CN103687879B - 多价抗原结合fv分子 - Google Patents

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Abstract

在一个方面，本发明涉及对白蛋白和CD3有特异性的抗原结合分子，其包含两条多肽链，每条多肽链以防止Fv形成的方向具有至少4个可变结构域，并且两条多肽链相互聚合，从而形成多价抗原结合分子。在两条多肽链中的每条链上，四个可变结构域从多肽的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列。本文还提供了该抗原结合分子的组合物，以及使用该抗原结合分子或其组合物用于治疗多种疾病的方法。

Description

多价抗原结合FV分子
技术领域
本发明涉及新型串联Fv双抗体及其用途。
背景技术
已设计出各种形式的多价重组抗体片段作为细胞杂交瘤衍生抗体的替代物。
US7129330、Kipriyanovetal.J.Mol.Biol.(1999)293,41-56以及KipriyanovMeth.Mol.Biol.(2009)562,177-193描述了构建和产生特定形式的多价抗体片段，由于它们的设计是基于两种不同的多肽的可变结构域VH和VL的分子间配对，如关于双抗体的描述(Holligeretal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448)，因此将其命名为“串联双抗体”(tandemdiabodies)()。所述抗体对CD19和CD3是双特异性的。与二价的scFv-scFv(scFv)2的串联比较，该串联双抗体是四价的，因为它们具有四个抗原结合位点。对从多肽的N-末端到C-末端具有结构域顺序为VHA-VLB-VHB-VLA且形成串联双抗体的多肽进行了描述。它们之间的可变结构域和连接肽的顺序被设计成每一结构域与另一相同分子中的互补结构域相连接，从而形成二聚四价串联双抗体。串联双抗体缺少免疫球蛋白恒定结构域。据报道，串联双抗体具有如高亲和性、高亲合力、低清除率的优点，并且在体外和体内均表现出良好的效能。
已知几种其他的含抗体特异性的串联双抗体，例如抗CD16、抗EpCAM和抗CD30。然而，在所有情况下，沿串联双抗体的多肽链从N-末端到C-末端的四个抗体结构域的顺序总是VHA-VLB-VHB-VLA，这里VH和VL代表抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，其分别对抗原A和B有特异性。
这种双特异性串联双抗体能够在肿瘤细胞(例如B-CLL细胞)和人类免疫系统效应细胞(例如NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒性白细胞)之间提供连接，从而允许杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞与细胞毒性细胞的紧密结合导致肿瘤细胞的破坏。
虽然已证实这种串联双抗体对治疗应用、例如治疗肿瘤的治疗概念是有利的，但是仍然需要改进的抗原结合分子。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种二聚抗原结合分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，第一多肽链和第二多肽链中的每条链均包含：(a)第一结构域VLA，其是对第一抗原A有特异性的轻链可变结构域；(b)第二结构域VHB，其是对第二抗原B有特异性的重链可变结构域；(c)第三结构域VLB，其是对第二抗原B有特异性的轻链可变结构域；以及(d)第四结构域VHA，其是对第一抗原A有特异性的重链可变结构域，其中上述结构域从所述多肽链的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列在第一多肽链和第二多肽链的每条链中，并且第一多肽链的第一结构域VLA与第二多肽链的第四结构域VHA连接，以形成第一抗原A的抗原结合位点；第一多肽链的第二结构域VHB与第二多肽链的第三结构域VLB连接，以形成第二抗原B的抗原结合位点；第一多肽链的第三结构域VLB与第二多肽链的第二结构域VHB连接，以形成第二抗原B的抗原结合位点；第一多肽链的第四结构域VHA与第二多肽链的第一结构域VLA连接，以形成第一抗原A的抗原结合位点。
在一些实施方案中，本文所述的抗原结合分子是同源二聚体，且第一多肽链和第二多肽链具有相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一多肽链和第二多肽链是非共价连接的。在一些实施方案中，抗原结合分子是四价的。在一些实施方案中，抗原结合分子是双特异性的。在一些实施方案中，结构域是人结构域或人源化结构域。在一些实施方案中，抗原结合分子包含至少一个其他功能单元。在一些实施方案中，抗原结合分子对B-细胞、T-细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓细胞或吞噬细胞有特异性。在一些实施方案中，抗原结合分子是双特异性的，所述抗原结合分子还对肿瘤细胞有特异性。在一些实施方案中，第一轻链可变结构域(VLA)和第一重链可变结构域(VHA)对肿瘤细胞有特异性。在一些实施方案中，抗原结合分子对白蛋白和CD3具有双特异性。
在另一方面，本发明提供了多肽链，其包含a)第一结构域VLA，其是对第一抗原A有特异性的轻链可变结构域；(b)第二结构域VHB，其是对第二抗原B有特异性的重链可变结构域；(c)第三结构域VLB，其是对第二抗原B有特异性的轻链可变结构域；以及(d)第四结构域VHA，其是对第一抗原A有特异性的重链可变结构域；其中所述结构域从多肽链的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列在多肽链中。在一些实施方案中，第一结构域VLA与第四结构域VHA不连接，以形成第一抗原A的抗原结合位点，且第三结构域VHB与第三结构域VLB不连接，以形成第二抗原B的抗原结合位点。在一些实施方案中，第一结构域VLA和第二结构域VHB，第二结构域VHB和第三结构域VLB，以及第三结构域VLB和第四结构域VHA被不超过约12个氨基酸残基分隔开。在一些实施方案中，多肽链包含第一结构域VLA上游和/或第四结构域VHA下游的氨基酸残基。在一些实施方案中，多肽链连接其他功能单元。在具体实施方案中，可变结构域对白蛋白和CD3有特异性。
在另一方面，本发明提供了编码本文所述多肽链的核酸分子。在另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文公开的抗原结合分子、多肽链或核酸分子，以及药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供了抗原结合分子作为用于治疗自身免疫疾病、炎性疾病、传染病、过敏症、癌症的药物或作为免疫抑制剂的医药用途。
附图说明
图1示出了编码本发明的抗原分子的构建体的基因组织结构，其中VLA代表对抗原A有特异性的轻链可变免疫球蛋白结构域，VHB代表对抗原B有特异性的重链可变免疫球蛋白结构域，VLB代表对抗原B有特异性的轻链可变免疫球蛋白结构域，VHA代表对抗原A有特异性的重链可变免疫球蛋白结构域，L1代表连接VLA和VHB的肽连接体或肽键，L2代表连接VHB和VLB的肽连接体或肽键，以及L3代表连接VLB和VHA的肽连接体或肽键。
图2示出了本发明的二聚抗原结合分子的形成，通过第一多肽链1和第二多肽链2的可变结构域的分子内配对，从非功能单体多肽链(A)形成本发明的串联双抗体形式的功能化抗原结合分子(B)，其中“1”代表第一多肽链，“2”代表第二多肽链，VLA代表对抗原A有特异性的轻链可变免疫球蛋白结构域，VHB代表对抗原B有特异性的重链可变免疫球蛋白结构域，VLB代表对抗原B有特异性的轻链可变免疫球蛋白结构域，VHA代表对抗原A有特异性的重链可变免疫球蛋白结构域，L1代表连接VLA和VHB的肽连接体或肽键，L2代表连接的VHB和VLB的肽连接体或肽键，以及L3代表连接VLB和VHA的肽连接体或肽键。
图3示出了CD19×CD3串联双抗体在细胞毒性试验中的比较。选项0=结构域为VHA-VLB-VHB-VLA的抗体A1。选项2=本发明的结构域为VLA-VHB-VLB-VHA的抗体B。将1×104个钙黄绿素标记的淋巴瘤细胞与5×105个PBMC在存在浓度增大的CD19×CD3串联双抗体的条件下进行孵育。在PBMC作为试验中的效应细胞之前，使PBMC在存在25U/mL的人类IL-2的条件下培养过夜。4h(小时)的孵育后，在520nm处测量细胞培养基中的从凋亡的靶细胞释放出的荧光钙黄绿素，并计算出特异性裂解的%。使用GraphPad软件通过非线性回归对EC50值进行分析。绘制副本的平均偏差和标准偏差。
图4示出了CD19×CD3串联双抗体在细胞毒性试验中的比较。选项0=结构域为VHA-VLB-VHB-VLA的抗体A2。选项2=本发明的结构域为VLA-VHB-VLB-VHA的抗体C。将1×104钙黄绿素标记的淋巴瘤细胞与5×105个新鲜分离的PBMC在存在浓度增大的CD19×CD3串联双抗体的条件下进行孵育。4h的孵育后，在520nm处测量细胞培养基中的从凋亡的靶细胞释放出的荧光钙黄绿素，并计算出特异性裂解的%。使用GraphPad软件通过非线性回归对EC50值进行分析。绘制副本的平均偏差和标准偏差。
图5示出了实施例2中的HSA×CD3TandAb抗体在存在或缺乏HSA的情况下的TCR调节。在存在加入(填满的标识)或未加入(打开的标识)50mg/mLHSA的浓度增大的HSA×CD3TandAb选项0(VHA-VLB-VHB-VLA；三角)或选项2(本发明的VLA-VHB-VLB-VHA；方形)抗体的条件下，培养CD3+白血病(Jurkat)细胞2h。洗涤后，通过流式细胞仪使用PC5-缀合的抗-TCRα/β抗体测量残留的TCR/CD3复合物。通过非线性回归用平均荧光值进行分析。
图6示出了具有编码抗体B的pCDNA5FRT限制性位点的载体图。VH和VL：重链可变结构域和轻链可变结构域。
图7示出了具有编码抗体C的pSKK3限制性位点的载体图。VH和VL：重链可变结构域和轻链可变结构域。
发明详述
在一个方面中，本发明提供了重组二聚四价抗原结合分子，其具有在多肽链中相互连接且从所述多肽链的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列的四个免疫球蛋白结构域(两个重链可变结构域和两个轻链可变结构域)。本发明的这种抗原结合分子引发增强的生物活性，例如，增强的免疫反应或增强的免疫抑制。
在一个实施方案中，示出了对CD3和CD19有特异性并具有结构域顺序为VLA-VHB-VLB-VHA的多肽链的串联双抗体形式的二聚双特异性抗原结合分子，其比具有相同结构域但结构域顺序相反的VHA-VLB-VHB-VLA的相应的串联双抗体分子的体外活性即细胞毒性高60倍。
在另一实施方案中，示出了对白蛋白(HSA)和CD19有特异性并具有结构域顺序为VLA-VHB-VLB-VHA的多肽链的串联双抗体形式的二聚双特异性抗原结合分子，与具有相同结构域的但结构域顺序相反的VHA-VLB-VHB-VLA的相应的串联双抗体分子相比，它具有更为显著有效的T细胞受体体外调节活性，即它是更为免疫抑制的。
因此，从多肽链的N-末端到C-末端具有结构域顺序为VLA-VHB-VLB-VHA的串联双抗体具有提高的用于免疫治疗的潜力。增强的生物活性的另一优点在于，可以减少这种串联双抗体的有效治疗剂量。此外，由于剂量较低，也可以降低由施用抗原结合分子引起的副作用。在不受任何理论的束缚的情况下，相比现有技术的串联双抗体，新的结构域顺序允许抗原A与抗原B之间的二聚抗原结合分子的修饰性交联，并且在本发明的某些方面，这将使该分子比现有技术的二聚抗原结合分子与靶抗原如受体的结合更有效。
因此，当形成二聚抗原结合分子的每条多肽链的四个可变结构域从每条多肽链的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列时，可以增强二聚抗原结合分子例如串联双抗体的生物活性。引发的“生物活性”取决于抗原结合分子的特异性，且可以包括细胞毒性、吞噬作用、抗原呈递、细胞因子释放或免疫抑制，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一些实施方案中，本发明提供了二聚抗原结合分子，其包含第一多肽链和第二多肽链，其中第一多肽链和第二多肽链中的每条链均含有第一结构域VLA，其是对第一抗原A有特异性的轻链可变结构域；第二结构域VHB，其是对第二抗原B有特异性的重链可变结构域；第三结构域VLB，其是对第二抗原B有特异性的轻链可变结构域；第四结构域VHA，其是对第一抗原A有特异性的重链可变结构域，并且所述结构域从所述多肽链的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列在所述第一多肽链和第二多肽链中。
在一些实施方式中，第一、第二、第三和第四可变结构域以防止同一多肽链内的分子内配对的方向排列，并且第一多肽链与第二多肽链连接即发生二聚，从而使第一多肽链的第一结构域VLA与第二多肽链的第四结构域VHA连接，以形成第一抗原A的抗原结合位点，第一多肽链的第二结构域VHB与第二多肽链的第三结构域VLB连接，以形成第二抗原B的抗原结合位点，第一多肽链的第三结构域VLB与第二多肽链的第二结构域VHB连接，以形成第二抗原B的抗原结合位点，第一多肽链的第四结构域VHA与第二多肽链的第一结构域VLA相连，以形成第一抗原A的抗原结合位点。
术语“抗原结合分子”指具有多价抗原结合特性的免疫球蛋白衍生物，优选具有至少四个抗原结合位点。每个抗原结合位点是通过相同抗原的重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL即抗原表位特异性形成的。优选地，本发明的抗原结合分子不含免疫球蛋白恒定结构域或免疫球蛋白恒定结构域的片段，但在下述的某些情况中，恒定结构域或其部分可以与抗原结合分子连接。
抗原结合分子是“二聚的”，该术语是指两个多肽单体的复合物。这两个多肽单体为第一多肽链和第二多肽链。优选地，抗原结合分子是“同源二聚体”，该术语的意指抗原结合分子由相同的多肽单体构成。在本发明的优选的同源二聚抗原结合分子中，第一多肽链和第二多肽链可具有相同的氨基酸序列，即第一多肽链和第二多肽链是相同的，并因此由相同的单一多核苷酸来编码和表达。这不同于所谓的双特异性双抗体，其是由两个不同的多核苷酸编码的异源二聚体。在前一种情况中，第一多肽链和第二多肽链的每条均包含四个可变结构域，形成四个结合位点，且抗原结合分子是四价的。将这种四价同源二聚抗原结合分子作为串联双抗体得到了本领域的认可。
优选地，在抗原结合分子中，第一多肽链和第二多肽链相互之间是非共价连接的，特别是在第一多肽链和第二多肽链之间不存在共价结合的条件下。然而，必要时，可以通过至少一个共价连接例如通过不同多肽链的半胱氨酸残基之间的二硫键来额外地稳定两条多肽链。
术语“多肽链”指通过酰胺键连接的氨基酸残基的聚合物。第一多肽链和第二多肽链优选是未分支的单链融合蛋白。在第一多肽链和第二多肽链的每条链中，四个结构域排列成使第二结构域VHB是从第一结构域VLA开始的C-末端，第三结构域VLB是从第二结构域VHB开始的C-末端，第四结构域VHA是从第三结构域VLB开始的C-末端。第一多肽链和第二多肽链可在第一结构域VLA的N-末端和/或第四结构域VHA的C-末端附加有连续的氨基酸残基。例如，多肽链可包含标签序列，优选在C-末端，其可以用于多肽的纯化。标签序列的实例是His标签，例如由六个His残基构成的His标签。
在一些实施方案中，第一、第二、第三和第四结构域共价连接，从而使同一多肽链的结构域相互之间不连接即不配对。结构域可以连接成使第一结构域VLA通过第一连接体L1与第二结构域VHB连接，第二结构域VHB通过第二连接体L2与第三结构域VLB连接，第三结构域VLB通过第三连接体L3与第四结构域VHA连接，其中在第一多肽链和第二多肽链中的每条上，第一连接体L1和第三连接体L3在中心连接体L2的远端。连接体L1、连接体L2和连接体L3每个均可以是含至少一个氨基酸残基的肽连接体，或者是在两个相邻的结构域之间没有任何介入的氨基酸残基的肽键。
在一些实施方案中，每个连接体L1、L2和L3的长度设为使第一多肽链的结构域可以与第二多肽链的结构域连接，以形成二聚抗原结合分子。连接体的长度会影响抗原结合分子的灵活性。抗原结合分子的灵活性取决于靶抗原的密度和靶抗原的可及性，即抗原表位。较长的连接体为更灵活的抗原结合分子提供了更灵活的抗原结合位点。在例如Todorovska等(2001JournalofImmunologicalMethods248:47-66)；Perisic等(1994Structure2:1217-1226)；LeGall等(2004,ProteinEngineering17:357-366)以及WO94/13804中描述了连接体长度对于二聚抗原结合分子的形成的影响。
在某些优选的实施方案中，连接体L1、L2和/或L3是“短的”，即由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或约12个氨基酸残基构成。这种短的连接体有利于第一多肽链与第二多肽链通过结合并在不同多肽链的轻链可变结构域和重链可变结构域之间形成抗原结合位点正确地二聚化。特别是，中心连接体L2应为短的，从而使其防止在同一多肽链中通过两个相邻的结构域VHB和VLB形成单链Fv(scFv)抗原结合单元。中心连接体L2会影响多肽链的灵活性。若中心连接体L2是长的且柔性的(通常由约12个或更多个氨基酸残基构成)，则多肽链可以头对尾地折叠，并形成作为单链双抗体的本领域已知的单链抗原结合分子。若中心连接体L2是短的且刚性的，则多肽链无法头对尾地折叠并与另一多肽链二聚化。用于防止头对尾折叠的连接体的氨基酸残基的数量也取决于在多肽中结合的可变结构域的种类。一般而言，将连接体缩短至约12个或更少的氨基酸残基，通常可防止同一多肽链的相邻的结构域相互反应。因此，中心连接体L2和远端连接体L1与L3应优选由约12个或更少的氨基酸残基构成，以防止同一多肽链的相邻结构域的配对。在本发明的优选实施方案中，连接体L1、L2和/或L3由约3至约10个连续的氨基酸残基构成。连接体可由不同数量的氨基酸残基构成，但优选的是，远端连接体L1和L3具有相同数量的氨基酸残基，或者长度的不同不多于一个或两个氨基酸残基。在本发明的某些方面，连接体L1、L2和/或L3的至少一个由九个氨基酸残基构成。在本发明的具体实施方案中，三个连接体L1、L2和L3都由九个氨基酸残基构成。在一些实施方案中，连接体L1、L2和L3中的至少一个由小于10-3个之间的氨基酸残基构成。
额外的氨基酸残基提供了额外的灵活性。在可选的方面，中心连接体L2可具有约12个或更少的氨基酸残基，以防止多肽链的头对尾折叠，且至少一个远端连接体L1和/或L3可具有多于约12个氨基酸残基，以提供额外的灵活性。在另一实施方案中，具有含多于12个氨基酸残基的中心连接体L2的两条多肽链相互之间准确地二聚成为四价二聚抗原结合分子(例如参见LeGalletal.,2004,ProteinEngineering(蛋白工程),17:357-366)。然而，若使用较长的连接体，例如由约13个或更多个，特别是约15个或更多个氨基酸残基构成的连接体，则可额外地通过位于这样的两条多肽链之间的至少一个共价键来稳定二聚抗原结合分子。
关于连接体的氨基酸组成，在一些实施方案中，选择不会妨碍第一多肽链和第二多肽链的二聚化的肽。例如含甘氨酸和丝氨酸残基的连接体通常提供灵活性和蛋白酶抗性。可以通过例如噬菌体展示的方法来优化连接体的氨基酸序列，以提高抗原的结合以及分子的产率。在本发明的具体实施方案中，连接体可以包含氨基酸序列GGSGGSGGS。
第一结构域VLA、第二结构域VHB、第三结构域VLB和第四结构域VHA是免疫球蛋白的轻链可变结构域和重链可变结构域。可变结构域包含高变环或互补结合区(CDR)，其包含与抗原接触的残基以及对CDR的准确折叠和显示有贡献的片段。优选的是，每一重链和轻链可变结构域包含有各自的三个CDR。结构域可来源于任何免疫球蛋白种类，例如IgA、IgD、IgE和IgM，或其子类。免疫球蛋白可以是动物来源、特别是哺乳动物来源的。每个结构域可以是完整的免疫球蛋白重链可变结构域或轻链可变结构域、突变体、天然产生的可变结构域的片段或衍生物，或合成物，例如基因工程化的重组结构域。衍生物是通过至少一个氨基酸的缺失、取代、添加或插入而不同于天然产生的可变结构域的氨基酸序列的可变结构域。可通过例如熟知的复制法从杂交瘤衍生的抗体或噬菌体展示免疫球蛋白文库获得合成物，如重组结构域。例如，可以使用噬菌体展示的方法通过从人类免疫球蛋白序列中筛选文库来获得针对抗原的人类抗体的可变结构域。通过亲和力成熟法例如链改组(chainshuffling)或随机突变可以进一步提高最初选择的抗体的亲和力。本领域技术人员熟悉用于从天然或重组抗体中获得结构域的方法，参见实验室手册，例如BennyK.C.Lo编辑的Antibodyengineering:methodsandprotocols(抗体工程：方法与实验操作)；和BennyK.C.IISeries:Methodsinmolecularbiology(BennyK.C.II系列：分子生物学方法)(Totowa,N.J.)。一般而言，可以使用本领域中已知的任何抗体，作为本发明的可变结构域的来源。
在本发明的某些方面，第一结构域VLA、第二结构域VHB、第三结构域VLB和第四结构域VHA中的至少一个，优选所有的结构域，是完整的人类的、人源化的或嵌合的结构域。人源化可变结构域包含基本上具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列和非人类免疫球蛋白的CDR的框架区。可通过已确立的方法如CDR移植来生产人源化抗体，参见例如BennyK.C.Lo编辑的Antibodyengineering:methodsandprotocols(抗体工程：方法与实验操作)；和BennyK.C.IISeries:Methodsinmolecularbiology(BennyK.C.II系列：分子生物学方法)(Totowa,N.J.)。因此，利用本领域已知的标准分子生物学技术，本领域技术人员能够容易地从非人类来源例如鼠来源制备出人源化的或完整的人类版本的抗原结合分子和可变结构域，以用于降低免疫原性并提高人类免疫系统中抗原结合分子的效能。在本发明的优选实施方案中，所有结构域(例如VLA、VHB、VLB和VHA)都是人源化的或完整人类的；最优选的是，本发明的二聚体抗原结合分子是人源化的或完整人类的。本文使用的术语“完整人类的”意指可变结构域的氨基酸序列和连接第一多肽链与第二多肽链中的可变结构域的肽来源于人类或可存在于人类中。在本发明的某些实施方案中，可变结构域可以是人类或人源化的，但连接可变结构域的肽可以不是人类或人源化的。
在一个实施方案中，第一结构域VLA、第二结构域VHB、第三结构域VLB和第四结构域VHA对同一抗原具有特异性，从而使得由结构域形成的抗原结合位点与同一抗原表位结合，或者与同一抗原上的不同抗原表位结合。在该情况下，表述“抗原A”和“抗原B”指同一抗原。这种抗原结合分子是单特异性的。
在另一实施方案中，第一结构域VLA、第二结构域VHB、第三结构域VLB和第四结构域VHA对不同的抗原具有特异性，从而使VLA和VHA形成对抗原A具有第一特异性的抗原结合位点，并使VHB和VLB形成对抗原B具有第二特异性的抗原结合位点。不同的抗原可以与不同种类的细胞相关，或者代表同一类细胞的不同抗原。本发明的这种抗原结合分子是双特异性的。
在一些实施方案中，至少一个抗原结合位点可以对细菌质、病毒蛋白、自身免疫标记物或存在于特定细胞如B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓细胞、吞噬细胞、肿瘤细胞的细胞表面蛋白上的抗原具有特异性。
在本发明的一个方面，二聚抗原结合分子是双特异性的，其包含对效应细胞的第一特异性和对不同于效应细胞的靶细胞的第二特异性。这类抗原结合分子能够交联两种细胞，并可用于将效应细胞引导至特异性靶标。在本发明的另一方面，二聚抗原结合分子可对靶细胞和选自药物、毒素、放射性核苷酸、酶、白蛋白和脂蛋白、天然产生的配体例如细胞因子或趋化因子的分子具有双特异性。若靶分子是白蛋白，则白蛋白或血清白蛋白的来源可以选自人、牛、兔、犬和鼠。
“效应细胞”通常是指免疫系统的细胞，其能够刺激或引发细胞毒性、吞噬作用、抗原呈递和细胞因子释放。这样的效应细胞例如但不限于T细胞、自然杀伤(NK)细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、红细胞和抗原呈递细胞。对效应细胞适合的特异性的实例包括但不限于对T细胞有特异性的CD2、CD3、CD5、CD28和T细胞受体(TCR)的其它成分；对NK细胞有特异性的CD16、CD38、CD44、CD56、CD69、CD335(NKp46)、CD336(NKp44)、CD337(NKp30)、NKp80、NKG2C和NKG2D；对粒细胞有特异性的CD18、CD64和CD89；对单核细胞和巨噬细胞有特异性的CD18、CD64、CD89和甘露糖受体；对树突细胞有特异性的CD64和甘露糖受体；对红细胞有特异性的CD35。在本发明的某些方面，效应细胞的那些特异性，即细胞表面分子，适用于在双特异性抗体与这样的细胞表面分子结合后介导细胞的杀伤，并由此诱导细胞溶解或凋亡。
“靶细胞”通常是指这样的位点，应将效应细胞引导到所述位点，以诱导或引发相应的生物反应，例如免疫反应。靶细胞的实例可以是肿瘤细胞或致病原，如病毒或细菌病原体，例如登革热病毒、单纯疱疹、流感病毒、艾滋病毒或携带自体免疫靶标如IL-2、自身免疫标记物或自身免疫抗原的细胞。
在本发明的优选实施方案中，二聚抗原结合分子对肿瘤细胞和效应细胞、特别是T细胞或NK细胞具有双特异性。对肿瘤细胞的合适的特异性可以是在相应的肿瘤细胞上的肿瘤抗原和细胞表面抗原，例如特异性肿瘤标记物。这种双特异性二聚抗原结合分子与肿瘤细胞和免疫效应细胞同时结合，从而引发由T细胞或NK细胞诱导的细胞毒性反应。本文所用的术语“肿瘤抗原”包含肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)。“肿瘤相关抗原”是指在肿瘤细胞上存在的蛋白，以及在胎儿期间(曾经的胚胎抗原)和出生后在所选的器官中的正常细胞上存在的蛋白，但其浓度远远低于在肿瘤细胞中的浓度。TAA也可以存在于肿瘤细胞附近的间质中，但以较低的量在体内其他间质中表达。相反，术语“肿瘤特异性抗原”(TSA)是指肿瘤细胞表达的蛋白。术语“细胞表面抗原”是指细胞表面上的能够被抗体识别的抗原或其片段。
对肿瘤细胞的特异性的实例包括但不限于，如现有技术所述的CD19、CD20、CD30、层粘连蛋白受体前体蛋白、EGFR1、EGFR2、EGFR3、Ep-CAM、PLAP、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、MUC-1(粘蛋白)、IGFR、CD5、IL4-Rα、IL13-R、FcεRI和IgE。
在一个实施方案中，对效应细胞的特异性可以是CD3或CD16，对肿瘤细胞的特异性可以选自CD19、CD20、CD30、层粘连蛋白受体前体、Ep-CAM、EGFR1、EGFR2、EGFR3、PLAP、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、MUC-1(粘蛋白)、IGFR、CD5、IL4-Rα、IL13-R、FcεRI和IgE。这样的抗原结合分子的具体实例对CD3和CD19或CD16和CD30具有双特异性。
在本发明的某一方面，第一结构域VLA和第四结构域VHA对肿瘤细胞具有特异性，且其他两个结构域，即第二结构域VHB和第三结构域VLB对效应细胞特别是T细胞或NK细胞具有特异性。在一个实施方案中，第一结构域VLA和第四结构域VHA对肿瘤细胞具有特异性，且其他两个结构域，即第二结构域VHB和第三结构域VLB对CD13或CD16具有特异性。在某个实施方案中，第一结构域VLA和第四结构域VHA对CD19、CD20、层粘连蛋白受体前体、Ep-CAM、EGFR1、EGFR2、EGFR3、PLAP、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、MUC-1(粘蛋白)、IGFR、CD5、IL4-Rα、IL13-R、FcεRI具有特异性，且其他两个结构域，即第二结构域VHB和第三结构域VLB对CD3具有特异性。
在本发明的另一方面，第一结构域VLA和第四结构域VHA对效应细胞特别是T细胞和NK细胞具有特异性，且其他两个结构域，即第二结构域VHB和第三结构域VLB对肿瘤细胞具有特异性。在一个实施方案中，第一结构域VLA和第四结构域VHA对CD3或CD16具有特异性，且其他两个结构域，即第二结构域VHB和第三结构域VLB对肿瘤细胞具有特异性。在特别优选的实施方案中，第一结构域VLA和第四结构域VHA对CD3具有特异性，且其他两个结构域，即第二结构域VHB和第三结构域VLB对选自CD19、CD20、CD30、层粘连蛋白受体前体、Ep-CAM、EGFR1、EGFR2、EGFR3、PLAP、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、MUC-1(粘蛋白)、IGFR、CD5、IL4-Rα、IL13-R、FcεRI和IgE的肿瘤细胞具有特异性。
CD3抗原与T细胞上的T细胞受体复合物连接。在效应细胞的特异性是CD3的情况下，本发明的二聚抗原结合分子与CD3的结合可在靶细胞上引发T细胞的细胞毒性。即，通过二聚抗原结合分子与CD3和靶细胞例如肿瘤细胞的双特异性结合，可以诱导靶细胞的细胞裂解。对CD3具有特异性的二聚抗原结合分子以及它们的产生是现有技术中已知的(例如在Kipriyanovetal.,1999,JournalofMo-lecularBiology293:41-56和LeGalletal.,2004,ProteinEngineering,Design&Selection,17/4:357-366中描述)。
单特异性抗CD3抗原结合分子因结合并调节T细胞受体的免疫抑制特性众所周知(例如，如同WO2004/024771中所述)。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子对CD3和白蛋白具有双特异性，其作为免疫抑制剂在例如移植中使用。
CD16(FcγIIIA)抗原是在NK细胞的表面上表达的受体。NK细胞具有固有的细胞活性，并且通过本发明的二聚抗原结合分子与CD16的双特异性结合，可以引发NK细胞对靶细胞的细胞活性。例如在Arndt等(Arndtetal.,1999,Blood,94:2562-2568)中描述了对CD16具有特异性的双特异性抗原结合分子的实例。在本发明的具体实施方案中，重链可变结构域或轻链可变结构域的至少一个来自WO2006/125668所述的抗CD-16抗体，特别是识别CD16A亚型但不识别CD16B亚型的抗体。
其中肿瘤特异性是针对CD19抗原的本发明的二聚抗原结合分子，可用于B-细胞恶性肿瘤的免疫治疗，因为CD19抗原表达于从淋巴细胞白血病(ALL)到非霍奇金淋巴瘤(NHL)的几乎所有的B-谱系恶性肿瘤。特别是对于治疗非霍奇金淋巴瘤，可以使用对CD19或CD20具有特异性的二聚抗原结合分子。对CD19具有特异性的二聚抗原结合分子和它们的产生在本领域中是已知的(描述于例如Cochloviusetal.,2000,CancerResearch60:4336-4341中)。
其中肿瘤特异性是针对层粘连蛋白受体或层粘连蛋白受体前体的本发明的二聚体抗原结合分子,可用于治疗例如但不限于B-细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、特别是在转移性癌症或微小残留癌症的情况。对层粘连蛋白受体前体具有特异性的抗原结合分子描述于例如Zuber等(Zuberetal.,2008,J.Mol.Biol.,378:530-539)中。
其中肿瘤特异性是针对EGFR1的本发明的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗其中上调或改变EGFR1的表达的癌症，例如在乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、前列腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌和神经胶质瘤中。
其中肿瘤特异性是针对TF-抗原的本发明的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗乳腺癌或结肠癌和/或肝转移癌。
其中肿瘤特异性是针对CD30的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗霍奇金病。对CD30具有特异性的抗原结合分子描述于例如Arndt等(Arndtetal.,1999,Blood,94:2562-2568)。
其中肿瘤特异性是针对IL4受体的α链(IL4Rα)的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗实体瘤，特别是乳腺癌、卵巢癌，泌尿系统癌、头颈癌、恶性黑色素瘤和AIDS相关的卡波西肉瘤。其中至少一种另外的特异性是针对EGFR3/HER3和/或EGFR2/neu的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗乳腺癌。其中肿瘤特异性是针对IGFR的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌。
其中肿瘤特异性是针对CD5的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗慢性淋巴细胞性白血病。
其中肿瘤特异性是针对MUC-I的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗胃癌和卵巢癌。
其中肿瘤特异性是针对EpCAM的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗结肠癌、肾脏癌、乳腺癌。
其中肿瘤特异性是针对PLAP的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗卵巢癌或睪丸癌。
其中肿瘤特异性是针对OFA-iLR的二聚抗原结合分子，可特别用于治疗转移性肿瘤。
在本发明的某一方面，本文所述的抗原结合分子是二聚体且对CD3和CD19有双特异性，或者所述抗原结合分子是二聚体且对CD16和CD19有双特异性。在其具体的实施方案中，第一结构域VLA和第四结构域VHA分别对CD3和CD16有特异性，而第二结构域VHB和第三结构域VLB对CD19有特异性。在这两种情况下，第一多肽链和第二多肽链的每条从多肽链的N-末端到C-末端的结构域顺序均为VL CD3-VH CD19-VL CD19-VH CD3或VL CD16-VH CD19-VL CD19-VH CD16。在优选的实施方案中，第一、第二、第三和第四结构域是人源化的或完整人类的。在最优选的实施方案中，如上定义的第一多肽链和第二多肽链是人源化或完整人类的。在本发明的另一方面，二聚抗原结合分子可以对例如EpCAM和CD3；白蛋白（如HSA）和CD3；或EGFR和CD3具有双特异性。
在本发明的又一方面，本文所述的抗原结合分子对白蛋白如人血清白蛋白(HSA)和不同于白蛋白的另一抗原有特异性。这种抗原结合分子与血清白蛋白结合，从而提高了血清中和体内的血清半衰期。因此，这种抗原结合分子对医疗或诊断用途以及药物组合物是有利的，其中这种抗原结合分子的多肽包含治疗性或诊断性抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域，以及对白蛋白有特异性的轻链可变结构域和重链可变结构域。已知的和/或市售的治疗性、诊断性或抗白蛋白抗体可用作轻链可变结构域和重链可变结构域的来源。此外，培育和产生对白蛋白如HSA有特异性的抗体或Fv片段是本领域已知的。在这种抗原结合分子中，多肽链的结构域按照VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列，其中抗原A或抗原B是白蛋白。在优选的实施方案中，白蛋白为抗原A。在本发明的某一方面，其他抗原是CD3。在具体的实施方案中，抗原A是人血清白蛋白(HSA)，如实施例2所示，HSA×CD3抗原结合分子的多肽的结构域顺序为VL HSA-VH CD3-VL CD3-VH HSA。为了生成这种抗原结合分子，可以生成抗HSA和抗CD3抗体或抗体片段的可变结构域，并通过替换所示的抗CD3和抗CD19的结构域或任何其它合适的表达质粒或表达构建体，以例如类似于实施例1中对CD3×CD19描述的相应的顺序，将其插入图7所示的表达质粒中。
本发明的又一方面，提供了根据上述实施方案的任一个的二聚抗原结合分子，其与其他功能单元连接，所述其他功能单元例如功能结构域或功能介质，其独立地介导生物功能，特别是生化反应。所述其他功能单元可以与二聚抗原结合分子的两条单独的多肽链中的至少一条络合或共价结合。在一个方面，所述其他功能单元可以仅与各条多肽链中的一条共价结合，在另一方面，所述其他功能单元可以与二聚抗原结合分子的两条多肽链共价结合，从而将两条多肽链连接。在其他方面，两个多肽链中的每条分别与其他功能单元共价结合。当所述其他功能单元与两条多肽链的至少一条共价连接时，可将所述其他功能单元通过肽键或肽连接体与两条多肽链的至少一条融合。可选地，通过化学共轭如二硫键（例如位于至少一条多肽链的半胱氨酸残基和其他功能单元的半胱氨酸残基之间）、酯连接体或通过化学交联，可连接其他功能单元。在本发明的某一方面，所述其他功能单元可通过可分裂的连接体例如二硫键与抗原结合分子连接。
所述其他功能单元可以连接至第一多肽链和/或第二多肽链的N-末端或C-末端。如果一个其他功能单元同时与第一多肽链和第二多肽链连接，所述其他功能单元可以连接一条多肽链的N-末端，且连接另一条多肽链的C-末端。
用于多肽链与其它功能单元如其他多肽或介质的化学交联的同源双功能和异源双功能试剂是本领域熟知的。实例包括但不限于5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(O-PDM)、琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、N-琥珀酰亚胺S-乙酰基硫代醋酸盐(SATA)、琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)或4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)。例如Graziano等(Grazianoetal.,MethodsinMolecularBiology,2004,vol.283,71-85)和生物共轭技术(Hermanson,G.T.“BioconjugateTechniques”AcademicPress,London1996)中描述了用于包含免疫球蛋白链的多肽链与其他多肽或化学试剂交联的方法。
在一个方面，所述其他功能单元可以是至少一个其他可变免疫球蛋白结构域。所述其他可变免疫球蛋白结构域可对第一抗原A或第二抗原B有特异性，或者对不同于抗原A和抗原B的第三抗原C有特异性，二聚抗原结合分子的结合位点对所述第一抗原A或第二抗原B是特异性的。在某一方面，可将其他轻链可变结构域VL和其他重链可变结构域VH融合至两条多肽链中的每条，从而将一个其他的结构域、特别是VH融合至N-末端，而将另一个其他的结构域、特别是VL融合至C-末端，产生具有六个可变结构域的多肽，其将与另一条相同的多肽连接成具有六个抗原结合位点的二聚抗原结合分子。在另一方面，可将一个其他可变免疫球蛋白结构域融合至抗原结合分子的其中一条多肽链，然后其与具有与另一第三多肽相同特异性的互补可变免疫球蛋白结构域非共价连接，由此在二聚抗原结合分子和另一第三多肽之间形成另一抗原结合位点。在另一方面，可将包含scFv的另一抗原结合单元或双抗体作为其他功能单元连接至二聚抗原结合分子。
在某些方面，所述其他功能单元可以是本文所述的至少一个其他二聚抗原结合分子。因此，两个或多个本发明的二聚抗原结合分子可以互相连接，以提高抗原结合分子的化合价和亲和力(avidity)。
在另一方面，其他功能单元可以是效应结构域，包括Fc结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域或其片段。在与Fc受体结合的情况下，这类单元可以赋予抗原结合分子效应特性。这类功能单元可以进一步用于增长抗原结合分子的血清半衰期。
在另一方面，其他功能单元可以是酶。在酶能够将前药转化为活性药物的情况下，这类抗原结合分子可用于抗体依赖性酶前药疗法。为此，抗原结合分子将酶引导向目标组织，且当抗原结合分子与该组织结合时，在那个位点活化前药。进一步地，靶向酶的双特异性抗原分子用于癌症治疗的用途是本领域已知的，例如但不限于，对CD30和催化磷酸丝裂霉素转化为丝裂霉素醇的碱性磷酸酶具有特异性的双特异性抗原分子，以及对活化头孢菌素基的抗癌前药的胎盘碱性磷酸酶和β-内酰胺酶具有特异性的双特异性抗原分子。对用于纤维蛋白溶解的纤维蛋白和组织纤溶酶原活化剂具有特异性的双特异性抗原结合分子，以及缀合抗原结合分子的酶在酶基免疫测定中的用途也是合适的。
在另一方面，功能单元可以是药物、毒素、放射性同位素、淋巴因子、趋化因子或标记分子。这种抗原结合分子将功能单元递送至期望的作用位点。例如，可将与对肿瘤抗原有特异性的抗原结合分子连接的化疗药物递送到肿瘤细胞，以及可将毒素递送到病原体或肿瘤细胞。与毒素连接的抗原结合分子可用于靶向NK细胞或巨噬细胞，并优选对CD16有特异性。毒素的实例是，但不限于，核糖基转移酶、丝氨酸蛋白酶、鸟苷酸环化酶活化剂、钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶、核糖核酸酶、DNA烷化剂或有丝分裂抑制剂，例如：阿霉素。标记分子可以是例如荧光、发光或放射性标记的分子、金属螯合物或酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、脲酶、过氧化氢酶等)，当它与本发明的抗原结合分子连接时，在后来暴露于底物时将转而与底物以这种方式反应，以产生可被检测和用于体内成像或免疫测定中的化学部分。当用于免疫测定时，二聚抗原结合分子也可以固定于不溶性载体，例如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁珠。
为增长本发明的抗原结合分子在体内的血清半衰期，必要时，可将抗原结合分子融合至白蛋白或聚乙二醇化、唾酸化或糖基化(参见例如Storketal.,2008,J.Biol.Chem.,283:7804-7812)。或者对于另外的白蛋白与本发明的抗原结合分子的融合，如前所述，抗原结合分子自身可以对白蛋白和另一抗原有特异性。
任一前述实施方案的二聚抗原结合分子，可通过表达编码相互连接以形成二聚抗原结合分子的各条多肽链的多核苷酸来产生。因此，本发明的另一实施方案是编码本文上述的二聚抗原结合分子的多肽链的多核苷酸，例如DNA或RNA。
可通过熟练技术人员已知的方法构建所述多核苷酸，例如通过将编码由肽连接体分开或直接通过肽键连接的第一结构域VLA、第二结构域VHB、第三结构域VLB和第四结构域VHA的基因，并入与合适的启动子、并任选地与合适的转录终止子可操作地连接的单一基因构建体，并且将其在细菌或其他适合的表达系统中表达。根据所使用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译要素，包括组成型和诱导型启动子。选择启动子，以使其驱动多核苷酸在相应宿主细胞中表达。
随着改变密码子偏好可以对多核苷酸进行密码子优化，以适用于在所选择的宿主中特异性表达。
可将多核苷酸插入载体中，优选表达载体，其代表本发明的另一实施方案。可根据本领域技术人员已知的方法构建这些重组载体；参见例如Sambrook,MolecularCloningALaboratoryManual(分子克隆:实验室手册),ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y.)。
可使用各种表达载体/宿主系统，以容纳和表达编码本发明的多肽链的多核苷酸。这些包括但不限于，用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的微生物如细菌、用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病病毒TMV)或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统，为此，可以使用例如基于病毒的表达系统。
特别优选的用于在大肠杆菌中表达的表达载体是pSSK(LeGalletal.,JImmunolMethods.(2004)285(1):111-27)或用于在哺乳动物细胞中表达的pcDNA5(Invitrogen)。
因此，可通过将上述的编码多肽链的多核苷酸或载体引入宿主细胞，并在表达多肽链的条件下培养所述宿主细胞，产生本文所述的二聚抗原结合分子。可以分离并任选地纯化从表达的多肽链获得的二聚抗原结合分子。用于宿主细胞生长和维持的条件、从这些宿主细胞而来的本发明的二聚抗原结合分子的表达、分离与纯化完整地描述于现有技术中。
在本发明的另一实施方案中，提供了包含本文上述的二聚抗原结合分子或多核苷酸以及至少一种其他成分的组合物。为了用于预防或治疗疾病或紊乱，含有二聚抗原结合分子或编码形成所述抗原结合分子的多肽链的多核苷酸分子的组合物优选与合适的药学上可接受的载体组合。术语“药学上可接受的载体”意味着包括不干预成分的生物活性的有效性并且对施用的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的实例是本领域熟知的，包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。这样的载体可通过常规方法制备，并以合适的剂量施用于个体。优选地，组合物为无菌的。这些组合物也可以包含辅药，例如防腐剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂可确保预防微生物的作用。可通过不同途径施用合适的组合物来发挥作用，例如通过静脉给药、腹腔内给药、皮下给药、肌内给药、外用或皮内给药。给药途径当然取决于治疗的种类以及包含在药物组合物中的化合物的种类。剂量方案将由主治医生和其他临床因素来确定。如医学领域中所熟知的，对于任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身形大小，体表面积、年龄、性别、待施用的具体化合物、给药时间和途径、治疗类型、大体的健康状况和同时施用的其他药物。
本发明还提供了一种医疗用途或方法，其中将如上文所述的二聚抗原结合分子以有效的剂量施用于个体,例如患者，用于例如移植的免疫抑制治疗、治疗自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性疾病、过敏或癌症(例如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病；霍奇金淋巴瘤、实体瘤例如发生于乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾脏癌或胆管癌中的那些；微小残留疾病；转移性肿瘤例如在肺部、骨骼、肝脏或大脑中的转移的那些)。所述抗原结合分子可以单独或与现有疗法结合用于预防或治疗环境中。
可使用本发明的抗原结合分子来治疗癌症，包括但不限于：原发性和转移性肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、CNS肿瘤、外周CNS癌症、乳腺癌、巨淋巴结增生症、子宫颈癌、儿童非霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤文家族(Ewing’sfamily)肿瘤(例如尤文氏肉瘤)、眼癌、胆囊癌，胃肠道类癌、胃肠道间质瘤，妊娠滋养细胞疾病、毛细胞白血病、霍奇金病、卡波济氏肉瘤、肾脏癌、喉癌和下咽癌、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、儿童白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、肝癌、肺癌、肺类癌肿瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌，恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、骨髓增生性紊乱，鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤，口腔癌和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤、唾液腺癌，肉瘤(成人软组织癌)、黑素瘤皮肤癌、非黑素瘤皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌症(如子宫肉瘤)、阴道癌、外阴癌，和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)。
“有效剂量”指足以影响疾病的过程和严重程度、导致这种病例的减少或缓解的活性成分的量。用于治疗和/或预防这些疾病或紊乱的“有效剂量”可以使用本领域技术人员已知的方法来确定(参见例如Fingletal.,ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,GoddmanandGilman,eds.MacmillanPublishingCo.,NewYork,pp.1-46(1975))。
在本发明的另一方面，本文上述的二聚抗原结合分子用于制备免疫抑制药物或用于治疗自身免疫疾病、炎性疾病、传染病、过敏或癌症(例如非霍奇金淋巴瘤；慢性淋巴细胞性白血病；霍奇金淋巴瘤；实体瘤如发生于乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肾脏癌或胆管癌中的那些；微小残留疾病；转移性肿瘤如在肺、骨骼、肝脏或脑中转移的那些)的药物。上文以描述过其中指定的多特异性结合分子在特定疾病的治疗中具有特殊用途，这些结合分子也可以在用于该特定疾病的药物的制备中使用。
本领域技术人员已知制备药物组合物即药物的方法，以及抗原结合分子在预防和/或治疗疾病如癌症的临床应用。
在本发明的具体方面，二聚抗原结合分子是双特异性的且用于癌症治疗，因为这种抗体可以用于重新靶向针对肿瘤细胞的细胞毒性效应细胞。这种治疗理念在本领域中是已知的。例如临床研究显示，用抗CD3×抗肿瘤双特异性抗体(例如Canevari,S.etal.,J.Natl.CancerInst.,87:1463-1469,1996)治疗的患者或用抗CD16×抗肿瘤双特异性抗体(例如Hartmannetal.;ClinCancerRes.2001;7(7):1873-81)治疗的患者体内的肿瘤消退。概念验证也已证明用于多种仅含有可变结构域(Fv)的重组特异性抗体分子，例如结构域顺序为VHA-VLB-VHB-VLA的二聚且四价的CD3×CD19抗原结合分子(Cochloviusetal.;CancerResearch,2000,60:4336-4341)，或者近期用-format的单体的单链Fv抗体分子(twosingle-chainantibodiesofdifferentspecificitieslinkedtogether，连接在一起的不同特异性的两个单链抗体；MicrometAG,Germany;BargouR.etal.,Science,2008,321(5891):974-977;BaeuerlePAandReinhardtC.,CancerRes.2009,69(12):4941-4944))进行的临床研究。本文所述二聚抗原结合分子可用作药物，并应用于以与本领域的双特异性抗体类似的治疗方法中，因为它们能够使用相同组合的抗体特异性重新定向治疗机制如细胞毒性机制。此外，已知对CD3有单特异性的免疫抑制抗体，如莫罗莫那-CD3(Muromonab-CD3)用于治疗移植排斥反应、肾移植(同种异体移植)、肝和心脏移植的急性排斥反应。因此，对白蛋白和CD3有双特异性的抗原结合分子可用于如已知的单特异性抗CD3抗体的相同治疗方法中。此外，如本文所述的，对白蛋白和另一抗原即治疗或诊断靶标有特异性的抗原结合分子可以用于除白蛋白外的抗原特异性的相应临床应用。抗原结合分子及其组合物可以是口服、静脉注射、腹腔注射形式的，或者是其他药学上可接受剂型。在一些实施方案中，所述组合物是口服的，且剂型为药片、胶囊、药丸(caplet)或其他可用口服剂型。在一些实施方案中，所述组合物是不经肠胃的，如静脉的、腹膜内的、肌内或皮下注射，通过包含抗原结合分子的溶液的方式进行给药。
通过使用本领域已确立的技术和已知的标准方法，参见例如分子克隆A实验室手册(Sambrook,MolecularCloningALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y.)、蛋白质操作手册(TheProteinProtocolsHandbook,由JohnM.Walker编辑，HumanaPressInc.(2002))，或BennyK.C.Lo编辑的Antibodyengineering:methodsandprotocols(抗体工程：方法与操作)、BennyK.C.IISeries:Methodsinmolecularbiology(BennyK.C.II系列：分子生物学方法)(Totowa,N.J.)。本领域技术人员将容易地毫无负担地构建并获得本文所述的抗原结合分子。此外，通过使用本领域已知的标准方法并修改描述于US7129330、Kipriyanovetal.J.Mol.Biol.(1999)293,41-56或LeGalletal.,2004,ProteinEngineering17:357-366中的方法，本领域技术人员将能够制备本文所述的抗原结合分子，从而获得上述的包含两条多肽链的二聚抗原结合分子，所述多肽链从每条多肽链的N-末端到C-末端的结构域顺序为VLA-VHB-VLB-VHA。
以下实施例进一步说明了本发明，但并不限制本发明的范围。
实施例1:
为使用除VHA-VLB-VHB-VLA外的结构域排列方式构建功能化二聚串联双抗体()，分别使用人源化抗CD19单链抗体和人源化抗CD3单链抗体的两个结构域以本发明的VLA-VHB-VLB-VHA的结构域排列方式构建数个这样的二聚串联双抗体。同时对人源化抗CD39抗体和人源化抗CD3抗体进行亲和力成熟过程，使用每一抗原结合分子的两个变体来确认代表所述亲和力成熟过程的不同阶段的产物的结果。
分别针对CD19和CD3的鼠单克隆抗体HD37和UCHT是用于获得具有相对高亲和力的人源化抗体的起始原料。在每种情况中，首先在scFv噬菌粒载体中将VH结构域与人VL文库结合，以通过噬菌体显示选择合适的人VL链。在第二步中，将所选择的人VL链与其中CDR3区保持恒定的VH结构域的文库结合。这个过程会分别产生人源化抗CD19和抗CD3，其在VHCDR3区仅包含短的鼠序列。随后在被认为参与抗原结合的残基处引入点突变对这些克隆进行亲和力成熟。然后通过噬菌体展示筛选最佳的结合突变体。所选的用于构建TandAb的克隆是与CD19结合的M13和M39，以及与CD3结合的C4和LcHC21。
产生了以下抗体：
抗体A1：
CD19M39×CD3C4(选项0)VH CD3C4-VL CD19M39-VH CD19M39-VL CD3C4
抗体B：
CD19M39×CD3C4(选项2)VL CD3C4-VH CD19M39-VL CD19M39-VH CD3C4
抗体A2:
CD19M13×CD3LCHC21(选项0)
VH CD3LCHC21-VL CD19M13-VH CD19M13-VL CD3LCHC21
抗体C:
CD19M13×CD3LCHC21(选项2)
VL CD3LCHC21-VH CD19M13-VL CD19M13-VH CD3LCHC21
通过DNA工程和加工供应商来产生编码抗体B的杂合单体VL CD3C4-VH CD19M39-VL CD19M39-VH CD3C4与抗体C的杂合单体VL CD3LCHC21-VH CD19M13-VL CD19M13-VH CD3LCHC21的质粒。VL CD3C4-VH CD19M39-VL CD19M39-VH CD3C4单体的序列主链分别包括两个scFv抗体即scFvCD19M39和scFvCD3C4的DNA序列。VL CD3LCHC21-VH CD19M13-VL CD19M13-VH CD3LCHC21单体序列与单链FvCD19M13和单链FvCD3LCHC21的可变结构域结合。通过噬菌体显示筛选针对抗原CD19和CD3的单链抗体，获得所有的四个scFv。在这两种情况下，序列信息用于构建以上的杂合单体。使用9个氨基酸(G2S)3连接体使结构域相互连接。将编码VL CD3C4-VH CD19M39-VL CD19M39-VH CD3C4的合成基因克隆入哺乳动物表达载体pCDNA5FRT(Invitrogen)。VL CD3LCHC21-VH CD19M13-VL CD19M13-VH CD3LCHC21的基因也克隆入表达载体中，并使用引入NcoI切割位点的正向引物和引入NotI切割位点的反向引物通过PCR对其扩增。用琼脂糖凝胶分析和分离后，随后将PCR产物用NcoI和NotI进行双酶切，并将其克隆入NcoI和NotI线性化pSKK3载体。通过DNA测序证实正确的克隆。
图6示出了编码抗体B的pCDNA5FRT的载体图。图7示出了编码抗体C的pSKK3的载体图。
为了高水平的产生，将包含VL CD3C4-VH CD19M39-VL CD19M39-VH CD3C4的基因的载体瞬时转染(使用CaPO4)至贴壁HEK293细胞中。在本领域熟知的生长条件下进行蛋白发酵。
将重组蛋白表达为具有信号肽的His标签融合蛋白。正如所描述的(Kipriyanovetal.,1999,J.Mol.Biol.,293,41-56)，通过固相金属亲和层析(IMAC)从细胞培养上清液中分离蛋白质。随后通过SDS-PAGE分析纯化的材料。SDSPAGE凝胶的考马斯染色和在磷酸钠缓冲液(30mMNaPO4,0.75M精氨酸/HCl，pH6.0)中在校准过的Superdex200HR10/30柱(AmershamPharmacia,Freiburg,Germany)上进行的尺寸排阻层析，显示纯的且正确组装的重组蛋白(抗体B)。
为了高水平表达，将编码6×His标签跟随的人源化VL CD3LCHC21-VH CD19M13-VL CD19M13-VH CD3LCHC21单体的该基因克隆到包含hok/sok基因细胞自杀系统和编码Skp/OmpH周质因子的skp基因的pSKK3质粒中(LeGalletal.,2004,J.Immunol.Methods,285,111-127)。将质粒转染至大肠杆菌K12菌株(ATCC31608TM)中。
使转化的细菌在摇瓶中生长并基本如前述方法(Cochloviusetal.,2000,J.Immunol.,165,888-895)进行诱导。如同已经描述的，通过固相金属亲和层析(IMAC)从可溶性周质级分和细菌培养基上清液中分离重组蛋白(Kipriyanovetal.,1999,J.Mol.Biol.,293,41-56)。
随后通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE以及在磷酸钠缓冲液(30mMNaPO4,0.75M精氨酸/HCl，pH6.0)中在校准过的Superdex200HR10/30柱(AmershamPharmacia,Freiburg,Germany)上进行的尺寸排阻层析来分析纯化的物质。产物看起来是纯的且是正确组装的。
以与抗体B和C同样的方式分别生成比较抗体A1和A2，其中抗体A1和A2的结构域顺序分别与抗体B和C的结构域顺序相反。
基本按照T.Dreieretal.(2002,IntJCancer100,690-697)中的描述进行细胞毒性试验。通过密度梯度离心法从健康个体的外周血中分离出用作效应细胞的PMBC。在一些情况中，在PBMC在细胞毒性试验中用作效应细胞前，将它们在存在25U/mL人IL-2的条件下培养过夜。在每种情况中，通过流式细胞仪来检测分离的PBMC的纯度和抗原表达(数据未示出)。
将CD19+JOK-1或淋巴瘤靶细胞培养于补充有10%FCS、2mM的L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠盐和100μg/mL硫酸链霉素的RPMI1640培养基(本文中称为RPMI培养基；所有组分均来自Invitrogen)。对于细胞毒性试验，在37℃和不含FCS的RPMI培养基中，用10μM的钙黄绿素AM(分子探针/Invitrogen)将细胞标记30min(分钟)。在温和地清洗后，将标记细胞以1×105/mL的密度悬浮于RPMI培养基中。然后将1×104个靶细胞连同具有所示抗体的5×105个PBMC以200μL/孔的总体积接种于圆底96孔微孔板中的各个孔中。在200g离心2min后，将试样在37℃和具有5%CO2的潮湿环境中孵育4h。孵育结束前15min，仅向具有靶细胞的孔中加入RPMI培养基中的20μL10%TritonX-100。向所有其他的孔中加入20μLRPMI培养基。在500g额外离心5min后，从每个孔采集100μL细胞培养上清液，并用荧光板读数器(Victor3,PerkinElmer)在520nm处测量所释放的钙黄绿素的荧光。基于所测量的数值，根据以下公式计算特异性细胞裂解：[荧光值(样品)-荧光值(自发)]/[荧光值(最大)-荧光值(自发)]×100%。荧光值(自发)代表在不含效应细胞和抗体的情况下来自靶细胞的荧光值，荧光值(最大)代表由加入TritonX100引起的总细胞裂解。使用Prism软件(GraphPad软件)计算S形剂量效应曲线和EC50值。
结果：
图3示出了使用抗CD19变体M39和抗CD3变体C4分别在N-末端起始的具有以下结构域顺序VHA-VLB-VHB-VLA(抗体A)和VLA-VHB-VLB-VHA(抗体B)的串联双抗体的细胞毒性试验结果。
令人惊讶的是，两种串联双抗体的细胞毒性存在非常大的差异。如在给定条件下通过比较串联双抗体的EC50值所确定的，具有本发明的结构域排列命名为“抗体B”的串联双抗体比命名为“抗体B”的串联双抗体的活性高60倍。
使用两个另外的抗CD19和抗CD3抗体的变体(见图4)确定本发明(抗体C)所代表的结构域顺序的较佳细胞毒性的优势。
具有由选项2表示的本发明的结构域顺序的串联双抗体的EC50值是极低的(0.1pM)。在给定条件下比较EC50值后得出，它的活性比选项0所代表的TandAb的活性高27倍。
实施例2:
在体外通过人血清白蛋白(HSA)×CD3TandAb抗体进行T细胞受体调节
为了确定具有不同结构域顺序的HSA×CD3TandAb抗体在T细胞中体外诱导T细胞受体(TCR)/CD3调节的效力是否不同，在存在浓度增加的双特异性HSA×CD3TandAb抗体的条件下体外培养CD3+白血病细胞，随后对其余的TCR进行分析。在存在或不存在HSA的条件下进行调节试验，以测量HSA对TandAb活性的影响。
简而言之，将1×106个白血病细胞接种于RPMI1640培养基中的圆底96孔微孔板的各个孔中，所述RPMI1640培养基补充有2mM的L-谷氨酰胺和100IU/mL青霉素G钠盐和100μg/mL硫酸链霉素(所有组分来自Invitrogen)。在不同的微孔板中，将白血病细胞接种于前述的RPMI培养基，但其中加入50mg/mLHSA(Sigma)。加入所示抗体后，在37℃和存在5%CO2的潮湿培养箱中以200μL/孔的总体积对细胞进行孵育。作为对照，在不含抗体的情况下培养细胞。在用补充有2%热灭活的FCS(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)和0.1%叠氮化钠(Roth,Karlsruhe,Germany)的冰冷磷酸盐缓冲盐水(PBS,Invitrogen,Karlsruhe,Germany)冲洗后，用总体积为100μL的FACS缓冲液中10μLPC5缀合的抗TCRα/β抗体(Beckman-Coulter)在黑暗下及冰中对细胞染色45。用FACS缓冲液冲洗两次后，用FC500MPL流式细胞仪(Beckman-Coulter)在675nm下测量104个细胞的荧光。平均荧光值使用CXP软件来确定，并用于使用Windows用GraphPadPrism3.03版本(GraphPad软件，SanDiegoCaliforniaUSA)通过非线性回归/4参数对数拟合进行分析。
从图5描绘的TCR调节实验CAB-306获得的并总结在表1中的结果展示了结构域顺序为VHA-VLB-VHB-VLA(=选项0)和VLA-VHB-VLB-VHA(=选项2)(其展示了当HSA是抗体B时的调节功效)的HSA×CD3TandAb的比较的TCR调节功效。然而，在存在生理浓度的HSA的情况下，选项0(VHA-VLB-VHB-VLA)TandAb的调节效果大幅降低，而在选项2(VLA-VHB-VLB-VHA)方向中TandAb的EC50值仅以2.6的系数增大。
这些数据清楚地表明，相比HSA×CD3TandAb选项0(VHA-VLB-VHB-VLA)，以选项2(VLA-VHB-VLB-VHA)的结构域方向的HSA×CD3TandAb具有优异的性质。
表1：TCR调节实验结果的总结：通过非线性回归/4参数对数拟合的方法确定两种HSA×CD3TandAb抗体在存在或不存在HSA的情况下(图5；实验CAB-306)的TCR调节实验的EC50值。
本文中示出并描述了本发明的优选实施方案，对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅是以示例的方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可做出多种变体、变化以及替换。应理解，本文所述的本发明的实施方案的各种变体可用于实施本发明。意图是，权利要求限定本发明的保护范围，且这些权利要求的范围中的方法和结构以及其等同物都涵盖于其中。

Claims (15)

1.二聚抗原结合分子，由第一多肽链和第二多肽链构成，所述第一多肽链和第二多肽链中的每条链均含有：
第一结构域VLA，其是对第一抗原A有特异性的轻链可变结构域；
第二结构域VHB，其是对第二抗原B有特异性的重链可变结构域；
第三结构域VLB，其是对所述第二抗原B有特异性的轻链可变结构域；
第四结构域VHA，其是对所述第一抗原A有特异性的重链可变结构域；
其中，
所述结构域从所述多肽链的N-末端到C-末端按VLA-VHB-VLB-VHA的顺序排列在所述第一多肽链和第二多肽链的每条链中，
所述第一结构域VLA通过第一连接体L1与所述第二结构域VHB连接，所述第二结构域VHB通过连接体L2与所述第三结构域VLB连接，以及所述第三结构域VLB通过第三连接体L3与所述第四结构域VHA连接；
所述连接体L2由12个或更少的氨基酸残基构成，以及
所述第一多肽链的所述第一结构域VLA与所述第二多肽链的所述第四结构域VHA连接，以形成所述第一抗原A的抗原结合位点；
所述第一多肽链的所述第二结构域VHB与所述第二多肽链的所述第三结构域VLB连接，以形成所述第二抗原B的抗原结合位点；
所述第一多肽链的所述第三结构域VLB与所述第二多肽链的所述第二结构域VHB连接，以形成所述第二抗原B的抗原结合位点；和
所述第一多肽链的所述第四结构域VHA与所述第二多肽链的所述第一结构域VLA连接，以形成所述第一抗原A的抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽链和所述第二多肽链非共价连接。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是四价的。
4.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是双特异性的，且所述第一抗原A或所述第二抗原B是白蛋白。
5.根据权利要求1所述抗原结合分子，其中所述抗原结合分子对(i)HSA与CD3，(ii)CD3与CD19或(iii)CD16与CD19是双特异性的。
6.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述结构域是人结构域或人源化结构域。
7.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子包含至少一个其他功能单元。
8.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子对B-细胞、T-细胞、自然杀伤(NK)细胞、骨髓细胞或吞噬细胞有特异性。
9.根据权利要求8所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是双特异性的，所述抗原结合分子还对肿瘤细胞有特异性。
10.根据权利要求9所述的抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子对(a)存在于肿瘤细胞上的抗原和(b)T细胞或NK细胞是特异性的。
11.根据权利要求10所述的抗原结合分子，其中所述第一轻链可变结构域(VLA)和所述第一重链可变结构域(VHA)对CD3或CD16是特异性的。
12.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中所述连接体L1和L3由12个或更少的氨基酸残基构成。
13.根据权利要求12所述的抗原结合分子，其中所述连接体L1、L2、以及L3由3-10个氨基酸残基构成。
14.一种组合物，其包含权利要求1-11中任一项所述的抗原结合分子和药学上可接受的载体。
15.权利要求14所述的组合物在制备用于免疫抑制治疗、治疗自身免疫性疾病、炎性疾病、感染性疾病、过敏或用于治疗癌症的药物中的用途。
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