ES2198367T3

ES2198367T3 - Uso de gdnf para tratar defectos de la cornea.

Info

Publication number: ES2198367T3
Application number: ES00983097T
Authority: ES
Inventors: Michael Hanke; Friedrich Kruse; Michael Paulista; Jens Pohl
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2004-02-01
Anticipated expiration: 2020-10-30
Also published as: EP1223966B1; WO2001030375A3; WO2001030375A2; JP2003512433A; ATE238806T1; DE60002496T2; DE60002496D1; PT1223966E; AU1997501A; CA2385929A1; DK1223966T3; EP1223966A2; US20030166537A1

Abstract

Uso de un factor de crecimiento derivado de una línea de células gliales (GDNF) o de un derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o un agonista que sustituye la actividad funcional del GDNF, y/o un ácido nucleico que contiene por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia primaria de aminoácidos del GDNF o del derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o del agonista para la fabricación de una composición farmacéutica para la curación de heridas de la epidermis y del estroma y/o para el tratamiento de trastornos de la curación y/o trastornos de la cicatrización de heridas de la epidermis y del estroma.

Description

Uso del GDNF para tratar defectos de la córnea.

La presente invención trata del uso de un factor de crecimiento derivado de una línea de células gliales (GDNF) o de un derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o un agonista que sustituye la actividad funcional del GDNF, y/o un ácido nucleico que contiene por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia primaria de aminoácidos del GDNF o del derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o del agonista para la fabricación de una composición farmacéutica para la curación de heridas de la epidermis y del estroma.

Hasta ahora, los trastornos de la curación de las heridas de la córnea, en particular, los trastornos de la curación de las heridas del epitelio corneal, no se pueden tratar en ciertos pacientes. En su mayor parte tales pacientes están aquejados de trastornos asociados tales como las enfermedades neurotróficas del ojo (por ejemplo, distintas formas de deterioro de la inervación), enfermedades infecciosas (enfermedades víricas, enfermedad bacteriana, enfermedad micótica, enfermedad clamidial), enfermedades inmunológicas localizadas o generalizadas (por ejemplo, queratoconjuntivitis atópica, alérgica, de primavera), distintas formas de enfermedades del ojo reumatoides (por ejemplo, dentro del ámbito del reuma articular, enfermedad de Wegener, lupus eritematoso, esclerodermia), síndrome de Stevens-Johnson, enfermedades provocadas por enfermedades dérmicas asociadas (por ejemplo, rosácea, ictiosis), trastornos de la humidificación (distintas formas de ojo seco), deterioro del funcionamiento de los párpados y de las pestañas y enfermedades sistémicas (tales como diabetes, gota, enfermedad de Crohn), distintas formas de enfermedades degenerativas (degeneración senil, marginal, pelúcida, de Terrien, de Salzman), enfermedad distrófica (distrofias corneales de las tres capas de la córnea, incluida la distrofia de Fuchs) así como varias inflamaciones de los tejidos vecinos (conjuntiva, esclerótica). Pueden ser causas adicionales de trastornos de la curación de las heridas de la córnea todo tipo de lesiones físicas de la superficie ocular tales como abrasiones, cortes, laceraciones debidos a material orgánico e inorgánico, además de lesiones químicas inducidas por material sólido, líquido y gaseoso, así como quemaduras. Además, los trastornos de la curación de las heridas pueden ser inducidos por intervenciones médicas y cosméticas que comprenden la gama entera de las cirugías por láser terapéuticas y refractivas (a saber, excímero, infrarrojo y Nd:Yag) así como las cortaduras mecánicas y no mecánicas dentro del ámbito de la cirugía médica convencional y refractiva (queratotomía radial, LASIK, trepanación dentro del ámbito de la queratoplastia lamelar o perforante).

Para tales enfermedades, no existe actualmente terapia conservadora y, por lo tanto, a menudo hay que llevar a cabo un complicado e invasivo transplante de córnea. El mismo problema se presenta en el caso de lesiones físicas que producen abrasiones de la córnea.

Estudios iniciales llevados a cabo por Lambiase y col. (1998) parecen indicar que el factor de crecimiento del tejido nervioso (NGF) aislado de las glándulas submaxilares de ratones podría ser adecuado para la terapia conservadora de la úlcera corneal neurotrófica. Sin embargo, había que usar el NGF de ratón a dosis muy altas, hay que aislarlo por un procedimiento complicado y muy caro, y representa una proteína no humana.

Por lo tanto, hay una elevada demanda de aproximaciones novedosas a la terapia conservadora para la curación de las heridas y el tratamiento de los trastornos de la curación de las heridas de los tejidos epiteliales y del estroma, en particular, en el ojo anterior.

Por consiguiente, el problema técnico subyacente a la presente invención es el de proporcionar un sistema novedoso para la curación y el tratamiento de los trastornos de la curación de las heridas epiteliales y del estroma, en particular, en el ojo anterior.

La solución al problema técnico anterior se consigue al proporcionar las realizaciones tal y como se caracterizan en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención trata del uso de un factor de crecimiento derivado de una línea de células gliales (GDNF) o de un derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o un agonista que sustituye la actividad funcional del GDNF, y/o un ácido nucleico que contiene por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia primaria de aminoácidos del GDNF o del derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o del agonista para la fabricación de una composición farmacéutica para la curación de heridas de la epidermis y del estroma y/o para el tratamiento de trastornos de la curación y/o trastornos de la cicatrización de heridas de la epidermis y del estroma.

El término ``factor de crecimiento derivado de una línea de células gliales (GDNF)'' se refiere al GDNF, la neurturina, la persefina, la artemina (también denominada enovina o neublastina) y a todas las proteínas capaces de curar defectos de la córnea y cuya secuencia de aminoácidos comprende por lo menos la región conservada de siete cisteínas y que comparte más del 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la región conservada de siete cisteínas del GDNF humano (SEC ID Nº 1). Según una realización de la presente invención, el término ``GDNF'' incluye proteínas que comprenden como mínimo la secuencia genérica de aminoácidos como se presenta en la fig. 1 (SEC ID Nº 2) que se deriva de la región conservada de siete cisteínas del GDNF (SEC ID Nº 1), la neurturina (SEC ID Nº 3), la persefina (SEC ID Nº 4) y la artemina (SEC ID Nº 5), y son capaces de curar defectos de la córnea. En la SEC ID Nº 2, X representa cualquier aminoácido e Y representa cualquier aminoácido o un aminoácido suprimido. Los términos ``derivado funcionalmente activo'' y ``parte funcionalmente activa'' se refieren a un compuesto proteínico que exhibe por lo menos parte de las funciones biológicas del GDNF e incluyen polipéptidos que contienen secuencias de aminoácidos además del GDNF maduro, por ejemplo, proGDNF y preproGDNF, el GDNF maduro mismo así como mutantes del polipéptido GDNF de tipo silvestre. El término ``mutante'' tal y como se usa en la presente invención comprende polipéptidos que se obtuvieron por inserción, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos en la secuencia primaria de aminoácidos del GDNF de tipo silvestre tal como la secuencia del GDNF humano de tipo silvestre. Además, el término ``GDNF'' comprende polipéptidos producidos de manera recombinante, tales como, por ejemplo, el GDNF humano recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos del GDNF humano de tipo silvestre según los números de entrada L19063, L15306 en GenBank.

El término ``agonista'' tal y como se usa en la presente significa un compuesto proteínico o no proteínico capaz de sustituir la actividad funcional del GDNF o del derivado o parte funcionalmente activa del mismo. Tales agonistas pueden exhibir un efecto biológico del GDNF mediante, por ejemplo, la unión a los mismos receptores, tales como el receptor tirosina quinasa ret y el receptor alfa 1-4 para la familia del GDNF (GFRalfa1-4), respectivamente, y/o al afectar las mismas vías de transducción aguas arriba y/o abajo de estos receptores.

La forma funcionalmente activa del GDNF o del agonista del mismo o de los derivados o partes funcionalmente activos de los mismos puede ser una forma monomérica o multihomo o heteromultimérica tal como una forma dimérica, trimérica u otra forma oligomérica.

El término ``ácido nucleico'' se refiere a moléculas de ácido nucleico naturales o semisintéticas o sintéticas o modificadas que pueden componerse de desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos y/o nucleótidos modificados. El ácido nucleico tal y como se define arriba contiene como mínimo una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia primaria de aminoácidos del polipéptido de GDNF definido arriba o del derivado funcionalmente activo tal como un mutante o parte del mismo y/o de un agonista proteínico del mismo definido arriba. Los ejemplos de ácido nucleico según la presente invención contienen una secuencia nucleotídica según el nº de entrada en GenBank NM 000514 que codifica el GDNF humano de tipo silvestre. La secuencia nucleotídica según la presente invención puede ser también una secuencia mutante producto de una inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre.

La composición farmacéutica según la presente invención se puede usar también como agente de terapia génica o de terapia celular. Por lo tanto, según una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica comprende células que están, por ejemplo, transformadas por el ácido nucleico definido arriba, que producen GDNF o el derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o el agonista del mismo.

Preferiblemente, la composición farmacéutica tal como se define arriba contiene como mínimo un agente adicional que tenga un efecto trófico sobre las células epiteliales y/o neuronales. Tales agentes son preferiblemente citoquinas tales como TGF-\beta (por ejemplo, TGF-\beta1, -\beta2 y -\beta3), BMPs, GDFs, y citoquinas capaces de unirse a los receptores TrkA, TrkB y TrkC, tales como las neurotrofinas, (por ejemplo, NGF, NT-3, NT-4/5, BDNF, CDNF), ligandos de ret y de GFRalfa 1-4, ligandos de los receptores para EGF (EGF, el factor semejante al EGF que se une a la heparina (HB-EGF), TGF-\alpha) varios miembros de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF 1-5), el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), las distintas isoformas del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF A, B, AB) e isoformas del factor de crecimiento insulínico (IGF-I, II). Además, el agente adicional que tenga un efecto trófico sobre las células epiteliales y/o neuronales en combinación con el GDNF puede ser uno o más componentes del suero humano que se puede usar en su totalidad o como parte del mismo, preferiblemente en combinación con la fibronectina o metabolitos de la misma. Además, el GDNF puede usarse en combinación con cualquier tipo de agente antiinflamatorio (por ejemplo esteroides tales como la cortisona y sus análogos, agentes no esteroides tales como los inhibidores de la vía del ácido araquidónico o de la vía de transducción de la señal de NF-\kappaB y anticuerpos contra las quimioquinas). Tales agentes adicionales pueden exhibir efectos aditivos y/o sinérgicos en combinación con el GDNF, el agonista y/o el ácido nucleico tal como se define arriba.

Según una realización preferida adicional del uso según la presente invención, la herida que hay que curar o cuya curación normal está impedida debido a un trastorno de la curación de heridas se encuentra en el ojo anterior de un mamífero. Más preferiblemente, la composición farmacéutica definida arriba se usa para la curación y la cicatrización de heridas del epitelio, del estroma y del endotelio corneal y/o para el tratamiento de la curación y la cicatrización de heridas del epitelio, del estroma y del endotelio corneal. Un ejemplo particularmente preferido de herida de la córnea es la úlcera corneal.

Como ejemplo adicional, la herida y/o el trastorno de la curación de heridas tal y como se definió arriba está causado por trastornos tales como las enfermedades neurotróficas del ojo (por ejemplo, distintas formas de deterioro de la inervación), enfermedades infecciosas (enfermedades víricas, enfermedad bacteriana, enfermedad micótica, enfermedad clamidial), enfermedades inmunológicas localizadas o generalizadas (por ejemplo, queratoconjuntivitis atópica, alérgica, de primavera), distintas formas de enfermedades del ojo reumatoides (por ejemplo, dentro del ámbito del reuma articular, enfermedad de Wegener, lupus eritematoso, esclerodermia), síndrome de Stevens-Johnson, enfermedades provocadas por enfermedades dérmicas asociadas (por ejemplo, rosácea, ictiosis), trastornos de la humidificación (distintas formas de ojo seco), deterioro del funcionamiento de los párpados y de las pestañas y enfermedades sistémicas (tales como diabetes, gota, enfermedad de Crohn), distintas formas de enfermedades degenerativas (degeneración senil, marginal, pelúcida, de Terrien, de Salzman), enfermedad distrófica (distrofias corneales de las tres capas de la córnea, incluida la distrofia de Fuchs) así como varias inflamaciones de los tejidos vecinos (conjuntiva, esclerótica). Pueden ser causas adicionales de trastornos de la curación de las heridas de la córnea como se definen arriba todo tipo de lesiones físicas de la superficie ocular tales como abrasiones, cortes, laceraciones debidos a material orgánico e inorgánico, además de lesiones químicas inducidas por material sólido, líquido y gaseoso, así como quemaduras. Además, los trastornos de la curación de las heridas como se definen arriba pueden ser inducidos por intervenciones médicas y cosméticas que comprenden la gama entera de las cirugías por láser terapéuticas y refractivas (a saber, excímero, infrarrojo y Nd:Yag) así como las cortaduras mecánicas y no mecánicas dentro del ámbito de la cirugía médica convencional y refractiva (queratotomía radial, LASIK, trepanación dentro del ámbito de la queratoplastia lamelar o perforante).

Preferiblemente, la composición farmacéutica como se define arriba contiene un vehículo y/o un diluyente farmacéuticamente aceptables y puede aplicarse preferiblemente por vía oral, tópica, intravenosa y/o parenteral. Así, el vehículo y/o diluyente que se pueden usar en la composición farmacéutica según la presente invención depende de la vía de administración que también influye sobre la formulación final tal como, por ejemplo, ungüentos, colirios, formulaciones en gel o soluciones para inyección ocular.

La composición farmacéutica según la presente invención incluye típicamente una cantidad farmacéuticamente eficaz de un GDNF o de un derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o un agonista que sustituye la actividad funcional del GDNF, y/o el ácido nucleico definido arriba que codifica la secuencia primaria de aminoácidos del GDNF y/o del agonista en combinación con uno o más materiales de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como un vehículo y/o un diluyente. Los componentes adicionales de la formulación incluyen agentes antioxidantes, conservadores, colorantes, aromatizantes, y emulsionantes, agentes de suspensión, disolventes, agentes de relleno, agentes diluyentes, tampones, vehículos de administración, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Por ejemplo, un soporte o vehículo adecuado puede ser el agua para inyecciones, una solución salina fisiológica, o una solución salina mezclada con una proteína portadora adecuada tal como la sueroalbúmina.

El disolvente o diluyente de la composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso y puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables que son capaces de modificar y/o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, la escala, la esterilidad, la estabilidad, la tasa de disolución o el olor de la disolución. Asimismo, se pueden incluir otros componentes en la composición farmacéutica según la presente invención para modificar y/o mantener la velocidad de liberación de la sustancia farmacéuticamente eficaz, tal como el producto proteico de GDNF o para estimular la absorción o penetración del mismo a través de las células epiteliales y/o estromales. Tales componentes modificadores son sustancias que se emplean habitualmente en la materia para formular posologías para la administración parenteral en forma bien unitaria o multidosis.

La composición farmacéutica finalmente formulada según la presente invención se puede guardar en viales estériles en forma de una solución, una suspensión, un gel, una emulsión, un sólido o un polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones pueden almacenarse bien en una forma lista para uso o bien en una forma, por ejemplo, en el caso de un polvo liofilizado, que requiera reconstitución antes de su administración.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas anteriores y adicionales son conocidas en la materia y se describen en, por ejemplo, Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18ª Ed., Mack Publishing Co., Eastern, PA, 1990, 1435-1712). Tales formulaciones pueden tener influencia sobre el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo del componente farmacéuticamente eficaz, tal como la proteína GDNF, el agonista y/o el ácido nucleico tal como se definió arriba.

Otras formas de administración eficaces comprenden formulaciones parenterales de liberación lenta, es decir, retardada, nebulizaciones de inhalación, o formulaciones activas por vía oral. Por ejemplo, una formulación de liberación lenta puede comprender el GDNF o un derivado o parte funcionalmente activa del mismo que puede estar unido a, o incorporado en, preparaciones en partículas de compuestos poliméricos (tales como el ácido poliláctico, el ácido poliglicólico, etc.) o liposomas. Según una realización preferida adicional de la presente invención, se puede usar el ácido hialurónico como vehículo para el componente farmacéuticamente activo, por ejemplo el GDNF, que puede tener el efecto de fomentar la duración sostenida en la circulación. La composición farmacéutica según la presente invención puede formularse también para administración parenteral, por ejemplo, por infusión o inyección ocular, y puede incluir también formulaciones de liberación lenta o de circulación prolongada. Tales composiciones terapéuticas administradas por vía parenteral están típicamente en forma de soluciones acuosas exentas de pirógenos, parenteralmente aceptables que comprenden el (los) componente(s) farmacéuticamente eficaz (eficaces) tal(es) como el GDNF en un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Las formulaciones preferidas de la composición farmacéutica según la presente invención comprenden preparaciones oftálmicas típicas, que incluyen soluciones, suspensiones, ungüentos y formulaciones en gel oftálmicos. Otras vías de administración son, por ejemplo, inyecciones intracamerales, que se puede realizar directamente dentro de la cámara anterior o directamente dentro de la cámara vítrea del ojo, inyecciones subconjuntivales e inyecciones retrobulbares.

Preferiblemente, la composición farmacéutica según la presente invención se puede administrar a la superficie ocular y el espacio (externo) entre el globo ocular y el párpado, es decir por administración extraocular. Los ejemplos preferidos de regiones extraoculares incluyen el fórnix o callejón sin salida de los párpados, la superficie de la conjuntiva y, más preferiblemente, la superficie corneal. Esta localización es externa a todos los tejidos oculares y, por lo tanto, no se necesita un procedimiento invasivo para acceder a estas regiones. Los ejemplos preferidos de administración extraocular incluyen insertos y típicamente la aplicación de colirios, formulaciones en gel o ungüentos que se pueden usar para administrar material terapéutico a las regiones extraoculares. Otras formas posibles de aplicación son protecciones de liberación lenta y/o de contacto hechas de material inorgánico y/o orgánico (tales como una protección biodegradable hecha, por ejemplo, de colágeno), lentes de contacto así como sustratos superficiales naturales y artificiales tales como membranas amnióticas o matrices compuestas de distintas formas de colágeno o materiales artificiales tales como los plásticos. Tales dispositivos extraoculares son generalmente fáciles de retirar incluso por el paciente el mismo o ella misma.

Las formulaciones particularmente preferidas para composiciones farmacéuticas para la curación de heridas en las partes anteriores del ojo, tales como las heridas de la córnea, son formulaciones en gel poliméricas que comprenden un polímero que se puede escoger de entre el grupo que está formado por polímeros vinílicos, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, polisacáridos, proteínas, óxido de polietileno, polímeros de acrilamida y derivados o sales de los mismos. Tales formulaciones en gel están descritas en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.705.485. Las formulaciones en gel que comprenden un material polimérico soluble en agua, farmacéutica u oftálmicamente compatible influyen ventajosamente sobre la viscosidad de las composiciones farmacéuticas dentro de distintos intervalos determinados por la aplicación, puesto que las formulaciones son capaces de controlar la liberación y el aumento del tiempo de contacto del componente farmacéuticamente activo en el lugar de la herida. Los ejemplos particularmente preferidos de formulaciones en gel que contienen un material polimérico son las formulaciones en gel con ácido hialurónico. El ácido hialurónico (AH) es uno de los mucopolisacáridos que tienen una estructura en cadena lineal y está formado por una repetición de una unidad disacarídica de N-acetilglucosamina y ácido glucurónico. El AH se encuentra en la naturaleza, en microorganismos y en la piel en el tejido conectivo de los humanos y animales. Los pesos moleculares del AH se encuentran en el intervalo desde 50.000 hasta 8.000.000 según la fuente, la preparación y el procedimiento de determinación. Las soluciones viscosas de AH tienen propiedades lubricantes y un excelente efecto hidratante. Se encuentra en el fluido sinovial de las articulaciones, el humor vítreo del globo ocular, el cordón umbilical, la piel, los vasos sanguíneos y el cartílago. El AH funciona extraordinariamente bien como lubricante y como agente amortiguador de choques, y eso se debe probablemente a su capacidad de retención de agua y su afinidad de unión con ciertas proteínas específicas. Se considera una molécula muy segura para uso interno dentro del cuerpo humano. Por eso, se puede usar en las composiciones farmacéuticas según la presente invención para la curación de heridas y el tratamiento de trastornos de la curación de heridas, tales como las heridas en el ojo anterior. Además, las excelentes propiedades lubricantes y los efectos hidratantes del AH son altamente ventajosos para una composición farmacéutica según la presente invención que se puede, por ejemplo, usar para el tratamiento de trastornos de la curación de heridas provocados por distintas formas de ojo seco. Preferiblemente, el ácido hialurónico se encuentra presente en concentraciones de 0,5 a 5,0% en peso, respecto al peso total de la composición farmacéutica. Tal intervalo de concentraciones es adecuado para la formulación de soluciones ligeramente viscosas que se pueden usar como colirios que tengan una viscosidad que se encuentra preferiblemente en el intervalo de 1 a 1.000 mPa\cdots así como para otras formas de aplicaciones tales como las vendas empapadoras, en las que la viscosidad se encuentra preferiblemente en el intervalo de 1,0 a 5.000 mPa\cdots.

Según una realización preferida de la composición farmacéutica según la presente invención, el componente farmacéuticamente eficaz, tal como el GDNF, preferiblemente el GDNF humano recombinante, puede encontrarse presente en concentraciones que se extienden desde 0,01 a 1 mg/ml, por ejemplo en el caso de formulaciones líquidas tales como las formulaciones en gel o las formulaciones acuosas.

La composición farmacéutica según la presente invención se puede aplicar, por ejemplo, en el caso de formulaciones líquidas tales como las formulaciones en gel o las formulaciones acuosas para la administración tópica, por ejemplo colirios, en dosis que se extienden desde 5 a 100 \mul y pueden administrarse una a 24 veces al día.

Las figuras presentan:

La fig. 1 es un alineamiento de secuencias de las regiones conservadas de siete cisteínas del GDNF (SEC ID Nº 1, nº de entrada en GenBank L19063, L15306), la artemina (SEC ID Nº 5, nº de entrada en GenBank AF109401), la persefina (SEC ID Nº 4, nº de entrada en GenBank AF040962), la neurturina (SEC ID Nº 3, nº de entrada en GenBank U78110) y la secuencia consenso genérica resultante (SEC ID Nº 2). En la secuencia consenso de la SEC ID Nº 2, X representa cualquier aminoácido e Y representa cualquier o ningún aminoácido.

La fig. 2 presenta una electroforesis en gel de agarosa al 1,8% de productos de PCR amplificados a partir del ADNc que se generó a partir de ARNm extraído del epitelio corneal (A) y del estroma (B) ex vivo teñido con bromuro de etidio. Tanto el epitelio como el estroma expresaron el NGF (233 pb) (carril 1), la NT-3 (298 pb) (carril 2), y el BDNF (373 pb) (carril 4). La NT-4 (464 pb) (carril 3) se expresó únicamente en el epitelio corneal. El GDNF (343 pb) (carril 5) se expresó sobre todo en el estroma corneal. M = marcador de peso molecular de ADN (fragmentos de ADN de PhiX 174/Hinf I).

La fig. 3 presenta una electroforesis en gel de agarosa al 1,8% de productos de PCR amplificados a partir del ADNc que se generó a partir de ARNm extraído del epitelio corneal (A) y del estroma (B) ex vivo teñido con bromuro de etidio. Tanto el epitelio como el estroma expresaron los receptores para neurotrofinas TrkA (570 pb) (carril 1), TrkB (472 pb) (carril 2), TrkC (484 pb) (carril 3) y TrkE (545 pb) (carril 4). M = marcador de peso molecular de ADN (fragmentos de ADN de PhiX 174/Hinf I).

La fig. 4 presenta un análisis de transferencia de manchas de ADN para la determinación del nivel de transcripción del GDNF y de otros factores neurotróficos y de los receptores tirosina quinasa correspondientes en células epiteliales corneales (A) y queratocitos estromales (B) humanos de cultivo. Cada mancha de ADN en 1 a 10 representa manchas de PCR de 0,1 \mug específicas para el NGF (carril 1), la NT-3 (carril 2), la NT-4 (carril 3), el BDNF (carril 4), el GDNF (carril 5), el TrkA (carril 6), el TrkB (carril 7), el TrkC (carril 8), el TrkE (carril 9), y la GAPDH (carril 10). La transcripción de NT-4 sólo se pudo detectar en la línea de células epiteliales corneales humanas de cultivo y la transcripción del GDNF se pudo detectar sobre todo en los queratocitos estromales corneales humanos de cultivo. A efectos de comparación, el carril 10 representa la GAPDH como control positivo que muestra la señal más fuerte.

La fig. 5 es una gráfica que muestra el efecto del GDNF humano recombinante sobre la formación de colonias de células epiteliales corneales primarias de conejo el día 6 (valores medios y desviaciones típicas). Las células se pusieron en cultivo a densidad clonal en MCDB exento de suero. La adición de 50 ó 200 ng/ml de GDNF tuvo como resultado un aumento estadísticamente significativo (p < 0,005,*) del número total de colonias.

La fig. 6 presenta una gráfica que demuestra el efecto del GDNF recombinante humano sobre la proliferación clonal de las células epiteliales corneales primarias de conejo el día 6 (valores medios y desviaciones típicas). La adición de GDNF (50 ó 200 ng/ml) tuvo como resultado un aumento estadísticamente significativo (p < 0,005, *) del número de células por colonia.

La fig. 7 es una gráfica que presenta el efecto del GDNF sobre la proliferación de las células estromales corneales primarias humanas el día 6. Después de ponerse en cultivo en DMEM más STF al 10%, las células se sembraron en placa a una baja densidad en DMEM sin STF y se siguió con su procesamiento. Los valores se presentan como media +/- desviación típica (SD). El GDNF produjo una inducción significativa de la absorbancia que refleja la densidad celular en comparación con el control (p < 0,005, *).

La fig. 8 presenta transferencias de tipo Western que demuestran el efecto del GDNF y de otros factores neurotróficos sobre la fosforilación de las MAP quinasas en epitelio corneal humano en cultivo. Las transferencias de tipo Western con anticuerpos contra ERK1 (44 kD) y ERK2 (42 kD) fosforiladas (A), ERK1 y ERK2 totales (fosforiladas y no fosforiladas) (44 kD y 42 kD) (B), JNK1 (46 kD) y JNK2 (54 kD) fosforiladas (C), y contra JNK1 y JNK2 totales (fosforiladas y no fosforiladas) (46 kD y 54 kD) (D) demuestran que la fosforilación de ERK1 y en menor medida de ERK2 se indujo en las células epiteliales humanas en cultivo en medio que contiene GDNF (carril 5), BDNF (carril 3) o NGF (carril 1) en comparación con las células en cultivo en medio control exento de suero (carril 7). La fosforilación de ERK1 por el NGF y el GDNF pero no por el BDNF estuvo inhibida por la adición del inhibidor de MEK PD 98059 (carriles 2, 6 y 4 respectivamente). Por contraste, las JNK1/2 no fueron inducidas por el NGF (carril 1), el BDNF (carril 2) o el GDNF (carril 3) en comparación con el control (carril 4).

La fig. 9 presenta transferencias de tipo Western que demuestran el efecto del GDNF y de otros factores neurotróficos sobre la fosforilación de las MAP quinasas en queratocitos estromales corneales humanos en cultivo. Las transferencias de tipo Western con anticuerpos contra ERK1 (44 kD) y ERK2 (42 kD) fosforiladas (A), ERK1 y ERK2 totales (fosforiladas y no fosforiladas) (44 kD y 42 kD) (B), JNK1 (46 kD) y JNK2 (54 kD) fosforiladas (C), y JNK1 y JNK2 totales (fosforiladas y no fosforiladas) (46 kD y 54 kD) (D) demuestran que la fosforilación de ERK1 y en menor medida de ERK2 fue débilmente inducida por el GDNF (carril 5) y el NGF (carril 1) en comparación con el medio control exento de suero (carril 7) o el BDNF (carril 3). La fosforilación de ERK1 por el NGF y el GDNF estuvo inhibida por la adición del inhibidor de MEK PD 98059 (carriles 2 y 5, respectivamente). La fosforilación de ERK1 por el BDNF permaneció sin cambiar tras la adición de PD 98059 (carril 4). La fosforilación de JNK1 (C) fue débilmente inducida por el NGF (carril 1), el BDNF (carril 2) o el GDNF (carril 3) en comparación con el medio exento de suero (carril 4).

La fig. 10 es una gráfica que presenta el curso cronológico del tamaño del defecto epitelial en un paciente durante el tratamiento tópico con el GDNF.

La fig. 11 presenta fotografías del centro de la córnea del mismo paciente tratado con GDNF que en la fig. 10. El día antes del inicio del tratamiento con GDNF se aprecia una gran superficie que se puede marcar con fluoresceína amarilla. Esta superficie no está recubierta de epitelio (día d0). Al cabo de tres días, se puede observar una disminución significativa de la superficie dañada debida a la proliferación del epitelio desde arriba (d3). El 17º día sólo se puede apreciar un pequeño defecto central que sólo se pudo marcar débilmente con fluoresceína (d17). Tan pronto como 21 días después del inicio del tratamiento la curación de la herida está prácticamente acabada salvo por irregularidades sólo ligeras (d21).

La fig. 12 es una fotografía de experimentos de transferencia de tipo Western que demuestran la fosforilación dependiente del tiempo de Ret por el GDNF. El nivel de Ret fosforilado (aproximadamente 150 kD) en las células epiteliales corneales en cultivo (control) era bajo antes de la adición de GDNF (200 ng/ml) (co), aumentó a los 5 minutos y se mantuvo a un nivel elevado a los 10 minutos y los 15 minutos después de la adición de GDNF. La fosforilación de las tirosinas de Ret en las células tratadas previamente con herbimicina A y estimuladas con GDNF (10 minutos) permanece a un nivel más bajo que en las células sin incubación con herbimicina A. La mancha de IgG (inmunoglobulina) indica que se usaron cantidades iguales de anticuerpo contra Ret para la inmunoprecipitación.

La fig. 13 es una fotografía de experimentos de transferencia de tipo Western que demuestra la fosforilación dependiente del tiempo de las señales intracelulares por el GDNF. La fosforilación de las tirosinas de FAK (aproximadamente 130 kD) y de Pyk2 (aproximadamente 130 kD), la fosforilación de las serinas de cRaf (aproximadamente 80 kD), de MEK1 (45 kD) y de Elk (aproximadamente 60 kD) así como la fosforilación de las tirosinas/treoninas de Erk1 (44 kD) y 2 (42 kD) fue inducida dentro de los 10 minutos después de la exposición al GDNF y aumentó gradualmente sobre los siguientes 30 minutos. La fosforilación de la p90RSK (90 kD) no fue inducida en respuesta a la estimulación por GDNF. Para demostrar que se cargaron cantidades iguales de proteínas totales en cada carril (80 \mug) se presenta una mancha con un anticuerpo contra Erk total (Erk1 y Erk2 fosforiladas y no fosforiladas).

La fig. 14 es una fotografía de experimentos de transferencia de tipo Western adicionales que muestran la inhibición de la fosforilación dependiente de GDNF de FAK, cRaf y Erk por la herbimicina A. El nivel de fosforilación de las tirosinas de FAK, la fosforilación de las serinas de cRaf y la fosforilación de las tirosinas/treoninas de Erk 1 y 2 dependientes de GDNF fueron todos significativamente disminuidos en las células epiteliales corneales en cultivo tras la incubación previa con herbimicina A durante dos horas. La cantidad de Erk total (Erk1 y Erk2 fosforiladas y no fosforiladas) permaneció sin cambiar.

La fig. 15 es una fotografía de una transferencia de tipo Western que muestra la fosforilación dependiente del tiempo de las señales intracelulares por la artemina. La fosforilación de las tirosinas de MEK1 (45 kD) fue muy baja en las células control (carril 1). La fosforilación se indujo dentro de los 10 (carril 2), 20 (carril 3) y más significativamente 40 (carril 4) y 60 minutos (carril 5) después de la exposición a la artemina (250 ng/ml). M: marcador de peso molecular.

La fig. 16 es una fotografía de una transferencia de tipo Western adicional que demuestra la fosforilación dependiente del tiempo de las señales intracelulares por la artemina. La fosforilación de las tirosinas/treoninas de Erk 1 y 2 fue muy baja en las células control (carril 1). La fosforilación se indujo dentro de los 10, 20 y más significativamente 40 y 60 minutos (carriles 2 a 5) después de la exposición a la artemina (250 ng/ml).

La fig. 17 muestra representaciones gráficas de experimentos que demuestran el efecto del GDNF sobre el cierre in vitro de ``heridas'' en monocapas semiconfluentes. El cierre de ``heridas'' de rasguño de 1 mm de diámetro fue significativamente (*) (p < 0,01) mejorado por 250 ng/ml de GDNF en comparación con los cultivos control (co) tanto en las células epiteliales corneales primarias (A) como en las células epiteliales corneales sometidas a transfección con SV-40 (cfr. Arraki-Sasaki y col., 1995) (B). El cierre de la herida se expresa como tanto por ciento del espacio de la herida inicial en cultivos representativos a 18 horas. El NGF y el EGF hicieron las veces de controles positivos.

La fig. 18 presenta los resultados de experimentos que demuestran el efecto del GDNF sobre la migración de las células epiteliales corneales en un sistema de cámara de Boyden modificada. En el medio control, sólo pocas (19 \pm 6,8) células epiteliales corneales migraron desde la cámara superior a través del filtro [fotografía en (A); gráfica en (C)]. La adición de 250 ng/ml de GDNF en la cámara inferior tuvo como resultado un aumento de 6 veces de la migración de las células a través del filtro (117 \pm 37,6) (p < 0,0001) [fotografía en (B); gráfica en (C)].

La fig. 19 es una representación gráfica de experimentos que muestran el efecto de la artemina sobre el cierre in vitro de ``heridas'' en monocapas semiconfluentes. El cierre de las ``heridas'' de rasguño de 1 mm de diámetro fue significativamente (*) (p < 0,01) mejorado por la artemina a concentraciones de 100 ng/ml y 250 ng/ml en comparación con los cultivos control (Co). Los resultados se expresan como espacio de la herida en % en comparación con el espacio de la herida original al principio del experimento en las células epiteliales corneales de conejo. El efecto del EGF hizo las veces de control positivo.

La fig. 20 es una representación gráfica de experimentos que muestran el efecto de la artemina sobre la proliferación in vitro de las células epiteliales corneales. Lo que se muestra son colonias de células por placa después de una semana de incubación con bien 10 ng/ml de EGF como control positivo o con artemina a concentraciones de 100 ó 250 ng/ml en comparación con el control (medio MCDB 151 sin factores de crecimiento).

La fig. 21 es una representación gráfica de experimentos que ilustran más el efecto de la artemina sobre la proliferación in vitro de las células epiteliales corneales. Las barras representan el número de células por placa después de una semana de incubación con bien 10 ng/ml de EGF como control positivo o con artemina a concentraciones de 100 ó 250 ng/ml en comparación con el control (medio MCDB 151 sin factores de crecimiento).

La fig. 22 es una representación esquemática de las vías de transducción de señales que parecen implicadas en los procesos de curación de heridas desencadenados por las moléculas de GDNF.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no restrictivo.

Ejemplo Transcripción del GDNF en la córnea humana

Se detectó la transcripción del GDNF y de otros factores neurotróficos en células recién recogidas del epitelio (fig. 2A) y del estroma (fig. 2B) corneal humano por RT-PCR. En la fig. 2A, el resultado de una RT-PCR representativa muestra que se podían amplificar los fragmentos de ADNc específicos del NGF (carril 1, 233 pb), de la NT-3 (carril 2, 298 pb), de la NT-4 (carril 3, 464 pb), del BDNF (carril 4, 373 pb) a partir de epitelio corneal humano ex vivo. Sin embargo, no se pudo detectar transcripción del GDNF (carril 5) mediante el uso de los cebadores que se enumeran más adelante. Este resultado fue confirmado por tres experimentos independientes que usaron el ADNc de células epiteliales en cultivo primario y de una línea de células epiteliales corneales humanas inmortalizadas con el SV40 (Araki-Sasaki y col., 1995). Por contraste, el estroma corneal ex vivo contenía ARNm que codificaba también el GDNF (carril 5, 343 pb) (cfr. fig. 2B). Sin embargo, en este tejido no se pudo detectar transcripción de la NT-4 (carril 3) mediante el uso de los cebadores que se enumeran más adelante. Los resultados de los experimentos de RT-PCR fueron idénticos cuando se usaba ADNc de queratocitos del estroma de la córnea en cultivo.

Todos los productos de PCR arriba mencionados se usaron para transformar E. coli y se secuenciaron. La comparación de las secuencias de ADN obtenidas con genes conocidos a través del programa de búsqueda Blast de Gen Bank reveló una identidad de secuencia del 100% con los factores neurotróficos esperados en todos los experimentos.

Transcripción de receptores tirosina quinasa específicos para el GDNF en la córnea humana

El epitelio (fig. 3A) y el estroma (fig. 3B) corneal ex vivo contenían también ARNm que codifican receptores tirosina quinasa que son necesarios para la unión y la transducción de la señal de factores neurotróficos.

La fig. 3A presenta el resultado de experimentos de RT-PCR tras la amplificación de fragmentos de ADNc específicos para TrkA (carril 1) (570 pb), TrkB (carril 2) (472 pb), TrkC (carril 3) (484 pb) y TrkE (carril 4) (545 pb) del epitelio corneal ex vivo. La fig. 3B presenta el mismo resultado mediante el uso de ARNm del estroma corneal ex vivo. Cuando se usaron células epiteliales corneales de cultivo (cultivos primarios o línea de células epiteliales corneales) o queratocitos estromales corneales de cultivo, el espectro de TR-PCR no cambiaba. Todos los fragmentos de los genes Trk anteriores se clonaron, secuenciaron y analizaron también mediante el programa de búsqueda Blast para confirmación adicional.

Nivel de transcripción del GDNF y de los receptores tirosina quinasa correspondientes en epitelio corneal y queratocitos estromales humanos en cultivo

Para confirmar los resultados de los experimentos de PCR anteriores así como para estimar el nivel de transcripción génica, se llevó a cabo un análisis de transferencia de manchas de ADN (fig. 4). Puesto que la sonda de hibridación para la transferencia de manchas de ADN era ADNc de primera hebra que se generó a partir de 1 \mug de ARNm de células epiteliales o de queratocitos estromales de cultivo, el resultado de la transferencia de manchas de ADN permite estimar y comparar el nivel de transcripción del GDNF y de otros factores neurotróficos y receptores tirosina quinasa correspondientes en distintas células. La fig. 4A presenta la gama de los niveles de transcripción del GDNF y de otros factores de transcripción y de los receptores tirosina quinasa correspondientes en la línea celular de epitelio corneal humano. La transcripción de NGF (carril 1), BDNF (carril 4) y TrkE (carril 9) fue significativamente más débil que la de NT-3 (carril 2), NT-4 (carril 3), TrkA (carril 6), TrkB (carril 7) y TrkC (carril 8). El nivel de transcripción de la NT-3 (carril 2), la NT-4 (carril 3), TrkA (carril 6), TrkB (carril 7) y TrkC (carril 8) fue inferior al de la GAPDH que se usó como control positivo (carril 10). El GDNF no se transcribió en las células epiteliales (carril 5, fig. 4A) pero presentó una señal positiva en los queratocitos estromales de cultivo (carril 5, fig. 4B).

Papel funcional del GDNF en el epitelio y el estroma corneales en cultivo

El GDNF tuvo un efecto considerable sobre la proliferación de las células epiteliales corneales. Como se muestra en la fig. 5, el número de colonias por placa aumentó significativamente tras la adición de GDNF humano recombinante (50 ng, p < 0,05, y 200 ng, p < 0,0001). Esto indica que la capacidad de las células epiteliales corneales para formar colonias fue mejorada por el GDNF. Incluso más importante es el efecto sobre la proliferación clonal que se refleja por el número de células en el seno de cada colonia (fig. 6). Las células epiteliales corneales están entrando constantemente en una proliferación celular que el día 6 tiene como resultado una gama de colonias que se extiende desde colonias muy pequeñas hasta muy grandes. Esta observación explica la desviación típica (SD) relativamente grande y la necesidad de contar un gran número de colonias (75) en cada placa para obtener datos estadísticamente significativos. La proliferación clonal de las células epiteliales corneales fue significativamente estimulada por el GDNF (50 y 200 ng/ml, p < 0,01) como se muestra en la fig. 6.

Además del efecto estimulador sobre la proliferación epitelial corneal, el GDNF a concentraciones de bien 20 o 100 ng/ml aumentó significativamente la proliferación de los queratocitos estromales (p < 0,005) como se muestra en la fig. 7. Estos datos indican que el GDNF puede aumentar la proliferación de queratocitos estromales humanos en medio exento de suero.

Efecto del GDNF sobre la fosforilación de MAP quinasas en el epitelio corneal y los queratocitos estromales en cultivo

La activación de la cascada de señalización de las MAP quinasas es esencial para mediar el efecto de diversos factores de crecimiento sobre la proliferación y la diferenciación celular. Por lo tanto, la acumulación intracelular de las MAP quinasas fosforiladas ERK y JNK es una señal de la activación de la vía de las MAP quinasas en respuesta a factores neurotróficos. Para establecer una correlación entre la acumulación de la transducción de la señal y los resultados de los efectos sorprendentes del GDNF sobre la proliferación de las células epiteliales corneales en cultivo y los queratocitos estromales en cultivo, se estudió la inducción de miembros de la cascada de las MAP quinasas en el epitelio y el estroma corneales humanos. Para asegurar que las señales correspondiesen a fosforilaciones, se usó también el inhibidor PD 98059 que inhibe a las MAP quinasas. La fig. 8A muestra que se pueden inducir las formas fosforiladas de ERK1 y 2 en células epiteliales humanas en cultivo. En comparación con el medio control exento de suero (carril 7) el GDNF a una concentración de 200 ng/ml indujo la fosforilación de ERK1 y ERK2 (carril 5). Esta inducción fue impedida por la adición del inhibidor PD 98059. El nivel de ERK1 y ERK2 fosforiladas también fue aumentado por el NGF (200 ng/ml) (carril 1), y este aumento también pudo ser impedido por el PD 98059. De manera similar, el nivel de ERK1 y ERK2 fosforiladas también fue aumentado por el BDNF (200 ng/ml) (carril 3), pero este aumento no fue inhibido por el PD 98059. Los datos de la fig. 8B, C y D muestran el mismo nivel de expresión de ERK1 y ERK2 totales (fosforiladas y no fosforiladas) (fig. 8B), JNK1 y JNK2 activadas (fig. 8C) así como JNK1 y JNK2 totales (fosforiladas y no fosforiladas) (fig. 8D) en las células epiteliales corneales humanas cuando se incuban con o sin los factores neurotróficos anteriores. Los resultados indican que la fosforilación de ERK1 y ERK2 (pero no de JNK1/2) puede ser inducida por el GDNF en células epiteliales corneales de conejo en cultivo.

La fig. 9 muestra que el efecto del GDNF sobre la fosforilación de las MAP quinasas es distinto de aquel de los factores neurotróficos en queratocitos estromales corneales humanos en cultivo. Los datos que se muestran en la fig. 9A indican que en comparación con el control en queratocitos estromales (carril 7) la fosforilación de ERK1 y en menor medida de ERK2 fue inducida por 200 ng/ml de NGF (carril 1), y que este aumento fue inhibido por el PD 98059 (carril 2). Por contraste, 200 ng/ml de BDNF no indujeron la fosforilación de ERK1 o ERK2 en comparación con el control (carril 3) y ésta permaneció sin cambiar con PD 98059 (carril 4). El GDNF (200 ng/ml) indujo la ERK1 en un grado limitado (carril 5), y este aumento fue inhibido por el PD 98059 (carril 6). La fig. 9B muestra que la ERK total fue inducida hasta el mismo nivel en queratocitos estromales en cultivo bien en medio exento de suero o con los factores neurotróficos anteriores. En comparación con ERK1 la expresión tanto de JNK1 como 2 activadas fue relativamente débil en los queratocitos estromales. Se pudieron observar ligeras diferencias en cuanto a la expresión de la JNK1 activada que fue más baja en la células en cultivo en DMEM exento de suero (carril 4) que en células estimuladas con NGF (carril 1), BDNF (carril 2) o GDNF (carril 3). El BDNF pareció tener el efecto más potente sobre la activación de la JNK1 (carril 2). La JNK2 activada no fue inducida por GDNF, NGF ni BDNF (cfr. fig. 9C) en los queratocitos estromales. La fig. 9D muestra que la expresión de las JNK1 y JNK2 totales es la misma en los queratocitos estromales independientemente de las condiciones de cultivo. Los resultados anteriores indican que el GDNF, el NGF y el BDNF tienen efectos distintos sobre la acumulación de las formas fosforiladas de la ERK1 y la JNK1 en los queratocitos estromales humanos en cultivo.

Resumen de los datos in vitro y de cultivo celular

Para estudiar el efecto del GDNF y de otros factores neurotróficos sobre el estroma y el epitelio corneal humano y de conejo y la posible vía de transducción implicada, se estudió la transcripción de GDNF, NGF, NT-3, NT-4, BDNF, y de los receptores TrkA a E por RT-PCR. El análisis de transferencias de manchas de ADN permitió una estimación de los niveles de transcripción. Se llevaron a cabo ensayos de proliferación de células individuales mediante el uso de GDNF recombinante. La transducción de la señal por MAP quinasas se estudió por análisis de transferencias de tipo Western que usaron anticuerpos contra ERK1/2 y JNK1/2 activadas y totales, respectivamente.

Los resultados anteriores indican que la transcripción de NGF, NT-3, BDNF, y de los receptores TrkA, TrkB, TrkC, TrkE se puede detectar en el epitelio y el estroma tanto ex vivo como en cultivo. Por contraste, la transcripción del GDNF se detectó principalmente en el estroma mientras que la transcripción de NT-4 se detectó únicamente en el epitelio. Los niveles de transcripción fueron más elevados para la NT-3, la NT-4 y los receptores Trk y más bajos para el GDNF, el NGF y el BDNF. El GDNF estimuló tanto la formación como la proliferación de colonias epiteliales. La proliferación de colonias estromales fue aumentada por el GDNF en medio exento de suero. En el epitelio, sobre todo ERK1 fue activada por GDNF, NGF y BDNF. En las células estromales el GDNF y el NGF estimularon la fosforilación de ERK1 y JNK1.

Estos resultados muestran que el GDNF se transcribe en la córnea humana. El GDNF estimula la proliferación epitelial corneal. El GDNF tiene efectos muy específicos sobre la fosforilación de ERK1 y JNK1 en las células epiteliales y estromales. La expresión diferencial del GDNF sugiere una función reguladora dentro de la red de citoquinas de la córnea. El hallazgo de que el GDNF se expresa principalmente en los queratocitos estromales pero que estimula la proliferación de las células epiteliales de la córnea y que la proliferación de los queratocitos estromales estaba afectada en una menor medida por el GDNF sugiere que el GDNF desempeña su papel como modulador epitelial.

Terapia de una úlcera corneal en un paciente humano

Para demostrar directamente el efecto positivo sobre la proliferación de las células epiteliales corneales, se trató un paciente de 45 años de edad aquejado de una úlcera corneal con inflamación masiva asociada del lado izquierdo con GDNF humana recombinante. Antes del tratamiento, el paciente había sido tratado sin éxito durante seis semanas en un hospital especializado en enfermedades del ojo con distintos ungüentos, colirios, una lente de contacto y también con gotas de suero. Por lo tanto, se concluyó que el paciente tenía que ser sometido a una operación quirúrgica. Sin embargo, se trató el paciente con GDNF humana recombinante a una concentración de 0,2 mg/ml (25 \mul/dosis) a 2 horas de intervalo durante 40 horas, luego con 20 \mul/dosis 6 veces al día. Como se muestra en las fig. 10 y 11, respectivamente, la curación de la herida empezó a partir del día 2. A partir de entonces, la curación de la herida del epitelio progresó y se completó al cabo de 3 semanas de terapia (fig. 10). Además, se pudo observar un aumento constante de espesor del estroma. Además, después de la curación del epitelio, se consiguió una reducción significativa de la inflamación así como de los achaques subjetivos.

La fosforilación de Ret es inducida por el GDNF de una manera dependiente del tiempo en células epiteliales corneales en cultivo

Tras la estimulación con GDNF, GFRalfa-1 recluta a Ret para la membrana celular y activa su dominio receptor tirosina quinasa para mediar las señales del GDNF entre las proteínas de receptor de membrana y proteínas de señalización intracelulares. Para determinar si Ret se expresa en el epitelio corneal y participa en las vías de señalización inducidas por el GDNF, se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones mediante el uso de un anticuerpo anti-Ret seguidas de transferencias de tipo Western con anticuerpos monoclonales contra la fosfotirosina para detectar Ret fosforilado. La fig. 12 muestra que el Ret fosforilado se acumulaba de manera dependiente del tiempo en las células epiteliales corneales en respuesta el GDNF. En comparación con los cultivos control exentos de suero (co), la fosforilación de las tirosinas de Ret fue inducida dentro de los 5 minutos después de la adición de GDNF (200 ng/ml) al medio de cultivo. La fosforilación de las tirosinas de Ret se mantuvo a un nivel elevado durante 15 minutos. En comparación, el nivel de Ret fosforilado en células tratadas previamente con herbimicina fue incluso menor que en los cultivos control. Estos resultados indican que la fosforilación de las tirosinas de Ret dependiente de GDNF está específicamente inhibida por el inhibidor de tirosina quinasas herbimicina A.

Activación dependiente del tiempo de las señales intracelulares inducidas por el GDNF en células epiteliales corneales en cultivo

Para determinar qué vías de transducción de señales están inducidas por el GDNF, se buscó detectar la fosforilación de las tirosinas dependiente del GDNF en los miembros de la familia de la FAK y la activación dependiente del GDNF de los componentes de señalización de la MAPK por transferencias de tipo Western con anticuerpos específicos contra cada una de las proteínas fosforiladas.

La fosforilación de las tirosinas de la FAK se encontró gradualmente aumentada dentro de los 40 minutos en presencia de GDNF (fig. 13). La fosfotirosina quinasa 2 (Pyk2), otro miembro de la familia de la FAK, también se encontró fosforilada dentro de los 40 minutos después de la exposición al GDNF (fig. 13).

En cuanto a las señalización de la MAPK, cRaf pertenece a la familia de las MAPK quinasas (MKKK) y desempeña un papel de iniciador de la propagación de las señales de la MAPK. La MAPK quinasa 1 (MEK1) es una proteína clave que media las cascadas de señalización desde MKKK hasta los dos componentes de la MAPK Erk 1 y 2. La activación de Erk facilita su translocación dentro del núcleo donde fosforila a activadores de la transcripción tales como Elk. La fig. 13 demuestra que todos estos componentes de señalización están activados por el GDNF: la fosforilación de las serinas de cRaf, MEK1 y Elk así como la fosforilación de las tirosinas/treoninas de Erk 1 y 2 fueron todas inducidas considerablemente ya dentro de los 10 minutos después de la exposición al GDNF y el nivel de fosforilación aumentó gradualmente a lo largo del periodo de observación (fig. 13). Por contraste, no se pudo detectar fosforilación de la RSK en respuesta al GDNF (fig. 13). Estos resultados indican que la inducción de la transcripción génica por el GDNF depende de la vía FAK (Pyk2)-MAPK-Elk.

Efecto de la herbimicina A sobre la fosforilación dependiente de GDNF de las proteínas de señalización intracelulares

El tratamiento de células con el inhibidor de las proteínas tirosina quinasas herbimicina A tuvo como resultado la reducción de la activación dependiente de GDNF de FAK, cRaf y Erk. Los análisis de transferencias de tipo Western muestran que el GDNF indujo la fosforilación de FAK, cRaf y Erk dentro de los 30 minutos después de su adición al medio (fig. 14). Sin embargo, cuando se pusieron en cultivo células epiteliales corneales en presencia de herbimicina A, la fosforilación dependiente de GDNF de FAK, cRaf y Erk se encontró considerablemente disminuida (fig. 14). En este contexto, cabría tomar nota de que no sólo la fosforilación de las tirosinas de FAK, sino también la fosforilación de las serinas de cRaf así como la fosforilación de las tirosinas/treoninas de Erk 1 y 2 estuvieron inhibidas por el inhibidor de las tirosina quinasas herbimicina A. Esto sugiere que la activación de la vía de cRaf-Erk depende en gran medida de la fosforilación de FAK que representa un regulador aguas arriba.

La fosforilación de la MEK es inducida por la artemina

La incubación de células epiteliales corneales humanas con 250 mg/ml de artemina produjo una inducción dependiente del tiempo de la fosforilación de la MEK. La transferencia de tipo Western en la fig. 15 muestra un muy bajo nivel de fosforilación en el control (carril 1). La incubación con 250 ng/ml de artemina durante 10, 20, 40 y 60 minutos (carriles 2 a 5) produjo una cantidad creciente de MEK fosforilada en las células epiteliales corneales. Todos los carriles en la fig. 15 fueron cargados con la misma cantidad de proteínas.

La fosforilación de Erk 1/2 es inducida por la artemina

La incubación de células epiteliales corneales humanas con 250 mg/ml de artemina produjo una inducción dependiente del tiempo de la fosforilación de Erk 1/2. La transferencia de tipo Western en la fig. 16 muestra un muy bajo nivel de fosforilación en el control (carril 1). La incubación con 250 ng/ml de artemina durante 10, 20, 40 y 60 minutos (carriles 2 a 5) aumentó gradualmente la cantidad de Erk 1 y 2 fosforiladas en las células epiteliales corneales. Todos los carriles en la fig. 16 fueron cargados con la misma cantidad de proteínas.

El GDNF induce la migración de las células epiteliales corneales

Tras una ``herida'' de rasguño de aproximadamente 1 mm de diámetro en una monocapa subconfluente de células epiteliales corneales humanas primarias en medio control [SHEM sin aditivos (co)], menos del 10% del espacio en la monocapa de células se colmó con células dentro de las 18 horas (la fig. 17A presenta el resultado de un experimento de cultivo representativo). La adición tanto de GDNF como de NGF así como de EGF tuvo como resultado un aumento significativo de la curación de la herida in vitro. Como se muestra en la fig. 17A, se colmó 16,5 \pm 6% del espacio en presencia de 250 ng/ml de GDNF lo cual representa un aumento significativo respecto al control (p < 0,01).

De manera similar, la exposición de las células a NGF (250 ng/ml) o a EGF (10 ng/ml) tuvo como resultado el cierre de aproximadamente el 20% del espacio (19,6% \pm 3,1 y 19,0% \pm 8,6 respectivamente). Estos datos indican que el NGF y el EGF estimulan también significativamente el cierre de la herida en comparación con el control (p < 0,0001 y p < 0,0001, respectivamente).

Estos resultados fueron confirmados mediante el uso de células epiteliales corneales de la línea de células transformadas con el SV-40 como se muestra en la fig. 17B. En medio control [SHEM sin aditivos (Co)], el 20% \pm 4,5 del espacio en la monocapa de células se colmó al cabo de 18 horas. En presencia de GDNF (250 ng/ml), el 30% \pm 6,9 del espacio estaba colmado lo cual indica un aumento significativo respecto al control (p < 0,001). De manera similar, la exposición de los cultivos bien a NGF (250 ng/ml) o a EGF (10 ng/ml) mostró que el 27% \pm 7,1 y el 44,6 \pm 9% del espacio en la capa de células se había colmado con células (p < 0,0001 y p < 0,0001, respectivamente) (fig. 17B). Estos resultados demuestran que el GDNF aumentó significativamente el cierre de una ``herida'' en una monocapa semiconfluente de células epiteliales corneales y que este efecto fue similar al del NGF y del EGF.

Para confirmar más el efecto del GDNF sobre la migración celular, se llevó a cabo un análisis en cámara de Boyden modificada: en medio control (SHEM sin factores de crecimiento) sólo pocas células (19 \pm 6,8) migraron a través de un filtro de 8 \mum de tamaño de poro (fig. 18A, C). Sin embargo, cuando se añadía 250 ng/ml de GDNF al pocillo inferior de la cámara de Boyden modificada, el número de células que habían migrado a través de los poros del filtro aumentó más de 6 veces (117 \pm 37,6) (p < 0,0001); cfr. fig. 18B, C.

La migración inducida por el GDNF está inhibida por la herbimicina A

Para comprobar más la importancia de las vías de señalización de FAK-MAPK durante la curación de las heridas, se estudió el efecto de la herbimicina A sobre la migración celular mediada por el GDNF en el modelo in vitro de curación de las heridas. La herbimicina A fue capaz de bloquear la migración celular en presencia de GDNF. En un cultivo representativo que contenía 250 ng/ml de GDNF, el 37,9 \pm 8,1% del espacio de la herida estuvo colmado con células al cabo de 18 horas. En presencia de GDNF y de herbimicina A 10 \muM, sólo el 19,2 \pm 5,5% del espacio se encontraba cerrado (p < 0,001).

La artemina induce la migración de células epiteliales corneales

Tras una ``herida'' de rasguño de aproximadamente 1 mm de diámetro en una monocapa subconfluente de células epiteliales corneales de conejo primarias en medio control [medio 500 sin aditivos (Co)], aproximadamente el 20% del espacio en la monocapa de células se colmó con células dentro de las 6 horas (la fig. 19 presenta el resultado de un experimento de cultivo representativo). La adición tanto de artemina (100 o 250 ng/ml) como de EGF (10 ng/ml) tuvo como resultado un aumento significativo de la curación de la herida in vitro. Como se muestra en la fig. 19, se colmó el 29 \pm 8% del espacio en presencia de 100 ng/ml de artemina lo cual representa un aumento significativo respecto al control (p < 0,01). De manera similar, la exposición de las células a 250 ng/ml de artemina tuvo como resultado el cierre de aproximadamente el 30% al 35% del espacio. Estos datos indican que la artemina estimula también significativamente el cierre de la herida en comparación con el control (p < 0,001).

La artemina aumenta la formación de colonias y de este modo estimula la proliferación

La fig. 20 presenta el efecto de la artemina (100 ng/ml y 250 ng/ml) sobre el número total de colonias de células epiteliales corneales de conejo el día 6. Los cultivos control (Co) contenían una media de 40\pm20 colonias. Los cultivos que se incubaron con 10 ng/ml contenían una media de 58\pm18 colonias (p < 0,01). La adición de 250 ng/ml de artemina aumentó significativamente el número de colonias respecto al control hasta una media de 79\pm38 cultivos (p < 0,01).

La artemina aumenta el número total de células por placa y de este modo induce la proliferación de células epiteliales corneales

La fig. 21 presenta el número de células en respuesta a la artemina. En los cultivos control, estaba presente un total de 200\pm98 células. Por contraste, la adición de 250 ng/ml de artemina aumentó significativamente el número total de células por placa (p < 0,001). Estos datos demuestran claramente que la artemina aumenta la proliferación de células epiteliales corneales in vitro.

Procedimientos Tejidos de córnea ex vivo

Se obtuvo el estroma y el epitelio corneales frescos ex vivo de 8 ojos sometidos a enucleación para melanomas coroideos tras el consentimiento informado y en conformidad con los principios de la Declaración de Helsinki. Inmediatamente después de la enucleación, se eliminaron todas las capas del epitelio corneal central y semiperiférico dentro de una zona de aproximadamente 8 mm por raspadura mecánica. Dentro de esta zona, se extirparon pequeñas muestras del estroma con una cuchilla de diamante. Las muestras de tejido se congelaron instantáneamente.

Cultivo de células

Se consiguieron córneas humanas guardadas por menos de 24 horas en Likorol® (Chauvin-Opsia, Ablege Cedex, Francia) a 4ºC a través del banco de ojos del Departamento de Oftalmología, Universidad de Heidelberg, Escuela de Medicina, Heidelberg, Alemania. Todas las córneas fueron de calidad para transplante pero excluidas del uso clínico por motivos no oculares según los criterios del banco de ojos internacional. Tanto las células epiteliales como estromales se pusieron en cultivo en placas de plástico como cultivos de excrecencia con una ligera modificación de la técnica que se describe por You y col. (1999). Para la extracción de ARN, se iniciaron cultivos de explantes y se pusieron en cultivo en medio SHEM [mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbeco y mezcla de nutrientes F10 de Ham con suero de ternera fetal (STF) al 10%, Gibco, Grant Island, NY, EEUU], 5 \mul de insulina y 10 ng/ml de EGF sin antibióticos (cfr. Arrak-Saki y col., 1995; Shimura y col., 1997). El fenotipo epitelial de los cultivos se confirmó por tinción con un anticuerpo específico para la citoqueratina K12. Puesto que este procedimiento produjo sólo una cantidad muy limitada de células, los autores usaron también una línea de células epiteliales corneales transformadas con el adenovirus SV 40 (que se describe en Arrak-Saki y col., 1995). Parecidas al epitelio corneal normal, estas células exhiben características de crecimiento clonal y exhiben un fenotipo epitelial corneal que incluye, por ejemplo, la expresión de la queratina K12. La línea celular se puso en cultivo en medio SHEM como se describe en Arrak-Saki y col. (1995) y en Shimura y col. (1997). Se pusieron los fibroblastos estromales en cultivo en DMEM + STF al 10% como se describe en You y col. (1999). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y con células que se obtuvieron de distintos donantes.

Aislamiento del ARN total y purificación del ARNm

El ARN total se aisló según el procedimiento de extracción con fenol-cloroformo tiocianato de guanidina

\break

(Chomczynsky y col., 1987) mediante el uso de un kit sistema de aislamiento de ARN total RNAgents® de Promega (Promega Co., Madison, WI, EEUU) como se describe en You y col. (1990). Para el aislamiento del ARNm se usó un sistema III polyATract® de Promega como se describe en You y col. 1990). Para minimizar el riesgo de contaminación por ADN genómico, se digirieron las muestras de ARNm con la ADNasa exenta de ARNasa seguido de extracción con fenol- cloroformo-alcohol isoamílico y precipitación con isopropanol. Cebadores para PCR y transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)

Para el diseño de los cebadores para PCR, se tomaron secuencias codificantes conocidas de GenBank. Debido a la alta similitud estructural de las secuencias de todos los miembros conocidos de las familias de los genes de las neurotrofinas y de la familia de los receptores tirosina quinasa para las neurotrofinas, todas las secuencias en el marco abierto de lectura se compararon mediante el uso de un programa de alineamiento de múltiples secuencias como se describe en You y col. (1999). Cuando fuera posible, se diseñaron cebadores para abarcar uno o más intrones de la secuencia genómica: NGF: sentido GAGGTGCATAGCGTAATGTCCA (SEC ID Nº 6), y antisentido TCCACAGTAATGTTGCGGGTCT (SEC ID Nº 7) (producto de 233 pb) (nº de entrada en GenBank: V 0511, X 52599); NT-3: sentido TTACAGGTGACCAAGGTGATG (SEC ID Nº 8), y antisentido GCAGCAGTGCGGTGTCCATTG (SEC ID Nº 9) (producto de 298 pb) (nº de entrada en GenBank: M 37763); NT-4: sentido, CTCTTTCTGTCTCCAGGTGCTCCG (SEC ID Nº 10), y antisentido CGTTATCAGCCTTGCAGCGGGTTTC (SEC ID Nº 11) (producto de 464 pb) (nº de entrada en GenBank: M 86528); BDNF: sentido GTGAGTTTGTGTGGACCCCGAG (SEC ID Nº 12) y antisentido CAGCAGAAAGAGAAGAGGAGGC (SEC ID Nº 13) (producto de 373 pb) (nº de entrada en GenBank: X 60201, X 91251); GDNF: sentido GCCCTTCGCGTTGAGCAGTGAC (SEC ID Nº 14) y antisentido CTCGTACGTTGTCTCAGCTGC (SEC ID Nº 15) (producto de 343 pb) (nº de entrada en GenBank: NM 000514); TrkA: sentido GATGCTGCGAGGCGGACGGC (SEC ID Nº 16) y antisentido CTGGCATTGGGCATGTGGGC (SEC ID Nº 17) (producto de 570 pb) (nº de entrada en GenBank: M 23102); TrkB: sentido TGCACCAACTATCACATTTCTCG (SEC ID Nº 18) y antisentido CACAGACGCAATCACTACCCA (SEC ID Nº 19) (producto de 472 pb) (nº de entrada en GenBank: S 76473); TrkC: sentido ACTTCGGAGCATTCAGCCCAGAG (SEC ID Nº 20) y antisentido ACTCGTCACATTCACCAGCGTCAA (SEC ID Nº 21) (producto de 484 pb) (nº de entrada en GenBank: S 76475, U 05012); TrkE: sentido AGGAGTACTTCAGGTGGATC (SEC ID Nº 22) y antisentido ACTGGAGAAGCTGTGGTTGCT (SEC ID Nº 23) (producto de 545 pb) (nº de entrada en GenBank: X 74979).

El ADNc de primera hebra se sintetizó como se describe en You y col. (1999). La PCR se llevó a cabo mediante el uso de 0,5 \mul de ADNc de hebra sencilla con 3 unidades de ADN polimerasa de Thermus Aquaticus} (Taq), una mezcla de desoxirribonucleótidos (a una concentración final de 0,2 mM), tampón de PCR 10 x (5 \mul) y 25 pmol de cebadores sentido y antisentido en un volumen total de 50 \mul (todos los reactivos fueron de Takara Shuzo Co., Ltd., Japón). La concentración final de MgCl_{2} en el tampón fue de 1,5 mM. Se usó un termociclador programable PTC-100 (MJ Research, Watertown, MA, EEUU) a 95ºC durante 3 min (desnaturalización previa). A continuación, se llevaron a cabo 35 ciclos que incluyeron la desnaturalización a 94ºC durante 1 min, el alineamiento a 55ºC durante 1 min y el alargamiento a 72ºC durante 1 min.

Los productos de PCR se fraccionaron por tamaños por electroforesis en geles de agarosa al 1,8%/TAE 1 x que se tiñeron con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio. Todos los fragmentos de PCR se clonaron en el vector pCR2.1 (Invitrogen Corp., San Diego, CA, EEUU) y se confirmaron las secuencias por procedimientos estándares.

Análisis de transferencia de manchas de ADN para la detección del nivel de transcripción génica de la córnea en cultivo

Para estimar el nivel de transcripción en las células estromales epiteliales de cultivo, se llevó a cabo un análisis de transferencia de manchas de ADN. Puesto que no fue posible poner en cultivo cantidades suficientes de células epiteliales corneales humanas, se usó una línea de células epiteliales corneales como fuente de epitelio corneal. Los fragmentos de PCR clonados que correspondían a genes de una familia de factores neurotróficos y de los receptores Trk se amplificaron mediante el uso de los cebadores arriba mencionados y se purificaron a partir de geles de agarosa. Se cargó 0,1 \mug de producto de PCR como una mancha en membranas de nailon. Para generar la sonda de alta dosificación, se aisló 1 \mug de ARNm a partir de células estromales y epiteliales de cultivo y se transcribió con una mezcla de síntesis de sondas con digoxigenina (de Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) para la síntesis de ADNc de primera hebra marcado con digoxigenina. A continuación se prehibridaron las transferencias de ADN y se hibridaron con la sonda de ADNc marcada con digoxigenina en tampón DIG EasyHyb (Boehringer Mannheim) a 40ºC durante la noche. Tras el lavado después de la hibridación, se trataron las transferencias con el kit de lavado DIG de Boehringer Mannheim según la descripción del fabricante y se expusieron a una película para ECL (Amersham Life Science, Little Chalfont, RU). A efectos de comparación, se usó un fragmento de ADNc que codifica la gliceraldehído-fosfato deshidrogenasa reducida (GAPDH) como control positivo.

Estudio de los componentes de las vías de transducción de la señal de las MAP quinasas inducidos por factores neurotróficos en la córnea de cultivo

Para evaluar el efecto del GDNF y de otros factores neurotróficos sobre la activación de las vías de transducción de la señal en el epitelio corneal y en los queratocitos estromales de cultivo, se llevaron a cabo transferencias de tipo Western para detectar una acumulación de las MAP quinasas fosforiladas ERK y JNK en presencia de GDNF, NGF y BDNF. Se pusieron queratocitos estromales humanos en cultivo en medio RPMI 1640 que contenía L-glutamina (glutaMAX) o DMEM con STF al 10% durante un día y se les privó de nutrientes en medio exento de suero durante otro día. A continuación se lavaron los cultivos con PBS y se incubaron en DMEM exento de suero sin aditivos o con GDNF humano recombinante (200 ng/ml), NGF humano recombinante (200 ng/ml) y BDNF humano recombinante (200 ng/ml) (que se consiguieron todos de R & D Systems, Minneapolis, MN, EEUU) durante 30 minutos. Algunos cultivos se incubaron con un inhibidor de las MAP quinasas (PD 98059, Torcris Cookson, Ballwin, MO, EEUU) a 100 \muM durante 1 h antes de ser expuestos a las neurotrofinas. Después de lavarlas con PBS, las células de los cultivos se solubilizaron en tampón de lisis que contenía Tris_{2}Cl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, azida sódica al 0,02%, 100 \mug/ml de PMSF, Triton X-100 al 1% y una mezcla de varios inhibidores de proteasas (Complete®, Boehringer Mannheim) (un comprimido/50 ml de tampón). Se fraccionaron 50 \mug de proteínas totales por carril mediante un gel STS-MOPS NUPAGE Bis-tris al 10% (NOVEX, San Diego, CA, EEUU) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Se tiñeron las membranas con anticuerpos policlonales diluidos contra ERK1, ERK2, JNK1 y JNK2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EEUU). Se usó también un anticuerpo policlonal que reconoce la forma desactivada de bien la ERK1 o bien la ERK2 que se crió contra el núcleo catalítico del residuo de treonina 183 y del residuo de tirosina 185 fosforilados de la ERK2 de mamíferos. Asimismo, se usó un anticuerpo policlonal que reconoce la forma fosforilada de la JNK1 y de la JNK2 (ambos de Promega). En la última etapa, se visualizaron las membranas con el sistema ECL (Amersham) de análisis de transferencias de tipo Western.

Estudio del efecto del GDNF sobre la proliferación de las células epiteliales y estromales corneales

Para evaluar el efecto del GDNF sobre la proliferación corneal, se usó GDNF humano recombinante (R & D, Minneapolis, MN, EEUU). Para la evaluación del efecto sobre la proliferación epitelial corneal, se utilizó un modelo de crecimiento clonal de una célula individual que permite determinar el efecto del factor de crecimiento determinado a la vez sobre la formación de colonias así como sobre la expansión clonal (Kruse y col., 1991). Se alojaron y se trataron conejos blancos New Zealand según la Resolución AVRO de Animales en Investigación y en cumplimiento de las leyes federales alemanas y de las leyes del estado de Baden-Württemberg. Antes de sacrificarlos con una sobredosis de pentobarbital por vía intravenosa, recibieron una inyección intramuscular de clorhidrato de xilazina y clorhidrato de ketamina. Los detalles del ensayo de crecimiento clonal se describen en Kruse y col. (1991). Se sembraron 5000 células viables en cada placa de 16 mm en medio MCDB 151 exento de suero con un complemento (C) de insulina (5 \mug/ml), transferrina (5 \mug/ml), selenio (5 ng/ml) e hidrocortisona (5 \mug/ml) (todos de Sigma, Deisenhofen, Alemania). Esta densidad de siembra tuvo como resultado un crecimiento clonal a partir de una célula individual que se pudo cuantificar bajo el microscopio de contraste de fases (el día 6) por determinación del número de colonias por placa así como por el número de células por colonia. Esta cuantificación fue facilitada por el uso de placas que contenían una rejilla en el fondo que tiene una anchura de aproximadamente 2 mm (de Sarstedt, Newton, NC, EEUU). Para la recogida de datos, se cribó la superficie entera de cuatro placas escogidas al azar para cada condición. Además, se determinó el número de células por colonia en 75 colonias escogidas al azar para cada condición. Además, se calculó en número total de células/placa para llevar a cabo una evaluación para la artemina. Para estimular la proliferación celular, se añadió GDNF (50 ó 200 ng/ml) o artemina (250 ng/ml) al medio. Para estimar la tasa de proliferación al cabo de 12 días (un momento en el que las colonias vecinas empezaban a crecer la una dentro de la otra y, por lo tanto, impedían la cuantificación numérica) se fijaron las placas en metanol a -20ºC y se tiñeron con azul de metileno.

Para estudiar el efecto del GDNF sobre la proliferación de queratocitos estromales de cultivo, se pasaron las células de DMEM + STF al 10% a DMEM + STF al 1% o a DMEM sin STF a una densidad de 5 x 10^{4} células/placa de 60 mm. Algunos cultivos recibieron GDNF humano recombinante a las concentraciones arriba mencionadas. La proliferación se midió al cabo de 6 días por recuento de las células bajo el microscopio de contraste de fases (50 campos a un aumento de 100 x por condición) así como de células sometidas a tratamiento con tripsina. También se llevó a cabo un ensayo de proliferación Cell Titer 96 AQueous One Solution (Promega) según la descripción del fabricante. Para este ensayo colorimétrico, se hicieron crecer 500 o 1000 células durante 8 días en placas de 96 pocillos (Falcon). Tras su adición a los pocillos de cultivo, un tinte de tetrazolio está reducido biológicamente por las células en un producto formazan coloreado y se mide la absorbancia a 490 nm. La cantidad de producto formazan es proporcional al número de células vivas en el pocillo y por lo tanto puede servir para estimar la proliferación.

Estudio de las vías de transducción de la señal inducidas por el GDNF y la artemina en las células epiteliales corneales

Para averiguar qué cascadas de proteína quinasas están activadas por el GDNF y la artemina, se sembraron células epiteliales corneales de la línea celular a una densidad de 5 x 10^{5} células/75 cm^{2} y se pusieron en cultivo durante un día en SHEM con STF al 10%. A continuación se lavaron los cultivos con PBS y se incubaron en SHEM exento de suero sin aditivos o con GDNF (200 ng/ml) o con artemina (250 ng) durante 10 a 40 minutos. Después de lavarlas con PBS, las células de los cultivos se solubilizaron en tampón de lisis que contenía Tris_{2}Cl 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, azida sódica al 0,02%, 100 \mug/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, Na_{3}VO_{4} 1 mM, Triton X-100 al 1% y una mezcla de varios inhibidores de proteasas [Complete^{TM}, Boehringer Mannheim (1 comprimido/30 ml de tampón)]. Se fraccionaron 80 \mug de proteínas totales por carril en un gel NuPAGE SDS-MOPS-Bis-Tris al 10% o un gel NuPAGE Tris-acetato al 3-8% (todos de NOVEX, San Diego, CA) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas fosforiladas se detectaron con anticuerpos fosfo-específicos y se visualizaron con el sistema ECL (Amersham) de análisis de transferencias de tipo Western. Los anticuerpos contra fosfoRaf (ser259), fosfoMEK1/2 (ser217/221), fosfoMAPK (Erk1/2) (thr202/tyr204), fosfo-p90 quinasa ribosómica S6 (RSK) (ser381) y fosfoElk-1 (ser383) se consiguieron de New England Biolabs (Beverly, MA). Los anticuerpos contra fosfoFAK (tyr397/tyr407/tyr576/tyr577/tyr861/tyr925) y fosfoPyk2 (tyr402/tyr579/tyr/580/tyr881) se compraron a Biosource (Camarillo, CA, EEUU). Un anticuerpo monoclonal contra fosfotirosina procedió de Sigma (Deisenhofen, Alemania).

La inmunoprecipitación se llevó a cabo para detectar la fosforilación de las tirosinas de Ret y de la paxilina. En resumen, se incubó 1 ml de producto de la lisis de 5 x 10^{5} células (en cultivo en distintas condiciones de cultivo) con 40 \mul de proteína-G-agarosa (Boehringer Mannheim) durante 2 horas seguido de una breve centrifugación a 12000 rpm. El sobrenadante se incubó con 40 \mul de proteína-G-agarosa y 10 \mug de anticuerpo policlonal contra Ret (Santa Cruz) o paxilina (Sigma) durante la noche con agitación. Luego se recogió el complejo de proteína G-agarosa por breve centrifugación y se lavó dos veces en tampón de lisis. El sedimento de proteínas unidas se eluyó en tampón de carga para gel con SDS por ebullición y se separaron las proteínas por electroforesis en gel de NuPage y transferencia a una membrana de nailon seguida de la visualización como se describió anteriormente.

Ensayo de curación de heridas in vitro y análisis en cámara de Boyden modificada

En experimentos adicionales, se estudió el efecto del GDNF sobre la migración de células epiteliales corneales y la curación de heridas en un modelo de curación de heridas in vitro así como en un ensayo en cámara de Boyden modificada.

Para los ensayos de curación de heridas in vitro se sembraron células epiteliales corneales primarias y células de la línea de células epiteliales corneales a una densidad de 5 x 10^{5} en placas de plástico de 60 mm con una rejilla de 2 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) y se pusieron en cultivo durante 2 días hasta que alcanzaran subconfluencia. Para los experimentos con artemina se usaron células epiteliales corneales de conejo de cultivo primario. Estas células se habían aislado con dispasa (1,2 U/ml) y tripsina/EDTA. Las células de conejo se habían puesto en cultivo en medio 500 con aditivos (Cascade Biologies).

La capa de células se dañó bajo el microscopio al producir varios rasguños paralelos con un raspador de células de plástico blando (Falcon, Becton and Dickinson, Heidelberg, Alemania). La punta del raspador se cortó y midió aproximadamente 1 mm y por consiguiente la anchura de los rasguños en la capa de células fue también de aproximadamente 1 mm. Se marcaron zonas escogidas en las placas con un rotulador muy fino y se tomaron imágenes sucesivas a distintos tiempos a aumento 5 x bajo un microscopio de contraste de fases invertido (Axiovert 25, Zeiss, Jena, Alemania) provisto de una cámara de vídeo. Después de la lesión experimental, se incubaron las placas en medio SHEM que contenía o bien ningún factor de crecimiento (control) o bien que contenía bien GDNF (250 ng/ml) (GDNF humano recombinante expresado en E. coli}), NGF (250 ng/ml) (Boehringer Mannheim, Alemania) o EGF (10 mg/ml). Para los experimentos en los que se estudiaba la artemina, se pusieron las células en cultivo en medio 500 sin aditivos y se añadió 250 ng de artemina. Para cada condición, se evaluaron cuatro zonas representativas dentro de tres placas. Se fijó como 100% el diámetro medio del rasguño en cada zona representativa al principio del experimento. Al cabo de 18 horas se volvió a calcular el diámetro medio del mismo rasguño y se expresó en tanto por ciento del diámetro al principio del experimento.

Para determinar qué vías de transducción de la señal están mediando el efecto del GDNF sobre la migración epitelial corneal en este modelo, se usó el inhibidor de tirosina quinasas herbimicina A como se describió anteriormente.

Para evaluar más allá el efecto quimiotáctico del GDNF sobre las células epiteliales corneales, se usó un ensayo en cámara de Boyden modificada. Se sembraron 4 x 10^{5} células bien de las células en cultivo primario o bien de la línea de células epiteliales corneales en insertos de cultivo de tejido que contenían un filtro de politereftalato de etilenglicol (PET) que tenía un tamaño de poro de 8 \mum (Falcon). Dentro de las 4 horas después de la siembra, la mayoría de las células se habían unido al filtro y formado una monocapa semiconfluente. A continuación se cambió el medio por SHEM sin aditivos en el pocillo superior y SHEM con GDNF (250 ng/ml) en el pocillo inferior. Al cabo de 24 h de cultivo se recogieron las células de la superficie del inserto al cepillarlas suavemente con un raspador de goma. Las células en el fondo del inserto (que habían migrado a través del filtro) se fijaron con metanol a -20ºC y se tiñeron con cristal violeta. Se cribó la superficie entera de los filtros para células bajo el microscopio.

Análisis estadístico

Todos los experimentos en los que se estudió el efecto del GDNF sobre la proliferación corneal se realizaron por triplicado con células de distintos donantes. Se estudió la influencia del factor de crecimiento sobre la formación de colonias, el tamaño de las colonias y el número de células por análisis de la varianza unidireccional. Se usó la transformación logarítmica cuando fuera necesario para producir la homogeneidad de las varianzas y la normalidad en estos datos. Se empleó la prueba t de Student para determinar qué diferencias eran significativas después del análisis de la varianza.

Paciente

Edad 45 años. Úlcera corneal acompañada de inflamación masiva del lado izquierdo. Defecto epitelial de tamaño 3,8 x 3,0 mm, además de úlcera del estroma corneal en forma de una laguna perforada que comprende 80% del espesor de la córnea. Ninguna sensación de dolor de la córnea e inflamación asociada significativa del ojo.

Terapia

Se trató el paciente con GDNF humano recombinante (rh) (0,2 mg/ml) (25 \mul/dosis) a intervalos de 2 horas durante 48 horas, luego se redujeron las dosis hasta 20 \mul, 6 veces al día. Tras la curación del epitelio, se redujo la concentración a 0,1 mg/ml, y se dieron dosis de 20 \mul, 5 veces al día. Para la administración, se diluyó el GDNF humano recombinante liofilizado en solución salina equilibrada estéril (Alcon, Freiburg, Alemania).

Bibliografía

Arraki-Sasaki y col. (1995) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 614- 621.

Chomczynski y col. (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159.

Kruse y col. (1991) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2086-2095.

Lambiase y col. (1998) N. Engel. J. Mit. 33, 1174-1180.

Shimmura y col. (1997) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 620-626.

You y col. (1999) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 296-311.

Claims

1. Uso de un factor de crecimiento derivado de una línea de células gliales (GDNF) o de un derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o un agonista que sustituye la actividad funcional del GDNF, y/o un ácido nucleico que contiene por lo menos una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia primaria de aminoácidos del GDNF o del derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o del agonista para la fabricación de una composición farmacéutica para la curación de heridas de la epidermis y del estroma y/o para el tratamiento de trastornos de la curación y/o trastornos de la cicatrización de heridas de la epidermis y del estroma.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica comprende el GDNF humano recombinante o un derivado o parte funcionalmente activa del mismo.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que contiene por lo menos la secuencia nucleotídica que codifica el GDNF humano de tipo silvestre.

4. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la composición farmacéutica contiene como mínimo un agente adicional que tenga un efecto trófico sobre las células epiteliales y/o neuronales.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que el agente se selecciona entre el grupo que está formado por TGF-\beta, BMPs, GDFs, activina/inhibina, neurotrofinas, EGF, HB-EGF, TGF-\alpha, FGF, KGF, HGF, IGF, PDGF, fibronectina y metabolitos de los mismos.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composición farmacéutica contiene por lo menos un agente adicional que tenga un efecto antiinflamatorio.

7. El uso según la reivindicación 6, en el que el agente antiinflamatorio se selecciona entre el grupo que está formado por análogos de la cortisona, inhibidores de la vía del NF-\kappaB, inhibidores de la vía del ácido araquidónico y anticuerpos contra las quimioquinas.

8. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la composición farmacéutica comprende células que producen el GDNF o el derivado o parte funcionalmente activa del mismo y/o el agonista del mismo.

9. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la herida se encuentra en el ojo anterior de un mamífero.

10. El uso de la reivindicación 9, en el que la herida se encuentra en el epitelio, el estroma y/o el endotelio corneal.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que la herida corneal es una úlcera corneal.

12. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la herida y/o el trastorno de la curación de heridas está provocado por enfermedades infecciosas, trastornos de la humidificación, enfermedades inmunológicas localizadas o generalizadas, trastornos dérmicos asociados, manifestación ocular de enfermedad sistémica, lesiones físicas, distrofias y degeneraciones y/o intervenciones quirúrgicas de la córnea.

13. El uso según la reivindicación 12, en el que la herida o el trastorno de la curación de heridas está provocado por infección bacteriana, infección vírica, infección micótica, queratoconjuntivitis, penfigoide, síndrome de Stevens- Johnson, queratitis rosácea, ictiosis, diabetes, reuma articular, enfermedad de Crohn, enfermedad de Wegener, lupus eritematoso, esclerodermia, degeneración de Terrien, degeneración de Salzman, distrofia de Fuchs y/o intervención quirúrgica por láser.

14. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la composición farmacéutica contiene además un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que el vehículo es el ácido hialurónico o una lente de contacto o una protección.

16. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la composición farmacéutica se aplica por vía oral, tópica, intravenosa y/o parenteral.

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17. El uso de la reivindicación 16, en el que la composición farmacéutica para aplicación tópica está formulada como un colirio, una formulación en gel, un ungüento o una solución para inyección ocular.