JPS61148200A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPS61148200A JPS61148200A JP60278416A JP27841685A JPS61148200A JP S61148200 A JPS61148200 A JP S61148200A JP 60278416 A JP60278416 A JP 60278416A JP 27841685 A JP27841685 A JP 27841685A JP S61148200 A JPS61148200 A JP S61148200A
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- tpa
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
友！上辺上月没１
この発明は、新規なモノクローナル抗体に関するもので
ある。さらに詳細には、この発明は、ヒト組織型プラズ
ミノーゲン活性化因子（以下、ＴＰＡと称する）に対す
るモノクローナル抗体、ＦＴＰ１１６３およびＦＴＰ２
１７に関するものであり、これらの抗体はＴＰＡの酵素
免疫定量法のための試薬およびＴＰＡのアフィニティー
・カラム・クロマトグラフィーのための免疫吸着剤とし
て有用である。
ある。さらに詳細には、この発明は、ヒト組織型プラズ
ミノーゲン活性化因子（以下、ＴＰＡと称する）に対す
るモノクローナル抗体、ＦＴＰ１１６３およびＦＴＰ２
１７に関するものであり、これらの抗体はＴＰＡの酵素
免疫定量法のための試薬およびＴＰＡのアフィニティー
・カラム・クロマトグラフィーのための免疫吸着剤とし
て有用である。
′来のｔ および 明が 決しようとするー 。
ＴＰＡはプラズミノーゲンをプラズミンに酵素的に転換
することができ、ヒト・メラノーマ細胞系の培養物から
得られる公知の酵素である。［ザ・ジャーナル・才ブ・
バイオロジカル・ケミストリー第２５６巻第７０３５頁
（１９８１年）参照］、抗ＴＰＡモノクローナル抗体と
しては、例えば特開昭５９−５１２１号公報に記載され
たものがあるが、これらの抗体は使用上必ずしも満足さ
れるものではなかった。そこで、この発明者等はより優
れた技工ＰＡモノクローナル抗体の創成を企図した。
することができ、ヒト・メラノーマ細胞系の培養物から
得られる公知の酵素である。［ザ・ジャーナル・才ブ・
バイオロジカル・ケミストリー第２５６巻第７０３５頁
（１９８１年）参照］、抗ＴＰＡモノクローナル抗体と
しては、例えば特開昭５９−５１２１号公報に記載され
たものがあるが、これらの抗体は使用上必ずしも満足さ
れるものではなかった。そこで、この発明者等はより優
れた技工ＰＡモノクローナル抗体の創成を企図した。
明の構成および 果
抗ＴＰＡモノクローナル抗体、ＦＴＰ１１６３およびＦ
ＴＰ２１７はマウス・ハイブリドーマ・クローン１−１
６３−３および２−１７−１を培地またはマウスの腹水
中で培養することにより製造きれる。
ＴＰ２１７はマウス・ハイブリドーマ・クローン１−１
６３−３および２−１７−１を培地またはマウスの腹水
中で培養することにより製造きれる。
マウス・バイブリド−７・クローン１−１６３−３およ
び２−１７−１はＴＰＡで感作したマウスの膵臓細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを常法、例えばケーラーとミＪＬ
、７．タイン（Ｋ６ｈｌａｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔａｉ
ｎ）の細胞融合の基本方法［ネイチャー第２５６巻第４
９５頁（１９７５年）参照］により細胞融合して製造す
ることができるが、詳細には、下記実施例を参照された
い。
び２−１７−１はＴＰＡで感作したマウスの膵臓細胞と
マウスの骨髄腫細胞とを常法、例えばケーラーとミＪＬ
、７．タイン（Ｋ６ｈｌａｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔａｉ
ｎ）の細胞融合の基本方法［ネイチャー第２５６巻第４
９５頁（１９７５年）参照］により細胞融合して製造す
ることができるが、詳細には、下記実施例を参照された
い。
上記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリ
ドーマの培養に適した培地であればよく、そのような例
としては、例えばダルベツコ比変法イーグル式最小必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍ
ｅｄｉｕｍ。
ドーマの培養に適した培地であればよく、そのような例
としては、例えばダルベツコ比変法イーグル式最小必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍ
ｅｄｉｕｍ。
以下叶ＨＥＭと略称する）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタ
ミン、２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（例え
ば、ペニシリンＧ５ストレプトマイシン、ゲンタミシン
等）を含有せしめた培地が挙げられる。
ミン、２−メルカプトエタノールおよび抗生物質（例え
ば、ペニシリンＧ５ストレプトマイシン、ゲンタミシン
等）を含有せしめた培地が挙げられる。
この発明のハイブリドーマの培養は、通常、培地中で培
養する時には３７°Ｃで２〜４日間、またマウスの腹腔
内で培養する時には７−２０日間程度で行なわれる。
養する時には３７°Ｃで２〜４日間、またマウスの腹腔
内で培養する時には７−２０日間程度で行なわれる。
このようにして製造されたモノクローナル抗体は培養物
またはマウスの腹水から、蛋白質の単離、精製の常法に
より分離、精製および採取することができる。そのよう
な方法としては、例えば遠心分離、透析、硫安塩析、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースを用いるカラム・クロマトグラフィ
ー、ゲル［例えば、セファロース４Ｂ、セファデックス
（商１１１、ファルマシアφファイン・ケミカルブＡｇ
社製）等］を用いるゲル濾過法、プロティンＡ−セファ
ロースＣＬ−４Ｂ（商標、ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ社製）、結晶化等が挙げられる。
またはマウスの腹水から、蛋白質の単離、精製の常法に
より分離、精製および採取することができる。そのよう
な方法としては、例えば遠心分離、透析、硫安塩析、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースを用いるカラム・クロマトグラフィ
ー、ゲル［例えば、セファロース４Ｂ、セファデックス
（商１１１、ファルマシアφファイン・ケミカルブＡｇ
社製）等］を用いるゲル濾過法、プロティンＡ−セファ
ロースＣＬ−４Ｂ（商標、ファルマシア・ファイン・ケ
ミカルズ社製）、結晶化等が挙げられる。
このようにして得られた抗ＴＰＡモノクローナル抗体Ｆ
ＴＰ１１６３およびＦＴＰ２１７はＴＰＡに対する結合
活性を有しＴＰＡの精製に用いる免疫吸着剤およびＴＰ
Ａの免疫定量用の試薬として有用である。
ＴＰ１１６３およびＦＴＰ２１７はＴＰＡに対する結合
活性を有しＴＰＡの精製に用いる免疫吸着剤およびＴＰ
Ａの免疫定量用の試薬として有用である。
この発明の抗ＴＰＡモノクローナル抗体をＴＰＡの精製
に使用するには、まず、抗ＴＰＡモノクローナル抗体、
ＦＴＰ１１６３またはＦＴＰ２１７を活性化された多糖
類［例えば、シアン化臭素−活性化セファロース４Ｂ（
商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）等コ
と常法により反応させ、ＦＴＰ１１６３またはＦＴＰ２
１７結合多糖類を調製し、これを用いて、カラム式また
はバッチ式でＴＰＡを常法により精製すればよい。
に使用するには、まず、抗ＴＰＡモノクローナル抗体、
ＦＴＰ１１６３またはＦＴＰ２１７を活性化された多糖
類［例えば、シアン化臭素−活性化セファロース４Ｂ（
商標、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）等コ
と常法により反応させ、ＦＴＰ１１６３またはＦＴＰ２
１７結合多糖類を調製し、これを用いて、カラム式また
はバッチ式でＴＰＡを常法により精製すればよい。
さらに、抗ＴＰＡモノクローナル抗体、ＦＴＰ１１６３
およびＦＴＰ２１７はＴＰＡの酵素免疫定量法（ＥＩＡ
）および放射能免疫定量法（ＲＩＡ）における試薬と
して使用できる。この免疫定量法は常法により行なうこ
とができ、酵素免疫定量法としては、マイクロタイター
・プレートを用いるワンステップ・サンドイッチ酵素免
疫定量法が好適な例として挙げられる。この方法ではＴ
ＰＡの異なった部位に結合する２種類のモノクローナル
抗体が用いられる。
およびＦＴＰ２１７はＴＰＡの酵素免疫定量法（ＥＩＡ
）および放射能免疫定量法（ＲＩＡ）における試薬と
して使用できる。この免疫定量法は常法により行なうこ
とができ、酵素免疫定量法としては、マイクロタイター
・プレートを用いるワンステップ・サンドイッチ酵素免
疫定量法が好適な例として挙げられる。この方法ではＴ
ＰＡの異なった部位に結合する２種類のモノクローナル
抗体が用いられる。
まず第一に、一種類の抗ＴＰＡモノクローナル抗体（例
えばＦＴＰ１１６３）を酵素（例えばペルオキシダーゼ
等）で常法（例えば、ジャーナル・才ブ・ヒストケミス
トリー・アンド・サイトケミストリー第２２巻第１０８
４頁（１９７４年）参照）により標識する。他方、固相
（例えば、マイクロタイター・プレートの穴、ビーズ等
）を別種の抗ＴＰＡモノクローナル抗体（例えばＦＴＰ
２１７）で感作した後さらに他の蛋白質（例えば牛血清
アルブミン、オブナルブミン等）で被覆する。
えばＦＴＰ１１６３）を酵素（例えばペルオキシダーゼ
等）で常法（例えば、ジャーナル・才ブ・ヒストケミス
トリー・アンド・サイトケミストリー第２２巻第１０８
４頁（１９７４年）参照）により標識する。他方、固相
（例えば、マイクロタイター・プレートの穴、ビーズ等
）を別種の抗ＴＰＡモノクローナル抗体（例えばＦＴＰ
２１７）で感作した後さらに他の蛋白質（例えば牛血清
アルブミン、オブナルブミン等）で被覆する。
次いで、この固相とＴＰＡを含有する被検体および上記
酵素標識した抗ＴＰＡモノクローナル抗体を接触させ、
次いで、同相を４−２４時間室温で放置した後、水性溶
媒（例えば緩衝液等）で洗浄する。得られた固相につい
て常法により酵素反応を行ない、固相の酵素活性を測定
した後、被検体中のτＰＡ濃度をＴＰＡの標準品を用い
て前もって作成しておいた標準曲線と対比して決定する
。
酵素標識した抗ＴＰＡモノクローナル抗体を接触させ、
次いで、同相を４−２４時間室温で放置した後、水性溶
媒（例えば緩衝液等）で洗浄する。得られた固相につい
て常法により酵素反応を行ない、固相の酵素活性を測定
した後、被検体中のτＰＡ濃度をＴＰＡの標準品を用い
て前もって作成しておいた標準曲線と対比して決定する
。
次に、実施例によりこの発明を説明する。６なお、実施
例でＴＰＡ活性は次の方法により測定された。
例でＴＰＡ活性は次の方法により測定された。
ＴＰＡ （またはウロキナーゼ ｔ の゛ 法ＴＰＡ
（またはウロキナーゼ）活性はフィブリン平板法により
測定された。すなわち、少量のプラスミノーゲン［生化
学工業株式会社製、りん酸根新液（ｐＨ７，２）に１２
ｍｇ／Ｉｌｌの濃度で溶解されたものコとトロンビン［
持田製薬株式会社、リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）にｔｏ
ｕ／＋ｎｉの濃度で溶解したものコを１＝１の割合で混
合したもの１０ｍ１１をプラスチック・プレート（内径
： ８５１１＋１ ”）に展開、固化する。
（またはウロキナーゼ）活性はフィブリン平板法により
測定された。すなわち、少量のプラスミノーゲン［生化
学工業株式会社製、りん酸根新液（ｐＨ７，２）に１２
ｍｇ／Ｉｌｌの濃度で溶解されたものコとトロンビン［
持田製薬株式会社、リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）にｔｏ
ｕ／＋ｎｉの濃度で溶解したものコを１＝１の割合で混
合したもの１０ｍ１１をプラスチック・プレート（内径
： ８５１１＋１ ”）に展開、固化する。
上記で調製したフィブリン平板の各々にモノクローナル
抗体を含有する被検体１０縛を滴下する。
抗体を含有する被検体１０縛を滴下する。
平板を３７°Ｃ−Ｃ’−夜装置し、次いで、フィブリン
クロットにおける溶解領域の面積からＴＰＡ活性を計算
する。
クロットにおける溶解領域の面積からＴＰＡ活性を計算
する。
抗体活性を次の共沈殿法および中和法により測定した。
（１）共沈殿法
ＴＰＡとモノクローナル抗体を含有する被検体の混合物
を３７°Ｃで２時間加温した後、この反応液にマウス免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（担体）およびウサギ抗マウ
スＩｇＧを加える０反応液を３７℃で１時間加温し、４
０℃で一夜放置する。沈殿物を遠心して除去し、上澄液
中の残存ＴＰＡ活性を上記フィブリン平板法で測定する
。
を３７°Ｃで２時間加温した後、この反応液にマウス免
疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（担体）およびウサギ抗マウ
スＩｇＧを加える０反応液を３７℃で１時間加温し、４
０℃で一夜放置する。沈殿物を遠心して除去し、上澄液
中の残存ＴＰＡ活性を上記フィブリン平板法で測定する
。
（ｉ）中和法
ＴＰＡとモノクローナル抗体を含有する被検体との混合
物を３７℃で２時間加温した後、反応液中の残存ＴＰＡ
活性を上記フィブリン平板法により測定した。
物を３７℃で２時間加温した後、反応液中の残存ＴＰＡ
活性を上記フィブリン平板法により測定した。
’！ＵＡＪ！ＬＬ
（ａ）免疫した膵臓細胞の調製：
ＢＡＬＢ／ｃ系雌マウス（６退会）に部分精製ＴＰＡ（
純Ｊｉ ： ３７．５％、ヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｕ
ｔｓの培養上清から得られたもの）３１．８４およびフ
ロイトの完全アジュバント０．２５１１の混合物を腹腔
内注射した（第１回免疫）、第１回免疫から２４日経過
後、同じマウスに上記と同じＴＰＡ３１．８ＭＥとフロ
イントの不完全アジュバント０．２５１１の混合物を腹
腔内注射した（第２回免疫）。
純Ｊｉ ： ３７．５％、ヒトメラノーマ細胞系Ｂｏｕ
ｔｓの培養上清から得られたもの）３１．８４およびフ
ロイトの完全アジュバント０．２５１１の混合物を腹腔
内注射した（第１回免疫）、第１回免疫から２４日経過
後、同じマウスに上記と同じＴＰＡ３１．８ＭＥとフロ
イントの不完全アジュバント０．２５１１の混合物を腹
腔内注射した（第２回免疫）。
第２回免疫の１６日経過後、同じマウスに上記と同じＴ
ＰＡ１８．７ ｇを簀有する生理食塩水０．３ＩＱを静
脈内注射した（第３回免疫）。
ＰＡ１８．７ ｇを簀有する生理食塩水０．３ＩＱを静
脈内注射した（第３回免疫）。
第３回免疫の１日経過後、同じマウスに上記と同じＴＰ
Ａｌｌ、２Ｋを含む生理食塩水０．２−を静脈内注射し
た（最終免疫）。
Ａｌｌ、２Ｋを含む生理食塩水０．２−を静脈内注射し
た（最終免疫）。
最終免疫の４日経過後に、肺臓細胞（２，５Ｘ １０８
細胞数）をマウスから採取し、細胞融合“に供した。
細胞数）をマウスから採取し、細胞融合“に供した。
（ｂ）ハイブリドーマ１−１６３−３の調製：上記で調
製した免疫した肺臓細胞と佐賀医大の渡辺教授から入手
したマウス骨髄腫細胞ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・０１ （Ｐ３
Ｕ１ ）とをケーラーとミルスタインの方法［ネイチャ
ー第２５６巻第４９５頁（１９７５年）参照］により融
合した。すなわち、免疫した肺臓細胞をＤ−ＭＥＭに懸
濁した。懸濁液中の赤血球は０．８３％塩化アンモニウ
ム緩衝液（９容量）と０．１７Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，６５） （１容量）との混液で４℃、５分間処
理することにより破壊し、遠心分離により除去した。肺
臓細胞の懸濁液と１５％ウシ胎児血清を添加した叶ＭＥ
Ｍで培養したマウス骨髄腫細胞Ｐ３ Ｘ ６３Ａｇ８・
Ｕｌの培養物をそれぞれ同じ培地で数回洗浄した。マウ
ス骨髄腫細胞Ｐ３ Ｘ ６３Ａｇ８・Ｕｌ（５ＸＬＯ細
胞数）の懸濁液にＴＰＡで免疫した肺臓細胞（２，５Ｘ
１０８細胞数）の懸濁液を加えた。この混合物を５０
ｆｆｌｊｌ容プラスチツク製試験管中で充分に混合した
６次いで遠心分離して培地を除去し、残渣を水浴中（３
７℃）で加温し、これに３７°Ｃに加温した４５％（賀
／Ｖ）ポリエチＬングリコール溶液（シグマ社製、平均
分子量：４０００）（１１１１）を１分間を要して攪拌
下体々に加えた０反応液を７分間３７℃で静置した後、
これに５分間を要してＤ−ＭＥＭ （３７℃、’ １５
−）を滴下して細胞融合反応を停止させた。大量のＤ−
１１！ＥＭを反応液に加えた後、反応液を遠心分離ｃ、
１．０００ｒｐｍＸ １０分）して上澄液を除去した
。残渣に１５％ウシ胎児血清を添加、したＤ−ＭＥＭを
加え、次いで軽−く混和した後、２４穴プラ胞！ｌＸ１
０ 個となるように１ｍｉずつ分注した。
製した免疫した肺臓細胞と佐賀医大の渡辺教授から入手
したマウス骨髄腫細胞ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・０１ （Ｐ３
Ｕ１ ）とをケーラーとミルスタインの方法［ネイチャ
ー第２５６巻第４９５頁（１９７５年）参照］により融
合した。すなわち、免疫した肺臓細胞をＤ−ＭＥＭに懸
濁した。懸濁液中の赤血球は０．８３％塩化アンモニウ
ム緩衝液（９容量）と０．１７Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，６５） （１容量）との混液で４℃、５分間処
理することにより破壊し、遠心分離により除去した。肺
臓細胞の懸濁液と１５％ウシ胎児血清を添加した叶ＭＥ
Ｍで培養したマウス骨髄腫細胞Ｐ３ Ｘ ６３Ａｇ８・
Ｕｌの培養物をそれぞれ同じ培地で数回洗浄した。マウ
ス骨髄腫細胞Ｐ３ Ｘ ６３Ａｇ８・Ｕｌ（５ＸＬＯ細
胞数）の懸濁液にＴＰＡで免疫した肺臓細胞（２，５Ｘ
１０８細胞数）の懸濁液を加えた。この混合物を５０
ｆｆｌｊｌ容プラスチツク製試験管中で充分に混合した
６次いで遠心分離して培地を除去し、残渣を水浴中（３
７℃）で加温し、これに３７°Ｃに加温した４５％（賀
／Ｖ）ポリエチＬングリコール溶液（シグマ社製、平均
分子量：４０００）（１１１１）を１分間を要して攪拌
下体々に加えた０反応液を７分間３７℃で静置した後、
これに５分間を要してＤ−ＭＥＭ （３７℃、’ １５
−）を滴下して細胞融合反応を停止させた。大量のＤ−
１１！ＥＭを反応液に加えた後、反応液を遠心分離ｃ、
１．０００ｒｐｍＸ １０分）して上澄液を除去した
。残渣に１５％ウシ胎児血清を添加、したＤ−ＭＥＭを
加え、次いで軽−く混和した後、２４穴プラ胞！ｌＸ１
０ 個となるように１ｍｉずつ分注した。
５％次酸ガス雰囲気中３７℃で加温し、１日経過後、各
穴にＨＡＴ培地（アミノプテリン（４ＸｌＯＭ）、チミ
ジン（１，６ＸｌＯＭ、）およびヒポキサンチン（ＩＸ
ＩＯＭ）を添加した１５％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥ
Ｍ ） （Ｉ ｍ１１ ）を加えた。２週間培養中、２
〜３日ごとに培地の半量を吸引除去し、上記ＨＡＴ培地
を加えた０次いで、各穴の培地の半量を６丁培地（１５
％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにチミジン１．６Ｘ
１Ｇ−５Ｍ、ヒポキサンチンＩ Ｘ １０−’Ｍになる
ように添加したもの）と交換した。さらにその２日後か
ら２〜３日ごとに培地の半量を１５％ウシ胎児血清を含
むＤ−ＭＥＭと交換した。
穴にＨＡＴ培地（アミノプテリン（４ＸｌＯＭ）、チミ
ジン（１，６ＸｌＯＭ、）およびヒポキサンチン（ＩＸ
ＩＯＭ）を添加した１５％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥ
Ｍ ） （Ｉ ｍ１１ ）を加えた。２週間培養中、２
〜３日ごとに培地の半量を吸引除去し、上記ＨＡＴ培地
を加えた０次いで、各穴の培地の半量を６丁培地（１５
％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにチミジン１．６Ｘ
１Ｇ−５Ｍ、ヒポキサンチンＩ Ｘ １０−’Ｍになる
ように添加したもの）と交換した。さらにその２日後か
ら２〜３日ごとに培地の半量を１５％ウシ胎児血清を含
むＤ−ＭＥＭと交換した。
細胞融合の３週間後、はとんど全ての穴の中に、雑種細
胞の増殖が見られたので各穴の培養上清の抗ＴＰＡ活性
を上記共沈殿法により測定した。
胞の増殖が見られたので各穴の培養上清の抗ＴＰＡ活性
を上記共沈殿法により測定した。
その結果、なんの溶解領域も示さない培養上清を抗ＴＰ
Ａモノクローナル抗体産生ハイプリドーマのそれと判断
した。
Ａモノクローナル抗体産生ハイプリドーマのそれと判断
した。
（Ｃ）抗ＴＰ＾抗体産生ハイプリドーマのクローン化：
抗ｒＰＡ抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞培養物をＢ
ＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞（４ＸＩＯ６細胞数／１ｕｌ
ｌ）をフィーダ一層として用いる９６穴平底マイクロプ
レート（ＮＵＮＣ）を用いる限界希釈法によりクローン
化した。得られたハイプリドーマ・クローンを１−１８
３−３と命名した。またハイプリドーマ・クローン１−
１６３−３により産生されるモノクローナル抗体をＦＴ
Ｐ１１６３と命名した。
抗ｒＰＡ抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞培養物をＢ
ＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞（４ＸＩＯ６細胞数／１ｕｌ
ｌ）をフィーダ一層として用いる９６穴平底マイクロプ
レート（ＮＵＮＣ）を用いる限界希釈法によりクローン
化した。得られたハイプリドーマ・クローンを１−１８
３−３と命名した。またハイプリドーマ・クローン１−
１６３−３により産生されるモノクローナル抗体をＦＴ
Ｐ１１６３と命名した。
！（モノクローナル抗体の産生）
マウスにテトラメチルペンタデカン（０，５１１１）を
腹腔的注射した。注射後７〜３０日目に、マウスにリン
酸緩衝食塩水（ｐＨ７，２）で十分に洗浄したマウス・
ハイプリドーマ・クローン１−１６３−３（投与量：
５−１０ｘ ｌｏ６＃Ｉ［Ｉ胞ｆｉｔ ） ヲＭ１ｍ内
接種した。
腹腔的注射した。注射後７〜３０日目に、マウスにリン
酸緩衝食塩水（ｐＨ７，２）で十分に洗浄したマウス・
ハイプリドーマ・クローン１−１６３−３（投与量：
５−１０ｘ ｌｏ６＃Ｉ［Ｉ胞ｆｉｔ ） ヲＭ１ｍ内
接種した。
７−２０日経過後、腹水をマウス腹膜腔より集めた。腹
水１容量に対して１容量のりん酸根衝化生理食塩水（ｐ
Ｈ７，２）および２容量の硫安飽和溶液を加えた。混合
物を水冷下撹拌し、３０分間静置する。遠心分離後、残
渣を１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対して充分
に透析し、１０ａ＋Ｍりん酸根、新液（ｐＨ８，０）で
平衡化したＤＥＡＥ−セルロースを使用するカラム・ク
ロマトグラフィーに付す、カラムを１０ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ８，０）と１５０ｍＭ塩化ナトリウムを添加し
た１０ＩＩＩＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）との間の連
続イオン匂配溶出法で溶出して、抗ＴＰＡモノクローナ
ル抗体、ＦＴＰ１１６３を含む画分を得る。
水１容量に対して１容量のりん酸根衝化生理食塩水（ｐ
Ｈ７，２）および２容量の硫安飽和溶液を加えた。混合
物を水冷下撹拌し、３０分間静置する。遠心分離後、残
渣を１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）に対して充分
に透析し、１０ａ＋Ｍりん酸根、新液（ｐＨ８，０）で
平衡化したＤＥＡＥ−セルロースを使用するカラム・ク
ロマトグラフィーに付す、カラムを１０ｍＭりん酸緩衝
液（ｐＨ８，０）と１５０ｍＭ塩化ナトリウムを添加し
た１０ＩＩＩＭりん酸緩衝液（ｐＨ８，０）との間の連
続イオン匂配溶出法で溶出して、抗ＴＰＡモノクローナ
ル抗体、ＦＴＰ１１６３を含む画分を得る。
！（免疫グロブリン・クラスの同定）
抗τＰＡモノクローナル抗体の免疫グロブリン・クラス
の同定はオフタロニー・二重免疫拡散法により行なわれ
た。結果は表１に示す通りである。
の同定はオフタロニー・二重免疫拡散法により行なわれ
た。結果は表１に示す通りである。
表１
！ｕｕＬｉ（アフィニティー響クロマトグラフィー）上
記で得られたモノクローナル抗体ＦＴＰ１１６３．２、
２ａ＋ｇをＣＮＢｒ−活性化セファロース４ＢＯ，ｆｉ
−に結合させたものを免疫吸着剤として使用した。ＴＰ
Ａを２３υ／絨含有するヒト・メラノーマ細胞系Ｂｏｗ
ｅｓの培養上清（ｔｉａｏｍ ）をＦＴＰ１１６３が結
合したセファロース４Ｂカラ云・クロマトグラフィーに
付す、カラムを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）ならびに１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％トリト
ンＸ−１００（界面活性剤、商標、半井薬品株式会社販
売）を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０
）で順次洗浄し、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１
％トリトンＸ −１００を含む０．１Ｍグリシン−塩酸
緩衝液（ｐＨ２，５）で溶出する。 ＴＰＡを含む主要
画分をＴＰＡの失活を防ぐために１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ９，０） （ｏ、１ｍｍ）を含むシリコン被覆
試験管（５ｍ１）に集め、直ちに中和する。
記で得られたモノクローナル抗体ＦＴＰ１１６３．２、
２ａ＋ｇをＣＮＢｒ−活性化セファロース４ＢＯ，ｆｉ
−に結合させたものを免疫吸着剤として使用した。ＴＰ
Ａを２３υ／絨含有するヒト・メラノーマ細胞系Ｂｏｗ
ｅｓの培養上清（ｔｉａｏｍ ）をＦＴＰ１１６３が結
合したセファロース４Ｂカラ云・クロマトグラフィーに
付す、カラムを０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）ならびに１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％トリト
ンＸ−１００（界面活性剤、商標、半井薬品株式会社販
売）を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ）１８．０
）で順次洗浄し、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１
％トリトンＸ −１００を含む０．１Ｍグリシン−塩酸
緩衝液（ｐＨ２，５）で溶出する。 ＴＰＡを含む主要
画分をＴＰＡの失活を防ぐために１Ｍトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ９，０） （ｏ、１ｍｍ）を含むシリコン被覆
試験管（５ｍ１）に集め、直ちに中和する。
結果を次表２に示す。
表２
７（ＴＰＡとウロキナーゼの結合活性）ｒＰＡ標品（３
２Ｕ／ＩＩＱ ）またはウロキナーゼ（ウロキナーゼ注
“ワカモト”、藤沢薬品工業株式会社販売、ヒト尿から
得られたウロキナーゼ）（７，３Ｕ／＋１１１１）を３
０縛とり、これとモノクローナル抗体Ｆ’ｌｐＨ６３の
溶液（１５縛）とを混合する。
２Ｕ／ＩＩＱ ）またはウロキナーゼ（ウロキナーゼ注
“ワカモト”、藤沢薬品工業株式会社販売、ヒト尿から
得られたウロキナーゼ）（７，３Ｕ／＋１１１１）を３
０縛とり、これとモノクローナル抗体Ｆ’ｌｐＨ６３の
溶液（１５縛）とを混合する。
混合物を上記共沈殿法および中和法に付す。
この試験の結果として、モノクローナル抗体ＦＩＰ１１
６３（１４”）は完全にＴＰＡと結合しかつ完全にＴＰ
Ａ活性を阻害した。この結果から、 ＦＩＰ１１６３は
ＴＰＡの活性部位に結合していることが分かる。他方、
同じ抗体は高濃度（１０ｘ／１５４ ）においてさえ、
ウロキナーゼと結合せずウロキナーゼ活性を阻害しなか
った。
６３（１４”）は完全にＴＰＡと結合しかつ完全にＴＰ
Ａ活性を阻害した。この結果から、 ＦＩＰ１１６３は
ＴＰＡの活性部位に結合していることが分かる。他方、
同じ抗体は高濃度（１０ｘ／１５４ ）においてさえ、
ウロキナーゼと結合せずウロキナーゼ活性を阻害しなか
った。
衷ｍ旦
（ａ）実施例１と同様の方法でマウス・ハイブリドーマ
・クローン２−１７−１を製造した。
・クローン２−１７−１を製造した。
（ｂ）実施例２と同様の方法で抗τＰＡモノクローナル
抗体ＦＴＰ２１７を製造した。
抗体ＦＴＰ２１７を製造した。
（Ｃ）実施例３と同様にして抗ＴＰＡモノクローナル抗
体、ＦＴＰ２１７の免疫グロブリン・クラスを測定した
。結果を次表３に示す。
体、ＦＴＰ２１７の免疫グロブリン・クラスを測定した
。結果を次表３に示す。
表３
（ｄ）モノクローナル抗体ＦＴＰ２１７のＴＰＡおよび
ウロキナーゼに対する結合活性を実施例５と同様にして
測定した。この試験の結果として、モノクローナル抗体
ＦＴＰ２１７（１４）はＴＰＡに完全に結合し、部分的
（約５０％）にτＰＡ活性を阻害した。この結果からモ
ノクローナル抗体ＦＴＰ２１７はＴＰＡの活性部位に結
合していることが分かる。また同じ抗体はｆｏｘ／１５
Ｐｄ１の高濃度においてさえ、ウロキナーゼと結合しな
いしかつウロキナーゼ活性を阻害しなかった。
ウロキナーゼに対する結合活性を実施例５と同様にして
測定した。この試験の結果として、モノクローナル抗体
ＦＴＰ２１７（１４）はＴＰＡに完全に結合し、部分的
（約５０％）にτＰＡ活性を阻害した。この結果からモ
ノクローナル抗体ＦＴＰ２１７はＴＰＡの活性部位に結
合していることが分かる。また同じ抗体はｆｏｘ／１５
Ｐｄ１の高濃度においてさえ、ウロキナーゼと結合しな
いしかつウロキナーゼ活性を阻害しなかった。
別途研究（例えば、合成基質に対するモノクローナル抗
体−結合τＰＡの酵素活性についての研究）から、モノ
クローナル抗体ＦＴＰ１１６３とＦＴＰ２１７の結合部
位は互いに異なることが見い出された。
体−結合τＰＡの酵素活性についての研究）から、モノ
クローナル抗体ＦＴＰ１１６３とＦＴＰ２１７の結合部
位は互いに異なることが見い出された。
東五輿↓（ＴＰＡのワンステップ・サンドインチ酵素免
疫定量法） 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（タイプ■、シグマ社製
）を抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＦＴｐＨ６３に結合さ
せる方法はナカネ等の方法［ジャーナル・才ブ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー第２２巻第
１０８４〜１０９１頁（１９７４年）参照］に準じて行
ない、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合ＦＴＰ１１６
３（ＰＯＤ−結合ＦＴＰ１１６３）を得た。もう一つの
モノクローナル抗体ＦＴＰ２１７を５０ｍＭ炭酸緩衝液
（ｐＨ９，３）にＩＯＭＥ／Ｉｌｌの濃度で溶解し、９
６穴マイクロタイター・プレート中で１時間室温で静置
する。そのプレートを０．２％ウシ血清アルブミンおよ
び０．０５％ツイン２０を含むりん酸根衝化生理食塩水
（ｐＨ７，２） （ＢＴ−ＰＢＳ ）で３回洗浄した。
疫定量法） 西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（タイプ■、シグマ社製
）を抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＦＴｐＨ６３に結合さ
せる方法はナカネ等の方法［ジャーナル・才ブ・ヒスト
ケミストリー・アンド・サイトケミストリー第２２巻第
１０８４〜１０９１頁（１９７４年）参照］に準じて行
ない、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合ＦＴＰ１１６
３（ＰＯＤ−結合ＦＴＰ１１６３）を得た。もう一つの
モノクローナル抗体ＦＴＰ２１７を５０ｍＭ炭酸緩衝液
（ｐＨ９，３）にＩＯＭＥ／Ｉｌｌの濃度で溶解し、９
６穴マイクロタイター・プレート中で１時間室温で静置
する。そのプレートを０．２％ウシ血清アルブミンおよ
び０．０５％ツイン２０を含むりん酸根衝化生理食塩水
（ｐＨ７，２） （ＢＴ−ＰＢＳ ）で３回洗浄した。
このようにして抗体を感作したプレートの穴にＰＯＤ−
結合ＦＴＰ１１６３のＢＴ−ＰＢＳ（２０（１４１）溶
液とＴＰＡのＢＴ−ＰＢＳ（５０４）試験液とを入れる
。プレートを室温で４時間静置した後ＢＹ−ＰＢＳで３
回洗浄した０次いで基質溶液（０，１Ｍクエン酸−りん
酸根新液（ｐＨ４，５）に０−フェニレンジアミン・２
塩酸塩を２．５ｍｇ／ｍＱおよび過酸化水素をｏ、ｏｔ
ｓ％溶解した液） ２００４ずつをプレートの各穴に添
加した。室温にて３０分間靜静置ＩＮ塩＃５０縛を添加
することにより反応を停止した。各穴の残存液の４９０
ｎｓｉにおける吸光度を測定した。被検体中のＴＰＡの
量は同時に行なった検量用ＴＰＡを用いて作成した検量
曲線から求めた。この酵素免疫定量法により被検体中の
１〜１１００ｎ／ＩＱのＴＰＡを検出することができた
。
結合ＦＴＰ１１６３のＢＴ−ＰＢＳ（２０（１４１）溶
液とＴＰＡのＢＴ−ＰＢＳ（５０４）試験液とを入れる
。プレートを室温で４時間静置した後ＢＹ−ＰＢＳで３
回洗浄した０次いで基質溶液（０，１Ｍクエン酸−りん
酸根新液（ｐＨ４，５）に０−フェニレンジアミン・２
塩酸塩を２．５ｍｇ／ｍＱおよび過酸化水素をｏ、ｏｔ
ｓ％溶解した液） ２００４ずつをプレートの各穴に添
加した。室温にて３０分間靜静置ＩＮ塩＃５０縛を添加
することにより反応を停止した。各穴の残存液の４９０
ｎｓｉにおける吸光度を測定した。被検体中のＴＰＡの
量は同時に行なった検量用ＴＰＡを用いて作成した検量
曲線から求めた。この酵素免疫定量法により被検体中の
１〜１１００ｎ／ＩＱのＴＰＡを検出することができた
。
Claims (4)
- （１）ＦＴＰ１１６３およびＦＴＰ２１７から選ばれた
抗ＴＰＡモノクローナル抗体。 - （２）マウス・ハイブリドーマ・クローン１−１６３−
３または２−１７−１を培地またはマウスの腹水中で培
養し、得られる培養物から抗ＴＰＡモノクローナル抗体
ＦＴＰ１１６３またはＦＴＰ２１７を採取することを特
徴とする抗ＴＰＡモノクローナル抗体ＦＴＰ１１６３お
よびＦＴＰ２１７の製造法。 - （３）クローン１−１６３−３および２−１７−１から
選ばれたマウス・ハイブリドーマ・クローン。 - （４）モノクローナル抗体を用いるＴＰＡのワンステッ
プ・サンドイッチ酵素免疫定量法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848432502A GB8432502D0 (en) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | Monoclonal antibody |
| GB8432502 | 1984-12-21 | ||
| GB8507781 | 1985-03-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61148200A true JPS61148200A (ja) | 1986-07-05 |
Family
ID=10571648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60278416A Pending JPS61148200A (ja) | 1984-12-21 | 1985-12-10 | モノクローナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61148200A (ja) |
| GB (1) | GB8432502D0 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01112157A (ja) * | 1987-07-10 | 1989-04-28 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS595121A (ja) * | 1982-06-11 | 1984-01-12 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | モノクロナル抗体 |
-
1984
- 1984-12-21 GB GB848432502A patent/GB8432502D0/en active Pending
-
1985
- 1985-12-10 JP JP60278416A patent/JPS61148200A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS595121A (ja) * | 1982-06-11 | 1984-01-12 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | モノクロナル抗体 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01112157A (ja) * | 1987-07-10 | 1989-04-28 | Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd | 組織プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定法，測定具及び測定用キット |
| JPH0588783B2 (ja) * | 1987-07-10 | 1993-12-24 | Yamanouchi Pharma Co Ltd |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB8432502D0 (en) | 1985-02-06 |
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