CN101605555A - 用于治疗伤口的基于TGF-β单体的药物和蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了单体TGF－β或其片段或其衍生物作为药物的用途。这些药物优选地包括单体TGF－β3或其片段或其衍生物。提供的药物可用于加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成、促进上皮再生、或预防和/或治疗纤维化疾病。

Description

用于治疗伤口的基于TGF-β单体的药物和蛋白质
本发明涉及新药物的提供。在优选的实施方案中，本发明提供了适合用于加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的药物。本发明还提供了加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的方法。
转化生长因子β(TGF-β)类是具多样生物活性的细胞因子家族。TGF-β家族包括五种同工型：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5。
TGF-β用于很多不同的治疗背景。由于TGF-β的治疗性潜能，对TGF-β家族成员尤其是TGF-β1-3的药学用途产生了很大兴趣。
众所周知，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3在调节伤口愈合的反应中起关键作用。TGF-β的活性可能影响了伤口愈合的速度和愈合引起的瘢痕形成的范围。
TGF-β1用于预防和/或治疗硬皮病、血管生成病症、肾病、骨质疏松、骨病、血管球性肾炎和肾病。
TGF-β2可用于治疗神经胶质瘤、非小细胞肺癌、胰腺肿瘤、实体瘤、结肠瘤、卵巢瘤、年龄相关性黄斑变性、视觉损伤、骨质疏松、视网膜病、溃疡、癌、口腔发炎和硬皮病。
TGF-β3可用于治疗纤维化疾病、肺纤维化、肝硬化、硬皮病、血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨的诱导、体外受精、口腔粘膜炎、肾病，预防、减少或抑制瘢痕形成，促进外周和中枢神经系统神经元重连接，预防、减少或抑制眼外科手术(例如LASIK或PRK手术)并发症或眼后部瘢痕形成(例如与增殖性玻璃体视网膜病变相关的瘢痕形成)。
TGF-β家族的成员以包含两条肽链的二聚体形式天然存在。有活性的TGF-β二聚体的分子量为大约25.4kDa。有活性的TGF-β二聚体片段可通过疏水和离子相互作用来稳定，所述相互作用可由亚基间的二硫键来进一步加强。普遍认为，TGF-β家族成员的生物活性和如此多的治疗活性只是由活性二聚体引起。
根据上面所述，人们认识到迫切需要提供能够利用TGF-β家族成员的治疗特性的药物。尽管充分认识到了对包含TGF-β家族成员的药物组合物的需求，但是关于生产用于治疗的TGF-β，仍存在很多公认的问题。
利用TGF-β作为治疗剂的最大的弊端之一是，为了用原核宿主生产有生物(及由此的治疗)活性的蛋白二聚体，需要对具生物活性的二聚体形式进行加强复性。二聚体形式能显著延长生产的时间。这在限制任何TGF-β的治疗用途上也有重要的意义。
本发明的目的是消除或减轻至少某些与包含TGF-β的药物组合物的现有技术相关的问题。尤其地，本发明某些实施方案的目的是，消除或减轻与时间密集生产方法的应用相关的问题，所述方法用于生产这些蛋白的生物活性二聚体。
本发明的第一方面提供了用作药物的TGF-β单体或其具生物活性的片段。
本发明基于发明人非常令人惊讶的发现，即单体TGF-β能发挥出目前认为只能由二聚体TGF-β蛋白提供的生物活性。这个发现使单体TGF-β用于有效的药物成为可能，所述药物能利用所选TGF-β的生物特性。由于这个发现立即被接受，因而本发明通过减少与适合药物生产相关的时间和成本，大大扩展了TGF-β用于治疗的实际应用。
本发明人相信本发明的药物的优点可以由包含任何单体TGF-β同工型的药物提供。因此，除了上下文另外需要的地方，提及的一种或多种TGF-β可用来包括任何具生物活性的单体形式的TGF-β同工型，例如TGF-β1，2，3，4和5。优选的适合用于本发明药物的单体是(任何期望的同工型的)野生型TGF-β单体。优选地，适合本发明应用的单体TGF-β选自TGF-β1，TGF-β2和TGF-β3。更优选的单体TGF-β是TGF-β3，本发明的第二方面提供了用作药物的TGF-β3单体或其生物活性的片段。优选地，依照本发明应用的TGF-β单体是人类TGF-β单体。优选地，在本发明药物中提供的TGF-β应该基本上全部以单体的形式存在。适合用于本发明药物或方法的单体TGF-β优选具有的分子量为大约12kDa，尤其为大约12.5kDa。
人类形式的TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3同工型的氨基酸残基序列分别显示为序列ID号1，2和3，包含这些序列的任意一个或这些序列任意一个具生物活性片段的单体TGF-β，构成了本发明应用的优选单体。单体TGF-β3(序列ID号3)构成本发明多个方面应用的尤其优选的单体。
除了上下文另外需要，本说明书提及的单体TGF-β(包括提及的特殊同工型)也应被用来包括这些单体TGF-β的生物活性片段和衍生物。从序列ID号1-3衍生的生物活性片段代表本发明药物中应用的优选片段，其中从序列ID号3衍生的生物活性片段构成尤其优选的片段。优选的生物活性片段可以包含所选TGF-β同工型的受体结合部分。
可用于本发明药物或方法的单体TGF-β的适合衍生物包括：单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的肽衍生物；包含或基于单体TGF-β(或其片段)的药效基团的治疗有效的片段或衍生物；单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的类肽衍生物；单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的D氨基酸衍生物；基于单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的肽模拟物；单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的肽类似物；基于单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的假肽；基于单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的逆反式肽；基于单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的缩酚酸肽衍生物；基于单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的β-肽衍生物；基于单体TGF-β(或其片段)的治疗有效的逆类肽衍生物。
本发明人发现人类TGF-β3的单体形式可采用与二聚体TGF-β3同样的方式应用，例如治疗纤维化疾病、硬皮病、血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨的诱导、体外受精、口腔粘膜炎、肾病，预防、减少或抑制瘢痕形成，促进外周和中枢神经系统的神经元重连接，预防、减少或抑制眼外科手术(例如LASIK或PRK手术)并发症，治疗唇裂和腭裂，预防、减少或抑制瘢痕形成以及加速肌腱和韧带的恢复。TGF-β3的单体形式也能促进表皮损伤部位的上皮再生。
本发明人的发现也表明TGF-β1和TGF-β2的单体形式能发挥出与这些生长因子二聚体形式相关的全部治疗活性。
本发明上下文中的“生物活性”优选地在体内测量。与现有技术公布的发现保持一致，本发明人发现，用体外方法评测的TGF-β的单体形式一般不表现生物活性。但是与现有技术的信条完全相反，本发明人惊奇地发现TGF-β的单体形式能在体内发挥出生物和治疗活性。因此，认识到，对于根据本发明被认为具生物活性的单体TGF-β或其片段或衍生物而言，单体TGF-β没有必要在体外和体内方式下都表现出可测量的生物活性，而是仅在体外或体内表现出可测量的生物活性即可，优选在体内可测量的活性。
适合地，本发明的第一方面适合应用的单体TGF-β的生物活性可参考给定TGF-β的二聚体的已知生物活性进行测量。在优选的实施方案中，生物活性可参考单体(例如序列ID号3的单体)加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的能力进行测量。
根据前段，认识到本发明第一或第二方面的药物尤其适合用于加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。而且，本发明第一或第二方面的药物也尤其适合用于促进上皮再形成。
实际上，本发明的第三方面提供了TGF-β3单体或其生物活性片段在用于加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成的药物制备中的用途。
本发明的第四方面提供了TGF-β3单体或其生物活性片段在用于促进上皮再生的药物制备中的用途。
本发明的第五方面提供了TGFβ3单体或其生物活性片段在用于预防和/或治疗纤维化疾病的药物制备中的用途。可以用这些药物预防和/或治疗的优选的纤维化疾病选自：肺纤维化、肝纤维化、硬皮病、皮肤纤维化、肌肉纤维化、放射纤维化、肾脏纤维化和子宫纤维化。
而且，本发明第六方面提供了一种加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成的方法，所述方法包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的单体TGF-β3或其片段。
本发明第七方面提供了一种促进上皮再生的方法，所述方法包括对需要这种治疗的患者施用治疗有效量的单体TGF-β3或其片段。
本发明第八方面提供了一种预防和/或治疗纤维化疾病的方法，所述方法包括对需要这种预防和/或治疗的患者施用治疗有效量的单体TGF-β3或其片段。可以用这些方法预防和/或治疗的优选的纤维化疾病：肺纤维化、肝纤维化、硬皮病、皮肤纤维化、肌肉纤维化、放射纤维化、肾脏纤维化和子宫纤维化。
出于本发明的目的，单体TGF-β或其片段的治疗有效量是足以产生以下效果所需的量：
i)加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成；或
ii)促进上皮再生；或
iii)预防和/或治疗纤维化疾病。
加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成、或促进上皮再生的程度，或者可能需要的预防或减少纤维化对于负责照料患者的临床医生是显然的，或实际可容易地由其决定。加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成、或促进上皮再生或预防或减少纤维化的程度的适合的评定可由临床医生决定，并且可参考这里描述的测量建议方法。
本发明应用的适合和优选的单体TGF-β可参考这里描述的任一项或全部考虑因素来进行选择。
在期望实现加速伤口愈合而且预防、减少或抑制瘢痕形成，或实现预防或治疗纤维化疾病例如肺纤维化、肝硬化、硬皮病、血管球性肾炎或类似疾病的情况下，一般优选使用单体TGF-β3或适合的生物活性片段。
尽管单体TGF-β3的应用有特别显著的好处，但是包含其它TGF-β同工型的单体形式的药物也有很大价值。
例如，包含单体TGF-β1或其生物活性片段的药物可用于预防和/或治疗慢性未愈伤口，例如静脉性溃疡、压疮、糖尿病性溃疡、血管生成病症、肾病、骨质疏松、骨病、血管球性肾炎和肾病。举例来说，局部递送的野生型二聚体TGF-β1在动物模型中显示为骨骼生长和再生的有效刺激剂。而且，已经显示施用TGF-β1保护组织免受缺血再灌注损伤，尤其是在大脑(中风后)和心脏(冠状动脉梗塞后)中的组织。
包含单体TGF-β2或其生物活性片段的药物可用于治疗神经胶质瘤、非小细胞肺癌、胰腺肿瘤、实体瘤、结肠瘤、卵巢瘤、年龄相关性黄斑变性、视觉损伤、骨质疏松、视网膜病、溃疡、癌、口腔发炎和硬皮病。举例来说，在两项临床试验中，局部施用野生型二聚体TGF-β2显示加速终止静脉停滞相关的下肢慢性溃疡，而在动物模型中局部递送重组人类TGF-β2显示促进了骨骼再生长和再生。
包含单体TGF-β3或其生物活性片段的药物可用于治疗伤口(包括慢性伤口例如溃疡)、硬皮病、纤维化疾病(例如肺纤维化、肝硬化、肾脏纤维化等)、血管生成病症、再狭窄、粘连、子宫内膜异位、缺血性疾病、骨和软骨的诱导、体外受精、口腔粘膜炎和肾病。举例来说，在动物模型和临床中显示局部施用野生型二聚体TGF-β3加速了慢性不愈合性压迫溃疡愈合的速度；减少了口腔粘膜炎的发生率、严重性和持续时间；减少了癌症治疗中放疗和化疗造成的干细胞损伤而导致的放射胃肠道综合症的不利副作用。本发明人的发现表明，为了产生二聚体TGF-β3的已知治疗活性，单体TGF-β3可用于所有这些背景。
参考治疗的伤口显示的特性，本发明某些方法和药物(例如那些利用序列ID号3所列TGF-β单体的方法和药物)加速伤口愈合的能力易于理解和/或测量。出于当前目的，“治疗的伤口”可认为是暴露于治疗有效量的本发明药物的伤口或已依据本发明方法接受治疗的伤口。
治疗的伤口愈合的加速可由与对照伤口相比上皮形成增加的速率表示。这样，本发明的方法和药物与其他方式相比，促进伤口面积上方的功能性上皮层更快地重建。
可选择地或另外，治疗的伤口愈合的加速可由与对照伤口相比对应时间点上减小的宽度表示。应理解的是，这种伤口宽度的减小确保了伤口闭合的相对较快的速率(由于待闭合的伤口宽度更小)，预示这些药物加速愈合反应的能力。较窄的伤口可导致美学上优于较宽瘢痕的较窄瘢痕。
因此，本发明上下文中的加速的伤口愈合应包括，与对照治疗或未治疗伤口中发生的愈合速率相比，治疗的伤口愈合速率的任何提高。优选地，伤口愈合的加速可从治疗和对照伤口中得到的表皮细胞再生速率比较方面，或治疗和对照伤口在对应时间点上相对宽度的比较方面进行评定。更优选地，加速的伤口愈合可定义为包含与对照伤口相比上皮再形成提高的速率和伤口宽度在对应时间点的减小。
优选地，促进伤口愈合加速可产生的伤口愈合速率比对照或未治疗伤口中发生的愈合速率高至少5％、10％、20％或30％。更优选地，促进伤口愈合加速可产生的愈合速率比对照伤口的愈合高至少40％、50％或60％。甚至更加优选地，促进伤口愈合加速可产生的愈合速率比对照伤口中发生的高至少70％、80％或90％，最优选地，促进伤口愈合加速可产生的愈合速率比对照伤口中发生的速率高至少100％。
存在范围广泛的伤口愈合疾病，其特征为或至少部分特征为正常伤口愈合反应的不当的缺失、延迟或障碍。因此，本发明某些方法和药物促进伤口加速愈合的能力在预防或治疗这些疾病中是有用的。
由于本发明的某些方法和药物能通过促进上皮再形成反应的激活(因此提高了伤口闭合的速率)而引起伤口愈合的加速，因此可理解地，本发明的这些方法和药物尤其有利于有上皮再形成缺陷、延迟或其他方式损伤倾向的患者伤口的治疗。例如，众所周知老年人的皮肤伤口表现出比年轻个体的皮肤伤口更弱的上皮再形成反应。也有很多其它的状态或疾病，在这些状态或疾病中，伤口愈合与延迟或其他方式损伤的上皮再形成相关。例如，患糖尿病的患者、复方用药的患者(例如由于老龄)、绝经期后的妇女、易于压迫受伤的患者(例如截瘫患者)、静脉疾病患者、临床肥胖患者、接受化疗的患者、接受放疗的患者、接受类固醇治疗的患者或免疫功能低下的患者可能都会经受损伤上皮再形成的伤口愈合。在很多这样的情况下，缺乏适当的上皮再形成反应促成了伤口部位感染的发生，这可能又促成慢性伤口例如溃疡的形成。因此，可理解的是，这些患者尤其可能从本发明适合的方法或药物中受益。
慢性伤口可能是与延迟伤口愈合反应相关的疾病的最重要的实例。如果受到适当(常规)治疗处理时，伤口在形成八周内没有表现出任何愈合倾向，就被定义为慢性。慢性伤口众所周知的实例包括静脉性溃疡、糖尿病性溃疡和褥疮，但是慢性伤口可在任意时间由另外的正常急性损伤引发。通常，慢性伤口可由伤口部位的感染、不当的伤口治疗引发，或作为静脉、动脉或代谢血管疾病、压迫、放射损伤或肿瘤造成的进展性组织衰竭的结果。
可理解的是，能加速伤口愈合的本发明的方法和药物可应用于现有慢性伤口的治疗，旨在促进它们的愈合。这些方法和药物可促进慢性伤口的上皮再形成，从而使得疾病治愈和终止。本发明优选的方法和药物(例如那些利用包含序列ID号3的单体TGF-β的方法和药物)还可抑制与伤口愈合相关的瘢痕形成。由于慢性伤口可典型地在患者身体相对大的部分延伸，这些背景中瘢痕形成的预防尤其有利。
可选择地或除了在现有慢性伤口治疗中的用途之外，本发明适合的方法和药物可用于预防患者的急性伤口，所述患者具有受损的伤口愈合发展成慢性伤口的倾向。由于本发明适合的方法和药物能促进上皮对损伤部位的覆盖，因此它们能减小治疗的伤口发生感染的可能性。同样地，对上皮再形成的这种促进可能有利于由其它状态例如糖尿病或静脉疾病引发的慢性伤口的治疗。
可以从本发明方法和药物中得到特别益处的另一组患者是那些免疫系统低下的患者(例如经受化疗或放疗或患有HIV感染的患者)。广为承认的是免疫低下患者可能不能在伤口产生后发生正常的炎症反应，其伤口倾向于与较差的愈合结果相关。这些患者可从本发明适合的方法和药物治疗中受益。
利用包含序列ID号3的单体TGF-β的本发明方法和药物，促进加速的伤口愈合，同时预防、减少或抑制瘢痕形成的能力在更多普遍的临床背景中也有用处。这些更多益处的实例可参考下面描述的初级、二级或三级愈合的伤口愈合进行判断。
出于本发明的目的，初级愈合治疗可认为涉及利用外科手段对伤口对立边缘的闭合(例如缝合、粘合带或钉)。初级愈合治疗典型地用于手术切口或其它清洁伤口的治疗，且与最低水平的组织缺失相关。技术人员认识到由于本发明适合的药物或方法(例如那些利用包含序列ID号3的单体的药物或方法)能减小伤口宽度，因此它们也有利于伤口对立边缘的接合，这样可能有益于为初级愈合的伤口愈合。而且，这些方法或药物(正如下面进一步描述的)导致预防、减少或抑制这种愈合可能另外发生的瘢痕形成。本发明人认为这种方式的治疗可对治疗的伤口形成的瘢痕的肉眼和显微镜下的外观产生影响；肉眼下瘢痕可能更不引人注意并与周围的皮肤融合，显微镜下瘢痕可表现出更多正常的皮肤结构的再生。
出于本发明的目的，二级愈合治疗可认为包括伤口愈合过程中，非直接手术干预的伤口闭合。有待二级愈合治疗的伤口可经过持续地护理(例如伤口的包扎和再包扎以及施用适合的药物)，但是它是肉芽组织形成和上皮再形成的、导致伤口闭合的天然过程。可理解的是由于本发明优选的方法和药物(例如那些利用包含序列ID号3的单体的方法和药物)与对照伤口中所发生的相比，能提高上皮再形成的速率和减少并发的瘢痕形成，因此所述方法和药物在促进二级愈合的伤口愈合中有用处。
三级愈合治疗可认为包含先前开着的伤口的手术闭合，允许至少部分肉芽组织形成和上皮再形成。使之适合初级或二级愈合治疗应用的本发明优选方法和药物的特性也有益于促进三级愈合治疗伤口方面。
利用包含序列ID号3的单体的本发明优选方法和药物促进上皮再形成(作为它们促进伤口愈合加速的一部分)同时抑制瘢痕形成的应用也在与移植过程相关的伤口治疗中尤其有效。用本发明这些方法和药物的治疗有益于移植供体部位(在此部位其能辅助功能性上皮层的重建同时预防、减少或抑制瘢痕形成)和移植受体部位(在此部位治疗的抗瘢痕形成作用抑制了瘢痕形成，同时加速的愈合促进了移植组织的整合)。本发明人认为本发明的方法和药物在用皮肤、人造皮肤或皮肤取代物移植的方面中提供了优势。
本发明人发现利用包含序列ID号3的单体的本发明的方法和药物，在伤口产生前或者伤口已经形成时施用，能促进加速的伤口愈合且抑制瘢痕形成。
本发明人发现利用单体TGF-β3(例如包含序列ID号3的那些)的本发明的方法或药物能促进上皮再生。在本发明上下文中的促进上皮再生可理解为，包括与对照治疗或未治疗的上皮发生的再生相比，上皮再生速率的任何提高。
可容易地将本发明适合的方法或药物得到的上皮再生速率与对照治疗或未治疗的上皮获得的速率相比，这可用本领域已知的任何适宜的上皮再生模型进行。例如，具有已知面积的实验上皮损伤部位的再生速率可用公知的小鼠、大鼠、兔子或猪体内模型进行比较，例如在Tomlinsonand Ferguson(2003)、Davidson等(1991)和Paddock等(2003)中描述的那些。
本发明人不希望被任何假说限制，认为通过TGF-β3单体形式实现的上皮再生的促进由上皮细胞迁移的单体促进作用介导。上皮细胞(其迁移已被促进)因此能够比未治疗的上皮更快速地重建和再生损伤的上皮。
可理解地，利用包含序列ID号3的单体促进上皮再生可诱导有效的上皮再形成，其处于上皮再形成反应被损伤、抑制、延迟或具有缺陷的情况中。上皮再生的促进也可有效地加快经受上皮损伤患者的具有缺陷的或正常上皮再生反应的速率。
在很多情况中，机体上皮再形成反应可能是具有缺陷的。例如，皮肤上皮再形成的缺陷可能与状态相关，所述状态例如天疱疮、Hailey-Hailey病(家族性良性天疱疮)、中毒性表皮坏死松解症(TEN)/Lyell′s综合症、大疱性表皮松解症、皮肤利什曼病和光化性角化病。肺上皮再形成的缺陷可能与原发性肺纤维化(IPF)或肺间质性疾病相关。眼上皮再形成的缺陷可能与状态相关，所述状态例如部分角膜缘干细胞缺失或角膜糜烂。胃肠道或结肠的上皮再形成的缺陷可能与状态相关，所述状态例如慢性肛裂(肛(门)裂)、溃疡性结肠炎或克罗恩病(Crohn’sdisease)和其他炎症性肠病。
正如上文所陈述的，本发明的某些方法或药物(和尤其是利用包含序列ID号3的单体的那些)能预防、减少或抑制瘢痕形成。瘢痕形成的抑制能在任意机体部位和任意组织或器官，包括皮肤、眼睛、神经、肌腱、韧带、肌肉和口腔(包括嘴唇和上腭)，以及内部器官(例如肝脏、心脏、大脑、腹腔、骨盆腔、胸腔、肠和生殖组织)实现。皮肤中，治疗可改善瘢痕肉眼下和显微镜下的外观；肉眼下瘢痕可能更不明显并且与周围的皮肤融合，显微镜下瘢痕里的胶原纤维可具有与周围皮肤的形态和组织更相似的形态和组织。本发明上下文中的预防、减少或抑制瘢痕形成应被理解为与对照治疗或未治疗伤口(如说明书其他地方定义)产生的瘢痕形成的水平相比，包括任何程度的预防、减少或抑制瘢痕形成。除了上下文另外需要参考的地方，瘢痕形成的“预防”、“减少”或“抑制”可被作为抗瘢痕活性中全部被证实的等效机制。
使用本发明的方法或药物实现的皮肤瘢痕形成的预防、减少或抑制，可根据治疗的瘢痕的显微镜下或优选肉眼下的外观与未治疗瘢痕的外观比较来进行评定和/或测量。更优选地，瘢痕形成的预防、减少或抑制可根据治疗的瘢痕的显微镜下和肉眼下的外观进行评定。出于本发明的目的，“治疗的瘢痕”可被定义为在治疗的伤口愈合时形成的瘢痕，而“未治疗的瘢痕”可被定义为未治疗的伤口、或用安慰剂治疗或标准护理治疗的伤口愈合时形成的瘢痕。适合的瘢痕比较可优选地根据瘢痕年龄、部位、尺寸和患者，与治疗的瘢痕进行匹配。
在考虑治疗伤口产生的瘢痕肉眼下外观时，瘢痕的程度和由此的任何瘢痕形成预防、减少或抑制的量级可根据以下很多参数中的任一项进行评定。
肉眼下瘢痕评定的适合参数可包括：
i)瘢痕的颜色。正如上文提到的，瘢痕典型地可相对于周围皮肤而色素沉着减少或色素沉着过度。当治疗的瘢痕的色素沉着比未治疗瘢痕的色素沉着更接近无瘢痕皮肤时，表明瘢痕的抑制或减少。同样地，瘢痕可能比周围皮肤更红。在这种情况下，当治疗的瘢痕的红色与未治疗瘢痕比较，更早褪色、褪色更完全或更类似周围皮肤的外观时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
ii)瘢痕的高度。瘢痕与周围皮肤比较可典型地升高或降低。当治疗的瘢痕的高度比未治疗瘢痕的高度更接近无瘢痕皮肤(即无升高和降低)时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
iii)瘢痕的表面肌理。瘢痕比周围皮肤可能具有相对更光滑的表面(瘢痕产生“有光泽的”外观)或比周围皮肤更粗糙。当治疗的瘢痕的表面肌理比未治疗瘢痕的表面更接近无瘢痕皮肤时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
iv)瘢痕的硬度。瘢痕异常的成分和结构意味着它们通常比瘢痕周围未损伤的皮肤更硬。在这种情况下，当治疗的瘢痕的硬度比未治疗瘢痕的硬度更接近无瘢痕皮肤时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
优选地，当根据上文所述肉眼下评定的至少一项参数进行评定时，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。更优选地，根据这些参数中至少两项参数，甚至更加优选地至少三项参数和最优选地全部四项参数，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。瘢痕形成的全面评定可利用，例如视觉模拟评分(Visual Analogue Scale)或数字评定等级来进行。
显微镜下瘢痕评定的适合参数可包括：
i)胞外基质(ECM)纤维的厚度。瘢痕典型地比周围皮肤包含较细的ECM纤维。这个特性在瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的情况下甚至更明显。当治疗的瘢痕的ECM纤维厚度比未治疗瘢痕的ECM纤维厚度更接近无瘢痕皮肤的ECM纤维厚度时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
ii)ECM纤维的定向。瘢痕中发现的ECM纤维比无瘢痕皮肤发现的那些(经常具有随机的定向，称为“篮网状”)倾向于表现出互相之间更高程度的排列。病理性瘢痕，例如瘢痕瘤和肥厚性瘢痕的ECM可表现出更加不规则的定向，经常形成ECM分子的大的“涡旋”或“囊”。因此，当治疗的瘢痕的ECM纤维定向比未治疗瘢痕中的ECM纤维定向更接近无瘢痕皮肤中发现的ECM纤维定向时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
iii)瘢痕的ECM成分。瘢痕中存在ECM分子的成分表现出与其在正常皮肤中发现的成分的差异，瘢痕的ECM存在的弹性蛋白数量有所减少。因此，当治疗的瘢痕真皮的ECM纤维成分比未治疗瘢痕中发现的成分更接近无瘢痕皮肤中发现的这种纤维成分时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
iv)瘢痕的细胞结构。瘢痕倾向于比无瘢痕皮肤包含相对少的细胞。因此可理解当治疗的瘢痕的细胞结构比未治疗瘢痕的细胞结构更接近无瘢痕皮肤的细胞结构时，表明瘢痕形成的抑制或减少。
优选地，当根据上文所述的显微镜下评定的至少一项参数进行评定时，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。更优选地，根据这些参数中的至少两项参数，甚至更加优选地至少三项参数，最优选地全部四项参数进行评定，治疗的瘢痕将表明瘢痕形成的预防、抑制或减少。
治疗的伤口的瘢痕形成预防、抑制或减少可进一步根据以下使用的适合参数进行评定：
i)瘢痕肉眼下的临床评定，尤其是对个体瘢痕的评定；
ii)瘢痕照片图像的评定；
iii)有机硅模具或由瘢痕的有机硅模具制作的阳性石膏模型进行评定；和
iv)瘢痕的显微镜下评定，例如瘢痕显微结构的组织学分析。
可理解地，治疗伤口的瘢痕形成的预防、抑制或减少可通过改善这些适合参数的一项或多项来显示，在根据大量参数评定预防、抑制或减少的情况下，可根据不同的评定方案将这些参数结合(例如肉眼评定中使用的至少一项参数和显微镜下评定中使用的至少一项参数的减少、抑制或改善)。
可通过一项或多项参数的改善表明瘢痕形成的预防、减少或抑制，这显示根据所选的参数，治疗的瘢痕比未治疗或对照瘢痕更接近无瘢痕皮肤。
瘢痕临床测量和评定的适合参数可基于多种测量或评定进行选择，包括由Beausang等(1998)和van Zuijlen等(2002)描述的那些
典型地，适合的参数可包括：
1.根据视觉模拟评分(VAS)瘢痕分数的评定。
当与对照瘢痕比较时，由治疗的瘢痕的VAS分数的减少，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。在瘢痕评定中使用的适合的VAS可基于Beausang等人(1998)所述方法进行。
2.瘢痕的高度、瘢痕的宽度、瘢痕的周长、瘢痕的面积或瘢痕的体积。
瘢痕的高度和宽度可直接从个体测量，例如通过利用手工测量装置例如卡钳。瘢痕的宽度、周长和面积可直接从个体测量或从瘢痕的照片图像分析进行测量。本领域技术人员也知道其他非损伤的方法和装置，所述方法和装置可用于研究适合的参数，包括有机硅制模、超声波、光学三维剖析图和高分辨率核磁共振图像。
通过与未治疗瘢痕比较，治疗的瘢痕的高度、宽度、面积或体积以及其任意组合的减少，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。
3.与周围无瘢痕皮肤比较瘢痕的外观和/或颜色。
治疗的瘢痕的外观或颜色可与周围无瘢痕皮肤的外观或颜色进行比较，将其差异(如果有)与未治疗瘢痕的外观和颜色和无瘢痕皮肤的外观和颜色之间的差异进行比较。这种比较可在各自的瘢痕和无瘢痕皮肤的视觉评定的基础上进行。瘢痕的外观可根据瘢痕是否比无瘢痕皮肤更亮或更暗，来与无瘢痕皮肤比较。瘢痕和皮肤各自的颜色可完美地互相匹配、轻微错配、明显错配或显著错配。
对于视觉评定可选择地或另外地，有大量非损伤比色装置，其能够提供关于瘢痕和无瘢痕皮肤的色素沉着以及皮肤的红色(可作为瘢痕或皮肤中存在的血管分布程度的指示)的数据。这些装置的实例包括MinoltaChronameter CR-200/300；Labscan 600；Dr.Lange Micro Colour；皮肤分光计(Derma Spectrometer)、激光-多普勒流速计(laser-Doppler flow meter)和皮内分析分光光度法(SIA)。
治疗的瘢痕的外观或颜色和无瘢痕皮肤之间差异的量级比未治疗瘢痕和无瘢痕皮肤之间差异更小时，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。
4.瘢痕的变形和机械性能
瘢痕的变形可通过瘢痕和无瘢痕皮肤的视觉比较进行评定。适合的比较可将所选的瘢痕分类为无变形、轻微变形、中等变形或严重变形。
瘢痕的机械性能可利用大量基于吸力、压力、扭转力、张力和声学的非损伤的方法和装置进行评定。适合的实例包括能用于评定瘢痕机械性能的已知装置，包括直读压痕硬度计、皮肤弹性仪、Reviscometer、粘弹性皮肤分析仪、Dermaflex、硬度计、皮肤扭力计和弹力计。
当与未治疗瘢痕造成的变形比较时，由治疗的瘢痕造成的变形的减少，表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。还可理解地，由治疗的瘢痕的机械性能比未治疗瘢痕更类似于无瘢痕皮肤的机械性能，可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。
5.瘢痕的轮廓和瘢痕的肌理
瘢痕的轮廓可通过视觉评定的方式进行研究。这种评定中考虑的适合参数包括瘢痕和周围的皮肤是否为齐平、轻微隆起、轻微锯齿状、肥厚性瘢痕或瘢痕瘤。瘢痕的肌理可根据瘢痕的外观进行评定，这也可通过当与无瘢痕皮肤比较时，瘢痕例如是否无光泽或有光泽发亮或具有粗糙或光滑外观的视觉评定来进行。
另外，瘢痕的肌理可根据瘢痕是否具有与无瘢痕皮肤同样的肌理(正常肌理)，与无瘢痕皮肤比较，是否可触摸到、结实或坚硬来进行评定。瘢痕的肌理也可根据汉密尔顿量表(Hamilton scale)(Crowe等描述，1998)进行评定。
除了上文所述的技术外，有大量的使用光学或机械的方法评定瘢痕的轮廓和/或肌理的非损伤剖析图装置。这种评定可在个体的身体上进行，或例如在瘢痕的有机硅模具印模，或由这种印模做出的阳性石膏模型上进行。
如果治疗的瘢痕具有的轮廓和肌理比未治疗瘢痕更与无瘢痕皮肤相当，则表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。
照片评定
独立外行的小组(Independent lay panel)
治疗和未治疗瘢痕的照片评定可由独立外行的评定者小组用标准化和校准的瘢痕照片来进行。瘢痕可由独立外行的小组进行评定以提供分类的评分数据(例如特定治疗的瘢痕与未治疗瘢痕比较是“较好”、“较差”或“无差异”)和使用基于Beausang等(1998)描述方法的视觉模拟评分(VAS)获得定量的数据。这些数据的取得可利用在申请人共同待决的的专利申请中描述的适合软件和/或电子系统。
专家小组
可选择地或另外地，治疗的和未治疗瘢痕的照片评定可由专家评定者小组用待评定的瘢痕的被标准化和校准的照片来进行。优选地，专家小组由适合的本领域技术人员，例如整形外科医生和适合背景的科学家组成。
这种评定可提供分类的数据，如上文所述的或根据所选治疗和未治疗瘢痕的一段时间过程的图像比较。
所进行的适合的评定可包括：
出于本发明的目的，最好的瘢痕的鉴别被认为是最类似于周围皮肤的瘢痕。一旦鉴别出最好的瘢痕，瘢痕间差异的量级可认为是，例如瘢痕之间的轻微或明显的差异。所考虑的进一步的参数包括瘢痕形成后检测到瘢痕间差异的最早时间，形成后瘢痕间差异最明显的时间(或可选择地在最后评定时间点继续发现差异)，以及考虑较好的瘢痕是否一贯地保持更好。
也要考虑一个瘢痕是否会一贯地比另外一个的更红和红色是否会在所认定的时间点后褪色(或在最后时间点后继续)以及如果是这样，则在瘢痕形成后的什么时间出现。专家小组也可考虑在形成后的什么时间红色的任何差异变得可觉察，以及形成后的什么时间红色差异最明显。
专家小组也可考虑治疗或未治疗的一个瘢痕是否一贯地比另一个更白或比无瘢痕皮肤更白。如果白色的差异可觉察，则考虑瘢痕形成后差异可被检测的时间，差异最明显的时间和差异消失的时间。
专家小组可评定的进一步参数是治疗和未治疗瘢痕的肌理。在治疗和未治疗瘢痕的比较中，专家小组可考虑哪个瘢痕具有最好的皮肤肌理，瘢痕形成后所存在的任何差异可被检测的最早时间，形成后任何差异最明显的时间和任何差异消失的时间。
治疗和未治疗瘢痕的比较可进一步评定哪个瘢痕是最窄的和哪个瘢痕是最短的。也可考虑瘢痕的形状和区别于周围皮肤的瘢痕边缘的比例。正如与前文所述，还可考虑视觉评定，和色素沉着过度的存在、程度和位置的颜色评定。
如上所述，治疗和未治疗瘢痕性质比较的一种方法是通过显微镜评定进行。瘢痕性质的显微镜评定可典型地用瘢痕的组织学切片进行。显微镜评定和测量瘢痕的过程可考虑基于以下适合参数的分类数据：
1.表皮重建。特别关注网脊(rete ridge)的恢复程度和恢复表皮的厚度。
2.血管形成和炎症。可考虑存在血管的数量、存在血管的尺寸和炎症的迹象，包括评定存在的任何水平的炎症。
3.胶原组织。在评定胶原组织时，可参考瘢痕中存在的胶原纤维的定向、这些纤维的密度和乳突状及网状真皮中胶原纤维的厚度。
4.乳突状真皮和网状真皮的胶原组织的视觉模拟评分(VAS)评定也可提供有用的瘢痕性质指标。
5.评定瘢痕的显微镜下性质时可考虑其他特征，包括相对于周围无瘢痕皮肤的瘢痕的升高或降低和正常真皮界面的瘢痕的突出或明显度。
6.可以看出，与对照、未治疗或其他适合比较的瘢痕比较，上文描述的评定产生了能提供关于治疗的瘢痕是否更好、更差或无差别的指示的瘢痕评分数据。
除了分类数据外，可将图像分析与适合的可视技术结合使用来产生定量数据(优选与上文参数有关的)。可用于评定瘢痕性质的适合可视技术的实例是特异的组织学染色或免疫标记，其中呈现的染色或标记程度可通过图像分析定量测定。
可有效和容易地产生与下列参数有关的定量数据：
1.瘢痕的宽度、高度、升高、体积和面积。
2.上皮的厚度和范围(例如瘢痕中存在的表皮的面积或具有表皮覆盖伤口的比例)。
3.血管的数量、尺寸、面积(即横截面)和位置。
4.炎症的程度、存在的发炎细胞的数量、位置和种群/类型。
5.胶原的组织、胶原纤维的厚度和胶原纤维的密度。
通过上文考虑的任何一项参数的变化，可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制，以至于治疗的瘢痕比对照或未治疗瘢痕(或其他适合的比较物)更类似于无瘢痕皮肤。
所讨论的评定和参数适合于在动物或人中比较本发明肽或药物与对照、安慰剂或标准护理治疗的效果。为了研究结果的显著性，适当的统计学检验可用于分析产生自不同治疗的数据组。
优选地，根据一项以上参数可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。更优选地，根据临床(即观察个体)参数和照片参数可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。甚至更加优选地，根据临床参数、照片参数和显微镜下评定参数(例如组织学参数)可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。最优选地，根据临床VAS分数、外行小组VAS分数以及网状真皮的评分(来自照片图像)和显微镜下的VAS分数可表明瘢痕形成的预防、减少或抑制。
使用本发明适合方法和药物能使接受如此治疗的损伤区域的美观表征快速改善。美观考虑在大量临床情况中，尤其是当伤口在身体显著的部位例如脸、颈和手上形成时是重要的。因此，在这些期望改善所形成的瘢痕美观表征的部位抑制瘢痕形成(优选地与加速伤口愈合相结合)代表了本发明的优选实施方案。
除了它的美观效果外，皮肤瘢痕形成导致了大量使经受这种瘢痕形成的患者痛苦的不良后果。例如，皮肤瘢痕形成与身体和机械的功能减弱有关，尤其是在收缩性瘢痕(例如肥厚性瘢痕)的情况下和/或跨越关节形成瘢痕的情况时。在这些情况下，对照于无瘢痕皮肤，瘢痕形成皮肤改变的机械性质和瘢痕收缩的效果使受到如此影响的关节(关节连接)运动受到很大限制。因此，优选的实施方案是使用本发明适合的药物和方法来预防、减少或抑制覆盖机体关节的伤口的瘢痕形成(优选地也加速这些伤口的愈合)，另一个优选的实施方案是，使用本发明适合的药物和方法促进伤口的加速愈合，和/或预防、减少或抑制具有增加的形成收缩瘢痕危险的伤口瘢痕形成。
瘢痕形成的程度，由此由瘢痕造成的整形或其他损伤的程度也会受到很多因素，例如伤口形成部位的张力的影响。例如，已知相对高张力下的皮肤(例如遍布胸或与张力线有关的)倾向于比机体其他部位形成更严重的瘢痕。这样在优选的实施方案中，使用本发明适合的药物和方法促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制位于高皮肤张力部位的伤口瘢痕形成。很多外科方法可用于瘢痕修复以使伤口和瘢痕重排，以至于减少它们经受的张力。大概这些中最熟知的是“Z字成形术”，其中调换两个V形的皮肤薄片组织以使张力线旋转。这样在更优选的实施方案中，使用本发明这样的药物和方法促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制外科修复毁容瘢痕过程中伤口的瘢痕形成。
病理瘢痕形成比相对严重的正常瘢痕形成具有更显著的不良后果。病理瘢痕普遍的实例包括肥厚性瘢痕和瘢痕瘤。可认识到某些类型的伤口或某些个体倾向于形成病理瘢痕。例如加勒比黑人、日本人或蒙古人种，或那些具有病理瘢痕家族史的个体可能被认为具有增加的形成肥厚性瘢痕或瘢痕瘤的风险。儿童的伤口，尤其是儿童烧伤也与增加的肥厚性瘢痕形成有关。因此，本发明优选的实施方案是使用适合的药物和方法来促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制具有增加的病理瘢痕形成风险的伤口的瘢痕形成。
尽管已经经历了病理瘢痕形成的个体会经受另外过多的瘢痕形成的倾向，但是通常临床上必须外科修复肥厚性瘢痕或瘢痕瘤，其伴随有随后形成病理瘢痕形成的风险。因而，本发明进一步的优选实施方案是使用适合的药物和方法来促进加速伤口的愈合和/或预防、减少或抑制由外科修复病理瘢痕产生的伤口瘢痕形成。
可认识到，烧伤造成的伤口(出于本发明的目的，也可包括涉及热的液体或气体的烫伤)会在受到如此痛苦的个体上大面积扩展。因此，烧伤可产生覆盖患者机体上大部分的瘢痕形成，从而增加了形成的瘢痕覆盖具有高的美观重要性的区域(例如脸、颈、臂或手)或机械重要性区域(尤其是覆盖或围绕关节的区域)的风险。儿童经常遭受热的液体造成的烧伤(例如打翻的锅、壶或类似的)并且由于儿童相对小的身体尺寸，尤其可能造成覆盖身体大部分的大面积损伤。本发明进一步的优选实施方案是使用适合的药物和方法来促进伤口的加速愈合和/或预防、减少或抑制烧伤产生的伤口瘢痕形成。
如上所述，响应于烧伤的伤口愈合经常与不利的瘢痕形成结果有关，例如形成肥厚性瘢痕。相对大尺寸的烧伤的进一步后果是它们尤其易发生并发症，例如感染和由于缺乏功能性的上皮层造成的脱水。根据上文，可理解的是，本发明适合的药物和方法可用于烧伤的治疗，以减少由伤口产生的瘢痕形成的水平和/或加速功能性的上皮屏障的重建。
本发明人已发现，利用单体例如那些包括序列ID号3的本发明的药物和方法能促进上皮再形成。因此这些方法和药物在涉及上皮层损伤的所有损伤的治疗中尤其有效。这些损伤示例有，但不限于上皮受到损伤的皮肤损伤。但是可理解的是，本发明的这样的方法和药物也可用于其他类型的上皮受到损伤的伤口，例如涉及呼吸道上皮、消化道上皮或围绕内部组织或器官的上皮(例如腹膜上皮)的损伤。
涉及腹膜(覆盖内部器官和/或体腔内部的上皮)的伤口愈合经常引发粘连。这种粘连是涉及妇科或肠组织手术的普通结果。本发明人相信，本发明方法和药物(利用适合的单体，例如包括序列ID号3的那些)加速腹膜再生而减少瘢痕形成的能力，可减少腹膜各部分互相之间不当连接的发生，因而减少了粘连的发生。因此，使用本发明这样的方法和药物预防肠或妇科粘连形成了代表本发明的优选的实施方案。事实上，在涉及腹膜的任何伤口愈合中使用本发明这些方法和药物是优选的实施方案。
本发明的方法或药物可用于预防，例如在无伤口存在但以其他方式会产生瘢痕的伤口或形成慢性伤口的部位。通过实施例，可将本发明的药物施用到遭受选择性操作(例如手术)造成的伤口的部位，或被认为具有提高的创伤风险的部位。优选地，本发明的药物可在大约创伤时或在伤口形成前(例如创伤前直到6小时期间)立即施用到部位，或药物可在创伤前更早的时间施用(例如伤口形成前直到48小时内)。技术人员理解的是，伤口形成前施用的最优选时间将根据大量因素来决定，所述因素包括所选药物的制剂和施用途径、施用药物的剂量、伤口形成的尺寸和性质以及患者的生物学状况(根据例如患者的年龄、健康和发生愈合并发症或不利瘢痕形成倾向等来确定)。本发明的方法和药物的预防性应用是本发明优选的实施方案，在外科伤口的情况下，特别优选用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。
如果在伤口形成后施用本发明的方法和药物，也能促进伤口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。优选地，这种施用应在伤口形成后尽可能早地进行，但是本发明的药剂能在直到愈合过程完成前的任何时间(即甚至如果伤口已经部分愈合，本发明的药物也可用于剩下的未愈合部分的加速伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成)促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。可理解地，可使用本发明方法和药物促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的“窗口”，取决于所讨论的伤口的性质(包括发生损伤的程度、损伤区域的尺寸)。因此在大的损伤的情况下，本发明的方法和药物在愈合反应中的施用可相对晚一些，但是仍然能促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。优选地，本发明的方法和药物可例如在伤口形成后的第一个24小时内施用，但如果伤口发生后十天或更长时间内施用，仍然可促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。
为了促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成，本发明的方法和药物根据需要可施用一或多次。例如治疗有效量的药物可根据需要经常给伤口施用，直到完成愈合过程。通过实例，本发明的药物可在伤口形成后至少前三天给伤口一天一次或一天两次施用。发明人已发现了包括本发明药物两次施用的方案，第一次在伤口形成前和第二次在伤口形成后，尤其有利于减少瘢痕形成。优选地，这样的给药方案可包括就在伤口形成前第一次施用和创伤后24小时第二次施用。
最优选地，本发明的方法和药物可在伤口形成前后都施用。发明人已发现，本发明药物在伤口形成前立即施用，接着在创伤后的时间内每天施用这些药剂，可特别有效的促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。
出于本说明书的目的，“药剂”或“本发明药剂”是指具生物学或治疗活性的单体TGF-β。优选地，这些药剂可为野生型的单体TGF-β，和更优选地可为能促进伤口加速愈合和/或抑制瘢痕形成的单体TGF-β，其中优选的实例包括以序列ID号3列出的单体。可理解地，所有这些药剂可根据本发明掺合到药物里，可用于本发明的方法或用途。
可理解地，本发明药物应用于伤口的量依赖于大量因素，例如药物中存在的药剂的生物活性和生物利用率，在其他因素中还依赖于药剂的性质和药物施用的模式。决定药物的适合治疗量的其他因素可包括：
A)药剂在受治疗个体体内的半衰期。
B)待治疗的特定状态(例如急性或慢性伤口)。
C)个体的年龄。
施用的频率也受到上文提及的因素，尤其是在受治疗个体体内所选药剂的半衰期的影响。
一般地，当将本发明的药物用于治疗现存的伤口时，药物应在伤口一发生(或在伤口未立刻显现的情况下，例如在机体内部部位的那样，伤口一经诊断出就施用)时就施用。用本发明的方法或药物进行治疗应持续到愈合过程已经被加速和/或瘢痕形成已经被预防、减少或抑制，直到临床医生满意为止。
施用频率依赖于使用药剂的生物半衰期。典型地，应将含有本发明药物的乳膏或软膏施用到靶组织，以使药剂在伤口上的浓度保持在适合产生治疗效果的水平。这需要每天一次或甚至每天几次施用。
本发明的药物可通过能达到期望的促进伤口愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成效果的任何途径施用，但是优选药物在伤口部位局部施用。
本发明人已发现，促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成可通过在伤口部位注射施用本发明的药剂实现。例如，在真皮伤口的情况下，本发明的药剂可通过真皮内注射的方式施用。因此本发明的优选药物包含本发明药剂的可注射溶液(例如在上皮损伤部位或可能损伤部位边缘的周围注射)。本发明实施方案中使用的适合的制剂在下文考虑。
可选择地或另外地，本发明的药物也可通过局部的形式施用以促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。这样施用可作为伤口区域的初期和/或后续护理后的一部分起作用。
发明人发现通过本发明药剂对伤口的局部施用(或在对形成伤口的组织或部位预防性施用的情况下)尤其改善了促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。
含有本发明药剂的组合物或药物可采取很多不同的形式，尤其依赖于它们被使用的方式。因此，例如它们可以为液体、软膏、乳剂、凝胶、水凝胶、粉末或气溶胶的形式。所有这些组合物适合对伤口局部施用，是对个体(人或动物)施用本发明药剂的优选方式。
本发明的药剂可以由无菌敷料或贴片的形式提供，其可用于覆盖伤口或所治疗上皮损伤的其他部位。
可理解地，包含本发明药剂的组合物的赋形剂应被患者很好地耐受，使得药剂对伤口释放。这种赋形剂优选是生物可降解、生物可溶解、生物可吸收和/或非炎性的。
包含本发明药剂的药物和组合物可以很多方式使用。因此，例如为了促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成，组合物可应用于伤口内部和/或周围。如果组合物应用于“现存的”伤口，那么药剂学可接受的赋形剂将是相对“温和的”，即赋形剂是生物可相容的、生物可溶解和非炎性的。
本发明的药剂，或编码这种药剂的核酸(下文进一步考虑)，可掺入缓释或延迟释放的装置。这些装置可例如放在或插入皮下，药剂或核酸可在数天、数周或甚至数月内释放。这种装置对于需要长期促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的患者(例如经受慢性伤口的那些)尤其有用。当用于通常要求频繁施用(例如通过其他途径至少每天施用)的药剂或核酸施用时，该装置尤其有利。
本发明药剂的每日剂量可以单次施用(例如局部制剂的每日应用或每日注射)。可选择地，本发明的药剂一天内可能需要施用两次或多次。进一步可选择地，缓释装置可用于对不需要施用重复剂量的患者提供本发明药剂的最佳剂量。
在一个实施方案中，用于本发明药剂施用的药学赋形剂可为液体，适合的药学组合物将采取溶液的形式。在另一个实施方案中，药学可接受的赋形剂是固体，适合的组合物采取粉末或片剂的形式，在进一步的实施方案中，本发明药剂可配制成为药学可接受的经皮贴片的一部分。
固体赋形剂可包括可作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填充剂、助流剂、压缩辅助剂、粘合剂或片剂崩解剂的一种或多种物质；也可是包囊材料。在粉末中，赋形剂是细碎的固体，所述固体与细碎的本发明的药剂混合。在片剂中，本发明药剂以适合比例与具有必要压缩特性的赋形剂混合，以期望的形状和尺寸压制。优选地，粉末和片剂含有达到99％的本发明药剂。适合的固体赋形剂包括，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡和离子交换树脂。
液体赋形剂可用于制备溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂、酏剂和加压的组合物。本发明的药剂可在药学可接受的液体赋形剂，例如水、有机溶剂、药学可接受的油或脂肪或其混合物中溶解或悬浮。液体赋形剂可含有其他适合的药学添加剂例如增溶剂、乳化剂、缓冲液、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、色素、粘度调节剂、稳定剂或渗透调节剂。口服和肠胃施用的液体赋形剂的适合实例包括水(部分包含上文的添加剂，例如纤维素衍生物、优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括单羟基醇和多羟基醇，例如乙二醇)和它们的衍生物以及油(例如分馏的椰子油和花生油)。通常优选地，本发明的药物或方法利用的制剂中，单体TGF-β，例如TGF-β3在不含醇时提供。这些无醇制剂由于其相对“温和”的性质，对于伤口部位(或伤口将形成的部位)使用尤其是优选的。对于肠胃外施用，赋形剂也可为油，例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体赋形剂在用于肠胃外使用的无菌液体组合物中是有利的。加压组合物的液体赋形剂可为卤代烃或其它药学可接受的推进剂。
液体药学组合物的无菌溶液或悬浮液可以例如以肌内、鞘内、硬膜外、腹腔内、皮内、基质内(角膜)或皮下注射的方式使用。无菌溶液也可静脉施用。本发明药剂可制备成无菌固体组合物，可在施用时用无菌水、盐水或其它适合的无菌可注射介质溶解或悬浮。赋形剂倾向于包括必要和惰性的粘合剂、悬浮剂、润滑剂和防腐剂。
在期望以口服摄取的方式施用本发明药剂的情况下，可理解地，所选的药剂将优选为具有提高程度的抵抗降解的药剂。例如，本发明药剂可被保护(例如用上文所述的技术)，以便降低其在消化道中的降解速率。
本发明药剂的组合物适合用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制角膜内的瘢痕形成。角膜伤口可由意外伤害(如上文考虑的)或外科手术(例如角膜的激光手术)造成的眼外伤引起。在这种情况下本发明优选的药物是滴眼剂的形式。
本发明药剂可应用于一系列“内部的”伤口(即伤口发生在机体内，而不是在外表面上)。因此，例如可配制本发明的药物供吸入用于肺或其它呼吸道上皮产生的伤口。
已知的，例如那些药学领域常规使用的方法(例如在体内实验、临床试验等中)，可用于建立包括本发明药剂的组合物的特殊制剂和这些组合物施用的精确治疗方案(例如活性药剂的每日剂量和施用的频率)。
本发明的药剂能促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的适合的每日剂量，依赖于一系列因素包括(但不限于)伤口组织的性质、治疗伤口的面积和/或深度、伤口的严重性和形成病理性瘢痕或慢性伤口的诱病因素的存在或缺乏。
通过实例，在单次发病治疗中可施用给伤口或上皮损伤部位的活性药剂的量可优选地为约50-200ng/cm线性伤口或cm2上皮损伤(如果注射施用)，或约100-300ng/cm线性伤口或cm2上皮损伤(如果局部施用)。
通过进一步的实例，可施用给伤口或上皮损伤部位的活性药剂的优选量可为约50ng/cm线性伤口或cm2上皮损伤(如果注射施用)或约100ng/cm线性伤口或cm2上皮损伤(如果局部施用)。
通过实例，可局部施用给伤口或上皮损伤部位活性药剂的总量可优选地为约50ng/100μL每厘米线性伤口或cm2上皮损伤，一日一次连用三天，因而提供的总剂量是150ng/厘米线性伤口或cm2上皮损伤。
在给急性伤口或上皮损伤部位局部施用的情况下，活性药剂适合的量可优选为约100ng/线性伤口或cm2上皮损伤，一日一次连用三天，因而提供的总剂量是300ng/cm线性伤口或cm2上皮损伤。
没有有损于上文，治疗伤口或其它上皮损伤部位需要的本发明的药剂量典型地为每24小时每厘米线性伤口或上皮损伤施用1pg到1mg药剂，尽管这个数字可根据上文概括的因素向上或向下修正。药剂可优选地以1pg/100μL-1mg/100μL的药剂溶液的形式提供，24小时期间每厘米线性伤口或上皮损伤施用100μL这种溶液。
更优选地，药剂以10pg/100μL-100μg/100μL的溶液施用，24小时期间每厘米线性伤口或上皮损伤施用100μL这种溶液。
最优选地，药剂以1ng/100μL-1000ng/100μL的溶液施用，24小时期间每厘米线性伤口或上皮损伤施用100μL这种溶液。
一般地，包括本发明药剂的组合物应被配制使得当给伤口施用时药剂浓度达到每厘米线性伤口或上皮损伤0.79pM至0.79mM。优选地，药剂以每厘米线性7.9pM至0.079mM的浓度提供。
本发明药剂的(例如序列ID号3的肽)施用浓度可为0.79pM至0.79mM。优选地，本发明药剂的施用浓度可为7.9pM至0.079mM。最优选地，本发明药剂的施用浓度可为0.79nM至0.79μM。
纯粹通过实例，当皮内注射施用并以100μL每厘米线性伤口边缘给药，含有浓度为10pg/100μL至100μg/100μL的本发明活性药剂(例如序列ID号3的肽)的可注射溶液适合于用来促进真皮伤口加速愈合和/或抑制瘢痕形成。
在序列ID号3的单体肽的情况下，施用给伤口的优选剂量为约1ng/100μL-1000ng/100μL，每cm线性伤口边缘施用约100μL的这种溶液。
本发明的药剂可作为单一疗法(例如通过单独使用本发明的药物)用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成。可选择地，本发明的药物或方法可用于与其它促进伤口愈合或抑制瘢痕的化合物或治疗结合。可用于作为这些组合疗法的部分的适合治疗为本领域技术人员熟知。
本发明人发现，本发明的药物，尤其是包括序列ID号3的肽的那些可在糖存在时方便地配制。这种糖可为还原或非还原糖和/或其磷酸酯或其磷酸酯衍生物。这些糖的实例可选自，但不限于选自麦芽糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯醣、甘露醇、蔗糖、果糖、右旋糖和葡萄糖。优选的糖可选择由麦芽糖和海藻糖组成的组。优选地，本发明的药物，尤其是本发明实施方案的那些可具有的pH为5至7。
可理解地，通过包括编码这些分子的核酸序列的细胞表达技术，单体TGF-β肽可代表有利的施用药剂。这些细胞表达的方法尤其适合医疗应用，其中需要长期的肽的治疗效果，例如在期望其长时间增强有缺陷的伤口愈合反应的情况下。尤其优选的是，通过细胞表达施用的TGF-β单体包括序列ID号3定义的肽。
给组织例如伤口施用本发明肽药剂的很多已知方法具有如下缺点：由于肽药剂在体内的半衰期短，即使几天的过程也很难达到本发明药剂在治疗部位上的持续水平。药剂的半衰期短出于很多原因，包括：
(i)被蛋白酶和类似物的降解。
(ii)被结合蛋白的清除。
(iii)被胞外基质分子结合和抑制药剂活性。
而且，用于促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的药剂需要在适合的赋形剂内施用，并且经常以包含药剂和赋形剂的组合物的形式提供。正如所讨论的，优选地这些赋形剂是非炎性、生物可相容的、生物可吸收的并且必须不能使药剂降解或失活(贮存或使用中)。然而，经常难以提供令人满意的赋形剂以将药剂递送到具有待治疗伤口的组织。
排除或减轻这些问题的便利方法是，通过基因治疗的方式提供治疗有效量的本发明药剂到待治疗的区域。
由于遗传密码子的简并性，清楚地是，编码适合本发明使用的药剂的核酸序列可变化或改变，而基本上不会影响编码产物的序列，因此可提供其功能性的变体。可用于编码序列ID号1-3所定义的肽的可能的核酸序列对于本领域技术人员来说是非常明显的，适合的实例如序列ID号4-7所分别提供的。
基因治疗递送系统比大多数常规的递送系统更可能非常适合在更长时间内在伤口上达到本发明药剂的持续水平。适合促进伤口加速愈合和/或抑制瘢痕形成的本发明药剂在伤口部位由细胞持续表达，所述细胞已用本发明第九方面公开的DNA分子转化。因此，即使本发明药剂在体内的半衰期很短，治疗有效量的药剂也可从治疗组织持续地表达。
而且，基因治疗递送系统可用于提供DNA分子(和由此的本发明药剂)，而不需要使用常规的药学赋形剂，例如那些接触伤口的软膏或乳剂中需要的。
优选地，适合的基因治疗递送系统是这样的：DNA分子能被表达(当递送系统施用到患者时)产生被包括序列ID号1-3的组所定义的肽。DNA分子可包含在适合的载体内形成重组载体。载体例如可为质粒、粘粒或噬菌体。这些重组载体在本发明的基因治疗递送系统中，对于用适合的DNA分子转化细胞非常有用。
重组载体也可包括其它功能性元件。例如，重组载体可被设计以使载体在细胞核内自主复制。在这种情况下，诱导DNA复制的元件需要在重组载体内。可选择地，重组载体可被设计以将载体和重组DNA分子整合进细胞的基因组。在这种情况下，利于靶向整合的(例如通过同源重组)DNA序列是期望的。重组载体也可含有编码用作克隆过程中可选择标记物的基因的DNA。
重组载体也可进一步根据需要包含控制基因表达的启动子或调节子。
DNA分子可(但不必须)整合进受治疗个体细胞的DNA内。未分化细胞可被稳定地转化，引起遗传改变的子细胞的产生。在这种情况下，需要对个体的表达进行调控，例如用特异的转录因子、基因激活子或更优选地用可诱导的启动子，其可转录响应于在伤口中发现的特异信号的基因。可选择地，递送系统可设计为利于受治疗个体未分化细胞的不稳定或瞬时转化。在这种情况下，因为当转化细胞死亡或停止表达蛋白时(理想地当实现促进伤口加速愈合并减少瘢痕形成时)DNA分子的表达将终止，所以表达调控的重要性变小。
递送系统可给个体提供没有整合进载体的DNA分子。例如，DNA分子可整合进脂质体或病毒颗粒。可选择地，“裸”DNA分子可通过适合的方式例如直接内吞摄取插入个体的细胞。
DNA分子可通过转染、感染、微注射、细胞融合、原生质体融合或基因枪轰击的方式转移到个体的细胞内。例如，转移可通过用包被的金颗粒、包含DNA分子的脂质体、病毒载体(例如腺病毒)的基因枪转染和通过直接应用质粒DNA到局部伤口或注射来直接提供DNA摄取(例如内吞)的方式进行。
本发明药剂的细胞表达可以是通过伤口周围无损伤区域的边缘的细胞，或可选择地通过治疗性引入伤口的细胞(例如培养的与伤口愈合反应有关的内源或外源细胞)。
可理解地，被治疗性诱导促进伤口加速愈合和/或预防、减少或抑制瘢痕形成的细胞可体外操作，以使它们可表达增加水平的本发明药剂，接着引入伤口区域。优选地，这些细胞是体外培养用于制备或制造在促进伤口愈合中使用的人造皮肤或皮肤取代物的细胞。更优选地，细胞是自体同源的细胞，尽管可理解地任何适合细胞都可用。
因此，本发明第十七方面中提供了包含被诱导表达本发明药剂的细胞的药物。这些细胞可优选地表达单体TGF-β3。
本发明药剂细胞表达的诱导可通过将核酸整合进细胞的方式实现，所述核酸可使本发明适合使用的药剂表达。
现在，本发明将通过实例参考以下实验方案和研究，以及附加的附图做进一步描述：
图1说明在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE比较单体和二聚体形式的TGF-β3的结果；
图2列出用于定位实验大鼠切入性伤口的模板；
图3概括了施用到实验动物伤口部位的治疗；
图4显示创伤后三天，用单体或二聚体TGF-β3治疗的实验伤口的外观评定结果；
图5概括了施用到实验动物伤口部位的治疗；
图6显示创伤后70天，用单体或二聚体TGF-β3治疗的实验瘢痕的外观评定结果；
图7示出显示创伤后70天，实验瘢痕的外观的代表性肉眼下图像；
图8表现创伤后70天，实验瘢痕结构的代表性显微镜下图像；
图9说明被成功转化的宿主细胞的TGF-β3单体的产生；
图10说明在实验蛋白再折叠的情况下，二聚体和单体TGF-β3的产生；和
图11说明通过超滤/疏水相互作用色谱法分离TGF-β3蛋白。
关于重要的氨基酸或核酸序列的信息在“序列信息”部分提供(包括本发明适合使用的人TGF-β同工型的活性片段的氨基酸序列，以及编码TGF-β同工型全长肽的DNA分子的序列，和编码野生型TGF-β3的活性片段的DNA，和用于产生cDNA的引物的DNA序列，所述cDNA编码本发明适合使用的人TGF-β同工型)。
实验方案和实施例
1.TGF-β单体蛋白的产生、再折叠和纯化方法
1.1核苷酸序列
编码全长TGF-β蛋白的DNA序列如序列ID号4-6显示。全长TGF-β蛋白由信号肽(斜体显示)、前体肽(粗体显示)以及活性片段(正常文本显示)构成。编码野生型TGF-β3活性片段的核苷酸序列在序列ID号7中显示。
1.2cDNA的产生
来自人切入性伤口的总RNA(创伤后第5天采集)用′DNA-Free′(Ambion)处理，以便除去任何污染的DNA。用总RNA作为模板，三种哺乳动物TGF-β同工型即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3中每一种的cDNA通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)产生。RT-PCR反应混合物由
Figure A20078001626900331
QRT-PCR Core Reagent Kit、一步法(Stratagene)制备。将1微克RNA加入50μL溶液中，所述溶液包含：一步QRT-PCR缓冲液、0.2mMdNTP、3.5mM MgCl2、1μL StrataScript逆转录酶、Taq聚合酶2.5单位、0.4μM有义引物(图1)、0.4μM反义引物(如序列信息中所显示)。反应在热循环器(Hybaid PCR Expresses)中发生，在以下条件下运行：45℃ 30分钟，95℃ 10分钟，接着95℃ 30秒的40个循环，65℃ 1分钟和72℃ 1分钟。最后的步骤是72℃ 10分钟。PCR样品在2％(w/v)琼脂糖凝胶中跑胶，以检验条带的尺寸，和用Wizard PCR Prep Kit(Promega)纯化。
1.3质粒的构建
使用的pET-3d载体来自pBR322载体，并且包含一个LacUV5控制的T7启动子和一个抗氨苄西林抗性标记物基因。
三个TGF-β同工型的cDNA片段(1.2部分中产生的)被亚克隆进pET-3d载体的NcoI和Bam HI位点(分别是5′-3′)。产生的连接接着被转化进XL10 Gold细胞(Stratagene)并进行菌落PCR分析来定位包含插入物的克隆。使最后的克隆生长并用
Figure A20078001626900341
Spin Miniprep Kit(Qiagen)将它们的质粒DNA提取进水中。质粒用T7启动子引物(5′-TAA TAC GAC TCACTA TAG GG-3′)和T7终止子引物(5′-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3′)测序和检验。
1.4转化和克隆
将编码每一种TGF-β同工型的质粒DNA(来自1.3部分)10μL(50ng/μl)加入1mL冷的(4℃)感受态R.coli(大肠杆菌)BL21(DE3)pLysSSinglesTM细胞(Novagen)。20分钟后细胞在42℃的水浴中温育30秒，热激细胞。将100μL Psi培养基加入细胞/质粒混合物中，37℃摇90分钟。将50μL和100μL的等分试样涂布到含有100μg/mL氨苄西林(Sigma)的LB琼脂平板上，在37℃温育18小时。单个克隆被培养，产生细胞冻存物，-80℃储存。分析细胞冻存物的质粒DNA，以检验正确的转化。
1.5表达
复苏冻存的转化了每一种TGF-β同工型的E.coli细胞(来自1.4部分)的安瓿，接种到含有100mL LB培养基和100μg/mL氨苄西林的封口的Erlenmeyer烧瓶里。烧瓶振荡温育，37℃过夜，将5mL这种过夜的培养物加入到2升的Erlenmeyer烧瓶(500mL LB培养基/amp)并在37℃振荡温育。每小时取2mL肉汤样品，追踪其生长和TGF-β同工型的表达(诱导后)。生长由分光光度计测量在波长600nm的吸收来确定。当测得的吸收是0.6Abs时，通过加入异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)至终浓度1mM来诱导细胞表达TGF-β同工型。培养物再多温育4小时。0.5mL肉汤样品离心沉淀(Sorvall Biofuge 10,000rpm离心10min)，弃去上清液。沉淀在50μL十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)样品缓冲液中重悬浮，并在95℃水浴中加热10分钟。将10μL样品加到SDS-PAGE上。SDS-PAGE和考马斯蓝染色(如A.T Andrews描述的，1986)用
Figure A20078001626900351
Mighty Small SE 245Dual Gel Caster(Amersham)进行。凝胶厚度是1mm，含有15％(v/v)聚丙烯酰胺凝胶。
1.6细胞收集和包涵体的分离
来自1.5部分的细胞通过在带有4315转头的Hettich Rotina 46R离心机中，于4℃ 5000g离心10分钟而沉淀。于4℃进行细胞破碎和每一种不溶性(包涵体)TGF-β同工型的回收。细胞在pH 8.3的50mL 100mMTris/HCl(Sigma)和10mM EDTA(Sigma)中悬浮，用Sanjo Soniprep 150超声破碎。加入0.2％(w/w)Triton X-100(Sigma)，将悬浮液搅拌1小时。悬浮液12,000g离心40分钟。沉淀在以15,000g离心40分钟之前，在室温下于pH 8.3的50mL 100mM Tris/HCl和10mM EDTA中重悬浮。
1.7包涵体的溶解
来自1.6部分的沉淀在40mL 8M尿素1％(w/w)DL-二硫苏糖醇(DTT)中重悬浮，并在Heidolph Diax 900匀浆机中破碎。悬浮液加盖并搅拌1小时以溶解包涵体，将TGF-β同工型还原成它们变性的单体形式。接着悬浮液在4℃ 12,000g离心30分钟。将上清液透析以使缓冲液从8M尿素(ICN Biomedical)换成10％(v/v)醋酸。当缓冲液交换到10％(v/v)醋酸时，溶于8M尿素的E.coli蛋白从溶液沉淀出来。将1％(w/v)DTT(Sigma)加入悬浮液中，加盖并搅拌30分钟以便还原缓冲液交换过程中TGF-β单体间形成的任何二硫键。离心悬浮液以便分离可溶和不溶的蛋白。尿素溶解和缓冲液交换步骤取出的样品(醋酸可溶和不溶物质)，接着用SDS-PAGE分析。
1.8超滤
来自1.7部分的10％(v/v)醋酸物质用10kDa膜在Vivoflow50(Vivascience)中进行超滤。这样做的目的是减少10％(v/v)醋酸悬浮液的体积到3mL，以及除去低分子量的蛋白(＜10kDa)。
1.9再折叠和纯化
溶解的TGF-β1、2和3蛋白首先用超滤浓缩，接着跑经尺寸排阻色谱法(SEC)柱子。来自SEC包含TGF-β蛋白的部分接着被汇集和冻干。冻干的单体TGF-β1、2和3在含有10mM DTT的8M尿素中溶解，直到达到终浓度10mg/mL。在搅拌的同时，将TGF-β1、2和3蛋白溶液逐滴加入再折叠溶液(1M 3-(-吡啶并)-1-丙烷磺酸盐(NDSB-201)、20％(v/v)二甲基亚砜(DMSO，Sigma)、2％(w/v)3-(3-胆酰胺丙基)二甲铵基-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、1M NaCl(Sigma)、1％(w/v)还原型谷胱甘肽(GSH，Sigma)和0.05MBase(Sigma)pH 9.3)直到TGF-β1、2和3蛋白达到0.2mg/mL的终浓度。重要的是用浓NaOH/HCl将pH保持在9.2-9.4的范围内。溶液用石蜡封口膜(Parafilm)封口，石蜡封口膜上打孔以允许单体蛋白氧化，并在8℃搅拌。144小时后将溶液15,000g离心40分钟，去除形成的沉淀，pH用冰醋酸调整为pH 3.5。
1.10再折叠单体蛋白的纯化
产物再折叠TGF-β物质接着用标准的色谱技术进一步纯化，然后是表征前超滤浓缩相关部分(即包含单体TGF-β蛋白)。
2.体外和体内表征和评定单体TGF-β蛋白的生物活性的方法
通过很多方法来表征和评定TGF-β单体蛋白的生物活性，所述方法包括：SDS-PAGE、氨基酸序列分析(通过LCMS)和体内生物活性测定(用下面描述的大鼠皮肤伤口愈合和瘢痕形成模型)。
2.1体外表征TGF-β3单体
2.1.1纯化的单体TGF-β3的非还原和还原SDS-PAGE分析
2.1.1.1方法
纯化的野生型TGF-β3单体用SDS-PAGE测定纯度和分子质量而进行评价。将3μg纯化的TGF-β3单体(还原和非还原的样品)、3μg二聚体TGF-β3阳性对照(还原和非还原)和10μL Invitrogen Mark 12分子量标准品加样到聚丙烯酰胺凝胶(10％-20％(v/v)丙烯酰胺梯度)上。一旦电泳完成，凝胶用考马斯蓝染色。
2.1.1.2结果
非还原和还原的SDS-PAGE分析结果在图1中显示，图示二聚体TGF-β3跑到凝胶上的期望位置(还原的单体为约13kDa和非还原的样品为25kDa)。对还原和非还原样品，单体TGF-β跑到凝胶上期望的约13kDa(理论上是12.5kDa)的位置。用对约1μg蛋白敏感的考马斯蓝染色没有检测到其它的蛋白条带。
2.1.2氨基酸序列分析
2.1.2.1方法
将50微升纯化的单体TGF-β3在真空下干燥，然后重悬浮于20μl含有50mM NH4HCO3和10％(v/v)乙腈的溶液。20μg测序级胰蛋白酶(Trypsin，Promega)在10μl试剂盒提供的重悬浮缓冲液(Promega)中重悬浮，得到的胰蛋白酶浓度是2μg/μl。再将其稀释到50mM NH4HCO3和10％(v/v)乙腈中，得到的胰蛋白酶终浓度是0.2μg/μl。通过加入和单体TGF-β3为1∶20(w/w)比例的胰蛋白酶来过夜完成消化。消化通过加入蚁酸(Fluka)到终浓度0.1％(v/v)来终止。接着样品稀释到1pmole/μl，然后肽用nano-flow RP-LCMS(临界系统，Dionex与Q-ToF2联机，微量)的方法分析。色谱分析在75μm C18柱(LC填料)上用从5％到55％的乙腈(Romil)梯度45分钟完成。MS分析采用数据依赖分析的形式，其中仪器测量从LC洗脱的肽离子的m/z，并选择MSMS分析的合适离子，其中利用碰撞引起的分解使肽离子片段化以提供序列信息。
2.1.2.2结果
氨基酸序列分析证实TGF-β3的‘野生型’单体具有期望的氨基酸序列(对应于序列ID号3)。
2.2体内TGF-β3单体生物活性的评定
文献中的数据表明包含TGF-β3的二聚体TGF-β加速了创伤或损伤后的皮肤愈合和减少瘢痕形成(Shah，M等1995)。下面的实例研究了单体TGF-β3在成年雄鼠中对切入性伤口愈合(创伤后3天)和瘢痕形成(创伤后70天)的生物作用。
2.2.1单体‘野生型’和突变的TGF-β3蛋白对伤口愈合的效果(切口创伤的第3天)
2.2.1.1方法
雄性大鼠(Sprague Dawley)用氟烷麻醉，剃去其背毛。伤口位置用标准专用模板和皮肤标记墨水如图2显示的进行标记。样品在无菌赋形剂缓冲液中稀释到图3图表中概括的浓度，所述缓冲液含有0.25M麦芽糖(Sigma)、0.002％(v/v)醋酸和0.33％(v/v)异丙醇。全部样品经无菌过滤且不含内毒素。每个治疗组用四只大鼠。来自每个治疗组的100μL样品(图3)皮内注射进标记的伤口部位A和B(除了不接受治疗的大鼠-“未实验的”)。用11号解剖刀片在伤口部位A和B做成完整厚度为1cm的长切口。全部动物分开笼养。24小时后动物接受样品的第二个剂量。3天后给伤口拍照并用肉眼的直观模拟记分系统(Visual Analogue Scoring system)分析(根据Beausang，E等.1998改进)。用Mann Whitney U/Student T检验对数据进行统计学分析。p＜0.05的值被认为是显著的。
2.2.1.2结果
3天后用肉眼的VAS系统考察切入性伤口(见图4)。在这种10分标准下，0分代表完全愈合的伤口，10分代表愈合极差的伤口。数据显示：
50ng/100μL或100ng/100μL的‘野生型’单体TGF-β3的治疗与无治疗(未实验的对照)和安慰剂治疗比较，降低了VAS分数(即改善了伤口的肉眼外观)。100ng/100μL剂量的治疗与无治疗(未实验的对照)比较，显著改善了(p＜0.01)伤口的外观。令人惊奇地，注意到单体野生型TGF-β比二聚体形式表现出更强的效力。
2.2.2单体‘野生型’TGF-β3蛋白对瘢痕形成的效果(切口创伤后70天)
2.2.2.1方法
雄性大鼠(Sprague Dawley)用氟烷麻醉，剃去其背毛。伤口位置用标准模板和皮肤标记墨水如图5显示的进行标记。样品在无菌赋形剂缓冲液中稀释到图5图表中概括的浓度，所述缓冲液含有0.25M麦芽糖(Sigma)、0.002％(v/v)醋酸和0.33％(v/v)异丙醇。全部样品经无菌过滤且不含内毒素。每个治疗组用四只大鼠。来自每个治疗组的100μL样品(图5)皮内注射进标记的伤口部位A和B(除了不接受治疗的大鼠-“未实验的”)。用11号解剖刀片在伤口部位A和B做成完整厚度为1cm的长切口。全部动物分开笼养。24小时后动物接受样品的第二个剂量。70天后给瘢痕拍照并用肉眼的直观模拟记分系统分析(根据Beausang，E等.1998改进)。如上面描述产生的瘢痕肉眼外观的代表性例子在图7显示。
肉眼分析后，并在处理成蜡块用于组织学评定之前，切除伤口并置于10％缓冲盐水中。蜡块被切成5μm的连续切片，置于载玻片上。载玻片用Masson三色法(Massons Trichrome)染色、分析。用Mann WhitneyU/Student T检验对数据进行统计学分析。p＜0.05的值被认为是显著的。如上面描述产生的瘢痕显微镜下外观的代表性例子在图8显示。
2.2.2.2用肉眼VAS对70天的切入性伤口进行评定
70天后用肉眼的VAS系统考察切入性伤口。10分代表不好的瘢痕，0分代表正常皮肤。图6总结了伤口70天的VAS分析结果。数据显示：
单体‘野生型’TGF-β3(50ng/100μL和100ng/100μL的剂量)与安慰剂治疗和未实验的伤口比较，减少了瘢痕形成。100ng/100μL的剂量与安慰剂治疗的伤口比较，这种减少是统计学显著的(p＜0.01)。
50ng/100μL的二聚体TGF-β3与安慰剂治疗和未实验的伤口比较，减少了瘢痕形成。与安慰剂治疗的伤口比较，这种减少是统计学显著的(p＜0.01)。
3.生产生物活性单体优选条件的开发
发明人研究了是否可以建立产生正确折叠的、生物活性TGF-β单体的改进方法。下面的实例例证了本发明方法对TGF-β3单体再折叠的应用。
进行筛选再折叠试剂的研究(见3.12)。接着研究了纯化正确再折叠单体的方法(3.13)。
这些研究使发明人意识到，可通过遵循以下的方法来建立生产生物正确折叠的TGF-β单体的改进方法，其包括：
将溶解的、未折叠单体生长因子加入到一种溶液中，所述溶液包含：
(i)2-(环己基氨基)-乙磺酸(CHES)或其功能性类似物；和
(ii)低分子量巯基/二硫化物氧化还原系统；且
在溶液中孵育生长因子直到形成二聚体生物活性生长因子。
实验：
3.1cDNA的产生
来自人切入性伤口的总RNA(创伤后5天取出)用DNA-Free(Ambion)处理，以便除去任何污染的DNA。用总RNA作为模板，TGF-β3的cDNA通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)产生。RT-PCR反应混合物由QRT-PCR Core Reagent Kit、一步法(Stratagene)制备。将1微克RNA加入50μL溶液中，所述溶液包含：一步QRT-PCR缓冲液、0.2mMdNTP、3.5mM MgCl2、1μL StrataScript逆转录酶、Taq聚合酶2.5单位、0.4μM有义引物(5′GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACTACT GC 3′)、0.4μM有义引物(5′-CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCAGCT ACA TTT ACA AGA C 3′)。反应在热循环器(Hybaid PCR Express)中发生，在以下条件下运行：45℃ 30分钟，95℃ 10分钟，接着95℃ 30秒的40个循环，65℃1分钟和72℃1分钟。最后的步骤是72℃ 10分钟。PCR样品在2％(w/w)琼脂糖凝胶中跑胶，以检验条带的尺寸，和用Wizard PCR Prep Kit(Promega)纯化。
3.2载体克隆和宿主细胞转化
pET-24d载体来自pBR322载体，并包含一个LacUV5控制的T7启动子和一个抗卡那霉素标记基因。
TGF-β3的cDNA片段(1.1部分中产生)用0.75μL Nco1(New EnglandBiolabs)和0.75μL BamH1(New England Biolabs)与1×BamH1缓冲液(New England Biolabs)在15μL反应液(Nuclease Free Water，Novagen)中37℃消化4小时。1微升pET-24d质粒(Novagen)用同样的方法消化。消化的cDNA和大的质粒片段经琼脂糖凝胶纯化，并用SpinPrep Gel DNA提取试剂盒(Novagen)回收。
纯化的cDNA和质粒片段用T4连接酶试剂盒(Novagen)连接。连接的cDNA/质粒转化进HMS 174(DE3)(Novagen HMS 174(DE3)转化试剂盒)。转化体通过在含有50μg/mL卡那霉素(Invitrogen)的Luria肉汤(LB)琼脂平板上涂布来选择。选择3个克隆进行限制性消化和/或表达。
3.3用于产物表达的克隆筛选
克隆在摇瓶培养基中生长，并在OD600为0.65-0.85的指数期用1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，其中所述培养基含有半浓度′Terrific Broth′(6g/L植物蛋白胨(Becton Dickinson)、12g/L酵母提取物(Becton Dickinson)、2g/L甘油(JT Baker)、1.16g/L磷酸二氢钾(JT Baker)、6.25g/L磷酸氢二钾(JT Baker)，用蒸馏水适量到1升)。加入IPTG 3小时后取出诱导后样品，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析产物的诱导和表达。克隆1-4诱导前/后样品等分试样和Mark 12分子量标准品(Invitogen-分子量范围2.5-200kDa)在
Figure A20078001626900411
Novex 12％Bis-Tris Gel，1.0mm(Invitrogen)上于120毫安、200伏跑胶约40-50分钟，接着用考马斯蓝染色。在这些培养物的每一种中，大小在6-14.4kDa的蛋白(即TGF-β3单体)被清晰地诱导出来(见图9)，其中克隆2表达最大量的TGF-β3蛋白。
3.4细胞冻存物
克隆1-4在摇瓶中半浓度Terrific Broth中生长到OD600为大约1，通过加入甘油到20％(v/v)而作为甘油储液储存。等分1.2mL肉汤到12x 2mL冷冻管(含有0.3mL甘油)中，然后-70℃储存。
3.5TGF-β3基因序列确认
在加入甘油前取出用于细胞冻存物的培养样品，利用QiagenMiniPrep Kit进行质粒分离。给分离的质粒测序，用一个T7启动子引物(5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′)和一个T7终止子引物(5′-GCTAGT TAT TGC TCA GCG G-3′)检验。
3.6种子培养物
因为克隆2表达最大量的TGF-β3蛋白，所以复苏细胞冻存物的安瓿(来自3.4部分)，并接种到2升封口的(baffled)Erlenmeyer烧瓶，该烧瓶含有500mL HySoy培养基(12g/L蛋白胨(Quest International)、24g/L酵母提取液(Becton Dickinson)、10g/L NaCl(Sigma)和10g/L甘油(Sigma)及50μg/mL卡那霉素。烧瓶37℃、200rpm振荡温育，周期性取样测OD550。当培养物的OD达到3.21U/mL(7小时后)时，细胞肉汤用于接种150L发酵罐(100L工作体积)。
3.7发酵
900毫升细胞肉汤(来自3.6部分)用于接种150L发酵罐(WHE)，该发酵罐中含有90L分批培养基(0.6g/L K2HPO4、0.4g/L KH2HPO4、1.25g/L NH4SO4、12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取液和10g/L甘油)。发酵操作参数控制如下：温度设定值37℃；pH设定值7.0(用4N氢氧化铵和4N磷酸保持)和溶解氧(DO)最初校准为100％。罐的排出压力为7psi，搅拌速度和空气流速分别是200-400rpm和每分钟每体积培养基1体积空气(vvm或slpm)。以下列优先顺序通过调节发酵设定值参数，而将DO保持在20％以上：搅拌速度(最大400rpm)、通风量(最大1.5vvm)、吸氧量(最大33.3Ipm)和背压(最大12psi)。泡沫用Pluronic L-61(25％v/v)控制。当培养物的OD达到10U/mL时，以45mL/min的起始流速进行甘油进料(50％v/v)。当OD达到40U/mL时，加入IPTG到终浓度0.2mM，诱导细胞。
3.8收集
诱导4小时后，发酵罐冷却到10℃，并将空气流速和搅拌速度分别减小到0.3vvm和100rpm。终止起泡和pH控制，并将背压调节为3psi。通过用Westfalia CSA 8连续式离心机在10℃连续离心来收集培养物。离心机以15,000rpm操作，流速为3升每分钟，采集细胞浆液。
3.9细胞裂解和IB回收
发酵细胞体(来自3.8部分)用裂解缓冲液(6.1g/L TrizmaBase(Tris)、3.7g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、58.44g/L NaCl和10g/L Triton X-100，pH 8.0)1∶5稀释，并使用手提式匀浆器重悬浮。将重悬浮的细胞体通过高压匀浆器两次(参数：压力10,000psig；流速450mL/min和温度15℃)。然后将匀浆细胞裂解液5,000xg、4℃离心(桶式离心机，固定角转头)20分钟。弃去上清液，留下不溶的(包涵体)TGF-β3。包涵体(IB)沉淀用手提式匀浆器在洗涤缓冲液(6.1g/L Tris和3.72g/L EDTA，pH 8.0)中重悬浮，并离心(5,000xg、20分钟、4℃)。
3.10包涵体溶解
来自3.9部分的沉淀用溶解缓冲液(6.1g/L Tris、15.4g/L DL-二硫苏糖醇(DTT)和360.4g/L尿素，pH 8.0)1∶10稀释，用手提式匀浆器重悬浮。悬浮液加盖并室温搅拌60-75分钟以溶解包涵体并还原TGF-β3到它们的单体形式。在第二次温育60-75分钟之前，重悬浮沉淀的pH用NaOH/醋酸调节到pH 9.4-9.6。
3.11净化/超滤和渗滤
来自3.10部分的溶解的材料在切向流过滤(TFF)系统(Millipore)中被净化、浓缩和渗滤。初期的净化和浓缩用预处理的净化TFF膜(MilliporePellicon 1000kDa，再生纤维素，筛网V)完成。净化的TGF-β3在透过液中收集。换到超滤/渗滤(UF/DF)膜(Millipore Pellicon 5kDa，再生纤维素，筛网C)，接着TGF-β3在6置换体积(diavolume)溶解缓冲液(6.1g/L Tris、15.4g/L DTT和360.4g/L尿素，pH 9.5)中清洗。
3.12再折叠筛选基质1
3.12.1方法
来自1.12部分的净化材料中的TGF-β3蛋白含量用RC DCTM蛋白质分析法(BioRad)结合SDS-PAGE、考马斯蓝染色和密度测定法定量。TGF-β3材料在一系列再折叠缓冲液中稀释(见表1和2)。6天时间内每天取1mL样品，并在非还原条件下用SDS-PAGE分析。样品等分试样和Mark 12分子量标准品(Invitogen-分子量范围2.5-200kDa)在
Figure A20078001626900431
Novex 12％Bis-Tris Gel，1.0mm(Invitrogen)上于120毫安、200伏跑胶约40-50分钟。然后蛋白样品用Novex印迹装置(Invitrogen)电泳转移到硝化纤维膜(Invitrogen)。膜用5％(w/v)脱脂奶粉和1％(v/v)聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20；Sigma)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中封闭。清洗膜(PBS，0.1％(v/v)吐温20)，在一抗(抗-TGF-β3，MAB643(R&D systems)，其用PBS和0.1(v/v)吐温20以1∶500稀释)中温育1小时。一抗温育后，硝化纤维膜在清洗缓冲液(PBS，1％(v/v)吐温20)中清洗。然后硝化纤维膜在二抗(与碱性磷酸酶轭合的羊抗小鼠IgG(Abeam PO397)，其用PBS和0.1％(v/v)吐温20以1∶2000稀释)中温育另外1小时。在用Western Blue稳定的碱性磷酸酶底物(Promega)显影之前，再次清洗膜(PBS，1％(v/v)吐温20)。
MAB 643抗体检测到正确折叠的单体和二聚体TGF-β3种类。
3.12.2结果
表1和表2总结了在50个不同实验条件下，检测再折叠的TGF-β3得到的结果。
发明人确定了，下面描述的条件(即实验条件12、19、36、37、42、43和44)产生正确再折叠的二聚体TGF-β3。
1.0.7M 2-(环己基氨基)乙磺酸(CHES)、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、0.4mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件12)。
2.30mM牛磺脱氧胆酸盐、0.7M CHES、2mM GSH、0.4mM GSSG、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件19)。
3.1M NDSB-201、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件36)。
4.0.7M CHES、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件37)。
5.30mM牛磺脱氧胆酸盐加1M NDSB-221、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件42)。
6.30mM牛磺脱氧胆酸盐加0.7M CHES、2mM还原型谷胱甘肽(GSH)、2mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件43)。
7.30mM牛磺脱氧胆酸盐、0.7M CHES、2mM GSH、2mM GSSG、0.12mg/mL TGF-β3、pH 9.5和2-8℃(实验条件44)。
举例来说，图10示出了实验条件12的效力。
表1再折叠筛选基质和结果
  实验条件 温度 去垢剂 TGF-β3浓度 GSH浓度 GSSG浓度  通过Western印迹(MAB643)分析的正确折叠的单体TGF-β3的存在
  1   2-8℃   100mM两性洗涤剂3-08   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  2   2-8℃   40mM牛磺胆酸盐   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  3   2-8℃   40mM Big CHAP   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  4   2-8℃   60mM己基吡喃葡萄糖苷   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  5   2-8℃   0.5％(w/v)ASB-14   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  6   2-8℃   0.5％(w/v)DDMAB   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  7   2-8℃   0.5％(w/v)CTAB   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  8   2-8℃   0.2％(w/v)SDS   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  9   2-8℃   0.1％(w/v)十二烷基-b-D-麦芽糖苷   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  10   2-8℃   0.1％(w/v)吐温20   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  11   2-8℃   1M NDSB-201   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  12   2-8℃   0.7M CHES   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   存在
  13   2-8℃   20％(v/v)蔗糖   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  14   2-8℃   20％(v/v)甘油   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  15   2-8℃   20mM两性洗涤剂3-12+0.5M精氨酸   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  16   2-8℃   20mM两性洗涤剂3-08+1M NDSB-221   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  17   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐+0.5M精氨酸   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  18   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐+1M NDSB-221   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  19   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐+0.7M CHES   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   存在
  20   2-8℃   0.5M精氨酸   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  21   2-8℃   40mM辛基-硫代吡喃葡萄糖苷   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  22   2-8℃   60mM己基吡喃葡萄糖苷+0.1％(w/v)PEG-6000   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  23   2-8℃   30％(v/v)乙醇   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  24   2-8℃   20％(v/v)异丙醇   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
  25   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐   0.12mg/mL   2mM   0.4mM   未检测到
表2.再折叠筛选基质和结果
  试验条件 温度 去垢剂 TGF-β3浓度 GSH浓度 GSSG浓度  通过Western印迹(MAB643)分析正确折叠的单体TGF-β3的存在
  26   2-8℃   100mM两性洗涤剂3-08   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  27   2-8℃   40mM牛磺胆酸盐   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  28   2-8℃   40mM Big CHAP   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  29   2-8℃   60mM己基吡喃葡萄糖苷   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  30   2-8℃   0.5％(w/v)ASB-14   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  31   2-8℃   0.5％(w/v)DDMAB   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  32   2-8℃   0.5％(w/v)CTAB   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  33   2-8℃   0.2％(w/v)SDS   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  34   2-8℃   0.1％(w/v)十二烷基-b-D-麦芽糖苷   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  35   2-8℃   0.1％(w/v)吐温20   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  36   2-8℃   1M NDSB-201   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  37   2-8℃   0.7M CHES   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  38   2-8℃   20％(v/v)蔗糖   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  39   2-8℃   20％(v/v)甘油   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  40   2-8℃   20mM两性洗涤剂3-12+0.5M精氨酸   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  41   2-8℃   20mM两性洗涤剂3-08+1M NDSB-221   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  42   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐+0.5M精氨酸   0.12mg/mL   2mM   2mM   存在
  43   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐+1M NDSB-221   0.12mg/mL   2mM   2mM   存在
  44   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐+0.7M CHES   0.12mg/mL   2mM   2mM   存在
  45   2-8℃   0.5M精氨酸   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  46   2-8℃   40mM辛基-硫代吡喃葡萄糖苷   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  47   2-8℃   60mM己基吡喃葡萄糖苷+0.1％(w/v)PEG-6000   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  48   2-8℃   30％(v/v)乙醇   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  49   2-8℃   20％(v/v)异丙醇   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
  50   2-8℃   30mM牛磺脱氧胆酸盐   0.12mg/mL   2mM   2mM   未检测到
3.13超滤/疏水相互作用色谱
选择的再折叠溶液用超滤(膜为平板微孔Pellicon 5kDa，0.1m2，再生纤维素，筛网)浓缩5倍。在稀释缓冲液(2.72g/L醋酸钠、264.28g/L硫酸铵、100g/L醋酸和210.7g/L盐酸精氨酸，pH 3.3)里1∶1稀释之前，浓缩的再折叠物质的pH用冰醋酸调节到pH 2.5-2.8。丁基琼脂糖凝胶4快流速柱(Amersham，床高16cm)用四柱体积的缓冲液A(2.72g/L醋酸钠、132.14g/L硫酸铵和100g/L醋酸，pH 3.3)平衡。在以100cm/hr的流速(整个过程都用这个流速)加样到丁基琼脂糖凝胶柱之前，再折叠物质经0.22μM膜(微孔Millipak过滤器)过滤。然后柱子用四柱体积的缓冲液A清洗。TGF-β3蛋白用缓冲液B(2.72g/L醋酸钠、100g/L醋酸和300g/L乙醇，pH 3.3)洗脱离柱。在分离单体蛋白之前，包含TGF-β3蛋白单体和二聚体形式的第一个峰被汇集(见图11)。
序列信息
TGF-β1(序列ID号1)
ALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGP
CPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGR
KPKVEQLSNMIVRSCKCS
TGF-β2(序列ID号2)
ALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAG
ACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTP
KIEQLSNMIVKSCKCS
TGF-β3(序列ID号3)
ALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGP
CPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTP
KVEQLSNMVVKSCKCS
编码全长TGF-β1的DNA(序列ID号4)，显示信号肽(斜体显示)、前体肽(粗体显示)以及活性片段(正常文本显示)
Figure A20078001626900481
编码全长TGF-β2的DNA(序列ID号5)，显示信号肽(斜体显示)、前体肽(粗体显示)以及活性片段(正常文本显示)
Figure A20078001626900482
编码全长TGF-β3的DNA(序列ID号6)，显示信号肽(斜体显示)、前体肽(粗体显示)以及活性片段(正常文本显示)
Figure A20078001626900491
序列ID号7-编码野生型人TGF-β3活性片段的DNA
GCT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC
TGC TGT GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG
GGC TGG AAG TGG GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC
AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC
ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG TAC AAC ACT CTG
AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC CAG
GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC
CCC AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT
TGT AAA TGT AGC
产生TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的cDNA的有义和反义引物：
TGF-β1
有义引物-5′GTT ACA CCA TGG CCC TGG ACA CCA ACT ATT 3′
反义引物-3′CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT GCA CTT 5′
TGF-β2
有义引物-5′GTT ACA CCA TGG CTT TGG ATG CGG CCT ATT
反义引物-3′CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT GCA TTT G 5′
TGF-β3
有义引物-5′GAT ATA CCA TGG CTT TGG ACA CCA ATT ACT ACT GC3′
反义引物-5′CAG CCG GAT CCG GTC GAC TCA GCT ACA TTT ACAAGA C 3′

Claims (23)

1.TGF-β单体或其生物活性片段或衍生物作为药物的用途。
2.TGF-β3单体或其生物活性片段或衍生物作为药物的用途。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述TGF-β单体具有大约12kDa的分子量。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的用途，其用于加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成的药物的制备。
5.根据权利要求2至4任一项所述的用途，其中所述TGF-β3单体或片段或衍生物，是包含序列ID号3的野生型TGF-β3单体或其生物活性片段或衍生物。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的用途，其中所述伤口是真皮伤口。
7.根据权利要求4或权利要求5所述的用途，其中所述伤口是眼部伤口。
8.根据权利要求4至7任一项所述的用途，其中所述伤口是急性伤口。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述伤口是烧伤。
10.根据权利要求4到7任一项所述的用途，其中所述伤口是慢性伤口。
11.根据权利要求2或权利要求3所述的用途，其用于促进上皮再生的药物的制备。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述上皮包括表皮。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述上皮包括眼上皮。
14.根据权利要求2或权利要求3所述的用途，其用于预防和/或治疗纤维化疾病的药物的制备。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述纤维化疾病选自肺纤维化、肝纤维化、硬皮病、皮肤纤维化、肌肉纤维化、放射纤维化、肾脏纤维化、眼纤维化和子宫纤维化。
16.根据前述权利要求的任一项所述的用途，其中所述单体或其生物活性片段或衍生物以0.78pM至0.78mM的浓度提供。
17.根据前述权利要求的任一项所述的用途，其中所述药物具有的pH约5至7。
18.根据前述权利要求的任一项所述的用途，其中所述药物基本上不含醇。
19.根据前述权利要求的任一项所述的用途，其中所述TGF-β单体或其生物活性片段或衍生物通过一种方法被折叠成其生物活性形式，所述方法包括：
将溶解的、未折叠的单体TGF-β(或其片段或衍生物)加入到一种溶液中，该溶液含：
(i)2-(环己基氨基)-乙磺酸(CHES)或其功能性类似物；和
(ii)低分子量巯基/二硫化物氧化还原系统；且
在所述溶液中孵育所述TGF-β直到形成具生物活性的单体TGF-β。
20.加速伤口愈合和/或抑制瘢痕形成的方法，包括给需要这种治疗的患者施用治疗有效量的单体TGF-β或其生物活性片段或衍生物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述TGF-β3单体或片段是包含序列ID号3的野生型TGF-β3单体或其生物活性片段或衍生物。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述伤口是真皮伤口。
23.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述伤口是眼部伤口。
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