JP2022551836A - Ｂｃｍａを標的とする抗体、二重特異性抗体及びその用途 - Google Patents

Ｂｃｍａを標的とする抗体、二重特異性抗体及びその用途 Download PDF

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Abstract

ＢＣＭＡを標的とする抗体、ＢＣＭＡとＣＤ３を標的とする二重特異性抗体及びその使用を提供する。前記ＢＣＭＡを標的とする抗体は２つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号２２、配列番号３３、配列番号４２のアミノ酸配列に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、又は配列番号２６、配列番号３７、配列番号４１のアミノ酸配列に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む。当該抗体は効果的にヒトＢＣＭＡを標的にしてカニクイザルＢＣＭＡと結合し、二重特異性抗体は効果的にヒトＢＣＭＡ及びヒトＣＤ３の両方を標的にしてカニクイザルＢＣＭＡ及びカニクイザルＣＤ３と結合できる。

Description

本願には出願日が２０１９年９月３０日の中国特許出願第２０１９１０９４１３１１０号の優先権が主張され、前記中国特許出願の全文が引用される。
本発明は、バイオ医薬品分野に関し、特に、ＢＣＭＡを標的とする抗体、二重特異性抗体及びその使用に関する。
ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ２６９）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する膜貫通型タンパク質である。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟、成長と生存に関与する非グリコシル化膜貫通型タンパク質である。ＢＣＭＡはＴＮＦスーパーファミリーの２つのリガンド、高親和性リガンドＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）及び低親和性リガンドＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）の受容体である。ＢＣＭＡは高度に分化した形質細胞選択的タンパク質であり、その発現はＢ細胞系統に限定され、且つ主に形質細胞と形質芽細胞に存在し、ある程度はメモリーＢ細胞に存在するが、末梢血のＢ細胞には存在しない。ＢＣＭＡは多発性骨髄腫（ＭＭ）患者の悪性形質細胞において発現され、多発性骨髄腫細胞の成長と生存をサポートする。
多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に次いで２番目の血液悪性腫瘍で、悪性腫瘍では約１％を、血液悪性腫瘍では１３％を占め、悪性腫瘍による死亡では２％を占めている。骨髄腫細胞は一般に骨髄と骨の海綿状の軟組織で増殖し、溶骨性骨破壊を引き起こす。貧血、腎不全や骨髄腫細胞の髄外浸潤によって引き起こされる様々な障害を伴うため、予後が不良である。２００６年時点で、ＭＭの５年相対生存率は約３４％で、現行のＭＭの療法は全て完治するものではない。多発性骨髄腫の新たな標的として、ＢＣＭＡ抗体は様々なメカニズムによってＭＭ細胞に働きかけることができ、ＢＣＭＡの研究開発は主にモノクローナル抗体、ＣＡＲ－Ｔ療法、ＡＤＣ及び二重特異性抗体療法に集中している。
既存抗体１（以下、陽性コントロール１とも呼ばれ、実施例では番号がＰＲ０００２７４である）はグラクソ・スミスクライン（ＧＳＫ）社の抗ＢＣＭＡ抗体ＣＡ８－Ｊ６Ｍ０ ｈＩｇＧ１であり、ＧＳＫ社によって開発された抗ＢＣＭＡ抗体ＣＡ８－Ｊ６Ｍ０に基づく抗体－薬物複合体ベランタマブマフォドチン（ｂｅｌａｎｔａｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）（ＣＡ８－Ｊ６Ｍ０－ｍｃＭＭＡＦ、ＧＳＫ２８５７９１６）は現在、複数の臨床試験で様々なタイプのＭＭ患者を治療するために使用されている。当該コントロール抗体の配列は（Ｔａｂｓ－Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄａｔａｂａｓｅ）に由来する。小規模な臨床試験のデータによると、必要以上に治療を受けた（殆どの患者は少なくとも５種の治療を受けて失敗した）再発性又は難治性（Ｒ／Ｒ）多発性骨髄腫（ＭＭ）患者３５例で、客観的奏効率（ＯＲＲ）は６０％に達しており、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値は１２ヶ月であった。安全性に関しては、最も一般的な副作用としては角膜関連、血小板減少症、貧血が挙げられ、これらはいずれもＡＤＣにおいて結合した細胞毒性薬に関連している。
現在で、臨床開発中の二重特異性抗体はアムジェン社のＡＭＧ－４２０、リジェネロン社のＲＥＧＮ－５４５８、セルジーン社のＣＣ－９３２６９、ジョンソン・エンド・ジョンソン社のＪＮＪ－６４００７９５７、アッヴィ社のＴＮＢ３８３Ｂがある。しかし、これらの二重特異性抗体には半減期が短い、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの問題がある。既存抗体２（以下、陽性コントロール２とも呼ばれ、実施例では番号がＰＲ００２１９９である）はＴｅｎｅｏｂｉｏ社の特許ＷＯ２０１８０５２５０３に由来する抗ＢＣＭＡ（ＴＮＢ３０８９０２）×ＣＤ３（ＴＮＢ＿Ｆ２Ｂ）二重抗体である。Ｔｅｎｅｏｂｉｏ社の二重特異性抗体ＴＮＢ３８３Ｂは２０１９年からＭＭ治療用のための臨床第Ｉ相が行われた。Ｔｅｎｅｏｂｉｏ社のＴＮＢ３８３Ｂでは弱毒化されたＣＤ３抗体が使用され、サイトカイン放出の低減を特徴としている。しかし、ＴＮＢ３８３ＢはカニクイザルＣＤ３とカニクイザルＢＣＭＡとは結合せず、カニクイザルにおいて毒物学的評価を行うことはできない。
したがって、ＢＣＭＡを標的としカニクイザルＢＣＭＡと結合できるより安全で効果的なモノクローナル抗体、及びヒトＢＣＭＡとＣＤ３の両方を標的としカニクイザルＢＣＭＡとＣＤ３と結合できるより安全で効果的な二重特異性抗体の開発が急務となる。
本発明は、ヒトＢＣＭＡを標的としカニクイザルＢＣＭＡと結合できるモノクローナル抗体、及びヒトＢＣＭＡとＣＤ３の両方を標的としカニクイザルＢＣＭＡとＣＤ３と結合できる安全で効果的な二重特異性抗体が欠如するという従来技術の技術的課題を解決するために、ＢＣＭＡを標的とする抗体、ＢＣＭＡとＣＤ３を標的とする二重特異性抗体及びその使用を提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第１態様の技術的解決手段は次のとおりである。２つの重鎖可変領域を含みＢＣＭＡを標的とする抗体であって、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号２２、配列番号３３及び配列番号４２のアミノ酸配列に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又は、配列番号２６、配列番号３７及び配列番号４１のアミノ酸配列に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。本発明のＢＣＭＡ抗体はヒトＢＭＣＡ及びカニクイザルＢＣＭＡと結合する活性を有する。サイズは従来のＩｇＧ抗体の半分だけで、二重特異性抗体の開発に使用されて、軽鎖のミスマッチとヘテロ二量体化の問題を解決することができる。
特定の好ましい実施例で、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５９、配列番号６０に示すとおりであり又はその変異であり、前記変異は初期のアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸が追加、置換又は欠失されており、且つ前記第１タンパク質ドメインと前記ＢＣＭＡ抗原の結合が保持又は改善されたものである。好ましくは、前記変異は配列番号５９、配列番号６０に示すアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列相同性を有する。
特定の好ましい実施例で、前記ＢＣＭＡを標的とする抗体はＦｃフラグメントをさらに含む。これによって、前記ＢＣＭＡを標的とする抗体は２つの重鎖を含む。好ましくは、前記ＦｃフラグメントはｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４のＦｃフラグメント又はその変異である。
特定の好ましい実施例で、前記重鎖のアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号７又は配列番号８に示すとおりである。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第２態様の技術的解決手段は次のとおりである。ＢＣＭＡを標的とする第１タンパク質ドメインとＣＤ３を標的とする第２タンパク質ドメインとを含む二重特異性抗体を提供し、前記第１タンパク質ドメインは本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体の２つの重鎖可変領域を含み、好ましくは、前記２つの重鎖可変領域は（Ｇ４Ｓ）ｎによって接続され、前記ｎは０以外の自然数であり、好ましくは１～２０であり、より好ましくは３又は４である。本発明のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、ＢＣＭＡと結合する部位を２つ有し、腫瘍細胞ＢＣＭＡとの結合の親和性と特異性が向上している独特なＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体であり、二重特異性抗体の２つのタンパク質ドメインはいずれもカニクイザルとの良好な結合活性を有する。
特定の好ましい実施例で、前記第２タンパク質ドメインはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５、配列番号３８及び配列番号４４に示すとおりであり、且つ／又は、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５０、配列番号５３及び配列番号５６に示すとおりである。
好ましくは、前記第２タンパク質ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６３、配列番号６２に示すとおりであり又はその変異であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６６に示すとおりであり又はその変異であり、前記変異には前記第２タンパク質ドメインのＣＤ３との結合が保持又は改善されている。本発明の二重特異性抗体ではＣＤ３側の活性が最適化され、サイトカインの放出が低減され、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の毒性が緩和されている。
特定の好ましい実施例で、前記二重特異性抗体は重鎖定常領域と軽鎖定常領域とをさらに含み、好ましくはヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域であり、前記ヒト軽鎖定常領域はヒトλ、κ軽鎖定常領域であることが好ましく、前記ヒト重鎖定常領域はｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４の重鎖定常領域又はその変異であることが好ましく、
好ましくは、前記ヒト重鎖定常領域の変異は以下からなる群より選ばれる。
（１）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、
（２）ｋｎｏｂ変異Ｔ３６６Ｗとｈｏｌｅ変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡとＹ４０７Ｖ、
（３）ｋｎｏｂ変異Ｓ３５４Ｃとｈｏｌｅ変異Ｙ３４９Ｃ。
より好ましくは、前記第１タンパク質ドメインはアミノ酸配列が配列番号８又は配列番号７に示すとおりである重鎖を含み、前記第２タンパク質ドメインはアミノ酸配列が配列番号５又は配列番号４に示すとおりである重鎖とアミノ酸配列が配列番号４７に示すとおりである軽鎖とを含む。本発明の二重特異性抗体はヒトＦｃフラグメントを有し、ＦｃＲｎとの結合機能が保持されているため、半減期が長い。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第３態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体又は本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体をコードする、分離された核酸を提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第４態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第３態様に記載の分離された核酸を含む発現ベクターを提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第５態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第４態様に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、好ましくは、前記宿主細胞は原核細胞又は真核細胞である。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第６態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体又は本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体と、細胞毒性剤とを含む抗体－薬物複合体を提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第７態様の技術的解決手段は次のとおりである。本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体、本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体又は本発明の第６態様に記載の抗体－薬物複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
上記の技術的課題を解決するための本発明の第８態様の技術的解決手段は次のとおりである。がんを治療及び／又は予防する薬物を製造するための、本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体、本発明の第２態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第６態様に記載の抗体－薬物複合体、又は本発明の第７態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。
また、上記の技術的課題を解決するための本発明の第８態様の技術的解決手段は次のとおりである。キットＡとキットＢとを含むキットの組み合わせを提供し、前記キットＡは本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体、第２態様に記載の二重特異性抗体、第５態様に記載の宿主細胞、第６態様に記載の抗体－薬物複合体、又は第７態様に記載の医薬組成物を含み、前記キットＢは他の抗体、二重特異性抗体、宿主細胞又は医薬組成物を含み、前記他の抗体、二重特異性抗体、宿主細胞又は医薬組成物はＣＤ３、ＢＣＭＡ又は他の標的を標的とする。前記キットＡとキットＢの使用は順番が決まらず、まずキットＡ、次にキットＢを使用してもよいし、又はまずキットＢ、次にキットＡを使用してもよい。
本発明の第１態様に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体、第２態様に記載の二重特異性抗体、第５態様に記載の宿主細胞、第６態様に記載の抗体－薬物複合体、又は第７態様に記載の医薬組成物は腫瘍の治療のために、患者に投与することができる。
本分野の常識を違反しない限り、前記各好ましい条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好ましい実施例を得ることができる。
本発明で使用する試薬と原料はいずれも市販品であってもよい。
本発明の有益な効果は次のとおりである。
１．本発明のＢＣＭＡ抗体は「重鎖」だけを含む全く新しい完全ヒト抗体であり、ヒトＢＭＣＡ及びカニクイザルＢＣＭＡと結合する活性を有する。当該ＢＣＭＡ重鎖抗体のサイズは従来のＩｇＧ抗体の半分だけで、軽鎖を含まないという特徴から、当該抗体は二重特異性抗体として使用することができ、軽鎖のミスマッチとヘテロ二量体化の問題を解決している。
２．本発明のＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、ａ．ＢＣＭＡと結合する部位を２つ有し、腫瘍細胞ＢＣＭＡとの結合の親和性と特異性が向上している独特なＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体であり、ｂ．ヒトＦｃフラグメントを有する二重特異性抗体構造であり、ＦｃのＦｃＲｎとの結合機能が保持されているため、半減期が長く、ｃ． ＣＤ３側の活性が最適化され、サイトカインの放出が低減され、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の毒性が緩和されており、ｄ． ＢＣＭＡ側とＣＤ３側抗体はカニクイザルとの良好な結合活性を有する。
図１は抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の結合能力の細胞レベルでのＦＡＣＳによる検出である。 図２はヒトＢＣＭＡとリガンドＢＡＦＦタンパク質の結合に対する抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の遮断のＥＬＩＳＡによる検出である。 図３はＢＣＭＡを高発現するＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株におけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビトロ結合のＦＡＣＳによる検出である。 図４はヒト及びアカゲザルＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株におけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビトロ結合のＦＡＣＳによる検出である。 図５はＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のヒト及びアカゲザルＴ細胞とのインビトロ結合のＦＡＣＳによる検出である。 図６はＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＢＣＭＡ高発現細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９のインビトロ殺傷実験及びサイトカインの放出である。 図６－１の続きである。 図７はＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＢＣＭＡ低発現細胞株ＲＰＩＭ８２２６のインビトロ殺傷実験及びサイトカインの放出である。 図７－１の続きである。 図８はＢＣＭＡ陰性細胞株ＨＬ－６０におけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の結合のＦＡＣＳによる検出である。 図９はＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＢＣＭＡ陰性細胞株ＨＬ－６０の非特異的殺傷及びサイトカインの放出のＦＡＣＳ法による検出である。 図９－１の続きである。 図１０はＮＣＩ－Ｈ９２９／ヒトＰＢＭＣマウスモデルにおけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍効果評価である。 図１１はＰＲ００３１７８のヒトＣＤ３ｅ／ｇ組換えタンパク質、カニクイザルＣＤ３ｅ／ｇ組換えタンパク質及びヒトＢＣＭＡ組換えタンパク質、カニクイザルＢＣＭＡ組換えタンパク質との親和性のＢＩＡＣＯＲＥによる検出である。
以下、実施例によって本発明を一層説明し、本発明はこれらの実施例の範囲に限定されない。下記の実施例で条件を詳しく記載していない実験方法は、通常の方法と条件で行われ、又は商品の取扱説明書に基づいて選択する。
本願では、用語「抗体」は一般に抗原と結合する部分を含むタンパク質、及び任意選択で抗原と結合する部分に抗体と抗原の結合を促進するコンフォメーションを採用してもよい足場又は骨格部分を指す。典型的には抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）又はその両方を含んでもよい。例えば、本願で「重鎖抗体」はＶＬ領域を含まず、ＶＨ領域だけを含む。ＶＨ又はＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に分けられてもよい。ＶＨ又はＶＬのそれぞれは、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置される３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ領域から構成されてもよい。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の例は全長抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ及び／又はｄＡｂ）、免疫複合体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体アナログ又は融合タンパク質などを含み、ただしそれらに限定されず、所望の抗原結合活性を示すものであればよい。
本願では、用語「可変」とは一般に、抗体の可変ドメインの配列の特定の部分が大きく変化し、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合と特異性に寄与することを指す。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分布するのではない。それは軽鎖及び重鎖可変領域の、ＣＤＲ又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中しており、ＦＲは可変ドメインで高度に保存された部分である。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、殆どは３つのＣＤＲによって接続されてループを形成させるβシート構造であるが、場合によってはβシート構造の一部として形成される。各鎖でＣＤＲはＦＲ領域によって緊密に結合され、しかも別の鎖からのＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成し、定常領域は抗体と抗原の結合に直接的に関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害に関与するなど、様々なエフェクター機能を示す。
本分野では、例えば、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義方式（Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義方式（Ａ１－Ｌａｚｉｋａｎｉ，ｅｔ．ａｌ，ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７参照）など様々な方式で抗体のＣＤＲを定義することができる。本願では、さらに、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式を採用して可変ドメイン配列及び全長抗体配列のアミノ酸残基を決定している（表１）。
Figure 2022551836000002
ここで、Ｌａａ－Ｌｂｂとは抗体軽鎖のＮ末端からのａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）からｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）までのアミノ酸配列を指してもよく、Ｈａａ－Ｈｂｂとは抗体重鎖のＮ末端からのａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）からｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）までのアミノ酸配列を指してもよく。例えば、Ｌ２４－Ｌ３４とは抗体軽鎖Ｎ末端から、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式による２４位から３４位までのアミノ酸配列を指してもよく、Ｈ２６－Ｈ３２とは抗体重鎖Ｎ末端から、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式による２６位から３２位までのアミノ酸配列を指してもよい。
ＡＤＣＣやＣＤＣなどの抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機能も、非常に重要な生物学的機能を有し、ＩｇＧサブタイプによってＡＤＣＣ又はＣＤＣ機能が異なり、例えば、ＩｇＧ１とＩｇＧ３はＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果が強く、ＩｇＧ２とＩｇＧ４は効果が弱い。また、アミノ酸の変異又は修飾でＦｃのＦｃ受容体との結合能力を変えることでＦｃの本来のエフェクター機能を調節することができる。例えば、ＩｇＧ１の「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）との親和性を明らかに低下させて、ＡＤＣＣ効果を低減させることができる。また、Ｐ３２９Ｇ変異は様々なＦｃγ受容体との結合を明らかに低下させることができる（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ Ｔ，Ｈｅｒｔｅｒ Ｓ，Ｋｏｌｌｅｒ ＣＦ，Ｇｒａｕ－Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｓ，Ｓｔｅｉｎｈａｒｔ Ｖ，Ｓｐｉｃｋ Ｃ，Ｋｕｂｂｉｅｓ Ｍ，Ｋｌｅｉｎ Ｃ，Ｕｍａｎａ Ｐ，Ｍｏｓｓｎｅｒ Ｅ．Ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＩｇＧ４ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ａｂｏｌｉｓｈｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥｎｇＤｅｓ Ｓｅｌ．２０１６ Ｏｃｔ；２９（１０）：４５７－４６６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｗ０４０．Ｅｐｕｂ ２０１６ Ａｕｇ ２９．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：２７５７８８８９参照）。本願では、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＦｃγ受容体との結合を低下させるために、これらの抗体のＦｃには「ＬＡＬＡ」二重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又は「ＬＡＬＡＰＧ」三重変異体（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ）が導入されている。
実施例１：マウスの免疫化及び抗ＢＣＭＡ抗体分子の製造
ＢＣＭＡ抗原で実験動物を免疫化してＢＣＭＡと特異的に結合する抗体分子を得ることができ、当該実験動物はマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ラクダなどであってもよい。一般に、得られる抗体分子は非ヒトである。非ヒト抗体を得た後は、免疫原性を低下させ、創薬可能性を向上させるために、抗体工学技術を用いてこれらの分子をヒト化して改変させる必要がある。しかし、抗体のヒト化は技術的に複雑なプロセスで、ヒト化によって改変された分子は抗原に対する親和性が低下していることがよくある。また、トランスジェニック技術の進歩により、ヒト免疫グロブリン免疫レパートリーを保有し、内因性マウス免疫レパートリーを枯渇させるトランスジェニックマウスを作成することが可能になる。このようなトランスジェニックマウスによって産生される抗体は完全ヒト化配列を有するため、さららなるヒト化改変は不要であるため、治療用抗体の開発の効率を大幅に向上させている。Ｈａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ、ＷＯ２００２／０８５９４５Ａ３）はヒト免疫グロブリン免疫レパートリーを保有しているトランスジェニックマウスで、「重鎖」だけを含み、サイズが従来のＩｇＧ抗体の半分だけな全く新しい抗体を産生することができる。産生された抗体はヒト抗体の「重鎖」可変ドメインとマウスＦｃ定常ドメインだけを含む。軽鎖を含まないという特徴から、当該抗体は軽鎖のミスマッチとヘテロ二量体化の問題をほぼ解決しているため、当該技術によって従来の抗体では実現しにくい商品を開発することができる。
１．１ ＢＣＭＡ抗原によるマウスの免疫化
可溶性組換えヒトＢＣＭＡ－ＥＣＤ－Ｆｃ融合タンパク質でＨａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウスを複数回免疫化した。抗原性タンパク質と免疫アジュバントを混合して免疫原性試薬を得、次に、鼠径部から皮下注射又するか、又は腹腔内注射する。各回の免疫化では、各マウスへの総注射量は１００μＬであった。１回目の免疫化で、各マウスには５０μｇの抗原性タンパク質（組換えヒトＢＣＭＡ－ＥＣＤ－Ｆｃ、ＡＣＲＯ、Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０）と完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ５８８１）を体積比１：１で混合して調製した免疫原性試薬を投与して免疫化した。その後の各回の追加免疫では、各マウスには２５μｇの抗原性タンパク質とＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍアジュバント（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ６３２２）を混合して調製した免疫原性試薬を投与して免疫化した。各回の追加免疫の間隔は少なくとも２週間で、追加免疫は一般に最大５回までとする。タイミングは０、１４、２８、４２、５６、７０日目で、また４９、７７日目に、マウスの血清抗体価を検出した。ＨＣＡｂマウスの脾臓からＢ細胞の分離を行う５日前に、各マウスには２５μｇの抗原性タンパク質の用量で最終追加免疫を行った。
１．２ ＨＣＡｂモノクローナル及び抗体配列の取得
マウスの血清中のＢＣＭＡ特異的抗体の力価が一定のレベルに達していると検出すると、マウスの脾臓細胞を取り出してＢ細胞を分離し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを用いてＣＤ１３８陽性形質細胞及びＢＣＭＡ抗原陽性Ｂ細胞集団を選別した。ＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡを逆転写した後、ＰＣＲによりヒトＶＨ遺伝子を増幅した。増幅されたＶＨ遺伝子フラグメントを、ヒトＩｇＧ１抗体重鎖Ｆｃドメイン配列をコードする哺乳類細胞発現プラスミドｐＣＡＧベクターに構築し、プラスミドを哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）にトランスフェクトして発現させ、発現されたＨＣＡｂ抗体上清を組換えヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ組換えタンパク質（ＡＣＲＯ、Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０）と一緒にＭｉｒｒｏｒｂａｌｌでスクリーニングし、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ陽性モノクローナル抗体を得て、そしてＦＡＣＳによって、ヒトＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕＢＣＭＡ、北京康源）、カニクイザルＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｃｙｎｏＢＣＭＡ、北京康源）及びヒトＢＣＭＡを高発現する細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））細胞との結合能力を同定した。スクリーニングして得た陽性クローンのクローン番号はＨＢＭ１００５Ｐ６３Ｂ７で、以下、ＰＲ００１０４６という番号を使用する。通常の配列決定方法で、抗体分子の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を得る。本実施例では、免疫化されたＨａｒｂｏｕｒ ＨＣＡｂマウスから得られた抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列はヒト抗体配列である。
表２には、本実施例に係るＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列、重鎖全長アミノ酸配列、及び組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式で定義したＣＤＲのアミノ酸配列が示される。本発明に係る抗体に対し他の方式で定義したＣＤＲのアミノ酸配列については、配列表を参照する。
Figure 2022551836000003
１．３ 抗ＢＣＭＡ完全ヒト組換え抗体の製造
抗体ＰＲ００１０４６重鎖をコードするプラスミドで哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３）をトランスフェクトし、通常の組換えタンパク質の発現と精製技術を利用して、精製抗ＢＣＭＡ組換え重鎖抗体を得ることができる。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ１３８３５０４）において拡大培養した。一過性トランスフェクションを始める前に、細胞濃度を６×１０５細胞／ｍＬに調整し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて２４時間培養し、細胞濃度は１．２×１０６細胞／ｍＬであった。培養細胞を３０ｍＬ用意し、前記ＰＲ００１０４６重鎖をコードするプラスミド３０μｇを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ、３１９８５０８８）に溶解し、さらに１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍＬ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ、Ｃａｔ＃２３９６６－２）１２０μＬに溶解し、５分間静置した。ＰＥＩをゆっくりとプラスミドに加えて、室温下で１０分間インキュベートし、培養フラスコを振りながらゆっくりとプラスミドとＰＥＩの混合溶液を滴加し、３７℃と８％ＣＯ２でシェーカーにおいて５日間培養した。５日後に細胞生存率を計測した。培養物を回収し、３３００ｇで１０分間遠心分離した後に上清を得、次に、高速遠心分離で上清から不純物を除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含む重力流カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ＃７３１１５５０）を平衡化し、カラム２～５個分の体積で洗い流した。上清サンプルをカラムに通した。カラム５～１０個分の体積のＰＢＳでカラムを洗い流した。さらにｐＨ３．５の０．１Ｍグリシンで目的タンパク質を溶出し、その後、ｐＨ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、最後に限外濾過遠心管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮してＰＢＳバッファーに交換して、精製抗ＢＣＭＡ重鎖抗体溶液を得た。
次の表は陽性コントロール１、即ち全長抗体ＰＲ０００２７４の軽鎖、重鎖配列、軽鎖、重鎖可変領域配列及び組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式で定義したＣＤＲのアミノ酸配列である。
Figure 2022551836000004
実施例２：抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の結合能力の細胞レベルでのＦＡＣＳによる検出
本実施例は、インビトロにおける抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体のヒト及びカニクイザルＢＣＭＡとの結合活性を検討するためである。ヒトＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕＢＣＭＡ、北京康源）、カニクイザルＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｃｙｎｏＢＣＭＡ、北京康源）及びヒトＢＣＭＡを高発現する細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９０６８（商標））を採用して細胞レベルにおいて抗体結合試験を行った。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕＢＣＭＡ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ／ｃｙｎｏＢＣＭＡ細胞を消化し、ＤＭＥＭ完全培地を用いて再懸濁させて、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞懸濁液を回収した。３種の細胞の密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１００μＬ細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェルで最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。細胞を４℃下で静置して、暗所で１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－５４５－０６、１：５００希釈）を加えて、４℃下で暗所で３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを使用して蛍光発光シグナル値を読み取った。
図１に示すように、抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体ＰＲ００１０４６は（Ａ）ヒトＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株、（Ｂ）カニクイザルＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株及び（Ｃ）ヒトＢＣＭＡを高発現する細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９における結合能力がいずれも陽性コントロール１（ＰＲ０００２７４）より優れていた。具体的には、ＰＲ００１０４６の結合曲線のＥＣ５０はいずれも陽性コントロール１より小さかった。最大蛍光値とＥＣ５０の詳細は図１の（Ｄ）を参照する。
実施例３：ヒトＢＣＭＡとリガンドＢＡＦＦタンパク質の結合に対する抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の遮断のＥＬＩＳＡによる検出
本実施例は、ヒトＢＣＭＡ（ＡＣＲＯ、ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ、１００μｇ）とリガンドＢＡＦＦタンパク質（ＡＣＲＯ、ＢＡＦ－Ｈ５２４８、５０μｇ）の結合に対する抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の遮断能力を評価するためである。ビオチン化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ３９２５７、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ）を用いて、取扱説明書の記載に従ってＢＡＦＦタンパク質をビオチン化した。１μｇ／ｍＬ ヒトＢＣＭＡタンパク質、Ｆｃ Ｔａｇ（ＡＣＲＯ、Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ５２５４）を用いてプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃９０１８）を一晩コーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、２％ＢＳＡを加えて室温下で１時間ブロックした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１００μＬ／ウェルで、３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えて、初期濃度５０ｎＭで、室温下で１時間インキュベートした後、上清を捨て、１００μＬ／ウェルで、０．５μｇ／ｍＬ ビオチン化したヒトＢＡＦＦタンパク質（本分野通常の方法で調製）を加えて、室温下で１時間インキュベートした。上清を捨て、１００μＬ／ウェルで、１：４０００希釈したストレプトアビジン結合ＨＲＰ（Ｂｉｏ－ＲＡＤ、Ｃａｔ＃１６１０３８０）を加えた。室温下で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μＬ／ウェルでＴＢＭを加えて発色させ、１５分間後に停止液を加えて反応を停止した。Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＯＤ４５０を読み取った。
図２の（Ａ）に示すように、抗ヒトＢＣＭＡ ＨＣＡｂモノクローナル抗体ＰＲ００１０４６は陽性コントロール１抗体と同等な、ヒトＢＣＭＡとそのリガンドＢＡＦＦタンパク質の結合を遮断する能力を有する。ＩＣ５０の詳細は図２の（Ｂ）を参照する。
実施例４：ＣＤ３抗体のヒト化改変
抗ＣＤ３抗体は二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を構築するための重要な部分である。ヒトＣＤ３ｅ（ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ単一サブユニット、又はＣＤ３ｅを含む複合体）と結合する既知のマウス抗体ＳＰ３４に対しヒト化改変を行う。ＷＯ２０１７０８４４９５Ａ１（江蘇恒瑞）又はＣＮ１０４１３６６１０Ｂ（中外制薬株式会社）に記載されるとおり、次のように実施した。
本実施例では「ＣＤＲグラフト化」の方法で配列のヒト化を行う。マウス抗体のＶＨのＣＤＲをヒト抗体ＶＨのフレームワーク領域にグラフトし、マウス抗体のＶＬのＣＤＲをヒト抗体ＶＬのフレームワーク領域にグラフトする。ヒト抗体ＶＨ又はＶＬのフレームワーク領域の配列はヒト生殖細胞系列遺伝子配列又はＶ（Ｄ）Ｊの再配列後の抗体配列又はヒト抗体の特定のＶＨもしくはＶＬ遺伝子ファミリーのコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列に由来するものであってもよい。本実施例ではヒト生殖細胞系列遺伝子配列から提供されるフレームワーク領域配列をヒト化テンプレート配列として使用し、即ち、ヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントはフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３の配列を提供し、ヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントはフレームワーク領域ＦＲ４の配列を提供する。最終的には（ヒト）ＦＲ１－（マウス）ＣＤＲ１－（ヒト）ＦＲ２－（マウス）ＣＤＲ２－（ヒト）ＦＲ３－（マウス）ＣＤＲ３－（ヒト）ＦＲ４の配置形態でヒト化可変領域（ＶＨ又はＶＬ）配列を構築する。
本実施例ではヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＨＶ３－７３＊０１又はヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＨＶ３－２３＊０１がヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントＩＧＨＪ１＊０１に結合した配列をヒト化テンプレートとしてフレームワーク領域配列を提供する。且つ３０位、７３位、７６位、７８位、９３位又は９４位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）に１つ又は複数の部位のアミノ酸変異を導入して、複数の異なるＶＨバリアント配列を得た。
本実施例ではヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＬＶ７－４６＊０２がヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントＩＧＬＪ２＊０１に結合した配列又はヒト生殖細胞系列Ｖ遺伝子フラグメントＩＧＫＶ１－３９＊０１がヒト生殖細胞系列Ｊ遺伝子フラグメントＩＧＫＪ４＊０１に結合した配列をヒト化テンプレートとしてフレームワーク領域配列を提供する。且つ２位、３６位、４６位、４９位、６６位、６９位、７１位又は８７位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け方式）にゼロ又は複数の部位のアミノ酸変異を導入して、複数の異なるＶＬバリアント配列を得た。次の表４はその１つのＣＤ３抗体のアミノ酸配列であり、当該抗体の軽鎖（ＬＣ）、重鎖（以下、本発明のＣＤ３抗体の重鎖、重鎖可変領域は二重特異性抗体でそれぞれＨＣ１、ＶＨ１と略称）と本発明のＢＣＭＡ抗体の重鎖（以下、本発明のＢＣＭＡ抗体の重鎖、重鎖可変領域は二重特異性抗体でそれぞれＨＣ２、ＶＨ２と略称）配列が二重特異性抗体ＰＲ００３１７８、ＰＲ００２２９９を構成する（構築方法の詳細は実施例５を参照する）。
Figure 2022551836000005
Figure 2022551836000006
実施例５：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の製造
実施例４以後に、二重特異性抗体を製造するために抗ＢＣＭＡ抗体と抗ＣＤ３抗体は選択される。このようなＢＣＭＡ×ＣＤ３合成二重特異性抗体は２つの標的と同時に結合することができ、一方の側は腫瘍細胞の表面に特異的に発現されたＢＣＭＡを認識することができ、他側はＴ細胞上のＣＤ３分子と結合できる。ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重抗体分子が腫瘍細胞の表面に結合した後、腫瘍細胞の近くのＴ細胞を動員してそれを活性化させて、腫瘍細胞を殺すことができる。
各二重特異性抗体は３つのタンパク質鎖に関し、それぞれが対応する抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖、及び前記抗ＣＤ３抗体の重鎖と軽鎖を含む。ミスマッチした重鎖（例えば、抗ＣＤ３抗体の２つの重鎖のミスマッチ）を有する副生成物の生成を最小限に抑えるために、ＷＯ２００９０８０２５１及びＷＯ２００９０８０２５２に記載のとおりに、「ｋｎｏｂ－ｈｏｌｅ」変異と改変したジスルフィド結合を保有する変異したヘテロダイマーＦｃ領域を使用した。ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＥＵインデックス番号）を有するＩｇＧ１である。
３つの異なる哺乳類発現ベクターを同時導入することによって、それぞれ、１）Ｆｃ領域に「ｈｏｌｅ」変異を保有することによってヘテロダイマー抗体を生成し、ＦｃのＣＨ３にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を保有する、対応するＢＣＭＡ抗体の重鎖、２）Ｆｃ領域に「ｋｎｏｂ」変異を保有することによってヘテロダイマー抗体を生成し、ＦｃのＣＨ３にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を保有する、対応するＣＤ３抗体の重鎖、３）対応するＣＤ３抗体の軽鎖をコードする各二重特異性抗体を生成する。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の「ｋｎｏｂ」変異はＴ３６６Ｗからなり、「ｈｏｌｅ」変異はＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖからなる。さらに、Ｆｃ領域の「ｋｎｏｂ」としてＳ３５４Ｃと「ｈｏｌｅ」としてＹ３４９Ｃを含んでジスルフィド結合を形成させて、安定性とヘテロダイマー抗体の産量を高めることができる。次の表５～表７はそれぞれ本発明の二重特異性抗体及び陽性コントロール２の配列情報である。
Figure 2022551836000007
Figure 2022551836000008
Figure 2022551836000009
Figure 2022551836000010
実施例６：ＢＣＭＡを高発現するＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株におけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビトロ結合のＦＡＣＳによる検出
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＢＣＭＡアームのヒトＢＣＭＡとの結合活性を検討するために、ＢＣＭＡを高発現するＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株を用いて細胞においてヒトＢＣＭＡとの結合試験を行う。簡単に説明すると、ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞懸濁液を回収した。細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１００μＬ細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェルで最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。細胞を静置して、４℃下で暗所で２時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－５４５－０６、１：５００希釈）を加えて、４℃下で暗所で１時間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇで、４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを使用して蛍光発光シグナル値を読み取った。
図３の（Ａ）と（Ｂ）に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８はＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株におけるヒトＢＣＭＡ分子との結合が陽性コントロール２より優れていた。具体的には、抗体ＰＲ００３１７８の結合曲線のＥＣ５０は陽性コントロール２と比べて約８倍低かった。また、抗体ＰＲ００２２９９のＮＣＩ－Ｈ９２９細胞株におけるヒトＢＣＭＡ分子との結合は最大結合蛍光値と結合曲線のＥＣ５０のいずれも抗体ＰＲ００３１７８より劣っていた。
実施例７：ヒト及びカニクイザルＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株におけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビトロ結合のＦＡＣＳによる検出
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＢＣＭＡアームのインビトロ結合活性を検討するために、ヒトＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕＢＣＭＡ）及びカニクイザルＢＣＭＡを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｃｙｎｏＢＣＭＡ）を用いて細胞レベルにおいて抗体結合試験を行う。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕＢＣＭＡ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ／ｃｙｎｏＢＣＭＡ細胞を消化し、ＤＭＥＭ完全培地を用いて再懸濁させた。２種の細胞の密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１００μＬ細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェルで最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。細胞を４℃下で静置して、暗所で１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－５４５－０６、１：５００希釈）を加えて、４℃下で暗所で３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを使用して蛍光発光シグナル値を読み取った。
図４の（Ａ）に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８はＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕＢＣＭＡ細胞におけるヒトＢＣＭＡとの結合が陽性コントロール２より強かった。具体的には、図４の（Ｃ）に示すように、抗体ＰＲ００３１７８の結合曲線のＥＣ５０は陽性コントロール２と比べて約５倍低かった。また、図４の（Ｂ）に示すように、ＰＲ００３１７８はＨＥＫ２９３Ｔ／ｃｙｎｏＢＣＭＡ細胞におけるカニクイザルＢＣＭＡと交差結合できるが、陽性コントロール２はカニクイザルＢＣＭＡと交差結合する能力を持たない。
実施例８：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体とヒト及びカニクイザルＴ細胞のインビトロ結合のＦＡＣＳによる検出
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＣＤ３アームのインビトロ結合活性を検討するために、ヒト及びカニクイザルＴ細胞を用いて細胞レベルにおいて抗体結合試験を行う。簡単に説明すると、ヒト及びカニクイザルＴ細胞の密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１００μＬ細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェルで最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加えた。細胞を４℃下で静置して、暗所で１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇで、４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－５４５－０６、１：５００希釈）を加えて、４℃下で暗所で３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇで、４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを使用して蛍光発光シグナル値を読み取った。
図５の（Ａ）に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８はヒトＴ細胞におけるヒトＣＤ３との結合が陽性コントロール２より強かった。具体的には、抗体濃度が同じである場合に、ＰＲ００３１７８の結合蛍光値は陽性コントロール２の結合蛍光値より高かった。また、図５の（Ｂ）に示すように、抗体ＰＲ００３１７８はカニクイザルＴ細胞におけるカニクイザルＣＤ３と交差結合できるが、陽性コントロール２はカニクイザルＣＤ３と交差結合する能力を持たない。
実施例９：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＢＣＭＡ高発現細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９のインビトロ殺傷実験及びサイトカインの放出
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体がインビトロで媒介する標的細胞殺傷能力を検討するために、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用し、ＢＣＭＡを高発現する細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９を標的細胞としてインビトロ殺傷実験を行いサイトカインの放出を検出した。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地でＰＢＭＣの密度を１．１×１０６細胞／ｍＬに調整し、ＮＣＩ－Ｈ９２９の密度を０．１１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２種の細胞懸濁液を各９０μＬ細胞／ウェルでＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３７９９）に播種し、その後、２０μＬ／ウェルで、最終濃度の１０倍となる４倍濃度勾配希釈した被検抗体を加え、抗体の最大最終濃度は３０ｎＭで、各抗体は合計で１０濃度とし、最終的な感染多重度は１０：１で、２回繰り返す。さらに、プレートには異なるコントロール群として、ＥＲ（０）：ＮＣＩ－Ｈ９２９＋ＰＢＭＣ＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地、ＥＳＲ：ＰＢＭＣ＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地、ＴＳＲ：ＮＣＩ－Ｈ９２９＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地、ＣＭＢ：ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地のみ、ＴＭＲ：ＮＣＩ－Ｈ９２９＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地＋溶解バッファー（２４時間インキュベートした後に加えた）、ＶＣＣ：ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地＋溶解バッファー（２４時間インキュベートした後に加えた）を設けた。９６ウェルプレートを３７℃二酸化炭素インキュベータに置いて２４時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、上清から５０μＬ取り分けて、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３５９９）に加え、そして５０μＬの細胞毒性検出試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ、ｃａｔ＃Ｇ１７８０）を加えて、室温下で３０分間インキュベートし、停止液を加えて反応を停止しＥｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でＯＤ４９０を読み取った。ＯＤ４９０から算式、特異性殺傷％＝｛（ＥＲ－ＣＭＢ）－［（ＥＳＲ－ＣＭＢ）＋（ＴＳＲ－ＣＭＢ）］｝／（ＴＭＲ－ＶＣＣ）×１００％で殺傷効果を計算した。サイトカインＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出を検出するために、細胞培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡ検出方法はＩＬ－６（ＩＬ－６ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃８８－７０６６－８８）及びＴＮＦ－α（ＴＮＦ ａｌｐｈａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃８８－７３４６－８８）キットの取扱説明書を参照する。
図６に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８が媒介するＰＢＭＣのＢＣＭＡを高発現する細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９に対する殺傷が陽性コントロール２より優れていた（Ａ）。具体的には、ＰＲ００３１７８は高濃度で達成する殺傷パーセンテージが陽性コントロール２より高くＰＲ００３１７８の殺傷曲線のＥＣ５０は陽性コントロール２と比べて約１０倍小さかった（Ｄ）。また、ＰＲ００３１７８殺傷系におけるサイトカインＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出はいずれも陽性コントロール２より高かった（（Ｂ、（Ｃ）、（Ｅ））。
実施例１０：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＢＣＭＡ低発現細胞株ＲＰＭＩ８２２６のインビトロ殺傷実験及びサイトカインの放出
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体がインビトロで媒介する標的細胞殺傷能力を検討するために、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用し、ＢＣＭＡを低発現する細胞株ＲＰＭＩ８２２６（中国科学院ＣＡＳセルバンク）を標的細胞としてインビトロ殺傷実験を行いサイトカインの放出を検出した。具体的には、ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地でＰＢＭＣの密度を１．１×１０６細胞／ｍＬに調整し、ＲＰＭＩ８２２６の密度を０．１１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２種の細胞懸濁液を各９０μＬ細胞／ウェルでＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３７９９）に播種し、その後、２０μＬ／ウェルで、最終濃度の１０倍となる４倍濃度勾配希釈した被検抗体を加え、抗体の最大最終濃度は３０ｎＭで、各抗体は合計で１０濃度とし、最終的な感染多重度は１０：１で、２回繰り返す。さらに、プレートには異なるコントロール群として、ＥＲ（０）：ＲＰＭＩ８２２６＋ＰＢＭＣ＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地、ＥＳＲ：ＰＢＭＣ＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地、ＴＳＲ：ＲＰＭＩ８２２６＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地、ＣＭＢ：ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地のみ、ＴＭＲ：ＲＰＭＩ８２２６＋ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地＋溶解バッファー（２４時間インキュベートした後に加えた）、ＶＣＣ：ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地＋溶解バッファー（２４時間インキュベートした後に加えた）を設けた。９６ウェルプレートを３７℃二酸化炭素インキュベータに置いて２４時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、上清から５０μＬ取り分けて、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３５９９）に加え、そして５０μＬの細胞毒性検出試薬（ＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出キット、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃Ｇ１７８０）を加えて、室温下で３０分間インキュベートし、停止液を加えて反応を停止しＥｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でＯＤ４９０を読み取った。ＯＤ４９０から算式、特異性殺傷％＝｛（ＥＲ－ＣＭＢ）－［（ＥＳＲ－ＣＭＢ）＋（ＴＳＲ－ＣＭＢ）］｝／（ＴＭＲ－ＶＣＣ）×１００％で殺傷効果を計算した。サイトカインＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出を検出するために、細胞培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡ検出方法はＩＬ－６（ＩＬ－６ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃８８－７０６６－８８）及びＴＮＦ－α（ＴＮＦ ａｌｐｈａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃８８－７３４６－８８）キットの取扱説明書を参照する。
図７に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８が媒介するＰＢＭＣのＢＣＭＡを低発現する細胞株に対する殺傷が陽性コントロール２より優れていた（Ａ）。具体的には、ＰＲ００３１７８は高濃度で達成する標的細胞殺傷パーセンテージが陽性コントロール２より高かった（Ｄ）。また、ＰＲ００３１７８殺傷系におけるサイトカインＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出はいずれも陽性コントロール２より高かった（（Ｂ、（Ｃ）、（Ｅ））。
実施例１１：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のＢＣＭＡを発現しない細胞株ＨＬ－６０との結合
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビトロ結合の特異性を検討するために、ヒトＢＣＭＡを発現しない細胞株ＨＬ－６０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４０（商標））を用いて細胞レベルにおいて抗体結合試験を行う。簡単に説明すると、ＨＬ－６０細胞懸濁液を回収した。細胞密度をそれぞれ１×１０６細胞／ｍＬに調整した。１００μＬ細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３８９４）に播種し、その後、１００μＬ／ウェルで、最終濃度の２倍となる３倍濃度勾配希釈した被検抗体を加え、抗体の最高最終濃度は３００ｎＭで、各抗体は４つの濃度であった。細胞を４℃下で静置して、暗所で１時間インキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳを加えて細胞を２回リンスし、５００ｇと４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ＃１０９－５４５－０６、１：５００希釈）をを加えて、４℃下で暗所で３０分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、５００ｇで、４℃下で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２００μＬ／ウェルで、予冷したＰＢＳで細胞を再懸濁させ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを使用して蛍光発光シグナル値を読み取った。
図８に示すように、３００ｎＭ、１００ｎＭ、３３．３ｎＭ及び１１．１ｎＭ下で、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８と陽性コントロール２はいずれもＢＣＭＡ陰性細胞株ＨＬ－６０と非特異的に結合することができない。
実施例１２：ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体によるＢＣＭＡ陰性細胞株ＨＬ６０の非特異的殺傷及びサイトカインの放出のＦＡＣＳ法による検出
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体がインビトロで媒介する標的細胞殺傷能力の特異性を検討するために、エフェクター細胞としてヒトＰＢＭＣを使用し、ＢＣＭＡを発現しない細胞株ＨＬ－６０を標的細胞としてインビトロ殺傷実験を行いサイトカインの放出を検出した。具体的には、標的細胞ＨＬ－６０を０．５μＭのＣＦＳＥ色素で標識した。ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳ培地で３つのドナーのＰＢＭＣの密度を１．１×１０６細胞／ｍＬに調整し、ＣＦＳＥによって標識されたＨＬ－６０細胞の密度を０．１１×１０６細胞／ｍＬに調整し、２種の細胞懸濁液を各９０μＬ細胞／ウェルでＵ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３７９９）に播種し、その後、２０μＬ／ウェルで、最終濃度の１０倍となる被検抗体を加え、抗体最終濃度は１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ及び３ｎＭで、合計で４つの濃度とし、最終的な感染多重度は１０：１で、２回繰り返す。９６ウェルプレートを３７℃二酸化炭素インキュベータに置いて２４時間インキュベートした。インキュベートが完了した後、サイトカインＩＬ－６及びＴＮＦ－αの放出を検出するために、細胞培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡ検出方法はＩＬ－６（ＩＬ－６ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃８８－７０６６－８８）及びＴＮＦ－α（ＴＮＦ ａｌｐｈａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ、Ｃａｔ＃８８－７３４６－８８）キットの取扱説明書を参照する。培養細胞をＶ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３８９４）に移し、１００μＬ／ウェルで７－ＡＡＤ（ＢＤ、Ｃａｔ＃５５９９２５、１：１００）染色系で染色し、室温下で３０分間インキュベートし、１００μＬ／ウェルでＰＢＳを加えて反応を停止した。ＢＤ ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯＩＩを用いて検出した。算式、特異性殺傷％＝７－ＡＡＤ＋ＣＦＳＥ＋パーセンテージ／（７－ＡＡＤ＋ＣＦＳＥ＋パーセンテージ＋７－ＡＡＤ－ＣＦＳＥ＋パーセンテージ）×１００％から殺傷効果を計算した。
図９の（Ａ）－（Ｅ）に示すように、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ及び３ｎＭ下で、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８と陽性コントロール２が媒介できない２つのドナーＰＢＭＣはＢＣＭＡ陰性細胞株ＨＬ－６０を非特異的に殺傷し（図９の（Ａ）、（Ｄ）、当該系からは非特異的なサイトカインＩＬ－６（図９の（Ｂ）、（Ｅ））及びＴＮＦ－α（図９の（Ｃ）、（Ｆ））の放出が検出されなかった。
実施例１３：ＮＣＩ－Ｈ９２９／ヒトＰＢＭＣマウスモデルにおけるＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体の抗腫瘍効果評価
ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体のインビボ抗腫瘍効果を評価するために、６～８週齢の雌ＮＣＧマウスを用いて、腫瘍細胞接種の３日前に、全てのマウスに３×１０６のヒトＰＢＭＣを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）し、次に、腫瘍細胞播種の当日に各実験マウスに５×１０６ＮＣＩ－Ｈ９２９細胞を皮下接種し、細胞をＰＢＳとマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の１：１混合液に再懸濁させた（０．１ｍＬ／匹）。腫瘍体積が９０ｍｍ３に達していたらマウスをランダムに群分けし、群あたり６匹のマウスであった。群分け後にＰＢＳで希釈した特定の濃度の薬物を週１回の静脈内注射（ｉ．ｖ．）で合計２回（ＱＷ×２）の方式で投与し、ＰＢＳをブランクコントロール群とした。初回投与後の３、７、１０及び１４日目に腫瘍の体積及びマウスの体重を測定した。腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）であった。
図１０の（Ａ）に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８は１０μｇ／マウス、３μｇ／マウスでいずれも腫瘍成長阻害効果が認められ、１０μｇ／マウス群は３μｇ／マウス群より効果が優れていた。また、１０μｇ／マウスの投与量ではＰＲ００３１７８の効果が同等な用量の陽性コントロール２より優れていた。図１０の（Ｂ）に示すように、各試験群のマウスの体重変化はいずれも正常な範囲内であった。
実施例１４：ＰＲ００３１７８のヒトＣＤ３ｅ／ｇ組換えタンパク質、カニクイザルＣＤ３ｅ／ｇ組換えタンパク質及びヒトＢＣＭＡ組換えタンパク質、カニクイザルＢＣＭＡ組換えタンパク質との親和性のＢＩＡＣＯＲＥによる検出
試験ではバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％Ｐ２０、ｐＨ７．４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００６－６９）を、実験用チップとしてシリーズＳ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００５－３０）を使用した。ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ組換えタンパク質（ＡＣＲＯ、Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０）、カニクイザルＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ（ＡＣＲＯ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｃ８２Ｆ４）はＡＣＲＯより購入し、ヒトＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃ組換えタンパク質（Ｌｏｔ＃２０１９０５０８００２）、カニクイザルＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃ組換えタンパク質及びヒト（Ｌｏｔ＃２０１８０４０００１）は上海睿智より購入した。
１４．１ 抗原の結合
流速を１０μＬ／ｍｉｎに設定し、２つのＣＭ５で４つのチャネルにおいて４種の抗原を結合させた。１）注入時間を３００秒に設定し、５０ｍＭ ＮＨＳと２００ｍＭ ＥＤＣを１：１の体積比で直前に混合して４つのチャネルに注入した。２）ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム（Ｃａｔ＃ＢＲ－１００３－５０）を用いてヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ組換えタンパク質、カニクイザルＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ、ヒトＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃ組換えタンパク質、カニクイザルＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃ組換えタンパク質をいずれも１μｇ／ｍＬに希釈して、それぞれチップ１のチャネル２、３、４及びチップ２のチャネル２に注入した。３）ｐＨ８．５の１Ｍ エタノールアミンを３００秒をかけて注入して、チップの表面に残っている活性カルボキシ基をブロックした。ブロックした後、引き続き１×ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファーで装置を２時間平衡化し、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ組換えタンパク質、カニクイザルＢＣＭＡ－Ｆｃ，Ａｖｉｔａｇ、ヒトＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃ組換えタンパク質及びカニクイザルＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃ組換えタンパクの質の最終的な結合量はそれぞれ１２０ＲＵ、７０ＲＵ、２００ＲＵ及び２９０ＲＵであった。
１４．２ 親和性の測定
動的マルチサイクルモデルを設定し、各サイクルはＰＲ００３１７８の結合とチップの再生を含む。ＰＲ００３１７８を２倍勾配希釈して４つのチャネルに注入し、流速は３０μＬ／ｍｉｎで、結合時間を１８０秒、解離時間を４００秒又は６００秒に設定した。最後に同じ流速で６０秒をかけてｐＨ１．５の１０ｍＭ グリシン－塩酸（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃ＢＲ－１００３－５４）を注入して、チップを再生させた。
ソフトウェアＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００で実験結果を分析し、チャネル１は参照チャネルであるため排除し、分析モデルには１：１動的フィッティングモデルを用いた。
図１１の（Ｂ）、（Ｄ）に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８はヒトＢＣＭＡと高い親和性で結合し、ヒトＢＣＭＡ－Ｆｃとの親和性は約９．４９３Ｅ－１１Ｍであり、しかもヒト及びカニクイザルＢＣＭＡと交差結合する活性が優れていた。図１１の（Ａ）、（Ｃ）に示すように、ＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８はヒトＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃとの親和性が約２．５４１Ｅ－０８Ｍで、しかもヒト及びカニクイザルＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃと交差結合する活性が優れていた。図１１の（Ｅ）はＢＣＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体ＰＲ００３１７８とＢＣＭＡ及びＣＤ３ｅ／ｇ ＥＣＤ－ｈＦｃの親和性測定データの詳細で、Ｋａ（１／Ｍｓ）、Ｋｄ（１／ｓ）、ＫＤを含む。

Claims (15)

  1. ２つの重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はそれぞれ配列番号２２、配列番号３３及び配列番号４２のアミノ酸配列に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又は、配列番号２６、配列番号３７及び配列番号４１のアミノ酸配列に示すＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含むことを特徴とするＢＣＭＡを標的とする抗体。
  2. 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５９に示すとおりであり、又は、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６０に示すとおりであることを特徴とする請求項１に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体。
  3. Ｆｃフラグメントをさらに含み、好ましくは、前記ＦｃフラグメントはｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４のＦｃフラグメント又はその変異であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体。
  4. 前記ＢＣＭＡを標的とする抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列番号１又は配列番号７又は配列番号８に示すとおりであることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体。
  5. ＢＣＭＡを標的とする第１タンパク質ドメインとＣＤ３を標的とする第２タンパク質ドメインとを含む二重特異性抗体であって、前記第１タンパク質ドメインは請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体の２つの重鎖可変領域を含み、好ましくは、２つの前記重鎖可変領域は（Ｇ４Ｓ）ｎによって接続され、前記ｎは０以外の自然数であり、好ましくは１～２０であり、より好ましくは３又は４であることを特徴とする前記二重特異性抗体。
  6. 前記第２タンパク質ドメインは重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５、配列番号３８及び配列番号４４に示すとおりであり、且つ／又は、前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５０、配列番号５３及び配列番号５６に示すとおりであることを特徴とする請求項５に記載の二重特異性抗体。
  7. 前記第２タンパク質ドメインの重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６３、配列番号６２に示すとおりであり又はその変異であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６６に示すとおりであり又はその変異であり、前記変異には前記第２タンパク質ドメインのＣＤ３との結合が保持又は改善されていることを特徴とする請求項５に記載の二重特異性抗体。
  8. 重鎖定常領域と軽鎖定常領域とをさらに含み、好ましくはヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域であり、前記ヒト軽鎖定常領域はヒトλ、κ軽鎖定常領域であることが好ましく、前記ヒト重鎖定常領域はｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４の重鎖定常領域又はその変異であることが好ましいことを特徴とする請求項５～７のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
  9. 前記ヒト重鎖定常領域の変異は、
    （１）Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異、
    （２）ｋｎｏｂ変異Ｔ３６６Ｗとｈｏｌｅ変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡとＹ４０７Ｖ、
    （３）ｋｎｏｂ変異Ｓ３５４Ｃとｈｏｌｅ変異Ｙ３４９Ｃ、
    かななる群より選ばれ、
    好ましくは、前記第１タンパク質ドメインはアミノ酸配列が配列番号８又は配列番号７に示すとおりである重鎖を含み、前記第２タンパク質ドメインはアミノ酸配列が配列番号５又は配列番号４に示すとおりである重鎖とアミノ酸配列が配列番号４７に示すとおりである軽鎖とを含むことを特徴とする請求項８に記載の二重特異性抗体。
  10. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体又は請求項５～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする、分離された核酸。
  11. 請求項１０に記載の分離された核酸を含む発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の発現ベクターを含み、好ましくは、原核細胞又は真核細胞である宿主細胞。
  13. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体又は請求項５～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、細胞毒性剤とを含む抗体－薬物複合体。
  14. 請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体、請求項５～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体又は請求項１３に記載の二重特異性抗体－薬物複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  15. がんを治療及び／又は予防する薬物を製造するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のＢＣＭＡを標的とする抗体、請求項５～９のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１３に記載の抗体－薬物複合体、又は請求項１４に記載の医薬組成物の使用。
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