KR20030022094A - 모낭에 존재하는 새로운 제 2 케라티노사이트 성장인자유사체 - Google Patents

모낭에 존재하는 새로운 제 2 케라티노사이트 성장인자유사체 Download PDF

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KR20030022094A
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keratinocyte growth
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kgf
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설경수
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(주)휴먼디엔에이테크놀로지
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Abstract

본 발명은 새롭게 분리한 제 2 케라티노사이트 성장인자 단백질 유사체, 이를 코딩하는 유전자, 이의 제조방법 및 이들의 의약학적 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 사람 두피의 모낭으로부터 KGF-2의 돌연변이형 유사체 KGF-2A를 새롭게 분리하여, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환한 형질전환체를 제조하고 이 형질전환체를 배양하여 KGF-2A를 제조하는 것이며, 본 발명의 KGF-2A는 탈모증 환자의 두피 모낭에서는 그 발현이 제한되고 모낭 세포의 증식을 촉진시키는 활성이 있으므로 탈모증의 예방 및 치료 또는 모발성장과 모낭재활을 촉진시키는데 이용될 수 있다.

Description

모낭에 존재하는 새로운 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 {Novel keratinocyte growth factor-2 analogue in hair follicle}
모낭은 성장기(anagen), 퇴행기(catagen) 및 휴지기(telogen)로 이루어지는 생활사를 가지는 표피세포 변이체이다. 비록 모낭의 생활사의 기초가 되는 메카니즘이 완전히 규명된 것은 아니지만, 모낭 내의 간엽 세포(mesenchymal cell) 군집과 상피 세포(epithelial cell) 군집간의 상호작용이 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있다(Jahoda, C. A. & Reynolds, A. J. (1996)Dermatol. Clin. 14, 573-583).
모낭의 생활사의 진행에 있어서, 가장 명백한 동력은 유두성 간엽(papillary mesenchyme)으로부터 유래하고, 특히 진피 유두(dermal papilla)가 중요한 역할을 한다. 유두성 간엽으로부터 나온 특정 인자(factor)는 소포성 상피의 생활사에 유도 신호로서 작용한다(Peus, D. & Pittelkow, M. R. (1996)Dermatol. Clin. 14, 559-572). 구체적으로는 모낭의 돌출부에 있는 상피 간 세포(epithelial stem cells)가 진피 유두에서 나온 유도 신호에 반응할 수 있는 것으로 생각되어지고 있다(Cotsarelis, G. , Sun, T. T. & Lavker, R. M. (1990)Cell 61, 1329-1337).
상기의 과정에 의하여 상피 간 세포가 활성화되면, 돌출부에서 간 세포의 증식이 일어나게 되고 간 세포 자손은 진피쪽으로 아래로 성장하게 되며, 이후 기질 세포(matrix cells)의 분화적 성장이 일어나고, 복합 소포성 산물(complex follicular product), 줄기(shaft) 및 그들을 둘러싼 껍질(sheath)이 생성된다.
형질변환 마우스 또는 유전자 녹아웃 마우스의 피부 표현형을 분석한 결과, 간엽 세포(진피 유두)와 상피 세포(케라티노사이트) 간의 상호작용이 태아에서 모낭의 형태발생에 관여한다는 주장이 힘을 얻었다(Gat, U. et al. (1998)Cell 95, 605-614 ; Chiang, C. et al. (1999)Dev. Biol. 205, 1-9 ; Botchkarev, V. A. et al. (1999)Nat. Cell Biol. 1, 158-164). 그러나, 생후 소낭에서 휴지기와 성장기 사이에서 일어나는 생물학적 스위치에 관한 메카니즘은 명확하지 않다. 그러한 인자로서 가장 설득력있는 후보자는 KGF-2이다. 왜냐하면 KGF-2는 진피 유두 섬유아세포에서 발견되고, 그의 수용체 FGFR2Ⅲb는 인접하는 케라티노사이트에 존재하기 때문이다(Katsuoka K, Schell H, Hornstein OP, Wessel B. (1987)Br. J. DermatolMar 116(3), 464-5).
kgf-2유전자는 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, 이하 "FGF"로 약칭함) 유전자 가족군에 속한 것으로서, FGF는 현재 포유동물에서 22종 이상이 발견되었다(Nishimura T. Nakatake Y. Konishi M. Itoh N. (2000)Biochim. Biophys. Acta. 1492,203-206). FGF는 타이로신 카이네이즈 수용체(tyrosine kinase receptors)의 일원인 FGF 수용체들(FGFRs)에 결합하여 이들을 활성화시킴으로써 세포의 증식, 분화, 이동 및 생존을 조절하는 것으로 생각되어진다.
22종의 FGF 중에서, KGF-2는 FGF-7과 구조적으로 가장 연관성이 깊으며(Yamasaki M. Miyake A. Tagashira S. Itoh N. (1996)J. Biol. Chem. 271,15918-15921), 이둘은 모두 네 개의 FGFRs 중에서 이성체의 하나인 FGFR2Ⅲb에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다(Miki T. et al (1991)Science 251,72-75 ; Ornitz D. M. et al. (1996)J. Biol. Chem. 271,15292-15297 ; Igarashi M. et al. (1998)J. Biol. Chem. 273,13230-13235).
또한 기능적으로는, KGF-2가 지아(limb bud)의 외성장(outgrowth)과 폐의 분지적 형태발생(branching morphogenesis)에 관여하는 것으로 보인다(Martin G. R. (1998)Genes Dev. 12, 1571-15869). 지아와 폐아(lung bud)는 기관 원기(organ primordia)의 전형적인 일 예로서, 기관이 발생(development)하는 데에 상피 조직과 간엽 조직간의 밀접한 상호작용이 필요하다. 상피-간엽 상호작용에서, 간엽으로부터 나온 신호는 직접적으로 상피 조직으로 전해져서 발아적 형태발생이나 분지적 형태발생(budding or branching morphogenesis)을 통한 특이 구조를 형성하게 하고, 두 조직간의 상호작용은 그 이후의 발생 동안에도 유지되는 것이 확실하다.
미국특허 제 5,184,605호, 제 5,824,643호 및 제 5,965,530호에는 KGF가 케라티노사이트 이외에도 상피 조직의 다양한 세포에서 증식, 성장 및 분화를 자극하는 활성이 있어, 이를 진피 부속기, 간, 폐 및 위장관과 같은 조직 및 기관을 괴롭히는 질병 상태나 의료 상황을 치료하는데 사용될 수 있고 이때 진피내의 부속기 요소로 피지선, 땀샘 및 모낭이 기재되어 있다.
그러나, KGF는 상처 회복 (wound healing) 차원의 상피재생(reepithelialization) 활성만 확인되어 화학요법에 의하여 유발된 탈모증(chemotherapy-induced alopecia)에만 적용가능한 것으로 설명되고 있을 뿐이고, 유전적인 원인으로 발병하는 탈모증에는 적용의 여지가 전무하다.
또한 미국특허 제 6,077,692호에는 KGF-2의 아미노산서열 및 이를 코딩하는 염기서열을 분리하고 이의 상처 회복, 항-염증 활성, 간세포의 분화 및 증식을 촉진시키고 폐의 손상을 방지하는 활성을 확인하여 이에 사용할 수 있슴이 개시되어 있다.
그렇지만, 상기 문헌에는 KGF-2가 모낭의 증식을 촉진하는 효과가 있는지 실험적으로 확인하여 기재한 바 없다.
상기에 인용된 문헌은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 포함된다.
이에, 본 발명자들은 탈모증의 원인이 될 수 있는 분자적 인자(molecular factor)를 찾고자 하던중, 탈모증 환자의 모낭에서는 KGF-2와 유사한 단백질의 발현이 제한되는 것을 발견하고 이를 분리하여 그 아미노산서열을 확인한 결과 KGF-2의 새로운 돌연변이형 단백질임을 확인하고 또한 상기 KGF-2A가 두피 모낭세포의 증식을 촉진하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 새롭게 분리한 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체(keratinocyte growth factor-2 analogue ; 이하 "KGF-2A"로 약칭함), 이를 코딩하는 유전자, 이의 제조방법 및 이들의 의약학적 용도에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 사람 두피의 모낭으로부터 KGF-2의 돌연변이체를 새롭게 분리하여, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 이를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환한 형질전환체를 제조하고 이 형질전환체를 배양하여 KGF-2A를 제조하는 것이며, 본 발명의 KGF-2A는 탈모증 환자의 두피 모낭에서는 그 발현이 제한되고 모낭 세포의 증식을 촉진시키는 활성이 있으므로 탈모증의 예방 및 치료 또는 모발성장과 모낭재활을 촉진시키는데 이용될 수 있다.
도 1 은 사람 KGF-2와 본 발명의 KGF-2A의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 2 는 GST-KGF2A 와 KGF-2A를 분리하여 아가로즈 겔 상에서 그 분자량을 확인한 결과이고,
도 3 은 정상인과 탈모증 환자의 두피로부터 분리한 모낭에서 본 발명의 KGF-2A와 KGF-2A 수용체의 발현양상을 비교분석한 결과이고,
도 4 는 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 KGF-2A의 DNA를 pGEM-T 벡터에 삽입하여 얻은 재조합 플라스미드 pGEM-T-KGF-2A(수탁번호: KCTC 1012BP)의 제한효소지도이며,
도 5 는 KGF-2A의 모낭 세포 증식 활성을 MTS 비색분석법으로 확인한 결과이고,
도 6a 는 정상인 두피의 모낭에서 진피 유두를 제거한 후 KGF-2A를 처리한 결과 세포 증식에 미치는 효과를 확인한 것이고, 도 6b 는 진피 유두를 제거하지 않은 모낭에 KGF-2A를 처리한 결과 세포 증식에 미치는 효과를 확인한 것이며,
도 7a 는 탈모증 환자의 모낭에 KGF-1, KGF-2 및 KGF-2A를 각각 처리한 후 세포 증식 활성을 확인한 것이고, 도 7b 는 탈모증 환자의 모낭에서 진피 유두를 제거한 후 KGF-1, KGF-2 및 KGF-2A를 각각 처리하여 그 세포증식 활성을 확인한 것이다.
본 발명은 탈모증 환자의 두피 모낭에서는 그 발현이 제한되며, 모낭세포의 증식을 촉진하는 새로운 KGF-2A를 분리 제공하고, 이를 탈모증 예방 및 치료 또는모발성장과 모낭재활을 촉진시키는데 이용하는 용도를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KGF-2의 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 KGF-2A를 제공한다. 이 때 KGF-2A는 사람의 두피 모낭세포로부터 분리한 KGF-2의 새로운 돌연변이형 단백질로서, 서열번호 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 경우에 N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수 있다. 또한 KGF-2A가 당쇄 등이 결합된 성숙 단백질(muture protein) 형태일 수도 있다.
또한 본 발명은 KGF-2A를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의kgf-2a유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하거나 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 상기 각각의 경우에 5'-말단 상류(upstream)에 개시코돈을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 2의 4번에서 627번까지 혹은 118번에서 627번까지의 염기 서열을 포함할 수 있고, 그 염기 서열 상류에 개시 코돈이 더 포함될 수 있다.
본 발명은 KGF-2A의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법은kgf-2a유전자를 발현 벡터에 클로닝한 후 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 얻고 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함한다. 이 때 상기kgf-2a유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하거나 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 상기 각각의 경우에 5'-말단 상류에 개시코돈을 더 포함할 수 있다. 또한kgf-2a유전자에 추가적인 염기 서열이 결합된 융합 유전자의 형태일 수도 있다.
또한 본 발명은 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
이 때 KGF-2A는 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 경우에 N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수 있다. 또한 KGF-2A가 당쇄 등이 결합된 성숙 단백질 형태일 수도 있다.
kgf-2a유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하거나 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 상기 각각의 경우에 5'-말단 상류에 개시코돈을 더 포함할 수 있다. 또한kgf-2a유전자에 추가적인 염기 서열이 결합된 융합 유전자의 형태일 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 탈모증 예방 및 치료 또는 모발성장과 모낭재활의 촉진을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 이용한 탈모증 치료 또는 예방방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 제 1 태양은 KGF-2의 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 KGF-2A에 관한 것이다. 이 때 KGF-2A는 사람의 두피 모낭세포로부터 분리한 KGF-2의 새로운 돌연변이형 단백질이다.
우선 본 발명에서는 KGF-2A를 분리, 확인하기 위하여, 사람의 두피 모낭세포로부터 총 mRNA를 추출한 후 KGF-2 DNA에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 이용한 RT-PCR을 실시하여 cDNA를 얻었으며 그의 염기서열을 결정하고 그에 따라 아미노산 서열을 추론하고 결정하였다.
그 결과 얻어진 아미노산 서열이 기존에 알려진 KGF-2와는 87번 아미노산이 상이하였으며 이를 서열번호 1에 개시하였다.
KGF-2의 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 새로운 단백질을 본 발명자들은 KGF-2A로 명명하였다.
본 발명에 따른 KGF-2A는 서열번호 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 2번부터 208번까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 경우에 N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 KGF-2A는 사람 두피의 모낭으로부터 분리된 것이며, 탈모증 환자의 두피에서는 정상인과는 상이한 발현양상을 보인다.
우선, 본 발명에서는 정상인과 탈모증 환자의 모낭에서의 KGF-2A의 mRNA 발현을 비교 분석하기 위하여, 정상인과 탈모증 환자의 두피로부터 형태발생학적으로 생성기의 구조적 특성을 가진 모낭을 각각 분리하였다. 상기 모낭으로부터 총 RNA(total RNA)를 추출하고, RT-PCR을 수행하여 얻은 cDNA를 아가로스 겔 상에서 분리하여 비교분석하였다.
그 결과, 본 발명의 KGF-2A는 KGF-2A 수용체인 FGFR2Ⅲb와는 달리 정상인과 탈모증 환자에서 다른 발현양상을 보였다. 즉, 정상인의 모낭에서는 KGF-2A가 일정정도 발현되는 반면 탈모증 환자의 모낭에서는 그 발현이 제한됨을 확인하였다(도 3 참조).
따라서 본 발명의 KGF-2A는 탈모를 조절하는 분자적 인자일 가능성이 높다.
본 발명의 제 2 태양은 KGF-2A를 코딩하는kgf-2a유전자에 관한 것이다.
KGF-2A는 KGF-2의 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 아미노산 서열을 가지는 것이므로, KGF-2A를 코딩하는kgf-2a유전자는 상기 아미노산 서열을 암호하는 모든 가능한 경우의 코돈으로 구성될 수 있다. 또한 상기 유전자는 gDNA 또는 cDNA 모두 가능하며, 따라서 gDNA인 경우 코딩부위내에 인트론과 같은 비코딩 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의kgf-2a유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하거나 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 상기 각각의 경우에 5'-말단 상류에 개시코돈을 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 2의 4번에서 627번까지 혹은 118번에서 627번까지의 염기 서열을 포함할 수 있고, 그 염기 서열 상류에 개시 코돈이 더 포함될 수 있다. 이 때 코돈의 디제너러시(degeneracy)에 의한 변형이 가능함은 당업자간에 주지의 사실이다.
우선, 본 발명에서는kgf-2a유전자를 얻기 위하여 사람 두피의 모낭세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 당업자간에 주지하는 바와 같이, 세포로부터 분리한 총 RNA는 증폭하고자 하는 유전자의 염기 서열에 상응하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 PCR이나 RT-PCR을 통하여 특정 유전자의 cDNA로 전환된다.
본 발명에서는 서열번호 2의 1번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하는kgf-2a유전자를 증폭시키기 위하여 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하며, 서열번호 2의 118번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하는kgf-2a유전자를 증폭시키기 위하여는 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하였다.
구체적으로, 모낭에서 추출한 총 RNA로부터 역전사를 수행하여 cDNA를 얻고 이로부터 상기 서열번호 3 및 서열번호 4 또는 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 PCR을 수행하였다. PCR 산물의 염기 서열을 확인한 결과, 기존에 알려진 사람 KGF-2 cDNA 서열에서 87번 코돈이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 새로운 cDNA 서열을 결정하였고(도 1 및 서열번호 2 참조), 이를kgf-2a유전자로 명명하고 pGEM-T 벡터에 삽입하여 pGEM-T-KGF-2A로 표시하고 2001년 5월 19일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 1012BP).
본 발명의 제 3 태양은 KGF-2A의 제조방법에 관한 것이다.
KGF-2A는 그 알려진 아미노산 서열 즉, 서열번호 1의 아미노산 서열에 따라 목적하는 서열을 직접 합성하는 방법으로 제조될 수 있으며, 사람 두피의 모낭으로부터 정제할 수도 있고 또한kgf-2a유전자를 이용한 재조합 방법에 의하여 발현, 정제하여 제조할 수 있다.
본 발명에서는kgf-2a유전자를 이용하여 이를 벡터내로 클로닝한 다음 얻어진 재조합 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시켜 형질전환체를 얻고 상기 형질전환체를 배양하여 KGF-2A를 제조한다. 이 때 상기kgf-2a유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하거나 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 상기 각각의 경우에 5'-말단 상류에 개시코돈을 더 포함할 수 있다. 또한kgf-2a유전자에 추가적인 염기 서열이 결합된 융합 유전자의 형태일 수도 있다.
추가적인 염기 서열로는 단백질의 발현 후 구획화(compartmentalization)를 위한 시그날이나 막 삽입(anchor)서열 등이 결합될 수도 있고, 면역원성 결정기 등이 융합될 수 있으며, 단백질의 분리 정제를 용이하게 하기 위한 태그(tag)를 삽입할 수도 있으며 융합 부위에 효소 특이 절단 서열이 삽입될 수 있다. 이러한 추가적인 염기 서열은 그 목적에 따라 단백질의 발현, 정제후에 효소 등에 의하여 절단가능하다.
우선 재조합 플라스미드를 얻기 위하여,kgf-2a유전자를 pET9c 또는 pGEX-2T와 같은 시판되는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 이 때 pET9c는 T7 프로모터를 포함하는 것으로 표적 유전자의 발현을 강하게 유도하며, pGEX-2T는 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathion S-transferase, 이하 "GST"로 약칭함)를 코딩하는 서열이 표적 유전자의 삽입 위치의 상류에 포함되어 있어 GST-융합 단백질의 형태로 발현된다.
구체적으로, 서열번호 2에서 신호 서열(signal sequence)을 코딩하는 부위인 1번부터 117번까지의 염기서열을 제외하고 118번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하는kgf-2a유전자를 pGEX-2T내로 서브클로닝하여 재조합 플라스미드 pGEX-2T-KGF2A를 얻었다.
상기와 같은 방법으로 얻어진kgf-2a유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 칼슘포스페이트(calcium phosphate) 침전방법, 리포좀(liposome) 매개방법, 미세주입(microinjection), 엘렉트로포레이션(electroporation)을 이용한 트렌스펙션(transfection) 방법 등과 같은 공지의 방법으로 대장균과 같은 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환체를 제조한다. 본 발명에서는 숙주 세포로 대장균 BL21(DE3) 균주를 이용하였다. 구체적으로 상기 재조합 플라스미드 pGEX-2T-KGF2A로 대장균 BL21(DE3) 균주를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다.
형질전환체로부터 단백질을 분리 정제하기 위하여, 형질전환체를 적당한 시간동안 배양하고 세포를 파쇄한 후 크로마토그래피, 투석 및/또는 여과를 실시하여 KGF-2A를 정제함으로써 KGF-2A를 순수분리한다.
본 발명에서는 상기 과정으로 얻은 대장균 형질전환체를 48시간 이상 배양한 다음 세포를 파쇄하고 농도구배 NaCl 용액으로 용리하는 헤파린-세파로즈 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 KGF-2A를 분리 정제하였다. pGEX-2T-KGF2A와 같은 재조합플라스미드로 형질전환된 형질전환체의 경우에는 GST-KGF2A 융합 단백질이 생성되므로 글루타치온 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 선택적으로 GST-KGF2A 융합 단백질을 분리할 수 있다. 상기 융합단백질은 트롬빈 처리로 간단하게 GST를 표적 단백질로부터 제거할 수 있다. 단백질의 분리 정제시에 적절한 컬럼의 선택과 적용은 당업자간에 용이하게 변형 가능하다.
또한kgf-2a유전자에 추가적인 염기 서열이 결합된 융합 유전자를 발현벡터내로 서브클로닝한 경우에는 필요한 경우 단백질의 발현후에 트립신과 같은 효소를 이용하여 절단하여 제거할 수 있다.
본 발명에서 아가로즈 겔상에서 확인한 단백질의 분자량은 GST-KGF2A는 약 45 kDa, KGF-2A는 약 20 kDa 이었고, 이는 예상된 분자량과 일치하는 것이었다(도 2 참조).
본 발명의 제 4 태양은 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
이 때 KGF-2A는 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함하거나 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 경우에 N-말단에 메티오닌을 더 포함할 수 있다. 또한 KGF-2A가 당쇄 등이 결합된 성숙 단백질 형태일 수도 있다.
kgf-2a유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하거나 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것이며, 상기 각각의 경우에 5'-말단 상류에 개시코돈을 더 포함할 수 있다. 또한kgf-2a유전자에 추가적인 염기 서열이 결합된 융합 유전자의 형태일 수도 있다.
본 발명에서는 KGF-2A의 생물학적 활성을 확인하기 위하여, KGF-2A의 사람 두피 모낭세포에서의 증식 촉진능을 측정하였다.
구체적으로 사람 두피에서 분리한 모낭 세포에 KGF-2A를 처리하여 일정 시간 경과후에 MTS 비색측정법으로 세포의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이 KGF-2A 30 ng/ml에서 최대활성을 보이며 음성 대조구 100% 대비 약 140%의 현저한 증식활성을 보였다(도 5 참조).
또한 내재적 KGF-2의 원인을 제거하기 위하여 진피 유두가 외과적으로 제거된 사람 두피의 모낭에 KGF-2A를 처리하여 일정 시간 경과후에 MTS 비색측정법으로 세포의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과 흥미롭게도 진피 유두가 제거되지 않은 모낭에 비하여 진피 유두가 제거된 모낭에서 세포의 증식이 더 현저함을 확인하였다(도 6a 및 도 6b 참조.)
KGF-1은 FGF 가족군에서 KGF-2와 밀접한 일원이다. 따라서 KGF-2A의 자극효과는 KGF-1 및 KGF-2와 비교될 수 있다. 본 발명에서는 사람 두피에서 분리한 모낭 세포에 각각 KGF-1, KGF-2 및 KGF-2A를 처리하고 일정 시간 경과후에 MTS 비색측정법으로 세포의 증식 정도를 확인하였다. 또한 내인성 인자에 의한 영향을 제거하기 위하여 진피 유두를 제거한 사람 두피의 모낭에 각각 각각 KGF-1, KGF-2 및 KGF-2A를 처리하고 모낭 세포의 증식 정도를 확인하였다.
그 결과 진피 유두의 제거 여부에 관계없이 KGF-2A가 KGF-1 및 KGF-2에 비하여 현저하게 모낭 세포 증식을 촉진함을 확인하였다(도 7a 및 도 7b 참조.)
따라서 본 발명에 의한 KGF-2A는 모낭 세포의 증식을 촉진시키는 활성이 있어, 탈모증의 예방 및 치료 또는 모발성장 및 모발재활을 촉진시키는 약학적 조성물에 유효성분으로 이용될 수 있다.
또한 KGF-2A를 코딩하는kgf-2a유전자는 탈모증의 예방 및 치료 또는 모발성장 및 모발재활을 촉진시키는 유전자 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 약제학적으로 허용되는 통상의 부형제 또는 보조제와 혼합하고, 통상의 약제학적 제제방법으로 제제화하여 제조될 수 있다. 이 때 통상의 약제학적 제제방법에는kgf-2a유전자를 유전자 치료용 벡터에 삽입하여 이용하는 것이 포함된다.
본 발명의 제 5 태양은 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 이용한 탈모증 치료 또는 예방방법을 제공한다. 상기 방법은 환자에게 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 KGF-2A 또는kgf-2a유전자를 함유하는 약학적 조성물은 경구적으로 또는 비경구적으로, 예컨대, 정맥내, 피하, 근육내, 경피 또는 직장내로 투여될 수 있으며, 두피에 직접 투여하는 경피투여가 바람직하다.
이하 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1> 모낭의 분리
정상인과 탈모증 환자의 두피로부터 형태발생학적으로 생성기의 구조적 특성을 가진 모낭을 각각 분리하였다.
<실시예 2> 사람 KGF-2A cDNA의 분리
트리졸(Gibco BRL)을 사용하여 모낭으로부터 추출한 총 RNA를 가지고 역전사를 수행하였다.
구체적으로, 사람 모낭 총 RNA(1㎍)를 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역 전사효소 300 units, 사람 태반 RNase 저해제 15 units 및 무작위 헥사데옥시뉴클레오타이드 프라이머 0.5㎍을 포함하는 반응 혼합물(20㎕)과 함께 37℃에서 60분간 배양하여 역전사를 수행하여 cDNA 용액을 얻었다.
얻어진 상기 cDNA 용액으로부터 인간 KGF-2 cDNA 절편을 증폭시키기 위하여, cDNA 용액과 0.05 unit/㎕의TagDNA 중합효소 및 서열번호 3의 센스 프라이머와 서열번호 4의 안티센스 프라이머를 각각 4 pmol/㎕ 포함하는 반응 혼합물(reaction mixture)로 PCR을 30회 수행하였다. 상기 프라이머는 사람 KGF-2의 1번에서 208번까지의 아미노산 서열에 상응하는 것이고, PCR의 조건은 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간으로 이루어졌다. PCR 기기는 GeneAmp PCR 시스템 9600 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)을 사용하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물은 사람 KGF-2의 1번에서 208번 아미노산 서열에 상응하는 모든 가능한 코돈이며, 627 염기쌍(base pairs)의 예상된 크기의 DNA 클론이 주요 증폭 산물이었다. 다섯 개의 클론을 무작위로 선택하여 이들의 염기 서열을 결정하였다. 구체적으로, 상기의 예상된 크기로 증폭된 DNA를 pGEM-T DNA (Promega Biotech) 내로 클로닝한 다음, 클로닝된 DNA의 염기 서열을 디데옥시 종결 순환 서열(Applied Biosystems)을 이용하여 어플라이드 바이오시스템 모델 377DNA 시퀀서(Perkin-Elmer)를 가지고 확인하였다.
그 결과, 상기 다섯 개의 클론중 하나에서 기존에 알려진 사람 KGF-2 cDNA 서열에서 87번 코돈이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 서열을 확인하였고, 이는 기존의 KGF-2 단백질의 돌연변이형 유사체를 코딩하는 것으로서kgf-2a유전자로 명명하였다. 사람kgf-2acDNA의 코딩부위는 627개의 뉴클레오타이드로 이루어지며 서열번호 2에 나타내었다. 이는kgf-2의 염기 서열과 99.5%의 상동성을 보였다. 상기에서 분리한kgf-2a유전자를 pGEM-T 벡터에 삽입하여 pGEM-T-KGF-2A로 표시하고 2001년 5월 19일자로 한국과학기술연구원 생명공학연구소 부설 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 1012BP)(도 4 참조). pGEM-T 벡터는 T7 Sp6 RNA 중합효소 이중 프로모터(-17 - +3)와 lac 오퍼레이터(operator, 200-216)를 가지고 있다.
서열번호 2의kgf-2a유전자 염기 서열은 완전한 KGF-2A의 208개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 코딩하며 4번에서 117번까지의 염기 서열은 KGF-2A의 신호 서열을 코딩한다. KGF-2A의 아미노산 서열을 서열번호 1에 표시하였다.
<실시예 3> RT-PCR에 의한 KGF-2A 및 FGFR2Ⅲb mRNA 발현 분석
서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용한 RT-PCR을 수행하여 KGF-2A mRNA의 발현을 분석하였다. 서열번호 5의 센스 프라이머 및 서열번호 6의 안티센스 프라이머는 KGF-2의 코딩 서열중 427 염기쌍으로 이루어진 서열(119-627)에 인접하여 연결되는(flanking) 서열이다.
RT-PCR은 구체적으로, 상기 실시예 2에서 모낭으로부터 분리한 총 RNA(1㎍)에, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역 전사효소 15 units 및 상기 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 포함된 반응혼합물로 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간을 40회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시겼다. 그 결과 얻어진 RT-PCR의 산물은 1.5% 아가로스 겔에서 분석하였다.
또한, KGF-2A의 수용체인 FGFR2Ⅲb mRNA의 발현을 분석하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 때 서열번호 7의 센스 프라이머와 서열번호 8의 안티센스 프라이머를 사용하였으며, 이는 사람 FGFR2Ⅲb의 코딩 서열중 350 염기쌍으로 이루어진 서열(699-1049)에 인접하여 연결되는 서열에 상응하는 것이다. PCR 조건은 94℃에서 1 분동안 1회 실시한 다음 94 ℃에서 1 분, 58 ℃에서 30 초 및 72℃에서 1 분을 35회 반복하고 72℃에서 5분 실시하였다.
β-액틴 mRNA의 발현 수준을 분석하여 내부 대조구로 이용하였다.
도 3에서 나타난 바와 같이, KGF-2A는 정상인의 모낭에서는 발현되는 반면 탈모증 환자의 모낭에서는 검출되지 않았다. 반면, KFG-2A의 수용체인 FGFR2Ⅲb 는 정상인과 탈모증 환자 양쪽의 모낭에서 모두 검출되었다.
또한 하기 표 1에서와 같이, 탈모증 환자의 경우에는 예외없이 KGF-2A의 발현이 제한되는 반면 정상인의 경우에는 57%만 정상적으로 발현되고 43%는 그 발현이 제한되는 것으로 나타났다(p<0.05).
사람 모낭에서의 KGF-2A 발현
모낭 발현 비발현
정상인 4/7 (57%) 3/7 (43%)
탈모증 환자 0/7 (0%) 7/7 (100%)
이는 외견상으로 정상인으로 보이는 경우에도 유전적인 원인으로 인하여KGF-2A의 발현이 제한되는 보인자가 존재함을 나타내는 것이며, 이러한 보인자는 향후 탈모증이 발병될 가능성이 높은 것으로 해석 가능하다.
<실시예 4> 재조합 KGF-2A의 제조
우선, 사람 KGF-2A 40번부터 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA를 증폭하기 위하여, 사람 KGF-2A cDNA를 주형으로 하고TagDNA 폴리머라제 및 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 25회 PCR을 수행하였다. 증폭된 부위는 신호 서열의 분비 및 절단부위 하류에 연결되는 성숙한 KGF-2A를 코딩하는 부위에 해당하는 것이었다.
다음에, 증폭 산물을 pET9c 플라스미드(Novagen)내로 서브클로닝하여 재조합 플라스미드 pET9c-KGF-2A를 제조하고 이를 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켰다.
상기 과정으로 얻은 형질전환체를 48시간 동안 배양하여 대장균 형질전환체에서 T7 유전자의 프로모터로부터 재조합 KGF-2A를 발현시킨 다음 세포를 파쇄하여 트롬빈(Sigma)을 전처리하고 헤파린-세파로즈 컬럼에 주입한 다음, 컬럼으로부터 NaCl 농도를 증가시키며 용리한 연속하는 분획을 분석한 결과, 1.0 M NaCl 분획에서 사람 KGF-2A가 대부분 용출된 것을 확인하였고, 이를 다시 SDS-PAGE로 분리한 후 실버 스태이닝을 수행하여 확인하였다. 0.8M 및 1.2M NaCl 분획에서도 KGF-2A가 일부 용출되었다.
용출된 단백질의 분자량은 약 20 kDa 이었고 이는 예상된 분자량과 일치하는 것이었다. 1.0 M NaCl 분획에서 용출된 단백질 샘플로 아미노산 분석을 수행하여본질적으로 순수한 KGF-2A를 얻은 것을 확인하였다.
<실시예 5> GTS-융합 시스템을 이용한 재조합 KGF-2A의 제조
상기 실시예 4의 방법으로 사람 KGF-2A cDNA를 증폭하였으며, 증폭된 산물을 제한효소EcoRⅠ 및BamHⅠ로 절단하고 발현벡터 pGEX-2T (Pharmacia)의EcoRⅠ/BamHⅠ 위치에 연결시켜 얻은 재조합 플라스미드 pGEX-2T-KGF2A로 대장균 BL21(DE3) 균주를 42℃에서 30초동안 열충격을 가하여 형질전환시켰다.
상기 과정으로 얻은 형질전환체를 48시간 동안 배양한 다음 세포를 파쇄하여 50mM Tris-HCl(pH 8.0)로 미리 평형화한 글루타치온 컬럼에 직접 주입하였다. 글루타치온 비드에 결합된 단백질은 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 으로 글루타치온과 함께 용출하였다.
GST-KFG2A 융합 단백질을 포함하는 분획은 다시 헤파린 컬럼(Pharmacia Biotech.)에 트롬빈 2㎍을 첨가하여 1시간 동안 반응시켜 GST를 절단 한후, 50mM Tris-HCl(pH 8.0)에 녹인 0 - 2.0 M의 농도구배 NaCl로 용출하였다. 그런 다음 인산염-완충 염 용액(phosphate-buffered saline) 에 대하여 밤새도록 투석하였고, 이어서 PyroSep-C (Danabe Pharmaceuticals, Japan)에 적용하여 내독소를 제거하여 순수한 KGF-2A 단백질을 분리하였다.
아가로즈 겔상에서 확인한 단백질의 분자량은 GST-KGF-2A는 약 45 kDa, KGF-2A는 약 20 kDa 이었고, 이는 예상된 분자량과 일치하는 것이었다(도 2 참조).
<실시예 6> 재조합 KGF-2A의 분열유발 활성의 검증
사람 두피로부터 모낭을 분리하여 100 U/ml 페니실린, 10 ng/ml 하이드로콜티손 및 75μg/ml 소 뇌하수체 추출물이 보충된 KBM 배지(Clonetics)가 각 웰당 1ml씩 담긴 24-웰 플레이트에 넣고 5% CO2/95% 공기의 대기하에서 유지시켰다.
본 발명에서는 모낭 세포의 성장 정도를 MTS 비색측정법으로 측정하였다.
구체적으로, MTS 분석을 실시하기 전에 상기 모낭 세포 배양액에 KGF-2A를 10, 30 및 100ng/ml 농도로 각각 처리하여 48시간 배양하였다. 이 때 KGF-2A로는 상기 실시예 4에서 제조한 단백질을 사용하였다.
다음에 96-웰 마이크로타이터내로 각 웰당 하나의 모낭을 담아서, 4 시간 경과후에 제조사(Promega)에서 지시하는 방법에 따라 MTS 비색측정법을 이용하여 세포 증식을 확인하였다. 각 실험은 8회 반복하여 실시하였으며, 데이타 값은 평균±표준편차(S.E.)로 표시하였다. 음성 대조구로는 비처리 모낭 세포를 이용하였다.
도 5에 나타난 바와 같이 KGF-2A의 첨가는 용량-의존적으로 인간 모낭 세포의 증식을 촉진시켰고 최대촉진활성을 보이는 농도는 30 ng/ml 이었다.
<실시예 7> KGF-2A 활성의 분자적 메카니즘의 확인
이(tooth) 혹은 깃털의 눈(芽) 발생과 같이, 모낭 형태발생은 상피-간엽 상호작용에 의하여 좌우되며, 구체적으로 모발 판(hair placode) 케라티노사이트와 간엽 응축 하부(underlying mesenchymal condensations)의 섬유아세포 사이의 상호작용에 의한 것으로 알려져 있다.
따라서 본 발명자들은 구체적인 기관 배양으로 모낭 세포 증식에 KGF-2A의 투여가 미치는 영향을 평가하여 KGF-2A의 분자적 메카니즘을 확인하고자 하였다.
즉, 정상인의 두피 모낭에는 KGF-2A가 존재하는 것에 착안하여 KGF-2A의 분열 촉진 활성에서 내인성 KGF-2에 의한 영향을 제거하기 위하여, 정상인의 모낭을 분리하여 진피 유두를 외과적으로 제거한 후 실시예 6에서와 같은 방법으로 이를 포함하는 배양 배지에 KGF-2A를 처리하고 세포 증식의 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이 KGF-2A는 진피 유두를 포함하는 모낭 세포에서의 세포 증식(125% ± 11.0)과 비교하여 진피 유두가 제거된 모낭 세포를 135% ± 11.1(P<0.05)까지 증가된 값으로 세포 증식을 촉진시키는 것을 확인하였다.
<실시예 8> KGF-1 및 KGF-2의 분열촉진 활성과의 비교
본 발명에 의한 KGF-2A의 활성을 KGF-1 및 KGF-2와 비교하였다.
구체적으로 탈모증 환자의 모낭을 분리하여 각각 KGF-1, KHG-2 및 KGF-2A를 처리하고 실시예 6에서와 같이 그 세포 증식 활성을 측정하였다(8회 반복). 이 때 실시예 7에서와 내인성 인자의 영향을 배제하기 위하여 진피 유두를 제거한 후 같은 실험을 실시하였다.
그 결과 도 7a에서 보이는 바와 같이 KGF-2A는 KGF-1 및 KGF-2에 비하여 유의성 있게 탈모증 환자의 두피로부터 분리된 모낭 세포의 증식을 촉진시켰다(KGF-1 :112% ± 6.9; KGF-2: 126% ± 8.6; KGF-2A: 135% ± 7.8). KGF-2A의 활성은 진피 유두가 제거된 모낭 세포에서도 유의성있게 나타났다(도 7b 참조).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 KGF-2A는 기존에 알려진 KGF-2의 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 새로운 돌연변이형 단백질로서, 사람의 모낭으로부터 분리한 것이며 탈모증 환자의 두피 모낭에서는 그 발현이 제한되고 모낭 세포의 증식을 촉진시키는 활성이 있으므로 탈모증의 예방 및 치료 또는 모발성장과 모낭재활을 촉진시키는데 이용될 수 있다.

Claims (34)

  1. 제 2 케라티노사이트 성장인자의 아미노산 서열에서 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  2. 서열번호 1의 40번부터 208번까지의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기에 더하여 N-말단에 메티오닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  4. 서열번호 1의 2번부터 208번까지의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기에 더하여 N-말단에 메티오닌을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  6. 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 사람의 두피 모낭으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 성숙 단백질인 것을 특징으로 하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체.
  8. 제 1 항의 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체를 코딩하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자.
  9. 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자.
  10. 제 9 항에 있어서, 서열번호 2의 4번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  11. 서열번호 1의 1번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자.
  12. 제 11 항에 있어서, 서열번호 2의 1번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  13. 서열번호 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자.
  14. 제 13 항에 있어서, 서열번호 2의 118번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  15. 서열번호 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 포함하고 그 N-말단에 메티오닌이 결합된 아미노산 서열을 코딩하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자.
  16. 제 15 항에 있어서, 서열번호 2의 118번에서 627번까지의 염기 서열을 포함하고 그 5'-말단 상류에 개시 코돈을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  17. 제 8 항 내지 제 16 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 cDNA 형태인 것을 특징으로 하는 유전자.
  18. 제 8 항 내지 제 16 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 gDNA 형태인 것을 특징으로 하는 유전자.
  19. 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자를 벡터에 클로닝한 후 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 얻고 상기 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체의 제조방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 제 2 케라티노사이트 성장인자의 아미노산 서열에서 87번 아미노산이 라이신에서 글루탐산으로 치환된 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 서열번호 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 서열번호 2의 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고 부가적인 DNA 서열이 더 포함되어 있는 융합 유전자의 형태인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  24. 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 또는 제 2 케라티노사이트 성장인자유사체 유전자를 유효성분으로 하는 탈모증 예방 및 치료 또는 모발성장 및 모낭재활 촉진용 약학적 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체는 서열번호 1의 40번부터 208번까지의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 제 24 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체는 서열번호 1의 2번부터 208번까지의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 상기 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체의 아미노산 서열 각각의 N-말단에 메티오닌이 더 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  28. 제 24 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체는 성숙 단백질 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  29. 제 24 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 서열번호 1의 2번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  30. 제 24 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 서열번호 1의 40번에서 208번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  31. 제 24 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자는 서열번호 2의 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자의 전부 또는 일부를 포함하고부가적인 DNA 서열이 더 포함되어 있는 융합 유전자의 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  32. 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 또는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자를 이용한 탈모증 예방 또는 치료방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 또는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 환자의 두피에 경피적으로 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 또는 제 2 케라티노사이트 성장인자 유사체 유전자를 이용한 모발성장 또는 모낭재활 촉진방법.
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