KR20080100828A - 상처의 치료를 위한 ＴＧＦ－β 단량체를 기초로 한 약제 및 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단량체 TGF-β 또는 이의 단편 또는 유도체의 약제로서의 용도를 제공한다. 이러한 약제는 바람직하게는 단량체 TGF-β3 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함한다. 제공된 약제는 상처 치유(wounding)를 촉진시키고/거나 반흔 형성을 억제하거나, 상피 재생을 촉진시키거나, 섬유성 질환을 예방하고/거나 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

상처의 치료를 위한 ＴＧＦ－β 단량체를 기초로 한 약제 및 단백질 {MEDICAMENTS AND PROTEINS BASED ON TGF-BETA MONOMERS FOR THE TREATMENT OF WOUNDS}

본 발명은 신규한 약제의 공급에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 상처 치유 가속화 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제에서 사용하는데 적합한 약제를 제공한다. 본 발명은 또한 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 예방, 감소 또는 억제하기 위한 방법을 제공한다.

전환 성장 인자-베타(TGF-β)는 다양한 생물학적 활성을 갖는 사이토카인의 패밀리이다. TGF-β 패밀리는 5개의 이형체, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 및 TGF-β5를 포함한다.

TGF-β는 수많은 상이한 치료학적 환경에서 유용성을 갖는다. TGF-β의 치료학적 잠재성의 결과로서, TGF-β 패밀리의 일원, 특히 TGF-β1 내지 TGF-β3의 약제학적 적용에 큰 관심을 가지고 있다.

TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 모두는 상처 치유 반응의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. TGF-β 활성은 상처 치유 속도뿐만 아니라 치유의 결과로서 발생하는 반흔 형성의 범위에 영향을 미칠 수 있다.

TGF-β1은 공피증, 혈관형성 질환, 신장 질환, 골다공증, 골 질환, 사구체 신염 및 신장 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용된다.

TGF-β2는 신경교종, 비소세포성 폐암, 췌장 종양, 고형 종양, 결장 종양, 난소 종양, 노인성 황반변성, 안구 손상, 골다공증, 망막증, 궤양, 암종, 구강 염증 및 공피증의 치료에서 사용될 수 있다.

TGF-β3는 섬유성 질환, 폐 섬유증, 간경변, 공피증, 혈관형성 질환, 재협착증, 유착, 자궁내막증, 허혈성 질환, 골 및 연골 유도, 시험관 수정, 구강점막염, 신장 질환의 치료, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제, 말초 및 중추신경계에서 신경 재연결의 향상, 안구 수술 (예를 들어, LASIK 또는 PRK 수술)의 합병증 또는 안구의 후면에서의 반흔 형성 (예를 들어, 증식성 유리체 망막증과 관련된 반흔 형성)의 예방, 감소 또는 억제에서 사용될 수 있다.

TGF-β 패밀리의 일원은 천연적으로 두개의 펩티드 사슬을 포함한 이합체의 형태로 존재한다. 활성 TGF-β 이합체는 대략 25.4 kDa의 분자량을 갖는다. 활성 TGF-β 이합체 단편은 소수성 및 이온성 상호작용에 의해 안정화되며, 이는 서브유닛간 이황화 브릿지에 의해 추가로 강화된다. 일반적으로 TGF-β 패밀리 일원의 생물학적 활성, 및 이에 따른 임의의 치료학적 활성은 활성 이합체에 의해서 단독으로 유도되는 것으로 인정되고 있다.

이러한 측면에서, TGF-β 패밀리 일원의 치료학적 성질을 이용할 수 있는 약제를 제공하기 위한 필요성이 충분히 확립된 것으로 인식될 것이다. 그러나, 이러한 TGF-β 패밀리 일원을 포함하는 약제 조성물에 대한 충분히 인식된 요구에도 불 구하고, 치료학적 용도를 위한 TGF-β의 제조와 관련하여 수많은 문제점이 알려져 있다.

치료제로서 TGF-β를 이용한 것 중 가장 큰 단점 중 하나는 원핵 생물 숙주를 사용하여 생물학적 (및 이에 따라 치료학적) 활성 단백질 이합체를 생산하기 위하여 생물학적 활성 이합체 형태에 대한 집중적인 복원이 요구된다는 것이다. 이합체 형성은 제조 시간을 현저하게 연장시킬 수 있다. 이는 또한 임의의 TGF-β의 치료학적 용도를 제한함에 있어서 중요한 관련성을 갖는다.

본 발명의 목적은 TGF-β를 포함하는 종래 기술의 약제 조성물과 관련된 문제의 적어도 일부를 제거하거나 완화시키기 위한 것이다. 특히 본 발명의 특정 구체예의 목적은 이러한 단백질의 생물학적 활성 이합체를 생산하기 위해 사용되는 시간-내포적 제조 방법의 사용과 관련된 문제점을 제거하거나 완화시키기 위한 것이다.

본 발명의 첫번째 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 TGF-β 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편이 제공된다.

본 발명은 단량체 TGF-β가 종래 이합체 TGF-β 단백질에 의해서만 제공되는 것으로 여겨지는 생물학적 활성을 나타낼 수 있다는 본 발명자들의 매우 놀라운 발견을 기초로 한 것이다. 이러한 발견으로 선택된 TGF-β의 생물학적 성질을 사용할 수 있는 효과적인 약제로 단량체 TGF-β를 사용할 수 있게 되었다. 이러한 발견, 및 이에 따른 본 발명이, 적합한 약제의 제조와 관련된 시간 및 비용의 감소를 통해 TGF-β가 치료학적으로 사용될 수 있는 실제적인 적용을 크게 확장시킴이 즉시 인지될 것이다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 약제의 장점이 임의의 단량체 TGF-β 이형체를 포함하는 약제에 의해 제공될 수 있는 것으로 여긴다. 따라서, 문맥에서 다른 것을 요구하는 것을 제외하고, TGF-β 또는 TGF-β들에 대한 언급은 TGF-β 이형체, 예를 들어 TGF-β1, 2, 3, 4 및 5의 임의의 생물학적 활성 단량체 형태를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제에서 사용하기 위해 적합한 바람직한 단량체는 (임의의 요망되는 이형체의) 야생형 TGF-β 단량체이다. 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 단량체 TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 단량체 TGF-β는 TGF-β3이며, 본 발명의 두번째 양태에서 TGF-β3 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편이 약제로서 사용하기 위해 제공된다. 본 발명에 따라 사용되는 TGF-β 단량체는 인간 TGF-β 단량체인 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 약제에 사용되는 TGF-β는 실질적으로 전부 단량체 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제 또는 방법에서 사용하기에 적합한 단량체 TGF-β는 바람직하게는 대략 12 kDa, 더욱 바람직하게는 대략 12.5 kDa의 분자량을 가질 수 있다.

TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 이형체의 인간형의 아미노산 잔기 서열은 각각 서열 목록 번호 1, 2 및 3으로 나타내며, 임의의 이러한 서열, 또는 임의의 이러한 서열의 생물학적 활성 단편을 포함한 단량체 TGF-β는 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 단량체를 구성한다. 단량체 TGF-β3 (서열 목록 번호 3)은 특히 본 발명의 여러 양태에 따라 사용하기 위한 바람직한 단량체를 구성한다.

문맥에서 다른 것을 요구하는 것을 제외하고, 본 명세서에서 단량체 TGF-β에 대한 언급 (특정 이형체에 대한 언급을 포함)은 또한 이러한 단량체 TGF-β의 생물학적 활성 단편 및 유도체를 포함하는 것이다. 서열 목록 번호 1 내지 3으로부터 유도가능한 생물학적 활성 단편은 본 발명의 약제에서 사용하기 위한 바람직한 단편이며, 서열 목록 번호 3으로부터 유도가능한 생물학적 활성 단편은 특히 바람직한 단편을 구성한다. 바람직한 생물학적 활성 단편은 선택된 TGF-β 이형체의 수용체-결합 부분을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제 또는 방법에서 사용될 수 있는 단량체 TGF-β의 적합한 유도체는 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 치료학적으로 효과적인 펩티드 유도체; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 약리작용단을 포함하거나 이를 기초로 한 치료학적으로 효과적인 단편 또는 유도체; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 치료학적으로 효과적인 펩토이드 유도체; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 치료학적으로 효과적인 D-아미노산 유도체; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)을 기초로 한 치료학적으로 효과적인 펩티도미메틱 (peptidomimetic); 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 치료학적으로 효과적인 펩티드 유사체; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 치료학적으로 효과적인 유사펩티드; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)의 치료학적으로 효과적인 레트로-인버소 (retro-inverso) 펩티드; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)에 기초한 치료학적으로 효과적인 뎁시펩티드 (depsipeptide) 유도체; 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)를 기초로 한 치료학적으로 효과적인 β-펩티드 유도체; 및 단량체 TGF-β (또는 이의 단편)를 기초로 한 치료학적으로 효과적인 레트로펩토이드 유도체를 포함한다.

본 발명자들은 인간 TGF-β3의 단량체 형태가 예를 들어 섬유성 질환, 공피증, 혈관형성 질환, 재협착증, 유착, 자궁내막증, 허혈성 질환, 골 및 연골 유도, 시험관 수정, 구강점막염, 신장 질환의 치료, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제, 말초 및 중추신경계에서 신경 재연결의 향상, 안구 수술 (예를 들어, LASIK 또는 PRK 수술)의 합병증의 예방, 감소 또는 억제, 언청이 및 구개열의 치료, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제 및 힘줄 및 인대의 치유 가속화를 위해, 이합체 TGF-β3과 동일한 방식으로 사용될 수 있음을 발견하였다. TGF-β3의 단량체 형태는 또한 상피 손상 부위에서 상피 재생을 촉진시킬 수 있다.

본 발명자들의 발견은 또한 TGF-β1 및 TGF-β2의 단량체 형태가 이러한 성장 인자의 이합체 형태와 관련된 모든 치료학적 활성을 나타낼 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 문맥에서 "생물학적 활성"은 바람직하게는 생체내에서 측정된다. 본 발명자들은, 종래 기술에서 공개된 발견과 일치하게, TGF-β의 단량체 형태는 대개 시험관내 방법에 의해 평가하여 생물학적 활성을 나타내지 못함을 발견하였다. 그러나, 종래 기술과는 정반대로, 본 발명자들은 매우 놀랍게도 TGF-β의 단량체 형태가 생체내에서 생물학적 및 치료학적 활성을 나타낼 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따라 생물학적 활성인 것으로 여겨지는 단량체 TGF-β 또는 이의 단편 또는 유도체에 대해, 단량체 TGF-β가 시험관내 및 생체내 수단 모두에 의해 측정가능한 생물학적 활성을 나타낼 필요는 없고, 단지 주로 시험관내 또는 생체내에서 측정될 수 있는 생물학적 활성, 및 바람직하게는 생체내에서 측정될 수 있는 활성을 나타내는 것이 인식될 것이다.

적합하게는, 본 발명의 첫번째 양태에 따라 사용하기에 적합한 단량체 TGF-β의 생물학적 활성은 제공된 TGF-β의 이합체의 공지된 생물학적 활성과 관련하여 측정될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물학적 활성은 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 예방, 감소 또는 억제하기 위한 단량체 (예를 들어, 서열 목록 번호 3의 단량체)의 능력과 관련하여 측정될 수 있다.

상기 문단의 측면에서, 본 발명의 첫번째 또는 두번째 양태에 따른 약제가 상체 치유의 가속화 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제에서 사용하기에 특히 적합한 것으로 인식될 것이다. 더욱이, 본 발명의 첫번째 또는 두번째 양태에 따른 약제는 또한 재-상피화의 촉진에서 사용하기에 특히 적합하다.

또한, 본 발명의 세번째 양태에서, 상처 치유의 가속화 및/또는 반흔 형성의 억제에서 사용하기 위한 약제의 제조에서, TGF-β3 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편의 사용이 제공된다.

본 발명의 네번째 양태에서, 상피 재생의 촉진에서 사용하기 위한 약제의 제조에서, TGF-β3 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편의 사용이 제공된다.

본 발명의 다섯번째 양태에서, 섬유성 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용하기 위한 약제의 제조에서 TGF-β3 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편의 사용이 제공된다. 이러한 약제를 사용하여 예방되고/거나 치료될 수 있는 바람직한 섬유성 질환은 폐 섬유증, 간 섬유증, 공피증, 피부 섬유증, 근섬유증, 방사선 섬유증, 신장 섬유증, 및 자궁 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 여섯번째 양태에서, 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 억제하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 단량체 TGF-β3 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 일곱번째 양태에서, 상피 재생을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 단량체 TGF-β3 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 여덟번째 양태에서, 섬유증 질환을 예방하고/하거나 치료하는 방법이 제공되며, 이러한 방법은 이러한 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 치료학적 유효량의 단량체 TGF-β3 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법을 사용하여 예방되고/되거나 치료될 수 있는 바람직한 섬유성 질환은 폐 섬유증, 간 섬유증, 공피증, 피부 섬유증, 근섬유증, 방사선 섬유증, 신장 섬유증 및 자궁 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 목적을 위하여, 치료학적 유효량의 단량체 TGF-β, 또는 이의 단편은 하기 요구되는 것을 야기시키기에 충분한 양이다:

i) 상처 치유의 가속화 및/또는 반흔 형성의 억제; 또는

ii) 상피 재생의 촉진; 또는

iii) 섬유성 질환의 예방 및/또는 치료.

상처 치유의 가속화 및/또는 반흔 형성의 억제, 또는 상피 재생, 또는 섬유증의 예방 또는 감소의 요구될 수 있는 범위는 환자의 관리에 책임이 있는 임상의에게 자명하게 될 것이고, 또한 이에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상처 치유의 가속화 및/또는 반흔 형성의 억제, 또는 상피 재생의 촉진, 또는 섬유증의 예방 또는 감소의 범위의 적합한 평가는 임상의에 의해 결정될 수 있고, 본원에 기술된 제안된 평가 방법을 참조할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 적합한 및 바람직한 단량체 TGF-β는 본원에 기술된 임의의 고려사항 또는 모든 고려사항을 참조로 하여 선택될 수 있다.

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제와 함께 상처 치유의 가속화를 달성하거나 섬유증 질환, 예를 들어 폐 섬유증, 간경변, 공피증, 사구체 신염 등의 예방 또는 치료를 달성하기를 원하는 경우에서, 일반적으로 단량체 TGF-β3 또는 적합한 생물학적 활성 단편을 사용하는 것이 바람직할 것이다.

단량체 TGF-β3의 사용은 특히 뛰어난 잇점을 갖지만, 다른 TGF-β 이형체의 단량체 형태를 포함한 약제 또한 큰 가치를 갖는다.

예를 들어, 단량체 TGF-β1 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함한 약제는 만성 비치유 상처, 예를 들어, 정맥성 궤양, 욕창, 당뇨병 궤양, 혈관형성 질환, 신장 질환, 골다공증, 골 질환, 사구체 신염 및 신장 질환의 예방 및/또는 치료에서 사용될 수 있다. 예로서, 국소적으로 전달된 야생형 이합체 TGF-β1은 동물 모델에서 골 성장 및 재생의 강력한 자극제인 것으로 나타난다. 더욱이, TGF-β1의 투여는 특히 뇌 (이후 뇌졸중), 및 심장 (이후 관상동맥 패색증)에서의 허혈성 관류 손상으로부터 조직을 보호하는 것으로 나타났다.

단량체 TGF-β2 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 약제는 신경교종, 비소세포성 폐암, 췌장 종양, 고형 종양, 결장 종양, 난소 종양, 노인성 황반변성, 안구 손상, 골다공증, 망막증, 궤양, 암종, 구강 염증 및 공피증의 치료에서 사용될 수 있다. 예로서, 야생형 이합체 TGF-β2의 국소 적용은 두번의 임상 시도에서 정맥내 저혈과 관련된 만성 다리 궤양의 회복을 촉진하는 것으로 나타났으며; 동물 모델에서 재조합 인간 TGF-β2의 국소 전달은 골 재-성장 및 재생을 촉진시키는 것으로 나타났다.

단량체 TGF-β3 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 약제는 상처 (궤양과 같은 만성 상처를 포함), 공피증, 섬유성 질환, 예를 들어 폐 섬유증, 간경변, 신장 섬유증 등, 혈관형성 질환, 재협착증, 유착, 자궁내막증, 허혈성 질환, 골 및 연골 유도, 시험관 수정, 구강점막염 및 신장 질환의 치료에서 사용될 수 있다. 예로서, 야생형 이합체 TGF-β3의 국소 적용은 동물 모델 및 임상에서, 만성의 비-치유 욕창의 치유 속도를 가속화시키고; 구강점막염의 빈도, 중증도 및 기간을 감소시키고; 암치료 동안 방사선치료 및 화학치료에 의해 초래되는 줄기 세포에 대한 손상을 초래하는 방사선 위장 증후군의 부작용을 감소시키는 것으로 나타났다. 본 발명자들의 발견은 단량체 TGF-β3가 이합체 TGF-β3의 공지된 치료학적 활성을 초래하기 위하여 이러한 모든 환경에서 사용될 수 있음을 나타낸다.

상처 치유를 가속화시키는 본 발명의 특정 방법 및 약제 (서열 목록 번호 3에 나타낸 TGF-β 단량체를 사용한 것)의 능력은 치료된 상처에 의해 나타낸 성질과 관련하여 용이하게 인식되고/거나 측정될 수 있다. 본 발명의 목적상, "치료되는 상처"는 치료학적 유효량의 본 발명의 약제에 노출되는 상처, 또는 본 발명의 방법에 따라 치료된 상처로 간주될 수 있다.

치료되는 상처의 치유의 가속화는 대조군 상처와 비교하여 상피화의 증가 속도로 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 약제는 그렇지 않은 경우에서 보다 상처 영역에 대한 기능성 상피층의 보다 빠른 재구성을 촉진시킨다.

대안적으로 또는 추가적으로, 치료되는 상처의 가속화된 치유는 비교가능한 시점에서 대조군 상처와 비교하여 감소된 폭에 의해 나타낼 수 있다. 이러한 상처 폭의 감소는 상처 종결의 비교적 더 빠른 속도이며 (이는 보다 작은 상처의 폭이 닫혀지기 때문), 치유 반응을 가속화시키기 위한 이러한 약제의 능력을 나타냄이 인식될 것이다. 보다 폭이 좁은 상처는 보다 폭이 넓은 반흔에 비해 심미적으로 바람직한 보다 폭이 좁은 반흔을 야기시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 문맥에서 상처 치유 가속화는 대조군으로 치료되거나 치료되지 않은 상처에서 발생하는 치유 속도와 비교하여 치료되는 상처의 치유 속도의 임의의 증가를 포함할 것이다. 바람직하게는, 상처 치유 가속화는 비교가능한 시점에서 치료 상처 및 대조군 상처에서 달성되는 재-상피화 속도의 비교, 또는 치료 상처 및 대조군 상처의 상대적 폭의 비교와 관련하여 평가될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상처 치유 가속화는 비교가능한 시점에서 대조군 상처와 비교하여 증가된 재-상피화 속도 및 상처 폭의 감소 둘 모두를 포함하는 것으로서 규정될 수 있다.

바람직하게는 상처 치유 가속화의 촉진은 대조군 상처 또는 치료되지 않는 상처에서 발생하는 치유 속도에 비해 적어도 5%, 10%, 20% 또는 30% 이상 더 높은 상처 치유 속도를 초래할 수 있다. 더욱 바람직하게는 상처 치유 가속화의 촉진은 대조군 상처의 치유에 비해 적어도 40%, 50% 또는 60% 이상 더 높은 치유 속도를 초래할 수 있다. 더더욱 바람직하게는 상처 치유 가속화의 촉진은 대조군 상처에서 발생하는 것에 비해 적어도 70%, 80%, 또는 90% 이상 더 높은 치유 속도를 초래할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상처 치유 가속화의 촉진은 대조군 상처에서 발생하는 것에 비해 적어도 100% 이상의 치유 속도를 초래할 수 있다.

정상 상처 치유 반응의 부적절한 실패, 지연 또는 방해에 의해 특징되거나 적어도 부분적으로 특징되는 광범위한 상처 치유 질환이 존재한다. 따라서 상처 치유 가속화를 촉진시키기 위한 본 발명의 특정 방법 및 약제의 능력은 이러한 질환의 예방 또는 치료에서 유용하다.

본 발명의 특정 방법 및 약제가 자극화된 재-상피화 반응의 촉진을 통한 상처 치유 가속화를 초래할 수 있기 때문에 (이에 의해 상처가 아무는 속도를 증가시킴), 본 발명의 이러한 방법 및 약제는 그밖에 결함이 있거나 지연되거나, 그밖에 재상피화를 손상시키기 쉬울 수 있는 환자의 상처 치료에 특히 유리함이 인지될 것이다. 예를 들어, 노인의 피부 상처가 보다 젊은 개체의 피부 상처에 비해 보다 떨어진 활기의 재상피화 반응을 나타낸다는 것은 널리 공지된 것이다. 또한 상처 치유가 지연되거나 달리 손상된 재-상피화와 관련된 수많은 질환 또는 질병이 있다. 예를 들어, 당뇨병에 걸린 환자, 다약제 복용의 환자 (예를 들어, 노령의 결과로서), 폐경기 후 여성, 압력 손상에 걸리기 쉬운 환자 (예를 들어, 하반신 불수), 정맥 질환의 환자, 임상학적 비만 환자, 화학치료를 받는 환자, 방사선치료를 받는 환자, 스테로이드 치료를 받는 환자, 또는 면역-약화(immuno-compromised) 환자 모두는 손상된 재-상피화를 지닌 상처 치유로부터 고통당할 수 있다. 이러한 여러 경우에서, 적절한 재-상피화 반응의 결여는 상처 부위에서 감염증의 발달을 초래하고, 이는 이후 궤양과 같은 만성 상처를 형성시킬 수 있다. 따라서, 이러한 환자들은 본 발명의 적합한 방법 또는 약제로부터 특히 유익할 것으로 인식될 것이다.

만성 상처는 아마도 지연된 상처 치유 반응과 관련된 질환의 가장 중요한 예이다. 적절한 (통상적인) 치료학적 치료를 수행할 때 형성 후 8주 내에 임의의 치유 성향을 나타내지 않는 경우, 상처는 만성적인 것으로 정의될 수 있다. 널리 공지된 만성 상처의 예는 정맥성 궤양, 당뇨병 궤양 및 욕창을 포함하지만, 만성 상처는 임의의 시간에 다른 일반적인 급성 손상으로 일어날 수 있다. 통상적으로, 만성 상처는 상처 부위의 감염증, 부적합한 상처 치료의 결과로서, 또는 정맥, 동맥, 또는 대사성 혈관 질환, 압력, 방사선 손상, 또는 종양에 의해 야기되는 진행성 조직 파괴의 결과로서 일어날 수 있다.

상처 치유를 가속화시킬 수 있는 본 발명의 방법 및 약제는 이러한 치유를 촉진시키기 위하여 존재하는 만성 상처의 치료에 이용될 수 있는 것으로 인식될 것이다. 이러한 방법 및 약제는 만성 상처의 재-상피화를 촉진시킬 수 있으며, 이에 의해 치유 및 질환의 종결을 초래한다. 본 발명의 바람직한 방법 및 약제 (예를 들어, 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체 TGF-β3를 이용하는 방법 및 약제)는 또한 상처 치유와 관련된 반흔 형성을 억제할 수 있다. 이러한 문맥에서 반흔 형성의 예방은 특히 유리할 수 있는데, 이는 만성 상처가 통상적으로 환자의 신체에 비교적 큰 부분에 걸쳐 연장될 수 있기 때문이다.

추가로, 또는 대안적으로, 존재하는 만성 상처의 치료에서 이의 사용을 위하여, 본 발명의 적합한 방법 및 약제는 만성 상처로 발달되는 손상된 상처 치유에 대한 성향을 갖는 환자의 급성 상처를 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 적절한 방법 및 약제가 손상된 부위의 상피 적용범위를 촉진시킬 수 있기 때문에, 이들은 치료된 상처가 감염될 가능성을 감소시킬 수 있다. 유사하게는, 이러한 재-상피화의 촉진은 당뇨병 또는 정맥성 질환과 같은 다른 질환의 결과로서 발생하는 만성 상처의 치료에서 유익할 수 있다.

본 발명의 방법 및 약제에 특정하게 유리한 환자의 또 다른 군은 면역계가 약화된 환자 (예를 들어, 화학치료 또는 방사선치료를 수행하는 환자, 또는 HIV 감염증에 걸린 환자)이다. 상처 형성 후 일반적인 염증 반응을 수행할 수 없는 면역기능 약화된 환자의 상처는 불량한 치유 결과와 관련됨이 널리 인지되어 있다. 이러한 환자는 본 발명의 적합한 방법 및 약제를 이용한 치료에 유리할 수 있다.

상처 치유 가속화를 촉진시키면서 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하기 위한 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체 TGF-β를 이용하는 본 발명의 약제 및 방법의 능력은 또한 더욱 일반적인 임상적 환경에서 사용된다. 추가 잇점의 예는 하기에 기술된 바와 같이 1차, 2차 또는 3차 계획에 의한 상처 치유와 관련있는 것으로 간주될 수 있다.

본 발명의 목적상, 1차 계획에 의한 치유는 상처의 마주보는 가장자리의 수술 수단 (예를 들어, 봉합, 접착제 스트립 또는 스테이플)에 의한 봉합을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 1차 계획에 의한 치유는 통상적으로 수술 절개 또는 다른 청결 상처의 치료에서 사용되고, 최소 수준의 조직 손실과 관련이 있다. 당업자는 본 발명에 따른 적절한 약제 또는 방법 (예를 들어, 서열 목록 번호 3을 포함하는 것)가 상처 폭을 감소시킬 수 있기 때문에 이들은 마주보는 상처 가장자리의 결합을 촉진시키며, 이에 따라 1차 계획에 의해 상처 치유에 유리할 수 있는 것을 인식할 것이다. 더욱이, 이러한 방법 또는 약제는 (하기에 추가로 기술되는 바와 같이) 달리 이러한 치유에 대해 일어날 수 있는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제를 초래할 수 있다. 본 발명자들은 이러한 방식의 치료가 치료된 상처로부터 형성된 육안적 및 현미경적 외관의 반흔 모두에 영향을 미칠 것으로 생각되며; 육안적으로 반흔이 보다 덜 눈에 띄지 않고 주변 피부와 배합될 수 있고, 현미경적으로 반흔은 보다 일반적인 피부 구조의 재생을 나타낼 수 있다.

본 발명의 목적상, 2차 계획에 의한 치유는 직접적인 외과 수술 시행없이 상처 치유 과정에 의한 상처의 봉합을 구성하는 것으로 여겨질 수 있다. 2차 계획에 의해 치유되는 상처는 지속적인 주의 (예를 들어, 상처의 드레싱 및 재-드레싱 뿐만 아니라 적합한 약제의 적용)로 수행될 수 있지만, 상처의 봉합을 초래하는 과립화 조직 형성 및 재-상피화의 천연 과정이다. 본 발명의 바람직한 약제 및 방법 (예를 들어, 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체를 이용하는 약제 및 방법)이 대조군 상처에서 발생되는 것과 비교하여 재-상피화의 속도를 증가시키고 이후의 반흔 형성을 감소시킬 수 있기 때문에 이들은 2차 계획에 의한 상처 치유의 촉진에 유용함이 인식될 것이다.

3차 계획에 의한 치유는 적어도 부분적인 과립화 조직 형성 및 재-상피화를 허용하는 종래 개방되어 있는 상처의 수술 봉합을 포함하는 것으로 여겨질 수 있다. 1차 또는 2차 계획에 의한 치유에서 사용하기에 적합한 본 발명의 바람직한 방법 및 약제의 성질은 또한 3차 계획에 의해 상처 치유를 촉진시키는 환경에서 유리하다.

재-상피화를 자극하면서 (상처 치유 가속화 촉진의 일부로서) 반흔 형성을 억제하기 위한, 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체를 이용하는 본 발명의 바람직한 방법 및 약제의 사용은 또한 이식 수술과 관련된 상처의 치료에 특히 효과적이다. 본 발명의 이러한 방법 및 약제를 이용한 치료는 이식 공여체 부위 (반흔 형성을 예방, 감소 또는 억제하면서 기능성 상피 층의 재-확립에 도움을 줄 수 있는 부위) 및 이식 수용체 부위 (치료의 항-반흔 형성 효과가 반흔 형성을 억제하면서 가속화된 치유가 이식된 조직의 융합을 촉진시키는 부위) 모두에 유리하다. 본 발명자들은 피부, 인공 피부 또는 피부 치환물을 이용한 이식의 환경하에서 장점을 부여하는 것으로 여겨진다.

본 발명자들은 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체를 이용한 본 발명의 방법 및 약제가 상처 형성 이전에 또는 상처가 이미 형성된 직후에 투여될 때 반흔 형성의 억제와 함께 상처 치유 가속화를 촉진시킬 수 있음을 발견하였다.

본 발명자들은 단량체 TGF-β3, 예를 들어 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체 TGF-β3을 이용한 본 발명의 방법 또는 약제가 상피 재생을 촉진시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 문맥 내에서 상피 재생의 촉진은 대조군-처리되거나 처리되지 않은 상피에서 일어나는 재생과 비교하여 상피 재생 속도의 임의의 증가를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명에 따른 적합한 방법 또는 약제를 이용하여 달성된 상피 재생의 속도는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 상피 재생의 모델을 이용하여 대조군-처리되거나 처리되지 않은 상피에서 수행된 것과 용이하게 비교될 수 있다. 예를 들어, 공지된 재생 영역을 갖는 실험적 상피 손상 부위에서의 속도는 문헌[Tomlinson and Ferguson (2003), Davidson et al. (1991) and Paddock et al (2003)]에 기술된 것과 같은 마우스, 래트, 래빗 또는 돼지에서의 널리 공지된 생체내 모델을 이용하여 비교될 수 있다.

임의의 가설에 의해 제한하고자 하는 바는 아니지만, 본 발명자들은 TGF-β3의 단량체 형태에 의해 달성된 상피 재생의 촉진이 상피 세포 이동의 단량체의 촉진에 의해 매개되는 것으로 여긴다. 이에 의해 상피 세포 (이의 이동이 촉진됨)는 치료의 부재하에 일어나는 것 보다 더욱 빠르게 손상된 상피를 다시 차지하고 재생시킬 수 있다.

서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체를 이용한 상피 재생의 촉진은 재-상피화 반응이 손상되거나, 억제되거나, 지연되거나, 달리 불완전한 환경하에서 효과적인 재-상피화를 유도하기 위해 사용될 수 있는 것으로 인식될 것이다. 상피 재생의 촉진은 상피 손상으로 고통당하는 환자에게서 불완전하거나 정상인 상피 재생 반응의 속도를 가속시킬 수 있다.

신체의 재-상피화 반응이 불안정할 수 있는 수많은 환경이 존재한다. 예를 들어, 피부에서의 불안정한 재-상피화는 질환, 예를 들어 천포창, 헤일리-헤일리(Hailey-Hailey) 질환 (가족성 양성 천포창), 독성 표피 괴사융해증 (TEN)/리엘스 증후군, 수포성표피박리종, 피부 리슈마니아증 및 광선각화증과 관련이 있다. 폐의 불안정한 재-상피화는 특발성 폐섬유증 (IPF) 또는 간질성 폐질환과 관련이 있을 수 있다. 눈의 불안정한 재-상피화는 부분 각막윤부 결핍증 또는 각막 진무름과 같은 질환과 관련이 있을 수 있다. 위장관계 또는 결장의 불안정한 재-상피화는 만성 항문 열상 (치열), 궤양성 직장염 또는 크론병, 및 다른 염증성 장질환과 같은 질환과 관련이 있을 수 있다.

상기에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 특정 방법 또는 약제 (특히, 서열 목록 번호 3을 포함하는 단량체를 이용하는 방법 또는 약제)는 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 그밖에 억제하는데 사용될 수 있다. 반흔 형성의 이러한 억제는 임의의 신체 부위, 및 임의의 조직 또는 기관, 예를 들어 피부, 안구, 신경, 힘줄, 인대, 근육, 및 구강 (입술 및 구개), 뿐만 아니라 내부 기관 (예를 들어, 간, 심장, 뇌, 복강, 골반강, 흉강, 소화관 및 생식 조직)에서 달성될 수 있다. 피부에서, 치료는 육안적 및 현미경적 외관의 반흔을 개선시킬 수 있으며; 육안적으로 반흔은 보다 작게 보이게 될 것고 주변 피부와 융합될 것이며, 현미경적으로 반흔 내의 콜라겐 섬유는 주변 피부와 보다 유사한 형태 및 조직을 가질 수 있다. 본 발명의 문맥내에서 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 대조군-처리되거나 처리되지 않은 상처에서 발생하는 반흔 형성의 수준과 비교한 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제의 임의의 정도를 포함하는 것으로 이해되어야 한다 (본 명세서에서 정의됨). 문맥이 다른 것을 요구하는 것을 제외하고, 반흔 형성의 "예방," "감소," 또는 "억제"에 대한 언급은 항-반흔 형성 활성에서 모두 명백한 균등한 메카니즘을 가질 수 있다.

본 발명의 방법 및 약제를 사용하여 달성된 피부 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료되지 않은 반흔의 외관과 비교하여 치료된 반흔의 현미경적 또는 바람직하게는 육안적 외관과 관련하여 평가되고/거나 측정될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료된 반흔의 육안적 및 현미경적 형태 둘 모두와 관련하여 평가될 수 있다. 본 발명의 목적상, "치료된 반흔"은 치료된 상처의 치유시에 형성된 반흔으로 정의될 수 있으며, "치료되지 않은 반흔"은 치료되지 않은 상처, 또는 위약 또는 표준 간호로 치료된 상처의 치유시에 형성된 반흔으로 정의될 수 있다. 적합한 비교 반흔은 바람직하게는 반흔 연령, 부위, 크기 및 환자와 관련하여 치료된 반흔과 매치될 수 있다.

치료된 상처로부터 초래되는 반흔의 육안적 외관을 고려하여, 반흔 형성의 범위, 및 이에 따라 달성될 반흔 형성의 임의의 예방, 억제 또는 감소의 크기는 임의의 여러 파라미터와 관련하여 평가될 수 있다.

반흔의 육안적 평가를 위한 적합한 파라미터는 하기를 포함할 수 있다:

i) 반흔의 색. 상기에 기재된 바와 같이, 반흔은 통상적으로 주변 피부와 관련하여 저색소화되거나 과색소화될 수 있다. 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 색소화가 치료되지 않은 반흔의 색소화 보다 반흔을 지니지 않은 피부의 색소화에 더욱 밀접하게 유사해지는 것으로 입증될 수 있다. 유사하게는, 반흔은 주변 피부 보다 더욱 붉을 수 있다. 이러한 경우에, 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료되지 않은 반흔과 비교하여 치료된 반흔의 발적(redness)이 조기에, 또는 더욱 완전하게, 또는 주변 피부의 형태와 더욱 밀접하게 닮게 사라지는 경우 입증될 수 있다.

ii) 반흔의 높이. 반흔은 통상적으로 주변 피부와 비교하여 부풀어 오르거나 낮아질 수 있다. 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 높이가 치료되지 않은 반흔의 높이 보다 반흔을 지니지 않은 피부의 높이와 더욱 가까운 경우 (즉, 부풀어 오르지 않거나 낮아지지 않은 경우) 입증될 수 있다.

iii) 반흔의 표면 질감. 반흔은 주변 피부 보다 비교적 부드럽거나 ("광택" 외관을 갖는 반흔을 초래함), 주변 피부 보다 거친 표면을 가질 수 있다. 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 표면 질감이 치료되지 않은 반흔의 표면 질감 보다 반흔을 지니지 않은 피부의 것에 더욱 가까운 경우 입증될 수 있다.

iv) 반흔의 강직도. 반흔의 비정상적 조성 및 구조는 이들이 일반적으로 반흔 주변의 손상되지 않은 피부에 비해 강직함을 의미한다. 이러한 경우에, 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 강직도가 치료되지 않은 반흔의 강직도 보다 반흔을 지니지 않은 피부의 것에 더욱 가까운 경우 입증될 수 있다.

치료된 반흔은 바람직하게는 상기 기술된 육안적 평가를 위한 하나 이상의 파라미터와 관련하여 평가하므로써 반흔 형성의 예방, 억제, 또는 감소를 입증할 것이다. 더욱 바람직하게는, 치료된 반흔은 적어도 두개의 파라미터, 더더욱 바람직하게는 적어도 세개의 파라미터, 및 가장 바람직하게는 4개 모두의 파라미터와 관련하여 반흔 형성의 예방, 억제, 감소를 입증할 수 있다. 반흔 형성의 전체 평가는 예를 들어 비쥬얼 아날로그 스케일(Visual Analogue Scale) 또는 디지탈 평가 스케일을 이용하여 이루어질 수 있다.

반흔의 현미경적 평가를 위해 적합한 파라미터를 하기를 포함할 수 있다:

i) 세포외 매트릭스 (ECM) 섬유의 두께. 반흔은 통상적으로 주변 피부에서 발견되는 것 보다 얇은 ECM 섬유를 함유한다. 이러한 성질은 켈로이드 및 비후성 반흔의 경우에서 더욱 현저하다. 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔에서의 ECM 섬유의 두께가 치료되지 않은 반흔에서 발견된 섬유의 두께에 비해 반흔을 지니지 않은 피부에서 발견된 ECM 섬유의 두께와 더욱 가까운 경우 입증될 수 있다.

ii) ECM 섬유의 배향. 반흔에서 발견된 ECM 섬유는 반흔을 지니지 않은 피부에서 발견되는 것 보다 큰 정도의 정렬을 나타내는 성향이 있다 (이는 흔히 "바스켓 위브 (basket weave)"로서 언급되는 무작위 배향을 갖는다). 켈로이드 및 비후성 반흔과 같은 병리학적 반흔의 ECM은 심지어 변칙적 배향을 나타내어, 흔히 ECM 분자의 큰 "소용돌이(swirls)" 또는 "캡슐"을 형성할 수 있다. 따라서, 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 ECM 섬유의 배향이 치료되지 않은 반흔에서 발견된 이러한 섬유의 배향 보다 반흔을 지니지 않은 피부에서 발견된 ECM 섬유의 배향과 더욱 가까운 경우 입증될 수 있다.

iii) 반흔의 ECM 조성. 반흔에 존재하는 ECM 분자의 조성은 정상 피부에서 발견된 것과 차이를 나타내는데, 반흔의 ECM에 존재하는 엘라스틴의 양이 감소한다. 따라서, 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 진피 중의 ECM 섬유의 조성이 치료되지 않은 반흔에서 발견된 조성에 비해 반흔을 지니지 않은 피부에서 발견된 이러한 섬유의 조성과 더욱 가까운 경우 입증될 수 있다.

iv) 반흔의 세포충실성. 반흔은 반흔을 지니지 않은 피부에 비해 비교적 적은 세포를 함유하는 성향이 있다. 그러므로, 반흔 형성의 억제 또는 감소는 치료된 반흔의 세포충실성이 치료되지 않은 반흔의 세포충실성에 비해 반흔을 지니지 않은 피부의 세포충실성과 더욱 가까운 경우 입증될 수 있는 것으로 인식될 것이다.

치료된 반흔은 바람직하게는 상술된 현미경적 평가를 위한 파라미터 중 적어도 하나와 관련하여 평가하므로써 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제를 입증할 것이다. 더욱 바람직하게는, 치료된 반흔은 파라미터 중 적어도 두개, 더더욱 바람직하게는 파라미터 중 적어도 세개, 및 가장 바람직하게는 네개 모두의 파라미터와 관련하여 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제를 입증할 수 있다.

치료된 상처의 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 하기에서 사용되는 적합한 파라미터와 관련하여 추가로 평가될 수 있다:

i) 반흔의 육안적 임상 평가, 특히 피검체의 반흔의 평가;

ii) 반흔의 사진 이미지의 평가;

iii) 실리콘 몰드 또는 반흔의 실리콘 몰드로부터 제조된 포지티브 회반죽 캐스트의 평가; 및

iv) 예를 들어, 반흔의 현미경적 구조의 조직학적 분석에 의한 반흔의 현미경적 평가.

치료된 상처의 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 하나 이상의 이러한 적합한 파라미터의 개선에 의해 나타날 수 있으며, 여러 파라미터와 관련하여 평가한 예방, 감소 또는 억제의 경우에서 이러한 파라미터는 상이한 평가식으로부터 조합될 수 있는 것으로 인식될 것이다 (예를 들어, 적어도 하나의 파라미터의 감소, 억제 또는 개선은 육안적 평가에서 사용되고, 적어도 하나의 파라미터는 현미경적 평가에서 사용된다).

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료된 반흔이 치료되지 않거나 대조군 반흔에 비해 선택된 파라미터(들)와 관련하여 반흔을 지니지 않은 피부와 더욱 가까움을 나타내는 하나 이상의 파라미터의 개선에 의해 입증될 수 있다.

반흔의 임상적 측정 및 평가를 위한 적합한 파라미터는 문헌[Beausang et al (1998) and van Zuijlen et al (2002)]에 기재된 것을 포함하는 다양한 측정 또는 평가를 기초로 하여 선택될 수 있다.

통상적으로, 적합한 파라미터는 하기를 포함할 수 있다:

1. 비쥬얼 아날로그 스케일 (VAS) 반흔 스코어와 관련한 평가

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 대조군 반흔과 비교하여 치료된 반흔의 VAS 스코어의 감소에 의해 입증될 수 있다. 반흔의 평가에서 사용되는 적합한 VAS는 문헌[Beausang et al (1998)]에 기술된 방법을 기초로 할 수 있다.

2. 반흔 높이, 반흔 폭, 반흔 경계선, 반흔 면적 또는 반흔 부피.

반흔의 높이 및 폭은 예를 들어 수동 측정 디바이스, 예를 들어 캘리퍼스를 이용하여 피검체에서 직접 측정될 수 있다. 반흔 폭, 경계선 및 면적은 피검체에서 직접적으로 또는 반흔의 사진의 이미지 분석에 의해 측정될 수 있다. 당업자는 또한 실리콘 몰딩, 초음파, 광학적 3차원 프로필리메트리(profilimetry) 및 고해상도 자기공명이미지를 포함한, 적합한 파라미터를 조사하기 위해 사용될 수 있는 추가의 비-침습성 방법 및 디바이스를 인지할 것이다.

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료되지 않은 반흔과 비교하여 치료된 반흔의 높이, 폭, 면적 또는 부피, 또는 이들의 임의의 조합의 감소에 의해 입증될 수 있다.

3. 주변 반흔을 지니지 않은 피부와 비교한 반흔의 형태 및/또는 색

치료된 반흔의 외관 또는 색은 주변 반흔을 지니지 않은 피부의 것과 비교될 수 있으며, 차이 (존재시)는 치료되지 않은 반흔의 형태와 색 및 반흔을 지니지 않은 피부의 형태와 색 사이의 차이와 비교된다. 이러한 비교는 개개의 반흔 및 반흔을 지니지 않은 피부의 시각적 평가를 기초로 하여 이루어질 수 있다. 반흔의 외관은 반흔이 반흔을 지니지 않은 피부에 비해 더욱 밝거나 어두운 지의 여부와 관련하여 반흔을 지니지 않은 피부와 비교될 수 있다. 반흔 및 피부의 개개의 색은 서로 완전하게 일치되거나, 약간 불일치되거나, 명확하게 불일치되거나, 심각하게 불일치될 수 있다.

시각적 평가에 대해 대안적으로 또는 추가적으로, 반흔 및 반흔을 지니지 않은 피부의 색소화 및 피부의 발적과 관련한 데이터 (반흔 또는 피부에 존재하는 혈관 분포의 정도의 인디케이터일 수 있음)를 제공할 수 있는 다수의 비-침습성 비색측정 (colourimetry) 디바이스가 존재한다. 이러한 디바이스의 예로는 Minolta Chronameter CR-200/300; Labscan 600; Dr. Lange Micro Colour; Derma Spectrometer; laser-Doppler 흐름계측기; 및 Spectrophotometric Intracutaneous Analysis (SIA) 스코프를 포함한다.

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료되지 않은 반흔과 반흔을 지니지 않은 피부 사이에서 보다 치료된 반흔의 외관 또는 색과 반흔을 지니지 않은 피부의 외관 또는 색 간의 보다 작은 정도의 차이에 의해 입증될 수 있다.

4. 반흔 뒤틀림 및 기계적 성능

반흔 뒤틀림은 반흔 및 반흔을 지니지 않은 피부의 시각적 비교에 의해 평가될 수 있다. 적합한 비교는 뒤틀림을 초래하지 않거나, 온화한 뒤틀림, 중간 정도의 뒤틀림, 또는 심각한 뒤틀림을 초래하는 것으로로서 선택된 반흔을 분류할 수 있다.

반흔의 기계적 성능은 흡입, 압력, 토션(torsion), 장력 및 음향학(acoustics)을 기초로 한 다수의 비-침습성 방법 및 디바이스를 사용하여 평가될 수 있다. 반흔의 기계적 성능을 평가하는데 사용될 수 있는 공지된 디바이스의 적합한 예로는 인덴토미터(Indentometer), 피부탄력측정기, 피부산성도 측정기, 점탄성 피부 분석, 더마플렉스(Dermaflex), 듀로미터, 피부 토크 계측기, 탄성률계를 포함한다.

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료되지 않은 반흔에 의해 야기되는 뒤틀림과 비교하여 치료된 반흔에 의해 야기된 뒤틀림의 감소에 의해 입증될 수 있다. 또한 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료되지 않은 반흔에 비해 치료된 반흔의 기계적 성능과 더욱 유사한 반흔을 지니지 않은 피부의 기계적 성능에 의해 입증될 수 있다.

5. 반흔의 윤곽 및 반흔 질감

반흔 윤곽은 시각적 평가에 의해 조사될 수 있다. 이러한 평가에서 고려되는 적합한 파라미터는 반흔이 주변 피부를 홍조를 띠게 하거나 약간 돋아나거나, 약간 울퉁불퉁하거나, 비후성이거나 켈로이드인지의 여부를 포함한다. 반흔의 질감은 반흔의 외관과 관련하여 평가될 수 있으며, 이는 또한 반흔이 예를 들어 반흔을 지니지 않은 피부와 비교하여 광택이 없거나 광택을 지니거나, 거칠거나 부드러운 형태를 갖는지의 여부로서 시각적 평가에 의해 착수될 수 있다.

반흔 질감은 추가적으로 반흔이 반흔을 지니지 않은 피부와 동일한 질감 (정상 질감)을 갖는지, 반흔을 지니지 않은 피부와 비교하여 단지 감지할 수 있는 견고하거나 단단한 지의 여부와 관련하여 평가될 수 있다. 반흔의 질감은 또한 하밀톤 스케일(Hamilton scale; Crowe et al, 1998에 기술됨)과 관련하여 평가될 수 있다.

상기 기술된 기술 이외에, 반흔 윤곽 및/또는 질감의 평가를 위한 광학적 또는 기계적 방법을 이용하는 다수의 비-침습성 프로필리메트리 디바이스가 존재한다. 이러한 평가는 피검체의 신체 상에서, 또는 예를 들어 반흔의 실리콘 몰드 본(impression) 상에서, 또는 이러한 본으로부터 얻어진 포지티브 캐스트 상에서 수행될 수 있다.

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 이러한 경우에 치료된 반흔이 치료되지 않은 반흔에 비해 반흔을 지니지 않은 피부와 비교가능한 반흔 프로파일 및 질감을 갖는 것으로 입증될 수 있다.

사진 평가

독립적 레이 패널 (Independent Lay Panel)

치료되거나 치료되지 않은 반흔의 사진 평가는 반흔의 표준화되고 보정된 사진을 이용한 어세서(assessor)의 독립적 레이 패널에 의해 수행될 수 있다. 이러한 반흔은 문헌[Beausang et al (1998)]에 기술된 방법을 기초로 한 비쥬얼 아날로그 스케일 (VAS)을 이용하여 정량적 데이터 및 카테고리 순위 데이터 (예를 들어, 치료된 반흔은 치료되지 않은 반흔과 비교하여 "보다 양호," "보다 불량," 또는 "차이 없음"으로 제공됨)를 제공하기 위한 독립적 레이 패널에 의해 평가될 수 있다. 이러한 데이터의 획득은 본 출원인들의 공동 계류중인 특허 출원에 기술된 적합한 소프트웨어 및/또는 전자 시스템을 사용하여 얻어질 수 있다.

전문가 패널

치료된 반흔 및 치료되지 않은 반흔의 사진 평가는 대안적으로 또는 추가적으로 평가되는 반흔의 표준화되고 보정된 사진을 이용한 전문가 어세서의 패널에 의해 수행될 수 있다. 전문가 패널은 바람직하게는 성형외과의 및 적합한 배경의 과학자와 같은 당업자로 이루어질 수 있다.

이러한 평가는 상기 기술된 바와 같이, 또는 선택된 치료된 반흔 및 치료되지 않은 반흔의 이미지의 시간경과의 비교에 대하여 카테고리 데이터를 제공할 수 있다.

이루어질 수 있는 적합한 평가는 하기를 포함할 수 있다:

최적의 반흔의 식별, 이는 본 발명의 목적상 주변 피부와 거의 닮은 반흔으로 여겨질 수 있다. 최적의 반흔이 식별되자 마자, 반흔들 간의 차이의 크기가 고려될 수 있으며, 예를 들어 반흔들 간에 약간 차이가 있거나 명확하게 차이가 고려될 수 있다. 고려될 수 있는 추가 파라미터는 반흔 형성 후 반흔들 간의 차이가 검출될 수 있는 가장 빠른 시간, 반흔들간의 차이가 가장 명확하게 되는 (또는 대안적으로는 평가된 최종 시점 후에 차이가 계속적으로 발견되는) 형성 후 시간을 포함할 뿐만 아니라, 보다 양호한 반흔이 보다 양호하게 유지되는 지의 여부를 고려한다.

고려사항은 또한 하나의 반흔이 다른 하나의 반흔에 비해 계속적으로 발적하는 지의 여부, 및 고려되는 시점에 걸쳐 발적이 사라지는 지의 여부(또는 최종 시점 후에 계속되는 지의 여부), 및 만일 그렇다면 반흔 형성 후 어떠한 시점에서 사리지는 지의 여부가 제공될 수 있다. 전문가 패널은 또한 형성 후 발적의 임의의 차이가 검출될 수 있는 시점, 뿐만 아니라 발적의 차이가 가장 명확한 형성 후 시간을 고려할 수 있다.

전문가 패널은 또한 하나의 치료되거나 치료되지 않은 반흔이 다른 하나의 반흔 보다 지속적으로 백색화되거나, 반흔을 지니지 않은 피부 보다 백색화되는 지의 여부를 고려할 수 있다. 백색화의 차이가 검출될 수 있는 경우에, 고려사항은 반흔 형성 후 이러한 차이가 검출될 수 있는 시간, 차이가 가장 명확하게 되는 시간, 및 차이가 사라지는 시간으로 제공될 수 있다.

전문가 패널에 의해 평가될 수 있는 추가 파라미터는 치료된 반흔 및 치료되지 않은 반흔의 질감이다. 치료된 반흔 및 치료되지 않은 반흔을 비교함에 있어서, 전문가 패널은 반흔이 가장 양호한 피부 질감을 가지는지, 반흔 형성 후 존재하는 임의의 차이가 검출될 수 있는 가장 빠른 시간, 존재하는 임의의 차이가 명확하게 되는 형성 후 시간, 및 임의의 차이가 사라지는 시간을 고려할 수 있다.

치료된 반흔 및 치료되지 않은 반흔의 비교는 반흔이 가장 좁아지고, 반흔이 가장 짧아지는 것을 추가로 평가할 수 있다. 고려사항은 또한 주변 피부와 구별될 수 있는 반흔 가장자리의 비율 및 반흔의 모양으로 제공될 수 있다. 종래 기술된 색의 시각적 평가에 따라, 과색소화의 존재, 정도 및 위치의 평가가 또한 고려될 수 있다.

상기에 기재된 바와 같이, 치료된 반흔과 치료되지 않은 반흔의 질이 비교될 수 있는 방법 중 하나가 현미경적 평가에 의한 것이다. 반흔 질의 현미경적 평가는 통상적으로 반흔의 조직학적 섹션을 이용하여 수행될 수 있다. 반흔을 현미경적으로 평가하고 측정하는 방법은 하기 적합한 파라미터를 기초로 한 카테고리 데이터를 고려하여 수행될 수 있다:

1. 상피 회복. 특별한 주의는 상피 돌기의 복원 정도, 및 복원된 상피의 두께가 고려될 수 있다.

2. 혈관형성 및 염증. 고려사항은 존재하는 혈관의 수, 존재하는 혈관의 크기 및 염증의 증거, 예를 들어 존재하는 염증의 임의의 수준의 평가가 제공될 수 있다.

3. 콜라겐 조직화. 콜라겐 조직을 평가함에 있어서, 기준은 반흔에 존재하는 콜라겐 섬유의 배향, 이러한 섬유의 밀도 및 유두근 및 망상진피에서의 콜라겐 섬유 두께로 이루어질 수 있다.

4. 유두근 진피 및 망상 진피에 대한 콜라겐 조직화의 비쥬얼 아날로그 스케일(VAS) 평가가 또한 유용한 반흔 질의 지수를 제공할 수 있다.

5. 반흔의 현미경적 질을 평가하는데 고려될 수 있는 다른 특징은 주변 반흔이 존재하지 않는 피부에 대해 반흔의 부풀어오름 또는 낮아짐, 및 정상 피부 경계면에서 반흔의 돌출 또는 시각화를 포함한다.

6. 상술된 평가는 치료된 반흔이 대조군, 치료되지 않거나 다른 적합한 비교 반흔과 비교하여 보다 양호하거나, 보다 불량하거나, 차이가 없는 지의 여부로서의 표시를 제공할 수 있는 반흔 순위 데이터를 형성시키는 것으로 관찰될 수 있다.

카테고리 데이터 이외에, 정략적 데이터(바람직하게는, 상기 파라미터와 관련)는 적합한 시각화 기술과 함께 이미지 분석을 이용하여 발생될 수 있다. 반흔 질을 평가하는데 사용될 수 있는 적합한 시각화 기술의 예는 특정 조직학적 염색 또는 면역-표지가 있으며, 여기서 존재하는 염색 또는 표지의 정도는 이미지 분석에 의해 정량적으로 결정될 수 있다.

정량적 데이터는 하기 파라미터와 관련하여 유용하고 용이하게 생성될 수 있다:

1. 반흔 폭, 높이, 부풀어 오름, 부피 및 면적.

2. 상피 두께 및 적용 범위 (예를 들어, 반흔에 존재하는 상피의 면적 또는 상피 적용범위를 갖는 상처의 비율).

3. 혈관의 수, 크기, 면적(즉, 단면적) 및 위치.

4. 염증 정도, 존재하는 염증 세포의 수, 위치 및 집단/타입.

5. 콜라겐 조직화, 콜라겐 섬유 두께, 콜라겐 섬유 밀도.

반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 치료된 반흔이 대조군 또는 치료되지 않은 반흔 (또는 다른 적합한 비교체) 보다 반흔을 지니지 않은 피부와 거의 유사한 상기에서 고려된 임의의 파라미터의 변화에 의해 입증될 수 있다.

논의된 평가 및 파라미터는 대조군, 위약 또는 표준 관리 치료와 비교하여 펩티드의 동물 또는 인간에서의 본 발명의 펩티드 또는 약제의 효과의 비교에 적합하다. 적절한 통계학적 시험은 결과의 유의성을 조사하기 위하여 상이한 처리로부터 발생된 데이터 세트를 분석하는데 사용될 수 있다.

바람직하게는, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 하나 이상의 파라미터와 관련하여 입증될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 임상적(즉, 피검체에서 관찰된) 파라미터 및 사진 파라미터 둘 모두와 관련하여 입증될 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 임상적 파라미터, 사진 파라미터, 및 현미경적 평가 파라미터 (예를 들어, 조직학적 파라미터)와 관련하여 입증될 수 있다. 가장 바람직하게는, 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제는 망상 진피의 임상 VAS 스코어, 외부 레이 패널 VAS 스코어 및 순위 (사진 이미지로부터의 순위) 및 현미경적 VAS 스코어와 관련하여 입증될 수 있다.

본 발명의 적절한 방법 및 약제의 사용은 손상된 영역의 미용적 외관을 신속하게 개선시킴으로써 치료할 수 있다. 미용상의 고려는 다수의 임상적 상황, 특히 상처가 안면, 목 및 손과 같이 두드러지는 신체 부위에 형성되는 경우에 중요하다. 따라서, 바람직하게는 반흔의 미용적 외관을 개선시키는 것이 요망되는 상기 부위에서의 반흔 형성의 억제 (바람직하게는, 상처 치유 가속화와 함께 이루어질 수 있음)가 본 발명의 바람직한 구체예이다.

이러한 미용적 영향 외에, 피부 반흔 형성은 이러한 반흔 형성으로부터 고통받는 환자에 다수의 유해한 영향을 미친다. 예를 들어, 피부 반흔 형성은 특히, 수축 반흔 (예를 들어, 비후성 반흔)의 경우 및/또는 관절에 걸쳐 반흔이 형성되는 상황에서 물리적 및 기계적 기능의 감소와 관련될 수 있다. 이러한 경우, 반흔 형성되지 않은 피부와 대조적인 반흔 형성된 피부의 변경된 기계적 특성 및 반흔 수축의 효과는 관절 (접합)의 매우 제한적인 운동을 발생시켜 영향을 줄 수 있다. 따라서, 신체의 관절에 입은 상처의 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제 (바람직하게는, 이러한 상처 치유 가속화)하는데 사용되는 본 발명의 적절한 약제 및 방법이 바람직한 구체예이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 적절한 약제 및 방법은 수축 반흔 형성의 위험 증가에 있어서 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 상처의 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용될 수 있다.

반흔 형성의 범위, 및 이에 따른 반흔에 의해 야기될 수 있는 미용적 또는 기타 질환의 범위는 또한 상처가 형성되는 부위의 장력과 같은 요인에 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 비교적 높은 장력 하의 피부 (예를 들어, 흉부 상에 걸치거나, 장력선과 관련된 피부)는 다른 신체 부위보다 더욱 심각한 반흔을 형성하는 경향이 있다. 따라서, 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 적절한 약제 및 방법은 높은 피부 장력 부위에 위치한 상처의 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용될 수 있다. 상처 및 반흔의 재배열을 가능케 하여 장력을 감소시키는 반흔 교정술에 사용될 수 있는 다수의 외과적 방법이 존재한다. 아마도, 이들중 가장 공지된 것은 두개의 V-형의 피부판이 전치되어 장력선의 회전을 가능케 하는 "Z-형성술"이다. 따라서, 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 약제 및 방법은 미관손상 반흔의 외과적 교정 동안 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 상처의 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용될 수 있다.

병리학적 반흔 형성은 비교적 심각한 일반 반흔 형성의 결과로서 발생하는 것 보다 현저하게 유해한 영향을 지닐 수 있다. 병리학적 반흔의 일반적인 예는 비후성 반흔 및 켈로이드를 포함한다. 특정 유형의 상처, 또는 특정 개체가 병리학적 반흔이 쉽게 형성될 수 있음이 인지되어 있다. 예를 들어, 아프로-캐리비언 (Afro-Caribbean), 일본 또는 몽골계의 개체, 또는 병리학적 반흔 형성의 가족력을 지닌 개체가 비후성 반흔 또는 켈로이드 형성의 위험 증가가 있는 것으로 간주될 수 있다. 아동의 상처, 특히 아동의 화상 상처가 또한 비후성 반흔 형성 증가와 관련이 있다. 따라서, 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 병리학적 반흔 형성의 위험 증가가 존재하는 상처의 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용되는 적절한 약제 및 방법이 본 발명의 바람직한 구체예이다.

병리학적 반흔 형성에 이미 적용된 개체는 추가적인 과도한 반흔 형성의 소인으로 고통받으나, 결과적으로 발생한 병리학적 반흔 형성의 위험을 수반하는 비후성 반흔 또는 켈로이드의 외과적 교정이 종종 임상적으로 필요하다. 따라서, 병리학적 반흔의 외과적 교정에 의해 생성된 상처의 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제시키는데 사용되는 적절한 약제 및 방법이 본 발명의 추가의 바람직한 구체예이다.

화상 손상으로부터 발생한 상처 (본 발명의 목적상 고온의 액체 또는 기체와 관련되는 탕상 (scalding injury)을 포함하는 것으로 간주할 수 있음)는 개체의 광점위한 영역에 걸쳐 존재하여 고통을 줄 수 있다. 따라서, 화상은 환자 신체의 광범위한 크기에 걸친 반흔 형성을 발생시킬 수 있어, 형성된 반흔이 미용적 중요성 증가 영역 (예를 들어, 안면, 목, 팔 또는 손) 또는 기계적 중요 영역 (특히, 관절을 덮거나 둘러싸는 영역)에 걸쳐 있을 위험을 증가시킨다. 고온의 액체에 의해 야기된 화상 손상은 종종 아동에 의해 발생 (예를 들어, 냄비, 주전자 등을 뒤업은 결과)되며, 아동의 비교적 작은 신체 크기로 인해 신체 영역의 많은 부분에 걸쳐 광범위한 손상이 발생할 수 있다. 화상 손상에 의해 생성된 상처의 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용되는 적절한 약제 및 방법이 본 발명의 추가의 바람직한 구체예이다.

상기 언급된 바와 같이, 화상 손상에 대한 상처 치유는 종종 유해한 반흔 형성 결과, 예를 들어 비후성 반흔의 형성과 관련이 있다. 비교적 큰 규모의 화상 손상의 추가 결과는 손상 환자가 기능적 상피층의 결핍으로 인해 발생하는 감염 및 건조와 같은 합병증에 특히 민감하다는 점이다. 상기에 비추어, 본 발명의 적절한 방법 및 약제가 상처의 결과로서 발생하는 반흔 형성의 수준을 감소시키고/시키거나 기능적 상피 장벽의 재구성을 가속화시키는 화상 손상의 치료에 사용될 수 있음이 인지될 것이다.

본 발명자들은 서열 목록 번호 3을 포함하는 것과 같은 단량체를 이용하는 본 발명의 방법 및 약제가 재-상피화를 촉진할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 이러한 방법 및 약제는 상피층의 손상을 포함하는 모든 손상의 치료에 특히 유효하다. 이러한 손상은 표피가 손상되는 피부에 대한 손상으로 예시되나, 이로 제한되지는 않는다. 그러나, 본 발명의 이러한 방법 및 약제는 또한 상피가 손상되는 기타 유형의 상처, 예를 들어 호흡기 상피, 소화기 상피 또는 내부 조직 또는 기관을 둘러싸는 상피 (예를 들어, 복막의 상피)와 관련된 손상에 적용될 수 있음이 인지될 것이다.

복막 (내부 장기 및/또는 체강의 내부를 둘러싸는 상피)과 관련된 상처의 치유는 종종 유착을 발생시킬 수 있다. 이러한 유착은 부인과적 또는 장 조직과 관련된 수술의 통상적인 결과이다. 본 발명자들은 반흔 형성을 감소시키면서 복막의 재생을 가속화시키는 본 발명의 방법 및 약제 (예를 들어, 서열 목록 번호 3을 포함하는 것과 같은 적절한 단량체를 이용함)의 능력이 서로에 대한 복막의 일부의 부적절한 부착의 발생을 감소시킴으로써, 유착의 발생을 감소시킬 수 있는 것으로 생각한다. 따라서, 장 또는 부인과적 유착의 형성을 예방하는 본 발명의 상기 방법 및 약제의 용도가 본 발명의 한 바람직한 구체예이다. 또한, 복막과 관련된 임의의 상처의 치유에서의 본 발명의 상기 방법 및 약제의 용도가 한 바람직한 구체예이다.

본 발명의 방법 또는 약제는 예를 들어 상처가 존재하진 않으나 반흔 또는 만성 상처를 달리 발생시키는 상처가 형성되는 부위에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약제는 선택 시술 (예를 들어, 외과술)의 결과로서 상처가 발생하는 부위, 또는 상처 형성 위험이 상승되는 것으로 생각되는 부위에 투여될 수 있다. 본 발명의 약제가 상처 형성시, 또는 상처 형성 직전 (예를 들어, 상처 형성 전 6시간 이하의 기간)에 상기 부위로 투여되거나, 약제가 상처 형성 보다 이른 시간 (예를 들어, 상처가 형성되기 전 48시간 이하)에 투여되는 것이 바람직할 수 있다. 당업자는 상처 형성 전의 가장 바람직한 투여 시간이 선택약제의 제형 및 투여 경로, 투여되는 약제의 투여량, 형성되는 상처의 크기 및 특성, 및 환자의 생물학적 상태 (환자의 연령, 건강, 및 상처 복합증 또는 유해한 반흔 형성 경향과 같은 요인을 참조로 하여 결정될 수 있음)을 포함하는 다수의 요인을 참조로 하여 결정됨을 인지할 것이다. 본 발명에 따른 방법 및 약제의 예방적 용도가 본 발명의 한 바람직한 구체예이며, 이는 외과술 상처와 관련된 상처 치유 가속화의 촉진 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제에 특히 바람직하다.

본 발명의 방법 및 약제는 또한 상처가 형성된 후에 투여되는 경우에 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 억제할 수 있다. 상처의 형성 후에 상기 투여가 가능한 한 신속히 이루어지는 것이 바람직하나, 본 발명의 작용제는 치유 과정이 완료될때까지의 임의의 시간에서 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제할 수 있다 (즉, 상처가 이미 부분적으로 치료된 경우에도, 본 발명의 방법 및 약제는 치료되지 않은 부분과 관련된 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용될 수 있음). 본 발명의 방법 및 약제가 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 사용될 수 있는 "윈도우 (window)"는 당해 상처의 특성 (발생한 손상의 정도 및 상처 영역의 크기를 포함함)에 좌우됨이 인지될 것이다. 따라서, 큰 상처의 경우, 본 발명의 방법 및 약제는 치유 반응에서 비교적 늦게 투여될 수 있으며, 여전히 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 약제는 바람직하게는 상처가 형성된지 처음 24시간 이내에 투여될 수 있으나, 상처 형성 10일후 또는 더 늦게 투여되는 경우에도 여전히 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제시킬 수 있다.

본 발명의 방법 및 약제는 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제시키는 것이 필요한 경우 1회 이상으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료적 유효량의 약제가 치유 반응이 완료될때까지 필요한 만큼 빈번하게 상처에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제는 상처 형성 후 적어도 첫번째 3일 동안 상처에 매일 또는 하루에 2회 투여될 수 있다. 본 발명자들은 상처 형성 전 첫번째 투여 및 상처 형성 후 두번째 투여의 본 발명의 약제의 투여가 반흔 형성 감소에 특히 유리함을 발견하였다. 바람직하게는, 이러한 요법은 상처 형성 직전의 첫번째 투여 및 상처 형성 24시간 후의 두번째 투여를 포함할 수 있다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 방법 또는 약제는 상처의 형성 전 및 형성 후에 투여될 수 있다. 본 발명자들은 상처 형성 직전의 본 발명의 약제의 투여 및 이후의 상처 형성 후의 상기 작용제의 매일의 투여가 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는데 특히 효과적임을 발견하였다.

본 명세서의 목적상, "작용제" 또는 "본 발명의 작용제"는 생물학적 또는 치료적 활성 단량체 TGF-β를 의미한다. 이러한 작용제는 바람직하게는 야생형 단량체 TGF-β이고, 더욱 바람직하게는 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 억제할 수 있는 단량체 TGF-β일 수 있고, 이의 바람직한 예는 서열 목록 3에 기술된 단량체를 포함한다. 상기 모든 작용제가 본 발명에 따른 약제에 포함될 수 있고, 본 발명의 방법 또는 용도에 사용될 수 있음이 인지될 것이다.

상처에 적용되는 본 발명의 약제의 양은 다수의 요인, 예를 들어 약제에 존재하는 작용제의 생물학적 활성 및 생체이용율에 의존되며, 차례로 기타 요인 중에서 작용제의 특성 및 약제의 투여 방법에 의존됨이 인지될 것이다. 적절한 치료량의 약제의 결정에 있어서의 기타 요인들은 하기를 포함할 수 있다:

A) 치료되는 피검체에서의 작용제의 반감기.

B) 치료되는 특정 질환 (예를 들어, 급성 상처 형성 또는 만성 상처).

C) 피검체의 연령.

투여 빈도는 또한 상기 언급된 요인, 특히 치료되는 피검체에서의 선택된 작용제의 반감기에 의해 영향을 받을 것이다.

일반적으로, 본 발명에 따른 약제가 존재하는 상처를 치료하기 위해 사용되는 경우, 약제는 상처가 발생하고 곧 (또는 내부 신체 부위에서의 상처와 같이 즉시 명백해지지 않는 상처의 경우에서는 상처가 진단되고 곧) 투여되어야 한다. 본 발명에 따른 방법 또는 약제를 이용한 치료는 임상의가 만족할때까지 치유 과정이 가속화되고/되거나 반흔 형성이 예방되거나, 감소되거나, 억제될때까지 지속되어야 한다.

투여 빈도는 사용되는 작용제의 생물학적 반감기에 의존될 것이다. 통상적으로, 본 발명의 작용제를 함유하는 크림 또는 연고가 상처에서의 작용제의 농도가 치료 효과를 지니기에 적절한 수준으로 유지되도록 표적 조직에 투여되어야 한다. 이는 매일 또는 하루에 수회 투여하는 것이 필요할 수 있다.

본 발명의 약제는 상처 치유를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하는 요망되는 효과를 달성할 수 있는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있으나, 약제는 상처 부위에 국소적으로 투여되는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 상처 치유 가속화의 촉진 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제가 상처 부위에서의 주사에 의한 본 발명의 작용제의 투여에 의해 영향을 받을 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 피부 상처의 경우, 본 발명의 작용제는 피내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 바람직한 약제는 본 발명의 작용제의 주사용수 (예를 들어, 상피 손상 부위의 가장자리 주위 또는 손상된 듯한 부위의 주사를 위한 것)를 포함한다. 본 발명의 구체예에 사용하기에 적절한 제형이 하기에서 고려된다.

대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 약제는 또한 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제시키기 위한 국소 형태로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 손상된 영역에 대한 최초 및/또는 후속 의료의 일부로서 수행될 수 있다.

본 발명자들은 상처 치유 가속화 촉진 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제가 본 발명의 작용제의 상처로의 국소 적용 (또는 예방적 적용의 경우, 상처가 형성되는 조직 또는 부위로의 적용)에 의해 특히 개선됨을 발견하였다.

본 발명의 작용제를 함유하는 조성물 또는 약제는 특히 이들이 사용되는 방식에 의존하여 다수의 상이한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 이들은 액체, 연고, 크림, 젤, 수화젤, 분말 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 이러한 조성물 모두는 치료할 필요가 있는 피검체 (인간 또는 동물)로의 본 발명의 작용제를 투여하는 바람직한 수단인 상처로의 국소 적용에 적합하다.

본 발명의 작용제는 상처 또는 치료되는 상피 손상의 기타 부위를 덮기 위해 사용될 수 있는 멸균 드레싱 또는 패치로 제공될 수 있다.

본 발명의 작용제를 포함하는 조성물의 비히클은 환자에 의해 널리 용인되고, 상처로의 작용제의 방출을 허용하는 것이어야 한다. 이러한 비히클은 바람직하게는 생체분해성, 생체용해성, 생체흡수성 및/또는 비염증성이다.

본 발명의 작용제를 포함하는 약제 및 조성물은 다수의 방법으로 사용될 수있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 상치 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하기 위해 상처 및/또는 상처 주위에 적용될 수 있다. 조성물이 "존재하는" 상처에 적용되는 경우, 약학적으로 허용되는 비히클은 비교적 "순한" 것, 즉 생체적합성, 생체분해성, 생체용해성 및 비염증성인 비히클일 것이다.

본 발명의 작용제, 또는 이러한 작용제를 엔코딩하는 핵산 (하기에서 추가로 고려됨)은 서방형 장치 또는 지연 방출 장치에 포함될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어 피부 하에 위치되거나 삽입될 수 있고, 작용제 또는 핵산은 수일, 수주 또는 수개월에 걸쳐 방출될 수 있다. 이러한 장치는 장기간의 상처 치유 가속화 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제를 필요로 하는 환자 (예를 들어, 만성 상처로 고통받는 환자)에 특히 유용할 수 있다. 이러한 장치는 일반적으로 빈번한 투여 (예를 들어, 기타 경로에 의한 적어도 매일의 투여)를 필요로 하는 작용제 또는 핵산의 투여에 사용되는 경우 특히 유리할 수 있다.

본 발명의 작용제의 일일 용량은 단일 투여 (예를 들어, 국소 제형의 매일의 적용 또는 매일의 주사)로 제공될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 작용제는 하루에 2회 이상의 투여를 필요로 할 수 있다. 한 추가 대안에서, 반복 투여로 투여될 필요 없이 환자에게 최적 투여량의 본 발명의 작용제를 제공하기 위해 서방형 장치가 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 작용제의 투여를 위한 약학적 비히클은 액체일 수 있고, 적절한 약제 조성물은 용액의 형태이다. 또 다른 구체예에서, 약학적으로 허용되는 비히클은 고체이고, 적절한 조성물은 분말 또는 정제의 형태이다. 한 추가 구체예에서, 본 발명의 작용제는 약학적으로 허용되는 경피 패치의 일부로 제형화될 수 있다.

고체 비히클은 또한 착향제, 윤활제, 가용화제, 현탁제, 충전제, 유동화제, 압축 보조제, 결합제 또는 정제-붕해제로서 작용할 수 있는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있고; 이는 또한 피막 물질일 수 있다. 분말에서, 비히클은 본 발명의 미세하게 분할된 작용제와의 혼합물인 미세하게 분할된 고체이다. 정제에서, 본 발명의 작용제는 적절한 비율의 필요한 압축 특성을 지니는 비히클과 혼합되고, 이는 요망되는 형태 및 크기로 압축된다. 분말 및 정제는 바람직하게는 본 발명의 작용제를 99% 이하로 함유한다. 적절한 고체 비히클은 예를 들어 칼슘 포스페이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 당, 락토오스, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 저용융 왁스 및 이온 교환 수지를 포함한다.

액체 비히클은 용액, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 엘릭시르 및 가압된 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 작용제는 약학적으로 허용되는 액체 비히클, 예를 들어 물, 유기 용매, 이들의 혼합물 또는 약학적으로 허용되는 오일 또는 지방에 용해되거나 현탁될 수 있다. 액체 비히클은 기타 적절한 약학적 첨가제, 예를 들어 가용화제, 유화제, 완충제, 보존제, 감미제, 착향제, 현탁제, 증점제, 착색제, 점성 조절제, 안정화제 또는 삼투-조절제를 함유할 수 있다. 경구 및 비경구 투여를 위한 액체 비히클의 적절한 예는 물 (부분적으로 상기와 같은 첨가제, 예를 들어 셀룰로오스 유도체, 바람직하게는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 용액을 함유함), 알코올 (1가 알코올 및 다가 알코올, 예를 들어 글리콜을 포함함) 및 이들의 유도체, 및 오일 (예를 들어, 분획화된 코코넛 오일 및 아라키스 오일)을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 약제 또는 방법은, 단량체 TGF-β, 예를 들어 TGF-β3가 알코올을 함유하지 않은 채로 제공되는 제형을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 알코올을 함유하지 않는 제형은 이들의 비교적 "순한" 특성으로 인해 상처 부위 (또는 상처가 형성되는 부위)에 사용하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 비경구 투여를 위한 비히클은 또한 오일성 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 이소프로필 미리스테이트일 수 있다. 멸균 액체 비히클은 비경구 투여를 위한 멸균 액체 형태의 조성물에 유용하다. 가압된 조성물을 위한 액체 비히클은 할로겐화 탄화수소 또는 기타 약제학적으로 허용되는 분사제일 수 있다.

멸균 용액 또는 현탁액인 액체 약제 조성물은 예를 들어 근내, 수막강내, 경막외, 복막내, 피내, 각막내 (각막) 또는 피하 주사에 의해 이용될 수 있다. 멸균 용액은 또한 정맥내 투여될 수 있다. 본 발명의 작용제는 투여시 멸균수, 염수, 또는 기타 적절한 멸균 주사용 매질을 이용하여 용해되거나 현탁될 수 있는 멸균 고체 조성물로서 제조될 수 있다. 비히클은 필수 및 비활성 결합제, 현탁제, 윤활제 및 보존제를 포함한다.

경구 섭취에 의해 본 발명의 작용제를 투여하는 것이 요망되는 상황에서, 선택된 작용제는 바람직하게는 분해에 대해 상승된 수준의 내성을 지니는 작용제라는 것이 인지될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 작용제는 소화관에서의 분해 속도가 감소되도록 보호 (예를 들어, 상기 기술된 기술을 이용함)될 수 있다.

본 발명의 작용제의 조성물은 각막에서의 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 억제하는데 사용되는 것이 적절하다. 각막 상처는 우발적인 손상 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음)의 결과 또는 외과 수술 (예를 들어, 각막에서의 레이저 수술)의 결과로서 발생하는 안구에 대한 외상으로부터 발생할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 바람직한 약제는 안구 점적의 형태일 수 있다.

본 발명의 작용제는 "내부" 상처 (즉, 외부 표면이 아닌, 신체 내에서 발생하는 상처)의 범위로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 발명에 따른 약제는 폐 또는 기타 호흡 상피에서 발생하는 상처에 사용하기 위해 흡입용으로 제형화될 수 있다.

약제 산업에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 공지된 방법 (예를 들어, 생체내 시험, 임상 시험 등)은 본 발명의 작용제를 포함하는 조성물의 특정 제형 및 상기 조성물의 투여를 위한 정확한 치료 방법 (예를 들어, 활성제의 일일 투여량 및 투여 빈도)을 확립하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 작용제의 적절한 일일 투여량은 손상된 조직의 특성, 치료되는 상처의 영역 및/또는 깊이, 상처의 중증도, 및 병리학적 반흔 또는 만성 상처 형성의 경향이 있는 요인의 존재 또는 부재를 포함 (이에 제한되지는 않음)하는 요인의 범위에 따라, 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제할 수 있다.

예를 들어, 단일 투여 치료에서의 상처 또는 상피 손상 부위로 투여될 수 있는 활성제의 양은 바람직하게는 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 50-200 ng의 범위 (주사로 투여되는 경우), 또는 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 100-300 ng의 범위 (국소적으로 투여되는 경우)일 수 있다.

추가로 예를 들어, 상처 또는 상피 손상 부위로 매일 투여되는 활성제의 바람직한 양은 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 50 ng의 범위 (주사로 투여되는 경우), 또는 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 100 ng의 범위 (국소적으로 투여되는 경우)일 수 있다.

예를 들어, 상처 또는 상피 손상 부위로 국소 주사에 의해 투여될 수 있는 활성제의 전체량은 바람직하게는 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 50 ng/100 ㎕의 범위일 수 있고, 이러한 투여량은 3일 이하 동안 하루에 1회 투여되어, 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 150 ng의 전체 투여량이 제공될 수 있다.

급성 상처 또는 상피 손상 부위로의 국소 적용의 경우, 활성제의 적절한 양은 바람직하게는 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 100 ng의 범위일 수 있고, 이러한 투여량은 3일 이하 동안 하루에 1회 투여되어, 상처의 직선 센티미터 또는 상피 손상 부위 ㎠당 300 ng의 전체 투여량이 제공될 수 있다.

상기를 손상시킴이 없이, 상처 또는 기타 상피 손상 부위의 치료에 필요한 본 발명에 따른 작용제의 양은 통상적으로 24시간당 상처 또는 상피 손상 부위의 직선 센티미터당 투여되는 1 pg 내지 1 mg의 작용제의 범위내일 것이나, 이러한 수는 상기 기술된 요인에 따라 상향 또는 하향 조절될 수 있다. 작용제는 바람직하게는 1 pg/100 ㎕ - 1mg/100 ㎕의 작용제의 용액의 형태로 제공될 수 있으며, 상처 또는 상피 손상 부위의 직선 센티미터당 100 ㎕의 상기 용액이 24시간에 걸쳐 제공될 수 있다.

작용제는 더욱 바람직하게는 24시간의 기간에 걸쳐 상처 또는 상피 손상 부위의 직선 센티미터당 100 ㎕의 용액을 이용하여, 10 pg/100 ㎕ 내지 100 ㎍/100 ㎕의 용액으로 투여될 수 있다.

가장 바람직하게는, 작용제는 24시간의 기간에 걸쳐 상처 또는 상피 손상 부위의 직선 센티미터당 100 ㎕의 용액을 이용하여, 1 ng/100 ㎕ - 1000 ng/100 ㎕의 용액으로 투여될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 작용제를 포함하는 조성물은 상처에 투여시 상처 또는 상피 손상 부위의 직선 센티미터당 0.79 pM 내지 0.79 mM의 작용제 농도의 투여가 달성되도록 제형화되어야 한다. 바람직하게는, 작용제는 직선 센티미터당 7.9 pM 내지 0.079 mM의 농도로 제공될 수 있다.

본 발명의 작용제 (예를 들어, 서열 목록 번호 3 내지 8의 펩티드)는 0.79 pM 내지 0.79 mM의 농도로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 작용제는 7.9 pM 내지 0.079 mM의 농도로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 작용제는 0.79 nM 내지 0.79 μM의 농도로 투여될 수 있다.

단순히, 예를 들어 10 pg/100 μL 내지 100 μg/100 μL의 본 발명의 작용제 (예를 들어, 서열 목록 번호 3의 펩티드)를 함유하는 주사용수가 피내 주사로 투여되고, 상처 가장자리의 직선 cm당 100 ㎕로 투여되는 경우 피부 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 억제하기 위한 적용에 적합하다.

서열 목록 3의 단량체 펩티드의 경우, 상처로의 투여를 위한 바람직한 투여량은 1 ng/100 μL 내지 1000 ng/100 μL의 범위일 수 있고, 이러한 용액은 상처 가장자리의 직선 cm당 100 μL 투여된다.

본 발명의 작용제는 단일요법 (예를 들어, 본 발명의 약제의 단독 사용을 통함)으로서 상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법 또는 약제는 상처 치유 촉진 또는 반흔 억제를 위한 기타 화합물 또는 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있는 적절한 치료제는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 약제, 특히 서열 목록 번호 3의 펩티드를 포함하는 약제가 당의 존재하에게 유리하게 제형화될 수 있음을 발견하였다. 이러한 당은 환원당 또는 비환원당이고/이거나 포스페이트 또는 이의 포스포네이트 유도체일 수 있다. 이러한 당의 예는 말토오스, 만노오스, 트레할로오스, 아라비노스, 만니톨, 수크로오스, 프룩토오스, 덱스트로스 및 글루코오스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 당은 말토오스 및 트레할로오스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 약제, 특히 본 발명의 구체예에 따른 약제는 바람직하게는 5 내지 7의 pH를 지닐 수 있다.

단량체 TGF-β 펩티드가 상기 분자를 엔코딩하는 핵산 서열의 세포 발현을 포함하는 기술에 의해 투여되는 적절한 작용제일 수 있음이 인지될 것이다. 이러한 세포 발현 방법은 펩티드의 치료 효과가 연장된 기간에 걸쳐 요구되는 상황, 예를 들어 다른 경우에는 불완전한 상처 치유 반응기의 기간에 걸치도록 증가시키는 것이 요망되는 상황에서의 의약 용도에 특히 적합하다. 세포 발현을 통해 투여되는 TGF-β3 단량체가 서열 목록 번호 3으로 정의된 펩티드를 포함하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 펩티드 작용제를 조직, 예를 들어 상처에 투여하는 다수의 공지된 방법은 펩티드 작용제가 생체내에서 짧은 반감기를 지닐 수 있으므로 단지 몇일의 과정에 걸쳐 치료 부위에 본 발명의 작용제의 지속적인 수준을 달성하는 것이 어려울 수 있는 불이익을 지닌다. 작용제의 반감기는 하기를 포함하는 다수의 이유로 짧을 수 있다:

(ⅰ) 프로테아제 등에 의한 분해.

(ⅱ) 결합 단백질에 의한 청소.

(ⅲ) 세포외 기질 분자의 결합 및 이에 의한 작용제 활성의 억제.

또한, 상처 치유 가속화 촉진 및/또는 반흔 형성의 예방, 감소 또는 억제에 사용되는 작용제는 적절한 비히클 내에서 투여되는 것이 필요하고, 이는 종종 작용제 및 비히클을 포함하는 조성물로 제공된다. 논의된 바와 같이, 이러한 비히클은 바람직하게는 비염증성이고, 생체적합성이고, 생체용해성이고, 작용제를 분해하거나, 불활성화 시키지 않아야 한다 (보관시 또는 사용시). 그러나, 치료되는 상처를 지닌 조직으로 작용제를 전달하기 위한 만족스러운 비히클을 제공하는 것이 종종 어려울 수 있다.

이러한 문제점이 회피되거나 경감될 수 있는 편리한 방법은 유전자 요법에 의해 치료되는 영역에 치료적 유효량의 본 발명의 작용제를 제공하는 것이다.

유전 코드의 축퇴로 인해, 엔코딩된 생성물의 서열에 실질적으로 영향을 미치지 않고 본 발명에 사용하기에 적절한 작용제를 엔코딩하는 핵산 서열이 변화되어, 상기 작용제의 기능적 변이체가 제공될 수 있음이 명백하다. 서열 목록 번호 1 내지 3에 정의된 펩티드를 엔코딩하는데 사용될 수 있는 가능한 핵산의 서열은 당업자에게 용이하게 명백할 것이며, 당업자는 서열 목록 번호 4 내지 7로 각각 제공되는 예를 참조로 할 수 있을 것이다.

유전자 요법 전달 시스템은 대부분의 통상적인 전달 시스템에서 가능한 것보다 긴 기간에 걸쳐 상처에서 본 발명의 작용제의 지속적인 수준을 달성하기에 매우 적합하다. 상처 치유 가속화 촉진 및/또는 반흔 형성 억제에 적합한 본 발명의 작용제는 상처 부위에서 본 발명의 네번째 양태에 기술된 DNA 분자로 형질전환된 세포로부터 지속적으로 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 작용제가 생체내에서 매우 짧은 반감기를 지니더라도, 치료적 유효량의 작용제가 치료되는 조직으로부터 지속적으로 발현될 수 있다.

또한, 유전자 요법 전달 시스템은 상처와 접촉되는 연고 또는 크림에 필요한 것과 같은 통상적인 약학적 비히클을 사용할 필요 없이 DNA 분자를 제공 (이에 따라, 본 발명의 작용제를 제공)하는데 사용될 수 있다.

유전자 요법 전달 시스템은 DNA 분자가 발현되어 (전달 시스템이 환자에 투여되는 경우), 서열 목록 번호 1 내지 3을 포함하는 군에 정의된 펩티드를 생성할 수 있는 것이 바람직하다. DNA 분자는 적절한 벡터 내에 함유되어 재조합 벡터를 형성할 수 있다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 파지일 수 있다. 이러한 재조합 벡터는 적합한 DNA 분자로 세포를 형질전환시키기 위한 본 발명의 유전자 요법 전달 시스템에서 매우 유용하다.

재조합 벡터는 또한 기타 기능성 엘리먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 벡터는 벡터가 세포의 핵에서 자율적으로 복제하도록 고안될 수 있다. 이러한 경우, DNA 복제를 유도하는 엘리먼트가 재조합 벡터에 필요할 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터는 벡터 및 재조합 DNA 분자가 세포의 유전체로 통합되도록 고안될 수 있다. 이러한 경우, 표적으로 하는 통합을 유도 (예를 들어, 상동 재조합에 의함)하는 DNA 서열이 요망된다. 재조합 벡터는 또한 클로닝 과정에서 선택 마커로 사용될 수 있는 유전자를 엔코딩하는 DNA를 지닐 수 있다.

재조합 벡터는 또한 필요한 경우 유전자의 발현을 조절하기 위한 프로모터 또는 조절인자를 추가로 포함할 수 있다.

DNA 분자는 치료되는 피검체의 세포의 DNA에 통합되는 것이다 (그러나 반드시 통합될 필요는 없다). 미분화 세포는 안정적으로 형절전환되어 유전적으로 변형된 딸세포를 생성시킬 수 있다. 이러한 경우, 예를 들어 특정한 전사 인자, 유전자 활성인자 또는 더욱 바람직하게는 상처에서 특이적으로 발견되는 신호에 반응하여 유전자를 전사시키는 유도성 프로모터를 이용하는 피검체에서의 발현의 조절이 필요할 수 있다. 대안적으로, 전달 시스템은 치료되는 피검체에서 분화 세포의 불안정 또는 일시적 형질전환을 유도하도록 고안될 수 있다. 이러한 경우, 발현의 조절이 덜 중요할 수 있는데, 이는 형질전환된 세포가 사멸하거나, 단백질 발현을 중지하는 경우 (이상적으로는, 반흔 형성 감소와 함께 상처 치유 가속화 촉진이 발생하는 경우)에 DNA 분자의 발현이 중지될 것이기 때문이다.

전달 시스템은 벡터에 통합되지 않고 피검체에 DNA 분자를 제공할 수 있다. 예를 들어, DNA 분자는 리포솜 또는 바이러스 입자 내에 통합될 수 있다. 대안적으로, "네이키드(naked)" DNA 분자가 적절한 수단, 예를 들어 세포내이입 흡수에 의해 피검체의 세포로 삽입될 수 있다.

DNA 분자는 트랜스펙션, 감염, 미세주사, 세포융합, 원형질체 융합 또는 발리스틱 봄바르드먼트 (ballistic bombardment)에 의해 치료되는 피검체의 세포에 트랜스펙션될 수 있다. 예를 들어, 금 입자로 코팅된 발리스틱 트랜스펙션, DNA 분자를 함유하는 리포솜, 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스) 및 상처로의 국소적인 플라스미드 DNA의 직접 적용 또는 주사에 의한 직접적인 DNA 흡수 (예를 들어, 세포내이입)을 제공하는 수단에 의해 전달될 수 있다.

본 발명의 작용제의 세포 발현은 상처 주위의 손상되지 않은 영역의 가장자리의 세포에 의해 이루어질 수 있거나, 대안적으로 상처로 치료적으로 도입되는 세포 (예를 들어, 상처 치유 반응과 관련된 배양된 내인성 또는 외인성 세포)에 의해 이루어질 수 있다.

상처 치유 가속화를 촉진하고/하거나 반흔 형성을 예방하거나, 감소시키거나, 억제시키기 위해 치료적으로 도입되는 세포가 이들이 증가된 수준으로 본 발명의 작용제를 발현한 후, 상처 영역에 도입되도록 생체외에서 조작될 수 있음이 인지될 것이다. 이러한 세포는 바람직하게는 상처 치유 촉진에 사용되는 인공 피부 또는 피부 대체물의 생성 또는 제조에 사용하기 위해 생체외에서 배양된 세포일 수 있다. 세포는 더욱 바람직하게는 자가 세포일 수 있으나, 임의의 적절한 세포가 사용될 수 있음이 인지될 것이다.

따라서, 본 발명의 열일곱번째 양태에서, 본 발명의 작용제를 발현하도록 유도된 세포를 포함하는 약제가 제공된다. 이러한 세포는 바람직하게는 단량체 TGF-β3를 발현할 수 있다.

본 발명의 작용제의 세포 발현의 유도는 본 발명에 사용하기에 적합한 작용제의 발현을 야기시키는 핵산의 세포 내로의 통합에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명은 이제 하기의 실험 프로토콜 및 연구, 및 하기의 수반되는 도면을 참조로 하여 추가로 기술될 것이다:

도 1은 환원 또는 비-환원 조건 모두에서 SDS-PAGE에 의한 TGF-β3의 단량체 및 이합체 형태의 비교 결과를 도시한 것이다;

도 2는 실험 래트에서 절개 상처의 위치결정에 사용된 템플릿 (template)을 나타낸 것이다;

도 3은 실험 동물의 상처 부위에 투여된 치료를 요약한 것이다;

도 4는 상처 형성 3일 후의 단량체 또는 이합체 TGF-β3으로 치료된 실험적 상처의 외관의 평과 결과를 도시한 것이다;

도 5는 실험 동물의 상처 부위에 투여된 치료를 요약한 것이다;

도 6은 상처 형성 70일 후의 단량체 또는 이합체 TGF-β3으로 치료된 실험적 반흔의 외관의 평가 결과를 도시한 것이다;

도 7은 상처 형성 70일 후의 실험적 반흔의 외관을 나타낸 대표적인 육안적 이미지를 도시한 것이다;

도 8은 상처 형성 70일 후의 실험적 반흔의 구조를 나타낸 대표적인 현미경적 이미지이다;

도 9는 성공적으로 형질전환된 숙주 세포에 의한 TGF-β3 단량체의 생산을 나타낸 것이다;

도 10은 실험 단백질 재폴딩 조건하에서의 이합체 및 단량체 TGF-β3의 생성을 나타낸 것이다;

도 11은 초여과/소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 TGF-β3 단백질의 분리를 나타낸 것이다.

중요한 아미노산 또는 핵산 서열에 관한 정보는 섹션 "서열 정보"에 제공된다 (본 발명에 따라 사용하기에 적합한 인간 TGF-β의 활성 단편의 아미노산 서열, 및 TGF-β 이형체의 전장의 펩티드를 엔코딩하는 DNA 분자의 서열 및 야생형 TGF-β3의 활성 단편을 엔코딩하는 DNA; 및 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 인간 TGF-β 이형체를 엔코딩하는 DNA의 형성에서 사용되는 프라이머의 DNA 서열을 포 함).

프로토콜 및 실시예

1. TGF-β 단량체 단백질의 생산, 재폴딩, 및 정제를 위한 방법

1.1. 누클레오티드 서열

전장의 TGF-β 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열은 서열 목록 번호 4 내지 6에나타낸 것과 같다. 전장의 TGF-β 단백질은 신호 펩티드(이탤릭체로 나타냄), 프로-펩티드(굵은 글씨로 나타냄), 뿐만 아니라 활성 단편(일반적인 글씨로 나타냄)으로 이루어진다. 야생형 TGF-β3 활성 단편을 코딩하는 누클레오티드 서열은 서열 목록 번호 7로 나타낸다.

1.2. cDNA 형성

인간 절개 상처로부터의 전체 RNA (상처 형성 5일 후에 취함)를 'DNA-프리(DNA-Free)' (Ambion)로 처리하여 임의의 오염된 DNA를 제거하였다. 주형으로서 전체 RNA를 사용하여, 세개의 포유동물 TGF-β 이형체, 즉 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3 각각에 대한 cDNA를 역전사-중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 형성시켰다. RT-PCR 마스터 혼합물을 브릴리언트(Brilliant®) QRT-PCR 코어 시약 키트, 1-스텝 (Stratagene)로부터 제조하였다. 1 마이크로그램의 RNA를 원-스텝 QRT-PCR 완충액, 0.2mM dNTPs, 3.5mM MgCl₂, 1㎕ 스트라타스크립트 (StrataScript) 역전사효소, 태그중합효소(TaqPolymerse) 2.5 유닛, 0.4μM 센스 프라이머 (도 1), 0.4μM 안티-센스 프라이머 (서열정보에 나타냄)를 함유하는 용액 50㎕에 첨가하였다. 반응물을 열 사이클러 (Hybaid PCR Expresses)에 두고, 하기 조건하에서 수행하였다: 45℃에서 30분, 95℃에서 10분, 이후 95℃에서 30초, 65℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 40회 사이클. 72℃에서 10분의 최종 단계. PCR 샘플을 2%(w/v) 아가로즈 젤 상에서 수행하여 밴드 크기를 확인하고, 위자드 PCR 프렙 키트 (Wizard PCR Prep Kit, Promega)를 이용하여 정제하였다.

1.3. 플라스미드의 제조

사용되는 pET-3d 벡터는 pBR322 벡터로부터 유도되고, LacUV5 대조군 하의 T7 프로모터 및 앰피실린 내성 마커 유전자를 함유한다.

세개의 TGF-β 이형체 cDNA 단편 (섹션 1.2에서 생성됨)을 Nco I 및 Bam HI 부위 (5'-3' 각각)에서 pET-3d 벡터로 서브-클로닝시켰다. 생성된 라이게이션을 이후 XL1O 골드 세포(Gold cells) (Stratagene)로 형질 전환시키고, 콜로니 PCR 분석을 수행하여 삽입물을 함유한 클론을 위치시켰다. 최종 클론을 성장시키고, 이의 플라스미드 DNA를 키아프렙 스핀 미니프렙 키트(Qiaprep®Spin Miniprep Kit; Qiagen)를 사용하여 물로 추출하였다. 플라스미드를 서열분석하고, T7 프로모터 프라이머 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') 및 T7 종료자 프라이머 (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3')를 이용하여 확인하였다.

1.4. 형질 전환 및 클로닝

TGF-β 이형체 (섹션 1.3으로부터의) 각각을 엔코딩하는 플라스미드 DNA 1O㎕ (㎕ 당 50 ng)를 1 ml의 저온 (4℃) 적격 대장균 BL21 (DE3) pLysS Singles™ 세포 (Novagen)에 첨가하였다. 20분 후에, 세포를 42℃의 수조에서 30초 동안 인큐베이션하여 열충격 처리하였다. 100㎕의 Psi 배지를 세포/플라스미드 혼합물에 첨가하고, 37℃에서 90분 동안 교반하였다. 50㎕ 및 100㎕ 분취액을 100 μg/mL 앰피실린 (Sigma)을 함유한 LB 아가 플리에트 상에 플레이팅하고, 37℃에서 18 시간 동안 인큐베이션하였다. 단일 콜로니를 배양하고, 냉각된 세포 스톡을 형성시키고, -80℃에서 저장하였다. 플라스미드 DNA를 세포 스톡으로부터 분석하여 정확한 형질 전환을 확인하였다.

1.5. 발현

TGF-β 이형체 (섹션 1.4로부터의) 각각으로 형질 전환된 동결된 대장균 세포의 앰플을 회수하고 100 mL의 LB 배지 및 100 μg/mL 앰피실린을 함유한 배플드 에를렌마이어 플라스크 (baffled Erlenmeyer flask)에 접종하였다. 플라스크를 교반하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 5 mL의 이러한 밤새 배양물을 2-리터 에를렌마이어 플라스크 (500 mL의 LB 배지/amp)에 첨가하고, 37℃에서 교반하면서 인큐베이션하였다. 2 mL 브로스(Broth) 샘플을 1시간 마다 취득하여 성장 및 TGF-β 이형체 발현 (유도후)을 추적하였다. 성장을 분광기에서 600 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정하였다. 흡광도가 0.6 Abs로 측정될 때, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG, Sigma)를 1 mM의 최종농도로 첨가하여 세포를 유도시켜 TGF-β 이형체를 발현시켰다. 배양물을 추가 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 0.5mL의 브로스 샘플을 원심분리 (Sorvall Biofuge에서 10,000 rpm에서 10분)하여 펠렛화시키고, 상층액을 제거하였다. 펠렛을 50㎕의 나트륨 도데실 술페이 트(SDS)-폴리아크릴아미드 젤-전기영동(PAGE) 샘플 완충액에서 재현탁시키고, 95℃의 수조에서 10분 동안 가열하였다. 1O㎕ 샘플을 SDS-PAGE 상에 로딩하였다. SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색을 회퍼 마이티 스몰 (Hoefer®Mighty Small) SE 245 듀얼 젤 케스터(Dual Gel Caster) (Amersham)를 이용하여 수행하였다[문헌(A.T Andrews, 1986)에 기술됨]. 젤은 1 mm 두께였으며, 15%(v/v) 폴리아크릴아미드 젤을 함유하였다.

1.6. 세포 수거 및 봉입체의 분리

섹션 1.5로부터의 세포를, 4315 로터를 구비한 헤티치 로티나 (Hettich Rotina) 46R 원심분리기에서 4℃, 5000 g에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 세포 파열 및 불용성 (봉입체) TGF-β 이형체 각각의 회수를 4℃에서 수행하였다. 세포를 5OmL의 100mM Tris/HCl (Sigma), 1OmM EDTA (Sigma) pH 8.3에 현탁시키고, 산조 소니프렙 (Sanjo Soniprep) 150을 이용하여 음파처리하여 파열시켰다. 0.2%(w/w) 트리톤 X-100 (Sigma)을 현탁액에 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 현탁액을 12,000g에서 40분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 실온에서 5OmL의 100mM Tris/HCl, 1OmM EDTA pH 8.3에 재현탁시킨 후 15,000g에서 40분 동안 원심분리하였다.

1.7. 봉입체의 용해화

섹션 1.6으로부터의 펠렛을 4OmL의 8M 우레아 1%(w/w) DL-디티오트레이톨 (DTT)에 재현탁시키고, 헤이돌프 디액스 (Heidolph Diax) 900 균질화기에서 파열시켰다. 현탁액을 뚜껑을 덮고, 1 시간 동안 교반하여 봉입체를 용해시키고, TGF-β 이형체를 이의 변성된 단량체 형태로 환원시켰다. 현탁액을 이후 4℃, 12,000g에서 30분 동안 원심분리하였다. 완충액을 8M 우레아 (ICN Biomedical)에서 10%(v/v) 아세트산으로 교체하여 상층액을 투석시켰다. 8M 우레아에 용해될 수 있는 대장균 단백질은 완충액을 10%(v/v) 아세트산으로 교체할 때 용액으로부터 침전된다. 1%(w/v) DTT (Sigma)를 현탁액에 첨가하고, 뚜껑을 덮고, 30분 동안 교반하여 완충액 교환 동안 TGF-β 단량체들 간에 형성될 수 있는 임의의 이황화 결합을 감소시켰다. 현탁액을 원심분리하여 가용성 및 불용성 단백질을 분리하였다. 샘플을 우레아 용해화 및 완충액 교환 단계에서 취득하고(아세트산 수용성 및 비수용성 물질), 이후 SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.

1.8. 초여과

섹션 1.7로부터의 10% (v/v) 아세트산 물질을 비보플로우50 (Vivoflow50; Vivascience) 상의 1OkDa 막으로 초여과를 수행하였다. 이러한 목적은 10% (v/v) 아세트산 현탁액의 부피를 3 mL로 감소시키고 저분자량 단백질 (< 1OkDa)을 제거하기 위한 것이다.

1.9. 재폴딩 및 정제

용해된 TGF-β1 , 2 및 3 단백질을 먼저 초여과로 농축하고, 이후 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 컬럼을 통과시켰다. TGF-β 단백질을 함유한 SEC로부터의 분획물을 이후 풀링(pooled)하고 동결건조시켰다. 동결건조된 단량체 TGF-β1 , 2 및 3을 10 mg/mL의 최종 농도가 달성될 때까지 10 mM DTT를 함유한 8M 우레아에 용해시켰다. TGF-β1, 2 및 3 단백질 용액을 교반하면서 재폴딩 용액 (1M 3-(-피리 디노)-1-프로판 술포네이트 (NDSB-201), 20%(v/v) 디메틸 술폭사이드 (DMSO, Sigma), 2%(v/v) 3-(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판술포네이트 (CHAPS), 1M NaCl(Sigma), 1%(w/v) 환원 글루타티온 (GSH, Sigma), 0.05M 트리즈마®베이스(Sigma) pH 9.3)에 0.2mg/mL의 TGF-β1, 2 및 3 단백질의 최종 농도가 달성될 때까지 적가하였다. pH를 농축된 NaOH/HCl을 이용하여 9.2 내지 9.4의 범위내로 유지시키는 것이 중요하다. 용액을 파라필름으로 덮고, 이를 펀칭하여 단량체 단백질의 산화를 허용하고, 8℃에서 교반하였다. 144 시간 후에, 용액을 15,000 g에서 40분 동안 원심분리하여 형성된 침전물을 제거하고, pH를 빙냉 아세트산으로 pH 3.5로 조절하였다.

1.10. 재폴딩된 단량체 단백질의 정제

얻어진 재폴딩된 TGF-β 물질을 이후 표준 크로마토그래프 기술을 이용하여 추가로 정제한 후, 관련 분획물(즉, 단량체 TGF-β 단백질을 함유함)을 초여과로 농축시키고, 특성규명하였다.

2. 단량체 TGF-β 단백질의 특성규명 및 생물학적 활성의 평가를 위한 시험관내 및 생체내 방법

TGF-β 단량체 단백질을 SDS-PAGE; 아미노산 서열 분석(LCMS에 의함); 생체내 생물학적 활성 분석 (하기 기술된 피부 상처 치유 및 반흔 형성의 래트 모델 사용)을 포함하는 여러 방법을 통하여 특성규명하고 생물학적 활성에 대해 평가하였다.

2.1. TGF-β3 단량체의 시험관내 특성규명

2.1.1. 정제된 단량체 TGF-β3의 비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석

2.1.1.1. 방법

정제된 야생형 TGF-β3 단량체를 SDS-PAGE로 평가하여 순도 및 분자량을 결정하였다. 3μg의 정제된 TGF-β3 단량체 (환원되고 비-환원된 샘플), 3μg 이합체 TGF-β3 양성 대조군 (환원되고 비-환원됨) 및 1O㎕ 인비트로겐 마크(Invitrogen Mark) 12 분자량 표준을 폴리아크릴아미드 젤 (10% 내지 20%(v/v) 구배의 아크릴아미드)상에 로딩하였다. 전기영동을 완료한 직후에 젤을 쿠마시 블루로 염색하였다.

2.1.1.2. 결과

비-환원 및 환원 SDS-PAGE 분석의 결과는 도 1에 나타내었으며, 이합체 TGF-β3가 젤 상에서 예상된 위치로 이동되는 것으로 나타났다 (단량체로서 환원된 샘플에 대해 ~13 kDa 및 비환원된 샘플에 대해 25 kDa). 단량체 TGF-β는 환원 및 비환원 샘플에 대해 젤 상에서 예상된 ~13 kDa(12.5 kDa 이론치) 위치로 이동되었다. 추가적인 단백질 밴드는 쿠마시 블루 염색에 의해 전혀 검출되지 않았으며, 이는 대략 1 μg의 단백질의 감도를 갖는다.

2.1.2. 아미노산 서열분석

2.1.2.1. 방법

50 마이크로리터의 정제된 단량체 TGF-β3를 진공 건조시킨 후, 5OmM NH₄HCO₃ 및 10% (v/v) 아세토니트릴을 함유한 20㎕의 용액에 재현탁하였다. 20μg 의 서열분석 등급 트립신 (Promega)을 1O㎕의 키트에서 제공된 재-현탁 완충액 (Promega)에 재현탁시켜 2μg/㎕의 트립신 농도를 생성시켰다. 이를 이후 5OmM NH₄HCO₃ 및 10% (v/v) 아세토니트릴에 희석시켜 0.2μg/㎕의 최종 트립신 농도를 생성시켰다. 단량체 TGF-β3에 1:20 (w/w) 비율로 트립신을 첨가하여 밤새 분해를 수행하였다. 포름산 (Fluka)를 0.1% (v/v)의 최종 농도로 첨가하여 분해를 켄칭하였다. 샘플을 이후 1 pmole/㎕로 희석시키고, 이후 펩티드를 나노-흐름 RP-LCMS (Ultimate system, Q-ToF2, Micromass에 대해 Dionex 온라인)의 공정으로 분석하였다. 5% 아세토니트릴에서 55% 아세토니트릴 (Romil)의 45분 구배를 이용하여 75 μm C18 컬럼 (LC 패키징) 상에서 크로마토그래피를 수행하였다. MS 분석은 기기가 LC로부터 용리되는 펩티드 이온의 m/z를 측정하고, MS-MS 분석을 위한 적절한 이온을 선택하는 데이터 의존 분석의 형태를 취하며, 여기서 상호 충돌에 의한 분해가 서열 정보를 제공하기 위한 단편 펩티드에 사용되었다.

2.1.2.2. 결과

아미노산 서열분석은 TGF-β3 '야생형' 단량체가 예상된 아미노산 서열 (서열 목록 번호 3에 해당)을 가짐을 확인하였다.

2.2. TGF-β3 단량체의 생물학적 활성의 생체내 평가

문헌에서의 데이타는 TGF-β3을 포함한 이합체 TGF-β가 피부 치유를 가속화시키고, 상처 형성 또는 손상 후에 반흔 형성을 감소시킴을 나타낸다[Shah, M et al 1995]. 하기 실시예는 성체 수컷 래트에서 절개 상처 치유(상처 형성 3일 후) 및 반흔 형성 (상처 형성 70일 후)에 대한 단량체 TGF-β3의 생물학적 효과를 조사한 것이다.

2.2.1. 상처 치유 (절개 상처 형성 3일 후)에 대한 단량체 '야생형' 및 돌연변이된 TGF-β3 단백질의 효과

2.2.1.1. 방법

수컷 래트 (Sprague Dawley)를 할로탄으로 마취시키고, 이의 등을 면도하였다. 상처 위치를 도 2에 도시된 바와 같이 피부 표시 잉크로 표준물 소유 템플릿을 이용하여 표시하였다. 샘플을 0.25M 말토오스 (Sigma), 0.002%(v/v) 아세트산 및 0.33%(v/v) 이소프로필 알코올을 함유한 멸균 비히클 완충액에서 도 3의 표에 개략된 농도로 희석시켰다. 모든 샘플을 필터 멸균하고, 내독소가 존재하지 않게 하였다. 각 처리 그룹에 4마리의 래트를 사용하였다. 각 처리 그룹으로부터의 100㎕의 샘플 (도 3)을 표시된 상처 위치 A 및 B에 피내 주사하였다(치료하지 않은 래트-나이브(naive) 래트는 제외함). 상처 위치 A 및 B에서 전체 두께 1 cm 길이의 절개부를 11번 외과용 매스날로 만들었다. 모든 동물을 별도로 우리에 넣었다. 24시간 후에, 동물에 두번째 투여량의 샘플을 처리하였다. 3일 후에, 상처를 촬영하고, 육안적 비쥬얼 아날로그 스코어링 시스템 (Visual Analogue Scoring system) (문헌[Beausang, E et al. 1998]으로부터 변형됨)을 이용하여 분석하였다. 데이타의 통계학적 분석을 만 휘트니(Mann Whitney) U/스튜던트 T 시험을 이용하여 수행하였다. p<0.05의 값이 유의한 것으로 간주되었다.

2.2.1.2. 결과

절개 상처를 3일 후에 육안적 VAS 시스템을 이용하여 시험하였다 (도 4 참조). 이러한 10 포인트 점수에서 0의 점수는 잘-치유된 상처를 나타내며, 10의 점수는 매우 불량하게 치유된 상처를 나타낸다. 데이타는 하기와 같다:

50ng/100㎕ 또는 100ng/100㎕의 '야생형' 단량체 TGF-β3를 이용한 치료는 미처리 (나이브 대조군) 및 위약 처리 모두와 비교하여 VAS 점수를 감소시킨다 (즉, 상처의 육안적 외관을 개선시킨다). 100ng/100㎕ 용량을 이용한 처리는 미처리 (나이브 대조군)와 비교하여 상처의 외관을 유의하게 개선시킨다(p<0.01). 단량체 야생형 TGF-β가 이합체 형태 보다 큰 유효성을 나타낸다는 것을 놀라운 것이다.

2.2.2. 반흔 형성 (절개 상처 형성 70일 후)에 대한 단량체 '야생형' TGF-β3 단백질의 효과

2.2.2.1. 방법

수컷 래트 (Sprague Dawley)를 할로탄으로 마취시키고 이의 등을 면도하였다. 상처 형성 위치를 도 5에 나타낸 바와 같이 피부 표시 잉크를 지닌 표준화된 템플릿을 이용하여 표시하였다. 샘플을 0.25M 말토오스 (Sigma), 0.002% (v/v) 아세트산 및 0.33% (v/v) 이소프로필 알코올을 함유한 멸균 비히클 완충액에 도 5의 표에 개략된 농도로 희석시켰다. 모든 샘플을 필터 멸균하고, 내독소가 존재하지 않게 하였다. 각 처리 그룹에 4마리의 래트를 사용하였다. 각 처리 그룹으로부터의 100㎕의 샘플 (도 5)을 표시된 상처 위치 A 및 B에 피내 주사하였다 (치료하지 않은 래트-나이브 래트는 제외함). 상처 위치 A 및 B에서 전체 두께 1 cm 길이의 절개부를 11번 외과용 매스날로 만들었다. 모든 동물을 별도로 우리에 넣었다. 24시간 후에, 동물에 두번째 용량의 샘플을 처리하였다. 70일 후에, 반흔을 촬영하고, 육안적 비쥬얼 아날로그 스코어링 시스템 (문헌[Beausang, E et al. 1998]으로부터 변형됨)을 이용하여 분석하였다. 상기에 기술된 바와 같이 형성된 반흔의 육안적 외관의 대표적인 예는 도 7에 도시되어 있다.

육안적 분석 후에, 상처를 절개하고 10% 완충된 염수에 두고, 이후 왁스 블록에서 조직학적 평가를 위해 처리하였다. 왁스 블록을 5μm 연속 섹션으로 절단하고, 슬라이드에 위치시켰다. 슬라이드를 마손스 트리크롬(Massons Trichrome)으로 염색하고, 분석하였다. 데이타의 통계학적 분석을 만 휘트니 U/스튜던트 T 시험을 이용하여 수행하였다. p<0.05의 값이 유의한 것으로 간주되었다. 상기와 같이 기술된 바와 같이 형성된 반흔의 현미경적 외관의 대표적인 예는 도 8에 도시되어 있다.

2.2.2.2. 육안적 VAS를 이용한 70일 후의 절개 상처의 평가

절개 상처를 육안적 VAS 시스템을 이용하여 70일 후에 시험하였다. 10의 점수는 불량한 반흔을 나타내며, 0의 점수는 정상 피부를 나타낸다. 70일 상처의 VAS 분석의 결과는 도 6에 요약되어 있다. 이는 하기와 같다:

단량체 '야생형' TGF-β3 (50ng/100㎕ 및 100ng/100㎕ 용량에서)는 위약 처리된 상처 및 나이브 상처에 비해 반흔 형성을 감소시켰다. 100ng/100㎕ 용량에 대해 이러한 감소는 위약 처리된 상처에 비교하여 통계학적으로 유의하다 (p<0.01).

50ng/100㎕에서 이합체 TGF-β3는 위약 처리된 상처 및 나이브 상처에 비해 반흔 형성을 감소시켰다. 이러한 감소는 위약 처리된 상처에 비교하여 통계학적으로 유의하다 (p<0.01).

3. 생물학적 활성 단량체의 생성을 위한 바람직한 조건의 개발

본 발명자들은 정확하게 폴딩된 생물학적 활성 단편 TGF-β3 단량체를 생성하는 개선된 방법이 확립될 수 있는지의 여부를 연구하였다. 하기 실시예는 TGF-β3의 재폴딩 단량체에 대한 본 발명의 방법의 적용을 예시한다.

본 연구는 재폴드 시약을 스크리닝하는 것으로 구성되었다 (3.12 참조). 이후, 정확하게 재폴딩된 단량체를 정제시키는 방법을 연구하였다 (3.13).

이러한 연구로 본 발명자들은 정확하게 폴딩된 생물학적 TGF-β 단량체를 생성시키는 개선된 방법이 용해된 폴딩되지 않은 단량체 성장 인자를, (ⅰ) 2-(시클로헥실아미노)-에탄술폰산 (CHES) 또는 이의 기능적 유사체; 및 (ⅱ) 저분자량 술프히드릴/이황화 산화환원 시스템을 함유하는 용액에 첨가하고, 용액 중의 성장 인자를 이합체의 생물학적 활성 성장 인자가 형성될때까지 인큐베이팅시키는 것을 포함하는 방법에 의해 확립될 수 있음을 확인하였다:

실험:

3.1. cDNA 생성

인간 절제 상처로부터의 전체 RNA (상처 형성 5일 후에 채취)에 DNA-Free (Ambion)를 처리하여 임의의 오염 DNA를 제거하였다. 전체 RNA를 주형으로 이용하여, 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)에 의해 TGF-β3 cDNA를 생성시켰다. 브 릴리언트® QRT-PCR 코어 리전트 키트 (Brilliant® QRT-PCR Core Reagent Kit, 1-Step (Stratagene))로부터 RT-PCR 마스터 믹스를 제조하였다. 1 마이크로그램의 RNA를, 원-스텝 (One-step) QRT-PCR 완충용액, 0.2mM dNTPs, 3.5mM MgCl₂, 1 μL 스트라타스크립트 (StrataScript) 역전사효소, Taq 중합효소 2.5 유닛, 0.4 μM 센스 프라이머 (5' GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC 3'), 0.4μM 센스 프라이머 (5'- CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACA AGA C 3')를 포함하는 50 μL의 용액에 첨가하였다. 반응물을 열 사이클러 (Hybaid PCR Expresses)에 두고 하기 조건으로 수행하였다: 45℃에서 30분, 95℃에서 10분, 이후 30초 동안 95℃, 1분 동안 65℃ 및 1분 동안 72℃의 40 주기, 10분 동안 72℃의 최종 단계. PCR 샘플을 2% (w/w) 아가로오스 젤에서 영동시켜, 밴드 크기를 확인하고, 위저드 PCR 프렙 키트 (Wizard PCR Prep Kit) (Promega)를 이용하여 정제시켰다.

3.2. 벡터 클로닝 및 숙주 세포 형질전환.

pET-24d 벡터는 pBR322 벡터로부터 유래되며, 이는 LacUV5 조절하의 T7 프로모터 및 카나마이신 내성 마커 유전자를 함유한다.

TGF-β3 cDNA 단편을 4시간 동안 37℃에서 15μL의 반응물 (Nuclease Free Water, Novagen) 중의 0.75μL의 NcoＩ (New England Biolabs) 및 0.75μL의 BamHＩ (New England Biolabs)와 1 X BamHＩ 완충용액 (New England Biolabs)을 이용하여 분해하였다. 1 마이크로리터의 pET-24d 플라스미드 (Novagen)를 동일한 방식으로 분해하였다. 분해된 cDNA 및 큰 플라스미드 단편을 아가로오스 젤 정제시키고, 스핀프렙 (SpinPrep) 젤 DNA 추출 키트 (Novagen)를 이용하여 회수하였다.

정제된 cDNA 및 플라스미드 단편을 T4 리가아제 키트 (Novagen)를 이용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션된 cDNA/플라스미드를 HMS174 (DE3) (Novagen HMS 174 (DE3) 형질전환 키트)로 형질전환시켰다. 50μg/mL 카나마이신 (Invitrogen)을 함유하는 루리아 브로쓰 (LB) 아가 플레이트에 플레이팅하여 형질전환체를 선택하였다. 제한 절단 및/또는 발현을 위한 적절한 클론을 선택하였다.

3.3. 생성물 발현을 위한 클론 스크리닝

클론을 절반 강도의 '테리픽 브로쓰 (Terrific Broth)' (6g/L 피톤 (phytone) 펩톤 (Becton Dickinson), 12g/L 효모 추출물 (Becton Dickinson), 2g/L 글리세롤 (JT Baker), 1.16g/L 제 1 인산칼륨 (JT Baker), 6.25g/L 제 2 인산칼륨 (JT Baker), 1리터로 채우는 증류수)의 플라스크 배양으로 교반하면서 성장시키고, 1 mM 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 이용하여 0.65 내지 0.85의 OD_6O0의 지수기를 유도하였다. 유도후 샘플을 IPTG의 첨가 3시간 후에 수집하고, 생성물 유도 및 발현에 대해 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)으로 분석하였다. 유도전/유도후 클론 1-4 샘플 분취량 및 마크 12 분자량 표준 (Invitogen - 2.5-200kDa의 분자량 범위)을 120 밀리암페어 및 200 볼트에서 약 40-50분 동안 NuPAGE® Novex 12% Bis-Tris Gel, 1.0mm (Invitrogen)에서 영동시키고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 6 내지 14.4kDa의 크기의 단백질 (즉, TGF-β3 단량체)이 각각의 상기 배양물에서 명백하게 유도되었고 (도 9 참조 ), 클론 2가 가장 많은 양의 TGF-β3 단백질을 발현하였다 (도 9 참조).

3.4. 동결 세포 스톡

클론 1-4를 절반 강도의 테리픽 브로쓰에서 약 1의 OD₆₀₀으로 교반 플라스크에서 성장시키고, 글리세롤을 20%(v/v)로 첨가하여 글리세롤 스톡으로 보관하였다. 1.2 mL의 브로쓰를 12 x 2mL의 냉동바이얼 (0.3 mL의 글리세롤 함유)에 분취시키고, -70℃에서 보관하였다.

3.5. TGF-베타 3 유전자의 서열 확인.

동결 세포 스톡에 사용된 배양물 샘플을 수집하고, 글리세롤을 첨가하고, 키아젠 미니프렙 키트를 이용하는 플라스미드 분리에 사용하였다. 분리된 플라스미드를 T7 프로모터 프라이머 (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3') 및 T7 종료자 프라이머 (5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3')를 이용하여 서열 분석하고 확인하였다.

3.6. 시드 배양.

클론 2가 가장 많은 양의 TGF-베타 3 단백질을 발현함에 따라, 동결 스톡 앰풀 (섹션 3.4)을 회수하고, 500mL의 HySoy 배지 (12g/L Hy-Soy (Quest International), 24g/L 효모 추출물 (Becton Dickinson), 10g/L NaCl (Sigma) 및 10g/L 글리세롤 (Sigma) 및 50μg/mL의 카나마이신)를 함유하는 2리터의 배플드 에를렌마이어 플라스크에 접종시켰다. 플라스크를 37℃ 및 200 rpm에서 교반하면서 인큐베이팅시키고, OD₅₅₀을 측정하기 위해 주기적으로 샘플을 채취하였다. 배양물의 OD가 3.21 U/mL에 도달 (7시간 후)하는 경우, 세포 브로쓰를 150L 발효기 (100 L 작업 부피)에 시딩하기 위해 사용하였다.

3.7. 발효

900 밀리리터의 세포 브로쓰 (섹션 3.6)을 90L의 배치 배양 배지 (0.6g/L K₂HPO₄, 0.4g/L KH₂HPO₄, 1.25g/L NH₄SO₄, 12g/L HY-Soy, 24g/L 효모 추출물 및 10g/L 글리세롤)를 함유하는 150L 발효기 (WHE)에 접종하기 위해 사용하였다. 발효 수행 파라미터를 다음과 같이 조절하였다: 온도 설정, 37℃; pH 설정, 7.0 (4N 수산화암모늄 및 4N 인산을 이용하여 유지); 및 최초에 100%로 조정된 용존산소 (OD). 용기 수두압은 7 psi였고, 교반 및 기류 (vvm 또는 slpm)는 각각 분당 배지 부피당 1 부피의 공기를 이용하여 200-400 rpm이었다. 하기의 우선사항의 발효 설정 파라미터를 조정하여 DO를 20%를 초과하도록 유지시켰다: 진탕 (최대 400 rpm), 통기 (최대 1.5 vvm), 산소 보충 (최대 33.3 Ipm), 및 역위압 (최대 12 psi). 플루로닉 (Pluronic) L-61 (25% v/v)를 이용하여 기포형성을 조절하였다. 배양물의 OD가 10 U/mL에 도달하는 경우, 글리세롤 공급 (50% v/v)을 45 mL/분의 유속으로 개시하였다. OD가 40 U/mL에 도달하는 경우, IPTG를 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하여 세포를 유도시켰다.

3.8. 수거

유도 4시간 후, 발효기를 10℃로 냉각시키고, 기류 및 교반을 각각 0.3 vvm 및 100 rpm으로 감소시켰다. 기포 및 pH 조절을 중지하고, 역위압을 3 psi로 조정하였다. 10℃에서 웨스트팔리아 (Westfalia) CSA 8 연속 원심분리를 이용한 연속 적인 원심분리에 의해 배양물을 수거하였다. 원심분리를 15,000 rpm 및 분당 3리터의 유속에서 수행하고, 세포 슬러리를 수집하였다.

3.9. 세포 용해 및 IB 회수

발효 세포 페이스트 (섹션 3.8)를 용해 완충용액 (6.1g/L 트리즈마베이스 (TrizmaBase)(트리스), 3.7g/L 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 58.44g/L NaCl 및 10g/L 트리톤 X-100, pH 8.0)으로 1:5로 희석시키고, 핸드 헬드 균질화기를 이용하여 재현탁시켰다. 재현탁된 세포 페이스트를 고압 균질화기 (파라미터: 압력, 10,000 psig; 유속, 450 mL/분; 및 온도, 15℃)를 통해 2회 통과시켰다. 이후, 균질화된 세포 용해물을 4℃에서 20분 동안 5,000 x g에서 원심분리 (bucket centrifuge, fixed-angle rotor)시켰다. 상층액을 불용성 (봉입체) TGF-β3를 남기고 폐기하였다. 봉입체 (IB) 펠렛을 핸드 헬드 균질화기를 이용하여 세척 완충용액 (6.1 g/L 트리스 및 3.72 g/L EDTA, pH 8.0)에 재현탁시키고, 원심분리 (4℃에서 20분 동안 5,000 x g)시켰다.

3.10. 봉입체 용해화

섹션 3.9로부터의 침전물을 용해화 완충용액 (6.1g/L 트리스, 15.4g/L DL-디티오트레이톨 (DTT) 및 360.4g/L 우레아, pH 8.0)에 1:10으로 희석시키고, 핸드 헬드 균질화기를 이용하여 재현탁시켰다. 현탁액의 커버를 씌우고, 60-75분 동안 실온에서 교반시켜, 봉입체를 용해시키고, TGF-β3를 이의 단량체 형태로 환원시켰다. 재현탁된 펠렛의 pH를 NaOH/아세트산을 이용하여 pH 9.4-9.6으로 조정하고, 60-75분 동안의 두번째 시간 동안 인큐베이팅시켰다.

3.11. 정화/초여과 및 정용여과

섹션 3.10의 용해된 물질을 정화시키고, 농축시키고, 접면 유동 여과 (Tangential Flow Filtration) (TFF) 시스템 (Millipore)으로 정용여과시켰다. 최초 정화 및 농축을 미리 조절된 정화 TFF 막 (Millipore Pellicon 1000kDa, regenerated cellulose, screen V)을 이용하여 수행하였다. 정화된 TGF-β3를 투과액에서 수거하였다. 초여과/정용여과 (UF/DF) 막 (Millipore Pellicon 5kDa, regenerated cellulose, screen C)으로 전환시킨 후, TGF-β3를 6 정용부피의 용해화 완충용액 (6.1g/L 트리스, 15.4g/L DTT 및 360.4g/L 우레아, pH 9.5)으로 세척하였다.

3.12. 재폴드 스크리닝 매트릭스 1

3.12.1. 방법

섹션 1.12로부터의 정화된 물질 내의 TGF-β3 단백질 함량을 SDS-PAGE, 쿠마시 블루 염색 및 농도 계측과 함께 RC DC™ 단백질 분석 (BioRad)을 이용하여 정량하였다. TGF-베타 3 물질을 일련의 재폴드 완충용액에 희석시켰다 (표 1 및 2 참조). 1 mL의 샘플을 6일의 시간에 걸쳐 매일 채취하고, SDS-PAGE를 이용하여 비환원 조건하에서 분석하였다. 샘플 분취량 및 마크 12 분자량 표준 (Invitogen - 2.5-200kDa의 분자량 범위)을 120 밀리암페어 및 200 볼트에서 약 40-50분 동안 NuPAGE® Novex 12% Bis-Tris Gel, 1.0mm (Invitrogen)에서 영동시켰다. 이후, 단백질 샘플을 노벡스 블로팅 (Novex Blotting) 장치 (Invitrogen)를 이용하여 니트로셀룰로오스 막 (Invitrogen)으로 전기영동적으로 옮겼다. 막을 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중의 5% (w/v) 탈지유 분말, 1% (v/v) 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트 (Tween 20, Sigma)를 이용하여 블로킹시켰다. 막을 세척 (PBS, 0.1%(v/v) Tween 20)하고, 일차 항체 (PBS 및 0.1(v/v) Tween 20에 1:500으로 희석된 항-TGF-β3, MAB643(R&D systems))로 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 일차 항체와 인큐베이팅시킨 후, 니트로셀룰로오스를 세척 완충용액 (PBS, 1% (v/v) Tween 20)으로 세척하였다. 이후, 니트로셀룰로오스를 이차 항체 (PBS, 0.1% (v/v) Tween 20에 1:2000으로 희석된 알칼리성 포스파타아제에 컨쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgG (Abcam PO397))로 1시간 동안 추가로 인큐베이팅시켰다. 막을 다시 세척 (PBS, 1% (v/v) Tween 20)하고, 알칼리성 포스파타아제에 대한 웨스턴 블루 (Western Blue) 안정화 기질 (Promega)을 이용하여 발달시켰다.

MAB 643 항체로 정확하게 재폴딩된 단량체 및 이합체 TGF-베타 3 종을 검출하였다.

3.12.2. 결과

표 1 및 2는 50개의 다양한 실험 조건하에서의 TGF-β3의 재폴딩 시험에서 수득된 결과를 요약한다.

본 발명자들은 하기 기술된 조건 (즉, 실험 조건 12, 19, 36, 37, 42, 43 및 44)이 정확하게 재폴딩된 이합체 TGF-베타 3를 생성한 것을 확립하였다.

1. 0.7M 2-(시클로헥실아미노) 에탄술폰산 (CHES), 2mM 환원 글루타티온 (GSH), 0.4mM 산화 글루타티온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 12).

2. 30mM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 0.4mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 19).

3. 1M NDSB-201, 2mM 환원 글루타티온 (GSH), 2mM 산화 글루타티온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 36).

4. 0.7M CHES, 2mM 환원 글루타티온 (GSH), 2mM 산화 글루타티온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 37).

5. 30mM 타우로데옥시콜레이트 + 1M NDSB-221, 2mM 환원 글루타티온 (GSH), 2mM 산화 글루타티온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 42).

6. 30 mM 타우로데옥시콜레이트 + 0.7M CHES, 2mM 환원 글루타티온 (GSH), 2mM 산화 글루타티온 (GSSG), 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 43).

7. 30 mM 타우로데옥시콜레이트, 0.7M CHES, 2mM GSH, 2mM GSSG, 0.12mg/mL TGF-베타 3, pH 9.5, 2-8℃ (실험 조건 44).

예를 들어, 도 10은 실험 조건 12의 유효성을 예시한다.

표 1. 재폴드 스크리닝 매트릭스 및 결과

표 2. 재폴드 스크리닝 매트릭스 및 결과

3.13. 초여과/소수성 상호작용 크로마토그래피.

선택된 재폴딩 용액을 초여과 (막은 플랫-시트(flat-sheet) 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon)임. 5kDa, 0.1m², 재생 셀룰로오스, screen)로 5배 농축시켰 다. 이후, 농축된 재폴드 물질의 pH를 빙냉 아세트산을 이용하여 2.5-2.8의 pH로 조정하고, 희석 완충용액 (2.72g/L 나트륨 아세테이트, 264.28g/L 암모늄 설페이트, 100g/L 아세트산, 및 210.7g/L 아르기닌 히드로클로라이드 pH 3.3)으로 1:1 희석시켰다. 부틸 세파로오스 4 패스트 플로우 (Fast Flow) 컬럼 (Amersham, 16cm Bed Height)을 4 컬럼 부피의 완충용액 A (2.72g/L 나트륨 아세테이트, 132.14g/L 암모늄 설페이트 및 100g/L 아세트산 pH 3.3)로 평형화시켰다. 재폴드 물질을 0.22μM 막 (Millipore Millipak filter)을 통해 여과시키고, 100 cm/시의 유속 (이러한 유속이 공정을 통해 사용됨)으로 부틸 세파로오스 컬럼에 로딩하였다. 이후, 컬럼을 4 컬럼 부피의 완충용액 A로 세척하였다. TGF-베타 3 단백질을 완충용액 B (2.72g/L 나트륨 아세테이트, 100g/L 아세트산 및 300g/L 에탄올 pH 3.3)를 이용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 단량체 및 이합체 형태의 TGF-β3 단백질을 함유하는 첫번째 피크를 풀링시키고 (도 11 참조), 단량체 단백질을 분리하였다.

서열 정보

TGF-β 1 (서열 목록 번호 1)

TGF-β 2 (서열 목록 번호 2)

TGF-β3 (서열 목록 번호 3)

전장의 TGF-β 1을 엔코딩하는 DNA (서열 목록 번호 4), 이는 신호 펩티드 (이탤릭체), 프로-펩티드 (굵은 글씨)뿐만 아니라 활성 단편 (정상 글씨)을 나타내고 있다.

전장의 TGF-β 2를 엔코딩하는 DNA (서열 목록 번호 5), 이는 신호 펩티드 (이탤릭체), 프로-펩티드 (굵은 글씨)뿐만 아니라 활성 단편 (정상 글씨)을 나타내고 있다.

전장의 TGF-β3를 엔코딩하는 DNA (서열 목록 번호 6), 이는 신호 펩티드 (이탤릭체), 프로-펩티드 (굵은 글씨)뿐만 아니라 활성 단편 (정상 글씨)을 나타내고 있다.

서열 목록 번호 7 - 야생형 인간 TGF-β3의 활성 단편을 엔코딩하는 DNA

TGF-베타 1, TGF-베타 2 및 TGF-베타 3의 cDNA 생성을 위한 센스 및 안티센스 프라이머:

SEQUENCE LISTING <110> Renovo Limited Ferguson, Mark Mellors, Phil Laverty, Hugh Occleston, Nick O'Kane, Sharon Atkinson, Emma <120> MEDICAMENTS AND PROTEINS <130> P90083PWO <150> GB0604966.2 <151> 2006-03-11 <160> 15 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15 Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95 Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 4 <211> 1173 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgccgccct ccgggctgcg gctgctgctg ctgctgctac cgctgctgtg gctactggtg 60 ctgacgcctg gccggccggc cgcgggacta tccacctgca agactatcga catggagctg 120 gtgaagcgga agcgcatcga ggccatccgc ggccagatcc tgtccaagct gcggctcgcc 180 agccccccga gccaggggga ggtgccgccc ggcccgctgc ccgaggccgt gctcgccctg 240 tacaacagca cccgcgaccg ggtggccggg gagagtgcag aaccggagcc cgagcctgag 300 gccgactact acgccaagga ggtcacccgc gtgctaatgg tggaaaccca caacgaaatc 360 tatgacaagt tcaagcagag tacacacagc atatatatgt tcttcaacac atcagagctc 420 cgagaagcgg tacctgaacc cgtgttgctc tcccgggcag agctgcgtct gctgaggctc 480 aagttaaaag tggagcagca cgtggagctg taccagaaat acagcaacaa ttcctggcga 540 tacctcagca accggctgct ggcacccagc gactcgccag agtggttatc ttttgatgtc 600 accggagttg tgcggcagtg gttgagccgt ggaggggaaa ttgagggctt tcgccttagc 660 gcccactgct cctgtgacag cagggataac acactgcaag tggacatcaa cgggttcact 720 accggccgcc gaggtgacct ggccaccatt catggcatga accggccttt cctgcttctc 780 atggccaccc cgctggagag ggcccagcat ctgcaaagct cccggcaccg ccgagccctg 840 gacaccaact attgcttcag ctccacggag aagaactgct gcgtgcggca gctgtacatt 900 gacttccgca aggacctcgg ctggaagtgg atccacgagc ccaagggcta ccatgccaac 960 ttctgcctcg ggccctgccc ctacatttgg agcctggaca cgcagtacag caaggtcctg 1020 gccctgtaca accagcataa cccgggcgcc tcggcggcgc cgtgctgcgt gccgcaggcg 1080 ctggagccgc tgcccathgt gtactacgtg ggccgcaagc ccaaggtgga gcagctgtcc 1140 aacatgatcg tgcgctcctg caagtgcagc tga 1173 <210> 5 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctgtctacct gcagcacact cgatatggac cagttcatgc gcaagaggat cgaggcgatc 60 cgcgggcaga tcctgagcaa gctgaagctc accagtcccc cagaagacta tcctgagccc 120 gaggaagtcc ccccggaggt gatttccatc tacaacagca ccagggactt gctccaggag 180 aaggcgagcc ggagggcggc cgcctgcgag cgcgagagga gcgacgaaga gtactacgcc 240 aaggaggttt acaaaataga catgccgccc ttcttcccct ccgaagccat cccgcccact 300 ttctacagac cctacttcag aattgttcga tttgacgtct cagcaatgga gaagaatgct 360 tccaatttgg tgaaagcaga gttcagagtc tttcgtttgc agaacccaaa agccagagtg 420 cctgaacaac ggattgagct atatcagatt ctcaagtcca aagatttaac atctccaacc 480 cagcgctaca tcgacagcaa agttgtgaaa acaagagcag aaggcgaatg gctctccttc 540 gatgtaactg atgctgttca tgaatggctt caccataaag acaggaacct gggatttaaa 600 ataagcttac actgtccctg ctgcactttt gtaccatcta ataattacat catcccaaat 660 aaaagtgaag aactagaagc aagatttgca ggtattgatg gcacctccac atataccagt 720 ggtgatcaga aaactataaa gtccactagg aaaaaaaaca gtgggaagac cccacatctc 780 ctgctaatgt tattgccctc ctacagactt gagtcacaac agaccaaccg gcggaagaag 840 cgtgctttgg atgcggccta ttgctttaga aatgtgcagg ataattgctg cctacgtcca 900 ctttacattg atttcaagag ggatctaggg tggaaatgga tacacgaacc caaagggtac 960 aatgccaact tctgtgctgg agcatgcccg tatttatgga gttcagacac tcagcacagc 1020 agggtcctga gcttatataa taccataaat ccagaagcat ctgcttctcc ttgctgcgtg 1080 tcccaagatt tagaacctct aaccattctc tactacattg gcaaaacacc caagattgaa 1140 cagctttcta atatgattgt aaagtcttgc aaatgcagct aa 1182 <210> 6 <211> 1239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgaagatgc acttgcaaag ggctctggtg gtcctggccc tgctgaactt tgccacggtc 60 agcctctctc tgtccacttg caccaccttg gacttcggcc acatcaagaa gaagagggtg 120 gaagccatta ggggacagat cttgagcaag ctcaggctca ccagcccccc tgagccaacg 180 gtgatgaccc acgtccccta tcaggtcctg gccctttaca acagcacccg ggagctgctg 240 gaggagatgc atggggagag ggaggaaggc tgcacccagg aaaacaccga gtcggaatac 300 tatgccaaag aaatccataa attcgacatg atccaggggc tggcggagca caacgaactg 360 gctgtctgcc ctaaaggaat tacctccaag gttttccgct tcaatgtgtc ctcagtggag 420 aaaaatagaa ccaacctatt ccgagcagaa ttccgggtct tgcgggtgcc caaccccagc 480 tctaagcgga atgagcagag gatcgagctc ttccagatcc ttcggccaga tgagcacatt 540 gccaaacagc gctatatcgg tggcaagaat ctgcccacac ggggcactgc cgagtggctg 600 tcctttgatg tcactgacac tgtgcgtgag tggctgttga gaagagagtc caacttaggt 660 ctagaaatca gcattcactg tccatgtcac acctttcagc ccaatggaga tatcctggaa 720 aacattcacg aggtgatgga aatcaaattc aaaggcgtgg acaatgagga tgaccatggc 780 cgtggagatc tggggcgcct caagaagcag aaggatcacc acaaccctca tctaatcctc 840 atgatgattc ccccacaccg gctcgacaac ccgggccagg ggggtcagag gaagaagcgg 900 gctttggaca ccaattactg cttccgcaac ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 960 tacattgact tccgacagga tctgggctgg aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat 1020 gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg 1080 gtgctgggac tgtacaacac tctgaaccct gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 1140 caggacctgg agcccctgac catcctgtac tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 1200 ctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa tgtagctga 1239 <210> 7 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gctttggaca ccaattactg cttccgcaac ttggaggaga actgctgtgt gcgccccctc 60 tacattgact tccgacagga tctgggctgg aagtgggtcc atgaacctaa gggctactat 120 gccaacttct gctcaggccc ttgcccatac ctccgcagtg cagacacaac ccacagcacg 180 gtgctgggac tgtacaacac tctgaaccct gaagcatctg cctcgccttg ctgcgtgccc 240 caggacctgg agcccctgac catcctgtac tatgttggga ggacccccaa agtggagcag 300 ctctccaaca tggtggtgaa gtcttgtaaa tgtagc 336 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense primer for TGF-beta 1 <400> 8 gttacaccat ggccctggac accaactatt 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense primer for TGF-beta 1 <400> 9 cagccggatc cggtcgactc agctgcactt 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense primer for TGF-beta 2 <400> 10 gttacaccat ggctttggat gcggcctatt 30 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense primer for TGF-beta 2 <400> 11 cagccggatc cggtcgactc agctgcattt g 31 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense primer for TGF-beta 3 <400> 12 gatataccat ggctttggac accaattact actgc 35 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense primer for TGF-beta 3 <400> 13 cagccggatc cggtcgactc agctacattt acaagac 37 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 promoter primer <400> 14 taatacgact cactataggg 20 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> T7 terminator primer <400> 15 gctagttatt gctcagcgg 19

Claims (23)

1. 약제로 사용하기 위한 TGF-β 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체.
2. 약제로 사용하기 위한 TGF-β3 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체.
3. 약 12kDa의 분자량을 지니는 제 1항 또는 제 2항에 따른 TGF-β 단량체의 용도.
4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 억제하는데 사용하기 위한 약제의 제조에서의 용도.
5. 제 2항 내지 제 4항에 있어서, TGF-β3 단량체 또는 이의 단편 또는 유도체가 서열 목록 번호 3을 포함하는 야생형 TGF-β3 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체인 용도.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상처가 피부 상처인 용도.
7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상처가 안구 상처인 용도.
8. 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 급성 상처인 용도.
9. 제 8항에 있어서, 상처가 화상인 용도.
10. 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 만성 상처인 용도.
11. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상피 재생의 촉진에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 용도.
12. 제 11항에 있어서, 상피가 표피를 포함하는 것인 용도.
13. 제 11항에 있어서, 상피가 안구의 상피를 포함하는 것인 용도.
14. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 섬유성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 용도.
15. 제 14항에 있어서, 섬유성 장애가 폐 섬유증, 간 섬유증, 공피증, 피부 섬유증, 근섬유증, 방사선 섬유증, 신장 섬유증, 안구 섬유증 및 자궁 섬유증으로 구성 된 군으로부터 선택되는 용도.
16. 제 3항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체가 0.78pM 내지 0.78mM의 농도로 제공되는 용도.
17. 제 3항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 약 5 내지 7의 pH를 지니는 것인 용도.
18. 제 3항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 약제가 실질적으로 알코올을 함유하지 않는 것인 용도.
19. 제 3항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체가, 용해된 폴딩되지 않은 단량체 TGF-β (또는 이의 단편 또는 유도체)를, (ⅰ) 2-(시클로헥실아미노)-에탄술폰산 (CHES) 또는 이의 기능적 유사체; 및 (ⅱ) 저분자량 술프히드릴/디술피드 산화환원 시스템을 함유하는 용액에 첨가하고, 생물학적 활성의 단량체 TGF-β가 형성될때까지 상기 용액에서 TGF-β를 인큐베이팅시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생물학적 활성 형태로 폴딩되는 용도.
20. 치료학적 유효량의 단량체 TGF-β 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도 체를 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 억제할 필요가 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 상처 치유를 가속화시키고/시키거나 반흔 형성을 억제하는 방법.
21. 제 20항에 있어서, TGF-β 단량체 또는 이의 단편이 서열 목록 번호 3을 포함하는 야생형 TGF-β 단량체 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체인 방법.
22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상처가 피부 상처인 방법.
23. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 상처가 안구 상처인 방법.

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