KR100418465B1

KR100418465B1 - 인슐린 의존성 당뇨병의 유전자 치료방법 및 그 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100418465B1
Application number: KR10-2001-0002229A
Authority: KR
Inventors: 서동상
Original assignee: 서동상
Priority date: 2001-01-15
Filing date: 2001-01-15
Publication date: 2004-02-14
Also published as: ATE299186T1; DE60111818T2; JP2002218987A; DE60111818D1; EP1223221B1; EP1223221A3; CN1202257C; EP1223221A2; US20030054498A1; US6596515B2; JP3538148B2; KR20020061270A; CN1366062A

Abstract

본 발명은 인슐린 의존성 당뇨병의 유전자 치료방법 및 그 치료용 조성물에 관한 것으로 K14 프로모터와 인간의 인슐린 유전자, K 14 프로모터와 β-갈락토시데이즈(galactosidase) 유전자가 클로닝된 벡터를 제작하고 리포솜 방법과 가압주입법으로 노랑초파리의 P-전이효소(transposase)를 발현하는 헬퍼 벡터와 함께 마우스의 피부조직에 투여한 결과, β-갈락토시데이즈 유전자는 24시간부터 20주까지 발현되고, 전이효소에 의해 마우스 염색체상으로 삽입되며, β-갈락토시데이즈 유전자가 케라틴 세포층(keratinocytes layer)에서 발현된 것으로 보아 프로모터의 인핸싱(enhancing)과 조직 특이성을 확인하였으며, 당뇨마우스 췌장에 인슐린을 생성하는 β세포는 거의 존재하지 않음에도 불구하고, 인슐린 벡터의 발현으로 케라틴 세포(Keratinocytes)에서 생성되는 인슐린이 혈당치를 낮추므로 본 발명 유전자 치료용 인슐린 벡터는 당뇨병을 치료할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

인슐린 의존성 당뇨병의 유전자 치료방법 및 그 치료용 조성물{Gene theraphy and gene therapeutic composition for insulin dependent diabetes mellitus}

본 발명은 인슐린 의존성 당뇨병의 유전자 치료방법 및 그 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 K14 프로모터와 인간의 인슐린 유전자, K 14 프로모터와 β-갈락토시데이즈(galactosidase) 유전자가 클로닝된 벡터를 제작하고 리포솜 방법과 가압주입법으로 노랑초파리의 P-전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터와 함께 마우스의 피부조직에 투여한 결과, 헬퍼 벡터에서 발현된 전이효소에 의해 β-갈락토시데이즈 유전자가 마우스 염색체상에 삽입되며, 24시간부터 20주까지 발현되고, K 14 프로모터에 의해 β-갈락토시데이즈 유전자가 케라틴 세포층(keratinocytes layer)에서 발현되는 조직 특이성을 확인하였으며, 당뇨마우스에서 인슐린 벡터의 발현으로 케라틴 세포(Keratinocytes)에서 생성되는 인슐린이 혈당치를 낮추어 인슐린 의존성 당뇨병의 치료에 효과가 있는 인슐린 발현 벡터와 이를 이용한 유전자 치료법에 관한 것이다.

유전자 치료법은 유전자 전이와 유전자의 발현을 인공적으로 조절하여 환자의 돌연변이된 유전정보를 유전자 재조합에 의해 교정하는 것으로써 신경계교란, 심장혈관 질환, 관절염 또는 암을 포함한 다양한 유형의 병리 치료를 위해 개발되어 왔다. 종래에 유전자 치료에 대한 연구로는 국제 공개번호 제 1997-27310에 레트로 바이러스 벡터 및 유전자 치료에서의 이의 용도가 공지된 바 있고, 국제 공개번호 제 1997-34009에 인간 종양 유전자 치료를 위한 재조합 아데노 바이러스 벡터가 공지된 바 있다. 그러나 상기와 같이 공지된 방법들은 바이러스 벡터를 이용한 것으로써 많은 시간과 고비용을 요하며 안전성 여부와 과정의 복잡성 때문에 유전병의 치료에만 제한적으로 사용되고 있으며 본 발명에서와 같은 비바이러스 인슐린 벡터는 공지된 바 없다.

당뇨병은 인슐린을 생산하는 췌장의 β-세포가 손상되었을 경우 인슐린 부족으로 야기되는 신체 대사장애이다. type Ⅰ으로 불리는 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM)은 매년 3%가 새로 발생하며 아동 7000명 중 한 명이 발병되고 있다. 현재 인슐린 의존성 당뇨병을 치료하기 위해 혈당측정, 인슐린 투여, 식이용법, 운동요법등이 행해지고 있으나 집중적인 치료에도 불구하고 당뇨병의 악화를 감소시킬 수 있는 경우는 50∼70% 정도에 불과하며 더 나은 치료법이 요구되고 있는 실정이다.

한편, 스스로 재생능력이 있는 상피세포와 그 부속물은 간세포(stem cell)의 일부로 구성되어 있으며 인체 표면을 덮고 있고 증식능력이 있다. Green에 의해서 연구된 몇 백 세대에 걸쳐 증식할 수 있는 인간 피부 케라틴 세포(keratinocytes)의 배양기술은 현재 주요 병원에서 화상치료를 위해 케라틴 세포(keratinocytes)를 배양하여 이식하므로써 널리 이용되고 있다. 배양된 케라틴 세포(keratinocytes)로의 유전자 전이는 다양한 외부 프로모터를 이용하여 발현된 다양한 생성물에 의해 입증되었다. 상피세포내의 케라틴 세포(keratinocytes)는 (1) 무제한 성장 능력을 가지거나 증식할 수 있는 간세포 (2) 간세포로부터 발생되고 최종 분화되기 전까지 한정된 수의 사이클을 반복하는 TA세포(translent amplifying cell), 이 두 범주의 복제세포에 의해 재생된다. 간세포(stem cell)는 주기(cycle)가 느리고 뉴클레오타이드 아날로그에 잘 표식되지 않지만, 한번 표식되면 긴 기간동안 유지된다. 간세포와 TA세포(transient amplifiying cell)는 super-basal층을 형성하는 최종분화세포와 상피세포의 기저부위에 위치하고 있다. 간세포와 그 분열된 세포 및 최종분화세포는 별개의 공간배열을 이루고 있으며 '상피증식단위(epidermal proliferation unit)'로 일컬어지고 있다. 케라틴 14(K 14)와 케라틴 5(K 5)는 상피와 그 부속물의 활성세포에 의해 발현되는 주 단백질이다. 이러한 케라틴을 암호화하는 유전자는 배양된 인간 케라틴세포 배양에 있어서 많이 전사된다. 이러한 이유 때문에 K14와 K5의 프로모터의 이용은 케라틴 세포 관련(Keratinocyte-mediated) 유전자 치료에 이상적이라 할 수 있다.

노랑초파리의 전이인자는 1970년대에 교잡 부전(hybrid dysgenesis)현상에 P 전이인자가 관여하는 것이 발견된 이래 많은 연구가 보고되었으며, 1982년에 P 전이인자가 클로닝된 유전자를 초파리의 배(embryo)에 운반할 수 있는 기술이 보고된 바 있다(Rubin, G.M et al. Science. 1982, 218:348-353). 그러나 상기 공지된 방법은 근연종에서조차 활성이 없는 것으로 알려져 왔다. 특히 본 발명에서와 같이 포유류에서의 노랑초파리의 P 전이인자의 적용은 현재까지 보고된 바 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 K14 프로모터와 인간의 인슐린 유전자, K14 프로모터와 β-갈락토시데이즈(galactosidase)유전자를 클로닝하여 본 발명 유전자 재조합 벡터를 제조하고 리포솜 방법과 가압주입법으로 노랑초파리 전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터와 함께 피부조직에 투여한 결과, 인슐린 벡터의 발현으로 피부 케라틴 세포(Keratinocytes)에서 인슐린이 생성되어 혈당치를 낮추므로 본 발명 재조합 유전자 벡터는 인슐린 의존성 당뇨병치료에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인슐린 의존성 당뇨병 유전자 치료에 효과가 있는 비바이러스성 인슐린 발현 재조합 벡터 및 그 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 노랑초파리의 P 전이인자를 포유류의 비바이러스성 벡터로 사용함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 비바이러스성 인슐린 발현 재조합 벡터와 노랑초파리 P 전이효소 발현 재조합 헬퍼 벡터를 리포솜 방법과 가압주입법으로 피부에 투여, 인슐린 유전자가 염색체에 삽입되어 장기간 유지되게 하는 인슐린 의존성 당뇨병의 치료용 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 K14 프로모터와 인간의 인슐린 유전자, K14 프로모터와 β-갈락토시데이즈(galactosidase) 유전자가 클로닝된 벡터를 제조하고 리포솜 방법과 가압주입법으로 노랑초파리 전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터와 함께 피부조직에 투여한 다음 X-gal 염색법으로 β-갈락토시데이즈 유전자의 발현을 확인하고, PCR과 서던 블럿(Southern blot analysis)으로 헬퍼 벡터에서 만들어지는 전이효소(transposase)에 의해 β-갈락토시데이즈 유전자가 마우스의 염색체로 삽입(integration)되며, H/E(Hematoxylin/Eosin)염색법으로 β-갈락토시데이즈 유전자가 케라틴 세포층에서 발현되는 조직특이성(tissue specificity)을 확인하고 면역염색(Immunostaining)에 의해 췌장의 α, β, δ 세포분포를 관찰한 결과 β세포는 거의 존재하지 않음을 관찰하여 케라틴 세포층에서 생성되는 인슐린이 혈당치를 낮추는 것을 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1a은lacZ 유전자와 K14 프로모터(pUC KZ),lacZ 유전자(pUC4.3Z)를 각각 도입시켜 구축한 β-갈락토시데이즈 발현 벡터의 제작 모식도이다.

도 1b는 노랑초파리의 P-전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터(pπ25.7wc??2-3)의 모식도이다.

도 2는 pUCK-Z을 투여한 마우스의 피부조직에 시간 경과에 따른(1일 ∼ 20주)lacZ 발현을 X-gal염색으로 확인한 결과이다.

도 3은 pUCK-Z을 투여한 마우스 피부조직의 시간 경과에 따른 β-갈락토시데이즈 유전자의 발현을 X-gal 염색과 H/E(Hematoxylin/ Eosin)염색한 결과이다.

도 4는 전이효소(transposase)에 의한 염색체상의 β-갈락토시데이즈 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 PCR한 결과이다.

도 5는 전이효소(transposase)에 의한 염색체상의 β-갈락토시데이즈 유전자의 삽입여부를 확인하기 위해 서던 블럿(southern blot analysis)한 결과이다.

도 6은 본 발명 인슐린 벡터(pUCK14-INS)의 제작 모식도이다.

도 7은 본 발명 인슐린 벡터의 K14 프로모터와 인슐린유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 8a는 스트렙토조토신 (STZ)을 65㎎/㎏의 농도로 처리하여 당뇨마우스를 만든 다음 pUCK14-INS을 처리하여 혈당 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8b는 스트렙토조토신(STZ)을 200㎎/㎏의 농도로 처리하여 당뇨마우스를 만든 다음 pUCK14-INS을 처리하여 혈당의 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 췌장의 형태와 랑게르한스 섬의 분포를 나타낸 사진이다.

도 10은 정상마우스, 당뇨마우스 및 인슐린발현 벡터를 처리한 당뇨마우스의 랑게르한스 섬을 면역염색(immunostaining)한 결과이다.

본 발명은 K14 프로모터가 있는 β-갈락토시데이즈 발현 벡터(pUC KZ)와 K14 프로모터가 없는 β-갈락토시데이즈 발현 벡터(pUC-4.3Z)을 구축하는 단계; 상기벡터에 리포솜을 혼합하고 노랑초파리의 P-전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터를 첨가하여 DNA/리포솜 혼합체를 제조하는 단계; 상기 DNA/ 리포솜 혼합체를 마우스 피부에 가압주입법으로 투여하고 시간경과에 따라 피부조직을 획득하는 단계; 상기 피부조직을 X-gal 염색하여 β-갈락토시데이즈의 발현을 확인하는 단계; 상기 피부조직을 H/E(Hematoxylin/Eosin) 염색하여 상기 인슐린 유전자가 케라틴 세포층에서 발현됨을 확인하는 단계; 상기 피부조직에서 게놈 DNA를 추출하는 단계; 마우스 염색체상에 삽입여부를 알기 위해lacZ 프라이머를 이용하여 PCR 하는 단계; 마우스 염색체상에 삽입여부를 알기 위해 서던 블럿(sourthern blot analysis)하는 단계; 상기 실험결과, 벡터의 조직특이성과 염색체상으로의 전이를 확인하고, 이 결과를 바탕으로 해서 기존에 알려진 인간 preproinsulin 유전자와 K 14 프로모터 부분의 염기서열로부터 프라이머를 제작하고, 이 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고 pUChsneo와 pGEM T-easy 벡터에 각각 클로닝한 다음 pUChsneo에 삽입하여 인슐린 발현 벡터를 제작하는 단계; 상기 제작된 인슐린 발현 벡터를 시퀀싱 하는 단계; 마우스에 60㎎/㎏, 200㎎/㎏의 농도가 되게 스트렙토조토신(STZ)를 투여하여 마우스에서 당뇨를 유발하는 단계; 당뇨가 유발된 마우스에 본 발명 인슐린 발현 벡터를 1㎍, 50㎍, 100㎍ 주입하고 혈당 측정하는 단계; H/E염색을 통하여 인슐린 발현벡터가 투여된 마우스의 췌장 형태와 랑게르한스 섬의 분포를 관찰하는 단계; 랑게르한스 섬을 면역염색(immuno staining)하여 α, β, δ세포의 분포를 측정하는 단계로 구성된다.

본 발명의 가압주입법에 사용된 Needless jet injector는 MADA MEDICALPRODUCTS, INC(USA, NJ)에서 구입하였다.

본 발명에 이용된 혈당측정기(Super Glucocard Ⅱ kit)와 스트립(Glucocard test strip Ⅱ)은 Arkray KDK Corp (Kyoto, Japan)에서 구입하였다.

GENEPORTER^TMtransfection reagent는 GTS INC(San diego CA,USA)로부터 구입하였고, STZ(스트렙토조토신)은 시그마사로부터 구입하였다.

본 발명의 실험동물인 마우스는 12 ∼ 14주 된 무게 26g 정도인 것을 대한 바이오 링크(주)에서 구입하였다.

본 발명 인슐린 발현 벡터 또는 그 치료용 조성물은 상기 공지한 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 획득할 수 있다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.

실험예1: 마우스 피부에서β-갈락토시데이즈 유전자의 발현

제 1단계: β-갈락토시데이즈 발현 벡터 제작

K14 프로모터 유무에 따른 효과(activieity)를 확인하기 위해 도 1a에 나타낸 바와 같이 pUCheo의EcoR I 사이트에 K14 프로모터를 클로닝한 다음 cpwβ-22의 4.3kblacZ 유전자를BamHI과SalI 사이트에 클로닝하여 pUC KZ을 제작하였고, K 14 프로모터 없이lacZ 유전자만 삽입하여 pUC 4.3Z을 제작하였다. 상기 두종류의 벡터를 대장균에 형질전환한 다음 페놀/ 클로로포름/이소아미알콜로 플라스미드를추출하여 제한효소 지도로 클로닝을 확인하였다.

제 2단계: 헬퍼 벡터 제조

pUCHshneo 스스로 염색체 상에 전이될 수 없으므로 도 1b에 나타낸 바와 같은 노랑 초파리의 전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터를 구축하였다. 헬퍼 벡터(pπ25.7wc△2-3) ORF 2와 ORF 3사이의 인트론을 조절하여 전이효소를 생산할 수 있게 제작하였다.

제 3단계: DNA/리보솜 복합체 제조

상기 제 1단계에서 제조한 β-갈락토시데이즈 발현 벡터를 QIAGEN plasmid maxi kit로 정제하였고 Gene PORTER^TM유전자 전이시약은 0.75mL의 수화용액(hydration buffer)에서 수화시켰다. 2 ㎍, 5㎍, 10㎍, 50㎍ 100㎍의 정제한 플라스미드 DNA와 5uL, 10 uL, 20uL의 리포솜을 각각 혼합하여 복합체(complex)를 만들고, 노랑초파리의 P-전이효소(transposase)를 발현하는 헬퍼 벡터(pπ25.7wc2-3)를 상기 정제한 플라스미드 DNA의 40%(w/v)가 되게 첨가한 다음 동량의 GenePOPTER^TM전이(trnasfection)시약을 넣고 PBS 용액을 섞어주어 30분간 실온에서 방치한다.

제 4단계: 마우스에 DNA 투여

10 ∼ 12주된 평균무게 26g 정도의 마우스에 상기 제 3단계에서 제조된 DNA/리포솜 복합체를 Needless jet injector(Madajet XL)에 충진시켜 가압주입법으로 마우스의 뒷다리에 주입하고, 주입 후 1일∼20주동안 기간별로 경추탈골(cervical dislocation)하여 시료를 준비하고 투여부위 피부의 털을 깎아낸 후 멸균된 가위로 피부조직을 잘라내었다.

제 5단계 : X-gal 염색

상기 제 4단계에서 자른 피부조직을 PBS 버퍼에 씻은 후 고정액(2% Paraformaldehyde, 0.2% glutaraldehyde in 0.1M sodium phosphate buffer, pH 7.3)에서 4℃, 30분간 고정하였다. X-gal용액(1.3mM MgCl_2,3 mM K₄Fe(CN)_6,1 ㎎/mL X-gal, 0.1M sodium phosphate buffer, Ph 7.3)은 사용하기 바로 직전에 제조하여 37℃에서 3시간 동안 침지하였다. 피부조직에서의lacZ 발현을 비교하기 위해서 대조군으로 마우스에 리포솜만 주입하고 상기와 같은 방법으로 염색한 후 현미경으로 관찰비교하였다.

현미경 관찰결과, 프로모터가 없는 플라스미드 벡터(pUC 4.3Z)를 투여하였을 경우 5일까지만 낮은 농도로 발현되며 X-gal 염색하였을 때 옅은 파란색을 나타내었다. 반면, K 14 프로모토를 포함하고 있는 pUCK-Z 벡터를 투여하였을 경우 도 2에 나타난 것과 같이 β-갈락토시데이즈 유전자가 5∼6주까지 강하게 발현되어 X-gal 염색시 진한 파란색을 나타내었고 20주까지 지속되었다. 또한 K 14 프로모터의 증강작용(enhancement)에 의한 조직 특이성이 나타났다.

제 6단계 : H/E(Hematoxylin/Eosin)염색

상기 실시예 5에서 파란색을 나타낸 피부조직을 PBS에서 두번 씻은 후 H/E(Hematoxylin/ Eosin)염색을 위해 포르말린에서 고정하였다. 16시간∼3일간 고정하고 일반적 H/E 염색 방법으로 수행하였으며 섹션은 10 um이하 두께로 시행하였다.

실험결과, 도 3에 나타난 것과 같이, pUCK-Z 벡터를 투여한 경우, 케라틴 세포층에서 β-갈락토시데이즈 유전자가 발현되어 조직 특이성을 나타내었고, 4일부터 5∼6주까지 강하게 지속되었다.

제 7단계 : 마우스 게놈 DNA 추출

마우스 피부를 자른 후 tail tip 버퍼 (60mM Tris pH 8.0, 100mM EDTA, 0.5% SDS)에서 잘게 썰어 혼합한 후 600uL의 tail tip 버퍼를 첨가한 다음 RNase A (20 ㎎/mL)를 처리하고 37℃에서 30분간 방치하였다. 프로티나제 K는 500㎍/㎖이 되게 넣어 준 후 50∼55℃에서 반응시켰다. 20℃, 12000rpm에서 30분간 원심분리한 후 중간층을 제거하고 다시 재원심분리하였다. 상층은 3번의 페놀/클로로포름과 1번의 클로로포름으로 처리하였고 20℃ 10,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 1/10의 3M NaOAc를 넣고 에탄올 침전한 후 건조시켜 pellet을 TE 버퍼에 녹이고1/5000로 희석하여 260nm에서 O·D값을 측정하였다.

제 8단계: 염색체상의 β-갈락토시데이즈 삽입을 확인을 위한 PCR 스크리닝

lacZ 유전자의 마우스 염색체상의 삽입을 확인하기 위해, 투여한지 5일에서 4주된 마우스의 투여부위(반경 2㎝)피부 조직에서 상기 제 7단계의 방법으로 게놈 DNA를 추출하여 PCR 하였다.lacZ의 확인은 하기와 같은 프라이머를 사용하였으며, PCR 산물은 약 3110bp로 추정되었다. PCR 반응은 표 1에 나타낸 바와 같은 조건으로 실시하였다.

lacZ forward - 5' TCACTCTAGAAACAGCTCTGA 3'

lacZ reverse - 5' TCGACCCGGTTATTATTA 3'

lacZ 유전자의 PCR 반응농도 및 조건

반 응 농 도
프라이머	10 pmol(lac5', lac3')
PCR 산물의 예상 사이즈	3110 bp
반응부피	20 uL
Ex Taq	0.5 unit
10× Ex Taq 버퍼	2 uL
주형 DNA 농도	50 pmol
dNTPs	200 umol
PCR 반응조건
	1 사이클(cycle)	35 사이클(cycle)	1 사이클(cycle)
변성(denaturation)어닐링(annealing)신장(extension)	90°(180초)52°(60초)72°(60초)	94°(30초)52°(60초)72°(60초)	94°(60초)52°(60초)72°(60초)

실험결과, 도 4에 나타난 것과 같이 5개의 시료( 5일∼ 4주)에서 3100 bp의 PCR 산물이 증폭되어 β-갈락토시데이즈 유전자가 마우스 염색체상으로 삽입되었음을 확인할 수 있었다.

제 9단계: 염색체상의 β-갈락토시데이즈 삽입 확인을 위한 서던 블럿 ( Southern blotting )

β-갈락토시데이즈 발현 벡터가 투여된 마우스와 negative control로써 투여되지 않은 마우스, positive control로써 pUCK-Z DNA를 사용하여 서던 블럿을 실시하였다. 0.8% 아가로즈 겔, 1×TAE에서 전기영동하고 Hybond N+ 멤브레인에 트랜스퍼(transfer)한 후 80℃에서 2시간 건조시킨 다음 혼성화(hybridization) 버퍼 (5×SSC, 1/20 희석된 liquid Block, 0.1% SDS, 5% Dextran sulphate)를 사용하여 [α-³²P]dCTP로 라벨된 프로브를 이용하여 혼성화(hybridization)하였다. 혼성화한 후 2×SSC, 0.1% SDS로 42℃에서 10분 동안 씻어준 다음 다시 1×SSC, 0.1% SDS로 42℃에서 10분 씻어주고 마지막으로 1×SSC, 0.1% SDS로 65℃에서 10분간 2번 씻어주었다.

실험결과, 도 5에 나타난 것과 같이 투여 5일에서 1주일까지는 밴드가 불명확하지만 나머지는 밴드가 명확히 나타나 헬퍼 벡터에서 발현된 전이효소에 의한 β-갈락토시데이즈 유전자가 마우스 염색체상에 삽입됨을 확인할 수 있었다.

실시예 1: 본 발명 인슐린 발현 벡터의 제조

기존에 알려진 인간 preproinsulin 유전자와 K 14 프로모터 부분의 염기서열로부터 표 2에 나타낸 것과 같은 PCR 프라이머를 제작하고, 이 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 하여 pUChsneo와 pGEM T-easy 벡터에 각각 클로닝한 다음 도 6의 벡터 모식도에 나타낸 것과 같이SalI 사이트로 pUChsneo에 삽입하여 인슐린 발현 벡터를 제작하고, pUCK14-INS 명명하였다.

인슐린 발현벡터를 제작하기 위한 K14 프로모터와 인슐린 유전자 프라이머.

프라이머	염기서열( sequence )
인슐린 forward인슐린 reverse	5'CCTGCCTGTCTCCCAGAGCTCTGTCCTTCT 3'5'GCAGGGCTGGTTCTAGAGCTTTATTCCATC 3'
K 14 프로모터 forwardk 14프로모토 reverse	5'ATTGCTGAAGTTTTGATCTAGACACCTCCA 3'5'CTGAGTGAAGAGAAGGAGCTCGGGTAAATT 3'

상기 본 발명 인슐린 발현 재조합 벡터 pUCK14-INS는 2001년 1월 10일자로 생명공학연구소 유전자은행에 수탁번호 KCTC 0928BP로 기탁하였다.

실시예 2: 인슐린벡터의 염기서열 분석

상기 실시예 1에서 제작된 인슐린 벡터를 QUAGEN Plasmid mini로 정제하고 ABI Prism 377 XL로 Sequence 분석하였다. 분석결과를 도 7에 나타내었다.

K 14 프로모터는SacI 사이트로 연결되어 있고 프로인슐린(proinsulin) 펩타이드B, 프로인슐린 펩타이드 C, 프로인슐린 펩타이드 A와 C-체인의 인트론 790bp로 구성되어있다.

실시예 3: 마우스의 당뇨 유도와 본 발명 인슐린 발현벡터를 투여했을 경우 혈당의 변화

스트렙토조토신(STZ)을 차가운 0.1M 시트레이트 용액(ph4.5)에 용해시킨 후 마우스에 65㎎/㎏과 200㎎/㎏의 농도로 투여하여 당뇨를 유발하였다. STZ 처리후 DNA 주입은 4일 간격으로 반복 투여하였으며 혈당측정을 통해 변화를 분석하였다.

혈액시료는 쥐의 꼬리로부터 혈액 한 방울을 Glucocard test strip에 떨어뜨리고 혈당측정기(Super Glucocard^TMⅡ)에 넣어 측정하였다.

대조구로써 일반 마우스의 혈당은 매 2시간마다 측정한 결과 하루동안 혈당은 65㎎/dL에서 145㎎/dL 범위내로 나타났고, 평균혈당은 105㎎/dL로 결정되었다.

마우스에서 당뇨를 유발하기 위하여 65㎎/㎏, 200㎎/㎏이 되게 스트렙토조토신(STZ)을 10회에 걸쳐 투여하였고, 매회 혈당을 측정하여 표 3에 나타내었다. 상기와 같이 스트렙토조토신(STZ) 처리 4 일후에 인슐린 벡터를 1㎍, 2㎍, 3㎍과 10㎍, 50㎍, 100㎍으로 투여하였고, 한 그룹당 4개체씩 투여하여 혈당을 측정하였다.

인슐린 벡터를 투여한 결과 표 4, 5와 도8a, 8b에 나타난 것과 같이, dose-dependent하게 혈당치가 감소하는 것을 관찰하였고 65㎎/㎏의 STZ와 인슐린 벡터를반복적으로 투여하면서 횟수에 따라 반응하는 혈당상승 효과는 감소했고 인슐린 벡터의 혈당강하 효과는 지속적으로 나타났다. 그리고 또한 200㎎/㎏의 농도로 STZ을 높여서 투여한 마우스 집단에서는 상대적으로 짧은 시간 안에 혈당값이 급격히 상승되어 당뇨병이 유도되었고 인슐린 벡터 역시 dose-dependent하게 혈당 강하 효과를 보였다.

스트렙토조토신에 의해 유발된 당뇨마우스의 혈당값

투여량(㎎/㎏)	투여횟수	혈당값(㎎/dl)
65	0	105
65	1,2	119,128
65	3.4.5	130,238,280
65	6	320
65	10	600이상
200	0	105
200	1,2	339,448
200	3.4.5	574, 600,600이상
200	6	600이상
200	10	600이상

STZ 65㎎/㎏농도로 처리되어 유도된 당뇨마우스에 인슐린 벡터 투여한 경우 혈당변화

처리전 혈당값(㎎/dl)	처리 후 혈당값 (㎎/dl)
	인슐린 벡터1㎍	인슐린 벡터2㎍	인슐린 벡터3㎍
150	116	147	121
200	148	99	114
300	105	121	263
400	196	204	215
500	207	245	234
600	328	342	344

STZ 200㎎/㎏농도로 처리되어 유도된 당뇨마우스에 인슐린 벡터를 투여한 경우 혈당변화

처리전 혈당값(㎎/dl)	처리 후 혈당값 (㎎/dl)
	인슐린 벡터10㎍	인슐린 벡터50㎍	인슐린 벡터100㎍
150	76	62	61
200	138	99	68
300	58	182	108
400	293	*	*
500	300	*	*
600	375	*	*
* 는 인슐린 발현벡터를 50㎍/uL, 100㎍/uL로 투여하였을 때 모든 그룹에서 혈당치는 320㎎/dl이상 나타나지 않았고 85∼120㎎/dl 사이를 유지하였다.

실시예 5: 랑게르한스 섬의 면역 조직 화학분석(Immunohistochemistry)

정상 마우스, 65㎎/㎏, 200㎎/㎏ STZ 에 의해 유발된 당뇨마우스, 1㎍, 50㎍, 100㎍의 인슐린 벡터가 투여된 마우스의 췌장을 분리하여 10% 포르말린 고정용액에 고정시켰다. 랑게르한스 섬과 인슐린을 생성하는 β세포의 존재를 분석하기 위해 anti-insulin Ab, anti-glucagon Ab, anti-somatostatin Ab를 이용하여 면역염색(immunostaining)과 H/E (Hematoxylin/Eosin)염색을 하였다.

실험결과, 도 9에 나타난 것과 같이 혈당치가 벡터 투여 후 정상적으로 회복된 마우스 선별하여 췌장의 인슐린을 생성하는 β세포를 관찰한 결과 랑게르한스 섬의 수가 현저히 줄어들었거나 거의 존재하지 않았고 외부로부터 함몰되어 흐트러진 모양을 갖고 있었다. 남아있는 랑게르한스 섬의 α, β, δ세포 중 남아있는 세포가 어떤 것인지를 보기 위해 anti-insulin Ab, anti-glucagon Ab, anti-somatostatin Ab를 이용해 면역분석(immunoassay)을 시행한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 거의 β세포는 존재하지 않았고 그 자리가 대부분 α세포로 채워져 있었으며 δ세포가 가장자리로 분포하고 있었다. 이로써 STZ로 유도되어 높아졌던 혈당치가 정상으로 되돌아 온 마우스에서 췌장의 인슐린 세포를 대신해 투여된 인슐린 벡터의 발현으로 케라틴 세포에서 생성되는 인슐린이 혈당치를 낮춘다는 결론을 얻었다.

이상, 상기 실험예와 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, K14 프로모터와 인간의 인슐린 유전자를 클로닝한 본 발명 재조합 인슐린 벡터를 노랑 초파리 P-전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터와 함께 리포솜 방법과 가압주입법으로 피부조직에 투여한 결과, 인슐린 벡터의 발현으로 케라틴 세포(Keratinocytes)에서 생성되는 인슐린이 혈당치를 낮추어 인슐린 의존성 당뇨병을 치료할 수 있는 재조합 벡터 및 그를 이용한 치료방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

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하기와 같은 염기서열을 갖는 인슐린 유전자 프라이머(Ⅰ)와 K 14 프로모터 프라이머(Ⅱ)로 PCR 한 다음 증폭된 인슐린 유전자와 K 14 프로모터를 pUChsneo에 삽입하여 구축된 서열목록 1의 염기서열을 갖는 비바이러스성 인슐린 발현 벡터 pUCK14-INS(수탁번호 KCTC 0928BP)에 리포솜을 넣어 혼합체를 만든 후 노랑 초파리의 전이효소를 발현하는 헬퍼 벡터를 첨가하여 이를 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 인슐린 의존성 당뇨병 치료용 조성물.

인슐린 forward :인슐린 reverse : 5'CCTGCCTGTCTCCCAGAGCTCTGTCCTTCT 3'5'GCAGGGCTGGTTCTAGAGCTTTATTCCATC 3' ----(I) K 14 프로모터 forward :k 14 프로모토 reverse : 5'ATTGCTGAAGTTTTGATCTAGACACCTCCA 3'5'CTGAGTGAAGAGAAGGAGCTCGGGTAAATT 3' ----(Ⅱ)
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제 4항 기재의 인슐린 의존성 당뇨병 치료용 조성물을 피부조직에 가압주입법으로 투여함을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 인슐린 의존성 당뇨병의 치료방법.
제 6항에 있어서, 상기 당뇨병의 치료방법은 인슐린 유전자를 K14 프로모터를 이용해 간세포인 케라틴 세포(Keratinocyte)에서 특이적으로 발현시키는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유류의 인슐린 의존성 당뇨병의 치료방법.