JP2005504515A - 毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 - Google Patents
毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005504515A JP2005504515A JP2002592345A JP2002592345A JP2005504515A JP 2005504515 A JP2005504515 A JP 2005504515A JP 2002592345 A JP2002592345 A JP 2002592345A JP 2002592345 A JP2002592345 A JP 2002592345A JP 2005504515 A JP2005504515 A JP 2005504515A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- growth factor
- gene
- keratinocyte growth
- sequence
- kgf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 claims abstract description 34
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 claims abstract description 33
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 2
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 abstract description 25
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 19
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 6
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 6
- 101000917237 Homo sapiens Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 6
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 6
- 102000057243 human FGF10 Human genes 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 4
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 4
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 4
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000023643 hair follicle morphogenesis Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 210000000982 limb bud Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 1
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003778 catagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 208000022605 chemotherapy-induced alopecia Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029544 epithelial tube branching involved in lung morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000009583 hair follicle growth Effects 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000024799 morphogenesis of a branching structure Effects 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000000106 sweat gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003797 telogen phase Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/20—Dermatological disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Birds (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本発明は、新たに分離した第２ケラチノサイト成長因子類似体、これをコーディングする遺伝子、この製造方法及びこれらの医薬学的用途に関するもので、具体的には、ヒトの頭皮毛嚢からＫＧＦ−２の突然変異型類似体ＫＧＦ−２Ａを新たに分離し、前記蛋白質をコーディングする遺伝子、これを含む発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換した形質転換体を製造し、この形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造するものである。本発明のＫＧＦ−２Ａは、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防及び治療又は毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに利用できる。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たに分離した第２ケラチノサイト成長因子類似体（keratinocyte growth factor-2 analogue、以下「ＫＧＦ―２Ａ」という）、これをコーディングする遺伝子、この製造方法及びこれらの医薬学的用途に関する。
【０００２】
より詳しくは、ヒトの頭皮毛嚢からＫＧＦ−２の突然変異体を新たに分離し、前記蛋白質をコーディングする遺伝子、これを含む発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換した形質転換体を製造し、この形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造するものである。本発明のＫＧＦ―２Ａは、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに利用できる。
【背景技術】
【０００３】
毛嚢は成長期(anagen)、退行期(catagen)及び休止期(telogen)からなる生活史を有する表皮細胞変異体である。
【０００４】
毛嚢は、たとえ生活史の基礎となるメカニズムが完全に究明されてはいないが、毛嚢内の間葉細胞(mesenchymal cell)群集と上皮細胞(epithelial cell)群集間の相互作用が核心的な役割を果たすと知られている(Jahoda, C. A.& Reynolds, A. J. (1996) Dermatol. Clin. 14, 573-583)。毛嚢の生活史の進行において、最も明白な動力は乳頭性間葉(papillary mesenchyme)から由来し、特に真皮乳頭(dermal papilla)が重要な役割を行う。
乳頭性間葉から出た特定因子(factor)は小胞性上皮の生活史に誘導信号として作用する(Peus, D. & Pittelkow, M. R. (1996) Dermatol. Clin. 14, 559-572)。
具体的には毛嚢の突出部にある上皮幹細胞(epithelial stem cells)が真皮乳頭からの誘導信号に反応可能であると考えられている(Cotsarelis, G., Sun, T. T. & Lavker, R. M.(1990) Cell 61, 1329-1337)。前記の過程によって上皮幹細胞が活性化されると、突出部で幹細胞の増殖が起こり、幹細胞子孫が真皮側に下方に成長し、その後マトリックス細胞(matrix cells)の分化的成長が起こり、複合小胞性上皮(complex follicular product)、シャフト(shaft)及びそれらを取り囲んだシース(sheath)が生成される。
【０００５】
形質変換マウス又は遺伝子ノックアウトマウスの皮膚表現型を分析した結果、間葉細胞（真皮乳頭）と上皮細胞（ケラチノサイト）間の相互作用が胎児において毛嚢の形態発生に関与するという主張が力を得た(Gat, U. et al. (1998) Cell 95, 605-514 ; Chiang, C. et al. (1999) Dev. Biol. 205, 1-9 ; Botchkarev. V. A. et al.(1999) Nat. Cell Biol. 1, 158-164)。ところが、生後の小嚢で休止期と成長期との間に発生する生物学的スイッチに関するメカニズムは不明である。そのような因子して最も説得力のある候補者はＫＧＦ―２である。なぜなら、ＫＧＦ−２は、真皮乳頭繊維芽細胞で発見されるし、その受容体ＦＧＦＲ２IIIｂが隣接のケラチノサイトに存在するためである(Katsuoka K, Schell H, Hornstein OP, Wessel B. (1987) Br. J. Dermatol Mar 116(3), 464-5)。
【０００６】
ｋｇｆ−２遺伝子は繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor、以下「ＦＧＦ」という)遺伝子家族群に属するものであり、ＦＧＦは現在哺乳動物から２２種以上が発見された(Nishimura T. Nakatake Y, Konishi M. Itoh N. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1492, 203-206)。ＦＧＦはチロシンキナーゼ受容体(tyrosine kinase receptors)の一員であるＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲｓ）に結合してこれらを活性化させることにより、細胞の増殖、分化、移動及び生存を調節するものと考えられる。
【０００７】
２２種のＦＧＦのうち、ＫＧＦ―２はＦＧＦ―７と構造的に最も深い連関性を持っており(Yamasaki M. Miyake A. Tagashira S. Itoh N. (1996) J. Biol. Chem. 271, 15918-15921)、これらのＦＧＦは両方とも四つのＦＧＦＲｓの中でも異性体の一つであるＦＧＦＲ２IIIｂに特異的に結合すると知られている(Miki T. et al (1991) Science 251, 72-75 ; Ornitz D. M. et al.(1996) J. Biol. Chem. 271, 15292-15297 ; Igarashi M. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 13230-13235)。
【０００８】
また、機能的には、ＫＧＦ―２が肢芽(limb bud)のアウトグロース(outgrowth)と肺の分枝的形態発生(branching morphogenesis)に関与するものと見られる(Martin G. r. (1998) Genes Dev. 12, 1571-15869)。肢芽と肺芽(lung bud)は器官原基(organ primordia)の典型的な一例であって、器官の発生development)に上皮組織と間葉組織間の密接な相互作用が必要である。
【０００９】
上皮−間葉の相互作用において、間葉から出た信号は直接的に上皮組織に伝えられて発芽的形態発生又は分枝的形態発生(budding or branching morphogenesis)による特異構造を形成し、両組織間の相互作用はその以後の発生中にも維持されることが確実である。
【００１０】
米国特許第５,１８４,６０５号、第５,８２４,６４３号及び第５,９６５,５３０号には、ＫＧＦがケラチノサイト以外にも上皮組織の様々な細胞で増殖、成長及び分化を刺激する活性があって、ＫＧＦを、真皮付属器、肝、肺及び胃腸管のような組織及び器官を苦しめる疾病状態又は医療状況の治療に使用することができることと、この際、真皮内の付属器要素が皮脂腺、汗腺及び毛嚢であることなどが記載されている。
【００１１】
ところが、ＫＧＦは傷回復(wound healing)次元の上皮再生(reepithelialization)活性のみが確認され、化学療法によって誘発された脱毛症(chemotherapy-induced alopecia)にのみ適用可能であると説明されているだけで、遺伝的な原因により発病する脱毛症には適用の余地が全くない。
【００１２】
また、米国特許第６,０７７,６９２号には、ＫＧＦ―２のアミノ酸序列及びこれをコーディングする塩基序列を分離し、その傷回復、抗炎症活性、肝細胞の分化及び増殖を促進させ且つ肺の損傷を防止する活性を確認することにより使用できることが開示されている。
【００１３】
ところが、前記文献にはＫＧＦ―２が毛嚢の増殖を促進する効果があるか否かを実験的に確認して記載されていない。
【００１４】
前記に引用された文献はその全体が参考として本明細書に含まれる。
【００１５】
本発明者は、脱毛症の原因になれる分子的因子(molecular factor)を見出そうとしている中、脱毛症患者の毛嚢ではＫＧＦ―２と類似している蛋白質の発現が制限されることを発見し、これを分離してそのアミノ酸序列を確認した結果、ＫＧＦ−２の新しい突然変異型蛋白質であること及び前記ＫＧＦ―２Ａが頭皮毛嚢細胞の増殖を促進することを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、脱毛症患者の頭皮毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進する新規のＫＧＦ―２Ａを分離提供し、これを脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに用いる用途を提供することをその目的とする。
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明は、ＫＧＦ―２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたＫＧＦ―２Ａを提供する。この際、ＫＧＦ−２Ａはヒトの頭皮毛嚢細胞から分離したＫＧＦ―２の新しい突然変異型蛋白質であって、序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含み、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２が糖鎖などの結合した成熟蛋白質(mature protein)の形態であってもよい。
【００１８】
また、本発明は、ＫＧＦ−２Ａをコーディングする遺伝子を提供する。本発明のｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流(upstream)に開始コドンをさらに含むことができる。
【００１９】
具体的に、序列番号２の４番から６２７番まで、或いは１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことができ、その塩基序列の上流に開始コドンをさらに含むことができる。
【００２０】
本発明は、ＫＧＦ−２Ａの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、ｋｇｆ―２ａ遺伝子を発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に形質転換させて形質転換体を得た後、前記形質転換体を培養する段階を含む。この際、前記ｋｇｆ―２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００２１】
また、本発明は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を提供する。この際、ＫＧＦ−２Ａは、１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むか、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２Ａが糖鎖などの結合した成熟蛋白質の形態であってもよい。
【００２２】
ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００２３】
前記薬学的組成物は、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに使用できる。
【００２４】
本発明は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた脱毛症の治療又は予防方法を提供する。前記方法はＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分として含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。
【００２５】
本発明の第１態様は、ＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたＫＧＦ−２Ａに関するものである。この際、ＫＧＦ−２Ａはヒトの頭皮毛嚢細胞から分離したＫＧＦ−２の新しい突然変異型蛋白質である。
【００２６】
まず、本発明では、ＫＧＦ−２Ａを分離、確認するために、ヒトの頭皮毛嚢細胞から総ｍＲＮＡを抽出した後、ＫＧＦ−２のＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲを施してｃＤＮＡを得、その塩基序列を決定することにより、アミノ酸序列を推論し決定した。
【００２７】
その結果、得られたアミノ酸序列は既存のＫＧＦ−２とは８７番アミノ酸が相異し、これを序列番号１に開示した。本発明者は、ＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された新しい蛋白質をＫＧＦ−２Ａと命名した。
【００２８】
本発明に係るＫＧＦ−２Ａは、序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むか、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。
【００２９】
具体的に、本発明のＫＧＦ−２Ａは、ヒトの頭皮毛嚢から分離されたもので、脱毛症患者の頭皮では正常人とは異なる発現様相を示す。
【００３０】
まず、本発明では、正常人と脱毛症患者の毛嚢におけるＫＧＦ−２ＡのｍＲＮＡ発現を比較分析するために、正常人と脱毛症患者の頭皮から形態発生学的に生成期の構造的特性を有する毛嚢をそれぞれ分離した。前記毛嚢から総ＲＮＡ(total RNA)を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って得たｃＤＮＡをアガロースゲル上で分離して比較分析した。
【００３１】
その結果、本発明のＫＧＦ−２Ａは、ＫＧＦ−２Ａ受容体のＦＧＦＲ２IIIｂとは異なり、正常人と脱毛症患者において相異した発現様相を示した。すなわち、正常人の毛嚢ではＫＧＦ−２Ａが一定の程度発現される反面、脱毛症患者の毛嚢ではその発現が制限されることを確認した（図３参照）。従って、本発明のＫＧＦ−２Ａは脱毛を調節する分子的因子である可能性が高い。
【００３２】
本発明の第２態様はＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子に関するものである。
【００３３】
ＫＧＦ−２ＡはＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたアミノ酸序列を有するものである。このため、ＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子は、前記アミノ酸序列を暗号化する全ての可能な場合のコドンから構成できる。また、前記遺伝子はｇＤＮＡ又はｃＤＮＡであり、よって、ｇＤＮＡの場合はコーディング部位内にイントロンのような非コーディング部位を含むことができる。
【００３４】
本発明のｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。
【００３５】
具体的に、序列番号２の４番から６２７番まで或いは１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことができ、その塩基序列の上流に開始コドンをさらに含むことができる。この際、コドンのデジェネラシー(degeneracy)による変形が可能なのは当業者間には周知の事実である。
【００３６】
まず、本発明ではｋｇｆ−２ａ遺伝子を得るためにヒトの頭皮毛嚢細胞から総ＲＮＡを抽出した。当業者間に周知されているように、細胞から分離した総ＲＮＡは、増幅させようとする遺伝子の塩基序列に相応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを介して特定の遺伝子のｃＤＮＡに転換される。
【００３７】
本発明では、序列番号２の１番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子を増幅させるためには序列番号３及び序列番号４のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子を増幅させるためには序列番号９及び序列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【００３８】
具体的に、毛嚢から抽出した総ＲＮＡから逆転写を行ってｃＤＮＡを得、これから前記序列番号３及び序列番号４又は序列番号９及び序列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基序列を確認した結果、既存のヒトのＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ序列において８７番コドンがリジンからグルタミン酸に置換された新規のｃＤＮＡ序列を決定した（図１及び序列番号２参照）。
【００３９】
これをｋｇｆ−２ａ遺伝子と命名し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａで表示し、２００１年５月１９日付で韓国科学技術研究院の生命工学研究所付設の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）。
【００４０】
本発明の第３態様はＫＧＦ−２Ａの製造方法に関するものである。
【００４１】
ＫＧＦ−２Ａは、公知のアミノ酸序列、すなわち序列番号１のアミノ酸序列に応じて目的の序列を直接合成する方法で製造することができ、ヒトの頭皮毛嚢から精製することもでき、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた組換え方法によって発現、精製して製造することもできる。
【００４２】
本発明では、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いてこれをベクター内にクローニングした後、得られた組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換させて形質転換体を得、前記形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造する。この際、前記ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００４３】
追加的な塩基序列としては、蛋白質の発現後に区画化(compartmentalization)のためのシグナルや膜挿入(anchor)序列などが結合することもでき、免疫源性決定基などが融合することができ、蛋白質の分離精製を容易にするためのタグ(tag)を挿入することもでき、融合部位に酵素特異切断序列が挿入されることができる。このような追加的な塩基序列はその目的に応じて蛋白質の発現、精製後に酵素などによって切断可能である。
【００４４】
まず、組換えプラスミドを得るために、ｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＥＴ９ｃ又はｐＧＥＸ−２Ｔのような市販の発現ベクター内にサブクローニングする。この際、ｐＥＴ９ｃはＴ７プロモータを含むもので、標的遺伝子の発現を強く誘導し、ｐＧＥＸ−２ＴはグルタチオンＳ−転移酵素（glutathion S-transferase、以下「ＧＳＴ」という）をコーディングする序列が標的遺伝子の挿入位置の上流に含まれているため、ＧＳＴ−融合蛋白質の形態で発現される。
【００４５】
具体的に、序列番号２において信号序列(signal sequence)をコーディングする部位である１番から１１７番までの塩基序列を除き、１１８番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＧＥＸ−２Ｔ内にサブクローニングして組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａを得た。
【００４６】
前記のような方法で得られたｋｇｆ−２ａ遺伝子を含む組換えプラスミドを、リン酸カルシウム(calcium phosphate)沈澱方法、リポソーム(liposome)媒介方法、マイクロインジェクション(microinjection)、エレクトロポレーション(electroporation)を用いたトランスフェクション(transfection)方法などの公知の方法で大腸菌のような宿主細胞を形質転換させて形質転換体を製造する。
【００４７】
本発明では、宿主細胞として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を用いた。具体的に、前記組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換させて形質転換体を得た。
【００４８】
形質転換体から蛋白質を分離精製するために、形質転換体を適当な時間だけ培養し細胞を破砕した後、クロマトグラフィ、透析及び／又は濾過を施してＫＧＦ−２Ａを精製することにより、ＫＧＦ−２Ａを純粋分離する。
【００４９】
本発明では、前記過程で得た大腸菌形質転換体を４８時間以上培養した後、細胞を破砕し、濃度勾配ＮａＣｌ溶液で溶離するヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィを施してＫＧＦ−２Ａを分離精製した。
【００５０】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａのような組換えプラスミドで形質転換された形質転換体の場合には、ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質が生成されるので、グルタチオンカラムクロマトグラフィを用いて選択的にＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質を分離することができる。前記融合蛋白質はトロンビン処理で簡単にＧＳＴを標的蛋白質から除去することができる。蛋白質の分離精製時に適切なカラムの選択と適用は、当業者が容易に変形することができる。
【００５１】
また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子を発現ベクター内にサブクローニングした場合には、必要に応じて蛋白質の発現後にトリプシンのような酵素を用いて切断して除去することができる。
本発明において、アガロースゲル上で確認した蛋白質の分子量は、ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａが約４５ｋＤａ、ＫＧＦ−２Ａが約２０ｋＤａであった。これは予想の分子量と一致するものであった（図２参照）。
【００５２】
本発明の第４態様は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物に関するものである。この際、ＫＧＦ−２Ａは１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２Ａは糖鎖などが結合した成熟蛋白質の形態であってもよい。
【００５３】
ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００５４】
本発明では、ＫＧＦ−２Ａの生物学的活性を確認するために、ＫＧＦ−２Ａのヒトの頭皮毛嚢細胞における増殖促進能を測定した。具体的に、ヒトの頭皮から分離した毛嚢細胞にＫＧＦ−２Ａを処理して一定の時間経過後にＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。
【００５５】
その結果、図５に示すように、ＫＧＦ−２Ａ３０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示し、陰性対照区１００％対比約１４０％の著しい増殖活性を示した（図５参照）。
【００５６】
また、内在的ＫＧＦ−２の原因を除去するために、真皮乳頭が外科的に除去されたヒトの頭皮毛嚢にＫＧＦ−２Ａを処理し、一定時間の経過後、ＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。
【００５７】
その結果、真皮乳頭の除去されていない毛嚢に比べて、真皮乳頭の除去された毛嚢で細胞の増殖が一層著しいことを確認した（図６ａ及び図６ｂ参照）。
【００５８】
ＫＧＦ−１はＦＧＦ家族群においてＫＧＦ−２と密接した一員である。従って、ＫＧＦ−２Ａの刺激効果はＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２と比較できる。
【００５９】
本発明では、ヒトの頭皮から分離した毛嚢細胞にそれぞれＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａを処理し、一定の時間経過後、ＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。また、内因性因子による影響を除去するために、真皮乳頭を除去したヒトの頭皮毛嚢にそれぞれＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａを処理し、毛嚢細胞の増殖程度を確認した。
【００６０】
その結果、真皮乳頭の除去の如何を問わず、ＫＧＦ−２ＡがＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２に比べて著しく毛嚢細胞増殖を促進することを確認した（図７ａ及び図７ｂ参照）。
【００６１】
従って、本発明に係るＫＧＦ−２Ａは、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるため、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛髪再活を促進させる薬学的組成物に有効成分として利用できる。
【００６２】
また、ＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子は、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛髪再活を促進させる遺伝子治療剤として利用できる。
【００６３】
本発明において、前記薬学的組成物は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を薬剤学的に許容される通常の賦形剤又は補助剤と混合し、通常の薬剤学的製剤方法で製剤化して製造できる。この際、通常の薬剤学的製剤方法には、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を遺伝子治療用ベクターに挿入して用いることが含まれる。
【００６４】
本発明の第５態様は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた脱毛症治療又は予防方法を提供する。前記方法はＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。
【００６５】
具体的に、前記ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を含有する薬学的組成物は、経口的又は非経口的に、例えば静脈内、皮下、筋肉内、経皮又は直腸内に投与することができるが、 頭皮に直接投与する経皮投与が好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を制限するものではない。
【００６７】
〔実施例1〕毛嚢の分離
正常人と脱毛症患者の頭皮から、形態発生学的に生成期の構造的特性をもつ毛嚢をそれぞれ分離した。
【００６８】
〔実施例２〕ヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡの分離
トリゾール(Gibco BRL)を用いて毛嚢から抽出した総ＲＮＡをもって逆転写を行った。
【００６９】
具体的に、ヒトの毛嚢の総ＲＮＡ（１μｇ）を、モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素３００ｕｎｉｔｓ、ヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤１５ｕｎｉｔｓ及び無作為ヘキサデオキシヌクレオチドプライマー０.５μｇを含む反応混合物（２０μｌ）と共に３７℃で６０分間培養して逆転写を行ってｃＤＮＡ溶液を得た。得られた前記ｃＤＮＡ溶液からヒトＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ切片を増幅させるために、ｃＤＮＡ溶液と０.０５ｕｎｉｔ／μｌのＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び序列番号３のセンスプライマーと序列番号４のアンチセンスプライマーをそれぞれ４ｐｍｏｌ／μｌ含む反応混合物(reaction mixture)でＰＣＲを３０回行った。前記プライマーはヒトＫＧＦ−２の１番から２０８番までのアミノ酸序列に相応するものである。ＰＣＲの条件は９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間とした。ＰＣＲ機器はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６００(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)を使用した。
【００７０】
その結果、得られたＰＣＲ産物はヒトＫＧＦ−２の１番から２０８番までのアミノ酸序列に相応する全ての可能なコドンであり、６２７塩基対(base pairs)の予想サイズのＤＮＡクローンが主要増幅産物であった。
【００７１】
５つのクローンを無作為に選択してこれらの塩基序列を決定した。具体的に、前記予想サイズに増幅されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ ＤＮＡ(Promega Biotech)内にクローニングした後、クローニングされたＤＮＡの塩基序列をジデオキシ終結循環序列(Applied Biosystems)を用いてアプライドバイオシステムモデル３７７ＤＮＡシーケンサー(Perkin-Elmer)で確認した。
【００７２】
その結果、前記５つのクローンのうち１つから、既存のヒトＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ序列で８７番コドンがリジンからグルタミン酸に置換された序列を確認した。これは既存のＫＧＦ−２蛋白質の突然変異型類似体をコーディングするもので、ｋｇｆ−２ａ遺伝子と命名した。ヒトｋｇｆ−２ａ ｃＤＮＡのコーディング部位は６２７個のヌクレオチドからなり、序列番号２に表示される。これはｋｇｆ−２の塩基序列とは９９.５％の相同性を示した。
【００７３】
前記で分離したｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａで表示し、２００１年５月１９日付で韓国科学技術研究院の生命工学研究所付設の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）（図４参照）。ｐＧＥＭ−ＴベクターはＴ７ Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼ二重プロモータ（−１７〜＋３）とｌａｃオペレータ（operator、２００〜２１６）を持っている。
【００７４】
序列番号２のｋｇｆ−２ａ遺伝子塩基序列は、完全なＫＧＦ−２Ａの２０８個のアミノ酸からなるアミノ酸序列をコーディングし、４番から１１７番までの塩基序列は、ＫＧＦ−２Ａの信号序列をコーディングする。ＫＧＦ−２Ａのアミノ酸序列を序列番号１に表示した。
【００７５】
〔実施例３〕ＲＴ−ＰＣＲによるＫＧＦ−２Ａ及びＦＧＦＲ２IIIｂ ｍＲＮＡ発現分析
序列番号５及び序列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行ってＫＧＦ−２Ａ ｍＲＮＡの発現を分析した。
【００７６】
序列番号５のセンスプライマー及び序列番号６のアンチセンスプライマーは、ＫＧＦ−２のコーディング序列のうち、４２７塩基対からなる序列（１１９〜６２７）に隣接して連結(flanking)される序列である。
【００７７】
ＲＴ−ＰＲは、具体的に、前記実施例２で毛嚢から分離した総ＲＮＡ（１μｇ）に、モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素１５ｕｎｉｔｓと前記序列番号５及び序列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれた反応混合物を用いて９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間を４０回繰り返し行った後、最後に７２℃で５分間反応させた。その結果、得られたＲＴ−ＰＣＲの産物は１.５％のアガロースゲルで分析した。
【００７８】
また、ＫＧＦ−２Ａの受容体であるＦＧＦＲ２IIIｂ ｍＲＮＡの発現を分析するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、序列番号７のセンスプライマーと序列番号８のアンチセンスプライマーを使用したが、これはヒトＦＧＦＲ２IIIｂのコーディング序列のうち、３５０塩基対からなる序列（６９９〜１０４９）に隣接して連結される序列に相応するものである。
【００７９】
ＰＣＲは９４℃で１分間１回行った後、９４℃で１分間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５回繰り返し行い、７２℃で５分間行った。
【００８０】
β−アクチンｍＲＮＡの発現水準を分析して内部対照区として用いた。
【００８１】
図３に示すように、ＫＧＦ−２Ａは、正常人の毛嚢では発現される一方、脱毛症患者の毛嚢では検出されなかった。反面、ＫＧＦ−２Ａの受容体であるＦＧＦＲ２IIIｂは正常人と脱毛症患者の両者の毛嚢から全て検出された。
【００８２】
また、表１より、脱毛症患者の場合には、例外なくＫＧＦ−２Ａの発現が制限される一方、正常人の場合には、５７％のみ正常的に発現され、４３％はその発現が制限されることが分る（ｐ＜０.０５）。
【００８３】
【表１】
【００８４】
これは、外見上に正常人と見られる場合でも、遺伝的な原因によりＫＧＦ−２Ａの発現が制限される保因者が存在することを示し、このような保因者は向後脱毛症の発病可能性が高いものと解釈可能である。
【００８５】
〔実施例４〕組換えＫＧＦ−２Ａの製造
まず、ヒトＫＧＦ−２Ａの４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするｃＤＮＡを増幅するために、ヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び序列番号９と序列番号１０のプライマーを用いて２５回ＰＣＲを行った。増幅された部位は、信号序列の分泌及び切断部位の下流に連結される成熟なＫＧＦ−２Ａをコーディングする部位に相当するものであった。
【００８６】
次に、増幅産物をｐＥＴ９ｃプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングして組換えプラスミドｐＥＴ９ｃ−ＫＧＦ−２Ａを製造し、これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた。
【００８７】
前記過程から得た形質転換体を４８時間培養して大腸菌形質転換体でＴ７遺伝子のプロモータから組換えＫＧＦ−２Ａを発現させた後、細胞を破砕してトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を前処理し、ヘパリン−セファロースカラムに注入した。その後、カラムからＮａＣｌの濃度を増加させ、溶離した連続的な分画を分析した結果、１.０ＭのＮａＣｌ分画からヒトのＫＧＦ−２Ａが殆ど溶出されたことを確認し、これをさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、シルバーステイニングを行って確認した。０.８Ｍ及び１.２ＭのＮａＣｌ分画からもＫＧＦ−２Ａが一部溶出された。
【００８８】
溶出された蛋白質の分子量は約２０ｋＤａであり、これは予想の分子量と一致するものであった。１.０ＭのＮａＣｌ分画から溶出された蛋白質サンプルでアミノ酸分析を行って本質的に純粋なＫＧＦ−２Ａを得ることを確認した。
【００８９】
〔実施例5〕ＧＴＳ−融合システムを用いた組換えＫＧＦ−２Ａの製造
前記実施例４の方法でヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡを増幅し、増幅された産物を制限酵素ＥｃｏＲI及びＢａｍＨIで切断し、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲI／ＢａｍＨI位置に連結させて得た組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を４２℃で３０秒間熱衝撃を加えて形質転換させた。
【００９０】
前記過程から得た形質転換体を４８時間培養した後、細胞を破砕して５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）で予め平衡化したグルタチオンカラムに直接注入した。グルタチオンビードに結合した蛋白質は５０ｍＭのＴｉｒｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）でグルタチオンと共に溶出した。
【００９１】
ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質を含む分画は、さらにヘパリンカラム(Pharmacia Biotech.)にトロンビン２μｇを添加して１時間反応させることによりＧＳＴを切断した後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶かした０〜２.０Ｍの濃度勾配ＮａＣｌで溶出した。その後、リン酸塩−緩衝塩溶液(phosphate-buffered saline)に対して一晩中透析し、次にＰｙｒｏＳｅｐ−Ｃ(Tanabe Pharmaceuticals, Japan)に適用して内毒素を除去して純粋なＫＧＦ−２Ａ蛋白質を分離した。
【００９２】
アガロースゲル上で確認した蛋白質の分子量は、ＧＳＴ−ＫＧＦ−２Ａが約４５ｋＤａ、ＫＧＦ−２Ａが約２０ｋＤａであった。これは予想の分子量と一致するものであった（図２参照）。
【００９３】
〔実施例６〕組換えＫＧＦ−２Ａの分裂誘発活性の検証
ヒトの頭皮から毛嚢を分離し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン及び７５μｇ／ｍｌの牛脳下垂体抽出物の補充されたＫＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）が各ウェル当たり１ｍｌずつ入った２４ウェルプレートに仕込み、５％ＣＯ2／９５％空気の大気下で維持させた。
【００９４】
本発明では、毛嚢細胞の成長程度をＭＴＳ比色測定法で測定した。具体的に、ＭＴＳ分析を行う前に前記毛嚢細胞培養液にＫＧＦ−２Ａを１０、３０及び１００ｎｇ／ｍｌ濃度でそれぞれ処理して４８時間培養した。この際、ＫＧＦ−２Ａとしては前記実施例４で製造した蛋白質を使用した。
【００９５】
次に、９６ウェルマイクロタイター内に各ウェル当たり一つの毛嚢を入れ、４時間経過後に製造社（Ｐｒｏｍｅｇａ）で指示する方法に従ってＭＴＳ比色測定法を用いて細胞増殖を確認した。各実験は８回繰り返し行った。データ値は平均±標準偏差（Ｓ.Ｅ.）で表示した。陰性対照区としては非処理毛嚢細胞を用いた。
【００９６】
図５に示すように、ＫＧＦ−２Ａの添加は容量−依存的にヒト毛嚢細胞の増殖を促進させた結果、最大促進活性を示す濃度は３０ｎｇ／ｍｌであった。
【００９７】
〔実施例7〕ＫＧＦ−２Ａ活性の分子的メカニズムの確認
歯(tooth)或いは羽芽の発生の如き、毛嚢形態発生は、上皮−間葉の相互作用によって左右され、具体的に毛髪板(hair placode)ケラチノサイトと間葉凝縮下部(underlying mesenchymal condensations)の繊維芽細胞間の相互作用によるものと知られている。
【００９８】
したがって、本発明者は、具体的な器官培養で毛嚢細胞増殖にＫＧＦ−２Ａの投与が及ぼす影響を評価し、ＫＧＦ−２Ａの分子的メカニズムを確認しようとした。
【００９９】
すなわち、正常人の頭皮毛嚢にはＫＧＦ−２Ａが存在することに着目し、ＫＧＦ−２Ａの分裂促進活性で内因性ＫＧＦ−２による影響を除去するために、正常人の毛嚢を分離して真皮乳頭を外科的に除去した後、実施例６と同様の方法でこれを含む培養培地にＫＧＦ−２Ａを処理し、細胞増殖の程度を測定した。
【０１００】
その結果、図６ａ及び図６ｂに示すように、ＫＧＦ−２Ａは、真皮乳頭を含む毛嚢細胞における細胞増殖（１２５％±１１.０）と比較して、真皮乳頭が除去された毛嚢細胞の増殖を１３５％±１１.１（Ｐ＜０.０５）まで増加した値に促進させることを確認した。
【０１０１】
〔実施例８〕ＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２の分裂促進活性との比較
本発明に係るＫＧＦ−２Ａの活性をＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２と比較した。具体的に、脱毛症患者の毛嚢を分離してそれぞれＫＧＦ−１、ＫＨＧ−２及びＫＧＦ−２を処理し、実施例６と同様にその細胞増殖活性を測定した（８回反復）。この際、実施例７のように内因性因子の影響を排除するために真皮乳頭を除去した後、同一の実験を行った。
【０１０２】
その結果、図７ａに示すように、ＫＧＦ−２ＡはＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２に比べて有意的に脱毛症患者の頭皮から分離された毛嚢細胞の増殖を促進させた（ＫＧＦ−１：１１２％±６.９；ＫＧＦ−２：１２６％±８.６；ＫＧＦ−２Ａ：１３５％±７.８）。ＫＧＦ−２Ａの活性は真皮乳頭の除去された毛嚢細胞においても有意的に現われた（図７ｂ参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
以上述べたように、本発明のＫＧＦ−２Ａは、既存のＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された新規の突然変異型蛋白質であって、ヒトの毛嚢から分離したもので、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１はヒトＫＧＦ−２と本発明のＫＧＦ−２Ａとのアミノ酸序列を比較して示す図である。
【図２】図２はＧＳＴ−ＫＧＦ２ＡとＫＧＦ−２Ａとを分離してアガロースゲル上でその分子量を確認した結果を示す図である。
【図３】図３は正常人と脱毛症患者の頭皮から分離した毛嚢における本発明のＫＧＦ−２ＡとＫＧＦ−２Ａ受容体の発現様相を比較分析した結果を示す図である。
【図４】図４は序列番号２の塩基序列を含むＫＧＦ−２ＡのＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入して得た組換えプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａ（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）の制限酵素地図である。
【図５】図５はＫＧＦ−２Ａの毛嚢細胞増殖活性をＭＴＳ比色分析法で確認した結果を示す図である。
【図６ａ】図６ａは正常人の頭皮毛嚢から真皮乳頭を除去した後ＫＧＦ−２Ａを処理した結果、細胞増殖に及ぼす効果を確認した図である。
【図６ｂ】図６ｂは正常人の頭皮毛嚢から真皮乳頭を除去していない毛嚢にＫＧＦ−２Ａを処理した結果、細胞増殖に及ぼす効果を確認した図である。
【図７ａ】図７ａは脱毛症患者の毛嚢にＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａをそれぞれ処理した後細胞増殖活性を確認した図である。
【図７ｂ】図７ｂは脱毛症患者の毛嚢から真皮乳頭を除去した後、ＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａをそれぞれ処理してその細胞増殖活性を確認した図である。
【０００１】
本発明は、新たに分離した第２ケラチノサイト成長因子類似体（keratinocyte growth factor-2 analogue、以下「ＫＧＦ―２Ａ」という）、これをコーディングする遺伝子、この製造方法及びこれらの医薬学的用途に関する。
【０００２】
より詳しくは、ヒトの頭皮毛嚢からＫＧＦ−２の突然変異体を新たに分離し、前記蛋白質をコーディングする遺伝子、これを含む発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換した形質転換体を製造し、この形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造するものである。本発明のＫＧＦ―２Ａは、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに利用できる。
【背景技術】
【０００３】
毛嚢は成長期(anagen)、退行期(catagen)及び休止期(telogen)からなる生活史を有する表皮細胞変異体である。
【０００４】
毛嚢は、たとえ生活史の基礎となるメカニズムが完全に究明されてはいないが、毛嚢内の間葉細胞(mesenchymal cell)群集と上皮細胞(epithelial cell)群集間の相互作用が核心的な役割を果たすと知られている(Jahoda, C. A.& Reynolds, A. J. (1996) Dermatol. Clin. 14, 573-583)。毛嚢の生活史の進行において、最も明白な動力は乳頭性間葉(papillary mesenchyme)から由来し、特に真皮乳頭(dermal papilla)が重要な役割を行う。
乳頭性間葉から出た特定因子(factor)は小胞性上皮の生活史に誘導信号として作用する(Peus, D. & Pittelkow, M. R. (1996) Dermatol. Clin. 14, 559-572)。
具体的には毛嚢の突出部にある上皮幹細胞(epithelial stem cells)が真皮乳頭からの誘導信号に反応可能であると考えられている(Cotsarelis, G., Sun, T. T. & Lavker, R. M.(1990) Cell 61, 1329-1337)。前記の過程によって上皮幹細胞が活性化されると、突出部で幹細胞の増殖が起こり、幹細胞子孫が真皮側に下方に成長し、その後マトリックス細胞(matrix cells)の分化的成長が起こり、複合小胞性上皮(complex follicular product)、シャフト(shaft)及びそれらを取り囲んだシース(sheath)が生成される。
【０００５】
形質変換マウス又は遺伝子ノックアウトマウスの皮膚表現型を分析した結果、間葉細胞（真皮乳頭）と上皮細胞（ケラチノサイト）間の相互作用が胎児において毛嚢の形態発生に関与するという主張が力を得た(Gat, U. et al. (1998) Cell 95, 605-514 ; Chiang, C. et al. (1999) Dev. Biol. 205, 1-9 ; Botchkarev. V. A. et al.(1999) Nat. Cell Biol. 1, 158-164)。ところが、生後の小嚢で休止期と成長期との間に発生する生物学的スイッチに関するメカニズムは不明である。そのような因子して最も説得力のある候補者はＫＧＦ―２である。なぜなら、ＫＧＦ−２は、真皮乳頭繊維芽細胞で発見されるし、その受容体ＦＧＦＲ２IIIｂが隣接のケラチノサイトに存在するためである(Katsuoka K, Schell H, Hornstein OP, Wessel B. (1987) Br. J. Dermatol Mar 116(3), 464-5)。
【０００６】
ｋｇｆ−２遺伝子は繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor、以下「ＦＧＦ」という)遺伝子家族群に属するものであり、ＦＧＦは現在哺乳動物から２２種以上が発見された(Nishimura T. Nakatake Y, Konishi M. Itoh N. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1492, 203-206)。ＦＧＦはチロシンキナーゼ受容体(tyrosine kinase receptors)の一員であるＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲｓ）に結合してこれらを活性化させることにより、細胞の増殖、分化、移動及び生存を調節するものと考えられる。
【０００７】
２２種のＦＧＦのうち、ＫＧＦ―２はＦＧＦ―７と構造的に最も深い連関性を持っており(Yamasaki M. Miyake A. Tagashira S. Itoh N. (1996) J. Biol. Chem. 271, 15918-15921)、これらのＦＧＦは両方とも四つのＦＧＦＲｓの中でも異性体の一つであるＦＧＦＲ２IIIｂに特異的に結合すると知られている(Miki T. et al (1991) Science 251, 72-75 ; Ornitz D. M. et al.(1996) J. Biol. Chem. 271, 15292-15297 ; Igarashi M. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 13230-13235)。
【０００８】
また、機能的には、ＫＧＦ―２が肢芽(limb bud)のアウトグロース(outgrowth)と肺の分枝的形態発生(branching morphogenesis)に関与するものと見られる(Martin G. r. (1998) Genes Dev. 12, 1571-15869)。肢芽と肺芽(lung bud)は器官原基(organ primordia)の典型的な一例であって、器官の発生development)に上皮組織と間葉組織間の密接な相互作用が必要である。
【０００９】
上皮−間葉の相互作用において、間葉から出た信号は直接的に上皮組織に伝えられて発芽的形態発生又は分枝的形態発生(budding or branching morphogenesis)による特異構造を形成し、両組織間の相互作用はその以後の発生中にも維持されることが確実である。
【００１０】
米国特許第５,１８４,６０５号、第５,８２４,６４３号及び第５,９６５,５３０号には、ＫＧＦがケラチノサイト以外にも上皮組織の様々な細胞で増殖、成長及び分化を刺激する活性があって、ＫＧＦを、真皮付属器、肝、肺及び胃腸管のような組織及び器官を苦しめる疾病状態又は医療状況の治療に使用することができることと、この際、真皮内の付属器要素が皮脂腺、汗腺及び毛嚢であることなどが記載されている。
【００１１】
ところが、ＫＧＦは傷回復(wound healing)次元の上皮再生(reepithelialization)活性のみが確認され、化学療法によって誘発された脱毛症(chemotherapy-induced alopecia)にのみ適用可能であると説明されているだけで、遺伝的な原因により発病する脱毛症には適用の余地が全くない。
【００１２】
また、米国特許第６,０７７,６９２号には、ＫＧＦ―２のアミノ酸序列及びこれをコーディングする塩基序列を分離し、その傷回復、抗炎症活性、肝細胞の分化及び増殖を促進させ且つ肺の損傷を防止する活性を確認することにより使用できることが開示されている。
【００１３】
ところが、前記文献にはＫＧＦ―２が毛嚢の増殖を促進する効果があるか否かを実験的に確認して記載されていない。
【００１４】
前記に引用された文献はその全体が参考として本明細書に含まれる。
【００１５】
本発明者は、脱毛症の原因になれる分子的因子(molecular factor)を見出そうとしている中、脱毛症患者の毛嚢ではＫＧＦ―２と類似している蛋白質の発現が制限されることを発見し、これを分離してそのアミノ酸序列を確認した結果、ＫＧＦ−２の新しい突然変異型蛋白質であること及び前記ＫＧＦ―２Ａが頭皮毛嚢細胞の増殖を促進することを確認して本発明を完成した。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、脱毛症患者の頭皮毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進する新規のＫＧＦ―２Ａを分離提供し、これを脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに用いる用途を提供することをその目的とする。
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明は、ＫＧＦ―２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたＫＧＦ―２Ａを提供する。この際、ＫＧＦ−２Ａはヒトの頭皮毛嚢細胞から分離したＫＧＦ―２の新しい突然変異型蛋白質であって、序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含み、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２が糖鎖などの結合した成熟蛋白質(mature protein)の形態であってもよい。
【００１８】
また、本発明は、ＫＧＦ−２Ａをコーディングする遺伝子を提供する。本発明のｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流(upstream)に開始コドンをさらに含むことができる。
【００１９】
具体的に、序列番号２の４番から６２７番まで、或いは１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことができ、その塩基序列の上流に開始コドンをさらに含むことができる。
【００２０】
本発明は、ＫＧＦ−２Ａの製造方法を提供する。本発明の製造方法は、ｋｇｆ―２ａ遺伝子を発現ベクターにクローニングし、宿主細胞に形質転換させて形質転換体を得た後、前記形質転換体を培養する段階を含む。この際、前記ｋｇｆ―２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００２１】
また、本発明は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を提供する。この際、ＫＧＦ−２Ａは、１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むか、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２Ａが糖鎖などの結合した成熟蛋白質の形態であってもよい。
【００２２】
ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００２３】
前記薬学的組成物は、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるのに使用できる。
【００２４】
本発明は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた脱毛症の治療又は予防方法を提供する。前記方法はＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分として含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。
【００２５】
本発明の第１態様は、ＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたＫＧＦ−２Ａに関するものである。この際、ＫＧＦ−２Ａはヒトの頭皮毛嚢細胞から分離したＫＧＦ−２の新しい突然変異型蛋白質である。
【００２６】
まず、本発明では、ＫＧＦ−２Ａを分離、確認するために、ヒトの頭皮毛嚢細胞から総ｍＲＮＡを抽出した後、ＫＧＦ−２のＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを用いたＲＴ−ＰＣＲを施してｃＤＮＡを得、その塩基序列を決定することにより、アミノ酸序列を推論し決定した。
【００２７】
その結果、得られたアミノ酸序列は既存のＫＧＦ−２とは８７番アミノ酸が相異し、これを序列番号１に開示した。本発明者は、ＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された新しい蛋白質をＫＧＦ−２Ａと命名した。
【００２８】
本発明に係るＫＧＦ−２Ａは、序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むか、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。
【００２９】
具体的に、本発明のＫＧＦ−２Ａは、ヒトの頭皮毛嚢から分離されたもので、脱毛症患者の頭皮では正常人とは異なる発現様相を示す。
【００３０】
まず、本発明では、正常人と脱毛症患者の毛嚢におけるＫＧＦ−２ＡのｍＲＮＡ発現を比較分析するために、正常人と脱毛症患者の頭皮から形態発生学的に生成期の構造的特性を有する毛嚢をそれぞれ分離した。前記毛嚢から総ＲＮＡ(total RNA)を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って得たｃＤＮＡをアガロースゲル上で分離して比較分析した。
【００３１】
その結果、本発明のＫＧＦ−２Ａは、ＫＧＦ−２Ａ受容体のＦＧＦＲ２IIIｂとは異なり、正常人と脱毛症患者において相異した発現様相を示した。すなわち、正常人の毛嚢ではＫＧＦ−２Ａが一定の程度発現される反面、脱毛症患者の毛嚢ではその発現が制限されることを確認した（図３参照）。従って、本発明のＫＧＦ−２Ａは脱毛を調節する分子的因子である可能性が高い。
【００３２】
本発明の第２態様はＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子に関するものである。
【００３３】
ＫＧＦ−２ＡはＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換されたアミノ酸序列を有するものである。このため、ＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子は、前記アミノ酸序列を暗号化する全ての可能な場合のコドンから構成できる。また、前記遺伝子はｇＤＮＡ又はｃＤＮＡであり、よって、ｇＤＮＡの場合はコーディング部位内にイントロンのような非コーディング部位を含むことができる。
【００３４】
本発明のｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。
【００３５】
具体的に、序列番号２の４番から６２７番まで或いは１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことができ、その塩基序列の上流に開始コドンをさらに含むことができる。この際、コドンのデジェネラシー(degeneracy)による変形が可能なのは当業者間には周知の事実である。
【００３６】
まず、本発明ではｋｇｆ−２ａ遺伝子を得るためにヒトの頭皮毛嚢細胞から総ＲＮＡを抽出した。当業者間に周知されているように、細胞から分離した総ＲＮＡは、増幅させようとする遺伝子の塩基序列に相応するオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲを介して特定の遺伝子のｃＤＮＡに転換される。
【００３７】
本発明では、序列番号２の１番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子を増幅させるためには序列番号３及び序列番号４のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子を増幅させるためには序列番号９及び序列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【００３８】
具体的に、毛嚢から抽出した総ＲＮＡから逆転写を行ってｃＤＮＡを得、これから前記序列番号３及び序列番号４又は序列番号９及び序列番号１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の塩基序列を確認した結果、既存のヒトのＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ序列において８７番コドンがリジンからグルタミン酸に置換された新規のｃＤＮＡ序列を決定した（図１及び序列番号２参照）。
【００３９】
これをｋｇｆ−２ａ遺伝子と命名し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａで表示し、２００１年５月１９日付で韓国科学技術研究院の生命工学研究所付設の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）。
【００４０】
本発明の第３態様はＫＧＦ−２Ａの製造方法に関するものである。
【００４１】
ＫＧＦ−２Ａは、公知のアミノ酸序列、すなわち序列番号１のアミノ酸序列に応じて目的の序列を直接合成する方法で製造することができ、ヒトの頭皮毛嚢から精製することもでき、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた組換え方法によって発現、精製して製造することもできる。
【００４２】
本発明では、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いてこれをベクター内にクローニングした後、得られた組換えプラスミドで宿主細胞を形質転換させて形質転換体を得、前記形質転換体を培養してＫＧＦ−２Ａを製造する。この際、前記ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするものであり、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００４３】
追加的な塩基序列としては、蛋白質の発現後に区画化(compartmentalization)のためのシグナルや膜挿入(anchor)序列などが結合することもでき、免疫源性決定基などが融合することができ、蛋白質の分離精製を容易にするためのタグ(tag)を挿入することもでき、融合部位に酵素特異切断序列が挿入されることができる。このような追加的な塩基序列はその目的に応じて蛋白質の発現、精製後に酵素などによって切断可能である。
【００４４】
まず、組換えプラスミドを得るために、ｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＥＴ９ｃ又はｐＧＥＸ−２Ｔのような市販の発現ベクター内にサブクローニングする。この際、ｐＥＴ９ｃはＴ７プロモータを含むもので、標的遺伝子の発現を強く誘導し、ｐＧＥＸ−２ＴはグルタチオンＳ−転移酵素（glutathion S-transferase、以下「ＧＳＴ」という）をコーディングする序列が標的遺伝子の挿入位置の上流に含まれているため、ＧＳＴ−融合蛋白質の形態で発現される。
【００４５】
具体的に、序列番号２において信号序列(signal sequence)をコーディングする部位である１番から１１７番までの塩基序列を除き、１１８番から６２７番までの塩基序列を含むｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＧＥＸ−２Ｔ内にサブクローニングして組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａを得た。
【００４６】
前記のような方法で得られたｋｇｆ−２ａ遺伝子を含む組換えプラスミドを、リン酸カルシウム(calcium phosphate)沈澱方法、リポソーム(liposome)媒介方法、マイクロインジェクション(microinjection)、エレクトロポレーション(electroporation)を用いたトランスフェクション(transfection)方法などの公知の方法で大腸菌のような宿主細胞を形質転換させて形質転換体を製造する。
【００４７】
本発明では、宿主細胞として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を用いた。具体的に、前記組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を形質転換させて形質転換体を得た。
【００４８】
形質転換体から蛋白質を分離精製するために、形質転換体を適当な時間だけ培養し細胞を破砕した後、クロマトグラフィ、透析及び／又は濾過を施してＫＧＦ−２Ａを精製することにより、ＫＧＦ−２Ａを純粋分離する。
【００４９】
本発明では、前記過程で得た大腸菌形質転換体を４８時間以上培養した後、細胞を破砕し、濃度勾配ＮａＣｌ溶液で溶離するヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィを施してＫＧＦ−２Ａを分離精製した。
【００５０】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａのような組換えプラスミドで形質転換された形質転換体の場合には、ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質が生成されるので、グルタチオンカラムクロマトグラフィを用いて選択的にＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質を分離することができる。前記融合蛋白質はトロンビン処理で簡単にＧＳＴを標的蛋白質から除去することができる。蛋白質の分離精製時に適切なカラムの選択と適用は、当業者が容易に変形することができる。
【００５１】
また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子を発現ベクター内にサブクローニングした場合には、必要に応じて蛋白質の発現後にトリプシンのような酵素を用いて切断して除去することができる。
本発明において、アガロースゲル上で確認した蛋白質の分子量は、ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａが約４５ｋＤａ、ＫＧＦ−２Ａが約２０ｋＤａであった。これは予想の分子量と一致するものであった（図２参照）。
【００５２】
本発明の第４態様は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物に関するものである。この際、ＫＧＦ−２Ａは１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列、或いは２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことができ、前記それぞれの場合、Ｎ−末端にメチオニンをさらに含むことができる。また、ＫＧＦ−２Ａは糖鎖などが結合した成熟蛋白質の形態であってもよい。
【００５３】
ｋｇｆ−２ａ遺伝子は、序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングし、或いは４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするもので、前記それぞれの場合、５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことができる。また、ｋｇｆ−２ａ遺伝子に追加的な塩基序列が結合した融合遺伝子の形態であってもよい。
【００５４】
本発明では、ＫＧＦ−２Ａの生物学的活性を確認するために、ＫＧＦ−２Ａのヒトの頭皮毛嚢細胞における増殖促進能を測定した。具体的に、ヒトの頭皮から分離した毛嚢細胞にＫＧＦ−２Ａを処理して一定の時間経過後にＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。
【００５５】
その結果、図５に示すように、ＫＧＦ−２Ａ３０ｎｇ／ｍｌで最大活性を示し、陰性対照区１００％対比約１４０％の著しい増殖活性を示した（図５参照）。
【００５６】
また、内在的ＫＧＦ−２の原因を除去するために、真皮乳頭が外科的に除去されたヒトの頭皮毛嚢にＫＧＦ−２Ａを処理し、一定時間の経過後、ＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。
【００５７】
その結果、真皮乳頭の除去されていない毛嚢に比べて、真皮乳頭の除去された毛嚢で細胞の増殖が一層著しいことを確認した（図６ａ及び図６ｂ参照）。
【００５８】
ＫＧＦ−１はＦＧＦ家族群においてＫＧＦ−２と密接した一員である。従って、ＫＧＦ−２Ａの刺激効果はＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２と比較できる。
【００５９】
本発明では、ヒトの頭皮から分離した毛嚢細胞にそれぞれＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａを処理し、一定の時間経過後、ＭＴＳ比色測定法で細胞の増殖程度を確認した。また、内因性因子による影響を除去するために、真皮乳頭を除去したヒトの頭皮毛嚢にそれぞれＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａを処理し、毛嚢細胞の増殖程度を確認した。
【００６０】
その結果、真皮乳頭の除去の如何を問わず、ＫＧＦ−２ＡがＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２に比べて著しく毛嚢細胞増殖を促進することを確認した（図７ａ及び図７ｂ参照）。
【００６１】
従って、本発明に係るＫＧＦ−２Ａは、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるため、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛髪再活を促進させる薬学的組成物に有効成分として利用できる。
【００６２】
また、ＫＧＦ−２Ａをコーディングするｋｇｆ−２ａ遺伝子は、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛髪再活を促進させる遺伝子治療剤として利用できる。
【００６３】
本発明において、前記薬学的組成物は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を薬剤学的に許容される通常の賦形剤又は補助剤と混合し、通常の薬剤学的製剤方法で製剤化して製造できる。この際、通常の薬剤学的製剤方法には、ｋｇｆ−２ａ遺伝子を遺伝子治療用ベクターに挿入して用いることが含まれる。
【００６４】
本発明の第５態様は、ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を用いた脱毛症治療又は予防方法を提供する。前記方法はＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。
【００６５】
具体的に、前記ＫＧＦ−２Ａ又はｋｇｆ−２ａ遺伝子を含有する薬学的組成物は、経口的又は非経口的に、例えば静脈内、皮下、筋肉内、経皮又は直腸内に投与することができるが、 頭皮に直接投与する経皮投与が好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明する。これらの実施例は本発明の理解を助けるためのもので、本発明の範囲を制限するものではない。
【００６７】
〔実施例1〕毛嚢の分離
正常人と脱毛症患者の頭皮から、形態発生学的に生成期の構造的特性をもつ毛嚢をそれぞれ分離した。
【００６８】
〔実施例２〕ヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡの分離
トリゾール(Gibco BRL)を用いて毛嚢から抽出した総ＲＮＡをもって逆転写を行った。
【００６９】
具体的に、ヒトの毛嚢の総ＲＮＡ（１μｇ）を、モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素３００ｕｎｉｔｓ、ヒト胎盤ＲＮａｓｅ阻害剤１５ｕｎｉｔｓ及び無作為ヘキサデオキシヌクレオチドプライマー０.５μｇを含む反応混合物（２０μｌ）と共に３７℃で６０分間培養して逆転写を行ってｃＤＮＡ溶液を得た。得られた前記ｃＤＮＡ溶液からヒトＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ切片を増幅させるために、ｃＤＮＡ溶液と０.０５ｕｎｉｔ／μｌのＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び序列番号３のセンスプライマーと序列番号４のアンチセンスプライマーをそれぞれ４ｐｍｏｌ／μｌ含む反応混合物(reaction mixture)でＰＣＲを３０回行った。前記プライマーはヒトＫＧＦ−２の１番から２０８番までのアミノ酸序列に相応するものである。ＰＣＲの条件は９４℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で２分間とした。ＰＣＲ機器はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲシステム９６００(Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)を使用した。
【００７０】
その結果、得られたＰＣＲ産物はヒトＫＧＦ−２の１番から２０８番までのアミノ酸序列に相応する全ての可能なコドンであり、６２７塩基対(base pairs)の予想サイズのＤＮＡクローンが主要増幅産物であった。
【００７１】
５つのクローンを無作為に選択してこれらの塩基序列を決定した。具体的に、前記予想サイズに増幅されたＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ ＤＮＡ(Promega Biotech)内にクローニングした後、クローニングされたＤＮＡの塩基序列をジデオキシ終結循環序列(Applied Biosystems)を用いてアプライドバイオシステムモデル３７７ＤＮＡシーケンサー(Perkin-Elmer)で確認した。
【００７２】
その結果、前記５つのクローンのうち１つから、既存のヒトＫＧＦ−２ ｃＤＮＡ序列で８７番コドンがリジンからグルタミン酸に置換された序列を確認した。これは既存のＫＧＦ−２蛋白質の突然変異型類似体をコーディングするもので、ｋｇｆ−２ａ遺伝子と命名した。ヒトｋｇｆ−２ａ ｃＤＮＡのコーディング部位は６２７個のヌクレオチドからなり、序列番号２に表示される。これはｋｇｆ−２の塩基序列とは９９.５％の相同性を示した。
【００７３】
前記で分離したｋｇｆ−２ａ遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入してｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａで表示し、２００１年５月１９日付で韓国科学技術研究院の生命工学研究所付設の遺伝子銀行に寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）（図４参照）。ｐＧＥＭ−ＴベクターはＴ７ Ｓｐ６ ＲＮＡポリメラーゼ二重プロモータ（−１７〜＋３）とｌａｃオペレータ（operator、２００〜２１６）を持っている。
【００７４】
序列番号２のｋｇｆ−２ａ遺伝子塩基序列は、完全なＫＧＦ−２Ａの２０８個のアミノ酸からなるアミノ酸序列をコーディングし、４番から１１７番までの塩基序列は、ＫＧＦ−２Ａの信号序列をコーディングする。ＫＧＦ−２Ａのアミノ酸序列を序列番号１に表示した。
【００７５】
〔実施例３〕ＲＴ−ＰＣＲによるＫＧＦ−２Ａ及びＦＧＦＲ２IIIｂ ｍＲＮＡ発現分析
序列番号５及び序列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行ってＫＧＦ−２Ａ ｍＲＮＡの発現を分析した。
【００７６】
序列番号５のセンスプライマー及び序列番号６のアンチセンスプライマーは、ＫＧＦ−２のコーディング序列のうち、４２７塩基対からなる序列（１１９〜６２７）に隣接して連結(flanking)される序列である。
【００７７】
ＲＴ−ＰＲは、具体的に、前記実施例２で毛嚢から分離した総ＲＮＡ（１μｇ）に、モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素１５ｕｎｉｔｓと前記序列番号５及び序列番号６のオリゴヌクレオチドプライマーが含まれた反応混合物を用いて９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で２分間を４０回繰り返し行った後、最後に７２℃で５分間反応させた。その結果、得られたＲＴ−ＰＣＲの産物は１.５％のアガロースゲルで分析した。
【００７８】
また、ＫＧＦ−２Ａの受容体であるＦＧＦＲ２IIIｂ ｍＲＮＡの発現を分析するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、序列番号７のセンスプライマーと序列番号８のアンチセンスプライマーを使用したが、これはヒトＦＧＦＲ２IIIｂのコーディング序列のうち、３５０塩基対からなる序列（６９９〜１０４９）に隣接して連結される序列に相応するものである。
【００７９】
ＰＣＲは９４℃で１分間１回行った後、９４℃で１分間、５８℃で３０秒間及び７２℃で１分間を３５回繰り返し行い、７２℃で５分間行った。
【００８０】
β−アクチンｍＲＮＡの発現水準を分析して内部対照区として用いた。
【００８１】
図３に示すように、ＫＧＦ−２Ａは、正常人の毛嚢では発現される一方、脱毛症患者の毛嚢では検出されなかった。反面、ＫＧＦ−２Ａの受容体であるＦＧＦＲ２IIIｂは正常人と脱毛症患者の両者の毛嚢から全て検出された。
【００８２】
また、表１より、脱毛症患者の場合には、例外なくＫＧＦ−２Ａの発現が制限される一方、正常人の場合には、５７％のみ正常的に発現され、４３％はその発現が制限されることが分る（ｐ＜０.０５）。
【００８３】
【表１】
これは、外見上に正常人と見られる場合でも、遺伝的な原因によりＫＧＦ−２Ａの発現が制限される保因者が存在することを示し、このような保因者は向後脱毛症の発病可能性が高いものと解釈可能である。
【００８５】
〔実施例４〕組換えＫＧＦ−２Ａの製造
まず、ヒトＫＧＦ−２Ａの４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングするｃＤＮＡを増幅するために、ヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼ及び序列番号９と序列番号１０のプライマーを用いて２５回ＰＣＲを行った。増幅された部位は、信号序列の分泌及び切断部位の下流に連結される成熟なＫＧＦ−２Ａをコーディングする部位に相当するものであった。
【００８６】
次に、増幅産物をｐＥＴ９ｃプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）内にサブクローニングして組換えプラスミドｐＥＴ９ｃ−ＫＧＦ−２Ａを製造し、これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換させた。
【００８７】
前記過程から得た形質転換体を４８時間培養して大腸菌形質転換体でＴ７遺伝子のプロモータから組換えＫＧＦ−２Ａを発現させた後、細胞を破砕してトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を前処理し、ヘパリン−セファロースカラムに注入した。その後、カラムからＮａＣｌの濃度を増加させ、溶離した連続的な分画を分析した結果、１.０ＭのＮａＣｌ分画からヒトのＫＧＦ−２Ａが殆ど溶出されたことを確認し、これをさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、シルバーステイニングを行って確認した。０.８Ｍ及び１.２ＭのＮａＣｌ分画からもＫＧＦ−２Ａが一部溶出された。
【００８８】
溶出された蛋白質の分子量は約２０ｋＤａであり、これは予想の分子量と一致するものであった。１.０ＭのＮａＣｌ分画から溶出された蛋白質サンプルでアミノ酸分析を行って本質的に純粋なＫＧＦ−２Ａを得ることを確認した。
【００８９】
〔実施例5〕ＧＴＳ−融合システムを用いた組換えＫＧＦ−２Ａの製造
前記実施例４の方法でヒトＫＧＦ−２Ａ ｃＤＮＡを増幅し、増幅された産物を制限酵素ＥｃｏＲI及びＢａｍＨIで切断し、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲI／ＢａｍＨI位置に連結させて得た組換えプラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ−ＫＧＦ２Ａで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を４２℃で３０秒間熱衝撃を加えて形質転換させた。
【００９０】
前記過程から得た形質転換体を４８時間培養した後、細胞を破砕して５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）で予め平衡化したグルタチオンカラムに直接注入した。グルタチオンビードに結合した蛋白質は５０ｍＭのＴｉｒｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）でグルタチオンと共に溶出した。
【００９１】
ＧＳＴ−ＫＧＦ２Ａ融合蛋白質を含む分画は、さらにヘパリンカラム(Pharmacia Biotech.)にトロンビン２μｇを添加して１時間反応させることによりＧＳＴを切断した後、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）に溶かした０〜２.０Ｍの濃度勾配ＮａＣｌで溶出した。その後、リン酸塩−緩衝塩溶液(phosphate-buffered saline)に対して一晩中透析し、次にＰｙｒｏＳｅｐ−Ｃ(Tanabe Pharmaceuticals, Japan)に適用して内毒素を除去して純粋なＫＧＦ−２Ａ蛋白質を分離した。
【００９２】
アガロースゲル上で確認した蛋白質の分子量は、ＧＳＴ−ＫＧＦ−２Ａが約４５ｋＤａ、ＫＧＦ−２Ａが約２０ｋＤａであった。これは予想の分子量と一致するものであった（図２参照）。
【００９３】
〔実施例６〕組換えＫＧＦ−２Ａの分裂誘発活性の検証
ヒトの頭皮から毛嚢を分離し、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン及び７５μｇ／ｍｌの牛脳下垂体抽出物の補充されたＫＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）が各ウェル当たり１ｍｌずつ入った２４ウェルプレートに仕込み、５％ＣＯ2／９５％空気の大気下で維持させた。
【００９４】
本発明では、毛嚢細胞の成長程度をＭＴＳ比色測定法で測定した。具体的に、ＭＴＳ分析を行う前に前記毛嚢細胞培養液にＫＧＦ−２Ａを１０、３０及び１００ｎｇ／ｍｌ濃度でそれぞれ処理して４８時間培養した。この際、ＫＧＦ−２Ａとしては前記実施例４で製造した蛋白質を使用した。
【００９５】
次に、９６ウェルマイクロタイター内に各ウェル当たり一つの毛嚢を入れ、４時間経過後に製造社（Ｐｒｏｍｅｇａ）で指示する方法に従ってＭＴＳ比色測定法を用いて細胞増殖を確認した。各実験は８回繰り返し行った。データ値は平均±標準偏差（Ｓ.Ｅ.）で表示した。陰性対照区としては非処理毛嚢細胞を用いた。
【００９６】
図５に示すように、ＫＧＦ−２Ａの添加は容量−依存的にヒト毛嚢細胞の増殖を促進させた結果、最大促進活性を示す濃度は３０ｎｇ／ｍｌであった。
【００９７】
〔実施例7〕ＫＧＦ−２Ａ活性の分子的メカニズムの確認
歯(tooth)或いは羽芽の発生の如き、毛嚢形態発生は、上皮−間葉の相互作用によって左右され、具体的に毛髪板(hair placode)ケラチノサイトと間葉凝縮下部(underlying mesenchymal condensations)の繊維芽細胞間の相互作用によるものと知られている。
【００９８】
したがって、本発明者は、具体的な器官培養で毛嚢細胞増殖にＫＧＦ−２Ａの投与が及ぼす影響を評価し、ＫＧＦ−２Ａの分子的メカニズムを確認しようとした。
【００９９】
すなわち、正常人の頭皮毛嚢にはＫＧＦ−２Ａが存在することに着目し、ＫＧＦ−２Ａの分裂促進活性で内因性ＫＧＦ−２による影響を除去するために、正常人の毛嚢を分離して真皮乳頭を外科的に除去した後、実施例６と同様の方法でこれを含む培養培地にＫＧＦ−２Ａを処理し、細胞増殖の程度を測定した。
【０１００】
その結果、図６ａ及び図６ｂに示すように、ＫＧＦ−２Ａは、真皮乳頭を含む毛嚢細胞における細胞増殖（１２５％±１１.０）と比較して、真皮乳頭が除去された毛嚢細胞の増殖を１３５％±１１.１（Ｐ＜０.０５）まで増加した値に促進させることを確認した。
【０１０１】
〔実施例８〕ＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２の分裂促進活性との比較
本発明に係るＫＧＦ−２Ａの活性をＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２と比較した。具体的に、脱毛症患者の毛嚢を分離してそれぞれＫＧＦ−１、ＫＨＧ−２及びＫＧＦ−２を処理し、実施例６と同様にその細胞増殖活性を測定した（８回反復）。この際、実施例７のように内因性因子の影響を排除するために真皮乳頭を除去した後、同一の実験を行った。
【０１０２】
その結果、図７ａに示すように、ＫＧＦ−２ＡはＫＧＦ−１及びＫＧＦ−２に比べて有意的に脱毛症患者の頭皮から分離された毛嚢細胞の増殖を促進させた（ＫＧＦ−１：１１２％±６.９；ＫＧＦ−２：１２６％±８.６；ＫＧＦ−２Ａ：１３５％±７.８）。ＫＧＦ−２Ａの活性は真皮乳頭の除去された毛嚢細胞においても有意的に現われた（図７ｂ参照）。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
以上述べたように、本発明のＫＧＦ−２Ａは、既存のＫＧＦ−２の８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された新規の突然変異型蛋白質であって、ヒトの毛嚢から分離したもので、脱毛症患者の頭皮の毛嚢ではその発現が制限され、毛嚢細胞の増殖を促進させる活性があるので、脱毛症の予防と治療、毛髪成長及び毛嚢再活を促進させるに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１はヒトＫＧＦ−２と本発明のＫＧＦ−２Ａとのアミノ酸序列を比較して示す図である。
【図２】図２はＧＳＴ−ＫＧＦ２ＡとＫＧＦ−２Ａとを分離してアガロースゲル上でその分子量を確認した結果を示す図である。
【図３】図３は正常人と脱毛症患者の頭皮から分離した毛嚢における本発明のＫＧＦ−２ＡとＫＧＦ−２Ａ受容体の発現様相を比較分析した結果を示す図である。
【図４】図４は序列番号２の塩基序列を含むＫＧＦ−２ＡのＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔベクターに挿入して得た組換えプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−ＫＧＦ−２Ａ（受託番号：ＫＣＴＣ １０１２ＢＰ）の制限酵素地図である。
【図５】図５はＫＧＦ−２Ａの毛嚢細胞増殖活性をＭＴＳ比色分析法で確認した結果を示す図である。
【図６ａ】図６ａは正常人の頭皮毛嚢から真皮乳頭を除去した後ＫＧＦ−２Ａを処理した結果、細胞増殖に及ぼす効果を確認した図である。
【図６ｂ】図６ｂは正常人の頭皮毛嚢から真皮乳頭を除去していない毛嚢にＫＧＦ−２Ａを処理した結果、細胞増殖に及ぼす効果を確認した図である。
【図７ａ】図７ａは脱毛症患者の毛嚢にＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａをそれぞれ処理した後細胞増殖活性を確認した図である。
【図７ｂ】図７ｂは脱毛症患者の毛嚢から真皮乳頭を除去した後、ＫＧＦ−１、ＫＧＦ−２及びＫＧＦ−２Ａをそれぞれ処理してその細胞増殖活性を確認した図である。
Claims (34)
- 第２ケラチノサイト成長因子のアミノ酸序列で８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- 序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含む第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- Ｎ末端にメチオニンをさらに含むことを特徴とする請求項２記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- 序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列を含む第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- Ｎ末端にメチオニンをさらに含むことを特徴とする請求項４記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- ヒトの頭皮毛嚢から分離されたことを特徴とする請求項２又は４記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- 成熟蛋白質であることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の第２ケラチノサイト成長因子類似体。
- 請求項１の第２ケラチノサイト成長因子類似体をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
- 序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
- 序列番号２の４番から６２７番までの塩基序列を含むことを特徴とする請求項９記載の遺伝子。
- 序列番号１の１番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
- 序列番号２の１番から６２７番までの塩基序列を含むことを特徴とする請求項１１記載の遺伝子。
- 序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子。
- 序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含むことを特徴とする請求項１３記載の遺伝子。
- 序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含み、そのＮ−末端にメチオニンが結合したアミノ酸序列をコーディングする第２ケラチノサト成長因子類似体遺伝子。
- 序列番号２の１１８番から６２７番までの塩基序列を含み、その５'−末端の上流に開始コドンをさらに含むことを特徴とする請求項1５記載の遺伝子。
- 前記遺伝子はｃＤＮＡ型であることを特徴とする請求項８ないし１６のいずれか１項に記載の遺伝子。
- 前記遺伝子はｇＤＮＡ型であることを特徴とする請求項８ないし１６のいずれか１項に記載の遺伝子。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子をベクターにクローニングした後、宿主細胞に形質転換させて形質転換体を得、前記形質転換体を培養することを特徴とする第２ケラチノサイト成長因子類似体の製造方法。
- 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は、第２ケラチノサイト成長因子のアミノ酸序列で８７番アミノ酸がリジンからグルタミン酸に置換された第２ケラチノサイト成長因子類似体をコーディングすることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
- 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングすることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーティングすることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
- 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は、序列番号２の第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子の全部又は一部を含み、付加的なＤＮＡ序列をさらに含んでいる融合遺伝子の形態であることを特徴とする請求項１９記載の製造方法。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体又は第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子を有効成分とする脱毛症予防及び治療又は毛髪成長及び毛嚢再活促進用薬学的組成物。
- 第２ケラチノサト成長因子類似体は序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことを特徴とする２４記載の薬学的組成物。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体は序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列を含むことを特徴とする請求項２４記載の薬学的組成物。
- 前記第２ケラチノサイト成長因子類似体のアミノ酸序列それぞれのＮ−末端にメチオニンをさらに含むことを特徴とする請求項２５又は２６記載の薬学的組成物。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体は成熟蛋白質形態であることを特徴とする請求項２４記載の薬学的組成物。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の２番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングすることを特徴とする請求項２４記載の薬学的組成物。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号１の４０番から２０８番までのアミノ酸序列をコーディングすることを特徴とする請求項２４記載の薬学的組成物。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子は序列番号２の第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子の全部又は一部を含み、付加的なＤＮＡ序列をさらに含んでいる融合遺伝子の形態であることを特徴とする請求項２４記載の薬学的組成物。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体又は第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子を用いた脱毛症予防又は治療方法。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体又は第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子を有効成分とする薬学的組成物を患者の頭皮に経皮的に投与する段階を含むことを特徴とする請求項３２記載の方法。
- 第２ケラチノサイト成長因子類似体又は第２ケラチノサイト成長因子類似体遺伝子を用いた毛髪成長又は毛嚢再活促進方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20010028621 | 2001-05-24 | ||
| PCT/KR2001/001569 WO2002094871A1 (en) | 2001-05-24 | 2001-09-19 | Novel keratinocyte growth factor-2 analogue in hair follicle |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005504515A true JP2005504515A (ja) | 2005-02-17 |
| JP3966819B2 JP3966819B2 (ja) | 2007-08-29 |
Family
ID=19709884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002592345A Expired - Fee Related JP3966819B2 (ja) | 2001-05-24 | 2001-09-19 | 毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7094569B2 (ja) |
| EP (1) | EP1404713A4 (ja) |
| JP (1) | JP3966819B2 (ja) |
| KR (1) | KR20030022094A (ja) |
| WO (2) | WO2002094871A1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030022094A (ko) * | 2001-05-24 | 2003-03-15 | (주)휴먼디엔에이테크놀로지 | 모낭에 존재하는 새로운 제 2 케라티노사이트 성장인자유사체 |
| DE102005011957A1 (de) * | 2005-03-14 | 2006-12-07 | Henkel Kgaa | Neues Haarbehandlungsmittel, enthaltend L-Carnitin oder L-Carnitinderivate |
| US7477782B2 (en) * | 2006-08-25 | 2009-01-13 | Restoration Robotics, Inc. | System and method for classifying follicular units |
| US20080049993A1 (en) | 2006-08-25 | 2008-02-28 | Restoration Robotics, Inc. | System and method for counting follicular units |
| US7922688B2 (en) * | 2007-01-08 | 2011-04-12 | Restoration Robotics, Inc. | Automated delivery of a therapeutic or cosmetic substance to cutaneous, subcutaneous and intramuscular tissue regions |
| US8580236B2 (en) * | 2007-03-19 | 2013-11-12 | Richard P. De Maria | Hair sustaining formulation |
| BRPI0817233A2 (pt) | 2007-09-28 | 2012-11-06 | Intrexon Corp | construções terapêuticas de gene de trca e bireatores para a expressão de moléculas bioterapêuticas, e usos das mesmas |
| FR2932086A1 (fr) * | 2008-06-06 | 2009-12-11 | Lvmh Rech | Methode de soin cosmetique anti-age par stimulation de l'expression de la survivine |
| US8445445B2 (en) | 2009-09-15 | 2013-05-21 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Method of promoting hair growth using FGFR4 extracellular domains |
| IT1396020B1 (it) * | 2009-10-16 | 2012-11-09 | Fitologica Srl | Composizione topica a base di biopeptidi, e suo utilizzo in campo tricologico. |
| EP2512501A4 (en) | 2009-12-17 | 2014-01-01 | Five Prime Therapeutics Inc | METHODS FOR PROMOTING HAIR GROWTH USING FGFR3 EXTRACELLULAR DOMAINS |
| GB2481712B (en) * | 2010-06-30 | 2013-01-30 | Pangaea Lab Ltd | Composition comprising vascular endothelial growth factor (VEGF) for the treatment of hair loss |
| US8481038B2 (en) | 2010-11-15 | 2013-07-09 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Treatment of cancer with elevated dosages of soluble FGFR1 fusion proteins |
| FR2968560A1 (fr) * | 2010-12-13 | 2012-06-15 | Oreal | Utilisation de l'ide comme biomarqueur d'un etat du cuir chevelu |
| US9173921B1 (en) | 2015-03-23 | 2015-11-03 | Jaehyun Lim | Method of promoting hair growth by administration of bFGF |
| US10080714B2 (en) * | 2015-11-19 | 2018-09-25 | Avon Products, Inc. | Peptides and their use in the treatment of hair |
Family Cites Families (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
| AU600885B2 (en) | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
| DE3681787D1 (de) | 1985-07-05 | 1991-11-07 | Whitehead Biomedical Inst | Expression von fremdem genetischem material in epithelzellen. |
| US4980286A (en) | 1985-07-05 | 1990-12-25 | Whitehead Institute For Biomedical Research | In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells |
| AU607690B2 (en) | 1985-12-24 | 1991-03-14 | Marion Laboratories, Inc. | Use of synthetic sulfated saccharides to enhance wound healing |
| US4935349A (en) | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
| US4888116A (en) * | 1987-01-15 | 1989-12-19 | The Dow Chemical Company | Method of improving membrane properties via reaction of diazonium compounds or precursors |
| EP0633318A1 (en) | 1987-09-11 | 1995-01-11 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Transduced fibroblasts and uses therefor |
| US6140111A (en) | 1987-12-11 | 2000-10-31 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Retroviral gene therapy vectors and therapeutic methods based thereon |
| EP0391960B1 (en) | 1987-12-11 | 1994-08-17 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Genetic modification of endothelial cells |
| US6018026A (en) | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
| EP0732397A3 (en) | 1988-02-05 | 1996-10-23 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Modified hepatocytes and uses therefor |
| US5206152A (en) | 1988-04-08 | 1993-04-27 | Arch Development Corporation | Cloning and expression of early growth regulatory protein genes |
| US5422120A (en) | 1988-05-30 | 1995-06-06 | Depotech Corporation | Heterovesicular liposomes |
| JPH04507041A (ja) | 1988-12-13 | 1992-12-10 | アメリカ合衆国 | 遺伝工学により修飾された内皮細胞およびその利用方法 |
| GB8901778D0 (en) | 1989-01-27 | 1989-03-15 | Univ Court Of The University O | Manipulatory technique |
| EP1026253B2 (en) | 1989-03-21 | 2012-12-19 | Vical Incorporated | Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate |
| US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
| ZA911974B (en) | 1990-03-21 | 1994-08-22 | Res Dev Foundation | Heterovesicular liposomes |
| US5149655A (en) | 1990-06-21 | 1992-09-22 | Agracetus, Inc. | Apparatus for genetic transformation |
| CA2098849C (en) | 1990-12-20 | 2007-07-10 | Ralph R. Weichselbaum | Control of gene expression by ionizing radiation |
| US5184605A (en) | 1991-01-31 | 1993-02-09 | Excel Tech Ltd. | Therapeutic ultrasound generator with radiation dose control |
| US6063630A (en) | 1991-11-05 | 2000-05-16 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy |
| US5547871A (en) | 1993-01-25 | 1996-08-20 | American Cyanamid Company | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling proteins |
| WO1994017810A1 (en) | 1993-02-12 | 1994-08-18 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| US5814605A (en) | 1993-03-26 | 1998-09-29 | Amgen Inc. | Therapeutic uses of keratinocyte growth factor |
| WO1994023744A1 (en) | 1993-04-16 | 1994-10-27 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Recombinant cytomegalovirus vaccine |
| DK0695169T3 (da) | 1993-04-22 | 2003-03-17 | Skyepharma Inc | Multivesikulære liposomer med indkapslet cyclodextrin og farmakologisk aktive forbindelser samt fremgangsmåder til anvendelse af disse |
| US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| RO116341B1 (ro) | 1993-11-16 | 2001-01-30 | Depotech Corp La Jolia | Lipozom multivezicular si procedeu de obtinere a acestuia |
| US6077692A (en) * | 1995-02-14 | 2000-06-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 |
| US6251433B1 (en) | 1996-08-13 | 2001-06-26 | Chiron Corporation | Polycationic polymers |
| US6225290B1 (en) | 1996-09-19 | 2001-05-01 | The Regents Of The University Of California | Systemic gene therapy by intestinal cell transformation |
| US6271436B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-08-07 | The Texas A & M University System | Cells and methods for the generation of transgenic pigs |
| JP2001506975A (ja) * | 1996-10-15 | 2001-05-29 | アムジェン インコーポレイテッド | ケラチノサイト増殖因子―２産物 |
| JPH10279501A (ja) * | 1997-02-10 | 1998-10-20 | Rohto Pharmaceut Co Ltd | 育毛剤 |
| US6080912A (en) | 1997-03-20 | 2000-06-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for creating transgenic animals |
| US6238888B1 (en) * | 1997-12-22 | 2001-05-29 | Human Genone Sciences, Inc. | Keratinocyte growth factor-2 formulations |
| US6281408B1 (en) | 1998-02-20 | 2001-08-28 | Thomas Jefferson University | Efficient method for production of compound transgenic animals |
| US6468988B1 (en) * | 1999-03-01 | 2002-10-22 | Morris A. Mann | Composition that regulates and diminishes appetite and methods relating thereto |
| CA2367160A1 (en) * | 1999-03-18 | 2000-09-21 | Charles N. Serhan | Leukotriene b4 receptor transgenic mammals |
| WO2002050256A2 (en) * | 2000-12-18 | 2002-06-27 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 53010, a human carboxylesterase family member and uses thereof |
| KR20030022094A (ko) | 2001-05-24 | 2003-03-15 | (주)휴먼디엔에이테크놀로지 | 모낭에 존재하는 새로운 제 2 케라티노사이트 성장인자유사체 |
-
2001
- 2001-09-19 KR KR1020027001104A patent/KR20030022094A/ko not_active Application Discontinuation
- 2001-09-19 EP EP01972731A patent/EP1404713A4/en not_active Withdrawn
- 2001-09-19 WO PCT/KR2001/001569 patent/WO2002094871A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-09-19 JP JP2002592345A patent/JP3966819B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-22 WO PCT/KR2001/001787 patent/WO2002094872A1/en active Application Filing
-
2002
- 2002-05-24 US US10/155,292 patent/US7094569B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-06-29 US US11/479,419 patent/US7335641B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-20 US US11/490,945 patent/US20060251604A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002094871A1 (en) | 2002-11-28 |
| US7094569B2 (en) | 2006-08-22 |
| US7335641B2 (en) | 2008-02-26 |
| EP1404713A4 (en) | 2004-09-22 |
| US20060246024A1 (en) | 2006-11-02 |
| US20060251604A1 (en) | 2006-11-09 |
| US20030036174A1 (en) | 2003-02-20 |
| WO2002094872A1 (en) | 2002-11-28 |
| JP3966819B2 (ja) | 2007-08-29 |
| KR20030022094A (ko) | 2003-03-15 |
| EP1404713A1 (en) | 2004-04-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3966819B2 (ja) | 毛嚢に存在する新規の第２ケラチノサイト成長因子類似体 | |
| Eming et al. | Genetically modified human epidermis overexpressing PDGF-A directs the development of a cellular and vascular connective tissue stroma when transplanted to athymic mice–implications for the use of genetically modified keratinocytes to modulate dermal regeneration | |
| CN114106139B (zh) | 用于诱导组织再生的肽及其应用 | |
| EP0492614B1 (en) | Epitheliocyte growth accelerator | |
| JP5700343B2 (ja) | 発毛促進剤 | |
| CZ285996B6 (cs) | Způsob in vitro stimulace produkce nekeratinocytových epithelových buněk a růstový faktor keratinocytů pro léčbu chorob | |
| JP2001513334A (ja) | ヘパリン結合増殖因子（ｈｂｇｆ）ポリペプチド | |
| JP2002543824A (ja) | 皮膚細胞から単離された組成物およびその利用法 | |
| JP5510794B2 (ja) | 毛髪成長阻害剤 | |
| JPH10279501A (ja) | 育毛剤 | |
| KR102581376B1 (ko) | 콜라겐 합성 촉진 활성을 갖는 콜라겐 타입 3 저분자 펩타이드 및 이를 이용한 방법 | |
| WO1996016987A1 (fr) | Facteur thrombocytotique | |
| US5821223A (en) | Method of stimulating cell growth with a novel broad spectrum human lung fibroblast-derived mitogen | |
| RU2004137000A (ru) | Мутеины плацентарного фактора роста 1 типа, способ их получения и применение | |
| US5719126A (en) | Melanogenic inhibitor, and methods of producing and using the same | |
| EP0686194B1 (fr) | Facteurs de croissance de la famille de l'harp, procede d'obtention et applications | |
| AU3167999A (en) | Novel protein and processes for producing the same | |
| JP2001519765A (ja) | 上皮―間充織相互作用の調節 | |
| EP1603586A1 (en) | 14-3-3 protein for prevention and treatment of fibroproliferative disorders | |
| TW459044B (en) | Protein MP-121 of the TGF-β-like family | |
| RU2152791C1 (ru) | Новый белок эндотелиальных клеток головного мозга и композиция | |
| JP2004123679A (ja) | 好酸球カチオン性タンパク質を含有する組成物 | |
| JP2002293720A (ja) | 育毛剤 | |
| WO1997026276B1 (en) | Vertebrate fringe proteins | |
| WO1999050290A9 (de) | Parapockenvirus-kodierter vaskulärer endothelzell wachstumsfaktor (ppv-vegf) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060808 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061030 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20061030 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20061101 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070405 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070508 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070529 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110608 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |