JP2002510321A - 抗−第ＩＸ因子 Ｆａｂフラグメントの結晶構造およびペプチド模倣物デザインのための使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な抗−第ＩＸ因子Ｆａｂフラグメント結晶構造が同定される。これらのフラグメントのペプチド模倣物を同定する方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 抗−第ＩＸ因子Ｆａｂフラグメントの結晶構造および ペプチド模倣物デザインのための使用方法 本発明は、１９９７年７月３日に出願された米国仮出願第６０／０５１，６４ ５の利益を主張する。 発明の分野 本発明は、抗−第ＩＸ因子Ｆａｂフラグメント結晶およびペプチド模倣物のデ ザインおよび選択のための相補性決定領域（ＣＤＲ）構造パラメーターの使用に 関する。 発明の背景 正常な環境下では、血管の並んでいる脈管の血管内非細胞が傷つくと、多かれ 少なかれ、一般に凝集「カスケード」と称される一連の事象を介して止血応答が 作動する。カスケードは、可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変換し 、フィブリンは血小板と一緒になって、血液成分の管外溢出を防ぐ局在する血餅 または血栓を形成する。ついで、創傷治癒が起こり、その後血餅が分解し、血管 が完全に修復し、流れることができる。 傷害と血餅形成の間に起こる事象は、慎重に制御され、かつ関連している一連 の反応である。簡単には、複数の不活性なプロ酵素の形態にある血漿凝集タンパ ク質およびコファクターが血液中を循環する。活性な酵素複合体が傷害部位にて アセンブリされ、続いてセリンプロテアーゼに活性化され、各セリンプロテアー ゼは次にその後のプロ酵素のプロテアーゼへの活性化を触媒する。この酵素カス ケードにより、各工程が次の工程の効果を強めることになる。凝集カスケードの 総説については、「Thombosis and Hemorrhage」，J．Loscalzo and A．Schafer ，eds.，Blackwell Scientific Publications，Oxford，England(1994)の第一章 を参考のこと。 有効な凝固は、障害部位における血液の損失を制限するが、静脈または動脈中 での不適当な血栓の形成は、疾病および死亡の一般的原因である。異常な凝固活 性は、心筋梗塞、不安定アンギナ、心室細動、発作、腎臓障害、経皮経管冠動脈 形成、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、肺塞栓症および深静脈血栓症などの病 状または治療をもたらし、および／または、その病状または治療より由来しうる 。人工心臓弁などの人工臓器、シャントおよび補綴の外来物質の表面上の血餅の 形成もまた、問題がある。 これらの病状および他の血栓性および塞栓性障害の治療において現在用いられ る承認された抗凝固剤には、硫酸化ヘテロポリサッカライドヘパリンおよび低分 子量（ＬＭＮ）ヘパリンが包含される。これらの薬剤は、非経口投与され、トロ ンビン阻害剤、アンチトロンビンIIIの活性化およびすべての凝固因子の不活化 によって迅速かつ完全な凝固阻害を引き起こすことができる。 しかしながら、その効能により、ヘパリンおよびＬＭＷヘパリンは不利益を生 じる。単純な動作のストレスの結果として、手術部位での物質との接触に伴い、 出血を制御できないことが主な合併症であり、連続注入を受けている患者の１〜 ７％において、および、間欠性ボーラス投与を受けている患者の８〜１４％にお いて観察される。この危険を最小とするため、サンプルを連続的に採取し、ex v ivoで凝固時間を連続的にモニターできるようにするが、これにより実質的な治 療のコストが上がり、患者を不自由なものとする。 さらに、患者を出血の危険にさらすことなく所望の効能レベルに達するための 標的とする治療範囲は狭い。その治療範囲は、約１ないし３μｇ以下のヘパリン ／ｍｌ血漿であり、これにより、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ ）アッセイ時間は約３５〜約１００秒となる。ヘパリン濃度を３μｇ／ｍｌに増 加すると標的範囲を上回り、４μｇ／ｍｌよりも高い濃度では、凝固活性が検出 されない。それゆえ、患者の血漿濃度を治療範囲内に維持するために大きな注意 を払わなければならない。 よりゆっくりかつより長く持続効果を有する別の承認された抗凝固剤は、クマ リン誘導体であるワルワァリンである。ワルワァリンは、プロトロンビンのビタ ミンＫ依存性翻訳後修飾および他のビタミンＫ依存性凝固因子と競合することに より作用する。 治療範囲よりもわずかに高いだけの濃度において血液が凝固できなくなる抗凝 固作用の一般的なパターンは、ワルワァリンならびにヘパリンおよびＬＭＷヘパ リンについて見られる。明らかに、血栓性および塞栓性障害の制御において効果 的であり、制御されていない出血を引き起こさないかまたはその可能性のない抗 凝固剤が必要とされている。したがって、新規な抗凝固剤の同定および構造に基 づくデザインを可能とする抗凝固剤の構造的情報も必要とされている。 発明の要約 したがって、本発明の一態様は、ＢＣ２ Ｆａｂフラグメント結晶である。 本発明の別の態様は、ＢＣ２ ＣＤＲを含むＦａｂフラグメント結晶である。 本発明の別の態様は、ＳＢ２４９４１７ Ｆａｂフラグメント結晶である。 本発明の別の態様は、第ＩＸ因子結合活性を有するペプチド模倣物を同定する 方法であって、抗一第ＩＸ因子Ｆａｂフラグメント結晶由来のＣＤＲ構造パラメ ーターで小分子構造データベースをサーチする；ＣＤＲ構造パラメーターを模倣 する分子構造をデータベースから選択する；選択した分子構造を合成する；およ び第ＩＸ因子結合活性について合成した分子をスクリーニングする工程を含む方 法である。 図面の簡単な説明 図１は、ＢＣ２ ＨＣ−ＣＤＲ１の残基の３次元構造である。 図２は、ＢＣ２ ＨＣ−ＣＤＲ２の残基の３次元構造である。 図３は、ＢＣ２ ＨＣ−ＣＤＲ３の残基の３次元構造である。 図４は、ＢＣ２ ＬＣ−ＣＤＲ１の残基の３次元構造である。 図５は、ＢＣ２ ＬＣ−ＣＤＲ２の残基の３次元構造である。 図６は、ＢＣ２ ＬＣ−ＣＤＲ３の残基の３次元構造である。 図７は、ＳＢ２４９４１７ ＨＣ−ＣＤＲ１の残基の３次元構造である。 図８は、ＳＢ２４９４１７ ＨＣ−ＣＤＲ２の残基の３次元構造である。 図９は、ＳＢ２４９４１７ ＨＣ−ＣＤＲ３の残基の３次元構造である。 図１０は、ＳＢ２４９４１７２ ＬＣ−ＣＤＲ１の残基の３次元構造である。 図１１は、ＳＢ２４９４１７２ ＬＣ−ＣＤＲ２の残基の３次元構造である。 図１２は、ＳＢ２４９４１７ ＬＣ−ＣＤＲ３の残基の３次元構造である。発明の詳説 限定するものではないが特許および特許出願を含む、本明細書において引用し たすべての出版物は、たとえ完全に記載されているものとしても出典明示により 本明細書に含まれる。 第ＩＸ因子（ｆＩＸ）は、ビタミンＫ−依存性セリンプロテアーゼチモーゲン であり、これは活性型第ＶIII因子およびカルシウムの存在下で膜表面上で第Ｘ 因子の活性化を触媒することにより、凝血カスケードの増幅に重要な役割を担う 。米国特許出願第０８／７８３，８５３に記載されるネズミ科の抗−ヒト第ＩＸ 因子モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＢＣ２は、動脈および静脈血栓症における抗 凝固治療に有用な特性を有するＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体である。ＢＣ ２は、自己限定的に凝血カスケードをダウンレギュレートする。ＢＣ２は、ｆＸ ＩがｆＩＸのｆＩＸａへの活性化ならびに組織因子およびｆＶIIａの複合体がそ の活性化を阻害する。ＢＣ２はまた、ｆＩＸａ凝固活性を阻害する。ＢＣ２は、 解離定数Ｋｄ＝４ｎＭで、カルシウム−依存的にヒトｆＩＸおよびｆＩＸａと結 合する。ＢＣ２はまた、ラットｆＩＸと交差反応し、これを阻害する。 ＢＣ２のヒト化構築物を作成し、抗凝固活性について、in vitroおよび動物モ デルにおいて試験した。これらの構築物は、米国特許出願第０８／７８３,８５ ３に記載され、ＢＣ２と同様、自己限定性中和活性を示す新規な抗凝固剤であり 、すなわち、これらは自己限定的に凝血カスケードをダウン−レギュレートし、 ヘパリンおよび他の抗凝固治療に伴う出血の危険を最小にする。かかるＢＣ２の ヒト化構築物の１つがＳＢ２４９４１７である。本明細書において用いる場合、 「自己限定性中和活性」なる用語は、ヒト凝固第ＩＸ因子または第ＩＸａ因子に 結合し、かつ凝固作用の限定的制御が得られるように血栓症を阻害するペプチド 模倣物の活性をいう。「凝固作用の限定的制御」は、活性化部分トロンボプラス チン時間（ａＰＴＴ）が延長されることで測定される凝固時間の増加を言い、血 漿は、高濃度のモノクローナル抗体にもかかわらずａＴＰＰが最高値にある凝血 能をなおも有する。この凝固作用の限定的制御は、高濃度のヘパリンの存在下で 血漿が凝固能がなくなり、無限のａＰＴＴを示すことと対照的である。好ましく は、最大ａＰＴＴ値は、ヘパリン治療範囲内である。最も好ましくは、最大ａＰ ＴＴは、３５秒〜１００秒の範囲内であり、これは正常制御ａＰＴＴ値の約１． ５倍〜約３．５倍に対応する。 ヒト化工程において、抗原結合部位を変化させないまま、マウス抗体構造をヒ ト抗体由来のものに変える。この部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可 変セグメントと呼ばれる、ｍＡｂアミノ酸配列における特定の領域により形成さ れる。抗原に対する特異性を決定する抗原−結合部位は、抗体のＦａｂフラグメ ント中に位置し、これは全軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）部分からなる。 これらの治療に有用なマクロ分子の機能的な小分子模倣物を開発するための試 みの一部として、抗−ｆＩＸ ｍＡｂｓ ＢＣ２およびＳＢ２４９４１７の抗凝固 活性の構造的および機械的特徴を調べた。この情報は、機能的にｍＡｂの抗凝固 特性を模倣する小さなペプチドをデザインし、試験するのに有用であり、これら のペプチドを治療的使用のために開発するのに有用である。 ＢＣ２およびＳＢ２４９４１７のＦａｂフラグメントの３次元構造を、実施例 において記載したようにＸ−線結晶法を用いて調べた。構造情報をコンピュータ ー読み取り可能媒体上に保存することができる。 マウスおよびヒト化ＦａｂフラグメントからのＣＤＲは、一般に類似するコン フォメーションを有する。２つのＦａｂ間の対応するＣＤＲ Ｃα位置間のｒ． ｍ．ｓの違いは、ｒ．ｍ．ｓ値がそれぞれ１．９７および３．７ÅであるＨＣ− ＣＤＲ２およびＨＣ−ＣＤＲ３を除いて、０．５Åより小さい。ＨＣ−ＣＤＲ２ およびＨＣ−ＣＤＲ３のコンフォメーションにおけるわずかな変化は、これらの 間の角度を変えずに、これらのループの平面における角シフトに帰することとな る。両方のＦａｂにおいて、３つのＨＣ ＣＤＲおよびＬＣ−ＣＤＲ３は、ＣＤ Ｒ表面に走る溝（長さ２７Å、幅８Å、深さ９Å）を形成する。溝の中心の深い 穴にあるＣＤＲ残基ＨＣ−Ａｓｎ３５、ＨＣ−Ｔｒｐ５０およびＬＣ−Ａｒｇ９ ５は、抗原結合に重要であると考えられる。 ＢＣ２およびＳＢ２４９４１７ Ｆａｂ構造のＣＤＲについて得られた構造情 報は、小分子ペプチド模倣物を見出すのに有用である。好ましいペプチド模倣物 には、第ＩＸ因子に結合し、in vitro凝固アッセイにおいて自己限定性中和活性 を有するペプチドおよび合成有機分子が包含される。かかる構造に基づいてペプ チドを模倣するデザインの方法を以下に一例として示す(Zhao，et al.，1995;Mo nfardini C．et al.，1996)。 Available Chemicals Directory、Cambridge Crystallographic Database、Fi ne Chemical DatabaseおよびCONCORD database(総説は、Rusinko A.，1993を参 照のこと)などのいくつかの小分子構造データベースのサーチを、ＣＤＲ構造由 来のパラメーターを用いて行う。サーチは、２次元、３次元、またはその両方で 行うことができ、UNITY version 2.3.1(Tripos，Inc.)、MACCS 3D、CAVEATおよ びDOCKなどのソフトウェアの組み合わせを用いて行うことができる。小分子のコ ンフォメーションの柔軟性は許容される。サーチを行うための方法では、個々の ＣＤＲならびにＣＤＲの組み合わせのコンフォメーションおよび／またはｍＡｂ 結合部位の鍵となる残基を考慮する。 これらのＣＤＲは他のＦａｂ中において抗原認識に密接に関係することが見出 されているので、はじめのアプローチは、ＨＣ−ＣＤＲ３、ＬＣ−ＣＤＲ３およ びＨＣ−ＣＤＲ２からの構造パラメーターに焦点を合わせることである。ＨＣ− ＣＤＲ３、ＬＣ−ＣＤＲ３およびＨＣ−ＣＤＲ２の小分子模倣物についてのサー チは別個に行う。これらの３個のＣＤＲの各２個から由来の構造パラメーターを 組み合わせ、サーチを繰り返す。次の工程は、３種のＣＤＲすべての組み合わせ から由来のパラメーターを用いる。残る３つのＣＤＲのコンフォメーションパラ メーターは、６種のＣＤＲをすべて組み合わせてサーチする後の段階に含める。 好ましくは、選択された分子構造は、ＣＤＲ残基ＨＣ−Ａｓｎ３５、ＨＣ−Ｔｒ ｐ５０およびＬＣ−Ａｒｇ９５のパラメーターを模倣する。サーチにより得られ た小分子ヒットを合成し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて第ＩＸ因子結合について 、好ましくは、標準的なin vitro凝固アッセイにおいて抗−血栓活性についてス クリーンする。ヒットは自己限定性中和活性を示すことが最も好ましい。 本発明の方法により製造されたペプチド模倣物は、心筋梗塞、不安定アンギナ 、 心室細動、発作、腎臓障害、肺塞栓症、深静脈血栓症、経皮経管冠動脈形成、汎 発性血管内凝固症候群、敗血症、人工臓器、シャントまたは補綴物に伴う障害な どの、血栓性および塞栓性疾患の治療において有用であると考えられる。 本発明を以下の具体的な、限定するものではない実施例を用いて説明する。 実施例１ Ｆａｂフラグメントの調製および精製 ＢＣ２およびＳＢ２４９４１７ Ｆａｂフラグメントの両方を以下のように調 製し、精製した。５０ｍＬの新たに精製したモノクローナル抗−ヒトｆＩＸ抗体 サンプル（ＰＢＳ緩衝液中、１．２ｍｇ／ｍｌ）を３０−ｋＤａ分子量カットオ フ膜（ＹＭ３０、６５ｐｓｉ、４℃）を用いて、最終容積５．０ｍＬおよび最終 濃度１２．０ｍｇ／ｍｌにまでＡｍｉｃｏｎセル中に濃縮した。その濃縮ｍＡｂ サンプルに、２０μｇ／ｍＬパパイン(Boehringer Manheim，cat.＃ 108014)、 ２．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）および５．０ｍＭシステイン−ＨＣＬ−水 和物(PIERCE，cat.＃ 44889)を加え、その混合物を３７℃にて４時間インキュベ ートし、穏やかに振盪することによりｍＡｂのパパイン消化を開始した。反応を 混合物を氷上で２０分間冷却することにより終止した。 消化物を５ｍＬのプロテインＡ−セファロース樹脂(Pharmacia)とインキュベ ートし、４℃にて１時間混合することにより、Ｆｃフラグメントを除去した。混 合物を、１５ｍＬの重力供給カラム中に移し、結合していないフラクション（Ｆ ａｂフラグメントを含む）を集めた。カラムを８ｍＬ容量の２０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰ Ｏ₄、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で２回洗浄した。溶出物および２回の洗 浄物をプールし、ＹＭ１０膜とＡｍｉｃｏｎセルを用いて４℃にて５．３ｍＬに まで濃縮した。 サンプルを、２０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で予 め平衡化したPharmacia Superdex 75カラム(容積３２０ｍＬ)にローディングし た。ついで、カラムを２．５ｍＬ／分の速度で同じ緩衝液にて溶出し、３０分間 、空隙容量を集めた後、１ｍＬのフラクションを集めた。Ｆａｂフラグメントが フラクション２６〜３６に見られる大きなＡ₂₈₀ピークで示される単一の分 子種として溶出し、それをプールし、Ａ₂₈₀吸光度によりタンパク質濃度につい てアッセイした。この標準的なプロトコールを用いて、全部で２５ｍgのＦａｂ が作成された（精製率＝５０〜６０％）。Superdex 75の溶出物をＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ分析に付し、見かけの分子量４７，０００Ｄａの単一種が明らかにされた。 ＢＣ２ ＦａｂサンプルのＩＥＦ分析により、多くの等電変種の存在が明らか にされた；２種の主要なイソフオームは、８．９および７．３５の見かけのｐＩ 値を有する。これらの２つの種を、有用な結晶を得るために必要かつ十分である ことが判明したイオン交換クロマトグラフィー工程を用いて分離した。２５ｍｇ のＳＥＣ溶出物を完全に緩衝液交換し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．２に対し て透析を繰り返し、Ａｍｉｃｏｎセル中で５ｍＬにまで濃縮し、緩衝液Ａ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．２）で予め平衡化した１ｍＬのPharmacia Mono Qカラ ムにローディングした。カラムを１０ｍＬの緩衝液Ａで洗浄し、流出液中にはタ ンパク質は溶出しなかった。３つのタンパク種を、１．０ｍＬ／分の速度にて、 緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．２、１．０Ｍ ＮａＣｌ）の０〜１５％ 勾配、ついで緩衝液Ｂの１５〜１００％勾配で溶出した。１ｍＬフラクションを 集めた。クロマトグラムにおけるはじめの(シャープな)ピークに対応するフラク ションをプールし、Ａ₂₈₀吸光度についてアッセイし、Ａｍｉｃｏｎセル中２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に対して緩衝液交換し、８ｍｇ／ｍＬにまで濃縮 し、結晶化に用いた。他の２つのピークからのフラクションは結晶化しなかった 。プロトコールの最終収率は、約３６％であった(結晶化可能なフラクションの み)。 実施例２ Ｆａｂフラグメントの結晶化 ＢＣ２Ｆａｂ：イオン交換工程のピーク１からのタンパク質イソフォームを、 シッティング−ドロップセットアップ（sitting-drop setup）方式の蒸気拡散法 を用いて結晶化した。ウェル溶液は、１４％ ＰＥＧ６Ｋ、２０ｍＭ硫酸アンモ ニウム（または１００ｍＭ ＬｉＣｌ）、１０ｍＭ ＣａＡｃ₂および２００ｍＭ イミダゾール／ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０を含んだ。液剤を３μＬのウェル溶 液を３μＬのタンパク質溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中、８ｍｇ／ ｍｌ）を混合することにより調製した。大きな斜方晶系の結晶が５日間、２１℃ にて、０．８×０．３×０．２５ｍｍ³の大きさにまで成長した。結晶は、３． ０Åで回折し、単位格子寸法ａ＝８９．３、ｂ＝１２０．６、ｃ＝４３．４Åの 空間群、Ｐ２１２１２にて、非対称単位に１分子であった。 ＳＢ２４９４１７ Ｆａｂ：同様なシッティングドロップ方法を用いた。ウェ ル溶液は、３０〜４０％飽和硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭ Ｍｅｓ、ｐＨ６ ．０を含んだ。液剤を、ウェル溶液およびタンパク質溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥ Ｓ、ｐＨ７．０中、１０ｍｇ／ｍｌ）の等容積を混合することにより調製した。 大きな結晶が一週間、１５℃にて、０．６×０．４×０．３ｍｍ³にまで成長し た。結晶は、２．２Åで回折し、単位寸法ａ＝５６．６、ｂ＝５６．６、ｃ＝７ ３．７４Å、α＝８６．０、β＝８６．０、γ＝６４．９℃の空間群、Ｐ１にて 、非対称単位に２分子であった。 実施例３ Ｘ−線データ収集 Ｘ−線回折データを、１°振幅フレームにて、単色性のＣｕＫ_α放射線の５０ ｋＶ／１００ｍＡにて作動するリガク（Rigaku）高輝源に固定したＭＡＲ領域デ ィテクターに収集した。３および２個の異なる結晶からのデータを収集し、合わ せ、ＢＣ２ ＦａｂおよびＳＢ２４９４１７ Ｆａｂそれぞれの構造決定に用いた 。 すべてのデータをＨＫＬプログラム、第４版(Otwinowski，1993)を用いて処理し た。表１にデータ収集パラメーターをまとめる。 ＢＣ２の場合、合わせたデータを構造決定に用いたのに対し、構造精密化は、 最良のＲ−ｓｙｍ値で示される単結晶データを用いて行った。ＳＢ２４９４１７ の場合、構造決定および精密化に合わせたデータを用いた。 実施例４ 構造決定 汎用分子置換法を用いて決定した。この方法には、リアル−スペース・クロス− ローテーション・パターソン・サーチ(Huber，1985)、ついで、パターソン係数 ン・サーチ、および、最後に剛体精密化が包含される。Ｘ−ＰＬＯＲプログラム サーチモデルを２つのＦａｂのＰＤＢ−付着１．９Å構造からＢＣ２について 構築した：ヒトライノウイルス１４（ＰＤＢエントリＩＦＯＲ）を中和するネズ ミ科のＩｇＧ２ａＦａｂからの軽鎖モデルおよびネズミ科イディオタイプＦａｂ ７３０．１．４（ＰＤＢエントリ１ＩＡＩ）からの重鎖。２つのモデルを、２− 鎖モデルの最小二乗適合操作により合した。ＢＣ２Ｆａｂと得られるプローブの 配列同一性は： Ｖ_L ８４％ Ｃ_L １００％ Ｖ_H ８４％ Ｃ_H１ ９５％ であった。 ＰＤＢ−付着３．０Åヒト化抗−ＣＤ１８抗体Ｆａｂフラグメント（ＰＤＢエ ントリ２ＦＧＷ）から同様なサーチモデルをＳＢ２４９４１７について構築した 。 ＳＢ２４９４１７とサーチモデルの配列同一性は、 Ｖ_L ８１％ Ｃ_L １００％ Ｖ_H ５９％ Ｃ_H１ ９９％ であった。 各モデルにおいて、Ｆａｂのアミノ酸配列のものと異なる残基は、アラニンに 変異していた。 ＢＣ２の場合、クロス−ローテーションサーチを全体の非対称単位を示すこの モデルで行った。オイラー空間を、各次元にて定常的に２．５°増加する、回 θ₂、θ₃はRossmann & Blow(1962)により定義されたオイラー角である。）にお いてサーチした。分解能範囲１５．０〜４．０Åにおけるデータをこのサーチに おいて用いた。回転関数（ＲＦ）の上から６０００個のピークをクラスター解析 に用いた。ついで、ローテーションファンクションの溶液を、ＰＣ精密化、つい で、最も高いＰＣ値を有する溶液の剛体最小化に付した。後者を３工程で行った ：１）剛体として全分子モデルを処理すること、２）重鎖および軽鎖をそれぞれ 剛体として処理すること、３）各鎖の可変（Ｖ_HおよびＶ_L）および定常（Ｃ_H１ およびＣ_L）ドメインを処理すること。 ＳＢ２４９４１７の場合、はじめのセルフ−ローテーションサーチを、球面角 ψ、φ＝１４７、０により定義される非結晶性２倍軸を表す単一溶液に収束した 。ついでＰＣ精密化を行い、非結晶性対称性に関連する２つの溶液が得られた。 ＰＣ精密化（ＢＣ２の場合１つのピーク、ＳＢ２４９４１７の場合、ＮＣＳに 関連する２つのピーク）後の最も高いＲＦピークおよび１５．０〜４．０Åデー タに対応する構造を用いて、トランスレーションサーチを行った。ＢＣ２につい て、サーチはすべての３次元において単位格子の半分に制限された。ＳＢ２４９ ４１７について、ＮＣＳをトランスレーションファンクション溶液に直接適用し 、Ｐ１格子内に他の分子を作成した。各Ｆａｂについて、トランスレーションフ ァンクションのトップ溶液に対応する構造は、ついで上記したように剛体精密化 した。 剛体精密化構造を用いて、ＢＣ２の場合、単結晶データからの反射を相にする か、または、ＳＢ２４９４１７の場合、複数の結晶からの合わせたデータから反 射を相にした。Ｆ₀−Ｆ_cおよび２Ｆ₀−Ｆ_c電子密度マップを計算し、調べた。モ デルを再構築し、ＣＤＲ領域においてマップを適合させ、他には、Ｆａｂの真の アミノ酸配列を用いた。構造をＸ−ＰＬＯＲの促進されたアニーリングプロト める。 すべてのＦａｂフラグメントと同様に、ＢＣ２およびＳＢ２４９４１７Ｆａｂ 構造を、イムノグロブリン折りたたみ構造に従う、４つの球状ドメイン−Ｖ_L、 Ｖ_H、Ｃ_LおよびＣ_H１−の四面体アレイから作成した。各ドメインは、疎水性相 互作用により一緒に保持される逆平行のβ−ストランドの２つの広いシートから なる。ＣＤＲループを、可変温度−ファクター値で整列する。ＢＣ２およびＳＢ ２４９４１７のすべての６個のＣＤＲに属する残基の３次元座標を、それぞれ表 ３〜８および表９〜１４に列記する。図１〜６および７〜１２は、対応する３次 元構造を示す。 本発明は、本発明の精神および本質的な特性から逸脱することなく他の特定の 形態に具体化してもよく、したがって、本発明の範囲を示すものとして、前記明 細書よりもむしろ添付する請求の範囲に言及すべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＢＣ２Ｆａｂフラグメント結晶。 ２． ＢＣ２相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＦａｂフラグメント結晶。 ３． ＣＤＲが表３〜８の座標により特徴付けられる請求項２記載の結晶。 ４． ＳＢ２４９４１７ Ｆａｂフラグメント結晶。 ５． ＣＤＲが表９〜１４の座標により特徴付けられる請求項４記載の結晶。 ６． ａ．請求項１、２または４に記載の結晶由来のＣＤＲ構造パラメーターで 小分子構造データベースをサーチし； ｂ． ＣＤＲ構造パラメーターを模倣する分子構造をデータベースから選択し ； ｃ． 選択した分子構造を合成し； ｄ． 合成した分子を第ＩＸ因子結合活性についてスクリーニングする ことを含む第ＩＸ因子結合活性を有するペプチド模倣物を同定する方法。 ７． 合成した分子をさらに抗血栓活性についてスクリーニングする請求項６記 載の方法。 ８． 合成した分子をさらに自己限定性中和活性についてスクリーニングする請 求項７記載の方法。 ９． 選択した分子構造が、ＣＤＲ残基ＨＣ−Ａｓｎ３５、ＨＣ−Ｔｒｐ５０お よびＬＣ−Ａｒｇ９５のパラメーターを模倣する請求項６記載の方法。 １０． ＢＣ２ ＣＤＲ構造情報を格納したコンピューター読み取り可能媒体。 １１． ＳＢ２４９４１７ ＣＤＲ構造情報を格納したコンピューター読み取り 可能媒体。