KR100580936B1 - 개선된 생산성을 갖는 ＦＡＰα-특이적 항체 - Google Patents

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Abstract

섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)와 특이적으로 결합하고 숙주세포에서 생산성을 개선시키는 프레임웍 변형을 포함하는 재조합 항체 단백질이 제공된다. 본 발명은 또한 상기 항체의 진단 및 치료 목적을 위한 용도 및 상기 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 생산성을 갖는 ＦＡＰα-특이적 항체{FAPα-specific antibody with improved producibility}
본 발명은 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)에 특이적으로 결합하는 항체 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체의 진단 및 치료 목적을 위한 용도 및 상기 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상피 암의 침습성 성장은 지지 스트로마(stroma)에서의 다수의 특징적인 세포 및 분자 변화와 연결되어 있다. 많은 유형의 상피 암의 반응성 스트로마의 고도의 일관된 분자 형질 중 하나는 모노클로날 항체 F19로 본래 동정된 반응성 스트로마 섬유아세포의 세포 표면 분자인 섬유아세포 활성화 단백질 알파(이하 FAP라고 함)의 유도이다(Garin-Chesa P., Old L. J. and Rettig W.J.(1990) Cell surface glycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epitherial cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. 87:7235). FAP 항원은 위치 및 조직학적 형에 관계없이 일정 범위의 상피 악성종양의 스트로마에서 선택적으로 발현되기 때문에, 상피 암 및 특정 다른 증상의 영상화, 진단 및 치료를 위해 FAP-표적화 개념이 개발되어 왔다. 이를 위해, FAP에 특이적으로 결합하는 F19라고 칭하는 모노클로날 항체가 개발되었고, 본 명세서에서 완전히 참고로 인용되는 US 특허 제 5,059,523 호 및 WO 93/05804에 기술되어 있다.
인간의 생체내 적용을 위해 비-인간 항체를 사용할 때, 다른 심각한 문제는 이들 항체가 환자에게서 항체의 효력을 감소시키고 계속된 투여를 방해하는 인간의 항-비-인간 반응을 빠르게 일으킨다는 것이다. 비인간 항체의 인간화는 다음 두 방법 중 하나에 의해 통상 달성된다: (1) 비인간 가변 부위가 인간 불변 부위에 결합되어 있는 비-인간/인간 키메릭(chimeric) 항체를 구성하거나(Boulianne G. L. Hozumi N. and Schulman, M.J. (1984) Production of functional chimeric mouse/human antibody Nature 312: 643) 또는 (2) 비-인간 가변 부위로부터의 상보성 결정 부위(CDR)를 인간 가변성 부위에 이식시키고, 이어서 이들 "재형성된 인간" 가변성 부위를 인간 불변성 부위에 결합시킨다(Reichmann L., Clark M. Waldmann H. and Winter G. (1988) Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332:323). 마우스 항체보다 상당히 양호하지만 키메릭 항체는 여전히 인간에서 항-마우스 반응을 유도해 낼 수 있다(LoBuglio A. F., Wheeler R. H., Trang J., Haynes A., Rogers K., Harvey E.B., Sun L., Ghrayeb J. and Khazaeli M.B. (1989) Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: Kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:4220). CDR-이식 또는 재형성된 인간 항체는 마우스 항체로부터 유래된 것으로 동정될 수 있는 단백질 서열을 거의 또는 전혀 함유하지 않는다. CDR-이식에 의해 인간화된 항체는 천연 인간 항체에서조차 나타나는 바와 같이, 항-알로타입(anti-allotype) 또는 항-이디오타입 반응과 같은 일부 면역 반응을 유도할 수 있지만, CDR-이식된 항체는 마우스 항체보다 면역원성 이 상당히 적고, 따라서 환자를 보다 지속적으로 치료할 수 있다.
진단, 영상화 및 치료용 항체의 상업적 사용에 관련되는 또다른 심각한 제한은 대량 생산성이다. 많은 경우에, 세포 배양 시스템에서의 천연, 키메릭 및/또는 CDR-이식된 항체의 재조합 발현은 불량하다. 불량한 생산성을 부여하는 인자는 리더 서열의 선택 및 생산을 위한 숙주 세포의 선택 및 부적절한 접힘(folding) 및 감소된 분비를 포함할 수 있다. 부적절한 접힘은 중쇄 및 경쇄의 불량한 어셈블리(assembly)을 만들거나 하나 또는 양쪽쇄의 분비를 금지시키는 수송이 부적당한 형태를 만들 수 있다. 일반적으로, L-쇄는 어셈블리된 단백질의 분비 능력을 제공하는 것으로 받아들여지고 있다. 일부 경우에 다중 또는 단일 치환이 항체의 생산성을 증가시킬 수 있다.
인간에서 진단 및 치료를 위한 특이 질병-관련 항체의 시험관내 및 생체내 특이 면역학적 표적화의 임상적 중요성 때문에, 항원 특이성, 낮은 면역원성 및 높은 생산성의 특성들을 조합한 항체의 필요성이 증가하고 있다.
그러므로, 본 발명의 근원적인 문제는 FAP에 특이적으로 결합하고, 인간에서의 낮은 면역원성, 및 재조합 시스템에서의 높은 생산성에 대한 성질을 조합한 항체 단백질을 제공하는 것이다.
상기 기술적 문제는 청구범위에서 특징으로 하는 구체예에 의해 해결된다.
본 발명은 F19의 가변부위 및 외부 불변부위를 갖는 키메릭 항체에 비교해서 숙주에서 개선된 생산성을 주는 프레임웍(framework) 변형을 갖는 것을 특징으로 하는, 모노클로날 항체 F19(ATCC 수탁번호 HB 8269)의 상보성 결정 부위를 가지며 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는 신규의 항체 단백질을 제공하는 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "항체 단백질"은 모노클로날 항체의 항원 결합 특이성을 갖는 단백질이다.
"모노클로날 항체의 상보성 결정 부위"는 Chothia and Lesk(Chothia and Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)과 관련하여 Kabat(Kabat E.A., Wu T. T., Perry H.M., Gottesman K.S. and Foeller C.(1991) Sequence of proteins of Immunological Interest(5th Ed.) NIH Publication No. 91-3242. U.S. Department of Health and Human and Services, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD)에 따른 특이적 항원 결합에 포함되는 아미노산 서열인 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임웍 변형"(framework)은 개개의 상보성 결정 부위를 둘러싼 가변부위에서 단일 또는 다수 아미노산의 교환, 결실 또는 첨가를 뜻한다. 프레임웍 변형은 항체 단백질의 면역원성, 생산성 또는 결합 특이성에 영향을 가질 수 있다.
"섬유 아세포 활성화 단백질(FAP)"은 또한 섬유 아세포 활성화 단백질 알파(FAPα)라고 표시되는데, 세린 프로테아제 유전자 패밀리에 속하는 막-결합 당단백질이다(WO 97/34927). 떨어지거나(shed) 분비된 형태의 FAP는 알려져 있지 않다. FAP는 모노클로날 항체 F19(F19는 ATCC에 수탁번호 HB 8269로 기탁된 하이브 리도마 세포주로부터 입수가능함)에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
항체 단백질 중 용어 "섬유아세포 활성화 단백질 특이적 결합"은 본 명세서에서 FAP-발현 인간 세포를 특이적으로 인식하고 이를 결합하는 능력에 의해 정의된다. 본 발명의 단백질의 결합 특이성은 실시예 6, 8 및 실시예 12에 예시된 방법으로 기술된 바와 같은 결합 특이성 평가를 위한 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "키메릭 항체"는 도 17 및 도 18에 기술된 바와 같은 경쇄 및 중쇄 가변부위 및 외부 불변부위를 갖는 항체 단백질을 언급한다. 본 명세서에서 정의된 "외부 불변 부위"는 F19의 불변 부위와는 다른 불변부위이다. 본 발명의 항체 단백질을 키메릭 항체와 비교할 때, 이러한 키메릭 항체는 상기 항체 단백질과 같은 불변 부위를 함유해야 한다고 이해될 것이다. 단지 예시 및 비교 목적으로 도 19 내지 22에 기술된 바와 같이 인간 불변 중쇄 및 경쇄가 일예의 유형법으로 사용된다.
본 발명의 항체 단백질을 제공하기 위하여, F19라고 표시된 뮤린(murine) 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자의 핵산 서열은 F19 하이브리도마 세포(ATCC 수탁번호 HB 8269)로부터 추출된 RNA로부터 결정되었다.
한 구체예에서, 본 발명은 F19 및 외부 불변 부위를 갖는 키메릭 항체와 비교하여 숙주 세포에서 개선된 생산성을 주는 프레임웍 변형을 갖는 것을 특징으로 하는, 섬유아세포 단백질(FAP)에 특이적으로 결합하는, 모노클로날 항체 F19 (ATCC 수탁번호 HB 8269)의 상보성 결정 부위를 갖는 항체 단백질에 관한 것이며, 여기서 상기 항체 단백질은 F19라고 표시된 뮤린 항체(ATCC 수탁번호 HB 8269)로부터 유래된다.
인간화된 FAP-특이적 항체 단백질을 만들기 위하여, F19의 경쇄 및 중쇄의 가변부위 및 인간 경 및 중 불변부위를 각각 갖는 키메릭 항체를 제작하였다. 키메릭 마우스/인간 항체의 제작 및 생산은 잘 알려져 있고(Boulianne et al.(1984), 상기 참조), 실시예 1 및 2에서 예시방법으로 예시되어 있다.
본 발명의 항체 단백질의 가변 부위는 전형적으로 인간 면역글로부린의 일부분인, 면역글로부린 불변 부위(Fc)의 적어도 일부분과 전형적으로 연결되어 있다. 인간 불변 부위 DNA 서열은 다양한 인간 세포, 그러나 바람직하게는 영원성(immortalized) B 세포로부터 잘 알려진 방법에 따라 분리될 수 있다(상기 Kabat 등 및 WO 87/02671참조). 그러므로, 본 발명의 항체 단백질은 FAP 항원에 대해 특이적 결합을 나타내는 한 불변 부위의 모두 또는 단지 일부를 함유할 수 있다. 불변 부위의 유형 및 정도의 선택은 상보성 고정 또는 항체 의존성 세포 독성과 같은 이펙터 기능이 원해지는가 여부 및 항체 단백질의 원하는 약리학적 성질에 좌우된다. 본 발명의 항체 단백질은 전형적으로 두개의 경쇄/중쇄 쌍으로 구성된 사량체이나, 또한 이량체일 수 있다. 즉, 경쇄/중쇄 쌍, 예를들어 Fab 또는 Fv 단편으로 구성된다.
그러므로, 추가의 구체예에서, 본 발명은 각각 인간 불변 부위에 결합된 가변 경쇄 부위 및 가변 중쇄 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다. 특히, 경쇄의 가변 영역은 인간의 카파(kappa) 불변 부위 에 결합되어 있고, 중쇄의 가변 부위는 인간 감마-1 불변부위에 결합되어 있다. 경쇄 및 중쇄를 인간화 하기 위한 다른 인간 불변 부위 또한 전문가에게는 이용될 수 있다.
그러므로, 한 특별한 구체예에서, 본 발명의 항체 단백질은 인간의 카파 불변 부위를 함유한다.
또한, 또다른 특별한 구체예에서, 본 발명의 항체 단백질은 인간 감-1 불변 부위를 함유한다.
특별한 "키메릭 F19 항체" 단백질(cF19)는 도 17 내지 22에 기술된 경쇄 및 중쇄 가변 및 불변 부위로 구성된다. cF19는 FAP 항원에 대한 특이적 결합을 나타내며 이에 대한 욕구(avidity)가 크다. 실시예 2에 예시된 바와 같이, COS 세포(아프리카 그린 원숭이의 신장으로부터 유래된 세포)에서의 cF19의 발현은 약 10 내지 60 ng/ml의 범위(이는 대부분의 항체보다 적어도 10배 적다)로 불량하다.
cF19의 발현 수준을 증가시키려는 시도에서, F19 VL 부위의 리더 서열이 9-위치에서 프롤린이 류신으로 치환되어 변화되었다. 리더 서열에서 아미노산중의 이 단일 변화는 COS 세포에서 생산된 키메릭 항체의 양을 적어도 2배화시켰다. COS 세포에서 생산된 키메릭 항체의 발현을 위하여, 다음의 돌연변이된 경쇄의 리더 서열: MDSQAQVLMLLLLWVSGTCG, 및 다음의 중쇄의 리더 서열: MGWSWVFLFLLSGTAGVLS가 사용되었다.
본 발명에 따라, 숙주 세포에서 "개선된 생산성"이란 상기 정의된 바와 같이 프레임웍 변형이 없는 키메릭 항체의 발현 수준 및/또는 항체 수율과 비교할때, 발 현 수준 및/또는 정제된 항체 수율의 실질적인 개선을 뜻한다. 개선된 생산성을 예시하기위해 특별한 그러나 제한되지 않는 두개의 실시예가 COS 세포 발현 시스템에 대해(실시예 2 및 5) 및 CHO 세포 발현 시스템에 대해(실시예 10 및 11) 예시된다.
리더 서열의 돌연변이는 오직 키메릭 F19 항체의 발현 수율을 2배화 시키는 한편, 본 명세서에서 언급된 바와 같은 실질적인 개선은 적어도 10 계수(factor)의 발현 수준 및/또는 정제 수준에서의 개선을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 ELISA에 의해 결정된 조배지중의 항체 단백질 발현 수준 및/또는 정제된 항체 수율이 프레임웍 변형이 없는 키메릭 항체의 발현 수준 및/또는 정제 수율을 적어도 10의 계수로 초과함을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
보다 바람직한 구체예에서, 본 발명은 ELISA에 의해 결정된 조물질 샘플에서 항체 단백질의 발현 수준 및/또는 정제된 항체 수율이 프레임웍 변형이 없는 경우의 키메릭 항체의 정제 수율을 적어도 20의 계수로 초과함을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 ELISA에 의해 결정된 조물질 샘플에서 항체 단백질의 발현 수준 및/또는 정제된 항체 수율이 프레임웍 변형이 없는 경우의 키메릭 항체의 정제 수율을 적어도 100의 계수로 초과함을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 항체 단백질의 개선된 생산성은 COS 및 CHO(중국 햄스터 난소 유래된 세포) 진핵세포경우에 나타난 바와 같이 진핵 세포 경우에 입증될 수 있다(실시예 5 및 11). 추가의 실시형태에서, 본 발명은 진핵세포에서 개선된 생산성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 항체 단백질에 관한 것이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 상기 진핵세포가 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)인 항체 단백질에 관한 것이다.
예기치 않게, 경쇄 가변 부위의 특정 프레임웍 변형이 본 발명의 항체 단백질의 개선된 생산성을 결정한다는 것이 밝혀졌다. 도 1 내지 6에 기술된 바와 같이 버젼(version) A, B, 및 C 라고 표시된 세개 버젼의 재형성된 경쇄 가변 부위를 제조하였다.
경쇄 가변 부위 버젼 A, B 및 C는 실질적으로 CHO 세포에서 개선된 생산성을 나타낸다. 경쇄 가변 부위 A 및 C는 경쇄 가변 부위 버젼 B와 오직 두개의 공통적인 아미노산 잔기에 의해 상이하지만, 이들은 생산성에 있어서 추가의 실질적인 개선을 나타낸다. 인간의 재형성된 F19 경쇄 버젼 B와 버젼 A 또는 C사이에 항체 분비 수준에서 적어도 다른 10배의 차이가 있다. 재형성된 인간 F19 경쇄 버젼 A 및 B는 오직 그들의 아미노산 잔기에 있어서, 위치 36(Tyr이 Phe로 돌연변이) 및 87(Tyr에서 Asp로 돌연변이)의 두 잔기가 다르다(Kabat에 따라 명명). 경쇄 가변 부위 버젼 B를 함유하는 항체의 분비 능력상의 이 부정적 효과는 개별적으로 또는 함께로 여겨지는 Tyr의 Asp에로의 돌연변이 및 Tyr의 Phe에로의 돌연변이가 단지 단백질의 부적합한 접힘에 의해 일어난다면 비간접적이었다. 그러나, 이는 항원 결합 분석이 F19 경쇄 버젼 B를 함유하는 면역 글로부린이 F19 경쇄 버젼 A 또는 C 와 쌍을 이룬 것에 유사한 욕구를 갖는 것을 나타내어 이들이 엉뚱하게 잘못 접힌 것이 아님을 제안하기 때문에 진상은 아닌 것 같다.
재형성된 인간 F19 경쇄 버젼 B에서의 잔기 87은 특히 버젼 A 및 C에 비교할 때 분비의 감소에 관련이 있는 것으로 보인다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 경쇄 부위의 Kabat 위치 87에서의 아미노산이 아닌 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다.
보다 바람직한 구체예에서, 본 발명은 경쇄 부위의 Kabat 위치 87의 아미노산이 방향족 또는 지방족 아미노산으로부터 선택된 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 경쇄 부위의 Kabat 단백질 87에서의 방향족 아미노산이 티로신 또는 페닐알라닌인 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다.
추가의 구쳬예에서, 본 발명은 또한 경쇄 부위의 Kabat 위치 36에서의 아미노산이 방향족 아미노산으로부터 선택된 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다.
특별한 구체에에서, 본 발명은 경쇄 및 중쇄의 개별적으로 개시된 재형성된 가변 부위로 부터 제조될 수 있는 특이적 항체 단백질에 관한 것이다.
특히, 경쇄 가변 부위 버젼 A 및 C는 충분한 FAP-결합 특이성을 유지히고 낮은 돌연변이원성을 달성하는 한편 예외적으로 높은 생산성 때문에 본 발명을 실시하는데에 특히 적절하다. 이는 F19의 가변 영역 및 동일한 불변 영역을 갖는 키메 릭 항체와 비교할 때, 또한 경쇄 부위 버젼 B와 비교할 때 진실적이다.
그러므로, 한 구체에에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 기술된 경쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:1에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 항테 단백질에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:6에 기술된 경쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:5에 기술된 뉴클레오타이드서열에 의해 암호화됨을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한 개선된 생산성과 관련하여 경쇄 버젼 A 및 C의 가변 영역과 특히 잘 작용하는 중쇄의 수개의 상이한 가변 부위를 개시한다.
한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14의 어느 하나에 기술된 중쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 중쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13의 어느 하나에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호하됨을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
매우 특히 바람직한 구체에에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 기술된 경쇄의 가변 부위 및 SEQ ID NO:12에 기술된 중쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, 본 항체 단백질은 또한 SEQ ID NO:20에 기술된 경쇄의 불변 부위 및 SEQ ID NO:22에 기술된 중쇄의 불변 부위를 함유한다.
따라서, 본 발명의 추가의 면은 SEQ ID NO:2에 기술된 아미노산 서열을 함유하는 항체 단백질에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 이러한 항체 단백질은 SEQ ID NO:12에 기술된 아미노산 서열을 추가로 함유한다. 보다 바람직하게는, 상기 항체 단백질은 추가로 SEQ ID NO:20에 기술된 바와 같은 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:22에 기술된 바와 같은 아미노산 서열을 함유한다. 본 발명의 추가의 면은 방사성 동위원소, 바람직하게는 131I, 125I, 186Re, 188Re, 또는 90Y에 결합된 본 패퍼그래프에 기술된 바와 같은 항체 단백질이다. 본 발명의 추가의 면은 이 단락에서 기술된 바와 같은 항체 단백질을 코딩하는 DNA 분자이다. 본 발명의 추가의 면은 이러한 DNA 분자를 수반하는 숙주 세포이다. 따라서, 본 발명의 추가의 면은 이 단락에서 기술된 바와 같은 항체 단백질을 제조하는 방법이며, 상기 방법은 상기 항체 단백질이 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 조건하에서 이러한 숙주 세포를 배양하고, 상기 단백질을 단리하는 단계들을 포함한다. 본 발명의 추가의 면은 본 발명의 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 추가의 특별한 구체예에서, 본 발명은 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:1에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, 중쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:11에 기술된 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
추가의 특별한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2에 기술된 경쇄의 가변 부위와 SEQ ID NO:8에 기술된 바와 같은 중쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질에 관한 것이다.
추가의 특별한 구체예에서, 본 발명은 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:1에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, 중쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:7에 기술된 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 항체 단백질에 관한 것이다.
뮤린 항체의 가변 부위의 인간화는 본 분야에 공지된 방법을 이용하여 달성될 수 있다. EP 0239400에는 인간 가변 부위의 프레임웍에 뮤린 가변 부위의 CDR을 이식하는 것이 개시되어 있다. WO 90/07861에는 추가의 프레임웍 변형을 도입하여 CDR-이식된 가변 부위를 재형성하는 방법이 개시되어 있다. WO 92/11018에는 도너 CDR을 도너 프레임웍에 고도의 상동성을 갖는 어셉터 프레임웍과 조합하여 인간화된 Ig를 제조하는 방법이 개시되어 있다. WO 92/05274에는 뮤린 항체로부터 출발하여 프레임웍 돌연변이된 항체의 제조가 개시되어 있다. 뮤린 모노클로날 항체의 인간화에 관련된 추가의 선행기술 참고 문헌은 EP 0368684; EP 0438310; WO 92/07075, 또는 WO 92/22653이다. 따라서, 전문가는 공개적으로 이용될 수 있는 뮤린 모노크로날 항체 F19로 부터 출발하고, 본 분야에 알려진, 예를들어 WO 92/05274로부터 알려진 기술을 이용하여 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 본 발명의 항체 단백질을 코딩하는 DNA 분자는 물론 본 분야의 기술적 수준 합성 과정, 예를들어 적절한 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성 및 이어진 결찰 및 증폭과정에 의해 또한 수득될 수 있다(Frank et al.(1987) Methods Enzymol. 154:221-249).
추가의 면에서, 본 발명은 상기 게시된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 단백질에 대한 코딩 정보를 함유하는 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게는 본 발명 에 따른 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 또는 15로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 핵산 분자이다.
본 발명에 따른 추가의 면은, 특히 뉴클레오타이드 서열이 발현 벡터에서 처럼 발현 조절 서열에 기능적으로 연결될 때, 상기 언급된 핵산의 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 DNA 벡터이다. 재조합 DNA 벡터가 바람직하고, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
본 발명의 추가의 면은 특히 발현 벡터로서 기술된 바와 같은 벡터 수반 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포는 원핵(prokaryotic) 또는 진핵 세포일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 숙주 세포는 진핵 세포, 효모 세포, 또는 포유동물 세포이다. 보다 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 CHO(중국 햄스터 난소)세포 또는 COS 세포이다.
따라서, 본 발명의 추가의 면은 본 발명에 따른 항체 단백질을 생산하는 방법이다. 이러한 방법은
(a) 상기 항체 단백질이 숙주 세포에 의해 발현되는 조건하에서 상기 기술된 바와 같은 숙주 세포를 배양하고,
(b) 상기 항체 단백질을 단리시키는 단계들을 포함한다.
포유동물 숙주 세포, 바람직하게는 CHO 또는 COS 세포가 바람직하다. 본 발명의 항체 단백질을 생산하는 숙주 세포는 경쇄 및 중쇄에 대한 발현 단위를 함유하는 단일 벡터로 형질감염시킬 수 있다(transfected)(예를들어, WO 94/11523 참조). 한 특별한 구체예에서, 본 발명에 따른 항체 단백질을 생산하는 방법은 숙 주 세포에 관한 것이고, 상기 숙주 세포는 각각의 경쇄 및 중쇄용 발현 유니트를 수반하는 두개의 플라스미드로 공형질감염된다(cotransfected)(예를들어, EP 0481790 참조).
본 발명의 항체 단백질은 FAP 항원에 대해 치료제를 표적화시키기위한 고도의 특이적 도구를 제공한다. 그러므로, 추가의 면에서, 본 발명은 치료제와 결합된 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다. 본 분야에서 알려진 많은 치료제중에서, 방사성 동위원소, 독소, 톡소이드, 인플렘마토지닉제(inflammatogenic agents), 효소, 안티센스 분자, 펩타이드, 시토킨 및 화학요법제로부터 구성된 그룹으로부터 선택된 치료제가 바람직하다. 방사성 동위 원소중에서, 감마, 베타 및 알파-방출 방사성 동위원소가 치료제로서 사용될 수 있다. β-방출 방사성 동위원소가 치료 방사성 동위원소로 바람직하다. 186레늄, 188레늄, 131요오드 및 90 이트륨이 국소화된 조사 및 악성 종양 세포의 파괴를 달성하기 위하여 특히 유용한 β-방출 동위원소인 것으로 입증되었다. 그러므로, 186레늄, 188레늄, 131요오드 및 90 이트륨으로 구성된 그룹으로부터 선택된 방사성 동위원소가 본 발명의 항체 단백질과 결합된 치료제로서 특히 바람직하다. 예를들어, 본 발명의 항체를 방사성 요오드화 하기위하여 WO 93/05804에 개시된 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 면은 표지화되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다. 이러한 FAP-특이적 표지화된 항체는 시험관 내에서 및/또는 생체내에서 FAP 항원의 국소화 및/또는 검출을 가능하게 한다. 표지는 직접 적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 마커(marker)로서 정의된다. 간접적인 마커는 그자체로서는 검출될 수 없고, 간접적 마커에 특이적인 추가의 직접적으로 검출될 수 있는 마커를 필요로한다. 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 표지는 검출가능한 마커이다. 다양한 검출 가능한 마커중, 효소, 염료, 방사성 동위원소, 디곡시게닌 및 비오틴으로 구성되는 그룹으로 부터 선택된 검출 가능한 마커가 가장 바람직하다.
본 발명의 추가의 면은 영상화제(imageable agent)와 결합된 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 항체 단백질에 관한 것이다. 다양한 영상화제, 특히 방사성 동위 원소는 현재의 발달 수준에서 이용가능하다. 본 발명을 실시하기 위하여, 감마-방출 동위원소가 보다 바람직하다. 보다 바람직한 것은 125요오드이다.
본 발명의 한측면은 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 활성화된 스트로마(stromal) 섬유아세포와 결합된 종양을 치료하는데에 유용하다. 상승적으로 작용할 수 있는 항종양 스트로마 면역요법용으로 두개의 가능한 이펙터 원리가 있다: (a) 본 발명에 따른 비변형된 (비결합된, 그자체(naked)')항체는 종양 스트로마에서 면역 파괴 또는 염증성 반응을 일으킬 수 있고, 한편 (b) 예를들어 방사성 동위원소 또는 다른 독성 물질과 같은 치료제에 연결된 항체가 국소화된 조사 및 악성 종양 세포의 파괴를 달성 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 면은 특히 종양의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위해 기술된 바와 같은 항체 단백질의 용도이다.
추가의 구쳬예는 활성화된 스트로마 섬유아세포와 결합된 종양을 치료하는데 유용한 상기 기술된 치료제와 결합된 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물이다. 다른 구체예는 인간 환자에서 상처 염증이 있는 피부 또는 종양을 치유하는데 있어서 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 영상화하는데에 유용한 상기 기술된 바와 같은 영상화제와 결합된 본 발명에 따른 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 가장 바람직한 구체예는 상기 종양이 콜로렉탈(colorectal) 암, 대(non-small) 세포 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 침습성 방광암(invasive bladder cancers), 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로 부터 선택된 종양인, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이다.
동물 및 인간 신체에서, 처리하려는 질병 또는 문제, 예를들어 종양의 유형 및 기원에 따라 정맥내 또는 다른 경로, 예를들어 전신적으로, 국소적으로 또는 관심대상의 조직 또는 기관에 국소적으로 상기 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 적용하는 것이 유리한 것으로 입증될 수 있다. 예를들어, 전신 작용 방법은 예를들어, 전신 자동 면역 질병, 또는 알레르기, 또는 외부 기관 또는 조직의 이식, 또는 확산되거나 국소화시키기에 어려운 종양에서와 같이 상이한 기관 또는 기관 시스템이 치료를 요할때 요구된다. 국소적 작용 방법은 예를들어 국소적 종양과 같은 종양성 또는 면역학적 작용이 기대될 때 교려된다.
본 발명의 항체 단백질은 전문가에게 알려진 상이한 적용 경로 , 그중에서도 특히 정맥내 주사 또는 표적 조직에의 직접 주입에 의해 적용될 수 있다. 전신 적 용 경우, 정맥내, 혈관내, 근육내, 동맥내, 복강내, 경구, 또는 척수내(intrathecal) 경로가 바람직하다. 보다 국소적인 적용이 피하, 피내, 인트라카르디알리(intracardially), 인트라로발리(intralobally), 골수내, 폐내 또는 치료하려는 조직(결합-, 뼈-, 근육-, 신경-, 상피 조직)에 직접적으로 또는 근접하여 시행될 수 있다. 치료의 원하는 기간 및 효과에 따라, 약제학적 항체 조성물이 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를들어 수일, 수주 또는 수개월동안 1일 기준으로 그리고 상이한 투여량으로 투여될 수 있다.
상기 기술된 적용을 위해 적절한 항체 제제를 제조하기 위하여, 전문가는 알려진 주사가능한 생리학적으로 허용되는 멸균 용액을 사용할 수 있다. 비경구 주사 또는 주입용 즉시 사용형 용액을 제조하기 위하여, 예를들어 염수 또는 상응하는 플라즈마 단백질 용액과 같은 등장성 수용액이 쉽게 이용가능하다. 약제학적 조성물은 동결 건조물 또는 건조 제제로서 존재할 수 있고, 이는 예를들어 부분들의 키트로서 멸균 조건하에서 사용하기 직전에 알려진 주사 가능한 용액으로 재구성될 수 있다. 본 발명의 항체 조성물의 최종 제조는 본 발명에 따른 정제된 항체를 알려진 담체 물질 또는/ 및 첨가제(예를들어, 혈청 알부민, 덱스트로즈, 소듐 바이설파이트, EDTA)로 보충될 수 있는 멸균된 생리학적으로 허용되는 용액과 혼합시켜 주사, 주입 또는 관류(perfusion)용으로 제조된다.
적용되는 항체의 양은 질병의 성질에 좌우된다. 암 환자에 있어서, "그자체(naked)' 항체의 적용되는 투여량은 적용당 0.1 내지 100 mg/m2, 바람직하게 는 5 내지 50 mg/m2 일 수 있다. 예를들어 요오드-131로 방사성 표지된 항체 경우, 치료 세팅에서 능가되지 않아야하는 최대적으로 내약성 투여량(MTD)은 결정되어야 한다. 암 환자에게 방사성 표지된 항체의 적용은 이어서 MTD이하인 투여량의 반복된(월마다, 주마다) 정맥내 주입에 의해 수행될 수 있다(예를들어 Welt et al.(1994) J. Clin. Oncol. 12:1193-1203 참조).
또한, 본 발명의 한면은 암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항체 단백질의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 암의 치료를 위해 상기 기술된 바와 같은 치료제와 결합된 본 발명에 따른 항체 단백질의 용도에 관한 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 활성화된 스트로마 섬유아세포를 영상화제와 결합된 본 발명에 따른 항체 단백질의 용도에 관한 것이다. 추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 샘플에서 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 검출하기 위한 본 발명에 따른 표지된 항체 단백질의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한면은 종양과 유효량의 항체를 접촉시키는 것을 포함하는, 예를들어 융합 단백질, 또는 치료제와 결합된 항체 단백질과 같은, 그자체/비변형된 항체, 변형된 항체 단백질로서 존재하는 본 발명에 따른 항체 단백질과 복합체를 특이적으로 형성할 수 있는 활성화된 스트로마 섬유아세포와 결합된 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 콜로렉탈 암, 대세포 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 침습성 방광암, 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로부터 선택된 암 세포를 갖는 종양인 상기 정의된 바와 같은 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 기술된 바와 같은 종양을 치료하는 방 법은 시험관내에서 또는 생체내에서 실시될 수 있다.
본 발명의 추가의 면은
(a) 가능하게는 활성화된 스트로마 섬유아세포를 함유하는 샘플을 항체와 항원 사이의 복합체를 형성하기에 적절한 조건하에서 본 발명에 따른 항체 단백질과 접촉시키고,
(b) 상기 복합체의 존재를 검출하여, 상처 치유, 염증 또는 종양에서 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 상처 치유, 염증 또는 종양에서 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 콜로렉탈 암, 대세포 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 방광암, 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로부터 선택된 암 세포를 갖는 종양에서 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 항체 단백질은 상기 언급된 바와 같이 표지된 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 추가의 면은
(a) 영상화제와 결합된 본 발명에 따른 항체 단백질을 항체-항원 복합체의 형성에 적절한 조건하에서 인간 환자에 투여하고,
(b) 이 방법으로 형성된 복합체를 영상화시키며,
(c) 이에 의해 인간 환자의 활성화된 스트로마 섬유 아세포의 존재를 영상화시키는 것을 특징으로 하는, 인간 환자에서 치유되는 상처, 염증 조직(류마티스성 관절염 및 변경이 또한 양성이다) 또는 종양에서 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 영상화하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 콜로렉탈 암, 대세포 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 방광암, 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로부터 선택된 암 세포를 갖는 종양에서 상기 기술된 바와 같은 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재를 영상화시키는 방법에 관한 것이다.
추가의 면에서, 본 발명은
(a) 적절한 샘플을 항체-항원 복합체의 형성에 적절한 조건하에서 본 발명에 따른 항체 단백질과 접촉시키고,
(b) 이렇게 형성된 복합체의 존재를 검출하며,
(c) 상기 복합체의 존재를 종양-스트로마의 존재와 관련시키는 것을 특징으로 하는 종양-스트로마를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 실시하기 위한 항체 단백질은 바람직하게는 검출가능한 마커로 표지시킨다.
추가의 면에서, 본 발명은
(a) 항체-항원 복합체의 형성에 적절한 조건하에서 상기 기술된 바와 같은 영상화제 영상화제에 연결된 본 발명에 따른 항체를 환자에게 투여하고,
(b) 형성된 복합체를 영상화시키고, 이에 의해 인간 환자에서 종양-스트로마의 존재를 영상화시키는 것을 포함하는 인간 환자에서 종양-스트로마를 영상화하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 A(hF19LA) SEQ ID NO:1의 DNA 서열이다.
도 2는 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 A(hF19LA) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열이다.
도 3은 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 B(hF19LB) SEQ ID NO:3의 DNA 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 뉴클레오타이드는 밑줄이 그어졌고 볼드체이다.
도 4는 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 B(hF19LB) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 뉴클레오타이드는 밑줄이 그어졌고 볼드체이다.
도 5는 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 C(hF19LC) SEQ ID NO:5의 DNA 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 뉴클레오타이드는 밑줄이 그어졌고 볼드체이다.
도 6은 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 C(hF19LC) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열이다.
도 7은 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 A(hF19HA) SEQ ID NO:7의 DNA서열이다.
도 8은 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 A(hF19HA) SEQ ID NO:8의 아미노산 서열이다.
도 9는 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 B(hF19HB) SEQ ID NO:9의 DNA서열이다.
도 10은 F19 인간 재형성된 경쇄 가변 부위 버젼 B(hF19HB) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열이다.
도 11은 F19 인간 재형성된 중쇄 가변 부위 버젼 C(hF19HC) SEQ ID NO:11의 DNA 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 뉴클레오타이드는 밑줄이 그어졌고 볼드체이다.
도 12는 F19 인간 재형성된 중쇄 가변 부위 버젼 C(hF19HC) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 아미노산은 밑줄이 그어졌고, 볼드체이다.
도 13은 F19 인간 재형성된 중쇄 가변 부위 버젼 D(hF19HD) SEQ ID NO:13의 DNA 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 뉴클레오타이드는 밑줄이 그어졌고, 볼드체이다.
도 14는 F19 인간 재형성된 중쇄 가변 부위 버젼 D(hF19HD) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 아미노산은 밑줄이 그어졌고, 볼드체이다.
도 15는 F19 인간 재형성된 중쇄 가변 부위 버젼 E(hF19HE) SEQ ID NO:15의 DNA 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 뉴클레오타이드는 밑줄이 그어졌고, 볼드체이다.
도 16은 F19 인간 재형성된 중쇄 가변 부위 버젼 E(hF19HE) SEQ ID NO:16의 아미노산 서열이다. 버젼 A로부터 상이한 아미노산은 밑줄이 그어졌고, 볼드체이다.
도 17은 F19 키메릭 경쇄 가변 부위 (chF19LC) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열이다.
도 18은 F19 키메릭 중쇄 가변 부위 (chF19HC) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열이다.
도 19는 인간 카파 불변 경쇄 SEQ ID NO:19의 DNA 서열이다.
도 20은 인간 불변 경쇄 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열이다.
도 21은 인간 불변 중쇄 SEQ ID NO:21의 DNA 서열이다.
도 22는 인간 불변 중쇄 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열이다
도 23은 인간 카파 경쇄 및 인간 감마-1 중쇄를 갖는 키메릭 및 재형성된 인간 항체를 생산하기 위한 포유동물 세포 발현 벡터이다.
A. 경쇄 발현 벡터:pKN100
B. 중쇄 발현 벡터: pG1D105
도 24는 키메릭 F19 경쇄의 작제에서 사용하기 위해 변형된 바의 마우스 F19 경쇄 가변 부위의 DNA 및 아미노산 서열이다. 제한 부위는 볼드 문자로 나타냈다. Kozak 서열, CDR 1 내지 3 및 스플라이스(splice) 도너 부위는 밑줄이 그어졌다.
도 25는 키메릭 F19 중쇄의 작제에서 사용하기 위해 변형된 바의 마우스 F19 중쇄 가변 부위의 DNA 및 아미노산 서열이다. 제한 부위는 볼드 문자로 나타냈다. Kozak 서열 및 스플라이스(splice) 도너 부위는 밑줄이 그어졌다.
도 26은 pKN100 포유동물 발현 벡터에 클로닝된 F19 키메릭 항체의 DNA 서열이다. 제한 부위는 볼드 문자로 나타내지고 밑줄이 그어졌다. CDR 1 내지 3 및 스플라이스 도너 부위는 밑줄이 그어졌다. 이는 pKN100 진핵 발현 벡터안의 마우스 F19 경쇄의 DNA 서열이다. 이 벡터는 강한 인공적인 종결 서열에 의해 종결되는 인간의 카파 불변 부위 유전자(알로타입 Km(3))의 cDNA 버젼을 갖는다. 또한, Neo 선택 유전자는 또한 인공적인 서열에 의해 종결되고, 또한 카파 경쇄 발현 카세트와 같은 배향에 있다. pKN100 진핵 발현 벡터의 필수 성분은 다음과 같다:
1 - 6 = EcoRI 부위
7 - 1571 = HCMVi 프로모터/인핸서
583-587 = TATAA box
610 = 전사 개시
728 - 736 = 스플라이스 도너 부위
731 = 인트론의 시작
1557 = 인트론의 끝
1544 - 1558 = 스플라이스 어셉터 부위
1590 - 1598 = Kozak 서열
1599 - 1658 = 펩타이드 리더 서열
1659 -1997 = 마우스 F19 경쇄
1996 - 2004 = 스플라이스 도너 부위
2011 - 2657 = 인간 카파 불변 부위 (Km(3)) 유전자
2664 - 2880 = 인공 spa C2 종결 서열
2887 - 7845 = Amp-내성 유전자(반대 배향), 복제의 ColEl 및 SV40 기원(origin) 및 Neo-내성 유전자(HCMVi-KCT 카세트와 동일한 배향)으로 구성된 pSV2neo 벡터 DNA 단편
7852 - 8068 = 인공 spaC2 종결 시그날
이 서열은 서열의 시작에 있는 EcoRI 부위(위치 1-6)의 상유 바로에서 종결된다.
도 27은 pg1d105 포유동물 발현 벡터에 클로닝된 F19 키메릭 항체의 DNA 서열이다. 제한 부위는 볼드 문자로 나타내져 있고 밑줄이 그어져 있다. CDR 1 내지 3 및 스플라이스 도너 부위는 밑줄이 그어져 있다. 이는 마우스 F19 중쇄 가변 부위를 함유하는 진핵 발현 벡터 pG1D105의 DNA 서열이다. 이 벡터는 인간 감마-1-불변 부위의 cDNA 버젼(또한 Gm1(17)알로타입이라고 알려진 알로타입 G1m(non-a, z, -x))을 함유한다.
작제물의 필수 성분은 다음과 같다:
1 - 2501 = 앰피실린 내성 유전자 및 ColEl 기원 및 SV 40 기원 및 활동 불능의 SV40 초기 프로모터를 포함하는 pBR322 기초 서열
2502 - 3226 = dhfr 유전자
3233 - 4073 = SV40 폴리 A 서열 등
4074 - 4079 = 결찰된 BamHI 및 BgIII 부위 (BstYI)
4080 -4302 = SPA 부위 더하기 C2 종결 시그날
4303 - 5867 = HCMVi 프로모터
5879 - 5885 = 면역글로부린 가변 유전자의 클로닝을 위한 유일한 HindIII 제한 부위
5886 - 5894 = Kozak 서열
5895 -5951 = 시그날 펩타이드
5952 -6323 = 마우스 F19 중쇄
6323 -6330 = 스플라이스 도너 부위
6331 -6336 = 면역글로부린 가변 유전자의 클로닝을 유일한 BamHI 제한 부위
6337 -7388 = 62 bp 인트론으로 선행되는 인간 감마-1 불변 부위의 cDNA 카피
7389 -7709 = Arnie 종결 서열
상기 작제물에서 사용된 인간 감마-1 불변 부위는 위치 356(Eu 넘버링에 따름)에서의 글루탐산(E) 잔기, 위치 358(Eu 넘버링에 따름)에서의 메치오닌(M) 잔기 및 위치 214(Eu 넘버링에 따름)에서의 라이신(K) 잔기에 의해 정의되는 또한 Gm1(17) 알로타입으로 알려진 G1m(non-a, z, -x)을 갖는다. 이들 세개의 잔기는 상기 서열에서 밑줄이 쳐져 있다.
도 28은 인간 재형성 F-19 경쇄의 작제를 위한 PCR-기초의 방법이다. 이 도면은 작제의 전략의 도식적 개관을 제공한다. 점선은 프라이머들사이의 적어도 21개의 염기의 상보성 서열을 나타낸다.
도 29는 재형성된 인간 F19 경쇄가변 부위 버젼 A, B 및 C의 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열이다. 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열을 정렬하여 버젼 A와 비교하고 점선은 뉴클레오타이드 동일성을 나타내며, 점은 이들 서열과 아미노산 동일성을 나타낸다. 아미노산은 Kabat 등(1991)에 따라 넘버링하였다. CDR의 위치는 박스로 표시했다.
도 30은 pKN100 포유동물 발현 벡터에 클로닝된 F19 LA(인간 재형성된 경쇄 버젼 A)의 DNA 서열이다. 제한 부위는 볼드 문자로 나타내져 있고, 밑줄이 그어져 있다. CDR 1 내지 3 및 스플라이스 도너 부위는 밑줄이 그어져 있다. 이는 pKN100 진핵 발현 벡터에 클로닝된 재형성된 F19 경쇄 버젼 A의 DNA 서열이다. 이 벡터는 강한 인공 종료 서열에 의해 종료되는 인간 카파 불변 부위 유전자(알로타입 Km(3))의 cDNA 버젼을 갖는다. 또한, Neo 선택 유전자는 또한 인공서열에 의해 종료되고, 도한 카파 경쇄 발현 카세트와 같은 배향에 있다.
벡터의 성분들은 다음과 같다:
7 - 1571 = HCMVi 프로모터/인핸서
583 - 587 = TATAA 박스
610 = 전사의 출발
728 - 736 = 스플라이스 도너 부위
731 = 인트론의 시작
1557 = 인트론의 종료
1544 - 1558 = 스플라이스 어셉터 부위
1590 -1598 = Kozak 서열
1599 - 1658 = 펩타이드 리더 서열
1659 - 1997 = 재형성된 F19 경쇄 버젼 A
1996 - 2004 = 스플라이스 도너 부위
2011 - 2657 = 인간 카파 불변 부위(Km(3)) 유전자의 cDNA 카피
2664 - 2880 = 인공 spaC2 종료 서열
2887 - 7845 = 이는 AMP-내성 유전자(반대 배향), 복제의 ColEI 및 SV40 기원 및 Neo-내성 유전자(HCMVi-KCT 카세트와 동일한 배향)으로 구성된 pSV2neo 벡터 DNA 단편
7852 - 8068 = 인공 spaC2 종료 시그날.
이 서열은 하기 서열의 시작에서 EcoRI 부위(위치 1-6)의 상류 바로에 있다. 벡터로서 이 DNA 서열은 원형이다.
도 31은 인간의 재형성된 F19 중쇄의 작제를 위한 PCR-기초 방법에 관한 것이다. 이 도면은 작제 전략의 도식적 개관을 제공한다. 점선은 프라이머들사이의 적어도 21개의 염기의 상보성 서열을 나타낸다.
도 32는 재형성된 인간 F19 중쇄 가변 부위 a 내지 e의 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열이다. 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 서열을 정렬하여 버젼 A의 것과 비교한다. 점선은 뉴클레오타이드 동일성을 나타내고, 점은 이 서열과 아미노산 동일성을 나타낸다. 아미노산은 Kabat등(1991)에 따라 넘버링한다. CDR의 위치는 박스로 표시된다.
도 33은 pg1d105 포유동물 발현 벡터에 클로닝된 F19Ha(인간 재형성된 중쇄 버젼 a)의 DNA 서열이다. 제한 부위는 볼드 문자로 나타내져 있고, 밑줄이 그어져 있다. CDR 1 내지 3 및 스플라이스 도너 부위가 밑줄이 그어져 있다. 이는 F19 중쇄 가변 부위의 재형성된 버젼 A를 함유하는 진핵 발현 벡터 pG1D105의 DNA 서열이다. 이 벡터는 인간 감마-1 불변 부위(또한 Gm1(17)알로타입이라고 알려진 알로타입 G1m(non-a, z, -x))의 cDNA 버젼을 함유한다.
작제물의 필수 성분은 다음과 같다:
1 - 2501 = 앰피실린 내성 유전자 및 ColEI 기원 더하기 SV40 기원 및 활동이 불능한 SV40 초기 프로모터를 함유하는 pBR322 기초 서열이다.
2502 - 3226 = dhfr 유전자
3233 - 4073 = SV40 폴리 A 서열등
4080 -4302 = SPA 부위 더하기 C2 종료 시그날
4303 - 5867 = HCMVi 프로모터/인핸서
5879 - 5885 = 면역글로부린 가변 유전자의 클로닝을 위한 유일한 HindIII 제한부위
5886 - 5894 = Kozak 서열
5895 - 5951 = 시그날 펩타이드
5952 - 6323 = 재형성된 F19 중쇄 버젼 A
6323 - 6330 = 스플라이스 도너 부위
6331 - 6336 = 면역글로부린 가변 유전자의 클로닝을 위한 유일한 BamHI 제한 부위
6337 - 7388 = 62 bp 인트론이 선행되는 인간 감마-1 불변 부위의 cDNA 카피
7389 - 7709 = Arnie 종결 서열
상기 작제물에서 사용된 인간 감마-1 불변 부위는 위치 356(Eu 넘버링에 따름)에서의 글루탐산(E) 잔기, 위치 358(Eu 넘버링에 따름)에서의 메치오닌(M) 잔기 및 위치 214(Eu 넘버링에 따름)에서의 라이신(K) 잔기에 의해 정의되는 또한 Gm1(17) 알로타입으로 알려진 G1m(non-a, z, -x)을 갖는다. 이들 세개의 잔기는 상기 서열에서 밑줄이 쳐져 있다.
도 34는 포유동물 세포에서 항체 F19 발현동안 일어나는 중(패널 A) 및 경(패널 B) 쇄 RNA 스플라이싱 사건의 도식적 개략도이다.
A. 중쇄 RNA 스플라이싱
B. 카파 경쇄 RNA 스플라이싱
도 35는 CD8-FAP에 결합하는 LAHC 상등액의 농도 의존성
도 36은 인간 FAP에 대한 비오티닐화 LAHC의 결합
도 37은 CD8-FAP가 cF19로 검출된 바와 같이 F19 에피토프를 수반함을 보여주는 도면이다.
실시예 1: 마우스-인간 키메릭 유전자의 작제
키메릭 F19(cF19) 항체를 마우스 F19 VL 및 VH 부위를 각각 인간 카파 및 감마-1 불변 부위에 연결되도록 설계했다. PCR 프라이머를 마우스 F19 VL 및 VH 부위를 코딩하는 cDNA 서열을 옆에 접하는 5'- 및 3'- 서열을 변형시키기 위하여 사용하였다(표 1). F19 경쇄 V-부위에 특이적인 PCR 프라이머를 설계했다. 이어서 이들 적합화된 마우스 F19 가변 유전자를 이미 인간 카파(pKN100 벡터) 또는 감마-1-(pG1D105 벡터) 불변 부위를 함유하는 포유동물 세포 발현 벡터에 서브클로닝시켰다(도 23). 이들 벡터는 효율적으로 경쇄 및 중쇄를 전사하기 위하여 인간 시토메갈로바이러스(HCMV) 프로모터/인핸서를 이용한다. 벡터는 또한 COS 세포에서 효율적인 DNA 복제 및 이어서 단백질 발현을 가능케하는 복제의 SV40 기원을 함유한다. 발현 벡터는 HindIII-BamHI DNA 단편으로서 삽입된 가변 부위를 갖도록 설계되었다. PCR 프라이머를 V-부위를 코딩하는 cDNA의 5'-(HindIII) 및 3'-(BamHI) 말단에 이들 제한 부위를 도입하도록 설계했다. 또한 경쇄 및 중쇄 cDNA의 5'-말단에 Kozak 서열(GCCGCCACC)을 도입하여 효율적인 번역이 가능하게 하고(Kozak M.: At least nucleotides preceding the AUG intiator codon enhance translation in mammalian cells.(1987) J. Mol. Biol. 196:947), 가변 부위가 불변 부위에 스플라이싱되도록 경쇄 및 중쇄 cDNAs의 3'-말단에 스플라이스 도너 부위를 도입하여 PCR 프라이머를 설계했다. 키메릭 F19 경쇄 및 중쇄의 작제에 사용되는 PCR 프라이머가 표 1에 나타나 있다. 키메릭 F19 경쇄 및 중쇄의 작제에 사용하기에 적합화된 마우스 F19 VL 및 VH 부위의 DNA 및 아미노산 서열이 도 24 및 25에 나타나 있다. 진핵 발현 벡터 pKN100 및 pG1D105에 각각 클로닝된 마우스 F19 경쇄 및 중쇄의 DNA 서열이 도 26 및 도 27에 나타나있다.
표 1: 키메릭 F19 항체의 작제용 PCR 프라이머
A. 경쇄 가변 부위
1. 5'-말단의 작제를 위한 프라이머(37머(mer))
Figure 112000021892264-pct00001
2. 3'-말단의 작제를 위한 프라이머(35머)
Figure 112000021892264-pct00002
B. 중쇄 가변 부위
1. 5'-말단의 작제를 위한 프라이머(37머)
Figure 112000021892264-pct00003

2. 3'-말단의 작제를 위한 프라이머(35머)
Figure 112000021892264-pct00004

실시예 2: F19 항체의 발현 및 결합 활성
키메릭 F19 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 두개의 플라스미드 DNA(실시예 1 참조)를 하기 기술되는 바와같이 COS 세포에 공감염시켜 키메릭 F19 항체의 일시적인 발현을 찾았다. 72시간동안 배양한후, 배지를 모으고, 세포 조각을 제거하기 위하여 원심분리하며, 인간 IgG1류 항체의 생산에 대해 ELISA에 의해 분석하였다. 키메릭 F19 항체를 함유하는 COS 세포 상등액을 표면에 FAP 항원을 발현하는 HT 1080 세포(실시예 13 참조)에 결합하는 능력에 대해 분석하였다.
일렉트로포레이션을 사용한 COS 세포의 형질감염
각각 키메릭 또는 인간 중쇄 및 경쇄 버젼을 함유하는 포유동물 발현 벡터 pg1d105 및 pKN100을 F19 항체의 일시적인 발현을 보기위하여 COS 세포에서 시험하였다. COS7 세포를 페니실린(50 IU/ml), 스트렙토마이신(50 ㎍/ml), L-글루타민 및 10% 열-불화성화된 감마 글로부린이 없는 송아지 태아 혈청(FCS, Harlan Sera-Lab cat. # D0001)을 함유하는 DMEM(Gibco BRL cat. #41966)에서 일상적으로 통과시켰다. DNA를 Gene Pulsar 장치(BioRad)를 사용하는 일렉트로포레이션에 의해 COS 세포에 도입하였다. DNA(각 벡터의 10 ㎍)를 포스페이트-완충화된 염수(PBS, Ca2+ 및 Mg2+ 가 없음)중의 1×107 세포/ml의 0.8 ml 분취량에 첨가하였다. 펄스를 1,900 볼트, 25 μF 캐패시턴스로 전달했다. 주위온도에서 10분 회수 기간후, 일렉트로포레이트된 세포를 5% FCs를 함유하는 8 ml의 DMEM에 첨가하였다. 37℃에서 72시간동안 배양후, 배지를 모으고, 세포 조각을 제거하기 위하여 원심분리하여 짧은 기간동안 4℃에서 , 또는 장기간 -20℃에서 멸균 조건하에서 저장했다.
COS 세포 상등액에서 어셈블된 IgG1/카파 항체 농도를 측정하기 위한 ELISA 방법
형질감염된 COS 세포에서 생산된 항체의 샘플을 키메릭 및 재형성된 인간 항체가 어느 정도 많이 생산되었는 지를 결정하기 위하여 ELISA에 의해 분석하였다. 항체를 검출하기 위하여, 플레이트를 염소 항-인간 IgG(Fcγ 단편 특이적)항체(Jackson ImmuneResearch Laboratories Inc., # 109-005-098)로 코팅했다. COS 세포로부터의 샘플을 연속적으로 희석하고 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간동안 배양하고 세척후, 양고추냉이 퍼옥시다제 결합된 염소 항-인간 카파 경쇄(Sigma, A-7164)를 첨가했다. 37℃에서 30분간 배양하고 세척후, K-블루 기질(3,3'5,5' 테트라메틸벤즈이딘 및 과산화수소의 혼합물, Bionostics Limited, #KB175)을 실온에서 30분간 첨가하였다. 반응을 Red Stop 용액(Bionostics Limited, #RS20)을 사용하여 멈추게하고, 광학적 밀도를 650 nm에서 마이크로플레이트 리더상에서 읽었다. 공지된 농도의 정제된 인간 IgG1/카파 항체(Sigma, 1-3889)를 표준으로서 사용하였다.
COS 세포에서의 키메릭 F19 항체의 발현은 10 내지 60 ng/ml사이로 불량하고(표 2), 이는 대부분의 항체보다 적어도 10배 적다.
키메릭 F19 항체의 발현 수준을 증가시키려는 시도에서, F19VL 부위의 리더 서열을 9-위치에서 류신을 프롤린으로 치환하여 변화시켰다. 리더 서열의 아미노산에서의 이 단일 변화는 COS 세포에서의 생산된 키메릭 항체의 양을 적어도 2배화 시켰다.
세포 결합은 키메릭 F19가 FAP 표적에 특이적으로 및 예상된 욕구를 갖고 결합한다는 것을 보여준다.
표 2: COS 세포 상등액에서의 키메릭 F19 항체 농도(이들은 3개의 독립적인 형질감염의결과이다)
Figure 112000021892264-pct00005

실시예 3: 재형성된 인간 F19 경쇄 버젼 A 내지 C(L A - L B )의 작제
재형성된 인간 F19 VL 부위 (LA)의 제 1 버젼의 작제를 Daugherty B.L., DeMartino J. A., Law M.F., Kawa D. W., Singer I. I. and Mark G.E. (1991) Polymerase chain reaction(PCR) facilitates the cloning, CDR-grafting, and rapid expression of a murine monoclonal antibody directed against the CD18 compound of leukocyte integrins. Nucl. Acids Res. 19:2471에 기술된 것과 유사 한 방법으로 오버래핑(overlapping) PCR 단편을 사용하여 수행하였다. 5개의 프라이머 쌍, APCR1-vla1, vla2-vla3, vla4-vla5, vla6-vla7, 및 vla8-APCR4로 구성된 10개의 올리고뉴크레오타이드를 합성하였다(표 3 및 도 28). 인접한 쌍사이에 적어도 21개의 염기의 오버래핑 서열이 있었다(도 28). APCR1 및 APCR4가 접하는 pUC19 벡터 서열에 의해 하이브리다이즈되었다(hybridised). 돌연변이원(mutagenic) 프라이머를 5' 말단이 코돈의 흔들거리는(wobble) 위치에 바로 이어지도록 설계하였다. 이 전략을 PCR 동안 DNA 폴리머라제에 의한 돌연변이원성 프라이머에 상보적인 3' 말단에 한개의 뉴클레오타이드가 불필요한 첨가에 반대 작용하도록 사용하였다(Sharrocks A.D. and Shaw P.E.(1992) Improved primer design for PCR-based, site directed mutagenesis. Nucl. Acids Res. 20:1147). 적절한 프라이머 쌍(각각 0.2 μM )을 재형성된 인간 L25VL 부위 cDNA의 버젼 "B"의 10 ng, 및 10 mM Tris-HCl(pH 8.3), 50 mM KCl, 200 μM dNTPs, 및 1.5 mM MgCl2를 함유하는 50 ㎕의 PCR 버퍼중의 1 유니트의 AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus) DNA 폴리머라제와 혼합했다. 이를 광유로 덮고, PCR을 각 사이클이 94℃에서 1분간의 변성 단계, 55℃에서 1분간의 프라이머 어닐링 단계, 및 72℃에서 2분간의 연장 단게로 구성되는 사이클을 25회 수행하였다. 이어서 72℃에서 10 분간의 추가의 연장 단계 및 4℃로 냉각하는 것으로 구성되는 단일 사이클을 수행하였다. 프라이머-어닐링 단계와 연장 단계사이의 램프(ramp) 시간은 2.5분이었다. 이어서 5개 반응(A, B, C, D, E)의 PCR 생성물을 겔 전기영동으로 정제시키고, Wizard PCR preps(Promega)를 사용하여 DNA 용출시켰다. PCR 생성물 A, B, C, D 및 E를 서로의 상보성에 의해 어셈블링시켰다. PCR 반응의 제 2 세트에서, PCR 생성물 B 및 C, 및 D 및 E(각 50 ng)을 각각 1 유니트의 AmpliTaq(perkin Elmer Cetus) DNA 폴리머라제를 함유하는 50 ㎕ PCR 반응(상기 기술된 바와같이)에 첨가하였다. 반응을 어닐링 온도를 60℃로 상승시키는 것외에는 상기 기술된 바와 같이 20사이클을 수행하였다. PCR 반응의 제 3 세트에서, PCR 생성물 F 및 G를 1㎕의 각 선행 PCR 반응물 및 PCR 프라이머의 적절한 쌍(vla2-vla5 또는 vla6-APCR4)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 반응은 50 ㎕의 PCR 반응물(상기 기술된 바와 같음)에 1 유니트의 AmpliTaq DNA 폴리머라제를 함유했고, 제 1 단계에서 25사이클 증폭시켰다. 제 4세트의 반응에서, PCR 생성물 H를 1㎕의 각 선행 PCR 반응물 및 vla2-APCR4 쌍의 PCR 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 마지막으로, PCR 생성물 A 및 H를 말단 프라이머로서 RSP 및 UP를 사용하여 상기 기술된 바와 유사하게 두 단계-PCR 반응에서 그들 자신의 상보성으로 어셈블링시켰다. 리더 서열을 포함하는 완전 재형성된 인간 F19 VL 영역을 나타내는 완전히 어셈블리된 단편을 HindIII 및 BamHI로 분해하여 서열화를 위해 pUC19에 클로닝시켰다. 정확한 DNA 서열을 갖는 클론을 reshF19La라고 나타내고(도 29), 진핵 발현 벡터 pKN100에 서브클로닝시켰다. pKN100에 클론된 reshF19La의 DNA 서열을 도 30에 나타내었다.
재형성된 인간 F19 VL 부위(LB)의 제 2 버젼을 La에 대해 기술된 바와 같은 도식을 사용하여 작제하였으며, 그러나, 여기에서 vla4 및 vla7 프라이머를 각각 Vlb4 및 vlb7로 치환하였다(표 3). LB의 DNA 서열이 도 29에 나타나있다.
재형성된 인간 F19 VL 부위(LC)의 제 3 버젼을 Stratagene로부터의 QuickChangeTM의 부위-지정 돌연변이원 키트를 사용하여 작제하였다. QuickChange 부위지정 돌연변이 유발 방법은 이중 가닥 DNA 주형으로서 pKN100 벡터중의 reshF19La를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 이 프로토콜에서 사용하기 위한 돌연변이유발성 올리고뉴클레오타이드 프라이머 F19LC-센스 및 F19LC-앤티센스(표 3)가 제조자의 지시에 따라 설계되었다. 간략하게는, 돌연변이유발성 프라이머는 원하는 점 돌연변이(위치 49(Phe)의 Kabat 잔기에서의 코돈 TTT가 Tyr을 코딩하는 TAT로 변화)를 함유하고, pKN100 벡터안의 LA의 반대 가닥의 동일한 서열에 어닐링되었다. 점 돌연변이가 전 VL 부위를 서열화하는 DNA에 의해 입증되었다. LC의 DNA 서열은 도 29에 도시하였다. PCR 반응동안 pKN100에서 랜덤 돌연변이가 일어날 가능성을 제거하기 위하여, VL 부위를 HindIII/BamHI 단편으로서 pKN100 벡터로부터 절단하여 앞서 동일한 두개의 제한 효소로 절단된 비변형된 pKN100 벡터에 재서브클로닝시켰다.
표 3: 재형성된 인간 F19 경쇄 가변 부위의 작제를 위한 PCR 프라이머
1. 버젼"A"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00006
Figure 112000021892264-pct00007
Figure 112000021892264-pct00008
Figure 112000021892264-pct00009
Figure 112000021892264-pct00010
Figure 112000021892264-pct00011
Figure 112000021892264-pct00012
Figure 112000021892264-pct00013
2. 버젼"B"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00014
Figure 112000021892264-pct00015
3. 버젼"C"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00016
Figure 112000021892264-pct00017

4. 인접한 PUC19 벡터 서열에 대한 프라이머 하이브리다이징
Figure 112000021892264-pct00018

실시예 4: 재형성된 인간 F19 중쇄 버젼 A 내지 E(H A -H E )
재형성된 인간 F19 VH 부위(HA)의 버젼 "A"를 재형성된 인간 F19 VL 부위(LA)의 버젼"A"의 작제에 대해 기술된 바와 같이 PCR 방법을 사용하여 작제하였다(도 31). 주형 DNA는 재형성된 인간 226 VH의 버젼"A"이었다(Leger O. J. P., Yednock T. A., Tanner L., Horner L.C., Hines D. K., Keen S., Saldanha J., Jones T., Fritz L. C. and Bending M.M.(1997). Humanization of a mouse antibody against human alpha-4 integrin: a potential therapeutic for the treatment of multiple sclerosis. Hum. Antibod. 8:3). 6개의 PCR 프라이머를 재형성된 인간 F19 VH 부위의 버젼"A"의 작제를 위해 설계하고 합성하였다(표 4). PCR 생성물 A, B, C, 및 D를 PCR 프라이머 쌍으로서 각각 APCR1-Vha1, Vha2-Vha3, Vha4-Vha5 및 Vha6-APCR4를 사용하여 수득하였다. PCR 조건은 본질적으로 재형성된 인간 F19 VL 부위의 작제를 위해 기술된 바와 같다. 올바른 DNA 서열을 갖는 클론을 reshF19Ha라고 표시하고(도 32), 이어서 진핵 발현 벡터 pG1D105에 서브클로닝하였다. pG1D105에 클로닝된 reshF19Ha의 DNA 서열이 도 33에 나타나 있다.
재형성된 인간 F19VH 부위(Hc)의 제 3 버젼을 HA에 대해 기술된 바와 같은 도식을 사용하여 작제하였고, 그러나, 여기에서 Vha4 프라이머는 Vhc4에 의해 치환되었다(표 4). Hc의 DNA 서열을 도 32에 나타냈다. 재형성된 인간 F19VH 부위의 제 2(HB) 및 제 4(HD) 버젼을 Kamman등(Kamman M., Laufs J., Schell J. and Groneborn B. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction(PCR). Nicl. Acids Res. 17:5404)의 PCR-돌연변이유발 방법에 기초하여 작제하였다. HB 및 HD의 경우에, 돌연변이 유발성 프라이머 F19VHbd6(Tyr-91 내지 Phe-91, 표 4)를 각각 주형 DNA로서 HA 및 HC를 사용한 PCR 반응에서의 APCR4와 쌍을 이뤄 사용하였다. PCR 생성물 VHb 및 VHd는 PstI 및 BamHI로 제한효소 분해되어 미리 동일한 두개의 제한 효소로 분해된 reshF19Ha 및 reshF19Hc에 각각 서브클로닝시켰다. HB 및 HD의 DNA 서열이 도 32에 도시되어 있다.
재형성된 인간 F19VH 부위 (HE)의 버젼 "E"가 이미 상기 언급된 Kammam 등(1989)의 PCR-돌연변이 유발 방법에 기초하여 작제되었다.
reshF19He경우, 돌연변이 유발성 프라이머 F19MscIHe(표 5)가 주형 DNA로서 pg1d105 포유동물 발현 벡터에 클로닝된 HC를 사용한 PCR 반응에서 프라이머 F19VHHindIII(표 5)와 쌍을 이뤄 사용되었다. 적절한 프라이머 쌍(각각 0.2 μM)이 10 mM KCl, 10 mM(NH4)2SO4, 20 mM Tris-HCl(pH8.8) 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100 및 200 μM NTPs를 함유하는 100 ㎕의 PCR 버퍼중의 재형성된 인간 226VH 부위의 10 ng의 버젼 "A"의 cDNA와 혼합했다. 반응 혼합물을 광유로 덮고 94℃에서 5분간 유지시켰다. 이어서, 1 유니트의 Deep Vent DNA 폴리머라제(New England Biolabs)를 첨가하고("Hot Start"PCR; Chou Q., Russell M., Birch D., Raymond J. and Bloch W.(1992) Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplications. Nucl. Acids Res. 20: 1717), PCR을 TRIO-Theromoblock Thermal Cycler(Biometra, Goettingen, Germany)상에서 25 사이클 수행하였다. 각 사이클은 94℃에서 1분간의 변성 단계, 70℃에서 1 분간의 프라이머-어닐링 단계, 및 72℃에서 2분간의 연장 단계로 구성된다. 이어서 72℃에서 10분간의 추가의 연장 단계 및 4℃로의 냉각으로 구성되는 단일 사이클이 이어진다. 이어서 PCR 생성물을 제조자(QIAGEN Ltd., UK)에 의해 공급되는 프로토콜에 따라 QIAquickTM gel extraction 키트를 사용하는 TAE 1.4% 표준 아가로스 겔로부 터 추출하고 정제하였다. 이어서 PCR 생성물 VHe를 Mscl 및 HindIII로 제한효소 분해시키고 미리 동일한 두개의 제한 효소로 분해된 pd1d105에 클론된 reshF19Hc에 결찰시켰다. MscI 제한효소 인식 부위는 모든 재형성된 인간 F19 VH 부위 버젼에 유일하고, pgid105 발현 벡터에는 존재하지 않는다. HindIII 제한 인식 부위는 VH 면역글로부린 유전자를 클로닝하기 위한 pg1d105에서 유일한 부위이다. 일렉트로포레이션-캄피턴트(competent) XL-1 Blue E.coli 세포를 1㎕의 결찰된 DNA로 형질전환시키고, 암피실린을 함유하는 아가로즈 플레이트상에 플레이팅시켰다. 이어서 콜로니를 콜로니에 대해 인접한 pg1d105 벡터 서열에 하이브리다이징하는 프라이머 HCMi 및 Hucγ1(표 5)에 의해 직접 PCR에 의한 삽입물의 존재 및 정확한 크기에 대해 스크리닝했다(Guessow D. and Clackson T.(1989) Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction. Nucl. Acids Res. 17:4000). 양성 콜로니로부터의 DNA를 제조자(QIAGEN Ltd., UK)에 의해 공급되는 프로토콜에 따라 Plasmid Midi 키트를 사용하여 제조하였다. DNA 서열화를 통상적인 열 변성(Andersen A., Pettersson A, and Kieldsen T.(1992) A fast and simple technique for sequencing plasmid DNA with sequencinase using heat denaturation. Biotechnique 13:678) 및 Sequenase(USB, Cleveland, OH)를 사용하여 환형 벡터 DNA로부터 직접적으로 디데옥시 쇄 종결 방법(Sanger F., Nicklen S. and Coulson A. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463)에 의해 수행하 였다. reshF19He의 DNA 서열은 도 32에 나타낸다.
표 4: 재형된 인간 F19 중쇄 가변 부위 A 내지 D의 작제를 위한 PCR 프라이머
1. 버젼 "A"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00019
Figure 112000021892264-pct00020
Figure 112000021892264-pct00021
Figure 112000021892264-pct00022
Figure 112000021892264-pct00023
Figure 112000021892264-pct00024

2. 버젼"C"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00025

3. 버젼 "B" 및 "D"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00026

4. 인접한 PUC19 벡터 서열에 하이브리다이징하는 프라이머
Figure 112000021892264-pct00027

표 5: 재형성된 인간 F19 중쇄 가변 부위 버젼 "E"의 작제를 위한 PCR 프라이머
1. 버젼 "E"의 합성을 위한 프라이머
Figure 112000021892264-pct00028

2. 인접하는 pd1d105 포유동물 발현 벡터 서열에 하이브리다이징하는 프라이 머


실시예 5: COS 세포 상등액중의 재형성된 인간 F19 항체 농도
COS 세포를 한쌍의 일련의 재형성된 인간 F19 항체 작제물로 형질감염시키고 항체 농도를 실시예 2에 기술된 바와 같은 IgG1/카파 ELISA를 사용하여 측정하였다.
표 6: COS 세포 상등액중의 재형성된 인간 F19 항체 농도
Figure 112000021892264-pct00030

표 7: COS 세포 현탁액중의 재형성된 인간 F19 항체 농도
Figure 112000021892264-pct00031

포유동물 세포에서 면역글로부린 유전자의 발현에 요구되는 RNA 스플라이싱 결과(event)
포유동물 발현 벡터 pKN100 및 pg1d105는 메신저 RNA를 발생시키기 위하여 유전자 발현 과정동안 제거되는, 가변 부위와 불변 부위 사이에 인트론을 갖는다. 중쇄 또는 경쇄 도너 부위와 면역글로부린 스플라이스 어셉터 부위 사이의 DNA 재조합으로 이뤄지는 스플라이싱 사건이 도34에 기술되어 있다.
실시예 6: FAP-발현 인간 세포에 대한 cF19 및 L A H C 의 결합의 플로우(flow) 혈구 분석(cytometric analysis)
재조합체 및 세포 표면상의 내생적으로 발현되는 FAP에 결합하는 LAHC의 능력을 시험하였다.
세포 FAP에의 LAHC의 결합을 측정하는 실시예를 수행하였다. 천연 FAP 발현 MF-SH 인간 종양 세포(Shirasuma, K, et al., Cancer 1985, 55:2521-32) 및 FAP-형질감염된 인간 종양 세포주를 세포 표적으로 사용하였다. LAHC를 표적 세포에의 직 접 결합을 평가하는 사이토플루오메트릭 분석으로 및 뮤린 F19 또는 키메릭 cF19 안티-FAP 항체에의 결합에 대한 억제 효과에 의해 연구하였다.
사용된 항체 및 세포주는 F19(뮤린 모노클로날 항-인간 FAP 항체, IgG1 서브클래스), mIgG(뮤린 면역글로부린, IgG 클래스), cF19(키메릭 모노클로날 항-인간 FAP 항체, IgG1 서브클래스), LAHC(재형성된 모노클로날 항-인간 FAP 항체, IgG1 서브클래스), hIgG1(인간 면역 글로부린, IgG1 서브클래스), MF-SH(인간 악성 섬유성 조직구종 세포주), HT-1080(인간 선유육종), HT-1080FAP 클론 33(인간 FAP를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 HT-1080 세포주)이었다. 항체를 실시예 8 및 12에서 기술된 바와 같이 비오티닐화하였다.
인간 종양 세포주의 표면상의 FAP에 대한 L A H C 의 직접 결합
조사중의 종양세포 5 ×105세포를 얼음상에서 30분동안 1% 소 혈청 알부민(BSA)로 보충된 총부피 0.2 ml의 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중에서 지시된 농도의 시험 또는 대조군 항체와 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 2 ml의 PBS로 2회 세척하고, 1% BSA, 2차 시약으로서 1:20 희석의 마우스 항-인간 IgG FITC([Dianova]로 표지)가 보충된 0.2 ml PBS에 재현탁시키고, 얼음상에 다시 30분동안 인큐베이션시켰다.
다르게는, 조사중의 종양 세포주 5 × 105 세포를 1% BSA로 보충된 총부피 0.2 mlPBS중의 비오틴-표지된 cF19의 표시된 농도와 얼음상에서 30분동안 인큐베이 션 시켰다. 이어서, 세포를 2 ml의 PBS로 2회 세척하고, 1% BSA가 보충된 0.2 ml PBS에 재현탁시키고 2차 시약으로서 스트렙타비딘-FITC(Dianova)의 1:40의 희석물과 함께 얼음상에서 다시 30분동안 인큐베이션했다.
세포를 다시 2 ml의 PBS로 2회 세척하고, 1% 파라포름알데하이드(PFA)가 보충된 총 부피 0.5 ml의 PBS에 재현탁시키고 얼음상에서 유지하였다. 단세포 형광을 EPICS XL(Coulter)형광 -활성화된 분석기에서 488 nm에서 세포 그린 형광을 분석하여 세포형광분석으로(cytofluorometrically) 결정하였다.
FAP-발현 인간 세포주상의 세포 표면 FAP에의 비오티닐화 cF19 결합에 대한 L A H C 의 경쟁
1 ㎍/ml 비오틴-표지된 cF19 항체와 함께 첨가된 표시된 양의 비표지된 시험 또는 대조군 항체와 함께 인큐베이션 했다. 이어서, 세포를 2 ml의 PBS로 2회세척하고, 1%의 BSA, 2차 시약으로서 1:40 희석된 스트렙타비딘 FITC(Dianova)이 보충된 0.2 ml의 PBS에 재현탁시키며, 얼음상에서 다시 30분간 인큐베이션시켰다.
세포를 이어서 2 ml의 PBS로 2회 세척하고, 1% PFA 가 보충된 총부피 0.5 ml의 PBS에 재현탁시켰다. 단일 세포 형광을 EPICS XL(Coulter) 형광-활성화된 세포 분석기에서 488 nm에서 세포 녹색 형광을 세포 형광 분석법으로 결정하였다.
cF19 및 LAHC는 FAP-형질감염된 HT-1080FAP 클론33 인간 종양 세포에 특이적으로 농도 의존 방법으로 결합하였다(표 8). FAP-음성 HT-1080 세포에의 어떤 결합도 검출될 수 없었다(표 9). cF19 및 LAHC는 FAP를 내생적으로 발현하는 인간 MF-SH 세포에 농도 의존 방법으로 결합하였다(표 10).
비오티닐화 cF19는 농도 의존 방법으로 인간 HT-1080FAP 클론에 결합하였다(표 11). FAP-음성 HT-1080 세포에서는 어떤 결합도 검출될 수 없었다(표 12). HT-1080FAP 클론 33 세포에의 비오티닐화 cF19의 결합은 비표지된 cF19 및 비표지된 LAHC에 의해 억제되었다(표 13).
키메릭 항-인간 FAP 모노클로날 항체 cF19 및 재형성된 인간 항-인간 FAP 모노클로날 항체 LAHC(실시예 10)는 단백질을 내생적으로 발현하거나 이를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 인간 세포주상에서 발현되는 FAP에 직접적으로 결합함을 보여 주었다. 이 결합은 농도 의존적으로 나타났다. 비오티닐화 cF19의 결합은 비표지된 cF19 및 비표지된 LAHC에 의해 억제될 수 있다.
세포형광측정 기술을 사용하여, 직접 결합 및 특이적 결합 시약의 억제는 세포 표면 발현된 FAP에의 키메릭 cF19 및 재형성된 LAHC 인간 모노클로날 항체의 특이성을 나타냈다.
표 8: HT-1080FAP 클론 33세포에의 항-FAP 항체의 결합
Figure 112000021892264-pct00032

표 9: 비-형질감염된 HT-1080 세포에의 항-FAP 항체의 결합
Figure 112000021892264-pct00033

표 10: MF-SH 세포에의 항-FAP 항체의 결합
Figure 112000021892264-pct00034
n.d.: 실행되지 않음
표 11: HT-1080FAP 클론 세포에의 비오티닐화 cF19 항체의 결합
Figure 112000021892264-pct00035

표 12: 비-형질감염된 HT-1080 세포에 대한 비오티닐화 cF19 항체의 결합
Figure 112000021892264-pct00036


표 13: HT-1080FAP 클론 33 세포에 대한 비오티닐화 cF19의 결합과의 항-FAP 항체의 경쟁
Figure 112000021892264-pct00037
비오티닐화 cF19는 표 13에 나타난 모든 시험에서 1 ㎍/ml의 농도로 사용되었다
실시예 7: 모노클로날 항체 L A H C 의 시험관내 면역 이펙터 기능
이 실험을 인간 보체(complement) 또는 인간 단핵 백혈구 각각의 존재하에서 FAP-발현 표적을 용해하는 섬유아세포 활성 항원(FAP)대한 특이성을 갖는 모노클로날 항체(mAb) LAHC 의 잠재력을 결정하기 위하여 수행하였다.
특히, 표면상에 인간 FAP를 발현하는, HT-1080FAP 클론 33 세포에 대한 세포 독성 효과를 중재하는 LAHC의 능력을 연구하였다. 세폭독성은 다음과 같은 접근에 의해서 시험관 내에서 결정하였다: 51Cr-표지된 표적 세포를 LAHC의 존재하에서 이펙터로서 보체 또는 인간 MNC(말초혈액 세포)의 공급원으로서 인간 혈청과 함께 인큐베이션했다. 51Cr의 방출을 표적 세포 용해의 측정으로서 측정하였다.
사용된 항체 및 세포주는 LAHC(재형성된 인간 항-인간 IgG1 항체), hIgG1(인간 IgG1 이소타입 대조군), 3S193(뮤린 모노클로날 항-루이스y IgG3 항체), mIg(뮤린 IgG 대조군), HT-1080(인간 선유 육종), HT-1080FAP 클론 33, (인간 FAP를 코딩하는 cDNA로 형질감염된 HT1080), MCF-7(인간 브레스트(breast) 아데노카시노마 세포주)이었다.
L A H C 에 의한 표적 세포의 보체-중재된 용해
종양 세포를 100 μCi 51Cr(NEN)과함께 RPMI1640 배지에서 37℃에서 1시간동안 인큐베이션하여 방사성 표지시켰다. 이어서, 세포를 51Cr이 없는 배지에서 2회 세척하고, ml당 2 ×105의 농도로 재현탁시켰다.
보체의 공급원으로서 인간 혈청을 상이한 지원자의 혈액으로부터 새롭게 제조하였다. 혈액을 팔 정맥을 구멍내어 취하고 실온에서 1 시간동안 유지시켜 응고가 일어나게 하고, 4℃에서 밤새 유지시켰다. 혈청을 원심분리에 의해 분리하고, 침전물로부터 분리했다.
연구중의 항체를 저장 용액으로부터 RPMI1640 세포 배양 배지중에서 적절한 농도로 희석시켰다.
표시된 세포주의 1×105 방사성표지된 종양 세포를 인간 보체의 공급원으로서 25%(v/v) 인간 혈청 및 시험 또는 대조군 항체의 상이한 농도의 존재하에서 인큐베이터(95% 공기 및 5% CO2)중에서 37℃에서 2시간동안 인큐베이션했다. 인큐베이션을 총부피 200 ㎕ RPMI1640에서 U-모양의 96-웰 플레이트에서 3중으로 수행하였다. 인큐베이션 기간후, 플레이트를 원심분리하여 100 ㎕의 상등액을 제거하고 방사성을 감마-계수기에서 계수하였다. 혼입된 방사성의 총량은 104 표적 세포를 측정하여 결정하였다. 기술된 인큐베이션동안 항체 및 보체의 부재하에서 표적 세포로부터 방출된 활성을 자발적인 방출이라고 정의했다.
특정 용해는 다음과 같이 계산하였다.
[활성 샘플] - [자발적인 활성 방출]
특정 용해(5) = ------------------------------------- × 100
[최대 활성] - [자발적인 활성 방출]
L A H C 의 항체-의존성 세포 독성(ADCC)
종양 세포를 100 μCi 51Cr과 함께 RPMI1640 배지에서 37℃에서 1시간동안 인큐베이션하여 방사성 표지했다. 이어서, 세포를 51Cr 없는 배지에서 2회 세척하고, ml당 2×105의 농도로 재현탁시켰다.
MNC를 건강한 인간 자원자의 팔 정맥을 구멍뚫어 말초 혈액으로부터 제조하였다. 20% 시트레이트 버퍼를 첨가하여 응고를 방지했다. 이 혈액 제조물의 4ml로부터의 MNC를 3 ml의 림프구 제조 배지(Boehringer Mannheim, Germany)상에서 원심분리(400 G 및 실온에서 30분간)하여 정제하였다. MNC(말초 혈액 단핵 세포)를 구배로부터 취하여 3회 세척하고 RPMI1640으로 적절한 농도로 희석하였다. 림프구 활성화된 킬러(LAK) 세포를 100U 재조합 인간 인터류킨-2(IL-2)의 존재하에서 ml 당 1.3×106 세포의 초기 밀도로 95% 공기 및 5% CO2 인쿠베이터에서 37℃에서 5일동안 인큐베이션하여 MNC(말초 혈액 단핵 세포)로부터 유도하였다. 연구중의 항체를 저장용액으로부터 RPMI1640 세포 배양 배지에서 적절한 농도로 희석시켰다.
표시된 세포주의 1×104 방사성 표지된 종양세포를 상이한 농도의 시험 또는 대조군 항체 및 MNC의 존재하에서 37℃에서 5% CO2로 5시간동안 인큐베이션 했다. MNC를 표시된 이펙터:표적 세포 비에 도달하는 양으로 첨가하였다. 인큐베이션을 총부피 200 ㎕의 RPMI1640으로 U-형 96웰 플레이트에서 2중으로 수행하였다.
인큐베이션 기간후, 플레이트를 원심분리하고, 100 ㎕의 상등액을 취하여 감마-카운터에서 방사성을 측정하였다. 혼입된 방사성의 총량은 104 표적 세포를 측정하여 결정하였다. 기술된 인큐베이션동안 항체 및 이펙터 세포의 부재하에서 표적 세포로부터 방출된 활성을 자발적인 방출이라고 정의했다.
특정 용해는 다음과 같이 계산하였다.
[활성 샘플] - [자발적인 활성 방출]
특정 용해(5) = ------------------------------------ × 100
[최대 활성] - [자발적인 활성 방출]
종양 세포의 항체-중재된 보체 용해
50 ㎍/ml이하의 농도에서 LAHC로 처리된 HT-1080FAP 클론 33세포에서 어떤 LAHC-특이적인 보체-중재된 용해(이소타입 대조군에서 나타난 것 이상)도 나타나지 않았다(표 14, 표 15a).
보체의 공급원으로서 사용된 인간 혈청의 분해 활성이 공지된 보체 활성화 능력을 갖는 뮤린 모노클로날 항체-루이스y 항체인 3S193의 12.5 ㎍/ml의 존재하에서 MCF-7 인간 브레스트 카시노마 세포의 분해에 의해 나타났다(표 15b)
종양 세포의 항체-중재된 세포 용해
10 ㎍/ml이하의 농도의 LAHC의 존재하에서, 용해에 의해 측정된 바 HT-1080FAP 클론33에 대한 LAHC의 인간 MNC(표 16) 또는 인간 LAK 세포(림포카인 활성화된 킬러 세포, 표 17)에 의한 중재된 어떤 ADCC(항체 의존 세포 독성)도 50:1비의 이펙터:표적물에서 이소타입 대조군에서 나타난것 이상으로 검출할 수 없었다.
이펙터 메카니즘으로서 인간 보체 또는 인간 MNC를 사용한 적절한 시험관내 분석에서, 인간 항-FAP 모노클로날 항체 LAHC는 FAP-발현 종양 세포주 HT-1080FAP 클론33에 대해 이소타입 대조군이상의 어떤 검출할만한 세포 독성 효과도 밝혀내지 못하였다.
표 14: L A H C 에 의해 중재된 HT-1080FAP 클론 33 종양 세포 표적물의 특이적 보체 용해(%)
Figure 112000021892264-pct00038
인큐베이션: 37℃에서 2시간, 보체의 공급원으로서 각각 인간 지원자 A 또는 B로부터의 25% 혈청
표 15a: 인간 항-FAP 모노클로날 항체 L A H C 에 의해 중재된 HT-1080FAP 클론 33 종양 세포 표적물의 특이적 보체 용해(%)
Figure 112000021892264-pct00039
인큐베이션: 37℃에서 2시간, 보체의 공급원으로서 각각 인간 지원자 A, B 또는 C로부터의 25% 혈청
표 15b: 뮤린 항-루이스 y 모노클로날 항체 3S193에 의해 중재된 MCF-7 종양 세포 표적물의 특이적 보체 용해(%)
Figure 112000021892264-pct00040
인큐베이션: 37℃에서 2시간, 보체의 공급원으로서 각각 인간 자원자 A, B 또는 C로부터의 25% 혈청
표 16: L A H C 에 의해 중재된 인간 MNC(말초 혈액 단핵 세포)에 의한 HT-1080FAP 클론 33 표적 세포의 ADCC(항체 의존적 세포독성)(특이적 용해, %)
Figure 112000021892264-pct00041
인큐베이션: 37℃에서 5시간, 50:1의 104 표적 세포와 이펙터: 표적 세포비
표 17: L A H C 에 의해 중재된 LAK 세포(림포카인 활성화된 킬러 세포)에 의한 HT-1080FAP 클론 33 표적 세포의 ADCC(항체-의존 세포독성, 특이적 용해, %)
Figure 112000021892264-pct00042
인큐베이션: 37℃에서 5시간, 50:1의 104 표적 세포와 이펙터: 표적 세포비
실시예 8: 정상적 및 종양성 인간 조직에 결합하는 모노클로날 항체 L A H C 의 면역조직화학적 분석
이 실험은 정상 및 종양성 인간조직에의 인간화된 mAb LAHC의 결합 특성을 결정하기 위하여 수행된다.
하기 항체를 사용하였다: LAHC, cF19, 및 음성 대조군 hIgG1을 본 분야의 방법에 따라 직접적으로 비오티닐화하고, 2% BSA/PBS(포스페이트 완충된 염수중의 소 혈청 알부민)중의 2.5 내지 0.25 mg/ml의 농도로 사용하였다. 뮤린 mAb F19를 2% BSA/PBS중의 1:5 내지 1:10의 희석으로 F19 하이브리도마의 조직 배양 상등액으로서 사용하였다.
하기 시약을 면역화학적 분석을 위해 사용하였다: 스트렙타비딘 퍼옥시다제 복합체(Vector Labs, Burlingame, CA, USA), 아비딘-비오틴 퍼옥시다제 복합체(Vector Labs.), 비오티닐화 말 항-마우스(Vector Labs.), DAB(diaminobenzidine, Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo, USA), Harris의 헤마톡실린.
조사된 새로운 냉동 조직 샘플은 다음과 같다: 정상적 결장, 유방, 폐, 위장, 췌장, 피부, 후두, 방광, 평활 및 골격 근육. 시험된 종양은 유방, 결장, 폐, 식도, 자궁, 난소, 췌장, 위, 및 머리 및 목으로부터의 악성종양이다.
5 마이크로미터 두께의 새로운 냉동 섹션상에 간접적인 이뮤노퍼옥시다제 방법(Garin-Chesa P, Old LJ, Retting WJ: Cell surface glycoproteinof reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epitherial cancers. Proc Natl Acad Sci USA(1990) 87:7325-7329)을 수행하였다. DAB를 최종 반응 생성물에 대한 기질로서 사용하였다. 섹션을 Harris의 헤마톡실린으로 카운터염색을 하고 항원 발현에 대해 조사하였다.
정상적 인간 조직에서 L A H C 발현
시험된 정상 조직은 란게르한스(A 세포)의 아이리트(islets)에서의 양성 내분비 세포의 서브세트가 LAHC, cF19 및 F19로 동정된 정상적 췌장이외에는 LA HC에 대해 음성이었다(표 18). 어떤 면역 반응도 음성 대조군으로 사용된 hlgG1(인간 면역글로부린 IgG1 서브클래스)에서 관찰되지 않았다.
종양에서 L A H C 발현
종양 샘플에서, LAHC, cF19 및 F19는 종양 스트로말 섬유아세포에서 구별할 수 없는 발현 패턴을 나타냈다. 강하고 균질한 발현이 조사된 다수의 경우, 특히 유방, 결장, 폐, 췌장으로부터 유래된 암 샘플에서 및 시험된 머리 및 목의 편평상피 세포(SQCC)에서 발견되었다(표 19). 어떤 면역방법도 음성 대조군으로 사용된 hlgG1에서 관찰되지 않았다.
LAHC, cF19 및 F19는 시험된 상피 암 샘플에서 종양 스트로말 섬유아세포와 면역반응성을 나타냈다. 정성적 기관 간엽의 선유세포 또는 정상적 성인 기관의 실질세포(parenchymal cell)경우 어떤 LAHC 또는 F19 면역활성이 나타나지 않았다. 항-FAP 면역반응성이 오직 췌장 아이리트, 추정하기는 글루카곤-생산 A세포에서의 내분비 세포 서브세트, 및 시험된 9개의 자궁 샘플중 4개에서 관찰되었다.
정상적 인간 조직 및 FAP-발현 인간 악성종양의 면역조직화학 분석은 LAHC, cF19 및 뮤린 mAb F19에 대해 구별할 수 없는 결합 패턴을 나타냈다.
표 18: 정상적 인간 조직과의 mAbs L A H C , cF19 및 F19의 면역반응성
Figure 112000021892264-pct00043


Figure 112000021892264-pct00044





Figure 112000021892264-pct00045


Figure 112000021892264-pct00046
아세톤-고정된 냉동 섹션을 아비딘-비오틴 복합체 이뮤노퍼옥시다제 과정에 의해 시험하였다.
No, 시험된 상이한 개개인으로부터 유래된 조직 샘플의 수.
* 아이리트안에서의 형상 및 위치에 기초한 A-세포의 동정.
# 시험된 9개 샘플중 4개의 스트로마에서의 양성 면역반응성. 양성 샘플은 초기(×2) 및 중간체(×2) 상 증식 자궁내막을 나타낸다.
실시예 9: 조직 섹션에서 결합하는 L A H C 의 종 특이성
이 실험은 면역조직화학 방법에 의한 마우스, 래트, 토끼 및 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이로부터의 조직과 LAHC의 반응성을 평가하기 위해 실시했다.
또한 이들 시험에서, 음성 대조군으로서 cF19 및 인간 IgG1(hlgG1)를 사용하였다. 면역조직화학에서 사용된 시약은 스트렙타비딘 퍼옥시다제 복합체(Vector Labs., Burlingame, CA, USA), DAB (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA) 및 Harris의 헤마톡실린이었다.
마우스, 래트, 토끼 및 시노몰구스로부터의 하기 새로운 냉동 조직 샘플이 시험되었다: 뇌, 간, 폐, 신장, 위, 췌장, 장, 흉선, 피부, 근육, 심장, 비장, 난 소, 자궁 및 껍데기(tests). 양성 대조군으로서, 정상적 인간 췌장 및 유방 악성종양 샘플로부터의 섹션을 모든 분석에서 포함하였다.
면역조직화학
간접적인 이뮤노퍼옥시다제 방법을 5 마이크로미터 두께의 새로운 냉동 섹션에 대해 본 분야에 기술된대로 수행하였다(Garin-Chesa P, Old LJ, Rettig WJ: Cell surface glycoprotein of reactive stromal fibroblasts as a potential antibody target in human epithelial cancers. Proc Natl Acad Sci USA(1990) 87:7235-7239). 항체 LAHC, cF19 및 hlgG1(1 ㎍/ml)을 본 분야의 상태에 따라 비오티닐화하였고, 스트렙타비딘 퍼옥시다제 복합체로 검출하였다. DAB를 최종 반응 생성물에 대한 기질로서 사용하였다. 섹션을 Harris의 헤마톡실린으로 카운터염색하고 항원 발현에 대해 조사하였다.
시험된 정상적 조직은 실험에서 LAHC 또는 cF19와 반응하지 않았다(표 1).
양성 대조군으로서 사용된 정상적 인간 췌장은 F19에 대해 앞서 기술된 바와 같이 란게르한스의 아이리트의 내분비 세포의 서브세트에서 LAHC 및 cF19 결합을 나타냈다. 또한, LAHC 및 cF19의 결합이 유방 악성종양 샘플에서 종양 스트로마 섬유아세포에서 나타났다.
마우스, 래트, 토끼 및 시노메몰구스로부터의 정상 조직의 면역조직화학 분석은 수행된 실험에서 LAHC 또는 cF19의 어떤 결합도 검출하는데에 실패했다.
표 20: 면역조직화학에 의해 결정된 바의 비-인간 종의 조직 섹션에의 L A H C 의 결합
Figure 112000021892264-pct00047

실시예 10: 키메릭 및 재형성된 항-FAP 모노클로날 항체를 생산하는 세포주의 작제
본 실험의 목적은 본 발명에 따른 안정한 세포주가 CHO DG44 세포에서의 LAHC, LAHA, LBHB, LBHD , 및 cF19를 발현하는 것을 입증하기 위한 것이다. 인간화된 또는 키메릭 F19 항체로 형질감염된 안정한 세포주를 제조하고, 그들의 신원(identity)을 주형으로서 각 트랜스펙턴트(transfectants)로부터 유래된 게놈 cDNA를 사용하여 종쇄 및 경쇄 가변 부위의 PCR 증폭에 의해 확인하였다.
CHO DG44 세포를 SFM-II 배지에서 혈청이 없는 상태로 유지되었다. 리포펙틴 및 SFM-II 혈청이 없는 배지를 Gibco/BRL로부터 입수하였다. 제네티신 및 모든 제한 효소를 Boehringer Mannheim으로부터 입수하였다. Pfu 폴리머라제를 Stratagene으로부터 입수하였다.
형질감염을 위한 DNA를 제조자에 의해 지시된대로 QiaFilter Maxi Cartridges(Qiagen)를 사용하여 이. 콜라이로부터 정제하였다. 모든 DNA 제조물을 제한효소 분해에 의해 조사하였다. 각각의 벡터중의 LAHC 가변 부위의 서열은 ABI PRISM 310 Sequencer(Perkin-Elmer)를 사용하여 확인하였다.
이용된 벡터 및 DNa 서열에 대한 추가의 정보는 선행 실시예에서 이용될 수 있다.
CHO DG44 세포의 형질감염
로가리즘 성장의 세포를 1 ml 새로운 SFM-II 배지를 함유하는 6웰 플레이트에 플레이팅시켰다. 인간화된 또는 키메릭 F19 버젼을 코딩하는 플라스미드를 리포좀 형질감염을 사용하여 CHO DG44 세포에 공형질감염시켰다. 리포좀은 SFM-II 배지를 모든 시약을 희석하기 위하여 사용된 것이외에는 LipofectAMINE에 대해 기술된 바와 같이 6㎕ 리포펙틴 시약 및 0.5 ㎍의 각 벡터(원하는 중쇄에 대한 것 하나 및 경쇄에 대한 것 하나)를 사용하여 제조하였다. 24시간후, 세포를 300㎍/ml로 제네티신(Geneticin)을 함유하는 SFM-II 배지로 1:10으로 희석하였다. 세포 킬링의 초기 상이 경과후(10-14일), 제네티신의 농도가 200 mg/ml로 감소되었고, 메토트렉세이트를 5 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 메톡트렉세이트 농도는 10-14일후 20 nM의 최종 농도로 증가되었다.
트랜스펙탄트 DNA의 PCR 증폭
107 CHO DG44세포를 Eppendorf mocrocentrifuge에서 간략하게 풀 스피드로 원심분리하고, 다시 한번 펠릿화시켰다. 게놈 DNA를 세포 펠릿을 SDS 분해 및 Proteinase K 처리한 후, 에탄올 침전에 의해 제조하였다.
다음 프라이머 쌍의 하나, dNTPs, 버퍼, 및 Pfu 폴리머라제를 함유하는 혼합물을 주형으로서 게놈 DNA를 사용하여 중쇄 또는 경쇄 가변 부위를 증폭하기 위하여 사용하였다. 생성된 PCR 생성물을 적절한 제한 효소로 분해하고 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하여 신원을 확인하였다.
경쇄 프라이머 세트:
Figure 112000021892264-pct00048

중쇄 프라이머 세트:
Figure 112000021892264-pct00049

비분해된 중쇄 PCR 생성물은 469 bp의 예견된 크기를 갖고, 한편 경쇄 PCR 생성물은 286bp의 예견된 크기를 가졌다. 신원의 입증은 BstEII(중쇄) 또는 NiaIV(경쇄)에 의한 제한효소 분해로 결정하였다.
CHO 세포주를 LAHC, LAHA, LBHB, LB HD, 및 cF19로 형질감염시켰다. 제네티신-내성 세포를 수득하고, 이들 세포를 메토트렉세이트에 대한 내성에 대해 추가로 선별하였다. PCR 증폭후, 경쇄 및 중쇄 DNA를 제한 효소 절단하여 예상된 밴드를 생성하였고, LAHC, LBHB, LAHA,및 LB HD 트랜스펙턴트의 신원을 확인하였다.
기술된 세포를 내내 혈청-없는 조건으로 유지하고, 트립신과 같은 동물-유래된 생성물로 처리하지 않았다.
모노클로날 LAHC, LAHA, LBHB, LB HD, 및 cF19 항체를 발현하게 형질감염된 생산자 세포주를 제조하였다. 이들의 신원은 PCR 증폭 및 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 생성된 PCR 생산물을 제한효소 절단하여 확인하였다.
실시예 11: 중국 햄스터 난소 DG44 세포에서 항체 단백질의 발현 및 그들의 정제
본 실험의 목적은 특징화를 가능하게 LAHC, LAHA, LBH B, 및 LBHD mAbs를 발현 및 정제하는 것이다. 다른 목적은 조 배지 샘플 및 정제된 Ig 샘플에서의 항체 농도의 측정 및 이 분석을 이용한 다양한 인간화된 F19 작제물의 상대적 발현 수준의 결정을 가능하게하는 정량적 ELISA의 설정을 포함한다.
혈청 없는 CHO DG44 세포 및 USP-등급 메토트렉세이트를 Biotechnical Production Unit of the Dr. Karl Thomas GmbH, Biorach, Germany로부터 입수하였다; 양 생산물은 시판된다. 세포를 내내 혈청없는 상태로 유지하였다. SFM-II 혈청없는 배지를 Gibco/BRL로부터 입수하였다. 단백질 아가로스를 Pierce Chemical(Indianapolis, IN, USA로부터 입수하였다. 인간 IgG1 표준물(Cat. No. I 3889), p-니트로페닐 포스페이트 정제(N 2640), 소 혈청 알부민(BSA)(A 7906), 및 염소 항-인간 카파쇄 특이적 알칼리성 포스파타제-결합된 항체(A 3813)을 Sigma Chemical(St. Louis, MO, USA)로부터 입수하였다. 염소 항-인간 카파쇄 특이적 알칼리성 포스파타제-결합된 항체는 Jackson Immunoresearch Laboratories(through Stratech Scientific)으로부터 입수하였다. Tris-완충화된 염수(TBS)는 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5로 구성되어있다.
항체 발현을 위한 세포 배양 조건
세포를 배양하고, 진탕없이 T-175 플라스크중의 SFM-II 혈청이 없는 배지에서 유지하였다. 배지는 항생제가 없이 200 ㎍/ml 제네티신 및 20 nM 메토트렉세이트를 함유했다. 세포는 희석되고, 접착되지는 않았으며, 작은 덩어리로 배양됐다. 세포가 정지상에 도달했을 때, 배지를 모으고 원심분리하여 세포를 분리하였으며, 필요할 때까지 -20℃로 냉동시켰다.
L A H C 의 정제
모든 정제 단계를 4℃에서 수행하였다. C10/10 칼럼(Pharmacia Fine Chemicals)을 단백질 A 아가로즈(3 ml 베드(bed) 부피)로 패킹시켰다. 칼럼을 TBS로 세척하고, 어떤 느슨하게 결합된 물질도 칼럼에 남아있지 않도록 0.1M Na 시트 레이트, pH 3.0으로 1회 예비용출시켰다. 이어서, 칼럼을 TBS로 즉가적으로 재평형화시키고 4℃에서 저장했다. 소모된 배양물 상등액을 녹이고 조각을 제거하기 위하여 단백질 A 크로마토그래피전 10,000 ×g에서 30분간 원심분리하고, 동부피의 TBS로 희석시켰다. 이 물질을 P-1 peristatic pump(Pharmacia)를 사용하여 0.5 ml/분으로 단백질 A 칼럼에 적재하고 280 nm에서의 흡광도가 검출될 수 없을 때까지 TBS로 세척했다. 항체의 용출을 대략 0.2 ml/분에서 0.1M Na 시트레이트 pH 3.0으로 시작했다. 용출을 280 nm에서 모니터링하고, 용출된 물질 1 ml의 분획을 시트레이트 버퍼를 중화시키기에 충분한 Tris 염기 pH 9를 함유하는 튜브에 모았다. 단백질-함유 분획을 모아 YM-30 필터를 갖는 Amicon 여과 장치를 사용하여 농축시키고 PBS에 대해 투석하였다. 칼럼을 TBS로 즉각적으로 재생시켰다. 단백질 염료-결합 분석을 표준물로서 소 혈청 알부민을 사용하여, 제조자의 지시에 따라 BioRad(Hercules, California) 단백질 결정 키트로 수행하였다.
인간 IgG(감마 면역글로부린)ELISA
ELISA 플레이트를 코팅 버퍼중의 0.4 mg/ml로 4℃에서 100 ㎕ 염소 항-인간 감마쇄 특이적 알칼리성 포스파타제-결합된 항체로 코팅시켰다. 코팅 항체를 제거하고 플레이트를 PBS중의 2% BSA로 2시간동안 블로킹시켰다. 모든 추후단계를 37℃에서 수행하였다. 블로킹 버퍼를 희석 버퍼중에서 희석된 항체 샘플 또는 인간 IgG1 표준물로 대체하고, 200 ml 부피로 일련으로 희석시키고 1시간동안 인큐베이션시켰다. 음성 대조군은 희석 버퍼 및/또는 비형질감염된 세포의 배양 배지를 포함했다. 웰을 세척하고, 1:5000으로 희석된 100 ㎕의 염소 항-인간 카파쇄 특이적 알칼리성 포스파타제-결합된 항체를 첨가하고 1시간동안 인큐베이션 시켰다. 웰을 세척하고, 100 ㎕ 반응 버퍼를 첨가하고 30분동안 인큐베이션시켰다. 반응을 1 M NaOH 를 첨가하여 멈추게 하고 ELISA 플레이트 리더에서 405 nm로 흡광도를 읽었다. 결과를 네개 파라미터 반복 곡선 피팅에 의해 분석하였다.
아미노산 분석을 본 분야에서 이용될수 있는 방법에 따라 수행하였다.
모노클로날 항체 LAHC를 생산하고 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 균일하게 정제하였다. 표준물로서 인간 IgG1을 사용하는 ELISA 분석은 70%를 능가하는 LAHC 회수를 나타냈다. 물질의 순도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 ＞90%인 것으로 측정되었다. 대표적인 발현 데이타 및 전형적인 정제 수율이 표 21에 나타나 있다.
표 21: CHO 세포에서 FAP 항체 단백질의 발현 데이타 및 정제 수율
Figure 112000021892264-pct00050
상기 연구에서 생산된 항-FAP 항체 각각에 대한 대표적인 발현 데이타가 나타나있다. 단백질 A 아가로즈 친화성 크로마토그래피후의 회수가 표준물로서 BSA를 사용하는 정제된 Ig의 단백질 염료-결합 측정에 기초하였다.
실시예 12: 단리된 재조합 인간 FAP에 대한 모노클로날 항체 L A H C 의 결합
본 연구의 목적은 단리된 재조합 인간 FAP에 대한 LAHC의 결합을 특징화시키는 것이다.
CD8-FAP ELISA
ELISA 플레이트를 코팅 버퍼중에서 1:2000으로 4℃에서 100 ㎕의 마우스 항-래트 항체(Sigma Chemical R0761)로 밤새 코팅시켰다. 코팅 항체를 제거하고, 플레이트를 PBS중에서 2% BSA로 1시간동안 블로킹시켰다. 모든 추후 단계는 실온에서 수행하였다. 블로킹 버퍼를 100 ml의 1㎍/ml 래트 항-CD8 항체(Pharmingen 01041D)로 대체하고 1시간동안 인큐베이션했다. 플레이트를 세척하고, 100 μL CD8-FAP 배양 상등액(참조 실시예 14)(PBS중의 1:2)을 첨가하고 1시간동안 결합하도록 하였다. 플레이트를 세척하고, 항체 샘플을 100 ㎕ 부피로 첨가하고(2배 연속 희석), 1시간동안 인큐베이션했다. 음성 대조군은 인간 IgG 및/또는 비형질 감염된 세포의 배양 배지를 포함했다. 웰을 세척하고, 희석 버퍼로 1:500으로 희석된 100 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 결합된 마우스 항-인간 IgG1 항체(Zymed 05-3320)을 첨가하고 1시간동안 인큐베이션했다. 웰을 세척하고, 100 ㎕의 HRP 기질, (아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린 6-설폰산, Sigma Chemical A9941)을 첨가하고, 60분동안 인큐베이션시켰다. 반응을 1M NaOH를 첨가하여 멈추게하고, ELISA 플레이트 리더에서 405/490 nm에서 흡광도를 읽었다. 결과를 네개 파라미터 곡선 반복 곡선 피팅으로 분석하였다.
다르게는, 플레이트를 cF19로 직접적으로 코팅시켰다. FAP(재조합 인간 FAP, 실시예 13 참조)를 상기와 같이 이들 플레이트에 결합하게하고, 이어서 비오티니화 LAHC(∼ 1㎍/ml)를 첨가했다. 항체 결합을 상기와 같은 HRP-스트렙타비딘 콘주게이트로 검출하였다.
막-결합된 인간 FAP의 가용화
FAP-발현 293FAP 1/2세포 또는 대조군 293 세포를 PBS로 세척하고, Tris-완충된 염수중의 1% Triton X-114로 용해시켰다. 핵 및 조각을 10,000 ×g로 원심분리하여 제거하였다. 상등액을 상-분배시켜(Estreicher A, Woulend A, Belin D, Scheuning WD Vasalli JD. Characterization of the cellular binding site for the urokinase-type plasminogen activatoe.(1989) J Biol Chem 264:1180-1189) 막 단백질을 풍부하게 하였다. 세제 상을 모으고 Trito X-114의 재응집을 방지하기 위하여 1% Empigen BB(Calbiochem)을 함유하는 버퍼로 희석시켰다. 이 물질을 콘카나발린 A 아가로즈 크로마토그래피시켰다(Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su SL, Ozer HL, Schwab, M, Albino AP, Old LJ, regulation and heteromeric structure of the fibroblast activation protein in normal and transformed cells of mesenchymal and neuroectodermal origin. (1993) Cancer Res 53:3327-3335).
L A H C 의 비오티닐화
LAHC(1-2 mg)를 50 mM 중탄산염 버퍼에 대해 투석하고, 10 배 몰 과량의 설포숙신이미딜-6-비오틴아미도 헥사노에이트(NHS-LC biotin, Pierce Chemical, Rockford, Ilinois, USA)로 실온에서 2시간동안 비오티닐화하였다. 비-반응된 생성물은 마이크로콘센트레이터에서 반복된 미세 투석에 의해 제거하였다.
일시적인 형질감염
COS-7 세포(어메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션, 참조번호 CRL 1651)에 LAHC를 코딩하는 중쇄 및 경쇄 벡터를 일렉트로포레이션에 의해 공감염시켰다.
항-CD8 모노클로날 항체를 마이크로티터 플레이트에 고정화시켰다. CD8-FAP 바큘로바이러스에 의해 감염된 곤충세포의 배지로부터의 CD8-FAP를 이들 플레이트에 결합하게 하였다. LAHC를 토딩하는 두개의 별개의 벡터로 일시적으로 공감염된 COS-7 세포로부터의 사용된(spent) 배지를 일련으로 희석하고 고정화된 CD8-FAP를 함유하는 웰에 첨가하였다. LAHC는 단리된 고정화된 CD8-FAP 단백질(도 35)에 결합하였다. 거짓-형질감염된 COS-7 세포로부터의 세포 상등액은 결합을 보이지 않았다.
293FAP l/2 세포의 세제 추출물 또는 대조군 추출물로부터의 재조합 막-결합된 FAP를 일련으로 희석하고 마이크로티터 플레이트에 결합된 키메릭 F19 모노클로날 항체를 통해 고정화시켰다. 비오티닐화 LAHC는 cF19(도 36)으로 고정화된 재조합 인간 FAP에 농도-의존 방법으로 결합하였다.
LAHC는 뮤린 F19에 대한 에피토프를 수반하는 단리된 고정화된 재조합 인간 FAP를 인식하였다. LAHC는 곤충 세포에서 생산된 CD8-FAP 및 293FAP l/2 세포에서 생산된 FAP 단백질에 결합하였다.
LAHC를 코딩하는 종쇄 및 경쇄로 형질감염되거나 DNA(대조군)이 없는 COS7 세포로부터의 배양 상등액을 공형질감염시키고 3일후 모았다. CD8-FAP를 본문에 기술된 바와같이 항-CD8 항체를 통해 고정화시켰다. COS7 상등액의 일련의 희석물이 고정화된 CD8-FAP에 결합하게 하고, 이어서 HRP-결합된 항-인간 IgG1 항체로 검출하였다.
FAP-발현 293FAP l/2 세포 또는 대조군 293 세포의 세제 추출물을 일련으로 희석하고, cF19-코팅된 마이크로티터 플레이트에 첨가하였다. 비오티닐화 LAHC를 첨가하고, 비오티닐화 LAHC의 결합을 HRP-결합된 스트렙타비딘으로 검출하였다.
실시예 13: HT-1080 선유육종(fibrosarcoma) 세포 및 인간 FAP에 대한 cDNA로 공형질감염된 293 인간 태아 신장 세포의 특성화
섬유아세포 활성화 단백질(FAP)는 F19 에피토프를 수반하는 세포-표면, 막-결합된 단백질이고, 종양 스트로마 섬유아세포상에서 발현된다. 재조합 FAP 단백질을 발현하는 세포주 및 FAP가 결여된 매치된 대조군을 항-FAP 모노클로날 항체의 특성화를 위하여 제조하였다.
사용된 세포는 HT-1080(참조번호 CCL 121)이고, 293 인간 태아 신장 세포(참조번호 CRL 1573)은 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Maryland, USA)로부터 수득하였다. 트랜스펙탐(Transfectam)은 Promega(Madison, WI)로부터 입수하였다. 제네티신 및 모든 제한 효소는 Boehringer Mannheim으로부터 입수하였다. 형질감염을 위한 DNA 는 제조자의 지시대로 QiaFilter Maxi Cartridges(Qiagen)을 사용하여 E.coli세포로부터 정제하였다. 모든 DNA 제조물은 제한효소 분해에 의해 조사하였다. 벡터 서열은 ABI PRISM 310 시퀀서를 사용하여 확인하였다.
이용된 벡터 및 DNA 서열에 대한 추가의 정보는 Scanlan MJ, Raj BK, Calvo B, Garin-Chesa P, Sanz-Moncasi MP, Healey JH, Old LJ, Rettig WJ. Molecular cloning of fibroblast sctivation protein alpha, a member of the serine protease family selectively expressed in stromal fibrobalsts of epitherial cancers.(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10832-10836에 기술되어 있다. FAP cDNA 서열은 Genebank(수탁 번호 HS09287)에 기탁되어 있다.
세포 배양 및 면역분석
HT-1080 세포를 제조자의 지시에 따라 트랜스펙탐을 사용하여 1mg DNA로 형질감염시켰다. 인간 태아 신장 293 세포를 인산 칼슘 형질감염에 의해 10 mg DNA로 형질감염시켰다(Brann MR; Buckley NJ; Jones SVP; Bonner Tl. Expression of cloned muscarine receptor in A9L cells. (1987) Mol Pharmacol 32:450-455). 24시간후, 세포를 200 mg/ml로 제네티신을 함유하는 새로운 배지에 1:10으로 희석하였다. 콜로니를 따내어 문헌[Rettig WJ; Garin-Chesa P; Beresford HR; Oettgen HF; Melamed MR; Old LJ. Cell-surface glycoproteins of human sarcomas:differential expression in normal and malignant tissues and cultured cells.(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:3110-3114]에 기술된대로 면역형광에 의해 FAP 발현에 대해 조사하였다.
cF19에 의한 면역침전을 문헌[Rettig WJ, Garin-Chesa P, Healey JH, Su Sl, Ozer HL, Schwab, M, Albino AP, Old LJ.Regulation and heteromeric structure of the fibrobalst activation protein in normal transformed cells of mesenchymal and neuroectodermal origin.(1993) Cancer Res 53:3327-3335]에 기술된대로 대사적으로 표지된 세포를 사용하여 수행하였다.
HT-1080 및 293 세포를 항-FAP 항체에 의한 면역형광 분석으로 FAP 항원 발현에 대해 시험하고 항원-음성인 것으로 밝혀졌다. FAP.38 벡터에 의한 이들 세포의 형질감염은 제네티신-내성 콜로니를 발생시켰다. 단리된 코로니를 따내어 FAP 발현에 대해 면역형광에 의해 분석하였다. 두개의 세포 콜로니를 동정하였고, cF19 항체로 인식되는바 세포 표면-결합 FAP 단백질을 발현하는, HT-1080FAP 클론 33 및 293FAP l/2로 명명하였다. cF19 항체를 갖는 비침투성의 HT-1080FAP 클론 세포 및 293FAP l/2의 염색은 FAP 단백질의 세포 표면 위치를 확인하였다.
35S-메치오닌 표지된 HT-1080FAP 클론 33 세포 또는 293FAP l/2세포의 추출물로부터 cF19를 갖는 방사성 표지된 FAP 단백질을 면역침전시켜 방사성 사진후 93 킬로달톤 밴드가 나타나게 하였다. 이 밴드는 모(parental) HT-1080 또는 293 세포 추출물의 면역침전에서는 검출될 수 없다.
두개의 안정하게 형질감염된 세포주, HT-1080FAP 클론 33 및 293FAP l/2는 항-FAP mAbs에 의한 며역학적 분석에서 결정된바 세포 표면에서 FAP를 발현시켰다. 모 HT-1080 세포 또는 모 293 세포 어느 것도 검출될만한 수준의 FAP를 발현하지 않았다.
실시예 14: CD8-FAP 융합 단백질의 생성 및 특성화
CD8-FAP 융합 단백질 형태의 인간 FAP(섬유아세포 활성화 단백질)의 가요성 형태를 항-FAP mAbs에 대한 결합 부위를 염색하는 LAHC의 특성화를 위해 곤충세포에서 생산하였다. 뮤린 CD8을 단백질의 분비 및 추가의 에피토프 태그를 제공하기 위하여 선택했다.
뮤린 CD8α(Genbank M12825)의 처음 189개 아미노산으로 구성된 세포외 CD8의 도메인을 코딩하는 cDNA를 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 Lane 등(Lane P, Brocker T. Hubele S, Padovan E, Lazavecchia A, McConnel. Soluble CD40 ligand can replace the normal T cell-derived CD40 ligand signal to B cells in T cell-dependent activation.(1993) J Exp Med 177:1209-1213)에 의해 본질적으로 기술된 바와같이 FAP의 세포외 도메인(아미노산 27 내지 760)의 것에 연결시켰다. 모든 클론의 신빙성은 DNA 서열화에 의해 입증되었다. 생성된 DNA를 pVL 1393 벡터(Invitrogen)에 삽입시키고, 이 벡터에 의한 Sf9 세포(Invitrogen)의 형질감염 및 생성된 재조합 바큘로바이러스의 증폭을 문헌[Baculovirus Expression Vectors. A Laboratory Manual. O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA, (Eds.), Oxford University Press:New York, 1994]에 기술된대로 수행하였다. 4일동안 재조합 CD8-FAP 바큘로바이러스로 감염된 High FiveTM 세포(Invitrogen)의 사용된 배지를 모으고 울트라 원심분리에 의해 맑게했다.
CD8-FAP ELISA(효소-결합된 면역흡착 분석)는 상기 기술되었다(실시예 12).
CD8-FAP 바이러스로 감염된 곤충 세포 배양물은 배지에 F19 에피토프를 수반하고 항-FAP 항체에 의해 인식되는 융합 단백질을 분비하였다(도 1). 세포 배양 배지 단독 및 CD8-CD40L 융합 단백질로 감염된 곤충세포로부터의 배지도 항-FAP 항체와 결합하지 않았다.
F19 에피토프를 수반하는 가용성 CD8-FAP 단백질이 감염된 곤충 세포 배양물의 배지로 분비되었다. 대조군 작제물로 감염된 세포로부터의 배양 상등액은 F19 에피토프를 갖는 항원을 함유하지 않았다.
FAP, CD8-FAP의 가요성 형태가 곤충세포에서 생산되었고, CD8-FAP는 cF19에 의해 인식되는 에피토프를 수반하는 것으로 나타났다.
CD8-FAP 또는 CD8-CD40L 융합 단백질을 코딩하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 곤충세포로부터의 상등액을 감염하고 4일후 모았다. 세포가 없는 세포 배양 배지를 추가의 대조군(배지)으로 사용하였다. 이 물질의 일련의 희석물을 항-CD8 항체-코팅된 마이크로티터 플레이트에 첨가하고, 결합하게 하였다. cF19(1 mg/ml)를 이어서 첨가하고 결합하게 하였다. 결합된 CF19를 양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 항-인간 항체로 검출하였다.


SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> FAP alpha-specific antibody with improved producibility <130> 12-196-PCT <140> PCT/EP99/02711 <141> 1999-04-22 <150> EP 98107925.4 <151> 1998-04-30 <160> 101 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gacattgtga tgacccaatc tccagactct ttggctgtgt ctctagggga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagtca gagcctttta tattctagaa atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtatcagc agaaaccagg acagccaccc aaactcctca tcttttgggc tagcactagg 180 gaatctgggg tacctgatag gttcagtggc agtgggtttg ggacagactt caccctcacc 240 attagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttttagctat 300 ccgctcacgt tcggacaagg gaccaaggtg gaaataaaa 339 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile 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cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg 4860 tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag 4920 acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg 4980 ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgccaag agtgacgtaa gtaccgccta 5040 tagagtctat aggcccaccc ccttggcttc ttatgcatgc tatactgttt ttggcttggg 5100 gtctatacac ccccgcttcc tcatgttata ggtgatggta tagcttagcc tataggtgtg 5160 ggttattgac cattattgac cactccccta ttggtgacga tactttccat tactaatcca 5220 taacatggct ctttgccaca actctcttta ttggctatat gccaatacac tgtccttcag 5280 agactgacac ggactctgta tttttacagg atggggtctc atttattatt tacaaattca 5340 catatacaac accaccgtcc ccagtgcccg cagtttttat taaacataac gtgggatctc 5400 cacgcgaatc tcgggtacgt gttccggaca tgggctcttc tccggtagcg gcggagcttc 5460 tacatccgag ccctgctccc atgcctccag cgactcatgg tcgctcggca gctccttgct 5520 cctaacagtg gaggccagac ttaggcacag cacgatgccc accaccacca gtgtgccgca 5580 caaggccgtg gcggtagggt atgtgtctga aaatgagctc ggggagcggg cttgcaccgc 5640 tgacgcattt ggaagactta aggcagcggc agaagaagat gcaggcagct gagttgttgt 5700 gttctgataa gagtcagagg taactcccgt tgcggtgctg ttaacggtgg agggcagtgt 5760 agtctgagca gtactcgttg ctgccgcgcg cgccaccaga cataatagct gacagactaa 5820 cagactgttc ctttccatgg gtcttttctg cagtcaccgt ccttgacacg cgtctcggga 5880 agcttgccgc caccatggac tggacctggc gcgtgttttg cctgctcgcc gtggctcctg 5940 gggcccacag ccaggtgcaa ctggtgcagt ccggcgccga agtgaagaaa cccggtgctt 6000 ccgtgaaagt cagctgtaaa actagtagat acaccttcac tgaatacacc atacactggg 6060 ttagacaggc ccctggccaa aggctggagt ggataggagg tattaatcct aacaatggta 6120 ttcctaacta caaccagaag ttcaagggcc gggccacctt gaccgtaggc aagtctgcca 6180 gcaccgccta catggaactg tccagcctgc gctccgagga cactgcagtc tactactgcg 6240 ccagaagaag aatcgcctat ggttacgacg agggccatgc tatggactac tggggtcaag 6300 gaacccttgt caccgtctcc tcaggtgagt ggatcctctg cgcctgggcc cagctctgtc 6360 ccacaccgcg gtcacatggc accacctctc ttgcagcctc caccaagggc ccatcggtct 6420 tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg 6480 tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg 6540 gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg 6600 tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc 6660 ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat 6720 gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa 6780 aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg 6840 tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata 6900 atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgggtg gtcagcgtcc 6960 tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca 7020 aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac 7080 cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga 7140 cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc 7200 agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc 7260 tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct 7320 ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg 7380 gtaaatgagt gcgacggccg gcaagccccg ctccccgggc tctcgcggtc gcacgaggat 7440 gcttggcacg taccccctgt acatacttcc cgggcgccca gcatggaaat aaagcaccgg 7500 atctaataaa agatatttat tttcattaga tatgtgtgtt ggttttttgt gtgcagtgcc 7560 tctatctgga ggccaggtag ggctggcctt gggggagggg gaggccagaa tgactccaag 7620 agctacagga aggcaggtca gagaccccac tggacaaaca gtggctggac tctgcaccat 7680 aacacacaat caacagggga gtgagctgga aatttgctag cgaattaatt c 7731 <210> 43 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Gly Lys Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His 115 120 125 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser 130 135 140 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 145 150 155 160 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165 170 175 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185 190 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 195 200 205 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 210 215 220 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 225 230 235 240 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 accgtctcct caggtgagtg gatcc 25 <210> 45 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 cctctcttgc agcc 14 <210> 46 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 cctctcttgc agcc 14 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Thr Val Ser Ser 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ser Thr Lys Gly 1 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 accgtctcct cagcctccac caagggc 27 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Thr Val Ser Ser Ser Thr Lys Gly 1 5 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 accgtctcct cagcctccac caagggc 27 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 1 5 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 gaaataaaac gtgagtggat cc 22 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 cttctttcct caggaactgt ggctgca 27 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Thr Val Ala Ala 1 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gaaataaaac gaactgtggc tgca 24 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Ile Lys Thr Val Ala Ala 1 5 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gaaataaaac gaactgtggc tgca 24 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 1 5 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly 20 <210> 61 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 62 <211> 9 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gccgccacc 9 <210> 63 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PRIMER <400> 63 cagaaagctt gccgccacca tggattcaca ggcccag 37 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Met Asp Ser Gln Ala Gln 1 5 <210> 65 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 65 ccgaggatcc actcacgttt cagctccagc ttggt 35 <210> 66 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 66 cagaaagctt gccgccacca tgggatggag ctgggtc 37 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Met Gly Trp Ser Trp Val 1 5 <210> 68 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 68 ccgaggatcc actcacctga ggagacggtg actga 35 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 69 gtcatcacaa tgtctccgga ggaacctgga acccag 36 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 70 ctccggagac attgtgatga cccaatctc 29 <210> 71 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 71 gaatataaaa ggctctgact ggacttgcag ttgatggtgg ccctc 45 <210> 72 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 72 cagtcagagc cttttatatt ctagaaatca aaagaactac ttggcctggt atcagcagaa 60 accaggacag cc 72 <210> 73 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 73 accccagatt ccctagtgct agcccaaaag atgaggagtt tggg 44 <210> 74 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 74 tagcactagg gaatctgggg tacctgatag gttcagtggc agtgggtttg ggacagactt 60 caccctc 67 <210> 75 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 75 gtcccttgtc cgaacgtgag cggatagcta aaatattgct gacagtaata aac 53 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 76 gctcacgttc ggacaaggga ccaaggtgga aat 33 <210> 77 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 77 cagtcagagc cttttatatt ctagaaatca aaagaactac ttggcctggt tccagcagaa 60 accaggacag cc 72 <210> 78 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 78 gtcccttgtc cgaacgtgag cggatagcta aaatattgct gacagtcata aactgcc 57 <210> 79 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 79 cccaaactcc tcatctattg ggctagcact aggg 34 <210> 80 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 80 ccctagtgct agcccaatag atgaggagtt tggg 34 <210> 81 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 81 tacgcaaacc gcctctc 17 <210> 82 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 82 gagtgcacca tatgcggt 18 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 83 aacagctatg accatg 16 <210> 84 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 84 gttttcccag tcacgac 17 <210> 85 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 85 gtgtattcag tgaaggtgta tctactagtt ttacagctga ctttcac 47 <210> 86 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 86 tagtagatac accttcactg aatacaccat acactgggtt agacaggccc ctg 53 <210> 87 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 87 cccttgaact tctggttgta gttaggaata ccattgttag gattaatacc tcctatccac 60 tccagccttt g 71 <210> 88 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 88 taactacaac cagaagttca agggccgggc caccttgacc gtaggcaagt ctgccagcac 60 cgcctacatg g 71 <210> 89 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 89 gcatggccct cgtcgtaacc ataggcgatt cttcttctgg cgcagtagta gactgcagtg 60 tcc 63 <210> 90 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 90 ctatggttac gacgagggcc atgctatgga ctactggggt caaggaac 48 <210> 91 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 91 taactacaac cagaagttca agggccgggt caccatcacc gtagacacct ctgccagcac 60 cgcctacatg g 71 <210> 92 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 92 ggacactgca gtctacttct gcgccag 27 <210> 93 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 93 tacgcaaacc gcctctc 17 <210> 94 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 94 gagtgcacca tatgcggt 18 <210> 95 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 95 cctttggcca ggggcctgtc taacccagtg tatggtgtat tcagtgaagg tgtatccact 60 agtttccact agttt 75 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 96 gtcaccgtcc ttgacacgcg tctcggga 28 <210> 97 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 97 ttggaggagg gtgccag 17 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 98 gagacattgt gacccaatct cc 22 <210> 99 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 99 gacagtcata aactgccaca tcttc 25 <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 100 ttgacacgcg tctcgggaag ctt 23 <210> 101 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 101 ggcgcagagg atccactcac ct 22

Claims (73)

  1. 모노클로날 항체 F19(ATCC 수탁번호 HB 8269)의 상보성 결정 부위를 가지고, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:6에 기술된 경쇄의 가변 부위를 함유하는, 섬유아세포 활성화 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 각각 인간 불변 부위에 결합한 가변 경쇄 부위 및 가변 중쇄 부위를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 단백질.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 경쇄의 인간 불변 부위가 인간 카파 불변 부위인 항체 단백질.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 중쇄의 인간 불변 부위가 인간 감마-1 불변 부위인 항체 단백질.
  5. 제 1 항에 있어서, ELISA에 의해 결정된 조배지 샘플중의 항체 단백질 발현 수준 및/또는 정제된 항체 수율이 F19의 가변 부위 및 외부 불변 부위를 갖는 키메릭 항체의 발현 수준 및/또는 정제 수율을 적어도 10의 계수(factor)로 초과함을 특징으로 하는 항체 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서, ELISA에 의해 결정된 조배지 샘플에서 항체 단백질의 발현 수준 및/또는 정제된 항체 수율이 F19의 가변 부위 및 외부 불변 부위를 갖는 키메릭 항체의 정제 수율을 적어도 20의 계수로 초과함을 특징으로 하는 항체 단백질.
  7. 제 1 항에 있어서, ELISA에 의해 결정된 조배지 샘플에서 항체 단백질의 발현 수준 및/또는 정제된 항체 수율이 F19의 가변 부위 및 외부 불변 부위를 갖는 키메릭 항체의 정제 수율을 적어도 100의 계수로 초과함을 특징으로 하는 항체 단백질.
  8. 제 1 항에 있어서, 진핵세포에서 개선된 생산성을 나타내는 항체 단백질.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 진핵세포가 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포)인 항체 단백질.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2에 기술된 경쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서, 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:1에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 항체 단백질.
  16. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:6에 기술된 경쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질.
  17. 제 16 항에 있어서, 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:5에 기술된 뉴클레오타이 드 서열에 의해 코딩되는 항체 단백질.
  18. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14의 어느 하나에 기술된 중쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질.
  19. 제 18항에 있어서, 중쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO: 7, 9, 11, 13의 어느 하나에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 항체 단백질.
  20. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2에 기술된 경쇄의 가변 부위 및 SEQ ID NO:12에 기술된 중쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질.
  21. 제 20항에 있어서, 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:1에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, 중쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:11에 의해 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 항체 단백질.
  22. 제 20 항에 있어서, SEQ ID NO:20에 기술된 경쇄의 불변 부위 및 SEQ ID NO:22에 기술된 중쇄의 불변 부위를 함유하는 항체 단백질.
  23. 제 1 항에 있어서, SEQ ID NO:2에 기술된 경쇄의 가변 부위 및 SEQ ID NO:8에 기술된 중쇄의 가변 부위를 함유하는 항체 단백질.
  24. 제 23 항에 있어서, 경쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:1에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, 중쇄의 가변 부위가 SEQ ID NO:7에 기술된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 항체 단백질.
  25. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  26. 제 25 항의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 DNA 벡터.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 벡터가 발현 벡터인 재조합 DNA 벡터.
  28. 제 26 항 또는 제 27항에 따른 벡터를 수반하는 숙주 세포.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵 세포인 숙주세포.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 진핵 숙주 세포가 포유동물 세포인 숙주 세포.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 또는 COS 세포인 숙주 세포.
  32. (a) 항체 단백질이 숙주 세포에 의해 발현되는 조건하에서 제 28 항 내지 제 31 항중 어느 한항에 따른 숙주 세포를 배양하고
    (b) 상기 항체 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질을 생산하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유동물 세포인 방법.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 각각 경쇄 및 중쇄용 발현 유니트를 수반하는 두개의 플라스미드로 공형질감염되는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제에 결합된 항체 단백질.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 치료제가 방사성 동위원소, 독소, 톡소이드, 염증제 및 화학 치료제로 구성된 그룹으로부터 선택된 치료제인 항체 단백질.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 β-방출 방사성 동위원소인 항체 단백질.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 186레늄, 188레늄, 131요오드 및 90이트륨으로 구성된 그룹으로부터 선택된 항체 단백질.
  39. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 표지된 항체 단백질.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 표지가 검출가능한 마커(marker)인 항체 단백질.
  41. 제 40항에 있어서, 검출가능한 마커가 효소, 염료, 방사성 동위원소, 디곡시게닌, 및 비오틴으로 구성된 그룹으로부터 선택된 검출가능한 마커인 항체 단백질.
  42. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 영상화제(imageable agent)와 결합된 항체 단백질.
  43. 제 42 항에 있어서, 영상화제가 방사성 동위원소인 항체 단백질.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 γ-방출 방사성 동위원소인 항체 단백질.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 125I인 항체 단백질.
  46. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 활성화된 스트로마 섬유아세포와 관련된 종양을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  47. 제 35 항 내지 제 38항 중 어느 한항에 따른 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 활성화된 스트로마 섬유아세포와 관련된 종양을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  48. 제 42 항 내지 제 45 항중 어느 한항에 따른 항체 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 활성화된 스트로마 섬유아세포와 관련된 종양을 영상화하기 위한 약제학적 조성물.
  49. 제 46 항에 있어서, 종양이 콜로렉탈(colorectal) 암, 대세포(non-small cell) 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 방광암(bladder cancers), 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
  50. 제 1 항 내지 제 9 항 및 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질을 함유하는 항암제.
  51. 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질을 함유하는 항암제.
  52. 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질을 함유하는 활성화된 스트로마 섬유아세포의 영상화제.
  53. 제 39 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 따른 항체 단백질을 함유하는, 샘플중의 활성화된 스트로마 섬유아세포의 존재 검출제.
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  55. 제 47 항에 있어서, 종양이 콜로렉탈(colorectal) 암, 대세포(non-small cell) 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 방광암(bladder cancers), 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
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  59. 제 48 항에 있어서, 종양이 콜로렉탈(colorectal) 암, 대세포(non-small cell) 폐암, 유방암, 머리 및 목 암, 난소암, 폐암, 방광암(bladder cancers), 췌장암 및 뇌의 전이암으로 구성되는 암 그룹으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
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