIH 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.) en relación con Chothia and Lesk (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917).

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "modificaciones en el marco conservado" se refiere al cambio, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en las regiones variables que rodean las regiones determinantes de complementariedad individuales. Las modificaciones en el marco conservado pueden tener impacto sobre la inmunogenicidad, capacidad de producción y especificidad de unión de una proteína anticuerpo.

"Proteína activadora de fibroblasto (FAP)", también designada proteína activadora de fibroblasto alfa (FAP\alpha), es una glicoproteína que se une a la membrana que pertenece a la familia de genes serina proteasa (documento WO 97/34927). No se conoce forma circulante o segregada de FAP. Se puede caracterizar la FAP por su unión al anticuerpo monoclonal F19 (F19 puede obtenerse a partir de la línea de células de hibridoma con el número de acceso HB 8269 depositada en la ATCC).

El término "unión específica a proteína activadora de fibroblasto" de una proteína anticuerpo se define en la presente memoria por su capacidad de reconocer de forma específica y unirse a células humanas que expresan FAP. La especificidad de unión de las proteínas de la invención se puede determinar por procedimientos convencionales para la determinación de la especificidad de unión tales como los descritos en forma de ejemplo en los ejemplos 6, 8 y en el ejemplo 12.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a una proteína anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena ligera y pesada como se describen en las figuras 17 y 18 y las regiones constantes foráneas. "Regiones constantes foráneas" tal y como se define en la presente memoria son regiones constantes que son diferentes de las regiones constantes de F19. Para comparar una proteína anticuerpo de la invención con un anticuerpo quimérico se sobrentiende que dicho anticuerpo quimérico debe contener las mismas regiones constantes que dicha proteína anticuerpo. A efectos únicamente de demostración y comparación las cadenas pesada y ligera constantes humanas tal y como se describen en las Figuras 19 a 22 se usan a modo de ejemplo.

Para proporcionar las proteínas anticuerpo de la presente invención, se determinaron las secuencias de ácido nucleico de los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo murino designado F19 a partir de ARN extraído de células de hibridoma F19 (nº de acceso ATCC HB 8269).

En una realización la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo que tienen las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal F19 (nº de acceso ATCC HB 8269), uniéndose dichas nuevas proteínas anticuerpo de forma específica a proteína activadora de fibroblasto (FAP), caracterizada porque tienen modificaciones en el marco conservado que dan lugar a una mejor capacidad de producción en células hospedadoras al compararla con un anticuerpo quimérico que tiene la región variable de F19 y regiones constantes foráneas, obteniéndose dicha proteína anticuerpo del anticuerpo murino designado F19 (nº de acceso ATCC HB 8269).

Para generar proteínas anticuerpo específicas de FAP humanizadas se construyó un anticuerpo quimérico, que tenía regiones variables de las cadenas ligera y pesada de F19 y regiones ligera y pesadas humanas, respectivamente. La construcción y producción de anticuerpos quiméricos de ratón/humanos es bien conocida (Boulianne et al. (1984), citado antes) y se demuestra a modo de ejemplo en los ejemplos 1 y 2.

Las regiones variables de las proteínas anticuerpo de la presente invención se unen de forma típica a al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (F_{C}), de forma típica la de una inmunoglobulina humana. Las secuencias de ADN de la región constante humana se pueden aislar de acuerdo con procedimientos bien conocidos a partir de una diversidad de células humanas, pero preferiblemente linfocitos B inmortalizados (véase Kabat et al., supra, y el documento WO 87/02671). Por ello, las proteínas anticuerpo de la invención pueden contener todas o solo una porción de la región constante siempre que presenten unión específica al antígeno FAP. La elección del tipo y longitud de la región constante depende de si el efector funciona como fijación de complemento o se desea toxicidad celular dependiente del anticuerpo, y de las propiedades farmacológicas deseadas de la proteína anticuerpo. La proteína anticuerpo de la invención será típicamente un tetrámero consistente en dos parejas de cadena ligera/cadena pesada, pero puede ser también dimérica, es decir, consistente en una pareja de cadena ligera/cadena pesada, por ejemplo, un fragmento Fab o Fv.

Por tanto, en otra realización la invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, caracterizadas porque tienen una región de la cadena ligera variable y una región de la cadena pesada variable, cada una unida a una región constante humana. En particular, la región variable de la cadena ligera se unía una región constante kappa humana y la región variable de la cadena pesada se unía a una región constante gamma-1 humana. También están disponibles para el experto otras regiones constantes humanas para humanizar cadenas ligeras y pesadas.

Por tanto, en una realización particular las proteínas anticuerpo de la invención contienen una región constante kappa humana.

Además, en otra realización particular las proteínas anticuerpo de la invención contienen una región constante gamma-1 humana.

Una proteína "anticuerpo F19 quimérica" (cF19) particular comprende las regiones variable y constante de la cadena ligera y pesada descritas en las Figuras 17 a 22. cF19 demuestra unión específica y alta avidez por el antígeno FAP. Como se demuestra en el Ejemplo 2, la expresión de cF19 en células COS (células derivadas del riñón del mono verde africano) es baja, variando de aproximadamente 10 a 60 ng/ml, que es como mínimo 10 veces menos que la mayoría de anticuerpos.

En un intento por aumentar los niveles de expresión de cF19, la secuencia guía de la región V_{L} de F19 se cambió por sustitución de prolina a leucina en la posición -9. Este cambio sencillo en aminoácidos en la secuencia guía dio como resultado que al menos se dobló la cantidad de anticuerpo quimérico producido en células COS. Para la expresión de este anticuerpo quimérico particular en células COS se usaron la siguiente secuencia guía mutada de la cadena ligera: MDSQAQVLMLLLLWVSGTCG, y la siguiente secuencia guía de la cadena pesada: MGWSWVFLFLLSGTAGVLS.

De acuerdo con la invención, el término "capacidad de producción mejorada" en células hospedadoras se refiere a una mejora sustancial de los niveles de expresión y/o rendimientos de anticuerpo purificado cuando se compara con los niveles de expresión y/o niveles de anticuerpo de un anticuerpo quimérico sin modificaciones en el marco conservado como se ha definido antes. Se ejemplifican dos ejemplos particulares pero no limitantes para demostrar la capacidad de producción mejorada por el sistema de expresión de células COS (en los ejemplos 2 y 5) y para el sistema de expresión de células CHO (en los ejemplos 10 y 11).

Aunque la mutación de la secuencia guía solo conduce a doblar el rendimiento de expresión del anticuerpo F19 quimérico, una mejora sustancial como se define en la presente memoria se refiere a una mejora en el nivel de expresión y/o rendimiento de purificación de al menos un factor de 10.

En una realización preferida, la invención se refiere a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque sus niveles de expresión en muestras de medio bruto tal y como se determina por ELISA y/o anticuerpo purificado superan los niveles de expresión y/o niveles de purificación de los anticuerpos quiméricos sin modificaciones en el marco conservado al menos en un factor de 10.

En una realización más preferida, la invención se refiere a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque sus niveles de expresión en muestras de medio bruto tal y como se determina por ELISA y/o anticuerpo purificado superan los niveles de expresión y/o niveles de purificación de los anticuerpos quiméricos sin modificaciones en el marco conservado al menos en un factor de 20.

En la realización más preferida, la invención se refiere a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque sus niveles de expresión en muestras de medio bruto tal y como se determina por ELISA y/o anticuerpo purificado superan los niveles de expresión y/o niveles de purificación de los anticuerpos quiméricos sin modificaciones en el marco conservado al menos en un factor de 100.

La capacidad de producción de las proteínas anticuerpo recombinantes de la invención se puede demostrar para células eucarióticas en general como se muestra en células eucarióticas COS y CHO (células derivadas de ovario de hámster chino) (véanse los ejemplos 5 y 11). En otra realización, la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo recombinantes caracterizadas porque éstas presentan una capacidad de producción mejorada en células eucarióticas.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo, en la que dicha célula eucariótica es una célula de ovario de hámster chino (célula CHO).

Se encontró inesperadamente que ciertas modificaciones en el marco conservado de las regiones variables de la cadena ligera determinan la capacidad de producción mejorada de las proteínas anticuerpo de la invención. Se prepararon tres versiones de las regiones variables de la cadena ligera remodelada, designadas versión A, B y C, como se describe en las Figuras 1 a 6.

Las versiones A, B y C de la región variable de la cadena ligera demuestran sustancialmente una capacidad de producción mejorada en células CHO (véase el ejemplo 11). Aunque las versiones A y C de la región variable de la cadena ligera se diferencian de la versión B de la región variable de la cadena ligera en solo dos residuos aminoacídicos, éstas presentan una mejora todavía más sustancial en la capacidad de producción. Existe al menos otra diferencia de 10 veces en los niveles de secreción de anticuerpo entre la versión B de la cadena ligera de F19 humana remodelada y las versiones A o C. La versión A y B de la cadena ligera de F19 humana remodeladas solo se diferencian en sus secuencias de aminoácidos por dos residuos en las posiciones (mutación Tyr a Phe) y 87 (mutación Tyr a Asp) (nomenclatura según Kabat). Este efecto negativo en la capacidad secretora de anticuerpos que contienen la versión B de la región variable de la cadena ligera podría haber sido indirecto si las mutaciones Tyr a Asp y Tyr a Phe, consideradas de forma individual o en conjunto, únicamente causaran un plegamiento inapropiado de la proteína. Pero es improbable que este sea el caso puesto que los ensayos de unión a antígenos muestran que las inmunoglobulinas que contienen la versión B de la cadena ligera de F19 tienen afinidades similares por aquellos emparejados con las versiones A y C de la cadena ligera de F19, sugiriendo que éstos no se plegaron inapropiadamente en una gran extensión.

El residuo 87 en la versión B de la cadena ligera de F19 humana remodelada parece ser particularmente responsable de la reducción de la secreción cuando se compara con las versiones A y C.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, en las que el aminoácido en la posición 87 de Kabat de la región de la cadena ligera no es asparagina.

En una realización más preferida, la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, en las que el aminoácido en la posición 87 de Kabat de la región de la cadena ligera se selecciona de aminoácidos aromáticos o alifáticos.

En una realización más preferida, la invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, en las que el aminoácido aromático en la posición 87 de Kabat de la región de la cadena ligera es una tirosina o fenilalanina.

En otra realización preferida, la presente invención también se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, en las que el aminoácido en la posición 36 de Kabat de la región de la cadena ligera se selecciona de aminoácidos aromáticos.

En una realización particular, la invención se refiere a las proteínas anticuerpo específicas que se pueden preparar a partir de las regiones variables remodeladas descritas a título individual de las cadenas ligera y pesada.

En especial, las versiones A y C de la región variable de la cadena ligera son particularmente adecuadas para poner en práctica la invención debido a su capacidad de producción excepcionalmente alta, manteniendo al mismo tiempo la especificidad de unión a FAP completa y consiguiendo una baja inmunogenicidad. Esto es especialmente cierto cuando se compara con el anticuerpo quimérico que tiene las regiones variables de F19 y las mismas regiones constantes pero también cuando se compara con la versión B de la cadena ligera.

Por tanto, en una realización la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo que contienen la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2.

En otra realización la invención se refiere también a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 1.

En una realización la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo que contienen la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 6.

En otra realización la invención se refiere también a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 5.

La presente invención también describe varias regiones variables diferentes de la cadena pesada que funcionan particularmente bien con las regiones variables de las versiones A y C de la cadena ligera en términos de capacidad de producción mejorada.

En una realización la invención se refiere a proteínas anticuerpo que contienen una región variable de la cadena pesada como se describe en una cualquiera de SEQ ID N^{os}: 8, 10, 12, 14.

En otra realización la invención se refiere a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque la región variable de la cadena pesada está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID N^{os}: 7, 9, 11, 13.

En una realización muy particular la invención se refiere a proteínas anticuerpo que contienen la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2 y la región variable de la cadena pesada tal como se describe en la SEQ ID Nº: 12. Lo más preferible, esta proteína anticuerpo contiene adicionalmente la región constante de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 20 y la región constante de la cadena pesada tal como se describe en la SEQ ID Nº: 22.

Así, otro aspecto de la presente invención es una proteína anticuerpo que contiene una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2. Más preferiblemente, dicha proteína anticuerpo contiene además una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 12. Más preferiblemente, dicha proteína anticuerpo contiene además una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 20 y una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 22. Otro aspecto de la invención es una proteína anticuerpo como se describe en este párrafo que está conjugada con un isótopo radiactivo, con preferencia ^{131}I, ^{125}I, ^{186}Re, ^{188}Re o ^{90}Y. Un aspecto adicional de la presente invención es una molécula de ADN que codifica una proteína anticuerpo como la descrita en este párrafo. Otro aspecto de la invención es una célula hospedadora que porta dicha molécula de ADN. Por consiguiente, otro aspecto de la invención es un procedimiento para producir una proteína anticuerpo como la descrita en este párrafo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de cultivar dicha célula hospedadora en condiciones en las que dicha proteína anticuerpo sea expresada por dicha célula hospedadora y aislar dicha proteína. Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende una proteína anticuerpo de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización particular la invención se refiere a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 1 y la región variable de la cadena pesada está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº:11.

En otra realización particular la invención se refiere a proteínas anticuerpo que contienen la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2 y la región variable de la cadena pesada tal como se describe en la SEQ ID Nº: 8.

En una realización particular la invención se refiere a proteínas anticuerpo, caracterizadas porque la región variable de la cadena ligera está codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 1 y la región variable de la cadena pesada está codificada por una secuencia nucleotídica tal como se describe en la SEQ ID Nº:. 7.

La humanización de la región variable de un anticuerpo murino se puede conseguir empleando procedimientos conocidos en la técnica. El documento EP 0239400 describe el injerto de las CDR de una región variable murina en el marco conservado de una región variable humana. El documento WO 90/07861 describe procedimientos para remodelar una región variable injertada con CDR introduciendo otras modificaciones en el marco conservado. El documento WO 92/11018 describe procedimientos para producir Ig humanizada combinando CDR donantes con un marco conservado aceptor que tiene una alta homología con el marco conservado donante. El documento WO 92/05274 describe la preparación de anticuerpos mutados en el marco conservado partiendo de un anticuerpo murino. Otras referencias de la técnica anterior relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales murinos son los documentos EP 0368684; EP 0438310; WO 92/07075 o WO 92/22653. Así, el experto puede producir los anticuerpos de la presente invención partiendo del anticuerpo monoclonal murino F19 disponible públicamente y empleando técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, por el documento WO 92/05274. Las moléculas de ADN que codifican las proteínas anticuerpo de la presente invención se pueden obtener naturalmente por procedimientos de síntesis conocidos por el estado de la técnica, por ejemplo, por síntesis química de oligonucleótidos apropiados y los posteriores procedimientos de ligación y amplificación (véase por ejemplo Frank et al. (1987) Methods Enzymol. 154: 221-249).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen la información de codificación de las proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención como se ha descrito antes. Con preferencia, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID N^{os}: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, ó 15.

Otro aspecto de la presente invención es un vector ADN recombinante que contiene la secuencia de nucleótidos de uno cualquiera de los ácidos nucleicos anteriormente citados, en especial cuando dicha secuencia de nucleótidos está unida operativamente a una secuencia control de expresión tal como en vectores de expresión. Se prefiere un vector ADN recombinante, siendo dicho vector un vector de expresión.

Otro aspecto de la presente invención es una célula hospedadora que porta un vector como el descrito, en especial un vector de expresión. Dicha célula hospedadora puede ser una célula procariótica o eucariótica. Con preferencia, dicha célula hospedadora es una célula eucariótica, una célula de levadura o una célula de mamífero. Más preferiblemente, dicha célula hospedadora es una célula CHO (ovario de hámster chino) o una célula COS.

Por consiguiente, todavía otro aspecto adicional de la presente invención es un procedimiento para producir proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención. Dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a)

cultivar una célula hospedadora como la que se ha descrito antes en condiciones en las que dicha proteína anticuerpo sea expresada por dicha célula hospedadora, y

(b)

aislar dicha proteína anticuerpo.

Se prefieren células hospedadoras de mamífero, con preferencia células CHO o COS. Las células hospedadoras para producir las proteínas anticuerpos de la invención se pueden transfectar con un vector único que contiene las unidades de expresión para ambas, la cadena ligera y la cadena pesada (véase por ejemplo el documento WO 94/11523). En una realización particular, el procedimiento para producir proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención se refiere a células hospedadoras, en el que dichas células hospedadoras se cotransfectan con dos plásmidos que portan las unidades de expresión para las cadenas ligera y pesada, respectivamente (véase por ejemplo el documento EP 0481790).

Las proteínas anticuerpo de la invención proporcionan una herramienta altamente específica para dirigir agentes terapéuticos al antígeno FAP. Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, en el que dicha proteína anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico. De los muchos agentes terapéuticos conocidos en la técnica, se prefieren los agentes terapéuticos seleccionados del grupo consistente en isótopos radiactivos, toxinas, toxoides, agentes inflamatógenos, enzimas, moléculas no codificantes, péptidos, citoquinas y agentes quimioterápicos. Entre los isótopos radiactivos se pueden usar como agente terapéutico isótopos radiactivos que emiten radiación gamma, beta y alfa. Se prefieren como isótopos radiactivos aquellos que emiten radiación \beta. Para conseguir una irradiación localizada y una destrucción de células tumorales malignas han demostrado ser particularmente útiles ^{186}Renio, ^{188}Renio, ^{131}Yodo e ^{90}Itrio. Por tanto, son particularmente preferidos como agentes terapéuticos conjugados con proteínas anticuerpo de la invención los isótopos radiactivos seleccionados del grupo consistente en ^{186}Renio, ^{188}Renio, ^{131}Yodo e ^{90}Itrio. Por ejemplo, para la yodación radiactiva de un anticuerpo de la invención, se puede emplear un procedimiento como el descrito en el documento WO 93/05804.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, caracterizadas porque éstas están marcadas. Dichos anticuerpos marcados específicos de FAP permiten la localización y/o detección del antígeno FAP in vitro y/o in vivo. Una etiqueta se define como un marcador que puede ser detectable directa o indirectamente. Un marcador indirecto se define como un marcador que no puede detectarse por si mismo sino que necesita un marcador directamente detectable adicional específico para el marcador indirecto. Etiquetas preferidas para llevar a la práctica la invención son marcadores detectables. De una gran variedad de marcadores detectables, el más preferido es un marcador detectable seleccionado del grupo consistente en enzimas, colorantes, isótopos radiactivos, digoxigenina y biotina.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, caracterizadas porque éstas están conjugadas con un agente visualizable. Están disponibles de la técnica anterior una gran diversidad de agentes visualizables, en especial isótopos radiactivos. Para llevar a la práctica la invención son más preferidos los isótopos que emiten radiación gamma. El más preferido es ^{125}Yodo.

Un aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen una proteína anticuerpo de acuerdo con la presente invención como se ha descrito antes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles para tratar tumores, asociándose dichos tumores con fibroblastos estromales activados. Existen dos principios efectores posibles para una inmunoterapia estromal antitumoral que pueden actuar de forma sinérgica: (a) Un anticuerpo no modificado (no conjugado, "sin conjugar") de acuerdo con la invención puede inducir una destrucción inmune o reacciones inflamatorias en el estroma tumoral mientras que (b) un anticuerpo conjugado con un agente terapéutico, tal como por ejemplo un isótopo radiactivo u otra sustancia tóxica, puede conseguir una irradiación localizada y una destrucción de las células tumorales malignas. Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención es el uso de una proteína anticuerpo como la descrita para la fabricación de una composición farmacéutica, en especial para el tratamiento de tumores.

Una realización adicional son composiciones farmacéuticas que contienen una proteína anticuerpo de acuerdo con la invención conjugada con un agente terapéutico como se ha descrito antes y un vehículo farmacéuticamente aceptable útil para tratar tumores, asociándose dichos tumores con los fibroblastos estromales activados. Otra realización se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen una proteína anticuerpo de acuerdo con la presente invención conjugada con un agente visualizable como el que se ha descrito antes y un vehículo farmacéuticamente aceptable útil para visualizar la presencia de fibroblastos estromales activados en una herida cicatrizante, piel inflamada o un tumor en un paciente humano. Una realización más preferida se refiere a las composiciones farmacéuticas citadas antes, en las que dichos tumores son tumores seleccionados del grupo de cánceres consistente en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga invasivos, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro.

En el cuerpo de un animal o ser humano, se puede demostrar que es ventajoso aplicar las composiciones farmacéuticas que se han descrito antes por vía intravenosa o por otra vía, por ejemplo, por vía sistémica, local o tópica al tejido u órgano de interés, dependiendo del tipo y origen de la enfermedad o problema tratado, por ejemplo, un tumor. Por ejemplo, se desea un modo de acción sistémico cuando es necesario el tratamiento de diferentes órganos o sistemas de órganos como, por ejemplo, en enfermedades autoinmunes sistémicas, o alergias o trasplantes de órganos o tejidos extraños, o tumores que son difusos o difíciles de localizar. Se podría considerar un modo de acción local cuando solo se esperan manifestaciones locales de la acción neoplásica o inmunológica, tal como por ejemplo, tumores
localizados.

Las proteínas anticuerpo de la presente invención se pueden aplicar por diferentes vías de aplicación conocidas por el experto, particularmente inyección intravenosa o inyección directa en tejidos diana. Para la aplicación sistémica, se prefieren las vías intravenosa, intravascular, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, oral o intratecal. Se puede efectuar una aplicación más local por vía subcutánea, intracutánea, intracardial, intralobular, intramedular, intrapulmonar o directamente en, o cerca del tejido a tratar (tejido conjuntivo, óseo, muscular, nervioso, epitelial). Dependiendo de la duración deseada y la eficacia del tratamiento, se pueden administrar las composiciones farmacéuticas de anticuerpo una o varias veces, también intermitentemente, por ejemplo a diario durante varios días, semanas o meses y en diferentes dosis.

Para preparar preparaciones de anticuerpo adecuadas para las aplicaciones descritas antes, el experto puede usar soluciones estériles inyectables y fisiológicamente aceptables conocidas. Para preparar una solución lista para el uso para inyección parenteral o infusión, están fácilmente disponibles soluciones isotónicas acuosas, tales como, p. ej., solución salina o correspondientes soluciones de proteínas en el plasma. Las composiciones farmacéuticas pueden estar presentes en forma de liofilizados o preparaciones secas, las cuales se pueden reconstituir con una disolución inyectable conocida, directamente antes del uso bajo condiciones estériles, p. ej. en forma de un kit de partes. La preparación final de las composiciones de anticuerpo de la presente invención se prepara por inyección, infusión o perfusión mezclando anticuerpos purificados de acuerdo con la invención con una solución estéril fisiológicamente aceptable, que puede estar suplementada con sustancias vehículo conocidas y/o aditivos (por ejemplo albúmina sérica, dextrosa, bisulfito sódico, EDTA).

La cantidad de anticuerpo aplicado depende de la naturaleza de la enfermedad. En pacientes con cáncer, la dosis aplicada de un anticuerpo "sin conjugar" puede variar de 0,1 a 100 mg/m^{2}, preferiblemente de 5 a 50 mg/m^{2} por aplicación. Para anticuerpos marcados con isótopos radiactivos, por ejemplo con yodo-131, tiene que determinarse la dosis máxima tolerada (DMT), la cual no puede superarse en condiciones de tratamiento terapéutico. La aplicación de un anticuerpo marcado con isótopos radiactivos a pacientes con cáncer se puede llevar a cabo por infusión intravenosa repetida (mensual o semanalmente) de una dosis que está por debajo de la DMT (véase por ejemplo Welt et al. (1994) J. Clin. Oncol. 12: 1193-1203).

Además, un aspecto de la presente invención se refiere al uso de las proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención para el tratamiento de cáncer. En una realización preferida la presente invención se refiere al uso de proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención conjugadas con un agente terapéutico como se ha descrito antes para el tratamiento de cáncer. En otra realización preferida la presente invención se refiere al uso de proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención conjugadas con un agente visualizable para visualizar fibroblastos estromales activados. En otra realización preferida la presente invención se refiere al uso de proteínas anticuerpo marcadas de acuerdo con la invención para detectar la presencia de fibroblastos estromales activados en una muestra.

Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para tratar tumores, en el que el tumor está asociado con fibroblastos estromales activados capaces de formar especialmente un complejo con proteínas anticuerpo de acuerdo con la invención, presentes como anticuerpos sin conjugar/no modificados, proteínas anticuerpo modificadas tales como por ejemplo, proteínas de fusión o proteínas anticuerpo conjugadas con un agente terapéutico, que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad eficaz de dichos anticuerpos. En una realización más preferida la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar tumores como se ha citado antes, en el que el tumor es un tumor que tiene células cancerosas seleccionado del grupo de cánceres consistente en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga invasivos, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro. El procedimiento de tratar tumores como se ha descrito antes se puede llevar a cabo in vitro o in vivo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de fibroblastos estromales activados en heridas en cicatrización, inflamación o en tumores, caracterizado porque

(a)

se pone en contacto una muestra, que posiblemente contiene fibroblastos estromales activados con una proteína anticuerpo de acuerdo con la invención en condiciones adecuadas para la formación de un complejo entre dicho anticuerpo y antígeno,

(b)

detectar la presencia de dicho complejo, detectando de este modo la presencia de fibroblastos activados en heridas en cicatrización, inflamación o tumor.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de fibroblastos estromales activados en un tumor, en el que el tumor es un tumor que tiene células cancerosas seleccionado del grupo de cánceres consistente en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro. Las proteínas anticuerpo más preferidas de la invención son aquellas que se caracterizan porque están marcadas como se ha citado antes.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para visualizar la presencia de fibroblastos estromales activados en una herida en cicatrización, tejido inflamado (artritis reumatoide y cirrosis también son positivos) o un tumor, en un paciente humano, caracterizado porque

(a)

se administra una proteína anticuerpo de acuerdo con la presente invención conjugada con un agente visualizable a un paciente humano en condiciones adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-antígeno,

(b)

visualizar cualquier complejo formado de este modo,

(c)

visualizar de este modo la presencia de fibroblastos estromales activados en un paciente humano.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento para visualizar la presencia de fibroblastos estromales activados como se ha descrito antes en un tumor, en el que el tumor es un tumor que tiene células cancerosas seleccionado del grupo de cánceres consistente en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar estroma tumoral, caracterizado porque

(a)

se pone en contacto una muestra adecuada con una proteína anticuerpo de acuerdo con la presente invención, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-antígeno,

(b)

detectar la presencia de cualquier complejo así formado,

(c)

relacionar la presencia de dicho complejo con la presencia de estroma tumoral.

Las proteínas anticuerpo para llevar a la práctica la invención están marcadas preferiblemente con un marcador detectable.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para visualizar estroma tumoral, en un paciente humano que comprende

(a)

administrar al paciente un anticuerpo de acuerdo con la presente invención conjugado con un agente como se ha descrito antes en condiciones adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-antígeno,

(b)

visualizar cualquier complejo así formado, y de este modo visualizar la presencia de estroma tumoral en un paciente humano.

Leyendas de las figuras

Fig. 1. Secuencia de ADN de la versión A de la región variable de la cadena ligera remodelada humana de F19 (hF19L_{A}) SEQ ID Nº:1.

Fig. 2. Secuencia de aminoácidos de la versión B de la región variable de la cadena ligera remodelada humana de F19 (hF19L_{A}) SEQ ID Nº:.2.

Fig. 3. Secuencia de ADN de la versión B de la región variable de la cadena ligera remodelada humana de F19 (hF19L_{B}) SEQ ID Nº:. 3. Los nucleótidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 4. Secuencia de aminoácidos de la versión B de la región variable de la cadena ligera remodelada humana de F19 (hF19L_{B}) SEQ ID Nº:. 4. Los aminoácidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 5. Secuencia de ADN de la versión C de la región variable de la cadena ligera remodelada humana de F19 (hF19L_{C}) SEQ ID Nº:. 5. Los nucleótidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 6. Secuencia de aminoácidos de la versión C de la región variable de la cadena ligera remodelada humana de F19 (hF19L_{C}) SEQ ID Nº:. 6. Los aminoácidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 7. Secuencia de ADN de la versión A de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{A}) SEQ ID Nº:.7.

Fig. 8. Secuencia de aminoácidos de la versión A de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{A}) SEQ ID Nº:.8.

Fig. 9. Secuencia de ADN de la versión B de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{B}) SEQ ID Nº:. 9. Los nucleótidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 10. Secuencia de aminoácidos de la versión B de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{B}) SEQ ID Nº:.10. Los aminoácidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 11. Secuencia de ADN de la versión C de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{C}) SEQ ID Nº:. 11. Los nucleótidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 12. Secuencia de aminoácidos de la versión C de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{C}) SEQ ID Nº:. 12. Los aminoácidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 13. Secuencia de ADN de la versión D de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{D}) SEQ ID Nº:. 13. Los nucleótidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 14. Secuencia de aminoácidos de la versión D de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{D}) SEQ ID Nº:.14. Los aminoácidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 15. ecuencia de ADN de la versión E de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{E}) SEQ ID Nº:. 15. Los nucleótidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 16. Secuencia de aminoácidos de la versión E de la región variable de la cadena pesada remodelada humana de F19 (hF19H_{E}) SEQ ID Nº:.16. Los aminoácidos que se diferencian de la versión A están subrayados y en negrita.

Fig. 17. Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera quimérica F19 (chF19LC) SEQ ID Nº: 17.

Fig. 18. Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada quimérica F19 (chF19HC) SEQ ID Nº: 18.

Fig. 19. Secuencia de ADN de la cadena constante ligera kappa humana SEQ ID Nº: 19.

Fig. 20. Secuencia de aminoácidos de la cadena constante ligera humana SEQ ID Nº: 20.

Fig. 21. Secuencia de ADN de la cadena constante pesada humana SEQ ID Nº: 21.

Fig. 22. Secuencia de aminoácidos de la cadena constante pesada humana SEQ ID Nº: 22.

Fig. 23. Vectores de expresión de células de mamíferos usados para producir anticuerpos humanos quiméricos y remodelados con cadenas ligeras kappa humanas y cadenas pesadas gamma-1 humanas.

A.

Vector de expresión de la cadena ligera: pKN 100

B.

Vector de expresión de la cadena pesada: pG1D105

Fig. 24. Secuencias de ADN y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de F19 de ratón tal como se modificó para usar en la construcción de la cadena ligera de F19 quimérica. Los sitios de restricción están indicados por letras en negrita. La secuencia de Kozak, CDR 1 a 3 y el sitio donante de corte y empalme están subrayados.

Fig. 25. Secuencias de ADN y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de F19 de ratón tal como se modificó para usar en la construcción de la cadena pesada de F19 quimérica. Los sitios de restricción están indicados por letras en negrita. La secuencia de Kozak y el sitio donante de corte y empalme están subrayados.

Fig. 26. Secuencia de ADN del anticuerpo quimérico F19 clonado en vector de expresión de mamífero pKN100. Los sitios de restricción están indicados por letras en negrita y subrayados Las CDR 1 a 3 y el sitio donante de corte y empalme están subrayados. Esta es la secuencia de ADN de la cadena ligera de F19 de ratón en el interior del vector de expresión eucariótico pKN100. Este vector tiene una versión de ADNc del gen de la región constante kappa humana (alotipo Km(3)) rematado por una secuencia de terminación artificial fuerte. Además, el gen de selección Neo también está rematado por esta secuencia artificial y también está en la misma orientación que el módulo de expresión de la cadena ligera kappa.

Los componentes esenciales del vector de expresión eucariótico pKN100 son:

1-6

= Sitio EcoRI

7-1571

= promotor/potenciador HCMVi

583-587

= caja o secuencia TATAA

610

= Inicio de transcripción

728-736

= Sitio donante de corte y empalme

731

= Comienzo de intrón

1557

= Final de intrón

1544-1558

= Sitio aceptor de corte y empalme

1590-1598

= Secuencia de Kozak

1599-1658

= secuencia guía peptídica

1659-1997

= cadena ligera de F19 de ratón

1996-2004

= Sitio donante de corte y empalme

2011-2657

= copia de ADNc del gen de la región constante Kappa humana (Km(3))

2664-2880

= Secuencia de terminación spaC2 artificial

2887-7845

= Este es el fragmento de ADN del vector pSV2neo que comprende el gen de la resistencia a {}\hskip0.2cm la Amp (en la orientación opuesta), los orígenes ColEl y SV40 de replicación y el gen de la {}\hskip0.2cm resistencia a la Neo (en la misma orientación que el módulo HCMVi-KCT)

7852-8068

= Señal de terminación spaC2 artificial

Esta secuencia termina inmediatamente cadena arriba del sitio EcoRI (posición 1-6) en el comienzo de la secuencia. Como un vector, esta secuencia de ADN podría ser circular.

Fig. 27. Secuencia de ADN del anticuerpo quimérico F19 clonado en vector de expresión de mamífero pg1d105. Los sitios de restricción están indicados por letras en negrita y subrayados. Las CDR 1 a 3 y el sitio donante de corte y empalme están subrayados. Esta es la secuencia de ADN del vector de expresión eucariótico pG1D105 que contiene la región variable de la cadena pesada de F19 de ratón. Este vector contiene una versión ADNc de la región constante gamma-1 humana (alotipo G1m (no-a, z, -x) también conocida como alotipo Gm1(17)).

Los componentes esenciales de la construcción son:

1-2501

= secuencia basada en pBR322 que incluye el gen de la resistencia a la Ampicilina y el origen {}\hskip0.2cm ColEl más el origen SV40 y el promotor temprano SV40 cortado

2502-3226

= gen dhfr

3233-4073

= secuencia de poli A de SV40 etc.

4074-4079

= sitio BamHI y BgIII ligado (BstYl)

4080-4302

= sitio SPA más señal de terminación C2

4303-5867

= promotor HCMVi

5879-5885

= sitio de restricción HindIII característico para clonar genes variables de inmunoglobulina

5886-5894

= Secuencia de Kozak

5895-5951

= péptido señal

5952-6323

= cadena pesada de F19 de ratón

6323-6330

= Sitio donante de corte y empalme

6331-6336

= sitio de restricción BamHI característico para clonar genes variables de inmunoglobulina

6337-7388

= copia ADNc de regiones constantes gamma-1 humanas precedidas por un intrón de 62 pb

7389-7709

= secuencia de terminación de Arnie

La región constante gamma-1 humana usada en esta construcción tiene una alotipo G1m (no-a, z, -x) también conocido como Gm1(17) que está definido por un residuo ácido glutámico (E) en la posición 356 (de acuerdo con la numeración Eu), un residuo metionina (M) en la posición 358 (de acuerdo con la numeración Eu) y un residuo lisina (K) en la posición 214 (de acuerdo con la numeración Eu). Estos tres residuos están subrayados en la secuencia anterior.

Fig. 28. Procedimiento basado en PCR para la construcción de la cadena ligera de F19 remodelada humana. Esta figura proporciona una visión esquemática de la estrategia de construcción. Las líneas de trazos indican una secuencia complementaria de al menos 21 bases entre los cebadores.

Fig. 29. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducida de las versiones A, B y C de las regiones variables de la cadena ligera humana remodelada de F19. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducida se alinean y comparan con la de la versión A, el sombreado indica identidad de nucleótidos, los puntos indican identidad de aminoácidos con esta secuencia. Los aminoácidos están numerados de acuerdo con Kabat et al. (1991). Las posiciones de las CDR se indican en las cajas.

Fig. 30. Secuencia de ADN de F19 L_{A} (versión A de la cadena ligera remodelada humana) clonada en vector de expresión de mamífero pKN100. Los sitios de restricción están indicados por letras en negrita y subrayados. Las CDR 1 a 3 y el sitio donante de corte y empalme están subrayados. Esta es la secuencia de ADN de la versión A de la cadena ligera de F19 remodelada clonada en vector de expresión eucariótico pKN100. Este vector tiene una versión de ADNc del gen de la región constante kappa humana (alotipo Km(3)) rematado por una secuencia de terminación artificial fuerte. Además, el gen de selección Neo también está rematado por esta secuencia artificial y también está en la misma orientación que el módulo de expresión de la cadena ligera kappa.

Los componentes del vector son:

7-1571

= promotor/potenciador HCMVi

583-587

= caja o secuencia TATAA

610

= Inicio de transcripción

728-736

= Sitio donante de corte y empalme

731

= Comienzo de intrón

1557

= Final de intrón

1544-1558

= Sitio aceptor de corte y empalme

1590-1598

= Secuencia de Kozak

1599-1658

= secuencia guía peptídica

1659-1997

= versión A de la cadena ligera de F19 remodelada

1996-2004

= Sitio donante de corte y empalme

2011-2657

= copia de ADNc del gen de la región constante Kappa humana (Km(3)).

2664-2880

= Secuencia de terminación spaC2 artificial.

2887-7845

= Este es el fragmento de ADN del vector pSV2neo que comprende el gen de la resistencia a {}\hskip0.2cm la Amp (en la orientación opuesta), los orígenes ColEl y SV40 de replicación y el gen de la {}\hskip0.2cm resistencia a la Neo (en la misma orientación que el módulo HCMVi-KCT).

7852-8068

= Señal de terminación spaC2 artificial.

Esta secuencia termina inmediatamente cadena arriba del sitio EcoRI (posición 1-6) en el comienzo de la secuencia inferior. Como un vector, esta secuencia de ADN podría ser circular.

Fig. 31. Procedimiento basado en PCR para la construcción de la cadena pesada remodelada humana de F19. Esta figura proporciona una visión esquemática de la estrategia de construcción. Las líneas de trazos indican una secuencia complementaria de al menos 21 bases entre los cebadores.

Fig. 32. Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducida de las versiones a a e de la región variable de la cadena pesada humana remodelada de F19. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducidas se alinean y comparan con la de la versión A, el sombreado indica identidad de nucleótidos, los puntos indican identidad de aminoácidos con esta secuencia. Los aminoácidos están numerados de acuerdo con Kabat et al. (1991). La posición de las CDR está indicada por las cajas.

Fig. 33. Secuencia de ADN de F19 Ha (versión a de la cadena pesada remodelada humana) clonada en vector de expresión de mamífero pg1d105. Los sitios de restricción están indicados por letras en negrita y subrayados Las CDR 1 a 3 y el sitio donante de corte y empalme están subrayados. Esta es la secuencia de ADN del vector de expresión eucariótico pG1D105 que contiene la versión A remodelada de la región variable de la cadena pesada de F19. Este vector contiene una versión ADNc de la región constante gamma-1 humana (alotipo G1m (no-a, z, -x) también conocida como alotipo Gm1(17)).

Los componentes esenciales de la construcción son:

1-2501

= secuencia basada en pBR322 que incluye el gen de la resistencia a la Ampicilina y el origen {}\hskip0.2cm ColEl más el origen SV40 y el promotor temprano SV40 cortado

2502-3226

= gen dhfr

3233-4073

= secuencia de poli A de SV40 etc.

4080-4302

= sitio SPA más señal de terminación C2

4303-5867

= promotor/potenciador HCMVi

5879-5885

= sitio de restricción HindIII característico para clonar genes variables de inmunoglobulina

5886-5894

= Secuencia de Kozak

5895-5951

= péptido señal

5952-6323

= versión A de la cadena pesada de F19 remodelada

6323-6330

= Sitio donante de corte y empalme

6331-6336

= sitio de restricción BamHI característico para clonar genes variables de inmunoglobulina

6337-7388

= copia ADNc de regiones constantes gamma-1 humanas precedidas por un intrón de 62 pb

7389-7709

= secuencia de terminación de Arnie

La región constante gamma-1 humana usada en esta construcción tiene una alotipo G1m (no-a, z, -x) también conocido como Gm1(17) que está definido por un residuo ácido glutámico (E) en la posición 356 (de acuerdo con la numeración Eu), un residuo metionina (M) en la posición 358 (de acuerdo con la numeración Eu) y un residuo lisina (K) en la posición 214 (de acuerdo con la numeración Eu). Estos tres residuos están subrayados en la secuencia anterior.

Fig. 34. Sucesos de corte y empalme de ARN de las cadenas pesada (panel A) y ligera (panel B) que tienen lugar durante la expresión del anticuerpo F19 en células de mamífero - vista esquemática.

A.

Corte y empalme de ARN de la cadena pesada

B.

Corte y empalme de ARN de la cadena ligera Kappa

Fig. 35. Dependencia de la concentración de la unión de sobrenadante de L_{A}H_{C} a CD8-FAP.

Fig. 36. Unión de L_{A}H_{C} biotinilada a FAP humana.

Fig. 37. CD8-FAP porta el epítopo de F19 como se detecta con cF19.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de genes quiméricos de ratón - humanos

El anticuerpo F19 (cF19) quimérico se diseñó para que tuviera las regiones V_{L} y V_{H} de F19 de ratón unidas a las regiones constantes kappa y gamma-1 humanas, respectivamente. Se usaron cebadores por PCR para modificar las secuencias 5'- y 3'- que flanquean las secuencias de ADNc que codifican las regiones V_{L} y V_{H} de F19 de ratón (Tabla 1). Se diseñaron cebadores de PCR específicos para la región V de la cadena ligera de F19. Estas regiones de F19 de ratón adaptadas se subclonaron entonces en vectores de expresión de células de mamíferos que ya contenían las regiones constantes kappa (vector pKN100) o gamma-1 (vector pG1 D105) humanas (Figura 23). Estos vectores emplearon el promotor/potenciador de citomegalovirus (HCMV) para transcribir de forma eficaz las cadenas ligera y pesada. Los vectores también contienen el origen SV40 de replicación para permitir la replicación de ADN eficaz y la posterior expresión de proteínas en células COS. Los vectores de expresión se diseñaron para tener las regiones variables insertadas como fragmentos de ADN HindIII-BamHI. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir estos sitios de restricción en los extremos 5'- (HindIII) y 3'- (BamHI) de los ADNc que codifican las regiones variables. Además, los cebadores de PCR se diseñaron para introducir la secuencia de Kozak (GCCGCCACC) en los extremos 5'- de ambos ADNc de las cadenas ligera y pesada para permitir una traducción eficaz (Kozak M.: At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. (1987) J. Mol. Biol. 196: 947), e introducir los sitios donantes de corte y empalme en los extremos 3' de los ADNc de ambas cadenas ligera y pesada para las regiones variables a cortar y empalmar con las regiones constantes. Los cebadores de PCR usados en la construcción de las cadenas ligera y pesada de F19 quiméricas se muestran en la Tabla 1. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de las regiones V_{L} y V_{H} de F19 de ratón tal como se adaptaron para usar en la construcción de las cadenas ligera y pesada de F19 de ratón se muestran en las Figuras 24 y 25. Las secuencias de ADN de las cadenas ligera y pesada de F19 clonadas en los vectores de expresión eucarióticos pKN100 y pG1D105, respectivamente, se muestran en las Figuras 26 y 27.

TABLA 1 Cebadores de PCR para la construcción del anticuerpo F19 quimérico.

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1

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Ejemplo 2 Expresión y actividad de unión del anticuerpo F19 quimérico

Los dos ADN plásmidos que codifican las cadenas ligera y pesada de F19 quiméricas (véase el ejemplo 1) se cotransfectaron en células COS para buscar la expresión transitoria del anticuerpo F19 quimérico como se describe más adelante. Después de incubación durante 72 horas, se recogió el medio, se centrifugó para retirar los restos celulares y se analizó por ELISA para la producción de anticuerpo del tipo IgG1 humano. El sobrenadante de células COS que contiene el anticuerpo F19 quimérico se analizó para su capacidad para unirse a células HT 1080 (véase el ejemplo 13) que expresan el antígeno FAP sobre su superficie.

Transfección de células COS usando electropermeabilización

Los vectores de expresión de mamíferos pg1d105 y pKN100 que contienen las versiones de la cadena ligera y pesada humana quiméricas o remodeladas, respectivamente, se ensayaron en células COS para buscar la expresión transitoria de anticuerpos F19. Las células COS7 se sometieron a un pase de rutina en DMEM (Gibco BRL cat. nº 41966) que contenía penicilina (50 IU/ml), estreptomicina (50 \mug/ml), L-glutamina y suero bovino fetal exento de gamma globulina inactivado térmicamente al 10% (FCS, Harlan Sera-Lab cat. nº D0001). El ADN se introdujo en las células COS por electropermeabilización usando el aparato Gene Pulsar (BioRad). Se añadió ADN (10 \mug de cada vector) a una alícuota de 0,8 ml de 1\times10^{7} células/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS, exenta de Ca^{2+} y Mg^{2+}). Se emitió un impulso a 1.900 volts, 25 \muF de capacitancia. Después de un período de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, se añadieron las células electropermeabilizadas a 8 ml de DMEM que contenía FCS al 5%. Después de incubar a 37ºC durante 72 horas, se recogió el medio, se centrifugó para eliminar los restos celulares y se almacenó en condiciones estériles a 4ºC durante cortos períodos de tiempo, o a -20ºC durante períodos más
largos.

Procedimiento ELISA para medir las concentraciones de anticuerpo IgG1/kappa ligado en sobrenadantes de células COS

Se ensayaron por ELISA muestras de anticuerpos producidos en células COS transfectadas para determinar cuanto anticuerpo humano quimérico o remodelado se ha producido. Para la detección del anticuerpo, se revistieron placas con anticuerpo frente a IgG humana de cabra (fragmento específico Fcy) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., #109-005-098). Las muestras de las células COS se diluyeron en serie y se añadieron a cada pocillo. Después de incubar durante 1 h a 37ºC y lavar, se añadió la cadena ligera kappa antihumana conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma, A-7164). Después de incubar durante 30 minutos a 37ºC y lavar, se añadió sustrato K-azul (una mezcla de 3,3',5,5' tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno, Bionostics Limited, #KB175) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo usando solución de parada Red Stop (Bionostics Limited, #RS20) y se leyó la densidad óptica en un lector de microplacas a 650 nm. Como patrón se usó anticuerpo IgG1/Kappa humano purificado (Sigma, I-3889) de concentración conocida.

La expresión del anticuerpo F19 quimérico en células COS fue baja (Tabla 2), de 10 a 60 ng/ml, que es al menos 10 veces menos que para la mayoría de anticuerpos.

En un intento por aumentar los niveles de expresión del anticuerpo F19 quimérico, la secuencia guía de la región V_{L} de F19 se cambió por sustitución de prolina a leucina en la posición -9. Este cambio sencillo en aminoácidos en la secuencia guía dio como resultado que al menos se dobló la cantidad de anticuerpo quimérico producido en células COS.

Los resultados de unión celular muestran que F19 quimérico se une de forma específica y con la afinidad esperada al FAP diana.

TABLA 2 Concentraciones de anticuerpo F19 quimérico en sobrenadantes de células COS (Estos son los resultados de tres transfecciones independientes)

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Ejemplo 3 Construcción de las versiones A a C (L_{A}-L_{B}) de la cadena ligera de F19 humana remodelada

La construcción de la primera versión (V_{L}) de la región L_{A} de F19 remodelada se llevó a cabo usando fragmentos de PCR solapados en un procedimiento similar al descrito por Daugherty B. L., DeMartino J. A., Law M. F., Kawka D. W., Singer I. I. and Mark G. E. (1991) Polymerase chain reaction (PCR) facilitates the cloning, CDR-grafting, and rapid expression of a murine monoclonal antibody directed against the CD18 component of leukocyte integrins. Nucl. Acids Res. 19: 2471. Se sintetizaron diez oligonucleótidos que consistían en cinco parejas de cebadores, APCR1-vla1, vla2-vla3, vla4-vla5, vla6-vla7 y vla8-APCR4 (Tabla 3 y Figura 28). Existía una secuencia de solapamiento de al menos 21 bases entre parejas adyacentes (Figura 28). APCR1 y APCR4 hibridaron a las secuencias del vector pUC19 flanqueante. Los cebadores mutágenos se diseñaron tal que su extremo 5' siguiera inmediatamente la posición de titubeo de un codon. Esta estrategia se usó para contrarrestar la adición natural de un nucleótido al extremo 3' de la cadena complementaria al cebador mutágeno por la ADN polimerasa durante la PCR (Sharrocks A. D. and Shaw P. E. (1992) Improved primer design for PCR-based, site-directed mutagenesis. Nucl. Acids Res. 20: 1147). Las parejas de cebadores apropiadas (0,2 \muM de cada uno) se combinaron con 10 ng de la versión "B" del ADNc de la región L25V_{L} humana remodelada, y 1 unidad de ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) en 50 \mul de tampón de PCR que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, dNTPs 200 \muM y MgCl_{2} 1,5 mM. Esto se cubrió con aceite mineral y se llevó a cabo la PCR durante 25 ciclos, consistiendo cada ciclo en una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, una etapa de reasociación de cebador a 55ºC durante 1 minuto y una etapa de extensión a 72ºC durante 2 minutos. Esto estuvo seguido por un ciclo único consistente en otra etapa de extensión adicional a 72ºC durante 10 minutos seguida por enfriamiento a 4ºC. El tiempo de cambio entre las etapas de reasociación de cebador y de extensión fue de 2,5 minutos. Los productos de PCR de las cinco reacciones (A, B, C, D y E) se purificaron entonces por electroforesis en gel seguido por elución con ADN usando preparaciones de PCR Wizard (Promega). Los productos de PCR A, B, C, D y E se ensamblaron por su complementariedad entre si. En el segundo grupo de reacciones de PCR, los productos de PCR B y C, y D y E (50 ng de cada uno) se añadieron a reacciones de PCR de 50 \mul (como se ha descrito antes) que contenían cada una 1 unidad de ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus). Las reacciones se repitieron durante 20 ciclos como se ha descrito antes con la excepción de que la temperatura de la reasociación se elevó hasta 60ºC. En el tercer grupo de reacciones de PCR, se amplificaron por PCR los productos F y G usando 1 \mul de cada una de las reacciones anteriores de PCR y la pareja apropiada de cebadores de PCR (vla2-vla5 o vla6-APCR4). Las reacciones de PCR contenían 1 unidad de ADN polimerasa AmpliTaq en 50 \mul de reacción de PCR (como se ha descrito antes) y se amplificaron durante 25 ciclos como en la primera etapa. En el cuarto grupo de reacciones de PCR, se amplificó por PCR el producto H de PCR usando 1 \mul de cada una de las reacciones de PCR anteriores y la pareja vla2-APCR4 de cebadores de PCR. Finalmente, se ensamblaron los productos A y H por su complementariedad en una reacción de PCR de dos etapas similar a la que se ha descrito antes usando RSP y UP como cebadores terminales. El fragmento totalmente ensamblado que representa la región completa V_{L} de F19 humana remodelada que incluye una secuencia guía se sometió a digestión con HindIII y BamHI y se clonó en pUC19 para la secuenciación. Se diseñó un clon que tenía la secuencia de ADN correcta reshF19La (Figura 29) y se subclonó entonces en el vector de expresión eucariótico pKN100. La secuencia de ADN de reshF19La clonado en pKN100 se muestra en la Figura 30.

La segunda versión (L_{B}) de la región V_{L} de F19 remodelada humana se construyó usando el mismo esquema que se ha descrito para La pero se sustituyeron los cebadores vlb4 y vlb7 por vla4 y vla7, respectivamente (Tabla 3). La secuencia de ADN de L_{B} se muestra en la Figura 29.

La tercera versión (L_{C}) de la región V_{L} de F19 remodelada humana se construyó usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange™ de Stratagene. El procedimiento de mutagénesis dirigida al sitio de QuikChange se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando reshF19La en el vector pKN100 como ADN molde de doble cadena. Los cebadores oligonucleótidos mutágenos F19Lc-codificante y F19Lc-no codificante (Tabla 3) para usar en este protocolo se diseñaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. De forma resumida, ambos cebadores mutágenos contenidos en la mutación puntual deseada (codon TTT en la posición 49 del residuo de Kabat (Phe) cambiaron a TAT que codifica Tyr) y se reasociaron a la misma secuencia en cadenas opuestas de L_{A} en el vector pKN100. La mutación puntual se verificó por secuenciación de ADN de toda la región V_{L}. La secuencia de ADN de L_{C} se muestra en la Figura 29. Para eliminar la posibilidad de mutaciones aleatorias producidas en pKN100 durante la reacción de PCR, se cortó la región V_{L} del vector pKN100 como un fragmento HindIII/BamHI y se volvió a subclonar en un vector pKN100 sin modificar cortado con las dos mismas enzimas de restricción con antelación.

TABLA 3 Cebadores de PCR para la construcción de las regiones variables de la cadena ligera de F19 remodelada humana

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Ejemplo 4 Construcción de las versiones A a E (H_{A}-H_{E}) de la cadena pesada de F19 humana remodelada

La versión "A" (H_{A}) de las regiones V_{H} de F19 remodelada humana se construyó usando los mismos procedimientos de PCR que se han descrito para la construcción de la versión "A" (L_{A}) de la región V_{L} de F19 remodelada humana (Figura 31). El ADN molde era la versión "A" de 226 V_{H} remodelada humana (Léger O. J. P., Yednock T. A., Tanner L., Horner H. C., Hines D. K., Keen S., Saldanha J., Jones T., Fritz L. C. and Bendig M. M. (1997). Humanization of a mouse antibody against human alpha-4 integrin: a potential therapeutic for the treatment of multiple sclerosis. Hum. Antibod. 8: 3). Se diseñaron y sintetizaron seis cebadores de PCR para la construcción de la versión "A" de la región V_{H} de F19 remodelada humana (Tabla 4). Los productos de PCR A, B, C y D se obtuvieron usando APCR1-Vha1, Vha2-Vha3, Vha4-Vha5 y Vha6-APCR4 como cebadores de PCR, respectivamente. Las condiciones de la PCR fueron básicamente como se han descrito para la construcción de la región V_{L} de F19 remodelada humana. Se diseñó un clon que tenía la secuencia de ADN correcta reshF19Ha (Figura 32) y se subclonó entonces en el vector de expresión eucariótico pG1D105. La secuencia de ADN de reshF19Ha clonado en pG1D105 se muestra en la Figura 33.

La tercera versión (H_{C}) de la región V_{H} de F19 remodelada humana se construyó usando el mismo esquema que se ha descrito para H_{A} pero se sustituyó el cebador Vhc4 por Vha4 (Tabla 4). La secuencia de ADN de L_{C} se muestra en la Figura 32. La versión segunda (H_{B}) y cuarta (H_{D}) de la región V_{H} de F19 remodelada humana se construyeron basándose en procedimientos de mutagénesis por PCR de Kamman et al. (Kamman M., Laufs J., Schell J. and Gronenborn B. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR). Nucl. Acids Res. 17: 5404). Para H_{B} y H_{D}, se usó un cebador mutagénico F19VHbd6 (Tyr-91 a Phe-91, Tabla 4) emparejado con APCR4 en reacciones de PCR con H_{A} y H_{C} como el ADN molde, respectivamente. Los productos de PCR VHb y VHd eran enzimas de restricción digeridas con PstI y BamHI y subclonadas en reshF19Ha y reshF19Hc, respectivamente, digeridas previamente con las mismas dos enzimas de restricción. Las secuencias de ADN de H_{B} y H_{D} se muestran en la Figura 32.

La versión "E" (H_{E}) de la región V_{H} de F19 remodelada humana se construyó basándose en procedimientos de mutagénesis por PCR de Kamman et al. (1989) ya citados anteriormente:

Para el cebador mutágeno reshF19He se usó F19MscIHe (Tabla 5) emparejado con el cebador F19V_{H}HindIII (Tabla 5) en reacciones de PCR con H_{C} clonado en vector de expresión de mamífero pg1d105 como ADN molde. Las parejas de cebadores apropiadas (0,2 \muM de cada una) se combinaron con 10 ng de ADNc de la versión "A" de la región 226 V_{H} remodelada humana en 100 \mul de tampón PCR que contenía KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 nM_{,} Tris-HCl 20 mM (pH 8,8) MgSO_{4} 2 mM, Triton X-100 al 0,1% y 200 \muM de dNTPs. Las mezclas de reacción se cubrieron con aceite mineral y se mantuvieron a 94ºC durante 5 minutos. A continuación, se añadió 1 unidad de ADN polimerasa Deep Vent (New England Biolabs) ("Hot Start" PCR; Chou Q., Russell M., Birch D., Raymond J. and Bloch W. (1992) Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucl. Acids Res. 20: 1717) y la PCR se realizó durante 25 ciclos de un TRIO-Thermoblock Thermal Cycler (Biometra, Göttingen, Alemania). Cada ciclo consistía en una etapa de desnaturalización a 94ºC durante 1 min, una etapa de reasociación con cebador a 70ºC durante 1 min y una etapa de extensión a 72ºC durante 2 minutos. Esto estuvo seguido por un ciclo único consistente en otra etapa de extensión adicional a 72ºC durante 10 minutos seguida por enfriamiento a 4ºC. Los productos de PCR se extrajeron entonces y purificaron en un gel de agarosa convencional TAE 1,4% usando un kit de extracción de gel QIAquick™, siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante (QIAGEN Ltd., Reino Unido). El producto de PCR V_{H}e se digirió entonces con enzima de restricción con MscI y HindIII y se ligó en reshF19Hc clonada en pg1d105 previamente digerido con las dos mismas enzimas de restricción. El sitio de reconocimiento de restricción MscI es característico para todas las versiones de la región V_{H} de F19 remodelada humana y no está presente en el vector de expresión pg1d105. El sitio de reconocimiento de restricción HindIII es un sitio característico en pg1d105 para clonar genes de inmunoglobulina V_{H}. Se transformaron células de E. coli XL-1 Blue competentes para la electropermeabilización con 1 \mul del ADN ligado y se cultivaron en placas de agarosa que contenían Ampicilina. Se rastrearon seguidamente las colonias para determinar la presencia y tamaño correcto de insertos por PCR directa en colonias (Güssow D. and Clackson T. (1989) Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res. 17: 4000) con cebadores HCMi y Huc\gamma1 que hibridan con las secuencias del vector flanqueante pg1d105 (Tabla 5). Se preparó ADN de colonias positivas usando un kit Plasmid Midi, siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante (QIAGEN Ltd., Reino Unido). La secuenciación del ADN se llevó a cabo por el procedimiento de terminación de la cadena didesoxi (Sanger F., Nicklen S. and Coulson A. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74: 5463) directamente a partir de un ADN vector circular usando desnaturalización térmica convencional (Andersen A., Pettersson A. and Kieldsen T. (1992) A fast and simple technique for sequencing plasmid DNA with sequenase using heat denaturation. Biotechniques 13: 678) y Sequenase 2.0 (USB, Cleveland, OH). La secuencia de ADN de reshF19He se muestra en la Figura 32.

TABLA 4 Cebadores de PCR para la construcción de las versiones A a D de las regiones variables de la cadena pesada de F19 humana remodelada

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TABLA 5 Cebador de PCR para la construcción de la versión E de las regiones variables de la cadena pesada de F19 humana remodelada

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Ejemplo 5 Concentraciones de anticuerpo F19 humano remodelado en sobrenadantes de células COS

Las células COS se transfectaron con una pareja de una serie de construcciones de anticuerpo F19 humano remodelado y la concentración de anticuerpo humano se midió usando el ELISA lgG1/Kappa como se describe en el ejemplo 2.

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TABLA 6 Concentraciones de anticuerpo F19 humano remodelado en sobrenadantes de células COS

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TABLA 7 Concentraciones de anticuerpo F19 humano remodelado en sobrenadantes de células COS

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Sucesos de corte y empalme de ARN requeridos para la expresión de genes de inmunoglobulina en células de mamífero

Ambos vectores de expresión de mamífero pKN100 y pg1d105 tienen un intrón entre las regiones variable y constante que se retira durante el proceso de expresión génica para dar lugar a un ARN mensajero. El suceso de corte y empalme que consiste en una recombinación de ADN entre los sitios donantes de corte y empalme de la cadena pesada o ligera y el sitio aceptor de corte y empalme de la inmunoglobulina se describe en la Figura 34.

Ejemplo 6 Análisis de citometría de flujo de la unión de cF19 y L_{A}H_{C} a células humanas que expresan FAP

Se ensayó la capacidad de L_{A}H_{C} para unirse a FAP expresado de forma recombinante y endógena en la superficie celular.

El ejemplo se llevó a cabo para determinar la unión de L_{A}H_{C} a FAP celular. Tanto las células tumorales humanas MF-SH que expresan FAP de forma natural (Shirasuma, K, et al., Cancer 1985, 55:2521-32) como las líneas de células tumorales humanas transfectadas con FAP se usaron como dianas celulares. Se estudió L_{A}H_{C} en ensayos citofluorométricos que evaluaban la unión directa a células diana así como por el efecto inhibidor sobre la unión de anticuerpos F19 murinos o anti-FAP cF19 quiméricos.

Los anticuerpos y las líneas celulares eran F19 (anticuerpo FAP anti-humano monoclonal murino, subclase IgG2), mIgG (inmunoglobulina murina, clase IgG), cF19 (anticuerpo FAP anti-humano monoclonal quimérico, subclase IgG1), L_{A}H_{C} (anticuerpo FAP anti-humano monoclonal remodelado, subclase lgG1), hlgG1 (inmunoglobulina humana, subclase lgG1), MF-SH (línea celular de histiocitoma fibroso maligno humano), HT-1080 (línea celular de fibrosarcoma humano), HT-1080FAP clon 33 (línea celular HT-1080 transfectada con ADNc que codifica FAP humano). Los anticuerpos se biotinilaron como se describe en los ejemplos 8 y 12.

Unión directa de L_{A}H_{C} a FAP en la superficie de líneas celulares tumorales humanas

Se incubaron 5x10^{5} células de la línea tumoral investigada con la concentración indicada de anticuerpo de ensayo o control en un volumen total de 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (FPBS) suplementada con albúmina sérica bovina al 1% (BSA) durante 30 min en hielo. A continuación, se lavaron las células dos veces con 2 ml de PBS, se volvieron a suspender en 0,2 ml de PBS suplementada con BSA al 1% (se añadió una dilución 1:20 de IgG FITC antihumana de ratón marcada [Dianova] como reaccionante secundario) y se incubó durante otros 30 minutos en hielo.

De forma alternativa, se incubaron 5x10^{5} células de la línea celular tumoral investigada con la concentración indicada de cF19 marcado con biotina indicada en un volumen total de 0,2 ml de PBS suplementada con BSA al 1% durante 30 minutos en hielo. A continuación, se lavaron las células dos veces con 2 ml de PBS, se volvieron a suspender en 0,2 ml de PBS suplementada con BSA al 1% y se incubó durante otros 30 minutos en hielo con dilución 1:40 de estreptavidina -FITC (Dianova) como reaccionante secundario.

Se lavaron de nuevo las células dos veces con 2 ml de PBS, se volvieron a suspender en un volumen total de 0,5 ml de PBS suplementada con paraformaldehído al 1% (PFA) y se mantuvo en hielo. La fluorescencia de células aisladas se determinó de forma citofluorométrica analizando la fluorescencia verde celular a 488nm en un analizador celular activado por fluorescencia EPICS XL (Coulter).

Competición de L_{A}H_{C} para la unión de cF19 biotinilado a FAP de la superficie celular en líneas de células humanas que expresan FAP

Se incubaron 5x10^{5} células de la línea de células tumorales investigada con las cantidades indicadas de anticuerpo control o de ensayo no marcado añadido junto con 1 \mug/ml de anticuerpo cF19 marcado con biotina. A continuación, se lavaron las células dos veces con 2 ml de PBS, se volvieron a suspender en 0,2 ml de PBS suplementada con BSA al 1%, estreptavidina-FITC (Dianova) diluida 1:40 como agente secundario y se incubó durante otros 30 minutos en hielo.

Se lavaron entonces las células dos veces con 2 ml de PBS, se volvieron a suspender en un volumen total de 0,5 ml de PBS suplementada con PFA al 1% y se mantuvo en hielo. La fluorescencia de células aisladas se determinó de forma citofluorométrica analizando las fluorescencia verde celular a 488nm en un analizador celular activado por fluorescencia EPICS XL (Coulter).

cF19 y L_{A}H_{C} se unieron ambos en una forma dependiente de la concentración de forma específica a células tumorales humanas HT-1080FAP clon 33 transfectadas con FAP (Tabla 8). No fue detectable la unión a células HT-1080 negativas a FAP (Tabla 9). cF19 y L_{A}H_{C} se unieron ambos en una forma dependiente de la concentración a células MF-SH humanas que expresan de forma endógena FAP (Tabla 10).

cF19 biotinilado se unión a HT-1080FAP clon 33 humanas (Tabla 11) en una forma dependiente de la concentración. No fue detectable la unión a células HT-1080 negativas a FAP (Tabla 12).

La unión de cF19 biotinilado a células HT-1080FAP clon 33 estuvo inhibida tanto por cF19 no marcado como por L_{A}H_{C} marcado (Tabla 13).

El anticuerpo monoclonal cF19 frente a FAP humana quimérico así como el anticuerpo monoclonal L_{A}H_{C} frente a FAP humana humano remodelado (ejemplo 10) mostraron que se unían directamente a FAP expresada en líneas celulares humanas bien de forma endógena expresando esta proteína o transfectado con ADNc que lo codifica. Esta unión se demostró que era dependiente de la concentración. La unión de cF19 biotinilado se podía inhibir tanto por cF19 no marcado como por L_{A}H_{C} no marcado.

Usando tecnología citofluorométrica, la unión directa, así como la inhibición de reaccionantes de unión específica mostraron especificidad de anticuerpos monoclonales cF19 quimérico y L_{A}H_{C} remodelado hacia FAP expresada en la superficie celular.

TABLA 8 Unión de anticuerpos anti-FAP a células HT-1080FAP clon 33

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TABLA 9 Unión de anticuerpos anti-FAP a células HT-1080 no transfectadas

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TABLA 10 Unión de anticuerpos anti-FAP a células MF-SH

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TABLA 11 Unión de anticuerpos cF19 biotinilados a células HT-1080FAP clon 33

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TABLA 12 Unión de anticuerpos cF19 biotinilados a células HT-1080 no transfectadas

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TABLA 13 Competición de anticuerpos anti-FAP con la unión de cF19 biotinilado a células HT-1080FAP clon 33

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Ejemplo 7 Funciones efectoras inmunes in vitro de anticuerpo monoclonal L_{A}H_{C}

Este experimento se llevó a cabo para determinar el potencial del anticuerpo monoclonal (mAb) L_{A}H_{C} con especificidad por el antígeno activador de fibroblastos (FAP) para lisar dianas que expresan FAP en presencia de complemento o leucocitos mononucleares humanos, respectivamente.

En particular, se estudió la capacidad de L_{A}H_{C} para mediar efectos citotóxicos contra células HT-1080FAP clon 33, que expresaron FAP humano sobre la superficie. Se determinó la citotoxicidad in vitro usando la técnica siguiente: Se incubaron células diana marcadas con ^{51}Cr en presencia de L_{A}H_{C} con suero humano como fuente de complemento o MNC humanos (células mononucleares de sangre periférica) como efectores. La liberación de ^{51}Cr se midió como una medida de la lisis diana-célula.

Los anticuerpos y las líneas celulares usadas fueron L_{A}H_{C} (anticuerpo lgG1 frente a FAP humana remodelado humano), hlgG1 (isotipo lgG1 control), 3S193 (anticuerpo IgG3 monoclonal murino anti-Lewis^{y}), mlgG (IgG control murina), HT-1080 (fibrosarcoma humano), HT-1080FAP clon 33, (HT1080 transfectado con ADNc que codifica FAP humana), MCF-7 (línea celular de adenocarcinoma de mama humano).

Lisis mediada por el complemento de células diana por L_{A}H_{C}

Las células tumorales se radiomarcaron por incubación en medio RPMI1640 con 100 \muCi de ^{51}Cr (NEN) a 37ºC durante una hora. Seguidamente, las células se lavaron dos veces en medio exento de ^{51}Cr y se volvieron a suspender a una concentración de 2x10^{5} células por ml.

Se preparó reciente suero humano como fuente de complemento a partir de sangre de diferentes voluntarios. La sangre se extrajo por punción de la vena del brazo, se dejó a temperatura ambiente durante una hora para coagular y se mantuvo a 4ºC durante la noche. Se separó el suero por centrifugación y se retiró el sedimento.

El anticuerpo estudiado se diluyó a partir de una solución madre hasta la concentración apropiada en medio de cultivo celular RPMI1640.

Se incubaron 1x10^{5} células tumorales radiomarcadas de la línea celular indicada durante 2horas a 37ºC en un incubador (aire al 95% y CO_{2} al 5%) en presencia de concentraciones diferentes de anticuerpo de ensayo o control y 25% (v/v) de suero humano como fuente de complemento humano. Las incubaciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos con forma de U en un volumen total de 200 \mul de RPMI1640 y se realizaron por triplicado. Después del período de incubación, se centrifugaron las placas, se retiraron 100 \mul de sobrenadante y se realizó el recuento radiactivo en un contador gamma. La cantidad total de radiactividad incorporada se determinó midiendo 10^{4} células diana. La liberación espontánea se definió como actividad liberada de las células diana en ausencia de anticuerpo y complemento durante el período de incubación descrito.

La lisis específica se calculó como sigue:

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Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de L_{A}H_{C}

Las células tumorales se radiomarcaron por incubación en medio RPMI1640 con 100 \muCi de ^{51}Cr a 37ºC durante una hora. Seguidamente, las células se lavaron dos veces en medio exento de ^{51}Cr y se volvieron a suspender a una concentración de 2x10^{5} células por ml.

Se prepararon MNC (células mononucleares de sangre periférica) a partir de sangre periférica tomada por punción de la vena del brazo de voluntarios sanos. Se evitó la coagulación añadiendo tampón citrato al 20%. Se purificaron MNC de 4 ml de esta preparación de sangre por centrifugación (30 min a 400 G y temperatura ambiente) en 3 ml de medio de preparación de linfocitos (Boehringer Mannheim, Alemania). Se separaron las MNC (células mononucleares de sangre periférica) del gradiente, se lavaron tres veces y diluyeron con RPMI1640 hasta la concentración apropiada. Se obtuvieron células citotóxicas activadas por linfocitos (LAK) de MNC (células mononucleares de sangre periférica) por incubación durante 5 días a 37ºC en un incubador con aire al 95% y CO_{2} al 5% a una densidad inicial de 1,3x10^{6} células por ml en presencia de 100 U de interleuquina-2 recombinante humana (lL-2). El anticuerpo estudiado se diluyó a partir de una solución madre hasta la concentración apropiada en medio de cultivo celular RPMI1640.

Se incubaron 1x10^{4} células tumorales radiomarcadas de la línea celular indicada durante 5 h a 37ºC y en CO_{2} al 5% en presencia de diferentes concentraciones del anticuerpo de ensayo o control y MNC. Se añadieron MNC en cantidades para alcanzar la relación efector:célula diana indicada. La incubación se llevó a cabo en placas de 96 pocillos con forma de U en un volumen total de 200 \mul de RPMI1640 y se realizó por triplicado.

Después del período de incubación, se centrifugaron las placas, se separaron 100 \mul del sobrenadante y se determinó la radiactividad en un contador gamma. La cantidad total de radiactividad incorporada se determinó midiendo 10^{4} células diana. La liberación espontánea se definió como actividad liberada de las células diana en ausencia de anticuerpo y de células efectoras durante el período de incubación descrito.

La lisis específica se calculó como sigue:

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Lisis de complemento mediado por anticuerpo de células tumorales

No se observó lisis mediada por complemento específica de L_{A}H_{C} (por encima de la apreciada con un isotipo control) en células HT-1080FAP clon 33 tratadas con L_{A}H_{C} en concentraciones de hasta 50 \mug/ml (Tabla 14, Tabla 15a).

La actividad lítica de suero humano usado como fuente de complemento se mostró por la lisis de células de carcinoma de mama humano MCF-7 en presencia de 12,5 \mug/ml de 3S193, un anticuerpo monoclonal murino anti-Lewis^{y} con capacidad activadora de complemento conocida (Tabla 15b).

Lisis celular mediada por anticuerpo de células tumorales

En presencia de L_{A}H_{C} en concentraciones de hasta 10 \mug/ml, no fue detectable ADCC (toxicidad celular dependiente del anticuerpo) mediada por MNC humanos (Tabla 16) o células LAK humanas (células citotóxicas activadas por linfoquina, Tabla 17) de L_{A}H_{C} en HT-1080FAP clon 33 medidas por la lisis por encima de la apreciada con un isotipo control a una relación efector:diana de 50:1.

En ensayos in vitro apropiados con complemento humano o con MNC humanas - como mecanismos efectores, el anticuerpo monoclonal L_{A}H_{C} anti-FAP humano no reveló efectos citotóxicos detectables por encima de isotipos control sobre la línea de células tumorales HT-1080FAP clon 33 que expresan FAP.

TABLA 14 Lisis de complemento específica (en %) de dianas celulares HT-1080FAP clon 33 mediada por L_{A}H_{C}

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TABLA 15a Lisis de complemento específica (en %) de dianas celulares tumorales HT-1080FAP clon 33 mediada por anticuerpo monoclonal humano L_{A}H_{C} anti-FAP

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TABLA 15b Lisis de complemento específica (en %) de dianas celulares tumorales MCF-7 mediadas por anticuerpo monoclonal murino anti-Lewis^{y} 3S193

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TABLA 16 ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) (lisis específica en %) de células diana HT-1080FAP clon 33 por MNC humanos (células mononucleares de sangre periférica) mediada por L_{A}H_{C}

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TABLA 17 ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo, lisis específica en %) de células diana HT-1080FAP clon 33 por células LAK (células citotóxicas activadas por linfoquina) mediada por L_{A}H_{C}

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Ejemplo 8 Análisis inmunohistoquímico de la unión de anticuerpo monoclonal L_{A}H_{C} a tejidos humanos normales y neoplásicos

Este experimento se llevó a cabo para determinar las características de unión del mAb L_{A}H_{C} humanizado a tejidos humanos normales y neoplásicos.

Se añadieron los siguientes anticuerpos: L_{A}H_{C}, cF19 y el control negativo hlgG1 se biotinilaron directamente de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica y se usaron en concentraciones de 2,5 a 0,25 mg/ml en BSA/PBS al 2% (albúmina sérica bovina en solución salina tamponada con fosfato). Se usó mAb F19 murino como sobrenadante de cultivo tisular del hibridoma F19, en diluciones de 1:5 a 1:10 en BSA/PBS al 2%.

Se usaron los siguientes reaccionantes para los ensayos inmunoquímicos: Complejo de estreptavidina peroxidasa (Vector Labs, Burlingame, CA, EEUU), complejo de avidina-biotina peroxidasa (Vector Labs.), anti-ratón de caballo biotinilado (Vector Labs.), DAB (diaminobenzidina, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, EEUU), hematoxilina de Harris.

Las muestras de tejido congelado recientes examinadas incluyeron lo siguiente: colon, mama, pulmón, estómago, páncreas, piel, laringe, vejiga urinaria, músculo liso y esquelético normales. Entre los tumores ensayados se encontraron carcinomas de mama, colon, pulmón, esófago, útero, ovario, páncreas, estómago y cabeza y cuello.

Se llevó a cabo un procedimiento indirecto con inmunoperoxidasa de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica (Garin-Chesa P, Old LJ, Rettig WJ: Cell surface glycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epithelial cancers. Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:7235-7239) en secciones recién congeladas de cinco micrómetros de espesor. Se usó DAB como sustrato para el producto de reacción final. Las secciones se tiñeron con hematoxilina de Harris y se examinaron para determinar la expresión de antígeno.

Expresión de L_{AHC} en tejidos humanos normales

Los tejidos normales usados fueron negativos para la expresión de L_{A}H_{C}, salvo para el páncreas normal en el que se identificaron un subgrupo de células endocrinas positivas en los islotes de Langerhans (células A) con L_{A}H_{C}, cF19 y F19. (Tabla 18). No se observó inmunoreactitivad con la hlgG1 (subclase de inmunoglobulina humana lgG1) usada como control negativo.

Expresión de L_{A}H_{C} en tumores

En las muestras de tumores, L_{A}H_{C}, cF19 y F19 mostraron un inequívoco patrón de expresión en los fibroblastos estromales tumorales. Se encontró una fuerte expresión homogénea en la mayoría de los casos examinados, en especial en las muestras de cáncer derivadas de mama, colon, pulmón, páncreas y carcinoma de células escamosas (SQCC) de la cabeza y cuello ensayados (Tabla 19). No se observó inmunoreactividad con la hlgG1 usada como control negativo.

L_{A}H_{C}, cF19 y F19 mostraron inmunoreactividad con los fibroblastos estromales tumorales en las muestras de cáncer epiteliales ensayadas. No se apreció inmunoreactividad de L_{A}H_{C} o F19 con ninguno de los fibrocitos de las células de mesénquima o parénquima de órganos normales de órganos adultos normales. La inmunoreactividad anti-FAP se observó únicamente en un subgrupo de células endocrinas en los islotes pancreáticos, presumiblemente células A productoras de glucagón, y en cuatro de nueve muestras uterinas ensayadas, que representan subgrupos de fibroblastos estromales en estos tejidos.

El análisis inmunohistoquímico de L_{A}H_{C} en tejidos humanos normales y carcinomas humanos que expresan FAP mostró patrones no distinguibles de unión por L_{A}H_{C}, cF19 y mAb F19 murino.

TABLA 18 Inmunoreactividad de mAbs L_{A}H_{C}, cF19 y F19 con tejidos humanos normales

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Ejemplo 9 Especificidad a especies de la unión de L_{A}H_{C} en secciones de tejidos

Este experimento se llevó a cabo para valorar la reactividad de L_{A}H_{C} con tejidos de ratón, rata, conejo y monos cinomolgos por procedimientos inmunohistoquímicos.

También se usaron en estos ensayos cF19 e IgG1 humana (hlgG1) como controles negativos. Los reaccionantes usados para la inmunohistoquímica fueron complejo de estreptavidina peroxidasa (Vector Labs., Burlingame, CA, EEUU), DAB (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EEUU) y hematoxilina de Harris.

Se ensayaron las siguientes muestras de tejido congeladas recientes de ratón, rata, conejo y cinomolgo: Cerebro, hígado, pulmón, riñón, estómago, páncreas, intestino, timo, piel, músculo, corazón, bazo, ovario, útero y testículos. Como controles positivos se incluyeron en cada ensayo secciones de páncreas y humano normal y una muestra de carcinoma de mama.

Inmunohistoquímica

Se llevó a cabo un procedimiento indirecto con inmunoperoxidasa como se describe en el estado de la técnica (Garin-Chesa P, Old LJ, Rettig WJ: Cell surface glycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epithelial cancers. Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87:7235-7239) en secciones recién congeladas de cinco micrómetros de espesor. Los anticuerpos L_{A}H_{C}, cF19 y hlgG1 (a 1 \mug/ml) se biotinilaron de acuerdo con el estado de la técnica y se detectaron con complejo de estreptavidina peroxidasa. Se usó DAB como sustrato para el producto de reacción final. Las secciones se tiñeron con hematoxilina de Harris y se examinaron para determinar la expresión de antígeno.

Los tejidos normales ensayados no reaccionaron con L_{A}H_{C} o cF19 en los experimentos (Tabla 1).

El páncreas humano normal usado como control positivo mostró unión de L_{A}H_{C} y cF19 en un subgrupo de células endocrinas en los islotes de Langerhans como se ha descrito anteriormente para F19. Además, la unión de L_{A}H_{C} y cF19 se apreció en los fibroblastos estromales tumorales en la muestra de carcinoma de mama.

El análisis inmunohistoquímico de tejidos normales de ratón, rata, conejo y cinomolgo no pudo detectar unión alguna de L_{A}H_{C} o cF19, en los experimentos realizados.

TABLA 20 Unión de L_{A}H_{C} a secciones de tejido de especies no humanas, como se determina por inmunohistoquímica

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Ejemplo 10 Construcción de líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales anti-FAP quiméricos y remodelados

El objetivo de este experimento fue demostrar que líneas celulares estables de acuerdo con la invención expresan L_{A}H_{C}, L_{A}H_{A}, L_{B}H_{B}, L_{B}-H_{D} y cF19 en células DG44 de CHO. Se produjeron líneas celulares estables transfectadas con anticuerpos F19 quiméricos humanizados y se confirmó su identidad por amplificación por PCR de las regiones variables pesada y ligera usando ADN genómico obtenido de cada transfectante como molde.

Las células DG44 de CHO se mantuvieron en condiciones exentas de suero en medio SFM-II. Se obtuvieron lipofectina y medio SFM-II exento de suero de Gibco/BRL. Geneticina y todas las enzimas de restricción se obtuvieron de Boehringer Mannheim. Se obtuvo Pfu polimerasa de Stratagene.

El ADN para las transfecciones se purificó en células de E. coli usando cartuchos QiaFilter Maxi Cartridges (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Todas las preparaciones de ADN se examinaron por digestión con enzimas de restricción. Las secuencias de las regiones variables de L_{A}H_{C} en sus respectivos vectores se confirmaron usando un secuenciador ABI PRISM 310 Sequencer (Perkin-Elmer).

En los ejemplos anteriores puede encontrarse información adicional relativa a los vectores y secuencias de ADN empleadas.

Transfección de células DG44 de CHO

Se sembraron células en crecimiento logarítmico en placas de 6 pocillos usando 1 ml de medio SFM-II nuevo. Los plásmidos que codificaban las cadenas pesada y ligera de las versiones quiméricas y humanizadas de F19 se cotransfectaron en células DG44 de CHOP usando transfección liposomal. Los liposomas se prepararon usando 6 \mul de reaccionante Lipofectina y 0,5 \mug de cada vector (uno para la cadena pesada deseada y uno para la ligera) como se describe para transfecciones de LipofectAMINE salvo que se usó medio SFM-II para diluir todos los reaccionantes. Veinticuatro horas después, se diluyeron las células 1:10 en medio SFM-II que contenía 300 \mug/ml de Geneticina. Después de que la fase inicial de destrucción celular terminara (10-14 días), se redujo la concentración de Geneticina hasta 200 mg/ml y se añadió metotrexato hasta una concentración final de 5 nM. Las concentraciones de metotrexato se incrementaron después de 10-14 días hasta una concentración final de 20 nM.

Amplificación por PCR del ADN transfectado

Se centrifugaron 10^{7} células DG44 de CHO en una microcentrífuga Eppendorf rápidamente a máxima velocidad, se lavaron una vez con PBS y se sedimentaron una vez más. Se prepararon ADN genómicos por preparación en etanol después de lisis por SDS y tratamiento con Proteinasa K de los sedimentos celulares.

Se usó una mezcla que contenía una de las primeras parejas de cebadores siguientes, dNTPs, tampón y Pfu polimerasa para amplificar bien la región variable de la cadena pesada o ligera usando ADN genómico como molde. Los productos de PCR resultantes se digirieron con la enzima de restricción apropiada y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa para confirmar su identidad.

Grupo de cebador de la cadena ligera:

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Grupo de cebador de la cadena pesada:

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El producto de PCR de la cadena pesada sin digerir tiene un tamaño predicho de 469 pb mientras que el producto de PCR de la cadena ligera tiene un tamaño predicho de 286 pb. La verificación de la identidad se determinó por digestión con enzimas de restricción con BstEll (cadena pesada) o NIaIV (cadena ligera).

Se transfectaron líneas celulares de CHO con L_{A}H_{C}, L_{A}H_{A}, L_{B}H_{B}, L_{B}H_{D}, así como cF19. Se obtuvieron células resistentes a la geneticina y se seleccionaron estas células a su vez para la resistencia al metotrexato. La amplificación por PCR, seguida por ruptura con enzima de restricción del ADN de la cadena pesada y ligera produjo las bandas esperadas y confirmó la identidad de los transfectantes L_{A}H_{C}, L_{B}H_{B}, L_{A}H_{A} y L_{B}H_{D}.

Las células descritas se mantuvieron en condiciones exentas de suero en todo momento y no se trataron con productos derivados de animales tales como tripsina.

Se produjeron líneas celulares productoras transfectadas con expresión de anticuerpos monoclonales L_{A}H_{C}, L_{A}H_{A}, L_{B}H_{B}, L_{B}H_{D} y cF19. Sus identidades se confirmaron usando amplificación por PCR y ruptura con enzima de restricción de los productos de PCR resultantes de ambas regiones variables de la cadena ligera y pesada.

Ejemplo 11 Expresión de proteínas anticuerpo en células DG44 de ovario de hámster chino y su purificación

El objetivo de este experimento fue expresar y purificar mAbs L_{A}H_{C}, L_{A}H_{A}, L_{B}H_{B} y L_{B}H_{D} para permitir su caracterización. Otros objetivos incluyen el establecimiento de un ELISA cuantitativo para permitir la medida de concentraciones de anticuerpo en muestras de medios brutos, así como en muestras de Ig purificadas y la determinación de los niveles de expresión relativos de diversas construcciones de F19 humanizado usando este ensayo.

Se obtuvieron células DG44 de CHO y metotrexato de calidad USP exentos de suero de la unidad de producción biotécnica de Dr. Karl Thomae GmbH, Biberach, Alemania; ambos productos están también disponibles de forma comercial. Las células se mantuvieron en condiciones exentas de suero en todo momento. Se obtuvo medio SFM-II exento de suero de Gibco/BRL. La proteína A agarosa era de Pierce Chemical (Indianapolis, IN, EEUU). Se obtuvieron patrones de IgG1 humana (nº de catálogo I 3889), comprimidos de p-Nitrofenil fosfato (N 2640), albúmina sérica bovina (BSA) (A 7906) y anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina específico para la cadena kappa antihumana de cabra (A 3813) de Sigma Chemical (St. Louis, MO, EEUU). El anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina específico de la cadena gamma antihumana de cabra se obtuvo de Jackson Immunoresearch Laboratories (a través de Stratech Scientific). Esta solución salina tamponada con Tris (TBS) consistía en NaCl 150 mM, Tris 50 mM, pH 7,5.

Condiciones de cultivo celular para la expresión de anticuerpos

Las células se cultivaron y mantuvieron en matraces T-175 en medio SFM-II exento de suero sin agitación. El medio contenía 200 \mug/ml de Geneticina y 20 nM de metotrexato sin anticuerpos. Se realizó un pase de las células por dilución, eran no adherentes y crecieron en pequeños conglomerados. Cuando las células alcanzaron la fase estacionaria, se centrifugó el medio para separar las células y se congeló a -20ºC hasta que fue necesario.

Purificación de L_{A}H_{C}

Todas las etapas de purificación se llevaron a cabo a 4ºC. Se rellenó una columna C10/10 (Pharmacia Fine Chemicals) con Proteína A agarosa (3 ml de volumen de lecho). La columna se lavó con TBS y se preeluyó una vez con citrato sódico 0,1 M, pH 3,0 para garantizar que no quedaba en la columna material poco ligado. La columna se volvió a equilibrar inmediatamente con TBS y se almacenó a 4ºC. Los sobrenadantes de cultivo gastados se descongelaron y se centrifugaron a 10.000 x g durante 30 minutos antes de la cromatografía de la Proteína A para retirar los restos y se diluyó con un volumen igual de TBS. Este material se cargó en una columna de Proteína A a 0,5 ml/min usando una bomba peristáltica P-1 (Pharmacia) y se lavó con TBS hasta que la absorbancia a 280 nm no era detectable. La elución del anticuerpo se inició con citrato sódico 0,1 M pH 3,0 a aproximadamente 0,2 ml/min. La elución se controló a 280 nm y se recogieron fracciones de un ml del material eluido en tubos que contenían suficiente base Tris pH 9 para neutralizar el tampón citrato. Las fracciones que contenían proteína se agruparon y se concentraron usando un aparato de filtración Amicon con un filtro YM-30 y se dializaron frente a PBS. La columna se regeneró inmediatamente con TBS. Se llevaron a cabo ensayos de unión a colorante de la proteína con el kit de determinación de proteínas BioRad (Hercules, California), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, usando albúmina sérica bovina como patrón.

ELISA de IgG humana (inmunoglobulina gamma)

Se revistieron placas ELISA durante la noche con 100 \mul de anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina específico de la cadena gamma antihumana de cabra a 0,4 mg/ml en tampón de recubrimiento a 4ºC. El anticuerpo de recubrimiento se retiró y se bloquearon las placas con BSA al 2% en PBS durante 2 horas. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 37ºC. El tampón de bloqueo se reemplazó por muestras de anticuerpo o patrón IgG1 humana diluida en tampón de dilución, diluidas en serie en un volumen de 200 ml y se incubaron durante una hora. Los controles negativos incluyeron tampón de dilución y/o medio de cultivo de células no transfectadas. Se lavaron los pocillos y se añadieron 100 \mul de anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina específica de la cadena kappa antihumana de cabra diluida 1:5000 y se incubó durante una hora. Los pocillos se lavaron y se añadieron 100 \mul de tampón de reacción y se incubó durante 30 minutos. La reacción de detuvo mediante la adición de NaOH 1 M y la absorbancia se leyó a 405 nm en un lector de placas ELISA. Los resultados se analizaron por ajuste a una curva iterativa de cuatro parámetros.

El análisis de aminoácidos se llevó a cabo de acuerdo con procedimientos disponibles en la técnica.

Se produjo anticuerpo monoclonal L_{A}H_{C} y se purificó hasta homogeneidad usando cromatografía de afinidad de Proteína A. Los ensayos ELISA usando IgG1 humana como patrón indicaron recuperaciones de L_{A}H_{C} superiores al 70%. Se estimó que la pureza del material era >90% por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos de expresión representativos y los rendimientos típicos de purificación se muestran en la Tabla 21.

TABLA 21 Datos de expresión y rendimientos de purificación de proteínas anticuerpo frente a FAP en células

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Se muestran datos representativos de la expresión para cada uno de los anticuerpos anti-FAP producidos en este estudio. Las recuperaciones después de cromatografía de afinidad de proteína A en agarosa estaban basadas en las medidas de unión a colorante de la proteína de la Ig purificada usando BSA como patrón.

Ejemplo 12 Unión de anticuerpo monoclonal L_{A}H_{C} a FAP humano recombinante aislado

El objetivo de este estudio fue caracterizar la unión de L_{A}H_{C} a FAP humano recombinante aislado.

ELISA DE CD8-FAP

Se revistieron placas ELISA durante la noche con 100 \mul de anticuerpo anti-rata de ratón (Sigma Chemical R0761) a 1:2000 en tampón de revestimiento a 4ºC. El anticuerpo de recubrimiento se retiró y se bloquearon las placas con BSA al 2% en PBS durante una hora. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se reemplazó el tampón de bloqueo con 100 ml de anticuerpo anti-CD8 de rata 1 \mug/ml (Pharmingen 01041 D) y se incubó durante una hora. Las placas se lavaron y se añadieron 100 \mul de sobrenadante de cultivo CD8-FAP (véase el Ejemplo 14) (1:2 en PBS) y se dejó unir durante una hora. Las placas se lavaron y se añadieron muestras de anticuerpo (diluciones en serie a la mitad) en un volumen de 100 \mul y se incubó durante una hora. Los controles negativos incluyeron IgG humana y/o medio de cultivo de células no transfectadas. Los pocillos se lavaron y se añadieron 100 \mul de anticuerpo IgG1 anti-humano de ratón (Zymed 05-3320) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluido 1:500 en tampón de dilución y se incubó durante una hora. Los pocillos se lavaron y se añadieron 100 \mul de sustrato HRP, ácido (azino-bis (3-etilbenztiazolin 6-sulfónico), Sigma Chemical A9941) y se incubó durante 60 minutos. La reacción de detuvo mediante la adición de NaOH 1 M y la absorbancia se leyó a 405/490 nm en un lector de placas ELISA. Los resultados se analizaron por ajuste a una curva iterativa de cuatro parámetros.

De forma alternativa, se revistieron las placas directamente con cF19. Se dejó unir FAP (FAP humano recombinante, véase el ejemplo 13) a estas placas como antes y se añadió L_{A}H_{C} (\sim1 \mug/ml) biotinilado. La unión al anticuerpo se detectó con conjugado HRP-estreptavidina como antes.

Solubilización de FAP humano unido a la membrana

Se añadieron células 293FAP l/2 que expresan FAP o control 293 con PBS y se lisaron con Triton X-114 al 1% en solución salina tamponada con Tris. Se separaron los núcleos y restos por centrifugación a 10.000 x g. Se realizó el reparto de fases del sobrenadante (Estreicher A, Wohlend A, Belin D, Scheuning WD Vasalli JD. Characterization of the cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activator. (1989) J Biol Chem 264:1180-1189) para enriquecer las proteínas de la membrana. La fase detergente se recogió y se diluyó en tampón que contenía Empigen BB al 1% (Calbiochem) para prevenir la nueva agregación del Triton X-114. Este material se sometió a cromatografía con agarosa Concanavalina A (Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su SL, Ozer HL, Schwab, M, Albino AP, Old LJ. Regulation and heteromeric structure of the fibroblast activation protein in normal and transformed cells of mesenchymal and neuroectodermal origin. (1993) Cancer Res 53:3327-3335).

Biotinilación de L_{A}H_{C}

Se dializó L_{A}H_{C} (1-2 mg) frente a tampón bicarbonato 50 mM y se biotiniló con un exceso molar de diez veces de hexanoato de sulfosuccinimidil-6-biotinamido (NHS-LC biotin, Pierce Chemical, Rockford, Illinois, USA) durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto sin reaccionar se separó por microdiálisis repetida en un microconcentrador.

Transfecciones transitorias

Se cotransfectaron células COS-7 (American Type Tissue Culture Collection, número de referencia CRL 1651) por electropermeabilización con los vectores de la cadena pesada y ligera que codifican L_{A}H_{C}.

Se inmovilizó el anticuerpo monoclonal anti-CD8 sobre placas de microvaloración. Se dejó que el CD8-FAP del medio de células de insecto infectadas con vaculovirus CD8-FAP se uniera a estas placas. Se diluyó en serie medio gastado de cultivos de células COS-7 transfectadas de forma transitoria con dos vectores separados que codifican L_{A}H_{C} y se añadió a los pocillos que contenían CD8-FAP inmovilizado. L_{A}H_{C} ligado a proteína CD8-FAP inmovilizado aislado (Figura 35). Los sobrenadantes de cultivo de células transfectadas con COS-7 Mock no pudieron demostrar unión.

Se diluyó en serie FAP ligado a la membrana recombinante de extractos detergentes de células 293FAP I/2 o extractos control y se inmovilizó a través de anticuerpo monoclonal F19 quimérico ligado a placas de microvaloración. L_{A}H_{C} biotinilado se une a FAP humano recombinante inmovilizado con cF19 (Figura 36) de un modo dependiente de la concentración.

L_{A}H_{C} reconoció FAP humano recombinante inmovilizado aislado que porta el epítopo de F19. L_{A}H_{C} se unió a ambos CD8-FAP producidos en células de insectos, así como a proteína FAP producida en células 293FAP l/2.

Tres días después de la transfección se recogieron los sobrenadantes de cultivo de células COS7 transfectadas bien con vectores de la cadena pesada y ligera que codifican L_{A}H_{C} o con ADN (Control). CD8-FAP se inmovilizó a través de un anticuerpo anti-CD8 como se describe en el texto. Se dejó que diluciones en serie de sobrenadantes de COS7 se unieran a CD8-FAP inmovilizado y seguidamente se detectó con un anticuerpo IgG1 anti-humano conjugado con HRP.

Se diluyeron en serie extractos detergentes de células 293FAP l/2 que expresan FAP o células control 293 y se añadieron a placas de microvaloración revestidas de cF19. Se añadió L_{A}H_{C} biotinilado y se detectó la unión de L_{A}H_{C} biotinilado con estreptavidina conjugada con HRP.

Ejemplo 13 Caracterización de células de fibrosarcoma HT-1080 y células de riñón embrionario humano 293 transfectadas con ADNc para FAP humano

La proteína activadora de fibroblastos (FAP) es una proteína de la superficie de la célula, unida a la membrana que porta el epítopo de F19 y es expresada en fibroblastos estromales tumorales. Para la caracterización de anticuerpos monoclonales anti-FAP se generaron líneas celulares que expresan la proteína FAP recombinante y controles similares sin FAP.

Las células usadas fueron células HT-1080 (número de referencia CCL 121) y las células de riñón embrionarias humanas 293 (número de referencia CRL 1573) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Maryland, EEUU). Transfectam se obtuvo de Promega (Madison, WI). Geneticina y todas las enzimas de restricción se obtuvieron de Boehringer Mannheim. El ADN para las transfecciones se purificó en células de E. coli usando cartuchos QiaFilter Maxi Cartridges (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Todas las preparaciones de ADN se examinaron por digestión con enzimas de restricción. Se confirmaron las secuencias de vectores usando un secuenciador ABI PRISM 310.

Se ha descrito información adicional referida a los vectores y secuencias de ADN empleados en Scanlan MJ, Raj BK, Calvo B, Garin-Chesa P, Sanz-Moncasi MP, Healey JH, Old LJ, Rettig WJ. Molecular cloning of fibroblast activation protein alpha, a member of the serine protease family selectively expressed in stromal fibroblasts of epithelial cancers, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10832-10836. La secuencia de ADNc de FAP se ha depositado en Genbank (número de acceso HS09287).

Cultivo celular e inmunoensayos

Se transfectaron células HT-1080 con 1 mg de ADN usando Transfectam de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transfectaron células de riñón embrionarias humanas 293 por transfección en fosfato cálcico (Brann MR; Buckley NJ; Jones SVP; Bonner TI. Expression of cloned muscarinic receptor in A9 L cells. (1987) Mol Pharmacol 32: 450-455) con 10 mg de ADN. Veinticuatro horas después, se diluyeron las células 1:10 en medio nuevo que contenía 200 mg/ml de Geneticina. Se tomaron muestras de las colonias y se examinaron por inmunofluorescencia para determinar la expresión de FAP como se describe en Rettig WJ; Garin-Chesa P; Beresford HR; Oettgen HF; Melamed MR; Old LJ. Cell-surface glycoproteins of human sarcomas: differential expression in normal and malignant tissues and cultured cells.(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85: 3110-3114.

Se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones con cF19 con células marcadas metabólicamente como se describe en Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su SL, Ozer HL, Schwab, M, Albino AP, Old LJ. Regulation and heteromeric structure of the fibroblast activation protein in normal and transformed cells of mesenchymal and neuroectodermal origin. (1993) Cancer Res 53:3327-3335.

Se ensayaron las células HT-1080 y 293 para la expresión del antígeno FAP en ensayos de inmunofluorescencia con anticuerpos anti-FAP y se encontraron que eran negativos al antígeno. La transfección de estas células con vector FAP.38 dio como resultado la generación de colonias resistentes a la Geneticina. Se tomaron muestras de colonias aisladas y se analizaron por inmunofluorescencia para la expresión de FAP. Se identificaron dos clones celulares, designados HT-1080FAP clon 33 y 293FAP l/2, que expresan la proteína FAP ligada a la superficie celular, como fue reconocido por el anticuerpo cF19. La tinción de las células HT-1080FAP clon 33 y 293FAP l/2 no permeabilizadas con anticuerpo cF19 confirmó la localización en la superficie celular de la proteína FAP.

La inmunoprecipitación de la proteína FAP radiomarcada con cF19 en extractos de células HT-1080FAP clon 33 o células 293FAP l/2 marcadas con ^{35}S-metionina dio lugar a la aparición de una banda de 93 kilodalton después de autorradiografía. Esta banda no es detectable en inmunoprecipitados de extractos de células HT-1080 o 293 parentales.

Dos líneas celulares transfectadas de forma estable, HT-1080FAP clon 33 y 293FAP l/2, expresan FAP en la superficie celular como se determinó en ensayos inmunológicos con anti-FAP mAbs. Ni las células HT-1080 parentales ni las células 293 parentales expresan niveles detectables de FAP.

Ejemplo 14 Generación y caracterización de proteína de fusión CD8-FAP

Se produjo una forma soluble de FAP humana (proteína activadora de fibroblastos) en forma de proteína de fusión CD8-FAP en células de insecto para la caracterización de L_{A}H_{C} que contiene el sitio de unión para anti-FAP mAbs. Se eligió CD8 murino para permitir la secreción de la proteína y proporcionar una etiqueta de epítopo adicional.

El ADNc que codifica el dominio extracelular de CD8, que comprende los 189 primeros aminoácidos de CD8\alpha murino (Genbank M12825), se unió al del dominio extracelular de FAP (aminoácidos 27 a 760), básicamente como se describe por Lane, et al. (Lane P, Brocker T, Hubele S, Padovan E, Lazavecchia A, McConnell. Soluble CD40 ligand can replace the normal T cell-derived CD40 ligand signal to B cells in T cell-dependent activation. (1993) J Exp Med 177:1209-1213) usando protocolos de PCR normalizados. Se verificó la autenticidad de todos los clones por secuenciamiento de ADN. El ADN resultante se insertó en el vector pVL1393 (Invitrogen) y se llevó a cabo la transfección de células Sf9 (Invitrogen) con este vector y la amplificación del bavulovirus recombinante resultante como se ha descrito (Baculovirus Expression Vectors. A Laboratory Manual. O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, (Eds.), Oxford University Press: New York, 1994). El medio gastado de células High Five™ (Invitrogen) infectado con baculovirus CD8-FAP recombinante durante cuatro días se recogió y se aclaró por ultracentrifugación.

El ensayo ELISA para CD8-FAP (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima) se ha descrito antes (Ejemplo 12).

Cultivos de células de insectos infectadas con virus CD8-FAP segregaron una proteína de fusión en el medio que porta el epítopo F19 y es reconocida por un anticuerpo anti-FAP (Figura 1). Ni el medio de cultivo celular solo ni el medio de células de insecto infectado con proteína de fusión CD8-CD40L se unieron al anticuerpo anti-FAP.

La proteína CD8-FAP soluble que porta el epítopo F19 se segregó en el medio de cultivo de células de insecto infectadas. El sobrenadante del cultivo de células infectadas con una construcción control no contenía antígeno que portara el epítopo F19.

Se produjo una forma soluble de FAP, CD8-FAP, en células de insecto y CD8-FAP mostró portar el epítopo reconocido por cF19.

Cuatro cías después de la infección se recogieron sobrenadantes de células de insectos infectadas con bavulovirus recombinante que codifica CD8-FAP o la proteína de fusión CD8-CD40L. El medio de cultivo celular sin células se usó como control adicional (medio). Se añadieron diluciones en serie de estos materiales a placas de microvaloración revestidas de anticuerpo anti-DC8 y se dejó que se unieran. Seguidamente se añadió cF19 (1 mg/ml) y se dejó que se unieran. El cF19 ligado se detectó con anticuerpo anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano picante.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Boehringer Ingelheim International GmbH

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(B)

CALLE: Rheinstrasse

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(C)

CIUDAD: Ingelheim am Rhein

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 55216

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: ++49-6132-772770

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: ++49-6132-774377

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpo específico de FAP alfa con capacidad de producción mejorada

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 101

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 339 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 339 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 339 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 220 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 453 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 321 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19:

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 990 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 330 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\newpage

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 427 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 133 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 457 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 143 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

64

65

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8068 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 239 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

71

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7731 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

72

73

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 472 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 339 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

81

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8068 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

84

85

86

87

88

89

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 234 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 372 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7731 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

99

100

101

102

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 472 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGTCTCCT CAGGTGAGTG GATCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCTCTTGC AGCC

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCTCTTGC AGCC

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Thr Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGTCTCCT CAGCCTCCAC CAAGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Ser Ser Thr Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGTCTCCT CAGCCTCCAC CAAGGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATAAAAC GTGAGTGGAT CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCTTTCCT CAGGAACTGT GGCTGCA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATAAAAC GAACTGTGGC TGCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATAAAAC GAACTGTGGC TGCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser}

\sac{Gly Thr Cys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Trp Ala Gly}

\sac{Val Leu Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGCCACC

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGGATTCACA GGCCCAG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Ser Gln Ala Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC ACTCACGTTT CAGCTCCAGC TTGGT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGGGATGGAG CTGGGTC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Trp Ser Trp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGATCC ACTCACCTGA GGAGACGGTG ACTGA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATCACAA TGTCTCCGGA GGAACCTGGA ACCCAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCGGAGAC ATTGTGATGA CCCAATCTC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCGGAGAC ATTGTGATGA CCCAATCTC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCCAGATT CCCTAGTGCT AGCCCAAAAG ATGAGGAGTT TGGG

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCCTTGTC CGAACGTGAG CGGATAGCTA AAATATTGCT GACAGTAATA AAC

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCACGTTC GGACAAGGGA CCAAGGTGGA AAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCCCTTGTC CGAACGTGAG CGGATAGCTA AAATATTGCT GACAGTCATA AACTGCC

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAACTCC TCATCTATTG GGCTAGCACT AGGG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTAGTGCT AGCCCAATAG ATGAGGAGTT TGGG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACGCAAACC GCCTCTC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTGCACCA TATGCGGT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGCTATG ACCATG

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTCCCAG TCACGAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTATTCAG TGAAGGTGTA TCTACTAGTT TTACAGCTGA CTTTCAC

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 53 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGTAGATAC ACCTTCACTG AATACACCAT ACACTGGGTT AGACAGGCCC CTG

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

112

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGGTTAC GACGAGGGCC ATGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAAC

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACACTGCA GTCTACTTCT GCGCCAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACGCAAACC GCCTCTC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGTGCACCA TATGCGGT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 76 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCACCGTCC TTGACACGCG TCTCGGGA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGAGGAGG GTGCCAG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGACATTGT GACCCAATCT CC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACAGTCATA AACTGCCACA TCTTC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGACACGCG TCTCGGGAAG CTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCAGAGG ATCCACTCAC CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> Boehringer Ingelheim International GmbH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpo específico de FAP alfa con capacidad de producción mejorada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 12-196-PCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/EP99/02711

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-04-22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 98107925.4

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-04-30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

117

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Región variable de la cadena ligera quimérica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Región variable de la cadena pesada quimérica

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 990

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

138

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 427

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

139

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

140

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

141

\vskip1.000000\baselineskip

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<211> 143

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

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142

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<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8068

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

143

144

145

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<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7731

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

147

148

149

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 472

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

150

151

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

153

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

154

155

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

156

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8068

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

157

158

159

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

160

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

161

\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

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\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

162

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

163

164

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

165

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

166

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7731

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 42

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167

168

\newpage

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<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 472

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

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170

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtctcct caggtgagtg gatcc

\hfill

25

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<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctcttgc agcc

\hfill

14

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<211> 14

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctcttgc agcc

\hfill

14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Ser}

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<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Thr Lys Gly}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtctcct cagcctccac caagggc

\hfill

27

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Ser Ser Thr Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accgtctcct cagcctccac caagggc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaataaaac gtgagtggat cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctttcct caggaactgt ggctgca

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaataaaac gaactgtggc tgca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaataaaac gaactgtggc tgca

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser}

\sac{Gly Trp Cys Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly}

\sac{Val Leu Ser}

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccgccacc

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccag

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Ser Gln Ala Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaggatcc actcacgttt cagctccagc ttggt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgggtc

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Trp Ser Trp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaggatcc actcacctga ggagacggtg actga

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatcacaa tgtctccgga ggaacctgga acccag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccggagac attgtgatga cccaatctc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaatataaaa ggctctgact ggacttgcag ttgatggtgg ccctc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

172

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accccagatt ccctagtgct agcccaaaag atgaggagtt tggg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

173

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcccttgtc cgaacgtgag cggatagcta aaatattgct gacagtaata aac

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcacgttc ggacaaggga ccaaggtgga aat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

174

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcccttgtc cgaacgtgag cggatagcta aaatattgct gacagtcata aactgcc

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccaaactcc tcatctattg ggctagcact aggg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctagtgct agcccaatag atgaggagtt tggg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacgcaaacc gcctctc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagtgcacca tatgcggt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacagctatg accatg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtattcag tgaaggtgta tctactagtt ttacagctga ctttcac

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagtagatac accttcactg aatacaccat acactgggtt agacaggccc ctg

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

176

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

177

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatggttac gacgagggcc atgctatgga ctactggggt caaggaac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 91

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400

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<210> 92

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 92

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggacactgca gtctacttct gcgccag

\hfill

27

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<210> 93

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 93

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\hskip-.1em\dddseqskip

tacgcaaacc gcctctc

\hfill

17

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<210> 94

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 94

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagtgcacca tatgcggt

\hfill

18

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<210> 95

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<211> 75

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 95

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178

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<210> 96

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 96

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtcaccgtcc ttgacacgcg tctcggga

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28

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<210> 97

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 97

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttggaggagg gtgccag

\hfill

17

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<210> 98

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 98

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gagacattgt gacccaatct cc

\hfill

22

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<210> 99

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 99

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gacagtcata aactgccaca tcttc

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25

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<210> 100

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 100

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ttgacacgcg tctcgggaag ctt

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23

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<210> 101

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220> ADN

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<223> Descripción de secuencia artificial: CEBADOR

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<400> 101

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ggcgcagagg atccactcac ct

\hfill

22

Claims (51)

1. Una proteína anticuerpo que tiene las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal F19 (Nº de acceso ATCC HB 8269), uniéndose de forma específica dicha proteína anticuerpo a proteína activadora de fibroblastos, caracterizada porque contiene la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 6.

2. Una proteína anticuerpo de la reivindicación 1, caracterizada porque la región variable de la cadena ligera es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 1 o SEQ ID Nº: 5.

3. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que contiene una región variable de la cadena pesada tal como se describe en una cualquiera de las SEQ ID N^{os}: 8, 10, 12, 14.

4. Una proteína anticuerpo de la reivindicación 3, caracterizada porque la región variable de la cadena pesada es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en las SEQ ID N^{os}: 7, 9, 11, 13.

5. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que contiene la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2 y la región variable de la cadena pesada tal como se describe en las SEQ ID N^{os}: 12.

6. La proteína anticuerpo de la reivindicación 5, caracterizada porque la región variable de la cadena ligera es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 1 y la región variable de la cadena pesada es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº:. 11.

7. Una proteína anticuerpo según la reivindicación 5 o la reivindicación 6 que contiene la región constante de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 20 y la región constante de la cadena pesada tal como se describe en la SEQ ID Nº: 22.

8. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que contiene la región variable de la cadena ligera tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2 y la región variable de la cadena pesada tal como se describe en las SEQ ID N^{os}: 8.

9. La proteína anticuerpo de la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de la cadena ligera es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 1 y la región variable de la cadena pesada es codificada por una secuencia de nucleótidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 7.

10. Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un vector ADN recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 10.

12. El vector ADN recombinante de la reivindicación 11, siendo dicho vector un vector de expresión.

13. Una célula hospedadora que porta un vector según las reivindicaciones 11 ó 12.

14. La célula hospedadora de la reivindicación 13, en la que dicha célula hospedadora es una célula eucariótica.

15. La célula hospedadora de la reivindicación 14, en la que dicha célula eucariótica es una célula de mamífero.

16. La célula hospedadora de la reivindicación 15, en la que dicha célula hospedadora es una célula CHO o COS.

17. Un procedimiento para producir proteínas anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a)

cultivar una célula hospedadora según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 en condiciones en las que dicha proteína anticuerpo sea expresada por dicha célula hospedadora, y

(b)

aislar dicha proteína anticuerpo.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha célula hospedadora es una célula de mamífero, preferiblemente una célula CHO o COS.

19. El procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, en el que dicha célula hospedadora es cotransfectada con dos plásmidos que portan las unidades de expresión para las cadenas ligera y pesada, respectivamente.

20. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dicha proteína anticuerpo está conjugada con un agente terapéutico.

21. La proteína anticuerpo de la reivindicación 20, en la que dicho agente terapéutico es un agente terapéutico seleccionado del grupo consistente en radioisótopos, toxinas, toxoides, agentes inflamatorios y agentes quimioterápicos.

22. La proteína anticuerpo de la reivindicación 21, en la que dicho radioisótopo es un radioisótopo emisor de radiación \beta.

23. La proteína anticuerpo de la reivindicación 22, en la que dicho radioisótopo se selecciona del grupo consistente en ^{186}Renio, ^{188}Renio, ^{131}Yodo e ^{90}Itrio.

24. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque está marcada.

25. La proteína anticuerpo de la reivindicación 24, en la que dicho marcador es un marcador detectable.

26. La proteína anticuerpo de la reivindicación 25, en la que dicho marcador detectable es un marcador detectable seleccionado del grupo consistente en enzimas, colorantes, radioisótopos, digoxigenina y biotina.

27. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, conjugada con un agente visualizable.

28. La proteína anticuerpo de la reivindicación 27, en la que el agente visualizable es un radioisótopo.

29. La proteína anticuerpo de la reivindicación 28, en la que dicho radioisótopo es un radioisótopo emisor de radiación \gamma.

30. La proteína anticuerpo de la reivindicación 29, en la que dicho radioisótopo es ^{125}I.

31. Una composición farmacéutica que contiene una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Una composición farmacéutica que contiene una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. Una composición farmacéutica que contiene una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

34. La composición farmacéutica de las reivindicaciones 31 a 33, para usar en el tratamiento o visualización de tumores, en la que dichos tumores están asociados con fibroblastos estromales activados, preferiblemente en la que dichos tumores son tumores seleccionados del grupo de cánceres consistentes en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro.

35. Uso de una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

36. Uso de una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

37. Uso de una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30 para la fabricación de un medicamento para visualizar fibroblastos estromales activados.

38. Uso de una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 para detectar la presencia de fibroblastos estromales activados en una muestra.

39. El uso de la reivindicación 35 ó 36, en el que el cáncer se selecciona del grupo de cánceres consistentes en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro.

40. Un procedimiento para detectar la presencia de fibroblastos estromales activados en la curación de heridas, inflamación o un tumor, caracterizado porque

(a)

se pone en contacto una muestra, que posiblemente contiene fibroblastos estromales activados, con una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ó 24 a 26 en condiciones adecuadas para la formación de un complejo entre dicho anticuerpo y antígeno,

(b)

detectar la presencia de dicho complejo, detectando de este modo la presencia de fibroblastos activados en heridas en cicatrización, inflamación o un tumor.

\newpage

41. El procedimiento de la reivindicación 40, en el que el tumor es un tumor que tiene células cancerosas seleccionadas del grupo de cánceres consistentes en cánceres colorectales, cánceres de pulmón amicrocíticos, cánceres de mama, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de ovario, cánceres de pulmón, cánceres de vejiga, cánceres pancreáticos y cánceres metastásicos del cerebro.

42. Un procedimiento para detectar estroma tumoral, caracterizado porque

(a)

se pone en contacto una muestra adecuada con una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo anticuerpo-antígeno,

(b)

detectar la presencia de cualquier complejo así formado,

(c)

relacionar la presencia de dicho complejo con la presencia de estroma tumoral.

43. El procedimiento de la reivindicación 42, en el que dicho anticuerpo está marcado con un marcador detectable.

44. Una proteína anticuerpo que contiene una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 2.

45. Una proteína anticuerpo según la reivindicación 44 que contiene además una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 12.

46. Una proteína anticuerpo según la reivindicación 44 ó 45 que contiene además una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 20 y una secuencia de aminoácidos tal como se describe en la SEQ ID Nº: 22.

47. Una molécula de ADN que codifica una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46.

48. Una célula hospedadora que tiene una molécula de ADN según la reivindicación 47.

49. Un procedimiento para producir una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a)

cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 48 en condiciones en las que dicha proteína anticuerpo sea expresada por dicha célula hospedadora, y

(b)

aislar dicha proteína.

50. Una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 que está conjugada con un radioisótopo, preferiblemente ^{131}I, ^{125}I, ^{188}Re, ^{188}Re o ^{90}Y.

51. Una composición farmacéutica que comprende una proteína anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 o 50, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.