JP2003512433A - 角膜欠陥を処置するためのｇｄｎｆの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、表皮および間質創傷治癒用の薬学的組成物の製造のための、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）またはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および／またはＧＤＮＦの機能活性の代わりをするアゴニスト、ならびに／あるいはＧＤＮＦまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および／または該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、表皮および間質創傷治癒用の薬学的組成物の製造のための、グリア
細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）またはその機能的に活性な誘導体もしくは部分
および／またはＧＤＮＦの機能活性を代替するアゴニスト、ならびに／あるいは
ＧＤＮＦまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および／または該アゴニ
ストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸の
使用に関する。

【０００２】 現在まで、角膜創傷治癒障害、特に角膜上皮の創傷治癒障害は、ある患者にお
いて処置可能でない。このような患者は、大抵、以下のような付随障害（accomp
anying disorders）に罹患している：神経栄養性眼疾患（例えば、損なわれた神
経供給（impaired nerve supply）の種々の形態）、感染性疾患（ウイルス疾患
、細菌疾患、真菌疾患、クラミジア疾患）、局所または全身免疫疾患（例えば、
アレルギー性、春化（vernal）、アトピー性角結膜炎）、リウマチ様眼疾患の種
々の形態（例えば、慢性関節リウマチのコンテクストにおいて、ヴェグナー病（
Ｍｏｒｂｕｓ Ｗｅｇｎｅｒ）、エリテマトーデス（Lupus Erythematodes）、強
皮症）、スティーヴェンズ−ジョンゾン症候群、関連皮膚疾患によって引き起こ
される疾患（例えば、酒さ（rosazea）、魚鱗癬）、湿潤障害（moistening diso
rders）（ドライアイの種々の形態）、眼瞼および睫毛の機能障害（impaired fu
nction）、および全身性疾患（例えば、糖尿病、痛風、クローン病（Ｍ．Ｃｒｏ
ｈｎ））、変性疾患の種々の形態（老人の、辺縁の（marginal）、透明の（pell
ucid）、テリエン（Terrien’s）、ザルツマン変性（Salzman’s degeneration
））、ジストロフィー性疾患（フックスジストロフィー（Fuchs’ dystrophy）
を含む、角膜の全３層の角膜ジストロフィー）ならびに隣接組織（結膜、強膜）
の種々の炎症。角膜創傷治癒障害についてのさらなる理由は、有機および無機材
料のための擦過傷、切断、裂傷のような眼表面への物理的傷害の全種類、さらに
固体、液体および気体材料によって誘導される化学的傷害ならびに火傷であり得
る。さらに、創傷治癒障害は、屈折矯正および治療レーザー手術の全スペクトル
（すなわち、エキシマー、赤外線およびＮｄ：Ｙａｇ）を含む医学および美容的
介入（intervention）ならびに屈折矯正および慣用医学手術（放射状角膜切開術
、ＬＡＳＩＫ、全層角膜移植のラメラのコンテクストにおける穿孔術）のコンテ
ストにおける機械的および非機械的切開によって誘導され得る。

【０００３】 このような疾患のために、現在、利用可能な保存療法はなく、従って、頻繁に
、角膜の複雑かつ侵襲的な（invasive）移植を行わねばならない。同一の問題が
、角膜剥離へと導く物理的傷害に当てはまる。

【０００４】 Lambiaseら（1998）によって行われた最初の研究は、マウスの顎下腺から単離
された神経成長因子（ＮＧＦ）が神経栄養性角膜潰瘍の保存療法に適しているか
もしれないことを示すようである。しかし、マウスＮＧＦは、非常に高用量で使
用されねばならず、複雑かつ非常に高価なプロセスによって単離されなければな
らずそして非ヒトタンパク質を示す。

【０００５】 従って、特に前方眼（anterior eye）における、創傷の治癒ならびに上皮およ
び間質組織の創傷治癒障害の処置のための保存療法のための新規のアプローチに
対する大きな要求が存在する。

【０００６】 従って、本発明の基礎をなす技術的課題は、特に前方眼における、上皮および
間質創傷の治癒障害の治癒ならびに処置のための新規なシステムを提供すること
にある。

【０００７】 上記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられるような実
施形態を提供することによって達成される。

【０００８】 特に、本発明は、表皮および間質創傷治癒用ならびに／あるいは表皮および間
質創傷治癒障害および／または瘢痕（scarring）障害の処置用の薬学的組成物の
製造のための、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）またはその機能的に活性
な誘導体もしくは部分および／またはＧＤＮＦの機能活性を代替するアゴニスト
、ならびに／あるいはＧＤＮＦまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分お
よび／または該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
少なくとも含む核酸の使用に関する。

【０００９】 用語“グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）”は、ＧＤＮＦ、ニュールツリ
ン（neurturin）、ペルセフィン（persephin）、アルテミン（artemin）（エノ
ヴィン（enovin）またはノイブラスチン（neublastin）とも称される）および角
膜欠陥（corneal defects）を治癒し得る全てのタンパク質を指し、そしてその
アミノ酸配列は、少なくとも保存された７システイン領域（conserved seven cy
teine region）を含み、そしてヒトＧＤＮＦ（配列番号１）の保存された７シス
テイン領域のアミノ酸配列と６０％を超える同一性（identity）を共有する。本
発明の１つの実施形態によれば、用語“ＧＤＮＦ”は、図１において示されるジ
ェネリック（generic）アミノ酸配列（配列番号２）を少なくとも含むタンパク
質を含み、これは、ＧＤＮＦ（配列番号１）、ニュールツリン（配列番号３）、
ペルセフィン（配列番号４）およびアルテミン（配列番号５）の保存化７システ
イン領域から誘導され、そして角膜欠陥を治癒し得る。配列番号２において、Ｘ
は、任意のアミノ酸を意味し、そしてＹは、任意のアミノ酸または削除されたア
ミノ酸を意味する。用語“機能的に活性な誘導体”および“機能的に活性な部分
”は、ＧＤＮＦの生物学的機能の少なくとも一部を示すタンパク質性化合物をい
い、そして成熟ＧＤＮＦに加えてアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、ｐ
ｒｏＧＤＮＦおよびｐｒｅｐｒｏＧＤＮＦ）、成熟ＧＤＮＦ自体ならびに野生型
ＧＤＮＦポリペプチドの突然変異体を含む。本明細書中で使用される用語“突然
変異体”は、野生型ＧＤＮＦ一次アミノ酸配列（例えば、ヒト野生型ＧＤＮＦ配
列）における１以上のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換によって得られ
るポリペプチドを含む。さらに、用語“ＧＤＮＦ”は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
アクセッション番号Ｌ１９０６３、Ｌ１５３０６に従うヒト野生型ＧＤＮＦのア
ミノ酸配列を有する組換えヒトＧＤＮＦのような、組換えで作製されるポリペプ
チドを含む。

【００１０】 本明細書中で使用される用語“アゴニスト”は、ＧＤＮＦあるいはその機能的
に活性な誘導体または部分の機能活性を代替し得るタンパク質性または非タンパ
ク質性化合物を意味する。このようなアゴニストは、例えば、同一のレセプター
（例えば、それぞれ、ｒｅｔチロシンキナーゼレセプターおよびＧＤＮＦファミ
リーレセプターアルファ１〜４（ＧＦＲアルファ１〜４））へ結合することによ
って、および／またはこれらのレセプターの上流および／または下流の同一のト
ランスダクション経路に影響を与えることによって、ＧＤＮＦの生物学的効果を
示し得る。

【００１１】 ＧＤＮＦまたはそのアゴニストあるいはその機能的に活性な誘導体または部分
の機能的に活性な形態は、モノマー性形態またはマルチホモ−もしくはヘテロマ
ルチマー形態（例えば、二量体、三量体または他のオリゴマー性形態）であり得
る。

【００１２】 用語“核酸”は、天然のまたは半合成の（semi-synthetic）または合成のまた
は修飾された核酸分子を意味し、これは、デオキシリボヌクレオチドおよび／ま
たはリボヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチドから構成され得る
。上記で定義される核酸は、上記で定義されるＧＤＮＦポリヌクレオチドあるい
はその機能的に活性な誘導体（例えば、突然変異体）または部分並びに／あるい
はその上記で定義されるタンパク質性アゴニストの一次アミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を少なくとも含む。本発明に従う核酸の例は、野生型ヒトＧ
ＤＮＦをコードするＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ ０００５１４に従
うヌクレオチド配列を含む。本発明に従うヌクレオチド配列はまた、野生型配列
と比較して１以上のヌクレオチドの挿入、欠失および／または置換から得られる
突然変異配列であり得る。

【００１３】 本発明に従う薬学的組成物はまた、遺伝子治療または細胞治療剤として使用さ
れ得る。従って、本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的組成物は、例えば
、上記で定義される核酸によって形質転換され、ＧＤＮＦまたはその機能的に活
性な誘導体もしくは部分および／またはそのアゴニストを産生する、細胞を含む
。

【００１４】 好ましくは、上記で定義される薬学的組成物は、上皮および／または神経細胞
に対して栄養効果を有するさらなる薬剤を少なくとも１つ含有する。このような
薬剤は、好ましくは、サイトカイン［例えばＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β１
、−β２および−β３）、ＢＭＰ、ＧＤＦ］およびＴｒｋＡ、ＴｒｋＢおよびＴ
ｒｋＣレセプターへ結合し得るサイトカイン［例えば、ニューロトロフィン（例
えば、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＢＤＮＦ、ＣＤＮＦ）］、ｒｅｔおよ
びＧＦＲアルファ１−４のリガンド、ＥＧＦ−レセプターのリガンド（ＥＧＦ、
ヘパリン−結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ＴＧＦ−α）、線維芽細胞
成長因子ファミリーの種々のメンバー（ＦＧＦ１〜５）、ケラチノサイト成長因
子（ＫＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板由来成長因子の種々のアイソ
フォーム（isoforms）（ＰＤＧＦ Ａ、Ｂ、ＡＢ）ならびにインシュリン成長因
子のアイソフォーム（ＩＧＦ−Ｉ、II）である。また、ＧＤＮＦと組合せて上皮
および／または神経細胞に対して栄養効果を有するさらなる薬剤は、その全部と
してまたは部分として、好ましくはフィブロネクチンまたはその代謝物と組合せ
て使用され得るヒト血清の１以上であり得る。さらに、ＧＤＮＦは、任意の種類
の抗炎症剤（例えば、コルチゾンおよびそのアナログのようなステロイド、アラ
キドン酸経路またはＮＦ−κＢシグナル伝達経路のインヒビターのような非ステ
ロイド剤、ならびにケモカインに対する抗体）と組合せて使用され得る。このよ
うなさらなる薬剤は、ＧＤＮＦ、上記に定義されるようなアゴニストおよび／ま
たは核酸と組合せて、相加的および／または相乗的効果を示し得る。

【００１５】 本発明に従う使用のさらに好ましい実施形態によれば、治療されるか、または
創傷治癒障害のために通常の治療から妨げられる創傷は、哺乳動物の前方眼（an
terior eye）に局在される。より好ましくは、上記で定義される薬学的組成物は
、角膜上皮、間質および内皮創傷治癒および瘢痕（scarring）のためおよび／ま
たは角膜上皮、間質および内皮創傷治癒および瘢痕の処置のために使用される。
角膜創傷の特に好ましい例は、角膜潰瘍である。

【００１６】 さらなる例として、上記に定義される創傷および／または創傷治癒障害は、以
下のような障害によって引き起こされる：神経栄養性眼疾患（例えば、損なわれ
た神経供給（impaired nerve supply）の種々の形態）、感染性疾患（ウイルス
疾患、細菌疾患、真菌疾患、クラミジア疾患）局所または全身免疫疾患（例えば
、アレルギー性、春化（vernal）、アトピー性角結膜炎）、リウマチ様眼疾患の
種々の形態（例えば、慢性関節リウマチのコンテクストにおいて、ヴェグナー病
（Ｍｏｒｂｕｓ Ｗｅｇｎｅｒ）、エリテマトーデス（Lupus Erythematodes）、
強皮症）、スティーヴェンズ−ジョンゾン症候群、関連皮膚疾患によって引き起
こされる疾患（例えば、酒さ（rosazea）、魚鱗癬）、湿潤障害（moistening di
sorders）（ドライアイの種々の形態）、眼瞼および睫毛の機能障害（impaired
function）、および全身性疾患（例えば、糖尿病、痛風、クローン病（Ｍ．Ｃｒ
ｏｈｎ））、変性性疾患の種々の形態（老人の、辺縁の（marginal）、透明の（
pellucid）、テリエン（Terrien’s）、ザルツマン変性（Salzman’s degenerat
ion））、ジストロフィー性疾患（フックスジストロフィー（Fuchs’ dystrophy
）を含む、角膜の全３層の角膜ジストロフィー）ならびに隣接組織（結膜、強膜
）の種々の炎症。上記で明確にされるように角膜創傷治癒障害についてのさらな
る理由は、有機および無機材料のための擦過傷、切断、裂傷のような眼表面への
物理的傷害の全種類、さらに固体、液体および気体材料によって誘導される化学
的傷害ならびに火傷であり得る。さらに、創傷治癒障害は、屈折矯正および治療
レーザー手術の全スペクトル（すなわち、エキシマー、赤外線およびＮｄ：Ｙａ
ｇ）を含む医学および美容的介入（intervention）ならびに屈折矯正および慣用
医学手術（放射状角膜切開術、ＬＡＳＩＫ、全層角膜移植のラメラのコンテクス
トにおける穿孔術）のコンテストにおける機械的および非機械的切開によって誘
導され得る。

【００１７】 好ましくは、上記に定義される薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容される
担体および／または希釈剤を含み、そして好ましくは経口、局所、静脈内および
／または非経口で適用され得る。従って、本発明に従う薬学的組成物中に使用さ
れ得る担体および／または希釈剤は、投与経路に依存し、これはまた、最終製剤
（例えば、軟膏、点眼剤、ゲル製剤または眼注射用溶液）に影響を与える。

【００１８】 本発明に従う薬学的組成物は、典型的に、薬学的有効量の、ＧＤＮＦまたはそ
の機能的に活性な誘導体もしくは部分および／またはＧＤＮＦの機能活性を代替
するアゴニスト、ならびに／あるいはＧＤＮＦおよび／またはアゴニストの一次
アミノ酸配列をコードする上記に定義される核酸を、１以上の薬学的および生理
学的に許容可能な処方材料（例えば、担体および／または希釈剤）と組合せて含
む。さらなる製剤成分としては、抗酸化剤、保存剤、着色剤、矯味矯臭剤および
乳化剤、懸濁剤、溶媒、フィラー（fillers）、バルキング剤（bulking agents
）、緩衝液、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げら
れる。例えば、好適な担体またはビヒクルは、注射用水、生理食塩水、または好
適な担体タンパク質（例えば、血清アルブミン）と混合された生理食塩水であり
得る。

【００１９】 薬学的組成物の溶媒または希釈剤は、水性または非水性のいずれかであり得、
そして製剤のｐＨ、容量オスモル濃度（osmolarity）、粘度、透明性、スケール
、無菌性、安定性、溶解速度または臭いを調節および／または維持し得る他の薬
学的に許容される賦形剤を含み得る。同様に、他の成分が、薬学的に有効な物質
（例えば、ＧＤＮＦタンパク質産物）の放出速度を調節および／または維持する
ためにあるいは上皮および／または間質細胞を通るその吸収または浸透を促進す
るために、本発明に従う薬学的組成物中に含まれ得る。このような調節成分は、
ユニットまたは複数用量のいずれかの形態での非経口投与のための薬用量（dosa
ges）を処方するために当該分野において通常使用される物質である。

【００２０】 本発明に従う最終的に処方された薬学的組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマ
ルジョン、固体または脱水化もしくは凍結乾燥化粉末の形態で、無菌バイアル中
に保存され得る。これらの製剤は、使用準備のできている（ready-to-use）形態
または投与前に再構成が必要とされる形態（例えば、凍結乾燥粉末の場合）のい
ずれかで、保存され得る。

【００２１】 上記のおよびさらなる好適な薬学的製剤は、当該分野で公知であり、そして、
例えば、Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18^th Ed., Mack Publishi
ng Co., Eastern, PA, 1990, 1425-1712) に記載される。このような製剤は、薬
学的に有効な成分（例えば、上記で定義されるような、ＧＤＮＦタンパク質、ア
ゴニストおよび／または核酸）の、物理的状態（physical）、安定性、インビボ
放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。

【００２２】 他の有効な投与形態は、非経口徐放性（すなわち、遅延化された）製剤、吸入
ミスト、または経口活性製剤を含む。例えば、徐放性製剤は、ＧＤＮＦあるいは
その機能的に活性な誘導体または部分を含み得、これは、ポリマー性化合物（例
えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒状調製物またはリポソーム中へ結
合されるかまたは組み込まれ得る。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、
ヒアルロン酸が、薬学的に活性な成分（例えば、ＧＤＮＦ）のための担体として
使用され得、これは、循環において持続時間の促進効果を有し得る。本発明に従
う薬学的組成物はまた、例えば眼注入（ocular infusion）または注射による非
経口投与のために処方され得、そしてまた、徐放性（slow-release）または持続
化（sustained）循環製剤を含み得る。このような非経口投与される治療組成物
は、典型的に、薬学的に許容される担体および／または希釈剤中の薬学的に有効
な成分（単数または複数）（例えば、ＧＤＮＦ）を含む発熱物質無しの非経口的
に許容される水溶液の形態である。

【００２３】 本発明に従う薬学的組成物の好ましい製剤は、眼科用液剤、懸濁液、軟膏およ
びゲル製剤を含む、典型的な眼科用製剤を含む。他の投与経路は、例えば、眼房
内部（interior chamber）へ直接または眼の悪い房（vicious chamber）中へ直
接なされ得る眼房内注射（intracameral injections）、結膜下（subconjunctiv
al）注射および眼球後（retrobulbal）注射である。

【００２４】 好ましくは、本発明に従う薬学的組成物は、眼表面および眼球と眼瞼（eye li
d）との間の（外部）空間へ、すなわち眼球外投与（extra-ocular administrati
on）によって、投与され得る。眼球外領域の好ましい例としては、眼瞼円蓋また
は盲嚢（cul-de-sac）、結膜表面および、より好ましくは、角膜表面が挙げられ
る。この位置は、全ての眼組織に対して外でありそして、従って、侵襲的な（in
vasive）手技が、これらの領域へアクセスすることを必要としない。眼球外投与
の好ましい例としては、挿入物（inserts）ならびに典型的には、眼球外領域へ
治療材料を送達するために使用され得る適用される点眼剤、ゲル製剤または軟膏
が挙げられる。適用の他の可能な形態は、無機および／または有機材料から作製
された徐放性および／またはコンタクトシールド（contact shields）（例えば
、例えばコラーゲンから作製される生分解性シールド）、コンタクトレンズなら
びに人工および天然表面支持体（例えば、コラーゲンまたはプラスチックのよう
な人工材料の種々の形態から構成される羊膜の膜またはマトリックス（matrices
））である。このような眼球外デバイスは、一般的に、患者自身によってさえ容
易に除去される。

【００２５】 眼の前方部分における創傷治癒（例えば、角膜創傷）のための薬学的組成物に
特に好ましい製剤は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レンコポリマー、ポリサッカリド、タンパク質、ポリ（エチレンオキシド）、ア
クリルアミドポリマーおよびその誘導体または塩からなる群から選択され得るポ
リマーを含むポリマー性ゲル製剤である。このようなゲル製剤は、例えば米国特
許5,705,485に記載される。水溶性の薬学的または眼科的に適合性のポリマー性
材料を含むゲル製剤は、適用によって決定される種々の範囲内の薬学的組成物の
粘度に有利に影響し、何故ならば、製剤は、創傷部位への薬学的に活性な成分の
放出および増加した接触時間を制御し得るからである。ポリマー性材料を含有す
るゲル製剤の特に好ましい例は、ヒアルロン酸ゲル製剤である。ヒアルロン酸（
ＨＡ）は、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の二糖単位の繰り返し
からなる直鎖構造を有するムコ多糖類の１つである。ＨＡは、天然、微生物にお
いてそして皮膚におけるヒトおよび動物の結合組織中において見られる。ＨＡの
分子量は、供給源（source）、調製および測定法に依存して、５０，０００〜８
，０００，０００の範囲内にある。ＨＡの粘性溶液は、潤滑（lubricating）特
性および優れた湿潤化（moisturizing）効果を有する。それは、関節の滑液、眼
球のガラス体、臍帯、皮膚、血管および軟骨において見られる。ＨＡは、潤滑剤
および衝撃吸収剤として顕著に十分に機能し、そしてこれは、恐らく、その水保
持（water-retaining）能力およびある特定のタンパク質の連結するその親和性
に起因する。それは、人体内での内用のために非常に安全な分子であると考えら
れる。従って、それは、創傷治癒および創傷治癒障害（例えば、前方眼における
創傷）の処置のための、本発明に従う薬学的組成物において使用され得る。さら
に、ＨＡの優れた潤滑特性および湿潤効果は、本発明に従う薬学的組成物のため
に非常に有利であり、これは、例えば、ドライアイの異なる形態によって引き起
こされる創傷治癒障害の処置のために使用され得る。好ましくは、ヒアルロン酸
は、薬学的組成物の総重量に基づいて、０．５〜５．０重量％の濃度で存在する
。このような濃度範囲は、好ましくは１〜１，０００ｍＰａ・ｓの範囲にある粘
度を有する点眼剤として使用され得る低粘性溶液の製剤のために、そして他の形
態の適用（例えば、ソーキング包帯（soaking bandages））（ここで、粘度は好
ましくは１．０〜５，０００ｍＰａ・ｓの範囲にある）のために、好適である。

【００２６】 本発明に従う薬学的組成物の好ましい実施形態によれば、薬学的に有効な成分
（例えば、ＧＤＮＦ、好ましくは組換えヒトＧＤＮＦ）は、例えば液体製剤（例
えば、ゲル製剤または水に基づく製剤の場合、０．０１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲の
濃度で存在し得る。

【００２７】 本発明に従う薬学的組成物は、例えば液体製剤（例えば、ゲル製剤または局所
投与用の水に基づく製剤（例えば、点眼剤））の場合、５〜１００μｌの範囲の
用量で適用され得、そして１日当たり１回〜２４回投与され得る。

【００２８】 本発明は、以下の非制限的な実施例によってさらに例示される。

【００２９】 実施例 ヒト角膜におけるＧＤＮＦの転写 ＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子の転写は、ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト角膜
上皮（図２Ａ）および間質（図２Ｂ）から新たに収穫された細胞において検出さ
れた。図２Ａにおいて、代表的なＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＮＧＦ（レーン１、２
３３ｂｐ）、ＮＴ−３（レーン２、２９８ｂｐ）、ＮＴ−４（レーン３、４６４
ｂｐ）、ＢＤＮＦ（レーン４、３７３ｂｐ）の特異的ｃＤＮＡフラグメントは、
エクスビボ（ex vivo）ヒト角膜上皮から増幅され得たことを示す。しかし、以
下に列挙されるプライマーを使用するＧＤＮＦ（レーン５）の転写は、検出され
なかった。この結果は、初代培養上皮細胞およびＳＶ４０（Araki-Sasakiら，19
95）で不死化させたヒト角膜上皮細胞株由来のｃＤＮＡを使用する３つの独立の
実験によって確認された。対照的に、エクスビボ角膜間質はまた、ＧＤＮＦ（レ
ーン５、３４３ｂｐ）をコードするｍＲＮＡを含んだ（図２Ｂを参照）。しかし
、この組織において、ＮＴ−４（レーン３）の転写は、以下に列挙されるプライ
マーを使用して検出できなかった。ＲＴ−ＰＣＲ実験の結果は、培養された角膜
間質性角膜実質細胞由来のｃＤＮＡが使用された場合に、同一であった。

【００３０】 上述のＰＣＲ産物の全てを、大腸菌へ形質転換し、そして配列決定した。Ｇｅ
ｎ ＢａｎｋのＢｌａｓｔサーチプログラムを介しての公知の遺伝子との得られ
たＤＮＡ配列の比較によって、全ての実験において、予想される神経栄養因子と
の１００％配列同一性が明らかとなった。

【００３１】 ヒト角膜におけるＧＤＮＦについて特異的なチロシンキナーゼレセプターの転
写 エクスビボ角膜上皮（図３Ａ）および間質（図３Ｂ）はまた、神経栄養因子の
結合およびシグナル伝達に必要なチロシンキナーゼレセプターをコードするｍＲ
ＮＡを含んだ。

【００３２】 図３Ａは、エクスビボ角膜上皮からのＴｒｋＡ（レーン１）（５７０ ｂｐ）
、ＴｒｋＢ（レーン２）（４７２ ｂｐ）、ＴｒｋＣ（レーン３）（４８４ ｂ
ｐ）およびＴｒｋＥ（レーン４）（５４５ ｂｐ）に特異的なｃＤＮＡフラグメ
ントの増幅後のＲＴ−ＰＣＲ実験の結果を示す。図３Ｂは、エクスビボ角膜間質
からのｍＲＮＡを使用して同一結果を示す。培養された角膜上皮細胞（初代培養
物または角膜上皮細胞株）あるいは培養された角膜間質性角膜実質細胞を使用し
た場合、ＲＴ−ＰＣＲのスペクトルは変化しなかった。全ての上記Ｔｒｋ遺伝子
フラグメントをまた、クローニングし、配列決定し、そして、さらなる確認のた
めにＢｌａｓｔサーチプログラムによって分析した。

【００３３】 培養されたヒト角膜上皮および間質性角膜実質細胞における、ＧＤＮＦおよび
対応のチロシンキナーゼレセプターの転写のレベル 上記ＰＣＲ実験の結果を確認するためにならびに遺伝子転写のレベルを評価す
る（estimate）ために、ＤＮＡドットブロット分析を行った（図４）。ＤＮＡド
ットブロットについてのハイブリダイゼーションプローブは、培養された上皮細
胞または間質性角膜実質細胞の１μｇ ｍＲＮＡから生じた第１鎖（first-stran
d）ｃＤＮＡであったので、ＤＮＡドットブロットの結果は、異なる細胞におけ
るＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナーゼレセプター
の転写レベルを評価しそして比較することを可能にする。図４Ａは、ヒト角膜上
皮細胞株におけるＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナ
ーゼレセプターの転写レベルのスペクトルを示す。ＮＧＦ（レーン１）、ＢＤＮ
Ｆ（レーン４）およびＴｒｋＥ（レーン９）の転写は、ＮＴ−３（レーン２）、
ＮＴ−４（レーン３）、ＴｒｋＡ（レーン６）、ＴｒｋＢ（レーン７）およびＴ
ｒｋＣ（レーン８）のものよりも有意に弱かった。ＮＴ−３（レーン２）、ＮＴ
−４（レーン３）、ＴｒｋＡ（レーン６）、ＴｒｋＢ（レーン７）およびＴｒｋ
Ｃ（レーン８）の転写のレベルは、ポジティブコントロール（レーン１０）とし
て使用されたＧＡＰＤＨのものよりも低かった。ＧＤＮＦは、上皮細胞において
転写されなかった（レーン５、図４Ａ）が、培養された間質性角膜実質細胞にお
いて陽性のシグナルを示した（レーン５、図４Ｂ）。

【００３４】 培養された角膜上皮および間質におけるＧＤＮＦの機能的役割 ＧＤＮＦは、角膜上皮細胞の増殖に有意な効果を有した。図５に示されるよう
に、ディッシュ当たりのコロニーの数は、組換えヒトＧＤＮＦ（５０ｎｇ、ｐ＜
０．０５、および２００ｎｇ、ｐ＜０．０００１）の添加時に有意に増加した。
これは、コロニーを形成する角膜上皮細胞の能力がＧＤＮＦによって増強された
ことを示す。なおより重要なのは、クローン増殖に対する効果であり、これは、
各コロニー内の細胞数により反映される（図６）。角膜上皮細胞は、連続的に細
胞増殖へと入り、これは、Ｄ６において、非常に小さなコロニーから非常に大き
なものに及ぶコロニーのスペクトルを生じる結果となる。この観察は、比較的大
きな標準偏差（ＳＤ）および統計学的に意味のあるデータを得るために各ディッ
シュにおける多数のコロニー（７５）をカウントする必要性を説明する。角膜上
皮細胞のクローン増殖は、図６に示されるように、ＧＤＮＦ（５０および２００
ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０１）によって有意に刺激された。

【００３５】 角膜上皮増殖に対する刺激性効果に加えて、２０または１００ｎｇ／ｍｌのい
ずれかの濃度のＧＤＮＦは、図７に示されるように、間質性角膜実質細胞の増殖
を有意に促進した。これらのデータは、ＧＤＮＦが、無血清培地におけるヒト間
質性角膜実質細胞の増殖を促進し得ることを示す。

【００３６】 培養された角膜上皮および間質性角膜実質細胞におけるＭＡＰキナーゼのリン
酸化反応に対するＧＤＮＦの効果 ＭＡＰキナーゼシグナリングカスケードの活性化は、細胞増殖および分化に対
する種々の成長因子の効果を媒介するために必須である。従って、リン酸化ＭＡ
ＰキナーゼＥＲＫおよびＪＮＫの細胞内蓄積は、神経栄養因子に対する応答にお
けるＭＡＰキナーゼ経路の活性化についての指標である。シグナル伝達の蓄積と
、培養された角膜上皮細胞および培養された間質性角膜実質細胞の増殖に対する
ＧＤＮＦの驚くべき効果の結果とを関連させるために、ヒト角膜上皮および間質
におけるＭＡＰキナーゼカスケードのメンバーの誘導を研究した。シグナルがリ
ン酸化に対応していることを確実にするために、また、ＭＡＰキナーゼを阻害す
るインヒビターＰＤ ９８０５９を使用した。図８Ａは、ＥＲＫ１および２のリ
ン酸化形態が、培養されたヒト上皮細胞において誘導され得ることを示す。無血
清コントロール培地（レーン７）と比較して、２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＧＤＮ
Ｆは、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のリン酸化を誘導した（レーン５）。この誘導は
、インヒビターＰＤ ９８０５９の添加によって妨げられた。リン酸化ＥＲＫ１
およびＥＲＫ２のレベルをまた、ＮＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）（レーン１）によ
って増加され、そしてこの効果はまた、ＰＤ ９８０５９によって妨げられ得た
。同様に、リン酸化ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のレベルはまた、ＢＤＮＦ（２００
ｎｇ／ｍｌ）（レーン３）によって増加されたが、この増加はＰＤ ９８０５９
によって阻害されなかった。図８Ｂ、ＣおよびＤにおけるデータは、上記神経栄
養因子を用いてまたは用いずにインキュベートした場合のヒト角膜上皮細胞にお
ける、全（リン酸化および非リン酸化）ＥＲＫ１およびＥＲＫ２（図８Ｂ）、活
性化ＪＮＫ１およびＪＮＫ２（図８Ｃ）ならびに全（リン酸化または非リン酸化
）ＪＮＫ１およびＪＮＫ２（図８Ｄ）の同じ発現レベルを示す。この結果は、Ｅ
ＲＫ１およびＥＲＫ２（しかしＪＮＫ１／２ではない）のリン酸化は、培養され
たウサギ角膜上皮細胞においてＧＤＮＦによって誘導され得ることを示す。

【００３７】 図９は、ＭＡＰキナーゼのリン酸化に対するＧＤＮＦの効果が、培養されたヒ
ト角膜間質性角膜実質細胞における神経栄養因子のものとは異なることを示す。
図９Ａに示されるデータは、間質性角膜実質細胞（レーン７）におけるコントロ
ールと比較して、ＥＲＫ１およびより少ない程度でのＥＲＫ２のリン酸化が、２
００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（レーン１）によって誘導され、そしてこの増加はＰＤ
９８０５９（レーン２）によって阻害されたことを示す。対照的に、２００ｎ
ｇ／ｍｌ ＢＤＮＦは、コントロール（レーン３）と比較してＥＲＫ１またはＥ
ＲＫ２のリン酸化を誘導せず、そしてＰＤ ９８０５９（レーン４）で変化のな
いままであった。ＧＤＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）は、限られた程度までＥＲＫ１
を誘導し（レーン５）、そしてこの増加はＰＤ ９８０５９（レーン６）によっ
て阻害された。図９Ｂは、全ＥＲＫが、無血清培地中でまたは上記神経栄養因子
とのいずれかで培養された間質性角膜実質細胞(stromal keratocyte)において同
一レベルに誘導されたことを示す。ＥＲＫ１との比較において、間質性角膜実質
細胞における活性化ＪＮＫ１および２の両方の発現は、比較的弱かった。僅かな
差異が、活性化ＪＮＫ１の発現と関連して観察され得、これは、ＮＧＦ（レーン
１）、ＢＤＮＦ（レーン２）またはＧＤＮＦ（レーン３）で刺激された細胞にお
いてよりも、無血清ＤＭＥＭ（レーン４）中で培養された細胞においてより低か
った。ＢＤＮＦは、ＪＮＫ１（レーン２）の活性化に対して最も強い効果を有す
るようであった。間質性角膜実質細胞における活性化ＪＮＫ２は、ＧＤＮＦ、Ｎ
ＧＦまたはＢＤＮＦのいずれによっても誘導されなかった（図９ｃ参照）。図９
Ｄは、全ＪＮＫ１およびＪＮＫ２の発現が、培養条件に関わらず、間質性角膜実
質細胞において同一であることを示す。上記結果は、ＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびＢ
ＤＮＦは、培養化ヒト間質性角膜実質細胞におけるＥＲＫ１およびＪＮＫ１のリ
ン酸化形態の蓄積に対して異なる効果を有することを示す。

【００３８】 インビトロおよび細胞培養データの要約 ヒトおよびウサギ角膜上皮および間質に対するＧＤＮＦおよび他の神経栄養因
子の効果ならびに関連する可能な伝達経路を研究するために、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ
、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦおよびレセプターＴｒｋＡ〜Ｅの転写を、ＲＴ
−ＰＣＲによって研究した。ＤＮＡドットブロット分析により転写レベルの見積
もりが可能になった。組換え単一細胞増殖アッセイは組換えＧＤＮＦを使用して
行った。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達を、活性化および全ＥＲＫ１／２およびＪ
ＮＫ１／２それぞれに対する抗体を使用して、ウェスタンブロット分析によって
研究した。

【００３９】 上記結果は、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＤＮＦおよびＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、Ｔｒｋ
Ｃ、ＴｒｋＥレセプターの転写が、エクスビボおよび培養された上皮および間質
の両方において検出され得ることを示す。対照的に、ＧＤＮＦの転写は、間質に
おいて優勢に検出され、一方、ＮＴ−４の転写は、上皮においてのみ検出された
。転写レベルは、ＮＴ−３、ＮＴ−４およびＴｒｋレセプターについてより高く
、そしてＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびＢＤＮＦについてより低かった。ＧＤＮＦは、
上皮コロニー形成および増殖の両方を刺激した。間質性増殖は、無血清培地にお
いてＧＤＮＦによって増強された。上皮において、優勢なＥＲＫ１が、ＧＤＮＦ
、ＮＧＦおよびＢＤＮＦによって活性化された。間質細胞において、ＧＤＮＦお
よびＮＧＦは、ＥＲＫ１およびＪＮＫ１のリン酸化を刺激した。

【００４０】 これらの結果は、ＧＤＮＦがヒト角膜において転写されることを示す。ＧＤＮ
Ｆは、角膜上皮増殖を刺激する。ＧＤＮＦは、上皮および間質細胞におけるＥＲ
Ｋ１およびＪＮＫ１のリン酸化に対して非常に特異的な効果を有する。ＧＤＮＦ
の差別的発現は、角膜のサイトカインネットワーク内での調節機能を示唆する。
ＧＤＮＦは優勢に間質性角膜実質細胞で発現され、しかしそれは角膜上皮細胞の
増殖を刺激し、そして間質性角膜実質細胞の増殖はＧＤＮＦによってより少ない
程度に行われるという知見は、ＧＤＮＦが上皮モジュレーターとしてその役割を
果たすことを示唆する。

【００４１】 ヒト患者における角膜潰瘍の治療 直接的に角膜上皮細胞の増殖に対するポジティブ効果を実証するために、左側
に大きな炎症を伴うを伴う角膜潰瘍に罹患する４５才の患者を、組換えヒトＧＤ
ＮＦで処置した。処置の前に、患者は、異なる軟膏、点眼剤、コンタクトレンズ
でおよび血清点眼剤(serum drop)でまた、眼疾患専門の病院において６週間、不
成功に処置された。従って、患者は手術を受けなければならないと結論付けられ
た。しかし、患者を、２時間間隔で４０時間０．２ｍｇ／ｍｌ（２５μｌ／用量
）の濃度の組換えヒトＧＤＮＦで、次いで２０μｌ／用量で１日６回処置した。
図１０および１１にそれぞれ示されるように、創傷治癒が、第２日から始まった
。それから上皮の創傷治癒が続き、そして治療の３週間後に完了した（図１０）
。その上、間質の厚みの連続増加が観察され得た。さらに、上皮の治癒後、炎症
ならびに主観的苦痛の顕著な減少が得られた。

【００４２】 Ｒｅｔのリン酸化は、培養された角膜上皮細胞において時間依存様式でＧＤＮ
Ｆによって誘導される ＧＤＮＦでの刺激に続いて、ＧＦＲα−１は、細胞膜へＲｅｔを補充し（recr
uiting）、そしてそのレセプターチロシンキナーゼドメインを活性化させて膜レ
セプタータンパク質と細胞内シグナリングタンパク質との間でＧＤＮＦシグナル
を媒介する。Ｒｅｔが角膜上皮において発現されているかおよびＧＤＮＦ−誘発
シグナリング経路に関与しているどうかを測定するために、抗−Ｒｅｔ抗体を使
用する免疫沈降（immuno-precipitation）続いてホスホ−チロシンに対するモノ
クローナル抗体でのウェスタンブロットを、リン酸化Ｒｅｔを検出するために行
った。図１２は、リン酸化Ｒｅｔが、ＧＤＮＦに応答して角膜上皮細胞中に時間
依存的に蓄積されたことを示す。無血清コントロール培養（ｃｏ）との比較にお
いて、Ｒｅｔのチロシンリン酸化は、培養培地へのＧＤＮＦ（２００ｎｇ／ｍｌ
）の添加後５分以内で誘導された。Ｒｅｔのチロシンリン酸化は、１５分にわた
って高レベルのままであった。比較において、ヘルビマイシン（herbimycin）−
前処理した細胞におけるリン酸化Ｒｅｔのレベルは、コントロール培養物におい
てよりも低くさえあった。これらの結果は、ＲｅｔのＧＤＮＦ−依存チロシンリ
ン酸化がチロシンキナーゼインヒビターヘルビマイシンＡによって特異的に阻害
されることを示す。

【００４３】 培養された角膜上皮細胞におけるＧＤＮＦによって誘発される細胞内シグナル
の時間依存活性化 どのシグナル伝達経路がＧＤＮＦによって誘導されるかどうかを決定するため
に、リン酸化タンパク質の各々に対する特異的抗体を用いてのウェスタンブロッ
トによって、ＦＡＫファミリーメンバーのＧＤＮＦ−依存チロシンリン酸化およ
びＭＡＰＫシグナリング成分のＧＤＮＦ−依存活性化を検出することが求められ
た。

【００４４】 ＦＡＫのチロシンリン酸化は、ＧＤＮＦの存在下で４０分で徐々に増加された
（図１３）。ホスホ−チロシンキナーゼ２（Ｐｙｋ２）、ＦＡＫファミリーの別
のメンバーがまた、ＧＤＮＦへの引き続く曝露後４０分内でリン酸化された（図
１３）。

【００４５】 ＭＡＰＫシグナリングに関して、ｃＲａｆは、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＫＫＫ）
ファミリーに属し、そしてＭＡＰＫシグナルの伝播（propagation）のためのイ
ニシエーター（initiator）の役割を果たす。ＭＡＰＫキナーゼ１（ＭＥＫ１）
は、ＭＫＫＫからＭＡＰＫの２つの成分Ｅｒｋ １および２へのシグナリングカ
スケードを媒介するキータンパク質（key protein）である。Ｅｒｋの活性化は
、そこでそれが転写アクチベータ（transcription activators）（例えば、Ｅｌ
ｋ）をリン酸化する、核へのその輸送（translocation）を促進する。図１３は
、全てのこれらのシグナリング成分はＧＤＮＦによって活性化されることを実証
する：ｃＲａｆ、ＭＥＫ１およびＥｌｋのセリンリン酸化ならびにＥｒｋ １お
よび２のチロシン／スレオニンリン酸化は、ＧＤＮＦへの曝露後の既に１０分以
内に全て顕著に誘導され、そしてリン酸化のレベルは、徐々に、観察期間にわた
って増加した（図１３）。対照的に、ＧＤＮＦに応答するＲＳＫのリン酸化は、
検出可能でなかった（図１３）。これらの結果は、ＧＤＮＦによる遺伝子転写の
誘導は、ＦＡＫ（Ｐｙｋ２）−ＭＡＰＫ−Ｅｌｋ経路に依存していることを示す
。

【００４６】 細胞内シグナリングタンパク質のＧＤＮＦ−依存リン酸化に対するヘルビマイ
シン（herbimycin）Ａの効果 タンパク質−チロシンキナーゼインヒビターヘルビマイシンＡでの細胞の処理
は、ＡＦＫ、ｃＲａｆおよびＥｒｋのＧＤＮＦ−依存活性化の減少を生じさせた
。ウェスタンブロット分析は、培地への添加に続く３０分以内のＦＡＫ、ｃＲａ
ｆおよびＥｒｋのＧＤＮＦ−誘導化リン酸化を示す（図１４）。しかし、角膜上
皮細胞がヘルビマイシンＡの存在下で培養された場合、ＦＡＫ、ｃＲａｆおよび
ＥｒｋのＧＤＮＦ−依存リン酸化は顕著に減少された（図１４）。この文脈にお
いて、ＦＡＫのチロシンリン酸化だけでなくｃＲａｆのセリンリン酸化ならびに
Ｅｒｋ １および２のチロシン／スレオニンリン酸化も、チロシンキナーゼイン
ヒビターヘルビマイシンＡによって阻害されたことに注意されるべきである。こ
れは、ｃＲａｆ−Ｅｒｋ経路の活性化は、上流レギュレーター（upstream regul
ator）を示すＦＡＫのリン酸化に大いに依存することを示唆する。

【００４７】 ＭＥＫのリン酸化は、アルテミンによって誘導される ２５０ｍｇ／ｍｌアルテミンとのヒト角膜上皮細胞のインキュベーションは、
ＭＥＫのリン酸化の時間依存誘導を誘導した。図１５におけるウェスタンブロッ
トは、コントロール（レーン１）における非常に低いレベルのリン酸化を示す。
１０分、２０分、４０分および６０分間の２５０ｎｇ／ｍｌアルテミン（レーン
２〜５）での誘導は、角膜上皮細胞におけるリン酸化ＭＥＫの量の増加をもたら
した。図１５における全てのレーンは、同一量のタンパク質でロードされた。

【００４８】 Ｅｒｋ １／２のリン酸化は、アルテミンによって誘導される ２５０ｍｇ／ｍｌアルテミンでのヒト角膜上皮細胞のインキュベーションは、
Ｅｒｋ １／２のリン酸化の時間依存誘導を誘導した。図１６におけるウェスタ
ンブロットは、コントロール（レーン１）における非常に低いレベルのリン酸化
を示す。１０分、２０分、４０分および６０分間の２５０ｎｇ／ｍｌアルテミン
（レーン２〜５）とのインキュベーションは、角膜上皮細胞におけるリン酸化Ｅ
ｒｋ １および２の量を徐々に増加させた。図１６における全てのレーンは、同
一量のタンパク質でロードされた。

【００４９】 ＧＤＮＦは、角膜上皮細胞の移動（migration）を誘導する コントロール培地［添加剤なしのＳＨＥＭ（Ｃｏ）］における初代ヒト角膜上
皮細胞のサブコンフルエントな（subconfluent）単層における約１ｍｍ直径の引
っ掻き（scratch）“創傷”に続いて、細胞単層におけるギャップ（gap）の１０
％未満が、１８時間以内に細胞で満たされた［図１７Ａは、代表的な培養実験の
結果を示す］。ＧＤＮＦまたはＮＧＦの両方ならびにＥＧＦの添加は、インビト
ロ創傷治癒の有意な増加を生じさせた。図１７Ａに示されるように、ギャップの
１６．５％±６％が、２５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦの存在下で充填され、これは
、コントロールに対する有意な増加を示す（ｐ＜０．０１）。

【００５０】 同様に、ＮＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）への細
胞の曝露は、ギャップの約２０％の閉鎖（closure）（それぞれ、１９．６％±
３．１および１９．０％±８．６）を生じさせた。これらのデータは、ＮＧＦお
よびＥＧＦはまた、コントロールとの比較において、創傷の閉鎖を有意に促進し
た（それぞれ、ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０００１）ことを示す。

【００５１】 これらの結果は、図１７Ｂに示されるように、ＳＶ−４０形質転換化細胞株由
来の角膜上皮細胞を使用することによって確認された。コントロール培地［添加
剤なしのＳＨＥＭ（Ｃｏ）］において、細胞単層におけるギャップの２０％±４
．５が、１８時間後に満たされた。ＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、
ギャップの３０％±６．９が満たされ、これは、コントロールと比較して有意な
増加を示す（ｐ＜０．００１）。同様に、ＮＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）またはＥ
ＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかへの培養物の曝露は、細胞層におけるギャッ
プの２７％±７．１および４４．６±９％が、細胞で満たされた（それぞれ、ｐ
＜０．０００１およびｐ＜０．０００１）ことを示した（図１７Ｂ）。これらの
結果は、ＧＤＮＦが角膜上皮細胞のセミコンフルエント（semiconfluent）単層
における“創傷”の閉鎖を有意に促進したこと、ならびにこの効果がＮＧＦおよ
びＥＧＦのそれと類似であったことを実証する。

【００５２】 細胞移動に対するＧＤＮＦの効果をさらに確認するために、改変Ｂｏｙｄｅｎ
チャンバ分析を行った：コントロール培地（成長因子なしのＳＨＥＭ）において
、ほんの少数の細胞（１９±６．８）が、８μｍ孔サイズのフィルターを通って
移動した（図１８Ａ、Ｃ）。しかし、２５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦを改変Ｂｏｙ
ｄｅｎチャンバの下部ウェルへ添加した場合、フィルターの孔を通って移動した
細胞の数は６倍より多く増加した（１１７±３７．６）（ｐ＜０．０００１）；
図１８Ｂ、Ｃを参照。

【００５３】 ＧＤＮＦ−誘導された移動は、ヘルビマイシンＡによって阻害される 創傷治癒の間のＦＡＫ−ＭＡＰＫ−シグナリング経路の重要性をさらに試験す
るために、ＧＤＮＦ−媒介細胞移動に対するヘルビマイシンＡの効果を、インビ
トロ創傷治癒モデルにおいて研究した。ヘルビマイシンＡは、ＧＤＮＦの存在下
で細胞移動をブロックし得た。２５０ｎｇ／ｍｌ ＧＤＮＦを有する代表的培養
において、創傷ギャップの３７．９±８．１％が、１８時間後に細胞で満たされ
た。ＧＤＮＦおよび１０μＭ ヘルビマイシンＡの存在下で、ギャップの１９．
２±５．５％のみが閉じられた（ｐ＜０．００１）。

【００５４】 アルテミンは、角膜上皮細胞の移動を誘導する コントロール培地［添加剤なしの培地５００（Ｃｏ）］における初代ウサギ角
膜上皮細胞のサブコンフルエントな（subconfluent）単層における約１ｍｍ直径
の引っ掻き（scratch）“創傷”に続いて、細胞単層におけるギャップの約２０
％が、６時間以内に細胞で満たされた［図１９は、代表的な培養実験の結果を示
す］。アルテミン（１００または２５０ｎｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（１０ｎｇ／
ｍｌ）の両方の添加は、インビトロ創傷治癒の有意な増加を生じさせた。図１９
に示されるように、ギャップの２９±８％が、１００ｎｇ／ｍｌ アルテミンの
存在下で満たされ、これは、コントロールに対して有意な増加を示す（ｐ＜０．
０１）。同様に、２５０ｎｇ／ｍｌアルテミンへの細胞曝露は、ギャップの約３
０％〜３５％閉鎖を生じた。これらのデータは、アルテミンはまた、コントロー
ルとの比較において、創傷の閉鎖を有意に促進する（ｐ＜０．００１）ことを示
す。

【００５５】 アルテミンは、コロニー形成を促進し、そしてそれによって増殖を刺激する 図２０は、第６日におけるウサギ角膜上皮細胞のコロニーの全数に対するアル
テミン（１００ｎｇ／ｍｌおよび２５０ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。コントロー
ル培養物（Ｃｏ）は、平均４０±２０コロニーを含んだ。１０ｎｇ／ｍｌととも
にインキュベートした培養物は、平均５８±１８コロニー（ｐ＜０．０１）を含
んだ。２５０ｎｇ／ｍｌアルテミンの添加は、平均７９±３８培養物のコントロ
ールに対するコロニー数を有意に増加させた（ｐ＜０．０１）。

【００５６】 アルテミンは、ディッシュ当たりの全数を増加させ、そしてそれによって角膜
上皮細胞の増殖を誘導する 図２１は、アルテミンに応答する細胞数を示す。コントロール培養物において
、全部で２００±９８細胞が存在した。対照的に、２５０ｎｇ／ｍｌアルテミン
の添加は、ディッシュ当たりの細胞の全数を有意に増加させた（ｐ＜０．００１
）。これらのデータは、明確に、アルテミンがインビトロで角膜上皮細胞の増殖
を促進することを実証する。

【００５７】 方法 エクスビボ角膜組織 新鮮なエクスビボ角膜上皮および間質を、インフォームドコンセントに従いそ
してＤｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉの見解に従って、脈絡膜
メラノーマのための摘出を受けた８の眼から得た。摘出に続いて直ぐに、約８ｍ
ｍの領域内の中心および中間−周辺（mid-peripherial）角膜上皮を、機械的ス
クラッピング（mechanical scraping）によって除去した。この領域内で、間質
の小さいサンプルを、ダイヤモンドブレードで切開した。組織サンプルを、ショ
ック−凍結させた（shock-frozen）。

【００５８】 細胞培養 Ｌｉｋｏｒｏｌ（登録商標）（Ｃｈａｕｖｉｎ−Ｏｐｓｉａ，Ａｂｌｅｇｅ
Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）中に２４時間未満保存したヒト角膜を、Ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒ
ｇ，Ｇｅｒｍａｎｙのアイバンクを通して得た。全ての角膜は、移植クオリティ
ー（transplant quality）であったが、国際アイバンク規準に従う非眼（non-oc
ular）理由のために臨床使用からは除外された。上皮細胞および間質細胞の両方
を、Ｙｏｕら（1999）に記載される技術の僅かな改変を伴うアウトグロース培養
（outgrowth cultures）のように、プラスチックディッシュにおいて培養した。
ＲＮＡ抽出のために、外植片培養を開始し、そしてＳＨＥＭ培地［ウシ胎児血清
（ＦＢＳ）を含むダルベッコの改変イーグル培地およびＨａｍ’ｓ栄養混合物Ｆ
１０の１：１混合物、Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ］
、５μｌインシュリンおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ中、抗生物質なしで培養し
た（Arrak-Sakiら, 1995; Shimuraら, 1997を参照）。培養物の上皮表現型を、
サイトケラチンＫ１２について特異的な抗体で染色することによって確認した。
この方法は、非常に限られた量の細胞のみを生成したので、本発明者らはまた、
ＳＶ ４０アデノウイルス−形質転換角膜上皮細胞株を使用した（Arrak-Sakiら,
1995に記載される）。正常な角膜上皮と同様に、これらの細胞は、クローン成
長特性（clonal growth characteristics）を示し、そして例えばケラチンＫ１
２の発現を含む角膜上皮表現型を示した。細胞株を、Arrak-Sakiら（1995）およ
びShimuraら（1997）に記載されるようにＳＨＥＭ培地において培養した。間質
性線維芽細胞を、Ｙｏｕら（1999）に記載されるようにＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
中で培養した。全ての実験を、三重で（in triplicate）そして異なるドナーか
ら得た細胞を用いて行った。

【００５９】 全ＲＮＡの単離およびｍＲＮＡ精製 全ＲＮＡ（total RNA）を、Ｙｏｕら（1999）において記載されるようにＰｒ
ｏｍｅｇａ ＲＮＡｇｅｎｔｓ（登録商標）全ＲＮＡ単離システムキット（Prom
ega Co. Madison WI, USA）の使用によって、グアニジニウムチオシアナートフ
ェノール−クロロホルム抽出法（Chomczynskiら, 1987）に従って単離した。ｍ
ＲＮＡ単離のために、Ｐｒｏｍｅｇａ ｐｏｌｙＡＴｒａｃｔ（登録商標）シス
テムＩＩＩを、Ｙｏｕら（1990）に記載されるように使用した。ゲノムＤＮＡに
よる汚染の危険性を最小化するために、ｍＲＮＡサンプルを、ＲＮアーゼ無しＤ
Ｎアーゼによって消化し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽
出およびイソプロパノール沈殿を続けた。

【００６０】 ＰＣＲプライマーおよび逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ） ＰＣＲプライマー設計のために、公知のコーディング配列をＧｅｎＢａｎｋか
ら取った。ニューロトロフィン遺伝子ファミリーおよびニューロトロフィンチロ
シンキナーゼレセプターファミリーの全ての公知のメンバーの配列の高い構造類
似性に起因して、オープンリーディングフレーム（open reading frames）にお
ける全ての配列を、Ｙｏｕら（1999）に記載のように多重配列アライメントプロ
グラム（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇ
ｒａｍ）を使用して比較した。可能ならどんな場合でもプライマーをゲノム配列
の１以上のイントロンに及ぶように設計した：ＮＧＦ：センス ＧＡＧＧＴＧＣ
ＡＴＡＧＣＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡ（配列番号 ６）、およびアンチセンス ＴＣ
ＣＡＣＡＧＴＡＡＴＧＴＴＧＣＧＧＧＴＣＴ（配列番号７）（２３３ｂｐの産物
）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｖ ０５１１、Ｘ ５２５９９）；Ｎ
Ｔ−３：センス ＴＴＡＣＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＡＴＧ（配列番号８）
、およびアンチセンス ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＧ（配列番
号９）（２９８ｂｐの産物）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ ３７７
６３）；ＮＴ−４：センス、ＣＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＣＴＣＣ
Ｇ（配列番号１０）、およびアンチセンス ＣＧＴＴＡＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＡ
ＧＣＧＧＧＴＴＴＣ（配列番号１１）（４６４ｂｐの産物）（ＧｅｎＢａｎｋア
クセッション番号：Ｍ ８６５２８）；ＢＤＮＦ：センス ＧＴＧＡＧＴＴＴＧ
ＴＧＴＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧ（配列番号１２）およびアンチセンス ＣＡＧＣＡ
ＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣ（配列番号１３）（３７３ｂｐの産物）（
Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｘ ６０２０１、Ｘ ９１２５１）；ＧＤ
ＮＦ：センス ＧＣＣＣＴＴＣＧＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣ（配列番号１４
）およびアンチセンス ＣＴＣＧＴＡＣＧＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＣ（配列番
号１５）（３４３ｂｐの産物）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ ０
００５１４）；ＴｒｋＡ：センス ＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣ
（配列番号１６）およびアンチセンス ＣＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＧＧ
ＧＣ（配列番号１７）（５７０ｂｐの産物）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番
号：Ｍ ２３１０２）；ＴｒｋＢ：センス ＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＡＴＣＡＣＡ
ＴＴＴＣＴＣＧ（配列番号１８）およびアンチセンス ＣＡＣＡＧＡＣＧＣＡＡ
ＴＣＡＣＴＡＣＣＣＡ（配列番号１９）（４７２ｂｐの産物）（ＧｅｎＢａｎｋ
アクセッション番号：Ｓ ７６４７３）；ＴｒｋＣ：センス ＡＣＴＴＣＧＧＡ
ＧＣＡＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧ（配列番号２０）およびアンチセンス ＡＣＴ
ＣＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡ（配列番号２１）（４８４ｂｐの
産物）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｓ ７６４７５、Ｕ ０５０１２
）；ＴｒｋＥ：センス ＡＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣ（配列番号
２２）およびアンチセンス ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴ（配
列番号２３）（５４５ｂｐの産物）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ
７４９７９）。

【００６１】 第一鎖ｃＤＮＡ（first-strand cDNA）を、Ｙｏｕら（1999）に記載のように
合成した。ＰＣＲを０．５μｌの一本鎖ｃＤＮＡを、３ユニットのＴｈｅｒｍｕ
ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオ
チドの混合物（最終濃度０．２ｍＭ）、１０×ＰＣＲ緩衝液（５μｌ）および２
５ｐモルのセンスおよびアンチセンスプライマー（総容量５０μｌで）と共に使
用して行った（全ての試薬は、Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，
Ｊａｐａｎからであった）。緩衝液中のＭｇＣｌ₂の最終濃度は、１．５ｍＭで
あった。ＰＴＣ−１００ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ
（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を９５℃で３
分間使用した（前変性（predenaturation））。次いで、１分間９４℃での変性
、１分間５５℃でのアニーリングおよび１分間７２℃での伸長を含む３５サイク
ルを行った。

【００６２】 ＰＣＲ産物を、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムで染色した１．８％アガロー
ス／１×ＴＡＥゲルを使用する、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画化
（size-fractionated）した。全てのＰＣＲフラグメントをｐＣＲ ２．１ベクタ
ー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）
へクローニングし、そして配列を標準方法によって確認した。

【００６３】 培養された角膜の遺伝子転写レベルの検出のためのＤＮＡドットブロット分析 培養された上皮間質細胞における転写レベルを評価するために、ＤＮＡドット
ブロット分析を行った。十分な量のヒト角膜上皮細胞を培養することは不可能で
あったので、角膜上皮細胞株を、角膜上皮の供給源として使用した。神経栄養因
子ファミリーおよびＴｒｋレセプター遺伝子に対応するクローン化ＰＣＲフラグ
メントを、上述のプライマーを使用して増殖させ、そしてアガロースゲルから精
製した。０．１μｇ ＰＣＲ産物を、ドットとしてのナイロン膜上へロードした
。高用量プローブを生じさせるために、１μｇ ｍＲＮＡを、培養された上皮お
よび間質細胞から単離し、そしてジゴキシゲニン−標識化第一鎖ｃＤＮＡの合成
のためにジゴキシゲニンプローブ合成ミックス（digoxygenin probe synthesis
mix）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ製）で転写した。次いで、ＤＮＡブロットを、４０℃で一晩ＤＩＧ Ｅ
ａｓｙＨｙｂ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で
ジゴキシゲニン−標識化ｃＤＮＡプローブで、プレハイブリダイズおよびハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄後、ブロットを、製造業者の
説明に従ってＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ製のＤＩＧ洗浄キットで
処理し、そしてＥＬＣ−フィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）へ曝した。比較のために、還元グ
リセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードする
ｃＤＮＡフラグメントをポジティブコントロールとして使用した。

【００６４】 培養した角膜における神経栄養因子によって誘導されるＭＡＰキナーゼシグナ ル伝達経路の成分の研究 培養された角膜上皮および間質性角膜実質細胞におけるシグナル伝達経路の活
性化に対するＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子の効果を評価するために、ウェス
タンブロットを、ＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびＢＤＮＦの存在下でのリン酸化ＭＡＰ
キナーゼ ＥＲＫおよびＪＮＫの蓄積を検出するために行った。ヒト間質性角膜
実質細胞を、１日間、Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（ｇｌ
ｕｔａＭＡＸ）あるいは１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養し、そして別の日
の間、無血清培地中で飢餓状態にさせた（starved）。次いで、培養物をＰＢＳ
で洗浄し、そして添加剤を含まないかあるいは組換えヒトＧＤＮＦ（２００ｎｇ
／ｍｌ）、組換えヒトＮＧＦ（２００ｎｇ／ｍｌ）および組換えヒトＢＤＮＦ（
２００ｎｇ／ｍｌ）（全てＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍ
Ｎ，ＵＳＡから得た）を含む無血清ＤＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。
いくつかの培養物を、１時間１００μＭのＭＡＰキナーゼのインヒビター（ＰＤ
９８０５９、Ｔｏｒｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ Ｂａｌｌｗｉｎ，ＭＯ，ＵＳ
Ａ）と共にインキュベートし、その後ニューロトロフィンへ曝した。ＰＢＳで洗
浄後、培養細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、０．０２％アジ化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ、１％ Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００およびいくつかのタンパク質インヒビターの混合物を含む
溶解緩衝液中に溶解した（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（１タブレット／５０ｍｌ緩衝液）。レーン当たり５０
μｇ全タンパク質を、１０％ ＳＴＳ−ＭＯＰＳ ＮＵＰＡＧＥ Ｂｉｓ−トリ
スゲル（ＮＯＶＥＸ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって分画化し、
そしてニトロセルロース膜上へブロットした。膜（membranes）を、ＥＲＫ１、
ＥＲＫ２、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２に対する希釈化ポリクローナル抗体で染色し
た（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕ
ｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）。また、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のいずれかの不活性化形態
を認識するポリクローナル抗体を使用し、これは、哺乳動物ＥＲＫ２のリン酸化
スレオニン残基１８３およびチロシン残基１８５の触媒コア（catalytic core）
に対して惹起された。同様に、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２のリン酸化形態を認識す
るポリクローナル抗体を使用した（両方ともＰｒｏｍｅｇａから）。最終工程に
おいて、膜を、ＥＣＬウェスタンブロット分析システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を
用いて視覚化した。

【００６５】 角膜上皮および間質細胞の増殖に対するＧＤＮＦの効果の研究 角膜増殖に対するＧＤＮＦの効果を評価するために、組換えヒトＧＤＮＦを使
用した（Ｒ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）。角膜上皮増殖に対
する効果を評価するために、単一細胞クローン成長モデルを使用し、これは、コ
ロニー形成およびクローン拡張（clonal expansion）の両方に対する所与の成長
因子の効果を測定することを可能にする（Kruseら, 1991）。ニュージーランド
ホワイトウサギを、ＡＲＶＯ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従ってそしてＧｅｒｍａｎ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｌａｗ
ｓおよびＳｔａｔｅ ｏｆ Ｂａｄｅｎ−Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇの法律を遵守
して、収容および処置した。ペントバルビタールの静脈内過剰用量（overdose）
での犠牲の前に、それらは、キシラジンヒドロクロリド（xylazine hydrochlori
de）およびケタミンヒドロクロリドの筋肉内注射を受けた。クローン成長アッセ
イの詳細は、Ｋｒｕｓｅら（１９９１）に記載される。５０００生存細胞が、イ
ンシュリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、セレン（５
ｎｇ／ｍｌ）およびヒドロコルチゾン（５μｇ／ｍｌ）（全てＳｉｇｍａ，Ｄｅ
ｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから）の補足物（Ｓ）を含む無血清培地Ｍ
ＣＤＢ１５１中の各１６ｍｍディッシュにおいて播種された。この播種密度は、
ディッシュ当たりのコロニー数ならびにコロニーあたりの細胞数の測定によって
位相差顕微鏡（第６日）下で定量され得る単一細胞クローン成長を生じさせた。
この定量は、およそ２ｍｍ幅である底上にグリット（grit）を含んだディッシュ
（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ，ＵＳＡ製）の使用によって促進され
た。データ収集のために、各条件についての４つのランダムに選択されたディッ
シュの全表面積をスクリーニングした。さらに、コロニー当たりの細胞数を、各
条件についての７５のランダムに選択されたコロニー中で測定した。さらに、細
胞の全数／ディッシュを計算し、アルテミンについての評価を行った。細胞増殖
を刺激するために、ＧＤＮＦ（５０または２００ｎｇ／ｍｌ）またはアルテミン
（２５０ｎｇ／ｍｌ）を、培地へ添加した。１２日後（隣接するコロニーが互い
へと増殖し始め、そして従って数での定量を妨げる時）の増殖速度を評価するた
めに、ディッシュを−２０℃メタノールで固定し、そしてメチレンブルーで染色
した。

【００６６】 培養された間質性角膜実質細胞の増殖に対するＧＤＮＦの効果を研究するため
に、細胞を、５×１０⁴細胞／６０ｍｍディッシュの密度で、ＤＭＥＭ＋１０％
ＦＢＳからＤＭＥＭ＋１％ＦＢＳへまたはＦＢＳを含まないＤＭＥＭへ継代培養
した（passaged）。いくつかの培養物は、上述の濃度の組換えヒトＧＤＮＦを受
容した。増殖を、位相差顕微鏡（１条件当たり１００×倍率で５０フィールド(f
ield)）下で細胞ならびにトリプシン化（trypsinized）細胞をカウントすること
によって６日後測定した。また、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ
Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の説
明書に従って行った。この比色アッセイのために、５００または１０００細胞を
、９６−ウェル−プレート（Ｆａｌｃｏｎ）において６日間増殖させた。培養ウ
ェルへの添加時に、ティトラゾリウム（titrazolium）染料を、細胞によって着
色したホルマザン産物（formazan product）へ生物還元し（bioreduced）、そし
て吸光度を４９０ｎｍで定量する。ホルマザン産物の量は、ウェル中の生存して
いる細胞の数に比例し、そして従って増殖を評価するに役立ち得る。

【００６７】 角膜上皮細胞におけるＧＤＮＦおよびアルテミンによって誘導されるシグナル 伝達経路の研究 どのタンパク質キナーゼカスケードがＧＤＮＦおよびアルテミンによって活性
化されるかを研究するために、細胞株からの角膜上皮細胞を、５×１０⁵細胞／
７５ｃｍ²の密度で播種し、そして１日間１０％ＦＢＳを含むＳＨＥＭ中で培養
した。次いで、培養物をＰＢＳで洗浄し、そして添加物無しかあるいはＧＤＮＦ
（２００ｎｇ／ｍｌ）を含むかまたはアルテミン（２５０ｎｇ）を含む無血清Ｓ
ＨＥＭ中で１０〜４０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、培養細胞
を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ₂Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２
％ アジ化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌフェニルメチルスルホニルフルオリド
、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００およびいくつかのプロテ
アーゼインヒビターを含む溶解緩衝液［ｃｏｍｐｌｅｔｅＴＭ，Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（１タブレット／３０ｍｌ緩衝液）］中に溶解した。
１レーン当たり８０μｇの全タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ １０％ ＳＤＳ−Ｍ
ＯＰＳ−Ｂｉｓ−ＴｒｉｓゲルまたはＮｕＰＡＧＥ ３〜８％ Ｔｒｉｓ−アセ
テートゲル（全てＮＯＶＥＸ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって分画化し、
そしてニトロセルロース膜上へブロットした。リン酸化タンパク質をホスホ−特
異的（phospho-specific）抗体で検出し、そしてＥＣＬウェスタンブロット分析
システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で可視化した。ホスホ−Ｒａｆ（ｓｅｒ２５９）
、ホスホ−ＭＥＫ１／２（ｓｅｒ２ｌ７／２２１）、ホスホ−ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ
ｌ／２）（ｔｈｒ２０２／ｔｙｒ２０４）、ホスホ−ｐ９０リボソームＳ６キナ
ーゼ（ＲＳＫ）（ｓｅｒ３８１）およびホスホ−Ｅｌｋ−ｌ（ｓｅｒ３８３）に
対する抗体を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ）から得た。ホスホ−ＦＡＫ（ｔｙｒ３９７／ｔｙｒ４０７／ｔｙｒ５７６／
ｔｙｒ５７７／ｔｙｒ８６１／ｔｙｒ９２５）およびホスホ−Ｐｙｋ２（ｔｙｒ
４０２／ｔｙｒ５７９／ｔｙｒ／５８０／ｔｙｒ８８１）に対する抗体を、Ｂｉ
ｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ホスホ−
チロシンに対するモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ
，Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。

【００６８】 免疫−沈降を、Ｒｅｔおよびパキシリン（paxillin）のチロシンリン酸化を検
出するために行った。手短に言えば、５×１０⁵細胞（種々の培養条件で培養し
た）の１ｍｌライゼートを、２時間４０μｌプロテイン−Ｇ−アガロース（ベー
リンガーマンハイム）と共にインキュベートし、１２０００ｒｐｍでの短時間の
遠心分離を続けた。上清を、４０μｌプロテイン−Ｇ−アガロースおよびＲｅｔ
（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはパキシリン（Ｓｉｇｍａ）に対する１０μｇポ
リクローナル抗体と共に、一晩４℃で攪拌しながらインキュベートした。次いで
、プロテインＧ−アガロースコンプレックスを、短時間の遠心分離によって回収
し、そして２回溶解緩衝液中で洗浄した。結合されたタンパク質ペレットを、煮
沸によってＳＤＳゲル−ローディング緩衝液中で溶出させ、そしてタンパク質を
ＮｕＰａｇｅゲル電気泳動およびナイロン膜へのブロッティング続いて上記のよ
うな視覚化によって分離した。

【００６９】 インビトロ創傷治癒アッセイおよび改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバ分析 さらなる実験において、角膜上皮細胞移動および創傷治癒に対するＧＤＮＦの
効果を、インビトロ創傷治癒モデルにおいてならびに改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバ
アッセイにおいて研究した。

【００７０】 インビトロ創傷治癒アッセイのために、初代角膜上皮細胞および角膜上皮細胞
からの細胞を、２ｍｍグリッドを有する６０ｍｍプラスチックディッシュ（Ｓａ
ｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に５×１０⁵の密度で
播種し、そしてサブコンフルエンシー（subconfluency）まで２日間培養した。
アルテミンでの実験のために、初代培養化ウサギ角膜上皮細胞を使用した。これ
らの細胞は、Ｄｉｓｐａｓｅ（１，２Ｕ／ｍｌ）およびトリプシン／ＥＤＴＡを
用いて単離した。ウサギ細胞を、添加物を含む培地５００（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。

【００７１】 細胞層を、ソフトプラスチック細胞スクラバー（soft plastic cell scrubber
）（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いていくつかの平行な引っ掻きを誘導すること
によって、顕微鏡下で傷害を与えた。スクラバーの先端を切断し、そして約１ｍ
ｍ測定し、そして結果として細胞層における引っ掻きの幅はまた約１ｍｍであっ
た。ディッシュにおける選択した領域を、非常に細いマーカーペンでマークし、
そして連続イメージを、ビデオカメラを備えた逆位相差顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒ
ｔ ２５，Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下５×倍率で異なる時点で
撮った。実験的傷害に続いて、ディッシュを、成長因子を含まない（コントロー
ル）かあるいはＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）（大腸菌中で発現された組換えヒ
トＧＤＮＦ）、ＮＧＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＥＧＦ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むかのいずれ
かのＳＨＥＭ培地中でインキュベートした。アルテミンを研究する実験のために
、細胞を、添加物を含まない培地５００中で培養し、そして２５０ｎｇアルテミ
ンを添加した。各条件について、４つの代表的な領域を、３ディッシュ内で評価
した。各代表領域における引っ掻きの平均直径を、実験の開始で１００％として
設定した。１８時間後、同一引っ掻きの平均直径を再度計算し、そして実験の開
始での直径のパーセントで表現した。

【００７２】 どのシグナル伝達経路がこのモデルにおける角膜上皮移動に対するＧＤＮＦの
効果を媒介するかを決定するために、チロシンキナーゼインヒビターヘルビマイ
シンＡを、上述のように使用した。

【００７３】 角膜上皮細胞に対するＧＤＮＦの化学走化性効果をさらに評価するために、改
変Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイを使用した。初代培養細胞または角膜上皮細胞
株からの４×１０⁵細胞を、８μｍの孔サイズを有するポリエチレンテレフタレ
ートフィルター（Ｆａｌｃｏｎ）を含む組織培養挿入物上へ播種した。播種後４
時間以内に、殆どの細胞がフィルターへ付着し、そしてセミコンフルエントな単
層を形成した。次いで、培地を、上部ウェル中に添加物を含まないＳＨＥＭへ、
そして下部ウェル中にＧＤＮＦ（２５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＳＨＥＭへ交換した
。培養の２４時間後、細胞を、ラバーポリスマン（rubber policeman）を用いて
穏やかなスクラビング（scrubbing）によって挿入物の表面から除去した。挿入
物の下部における細胞（これは、フィルターを通って移動した）を、−２０℃メ
タノールで固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した。フィルターの全
表面を、顕微鏡下で細胞についてスクリーニングした。

【００７４】 統計分析 角膜増殖に対するＧＤＮＦの効果を調べる全ての実験は、異なるドナー由来の
細胞を用いて３重で行った。コロニー形成、コロニーサイズおよび細胞数に対す
る成長因子の影響を、これらのデータの一元配置の分散分析（one-way analysis
of variance）を使用して研究した。ｌｏｇトランスフォーメーションを、必要
である場合に使用して、これらのデータにおける分散および正規性の均質性（ho
mogeneity）に影響を及ぼした。スチューデントのｔ検定を使用して、分散の分
析後にどの差異が有意であったかを決定した。

【００７５】 患者 ４５才。左において大きな炎症を伴う角膜潰瘍。サイズが３．８×３．０ｍｍ
の上皮欠損、さらに角膜の厚みの８０％を含む穿孔（punched-out）欠損の形態
の角膜間質の潰瘍。角膜の痛覚なし、そして眼の顕著な付随する炎症。

【００７６】 治療 患者を、組換えヒト（ｒｈ）ＧＮＤＦ（０．２ｍｇ／ｍｌ）（２５μｌ／用量
）で、２時間間隔で４８時間処置し、次いで、用量を、１日当たり２０μｌ６回
へ減少させた。上皮の治癒後、濃度を０．１ｍｇ／ｍｌヘ減少させ、そして２０
μｌ用量を１日当たり５回与えた。投与のために、凍結乾燥組換えヒトＧＤＮＦ
を、無菌平衡塩類溶液（sterile balanced salt solution）に希釈した。

【００７７】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＧＤＮＦ（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ１９０
６３， Ｌ１５３０６）、アルテミン（配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋアクセッシ
ョン番号ＡＦ１０９４０１）、ペルセフィン(persephin)（配列番号４、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４０９６２）、ニュールツリン（配列番号３
、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７８１１０）および得られる一般的共通
配列（generic consensus sequence）（配列番号２）の保存された７システイン
領域の配列アラインメントである。配列番号２の共通配列において、Ｘは任意の
アミノ酸を意味し、そしてＹは任意アミノ酸のまたはアミノ酸が存在しないこと
を意味する。

【図２】 図２は、臭化エチジウムで染色したエクスビボ(ex vivo)角膜上皮（Ａ）およ
び間質（Ｂ）から抽出したｍＲＮＡから生じさせたｃＤＮＡから増幅されたＰＣ
Ｒ産物の１．８％アガロースゲル電気泳動を示す。上皮および間質の両方は、Ｎ
ＧＦ（２３３ｂｐ）（レーン１）、ＮＴ−３（２９８ｂｐ）（レーン２）、およ
びＢＤＮＦ（３７３ｂｐ）（レーン４）を発現した。ＮＴ−４（４６４ｂｐ）（
レーン３）は、角膜上皮においてのみ発現された。ＧＤＮＦ（３４３ｂｐ）（レ
ーン５）は、主として角膜間質において発現された。Ｍ＝ＤＮＡ分子量マーカー
（ＰｈｉＸ １７４ ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ Ｉフラグメント）。

【図３】 図３は、臭化エチジウムで染色したエクスビボ角膜上皮（Ａ）および間質（Ｂ
）から抽出したｍＲＮＡから生じさせたｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の１
．８％アガロースゲル電気泳動を示す。上皮および間質の両方は、ニューロトロ
フィンレセプターＴｒｋＡ（５７０ｂｐ）（レーン１）、ＴｒｋＢ（４７２ｂｐ
）（レーン２）、ＴｒｋＣ（４８４ｂｐ）（レーン３）およびＴｒｋＥ（５４５
ｂｐ）（レーン４）を発現した。Ｍ＝ＤＮＡ分子量マーカー（ＰｈｉＸ １７４
ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ Ｉフラグメント）。

【図４】 図４は、培養されたヒト角膜上皮細胞（Ａ）および間質性角膜実質細胞（Ｂ）
におけるＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナーゼレセ
プターの転写レベルの測定のためのＤＮＡドットブロット分析を示す。各ＤＮＡ
ドット１〜１０は、ＮＧＦ（レーン１）、ＮＴ−３（レーン２）、ＮＴ−４（レ
ーン３）、ＢＤＮＦ（レーン４）、ＧＤＮＦ（レーン５）、ＴｒｋＡ（レーン６
）、ＴｒｋＢ（レーン７）、ＴｒｋＣ（レーン８）、ＴｒｋＥ（レーン９）およ
びＧＡＰＤＨ（レーン１０）に特異的な０．１μｇＰＣＲドットを示す。ＮＴ−
４の転写は、培養されたヒト角膜上皮細胞株においてのみ検出可能であり、そし
てＧＤＮＦの転写は、主として、培養されたヒト角膜間質性角膜実質細胞におい
て検出可能であった。比較ために、レーン１０は、最も強いシグナルを示すポジ
ティブコントロールとしてのＧＡＰＤＨを示す。

【図５】 図５は、Ｄ６についての初代ウサギ角膜上皮細胞のコロニー形成に対する組換
えヒトＧＤＮＦの効果を示すダイアグラムである（平均値および標準偏差）。細
胞を、無血清ＭＣＤＢにおいてクローン密度（clonal density）に培養した。５
０または２００ｎｇ／ｍｌＧＤＮＦの添加によって、コロニーの全数の統計学的
に有意な（ｐ＜０．００５、^*）増加が生じた。

【図６】 図６は、Ｄ６についての初代ウサギ角膜上皮細胞のクローン増殖に対する組換
えヒトＧＤＮＦの効果を実証するダイアグラムを示す（平均値および標準偏差）
。ＧＤＮＦ（５０または２００ｎｇ／ｍｌ）の添加によって、１コロニー当たり
の細胞数の統計学的に有意な（ｐ＜０．００５、^*）増加が生じた。

【図７】 図７は、Ｄ６についての初代ヒト角膜間質細胞の増殖に対するＧＤＮＦの効果
を示すダイアグラムである。１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭにおける培養に続い
て、細胞を、ＦＢＳ無しのＤＭＥＭにおいて低密度でプレートし（plated）、そ
してさらに処理した。値は平均＋／−標準偏差（ＳＤ）として示めされる。ＧＤ
ＮＦは、コントロールと比較した場合の細胞密度を反映する吸光度の統計学的に
有意な誘導へ導いた（ｐ＜０．００５、^*）。

【図８】 図８は、培養化ヒト角膜上皮におけるＭＡＰキナーゼのリン酸化に対するＧＤ
ＮＦおよび他の神経栄養因子の効果を実証するウェスタンブロットを示す。リン
酸化ＥＲＫ１（４４ｋＤ）およびＥＲＫ２（４２ｋＤ）（Ａ）、全ＥＲＫ１およ
びＥＲＫ２（リン酸化および非リン酸化）（４４ｋＤおよび４２ｋＤ）（Ｂ）、
リン酸化ＪＮＫ１（４６ｋＤ）およびＪＮＫ２（５４ｋＤ）（Ｃ）に対する、な
らびに全ＪＮＫ１およびＪＮＫ２（リン酸化および非リン酸化）（４６ｋＤおよ
び５４ｋＤ）（Ｄ）に対する抗体を用いてのウェスタンブロットは、ＥＲＫ１お
よびより少ない程度のＥＲＫ２のリン酸化が、無血清コントロール培地で培養さ
れた細胞（レーン７）と比較して、ＧＤＮＦ（レーン５）、ＢＤＮＦ（レーン３
）またはＮＧＦ（レーン１）を含む培地において培養されたヒト上皮細胞におい
て誘導されたことを実証する。ＢＤＮＦによってではなくＮＧＦおよびＧＤＮＦ
によるＥＲＫ１のリン酸化は、ＭＥＫ−インヒビター ＰＤ ９８０５９（それ
ぞれ、レーン２、６および４）の添加によって阻害された。対照的に、ＪＮＫ１
／２は、コントロール（レーン４）と比較して、ＮＧＦ（レーン１）、ＢＤＮＦ
（レーン２）またはＧＤＮＦ（レーン３）によって誘導されなかった。

【図９】 図９は、培養されたヒト角膜間質性角膜実質細胞におけるＭＡＰキナーゼのリ
ン酸化に対するＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子の効果を実証するウェスタンブ
ロットを示す。リン酸化ＥＲＫ１（４４ｋＤ）およびＥＲＫ２（４２ｋＤ）（Ａ
）、全ＥＲＫ１およびＥＲＫ２（リン酸化および非リン酸化）（４４ｋＤおよび
４２ｋＤ）（Ｂ）、リン酸化ＪＮＫ１（４６ｋＤ）およびＪＮＫ２（５４ｋＤ）
（Ｃ）、ならびに全ＪＮＫ１およびＪＮＫ２（リン酸化および非リン酸化）（４
６ｋＤおよび５４ｋＤ）（Ｄ）に対する抗体を用いてのウェスタンブロットは、
ＥＲＫ１およびより少ない程度のＥＲＫ２のリン酸化が、無血清コントロール培
地（レーン７）またはＢＤＮＦ（レーン３）と比較して、ＧＤＮＦ（レーン５）
、及びＮＧＦ（レーン１）によって弱く誘導されたことを実証する。ＮＧＦおよ
びＧＤＮＦによるＥＲＫ１のリン酸化は、ＭＥＫ−インヒビター ＰＤ ９８０
５９（それぞれ、レーン２および６）の添加によって阻害された。ＢＤＮＦによ
るＥＲＫ１のリン酸化はＰＤ ９８０５９（レーン４）の添加時に変化しないま
まであった。ＪＮＫ１（Ｃ）のリン酸化は、無血清培地（レーン４）と比較して
、ＮＧＦ（レーン１）、ＢＤＮＦ（レーン２）およびＧＤＮＦ（レーン３）によ
って弱く誘導された。

【図１０】 図１０は、ＧＤＮＦでの局所処置の間の患者における上皮欠損のサイズの時間
経過を示すダイアグラムである。

【図１１】 図１１は、図１０においてのようにＧＤＮＦで処置した同一患者の角膜の中心
の写真を示す。ＧＤＮＦでの処置を開始する前の日に、大きな領域は可視であり
、これはイエローフルオレセインで標識化され得る。この領域は、上皮で覆われ
ていない（第ｄ０日）。３日後、上記からの上皮の増殖に起因する傷害を受けた
（injured）領域の顕著な減少が、観察され得る（ｄ３）。第１７日において、
フルオレセインで弱くのみ標識され得る小さな中心の欠損が、可視である（ｄ１
７）。処置の開始後２１日するとすぐに、創傷治癒の処置は、僅かな不規則性（
unregularities）を除いて、ほぼ完了される（ｄ２１）。

【図１２】 図１２は、ＧＤＮＦによるＲｅｔの時間依存チロシンリン酸化を実証するウェ
スタン−ブロット実験の写真である。培養された角膜上皮細胞（コントロール）
におけるリン酸化Ｒｅｔ（約１５０ｋＤ）のレベルは、ＧＤＮＦ（２００ｎｇ／
ｍｌ）（ｃｏ）の添加前に低く、そしてＧＤＮＦの添加後５分で増加し、１０分
および１５分後に高レベルのままであった。ヘルビマイシンＡで前処置しそして
ＧＤＮＦ（１０分）で刺激した細胞におけるＲｅｔのチロシンリン酸化は、ヘル
ビマイシン(herbimycin)Ａのインキュベーション無しの細胞よりもより低いレベ
ルのままである。ＩｇＧ（免疫ブロブリン）ブロットは、等量のＲｅｔ抗体が免
疫沈降のために使用されたことを示す。

【図１３】 図１３は、ＧＤＮＦによる細胞内シグナルの時間依存リン酸化を実証するウェ
スタン−ブロット実験の写真である。ＦＡＫ（約１３０ｋＤ）およびＰｙｋ２（
約１３０ｋＤ）のチロシンリン酸化、ｃＲａｆ（約８０ｋＤ）、ＭＥＫ１（４５
ｋＤ）およびＥｌｋ（約６０ｋＤ）のセリンリン酸化、ならびにＥｒｋ１（４４
ｋＤ）および２（４２ｋＤ）のチロシン／スレオニンリン酸化は、ＧＤＮＦへの
曝した後１０以内で誘導され、そして次の３０分にわたって徐々に増加された。
ｐ９０ＲＳＫ（９０ｋＤ）のリン酸化は、ＧＤＮＦ刺激に対する応答において誘
導されなかった。全タンパク質の等量（８０μｇ）が各レーンにおいてロードさ
れたことを示すために、全Ｅｒｋ（リン酸化および非リン酸化Ｅｒｋ１およびＥ
ｒｋ２）に対する抗体を用いてのブロットを示す。

【図１４】 図１４は、ヘルビマイシンＡによるＦＡＫ、ｃＲａｆおよびＥｒｋのＧＤＮＦ
−依存リン酸化の阻害を示すさらなるウェスタン−ブロット実験の写真である。
ＦＡＫのＧＤＮＦ−依存チロシンリン酸化、ｃＲａｆのセリンリン酸化およびＥ
ｒｋ１および２のチロシン／スレオニンリン酸化のレベルは、培養された角膜上
皮細胞において、２時間のヘルビマイシンＡでのプレインキュベーションに続い
て、全て有意に減少された。全Ｅｒｋ（リン酸化および非リン酸化Ｅｒｋ１およ
びＥｒｋ２）の量は、無変化のままであった。

【図１５】 図１５は、アルテミンによる細胞内シグナルの時間依存リン酸化を示すウェス
タンブロットの写真である。ＭＥＫ１（４５ｋＤ）のチロシンリン酸化は、コン
トロール細胞（レーン１）において非常に低かった。リン酸化は、アルテミン（
２５０ｎｇ／ｍｌ）への曝露後１０分（レーン２）、２０分（レーン３）そして
より顕著には４０分（レーン４）および６０分（レーン５）以内で誘導された。
Ｍ：分子量マーカー。

【図１６】 図１６は、アルテミンによる細胞内シグナルの時間依存リン酸化を実証するさ
らなるウェスタンブロットの写真である。Ｅｒｋ１および２のチロシン／スレオ
ニンリン酸化は、コントロール細胞（レーン１）において非常に低かった。リン
酸化は、アルテミン（２５０ｎｇ／ｍｌ）への曝露後１０分、２０分そしてより
顕著には４０分および６０分（レーン２〜５）以内で誘導された。

【図１７】 図１７は、セミ−コンフルエント（semi-confluent）単層における“創傷”の
インビトロ閉鎖に対するＧＤＮＦの効果を実証する実験のグラフ表示を示す。１
ｍｍ直径の引っ掻き“創傷”の閉鎖は、初代角膜上皮細胞（Ａ）およびＳＶ４０
−トランスフェクトされた角膜上皮細胞（Arraki-Sasakiら, 1995を参照のこと
）（Ｂ）の両方において、コントロール培養物（ｃｏ）と比較して、２５０ｎｇ
／ｍｌ ＧＤＮＦによって有意に（^*）（ｐ＜０．０１）促進された。創傷閉鎖は
、１８時間での代表的培養物における最初の創傷ギャップのパーセントとして表
現される。ＮＧＦおよびＥＧＦは、ポジティブコントロールとして役立つ。

【図１８】 図１８は、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバシステムにおける角膜上皮細胞移動に対
するＧＤＮＦの効果を実証する実験結果を示す。コントロール培地において、ほ
んの僅かな（１９±６．８）角膜上皮細胞が、上部チャンバからフィルターを通
って移動した［（Ａ）における写真；（Ｃ）におけるダイアグラム］。２５０ｎ
ｇ／ｍｌ ＧＤＮＦの下部チャンバへの添加によって、フィルターを通っての６
倍増の細胞移動が生じた（１１７±３７．６）（ｐ＜０．０００１）［（Ｂ）に
おける写真；（Ｃ）におけるダイアグラム］。

【図１９】 図１９は、セミ−コンフルエント単層における“創傷”のインビトロ閉鎖に対
するアルテミンの効果を示す実験のグラフ表示である。１ｍｍ直径の引っ掻き“
創傷”の閉鎖は、コントロール培養物（Ｋｏ）と比較して、１００ｎｇ／ｍｌお
よび２５０ｎｇ／ｍｌの濃度のアルテミンによって有意に（^*）（ｐ＜０．０１
）促進された。結果は、ウサギ角膜上皮細胞における実験の開始でのオリジナル
の創傷ギャップと比較しての％での創傷ギャップとして表現される。ＥＧＦの効
果は、ポジティブコントロールとして役立つ。

【図２０】 図２０は、角膜上皮細胞のインビトロ増殖に対するアルテミンの効果を示す実
験のグラフ表示である。コントロール（成長因子無しの培地ＭＣＤＢ１５１）と
比較しての、ポジティブコントロールとしての１０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦあるいは
１００または２５０ｎｇ／ｍｌの濃度でのアルテミンのいずれかでのインキュベ
ーションの１週間後の１ディッシュ当たりの細胞のコロニーが示される。

【図２１】 図２１は、角膜上皮細胞のインビトロ増殖に対するアルテミンの効果をさらに
例示する実験のグラフィック表示である。バーは、コントロール（成長因子無し
の培地ＭＣＤＢ１５１）と比較しての、ポジティブコントロールとしての１０ｎ
ｇ／ｍｌ ＥＧＦあるいは１００または２５０ｎｇ／ｍｌの濃度でのアルテミン
のいずれかでのインキュベーションの１週間後の１ディッシュ当たりの細胞数を
示す。

【図２２】 図２２は、ＧＤＮＦ分子によってトリガーされる（triggered）創傷治癒プロ
セスに関与するようであるシグナル伝達経路の略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 35/12 Ａ６１Ｋ 45/00 39/395 45/06 45/00 47/36 45/06 48/00 47/36 Ａ６１Ｐ 1/02 48/00 3/10 Ａ６１Ｐ 1/02 17/00 3/10 17/02 17/00 19/02 17/02 25/00 19/02 27/02 25/00 29/00 27/02 １０１ 29/00 31/00 １０１ 31/10 31/00 31/12 31/10 35/04 31/12 37/00 35/04 37/06 37/00 43/00 １０７ 37/06 １１１ 43/00 １０７ １２３ １１１ Ａ６１Ｋ 37/24 １２３ Ａ６１Ｆ 9/00 ５５０ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パウリスタ ミハエル ドイツ国 69181 リーメン イム ウイ ンゲルト 10 (72)発明者 ポール ジェンス ドイツ国 76707 ハンブリュッケン バ ストヴァルト 25 Ｆターム(参考） 4C076 AA06 AA07 BB01 BB11 BB13 BB24 CC01 CC04 CC05 CC07 CC10 CC16 CC18 CC19 CC20 CC29 CC31 CC35 EE37 FF01 FF11 FF31 4C084 AA02 AA03 AA13 AA17 AA19 AA23 BA44 DB52 DB53 DB54 DB55 DB70 MA02 MA16 MA28 MA52 MA58 MA66 NA12 NA14 ZA01 ZA33 ZA66 ZA89 ZA90 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB22 ZB31 ZB33 ZB35 ZC02 ZC35 ZC41 ZC75 4C085 AA13 BB17 CC21 EE03 GG01 GG02 GG08 4C086 AA01 AA02 DA10 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA16 MA28 MA52 MA58 MA63 MA66 NA12 NA14 ZA01 ZA33 ZA66 ZA89 ZA90 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB22 ZB31 ZB33 ZB35 ZC02 ZC35 ZC41 ZC75 4C087 AA01 AA02 BB63 MA02 MA16 MA28 MA52 MA58 MA66 NA12 NA14 ZA01 ZA33 ZA66 ZA89 ZA90 ZA96 ZB07 ZB08 ZB11 ZB15 ZB22 ZB31 ZB33 ZB35 ZC02 ZC35 ZC41 ZC75

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表皮および間質創傷治癒用ならびに／あるいは表皮および間
   質創傷治癒障害および／または瘢痕障害の処置用の薬学的組成物の製造のための
   、グリア細胞株由来成長因子（ＧＤＮＦ）またはその機能的に活性な誘導体もし
   くは部分および／またはＧＤＮＦの機能活性を代替するアゴニスト、ならびに／
   あるいはＧＤＮＦまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および／または
   該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含
   む核酸の使用。
2. 【請求項２】 前記薬学的組成物が、ヒト組換えＧＤＮＦまたはその機能的
   に活性な誘導体もしくは部分を含む、請求項１に記載の使用。
3. 【請求項３】 前記薬学的組成物が、ヒト野生型ＧＤＮＦをコードするヌク
   レオチド配列を少なくとも含む核酸を含む、請求項１に記載の使用。
4. 【請求項４】 前記薬学的組成物が、上皮および／または神経細胞に対する
   栄養効果を有するさらなる薬剤を少なくとも１つ含む、請求項１〜３のいずれか
   に記載の使用。
5. 【請求項５】 前記薬剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、ＧＤＦ、アクチビン／イ
   ンヒビン、ニューロトロフィン、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、
   ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、フィブロネクチンおよびその代謝産物から
   なる群から選択される、請求項４に記載の使用。
6. 【請求項６】 前記薬学的組成物が、抗炎症性効果を有するさらなる薬剤を
   少なくとも１つ含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
7. 【請求項７】 前記炎症性薬剤が、コルチゾンのアナログ、ＮＦ−κＢ経路
   のインヒビター、アラキドン酸経路のインヒビターおよびケモカインに対する抗
   体からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
8. 【請求項８】 前記薬学的組成物が、ＧＤＮＦまたはその機能的に活性な誘
   導体もしくは部分および／またはそのアゴニストを産生する細胞を含む、請求項
   １〜７のいずれかに記載の使用。
9. 【請求項９】 前記創傷が哺乳動物の前方眼（anterior eye）にある、請求
   項１〜８のいずれかに記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記創傷が、角膜上皮、間質および／または内皮にある、
    請求項９に記載の使用。
11. 【請求項１１】 前記角膜創傷が角膜潰瘍である、請求項１０に記載の使用
    。
12. 【請求項１２】 前記創傷および／または創傷治癒障害が、感染性疾患、湿
    潤障害（moistening disorders）、局所化または全身化免疫疾患、関連皮膚障害
    （associated dermal disorders）、全身性疾患の眼発現（ocular manifestatio
    n）、物理的傷害（physical injuries）、角膜ジストロフィーおよび変性（dege
    nerations）および／または外科的介入（surgical intervention）によって引き
    起こされる、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
13. 【請求項１３】 前記創傷または創傷治癒障害が、細菌感染、ウイルス感染
    、真菌感染角結膜炎、類天疱瘡、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、酒さ角
    膜炎（rosazea keratitis）、魚鱗癬、糖尿病、慢性関節リウマチ、クローン病
    （Ｍｏｒｂｕｓ Ｃｒｏｈｎ）、ヴェグナー病（Ｍｏｒｂｕｓ Ｗｅｇｎｅｒ）、
    エリテマトーデス（Lupus Erythematodes）、強皮症、テリエン変性（Terrien’
    s degeneration）、ザルツマン変性（Salzman’s degeneration）、フックスジ
    ストロフィー（Fuchs’ dystrophy）および／またはレーザー手術によって引き
    起こされる、請求項１２に記載の使用。
14. 【請求項１４】 前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および／ま
    たは希釈剤をさらに含有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
15. 【請求項１５】 前記担体が、ヒアルロン酸またはコンタクトレンズまたは
    シールド（shield）である、請求項１４に記載の使用。
16. 【請求項１６】 前記薬学的組成物が、経口的、局所的、静脈内および／ま
    たは非経口的に適用される、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用。
17. 【請求項１７】 前記局所適用のための薬学的組成物が、点眼剤、ゲル製剤
    、軟膏または眼注射用溶液として処方される、請求項１６に記載の使用。