JP2003512433A - 角膜欠陥を処置するためのgdnfの使用 - Google Patents
角膜欠陥を処置するためのgdnfの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、表皮および間質創傷治癒用の薬学的組成物の製造のための、グリア細胞株由来成長因子(GDNF)またはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および/またはGDNFの機能活性の代わりをするアゴニスト、ならびに/あるいはGDNFまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および/または該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸の使用に関する。
Description
【0001】
本発明は、表皮および間質創傷治癒用の薬学的組成物の製造のための、グリア
細胞株由来成長因子(GDNF)またはその機能的に活性な誘導体もしくは部分
および/またはGDNFの機能活性を代替するアゴニスト、ならびに/あるいは
GDNFまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および/または該アゴニ
ストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸の
使用に関する。
細胞株由来成長因子(GDNF)またはその機能的に活性な誘導体もしくは部分
および/またはGDNFの機能活性を代替するアゴニスト、ならびに/あるいは
GDNFまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および/または該アゴニ
ストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む核酸の
使用に関する。
【0002】
現在まで、角膜創傷治癒障害、特に角膜上皮の創傷治癒障害は、ある患者にお
いて処置可能でない。このような患者は、大抵、以下のような付随障害(accomp
anying disorders)に罹患している:神経栄養性眼疾患(例えば、損なわれた神
経供給(impaired nerve supply)の種々の形態)、感染性疾患(ウイルス疾患
、細菌疾患、真菌疾患、クラミジア疾患)、局所または全身免疫疾患(例えば、
アレルギー性、春化(vernal)、アトピー性角結膜炎)、リウマチ様眼疾患の種
々の形態(例えば、慢性関節リウマチのコンテクストにおいて、ヴェグナー病(
Morbus Wegner)、エリテマトーデス(Lupus Erythematodes)、強
皮症)、スティーヴェンズ−ジョンゾン症候群、関連皮膚疾患によって引き起こ
される疾患(例えば、酒さ(rosazea)、魚鱗癬)、湿潤障害(moistening diso
rders)(ドライアイの種々の形態)、眼瞼および睫毛の機能障害(impaired fu
nction)、および全身性疾患(例えば、糖尿病、痛風、クローン病(M.Cro
hn))、変性疾患の種々の形態(老人の、辺縁の(marginal)、透明の(pell
ucid)、テリエン(Terrien’s)、ザルツマン変性(Salzman’s degeneration
))、ジストロフィー性疾患(フックスジストロフィー(Fuchs’ dystrophy)
を含む、角膜の全3層の角膜ジストロフィー)ならびに隣接組織(結膜、強膜)
の種々の炎症。角膜創傷治癒障害についてのさらなる理由は、有機および無機材
料のための擦過傷、切断、裂傷のような眼表面への物理的傷害の全種類、さらに
固体、液体および気体材料によって誘導される化学的傷害ならびに火傷であり得
る。さらに、創傷治癒障害は、屈折矯正および治療レーザー手術の全スペクトル
(すなわち、エキシマー、赤外線およびNd:Yag)を含む医学および美容的
介入(intervention)ならびに屈折矯正および慣用医学手術(放射状角膜切開術
、LASIK、全層角膜移植のラメラのコンテクストにおける穿孔術)のコンテ
ストにおける機械的および非機械的切開によって誘導され得る。
いて処置可能でない。このような患者は、大抵、以下のような付随障害(accomp
anying disorders)に罹患している:神経栄養性眼疾患(例えば、損なわれた神
経供給(impaired nerve supply)の種々の形態)、感染性疾患(ウイルス疾患
、細菌疾患、真菌疾患、クラミジア疾患)、局所または全身免疫疾患(例えば、
アレルギー性、春化(vernal)、アトピー性角結膜炎)、リウマチ様眼疾患の種
々の形態(例えば、慢性関節リウマチのコンテクストにおいて、ヴェグナー病(
Morbus Wegner)、エリテマトーデス(Lupus Erythematodes)、強
皮症)、スティーヴェンズ−ジョンゾン症候群、関連皮膚疾患によって引き起こ
される疾患(例えば、酒さ(rosazea)、魚鱗癬)、湿潤障害(moistening diso
rders)(ドライアイの種々の形態)、眼瞼および睫毛の機能障害(impaired fu
nction)、および全身性疾患(例えば、糖尿病、痛風、クローン病(M.Cro
hn))、変性疾患の種々の形態(老人の、辺縁の(marginal)、透明の(pell
ucid)、テリエン(Terrien’s)、ザルツマン変性(Salzman’s degeneration
))、ジストロフィー性疾患(フックスジストロフィー(Fuchs’ dystrophy)
を含む、角膜の全3層の角膜ジストロフィー)ならびに隣接組織(結膜、強膜)
の種々の炎症。角膜創傷治癒障害についてのさらなる理由は、有機および無機材
料のための擦過傷、切断、裂傷のような眼表面への物理的傷害の全種類、さらに
固体、液体および気体材料によって誘導される化学的傷害ならびに火傷であり得
る。さらに、創傷治癒障害は、屈折矯正および治療レーザー手術の全スペクトル
(すなわち、エキシマー、赤外線およびNd:Yag)を含む医学および美容的
介入(intervention)ならびに屈折矯正および慣用医学手術(放射状角膜切開術
、LASIK、全層角膜移植のラメラのコンテクストにおける穿孔術)のコンテ
ストにおける機械的および非機械的切開によって誘導され得る。
【0003】
このような疾患のために、現在、利用可能な保存療法はなく、従って、頻繁に
、角膜の複雑かつ侵襲的な(invasive)移植を行わねばならない。同一の問題が
、角膜剥離へと導く物理的傷害に当てはまる。
、角膜の複雑かつ侵襲的な(invasive)移植を行わねばならない。同一の問題が
、角膜剥離へと導く物理的傷害に当てはまる。
【0004】
Lambiaseら(1998)によって行われた最初の研究は、マウスの顎下腺から単離
された神経成長因子(NGF)が神経栄養性角膜潰瘍の保存療法に適しているか
もしれないことを示すようである。しかし、マウスNGFは、非常に高用量で使
用されねばならず、複雑かつ非常に高価なプロセスによって単離されなければな
らずそして非ヒトタンパク質を示す。
された神経成長因子(NGF)が神経栄養性角膜潰瘍の保存療法に適しているか
もしれないことを示すようである。しかし、マウスNGFは、非常に高用量で使
用されねばならず、複雑かつ非常に高価なプロセスによって単離されなければな
らずそして非ヒトタンパク質を示す。
【0005】
従って、特に前方眼(anterior eye)における、創傷の治癒ならびに上皮およ
び間質組織の創傷治癒障害の処置のための保存療法のための新規のアプローチに
対する大きな要求が存在する。
び間質組織の創傷治癒障害の処置のための保存療法のための新規のアプローチに
対する大きな要求が存在する。
【0006】
従って、本発明の基礎をなす技術的課題は、特に前方眼における、上皮および
間質創傷の治癒障害の治癒ならびに処置のための新規なシステムを提供すること
にある。
間質創傷の治癒障害の治癒ならびに処置のための新規なシステムを提供すること
にある。
【0007】
上記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けられるような実
施形態を提供することによって達成される。
施形態を提供することによって達成される。
【0008】
特に、本発明は、表皮および間質創傷治癒用ならびに/あるいは表皮および間
質創傷治癒障害および/または瘢痕(scarring)障害の処置用の薬学的組成物の
製造のための、グリア細胞株由来成長因子(GDNF)またはその機能的に活性
な誘導体もしくは部分および/またはGDNFの機能活性を代替するアゴニスト
、ならびに/あるいはGDNFまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分お
よび/または該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
少なくとも含む核酸の使用に関する。
質創傷治癒障害および/または瘢痕(scarring)障害の処置用の薬学的組成物の
製造のための、グリア細胞株由来成長因子(GDNF)またはその機能的に活性
な誘導体もしくは部分および/またはGDNFの機能活性を代替するアゴニスト
、ならびに/あるいはGDNFまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分お
よび/または該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
少なくとも含む核酸の使用に関する。
【0009】
用語“グリア細胞株由来成長因子(GDNF)”は、GDNF、ニュールツリ
ン(neurturin)、ペルセフィン(persephin)、アルテミン(artemin)(エノ
ヴィン(enovin)またはノイブラスチン(neublastin)とも称される)および角
膜欠陥(corneal defects)を治癒し得る全てのタンパク質を指し、そしてその
アミノ酸配列は、少なくとも保存された7システイン領域(conserved seven cy
teine region)を含み、そしてヒトGDNF(配列番号1)の保存された7シス
テイン領域のアミノ酸配列と60%を超える同一性(identity)を共有する。本
発明の1つの実施形態によれば、用語“GDNF”は、図1において示されるジ
ェネリック(generic)アミノ酸配列(配列番号2)を少なくとも含むタンパク
質を含み、これは、GDNF(配列番号1)、ニュールツリン(配列番号3)、
ペルセフィン(配列番号4)およびアルテミン(配列番号5)の保存化7システ
イン領域から誘導され、そして角膜欠陥を治癒し得る。配列番号2において、X
は、任意のアミノ酸を意味し、そしてYは、任意のアミノ酸または削除されたア
ミノ酸を意味する。用語“機能的に活性な誘導体”および“機能的に活性な部分
”は、GDNFの生物学的機能の少なくとも一部を示すタンパク質性化合物をい
い、そして成熟GDNFに加えてアミノ酸配列を含むポリペプチド(例えば、p
roGDNFおよびpreproGDNF)、成熟GDNF自体ならびに野生型
GDNFポリペプチドの突然変異体を含む。本明細書中で使用される用語“突然
変異体”は、野生型GDNF一次アミノ酸配列(例えば、ヒト野生型GDNF配
列)における1以上のアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって得られ
るポリペプチドを含む。さらに、用語“GDNF”は、例えば、GenBank
アクセッション番号L19063、L15306に従うヒト野生型GDNFのア
ミノ酸配列を有する組換えヒトGDNFのような、組換えで作製されるポリペプ
チドを含む。
ン(neurturin)、ペルセフィン(persephin)、アルテミン(artemin)(エノ
ヴィン(enovin)またはノイブラスチン(neublastin)とも称される)および角
膜欠陥(corneal defects)を治癒し得る全てのタンパク質を指し、そしてその
アミノ酸配列は、少なくとも保存された7システイン領域(conserved seven cy
teine region)を含み、そしてヒトGDNF(配列番号1)の保存された7シス
テイン領域のアミノ酸配列と60%を超える同一性(identity)を共有する。本
発明の1つの実施形態によれば、用語“GDNF”は、図1において示されるジ
ェネリック(generic)アミノ酸配列(配列番号2)を少なくとも含むタンパク
質を含み、これは、GDNF(配列番号1)、ニュールツリン(配列番号3)、
ペルセフィン(配列番号4)およびアルテミン(配列番号5)の保存化7システ
イン領域から誘導され、そして角膜欠陥を治癒し得る。配列番号2において、X
は、任意のアミノ酸を意味し、そしてYは、任意のアミノ酸または削除されたア
ミノ酸を意味する。用語“機能的に活性な誘導体”および“機能的に活性な部分
”は、GDNFの生物学的機能の少なくとも一部を示すタンパク質性化合物をい
い、そして成熟GDNFに加えてアミノ酸配列を含むポリペプチド(例えば、p
roGDNFおよびpreproGDNF)、成熟GDNF自体ならびに野生型
GDNFポリペプチドの突然変異体を含む。本明細書中で使用される用語“突然
変異体”は、野生型GDNF一次アミノ酸配列(例えば、ヒト野生型GDNF配
列)における1以上のアミノ酸の挿入、欠失および/または置換によって得られ
るポリペプチドを含む。さらに、用語“GDNF”は、例えば、GenBank
アクセッション番号L19063、L15306に従うヒト野生型GDNFのア
ミノ酸配列を有する組換えヒトGDNFのような、組換えで作製されるポリペプ
チドを含む。
【0010】
本明細書中で使用される用語“アゴニスト”は、GDNFあるいはその機能的
に活性な誘導体または部分の機能活性を代替し得るタンパク質性または非タンパ
ク質性化合物を意味する。このようなアゴニストは、例えば、同一のレセプター
(例えば、それぞれ、retチロシンキナーゼレセプターおよびGDNFファミ
リーレセプターアルファ1〜4(GFRアルファ1〜4))へ結合することによ
って、および/またはこれらのレセプターの上流および/または下流の同一のト
ランスダクション経路に影響を与えることによって、GDNFの生物学的効果を
示し得る。
に活性な誘導体または部分の機能活性を代替し得るタンパク質性または非タンパ
ク質性化合物を意味する。このようなアゴニストは、例えば、同一のレセプター
(例えば、それぞれ、retチロシンキナーゼレセプターおよびGDNFファミ
リーレセプターアルファ1〜4(GFRアルファ1〜4))へ結合することによ
って、および/またはこれらのレセプターの上流および/または下流の同一のト
ランスダクション経路に影響を与えることによって、GDNFの生物学的効果を
示し得る。
【0011】
GDNFまたはそのアゴニストあるいはその機能的に活性な誘導体または部分
の機能的に活性な形態は、モノマー性形態またはマルチホモ−もしくはヘテロマ
ルチマー形態(例えば、二量体、三量体または他のオリゴマー性形態)であり得
る。
の機能的に活性な形態は、モノマー性形態またはマルチホモ−もしくはヘテロマ
ルチマー形態(例えば、二量体、三量体または他のオリゴマー性形態)であり得
る。
【0012】
用語“核酸”は、天然のまたは半合成の(semi-synthetic)または合成のまた
は修飾された核酸分子を意味し、これは、デオキシリボヌクレオチドおよび/ま
たはリボヌクレオチドおよび/または修飾されたヌクレオチドから構成され得る
。上記で定義される核酸は、上記で定義されるGDNFポリヌクレオチドあるい
はその機能的に活性な誘導体(例えば、突然変異体)または部分並びに/あるい
はその上記で定義されるタンパク質性アゴニストの一次アミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を少なくとも含む。本発明に従う核酸の例は、野生型ヒトG
DNFをコードするGenBankアクセッション番号NM 000514に従
うヌクレオチド配列を含む。本発明に従うヌクレオチド配列はまた、野生型配列
と比較して1以上のヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換から得られる
突然変異配列であり得る。
は修飾された核酸分子を意味し、これは、デオキシリボヌクレオチドおよび/ま
たはリボヌクレオチドおよび/または修飾されたヌクレオチドから構成され得る
。上記で定義される核酸は、上記で定義されるGDNFポリヌクレオチドあるい
はその機能的に活性な誘導体(例えば、突然変異体)または部分並びに/あるい
はその上記で定義されるタンパク質性アゴニストの一次アミノ酸配列をコードす
るヌクレオチド配列を少なくとも含む。本発明に従う核酸の例は、野生型ヒトG
DNFをコードするGenBankアクセッション番号NM 000514に従
うヌクレオチド配列を含む。本発明に従うヌクレオチド配列はまた、野生型配列
と比較して1以上のヌクレオチドの挿入、欠失および/または置換から得られる
突然変異配列であり得る。
【0013】
本発明に従う薬学的組成物はまた、遺伝子治療または細胞治療剤として使用さ
れ得る。従って、本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的組成物は、例えば
、上記で定義される核酸によって形質転換され、GDNFまたはその機能的に活
性な誘導体もしくは部分および/またはそのアゴニストを産生する、細胞を含む
。
れ得る。従って、本発明の好ましい実施形態によれば、薬学的組成物は、例えば
、上記で定義される核酸によって形質転換され、GDNFまたはその機能的に活
性な誘導体もしくは部分および/またはそのアゴニストを産生する、細胞を含む
。
【0014】
好ましくは、上記で定義される薬学的組成物は、上皮および/または神経細胞
に対して栄養効果を有するさらなる薬剤を少なくとも1つ含有する。このような
薬剤は、好ましくは、サイトカイン[例えばTGF−β(例えば、TGF−β1
、−β2および−β3)、BMP、GDF]およびTrkA、TrkBおよびT
rkCレセプターへ結合し得るサイトカイン[例えば、ニューロトロフィン(例
えば、NGF、NT−3、NT−4/5、BDNF、CDNF)]、retおよ
びGFRアルファ1−4のリガンド、EGF−レセプターのリガンド(EGF、
ヘパリン−結合EGF様成長因子(HB−EGF)、TGF−α)、線維芽細胞
成長因子ファミリーの種々のメンバー(FGF1〜5)、ケラチノサイト成長因
子(KGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血小板由来成長因子の種々のアイソ
フォーム(isoforms)(PDGF A、B、AB)ならびにインシュリン成長因
子のアイソフォーム(IGF−I、II)である。また、GDNFと組合せて上皮
および/または神経細胞に対して栄養効果を有するさらなる薬剤は、その全部と
してまたは部分として、好ましくはフィブロネクチンまたはその代謝物と組合せ
て使用され得るヒト血清の1以上であり得る。さらに、GDNFは、任意の種類
の抗炎症剤(例えば、コルチゾンおよびそのアナログのようなステロイド、アラ
キドン酸経路またはNF−κBシグナル伝達経路のインヒビターのような非ステ
ロイド剤、ならびにケモカインに対する抗体)と組合せて使用され得る。このよ
うなさらなる薬剤は、GDNF、上記に定義されるようなアゴニストおよび/ま
たは核酸と組合せて、相加的および/または相乗的効果を示し得る。
に対して栄養効果を有するさらなる薬剤を少なくとも1つ含有する。このような
薬剤は、好ましくは、サイトカイン[例えばTGF−β(例えば、TGF−β1
、−β2および−β3)、BMP、GDF]およびTrkA、TrkBおよびT
rkCレセプターへ結合し得るサイトカイン[例えば、ニューロトロフィン(例
えば、NGF、NT−3、NT−4/5、BDNF、CDNF)]、retおよ
びGFRアルファ1−4のリガンド、EGF−レセプターのリガンド(EGF、
ヘパリン−結合EGF様成長因子(HB−EGF)、TGF−α)、線維芽細胞
成長因子ファミリーの種々のメンバー(FGF1〜5)、ケラチノサイト成長因
子(KGF)、肝細胞成長因子(HGF)、血小板由来成長因子の種々のアイソ
フォーム(isoforms)(PDGF A、B、AB)ならびにインシュリン成長因
子のアイソフォーム(IGF−I、II)である。また、GDNFと組合せて上皮
および/または神経細胞に対して栄養効果を有するさらなる薬剤は、その全部と
してまたは部分として、好ましくはフィブロネクチンまたはその代謝物と組合せ
て使用され得るヒト血清の1以上であり得る。さらに、GDNFは、任意の種類
の抗炎症剤(例えば、コルチゾンおよびそのアナログのようなステロイド、アラ
キドン酸経路またはNF−κBシグナル伝達経路のインヒビターのような非ステ
ロイド剤、ならびにケモカインに対する抗体)と組合せて使用され得る。このよ
うなさらなる薬剤は、GDNF、上記に定義されるようなアゴニストおよび/ま
たは核酸と組合せて、相加的および/または相乗的効果を示し得る。
【0015】
本発明に従う使用のさらに好ましい実施形態によれば、治療されるか、または
創傷治癒障害のために通常の治療から妨げられる創傷は、哺乳動物の前方眼(an
terior eye)に局在される。より好ましくは、上記で定義される薬学的組成物は
、角膜上皮、間質および内皮創傷治癒および瘢痕(scarring)のためおよび/ま
たは角膜上皮、間質および内皮創傷治癒および瘢痕の処置のために使用される。
角膜創傷の特に好ましい例は、角膜潰瘍である。
創傷治癒障害のために通常の治療から妨げられる創傷は、哺乳動物の前方眼(an
terior eye)に局在される。より好ましくは、上記で定義される薬学的組成物は
、角膜上皮、間質および内皮創傷治癒および瘢痕(scarring)のためおよび/ま
たは角膜上皮、間質および内皮創傷治癒および瘢痕の処置のために使用される。
角膜創傷の特に好ましい例は、角膜潰瘍である。
【0016】
さらなる例として、上記に定義される創傷および/または創傷治癒障害は、以
下のような障害によって引き起こされる:神経栄養性眼疾患(例えば、損なわれ
た神経供給(impaired nerve supply)の種々の形態)、感染性疾患(ウイルス
疾患、細菌疾患、真菌疾患、クラミジア疾患)局所または全身免疫疾患(例えば
、アレルギー性、春化(vernal)、アトピー性角結膜炎)、リウマチ様眼疾患の
種々の形態(例えば、慢性関節リウマチのコンテクストにおいて、ヴェグナー病
(Morbus Wegner)、エリテマトーデス(Lupus Erythematodes)、
強皮症)、スティーヴェンズ−ジョンゾン症候群、関連皮膚疾患によって引き起
こされる疾患(例えば、酒さ(rosazea)、魚鱗癬)、湿潤障害(moistening di
sorders)(ドライアイの種々の形態)、眼瞼および睫毛の機能障害(impaired
function)、および全身性疾患(例えば、糖尿病、痛風、クローン病(M.Cr
ohn))、変性性疾患の種々の形態(老人の、辺縁の(marginal)、透明の(
pellucid)、テリエン(Terrien’s)、ザルツマン変性(Salzman’s degenerat
ion))、ジストロフィー性疾患(フックスジストロフィー(Fuchs’ dystrophy
)を含む、角膜の全3層の角膜ジストロフィー)ならびに隣接組織(結膜、強膜
)の種々の炎症。上記で明確にされるように角膜創傷治癒障害についてのさらな
る理由は、有機および無機材料のための擦過傷、切断、裂傷のような眼表面への
物理的傷害の全種類、さらに固体、液体および気体材料によって誘導される化学
的傷害ならびに火傷であり得る。さらに、創傷治癒障害は、屈折矯正および治療
レーザー手術の全スペクトル(すなわち、エキシマー、赤外線およびNd:Ya
g)を含む医学および美容的介入(intervention)ならびに屈折矯正および慣用
医学手術(放射状角膜切開術、LASIK、全層角膜移植のラメラのコンテクス
トにおける穿孔術)のコンテストにおける機械的および非機械的切開によって誘
導され得る。
下のような障害によって引き起こされる:神経栄養性眼疾患(例えば、損なわれ
た神経供給(impaired nerve supply)の種々の形態)、感染性疾患(ウイルス
疾患、細菌疾患、真菌疾患、クラミジア疾患)局所または全身免疫疾患(例えば
、アレルギー性、春化(vernal)、アトピー性角結膜炎)、リウマチ様眼疾患の
種々の形態(例えば、慢性関節リウマチのコンテクストにおいて、ヴェグナー病
(Morbus Wegner)、エリテマトーデス(Lupus Erythematodes)、
強皮症)、スティーヴェンズ−ジョンゾン症候群、関連皮膚疾患によって引き起
こされる疾患(例えば、酒さ(rosazea)、魚鱗癬)、湿潤障害(moistening di
sorders)(ドライアイの種々の形態)、眼瞼および睫毛の機能障害(impaired
function)、および全身性疾患(例えば、糖尿病、痛風、クローン病(M.Cr
ohn))、変性性疾患の種々の形態(老人の、辺縁の(marginal)、透明の(
pellucid)、テリエン(Terrien’s)、ザルツマン変性(Salzman’s degenerat
ion))、ジストロフィー性疾患(フックスジストロフィー(Fuchs’ dystrophy
)を含む、角膜の全3層の角膜ジストロフィー)ならびに隣接組織(結膜、強膜
)の種々の炎症。上記で明確にされるように角膜創傷治癒障害についてのさらな
る理由は、有機および無機材料のための擦過傷、切断、裂傷のような眼表面への
物理的傷害の全種類、さらに固体、液体および気体材料によって誘導される化学
的傷害ならびに火傷であり得る。さらに、創傷治癒障害は、屈折矯正および治療
レーザー手術の全スペクトル(すなわち、エキシマー、赤外線およびNd:Ya
g)を含む医学および美容的介入(intervention)ならびに屈折矯正および慣用
医学手術(放射状角膜切開術、LASIK、全層角膜移植のラメラのコンテクス
トにおける穿孔術)のコンテストにおける機械的および非機械的切開によって誘
導され得る。
【0017】
好ましくは、上記に定義される薬学的組成物は、さらに、薬学的に許容される
担体および/または希釈剤を含み、そして好ましくは経口、局所、静脈内および
/または非経口で適用され得る。従って、本発明に従う薬学的組成物中に使用さ
れ得る担体および/または希釈剤は、投与経路に依存し、これはまた、最終製剤
(例えば、軟膏、点眼剤、ゲル製剤または眼注射用溶液)に影響を与える。
担体および/または希釈剤を含み、そして好ましくは経口、局所、静脈内および
/または非経口で適用され得る。従って、本発明に従う薬学的組成物中に使用さ
れ得る担体および/または希釈剤は、投与経路に依存し、これはまた、最終製剤
(例えば、軟膏、点眼剤、ゲル製剤または眼注射用溶液)に影響を与える。
【0018】
本発明に従う薬学的組成物は、典型的に、薬学的有効量の、GDNFまたはそ
の機能的に活性な誘導体もしくは部分および/またはGDNFの機能活性を代替
するアゴニスト、ならびに/あるいはGDNFおよび/またはアゴニストの一次
アミノ酸配列をコードする上記に定義される核酸を、1以上の薬学的および生理
学的に許容可能な処方材料(例えば、担体および/または希釈剤)と組合せて含
む。さらなる製剤成分としては、抗酸化剤、保存剤、着色剤、矯味矯臭剤および
乳化剤、懸濁剤、溶媒、フィラー(fillers)、バルキング剤(bulking agents
)、緩衝液、送達ビヒクル、賦形剤および/または薬学的アジュバントが挙げら
れる。例えば、好適な担体またはビヒクルは、注射用水、生理食塩水、または好
適な担体タンパク質(例えば、血清アルブミン)と混合された生理食塩水であり
得る。
の機能的に活性な誘導体もしくは部分および/またはGDNFの機能活性を代替
するアゴニスト、ならびに/あるいはGDNFおよび/またはアゴニストの一次
アミノ酸配列をコードする上記に定義される核酸を、1以上の薬学的および生理
学的に許容可能な処方材料(例えば、担体および/または希釈剤)と組合せて含
む。さらなる製剤成分としては、抗酸化剤、保存剤、着色剤、矯味矯臭剤および
乳化剤、懸濁剤、溶媒、フィラー(fillers)、バルキング剤(bulking agents
)、緩衝液、送達ビヒクル、賦形剤および/または薬学的アジュバントが挙げら
れる。例えば、好適な担体またはビヒクルは、注射用水、生理食塩水、または好
適な担体タンパク質(例えば、血清アルブミン)と混合された生理食塩水であり
得る。
【0019】
薬学的組成物の溶媒または希釈剤は、水性または非水性のいずれかであり得、
そして製剤のpH、容量オスモル濃度(osmolarity)、粘度、透明性、スケール
、無菌性、安定性、溶解速度または臭いを調節および/または維持し得る他の薬
学的に許容される賦形剤を含み得る。同様に、他の成分が、薬学的に有効な物質
(例えば、GDNFタンパク質産物)の放出速度を調節および/または維持する
ためにあるいは上皮および/または間質細胞を通るその吸収または浸透を促進す
るために、本発明に従う薬学的組成物中に含まれ得る。このような調節成分は、
ユニットまたは複数用量のいずれかの形態での非経口投与のための薬用量(dosa
ges)を処方するために当該分野において通常使用される物質である。
そして製剤のpH、容量オスモル濃度(osmolarity)、粘度、透明性、スケール
、無菌性、安定性、溶解速度または臭いを調節および/または維持し得る他の薬
学的に許容される賦形剤を含み得る。同様に、他の成分が、薬学的に有効な物質
(例えば、GDNFタンパク質産物)の放出速度を調節および/または維持する
ためにあるいは上皮および/または間質細胞を通るその吸収または浸透を促進す
るために、本発明に従う薬学的組成物中に含まれ得る。このような調節成分は、
ユニットまたは複数用量のいずれかの形態での非経口投与のための薬用量(dosa
ges)を処方するために当該分野において通常使用される物質である。
【0020】
本発明に従う最終的に処方された薬学的組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、エマ
ルジョン、固体または脱水化もしくは凍結乾燥化粉末の形態で、無菌バイアル中
に保存され得る。これらの製剤は、使用準備のできている(ready-to-use)形態
または投与前に再構成が必要とされる形態(例えば、凍結乾燥粉末の場合)のい
ずれかで、保存され得る。
ルジョン、固体または脱水化もしくは凍結乾燥化粉末の形態で、無菌バイアル中
に保存され得る。これらの製剤は、使用準備のできている(ready-to-use)形態
または投与前に再構成が必要とされる形態(例えば、凍結乾燥粉末の場合)のい
ずれかで、保存され得る。
【0021】
上記のおよびさらなる好適な薬学的製剤は、当該分野で公知であり、そして、
例えば、Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., Mack Publishi
ng Co., Eastern, PA, 1990, 1425-1712) に記載される。このような製剤は、薬
学的に有効な成分(例えば、上記で定義されるような、GDNFタンパク質、ア
ゴニストおよび/または核酸)の、物理的状態(physical)、安定性、インビボ
放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。
例えば、Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., Mack Publishi
ng Co., Eastern, PA, 1990, 1425-1712) に記載される。このような製剤は、薬
学的に有効な成分(例えば、上記で定義されるような、GDNFタンパク質、ア
ゴニストおよび/または核酸)の、物理的状態(physical)、安定性、インビボ
放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。
【0022】
他の有効な投与形態は、非経口徐放性(すなわち、遅延化された)製剤、吸入
ミスト、または経口活性製剤を含む。例えば、徐放性製剤は、GDNFあるいは
その機能的に活性な誘導体または部分を含み得、これは、ポリマー性化合物(例
えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など)の粒状調製物またはリポソーム中へ結
合されるかまたは組み込まれ得る。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、
ヒアルロン酸が、薬学的に活性な成分(例えば、GDNF)のための担体として
使用され得、これは、循環において持続時間の促進効果を有し得る。本発明に従
う薬学的組成物はまた、例えば眼注入(ocular infusion)または注射による非
経口投与のために処方され得、そしてまた、徐放性(slow-release)または持続
化(sustained)循環製剤を含み得る。このような非経口投与される治療組成物
は、典型的に、薬学的に許容される担体および/または希釈剤中の薬学的に有効
な成分(単数または複数)(例えば、GDNF)を含む発熱物質無しの非経口的
に許容される水溶液の形態である。
ミスト、または経口活性製剤を含む。例えば、徐放性製剤は、GDNFあるいは
その機能的に活性な誘導体または部分を含み得、これは、ポリマー性化合物(例
えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など)の粒状調製物またはリポソーム中へ結
合されるかまたは組み込まれ得る。本発明のさらに好ましい実施形態によれば、
ヒアルロン酸が、薬学的に活性な成分(例えば、GDNF)のための担体として
使用され得、これは、循環において持続時間の促進効果を有し得る。本発明に従
う薬学的組成物はまた、例えば眼注入(ocular infusion)または注射による非
経口投与のために処方され得、そしてまた、徐放性(slow-release)または持続
化(sustained)循環製剤を含み得る。このような非経口投与される治療組成物
は、典型的に、薬学的に許容される担体および/または希釈剤中の薬学的に有効
な成分(単数または複数)(例えば、GDNF)を含む発熱物質無しの非経口的
に許容される水溶液の形態である。
【0023】
本発明に従う薬学的組成物の好ましい製剤は、眼科用液剤、懸濁液、軟膏およ
びゲル製剤を含む、典型的な眼科用製剤を含む。他の投与経路は、例えば、眼房
内部(interior chamber)へ直接または眼の悪い房(vicious chamber)中へ直
接なされ得る眼房内注射(intracameral injections)、結膜下(subconjunctiv
al)注射および眼球後(retrobulbal)注射である。
びゲル製剤を含む、典型的な眼科用製剤を含む。他の投与経路は、例えば、眼房
内部(interior chamber)へ直接または眼の悪い房(vicious chamber)中へ直
接なされ得る眼房内注射(intracameral injections)、結膜下(subconjunctiv
al)注射および眼球後(retrobulbal)注射である。
【0024】
好ましくは、本発明に従う薬学的組成物は、眼表面および眼球と眼瞼(eye li
d)との間の(外部)空間へ、すなわち眼球外投与(extra-ocular administrati
on)によって、投与され得る。眼球外領域の好ましい例としては、眼瞼円蓋また
は盲嚢(cul-de-sac)、結膜表面および、より好ましくは、角膜表面が挙げられ
る。この位置は、全ての眼組織に対して外でありそして、従って、侵襲的な(in
vasive)手技が、これらの領域へアクセスすることを必要としない。眼球外投与
の好ましい例としては、挿入物(inserts)ならびに典型的には、眼球外領域へ
治療材料を送達するために使用され得る適用される点眼剤、ゲル製剤または軟膏
が挙げられる。適用の他の可能な形態は、無機および/または有機材料から作製
された徐放性および/またはコンタクトシールド(contact shields)(例えば
、例えばコラーゲンから作製される生分解性シールド)、コンタクトレンズなら
びに人工および天然表面支持体(例えば、コラーゲンまたはプラスチックのよう
な人工材料の種々の形態から構成される羊膜の膜またはマトリックス(matrices
))である。このような眼球外デバイスは、一般的に、患者自身によってさえ容
易に除去される。
d)との間の(外部)空間へ、すなわち眼球外投与(extra-ocular administrati
on)によって、投与され得る。眼球外領域の好ましい例としては、眼瞼円蓋また
は盲嚢(cul-de-sac)、結膜表面および、より好ましくは、角膜表面が挙げられ
る。この位置は、全ての眼組織に対して外でありそして、従って、侵襲的な(in
vasive)手技が、これらの領域へアクセスすることを必要としない。眼球外投与
の好ましい例としては、挿入物(inserts)ならびに典型的には、眼球外領域へ
治療材料を送達するために使用され得る適用される点眼剤、ゲル製剤または軟膏
が挙げられる。適用の他の可能な形態は、無機および/または有機材料から作製
された徐放性および/またはコンタクトシールド(contact shields)(例えば
、例えばコラーゲンから作製される生分解性シールド)、コンタクトレンズなら
びに人工および天然表面支持体(例えば、コラーゲンまたはプラスチックのよう
な人工材料の種々の形態から構成される羊膜の膜またはマトリックス(matrices
))である。このような眼球外デバイスは、一般的に、患者自身によってさえ容
易に除去される。
【0025】
眼の前方部分における創傷治癒(例えば、角膜創傷)のための薬学的組成物に
特に好ましい製剤は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レンコポリマー、ポリサッカリド、タンパク質、ポリ(エチレンオキシド)、ア
クリルアミドポリマーおよびその誘導体または塩からなる群から選択され得るポ
リマーを含むポリマー性ゲル製剤である。このようなゲル製剤は、例えば米国特
許5,705,485に記載される。水溶性の薬学的または眼科的に適合性のポリマー性
材料を含むゲル製剤は、適用によって決定される種々の範囲内の薬学的組成物の
粘度に有利に影響し、何故ならば、製剤は、創傷部位への薬学的に活性な成分の
放出および増加した接触時間を制御し得るからである。ポリマー性材料を含有す
るゲル製剤の特に好ましい例は、ヒアルロン酸ゲル製剤である。ヒアルロン酸(
HA)は、N−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の二糖単位の繰り返し
からなる直鎖構造を有するムコ多糖類の1つである。HAは、天然、微生物にお
いてそして皮膚におけるヒトおよび動物の結合組織中において見られる。HAの
分子量は、供給源(source)、調製および測定法に依存して、50,000〜8
,000,000の範囲内にある。HAの粘性溶液は、潤滑(lubricating)特
性および優れた湿潤化(moisturizing)効果を有する。それは、関節の滑液、眼
球のガラス体、臍帯、皮膚、血管および軟骨において見られる。HAは、潤滑剤
および衝撃吸収剤として顕著に十分に機能し、そしてこれは、恐らく、その水保
持(water-retaining)能力およびある特定のタンパク質の連結するその親和性
に起因する。それは、人体内での内用のために非常に安全な分子であると考えら
れる。従って、それは、創傷治癒および創傷治癒障害(例えば、前方眼における
創傷)の処置のための、本発明に従う薬学的組成物において使用され得る。さら
に、HAの優れた潤滑特性および湿潤効果は、本発明に従う薬学的組成物のため
に非常に有利であり、これは、例えば、ドライアイの異なる形態によって引き起
こされる創傷治癒障害の処置のために使用され得る。好ましくは、ヒアルロン酸
は、薬学的組成物の総重量に基づいて、0.5〜5.0重量%の濃度で存在する
。このような濃度範囲は、好ましくは1〜1,000mPa・sの範囲にある粘
度を有する点眼剤として使用され得る低粘性溶液の製剤のために、そして他の形
態の適用(例えば、ソーキング包帯(soaking bandages))(ここで、粘度は好
ましくは1.0〜5,000mPa・sの範囲にある)のために、好適である。
特に好ましい製剤は、ビニルポリマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レンコポリマー、ポリサッカリド、タンパク質、ポリ(エチレンオキシド)、ア
クリルアミドポリマーおよびその誘導体または塩からなる群から選択され得るポ
リマーを含むポリマー性ゲル製剤である。このようなゲル製剤は、例えば米国特
許5,705,485に記載される。水溶性の薬学的または眼科的に適合性のポリマー性
材料を含むゲル製剤は、適用によって決定される種々の範囲内の薬学的組成物の
粘度に有利に影響し、何故ならば、製剤は、創傷部位への薬学的に活性な成分の
放出および増加した接触時間を制御し得るからである。ポリマー性材料を含有す
るゲル製剤の特に好ましい例は、ヒアルロン酸ゲル製剤である。ヒアルロン酸(
HA)は、N−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸の二糖単位の繰り返し
からなる直鎖構造を有するムコ多糖類の1つである。HAは、天然、微生物にお
いてそして皮膚におけるヒトおよび動物の結合組織中において見られる。HAの
分子量は、供給源(source)、調製および測定法に依存して、50,000〜8
,000,000の範囲内にある。HAの粘性溶液は、潤滑(lubricating)特
性および優れた湿潤化(moisturizing)効果を有する。それは、関節の滑液、眼
球のガラス体、臍帯、皮膚、血管および軟骨において見られる。HAは、潤滑剤
および衝撃吸収剤として顕著に十分に機能し、そしてこれは、恐らく、その水保
持(water-retaining)能力およびある特定のタンパク質の連結するその親和性
に起因する。それは、人体内での内用のために非常に安全な分子であると考えら
れる。従って、それは、創傷治癒および創傷治癒障害(例えば、前方眼における
創傷)の処置のための、本発明に従う薬学的組成物において使用され得る。さら
に、HAの優れた潤滑特性および湿潤効果は、本発明に従う薬学的組成物のため
に非常に有利であり、これは、例えば、ドライアイの異なる形態によって引き起
こされる創傷治癒障害の処置のために使用され得る。好ましくは、ヒアルロン酸
は、薬学的組成物の総重量に基づいて、0.5〜5.0重量%の濃度で存在する
。このような濃度範囲は、好ましくは1〜1,000mPa・sの範囲にある粘
度を有する点眼剤として使用され得る低粘性溶液の製剤のために、そして他の形
態の適用(例えば、ソーキング包帯(soaking bandages))(ここで、粘度は好
ましくは1.0〜5,000mPa・sの範囲にある)のために、好適である。
【0026】
本発明に従う薬学的組成物の好ましい実施形態によれば、薬学的に有効な成分
(例えば、GDNF、好ましくは組換えヒトGDNF)は、例えば液体製剤(例
えば、ゲル製剤または水に基づく製剤の場合、0.01〜1mg/mlの範囲の
濃度で存在し得る。
(例えば、GDNF、好ましくは組換えヒトGDNF)は、例えば液体製剤(例
えば、ゲル製剤または水に基づく製剤の場合、0.01〜1mg/mlの範囲の
濃度で存在し得る。
【0027】
本発明に従う薬学的組成物は、例えば液体製剤(例えば、ゲル製剤または局所
投与用の水に基づく製剤(例えば、点眼剤))の場合、5〜100μlの範囲の
用量で適用され得、そして1日当たり1回〜24回投与され得る。
投与用の水に基づく製剤(例えば、点眼剤))の場合、5〜100μlの範囲の
用量で適用され得、そして1日当たり1回〜24回投与され得る。
【0028】
本発明は、以下の非制限的な実施例によってさらに例示される。
【0029】
実施例
ヒト角膜におけるGDNFの転写
GDNFおよび他の神経栄養因子の転写は、RT−PCRによって、ヒト角膜
上皮(図2A)および間質(図2B)から新たに収穫された細胞において検出さ
れた。図2Aにおいて、代表的なRT−PCRの結果は、NGF(レーン1、2
33bp)、NT−3(レーン2、298bp)、NT−4(レーン3、464
bp)、BDNF(レーン4、373bp)の特異的cDNAフラグメントは、
エクスビボ(ex vivo)ヒト角膜上皮から増幅され得たことを示す。しかし、以
下に列挙されるプライマーを使用するGDNF(レーン5)の転写は、検出され
なかった。この結果は、初代培養上皮細胞およびSV40(Araki-Sasakiら,19
95)で不死化させたヒト角膜上皮細胞株由来のcDNAを使用する3つの独立の
実験によって確認された。対照的に、エクスビボ角膜間質はまた、GDNF(レ
ーン5、343bp)をコードするmRNAを含んだ(図2Bを参照)。しかし
、この組織において、NT−4(レーン3)の転写は、以下に列挙されるプライ
マーを使用して検出できなかった。RT−PCR実験の結果は、培養された角膜
間質性角膜実質細胞由来のcDNAが使用された場合に、同一であった。
上皮(図2A)および間質(図2B)から新たに収穫された細胞において検出さ
れた。図2Aにおいて、代表的なRT−PCRの結果は、NGF(レーン1、2
33bp)、NT−3(レーン2、298bp)、NT−4(レーン3、464
bp)、BDNF(レーン4、373bp)の特異的cDNAフラグメントは、
エクスビボ(ex vivo)ヒト角膜上皮から増幅され得たことを示す。しかし、以
下に列挙されるプライマーを使用するGDNF(レーン5)の転写は、検出され
なかった。この結果は、初代培養上皮細胞およびSV40(Araki-Sasakiら,19
95)で不死化させたヒト角膜上皮細胞株由来のcDNAを使用する3つの独立の
実験によって確認された。対照的に、エクスビボ角膜間質はまた、GDNF(レ
ーン5、343bp)をコードするmRNAを含んだ(図2Bを参照)。しかし
、この組織において、NT−4(レーン3)の転写は、以下に列挙されるプライ
マーを使用して検出できなかった。RT−PCR実験の結果は、培養された角膜
間質性角膜実質細胞由来のcDNAが使用された場合に、同一であった。
【0030】
上述のPCR産物の全てを、大腸菌へ形質転換し、そして配列決定した。Ge
n BankのBlastサーチプログラムを介しての公知の遺伝子との得られ
たDNA配列の比較によって、全ての実験において、予想される神経栄養因子と
の100%配列同一性が明らかとなった。
n BankのBlastサーチプログラムを介しての公知の遺伝子との得られ
たDNA配列の比較によって、全ての実験において、予想される神経栄養因子と
の100%配列同一性が明らかとなった。
【0031】
ヒト角膜におけるGDNFについて特異的なチロシンキナーゼレセプターの転
写 エクスビボ角膜上皮(図3A)および間質(図3B)はまた、神経栄養因子の
結合およびシグナル伝達に必要なチロシンキナーゼレセプターをコードするmR
NAを含んだ。
写 エクスビボ角膜上皮(図3A)および間質(図3B)はまた、神経栄養因子の
結合およびシグナル伝達に必要なチロシンキナーゼレセプターをコードするmR
NAを含んだ。
【0032】
図3Aは、エクスビボ角膜上皮からのTrkA(レーン1)(570 bp)
、TrkB(レーン2)(472 bp)、TrkC(レーン3)(484 b
p)およびTrkE(レーン4)(545 bp)に特異的なcDNAフラグメ
ントの増幅後のRT−PCR実験の結果を示す。図3Bは、エクスビボ角膜間質
からのmRNAを使用して同一結果を示す。培養された角膜上皮細胞(初代培養
物または角膜上皮細胞株)あるいは培養された角膜間質性角膜実質細胞を使用し
た場合、RT−PCRのスペクトルは変化しなかった。全ての上記Trk遺伝子
フラグメントをまた、クローニングし、配列決定し、そして、さらなる確認のた
めにBlastサーチプログラムによって分析した。
、TrkB(レーン2)(472 bp)、TrkC(レーン3)(484 b
p)およびTrkE(レーン4)(545 bp)に特異的なcDNAフラグメ
ントの増幅後のRT−PCR実験の結果を示す。図3Bは、エクスビボ角膜間質
からのmRNAを使用して同一結果を示す。培養された角膜上皮細胞(初代培養
物または角膜上皮細胞株)あるいは培養された角膜間質性角膜実質細胞を使用し
た場合、RT−PCRのスペクトルは変化しなかった。全ての上記Trk遺伝子
フラグメントをまた、クローニングし、配列決定し、そして、さらなる確認のた
めにBlastサーチプログラムによって分析した。
【0033】
培養されたヒト角膜上皮および間質性角膜実質細胞における、GDNFおよび
対応のチロシンキナーゼレセプターの転写のレベル 上記PCR実験の結果を確認するためにならびに遺伝子転写のレベルを評価す
る(estimate)ために、DNAドットブロット分析を行った(図4)。DNAド
ットブロットについてのハイブリダイゼーションプローブは、培養された上皮細
胞または間質性角膜実質細胞の1μg mRNAから生じた第1鎖(first-stran
d)cDNAであったので、DNAドットブロットの結果は、異なる細胞におけ
るGDNFおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナーゼレセプター
の転写レベルを評価しそして比較することを可能にする。図4Aは、ヒト角膜上
皮細胞株におけるGDNFおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナ
ーゼレセプターの転写レベルのスペクトルを示す。NGF(レーン1)、BDN
F(レーン4)およびTrkE(レーン9)の転写は、NT−3(レーン2)、
NT−4(レーン3)、TrkA(レーン6)、TrkB(レーン7)およびT
rkC(レーン8)のものよりも有意に弱かった。NT−3(レーン2)、NT
−4(レーン3)、TrkA(レーン6)、TrkB(レーン7)およびTrk
C(レーン8)の転写のレベルは、ポジティブコントロール(レーン10)とし
て使用されたGAPDHのものよりも低かった。GDNFは、上皮細胞において
転写されなかった(レーン5、図4A)が、培養された間質性角膜実質細胞にお
いて陽性のシグナルを示した(レーン5、図4B)。
対応のチロシンキナーゼレセプターの転写のレベル 上記PCR実験の結果を確認するためにならびに遺伝子転写のレベルを評価す
る(estimate)ために、DNAドットブロット分析を行った(図4)。DNAド
ットブロットについてのハイブリダイゼーションプローブは、培養された上皮細
胞または間質性角膜実質細胞の1μg mRNAから生じた第1鎖(first-stran
d)cDNAであったので、DNAドットブロットの結果は、異なる細胞におけ
るGDNFおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナーゼレセプター
の転写レベルを評価しそして比較することを可能にする。図4Aは、ヒト角膜上
皮細胞株におけるGDNFおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナ
ーゼレセプターの転写レベルのスペクトルを示す。NGF(レーン1)、BDN
F(レーン4)およびTrkE(レーン9)の転写は、NT−3(レーン2)、
NT−4(レーン3)、TrkA(レーン6)、TrkB(レーン7)およびT
rkC(レーン8)のものよりも有意に弱かった。NT−3(レーン2)、NT
−4(レーン3)、TrkA(レーン6)、TrkB(レーン7)およびTrk
C(レーン8)の転写のレベルは、ポジティブコントロール(レーン10)とし
て使用されたGAPDHのものよりも低かった。GDNFは、上皮細胞において
転写されなかった(レーン5、図4A)が、培養された間質性角膜実質細胞にお
いて陽性のシグナルを示した(レーン5、図4B)。
【0034】
培養された角膜上皮および間質におけるGDNFの機能的役割
GDNFは、角膜上皮細胞の増殖に有意な効果を有した。図5に示されるよう
に、ディッシュ当たりのコロニーの数は、組換えヒトGDNF(50ng、p<
0.05、および200ng、p<0.0001)の添加時に有意に増加した。
これは、コロニーを形成する角膜上皮細胞の能力がGDNFによって増強された
ことを示す。なおより重要なのは、クローン増殖に対する効果であり、これは、
各コロニー内の細胞数により反映される(図6)。角膜上皮細胞は、連続的に細
胞増殖へと入り、これは、D6において、非常に小さなコロニーから非常に大き
なものに及ぶコロニーのスペクトルを生じる結果となる。この観察は、比較的大
きな標準偏差(SD)および統計学的に意味のあるデータを得るために各ディッ
シュにおける多数のコロニー(75)をカウントする必要性を説明する。角膜上
皮細胞のクローン増殖は、図6に示されるように、GDNF(50および200
ng/ml、p<0.01)によって有意に刺激された。
に、ディッシュ当たりのコロニーの数は、組換えヒトGDNF(50ng、p<
0.05、および200ng、p<0.0001)の添加時に有意に増加した。
これは、コロニーを形成する角膜上皮細胞の能力がGDNFによって増強された
ことを示す。なおより重要なのは、クローン増殖に対する効果であり、これは、
各コロニー内の細胞数により反映される(図6)。角膜上皮細胞は、連続的に細
胞増殖へと入り、これは、D6において、非常に小さなコロニーから非常に大き
なものに及ぶコロニーのスペクトルを生じる結果となる。この観察は、比較的大
きな標準偏差(SD)および統計学的に意味のあるデータを得るために各ディッ
シュにおける多数のコロニー(75)をカウントする必要性を説明する。角膜上
皮細胞のクローン増殖は、図6に示されるように、GDNF(50および200
ng/ml、p<0.01)によって有意に刺激された。
【0035】
角膜上皮増殖に対する刺激性効果に加えて、20または100ng/mlのい
ずれかの濃度のGDNFは、図7に示されるように、間質性角膜実質細胞の増殖
を有意に促進した。これらのデータは、GDNFが、無血清培地におけるヒト間
質性角膜実質細胞の増殖を促進し得ることを示す。
ずれかの濃度のGDNFは、図7に示されるように、間質性角膜実質細胞の増殖
を有意に促進した。これらのデータは、GDNFが、無血清培地におけるヒト間
質性角膜実質細胞の増殖を促進し得ることを示す。
【0036】
培養された角膜上皮および間質性角膜実質細胞におけるMAPキナーゼのリン
酸化反応に対するGDNFの効果 MAPキナーゼシグナリングカスケードの活性化は、細胞増殖および分化に対
する種々の成長因子の効果を媒介するために必須である。従って、リン酸化MA
PキナーゼERKおよびJNKの細胞内蓄積は、神経栄養因子に対する応答にお
けるMAPキナーゼ経路の活性化についての指標である。シグナル伝達の蓄積と
、培養された角膜上皮細胞および培養された間質性角膜実質細胞の増殖に対する
GDNFの驚くべき効果の結果とを関連させるために、ヒト角膜上皮および間質
におけるMAPキナーゼカスケードのメンバーの誘導を研究した。シグナルがリ
ン酸化に対応していることを確実にするために、また、MAPキナーゼを阻害す
るインヒビターPD 98059を使用した。図8Aは、ERK1および2のリ
ン酸化形態が、培養されたヒト上皮細胞において誘導され得ることを示す。無血
清コントロール培地(レーン7)と比較して、200ng/mlの濃度のGDN
Fは、ERK1およびERK2のリン酸化を誘導した(レーン5)。この誘導は
、インヒビターPD 98059の添加によって妨げられた。リン酸化ERK1
およびERK2のレベルをまた、NGF(200ng/ml)(レーン1)によ
って増加され、そしてこの効果はまた、PD 98059によって妨げられ得た
。同様に、リン酸化ERK1およびERK2のレベルはまた、BDNF(200
ng/ml)(レーン3)によって増加されたが、この増加はPD 98059
によって阻害されなかった。図8B、CおよびDにおけるデータは、上記神経栄
養因子を用いてまたは用いずにインキュベートした場合のヒト角膜上皮細胞にお
ける、全(リン酸化および非リン酸化)ERK1およびERK2(図8B)、活
性化JNK1およびJNK2(図8C)ならびに全(リン酸化または非リン酸化
)JNK1およびJNK2(図8D)の同じ発現レベルを示す。この結果は、E
RK1およびERK2(しかしJNK1/2ではない)のリン酸化は、培養され
たウサギ角膜上皮細胞においてGDNFによって誘導され得ることを示す。
酸化反応に対するGDNFの効果 MAPキナーゼシグナリングカスケードの活性化は、細胞増殖および分化に対
する種々の成長因子の効果を媒介するために必須である。従って、リン酸化MA
PキナーゼERKおよびJNKの細胞内蓄積は、神経栄養因子に対する応答にお
けるMAPキナーゼ経路の活性化についての指標である。シグナル伝達の蓄積と
、培養された角膜上皮細胞および培養された間質性角膜実質細胞の増殖に対する
GDNFの驚くべき効果の結果とを関連させるために、ヒト角膜上皮および間質
におけるMAPキナーゼカスケードのメンバーの誘導を研究した。シグナルがリ
ン酸化に対応していることを確実にするために、また、MAPキナーゼを阻害す
るインヒビターPD 98059を使用した。図8Aは、ERK1および2のリ
ン酸化形態が、培養されたヒト上皮細胞において誘導され得ることを示す。無血
清コントロール培地(レーン7)と比較して、200ng/mlの濃度のGDN
Fは、ERK1およびERK2のリン酸化を誘導した(レーン5)。この誘導は
、インヒビターPD 98059の添加によって妨げられた。リン酸化ERK1
およびERK2のレベルをまた、NGF(200ng/ml)(レーン1)によ
って増加され、そしてこの効果はまた、PD 98059によって妨げられ得た
。同様に、リン酸化ERK1およびERK2のレベルはまた、BDNF(200
ng/ml)(レーン3)によって増加されたが、この増加はPD 98059
によって阻害されなかった。図8B、CおよびDにおけるデータは、上記神経栄
養因子を用いてまたは用いずにインキュベートした場合のヒト角膜上皮細胞にお
ける、全(リン酸化および非リン酸化)ERK1およびERK2(図8B)、活
性化JNK1およびJNK2(図8C)ならびに全(リン酸化または非リン酸化
)JNK1およびJNK2(図8D)の同じ発現レベルを示す。この結果は、E
RK1およびERK2(しかしJNK1/2ではない)のリン酸化は、培養され
たウサギ角膜上皮細胞においてGDNFによって誘導され得ることを示す。
【0037】
図9は、MAPキナーゼのリン酸化に対するGDNFの効果が、培養されたヒ
ト角膜間質性角膜実質細胞における神経栄養因子のものとは異なることを示す。
図9Aに示されるデータは、間質性角膜実質細胞(レーン7)におけるコントロ
ールと比較して、ERK1およびより少ない程度でのERK2のリン酸化が、2
00ng/ml NGF(レーン1)によって誘導され、そしてこの増加はPD
98059(レーン2)によって阻害されたことを示す。対照的に、200n
g/ml BDNFは、コントロール(レーン3)と比較してERK1またはE
RK2のリン酸化を誘導せず、そしてPD 98059(レーン4)で変化のな
いままであった。GDNF(200ng/ml)は、限られた程度までERK1
を誘導し(レーン5)、そしてこの増加はPD 98059(レーン6)によっ
て阻害された。図9Bは、全ERKが、無血清培地中でまたは上記神経栄養因子
とのいずれかで培養された間質性角膜実質細胞(stromal keratocyte)において同
一レベルに誘導されたことを示す。ERK1との比較において、間質性角膜実質
細胞における活性化JNK1および2の両方の発現は、比較的弱かった。僅かな
差異が、活性化JNK1の発現と関連して観察され得、これは、NGF(レーン
1)、BDNF(レーン2)またはGDNF(レーン3)で刺激された細胞にお
いてよりも、無血清DMEM(レーン4)中で培養された細胞においてより低か
った。BDNFは、JNK1(レーン2)の活性化に対して最も強い効果を有す
るようであった。間質性角膜実質細胞における活性化JNK2は、GDNF、N
GFまたはBDNFのいずれによっても誘導されなかった(図9c参照)。図9
Dは、全JNK1およびJNK2の発現が、培養条件に関わらず、間質性角膜実
質細胞において同一であることを示す。上記結果は、GDNF、NGFおよびB
DNFは、培養化ヒト間質性角膜実質細胞におけるERK1およびJNK1のリ
ン酸化形態の蓄積に対して異なる効果を有することを示す。
ト角膜間質性角膜実質細胞における神経栄養因子のものとは異なることを示す。
図9Aに示されるデータは、間質性角膜実質細胞(レーン7)におけるコントロ
ールと比較して、ERK1およびより少ない程度でのERK2のリン酸化が、2
00ng/ml NGF(レーン1)によって誘導され、そしてこの増加はPD
98059(レーン2)によって阻害されたことを示す。対照的に、200n
g/ml BDNFは、コントロール(レーン3)と比較してERK1またはE
RK2のリン酸化を誘導せず、そしてPD 98059(レーン4)で変化のな
いままであった。GDNF(200ng/ml)は、限られた程度までERK1
を誘導し(レーン5)、そしてこの増加はPD 98059(レーン6)によっ
て阻害された。図9Bは、全ERKが、無血清培地中でまたは上記神経栄養因子
とのいずれかで培養された間質性角膜実質細胞(stromal keratocyte)において同
一レベルに誘導されたことを示す。ERK1との比較において、間質性角膜実質
細胞における活性化JNK1および2の両方の発現は、比較的弱かった。僅かな
差異が、活性化JNK1の発現と関連して観察され得、これは、NGF(レーン
1)、BDNF(レーン2)またはGDNF(レーン3)で刺激された細胞にお
いてよりも、無血清DMEM(レーン4)中で培養された細胞においてより低か
った。BDNFは、JNK1(レーン2)の活性化に対して最も強い効果を有す
るようであった。間質性角膜実質細胞における活性化JNK2は、GDNF、N
GFまたはBDNFのいずれによっても誘導されなかった(図9c参照)。図9
Dは、全JNK1およびJNK2の発現が、培養条件に関わらず、間質性角膜実
質細胞において同一であることを示す。上記結果は、GDNF、NGFおよびB
DNFは、培養化ヒト間質性角膜実質細胞におけるERK1およびJNK1のリ
ン酸化形態の蓄積に対して異なる効果を有することを示す。
【0038】
インビトロおよび細胞培養データの要約
ヒトおよびウサギ角膜上皮および間質に対するGDNFおよび他の神経栄養因
子の効果ならびに関連する可能な伝達経路を研究するために、GDNF、NGF
、NT−3、NT−4、BDNFおよびレセプターTrkA〜Eの転写を、RT
−PCRによって研究した。DNAドットブロット分析により転写レベルの見積
もりが可能になった。組換え単一細胞増殖アッセイは組換えGDNFを使用して
行った。MAPキナーゼシグナル伝達を、活性化および全ERK1/2およびJ
NK1/2それぞれに対する抗体を使用して、ウェスタンブロット分析によって
研究した。
子の効果ならびに関連する可能な伝達経路を研究するために、GDNF、NGF
、NT−3、NT−4、BDNFおよびレセプターTrkA〜Eの転写を、RT
−PCRによって研究した。DNAドットブロット分析により転写レベルの見積
もりが可能になった。組換え単一細胞増殖アッセイは組換えGDNFを使用して
行った。MAPキナーゼシグナル伝達を、活性化および全ERK1/2およびJ
NK1/2それぞれに対する抗体を使用して、ウェスタンブロット分析によって
研究した。
【0039】
上記結果は、NGF、NT−3、BDNFおよびTrkA、TrkB、Trk
C、TrkEレセプターの転写が、エクスビボおよび培養された上皮および間質
の両方において検出され得ることを示す。対照的に、GDNFの転写は、間質に
おいて優勢に検出され、一方、NT−4の転写は、上皮においてのみ検出された
。転写レベルは、NT−3、NT−4およびTrkレセプターについてより高く
、そしてGDNF、NGFおよびBDNFについてより低かった。GDNFは、
上皮コロニー形成および増殖の両方を刺激した。間質性増殖は、無血清培地にお
いてGDNFによって増強された。上皮において、優勢なERK1が、GDNF
、NGFおよびBDNFによって活性化された。間質細胞において、GDNFお
よびNGFは、ERK1およびJNK1のリン酸化を刺激した。
C、TrkEレセプターの転写が、エクスビボおよび培養された上皮および間質
の両方において検出され得ることを示す。対照的に、GDNFの転写は、間質に
おいて優勢に検出され、一方、NT−4の転写は、上皮においてのみ検出された
。転写レベルは、NT−3、NT−4およびTrkレセプターについてより高く
、そしてGDNF、NGFおよびBDNFについてより低かった。GDNFは、
上皮コロニー形成および増殖の両方を刺激した。間質性増殖は、無血清培地にお
いてGDNFによって増強された。上皮において、優勢なERK1が、GDNF
、NGFおよびBDNFによって活性化された。間質細胞において、GDNFお
よびNGFは、ERK1およびJNK1のリン酸化を刺激した。
【0040】
これらの結果は、GDNFがヒト角膜において転写されることを示す。GDN
Fは、角膜上皮増殖を刺激する。GDNFは、上皮および間質細胞におけるER
K1およびJNK1のリン酸化に対して非常に特異的な効果を有する。GDNF
の差別的発現は、角膜のサイトカインネットワーク内での調節機能を示唆する。
GDNFは優勢に間質性角膜実質細胞で発現され、しかしそれは角膜上皮細胞の
増殖を刺激し、そして間質性角膜実質細胞の増殖はGDNFによってより少ない
程度に行われるという知見は、GDNFが上皮モジュレーターとしてその役割を
果たすことを示唆する。
Fは、角膜上皮増殖を刺激する。GDNFは、上皮および間質細胞におけるER
K1およびJNK1のリン酸化に対して非常に特異的な効果を有する。GDNF
の差別的発現は、角膜のサイトカインネットワーク内での調節機能を示唆する。
GDNFは優勢に間質性角膜実質細胞で発現され、しかしそれは角膜上皮細胞の
増殖を刺激し、そして間質性角膜実質細胞の増殖はGDNFによってより少ない
程度に行われるという知見は、GDNFが上皮モジュレーターとしてその役割を
果たすことを示唆する。
【0041】
ヒト患者における角膜潰瘍の治療
直接的に角膜上皮細胞の増殖に対するポジティブ効果を実証するために、左側
に大きな炎症を伴うを伴う角膜潰瘍に罹患する45才の患者を、組換えヒトGD
NFで処置した。処置の前に、患者は、異なる軟膏、点眼剤、コンタクトレンズ
でおよび血清点眼剤(serum drop)でまた、眼疾患専門の病院において6週間、不
成功に処置された。従って、患者は手術を受けなければならないと結論付けられ
た。しかし、患者を、2時間間隔で40時間0.2mg/ml(25μl/用量
)の濃度の組換えヒトGDNFで、次いで20μl/用量で1日6回処置した。
図10および11にそれぞれ示されるように、創傷治癒が、第2日から始まった
。それから上皮の創傷治癒が続き、そして治療の3週間後に完了した(図10)
。その上、間質の厚みの連続増加が観察され得た。さらに、上皮の治癒後、炎症
ならびに主観的苦痛の顕著な減少が得られた。
に大きな炎症を伴うを伴う角膜潰瘍に罹患する45才の患者を、組換えヒトGD
NFで処置した。処置の前に、患者は、異なる軟膏、点眼剤、コンタクトレンズ
でおよび血清点眼剤(serum drop)でまた、眼疾患専門の病院において6週間、不
成功に処置された。従って、患者は手術を受けなければならないと結論付けられ
た。しかし、患者を、2時間間隔で40時間0.2mg/ml(25μl/用量
)の濃度の組換えヒトGDNFで、次いで20μl/用量で1日6回処置した。
図10および11にそれぞれ示されるように、創傷治癒が、第2日から始まった
。それから上皮の創傷治癒が続き、そして治療の3週間後に完了した(図10)
。その上、間質の厚みの連続増加が観察され得た。さらに、上皮の治癒後、炎症
ならびに主観的苦痛の顕著な減少が得られた。
【0042】
Retのリン酸化は、培養された角膜上皮細胞において時間依存様式でGDN
Fによって誘導される GDNFでの刺激に続いて、GFRα−1は、細胞膜へRetを補充し(recr
uiting)、そしてそのレセプターチロシンキナーゼドメインを活性化させて膜レ
セプタータンパク質と細胞内シグナリングタンパク質との間でGDNFシグナル
を媒介する。Retが角膜上皮において発現されているかおよびGDNF−誘発
シグナリング経路に関与しているどうかを測定するために、抗−Ret抗体を使
用する免疫沈降(immuno-precipitation)続いてホスホ−チロシンに対するモノ
クローナル抗体でのウェスタンブロットを、リン酸化Retを検出するために行
った。図12は、リン酸化Retが、GDNFに応答して角膜上皮細胞中に時間
依存的に蓄積されたことを示す。無血清コントロール培養(co)との比較にお
いて、Retのチロシンリン酸化は、培養培地へのGDNF(200ng/ml
)の添加後5分以内で誘導された。Retのチロシンリン酸化は、15分にわた
って高レベルのままであった。比較において、ヘルビマイシン(herbimycin)−
前処理した細胞におけるリン酸化Retのレベルは、コントロール培養物におい
てよりも低くさえあった。これらの結果は、RetのGDNF−依存チロシンリ
ン酸化がチロシンキナーゼインヒビターヘルビマイシンAによって特異的に阻害
されることを示す。
Fによって誘導される GDNFでの刺激に続いて、GFRα−1は、細胞膜へRetを補充し(recr
uiting)、そしてそのレセプターチロシンキナーゼドメインを活性化させて膜レ
セプタータンパク質と細胞内シグナリングタンパク質との間でGDNFシグナル
を媒介する。Retが角膜上皮において発現されているかおよびGDNF−誘発
シグナリング経路に関与しているどうかを測定するために、抗−Ret抗体を使
用する免疫沈降(immuno-precipitation)続いてホスホ−チロシンに対するモノ
クローナル抗体でのウェスタンブロットを、リン酸化Retを検出するために行
った。図12は、リン酸化Retが、GDNFに応答して角膜上皮細胞中に時間
依存的に蓄積されたことを示す。無血清コントロール培養(co)との比較にお
いて、Retのチロシンリン酸化は、培養培地へのGDNF(200ng/ml
)の添加後5分以内で誘導された。Retのチロシンリン酸化は、15分にわた
って高レベルのままであった。比較において、ヘルビマイシン(herbimycin)−
前処理した細胞におけるリン酸化Retのレベルは、コントロール培養物におい
てよりも低くさえあった。これらの結果は、RetのGDNF−依存チロシンリ
ン酸化がチロシンキナーゼインヒビターヘルビマイシンAによって特異的に阻害
されることを示す。
【0043】
培養された角膜上皮細胞におけるGDNFによって誘発される細胞内シグナル
の時間依存活性化 どのシグナル伝達経路がGDNFによって誘導されるかどうかを決定するため
に、リン酸化タンパク質の各々に対する特異的抗体を用いてのウェスタンブロッ
トによって、FAKファミリーメンバーのGDNF−依存チロシンリン酸化およ
びMAPKシグナリング成分のGDNF−依存活性化を検出することが求められ
た。
の時間依存活性化 どのシグナル伝達経路がGDNFによって誘導されるかどうかを決定するため
に、リン酸化タンパク質の各々に対する特異的抗体を用いてのウェスタンブロッ
トによって、FAKファミリーメンバーのGDNF−依存チロシンリン酸化およ
びMAPKシグナリング成分のGDNF−依存活性化を検出することが求められ
た。
【0044】
FAKのチロシンリン酸化は、GDNFの存在下で40分で徐々に増加された
(図13)。ホスホ−チロシンキナーゼ2(Pyk2)、FAKファミリーの別
のメンバーがまた、GDNFへの引き続く曝露後40分内でリン酸化された(図
13)。
(図13)。ホスホ−チロシンキナーゼ2(Pyk2)、FAKファミリーの別
のメンバーがまた、GDNFへの引き続く曝露後40分内でリン酸化された(図
13)。
【0045】
MAPKシグナリングに関して、cRafは、MAPKキナーゼ(MKKK)
ファミリーに属し、そしてMAPKシグナルの伝播(propagation)のためのイ
ニシエーター(initiator)の役割を果たす。MAPKキナーゼ1(MEK1)
は、MKKKからMAPKの2つの成分Erk 1および2へのシグナリングカ
スケードを媒介するキータンパク質(key protein)である。Erkの活性化は
、そこでそれが転写アクチベータ(transcription activators)(例えば、El
k)をリン酸化する、核へのその輸送(translocation)を促進する。図13は
、全てのこれらのシグナリング成分はGDNFによって活性化されることを実証
する:cRaf、MEK1およびElkのセリンリン酸化ならびにErk 1お
よび2のチロシン/スレオニンリン酸化は、GDNFへの曝露後の既に10分以
内に全て顕著に誘導され、そしてリン酸化のレベルは、徐々に、観察期間にわた
って増加した(図13)。対照的に、GDNFに応答するRSKのリン酸化は、
検出可能でなかった(図13)。これらの結果は、GDNFによる遺伝子転写の
誘導は、FAK(Pyk2)−MAPK−Elk経路に依存していることを示す
。
ファミリーに属し、そしてMAPKシグナルの伝播(propagation)のためのイ
ニシエーター(initiator)の役割を果たす。MAPKキナーゼ1(MEK1)
は、MKKKからMAPKの2つの成分Erk 1および2へのシグナリングカ
スケードを媒介するキータンパク質(key protein)である。Erkの活性化は
、そこでそれが転写アクチベータ(transcription activators)(例えば、El
k)をリン酸化する、核へのその輸送(translocation)を促進する。図13は
、全てのこれらのシグナリング成分はGDNFによって活性化されることを実証
する:cRaf、MEK1およびElkのセリンリン酸化ならびにErk 1お
よび2のチロシン/スレオニンリン酸化は、GDNFへの曝露後の既に10分以
内に全て顕著に誘導され、そしてリン酸化のレベルは、徐々に、観察期間にわた
って増加した(図13)。対照的に、GDNFに応答するRSKのリン酸化は、
検出可能でなかった(図13)。これらの結果は、GDNFによる遺伝子転写の
誘導は、FAK(Pyk2)−MAPK−Elk経路に依存していることを示す
。
【0046】
細胞内シグナリングタンパク質のGDNF−依存リン酸化に対するヘルビマイ
シン(herbimycin)Aの効果 タンパク質−チロシンキナーゼインヒビターヘルビマイシンAでの細胞の処理
は、AFK、cRafおよびErkのGDNF−依存活性化の減少を生じさせた
。ウェスタンブロット分析は、培地への添加に続く30分以内のFAK、cRa
fおよびErkのGDNF−誘導化リン酸化を示す(図14)。しかし、角膜上
皮細胞がヘルビマイシンAの存在下で培養された場合、FAK、cRafおよび
ErkのGDNF−依存リン酸化は顕著に減少された(図14)。この文脈にお
いて、FAKのチロシンリン酸化だけでなくcRafのセリンリン酸化ならびに
Erk 1および2のチロシン/スレオニンリン酸化も、チロシンキナーゼイン
ヒビターヘルビマイシンAによって阻害されたことに注意されるべきである。こ
れは、cRaf−Erk経路の活性化は、上流レギュレーター(upstream regul
ator)を示すFAKのリン酸化に大いに依存することを示唆する。
シン(herbimycin)Aの効果 タンパク質−チロシンキナーゼインヒビターヘルビマイシンAでの細胞の処理
は、AFK、cRafおよびErkのGDNF−依存活性化の減少を生じさせた
。ウェスタンブロット分析は、培地への添加に続く30分以内のFAK、cRa
fおよびErkのGDNF−誘導化リン酸化を示す(図14)。しかし、角膜上
皮細胞がヘルビマイシンAの存在下で培養された場合、FAK、cRafおよび
ErkのGDNF−依存リン酸化は顕著に減少された(図14)。この文脈にお
いて、FAKのチロシンリン酸化だけでなくcRafのセリンリン酸化ならびに
Erk 1および2のチロシン/スレオニンリン酸化も、チロシンキナーゼイン
ヒビターヘルビマイシンAによって阻害されたことに注意されるべきである。こ
れは、cRaf−Erk経路の活性化は、上流レギュレーター(upstream regul
ator)を示すFAKのリン酸化に大いに依存することを示唆する。
【0047】
MEKのリン酸化は、アルテミンによって誘導される
250mg/mlアルテミンとのヒト角膜上皮細胞のインキュベーションは、
MEKのリン酸化の時間依存誘導を誘導した。図15におけるウェスタンブロッ
トは、コントロール(レーン1)における非常に低いレベルのリン酸化を示す。
10分、20分、40分および60分間の250ng/mlアルテミン(レーン
2〜5)での誘導は、角膜上皮細胞におけるリン酸化MEKの量の増加をもたら
した。図15における全てのレーンは、同一量のタンパク質でロードされた。
MEKのリン酸化の時間依存誘導を誘導した。図15におけるウェスタンブロッ
トは、コントロール(レーン1)における非常に低いレベルのリン酸化を示す。
10分、20分、40分および60分間の250ng/mlアルテミン(レーン
2〜5)での誘導は、角膜上皮細胞におけるリン酸化MEKの量の増加をもたら
した。図15における全てのレーンは、同一量のタンパク質でロードされた。
【0048】
Erk 1/2のリン酸化は、アルテミンによって誘導される
250mg/mlアルテミンでのヒト角膜上皮細胞のインキュベーションは、
Erk 1/2のリン酸化の時間依存誘導を誘導した。図16におけるウェスタ
ンブロットは、コントロール(レーン1)における非常に低いレベルのリン酸化
を示す。10分、20分、40分および60分間の250ng/mlアルテミン
(レーン2〜5)とのインキュベーションは、角膜上皮細胞におけるリン酸化E
rk 1および2の量を徐々に増加させた。図16における全てのレーンは、同
一量のタンパク質でロードされた。
Erk 1/2のリン酸化の時間依存誘導を誘導した。図16におけるウェスタ
ンブロットは、コントロール(レーン1)における非常に低いレベルのリン酸化
を示す。10分、20分、40分および60分間の250ng/mlアルテミン
(レーン2〜5)とのインキュベーションは、角膜上皮細胞におけるリン酸化E
rk 1および2の量を徐々に増加させた。図16における全てのレーンは、同
一量のタンパク質でロードされた。
【0049】
GDNFは、角膜上皮細胞の移動(migration)を誘導する
コントロール培地[添加剤なしのSHEM(Co)]における初代ヒト角膜上
皮細胞のサブコンフルエントな(subconfluent)単層における約1mm直径の引
っ掻き(scratch)“創傷”に続いて、細胞単層におけるギャップ(gap)の10
%未満が、18時間以内に細胞で満たされた[図17Aは、代表的な培養実験の
結果を示す]。GDNFまたはNGFの両方ならびにEGFの添加は、インビト
ロ創傷治癒の有意な増加を生じさせた。図17Aに示されるように、ギャップの
16.5%±6%が、250ng/ml GDNFの存在下で充填され、これは
、コントロールに対する有意な増加を示す(p<0.01)。
皮細胞のサブコンフルエントな(subconfluent)単層における約1mm直径の引
っ掻き(scratch)“創傷”に続いて、細胞単層におけるギャップ(gap)の10
%未満が、18時間以内に細胞で満たされた[図17Aは、代表的な培養実験の
結果を示す]。GDNFまたはNGFの両方ならびにEGFの添加は、インビト
ロ創傷治癒の有意な増加を生じさせた。図17Aに示されるように、ギャップの
16.5%±6%が、250ng/ml GDNFの存在下で充填され、これは
、コントロールに対する有意な増加を示す(p<0.01)。
【0050】
同様に、NGF(250ng/ml)またはEGF(10ng/ml)への細
胞の曝露は、ギャップの約20%の閉鎖(closure)(それぞれ、19.6%±
3.1および19.0%±8.6)を生じさせた。これらのデータは、NGFお
よびEGFはまた、コントロールとの比較において、創傷の閉鎖を有意に促進し
た(それぞれ、p<0.0001およびp<0.0001)ことを示す。
胞の曝露は、ギャップの約20%の閉鎖(closure)(それぞれ、19.6%±
3.1および19.0%±8.6)を生じさせた。これらのデータは、NGFお
よびEGFはまた、コントロールとの比較において、創傷の閉鎖を有意に促進し
た(それぞれ、p<0.0001およびp<0.0001)ことを示す。
【0051】
これらの結果は、図17Bに示されるように、SV−40形質転換化細胞株由
来の角膜上皮細胞を使用することによって確認された。コントロール培地[添加
剤なしのSHEM(Co)]において、細胞単層におけるギャップの20%±4
.5が、18時間後に満たされた。GDNF(250ng/ml)の存在下で、
ギャップの30%±6.9が満たされ、これは、コントロールと比較して有意な
増加を示す(p<0.001)。同様に、NGF(250ng/ml)またはE
GF 10ng/ml)のいずれかへの培養物の曝露は、細胞層におけるギャッ
プの27%±7.1および44.6±9%が、細胞で満たされた(それぞれ、p
<0.0001およびp<0.0001)ことを示した(図17B)。これらの
結果は、GDNFが角膜上皮細胞のセミコンフルエント(semiconfluent)単層
における“創傷”の閉鎖を有意に促進したこと、ならびにこの効果がNGFおよ
びEGFのそれと類似であったことを実証する。
来の角膜上皮細胞を使用することによって確認された。コントロール培地[添加
剤なしのSHEM(Co)]において、細胞単層におけるギャップの20%±4
.5が、18時間後に満たされた。GDNF(250ng/ml)の存在下で、
ギャップの30%±6.9が満たされ、これは、コントロールと比較して有意な
増加を示す(p<0.001)。同様に、NGF(250ng/ml)またはE
GF 10ng/ml)のいずれかへの培養物の曝露は、細胞層におけるギャッ
プの27%±7.1および44.6±9%が、細胞で満たされた(それぞれ、p
<0.0001およびp<0.0001)ことを示した(図17B)。これらの
結果は、GDNFが角膜上皮細胞のセミコンフルエント(semiconfluent)単層
における“創傷”の閉鎖を有意に促進したこと、ならびにこの効果がNGFおよ
びEGFのそれと類似であったことを実証する。
【0052】
細胞移動に対するGDNFの効果をさらに確認するために、改変Boyden
チャンバ分析を行った:コントロール培地(成長因子なしのSHEM)において
、ほんの少数の細胞(19±6.8)が、8μm孔サイズのフィルターを通って
移動した(図18A、C)。しかし、250ng/ml GDNFを改変Boy
denチャンバの下部ウェルへ添加した場合、フィルターの孔を通って移動した
細胞の数は6倍より多く増加した(117±37.6)(p<0.0001);
図18B、Cを参照。
チャンバ分析を行った:コントロール培地(成長因子なしのSHEM)において
、ほんの少数の細胞(19±6.8)が、8μm孔サイズのフィルターを通って
移動した(図18A、C)。しかし、250ng/ml GDNFを改変Boy
denチャンバの下部ウェルへ添加した場合、フィルターの孔を通って移動した
細胞の数は6倍より多く増加した(117±37.6)(p<0.0001);
図18B、Cを参照。
【0053】
GDNF−誘導された移動は、ヘルビマイシンAによって阻害される
創傷治癒の間のFAK−MAPK−シグナリング経路の重要性をさらに試験す
るために、GDNF−媒介細胞移動に対するヘルビマイシンAの効果を、インビ
トロ創傷治癒モデルにおいて研究した。ヘルビマイシンAは、GDNFの存在下
で細胞移動をブロックし得た。250ng/ml GDNFを有する代表的培養
において、創傷ギャップの37.9±8.1%が、18時間後に細胞で満たされ
た。GDNFおよび10μM ヘルビマイシンAの存在下で、ギャップの19.
2±5.5%のみが閉じられた(p<0.001)。
るために、GDNF−媒介細胞移動に対するヘルビマイシンAの効果を、インビ
トロ創傷治癒モデルにおいて研究した。ヘルビマイシンAは、GDNFの存在下
で細胞移動をブロックし得た。250ng/ml GDNFを有する代表的培養
において、創傷ギャップの37.9±8.1%が、18時間後に細胞で満たされ
た。GDNFおよび10μM ヘルビマイシンAの存在下で、ギャップの19.
2±5.5%のみが閉じられた(p<0.001)。
【0054】
アルテミンは、角膜上皮細胞の移動を誘導する
コントロール培地[添加剤なしの培地500(Co)]における初代ウサギ角
膜上皮細胞のサブコンフルエントな(subconfluent)単層における約1mm直径
の引っ掻き(scratch)“創傷”に続いて、細胞単層におけるギャップの約20
%が、6時間以内に細胞で満たされた[図19は、代表的な培養実験の結果を示
す]。アルテミン(100または250ng/ml)またはEGF(10ng/
ml)の両方の添加は、インビトロ創傷治癒の有意な増加を生じさせた。図19
に示されるように、ギャップの29±8%が、100ng/ml アルテミンの
存在下で満たされ、これは、コントロールに対して有意な増加を示す(p<0.
01)。同様に、250ng/mlアルテミンへの細胞曝露は、ギャップの約3
0%〜35%閉鎖を生じた。これらのデータは、アルテミンはまた、コントロー
ルとの比較において、創傷の閉鎖を有意に促進する(p<0.001)ことを示
す。
膜上皮細胞のサブコンフルエントな(subconfluent)単層における約1mm直径
の引っ掻き(scratch)“創傷”に続いて、細胞単層におけるギャップの約20
%が、6時間以内に細胞で満たされた[図19は、代表的な培養実験の結果を示
す]。アルテミン(100または250ng/ml)またはEGF(10ng/
ml)の両方の添加は、インビトロ創傷治癒の有意な増加を生じさせた。図19
に示されるように、ギャップの29±8%が、100ng/ml アルテミンの
存在下で満たされ、これは、コントロールに対して有意な増加を示す(p<0.
01)。同様に、250ng/mlアルテミンへの細胞曝露は、ギャップの約3
0%〜35%閉鎖を生じた。これらのデータは、アルテミンはまた、コントロー
ルとの比較において、創傷の閉鎖を有意に促進する(p<0.001)ことを示
す。
【0055】
アルテミンは、コロニー形成を促進し、そしてそれによって増殖を刺激する
図20は、第6日におけるウサギ角膜上皮細胞のコロニーの全数に対するアル
テミン(100ng/mlおよび250ng/ml)の効果を示す。コントロー
ル培養物(Co)は、平均40±20コロニーを含んだ。10ng/mlととも
にインキュベートした培養物は、平均58±18コロニー(p<0.01)を含
んだ。250ng/mlアルテミンの添加は、平均79±38培養物のコントロ
ールに対するコロニー数を有意に増加させた(p<0.01)。
テミン(100ng/mlおよび250ng/ml)の効果を示す。コントロー
ル培養物(Co)は、平均40±20コロニーを含んだ。10ng/mlととも
にインキュベートした培養物は、平均58±18コロニー(p<0.01)を含
んだ。250ng/mlアルテミンの添加は、平均79±38培養物のコントロ
ールに対するコロニー数を有意に増加させた(p<0.01)。
【0056】
アルテミンは、ディッシュ当たりの全数を増加させ、そしてそれによって角膜
上皮細胞の増殖を誘導する 図21は、アルテミンに応答する細胞数を示す。コントロール培養物において
、全部で200±98細胞が存在した。対照的に、250ng/mlアルテミン
の添加は、ディッシュ当たりの細胞の全数を有意に増加させた(p<0.001
)。これらのデータは、明確に、アルテミンがインビトロで角膜上皮細胞の増殖
を促進することを実証する。
上皮細胞の増殖を誘導する 図21は、アルテミンに応答する細胞数を示す。コントロール培養物において
、全部で200±98細胞が存在した。対照的に、250ng/mlアルテミン
の添加は、ディッシュ当たりの細胞の全数を有意に増加させた(p<0.001
)。これらのデータは、明確に、アルテミンがインビトロで角膜上皮細胞の増殖
を促進することを実証する。
【0057】
方法
エクスビボ角膜組織
新鮮なエクスビボ角膜上皮および間質を、インフォームドコンセントに従いそ
してDeclaration of Helsinkiの見解に従って、脈絡膜
メラノーマのための摘出を受けた8の眼から得た。摘出に続いて直ぐに、約8m
mの領域内の中心および中間−周辺(mid-peripherial)角膜上皮を、機械的ス
クラッピング(mechanical scraping)によって除去した。この領域内で、間質
の小さいサンプルを、ダイヤモンドブレードで切開した。組織サンプルを、ショ
ック−凍結させた(shock-frozen)。
してDeclaration of Helsinkiの見解に従って、脈絡膜
メラノーマのための摘出を受けた8の眼から得た。摘出に続いて直ぐに、約8m
mの領域内の中心および中間−周辺(mid-peripherial)角膜上皮を、機械的ス
クラッピング(mechanical scraping)によって除去した。この領域内で、間質
の小さいサンプルを、ダイヤモンドブレードで切開した。組織サンプルを、ショ
ック−凍結させた(shock-frozen)。
【0058】
細胞培養
Likorol(登録商標)(Chauvin−Opsia,Ablege
Cedex,France)中に24時間未満保存したヒト角膜を、Depar
tment of Ophthalmology,University of
Heidelberg,Medical School,Heidelber
g,Germanyのアイバンクを通して得た。全ての角膜は、移植クオリティ
ー(transplant quality)であったが、国際アイバンク規準に従う非眼(non-oc
ular)理由のために臨床使用からは除外された。上皮細胞および間質細胞の両方
を、Youら(1999)に記載される技術の僅かな改変を伴うアウトグロース培養
(outgrowth cultures)のように、プラスチックディッシュにおいて培養した。
RNA抽出のために、外植片培養を開始し、そしてSHEM培地[ウシ胎児血清
(FBS)を含むダルベッコの改変イーグル培地およびHam’s栄養混合物F
10の1:1混合物、Gibco,Grand Island,NY,USA]
、5μlインシュリンおよび10ng/ml EGF中、抗生物質なしで培養し
た(Arrak-Sakiら, 1995; Shimuraら, 1997を参照)。培養物の上皮表現型を、
サイトケラチンK12について特異的な抗体で染色することによって確認した。
この方法は、非常に限られた量の細胞のみを生成したので、本発明者らはまた、
SV 40アデノウイルス−形質転換角膜上皮細胞株を使用した(Arrak-Sakiら,
1995に記載される)。正常な角膜上皮と同様に、これらの細胞は、クローン成
長特性(clonal growth characteristics)を示し、そして例えばケラチンK1
2の発現を含む角膜上皮表現型を示した。細胞株を、Arrak-Sakiら(1995)およ
びShimuraら(1997)に記載されるようにSHEM培地において培養した。間質
性線維芽細胞を、Youら(1999)に記載されるようにDMEM+10%FBS
中で培養した。全ての実験を、三重で(in triplicate)そして異なるドナーか
ら得た細胞を用いて行った。
Cedex,France)中に24時間未満保存したヒト角膜を、Depar
tment of Ophthalmology,University of
Heidelberg,Medical School,Heidelber
g,Germanyのアイバンクを通して得た。全ての角膜は、移植クオリティ
ー(transplant quality)であったが、国際アイバンク規準に従う非眼(non-oc
ular)理由のために臨床使用からは除外された。上皮細胞および間質細胞の両方
を、Youら(1999)に記載される技術の僅かな改変を伴うアウトグロース培養
(outgrowth cultures)のように、プラスチックディッシュにおいて培養した。
RNA抽出のために、外植片培養を開始し、そしてSHEM培地[ウシ胎児血清
(FBS)を含むダルベッコの改変イーグル培地およびHam’s栄養混合物F
10の1:1混合物、Gibco,Grand Island,NY,USA]
、5μlインシュリンおよび10ng/ml EGF中、抗生物質なしで培養し
た(Arrak-Sakiら, 1995; Shimuraら, 1997を参照)。培養物の上皮表現型を、
サイトケラチンK12について特異的な抗体で染色することによって確認した。
この方法は、非常に限られた量の細胞のみを生成したので、本発明者らはまた、
SV 40アデノウイルス−形質転換角膜上皮細胞株を使用した(Arrak-Sakiら,
1995に記載される)。正常な角膜上皮と同様に、これらの細胞は、クローン成
長特性(clonal growth characteristics)を示し、そして例えばケラチンK1
2の発現を含む角膜上皮表現型を示した。細胞株を、Arrak-Sakiら(1995)およ
びShimuraら(1997)に記載されるようにSHEM培地において培養した。間質
性線維芽細胞を、Youら(1999)に記載されるようにDMEM+10%FBS
中で培養した。全ての実験を、三重で(in triplicate)そして異なるドナーか
ら得た細胞を用いて行った。
【0059】
全RNAの単離およびmRNA精製
全RNA(total RNA)を、Youら(1999)において記載されるようにPr
omega RNAgents(登録商標)全RNA単離システムキット(Prom
ega Co. Madison WI, USA)の使用によって、グアニジニウムチオシアナートフ
ェノール−クロロホルム抽出法(Chomczynskiら, 1987)に従って単離した。m
RNA単離のために、Promega polyATract(登録商標)シス
テムIIIを、Youら(1990)に記載されるように使用した。ゲノムDNAに
よる汚染の危険性を最小化するために、mRNAサンプルを、RNアーゼ無しD
Nアーゼによって消化し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽
出およびイソプロパノール沈殿を続けた。
omega RNAgents(登録商標)全RNA単離システムキット(Prom
ega Co. Madison WI, USA)の使用によって、グアニジニウムチオシアナートフ
ェノール−クロロホルム抽出法(Chomczynskiら, 1987)に従って単離した。m
RNA単離のために、Promega polyATract(登録商標)シス
テムIIIを、Youら(1990)に記載されるように使用した。ゲノムDNAに
よる汚染の危険性を最小化するために、mRNAサンプルを、RNアーゼ無しD
Nアーゼによって消化し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール抽
出およびイソプロパノール沈殿を続けた。
【0060】
PCRプライマーおよび逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)
PCRプライマー設計のために、公知のコーディング配列をGenBankか
ら取った。ニューロトロフィン遺伝子ファミリーおよびニューロトロフィンチロ
シンキナーゼレセプターファミリーの全ての公知のメンバーの配列の高い構造類
似性に起因して、オープンリーディングフレーム(open reading frames)にお
ける全ての配列を、Youら(1999)に記載のように多重配列アライメントプロ
グラム(multiple sequence alignment prog
ram)を使用して比較した。可能ならどんな場合でもプライマーをゲノム配列
の1以上のイントロンに及ぶように設計した:NGF:センス GAGGTGC
ATAGCGTAATGTCCA(配列番号 6)、およびアンチセンス TC
CACAGTAATGTTGCGGGTCT(配列番号7)(233bpの産物
)(GenBankアクセッション番号:V 0511、X 52599);N
T−3:センス TTACAGGTGACCAAGGTGATG(配列番号8)
、およびアンチセンス GCAGCAGTGCGGTGTCCATTG(配列番
号9)(298bpの産物)(GenBankアクセッション番号:M 377
63);NT−4:センス、CTCTTTCTGTCTCCAGGTGCTCC
G(配列番号10)、およびアンチセンス CGTTATCAGCCTTGCA
GCGGGTTTC(配列番号11)(464bpの産物)(GenBankア
クセッション番号:M 86528);BDNF:センス GTGAGTTTG
TGTGGACCCCGAG(配列番号12)およびアンチセンス CAGCA
GAAAGAGAAGAGGAGGC(配列番号13)(373bpの産物)(
Genbankアクセッション番号:X 60201、X 91251);GD
NF:センス GCCCTTCGCGTTGAGCAGTGAC(配列番号14
)およびアンチセンス CTCGTACGTTGTCTCAGCTGC(配列番
号15)(343bpの産物)(GenBankアクセッション番号:NM 0
00514);TrkA:センス GATGCTGCGAGGCGGACGGC
(配列番号16)およびアンチセンス CTGGCATTGGGCATGTGG
GC(配列番号17)(570bpの産物)(GenBankアクセッション番
号:M 23102);TrkB:センス TGCACCAACTATCACA
TTTCTCG(配列番号18)およびアンチセンス CACAGACGCAA
TCACTACCCA(配列番号19)(472bpの産物)(GenBank
アクセッション番号:S 76473);TrkC:センス ACTTCGGA
GCATTCAGCCCAGAG(配列番号20)およびアンチセンス ACT
CGTCACATTCACCAGCGTCAA(配列番号21)(484bpの
産物)(GenBankアクセッション番号:S 76475、U 05012
);TrkE:センス AGGAGTACTTCAGGTGGATC(配列番号
22)およびアンチセンス ACTGGAGAAGCTGTGGTTGCT(配
列番号23)(545bpの産物)(GenBankアクセッション番号:X
74979)。
ら取った。ニューロトロフィン遺伝子ファミリーおよびニューロトロフィンチロ
シンキナーゼレセプターファミリーの全ての公知のメンバーの配列の高い構造類
似性に起因して、オープンリーディングフレーム(open reading frames)にお
ける全ての配列を、Youら(1999)に記載のように多重配列アライメントプロ
グラム(multiple sequence alignment prog
ram)を使用して比較した。可能ならどんな場合でもプライマーをゲノム配列
の1以上のイントロンに及ぶように設計した:NGF:センス GAGGTGC
ATAGCGTAATGTCCA(配列番号 6)、およびアンチセンス TC
CACAGTAATGTTGCGGGTCT(配列番号7)(233bpの産物
)(GenBankアクセッション番号:V 0511、X 52599);N
T−3:センス TTACAGGTGACCAAGGTGATG(配列番号8)
、およびアンチセンス GCAGCAGTGCGGTGTCCATTG(配列番
号9)(298bpの産物)(GenBankアクセッション番号:M 377
63);NT−4:センス、CTCTTTCTGTCTCCAGGTGCTCC
G(配列番号10)、およびアンチセンス CGTTATCAGCCTTGCA
GCGGGTTTC(配列番号11)(464bpの産物)(GenBankア
クセッション番号:M 86528);BDNF:センス GTGAGTTTG
TGTGGACCCCGAG(配列番号12)およびアンチセンス CAGCA
GAAAGAGAAGAGGAGGC(配列番号13)(373bpの産物)(
Genbankアクセッション番号:X 60201、X 91251);GD
NF:センス GCCCTTCGCGTTGAGCAGTGAC(配列番号14
)およびアンチセンス CTCGTACGTTGTCTCAGCTGC(配列番
号15)(343bpの産物)(GenBankアクセッション番号:NM 0
00514);TrkA:センス GATGCTGCGAGGCGGACGGC
(配列番号16)およびアンチセンス CTGGCATTGGGCATGTGG
GC(配列番号17)(570bpの産物)(GenBankアクセッション番
号:M 23102);TrkB:センス TGCACCAACTATCACA
TTTCTCG(配列番号18)およびアンチセンス CACAGACGCAA
TCACTACCCA(配列番号19)(472bpの産物)(GenBank
アクセッション番号:S 76473);TrkC:センス ACTTCGGA
GCATTCAGCCCAGAG(配列番号20)およびアンチセンス ACT
CGTCACATTCACCAGCGTCAA(配列番号21)(484bpの
産物)(GenBankアクセッション番号:S 76475、U 05012
);TrkE:センス AGGAGTACTTCAGGTGGATC(配列番号
22)およびアンチセンス ACTGGAGAAGCTGTGGTTGCT(配
列番号23)(545bpの産物)(GenBankアクセッション番号:X
74979)。
【0061】
第一鎖cDNA(first-strand cDNA)を、Youら(1999)に記載のように
合成した。PCRを0.5μlの一本鎖cDNAを、3ユニットのThermu
s aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオ
チドの混合物(最終濃度0.2mM)、10×PCR緩衝液(5μl)および2
5pモルのセンスおよびアンチセンスプライマー(総容量50μlで)と共に使
用して行った(全ての試薬は、Takara Shuzo Co.,Ltd.,
Japanからであった)。緩衝液中のMgCl2の最終濃度は、1.5mMで
あった。PTC−100programmable thermocycler
(MJ Research,Watertown,MA,USA)を95℃で3
分間使用した(前変性(predenaturation))。次いで、1分間94℃での変性
、1分間55℃でのアニーリングおよび1分間72℃での伸長を含む35サイク
ルを行った。
合成した。PCRを0.5μlの一本鎖cDNAを、3ユニットのThermu
s aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオ
チドの混合物(最終濃度0.2mM)、10×PCR緩衝液(5μl)および2
5pモルのセンスおよびアンチセンスプライマー(総容量50μlで)と共に使
用して行った(全ての試薬は、Takara Shuzo Co.,Ltd.,
Japanからであった)。緩衝液中のMgCl2の最終濃度は、1.5mMで
あった。PTC−100programmable thermocycler
(MJ Research,Watertown,MA,USA)を95℃で3
分間使用した(前変性(predenaturation))。次いで、1分間94℃での変性
、1分間55℃でのアニーリングおよび1分間72℃での伸長を含む35サイク
ルを行った。
【0062】
PCR産物を、0.5μg/ml臭化エチジウムで染色した1.8%アガロー
ス/1×TAEゲルを使用する、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画化
(size-fractionated)した。全てのPCRフラグメントをpCR 2.1ベクタ
ー(Invitrogen Corp.,San Diego,CA,USA)
へクローニングし、そして配列を標準方法によって確認した。
ス/1×TAEゲルを使用する、アガロースゲル電気泳動によってサイズ分画化
(size-fractionated)した。全てのPCRフラグメントをpCR 2.1ベクタ
ー(Invitrogen Corp.,San Diego,CA,USA)
へクローニングし、そして配列を標準方法によって確認した。
【0063】
培養された角膜の遺伝子転写レベルの検出のためのDNAドットブロット分析
培養された上皮間質細胞における転写レベルを評価するために、DNAドット
ブロット分析を行った。十分な量のヒト角膜上皮細胞を培養することは不可能で
あったので、角膜上皮細胞株を、角膜上皮の供給源として使用した。神経栄養因
子ファミリーおよびTrkレセプター遺伝子に対応するクローン化PCRフラグ
メントを、上述のプライマーを使用して増殖させ、そしてアガロースゲルから精
製した。0.1μg PCR産物を、ドットとしてのナイロン膜上へロードした
。高用量プローブを生じさせるために、1μg mRNAを、培養された上皮お
よび間質細胞から単離し、そしてジゴキシゲニン−標識化第一鎖cDNAの合成
のためにジゴキシゲニンプローブ合成ミックス(digoxygenin probe synthesis
mix)(Boehringer Mannheim,Mannheim,Ger
many製)で転写した。次いで、DNAブロットを、40℃で一晩DIG E
asyHyb Buffer(Boehringer Mannheim)中で
ジゴキシゲニン−標識化cDNAプローブで、プレハイブリダイズおよびハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄後、ブロットを、製造業者の
説明に従ってBoehringer Mannheim製のDIG洗浄キットで
処理し、そしてELC−フィルム(Amersham Life Scienc
e,Little Chalfont,UK)へ曝した。比較のために、還元グ
リセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードする
cDNAフラグメントをポジティブコントロールとして使用した。
ブロット分析を行った。十分な量のヒト角膜上皮細胞を培養することは不可能で
あったので、角膜上皮細胞株を、角膜上皮の供給源として使用した。神経栄養因
子ファミリーおよびTrkレセプター遺伝子に対応するクローン化PCRフラグ
メントを、上述のプライマーを使用して増殖させ、そしてアガロースゲルから精
製した。0.1μg PCR産物を、ドットとしてのナイロン膜上へロードした
。高用量プローブを生じさせるために、1μg mRNAを、培養された上皮お
よび間質細胞から単離し、そしてジゴキシゲニン−標識化第一鎖cDNAの合成
のためにジゴキシゲニンプローブ合成ミックス(digoxygenin probe synthesis
mix)(Boehringer Mannheim,Mannheim,Ger
many製)で転写した。次いで、DNAブロットを、40℃で一晩DIG E
asyHyb Buffer(Boehringer Mannheim)中で
ジゴキシゲニン−標識化cDNAプローブで、プレハイブリダイズおよびハイブ
リダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄後、ブロットを、製造業者の
説明に従ってBoehringer Mannheim製のDIG洗浄キットで
処理し、そしてELC−フィルム(Amersham Life Scienc
e,Little Chalfont,UK)へ曝した。比較のために、還元グ
リセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)をコードする
cDNAフラグメントをポジティブコントロールとして使用した。
【0064】
培養した角膜における神経栄養因子によって誘導されるMAPキナーゼシグナ ル伝達経路の成分の研究
培養された角膜上皮および間質性角膜実質細胞におけるシグナル伝達経路の活
性化に対するGDNFおよび他の神経栄養因子の効果を評価するために、ウェス
タンブロットを、GDNF、NGFおよびBDNFの存在下でのリン酸化MAP
キナーゼ ERKおよびJNKの蓄積を検出するために行った。ヒト間質性角膜
実質細胞を、1日間、L−グルタミンを含有するRPMI 1640培地(gl
utaMAX)あるいは10%FBSを含むDMEM中で培養し、そして別の日
の間、無血清培地中で飢餓状態にさせた(starved)。次いで、培養物をPBS
で洗浄し、そして添加剤を含まないかあるいは組換えヒトGDNF(200ng
/ml)、組換えヒトNGF(200ng/ml)および組換えヒトBDNF(
200ng/ml)(全てR&D Systems,Mineapolis,M
N,USAから得た)を含む無血清DMEM中で30分間インキュベートした。
いくつかの培養物を、1時間100μMのMAPキナーゼのインヒビター(PD
98059、Torcris Cookson Ballwin,MO,US
A)と共にインキュベートし、その後ニューロトロフィンへ曝した。PBSで洗
浄後、培養細胞を、50mM Tris−Cl(pH8.0)、150mM N
aCl、0.02%アジ化ナトリウム、100μg/ml PMSF、1% Tr
iton X−100およびいくつかのタンパク質インヒビターの混合物を含む
溶解緩衝液中に溶解した(Complete(登録商標)、Boehringe
r Mannheim)(1タブレット/50ml緩衝液)。レーン当たり50
μg全タンパク質を、10% STS−MOPS NUPAGE Bis−トリ
スゲル(NOVEX,San Diego,CA,USA)によって分画化し、
そしてニトロセルロース膜上へブロットした。膜(membranes)を、ERK1、
ERK2、JNK1およびJNK2に対する希釈化ポリクローナル抗体で染色し
た(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cru
z,CA,USA)。また、ERK1およびERK2のいずれかの不活性化形態
を認識するポリクローナル抗体を使用し、これは、哺乳動物ERK2のリン酸化
スレオニン残基183およびチロシン残基185の触媒コア(catalytic core)
に対して惹起された。同様に、JNK1およびJNK2のリン酸化形態を認識す
るポリクローナル抗体を使用した(両方ともPromegaから)。最終工程に
おいて、膜を、ECLウェスタンブロット分析システム(Amersham)を
用いて視覚化した。
性化に対するGDNFおよび他の神経栄養因子の効果を評価するために、ウェス
タンブロットを、GDNF、NGFおよびBDNFの存在下でのリン酸化MAP
キナーゼ ERKおよびJNKの蓄積を検出するために行った。ヒト間質性角膜
実質細胞を、1日間、L−グルタミンを含有するRPMI 1640培地(gl
utaMAX)あるいは10%FBSを含むDMEM中で培養し、そして別の日
の間、無血清培地中で飢餓状態にさせた(starved)。次いで、培養物をPBS
で洗浄し、そして添加剤を含まないかあるいは組換えヒトGDNF(200ng
/ml)、組換えヒトNGF(200ng/ml)および組換えヒトBDNF(
200ng/ml)(全てR&D Systems,Mineapolis,M
N,USAから得た)を含む無血清DMEM中で30分間インキュベートした。
いくつかの培養物を、1時間100μMのMAPキナーゼのインヒビター(PD
98059、Torcris Cookson Ballwin,MO,US
A)と共にインキュベートし、その後ニューロトロフィンへ曝した。PBSで洗
浄後、培養細胞を、50mM Tris−Cl(pH8.0)、150mM N
aCl、0.02%アジ化ナトリウム、100μg/ml PMSF、1% Tr
iton X−100およびいくつかのタンパク質インヒビターの混合物を含む
溶解緩衝液中に溶解した(Complete(登録商標)、Boehringe
r Mannheim)(1タブレット/50ml緩衝液)。レーン当たり50
μg全タンパク質を、10% STS−MOPS NUPAGE Bis−トリ
スゲル(NOVEX,San Diego,CA,USA)によって分画化し、
そしてニトロセルロース膜上へブロットした。膜(membranes)を、ERK1、
ERK2、JNK1およびJNK2に対する希釈化ポリクローナル抗体で染色し
た(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cru
z,CA,USA)。また、ERK1およびERK2のいずれかの不活性化形態
を認識するポリクローナル抗体を使用し、これは、哺乳動物ERK2のリン酸化
スレオニン残基183およびチロシン残基185の触媒コア(catalytic core)
に対して惹起された。同様に、JNK1およびJNK2のリン酸化形態を認識す
るポリクローナル抗体を使用した(両方ともPromegaから)。最終工程に
おいて、膜を、ECLウェスタンブロット分析システム(Amersham)を
用いて視覚化した。
【0065】
角膜上皮および間質細胞の増殖に対するGDNFの効果の研究
角膜増殖に対するGDNFの効果を評価するために、組換えヒトGDNFを使
用した(R&D,Minneapolis,MN,USA)。角膜上皮増殖に対
する効果を評価するために、単一細胞クローン成長モデルを使用し、これは、コ
ロニー形成およびクローン拡張(clonal expansion)の両方に対する所与の成長
因子の効果を測定することを可能にする(Kruseら, 1991)。ニュージーランド
ホワイトウサギを、ARVO Resolution of Animals
in Researchに従ってそしてGerman Federal Law
sおよびState of Baden−Wurttembergの法律を遵守
して、収容および処置した。ペントバルビタールの静脈内過剰用量(overdose)
での犠牲の前に、それらは、キシラジンヒドロクロリド(xylazine hydrochlori
de)およびケタミンヒドロクロリドの筋肉内注射を受けた。クローン成長アッセ
イの詳細は、Kruseら(1991)に記載される。5000生存細胞が、イ
ンシュリン(5μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、セレン(5
ng/ml)およびヒドロコルチゾン(5μg/ml)(全てSigma,De
isenhofen,Germanyから)の補足物(S)を含む無血清培地M
CDB151中の各16mmディッシュにおいて播種された。この播種密度は、
ディッシュ当たりのコロニー数ならびにコロニーあたりの細胞数の測定によって
位相差顕微鏡(第6日)下で定量され得る単一細胞クローン成長を生じさせた。
この定量は、およそ2mm幅である底上にグリット(grit)を含んだディッシュ
(Sarstedt,Newton,NC,USA製)の使用によって促進され
た。データ収集のために、各条件についての4つのランダムに選択されたディッ
シュの全表面積をスクリーニングした。さらに、コロニー当たりの細胞数を、各
条件についての75のランダムに選択されたコロニー中で測定した。さらに、細
胞の全数/ディッシュを計算し、アルテミンについての評価を行った。細胞増殖
を刺激するために、GDNF(50または200ng/ml)またはアルテミン
(250ng/ml)を、培地へ添加した。12日後(隣接するコロニーが互い
へと増殖し始め、そして従って数での定量を妨げる時)の増殖速度を評価するた
めに、ディッシュを−20℃メタノールで固定し、そしてメチレンブルーで染色
した。
用した(R&D,Minneapolis,MN,USA)。角膜上皮増殖に対
する効果を評価するために、単一細胞クローン成長モデルを使用し、これは、コ
ロニー形成およびクローン拡張(clonal expansion)の両方に対する所与の成長
因子の効果を測定することを可能にする(Kruseら, 1991)。ニュージーランド
ホワイトウサギを、ARVO Resolution of Animals
in Researchに従ってそしてGerman Federal Law
sおよびState of Baden−Wurttembergの法律を遵守
して、収容および処置した。ペントバルビタールの静脈内過剰用量(overdose)
での犠牲の前に、それらは、キシラジンヒドロクロリド(xylazine hydrochlori
de)およびケタミンヒドロクロリドの筋肉内注射を受けた。クローン成長アッセ
イの詳細は、Kruseら(1991)に記載される。5000生存細胞が、イ
ンシュリン(5μg/ml)、トランスフェリン(5μg/ml)、セレン(5
ng/ml)およびヒドロコルチゾン(5μg/ml)(全てSigma,De
isenhofen,Germanyから)の補足物(S)を含む無血清培地M
CDB151中の各16mmディッシュにおいて播種された。この播種密度は、
ディッシュ当たりのコロニー数ならびにコロニーあたりの細胞数の測定によって
位相差顕微鏡(第6日)下で定量され得る単一細胞クローン成長を生じさせた。
この定量は、およそ2mm幅である底上にグリット(grit)を含んだディッシュ
(Sarstedt,Newton,NC,USA製)の使用によって促進され
た。データ収集のために、各条件についての4つのランダムに選択されたディッ
シュの全表面積をスクリーニングした。さらに、コロニー当たりの細胞数を、各
条件についての75のランダムに選択されたコロニー中で測定した。さらに、細
胞の全数/ディッシュを計算し、アルテミンについての評価を行った。細胞増殖
を刺激するために、GDNF(50または200ng/ml)またはアルテミン
(250ng/ml)を、培地へ添加した。12日後(隣接するコロニーが互い
へと増殖し始め、そして従って数での定量を妨げる時)の増殖速度を評価するた
めに、ディッシュを−20℃メタノールで固定し、そしてメチレンブルーで染色
した。
【0066】
培養された間質性角膜実質細胞の増殖に対するGDNFの効果を研究するため
に、細胞を、5×104細胞/60mmディッシュの密度で、DMEM+10%
FBSからDMEM+1%FBSへまたはFBSを含まないDMEMへ継代培養
した(passaged)。いくつかの培養物は、上述の濃度の組換えヒトGDNFを受
容した。増殖を、位相差顕微鏡(1条件当たり100×倍率で50フィールド(f
ield))下で細胞ならびにトリプシン化(trypsinized)細胞をカウントすること
によって6日後測定した。また、Cell Titer 96 AQueous
One Solution増殖アッセイ(Promega)を、製造業者の説
明書に従って行った。この比色アッセイのために、500または1000細胞を
、96−ウェル−プレート(Falcon)において6日間増殖させた。培養ウ
ェルへの添加時に、ティトラゾリウム(titrazolium)染料を、細胞によって着
色したホルマザン産物(formazan product)へ生物還元し(bioreduced)、そし
て吸光度を490nmで定量する。ホルマザン産物の量は、ウェル中の生存して
いる細胞の数に比例し、そして従って増殖を評価するに役立ち得る。
に、細胞を、5×104細胞/60mmディッシュの密度で、DMEM+10%
FBSからDMEM+1%FBSへまたはFBSを含まないDMEMへ継代培養
した(passaged)。いくつかの培養物は、上述の濃度の組換えヒトGDNFを受
容した。増殖を、位相差顕微鏡(1条件当たり100×倍率で50フィールド(f
ield))下で細胞ならびにトリプシン化(trypsinized)細胞をカウントすること
によって6日後測定した。また、Cell Titer 96 AQueous
One Solution増殖アッセイ(Promega)を、製造業者の説
明書に従って行った。この比色アッセイのために、500または1000細胞を
、96−ウェル−プレート(Falcon)において6日間増殖させた。培養ウ
ェルへの添加時に、ティトラゾリウム(titrazolium)染料を、細胞によって着
色したホルマザン産物(formazan product)へ生物還元し(bioreduced)、そし
て吸光度を490nmで定量する。ホルマザン産物の量は、ウェル中の生存して
いる細胞の数に比例し、そして従って増殖を評価するに役立ち得る。
【0067】
角膜上皮細胞におけるGDNFおよびアルテミンによって誘導されるシグナル 伝達経路の研究
どのタンパク質キナーゼカスケードがGDNFおよびアルテミンによって活性
化されるかを研究するために、細胞株からの角膜上皮細胞を、5×105細胞/
75cm2の密度で播種し、そして1日間10%FBSを含むSHEM中で培養
した。次いで、培養物をPBSで洗浄し、そして添加物無しかあるいはGDNF
(200ng/ml)を含むかまたはアルテミン(250ng)を含む無血清S
HEM中で10〜40分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、培養細胞
を、50mM Tris2Cl(pH8.0)、150mM NaCl、0.02
% アジ化ナトリウム、100μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオリド
、1mM Na3VO4、1%Triton X−100およびいくつかのプロテ
アーゼインヒビターを含む溶解緩衝液[completeTM,Boehrin
ger Mannheim(1タブレット/30ml緩衝液)]中に溶解した。
1レーン当たり80μgの全タンパク質を、NuPAGE 10% SDS−M
OPS−Bis−TrisゲルまたはNuPAGE 3〜8% Tris−アセ
テートゲル(全てNOVEX,San Diego,CA)によって分画化し、
そしてニトロセルロース膜上へブロットした。リン酸化タンパク質をホスホ−特
異的(phospho-specific)抗体で検出し、そしてECLウェスタンブロット分析
システム(Amersham)で可視化した。ホスホ−Raf(ser259)
、ホスホ−MEK1/2(ser2l7/221)、ホスホ−MAPK(Erk
l/2)(thr202/tyr204)、ホスホ−p90リボソームS6キナ
ーゼ(RSK)(ser381)およびホスホ−Elk−l(ser383)に
対する抗体を、New England Biolabs(Beverly,M
A)から得た。ホスホ−FAK(tyr397/tyr407/tyr576/
tyr577/tyr861/tyr925)およびホスホ−Pyk2(tyr
402/tyr579/tyr/580/tyr881)に対する抗体を、Bi
osource(Camarillo,CA,USA)から購入した。ホスホ−
チロシンに対するモノクローナル抗体は、Sigma(Deisenhofen
,Germany)製であった。
化されるかを研究するために、細胞株からの角膜上皮細胞を、5×105細胞/
75cm2の密度で播種し、そして1日間10%FBSを含むSHEM中で培養
した。次いで、培養物をPBSで洗浄し、そして添加物無しかあるいはGDNF
(200ng/ml)を含むかまたはアルテミン(250ng)を含む無血清S
HEM中で10〜40分間インキュベートした。PBSで洗浄した後、培養細胞
を、50mM Tris2Cl(pH8.0)、150mM NaCl、0.02
% アジ化ナトリウム、100μg/mlフェニルメチルスルホニルフルオリド
、1mM Na3VO4、1%Triton X−100およびいくつかのプロテ
アーゼインヒビターを含む溶解緩衝液[completeTM,Boehrin
ger Mannheim(1タブレット/30ml緩衝液)]中に溶解した。
1レーン当たり80μgの全タンパク質を、NuPAGE 10% SDS−M
OPS−Bis−TrisゲルまたはNuPAGE 3〜8% Tris−アセ
テートゲル(全てNOVEX,San Diego,CA)によって分画化し、
そしてニトロセルロース膜上へブロットした。リン酸化タンパク質をホスホ−特
異的(phospho-specific)抗体で検出し、そしてECLウェスタンブロット分析
システム(Amersham)で可視化した。ホスホ−Raf(ser259)
、ホスホ−MEK1/2(ser2l7/221)、ホスホ−MAPK(Erk
l/2)(thr202/tyr204)、ホスホ−p90リボソームS6キナ
ーゼ(RSK)(ser381)およびホスホ−Elk−l(ser383)に
対する抗体を、New England Biolabs(Beverly,M
A)から得た。ホスホ−FAK(tyr397/tyr407/tyr576/
tyr577/tyr861/tyr925)およびホスホ−Pyk2(tyr
402/tyr579/tyr/580/tyr881)に対する抗体を、Bi
osource(Camarillo,CA,USA)から購入した。ホスホ−
チロシンに対するモノクローナル抗体は、Sigma(Deisenhofen
,Germany)製であった。
【0068】
免疫−沈降を、Retおよびパキシリン(paxillin)のチロシンリン酸化を検
出するために行った。手短に言えば、5×105細胞(種々の培養条件で培養し
た)の1mlライゼートを、2時間40μlプロテイン−G−アガロース(ベー
リンガーマンハイム)と共にインキュベートし、12000rpmでの短時間の
遠心分離を続けた。上清を、40μlプロテイン−G−アガロースおよびRet
(Santa Cruz)またはパキシリン(Sigma)に対する10μgポ
リクローナル抗体と共に、一晩4℃で攪拌しながらインキュベートした。次いで
、プロテインG−アガロースコンプレックスを、短時間の遠心分離によって回収
し、そして2回溶解緩衝液中で洗浄した。結合されたタンパク質ペレットを、煮
沸によってSDSゲル−ローディング緩衝液中で溶出させ、そしてタンパク質を
NuPageゲル電気泳動およびナイロン膜へのブロッティング続いて上記のよ
うな視覚化によって分離した。
出するために行った。手短に言えば、5×105細胞(種々の培養条件で培養し
た)の1mlライゼートを、2時間40μlプロテイン−G−アガロース(ベー
リンガーマンハイム)と共にインキュベートし、12000rpmでの短時間の
遠心分離を続けた。上清を、40μlプロテイン−G−アガロースおよびRet
(Santa Cruz)またはパキシリン(Sigma)に対する10μgポ
リクローナル抗体と共に、一晩4℃で攪拌しながらインキュベートした。次いで
、プロテインG−アガロースコンプレックスを、短時間の遠心分離によって回収
し、そして2回溶解緩衝液中で洗浄した。結合されたタンパク質ペレットを、煮
沸によってSDSゲル−ローディング緩衝液中で溶出させ、そしてタンパク質を
NuPageゲル電気泳動およびナイロン膜へのブロッティング続いて上記のよ
うな視覚化によって分離した。
【0069】
インビトロ創傷治癒アッセイおよび改変Boydenチャンバ分析
さらなる実験において、角膜上皮細胞移動および創傷治癒に対するGDNFの
効果を、インビトロ創傷治癒モデルにおいてならびに改変Boydenチャンバ
アッセイにおいて研究した。
効果を、インビトロ創傷治癒モデルにおいてならびに改変Boydenチャンバ
アッセイにおいて研究した。
【0070】
インビトロ創傷治癒アッセイのために、初代角膜上皮細胞および角膜上皮細胞
からの細胞を、2mmグリッドを有する60mmプラスチックディッシュ(Sa
rstedt,Numbrecht,Germany)上に5×105の密度で
播種し、そしてサブコンフルエンシー(subconfluency)まで2日間培養した。
アルテミンでの実験のために、初代培養化ウサギ角膜上皮細胞を使用した。これ
らの細胞は、Dispase(1,2U/ml)およびトリプシン/EDTAを
用いて単離した。ウサギ細胞を、添加物を含む培地500(Cascade B
iologies)中で培養した。
からの細胞を、2mmグリッドを有する60mmプラスチックディッシュ(Sa
rstedt,Numbrecht,Germany)上に5×105の密度で
播種し、そしてサブコンフルエンシー(subconfluency)まで2日間培養した。
アルテミンでの実験のために、初代培養化ウサギ角膜上皮細胞を使用した。これ
らの細胞は、Dispase(1,2U/ml)およびトリプシン/EDTAを
用いて単離した。ウサギ細胞を、添加物を含む培地500(Cascade B
iologies)中で培養した。
【0071】
細胞層を、ソフトプラスチック細胞スクラバー(soft plastic cell scrubber
)(Falcon,Becton and Dickinson,Heidel
berg,Germany)を用いていくつかの平行な引っ掻きを誘導すること
によって、顕微鏡下で傷害を与えた。スクラバーの先端を切断し、そして約1m
m測定し、そして結果として細胞層における引っ掻きの幅はまた約1mmであっ
た。ディッシュにおける選択した領域を、非常に細いマーカーペンでマークし、
そして連続イメージを、ビデオカメラを備えた逆位相差顕微鏡(Axiover
t 25,Zeiss,Jena,Germany)下5×倍率で異なる時点で
撮った。実験的傷害に続いて、ディッシュを、成長因子を含まない(コントロー
ル)かあるいはGDNF(250ng/ml)(大腸菌中で発現された組換えヒ
トGDNF)、NGF(250ng/ml)(Boehringer Mann
heim,Germany)またはEGF(10mg/ml)を含むかのいずれ
かのSHEM培地中でインキュベートした。アルテミンを研究する実験のために
、細胞を、添加物を含まない培地500中で培養し、そして250ngアルテミ
ンを添加した。各条件について、4つの代表的な領域を、3ディッシュ内で評価
した。各代表領域における引っ掻きの平均直径を、実験の開始で100%として
設定した。18時間後、同一引っ掻きの平均直径を再度計算し、そして実験の開
始での直径のパーセントで表現した。
)(Falcon,Becton and Dickinson,Heidel
berg,Germany)を用いていくつかの平行な引っ掻きを誘導すること
によって、顕微鏡下で傷害を与えた。スクラバーの先端を切断し、そして約1m
m測定し、そして結果として細胞層における引っ掻きの幅はまた約1mmであっ
た。ディッシュにおける選択した領域を、非常に細いマーカーペンでマークし、
そして連続イメージを、ビデオカメラを備えた逆位相差顕微鏡(Axiover
t 25,Zeiss,Jena,Germany)下5×倍率で異なる時点で
撮った。実験的傷害に続いて、ディッシュを、成長因子を含まない(コントロー
ル)かあるいはGDNF(250ng/ml)(大腸菌中で発現された組換えヒ
トGDNF)、NGF(250ng/ml)(Boehringer Mann
heim,Germany)またはEGF(10mg/ml)を含むかのいずれ
かのSHEM培地中でインキュベートした。アルテミンを研究する実験のために
、細胞を、添加物を含まない培地500中で培養し、そして250ngアルテミ
ンを添加した。各条件について、4つの代表的な領域を、3ディッシュ内で評価
した。各代表領域における引っ掻きの平均直径を、実験の開始で100%として
設定した。18時間後、同一引っ掻きの平均直径を再度計算し、そして実験の開
始での直径のパーセントで表現した。
【0072】
どのシグナル伝達経路がこのモデルにおける角膜上皮移動に対するGDNFの
効果を媒介するかを決定するために、チロシンキナーゼインヒビターヘルビマイ
シンAを、上述のように使用した。
効果を媒介するかを決定するために、チロシンキナーゼインヒビターヘルビマイ
シンAを、上述のように使用した。
【0073】
角膜上皮細胞に対するGDNFの化学走化性効果をさらに評価するために、改
変Boydenチャンバアッセイを使用した。初代培養細胞または角膜上皮細胞
株からの4×105細胞を、8μmの孔サイズを有するポリエチレンテレフタレ
ートフィルター(Falcon)を含む組織培養挿入物上へ播種した。播種後4
時間以内に、殆どの細胞がフィルターへ付着し、そしてセミコンフルエントな単
層を形成した。次いで、培地を、上部ウェル中に添加物を含まないSHEMへ、
そして下部ウェル中にGDNF(250ng/ml)を含むSHEMへ交換した
。培養の24時間後、細胞を、ラバーポリスマン(rubber policeman)を用いて
穏やかなスクラビング(scrubbing)によって挿入物の表面から除去した。挿入
物の下部における細胞(これは、フィルターを通って移動した)を、−20℃メ
タノールで固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した。フィルターの全
表面を、顕微鏡下で細胞についてスクリーニングした。
変Boydenチャンバアッセイを使用した。初代培養細胞または角膜上皮細胞
株からの4×105細胞を、8μmの孔サイズを有するポリエチレンテレフタレ
ートフィルター(Falcon)を含む組織培養挿入物上へ播種した。播種後4
時間以内に、殆どの細胞がフィルターへ付着し、そしてセミコンフルエントな単
層を形成した。次いで、培地を、上部ウェル中に添加物を含まないSHEMへ、
そして下部ウェル中にGDNF(250ng/ml)を含むSHEMへ交換した
。培養の24時間後、細胞を、ラバーポリスマン(rubber policeman)を用いて
穏やかなスクラビング(scrubbing)によって挿入物の表面から除去した。挿入
物の下部における細胞(これは、フィルターを通って移動した)を、−20℃メ
タノールで固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した。フィルターの全
表面を、顕微鏡下で細胞についてスクリーニングした。
【0074】
統計分析
角膜増殖に対するGDNFの効果を調べる全ての実験は、異なるドナー由来の
細胞を用いて3重で行った。コロニー形成、コロニーサイズおよび細胞数に対す
る成長因子の影響を、これらのデータの一元配置の分散分析(one-way analysis
of variance)を使用して研究した。logトランスフォーメーションを、必要
である場合に使用して、これらのデータにおける分散および正規性の均質性(ho
mogeneity)に影響を及ぼした。スチューデントのt検定を使用して、分散の分
析後にどの差異が有意であったかを決定した。
細胞を用いて3重で行った。コロニー形成、コロニーサイズおよび細胞数に対す
る成長因子の影響を、これらのデータの一元配置の分散分析(one-way analysis
of variance)を使用して研究した。logトランスフォーメーションを、必要
である場合に使用して、これらのデータにおける分散および正規性の均質性(ho
mogeneity)に影響を及ぼした。スチューデントのt検定を使用して、分散の分
析後にどの差異が有意であったかを決定した。
【0075】
患者
45才。左において大きな炎症を伴う角膜潰瘍。サイズが3.8×3.0mm
の上皮欠損、さらに角膜の厚みの80%を含む穿孔(punched-out)欠損の形態
の角膜間質の潰瘍。角膜の痛覚なし、そして眼の顕著な付随する炎症。
の上皮欠損、さらに角膜の厚みの80%を含む穿孔(punched-out)欠損の形態
の角膜間質の潰瘍。角膜の痛覚なし、そして眼の顕著な付随する炎症。
【0076】
治療
患者を、組換えヒト(rh)GNDF(0.2mg/ml)(25μl/用量
)で、2時間間隔で48時間処置し、次いで、用量を、1日当たり20μl6回
へ減少させた。上皮の治癒後、濃度を0.1mg/mlヘ減少させ、そして20
μl用量を1日当たり5回与えた。投与のために、凍結乾燥組換えヒトGDNF
を、無菌平衡塩類溶液(sterile balanced salt solution)に希釈した。
)で、2時間間隔で48時間処置し、次いで、用量を、1日当たり20μl6回
へ減少させた。上皮の治癒後、濃度を0.1mg/mlヘ減少させ、そして20
μl用量を1日当たり5回与えた。投与のために、凍結乾燥組換えヒトGDNF
を、無菌平衡塩類溶液(sterile balanced salt solution)に希釈した。
【0077】
【表1】
【図1】
図1は、GDNF(配列番号1、GenBankアクセッション番号L190
63, L15306)、アルテミン(配列番号5、GenBankアクセッシ
ョン番号AF109401)、ペルセフィン(persephin)(配列番号4、Gen
Bankアクセッション番号AF040962)、ニュールツリン(配列番号3
、GenBankアクセッション番号U78110)および得られる一般的共通
配列(generic consensus sequence)(配列番号2)の保存された7システイン
領域の配列アラインメントである。配列番号2の共通配列において、Xは任意の
アミノ酸を意味し、そしてYは任意アミノ酸のまたはアミノ酸が存在しないこと
を意味する。
63, L15306)、アルテミン(配列番号5、GenBankアクセッシ
ョン番号AF109401)、ペルセフィン(persephin)(配列番号4、Gen
Bankアクセッション番号AF040962)、ニュールツリン(配列番号3
、GenBankアクセッション番号U78110)および得られる一般的共通
配列(generic consensus sequence)(配列番号2)の保存された7システイン
領域の配列アラインメントである。配列番号2の共通配列において、Xは任意の
アミノ酸を意味し、そしてYは任意アミノ酸のまたはアミノ酸が存在しないこと
を意味する。
【図2】
図2は、臭化エチジウムで染色したエクスビボ(ex vivo)角膜上皮(A)およ
び間質(B)から抽出したmRNAから生じさせたcDNAから増幅されたPC
R産物の1.8%アガロースゲル電気泳動を示す。上皮および間質の両方は、N
GF(233bp)(レーン1)、NT−3(298bp)(レーン2)、およ
びBDNF(373bp)(レーン4)を発現した。NT−4(464bp)(
レーン3)は、角膜上皮においてのみ発現された。GDNF(343bp)(レ
ーン5)は、主として角膜間質において発現された。M=DNA分子量マーカー
(PhiX 174 DNA/Hinf Iフラグメント)。
び間質(B)から抽出したmRNAから生じさせたcDNAから増幅されたPC
R産物の1.8%アガロースゲル電気泳動を示す。上皮および間質の両方は、N
GF(233bp)(レーン1)、NT−3(298bp)(レーン2)、およ
びBDNF(373bp)(レーン4)を発現した。NT−4(464bp)(
レーン3)は、角膜上皮においてのみ発現された。GDNF(343bp)(レ
ーン5)は、主として角膜間質において発現された。M=DNA分子量マーカー
(PhiX 174 DNA/Hinf Iフラグメント)。
【図3】
図3は、臭化エチジウムで染色したエクスビボ角膜上皮(A)および間質(B
)から抽出したmRNAから生じさせたcDNAから増幅されたPCR産物の1
.8%アガロースゲル電気泳動を示す。上皮および間質の両方は、ニューロトロ
フィンレセプターTrkA(570bp)(レーン1)、TrkB(472bp
)(レーン2)、TrkC(484bp)(レーン3)およびTrkE(545
bp)(レーン4)を発現した。M=DNA分子量マーカー(PhiX 174
DNA/Hinf Iフラグメント)。
)から抽出したmRNAから生じさせたcDNAから増幅されたPCR産物の1
.8%アガロースゲル電気泳動を示す。上皮および間質の両方は、ニューロトロ
フィンレセプターTrkA(570bp)(レーン1)、TrkB(472bp
)(レーン2)、TrkC(484bp)(レーン3)およびTrkE(545
bp)(レーン4)を発現した。M=DNA分子量マーカー(PhiX 174
DNA/Hinf Iフラグメント)。
【図4】
図4は、培養されたヒト角膜上皮細胞(A)および間質性角膜実質細胞(B)
におけるGDNFおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナーゼレセ
プターの転写レベルの測定のためのDNAドットブロット分析を示す。各DNA
ドット1〜10は、NGF(レーン1)、NT−3(レーン2)、NT−4(レ
ーン3)、BDNF(レーン4)、GDNF(レーン5)、TrkA(レーン6
)、TrkB(レーン7)、TrkC(レーン8)、TrkE(レーン9)およ
びGAPDH(レーン10)に特異的な0.1μgPCRドットを示す。NT−
4の転写は、培養されたヒト角膜上皮細胞株においてのみ検出可能であり、そし
てGDNFの転写は、主として、培養されたヒト角膜間質性角膜実質細胞におい
て検出可能であった。比較ために、レーン10は、最も強いシグナルを示すポジ
ティブコントロールとしてのGAPDHを示す。
におけるGDNFおよび他の神経栄養因子ならびに対応のチロシンキナーゼレセ
プターの転写レベルの測定のためのDNAドットブロット分析を示す。各DNA
ドット1〜10は、NGF(レーン1)、NT−3(レーン2)、NT−4(レ
ーン3)、BDNF(レーン4)、GDNF(レーン5)、TrkA(レーン6
)、TrkB(レーン7)、TrkC(レーン8)、TrkE(レーン9)およ
びGAPDH(レーン10)に特異的な0.1μgPCRドットを示す。NT−
4の転写は、培養されたヒト角膜上皮細胞株においてのみ検出可能であり、そし
てGDNFの転写は、主として、培養されたヒト角膜間質性角膜実質細胞におい
て検出可能であった。比較ために、レーン10は、最も強いシグナルを示すポジ
ティブコントロールとしてのGAPDHを示す。
【図5】
図5は、D6についての初代ウサギ角膜上皮細胞のコロニー形成に対する組換
えヒトGDNFの効果を示すダイアグラムである(平均値および標準偏差)。細
胞を、無血清MCDBにおいてクローン密度(clonal density)に培養した。5
0または200ng/mlGDNFの添加によって、コロニーの全数の統計学的
に有意な(p<0.005、*)増加が生じた。
えヒトGDNFの効果を示すダイアグラムである(平均値および標準偏差)。細
胞を、無血清MCDBにおいてクローン密度(clonal density)に培養した。5
0または200ng/mlGDNFの添加によって、コロニーの全数の統計学的
に有意な(p<0.005、*)増加が生じた。
【図6】
図6は、D6についての初代ウサギ角膜上皮細胞のクローン増殖に対する組換
えヒトGDNFの効果を実証するダイアグラムを示す(平均値および標準偏差)
。GDNF(50または200ng/ml)の添加によって、1コロニー当たり
の細胞数の統計学的に有意な(p<0.005、*)増加が生じた。
えヒトGDNFの効果を実証するダイアグラムを示す(平均値および標準偏差)
。GDNF(50または200ng/ml)の添加によって、1コロニー当たり
の細胞数の統計学的に有意な(p<0.005、*)増加が生じた。
【図7】
図7は、D6についての初代ヒト角膜間質細胞の増殖に対するGDNFの効果
を示すダイアグラムである。10%FBSを加えたDMEMにおける培養に続い
て、細胞を、FBS無しのDMEMにおいて低密度でプレートし(plated)、そ
してさらに処理した。値は平均+/−標準偏差(SD)として示めされる。GD
NFは、コントロールと比較した場合の細胞密度を反映する吸光度の統計学的に
有意な誘導へ導いた(p<0.005、*)。
を示すダイアグラムである。10%FBSを加えたDMEMにおける培養に続い
て、細胞を、FBS無しのDMEMにおいて低密度でプレートし(plated)、そ
してさらに処理した。値は平均+/−標準偏差(SD)として示めされる。GD
NFは、コントロールと比較した場合の細胞密度を反映する吸光度の統計学的に
有意な誘導へ導いた(p<0.005、*)。
【図8】
図8は、培養化ヒト角膜上皮におけるMAPキナーゼのリン酸化に対するGD
NFおよび他の神経栄養因子の効果を実証するウェスタンブロットを示す。リン
酸化ERK1(44kD)およびERK2(42kD)(A)、全ERK1およ
びERK2(リン酸化および非リン酸化)(44kDおよび42kD)(B)、
リン酸化JNK1(46kD)およびJNK2(54kD)(C)に対する、な
らびに全JNK1およびJNK2(リン酸化および非リン酸化)(46kDおよ
び54kD)(D)に対する抗体を用いてのウェスタンブロットは、ERK1お
よびより少ない程度のERK2のリン酸化が、無血清コントロール培地で培養さ
れた細胞(レーン7)と比較して、GDNF(レーン5)、BDNF(レーン3
)またはNGF(レーン1)を含む培地において培養されたヒト上皮細胞におい
て誘導されたことを実証する。BDNFによってではなくNGFおよびGDNF
によるERK1のリン酸化は、MEK−インヒビター PD 98059(それ
ぞれ、レーン2、6および4)の添加によって阻害された。対照的に、JNK1
/2は、コントロール(レーン4)と比較して、NGF(レーン1)、BDNF
(レーン2)またはGDNF(レーン3)によって誘導されなかった。
NFおよび他の神経栄養因子の効果を実証するウェスタンブロットを示す。リン
酸化ERK1(44kD)およびERK2(42kD)(A)、全ERK1およ
びERK2(リン酸化および非リン酸化)(44kDおよび42kD)(B)、
リン酸化JNK1(46kD)およびJNK2(54kD)(C)に対する、な
らびに全JNK1およびJNK2(リン酸化および非リン酸化)(46kDおよ
び54kD)(D)に対する抗体を用いてのウェスタンブロットは、ERK1お
よびより少ない程度のERK2のリン酸化が、無血清コントロール培地で培養さ
れた細胞(レーン7)と比較して、GDNF(レーン5)、BDNF(レーン3
)またはNGF(レーン1)を含む培地において培養されたヒト上皮細胞におい
て誘導されたことを実証する。BDNFによってではなくNGFおよびGDNF
によるERK1のリン酸化は、MEK−インヒビター PD 98059(それ
ぞれ、レーン2、6および4)の添加によって阻害された。対照的に、JNK1
/2は、コントロール(レーン4)と比較して、NGF(レーン1)、BDNF
(レーン2)またはGDNF(レーン3)によって誘導されなかった。
【図9】
図9は、培養されたヒト角膜間質性角膜実質細胞におけるMAPキナーゼのリ
ン酸化に対するGDNFおよび他の神経栄養因子の効果を実証するウェスタンブ
ロットを示す。リン酸化ERK1(44kD)およびERK2(42kD)(A
)、全ERK1およびERK2(リン酸化および非リン酸化)(44kDおよび
42kD)(B)、リン酸化JNK1(46kD)およびJNK2(54kD)
(C)、ならびに全JNK1およびJNK2(リン酸化および非リン酸化)(4
6kDおよび54kD)(D)に対する抗体を用いてのウェスタンブロットは、
ERK1およびより少ない程度のERK2のリン酸化が、無血清コントロール培
地(レーン7)またはBDNF(レーン3)と比較して、GDNF(レーン5)
、及びNGF(レーン1)によって弱く誘導されたことを実証する。NGFおよ
びGDNFによるERK1のリン酸化は、MEK−インヒビター PD 980
59(それぞれ、レーン2および6)の添加によって阻害された。BDNFによ
るERK1のリン酸化はPD 98059(レーン4)の添加時に変化しないま
まであった。JNK1(C)のリン酸化は、無血清培地(レーン4)と比較して
、NGF(レーン1)、BDNF(レーン2)およびGDNF(レーン3)によ
って弱く誘導された。
ン酸化に対するGDNFおよび他の神経栄養因子の効果を実証するウェスタンブ
ロットを示す。リン酸化ERK1(44kD)およびERK2(42kD)(A
)、全ERK1およびERK2(リン酸化および非リン酸化)(44kDおよび
42kD)(B)、リン酸化JNK1(46kD)およびJNK2(54kD)
(C)、ならびに全JNK1およびJNK2(リン酸化および非リン酸化)(4
6kDおよび54kD)(D)に対する抗体を用いてのウェスタンブロットは、
ERK1およびより少ない程度のERK2のリン酸化が、無血清コントロール培
地(レーン7)またはBDNF(レーン3)と比較して、GDNF(レーン5)
、及びNGF(レーン1)によって弱く誘導されたことを実証する。NGFおよ
びGDNFによるERK1のリン酸化は、MEK−インヒビター PD 980
59(それぞれ、レーン2および6)の添加によって阻害された。BDNFによ
るERK1のリン酸化はPD 98059(レーン4)の添加時に変化しないま
まであった。JNK1(C)のリン酸化は、無血清培地(レーン4)と比較して
、NGF(レーン1)、BDNF(レーン2)およびGDNF(レーン3)によ
って弱く誘導された。
【図10】
図10は、GDNFでの局所処置の間の患者における上皮欠損のサイズの時間
経過を示すダイアグラムである。
経過を示すダイアグラムである。
【図11】
図11は、図10においてのようにGDNFで処置した同一患者の角膜の中心
の写真を示す。GDNFでの処置を開始する前の日に、大きな領域は可視であり
、これはイエローフルオレセインで標識化され得る。この領域は、上皮で覆われ
ていない(第d0日)。3日後、上記からの上皮の増殖に起因する傷害を受けた
(injured)領域の顕著な減少が、観察され得る(d3)。第17日において、
フルオレセインで弱くのみ標識され得る小さな中心の欠損が、可視である(d1
7)。処置の開始後21日するとすぐに、創傷治癒の処置は、僅かな不規則性(
unregularities)を除いて、ほぼ完了される(d21)。
の写真を示す。GDNFでの処置を開始する前の日に、大きな領域は可視であり
、これはイエローフルオレセインで標識化され得る。この領域は、上皮で覆われ
ていない(第d0日)。3日後、上記からの上皮の増殖に起因する傷害を受けた
(injured)領域の顕著な減少が、観察され得る(d3)。第17日において、
フルオレセインで弱くのみ標識され得る小さな中心の欠損が、可視である(d1
7)。処置の開始後21日するとすぐに、創傷治癒の処置は、僅かな不規則性(
unregularities)を除いて、ほぼ完了される(d21)。
【図12】
図12は、GDNFによるRetの時間依存チロシンリン酸化を実証するウェ
スタン−ブロット実験の写真である。培養された角膜上皮細胞(コントロール)
におけるリン酸化Ret(約150kD)のレベルは、GDNF(200ng/
ml)(co)の添加前に低く、そしてGDNFの添加後5分で増加し、10分
および15分後に高レベルのままであった。ヘルビマイシンAで前処置しそして
GDNF(10分)で刺激した細胞におけるRetのチロシンリン酸化は、ヘル
ビマイシン(herbimycin)Aのインキュベーション無しの細胞よりもより低いレベ
ルのままである。IgG(免疫ブロブリン)ブロットは、等量のRet抗体が免
疫沈降のために使用されたことを示す。
スタン−ブロット実験の写真である。培養された角膜上皮細胞(コントロール)
におけるリン酸化Ret(約150kD)のレベルは、GDNF(200ng/
ml)(co)の添加前に低く、そしてGDNFの添加後5分で増加し、10分
および15分後に高レベルのままであった。ヘルビマイシンAで前処置しそして
GDNF(10分)で刺激した細胞におけるRetのチロシンリン酸化は、ヘル
ビマイシン(herbimycin)Aのインキュベーション無しの細胞よりもより低いレベ
ルのままである。IgG(免疫ブロブリン)ブロットは、等量のRet抗体が免
疫沈降のために使用されたことを示す。
【図13】
図13は、GDNFによる細胞内シグナルの時間依存リン酸化を実証するウェ
スタン−ブロット実験の写真である。FAK(約130kD)およびPyk2(
約130kD)のチロシンリン酸化、cRaf(約80kD)、MEK1(45
kD)およびElk(約60kD)のセリンリン酸化、ならびにErk1(44
kD)および2(42kD)のチロシン/スレオニンリン酸化は、GDNFへの
曝した後10以内で誘導され、そして次の30分にわたって徐々に増加された。
p90RSK(90kD)のリン酸化は、GDNF刺激に対する応答において誘
導されなかった。全タンパク質の等量(80μg)が各レーンにおいてロードさ
れたことを示すために、全Erk(リン酸化および非リン酸化Erk1およびE
rk2)に対する抗体を用いてのブロットを示す。
スタン−ブロット実験の写真である。FAK(約130kD)およびPyk2(
約130kD)のチロシンリン酸化、cRaf(約80kD)、MEK1(45
kD)およびElk(約60kD)のセリンリン酸化、ならびにErk1(44
kD)および2(42kD)のチロシン/スレオニンリン酸化は、GDNFへの
曝した後10以内で誘導され、そして次の30分にわたって徐々に増加された。
p90RSK(90kD)のリン酸化は、GDNF刺激に対する応答において誘
導されなかった。全タンパク質の等量(80μg)が各レーンにおいてロードさ
れたことを示すために、全Erk(リン酸化および非リン酸化Erk1およびE
rk2)に対する抗体を用いてのブロットを示す。
【図14】
図14は、ヘルビマイシンAによるFAK、cRafおよびErkのGDNF
−依存リン酸化の阻害を示すさらなるウェスタン−ブロット実験の写真である。
FAKのGDNF−依存チロシンリン酸化、cRafのセリンリン酸化およびE
rk1および2のチロシン/スレオニンリン酸化のレベルは、培養された角膜上
皮細胞において、2時間のヘルビマイシンAでのプレインキュベーションに続い
て、全て有意に減少された。全Erk(リン酸化および非リン酸化Erk1およ
びErk2)の量は、無変化のままであった。
−依存リン酸化の阻害を示すさらなるウェスタン−ブロット実験の写真である。
FAKのGDNF−依存チロシンリン酸化、cRafのセリンリン酸化およびE
rk1および2のチロシン/スレオニンリン酸化のレベルは、培養された角膜上
皮細胞において、2時間のヘルビマイシンAでのプレインキュベーションに続い
て、全て有意に減少された。全Erk(リン酸化および非リン酸化Erk1およ
びErk2)の量は、無変化のままであった。
【図15】
図15は、アルテミンによる細胞内シグナルの時間依存リン酸化を示すウェス
タンブロットの写真である。MEK1(45kD)のチロシンリン酸化は、コン
トロール細胞(レーン1)において非常に低かった。リン酸化は、アルテミン(
250ng/ml)への曝露後10分(レーン2)、20分(レーン3)そして
より顕著には40分(レーン4)および60分(レーン5)以内で誘導された。
M:分子量マーカー。
タンブロットの写真である。MEK1(45kD)のチロシンリン酸化は、コン
トロール細胞(レーン1)において非常に低かった。リン酸化は、アルテミン(
250ng/ml)への曝露後10分(レーン2)、20分(レーン3)そして
より顕著には40分(レーン4)および60分(レーン5)以内で誘導された。
M:分子量マーカー。
【図16】
図16は、アルテミンによる細胞内シグナルの時間依存リン酸化を実証するさ
らなるウェスタンブロットの写真である。Erk1および2のチロシン/スレオ
ニンリン酸化は、コントロール細胞(レーン1)において非常に低かった。リン
酸化は、アルテミン(250ng/ml)への曝露後10分、20分そしてより
顕著には40分および60分(レーン2〜5)以内で誘導された。
らなるウェスタンブロットの写真である。Erk1および2のチロシン/スレオ
ニンリン酸化は、コントロール細胞(レーン1)において非常に低かった。リン
酸化は、アルテミン(250ng/ml)への曝露後10分、20分そしてより
顕著には40分および60分(レーン2〜5)以内で誘導された。
【図17】
図17は、セミ−コンフルエント(semi-confluent)単層における“創傷”の
インビトロ閉鎖に対するGDNFの効果を実証する実験のグラフ表示を示す。1
mm直径の引っ掻き“創傷”の閉鎖は、初代角膜上皮細胞(A)およびSV40
−トランスフェクトされた角膜上皮細胞(Arraki-Sasakiら, 1995を参照のこと
)(B)の両方において、コントロール培養物(co)と比較して、250ng
/ml GDNFによって有意に(*)(p<0.01)促進された。創傷閉鎖は
、18時間での代表的培養物における最初の創傷ギャップのパーセントとして表
現される。NGFおよびEGFは、ポジティブコントロールとして役立つ。
インビトロ閉鎖に対するGDNFの効果を実証する実験のグラフ表示を示す。1
mm直径の引っ掻き“創傷”の閉鎖は、初代角膜上皮細胞(A)およびSV40
−トランスフェクトされた角膜上皮細胞(Arraki-Sasakiら, 1995を参照のこと
)(B)の両方において、コントロール培養物(co)と比較して、250ng
/ml GDNFによって有意に(*)(p<0.01)促進された。創傷閉鎖は
、18時間での代表的培養物における最初の創傷ギャップのパーセントとして表
現される。NGFおよびEGFは、ポジティブコントロールとして役立つ。
【図18】
図18は、改変Boydenチャンバシステムにおける角膜上皮細胞移動に対
するGDNFの効果を実証する実験結果を示す。コントロール培地において、ほ
んの僅かな(19±6.8)角膜上皮細胞が、上部チャンバからフィルターを通
って移動した[(A)における写真;(C)におけるダイアグラム]。250n
g/ml GDNFの下部チャンバへの添加によって、フィルターを通っての6
倍増の細胞移動が生じた(117±37.6)(p<0.0001)[(B)に
おける写真;(C)におけるダイアグラム]。
するGDNFの効果を実証する実験結果を示す。コントロール培地において、ほ
んの僅かな(19±6.8)角膜上皮細胞が、上部チャンバからフィルターを通
って移動した[(A)における写真;(C)におけるダイアグラム]。250n
g/ml GDNFの下部チャンバへの添加によって、フィルターを通っての6
倍増の細胞移動が生じた(117±37.6)(p<0.0001)[(B)に
おける写真;(C)におけるダイアグラム]。
【図19】
図19は、セミ−コンフルエント単層における“創傷”のインビトロ閉鎖に対
するアルテミンの効果を示す実験のグラフ表示である。1mm直径の引っ掻き“
創傷”の閉鎖は、コントロール培養物(Ko)と比較して、100ng/mlお
よび250ng/mlの濃度のアルテミンによって有意に(*)(p<0.01
)促進された。結果は、ウサギ角膜上皮細胞における実験の開始でのオリジナル
の創傷ギャップと比較しての%での創傷ギャップとして表現される。EGFの効
果は、ポジティブコントロールとして役立つ。
するアルテミンの効果を示す実験のグラフ表示である。1mm直径の引っ掻き“
創傷”の閉鎖は、コントロール培養物(Ko)と比較して、100ng/mlお
よび250ng/mlの濃度のアルテミンによって有意に(*)(p<0.01
)促進された。結果は、ウサギ角膜上皮細胞における実験の開始でのオリジナル
の創傷ギャップと比較しての%での創傷ギャップとして表現される。EGFの効
果は、ポジティブコントロールとして役立つ。
【図20】
図20は、角膜上皮細胞のインビトロ増殖に対するアルテミンの効果を示す実
験のグラフ表示である。コントロール(成長因子無しの培地MCDB151)と
比較しての、ポジティブコントロールとしての10ng/ml EGFあるいは
100または250ng/mlの濃度でのアルテミンのいずれかでのインキュベ
ーションの1週間後の1ディッシュ当たりの細胞のコロニーが示される。
験のグラフ表示である。コントロール(成長因子無しの培地MCDB151)と
比較しての、ポジティブコントロールとしての10ng/ml EGFあるいは
100または250ng/mlの濃度でのアルテミンのいずれかでのインキュベ
ーションの1週間後の1ディッシュ当たりの細胞のコロニーが示される。
【図21】
図21は、角膜上皮細胞のインビトロ増殖に対するアルテミンの効果をさらに
例示する実験のグラフィック表示である。バーは、コントロール(成長因子無し
の培地MCDB151)と比較しての、ポジティブコントロールとしての10n
g/ml EGFあるいは100または250ng/mlの濃度でのアルテミン
のいずれかでのインキュベーションの1週間後の1ディッシュ当たりの細胞数を
示す。
例示する実験のグラフィック表示である。バーは、コントロール(成長因子無し
の培地MCDB151)と比較しての、ポジティブコントロールとしての10n
g/ml EGFあるいは100または250ng/mlの濃度でのアルテミン
のいずれかでのインキュベーションの1週間後の1ディッシュ当たりの細胞数を
示す。
【図22】
図22は、GDNF分子によってトリガーされる(triggered)創傷治癒プロ
セスに関与するようであるシグナル伝達経路の略図である。
セスに関与するようであるシグナル伝達経路の略図である。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61K 35/12 A61K 45/00
39/395 45/06
45/00 47/36
45/06 48/00
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111 A61K 37/24
123 A61F 9/00 550
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG
,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,
RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,
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A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM
,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,
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,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM
,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
(72)発明者 パウリスタ ミハエル
ドイツ国 69181 リーメン イム ウイ
ンゲルト 10
(72)発明者 ポール ジェンス
ドイツ国 76707 ハンブリュッケン バ
ストヴァルト 25
Fターム(参考) 4C076 AA06 AA07 BB01 BB11 BB13
BB24 CC01 CC04 CC05 CC07
CC10 CC16 CC18 CC19 CC20
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FF11 FF31
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Claims (17)
- 【請求項1】 表皮および間質創傷治癒用ならびに/あるいは表皮および間
質創傷治癒障害および/または瘢痕障害の処置用の薬学的組成物の製造のための
、グリア細胞株由来成長因子(GDNF)またはその機能的に活性な誘導体もし
くは部分および/またはGDNFの機能活性を代替するアゴニスト、ならびに/
あるいはGDNFまたはその機能的に活性な誘導体もしくは部分および/または
該アゴニストの一次アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を少なくとも含
む核酸の使用。 - 【請求項2】 前記薬学的組成物が、ヒト組換えGDNFまたはその機能的
に活性な誘導体もしくは部分を含む、請求項1に記載の使用。 - 【請求項3】 前記薬学的組成物が、ヒト野生型GDNFをコードするヌク
レオチド配列を少なくとも含む核酸を含む、請求項1に記載の使用。 - 【請求項4】 前記薬学的組成物が、上皮および/または神経細胞に対する
栄養効果を有するさらなる薬剤を少なくとも1つ含む、請求項1〜3のいずれか
に記載の使用。 - 【請求項5】 前記薬剤が、TGF−β、BMP、GDF、アクチビン/イ
ンヒビン、ニューロトロフィン、EGF、HB−EGF、TGF−α、FGF、
KGF、HGF、IGF、PDGF、フィブロネクチンおよびその代謝産物から
なる群から選択される、請求項4に記載の使用。 - 【請求項6】 前記薬学的組成物が、抗炎症性効果を有するさらなる薬剤を
少なくとも1つ含有する、請求項1〜5のいずれかに記載の使用。 - 【請求項7】 前記炎症性薬剤が、コルチゾンのアナログ、NF−κB経路
のインヒビター、アラキドン酸経路のインヒビターおよびケモカインに対する抗
体からなる群から選択される、請求項6に記載の使用。 - 【請求項8】 前記薬学的組成物が、GDNFまたはその機能的に活性な誘
導体もしくは部分および/またはそのアゴニストを産生する細胞を含む、請求項
1〜7のいずれかに記載の使用。 - 【請求項9】 前記創傷が哺乳動物の前方眼(anterior eye)にある、請求
項1〜8のいずれかに記載の使用。 - 【請求項10】 前記創傷が、角膜上皮、間質および/または内皮にある、
請求項9に記載の使用。 - 【請求項11】 前記角膜創傷が角膜潰瘍である、請求項10に記載の使用
。 - 【請求項12】 前記創傷および/または創傷治癒障害が、感染性疾患、湿
潤障害(moistening disorders)、局所化または全身化免疫疾患、関連皮膚障害
(associated dermal disorders)、全身性疾患の眼発現(ocular manifestatio
n)、物理的傷害(physical injuries)、角膜ジストロフィーおよび変性(dege
nerations)および/または外科的介入(surgical intervention)によって引き
起こされる、請求項1〜11のいずれかに記載の使用。 - 【請求項13】 前記創傷または創傷治癒障害が、細菌感染、ウイルス感染
、真菌感染角結膜炎、類天疱瘡、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、酒さ角
膜炎(rosazea keratitis)、魚鱗癬、糖尿病、慢性関節リウマチ、クローン病
(Morbus Crohn)、ヴェグナー病(Morbus Wegner)、
エリテマトーデス(Lupus Erythematodes)、強皮症、テリエン変性(Terrien’
s degeneration)、ザルツマン変性(Salzman’s degeneration)、フックスジ
ストロフィー(Fuchs’ dystrophy)および/またはレーザー手術によって引き
起こされる、請求項12に記載の使用。 - 【請求項14】 前記薬学的組成物が、薬学的に許容される担体および/ま
たは希釈剤をさらに含有する、請求項1〜13のいずれかに記載の使用。 - 【請求項15】 前記担体が、ヒアルロン酸またはコンタクトレンズまたは
シールド(shield)である、請求項14に記載の使用。 - 【請求項16】 前記薬学的組成物が、経口的、局所的、静脈内および/ま
たは非経口的に適用される、請求項1〜15のいずれかに記載の使用。 - 【請求項17】 前記局所適用のための薬学的組成物が、点眼剤、ゲル製剤
、軟膏または眼注射用溶液として処方される、請求項16に記載の使用。
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