JP2023031064A - 肝線維化モデルマウス - Google Patents
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Abstract
【課題】短期間で取得可能な肝線維化モデルマウスを提供する。【解決手段】以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の特徴を有する、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するトランスジェニックマウス：（ｉ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側より、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入され、かつ、（ｉｉ）５’末端側より、アルブミンプロモーター、Ｃｒｅ遺伝子をこの順で含む、ＤＮＡ構築物が導入されている。【選択図】なし
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り 〔刊行物による公開〕 発行日 ：令和３年３月８日 刊行物名：第１７回東邦大学５学部合同学術集会抄録集 〔集会での発表による公開〕 開催日 ：令和３年３月１３日 集会名 ：第１７回東邦大学５学部合同学術集会 開催場所：オンライン開催
本発明は、肝線維化モデルマウス及びその利用に関する。
肝臓の線維化（肝線維化）は、慢性ウイルス性肝炎や非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ：ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）の疾患において、慢性に進行する炎症や細胞死、酸化ストレスなどに伴って生じる病態であり、最終的には肝硬変や肝癌に至る病態である。上記の疾患の進展を抑制するためには、炎症をいかに抑制するかに加えて、進行性の線維化をいかに抑制するかが重要な要素となり得る。その観点から、肝線維化の誘導メカニズムの研究は非常に多くなされてきた。しかしながら、いまだに肝線維化を抑制する治療方法の開発には至っていない。
近年、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ：ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）が増加しており、現在、国民の約３０％がＮＡＦＬＤと推定されている。ＮＡＦＬＤは肝臓に脂肪が蓄積しただけの単純脂肪肝（ＮＡＦＬ：ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ又はＳＳ）と、肝細胞死と炎症を伴う進行性のＮＡＳＨに大別される。ＮＡＳＨは線維化により肝硬変、さらには肝がんに進行するリスクの高い疾患であるが、ＮＡＦＬＤの約１０％がＮＡＳＨと推定されており、その患者数の増加が問題となっている（非特許文献１）。ＮＡＳＨの発症及び進行、特に肝線維化の進行のメカニズムは明確には解明されておらず、現在のところ、ＮＡＳＨの根本的な治療方法は存在しない。
病態発症のメカニズムの解析、治療薬・治療方法のスクリーニング等には、通常、その病態のモデル動物（例えば、モデルマウス）が使用される。ＮＡＳＨのモデルマウスとしては、食餌によりマウスにＮＡＳＨを発症させたモデルが報告されている（例えば、非特許文献２及び３）。
線維芽細胞増殖因子１８（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １８（ＦＧＦ１８））は、肺、肢芽、口蓋、骨格、中枢神経系、毛包などの一部の組織の発達に関与するタンパク質として知られる（非特許文献４）。また、ＦＧＦ１８をノックアウトしたマウスは、出生直後に呼吸障害で死亡することが報告されている（非特許文献５）。特許文献１では、ＮＡＦＬＤと診断された患者のうち、特にＮＡＳＨにおいて血清中のＦＧＦ１８タンパク質の濃度が健常者と比較して高値を示すことが報告されている。しかし、いずれにおいても、ＦＧＦ１８の肝線維化への関与は、直接的に示されていない。
日本肝臓学会編 「ＮＡＳＨ・ＮＡＦＬＤの診療ガイド２０２１」 文光堂
M. Charlton, et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 301, G825-G834 (2011)
A. Asgharpour, et al., et al., J. Hepatol., 65, 579-588 (2016)
A. S. Hagan, et al., Development Dynamics, 248, 882-893 (2019)
N. Ohbayashi, et al., Genes Dev. 16, 870-879 (2002)
上記の通りＮＡＳＨ等の疾患における肝線維化のメカニズムや治療薬・治療方法等の解明において、モデル動物、特にモデルマウスの使用は非常に有用である。しかしながら、例えば非特許文献２及び３等に記載のモデルマウスは、食餌により肝線維化を生じさせるまでに２４～５２週間という長期間を要するため、より短期間で効率よく取得可能な肝線維化モデルマウスが望まれる。
本発明の目的は、短期間で取得可能な肝線維化モデルマウスを提供することである。
本発明者らは、肝線維化を発症したマウスの肝細胞において、ＦＧＦ１８が高発現していることを見出し、さらに肝臓特異的にＦＧＦ１８を発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを構築したところ、該Ｔｇマウスにおいて短期間に高効率で肝線維化が見られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）肝臓特異的に線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ１８）を過剰発現するトランスジェニックマウス。
（２）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の特徴を有する、（１）に記載のトランスジェニックマウス：
（ｉ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側より、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入され、かつ、
（ｉｉ）５’末端側より、アルブミンプロモーター、Ｃｒｅ遺伝子をこの順で含む、ＤＮＡ構築物が導入されている。
（３）前記ＦＧＦ１８遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（２）に記載のトランスジェニックマウス。
（４）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側から、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入された、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製するためのトランスジェニックマウス。
（５）前記ＦＧＦ１８遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（４）に記載のトランスジェニックマウス。
（６）前記プロモーター配列がＣＡＧプロモーター配列であり、前記ＤＮＡ構築物が、さらに３’末端側にポリＡシグナルを含む、（４）又は（５）に記載のトランスジェニックマウス。
（７）（４）～（６）のいずれかに記載のトランスジェニックマウスとＡｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスとを交配させることを含む、トランスジェニックマウスの作製方法。
（８）（７）に記載の方法により得られる、トランスジェニックマウス。
（９）肝線維化モデルマウスである、（１）、（２）又は（８）に記載のトランスジェニックマウス。
（１）肝臓特異的に線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ１８）を過剰発現するトランスジェニックマウス。
（２）以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の特徴を有する、（１）に記載のトランスジェニックマウス：
（ｉ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側より、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入され、かつ、
（ｉｉ）５’末端側より、アルブミンプロモーター、Ｃｒｅ遺伝子をこの順で含む、ＤＮＡ構築物が導入されている。
（３）前記ＦＧＦ１８遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（２）に記載のトランスジェニックマウス。
（４）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側から、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入された、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製するためのトランスジェニックマウス。
（５）前記ＦＧＦ１８遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、（４）に記載のトランスジェニックマウス。
（６）前記プロモーター配列がＣＡＧプロモーター配列であり、前記ＤＮＡ構築物が、さらに３’末端側にポリＡシグナルを含む、（４）又は（５）に記載のトランスジェニックマウス。
（７）（４）～（６）のいずれかに記載のトランスジェニックマウスとＡｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスとを交配させることを含む、トランスジェニックマウスの作製方法。
（８）（７）に記載の方法により得られる、トランスジェニックマウス。
（９）肝線維化モデルマウスである、（１）、（２）又は（８）に記載のトランスジェニックマウス。
本発明によれば、短期間で取得可能な肝線維化モデルマウスを提供することが可能である。
１．第１の実施形態 ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ トランスジェニックマウス
本発明の第１の実施形態は、肝臓特異的に線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ１８）を過剰発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製するためのＴｇマウスであって、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側から、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入されたことを特徴とするＴｇマウスである。より具体的には、本発明の第１の実施形態は、生殖により、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するマウスを産生するためのＴｇマウスである。以下、導入されたＤＮＡ構築物の構造より、「ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス」とも称する。
本発明の第１の実施形態は、肝臓特異的に線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ１８）を過剰発現するトランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製するためのＴｇマウスであって、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側から、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入されたことを特徴とするＴｇマウスである。より具体的には、本発明の第１の実施形態は、生殖により、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するマウスを産生するためのＴｇマウスである。以下、導入されたＤＮＡ構築物の構造より、「ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス」とも称する。
本明細書において、「線維芽細胞増殖因子１８（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １８（ＦＧＦ１８））」とは、配列番号１で表されるアミノ酸配列又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。ここでいう「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等のタンパク質検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる値をいう。
ＤＮＡ分子内に２つのリコンビナーゼ認識配列が同じ向きで存在し、かつ、リコンビナーゼが存在するとき、リコンビナーゼが該配列を認識して、２つのリコンビナーゼ認識配列の間で部位特異的組換えが生じ、２つのリコンビナーゼ認識配列で挟まれた配列を切り出し欠失させる。リコンビナーゼとその認識配列を組合せた部位特異的組換えシステムとして、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムやＦＬＰ－ＦＲＴシステム等が知られる。本発明では、特にＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムを使用する。Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムにおけるリコンビナーゼ認識配列としては、ｌｏｘＰ配列（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ、配列番号２）が挙げられ、さらにｌｏｘＰ配列の変異配列であるｌｏｘ５１１（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧｔＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ、配列番号３）、ｌｏｘ２２７２（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧｇＡＴＡＣｔＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ、配列番号４）、ｌｏｘＦＡＳ（ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡｔａｃｃｔｔｔｃＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ、配列番号５）等も用いることができる。本発明においては、ｌｏｘＰ配列の変異配列も「ｌｏｘＰ配列」と称する。
本発明の第１の実施形態は、少なくとも、５’末端側から、プロモーター配列と、ＬＳＬ構造（ｌｏｘＰ配列、ストップコドン及びｌｏｘＰ配列）及びＦＧＦ１８遺伝子（以下、「ＬＳＬ－ＦＧＦ１８」とも称する）とを、この順で含む前記ＤＮＡ構築物を含む。２つのｌｏｘＰ配列の間のストップコドンの上流に、さらにマーカー遺伝子を含ませてもよい。マーカー遺伝子としては、細胞への遺伝子導入を確認できるマーカーの遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ＨＰＲＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられる。ストップコドンとマーカー遺伝子が２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたＤＮＡ構築物を、ＬｏｘＰ ｆｌａｎｋｅｄ ｓｔｏｐカセット（ストップカセット）と呼ぶことがある。Ｃｒｅが存在しない場合は、遺伝子の転写が始まった場合でも２つのｌｏｘＰの間のストップコドンで転写が終結するので、下流のＦＧＦ１８遺伝子が転写、翻訳されることはない。一方、Ｃｒｅが存在する場合は、２つのｌｏｘＰ間のストップコドンは欠失するので、下流のＦＧＦ１８遺伝子が転写、翻訳され、ＦＧＦ１８タンパク質が過剰発現する。
プロモーター配列としては、３’末端側、すなわち下流の遺伝子発現を促進し得るプロモーター配列であれば特に限定されないが、特に、ＣＡＧプロモーターを使用することができる。プロモーター配列としてＣＡＧプロモーターを使用する場合、さらに３’末端側にポリＡシグナルを有することが好ましい。
ＦＧＦ１８遺伝子の５’側には、翻訳の開始に関与するＫｏｚａｋ配列やＦＬＡＧ等のエピトープタグを連結させてもよく、３’側にはストップコドンを付加する。また、ＦＧＦ１８遺伝子の３’側にはＩＲＥＳ配列－ＧＦＰを配し、ＦＧＦ１８遺伝子を発現した細胞がＧＦＰ陽性細胞として分取できるようにしてもよい。
本発明の第１の実施形態のＴｇマウスは、ＬＳＬ－ＦＧＦ１８を含むＤＮＡ構築物をベクター上で構築し、ターゲティングベクターを作製する。ターゲティングベクターは、ＣＴＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等の市販のプラスミドベクターを利用して構築することができる。該ターゲティングベクターを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いた相同組換え等の既知の手法により、前記ＤＮＡ構築物をＥＳ細胞のＲＯＳＡ２６遺伝子座に挿入する。ＲＯＳＡ２６遺伝子座は、遺伝子を安全に挿入することができるセーフハーバー遺伝子座として知られる。ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法は限定されないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法等の公知の方法により行うことができる。
図３に本発明の第１の実施形態のＴｇマウスの一例について、そのＲＯＳＡ２６遺伝子座の配列構造を示す。図示例においては、プロモーターとしてＣＡＧプロモーターが使用され、プロモーターの下流に２つの同じ向きのｌｏｘＰ配列とこれらに挟まれたマーカー遺伝子とストップコドンを有し、さらにその下流にＦＧＦ１８遺伝子、ストップコドン、ポリＡシグナルを含む。本明細書において、以降、図示例の配列構造の遺伝子を有するＴｇマウスを、「ＣＡＧ－ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス」とも称する。
ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞は、ベクター中のマーカーにより選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして用いる場合、Ｇ４１８を添加したＥＳ細胞用培地中で培養することによりターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞を選択することができる。また、所望のＤＮＡ構築物が導入されているかは、サザンブロッティングやＰＣＲ法によるジェノタイプ解析により確認することができる。
ターゲティングベクターが導入されたＥＳクローンを受精卵または８細胞期胚等の初期胚に導入する。導入は、マイクロインジェクション法やアグリゲーション法等により行うことができる。受精卵または初期胚を仮親マウスに移植し、発生させ、キメラマウスを得ることができる。得られたキメラマウスを同系のマウスと交配し、ＬＳＬ－ＦＧＦ１８の配列が挿入されているＤＮＡ構築物をヘテロで有するＦ１マウスを得ることができる。さらに、Ｆ１マウス同士を交配することにより、ＬＳＬ－ＦＧＦ１８の配列が挿入されているＤＮＡ構築物をホモで有するマウスを得ることができる。
２．第２の実施形態－肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）
本発明の第２の実施形態は、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するＴｇマウスである。具体的には、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の特徴を有する、Ｔｇマウスである。
（ｉ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側より、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入され、かつ、
（ｉｉ）５’末端側より、アルブミンプロモーター、Ｃｒｅ遺伝子をこの順で含む、ＤＮＡ構築物が導入されている。
以下、本発明の第２の実施形態のＴｇマウスを「ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス」とも称する。
本発明の第２の実施形態は、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するＴｇマウスである。具体的には、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の特徴を有する、Ｔｇマウスである。
（ｉ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側より、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入され、かつ、
（ｉｉ）５’末端側より、アルブミンプロモーター、Ｃｒｅ遺伝子をこの順で含む、ＤＮＡ構築物が導入されている。
以下、本発明の第２の実施形態のＴｇマウスを「ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス」とも称する。
本発明の第２の実施形態のＴｇマウスでは、肝臓特異的にＦＧＦ１８が過剰発現するとともに、出生後６週間程度という比較的短期間で肝臓の線維化が生じる。そのため、本発明の第２の実施形態のＴｇマウスは、哺乳類、特にヒトの肝線維化のモデルマウスとして有用であり、短期間で構築可能である、という利点を有する。
通常、ＬＳＬ構造と目的の遺伝子を含むＤＮＡ構築物を含むＴｇマウスと、Ｃｒｅ発現ベクターを導入したＣｒｅ発現Ｔｇマウスとを交配することにより、目的の遺伝子を発現するＴｇマウスを作製することができる。あるいは、ＬＳＬ構造と目的の遺伝子を含むターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞に、さらにＣｒｅ発現ベクターを導入して得られたＥＳ細胞クローンからマウスを得ることによっても同様のＴｇマウスを作製することができる。
本発明のＦＧＦ１８ Ｔｇマウスは、肝線維化に関与することが見いだされたＦＧＦ１８遺伝子を肝臓において過剰発現することを要する。一方、ＦＧＦ１８遺伝子は、肺、肢芽、口蓋、骨格、中枢神経系、毛包などの一部の組織の発達に関与するタンパク質であることから、肝臓以外において過剰発現することで、マウスの生存にかかわる機能に影響を与える可能性がある。そのため、Ｔｇマウスに導入したＦＧＦ１８遺伝子は、肝臓特異的に発現させる必要がある。そこで、本発明のＦＧＦ１８ Ｔｇマウスにおいて、導入されるＣｒｅ遺伝子は、肝臓特異的に発現誘導するアルブミンプロモーターと共に、アルブミンプロモーターに制御される形で（Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅ）導入されることを要する。
本発明のＦＧＦ１８ Ｔｇマウスは、一例として、本発明の第１の実施形態のＴｇマウス（ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）と、Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスとを交配させることを含む、Ｔｇの作製方法により作製することができる。本明細書において、「Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウス」とは、アルブミンプロモーターの制御下でＣｒｅを発現するＴｇマウスを指す。Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスは、例えば、L. Wu, et al., Genesis, 36, 177-181 (2003)に記載のものを使用できる。また、Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスは、例えば、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手することができる。
本発明のＬＳＬ－ＦＧＦ１８ ＴｇマウスとＡｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスを交配して得られたＴｇマウスにおいては、肝細胞においてのみＣｒｅリコンビナーゼが作用し、ストップカセット（ＬＳＬ）が除去されて終止コドンが除去される。その結果、ＦＧＦ１８遺伝子が肝臓特異的に過剰発現する。
Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムの代わりに、ＦＬＰ－ＦＲＴシステムを用いる場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼの代わりにＦＬＰリコンビナーゼを用い、ｌｏｘＰ配列の代わりにＦＲＴ配列を利用することができる。
本発明の第２の実施形態において、ＦＧＦ１８、ｌｏｘＰ配列、Ｃｒｅ、マーカー遺伝子の構造・遺伝子塩基配列、使用する材料等の詳細な条件は、特に矛盾のない限り、「１．第１の実施形態 ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ トランスジェニックマウス」の項に記載した通りである。また、本発明は、第２の実施形態のＴｇマウスに加えて、本発明の第１の実施形態のＴｇマウスとＡｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスとを交配させることを含む、Ｔｇマウスの作製方法をも包含する。作製方法の詳細な条件についても、特に矛盾のない限り、「１．第１の実施形態 ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ トランスジェニックマウス」の項に記載した通りである。
３．本発明の第２の実施形態のＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）の表現形
本発明の第２の実施形態のＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）は、以下のような表現型を有する。
（１）肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現する。
（２）肝組織のＫｉ６７陽性領域がコントロールと比較して大きい。
（３）体重に占める肝臓の重量割合が約８％以上である。
（４）肝臓血管壁でコラーゲンＩＩ及びＩＩＩの発現が亢進する。
（５）肝臓組織中のヒドロキシプロリン量が亢進する。
（６）２０週齢を過ぎると肝臓に大きな嚢胞を形成する。
本発明の第２の実施形態のＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）は、以下のような表現型を有する。
（１）肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現する。
（２）肝組織のＫｉ６７陽性領域がコントロールと比較して大きい。
（３）体重に占める肝臓の重量割合が約８％以上である。
（４）肝臓血管壁でコラーゲンＩＩ及びＩＩＩの発現が亢進する。
（５）肝臓組織中のヒドロキシプロリン量が亢進する。
（６）２０週齢を過ぎると肝臓に大きな嚢胞を形成する。
４．本発明のＴｇマウス（ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス、ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）の利用
本発明の第１の実施形態のＴｇマウス（ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）は、肝線維化のモデルマウスとなり得る、本発明の第２の実施形態のＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）の作製に利用することができる。
本発明の第１の実施形態のＴｇマウス（ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）は、肝線維化のモデルマウスとなり得る、本発明の第２の実施形態のＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）の作製に利用することができる。
本発明の第２の実施形態のＴｇマウス（ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）は、肝臓において短期間で自然に線維化を発症することから、線維化のメカニズム解析や線維化を標的とした治療薬のｉｎ ｖｉｖｏでの評価に利用できると考えられる。発明者らは、チオアセトアミド（ＴＡＡ）による肝臓の線維化時にＦＧＦ１８の発現が上昇することを見出すとともに、ヒトのＮＡＳＨ発症のモデルとなるコリン欠乏食＋エチオニン添加水（ＣＤＥ）食をＦＧＦ１８ Ｔｇマウスに投与することで、ＮＡＳＨの病態が急速に進展するという結果を得た。従来の高脂肪食投与によるＮＡＳＨモデルマウス作製には、その線維化を誘導するのに１年以上という非常に長い時間を要する。ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスは、高脂肪食投与による線維化に至る時間を大幅に短縮することが可能である。本発明で樹立されたＦＧＦ１８ Ｔｇマウスは、病態の増悪に線維化が関与する疾患について、モデルマウスを介した疾患解析、治療薬スクリーニング等を短期間で実施するのに非常に有用である。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
［参考例１］チオアセトアミド誘導性肝線維化マウスの遺伝子発現解析
マウス（６～８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６（日本クレア社より入手））３匹について、チオアセトアミド（ＴＡＡ）を３００ｍｇ／Ｌ含む飲料水を４週間飲水させたところ、全てのマウスにおいて肝臓の線維化が誘導された。肝臓が線維化したマウス（肝線維化マウス）と、ＴＡＡを含まない飲料水を飲水させた以外は同様の条件で飼育したマウス（対照マウス）について、それぞれ肝臓を摘出し、肝線維化マウスにのみ多く発現する遺伝子を解析した結果、これまで肝線維化に関与することが報告されていない因子としてＦＧＦ１８が検出された。
マウス（６～８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６（日本クレア社より入手））３匹について、チオアセトアミド（ＴＡＡ）を３００ｍｇ／Ｌ含む飲料水を４週間飲水させたところ、全てのマウスにおいて肝臓の線維化が誘導された。肝臓が線維化したマウス（肝線維化マウス）と、ＴＡＡを含まない飲料水を飲水させた以外は同様の条件で飼育したマウス（対照マウス）について、それぞれ肝臓を摘出し、肝線維化マウスにのみ多く発現する遺伝子を解析した結果、これまで肝線維化に関与することが報告されていない因子としてＦＧＦ１８が検出された。
［参考例２］ ＦＧＦ１８の一過性発現
ＨＴＶｉ（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法を用いて、マウスにＦＧＦ１８を一過性に過剰発現させた。まず、マウスＦＧＦ１８ ｃＤＮＡをｐＬＩＶＥ（Ｍｉｒｕｓ社より入手）に組み込んだプラスミドベクターを作製した。このプラスミドベクターは、マウスＡＦＰエンハンサーおよびマウスＡｌｂｕｍｉｎプロモーターの下流で目的の遺伝子を肝細胞特異的に発現させる特徴を有する。１匹当たり１０μｇのプラスミドベクターを２ｍＬのリンゲル液に溶解して、マウス（６～８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６（日本クレア社より入手））４匹に、尾静脈から注入した（試験マウス）。ＦＧＦ１８ｃＤＮＡに代えてＧＦＰｃＤＮＡ（配列番号７の塩基配列）をｐＬＩＶＥに組み込んだプラスミドベクターを調製し、同様に４匹のマウスに注入した（対照マウス）。注入の１週間後に各マウスより肝臓を摘出し、ホルマリンで固定した後、パラフィン切片を作製した。各パラフィン切片について、抗Ｋｉ６７抗体（Ｎｏ．Ａｂ１６６６７（Ａｂｃａｍ社より）を用いて免疫染色を行った。
ＨＴＶｉ（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）法を用いて、マウスにＦＧＦ１８を一過性に過剰発現させた。まず、マウスＦＧＦ１８ ｃＤＮＡをｐＬＩＶＥ（Ｍｉｒｕｓ社より入手）に組み込んだプラスミドベクターを作製した。このプラスミドベクターは、マウスＡＦＰエンハンサーおよびマウスＡｌｂｕｍｉｎプロモーターの下流で目的の遺伝子を肝細胞特異的に発現させる特徴を有する。１匹当たり１０μｇのプラスミドベクターを２ｍＬのリンゲル液に溶解して、マウス（６～８週齢、Ｃ５７ＢＬ／６（日本クレア社より入手））４匹に、尾静脈から注入した（試験マウス）。ＦＧＦ１８ｃＤＮＡに代えてＧＦＰｃＤＮＡ（配列番号７の塩基配列）をｐＬＩＶＥに組み込んだプラスミドベクターを調製し、同様に４匹のマウスに注入した（対照マウス）。注入の１週間後に各マウスより肝臓を摘出し、ホルマリンで固定した後、パラフィン切片を作製した。各パラフィン切片について、抗Ｋｉ６７抗体（Ｎｏ．Ａｂ１６６６７（Ａｂｃａｍ社より）を用いて免疫染色を行った。
図１は、試験マウス及び対照マウスの肝組織について、抗Ｋｉ６７抗体による免疫染色を行った画像である。図２は、試験マウス及び対照マウスの肝組織について、抗Ｋｉ６７抗体による免疫染色を行った画像の全組織領域に占めるＫｉ６７陽性領域の割合を比較したグラフである。図中の「＊」は、対応のある両側スチューデントｔ検定においてｐ＜０．０５であったことを示す。少なくともＦＧＦ１８を一過性に発現させるだけでは肝臓の線維化を誘導することはできなかった。
［実施例１］ 肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するマウスの作製
肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するマウスを以下の手法で樹立した。ＲＯＳＡ２６遺伝子座にＣＡＧプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）逆向き配列、ｌｏｘＰ配列及びポリＡシグナルが挿入された配列を含む市販のベクター（ＣＴＶ（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１５９１２、Ａｄｄｇｅｎｅ社より入手）よりＩＲＥＳ配列及びＥＧＦＰ遺伝子を切り出し、ＡｓｃＩサイトを用いてＦＧＦ１８遺伝子を挿入して発現ベクターを調製した。調製したベクターの塩基配列は、配列番号８に示す通りである。調製したベクターを、マウスＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡ、熊本大学より入手）のＲＯＳＡ２６遺伝子座に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いてエレクトロポレーションにより導入した。ベクターを導入したＥＳ細胞とＩＣＲマウス由来の卵とを合わせてキメラを作製し、キメラマウスを得た。キメラマウスとＣ５７／ＢＬ６マウスを交配し生殖系列移行（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を確認した。得られたキメラマウスを、Ｆ０世代マウスとして同系マウスと交配させて、導入したＤＮＡ構築物の遺伝子配列をホモで有するＴｇマウス（ＣＡＧ－ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）を得た。
肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するマウスを以下の手法で樹立した。ＲＯＳＡ２６遺伝子座にＣＡＧプロモーター、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）逆向き配列、ｌｏｘＰ配列及びポリＡシグナルが挿入された配列を含む市販のベクター（ＣＴＶ（Ｐｌａｓｍｉｄ ＃１５９１２、Ａｄｄｇｅｎｅ社より入手）よりＩＲＥＳ配列及びＥＧＦＰ遺伝子を切り出し、ＡｓｃＩサイトを用いてＦＧＦ１８遺伝子を挿入して発現ベクターを調製した。調製したベクターの塩基配列は、配列番号８に示す通りである。調製したベクターを、マウスＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡ、熊本大学より入手）のＲＯＳＡ２６遺伝子座に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を用いてエレクトロポレーションにより導入した。ベクターを導入したＥＳ細胞とＩＣＲマウス由来の卵とを合わせてキメラを作製し、キメラマウスを得た。キメラマウスとＣ５７／ＢＬ６マウスを交配し生殖系列移行（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を確認した。得られたキメラマウスを、Ｆ０世代マウスとして同系マウスと交配させて、導入したＤＮＡ構築物の遺伝子配列をホモで有するＴｇマウス（ＣＡＧ－ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス）を得た。
ＣＡＧ－ＬＳＬ－ＦＧＦ１８ ＴｇマウスをＡｌｂｕｍｉｎプロモーター（肝細胞で発現）依存性にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウス（Ａｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウス（Ｎｏ．００３５７４、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙより入手））と交配させて交配マウスを得た。交配マウスでは、肝細胞で特異的にＣｒｅが発現するため、肝細胞ではＣＡＧプロモーターの直下に存在するストップコドンが排除されて、ＦＧＦ１８が過剰発現する。以下、前記交配マウスを「ＦＧＦ１８ Ｔｇマウス」と表記する。
［実施例２］ ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスの肝線維化
ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスはメンデルの法則にしたがって出生し、生殖機能も有しており、外見上は異常を認めなかった。しかし、６～８週齢のマウスを解剖して摘出した肝臓重量を測定したところ、同腹の野生型マウスでは肝臓の全体重に占める割合が約５％であったのに対して、ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスは約８％までに増加していた（図４）（ｎ＝５）。図中の「＊＊＊＊」は、対応のない両側スチューデントｔ検定においてｐ＜０．０００１であったことを示す。
ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスはメンデルの法則にしたがって出生し、生殖機能も有しており、外見上は異常を認めなかった。しかし、６～８週齢のマウスを解剖して摘出した肝臓重量を測定したところ、同腹の野生型マウスでは肝臓の全体重に占める割合が約５％であったのに対して、ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスは約８％までに増加していた（図４）（ｎ＝５）。図中の「＊＊＊＊」は、対応のない両側スチューデントｔ検定においてｐ＜０．０００１であったことを示す。
摘出した肝臓をホルマリンで固定した後、パラフィン切片を作製し、組織学的な解析を実施した。その結果、ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスの肝臓では単核球の浸潤と、太い血管の内皮細胞の増加が認められた。さらに抗Ｋｉ６７抗体を用いた免疫染色を行ったところ、肝細胞と太い血管の内皮細胞がＫｉ６７陽性であり、これらの細胞が増殖していることが明らかとなった（図５）。常法に従ってＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ染色を行ったところ、ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスで染色（陽性）領域の増加が見られた（図６）。図５及び図６のスケールバーは１００μｍをしめす。次いで、線維化に伴い増加するコラーゲンの構成成分であるヒドロキシプロリンの肝臓組織中の含有量を測定した。具体的には、各マウスの肝臓組織を加水分解した後、ヒドロキシプロリンアッセイキット（Ｎｏ．ＳＴＡ－６７５、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．より入手）を用いてヒドロキシプロリンの定量を行った（ｎ＝５）。その結果、ＦＧＦ１８ Ｔｇマウスの肝臓で、ヒドロキシプロリンが野生型マウスと比較して増加していた（図７）。図中の「＊」は、対応のない両側スチューデントｔ検定においてｐ＜０．０５あったことを示す。以上より、ＦＧＦ１８を肝細胞で過剰に発現させたマウスを、自然に肝臓で線維化が誘導できるマウスとして樹立することに成功した。
上記の方法で構築されたＦＧＦ１８ Ｔｇマウスに、人のＮＡＳＨモデルであるコリン欠乏食＋エチオニン添加水（ＣＤＥ）食を投与したところ、線維化がさらに急速に進展することが確認された（データ示さず）。このことから、ＦＧＦ１８ ＴｇマウスがＮＡＳＨの病態を反映し得ることが示された。
本発明の肝線維化モデルマウスは、ヒトを含む哺乳類動物におけるＮＡＳＨ等の肝線維化に対する治療薬・治療方法の開発等に有用であり、医学分野、医薬品製造分野等において利用可能である。
Claims (9)
- 肝臓特異的に線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ１８）を過剰発現するトランスジェニックマウス。
- 以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の特徴を有する、請求項１に記載のトランスジェニックマウス：
（ｉ）ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側より、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入され、かつ、
（ｉｉ）５’末端側より、アルブミンプロモーター、Ｃｒｅ遺伝子をこの順で含む、ＤＮＡ構築物が導入されている。 - 前記ＦＧＦ１８遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
- ＲＯＳＡ２６遺伝子座に、５’末端側から、プロモーター配列、ｌｏｘＰ配列、ストップコドン、ｌｏｘＰ配列、ＦＧＦ１８遺伝子を、この順で含むＤＮＡ構築物が導入された、肝臓特異的にＦＧＦ１８を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製するためのトランスジェニックマウス。
- 前記ＦＧＦ１８遺伝子が、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のトランスジェニックマウス。
- 前記プロモーター配列がＣＡＧプロモーター配列であり、前記ＤＮＡ構築物が、さらに３’末端側にポリＡシグナルを含む、請求項４又は５に記載のトランスジェニックマウス。
- 請求項４～６のいずれか１項に記載のトランスジェニックマウスとＡｌｂｕｍｉｎ－Ｃｒｅマウスとを交配させることを含む、トランスジェニックマウスの作製方法。
- 請求項７に記載の方法により得られる、トランスジェニックマウス。
- 肝線維化モデルマウスである、請求項１、２又は８に記載のトランスジェニックマウス。
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2021
- 2021-08-24 JP JP2021136540A patent/JP2023031064A/ja active Pending
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