JP2003505009A - ロイコトリエンｂ４受容体のトランスジェニック哺乳動物 - Google Patents

ロイコトリエンｂ４受容体のトランスジェニック哺乳動物

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JP2003505009A JP2000604675A JP2000604675A JP2003505009A JP 2003505009 A JP2003505009 A JP 2003505009A JP 2000604675 A JP2000604675 A JP 2000604675A JP 2000604675 A JP2000604675 A JP 2000604675A JP 2003505009 A JP2003505009 A JP 2003505009A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は白血球中にヒトＢＬＴＲの生理活性をもつ組み換えヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）を生産する、非ヒトトランスジェニック哺乳動物につき説明する。トランスジェニック哺乳動物は（Ａ）ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び、トランスジェニック哺乳動物の白血球中にＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球中にＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物をゲノム中に安定に取り込んでいる。一態様においては、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）はトランスジェニック哺乳動物の白血球中のＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように、遺伝子構造物中で操作可能に連結されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） 炎症及び二次的器官傷害の部位に対するＰＭＮ補充及び腐骨形成は、そのなか
でＬＴＢ4が非常に重要であると考えられている前炎症媒介物質により誘発され
る（Weissmann,G.,Smolen,J.E., and Korchak,H.M.1980. Release of inflammat
ory mediators from stimulated neutrophils. N.Engl.J.Med. 303:27-34; Samm
uelsson,B.1983. Leukotrienes: Mediators of inflammation and immediate hy
persensitivity. Science 220:568-575)。近年、ＬＴＢ4受容体（ＢＬＴＲ）は
また、宿主の防御におけるこのシステムの重要な役割を更に強調する、ＨＩＶ−
１侵入に対する共受容体として作用することが示された（Owman,C.1998. The le
ukotriene B4 receptor functions as a novel type of coreceptor mediating
entry of primary HIV-1 isolates into CD4-positive cells. Proc. Natl.Acad .Sci.USA 95:9530-9534）。アスピリンは、アスピリンの作用機序の完全な知識
を得ることの重要性を増加させる、心臓血管疾患の予防及び肺、大腸及び乳ガン
の発生率減少を含む幾つかの新規に確認された治療的作用を伴う、その抗炎症及
び鎮痛特性のために、広く使用されている（Marcus,A.J.1995.Aspirin as proph
ylaxis against colorectal cancer. N.Engl.J. Med.333:656-658）。アスピリ
ンを投与すると、プロスタノイドの生合成抑制に加えて、それはまた、アスピリ
ンのある治療的影響の一部を媒介するように見え、インビボで生成される、アス
ピリン引金ＬＸＡ4（ＡＴＬ）と称される１５エピマー又は１５Ｒ ＬＸＡ4の内
因性の経細胞生産の引金を引く。（Serhan,C.N.1997. Lipoxins and novel aspi
rin-triggered 15-epi-lipoxins(ATL). Prostaglandins 53:107-137; Chiang,N.
,Takano,T.,Clish,C.B.,Petasis,N.A. and Serhan C.N.1998. Aspirin-triggere
d 15-epi-Lipoxin A4(ATL) generation by human leukocytes and murine perit
onitis exudates: development of a specific 15-epi-LXA4 ELISA. J.Phar.Exp .Ther .287:779-790 ）。ＬＸＡ4は、これも１５−エピ−ＬＸＡ4を組み込むＡＬ
ＸＲと名付けたそれ自体の特異的なＧタンパク質結合受容体により白血球反応を
調節する（Serhan,C.N.1997.Lipoxins and novel aspirin-triggered 15-epi-li
poxins(ATL). Prostagrandins 53:107-137; Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,
Petasis,N.A. and Serhan C.N.1997. Neutrophil-mediated changes in vascula
r permeability are inhibited by topical application of aspirin-triggered
15-epi-lipoxin A4 and novel lipoxin B4 stable analogues. J.Clin.Invest.
101:819-826）。他の局部的媒介物質のように、ＬＸは早急に生成され、反応を
引き起こし、そして更なる代謝により不活性化される（Serhan,C.N.1997.Lipoxi
ns and novel aspirin-triggered 15-epi-lipoxins(ATL). Prostagrandins 53:1
07-137）。従って、同定された受容体と相互作用する、可能な薬剤、例えば抗炎
症剤をモニターし、研究しそしてスクリーニングする方法は興味深い。
【０００２】 （発明の要約） 本発明は、一つのアスペクトにおいて、白血球中にヒトＢＬＴＲの生理活性を
有する組み換えヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）を生産する非ヒト
トランスジェニック哺乳動物に関する。トランスジェニック哺乳動物は（Ａ）Ｂ
ＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び、トラ
ンスジェニック哺乳動物の白血球中にＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効
なシグナル配列をコードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球中にＤＮＡの過剰発現を
もたらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物をゲノム中に安定に組み込ん
でいる。一態様において（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、トランスジェニック哺乳
動物において白血球中のＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得えられるように遺
伝子構造物中で操作可能に連結されている。
【０００３】 本発明はもう一つのアスペクトにおいて、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有する組
み換えヒトＢＬＴＲの生産法に関する。本方法は（Ａ）ＢＬＴＲ特異性プロモー
ターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び、トランスジェニック哺乳動
物の白血球中にＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコー
ドするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球中にＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列
、を含む外来の遺伝子構造物をゲノム中に組み込んでいる非ヒトトランスジェニ
ック哺乳動物を提供することを含む。一態様において、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ
）は、トランスジェニック哺乳動物において白血球中のＢＬＴＲの生産及びその
過剰発現が得られるように遺伝子構造物中で操作可能に連結されている。ＢＬＴ
Ｒはトランスジェニック哺乳動物の白血球中に過剰発現し、分泌される。
【０００４】 本発明は更にもう一つのアスペクトにおいて、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有す
る組み換えヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）をその白血球中に生産
する非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生産する方法に関する。その方法は（
ａ）（Ａ）ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴ
Ｒ及び、トランスジェニック哺乳動物の白血球中にＢＬＴＲの過剰発現を誘導す
るために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球中にＤＮＡ
の過剰発現をもたらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物を提供すること
を含む。一態様において（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、トランスジェニック哺乳
動物において白血球中のＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように、遺
伝子構造物中で操作可能に連結されている。段階（ａ）の構造物は非ヒト哺乳動
物の胚中に導入され、そこで構造物は哺乳動物の胚のゲノム中に安定に組み込ま
れる。胚を非ヒトトランスジェニック哺乳動物中に発育させ、（ｃ）の非ヒトト
ランスジェニック哺乳動物がＢＬＴＲを過剰発現するかどうかが決定される。
【０００５】 本発明は更にもう一つのアスペクトにおいて、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有す
る組み換えヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）をその白血球中に生産
する非ヒトトランスジェニック哺乳動物において多形核白血球生産の過剰発現を
抑制する化合物をスクリーニングするための方法に関する。その方法は（ａ）（
Ａ）ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び
、トランスジェニック哺乳動物の白血球中にＢＬＴＲの過剰発現を誘導するため
に有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球中にＤＮＡの過剰
発現をもたらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物をゲノム中に組み込ん
でいる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供すること、を含む。一態様にお
いて（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、トランスジェニック哺乳動物において白血球
中のＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように、遺伝子構造物中で操作
可能に連結されている。ＢＬＴＲはトランスジェニック哺乳動物の白血球中に過
剰発現され、分泌される。トランスジェニック哺乳動物に生理学的ストレスをか
け、それにより過剰発現ＢＬＴＲにより白血球に好中球の補充増加を引き起こす
ことができる。治療的に有効量の化合物を哺乳動物に投与して、ストレスに反応
する好中球の補充と相互作用させる。次いで、化合物、例えばリポキシン誘導体
が、その中にＢＬＴＲを過剰発現したトランスジェニック哺乳動物の白血球の好
中球の活性化を減少させるかどうかを実験的に決定する。代替的には、段階（ｄ
）を段階（ｃ）の前に実施し、それにより好中球の活性化が予防又は抑制される
。
【０００６】 一つの好ましい態様においては、トランスジェニック哺乳動物はヒトのＢＬＴ
Ｒを生産する。もう一つの好ましい態様においては、ヒトのＢＬＴＲはヒトＢＬ
ＴＲのアミノ酸配列を有する。更にもう一つの好ましい態様においては、哺乳動
物はラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ又はウシからなる群、そして最も好ま
しくはマウスから選択される。哺乳動物が雌、例えば雌のマウスであることが好
ましい。
【０００７】 本発明は付記の図面に関連する下記の詳細な説明から、より十分に理解される
であろう。
【０００８】 （発明の詳細な説明） 今度は、本発明の特徴物及びその他の詳細がより具体的に説明され、特許請求
の範囲中に指摘されるであろう。本発明の具体的な態様は具体的例により示され
、本発明の制限としては示されていない。本発明の主要な特徴物を本発明の範囲
から逸脱せずに様々な態様に使用することができる。
【０００９】 略語：ＡＬＸＲ＝リポキシンＡ4受容体、ＡＴＬ＝アスピリン−引金１５−エ
ピ−ＬＸＡ4（ＡＴＬの類似物：１５−エピ−１６−パラ−フルオロ−フェノキ
シ−ＬＸＡ4（１５（Ｒ）−１６−パラ−フルオロ−フェノキシ−１７，１８，
１９，２０−テトラノール−ＬＸＡ4メチルエステル））、ＢＬＴＲ＝ロイコト
リエンＢ4受容体、５Ｓ−ＨＥＴＥ＝５Ｓ−ヒドロキシル−８，１１，１４−シ
ス−６−トランス−エイコサテトラエン酸、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ＝液体クロマトグ
ラフィータンデム型質量分析−質量分析、ＬＯ＝リポオキシゲナーゼ、ＬＴ＝ロ
イコトリエン、ＬＸ＝リポキシン、ＬＸＡ4＝５（Ｓ），６（Ｒ），１５（Ｓ）
−トリヒドロキシ−７，９，１３−トランス−１１−シス−エイコサテトラエン
酸、ＭＰＯ＝ミエロペルオキシダーゼ、及びＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写ポリメラーゼ
連鎖反応。リポキシン化合物の調製の適切な方法は例えば、引用により本明細書
に取り込まれている、米国特許第５，４１１，９５１号、第５，６４８，５１２
号、第５，６５０，４３５号及び第５，７５０，３５４号明細書に認めることが
できる。
【００１０】 好中球（ＰＭＮ）の活性化は急性の炎症及び再潅流からの傷害において中心的
である。インビボにおいて好中球を調節している構成成分を解明するために、機
能的特徴付けのためにヒト・ロイコトリエン（ＬＴ）Ｂ4受容体（ＢＬＴＲ）を
含む新規のトランスジェニックマウスを用意した。本発明に従うトランスジェニ
ック動物はＢＬＴＲ又はその変種をコードしている遺伝子を含んで成る核酸配列
を含んで成り、その遺伝子を過剰発現することができる。核酸は天然でも人工的
な供給源からのものでもよい。それはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（
ｃＤＮＡ）、ハイブリッド配列又は合成もしくは半合成配列の可能性がある。そ
れはヒト、動物、植物、バクテリヤ又はウイルス等の由来のものの可能性がある
。それは例えば、化学合成又は代替的には、配列の化学的もしくは酵素学的修飾
を含む混合法により、当業者に知られたあらゆる技法により得ることができる。
それは好ましくはｃＤＮＡ又はｇＤＮＡである。ヒトＢＬＴＲに対する完全なＤ
ＮＡ及びアミノ酸配列はその内容全体が引用により本明細書に取り込まれている
、Yokomizo et al.(1997)Nature 387:620-624に開示されており、更にGenBank A
ccession No.NM000752に認めることができる。
【００１１】 白血球中のＢＬＴＲの過剰発現は皮膚の微小膿瘍及び虚血−再潅流後の肺への
ＰＭＮ流通を劇的に増加し、一方５−リポオキシゲナーゼ（ＬＯ）欠乏マウスは
再潅流肺中への減少したＰＭＮ蓄積をもたらした。従ってＢＬＴＲ発現及びＬＴ
生合成の両方が再潅流−誘発の二次的器官傷害のＰＭＮ浸潤に対して重要である
。更にＢＬＴＲトランスジェニックマウスにおいて、５−ＬＯ発現及び生成物の
形成は浸潤物中に選択的に増加し、受容体の過剰発現が前−炎症回路を増幅する
ことを示している。外来のリポキシン（ＬＸ）Ａ4は虚血肺中に生成され、再潅
流により上昇された。ＬＸＡ4及び、アスピリン処置により生成されたアスピリ
ン−引金１５−エピマーＬＸＡ4（ＡＴＬ）は白血球の反応を選択的に調節する
ので、それらはＢＬＴＲトランスジェニックマウスにおいて試験される。ＢＬＴ
Ｒトランスジェニックマウスにおける過剰ＰＭＮの補充にもかかわらず、ＡＴＬ
の静脈内注射は遠隔器官への再潅流誘発ＰＭＮの流通を急激に減少させ、局部の
ＬＸＡ4は急性の皮膚の炎症において防御的であった。これらの結果はＰＭＮ調
節における、ＢＬＴＲ及び５−ＬＯ信号発信に関与する正のフィードバックを伴
う、ＢＬＴＲに対する直接的役割を示している。更に、ＬＸＡ4及びＡＴＬは、
手術時の薬剤の適用を有するストレス反応におけるＬＸ及びＡＴＬに対する新規
の防御的役割を示すＢＬＴＲ−増幅のネットワークに拮抗する。
【００１２】 ヒト及びマウスのＢＬＴＲの近年のクローニングは受容体及び遺伝子レベルに
おけるこの信号送信経路の解明を可能にした（Yokomizo,T.,Izumi,T.,Chang,K.,
Takuwa,Y. and Shimizu,T.1997. A G-protein-coupled receptor for leukotrie
ne B4 that mediates chemotaxis. Nature 387:620-624;Huang,W.W.,Garcia-Zep
eda,E.A.,Sauty,A.,Oettgen,H.C.,Rothenberg,M.E. et al.1998. Molecular and
bilogical characterization of the murine leukotriene B4 receptor expres
sed on esinophils. J.Exp.Med. 188:1063-1074）。これらのＢＬＴＲはそれぞ
れＡＬＸＲ並びに、ｆＭＬＰ、Ｃ５ａ及びＩＬ−８受容体により例示される受容
体のケミカイン及びケモスタチックペプチド族（〜３０％）と相同性を示すが、
プロスタノイド受容体には相同性を示さず、ＬＸ及びＬＴに対する受容体の供給
源はプロスタノイドに対するものと異なることの更なる証明を提供している（To
h,H.,Ichikawa,A. and Narumiya,S.1995. Molecular evolution of receptors f
or eicosanoids.FEBS Letters 361:17-21）。これらの方針に沿って、ヒトＢＬ
ＴＲ（ｈＢＬＴＲ）をもつトランスジェニックマウスを発育させた。使用可能な
５−ＬＯ欠乏マウスとともにこれらの新規のＢＬＴＲトランスジェニックマウス
を使用して、ＬＸＡ4及びＡＴＬが再潅流におけるＰＭＮ−誘発二次的器官傷害
を調節し、５−ＬＯ信号送信における新規の正の回路を暴露することが示された
（Funk C.D.1999. in “Molecular and Cellular Basis in Inflammation"(eds.
C.N.Serhan and P.A.Ward) Lipid -mediator-deficient mice in models of inf
lammation,pp.109-125. Humana Press, Totowa, NJ）。
【００１３】 本発明は、一アスペクトにおいて、その白血球中に、ヒトＢＬＴＲの生理活性
を有する組み換えヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）を生産する非ヒ
トトランスジェニック哺乳動物に関する。トランスジェニック哺乳動物は（Ａ）
ＢＬＴＲ特異的プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び、ト
ランスジェニック哺乳動物の白血球中へＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有
効なシグナル配列をコードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球にＤＮＡの過剰発現を
もたらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物をゲノム中に安定に組み込ん
でいる。一態様において、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）はトランスジェニック哺乳
動物の白血球中のＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように遺伝子構造
物中で操作可能に連結されている。
【００１４】 本発明はもう一つのアスペクトにおいて、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有する組
み換えヒトＢＬＴＲの生産法に関する。その方法は（Ａ）ＢＬＴＲ特異的プロモ
ーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び、トランスジェニック哺乳
動物の白血球中へＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコ
ードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球にＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列
、を含む外来の遺伝子構造物をそのゲノム中に安定に組み込んでいる非ヒトトラ
ンスジェニック哺乳動物を提供することを含む。一態様においては、（Ａ）、（
Ｂ）及び（Ｃ）は、トランスジェニック哺乳動物の白血球中のＢＬＴＲの生産及
びその過剰発現が得られるように遺伝子構造物中で操作可能に連結されている。
ＢＬＴＲはトランスジェニック哺乳動物の白血球中に過剰発現され、分泌される
。
【００１５】 本発明は、更にもう一つのアスペクトにおいて、その白血球中に、ヒトＢＬＴ
Ｒの生理活性を有する組み換えヒト・ロイコトリエン受容体（ＢＬＴＲ）を生産
する非ヒトトランスジェニック哺乳動物の生産法に関する。その方法は（Ａ）Ｂ
ＬＴＲ特異的プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）ＢＬＴＲ及び、トラ
ンスジェニック哺乳動物の白血球中へＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効
なシグナル配列をコードするＤＮＡ並びに（Ｃ）白血球にＤＮＡの過剰発現をも
たらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物をそのゲノム中に安定に組み込
んでいる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供することを含む。一態様にお
いては、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）はトランスジェニック哺乳動物の白血球中の
ＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように、遺伝子構造物中で操作可能
に連結されている。段階（ａ）の構造物は非ヒト哺乳動物の胚中に導入され、そ
こで構造物は哺乳動物の胚のゲノム中に安定に組み込まれる。胚は非ヒトトラン
スジェニック哺乳動物中に発育を許され、（ｃ）の非ヒトトランスジェニック哺
乳動物がＢＬＴＲを過剰発現するかどうかを決定される。
【００１６】 本発明は更にもう一つのアスペクトにおいて、その白血球中に、ヒトＢＬＴＲ
の生理活性を有する組み換えヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）を生
産する非ヒトトランスジェニック哺乳動物における多形核白血球生産の過剰発現
を抑制する化合物をスクリーニングする方法に関する。その方法は（ａ）（Ａ）
ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発現調節配列、（Ｂ）前記ＢＬＴＲ及び
前記トランスジェニック哺乳動物の白血球中に前記ＢＬＴＲの過剰発現を誘導す
るために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ、並びに（Ｃ）前記白血球中に
前記ＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列、を含む外来の遺伝子構造物をそ
のゲノム中に組み込んでいる非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供すること
を含む。一態様においては、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、トランスジェニック
哺乳動物における白血球中の前記ＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるよ
うに遺伝子構造物中で操作可能に連結されている。ＢＬＴＲはトランスジェニッ
ク哺乳動物の白血球中に過剰発現され、分泌されることを許される。トランスジ
ェニック哺乳動物に生理学的ストレスをかけて、それにより過剰発現ＢＬＴＲに
よる白血球への好中球補充増加を惹起させることができる。ストレスに反応する
好中球の補充と相互作用するために、治療的に有効量の化合物を哺乳動物に投与
する。次いで、化合物、例えばリポキシン誘導体が、その中にＢＬＴＲを過剰発
現したトランスジェニック哺乳動物の白血球中の好中球活性化を減少するかどう
かを実験的に決定する。代替的には、段階（ｄ）を段階（ｃ）の前に実施して、
それにより、好中球活性化を予防又は抑制する。
【００１７】 一つの好ましい態様においては、トランスジェニック哺乳動物はヒトＢＬＴＲ
を生産する。もう一つの好ましい態様においては、ヒトＢＬＴＲはヒトＢＬＴＲ
のアミノ酸配列を有する。更にもう一つの好ましい態様においては、哺乳動物は
ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ又はウシからなる群から、そして最も好ま
しくはマウスから選択される。その哺乳動物が雌である、例えば雌マウスである
ことが好ましい。
【００１８】 材料及び方法 ｈＢＬＴＲのクローニン及び機能的発現 TriZol試薬（GIBCO BRL, Grand Island, NY）を使用して総ＲＮＡをレチノイ
ン酸分化ＨＬ−６０細胞から単離し、５０℃で３０分間、逆転写し、次いでｈＢ
ＬＴＲに対する特異的プライマー（ＢＬＴＲ−Ｎ：５’−ＧＣＣＧＧＡＴＣＣＡ
ＴＧＡＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡ−３’及びＢＬＴＲ−Ｃ：５’−Ｇ
ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴ−３’）ととも
にVentＤＮＡポリメラーゼ（New England BioLabs, Beverly, MA)を使用する４
０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（１分間９８℃、１分間６０℃及
び２分間７２℃）を実施した（Fiore,S.,Romano,M.,Reardon,E.M. and Serhan,C
.N.1993. Inductin of functional lipoxin A4 receptors in HL-60 cells. Blo od 81:3395-3403）。ｈＢＬＴＲのｃＤＮＡをＣＤIIｂプロモーターの下流のＨ
ｉｎｄIII−ＰｐｕＭＩサイトでｐＧＬベクター（Promega）中に挿入した。ＨＥ
Ｋ２９３細胞をSuperFect試薬（Qiagen, Chatsworth, CA）を使用してこのｐＧ
Ｌ−ＣＤIIｂ−ｈＢＬＴＲ構造物とトランスフェクションさせた。それぞれ参考
文献（Yokomizo,T.,Izumi,T.,Chang,K.,Takuwa,Y.and Shimizu,T.1997. A G-pro
tein-coupled receptor for leukotriene B4 that mediates chemotaxis. Natur e 387:620-624）及び(Ng,C.F.,Sun,F.F.,Taylor,B.M.,Wolin,M.S. and Wong,P.Y
.1991. Functional properties of guinea pig eosinophil eukotriene B4 rece
ptors. J.Immunol. 147:3096-3103)におけるように、リガンドの結合及び細胞内
Ｃａ2+放出を実施した。安定なトランスフェクションのためにｈＢＬＴＲのｃＤ
ＮＡをネオマイシン耐性遺伝子を担持するｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen,
Carlsbad, CA）中に挿入した。ｈＡＬＸＲのｃＤＮＡを、異なる選択マーカー（
ブラスチシジン耐性遺伝子）を担持するｐｃＤＮＡ６（Invitrogen, Carlsbad,
CA）に挿入した。ＨＥＫ２９３細胞を両方の構造物でトランスフェクションし、
ネオマイシン及びブラスチシジンの両方で選択した。（Gronert,K.,Colgan,S.P.
and Serhan C.N.1998. Characterization of human neutrophil and endotheli
al cell ligand-operated extracellular acidification rate by microphysiom
etry:impact of reoxyganation.J.Phar.Exp.Ther.285:252-261）におけるように
、細胞外酸性化速度（ＥＡＲ）のCytosensorの微量物理測定分析を実施した。
【００１９】 ｈＢＴＲトランスジェニックマウスの準備及び同定 ｈＢＬＴＲトランスジェニック遺伝子（transgene）をＮｏｔＩ及びＢａｍＨ
Ｉによるプラスミド（ｐＧＬ−ＣＤIIｂ−ｈＢＬＴＲ）の消化により得、Ｅｌｕ
ｔｉｐ（Schleicher & Schuell, Keene, NH）により精製した。精製トランスジ
ェニック遺伝子をマイクロインジェクションによりマウス（ＦＶＢ種）の胚中に
注入し、次いで仮親マウスに移植した。トランスジェニック遺伝子を取り込んだ
トランスジェニック創始マウスは同種のマウスとともに飼育された。トランスジ
ェニック創始マウスからの正の子マウスは、マウスの全血から単離したゲノムＤ
ＮＡを使用してＰＣＲにより同定された。端的に言うと、血液１５μｌを各マウ
スから採血し、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％ＮＰ−４０を含む１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）２５０μｌ中に再懸濁した。細胞材料を５分間１１，０
００ｒｐｍの遠心分離により得て、０．１％トリトンＸ−１００を４０μｌ及び
０．４ＮのＮａＯＨ１０μｌ中に再懸濁させて、細胞膜を部分的に消化してタン
パク質を変性させた。次いで、それらを５分間９５℃に加熱し、氷上で冷却し、
１Ｍのトリス（ｐＨ７．５）１０μｌで中和し、そして各試料（１μｌ）を２５
μｌのＰＣＲに使用した。高温開始ＰＣＲ（Ｖｅｎｔポリメラーゼ添加前５分間
９８℃）をプライマーＢＬＴＲ−Ｎ及びＢＬＴＲ−Ｃによる４０サイクルの増幅
（１分間の９８℃、１分間の６０℃及び２分間の７２℃）により実施した。ｈＢ
ＬＴＲ及び５−ＬＯ発現を証明するために、カゼイン誘発腹膜炎（２％カゼイン
、４時間）を有するマウスからの腹腔白血球を、（Chiang,N.,Takano,T.,Clish,
C.B.,Petasis,N.A. and Serhan C.N.1998. Aspirin-triggered 15-epi-Lipoxin
A4(ATL) generation by human leukocytes and murine peritonitis exudates:
development of a specific 15-epi-LXA4 ELISA. J.Phar.Exp.Ther.287:779-790
.）におけるように採取し、総ＲＮＡを単離した。ヒト及びマウスＢＬＴＲの両
方を増幅する、プライマーＢＬＴＲ−III：５’−ＴＡＣＧＣＣＡＧＣＧＴＣＣ
ＴＧＣＴＴ−３’及びＢＬＴＲ−ＶII：５’−ＧＣＴＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣ
ＧＡＧ−３’を使用して前記と本質的に同様な条件を使用して逆転写（ＲＴ）−
ＰＣＲを実施した。５−ＬＯを増幅するためには、マウス特異性の有意な（５’
−ＡＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＣＡＣＧＧＣＣＡＧＧ−３’）及びアンチセンス（５
’−ＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＴＣＧＴＴＴＴＣＣＴＧ−３’）プライマーを使用
した。
【００２０】 耳の皮膚の炎症モデル ｈＢＬＴＲトランスジェニック及びｗｔマウスを麻酔し、N.A.Petasis教授及
びその共同研究者、 Dept. of Chemistry, Univ. of Southern Californiaによ
る参考文献７におけるような総合的合成により調製した１６−フェノキシル−Ｌ
ＸＡ4（１５（Ｓ）−１６−フェノキシ−１７，１８，１９，２０−テトラノー
ル−ＬＸＡ4メチルエステル（１０μｇ）（１０μｌのアセトン中）を右耳の内
側に投与した。ビヒクルの対照として左耳にアセトンのみを投与した。５分後に
、ＬＴＢ4（５Ｓ，１２Ｒ−ジヒドロキシ−６，８，１０，１４−エイコサテト
ラエン酸；１μｇ）（１０μｌのアセトン中）を両耳に投与した。耳の皮膚穿孔
生検物を白血球ＭＰＯ活性のために採取した（Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K
.,Petasis,N.A. and Serhan C.N.1997. Neutrophil-mediated changes in vascu
lar permeability are inhibited by topical application of aspirin-trigger
ed 15-epi-lipoxin A4 and novel lipoxin B4 stable analogues. J.Cin.Invest .101:819-826）。
【００２１】 後肢の虚血−再潅流に誘発された二次的器官傷害 マウスを麻酔し、（Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,Petasis,N.A. and Ser
han C.N.1997. Neutrophil-mediated changes in vascular permeability are i
nhibited by topical application of aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 a
nd novel lipoxin B4 stable analogues. J.Cin.Invest.101:819-826）における
ように調製したＡＴＬ類似体の１５−エピ−１６−パラ−フルオロ−フェノキシ
−ＬＸＡ4（１５（Ｒ）−１６−パラーフルオロ−フェノキシ−１７，１８，１
９，２０−テトラノール−ＬＸＡ4メチルエステル）又はビヒクルをトランスジ
ェニックマウスに静脈内投与した。約５分後に、止血帯を各後肢の周囲に、中心
に近位に配置して金属クランプで固定した（Goldman,G.,Welbourn,R.,Klausner,
J.M.,Kobzik,L.,Valeri,C.R. et al.1992. Mast cells and leukotrienes media
te neutrophil sequestration and lung edema after remote ischemia in rode
nts. Surgery 112:578-586）。脚の充血及び脱色により血管閉塞が証明された。
虚血の３時間後に、止血帯を外し、３時間再潅流を実施した。次いで、５−ＬＯ
（＋／＋）及び（−／−）マウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEからの
)並びにｈＢＴＲトランスジェニックマウスをHarvard Medical Area Standing C
ommittee on Animal(ハーバード医学部門動物監視委員会）（プロトコール番号
０２５７０−Ｒ９８）に従い、過剰量のペントバルビタール腹腔内注射で安楽死
させた（Chen,X.-S,Sheller,J.R.,Johnson,E.N. and Funk,C.D.1994. Role of l
eukotrienes revealed by targeted disruption of the 5-lipoxygenase gene. Nature 372:179-182）。左肺を採取し、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４
）１．５ｍｌ中にホモジナイズし、次いで１４，０００ｒｐｍ（５分間）で遠心
分離した。沈澱物を更に白血球ＭＰＯ分析のために抽出し、上澄み液をエイコサ
ノイド分析のために貯蔵（−８０℃）した（Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,
Petasis,N.A. and Serhan C.N.1997. Neutrophil-mediated changes in vascula
r permeability are inhibited by topical application of aspirin-triggered
15-epi-lipoxin A4 and novel lipoxin B4 stable analogues. J.Cin.Invest.1
01:819-826）。
【００２２】 ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析 ネズミの腹腔浸潤物をカゼイン誘発腹膜炎から得て、３０分間３７℃でＡ２３
１８７（５μＭ）とともにインキュベーションした。回復性を計算するための内
部標準としてそれぞれにｄ4−ＬＴＢ4（６，７，１４，１５−ジューテリウム［
ｄ4］−ＬＴＢ4を１０ｎｇを添加した、固体−相抽出クロマトグラフィー（ＳＰ
Ｅ）（Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,Petasis,N.A. and Serhan C.N.1997.
Neutrophil-mediated changes in vascular permeability are inhibited by to
pical application of aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 and novel lipox
in B4 stable analogues. J.Cin.Invest.101:819-826）により試料を調製した。
液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を電子ス
プレーイオン化プローブの付いたＬＣＱ（Finnigan Corp.,San Jose,CA）イオン
トラップ質量分析システムで実施した。試料を移動相に懸濁させ、４分の一勾配
ポンプ、ＬＵＮＡ Ｃ１８−２（１５０×２ｍｍ、５μｍ）カラム（Phenomenex
, Torrance, CA）及び走査ＵＶ／ＶＩＳ吸収検出計からなるＨＰＬＣ構成部品（
Thermo Separation Products, San Jose, CA）中に注入した。カラムをメタノー
ル／水／酢酸（６５／３５／０．０１、ｖ／ｖ／ｖ）で２０分間０．２ｍｌ／分
で無勾配で、次いで９９．９９／０．０１メタノール／酢酸（ｖ／ｖ）への２０
分間の直線勾配で溶離させた。質量スペクトルを、５ｋＶに設定したスプレー電
圧で陰イオンモード、２５０℃に加熱した毛細管及び３５０ｍｓの最大イオン注
入時間で記録した。選択されたイオンモニター（ＳＩＭ）質量スペクトルを分子
アニオン（［Ｍ−Ｈ］-）について生成物のイオンスペクトル（ＭＳ／ＭＳ）を
記録して、溶離期間中ｍ／ｚ３１５〜３６０間で測定した。
【００２３】 統計的分析 結果は平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントのｔ−試験を統計的に有意と
考えられるＰ値＜０．０５で実施した。
【００２４】 結果及び考察 トランスジェニックマウスを、（Yokomizo,T.,Izumi,T.,Chang,K.,Takuwa,Y.
and Shimizu,T.1997. A G-protein-coupled receptor for leukotriene B4 that
mediates chemotaxis. Nature 387:620-624）で報告された配列を使用して、（
Funk C.D.1999.In “molecular and Cellular Basis of Inflammation" (eds.C
.N.Serhan and P.A.Ward) Lipid-mediator-deficient mice in models of infla
mmation,pp.109-125. Human Press,Totowa,NJ）におけるようなＬＴＢ4結合及び
信号発信を示すレチノイド酸分化ＨＬ−６０細胞からクローニングしたヒトＢＬ
ＴＲにより、これらの実験のために準備した。このＢＬＴＲトランスジェニック
遺伝子を、（Dziennis,S.,Van Etten,R.A.,Pahl,H.L.,Morris,D.L.,Rothstein,T
.L. et al. 1995. The CDIIb promoter directs high-level expression of rep
orter genes in macrophages in transgenic mice. Blood 85:319-329）におけ
るように、白血球中に高度に異型の遺伝子発現を誘導するＣＤIIｂプロモーター
（図１Ａ）のコントロール下に置いた。クローンを確認するために、ヒト胚の腎
臓細胞（ＨＥＫ２９３）をｈＢＬＴＲのｃＤＮＡ（ｐＧＬ−ＣＤIIｂ−ｈＢＬＴ
Ｒ）でトランスフェクションさせた。これらの細胞は特異的［3Ｈ］−ＬＴＢ4結
合及び、細胞内Ｃａ2+のリガンド刺激移動（図１Ａ）の両方を示し、ｈＢＬＴＲ
トランスジェニックマウスを準備するためのその使用の適確性を示している。正
のｈＢＬＴＲトランスジェニックマウスから腹腔白血球浸潤物（カゼイン誘発腹
膜炎から）を採取し、年令及び種の合致した野生タイプ（ｗｔ）に比較してＢＬ
ＴＲメッセージレベルの〜７倍の増加を示し（図１Ｂ、挿入図）、ｈＢＬＴＲト
ランスジェニック遺伝子（transgene）が事実、発現し、総ＢＬＴＲ発現が劇的
に増加したことを示す。興味深いことには、これらのｈＢＬＴＲトランスジェニ
ックマウスは健康で、特別のチャレンジ（下記を参照されたい）の不在下で、明
白な大きな病理学的所見をもたないように見えた。
【００２５】 マウスの耳の皮膚に局所投与したＬＴＢ4は急性の皮膚の炎症反応においてＰ
ＭＮ流入及び微小膿瘍を誘発する（Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,Petasis,
N.A. and Serhan C.N. 1997. Neutrophil-mediated changes in vascular perme
ability are inhibited by topical application of aspirin-triggered 15-epi
-lipoxin A4 and novel lipoxin B4 stable analogues. J. Clin. Invest. 101:
819-826）。本発明のトランスジェニックマウスは皮膚中へのＰＭＮ浸潤の著し
い増加（７．４±０．９倍）をもたらし（図１Ｂ）、一方ｗｔの反応はビヒクル
の対照に比較して３．２±０．５倍だけ増加した。著しく対照的には、ＬＴＢ4
の天然の前駆体すなわちアラキドン酸（１０μｇ）、又はタンパク質キナーゼＣ
の直接的拮抗物フォルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（１００ｎｇ
）のいづれかによる耳の皮膚へのＰＭＮ浸潤はｈＢＬＴＲトランスジェニックマ
ウスにおいて増加しなかった。両方の薬剤は耳の皮膚の組織構造を破壊しないレ
ベルで投与された。これらの所見は、ｈＢＬＴＲが機能的に発現し、皮膚におけ
るＬＴＢ4誘発ＰＭＮ微小膿瘍の形成の著しい増幅と直接相関したことを示して
いる。
【００２６】 ＬＸＡ4がこの増幅されたＬＴＢ4−ＢＬＴＲ信号送信経路を調節するかどうか
、そしてこれらのＢＬＴＲトランスジェニックマウスがｗｔマウスのようにＬＸ
Ａ4に反応するかどうかを決定するために、早急な不活性化に抵抗し、ＬＸＡ4の
作用を模倣する安定なＬＸ類似体（ＬＸＡ4類似テンプレート構造体に対しては
図１Ｃの挿入図を参照されたい）をＰＭＮ流通を調節するその能力につき試験し
た（Serhan,C.N.1997. Lipoxins and novel apririn-triggered 15-epi-lipoxin
s (ATL) Prostaglandins 53:107-137;Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,Petasi
s,N.A. and Serhan C.N. 1997. Neutrophil-mediated changes in vascular per
meability are inhibited by topical application of aspirin-triggered 15-e
pi-lipoxin A4 and novel lipoxin B4 stable analogues. J. Clin. Invest. 10
1:819-826）。ｈＢＬＴＲトランスジェニックマウスの過剰ＰＭＮ浸潤にもかか
わらず、ＬＸＡ4安定な類似体の局所的投与はＰＭＮ浸潤を明白に抑制すること
ができた（図１Ｃ、ｎ＝３からの代表的データ）。ｗｔマウスに対するｈＢＬＴ
Ｒトランスジェニックマウスにおける抑制百分率（〜４５％対〜３７％）は有意
差であるとは証明されなかった。更に、大きさにおいては、ＬＸＡ4の安定な類
似体は、これらの穿孔生検からの白血球ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性
を目盛り合わせして、ＰＭＮの総数に変換する時に明白なように、ｗｔマウスに
おけるよりもｈＢＬＴＲトランスジェニックマウスにおいて３倍も多数のＰＭＮ
の浸潤を抑制した（図１Ｃ）。ＡＬＸＲのメッセージレベルの明白な増加は認め
られなかった。従って、ＬＸＡ4及びＡＬＸＲはインビボのＢＬＴＲ調節のため
の強力な系を構成する。ＢＬＴＲ又は、安定なトランスフェクション物質として
ＡＬＸＲと一緒にＢＬＴＲを発現するＨＥＫ２９３細胞における特異的結合及び
信号発信が試験された。ＬＸＡ4は［3Ｈ］−ＬＴＢ4結合体と競合せず（図１Ｄ
）、ＬＸＡ4又はその類似体はＬＴＢ4−惹起細胞外酸性化速度にも影響を与えな
かった（図１Ｅ）（Gronert,K.,Colgan,S.P. and Serhan C.N. 1998. Character
ization of human neutrophil and endothelial cell ligand-operated extrace
llular acidification rate by microphysiometry: impace of reoxygenation. J.Phar.Exp.Ther .285:252-261）。従って、ＡＬＸＲ活性化は指標のＬＴＢ4−Ｂ
ＬＴＲ認識物である信号の形質導入成分を抑制する。
【００２７】 虚血−再潅流は主要な臨床的重要性をもつ事例である。再潅流傷害におけるＢ
ＬＴＲ及びＬＴ両者の形成の寄与を評価するために、５−ＬＯ欠乏及びｈＢＬＴ
Ｒトランスジェニックマウス（図２Ａ及びＢ）の両者で、二次的器官傷害の後肢
止血モデルを使用した（Goldman,G.,Welbourn,R.,Klausner,J.M.,Kobzik,L.,Val
eri,C.R. et al. 1992. Mast cells and leukotrienes mediate neutrophil seq
uestration and lung edema after remote ischemia in rodents. Surgery 112:
578-586）。ヒトにおいて、手術に基づいたクランプ手順が異型のＰＭＮ活性化
をもたらして、より長期の入院の原因となる二次的器官傷害をもたらすことは周
知である（Gelman,S.1995. The pathophysiology of aortic cross-clamping an
d unclamping. Anesthesiology 82:1026-1060）。５−ＬＯ（＋／＋）及び（−
／−）マウスは、疑似処理マウス（図２Ａ）に比較して、肺中への白血球蓄積を
それぞれ〜１０倍及び〜５倍の増加をもたらし、５−ＬＯ誘導生成物（例えばＬ
ＴＢ4、図３の挿入図を参照されたい）が後肢虚血−再潅流後の肺中へのＰＭＮ
補充の主要な媒介物質であることを示した。薬理学的証拠は、マウス及びラット
における虚血−再潅流−誘導の二次的器官傷害における一成分として、ＬＴＢ4
を示唆した（Goldman,G.,Welbourn,R.,Klausner,J.M.,Kobzik,L.,Valeri,C.R. e
t al. 1992. Mast cells and leukotrienes mediate neutrophil sequestration
and lung edema after remote ischemia in rodents. Surgery 112:578-586; S
eekamp,A. and Ward,P.A.1993. Ischemia-reperfusion injury. Agents Actions
(Suppl.)41:137-152）。５−ＬＯ（−／−）マウスのＰＭＮ補充を伴う結果は
また、ＰＭＮ補充が内因性ＬＴＢ4形成の不在下で起こるので（図２Ａ）、Ｃ５
ａ、Ｉ−８及びＰＡＦのような他の媒介物質の寄与を示した（Gronert,K.,Colga
n,S.P. and Serhan C.N. 1998. Characterization of human neutrophil and en
dothelial cell ligand-operated extracellular accidification rate by micr
ophysiometry: impace of reoxygenation. J.Phar.Exp.Ther.285:252-261）。ｈ
ＢＬＴＲトランスジェニックマウスはまた、ｗｔマウスに比較して、再潅流後の
肺中へのＰＭＮ浸潤の劇的な増加を示した（図２Ｂ）。これらの遺伝子操作され
たマウス、すなわち５−ＬＯ欠乏及びｈＢＬＴＲトランスジェニックマウスから
の結果を合わせると、ＢＬＴＲ及びＬＴ両者の形成の高められた様相は虚血−再
潅流に誘起された二次的器官傷害において重要な事例であり、従って、手術時の
処置の更なる考慮のための可能な治療の標的であることを示す。
【００２８】 ＰＭＮ誘導の反応を調節するためのＬＸＡ4の能力を考慮すると、ＬＸＡ4が虚
血−再潅流期間に生成されるかどうか、そしてそれがトランスジェニック増幅Ｂ
ＬＴＲ信号発信に影響を有するかどうかを決定することは興味深い（Serhan,C.N
.1997. Lipoxins and novel apririn-triggered 15-epi-lipoxins(ATL) Prostag landins 53:107-137）。後肢虚血マウスは肺中の内因性ＬＸＡ4量の増加を示し
、止血帯の取り外し（再潅流）が更にこれらのレベルを増加させた（図２Ｃ）。
従って、アスピリン−引金ＬＸＡ4（ＡＴＬ）類似体（１５−エピ−ＬＸＡ4類似
体のテンプレート構造物については図２Ｄの挿入図を参照されたい）が、後肢虚
血−再潅流の前にｈＢＬＴＲトランスジェニックマウスへの静脈内注射により投
与された。ＡＴＬの投与は、ビヒクルのみを注射したｈＢＬＴＲトランスジェニ
ックマウスに比較すると、肺中へのＰＭＮ浸潤を著しく減少させた（図２Ｄ）。
従って、虚血組織内のＬＸＡ4形成及び再潅流によるその上昇はＰＭＮの流通及
びＰＭＮ媒介の損傷を制限するための内因性の代償的又は防御的役割を表すかも
知れない。これは、ＢＬＴＲ−誘起ＰＭＮ浸潤を減衰させる、虚血−再潅流の前
のＡＴＸＲ拮抗体（例えば、内因性ＬＸＡ4よりも持続性のＡＴＬ安定類似体、
を参照されたい）の血管内注射による結果により支持される（Serhan,C.N.1997.
Lipoxins and novel apririn-triggered 15-epi-lipoxins (ATL) Prostaglandi ns 53:107-137；Takano,T.,Clish,C.B.,Gronert,K.,Petasis,N.A. and Serhan C
.N. 1997. Neutrophil-mediated changes in vascular permeability are inhib
ited by topical application of aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 and n
ovel lipoxin B4 stable analogues. J. Clin. Invest. 101:819-826）。更に、
ＡＴＬは５−ＬＯ（−／−）又はＢＬＴＲトランスジェニックマウスのいずれか
において認めたＰＭＮ浸潤を、大体相反的レベル（４０〜６０％変化）で抑制し
たので（図２Ａ、Ｂ及びＤ）、それらの相反性はこれらの遺伝子的に規定された
マウスにおけるＬＸＡ4−ＬＴＢ4調節系の重要性を強調している。
【００２９】 興味深いことには、ＢＬＴＲトランスジェニックマウスにおいては、組織的な
液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に基づい
た分析を使用して、５Ｓ−ＨＥＴＥ（図３Ａ）（５−ＬＯの生成物、図３Ｂの挿
入図を参照されたい）の生成は、ｗｔに比較して（図３Ｂ）腹膜の炎症の浸潤物
中で選択的にそして劇的に上昇したことを認めた。それに比較して、１５Ｓ−Ｈ
ＥＴＥ，１２Ｓ−ＨＥＴＥ（図３Ｂ）又はＬＴＢ4を含む主要なリポオキシゲナ
ーゼ経路からの他のモノ−ＨＥＴＥの量には有意差を認めなかった。５Ｓ−ＨＥ
ＴＥはまた、ＬＴＢ4よりは弱いが、ＰＭＮ化学吸引物であることは注目に値す
る（Capodici,C.,Pillinger,M.H.,Han,G.,Philips,M.R. and Weissmann,G.1998.
Integrin-dependent homotypic adhesion of neutrophils. Arachidonic acid
activates Raf-1/Mek/Erk via a 5-lipoxygenase-dependent pathway. J.Clin.I nvest . 102:165-174）。腹腔白血球内の５−ＬＯ転写の発現はｈＢＬＴＲトラン
スジェニックマウスにおいて〜３．５倍高い（図３Ｂ、挿入図）。ＢＬＴＲトラ
ンスジェニックマウスにおいてＬＴＢ4でなく５Ｓ−ＨＥＴＥに認められた増加
は、このモデルの増加したＬＴＢ4使用及び消失（すなわち、更なる代謝）を反
映している可能性がある。シクロオキシゲナーゼ−２のメッセージレベルの明白
な増加は認めなかった。更に、シクロオキシゲナーゼ生成物（例えば、プロスタ
グランジンＥ2）の著しい上昇はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析では認めなかった。従っ
て、ＢＬＴＲの過剰発現はインビボで明白な５−ＬＯ遺伝子転写のレベルで作用
することにより前炎症ネットワークを特異的に上昇させ（図３Ｂ）、５−ＬＯ経
路内のこの正のフィードバックを広範囲の疾病状態において操作可能である可能
性があろうことを示唆している。
【００３０】 この所見はＢＬＴＲの過剰発現が急性の皮膚の炎症、腹膜炎及び再潅流−誘発
の二次的器官損傷のネズミモデルにおけるＰＭＮの補充、機能及び５−ＬＯ信号
発信を著しく増幅することの第１の証明を提供する。更に、研究のこれらの独立
した結果を総合すると、ＰＭＮ活性化の調節及び５−ＬＯ経路の調節増強におけ
るＢＬＴＲ発現のインビボの役割に対する第１の直接的証明を提供する。更に、
それらは宿主の反応並びに虚血−再潅流における重要な調節段階としての受容体
の発現の影響を強調しており、ヒトの免疫機能の調節に関係しているサイトカイ
ンによるＡＬＸＲ（Gronert,K.,Gewirtz,A.,Madara,J.L. and Serhan,C.N.1998.
Identification of a human enterocyte lipoxin A4 receptor that is regula
ted by interleukin(IK)-13 and interferon γ and inhibits tumor necrosis
factor α-induced IL-8 release. J.Exp.Med.187:1285-1294）及びＢＬＴＲ（H
uang,W-W.,Garcia-Zepeda,E.A.,Sauty,A.,Ottegen,H.C.,Rothenberg,M.E. et al
. 1998. Molecular and biological characterization of the murine leukotri
ene B4 receptor expressed on eosinophils. J.Exp.Med.188:1063-1074）の発
現の調節と一致している。更に、これらの結果は、過剰なＰＭＮ浸潤及び活性化
を特徴とし、それらにより悪化される炎症性疾患及び再潅流−関連の傷害の事例
を選択的に調節するための、調節信号拮抗体、すなわちＡＬＸＲ拮抗体及び安定
なアスピリン−引金ＬＸの使用に対する新規な道筋を開く。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】 当業者の一人は前記の態様に基づいた本発明の更なる特徴物及び利点を認識す
るであろう。従って、本発明は付記の特許請求の範囲に示されたものを除いて、
具体的に示され、説明されたものにより制約はされない。本明細書に引用された
すべての刊行物及び参考文献は発明の背景の節に引用されたものを含み、それら
の全体を引用により本明細書に特に取り入れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＬＸＡ4の局所投与がＬＴＢ4−ＢＬＴＲの認識を妨げずにｈＢＬＴＲトランス
ジェニックマウスのＰＭＮ浸潤を抑制することを示す。（Ａ）ｐＧＬ−ＣＤIIｂ
−ｈＢＬＴＲ及び偽物（ｐＧＬ）のプラスミドをＨＥＫ２９３細胞中に一時的に
トランスフェクションさせ、細胞内Ｃａ2+をＬＴＢ4（１００ｎＭ）の添加によ
り移動させた。（Ｂ）ＬＴＢ4（１μｇ）をｗｔマウス（影線棒）及びトランス
ジェニックマウス（充填棒）の右耳に局所投与した。左耳はビヒクルのみ（アセ
トン）を受けた。耳の皮膚の生検試料をＭＰＯ分析のために採取し、その値はビ
ヒクルの対照より倍の増加を示す（＊ｐ＜０．０１、ｗｔに対してｎ＝７、そし
てＴＧ−ｈＢＬＴＲに対してｎ＝１０）。ｗｔ及びｈＢＬＴＲトランスジェニッ
クマウスのＢＬＴＲ発現は矢印（挿入図）により示されるように〜０．５ｋｂに
おいて期待されたバンドを与えたｈＢＬＴＲ−III及びｈＢＬＴＲ−ＶIIIプライ
マーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより分析した。（Ｃ）ＬＸＡ4の安定な類似体（
１０μｇ）１６−フェノキシ−ＬＸＡ4（挿入図：ＬＸＡ4類似テンプレートＲ2
＝フェノキシ）をｗｔ及びｈＢＬＴＲトランスジェニックマウス（灰色）の右耳
に局所投与した。左耳はビヒクルのみ（黒）を受けた。次いで、５分後にＬＴＢ 4 （１μｇ）を各マウスの両耳に投与した。皮膚の生検を前記のように得た。値
は耳の皮膚中へのＰＭＮ浸潤物総数を表す（ｎ＝３からの代表的データ）。（Ｄ
）ＢＬＴＲで安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞において、ＬＴ
Ｂ4（正方形、構造が示されている）、ＬＸＡ4（菱形）又はＬＸＢ4（丸）によ
る特異的［3Ｈ］−ＬＴＢ4結合の置き換えを決定した。（Ｅ）ＬＸＡ4及びＬＴ
Ｂ4に反応する細胞外酸性化速度（ＥＡＲ）を、ＢＬＴＲ及びＡＬＸＲ（安定な
トランスフェクション物質）を含むＨＥＫ２９３細胞においてCytosensor微量物
理学測定により分析した。細胞をＬＴＢ4（１μＭ）にさらす２０分前にＬＸＡ4 （１μＭ、中空円）又は溶媒のみ（充填円）にさらした。値は基底線（１００％
）に標準を合わせたＥＡＲ（μＶ／ｓ）として表され、リガンドの添加は矢印で
示されている。
【図２】 ５−ＬＯ経路及びＢＬＴＲが後肢虚血−再潅流後の肺中へのＰＭＮ浸潤の主要
な決定因子であることを示す：アスピリン−引金ＬＸＡ4による抑制。（Ａ）５
−ＬＯ（−／−）及び（＋／＋）、並びに（Ｂ）ｈＢＬＴＲトランスジェニック
及びｗｔマウスを後肢虚血−再潅流にさらした。左肺を採取した。ＭＰＯ活性を
決定し、データを（Ａ）２種の別々の実験から、対照動物（虚血のみ）に比較し
た肺ＰＭＮ浸潤物中の増加倍数及び（Ｂ）虚血−再潅流後の肺中のＰＭＮ浸潤物
の総数として表している。ｈＢＬＴＲトランスジェニック及びｗｔマウスから得
たＰＭＮ総数は有意差を有した（＊ｐ＝０．０２、ｎ＝３）。（Ｃ）バルビニア
／ｃマウスを虚血−再潅流（〜０．８ｎｇ、充填棒）又は虚血のみ（〜０．５ｎ
ｇ、影線棒）にさらした。後肢の止血帯を取り外し後、再潅流を伴って又は伴わ
ずに左肺を採取した。各肺組織内に存在したＬＸＡ4をＥＬＩＳＡ（Neogen, Lex
ington, KY）又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量した。（Ｄ）ｈＢＬＴＲトランス
ジェニックマウスにビヒクル（影線棒）又はＡＴＬ類似体（１０μｇ、挿入図：
ＡＴＬ類似テンプレートＲ2＝パラ−フルオロ−フェノキシ）（充填棒）を注射
した。白血球ＭＰＯ値を虚血−再潅流後に各マウスの左肺から得て、肺ＰＭＮ浸
潤の抑制百分率で表した。ＡＴＬ類似体を受けたマウス対ビヒクルのみ（〜１２
×１０5ＰＭＮ）を受けたマウスからの値は有意差を有した（＊ｐ＝０．０４，
ｎ＝３）。
【図３】 ｈＢＬＴＲトランスジェニックマウスの正のフィードバックループを表す：５
−ＬＯ転写物及び５Ｓ−ＨＥＴＥは腹膜炎において調節されない。（Ａ）５Ｓ−
ＨＥＴＥのＭＳ／ＭＳスペクトル。カゼイン誘起腹膜炎からの腹膜の白血球を採
取し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。５Ｓ−ＨＥＴＥのｍ／ｚ３１９におけ
るＳＩＭクロマトグラム並びにＭＳ／ＭＳスペクトルをFinniganＬＣＱ ＬＣ／
ＭＳ／ＭＳで得た。５Ｓ−ＨＥＴＥをｍ／ｚ＝３１９（ａ），３０１（ａ−Ｈ2
Ｏ）、２７５（ｂ）、２５７（ｂ−Ｈ2Ｏ）及び１１５（ｃ）におけるその診断
用ＭＳ／ＭＳ生成イオンにより同定した。（Ｂ）ｗｔ（影線棒）及びｈＢＬＴＲ
トランスジェニックマウス（充填棒）における５Ｓ−ＨＥＴＥ、１５Ｓ−ＨＥＴ
Ｅ及び１２Ｓ−ＨＥＴＥのレベルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量し、ｐｇ／５×
１０5腹腔浸潤白血球で表した（＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。ｗｔ及びｈＢＬＴ
Ｒトランスジェニックマウスの浸潤白血球からの総ＲＮＡを単離し、矢印（挿入
図）により示した〜０．３ｋｂにおける期待された帯を与えたマウスの５−ＬＯ
特異性プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより分析した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年５月１０日（２００１．５．１０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA20 DA02 DA03 EA04 FA02 FA06 FA18 GA11 GA12 HA11 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR77 QR80 QX10 4B064 AG20 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA04 CA24 CA43 CA44 CA46

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 白血球内に、ヒト・ロイコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）
    の生理活性を有する組み換えヒトのＢＬＴＲを生産する非ヒトトランスジェニッ
    ク哺乳動物であって、 （Ａ） ＢＬＴＲ特異性のプロモーターを含む５’発現調節配列、 （Ｂ） 前記ＢＬＴＲ及び、前記トランスジェニック哺乳動物の白血球中に前記
    ＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ、
    並びに （Ｃ） 前記白血球中に前記ＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列、 を含んで成る外来の遺伝子構造物を前記トランスジェニック哺乳動物ゲノム中に
    安定に組み込んでおり、かつ、 前記トランスジェニック哺乳動物における前記白血球中の前記ＢＬＴＲの生産
    及びその過剰発現が得られるように（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は前記遺伝子構造
    物中で操作可能に連結されている、非トランスジェニック哺乳動物。
  2. 【請求項２】 前記トランスジェニック哺乳動物がヒトＢＬＴＲを生産する
    、請求項１記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  3. 【請求項３】 前記ヒトＢＬＴＲがヒトＢＬＴＲのアミノ酸配列を有する、
    請求項２記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  4. 【請求項４】 前記哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤ
    ギ又はウシからなる群から選択される、請求項１記載の非ヒトトランスジェニッ
    ク哺乳動物。
  5. 【請求項５】 前記哺乳動物が雌である、請求項１記載の非ヒトトランスジ
    ェニック哺乳動物。
  6. 【請求項６】 （ａ）（Ａ） ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発現
    調節配列、 （Ｂ） 前記ＢＬＴＲ及び、前記トランスジェニック哺乳動物の白血球中に前記
    ＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ、
    及び （Ｃ） 前記白血球中に前記ＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列、 を含んで成る外来の遺伝子構造物をゲノム中に組み込んでいる非ヒトトランスジ
    ェニック哺乳動物を提供する段階、［ここで、前記トランスジェニック哺乳動物
    における前記白血球中の前記ＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように
    （Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は前記遺伝子構造物中で操作可能に結合されておる。
    ］、並びに （ｂ） 前記ＢＬＴＲを前記トランスジェニック哺乳動物の前記白血球中に過剰
    発現させ、分泌させる段階、 を含んで成る、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有する組み換えヒトＢＬＴＲの生産法
    。
  7. 【請求項７】 前記トランスジェニック哺乳動物がヒトＢＬＴＲを生産する
    、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記ヒトＢＬＴＲがヒトＢＬＴＲのアミノ酸配列を有する、
    請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤ
    ギ又はウシからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記哺乳動物が雌である、請求項６記載の方法。
  11. 【請求項１１】 （ａ）（Ａ） ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発
    現調節配列、 （Ｂ） 前記ＢＬＴＲ及び、前記トランスジェニック哺乳動物の白血球中に前記
    ＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ、
    並びに （Ｃ） 前記白血球中に前記ＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列、 を含んで成る外来の遺伝子構造物を提供する段階［ここで、前記トランスジェニ
    ック哺乳動物における前記白血球中の前記ＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得
    られるように（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は前記遺伝子構造物中で操作可能に連結
    されておる。］、 （ｂ） 非ヒト哺乳動物の胚内に段階（ａ）の構造物を導入する段階（ここで、
    前記構造物は前記哺乳動物の胚のゲノム中に安定に組み込まれる。）、 （ｃ） 前記胚を非ヒトトランスジェニック哺乳動物中に発育させる段階、並び
    に （ｄ） （ｃ）の非ヒトトランスジェニック哺乳動物がＢＬＴＲを生産するかど
    うかを決定する段階、 を含んで成る、白血球中に、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有する組み換えヒト・ロ
    イコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）を生産する非ヒトトランスジェニック哺乳
    動物を生産する方法。
  12. 【請求項１２】 前記トランスジェニック哺乳動物がヒトＢＬＴＲを生産す
    る、請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ヒトＢＬＴＲがヒトＢＬＴＲのアミノ酸配列を有する
    、請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、
    ヤギ又はウシからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記哺乳動物が雌である、請求項１１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 （ａ）（Ａ） ＢＬＴＲ特異性プロモーターを含む５’発
    現調節配列、 （Ｂ） 前記ＢＬＴＲ及び、前記トランスジェニック哺乳動物の白血球中に前記
    ＢＬＴＲの過剰発現を誘導するために有効なシグナル配列をコードするＤＮＡ、
    並びに （Ｃ） 前記白血球中に前記ＤＮＡの過剰発現をもたらす３’調節配列、 を含んで成る外来の遺伝子構造物をゲノム中に組み込んでいる非ヒトトランスジ
    ェニック哺乳動物を提供する段階［ここで、前記トランスジェニック哺乳動物に
    おける前記白血球中の前記ＢＬＴＲの生産及びその過剰発現が得られるように（
    Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は前記遺伝子構造物中で操作可能に連結されておる。］
    、 （ｂ） 前記ＢＬＴＲを前記トランスジェニック哺乳動物の前記白血球中に過剰
    発現させ、分泌させる段階、 （ｃ） 前記トランスジェニック哺乳動物に生理学的にストレスをかけ、それに
    より前記白血球に好中球の増加した補充を誘起する段階、 （ｄ） 前記ストレスに反応する前記好中球の補充と相互作用させるために治療
    的に有効量の化合物を投与する段階、並びに （ｅ） 前記化合物が前記トランスジェニック哺乳動物の前記白血球中の好中球
    の活性化を減少させるかどうかを決定する段階、 を含んで成る、白血球中に、ヒトＢＬＴＲの生理活性を有する組み換えヒト・ロ
    イコトリエンＢ4受容体（ＢＬＴＲ）を生産する非ヒトトランスジェニック哺乳
    動物における多形核白血球生産を抑制する化合物をスクリーニングするための方
    法。
  17. 【請求項１７】 前記トランスジェニック哺乳動物がヒトＢＬＴＲを生産す
    る、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ヒトＢＬＴＲがヒトＢＬＴＲのアミノ酸配列を有する
    、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、
    ヤギ又はウシからなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記哺乳動物が雌である、請求項１６記載の方法。
  21. 【請求項２１】 段階（ｄ）が段階（ｃ）の前に実施され、それにより好中
    球の活性化が予防される、請求項１６記載の方法。
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