JP2002511762A

JP2002511762A - ネズミおよびヒトのサーベラス様蛋白およびそれらを含有する組成物

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Publication number: JP2002511762A
Application number: JP50714799A
Authority: JP
Inventors: フォレッティー，マキシミリアン; デロバーティス，エドワード・エム
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2002-04-16
Also published as: WO1999001553A1; AU749031B2; AU7814098A; US5935852A; US20020164682A1; EP1012278A1

Abstract

(57)【要約】精製哺乳動物サーベラス蛋白およびそれらの製造方法を開示する。哺乳動物サーベラス蛋白をコードするＤＮＡ分子も開示する。その蛋白は、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連細胞および組織の形成、成長、分化、増殖および／または維持、ならびに心臓組織および内皮組織を含む他の組織の修復に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ネズミおよびヒトのサーベラス様蛋白およびそれらを含有する組成物本発明は、サーベラス（cerberus）蛋白ファミリーの新規メンバー、それらをコードするＤＮＡ、ならびにそれらを得る方法に関する。これらの蛋白を用いて組織および器官における因子の発現および／または組織および器官の分化を誘導してもよく、特に、神経、内皮および心臓組織の形成、成長、分化、増殖および／または維持を誘導してもよい。よって、これらの蛋白は、創傷、腫瘍の治療において、および／または他の組織および器官、例えば表皮、膵臓、肝臓、肺、腎臓、脳および／または他の組織の形成、成長、分化、増殖および／または維持の促進および／または抑制において有用でありうる。これらの蛋白は、ＢＭＰ類のごとき他の組織再生および分化因子の活性増強に使用してもよい。当該蛋白は、発明者によりヒト哺乳動物サーベラス様と称される。発明の背景ニューロンならびに関連神経細胞および組織のごとき組織および器官の形成、増殖、分化および維持に関与する分子の検索は、これらの組織の変性またはダメージを包含する症状の治療に対して莫大な必要性があるので、広範囲にわたっている。以前同定されたアフリカツメガエルの胚中の蛋白サーベラスは、頭部の誘導に関与しているらしい。Bouwmeester et al.，Nature，382:595-601(1996)。発明の概要本発明者は、蛋白のサーベラスファミリーの新規哺乳動物のメンバーを見いだし、さらに、驚くべきことに、サーベラス蛋白ファミリーのメンバーが、ニューロンおよび／またはSchwann細胞グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の形成、成長、増殖、分化、維持の促進および／または抑制を誘導しうることを見いだした。したがって、本発明は、ニューロンおよび／またはSc hwann 細胞グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の形成方法を提供し、該方法は、サーベラス蛋白ファミリーのメンバーである少なくとも１種の蛋白を含む組成物を前駆細胞に投与することを含む。本発明は、サーベラスと命名された蛋白のファミリーに関し、それらはは９個のシステイン残基のパターンを有する新規蛋白であり、胚に存在する。アフリカツメガエルにおいて、サーベラスｍＲＮＡは受精卵中にて低レベルで発現され、接合体転写物が初期原腸胚において蓄積し始める。原腸形成および神経胚形成期間中、発現は継続するが、神経胚形成期間中に発現は低下する。重要なことに、サーベラスの発現は、コーディン（chordin）の発現から約１時間たってから開始し、サーベラスがコーディンシグナルの下流に作用しうることが示唆される。形成体のサーベラスドメインは大部分の形成体前部細胞のリーディングエッジを含んでおり、側中部胚葉中に伸長している。リーディングエッジは肝臓、膵臓および前腸をそのミッドラインに形成し、より側方の領域は発達の後期段階において心臓中胚葉を生じる。好ましい具体例において、組成物は、配列番号：２のアミノ酸１、１８ないし２４、４１、８５ないし９１、または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２７２で終了するアミノ酸配列；あるいは配列番号：８のアミノ酸１、１８ないし２５、４１、８５ないし９１、または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２６７で終了するアミノ酸配列を有する蛋白を含んでいてもよい。１の具体例において、本発明方法は、インビボにおいて組成物を患者に投与することを含む。別法として、本発明方法は、インビトロにおいて組成物を細胞に投与し、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織を回復させることを含む（ついで、それらを患者に投与してもよい）。本発明は、サーベラス蛋白ファミリーの新規メンバーをコードする新規ＤＮＡ配列も提供する。特別な具体例において、本発明は、ネズミおよびヒトのサーベラスのごとき哺乳動物サーベラス蛋白をコードする新規ＤＮＡ配列を提供する。ヌクレオチド配列、およびこれらのＤＮＡ配列によりコードされる対応アミノ酸配列を配列表に示す。詳細には、本発明は、配列番号：１のヌクレオチド５８、１０９、１７８、３１３、３１９、３２２、３２５、３２８、または５４１から開始し、ヌクレオチド７８０または８７３で終了するヌクレオチド；配列番号：７のヌクレオチド１、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、１２１、２５６、２５９、２６２、２６５、２６８、２７１、または４８４から開始し、ヌクレオチド７２３または８０１で終了するヌクレオチド；あるいは配列番号：２のアミノ酸１、１８ないし２４、４１、８５ないし９１、または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２７２で終了するアミノ酸をコードするヌクレオチド；あるいは配列番号：８のアミノ酸１、１８ないし２５、４１、８５ないし９１、または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２６７で終了するアミノ酸をコードするヌクレオチド、ならびに上記のものから容易に得ることのできる上記配列のフラグメントおよび変種であってサーベラス活性を維持しているものを包含する。さらに本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でこれらの配列にハイブリダイゼーションする配列であってサーベラス活性を示す蛋白をコードしている配列を包含する。ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現される呻乳動物サーベラス蛋白は、種々のＮ末端を有するサーベラス蛋白の活性種の混在集団として存在する。一部には、Von Heginjeシグナルペプチド推定アルゴリズムに基づけば、最初の１７ないし２４個のアミノ酸は成熟ペプチド分泌のシグナリングに関与していると思われる。活性種はシグナルペプチドを含んでいてもよく、配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸残基１、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５から開始するアミノ酸配列を含んでいてもよいと考えられる。よって、活性哺乳動物サーベラス蛋白をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７または１３０から７８０または８７３までのヌクレオチド；配列番号：７のヌクレオチド１、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０または７３から７２３または８０１までのヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を包含すると考えられる。したがって、サーベラス様蛋白の活性種は、配列番号：２のアミノ酸１、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５から２４１または２７２まで；あるいは配列番号：８のアミノ酸１、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５から２４１または２６７までを含む蛋白を包含すると考えられる。さらに本明細書にて説明するように、サーベラスおよびサーベラス様蛋白は細胞により蛋白分解的にプロセッシングされてさらなる活性種を商事うる。例えば、開裂される推定蛋白分解プロセッシング部位は配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸３７ないし４０および８２ないし８５において見いだされ、典型的には、それらは式Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒにより特徴づけられる。よって、活性哺乳動物サーベラス蛋白をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド１７８または３１３からヌクレオチド７８０または８７３までのヌクレオチドを含むＤＮＡ配列；および配列番号：７のヌクレオチド１２１または２５６からヌクレオチド７２３または８０１までのヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を包含すると考えられる。したがって、サーベラス様蛋白のさらなる活性種は、配列番号：２のアミノ酸４１または８６から開始し、アミノ酸２４１または２７２で終了するアミノ酸を含む蛋白；あるいは配列番号：８のアミノ酸４１または８６から開始し、アミノ酸２４１または２６７で終了するアミノ酸を含む蛋白を包含すると考えられる。上記配列番号：１および配列番号：２の配列を用いて、ヒトサーベラス様ＤＮＡおよびアミノ酸配列を単離し、配列決定する。さらなる具体例において、本発明は、遺伝子調節の変化を必要とする患者において遺伝子調節を変化させる方法を含み、該方法は、該患者に有効量の上記組成物を投与することを含む。ニューロン遺伝子の調節の変化は、サーベラス蛋白により、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ類）を包含する受容体蛋白の結合を刺激または抑制することにより行われうる。よって、哺乳動物サーベラスおよびサーベラス様蛋白ファミリーは、神経、骨、軟骨および他の組織の形成を誘導しうる。哺乳動物サーベラスおよびサーベラス様蛋白ファミリーは、それらが結合する受容体分子（ＢＭＰファミリーの分子を包含）の活性を抑制、増大させることができ、あるいはまたこれらの活性に影響することができる。他の具体例において、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された上記ＤＮＡ分子を含むベクター、ならびにこれらのベクターで形質転換された宿主細胞を含む。さらなる他の具体例において、本発明は、精製哺乳動物サーベラス蛋白、新規哺乳動物サーベラス蛋白、および哺乳動物サーベラス蛋白を含有する組成物の製造方法を含む。これらの方法は、上記のような哺乳動物サーベラス蛋白をコードするＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで、培地から該哺乳動物サーベラス蛋白を回収し精製することを含む。さらに本発明は、上記方法により製造される精製哺乳動物サーベラスポリペプチド、ならびに上記ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を含む精製哺乳動物サーベラスポリペプチドを含む。本発明蛋白は、配列番号：２のアミノ酸１、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、８６、８７、８８、８９、９０、９１または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２７２で終了するアミノ酸配列；配列番号：８のアミノ酸１、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、８６、８７、８８、８９、９０、９１または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２６７で終了するアミノ酸配列；あるいは約２０〜３０ｋｄの分子量を有する哺乳動物サーベラス蛋白であって配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸配列に対して高度に相同的なアミノ酸配列を含み、かつ１またはそれ以上の遺伝子の転写を調節する能力を有する蛋白を含んでいてもよい。活性サーベラス様蛋白の１の種は、配列番号：２のアミノ酸１８から２７２までのアミノ酸配列を含む成熟ペプチド；または配列番号：８のアミノ酸１８から２６７までのアミノ酸配列を含む成熟ペプチドであり、それぞれ、約２８.６ｋＤの分子量を有すると考えられる。活性サーベラス様蛋白のもう１つの種は、配列番号：２のアミノ酸８６ないし９１から開始し、アミノ酸２７２で終了するアミノ酸配列、特に、配列番号：２のアミノ酸１８または９０から２７２までのアミノ酸配列、あるいは配列番号：８のアミノ酸８６ないし９１から開始し、アミノ酸２６７で終了するアミノ酸配列、特に、配列番号：８のアミノ酸１８または９０から２６７までのアミノ酸配列を含む開裂されたペプチドである。これらの各蛋白の成熟ポリペプチドは約２０.７ｋＤの分子量を有すると考えられる。配列の説明配列番号：１は、哺乳動物サーベラスＤＮＡ、特に、ネズミのサーベラスＤＮＡのヌクレオチド配列である。配列番号：２は、配列番号：１によりコードされる哺乳動物サーベラス蛋白のアミノ酸配列である。配列番号:３から５までは、サーベラスおよびサーベラス様蛋白に対するプローブのコンセンサスヌクレオチド配列である。配列番号：６は、ヒトサーベラス様蛋白をコードするゲノムＤＮＡ配列である。「Ｎ」は、ヌクレオチド残基がＡ、Ｃ、ＴまたはＧのいずれであってもよいことを示す。配列番号：７は、ヒトサーベラス様蛋白をコードするｃＤＮＡ配列である。配列番号：８は、配列番号：７によりコードされるヒトサーベラス様蛋白のアミノ酸配列である。ＡＴＣＣ寄託物の説明配列番号：１に示す哺乳動物サーベラスコーディング配列を含むpGIMCCerbで形質転換されたE.coli DH5α株を、12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 にあるAmerican Type Culture Collectionに寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８３４７を付与された。発明の詳細な説明本明細書の用語「サーベラス」または「サーベラス様」は、両方とも、サーベラスおよびサーベラス様蛋白を含む蛋白ファミリーを命名するのに用いる。「サーベラスまたはサーベラス様蛋白」は、ネズミもしくはヒトのサーベラス蛋白、または哺乳動物サーベラス蛋白のＣ末端部分の高度に保存されたシステインパターンに対する配列相同性を有する他の蛋白のごとき、哺乳動物のサーベラスおよびサーベラス様蛋白をいう。サーベラス蛋白ファミリーの１の特別なメンバーは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するネズミサーベラス蛋白、ならびに他の種において見いだされるこの蛋白のホモログ；ならびにネズミサーベラスに対して構造的および／または機能的に密接に関連した他の蛋白である。サーベラス関連蛋白は、アフリカツメガエル、およびショウジョウバエ、C．elegans、ゼブラフィッシュ、ならびに例えばラット、マウスおよびヒトのようなすべての哺乳動物を包含する他の種においても存在するとも考えられる。「サーベラスまたはサーベラス様蛋白」は、サーベラス蛋白の変種、例えば、サーベラス活性を保持する対立遺伝子変種または突然変異もしくは欠失により誘発された変種、ならびにサーベラス活性を保持するサーベラス蛋白のフラグメントも包含する。「サーベラスまたはサーベラス様蛋白」は、さらに本明細書にて説明される蛋白を包含する、構造的および／または機能的類似性を有する蛋白のファミリーを命名するのにも用いられる。本明細書の用語「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、本発明の哺乳動物サーベラス様蛋白により示される１またはそれ以上の活性をいう。詳細には、「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、ニューロンおよび／または脳細胞、Sc hwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の形成、成長、増殖、分化、維持の促進および／または抑制を誘導する能力を包含する。「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、ＯＴＸ２、Ｎ−ＣＡＭ、ＭＡＳＨ、クロマグラニン、およびＡＰ２のごときニューロエンドクリンまたは外胚葉組織の分子マーカーを誘導する能力、ならびにニューロンおよび／または脳細胞、 Schwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の形成を誘導する能力をも包含する。さらに「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、リガンドおよびそれらの蛋白受容体の相互作用を調節する能力を包含する。例えば、「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ類）および／またはｗｎｔ蛋白ファミリーの１またはそれ以上のメンバーに結合し、そのことにより、かかる分子の活性を阻害、増大させ、あるいは影響を与える能力を包含する。さらに「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、他の細胞および／または組織、例えば、結合組織、器官の形成、分化、増殖および／または維持を調節する能力、ならびに創傷治癒能力を包含する。詳細には、「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、心臓、脾臓、肝臓、膵臓、胃、腎臓、胚および脳の細胞および組織、ならびに骨芽細胞および骨、軟骨細胞および軟骨、腱、表皮および筋肉の形成、成長、増殖、分化および／または維持を促進および／または抑制する能力を包含する。「サーベラスまたはサーベラス様活性」は、実施例および明細書に記載するアッセイにおけるサーベラスまたはサーベラス様蛋白の活性も包含する。サーベラスまたはサーベラス様ｃＤＮＡは、診断ツールとして有用なはずである（例えば、細胞系における蛋白のアッセイにおいて抗体を使用することによる診断、あるいはオリゴヌクレオチドプライマーに対して配列類似性を有するオリゴヌクレオチドを増幅し、どの程度の量のサーベラスが存在するのかを決定するためのＰＣＲ試験においてプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用することによる診断）。サーベラスは、それ自身の受容体を介してその標的細胞に対して作用しうる。それゆえサーベラスは、そのような受容体の単離に有用でありうる。さらに、サーベラスまたはその受容体は、特定の腫瘍タイプの診断プローブとして有用であることがわかるはずである。よって、サーベラス、その受容体、またはぞれのいずれかに対する抗体は、臨床的に有用でありうる有効なアゴニストまたはアンタゴニストでありうる。さらに、サーベラスおよびその受容体の複合体、サーベラスおよびそれに対する抗体の複合体、またはサーベラス受容体およびそれに対する抗体の複合体は、それぞれ、多くのインビトロ、エクスビボまたは臨床的使用において有用でありうる。また本発明は、サーベラス活性を保持する、配列番号：２に示す哺乳動物サーベラス蛋白のアミノ酸配列の蛋白変種および機能的フラグメントも包含する。また本発明は、上記したような精製哺乳動物サーベラス蛋白に対する抗体も包含する。本発明組成物は、治療量の少なくとも１種の上記哺乳動物サーベラス蛋白を含む。サーベラスまたはサーベラス様蛋白のかかる蛋白変種および機能的フラグメントは、配列番号：２のアミノ酸配列に対して有意な相同性を有するアミノ酸配列、最も好ましくは少なくとも８０％または９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を包含すると考えられる。サーベラス様活性を保持する変種および機能的フラグメントは、配列番号：２において見られるシステインパターンを保持するものを包含すると考えられる。例えば、配列番号：２のアミノ酸１６２から２４１まで、あるいは配列番号：８のアミノ酸１６２から２４１までを含む末端切断ポリペプチドは、それそれ、配列番号：２および配列番号：８のサーベラスおよびサーベラス様配列のカルボキシ末端部分に見いだされる全部で９個のシステインからなるパターンを保持している。さらにもう１つの具体例において、本発明は、遺伝子調節の変化を必要とする患者において遺伝子調節を変化させる方法を含み、該方法は、有効量の上記組成物を該患者に投与することを含む。例えば、受容体蛋白の結合を刺激または阻害することにより神経遺伝子の調節の変化を行ってもよく、そのような結合は、例えば、哺乳動物サーベラス蛋白とその受容体蛋白（例えば、ｗｎｔ蛋白またはＢＭＰ蛋白）との間の結合である。よって、サーベラス蛋白は、リガンドとそれらの受容体蛋白との結合相互作用、ならびに細胞に対する転写因子の相互作用を調節する能力を有する可能性がある。また本発明は、プロモーターまたオペレーターのごとき組織特異的または誘導可能な調節配列に連結された、本発明コーディングＤＮＡ配列および他のサーベラスコーディング配列を含むハイブリッドまたは融合ベクターも包含する。本発明の好ましい具体例において、哺乳動物サーベラス様蛋白のコーディング配列が、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織において選択的に発現される遺伝子由来の１またはそれ以上のプロモーター、エンハンサーおよび／または他の調節エレメントに、作動可能に連結される。例えば、星状細胞およびニューロン細胞において発現されることが知られているＧＦＡＰ遺伝子のプロモーター、および前脳において「発現されることが知られているＯＴＸ２遺伝子のプロモーターが、サーベラスの組織特異的産生に適している。さらに、哺乳動物サーベラスをコードするＤＮＡ配列を、ＧＦＡＰまたはＯＴＸ２蛋白、ならびにニューロンおよび／またはSchwann 細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織において選択的に産生される他の蛋白由来の１またはそれ以上の調節配列に作動可能に連結してもよい。本発明の他の好ましい具体例において、哺乳動物サーベラス様蛋白のコーディング配列が、対象とする他の遺伝子、器官または細胞から単離されたプロモーターに作動可能に連結される。他の組織選択的調節エレメントおよび誘導可能エレメントを用いたベクターも、本発明の哺乳動物サーベラス様蛋白の選択的または誘導可能な発現に有用である。本発明のもう１つの態様は、医薬上許容される賦形剤または担体中の治療上有効量の呻乳動物サーベラス蛋白を含有する医薬組成物を提供する。本発明のこれらの組成物を、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき神経細胞および組織、ならびに肝臓、膵臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、胃、心臓組織および細胞、ならびに骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、腱細胞、表皮細胞および脂肪細胞の形成に使用してもよい。さらにこれらの組成物を用いて、骨、骨芽細胞、軟骨、軟骨細胞、ベータ細胞およびランゲルハンス島に典型的に見出される他の細胞タイプ、または他の膵臓細胞、ならびに肝臓、脾臓、脳、心臓および腎臓組織のごとき他の器官の組織の形成、成長、増殖、分化および／または維持を促進および／または抑制してもよい。哺乳動物サーベラス様蛋白を含む組成物を用いて、分化した組織または器官を構成する細胞（例えば膵臓細胞）へと分化しうる前駆細胞または膵臓幹細胞のごとき幹細胞を処理して、かかる細胞、組織または器官の形成、分化、増殖および／または維持を促進してもよい。かかる細胞の形成および維持方法は、例えば、ＷＯ９３／００４４１に記載されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。さらに、組成物を用いて、例えば、胚性細胞および組織の内胚葉表現型への発達に影響させることにより、胚の発達を調節してもよい。本発明組成物は、哺乳動物サーベラス様蛋白のほかに、表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、アクチビン、インヒビン、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき成長因子を包含する治療上有用な作用剤を含んでいてもよい。組成物は適当なマトリックス、例えば、組成物を支持し、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき神経細胞および組織の成長、または他の組織もしくは細胞の増殖のための表面を提供するためのマトリックスを含んでいてもよい。マトリックスは、哺乳動物サーベラス様蛋白を除々に放出させるものであってもよく、さらに／あるいは哺乳動物サーベラス様蛋白提供のための適当な環境を提供するものであってもよい。哺動物サーベラス様蛋白含有組成物を、多くの組織欠損の治療方法、ならびに種々のタイプの組織および創傷の治癒および維持方法に使用してもよい。治療可能な組織および創傷は、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき神経細胞および組織を包含しうる。心臓、肝臓、膵臓、脾臓、肺、腎臓、脳および胃の組織も包含され、軟骨、表皮、筋肉（心筋を包含）、骨、腱および靭帯のごとき他の結合組織、および他の組織および創傷も包含される。本発明のこれらの方法は、かかる組織の形成、創傷の治癒または組織の修復を要する患者に有効量の哺乳動物サーベラス蛋白を投与することを含む。哺乳動物サーベラス様蛋白含有組成物を用いて、パーキンソン病、アルツハイマー病およびロウ・ゲーリッヒ病のごとき変性的な神経の症状、ならびに他の変性的な神経の疾病、および神経組織の欠損を包含する他の症状を治療または予防することができる。組成物は、骨粗鬆症、リューマチ性関節炎、骨関節炎のごとき他の症状、結合組織の他の異常、または筋肉、膵臓、肝臓、脾臓、肺、心臓、脳および腎臓の組織のごとき他の器官または組織の異常の治療にも有用でありうる。これらの方法は、本発明蛋白を少なくとも１種の他の蛋白、例えばＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ、Ｗｎｔ、ヘドゲホグス（hedgehogs）（インディアンおよびデザートヘドゲホグスを包含）、アクチビン、インヒビンおよびＩＧＦのごとき成長因子と組み合わせて投与することを含んでもよい。本発明の特別な具体例において、哺乳動物サーベラス様遺伝子または蛋白を用いてＢＭＰ類またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの活性を増大させてもよい。本発明のさらなる態様は、哺乳動物サーベラス様蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１または配列番号：７において５’ から３’方向へと示されるヌクレオチド配列を包含するが、遺伝コードの縮重を除いては配列番号：１または配列番号：７のＤＮＡ配列と同一であり、配列番号：２または配列番号：８の蛋白をコードするＤＮＡ配列も包含される。ストリンジェントな条件下で配列番号：１または配列番号：７のＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションし、サーベラス様活性を有する蛋白をコードするＤＮＡ配列も本発明に包含される。好ましいＤＮＡ配列は、ストリンジェントな条件下[T.Maniati s et al，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Labo ratory (1982),387〜389ページ参照]でハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を包含する。かかるＤＮＡ配列が、配列番号：２または配列番号：８に示す成熟哺乳動物サーベラス様アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドをコードしていることが一般的に好ましい。結局、配列番号：１または配列番号：２の配列の対立遺伝子変種または他の変種は、かかるヌクレオチド変化がペプチド配列の変化を引き起こすか否かにかかわらず、そのペプチド配列がやはりサーベラス様活性を有している場合には、本発明に包含される。また本発明は、サーベラス様蛋白の活性を保持しているポリペプチドをコードする、配列番号：１または配列番号：７に示す哺乳動物サーベラス様蛋白のＤＮＡ配列の機能的フラグメントを包含する。配列番号：２または配列番号：８に示される本発明哺乳動物サーベラス様蛋白の特定の変種またはフラグメントがサーベラス様活性を維持しているかどうかを調べることは、本明細書記載のアッセイを用いて通常的に行われる。本発明ＤＮＡ配列は、例えば、細胞集団中の他のサーベラス様蛋白をコードするｍＲＮＡの検出のためのプローブとして有用である。本発明ＤＮＡ配列は、後で説明する遺伝子治療用ベクターの調製にも有用である。本発明のさらなる態様は、発現制御配列に作動可能に結合した上記ＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。本発明の組み換え哺乳動物サーベラス様蛋白の新規製造方法にこれらのベクターを使用してもよく、該方法において、発現制御配列に作動可能に結合された哺乳動物サーベラス様蛋白をコードするＤＮＡ配列で形質転換された細胞系が適当な培地で培養され、哺乳動物サーベラス様蛋白が培地から回収され、精製される。この方法は、ポリペプチド発現用宿主細胞として、よく知られた多くの原核細胞および真核細胞の両方を使用することができる。ベクターを遺伝子治療用途に使用してもよい。かかる使用において、ベクターをエクスビボにおいて患者の細胞中にトランスフェクションし、細胞を患者に再導入してもよく、あるいはベクターをインビボにおいて標的化トランスフェクションにより患者に導入してもよい。別法として、ゲノム中の本明細書開示のサーベラスコーディング配列の近くに高発現調節エレメントを挿入することにより、相同的サーベラス遺伝子発現をアップレギュレートしてもよい。本発明の好ましい具体例において、哺乳動物サーベラス様のコーディング配列に作動可能に結合したプロモーターおよび／またはエンハンサーのごとき１またはそれ以上の本来的なものでない調節エレメントを用いてベクターを調製して、所望細胞組織において、および／または発達中の所望時期において、哺乳動物サーベラス様蛋白を発現させる。例えば、ニューロン発達中に構成的に発現されることが知られている遺伝子由来のプロモーターエレメントを用いてベクターを構築してもよい。適当な遺伝子由来のプロモーターをサーベラス様のコーディング配列に作動可能に結合させ、ニューロン幹細胞のごとき適当な細胞を形質転換することにより、これらの細胞において哺乳動物サーベラス様蛋白を発現させることができ、かくして、ニューロンのごとき細胞および／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき他の細胞および組織の形成、成長、増殖、分化および／または維持についての所望の効果をインビトロまたはインビボのいずれかにおいて促進することができる。本発明のさらなる態様は哺乳動物サーベラス様蛋白またはポリペプチドである。かかるポリペプチドは、配列番号：２または配列番号：８に示す配列を含むアミノ酸配列、あるいは天然に存在する対立遺伝子変種ならびにサーベラス様の能力、例えば、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき神経細胞および組織の形成、成長、増殖、分化および／または維持を促進および／または抑制する能力を有し、膵臓、肝臓、胃、心臓の組織または骨、骨細胞、軟骨細胞および／または軟骨組織のごとき他の組織、または脾臓、肺、脳および腎臓組織のごとき他の器官組織に影響しうるサーベラス様蛋白に特徴的な能力を保持している他の蛋白変種を包含する配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸配列の変種を有することにより特徴づけられる。好ましいポリペプチドは、配列番号：２および配列番号：８に示す成熟サーベラス様アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有するポリペプチドを包含する。結局、配列番号：２または配列番号：８の配列の対立遺伝子変種または他の変種は、かかるアミノ酸変化が突然変異、化学的変換、あるいはポリペプチド作成のためのＤＮＡ配列の変更によってなされたものであるかどうかにかかわらず、ペプチド配列がやはりサーベラス様活性を有しているかぎり、本発明に包含される。また本発明は、サーベラス様蛋白の活性を保持している、配列番号：２または配列番号：８に示す哺乳動物サーベラス様のアミノ酸配列のフラグメントも包含する。当業者は、当該分野で知られた方法を用いて哺乳動物サーベラス様蛋白のかかる変種およびフラグメントを容易に得ることができ、本明細書実施例に記載のごとくそれらの活性を容易にアッセイすることができる。本発明の精製蛋白を用い、当該分野で知られている抗体生成法を用いて、哺乳動物サーベラス様蛋白および／または他の関連蛋白に対するモノクローナルまたはポリクローナルな抗体を得てもよい。よって、本発明は、哺乳動物サーベラスおよび／または他のサーベラス様蛋白に対する抗体も包含する。抗体は、哺乳動物サーベラス様蛋白の精製、あるいはインビトロまたはインビボでサーベラス蛋白の効果を抑制または防止することに有用でありうる。哺乳動物サーベラス様蛋白は、胚性細胞および／または幹細胞の成長および／または分化の誘導に有用でありうる。よって、本発明蛋白または組成物は、胚性細胞または幹細胞のごとき細胞集団を処理して細胞の成長および／または分化を促進、豊富化または抑制することに有用でありうる。例えば、哺乳動物サーベラス様蛋白は、細胞集団を処理して、ニューロンおよび／またはSchwann細胞のごとき関連神経細胞および組織を形成、分化、増殖および／または維持を促進および／または抑制することに有用でありうる。処理された細胞集団は、とりわけ、後で説明する遺伝子治療用途に有用でありうる。よって、本発明蛋白は、創傷の治癒、組織および器官の修復および再生プロセス、ならびに組織の分化、例えば、胚の発達において有用でありうる。特に、哺乳動物サーベラス様蛋白を用いてニューロンおよび／または Schwann細胞のごとき関連神経細胞および組織を形成、分化、増殖および／または維持を誘導できることが、本発明者により観察されている。通常には、サーベラス様蛋白は分泌蛋白として存在し、ニューロンおよび他の神経細胞および組織タイプの成長および分化に影響することが示されている。よって、これらの蛋白およびそれらを含有する組成物は、パーキンソン病、アルツハイマー病のごとき神経および脳の疾病の治療において、および細胞の形成、成長、分化、増殖および／または維持の促進および／または抑制、例えば、ニューロンおよび／または Schwann細胞のごとき関連神経細胞および組織の形成において有用でありうる。本発明の哺乳動物サーベラス様蛋白は、配列番号：１または配列番号：７の配列に類似した配列によりコードされる因子を包含するが、該因子中には天然に存在する（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸変化を引き起こしうるヌクレオチド配列中の対立遺伝子変異）あるいは人工的に作成されたした修飾または欠失が存在している。例えば、合成ポリペプチドが、配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸残基の一連の配列を全体的または部分的に複製したものであってもよい。これらの配列は、一次、二次、または三次構造およびコンホーメーション的特質を配列番号：２または配列番号：８の哺乳動物サーベラス様ポリペプチドと共有することによって、それらに共通した生物学的特性を有する可能性がある。よって、本来の哺乳動物サーベラス様ポリペプチドの修飾および欠失体を、治療プロセスにおいて天然の哺乳動物サーベラス様ポリペプチドの生物学的活性置換体として用いてもよい。哺乳動物サーベラス様蛋白および哺乳動物サーベラス様蛋白変種またはフラグメントを本明細書記載のアッセイに供することにより、哺乳動物サーベラス蛋白変種またはフラグメントがサーベラスの生物学的活性を有しているかどうかを容易に決定することができる。本明細書記載の哺乳動物サーベラス様蛋白配列の他の特別な変異は糖鎖付加部位の修飾を包含する。これらの修飾はＯ−結合またはＮ−結合糖鎖付加部位を含むものであってもよい。例えば、糖鎖付加の不存在またはごく部分的な糖鎖付加は、アスパラギン結合糖鎖付加認識部位の置換または欠失により生じる。アスパラギン結合糖鎖付加認識部位は、適当な細胞の糖鎖付加酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン− Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンであり、通常にはＸはいずれかのアミノ酸である。糖鎖付加認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換または欠失（および／または２番目の位置におけるアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列において糖鎖付加を生じさせない。かかる哺乳動物サーベラス様蛋白の変種は本発明の範囲内である。さらに、哺乳動物サーベラス様蛋白の細菌による発現は、糖鎖付加部位が未修飾であっても、糖鎖付加されていない蛋白を生じるであろう。哺乳動物サーベラス様蛋白の、かかる細菌により産生されたバージョンは本発明の範囲内である。また本発明は、他の蛋白性物質をコードするＤＮＡ配列が結合しておらず、哺乳動物サーベラス様蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列をも包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１または配列番号：７に５’から３’方向に示したＤＮＡ配列ならびにストリンジェントな条件下(例えば、0.1X SSC,0.1% S DS，65℃;T.Maniatisetal,Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spri ng HarborLaboratory(1982)，387-389ページ参照）でそれらにハイブリダイゼーションする配列であってサーベラス様活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。これらのＤＮＡ配列もまた、配列番号：１または配列番号：７のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列、ならびにストリンジェントな条件下でそれらにハイブリダイゼーションし、サーベラス様活性を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列を包含する。同様に、配列番号：１または配列番号：７の配列によりコードされる哺乳動物サーベラス様蛋白をコードするＤＮＡ配列、あるいは配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸配列を含む哺乳動物サーベラス様蛋白をコードするＤＮＡ配列は、遺伝学的コードの縮重または対立遺伝子変異（種の集団中における天然に存在する塩基変化であり、アミノ酸変化を生じさせる者であっても、生じさせないものであってもよい）によりコドン配列が異なっていても、本明細書記載の新規因子をコードする。コードされるポリペプチドの活性、半減期または産生を増大させるための点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換を包含）により引き起こされる配列番号：１または配列番号：７のＤＮＡ配列における変異も本発明に包含される。本発明のもう１つの態様は、哺乳動物サーベラス様蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、本発明の哺乳動物サーベラス様蛋白をコードするＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を、調節配列の制御下において培養することを含む。形質転換宿主細胞を培養して、哺乳動物サーベラス様蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の混入物質を実質的に含まない。適当な細胞または細胞系はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞ならびに形質転換、培養、増幅、スクリ−ニング、生成物の製造および精製方法の選択は当該分野において知られている。例えば、Gething and Sambrook,Nature,293:620-625(1981) あるいはKaufman et al,Mol ．Cell．Biol.,5(7):1750-1759(1985)またはHowley らの米国特許第4,419,446号参照。もう１つの適当な哺乳動物細胞系は本明細書の実施例に記載されているサルＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当であるかもしれない。細菌細胞も適当な宿主であるかもしれない。例えば、種々のイー・コリ株（例えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B．subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他のバチルス等をこの方法に使用してもよい。細菌細胞における蛋白の発現には、一般的には、サーベラス様のプロペプチドをコードするＤＮＡは必要ない。当業者に知られた多くの酵母細胞株も、本発明ポリペプチド発現のための宿主細胞として利用できる。さらに、所望ならば、本発明方法において昆虫細胞を宿主として用いてもよい。例えば、Miller et al,Genetic Engineering,8:277-298 (Plenum Press 1986)およびその中で引用された文献参照。本発明のもう１つの態様は、これらの新規哺乳動物サーベラス様ポリペプチドの発現方法に使用するベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明新規因子をコードする上記の新規ＤＮＡ配列の全長を含む。さらに、ベクターは、サーベラス様蛋白配列の発現を可能にする適当な発現制御配列を含む。あるいはまた、上記修飾配列を含むベクターも本発明の具体例である。さらに、哺乳動物サーベラス様プロペプチド配列を欠失させ、他のサーベラス様蛋白の完全プロペプチドをコードする配列または他の適当なプロペプチドをコードする配列に置き換えることにより、配列番号：１または配列番号：７の配列または哺乳動物サーベラス様蛋白をコードする他の配列を処理して、成熟哺乳動物サーベラス様蛋白を発現させることもできる。よって、本発明は、哺乳動物サーベラス様ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に正しい読み枠において結合している、サーベラス様ファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードするキメラＤＮＡ分子を包含する。ベクターを細胞系の形質転換法に使用してもよく、ベクターは、選択された宿主における複製および発現を指令しうる、本発明コーディング配列に作動可能に結合された調節配列を含む。かかるベクターの調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択できる。かかる選択は通常のことであり、本発明の一部を形成しない。ラット、ヒトまたは他の哺乳動物のサーベラス様蛋白を製造するために、それをコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に移行させ、慣用的な遺伝子工学的手法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞または原核細胞宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換え哺乳動物サーベラス様蛋白を得るための好ましい発現系は安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。当業者は、配列番号:１、配列番号:７の配列、またはサーベラス様蛋白をコードする他のＤＮＡ配列または他の修飾配列ならびにｐＣＤ（Okayama et al.,Mol ．Cell Biol.,2:161-170(1982)）、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４（Gough et al.，EMBO J . ,4:645-653(1985)）およびｐＭＴ２ＣＸＭのごとき既知ベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ＣＸＭはｐ９１０２３（ｂ）（Wong et al.， Science 228:810-815,1985）の誘導体であり、テトラサイクリン耐性遺伝子のかわりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためのＸｈｏＩ部位を含むことにおいて異なっている。ｐＭＴ２ＣＸＭの機能的エレメントは記載されており（Kaufman，R.J.，1985，Proc．Natl．Acad．Sci．USA82: 689-693）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０複製開始点、５’スプライス部位およびアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス大後期プロモーター、３’スプライスアクセプター部位、ＤＨＦＲインサート、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、ならびにイー・コリ（E．coli）中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。受託番号ＡＴＣＣ６７１２２としてthe American Type Culture Collection ( ATCC),Rockville,MD(USA)に寄託されたｐＭＴ−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２ＣＸＭを得る。ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ２−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡインサートを切り出し、ｐＭＴ２を直鎖状とし、それをライゲーション（ligation）し、これを用いてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換してアンピシリン耐性とすることができる。慣用的方法によりプラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを調製することができる。ついで、ループアウト／イン突然変異(Morinaga，et al.,Biotechnology 84:636(1984)）を用いてｐＭＴ２ＣＸＭを構築する。これにより、ＳＶ４０複製開始点およびｐＭＴ２エンハンサー配列の近傍のＨｉｎｄＩＩＩ部位に対応した塩基１０７５〜１１４５が除去される。さらに、下記配列：をヌクレオチド１１４５に挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ認識部位を含む。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、Ｅｃｏ１ＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を含む。慣用的方法によりプラスミドｐＭＴ２ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡを調製してもよい。ｐＭＴ２１に由来するｐＥＭＣ２β１は本発明の実施に適するかもしれない。ｐＭＴ２１はｐＭＴ２に由来し、ｐＭＴ２はｐＭＴ２−ＶＷＦに由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡインサートを切り出し、ｐＭＴ２を直鎖状とし、これをライゲーションし、これを用いてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ５を形質転換させてアンピシリン耐性とすることができる。慣用的方法によりプラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを調製することができる。ｐＭＴ２１は下記の２つの修飾によりｐＭＴ２に由来するものである。第１は、ｃＤＮＡクローニング用のＧ／Ｃテイリング由来の１９個のＧ残基の伸長部分を含む、７６ｂｐのＤＨＦＲｃＤＮＡ５’非翻訳領域が欠失されている。このプロセスにおいて、ＸｈｏＩ部位が挿入されてＤＨＦＲのすぐ上流に下記配列：が得られる。第２は、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩ消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、およびＣｌａＩリンカー（CATCGATG）へのライゲーションにより単一のＣｌａＩ部位が導入されている。これにより、２５０ｂｐのセグメントがアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩＲＮＡ遺伝子発現または機能は妨げられない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌで消化して、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために使用する。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部をｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１（S K.Jung,et al,J.Virol 63:1651-1660(1989)）から得て、２７５２ｂｐのフラグメントを生じさせる。このフラグメントをＴａｑＩで消化して、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得て、これを低融点アガロースゲル電気泳動により精製する。下記の配列：を有する６８ｂｐのアダプターおよびその相補鎖を合成する。これは５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端を有する。この配列はＥＭＣウイルスリーダー配列のヌクレオチド７６３から８２７までに合致する。また、ＥＭＣウイルスリーダー中の位置１０のＡＴＧがＡＴＴに変化しており、その後にＸｈｏＩ部位がある。ｐＭＴ２１ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑＩ−ＸｈｏＩアダプターのスリーウェイライゲーション（three way ligation）によりベクターｐＥＭＣ２β１が得られる。このベクターは、哺乳動物細胞において所望ｃＤＮＡを高レベルで発現させるように適切に関連づけられたＳＶ４０複製開始点およびエンハンサー、アデノウイルス大後期プロモーター、アデノウイルス三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲおよびβ−ラクタマーゼマーカーならびにＥＭＣ配列を含む。ベクター構築物はヒトサーベラスＤＮＡ配列の修飾を含んでいてもよい。例えば、コーディング領域の５’および３’末端にある非コーディングヌクレオチドを除去することにより哺乳動物サーベラスｃＤＮＡを修飾することができる。欠失された非コーディングヌクレオチドを、発現に有利であることが知られている他の配列に置き換えてもよく、置き換えなくてもよい。これらのベクターを、哺乳動物サーベラス蛋白の発現のために適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、哺乳動物サーベラスコーディングプロペプチド配列を欠失させ、他の蛋白の完全なプロペプチドをコードする配列に置き換えることにより、配列番号：１の配列、哺乳動物サーベラス蛋白をコードする他の配列を加工して成熟哺乳動物サーベラス蛋白を発現させることができる。当業者は、コーディング配列に隣接する哺乳動物調節配列を細菌配列に置換することにより、配列番号：１または配列番号：７の配列を加工して、細菌細胞により細胞内または細胞外発現される細菌ベクターを作成することができる。例えば、コーディング配列をさらに加工することができる(例えば、他の既知リンカーを連結、あるいは非コーディング配列を欠失させることにより修飾、あるいは既知方法によりヌクレオチドを変化させる)。ついで、修飾哺乳動物サーベラスコーディング配列を、T．Taniguchi et al.，Proc ．Natl Acad．Sci．USA，77:5 230-5233(1980)に記載されたような方法を用いて既知細菌ベクター中に挿入することができる。ついで、この典型的な細菌ベクターを細菌宿主中に形質転換し、それにより蛋白を発現させる。哺乳動物サーベラス蛋白を細菌細胞の細胞外で発現させるための方法としては、例えば、欧州特許出願ＥＰＡ第１７７３４３号参照。昆虫細胞での発現のために、同様の操作を行って昆虫ベクターを構築することができる（例えば、出願公開された欧州特許出願第１５５４７６号記載の方法参照）。本発明因子を酵母により細胞内または細胞外発現させるために、酵母の調節配列を用いて酵母ベクターを構築してもよい（例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願ＥＰＡ第１２３２８９号参照）。本発明の哺乳動物サーベラス蛋白を哺乳動物細胞において高レベルで産生させる方法は、異型の哺乳動物サーベラス遺伝子の多数のコピーを含む細胞の構築を包含してもよい。異型遺伝子を増幅可能マーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結し、Kaufman and Sharp，J ．Mol．Biol.，159:60 1-629(1982)の方法に従ってメトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を上昇させつつ増殖させて、増大した遺伝子コピーを含む細胞を選択することができる。例えば、発現を可能にする他のプラスミドの配列に作動可能に結合された本発明の哺乳動物サーベラス蛋白のＤＮＡ配列を含むプラスミドならびにＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［Kaufman and Sharp，Mol ．Cell．Biol . ，2:1304(1982)］を、リン酸カルシウム共沈およびトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト融合を包含する種々の方法により同時にＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞中に導入することができる。透析されたウシ胎児血清を含有するアルファ培地中での選択に関してＤＨＦＲ発現形質転換体を選択し、ついで、Kaufman et al.，Mol Cell Biol.，5:1750(1983)に記載のごとくＭＴＸ濃度を上昇させつつ（例えば、逐次的に０.０２、０.２、１.０、ついで５μ ＭのＭＴＸ）増殖させることにより、増殖に関して選択する。形質転換体をクローン化し、本明細書記載のアッセイの１つにより、生物学的に活性のある哺乳動物サーベラス蛋白の発現をモニターする。哺乳どうぶるサーベラス蛋白発現はＭＴＸレベルの上昇に伴って増大するはずである。[３５Ｓ］メチオニンまたはシステインを用いるパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて哺乳動物サーベラスポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連サーベラス蛋白を得ることができる。サーベラス活性を示す本発明の哺乳動物サーベラス蛋白は、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織、ならびに他の組織のような細胞および組織の形成、成長、分化、増殖および／または維持および治癒に適用される。哺乳動物サーベラス蛋白を用いるかかる調合物は、パーキンソン病、アルツハイマー病の治療、ならびに神経腫瘍および他の神経組織の疾病の予防において予防的使用をしてもよい。ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の、サーベラス蛋白により誘導されるドゥノボ形成は、先天性の、外傷により誘導される、あるいは腫瘍学的な組織欠損または症状の修復に貢献する。哺乳動物サーベラス蛋白を神経の疾病および他の組織および器官の修復プロセスに使用してもよい。かかる作用剤は、適当な幹細胞を誘引する環境を提供し、ニューロン形成細胞の成長および増殖を刺激し、あるいはニューロン形成細胞の前駆細胞の分化を誘導する可能性があり、さらに他の組織および器官の再生を助ける可能性がある。本発明の哺乳動物サーベラスポリペプチドは器官の疾病の治療にも有用でありうる。本発明蛋白を創傷の治癒および関連組織の修復に使用してもよい。創傷のタイプは、熱傷、切り傷および潰瘍を包含するが、これらに限らない(創傷の治癒および関連組織の修復については例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照）。さらに本発明蛋白はニューロン、星状細胞および／またはグリア細胞の生存率を高め、それゆえ、移植ならびにニューロンの生存立および修復の低下を示す症状の治療において有用であると考えられる。さらに本発明蛋白は、神経、表皮、筋肉、骨、軟骨、腱および靭帯のごとき結合組織のごとき他のタイプの組織、ならびに膵臓、肝臓、脾臓、肺、心臓、脳および腎臓組織に関連した症状の治療に有用でありうる。本発明蛋白は食物の添加物として、あるいは細胞培養培地の添加物としても価値を有する。この用途には、蛋白を無傷の状態で使用してもよく、あるいは前消化して、より容易に吸収される添加物としてもよい。本発明蛋白は、サーベラスファミリーの蛋白に特徴的な他の有用な特性も有しうる。かかる特性は、血管形成、化学走性および／または化学誘引特性、および分化応答、細胞増殖応答、および細胞の付着、移動を包含する応答、および細胞外マトリックスに対する影響を包含する。これらの特性は、本発明蛋白を創傷の治癒、繊維症の軽減および瘢痕組織形成の抑制のための有効な作用剤としている。本発明蛋白は、内分泌もしくは外分泌ホルモンを包含する貴重なホルモンを分泌しうる細胞の形成の誘導にも有用でありうる。本発明のさらなる態様は、ニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞および組織の疾病、ならびにニューロン組織および神経組織の疾病または疾患に関連した他の症状の治療方法ならびに治療用組成物である。さらに本発明は、創傷の治癒および組織の修復のための治療方法ならびに組成物を包含する。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体またはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも１種の本発明哺乳動物サーベラス蛋白を含む。さらに本発明組成物はニューロンおよびグリア細胞の生存率を高め、それゆえ、移植ならびにニューロンの生存率低下を示す症状の治療に有用であると考えられる。サーベラスおよびサーベラス様蛋白は、本来的にはホモダイマーまたはヘテロダイマーとして存在しうる。安定性が向上したサーベラス様蛋白のダイマー形成を促進するために、配列番号：１または配列番号：７のＤＮＡ配列を遺伝子操作して、１種またはそれ以上のさらなるシステイン残基を提供し、潜在的なダイマー形成を促進することができる。得られるＤＮＡ配列は、サーベラス様蛋白の「システイン付加変種」を生成しうる。別法として、アミノ酸レベルで蛋白配列を変化させることにより、例えば、１またはそれ以上のアミノ酸残基をＣｙｓに変換することにより、サーベラス様蛋白の「システイン付加変種」を得ることもできる。蛋白の「システイン付加変種」の製造は米国特許第５１６６３２２号に記載されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。本発明蛋白は、他の関連蛋白および成長因子と協奏的に、あるいはおそらく相乗的に作用うしうると考えられる。かかる組み合わせは、サーベラスまたはサーベラス様蛋白および他の蛋白または異なる部分を含む異種分子といった別々の分子を包含する。例えば、本発明方法および組成物は、サーベラス蛋白サブユニットおよび「ＢＭＰ」蛋白の１つから得られるサブユニットを含むジスルフィド結合ダイマーを包含する。よって、本発明は、ヘテロダイマーである精製サーベラス様ポリペプチドを包含し、該ヘテロダイマー中において、１のサブユニットは配列番号：２または配列番号：８のアミノ酸配列を含み、もう１つのサブユニットはＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／１６０３５に開示されたＢＭＰ−１、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２またはＢＭＰ−１３、またはＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／３６７１０に開示されたＢＭＰ−１５または同時係属特許出願第０８／７１５２０２号（１９９６年９月１８日出願）に開示されたＢＭＰ −１６からなる群より選択される骨形態形成蛋白のアミノ酸配列を含む。さらなる具体例は、サーベラス部分からなるヘテロダイマーを含むものであってもよく、例えば、アフリラツメガエルのサーベラス蛋白ならびにアフリラツメガエルのサーベラス蛋白もしくは他のサーベラス様蛋白の哺乳動物ホモログからなるヘテロダイマーを含むものであってもよい。本発明のさらなる治療方法および組成物は、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）を包含するＴＧＦ−βスーパーファミリーの蛋白のメンバー、成長および分化因子（ＧＤＦ）および他の蛋白のごとき少なくとも１種の治療量の他の蛋白と組み合わされた少なくとも１種の治療量の本発明の哺乳動物サーベラス蛋白を含む。組成物は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、アクチビン、インヒビン、およびｋ−繊維芽細胞成長因子（ｋＦＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＨＴ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）のごとき他の作用剤および成長因子を含んでいてもよい。これらの作用剤の一部を本発明に使用してもよい。ｐＨ、等張性、安定性等において生理学的に許容されるかかる蛋白組成物の調製および処方は当業者に明らかである。またサーベラス蛋白における種特異性が欠乏している場合の獣医学的用途にも、本発明治療組成物は目下のところ価値を有する。詳細には、本発明のサーベラス蛋白でのかかる治療に適した対象は、ヒトのほかには家畜およびサラブレッドのウマである。治療方法は、組成物を局所的、全身的、または局部的に、注射または移植のごとき方法で投与することを包含する。投与する場合、本発明に使用する治療組成物は、もちろん、パイロジェン不含で、生理学的に許容される形態である。さらに、望ましくは、組成物をカプセル封入してもよく、あるいは膵臓または他の組織のダメージ部位へのデリバリーのために粘性のある形態として注射してもよい。局所的投与は創傷の治癒および組織の修復に適しているかもしれない。本発明方法において、上記組成物に含有されていてもよいサーベラス蛋白以外の治療上有用な作用剤を、サーベラス組成物のかわりに、あるいはそれに加えて、同時または逐次投与してもよい。移植には、好ましくは、組成物は、哺乳動物サーベラス蛋白をニューロンおよび／またはSchwann細胞、グリア細胞および星状細胞のごとき関連神経細胞または組織、または他の組織の部位にデリバリーすることのできるマトリックスを含み、マトリックスは組織の発達のための構造を提供し、最適には、体内に吸収されうるものである。マトリックスは、哺乳動物サーベラスおよび／または他の蛋白を除々に放出するほか、細胞を浸潤させるために正しく哺乳動物サーベラスを提供し、適切な環境を提供する。かかるマトリックスは、現在他の移植医療に使用されている材料から作られてもよい。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面特性に基づいて行われる。哺乳動物サーベラス組成物の個々の適用により、適切な処方が決定される。例えば形成が望まれる組織量、組織ダメージ部位、ダメージを受けた組織の状態、創傷のサイズ、ダメージを受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別、食事、感染症の重さ、投与期間ならびに他の臨床的要因のごとき哺乳動物サーベラス蛋白の作用を変化させる種々の要因を担当医が考慮することにより、投与規則が決定されるであろう。復元に用いるマトリックスおよび組成物中の哺乳動物サーベラス蛋白のタイプに応じて用量は変更されうる。ＩＧＦＩ（インスリン様増殖因子Ｉ）のごとき他の既知成長因子の添加もまた、用量に影響しうる。組織の成長および／または修復を定期的に評価することにより、進展をモニターすることができる。例えば、Ｘ線、組織形態学的試験およびテトラサイクリン標識により進展をモニターすることができる。下記実施例は、哺乳動物サーベラス蛋白の回収および特徴づけ、および他のサーベラス蛋白を回収するためのＤＮＡの使用、ヒト蛋白の取得、ならびに組み換え法による蛋白の発現における、本発明の実施を説明する。記載された材料および方法についての多くの変更が可能であり、それらは本発明の範囲内であると認識されよう。実施例１：アフリカツメガエルサーベラスのネズミホモログのクローニングアフリカツメガエルのサーベラスのカルボキシ末端のシステイン豊富ドメインを用いて、GENBANKにおいて報告された哺乳動物ライブラリーおよびＥＳＴをスクリーニングした。アフリカツメガエルのサーベラスに対する配列相同性により、Beddington７.５日胚領域ライブラリー由来のＥＳＴＡＡ１２０１２２が同定された。その部分クローンは分子のＮ末端における配列保存性はほとんど有していなかったが、Ｃ末端ドメインならびに特に９個のシステインのパターンは配列保存性を示した。ネズミサーベラス様蛋白をコードする全長ｃＤＮＡをネズミ胚性細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離し、その遺伝子をネズミゲノムライブラリーから単離した。ネズミサーベラス様ｃＤＮＡ（配列番号：１）は２７２個のアミノ酸からなる蛋白をコードし、推定分子量３０.５ｋＤである（配列番号：２）。ネズミサーベラス様遺伝子Ｍｃｅｒｂ−１は、配列番号：１の位置５６４において１個の２ｋｂのイントロンを有する。推定蛋白は、そのアミノ末端に疎水性シグナル配列を含み、分子が分泌されることが示唆される。Sigcleaveによる分析により、分泌時に最初の１７残基が成熟分子から開裂されることが示される（Sigcleaveスコア＝７.６）。成熟ネズミサーベラス様蛋白は、配列番号：２の１８〜２７２を含む、２５５個の残基からなる分子量２８.６ｋＤの蛋白であると推定される。サーベラス様ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞にて発現させ、³⁵Ｓ−Ｍｅｔ／³⁵Ｓ−Ｃｙｓで標識した。得られた蛋白は培地中に分泌され、１６％ポリアクリルアミド還元的ゲルで分画すると３８〜４４ｋＤのところに不鮮明なバンドを生じた。不鮮明なバンドは、蛋白が糖鎖付加されていることを示し、配列中の２個のＮ−結合型糖鎖付加部位と矛盾しなかった。網状赤血球系における蛋白発現により、糖鎖付加されていない推定蛋白と矛盾しない３３ｋＤのバンドが示された。非還元的ポリアクリルアミドで分画すると、ＣＯＳにより発現された物質の約半分が分子量７８〜９４ｋＤのところに移動し、蛋白がシステイン結合ホモダイマーを形成しうることが示された。蛋白配列はそのアミノ末端に疎水性のシグナル配列を含み、そのカルボキシ末端近くにシステイン豊富ドメインを含んでいる。アフリカツメガエルのサーベラスおよびネズミのサーベラス様蛋白のシステイン豊富ドメインは５８％の同一性を有し、全体のアミノ酸は３１％の同一性を有する。カルボキシ末端の９個のシステインのパターンは、アフリカツメガエルのサーベラスと哺乳動物サーベラス様蛋白との間で保存されている。実施例２：哺乳動物サーベラス様は分泌蛋白をコードする全長ｃＤＮＡが分泌蛋白をコードするかどうかを調べるために、配列番号：１のＤＮＡ配列（哺乳動物サーベラス様蛋白をコードしており、真核発現ベクター中のクローン化され、³⁵Ｓ−メチオニンで標識されている）で２９３Ｔヒト細胞系を一時的にトランスフェクションした。少量の形態とともに、広いバンドが培地中に分泌された。ＣＯＳ細胞での発現と同様、２９３Ｔにて発現された物質を分画し、システイン結合ダイマーの形成が明らかとなった。サーベラス様蛋白はおそらく糖鎖付加されているであろう。なぜなら、網状赤血球系（膜不存在下）にて翻訳された蛋白は、アミノ酸から推定される分子量に相当する３３ｋＤの分子量を示すからである。サーベラス様蛋白は２個の推定上のＮ−結合型糖鎖付加部位を有する。したがって、配列番号:１のＤＮＡは、システイン豊富ドメインにおいてアフリカツメガエルのサーベラスに対して高いアミノ酸同一性を有する分泌蛋白を規定する。実施例３：哺乳動物サーベラス様蛋白の発現前索マウス胚（交尾から５５日目）において、哺乳動物サーベラス様転写物が、胚の遠位先端を含む初期内胚葉の一方の側において検出された。初期索において、胚性領域の一方の側にある初期内胚葉細胞のパッチ中に発現が見られたが、もはや胚の先端には拡張しなかった。このパッチは胚の前側に対応していた。なぜなら、切片中において、外胚葉後部厚化として認識されうる初期索形成に対抗する内胚葉中にそれが見られたからである。中心索において、サーベラス様陽性部位は初期内胚葉前部に留どまっていた。後期索段階において、節が胚の遠位先端に到達した場合、サーベラス様蛋白を発現する第２の集団が節周囲の部位に見られた。おそらくこれらの細胞は、節から生じることが知られている最終的な内胚葉細胞に対応するのであろう。この細胞集団の内胚葉の性質を組織学的分析により確認した。神経板段階において、サーベラス様蛋白は、内胚葉中のＯｔｘ２発現ドメインに相当するパターンとして神経板前部に存在するのが見られる。An g et al，Cell,78:561-574(1994)。この段階において、おそらくサーベラス様陽性細胞集団は初期内胚葉および最終的内胚葉の両方からなっており、節自体を含まない。重要なことに、サーベラス様分泌因子発現細胞は、その後ＣＮＳの前脳および中脳領域を生じる細胞と直接接触している。初期頭側ひだ段階において、サーベラス様発現はミッドラインおよびその付近の内胚葉に限られる。発現は、胚の吻側端から節近傍に至るミッドラインの全細胞において見られ、脊索前板および脊索板からの前腸内胚葉および中胚葉に及ぶ。内胚葉前部におけるサーベラス様ｍＲＮＡの発現は体節形成開始まで続き、その後、検出できなくなる。同時に、発現の後期フェーズが体節の中胚葉において開始される。かくして、サーベラス様は初期マウス胚の内胚葉前部領域に限定される。将来神経板となる部分に直接接触した内胚葉前部において発現が見られるが、初期索に接触した内胚葉細胞後部においては決して観察されず、神経外胚葉前部の誘導におけるサーベラス様の役割を支持するさらなる証拠が提供される。実施例４：マウスにおけるサーベラスまたはサーベラス様の機能を調べるためのアッセイマウス胚におけるサーベラスおよびサーベラス様遺伝子の機能を調べるために、標準的方法を用いてネズミ胚性幹（ＥＳ）細胞を処理し、胞胚に注入することにより、トランスジェニックノックアウトおよび誤発現（misexpression）マウスを作成することができる。サーベラスまたはサーベラス様遺伝子の中心部分を選択可能マーカー（例えば、ｎｅｏ）で置換し、その構築物をＥＳ細胞中にトランスフェクションし、ダブルクロスオーバーを選択することにより、ネズミのノックアウト処理を行うことができる。誤発現させるには、サーベラスおよびサーベラス様遺伝子を処理して汎用（例えば、アクチン）プロモーターまたは組織特異的（例えば、ＩＤＸ）プロモーターから発現されるようにし、ネズミＥＳ細胞に再導入することができる。古典的手順を用いてかかる処理動物からトランスジェニック動物を得ることができる。成体マウスにおけるサーベラスまたはサーベラス様蛋白の機能を調べるために、蛋白を組織に直接注射でき、あるいはウイルスベクターによりデリバリーすることができる。例えば、ベクターを用いてサーベラスまたはサーベラス様遺伝子を成体マウス中で一時的に過剰発現させ、生理学的、組織化学的および生化学的に動物を分析することにより蛋白の機能または活性を調べることができる。実施例５：ヒトサーベラスおよびサーベラス様遺伝子の単離ネズミサーベラス様遺伝子のヒトＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションにより、ＸｂａＩにより得られた１個のバンド（約１５ｋｂ）が同定され、ヒトゲノムライブラリー中のヒトサーベラス様遺伝子を同定するためのプローブとしてのその有用性が示された。アフリカツメガエルのサーベラス遺伝子とネズミのサーベラス様遺伝子との並置比較により、システイン豊富ドメイン中において十分な核酸相同性のある３つの領域が同定され、それらはヒトサーベラス遺伝子およびサーベラス様遺伝子用プローブとして役立つ。３つのプローブのコンセンサス配列はである。第１のプローブはマウス遺伝子中の２ｋｂのイントロンを含み、それゆえ、プローブとしてはあまりよく機能しない可能性がある。それぞれ６倍および１０倍の縮重を有する第２および第３のオリゴヌクレオチドを個々に、あるいは一緒に使用すれば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー中のヒトサーベラスおよびサーベラス様遺伝子用プローブとして役立つであろう。ここに記載の方法により得られたヒトサーベラスの核酸およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：７および配列番号：８に示す。実施例６：さらなるサーベラスおよびサーベラス様蛋白の同定および単離サーベラスおよびサーベラス様蛋白は、それらのユニークなシステインパターンにより認識されうるファミリーのメンバーである。このファミリーは、サーベラス、サーベラス様蛋白、Dan蛋白およびNorrie蛋白を包含する。Dan蛋白は腫瘍サプレッサー候補であり、Norrie蛋白欠損は盲および聾唖を包含する先天性欠陥を生じさせる。よって、サーベラスファミリーのメンバーは、細胞分化および増殖において重要な役割を果たしていると思われ、したがって、このファミリーの蛋白の他のメンバーを見いだすことは重要である。ファミリーのメンバーは必ずしもアミノ酸相同性により認識されるものではなく、相当な多様性を示すが、９個のシステインのユニークなパターンにより認識されうる。これらの各蛋白中のコンセンサスシステインパターンはＣ（Ｘ_13-15）Ｃ（Ｘ₉）ＣｘＧｘＣ（Ｘ₁₄ _-23 ）ＣＸＸＣ（Ｘ₁₃）Ｃ（Ｘ_15-18）ＣＸＣであり、式中、Ｘｙは、サーベラスおよびサーベラス様ファミリーの蛋白の保存されたシステインパターン中の各システイン間に見いだされる非システインアミノ酸残基数を示す。このモチーフを求めて呻乳動物ＥＳＴを検索することにより、サーベラスファミリーの新規メンバーが同定され、ヒトＥＳＴＮ３５３７７およびネズミＥＳＴＡＡ２８９２４５が含まれていた。標準的方法を用いて、全長遺伝子をゲノムまたはｃＤＮＡいずれかのライブラリーから単離することがでいきる。これらの遺伝子は、胚のパターンを決定し、細胞分化または細胞増殖を制御する機能を発揮するシグナリング蛋白をコードすると考えられ、したがって、医学的治療の候補蛋白である。アフリカツメガエルのサーベラスおよびネズミのサーベラス様蛋白のシステイン豊富ドメイン中に２つの別個のサブ領域があり、それらは非常に保存されたシステインモチーフであり、他の種由来のサーベラスおよびサーベラス様蛋白ならびにサーベラスおよびサーベラス様ファミリーの関連メンバーの同定および単離に特に有用でありうる。GENBANKにおいて報告された哺乳動物ライブラリーおよびＥＳＴのスクリーニングを行うためにこれらの非常に保存されたモチーフを使用することは、ヒトおよび他の種由来の蛋白のサーベラスおよびサーベラス様ファミリーのさらなる蛋白を同定するものと考えられ、さらなるファミリーのメンバーが見いだされうる。第１領域はモチーフＣ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｃであり、配列番号：１の１８６から１９０までのアミノ酸残基において見いだされるＣｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓに対応する。よって、配列番号：１の６１３から６２７までのヌクレオチド位置における配列ＴＧＣＴＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣならびにその近くの領域に対する縮重オリゴヌクレオチドは、サーベラスおよびネズミのサーベラス様蛋白のＣ−Ｘ−Ｇ−Ｘ−Ｃモチーフを有する他の遺伝子を同定し単離するのに有用でありうる。アフリカツメガエルのサーベラスおよびネズミのサーベラス様蛋白のシステイン豊富ドメイン中の第２の非常に保存された領域はモチーフＣ−Ｘ−Ｘ−Ｃであり、配列番号：１の２０６から２０９までのアミノ酸残基において見いだされるＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓに対応する。よって、配列番号：１の６７３から６８４までのヌクレオチド位置における配列ＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣならびにその近くの領域に対する縮重オリゴヌクレオチドは、サーベラスおよびネズミのサーベラス様蛋白のＣ−Ｘ−Ｘ −Ｃモチーフを有する他の遺伝子を同定し単離するのに有用でありうる。上記モチーフを用いて、蛋白のサーベラスおよびサーベラス様ファミリーのさらなる蛋白を他の種から同定することができ、ヒト、マウス、またはカエル由来のさらなるメンバーを見いだすことができる。上記の２つのモチーフを協奏的に使用することは、さらなるサーベラスおよびサーベラス様ファミリーのメンバーの特異的な同定および単離をさらに提供する可能性がある。実施例７：サーベラスおよびサーベラス様活性のマイクロインジェクションアッセイアフリカツメガエルのサーベラスをコードするｍＲＮＡを、異なる段階（４細胞、８細胞および３２細胞）のアフリカツメガエルの割球に注入することにより、特定遺伝子の発現パターンおよび発達中の胚の形態に対して大きな影響が得られた。サーベラスの誤発現により、脊索前板、脊索および腹側体幹中胚葉の発達ならびにそれらの個々の分子マーカー（ゴーセコイド（goosecoid）、コラーゲンＩＩおよびｘ−グロビン）を阻害する。サーベラスのマイクロインジェクションにより、脳、嗅板およびセメント腺のごとき神経後胚葉前部構造が誘導される。サーベラスにより誘導される遺伝子発現は、Ｎ−ＣＡＭ（脳）、Ｏｔｘ２（前脳）、ＣＧ−１３（セメント腺）およびＮｋｘ−２．５（心臓原基）を包含する。サーベラスによる神経組織の誘導は、Ｏｔｘ２マーカーのアップレギュレーションにより示されるように脳の前部領域に対して特異的であったが、かかる誘導はＥｎ−２（中脳−後脳接合部）、Ｋｒｏｘ２０（後脳）およびＸ１Ｈｂｏｘ− ６（脊髄）を包含する後部マーカーによっては示されなかった。３２細胞の割球へのサーベラスの注入は、頭部においては異所性の、心臓および肝臓においては重複した誘導を生じさせた。サーベラスと同様に、サーベラス様ｍＲＮＡを動物のキャップエクスプラント（cap explants）中にマイクロインジェクションすると、アフリカツメガエル胚においてＣＮＳ前部の誘導が生じる。しかしながら、哺乳動物サーベラス様ｍＲＮＡをアフリカツメガエル胚にマイクロインジェクションしても、例えば前脳、サイクロピック（cyclopic）な目、嗅板およびセメント腺を含む異所性頭部構造の形成は誘導されず、重複しているが同一でない機能的効果が示唆された。よって、サーベラス様は、アフリカツメガエルにおけるアッセイにおいて前脳形成を誘導する中和因子である。実施例８：さらなる胚性幹細胞アッセイ本発明のサーベラス様蛋白の効果をアッセイするために、多くの利用可能な胚性幹細胞系に対するインビトロでの成長および分化効果をアッセイすることができる。１のかかる細胞系はＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２であり、メリーランド州Rockvil1 eのAmerican Type Culture Collectionから入手できる。アッセイを行うために、１００ユニットのＬＩＦ存在下で細胞を増殖させて、それらを未分化状態に保つことができる。まず、ＬＩＦを除去し、懸濁液中で細胞をいわゆる胚様体として凝集させることによりアッセイをセットアップする。３日後、胚様体をゼラチン被覆プレート（ＰＣＲ分析用１２ウェルプレート、免疫細胞化学用２４ウェルプレート）上に置き、アッセイすべき蛋白で処理する。細胞に栄養分を供給し、２〜３日ごとに蛋白因子で処理する。１５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)補足培地またはより少量のＦＢＳを含むＣＤＭ限定培地においてアッセイを行えるように、細胞を適合させてもよい。処理期間（７〜２１日の範囲）の終わりに、細胞からＲＮＡを集め、以下のマーカーに従って定量的マルチプレックスＰＣＲにより分析する。該マーカーは、 Brachyury（中胚葉マーカー）、ＡＰ−２（外胚葉マーカー）、およびＮＨＦ− ３α（内胚葉マーカー）である。免疫細胞化学により、ニューロン細胞（グリアおよびニューロン）、筋肉細胞（心筋細胞、骨格筋および平滑筋）の分化、ならびにプロテオグリカンコア蛋白（軟骨）およびサイトケラチン（真皮）のごとき他の種々の表現型マーカーを検出することも可能である。ＬＩＦが除去された場合にこれらの細胞は自律的に分化する傾向があるので、つねに未処理対照との比較により結果を定量する。実施例９：ヒトサーベラス蛋白の発現ヒトサーベラスｃＤＮＡ（配列番号：７）を、特許出願に記載のごとく哺乳動物発現ベクターを用いてＣＯＳ細胞において発現させた。観察された蛋白は分泌されたものであり、分子量約３５〜４５ｋＤであり、２５０個のアミノ酸（配列番号：８のアミノ酸１８から２６７まで）からなる糖鎖付加蛋白であった。上の説明は本発明の好ましい具体例を詳細に説明するものである。本発明の実施において、これらの説明を考慮して多くの修飾および変更が当業者によりなされると考えられる。これらの修飾および変更は添付した請求の範囲の範囲内であると確信する。本明細書において参照したすべての刊行物および特許文献を、特に参照によりそれらが十分に本明細書に記載されているものとみなす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 1/18 Ａ６１Ｐ 11/00 9/00 13/12 11/00 17/02 13/12 19/00 17/02 19/02 19/00 19/10 19/02 21/00 19/10 25/00 21/00 25/16 25/00 25/28 25/16 29/00 １０１ 25/28 43/00 １０５ 29/00 １０１Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 ＡＣ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フォレッティー，マキシミリアンアメリカ合衆国02178マサチューセッツ州ベルモント、コモン・ストリート187番 (72)発明者デロバーティス，エドワード・エムアメリカ合衆国90272カリフォルニア州パシフィック・パラセイズ、ダルス・イネズ・レイン16958番

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）配列番号：７のヌクレオチド１、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、１２１、２５６、２５９、２６２、２６５、２６８、２７１または４８４から開始し、ヌクレオチド７２３または８０１で終了するヌクレオチド；および（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）にハイブリダイゼーションし、サーベラス活性を示す蛋白をコードする配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ配列。２．（ａ）配列番号：８のアミノ酸１、１８ないし２５、４１、８５ないし９１、または１６２から開始し、アミノ酸２４１または２６７で終了するアミノ酸をコードするヌクレオチド；および（ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）にハイブリダイゼーションし、サーベラス活性を示す蛋白をコードする配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ配列。３．発現制御配列に作動可能に連結された請求項１のＤＮＡ分子を含むベクター。４．発現制御配列に作動可能に連結された請求項２のＤＮＡ分子を含むベクター。５．請求項３のベクターで形質転換された宿主細胞。６．請求項４のベクターで形質転換された宿主細胞。７．（ａ）配列番号：２のヌクレオチド２６８から８０１まで；および（ｂ）（ａ）の配列の天然に存在する対立遺伝子配列および等価な縮重コドンからなる群より選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。８．発現制御配列に作動可能に連結された請求項７のＤＮＡ分子を含むベクター。９．請求項８のベクターで形質転換された宿主細胞。１０．哺乳動物サーベラス蛋白をコードする単離ＤＮＡ分子であって、配列番号：７のヌクレオチド２６８から８０１までを含む単離ＤＮＡ分子。１１．適当な５’側のプロペプチドをコードしており、ＤＮＡコーディング配列にイン・フレーム（in frame）で連結されているヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０記載の単離ＤＮＡ分子。１２．発現制御配列に作動可能に連結された請求項１１のＤＮＡ分子を含むベクター。１３．請求項１２のベクターで形質転換された宿主細胞。１４．下記工程：（ａ）哺乳動物サーベラス蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで（ｂ）培地から該哺乳動物サーベラス蛋白を回収し精製するを含む、精製哺乳動物サーベラス蛋白の製造方法。１５．下記工程：（ａ）哺乳動物サーベラス蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで（ｂ）培地から該哺乳動物サーベラス蛋白を回収し精製するを含む、精製哺乳動物サーベラス蛋白の製造方法。１６．下記工程：（ａ）哺乳動物サーベラス蛋白をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１０記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；ついで（ｂ）培地から該哺乳動物サーベラス蛋白を回収し精製するを含む、精製哺乳動物サーベラス蛋白の製造方法。１７．配列番号：８記載のアミノ酸配列を含む精製哺乳動物サーベラスポリペプチド。１８．下記工程：（ａ）配列番号：７に示すヌクレオチド２６８から８０１までのヌクレオチド配列を含むＤＮＡで形質転換された細胞を培養し；ついで（ｂ）配列番号：８に示すアミノ酸９０からアミノ酸２６７までのアミノ酸配列を含む蛋白を培地から回収し精製するにより製造される精製哺乳動物サーベラス蛋白。１９．治療量の少なくとも１種の請求項１８記載の哺乳動物サーベラスポリペプチドを含む組成物。２０．ニューロン遺伝子の調節を変化させることを必要とする患者においてニューロン遺伝子の調節を変化させる方法であって、有効量の請求項１９の組成物を該患者に投与することを含む方法。２１．配列番号：８のアミノ酸１から２６７までのアミノ酸配列を含む精製哺乳動物サーベラス蛋白。２２．請求項２１記載の精製哺乳動物サーベラス蛋白に対する抗体。２３．配列番号：２のアミノ酸９０から２６７までのアミノ酸配列を含む精製哺乳動物サーベラス蛋白。２４．請求項２３記載の精製哺乳動物サーベラス蛋白に対する抗体。２５．下記工程：（ａ）配列番号：７に示すヌクレオチド５２から８０１までのヌクレオチド配列を含むＤＮＡで形質転換された細胞を培養し；ついで（ｂ）配列番号：８に示すアミノ酸１８からアミノ酸２６７までのアミノ酸配列を含む蛋白を培地から回収し精製するにより製造される精製哺乳動物サーベラス蛋白。