ES2582001T3

ES2582001T3 - Molécula que se une a antígeno y usos de la misma

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Publication number: ES2582001T3
Application number: ES10154751.1T
Authority: ES
Inventors: Melvyn Little; Fabrice Le Gall
Original assignee: Affimed GmbH
Current assignee: Affimed GmbH
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2010-02-25
Publication date: 2016-09-08
Anticipated expiration: 2030-02-25
Also published as: LT2371866T; HRP20190288T1; PL2371866T3; EP2371866B1; RS58352B1; HUE041615T2; PT2371866T; ES2711377T3; EP2371866A2; SI2371866T1; PL2361936T3; PT2361936T; EP2371866A3; EP2361936B1; TR201902400T4; EP2361936A1; LT2361936T; DK2371866T3

Abstract

Una molécula dímera que se une a antígeno específica de CD3 y CD19, compuesta por una primera y una segunda cadena polipeptídica, comprendiendo cada una de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas - un primer dominio VLA que es un dominio variable de cadena ligera específico de CD3; - un segundo dominio VHB que es un dominio variable de cadena pesada específico de CD19; - un tercer dominio VLB que es un dominio variable de cadena ligera específico de CD19; y - un cuarto dominio VHA que es un dominio variable de cadena pesada específico de CD3, en donde - en la primera y la segunda cadena polipeptídica el primer dominio VLA está enlazado con el segundo dominio VHB a través de un primer enlazador L1, el segundo dominio VHB está enlazado con el tercer dominio VLB a través de un segundo enlazador L2 y el tercer dominio VLB está enlazado con el cuarto dominio VHA a través de un tercer enlazador L3, en donde los enlazadores L1, L2 y L3 consisten en 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de aminoácidos, - dichos dominios están dispuestos en cada una de dichas primera y segunda cadenas polipeptídicas en el orden VLA-VHB-VLB-VHA desde el extremo N-terminal al C-terminal de dichas cadenas polipeptídicas en una orientación que evita el emparejamiento intramolecular, y - el primer dominio VLA de la primera cadena polipeptídica está asociado con el cuarto dominio VHA de la segunda cadena polipeptídica para formar un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno A; - el segundo dominio VHB de la primera cadena polipeptídica está asociado con el tercer dominio VLB de la segunda cadena polipeptídica para formar un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno B; - el tercer dominio VLB de la primera cadena polipeptídica está asociado con el segundo dominio VHB de la segunda cadena polipeptídica para formar un sitio de unión a antígeno para el segundo antígeno B; y - el cuarto dominio VHA de la primera cadena polipeptídica está asociado con el primer dominio VLA de la segunda cadena polipeptídica para formar un sitio de unión a antígeno para el primer antígeno A.

Description

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tido idéntico a una molécula dímera que se une a antígeno que tiene seis sitios de unión a antígeno. En otro aspecto, un dominio variable adicional de inmunoglobulina puede estar fusionado con una de las cadenas polipeptídicas de la molécula que se une a antígeno, que se asocia entonces de forma no covalente con un dominio variable complementario de inmunoglobulina con la misma especificidad que un tercer polipéptido adicional, formando de este modo un sitio de unión a antígeno adicional entre la molécula dímera que se une a antígeno y el tercer polipéptido adicional. En otro aspecto, una unidad adicional que se une a antígeno que incluye un scFv o un diacuerpo, puede estar enlazada como una unidad funcional adicional a la molécula dímera que se une a antígeno.

En un cierto aspecto, la unidad funcional adicional puede ser al menos una molécula dímera adicional que se une a antígeno, tal y como se describe en el presente documento. Por consiguiente, dos o más moléculas dímeras que se unen a antígeno de acuerdo con la invención pueden estar unidas entre sí para aumentar la valencia y la avidez de las moléculas que se unen a antígeno.

En otro aspecto, la unidad funcional adicional puede ser un dominio efector que incluye un dominio Fc, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio bisagra o un fragmento de los mismos. Una unidad de este tipo puede conferir propiedades efectoras a la molécula que se une a antígeno en el caso de unión a receptores Fc. Tales unidades funcionales se pueden emplear adicionalmente para aumentar la semivida en suero de la molécula que se une a antígeno.

En otro aspecto, la unidad funcional adicional puede ser una enzima. En el caso en el que la enzima es capaz de convertir un profármaco en un fármaco activo, una molécula que se une a antígeno de este tipo se puede utilizar en una terapia con enzima para profármaco dependiente de anticuerpo (ADEPT). Para ello, la molécula que se une a antígeno dirige a la enzima hacia el tejido de interés y cuando la molécula que se une a antígeno se une al tejido, el profármaco se activa en ese sitio.

En otro aspecto, la unidad funcional puede ser un fármaco, una toxina, un radioisótopo, una linfocina, una quimiocina

o una molécula marcada. Una molécula que se une a antígeno de este tipo entrega la unidad funcional en el sitio de acción deseado. Por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico ligado a una molécula que se une a antígeno que es específica de un antígeno tumoral, se puede administrar a una célula tumoral y las toxinas se pueden administrar a agentes patógenos o células tumorales. Ejemplos de toxinas son, pero no se limitan a, ribosil transferasa, serina proteasa, activador de guanil ciclasa, adenil ciclasa dependiente de calmodulina, ribunucleasa, agente alquilante de ADN o inhibidor de la mitosis, por ejemplo, doxorrubicina. La molécula marcadora puede ser, por ejemplo, una molécula fluorescente, luminiscente o radiomarcadora, un quelato metálico o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, malato deshidrogenasa, glucosa oxidasa, ureasa, catalasa, etc.) la cual, a su vez, cuando se expone más tarde a un sustrato, reaccionará con el sustrato de tal manera que producirá un resto químico que se puede detectar y se puede utilizar para la formación de imágenes in vivo o inmunoensayos, cuando está enlazado con la molécula que se une a antígeno de acuerdo con la invención. Cuando se utiliza para un inmunoensayo, la molécula dímera que se une a antígeno también se puede inmovilizar sobre un soporte insoluble, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosa y perlas magnéticas.

Para aumentar la semivida en suero de las moléculas que se unen a antígeno de acuerdo con la invención, en el cuerpo, la molécula que se une a antígeno, si se desea, se puede fusionar con albúmina o pegilar, sializar o glicosilar (véase, por ejemplo, Stork et al., 2008, J. Biol. Chem., 283:7804-7.812).

La molécula dímera que se une a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en esta memoria, se puede producir mediante la expresión de polinucleótidos que codifican las cadenas polipeptídicas individuales que se asocian entre sí para formar la molécula dímera que se une a antígeno. Por lo tanto, una realización adicional de la invención son polinucleótidos, por ejemplo, ADN o ARN, que codifican las cadenas polipeptídicas de la molécula dímera que se une a antígeno, tal y como se ha descrito anteriormente en este memoria.

Los polinucleótidos se pueden construir por métodos conocidos por la persona experta, por ejemplo, mediante la combinación de los genes que codifican el primer dominio VLA, el segundo dominio VHB, el tercer dominio VLB y el cuarto dominio VHA, o bien separados por enlazadores peptídicos o unidos directamente por un péptido unido, en una única estructura artificial genética, ligada funcionalmente a un promotor adecuado, y opcionalmente un terminador de la transcripción adecuado y que se expresa en bacterias u otro sistema de expresión apropiado. Dependiendo del sistema de vector y hospedador utilizados, se puede emplear cualquier cantidad de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. El promotor se selecciona de tal manera que dirige la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora respectiva.

En los polinucleótidos se pueden optimizar los codones alterando el sesgo de los codones para adaptar la expresión particular en el hospedador seleccionado.

El polinucleótido se puede insertar en vectores, preferiblemente vectores de expresión, que representan una realización adicional de la invención. Estos vectores recombinantes se pueden construir de acuerdo con métodos bien conocidos por el experto en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold

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Spring Harbor Laboratory (1989) Nueva York.

Se puede utilizar una variedad de sistemas de expresión vector/hospedador para contener y expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas polipeptídicas de la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con un bacteriófago recombinante, un plásmido o vectores que expresan ADN de cósmido, levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacteriana (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales, para los cuales se pueden utilizar, por ejemplo, los sistemas de expresión basados en virus.

Un vector de expresión preferido en particular para la expresión en E. coli es pSKK (LeGall et al., J Immunol Methods (2004) 285(1):111-27) o pcDNA5 (Invitrogen) para la expresión en células de mamífero.

Por lo tanto, la molécula dímera que se une a antígeno tal y como se describe en la presente memoria se puede producir mediante la introducción de un polinucleótido o un vector que codifica la cadena polipeptídica tal como se ha descrito anteriormente, en una célula hospedadora, y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones en las que se exprese la cadena polipeptídica. La molécula dímera que se une a antígeno obtenida a partir de las cadenas polipeptídicas expresadas se puede aislar y, opcionalmente, purificar adicionalmente. Las condiciones para el crecimiento y el mantenimiento de las células hospedadoras, la expresión, el aislamiento y la purificación de moléculas dímeras que se unen a antígeno de acuerdo con la invención, a partir de estas células hospedadoras, se describen ampliamente en la técnica.

En una realización adicional de la invención, se proporcionan composiciones que comprenden una molécula dímera que se une a antígeno o un polinucleótido tal y como se han descrito anteriormente en esta memoria y al menos un componente adicional. Para el uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno, la composición que contiene la molécula dímera que se une a antígeno o la molécula de poli(ácido nucleico) que codifica las cadenas polipeptídicas que forman la molécula que se une a antígeno, se combina preferiblemente con un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende que incluye cualquier vehículo, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los ingredientes y que no es tóxico para el paciente al que se administra. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Estos vehículos se pueden formular mediante métodos convencionales y se pueden administrar al sujeto en una dosis adecuada. Preferiblemente, las composiciones son estériles. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. Una prevención de la acción de los microorganismos se puede asegurar mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos. La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar mediante diferentes vías, por ejemplo, mediante administración por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La vía de administración, por supuesto, depende del tipo de terapia y del tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. El régimen de dosificación será determinado por el médico encargado y otros factores clínicos. Como es bien conocido en las técnicas médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el sexo, el compuesto particular que se va a administrar, el tiempo y la vía de administración, el tipo de terapia, la salud general y otros fármacos que se administran al mismo tiempo.

En otro aspecto de la invención, la molécula dímera que se une a antígeno tal y como se ha descrito anteriormente en este documento, se utiliza en la preparación de un medicamento para el tratamiento de neoplasias malignas de linfocitos B (por ejemplo, linfoma de no Hodgkin; leucemia linfocítica crónica; linfoma de Hodgkin).

Los métodos para la preparación de composiciones farmacéuticas, es decir, medicamentos, y la aplicación clínica de moléculas que se unen a antígeno en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades tales como, por ejemplo, el cáncer, son conocidos por el experto en la materia.

En un aspecto particular de la invención, la molécula dímera que se une a antígeno es biespecífica y se utiliza en la terapia contra el cáncer, debido a que tales anticuerpos se pueden usar para redirigir células efectoras citotóxicas contra células tumorales. Este concepto terapéutico es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estudios clínicos mostraron una regresión tumoral en pacientes tratados con un anticuerpo biespecífico anti-CD3 x antitumoral (por ejemplo, Canevari, S. et al., J. Natl. Cancer Inst., 87:1463-1469, 1996) o pacientes tratados con un anticuerpo biespecífico anti-CD16 x antitumoral (por ejemplo, Hartmann et al.; Clin Cancer Res. 2001; 7(7):1873-81). Una prueba de concepto también se ha mostrado para diversas moléculas de anticuerpos recombinantes biespecíficas que comprendían solo dominios variables (Fv), tales como, por ejemplo, moléculas dímeras y tetravalentes que se unen a antígeno CD3xCD19 que tenían un orden de los dominios VHA-VLB-VHB-VLA (Cochlovius et al.; Cancer Research, 2000, 60:4336-4341) o recientemente en estudios clínicos con moléculas de anticuerpo monómero de cadena sencilla Fv en formato BiTE® (dos anticuerpos de cadena sencilla con diferentes especificidades unidos entre sí; Micromet AG, Alemania; Bargou R. et al., Science, 2008, 321(5891):974-977; Baeuerle PA y Reinhardt C., Cancer Res. 2009, 69(12):4941-4944). Las moléculas dímeras que se unen a antígeno descritas en este documento se pueden utilizar como medicamentos y se aplican en métodos de tratamiento de una manera similar a los anticuerpos biespecíficos

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de la técnica, ya que son capaces de redirigir mecanismos terapéuticos, por ejemplo, citotóxicos utilizando las mismas especificidades combinadas de anticuerpo.

La molécula que se une a antígeno y las composiciones de la misma pueden estar como una forma de dosificación oral, intravenosa, intraperitoneal u otras formas de dosificación farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, la composición se administra por vía oral y la forma de dosificación es un comprimido, una cápsula, un comprimido oblongo u otra forma disponible por vía oral. En algunas realizaciones, la composición es parenteral, por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea, y se administra por medio de una solución que contiene la molécula que se une a antígeno.

Una persona experta será capaz fácilmente de construir y obtener, sin una carga indebida, las moléculas que se unen a antígeno que se describen en el presente documento, mediante la utilización de técnicas establecidas y métodos convencionales conocidos en la técnica, véase por ejemplo Sambrook, Manual Molecular Cloning A Laboratory, Cold Spring Harbor laboratorio (1989) N.Y.; The Protein Protocols Handbook, editado por John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); o Antibody engineering: methods and protocols / editado por Benny K.C. Lo; Benny K.C. II Series: Methods in molecular biology (Totowa, N.J.)). Además, un experto en la materia será capaz de preparar las moléculas que se unen a antígeno descritas en esta memoria, utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica y modificando los métodos descritos en el documento US 7.129.330, Kipriyanov et al. J. Mol. Biol. (1999) 293, 41-56 o Le Gall et al., 2004, Protein Engineering 17:357-366, de tal manera que se obtienen moléculas dímeras que se unen a antígeno tal y como se han descrito anteriormente, que comprenden dos cadenas polipeptídicas que tienen el orden de dominios VLA-VHB-VLB-VHA, desde el extremo N-terminal al C-terminal de cada cadena polipeptídica.

El siguiente ejemplo ilustra adicionalmente la invención, sin limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1:

Para construir diacuerpos dímeros funcionales en tándem (TandAb®) utilizando una disposición de dominios distintos de VHA-VLB-VHB-VLA, varios de tales diacuerpos dímeros en tándem se construyeron con la disposición de dominios VLA-VHB-VLB-VHA de acuerdo con la invención, usando los dos dominios de un anticuerpo anti-CD19 de cadena sencilla humanizado y un anticuerpo anti-CD3 de cadena sencilla humanizado, respectivamente. Los resultados fueron confirmados mediante el uso de dos variantes de cada molécula que se une a antígeno, en representación de los productos de diferentes etapas de un procedimiento de maduración por afinidad que se realizó para ambos anticuerpos anti-CD3 humanizado y anti-CD19 humanizado.

Los anticuerpos monoclonales murinos HD37 y UCHT dirigidos contra CD19 y CD3, respectivamente, fueron el material de partida para la obtención de anticuerpos humanizados con afinidades relativamente altas. En cada caso, el dominio VH se combinó primero con una genoteca de VL humano en un vector fagémido scFv para seleccionar una cadena VL humana adecuada mediante presentación en fagos. En una segunda etapa, la cadena de VL humano seleccionada se combinó con una genoteca de dominios VH en donde la región CDR3 se mantuvo constante. Este procedimiento dio lugar a un anticuerpo anti-CD19 y anti-CD3 humanizado, respectivamente, que solo contenía una secuencia murina corta en la región VHCDR3. Estos clones maduraron posteriormente por afinidad, introduciendo mutaciones puntuales en los residuos que se creía que participaban en la unión al antígeno. Los mutantes que se unían mejor, se seleccionaron a continuación mediante presentación en fagos. Los clones seleccionados para la construcción del TandAb eran M13 y M39 que se unían a CD19 y C4 y LcHC21 que se unía a CD3.

Se generaron los siguientes anticuerpos de acuerdo con la invención:

CD3C4-VLCD19M39-VHCD19M39-VLCD3C4

Anticuerpo A1: CD19M39xCD3C4 (opción 0) VH

CD3C4-VHCD19M39-VLCD19M39-VHCD3C4

Anticuerpo B: CD19M39xCD3C4 (opción 2) VH

CD3LCHC21-VLCD19M13-VHCD19M13-VLCD3LCHC21

Anticuerpo A2: CD19M13xCD3LCHC21 (opción 0) VH

CD3LCHC21-VHCD19M13-VLCD19M13-VHCD3LCHC21

Anticuerpo C: CD19M13xCD3LCHC21 (opción 2) VL

CD3C4-VHCD19M39-VLCD19M39-VHCD3C4

Los plásmidos que codificaban los monómeros híbridos VL del anticuerpo B y

D3LCHC21-VHCD19M13-VLD19M13-VH

VL CD3LCHC21 del anticuerpo C se generaron mediante modificación genética de ADN y

CD3C4-VHCD19M39-VLCD19M39

un proveedor de procesamiento. La secuencia de la estructura principal del monómero VL -VHCD3C4 comprende las secuencias de ADN de dos anticuerpos scFv, a saber scFvCD19M39 y scFvCD3C4 respecti-

CD3LCHC21-VHCD19M13-VLCD19M13-VH

vamente. La secuencia del monómero VL CD3LCHC21 combina los dominios variables de la cadena sencilla FvCD19M13 y la cadena sencilla FvCD3LCHC21. Los cuatro scFv se obtuvieron mediante selección por presentación en fago de anticuerpos de cadena sencilla frente a los antígenos CD19 y CD3. En ambos casos, la información de la secuencia se utilizó para construir los monómeros híbridos anteriores. Un enlazador (G2S)3 de 9

CD3C4-VHCD19M39

aminoácidos se utilizó para enlazar los dominios entre sí. El gen sintetizado que codificaba VL

CD19M39-VH CD3LCHC21

VL CD3C4 se clonó en el vector de expresión de mamífero pCDNA5FRT (Invitrogen). El gen de VL

CD19M13-VLCD19M13-VH

VH CD3LCHC21 también se clonó en un vector de expresión y se amplificó mediante PCR usando un cebador directo que introducía un sitio de escisión NcoI y un cebador inverso que introducía un sitio de escisión NotI.

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Después del análisis y el aislamiento mediante gel de agarosa, el producto de la PCR se digirió posteriormente de forma doble con NcoI y NotI y se clonó en el vector pSKK3 linealizado con NcoI y NotI. La clonación correcta se confirmó mediante secuenciación de ADN.

El mapa del vector pCDNA5FRTB que codifica el anticuerpo B se muestra en la Fig. 6. El mapa del vector pSKK3 que codifica el anticuerpo C se muestra en la Fig. 7.

CD3C4-VHCD19M39-VLCD19M39-VHCD3C4

Para obtener una producción elevada, el vector que contenía el gen VL se transfectó transitoriamente (usando CaPO4) en células HEK293 adherentes. La fermentación de proteínas se realizó en condiciones de crecimiento bien conocidas en la técnica.

La proteína recombinante se expresó como una proteína de fusión marcador His con un péptido señal. La proteína se aisló del material sobrenadante del cultivo celular mediante cromatografía de afinidad sobre metal inmovilizado (IMAC) tal y como se ha descrito (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293, 41-56). El material purificado se analizó posteriormente por SDS-PAGE. La tinción de Coomassie de un gel SDS PAGE y la cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 HR10/30 calibrada (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania) en tampón fosfato de sodio (NaPO4 30 mM arginina/HCl 0,75 M, pH 6,0), reveló una proteína recombinante pura y ensamblada correctamente (Anticuerpo B).

CD3LCHC21-VHCD19M13-VLCD19M13-VHCD3LCHC21

Para una expresión a nivel elevado, el gen que codificaba el monómero VL humanizado seguido de marcador 6x His, se clonó en el plásmido pSKK3 que contenía el sistema suicida celular del gen hok/sok y un gen skp que codificaba el factor periplásmico Skp/OmpH (LeGall et al., 2004, J. Immunol. Methods, 285, 111-127). El plásmido se transfectó en una cepa de E. coli K12 (ATCC 31608®).

Las bacterias transformadas crecieron en matraces de agitación y se indujeron esencialmente como se ha descrito anteriormente (Cochlovius et al., 2000, J. Immunol., 165, 888-895). Las proteínas recombinantes se aislaron tanto a partir de la fracción periplásmica soluble como del material sobrenadante del medio bacteriano, mediante cromatografía de afinidad sobre metal inmovilizado (IMAC) como ya se ha descrito (Kipriyanov et al., 1999, J. Mol. Biol., 293, 41-56).

El material purificado se analizó posteriormente mediante SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie y cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 HR10/30 calibrada (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania) en tampón fosfato de sodio (NaPO4 30 mM arginina/HCl 0,75 M, pH 6,0). El producto parecía ser puro y estar ensamblado correctamente.

Los anticuerpos comparativos A1 y A2 se generaron de la misma manera que los anticuerpos B y C, respectivamente, en donde el orden de los dominios de los anticuerpos A1 y A2, respectivamente, se invirtió en comparación con el de los anticuerpos B y C, respectivamente.

Los ensayos de citotoxicidad se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito en T. Dreier et al. (2002, Int. J. Cancer 100, 690-697). Las PBMCs que se utilizaron como células efectoras se aislaron a partir de la sangre periférica de voluntarios sanos por centrifugación en gradiente de densidad. En algunos casos, las PBMCs se cultivaron durante una noche en presencia de 25 U/ml de IL-2 humana, antes de utilizarlas como células efectoras en el ensayo de citotoxicidad. La pureza y la expresión de antígenos de las PBMCs aisladas se comprobó mediante citometría de flujo en cada caso (datos no mostrados).

Células diana CD19+ JOK-1 o Raji se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con 10% de FCS, L-glutamina 2 mM y 100 UI/ml de penicilina G sódica y 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina (en adelante denominado medio RPMI; todos los componentes eran de Invitrogen). Para el ensayo de citotoxicidad, las células se marcaron con calceína AM 10 µM (Molecular Probes/Invitrogen) durante 30 min en medio RPMI sin FCS a 37°C. Después de lavar suavemente, las células marcadas se resuspendieron en medio RPMI hasta una densidad de 1x105/mL. A continuación, se sembraron 1x104 células diana junto con 5x105 PBMCs con los anticuerpos indicados en pocillos individuales de una microplaca de fondo redondo de 96 pocillos, en un volumen total de 200 µL/pocillo. Después de centrifugar durante 2 minutos a 200 g, el ensayo se incubó durante 4 horas a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Quince minutos antes del final de la incubación, se añadieron 20 µL de 10% de Triton X-100 en medio RPMI a los pocillos que solo tenían células diana. Se añadieron 20 µL de medio RPMI a todos los demás pocillos. Se recogieron 100 µL de material sobrenadante del cultivo celular de cada pocillo después de una centrifugación adicional durante 5 minutos a 500 g, y la fluorescencia de la calceína liberada se midió a 520 nm usando un lector de placas de fluorescencia (Victor 3, Perkin Elmer). Basándose en los recuentos medidos, la lisis celular específica se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: [fluorescencia (muestra) -fluorescencia (espontánea)] / [fluorescencia (máxima) -fluorescencia (espontánea)] x 100%. La fluorescencia (espontánea) representa los recuentos de fluorescencia de las células diana en ausencia de células efectoras y anticuerpos, y la fluorescencia (máxima) representa la lisis celular total inducida por la adición de Triton X-100. Las curvas sigmoideas de respuesta a la dosis y los valores CE50 se calcularon utilizando el programa informático Prism (GraphPad).

Resultados:

Los resultados de los ensayos de citotoxicidad para diacuerpos en tándem que tienen el siguiente orden de domi

nios, a partir del extremo N-terminal, VHA-VLB-VHB-VLA (anticuerpo A) y VLA-VHB-VLB-VHA (anticuerpo B), respectivamente, utilizando la variante anti-CD19 M39 y la variante anti-CD3 C4, se muestran en la Figura 3.

Sorprendentemente, había una diferencia muy grande en la actividad citotóxica de los dos diacuerpos en tándem. El diacuerpo en tándem que tenía la disposición de dominios de acuerdo con la invención, denominado "anticuerpo B" 5 era más de 60 x más activo que el diacuerpo en tándem denominado "anticuerpo B" según se determinó mediante una comparación de sus valores CE50 en las condiciones dadas.

La superioridad de la disposición de dominios representada por la presente invención (anticuerpo C) para una mejor citotoxicidad, se confirmó mediante el uso de dos variantes adicionales de los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD19 (véase la Figura 4).

10 El valor CE50 del diacuerpo en tándem con el orden de dominios de acuerdo con la invención, representado por la opción 2, es extremadamente bajo (0,1 pM). Es 27x más activo que el TandAb representado por la opción 0 después de comparar los valores CE50 en las condiciones dadas.

Claims

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