WO2008119850A1 - Formulación tópica para el tratamiento de la hipertensión ocular y el glaucoma - Google Patents

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WO2008119850A1
WO2008119850A1 PCT/ES2008/000176 ES2008000176W WO2008119850A1 WO 2008119850 A1 WO2008119850 A1 WO 2008119850A1 ES 2008000176 W ES2008000176 W ES 2008000176W WO 2008119850 A1 WO2008119850 A1 WO 2008119850A1
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ptd4
compound
amino acid
acid sequence
formulation
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PCT/ES2008/000176
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Inventor
Miguel MORALES FUCIÑOS
Xavier Gasull Casanova
Jesús PINTOR JUST
Azucena GÓMEZ-CABRERO SEGURA
Emilio Enrique Syriani Casagrande
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Universidad De Barcelona
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics

Definitions

  • Topical formulation for the treatment of ocular hypertension and glaucoma Topical formulation for the treatment of ocular hypertension and glaucoma.
  • the present invention relates to the field of medicine, and specifically to the field of ophthalmology.
  • the invention relates to topical formulations for the treatment of glaucoma and ocular hypertension.
  • Glaucoma is characterized by producing a lesion in the head of the optic nerve accompanied by a decrease in the normal visual field.
  • An elevated intraocular pressure (hereinafter IOP) constitutes a risk factor for the loss of glaucomatous visual field.
  • IOP intraocular pressure
  • the causes of glaucoma are not fully known, its symptoms, in most cases, include a high IOP that can be caused by overproduction or by an inappropriate elimination of aqueous humor.
  • the elevation of the IOP is associated with clinical manifestations characteristic of glaucomatous optic neuropathy.
  • the optic nerve dysfunction could be the result of the changes produced in the pressure at the level of the structure of the head of the optic nerve and / or of a low blood supply in the head of the optic nerve and the retina.
  • the absence of treatment or inadequate treatment of glaucoma can lead to significant loss of vision or total blindness.
  • various drugs are useful for the treatment of glaucoma. These include: miotics (eg pilocarpine, carbacol, and acetylcholinesterase inhibitors); sympathomimetics (eg epinephrine, dipivalylepinephrine and apraclonidine); beta-blockers (eg betaxolol, levobunolol and timolol); and carbonic anhydrase inhibitors (eg dorzolamide hydrochloride, acetazolamide, metazolamide and ethoxyzolamide).
  • miotics eg pilocarpine, carbacol, and acetylcholinesterase inhibitors
  • sympathomimetics eg epinephrine, dipivalylepinephrine and apraclonidine
  • beta-blockers eg betaxolol, levobunolol and timolol
  • carbonic anhydrase inhibitors
  • the miotics and sympathomimetics decrease 1OP by increasing the flow of aqueous humor evacuation, while beta-blockers and carbonic anhydrase inhibitors would decrease 1OP by reducing aqueous humor formation.
  • the four types of drugs have potentially serious side effects.
  • Miotics such as pilocarpine can produce blurred vision and other side effects in vision, which leads to a sick person's discomfort or abandonment of treatment.
  • Carbonic anhydrase inhibitors can also produce important side effects that affect the patient's well-being and / or abandonment of treatment.
  • at least one beta-blocker, timolol has frequently been associated with important pulmonary side effects that are attributed to its effect on beta-2 receptors present in lung tissue.
  • prostaglandin analogues have proven useful in the treatment of glaucoma topically. These compounds decrease 1OP by increasing the flow of evacuation of the aqueous humor through the uveoscleral route. Consequently, there is a continuing need for new therapies to control the elevation of 1OP associated with glaucoma.
  • the inventors provide a new strategy for the treatment of glaucoma and ocular hypertension, which implies the topical administration of a compound based on the transduction domain of PTD4 proteins and Profilin I protein.
  • Profilin I and its function in the cells of the trabecular network has been previously investigated by the inventors as a new strategy to increase the flow of aqueous humor and in this way, treat 1OP (cf. A. Gómez-Cabrero et al. "Use of transduction proteins to target trabecular meshwork cells: outflow modulation by profilin I", Mol. Vis. 2005, vol. 9, pp. 1071-82).
  • the trabecular network is an ocular structure located in the ridocorneal angle and is believed to play an important role in the regulation of the flow of evacuation of aqueous humor and IOP.
  • the dynamics of the cytoskeleton has been implicated in the function of the trabecular network and the regulation of aqueous humor.
  • Profilina I is a small protein (12-15 kDa) abundantly expressed in all eukaryotic cells that binds actin monomers, catalyzing the exchange of ADP to ATP-actin, which promotes the polymerization of actin filaments and thus contributes to the regulation of their dynamics.
  • PTD4-Pfnl abbreviated Profilin I as Pfnl
  • Pfnl perfused in anterior ocular segments bovine modulates the evacuation flow of aqueous humor through this tissue
  • PTD4 is a non-natural protein transduction domain (PTD) derived from the natural PTD included in the TAT protein.
  • the TAT protein trans-activates certain HIV genes and is essential for viral replication. It has been shown that TAT PTD mediates the introduction of heterologous peptides and proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. While the complete HIV-1 TAT protein has 86 amino acids, the included PTD has 11 amino acids (amino acids 47-57).
  • the amino acid sequence of PTD4 is YARAAARQARA (cf. A. Ho et al., "Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential in vitro and in vivo", Cancer Res. 2001, vol. 61, pp. 474-7) .
  • the preferred route of administration is the topical corneal route.
  • the cornea is a structure where cells and proteins have a high organization in five basic layers: epithelium, Bowman's membrane, stroma, Descemet's membrane and endothelium.
  • the epithelium covers the surface of the cornea and has a thickness of between 5-6 layers of cells.
  • the Bowman membrane is just below the epithelium and, because this layer is resistant and difficult to penetrate, it protects the cornea from possible injuries.
  • the stroma is the thickest layer and is located just below the Bowman's membrane. It is made up of small collagen fibers arranged in parallel with each other.
  • the Descemet membrane is located between the stroma and the endothelium which, in turn, is composed of a single layer of cells.
  • the epithelial cells of the cornea could act as a barrier to the penetration of transduction proteins as in the case of the use of TAT- ⁇ -galactosidase (cf. X. Guo et al., "Transduction of functionally active TAT fusion proteins into cornea ", Exp Eve Res 2004, vol. 78, pp. 997-1005), and that this barrier can be overcome by tearing the corneal endothelium.
  • the compound PTD4-Pfnl of the invention is capable of crossing the corneal epithelium and the rest of the cell layers to reach the anterior chamber of the eye.
  • the PTD4-Pfnl compound is able to act by decreasing the IOP.
  • the PTD4-Pfnl compound preserves the biological activity of the Pfnl after transduction through the ocular structures.
  • the effect of the PTD4-Pfnl compound reduces IOP to a degree similar to other commercial drugs in terms of maximum effect.
  • the average time of the effect of the PTD4-Pfnl compound is remarkably longer compared to other tested compounds.
  • the effect observed on the IOP suggests that the most likely target of the PTD4-Pfnl compound after its corneal topical application is the trabecular network although other effects on other ocular structures related to the production or evacuation of aqueous humor cannot be ruled out.
  • PTD4-Pfnl compound refers to a compound comprising the amino acid sequence of the PTD4 protein transduction domain and the amino acid sequence of Profilin I or a fragment thereof.
  • the PTD4-Pfnl compound reduces 1OP by about 20% as shown in the attached results. It should be noted the absence of effect on 1OP when only the transduction domain (PTD4-HA) or the recombinant protein without the transduction domain (Pfn I) was tested. PTD4 can cross the different corneal layers but the peptide itself has no detectable effects on 1OP. On the contrary, the lack of effect of Pfnl alone can be attributed to its inability to cross biological membranes or the corneal structure.
  • the biochemical and pharmacological properties of the PTD4-Pfnl compound are especially interesting.
  • the combination of these two molecules provides a new concept in clear contrast with the drugs available for the treatment of ocular hypertension.
  • they are proteins, and not organic compounds.
  • the Pfnl protein does not act by stimulating a receptor (such as carbacol) or antagonizing it (such as timolol) or inhibiting an enzyme (such as dorzolamide).
  • Pfnl would act by modulating the cytoarchitecture and consequently, the properties of the tissues to increase the flow of evacuation of aqueous humor. This mechanism of action is similar to other antiglaucomatous drugs currently under development such as latrunculins.
  • Another relevant aspect is the nature of the PTD4 transport protein. In this case, the inventors have found that this protein provides an extraordinary mechanism for administering proteins or peptides within the eye and, at the same time, preserving Pfnl activity to reduce 1OP.
  • the present invention relates to a topical ophthalmic formulation for the preventive and / or therapeutic treatment of glaucoma and / or ocular hypertension, which comprises an ophthalmically effective amount of a compound comprising the amino acid sequence of the transduction domain. of PTD4 proteins and the amino acid sequence of Profilin I or a fragment thereof, and appropriate amounts of ophthalmically acceptable excipients to constitute a topical formulation.
  • the invention may alternatively be expressed as related to a method for the therapeutic and / or preventive treatment of glaucoma and / or ocular hypertension in a mammal, including a human, comprising The administration in the affected eyes of said mammal or human, of an effective amount of the topical ophthalmic formulation of the invention.
  • Profilin I suitable for the use of the invention includes the natural, synthetic or recombinant Profilin I polypeptide or biologically active fragments thereof; Profilin I polypeptide variants or biologically active fragments thereof, including hybrid fusion proteins or dimers; or Profilin I analog polypeptides or biologically active fragments thereof. Analogs include products where one or more amino acids have been replaced by a different amino acid. Preserved amino acid substitutions are preferable.
  • Profilin I is of mammalian origin and preferably of human origin.
  • the nucleotide sequence of human Profilin I is described in GenBank accession number NM_05022.
  • Profilin I of the invention comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • the compound also comprises a spacer between the amino acid sequence of the transduction domain of PTD4 proteins and the amino acid sequence of Profilin I or a fragment thereof.
  • the spacer facilitates the free movement of PTD4 with respect to Profilin I.
  • the spacers can be amino acid sequences or protease domains (cf. GPH Dietz et al., "Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach ", Molecular and Cellular Neuroscience 2004, vol. 27, pp. 85-131).
  • the spacer is a sequence of glycines.
  • the compound of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the spacer is a sequence of four glycines, a leucine and a glutamic.
  • the compound of the invention can include other sequences such as histidine sequences to allow the purification of proteins or antigenic sequences such as hematoglutinin, T7 and myc for the recognition of the compound of the invention.
  • the PTD4-Pfnl compound of the invention can be produced by chemical synthesis, but preferably by recombinant DNA methods. Both of them Methods are widely known to those skilled in the art.
  • the PTD4-Pfnl compound can also be produced by purifying natural Profilin I from the liver or bovine brain, chemically synthesizing PTD4 and covalently bonding both elements.
  • ophthalmically acceptable means suitable for use in contact with eye tissues without producing toxicity, irritation, incompatibility, instability, allergic response or the like.
  • Another aspect of the invention relates to a method of preparing a topical ophthalmic formulation, which comprises mixing ophthalmically effective amounts of the PTD4-Pfnl compound, together with appropriate amounts of ophthalmically acceptable excipients to constitute a topical formulation.
  • the amount of compound of the invention can be determined by a person skilled in the art without excessive experimentation. Due to the direct transduction of PTD4-Pfnl by topical corneal application, the effective amount of PTD4-Pfnl necessary to obtain a therapeutic effect is less than for other antiglaucomatous drugs that must reach the ciliary body where aqueous humor occurs. In general, for topical administration, an amount between 0.1 and 100 ⁇ M and, preferably between 1 and 10 ⁇ M, can be used in the formulations.
  • the formulations of the present invention may additionally comprise components to allow sustained release and / or better well-being. These components include mucomimetic polymers, gel-forming polysaccharides and substrates with micro- or nanoparticles.
  • the formulations of the invention may comprise various ingredients such as antimicrobial preservatives or agents for adjusting the osmolarity of the formulations.
  • the formulations may comprise the PTD4-Pfnl compound as a single active compound for the treatment of ocular hypertension and glaucoma, combinations of different active compounds, or combinations with other therapeutic agents depending on the case.
  • the formulations can be formulated in various dosage forms for suitable topical ophthalmic administration, including solutions, suspensions, emulsions, gels, creams, ointments and sprays.
  • FIG. 1 shows the temporal relationship of the changes produced by PTD4-Pfnl on the intraocular pressure (IOP) after a single instillation.
  • a single dose of PTD4-Pfnl (1.5 ⁇ M, 10 ⁇ l) produced a decrease in IOP (from 22.0 ⁇ 0.6 to 18.1 ⁇ 0.9 mmHg) that remained below the control value for more than 5 hours (black squares).
  • the application of PTD4 alone (PTD4-HA; clear squares) or Profileina I alone (clear triangles) did not modify the IOP compared to the vehicle (saline, clear circles).
  • the values represent the mean ⁇ S. E. M. of six independent experiments. * p ⁇ 0.05 vs. the effect of the vehicle alone.
  • T (h) means time in hours.
  • FIG. 2 shows the comparative effects between PTD4-Pfnl and other commercial drugs.
  • the values represent the mean ⁇ SEM of six independent experiments. ** p ⁇ 0.01, * p ⁇ 0.05 vs. the control group
  • FIG. 3 shows the comparative effects between the average duration of PTD4-Pfnl and other commercial drugs.
  • New Zealand albino rabbits weighing between 2 and 2.5 kg were kept in individual cages with water and food ad libitum. The animals were subjected to a light / dark cycle of 12 hours. All experimental protocols comply with the ARVO Statement for the Use of Animáis in Ophthalmology and Vision Research and also the guidelines of the European Communities Council Directive (86/609 / EEC).
  • the cDNA of the human sequence of Profilina I was cloned into a modified version of the expression vector pRSETA (cf. A. Gómez-Cabrero et al., Previously referenced).
  • the vector was previously created to allow the generation of recombinant proteins fused to the PTD4 domain (protein transduction domain 4, sequence: YARAAARQARA, SEQ ID NO: 1).
  • the human Profilin I clone was a donation from Drs Hitomi Mimuro and Tadaomi Takenawa, University of Tokyo, Japan. The expression and purification of the protein was performed as described in A. Gómez-Cabrero et al.
  • the pellets of a BL21-PLys bacteria culture expressing the modified vector containing Pfnl were isolated and used.
  • the recombinant protein was purified using a Ni-NTA resin (Quiagen, Hilden, GmgH) and eluted by imidazole.
  • the change of buffer solution and the concentration of the eluted protein was carried out by centrifugation using an Amicon Ultra-15 10,000 MWCO centrifugation filter (Millipore Ibérica, Madrid, Spain). Proteins were frozen in liquid N 2 and were they kept at -80 0 C in a 10-15% glycerol-PBS solution.
  • PTD4-HA the transduction domain linked to an HA antigenic sequence (Hematoglutinin, sequence ⁇ ARAAARQARAGEQKLISEEDL, SEQ ID NO: 2) was purchased from GenScript (Piscataway, NJ USA).
  • PTD4-Pfnl was formulated in saline solution at a final concentration of 1.5 ⁇ M.
  • the compound was added unilaterally to the cornea in a fixed volume of 10 ⁇ l.
  • the contralateral eye received the same volume of saline (0.9% NaCI, vehicle).
  • both compounds were tested in the same manner as PTD4-Pfnl (1.5 ⁇ M, 10 ⁇ l).
  • Commercial hypotensive agents Xalatan ® (latanoprost, 0.005%), Trusopt ® (dorzolamide hydrochloride, 2%), Timoftol ® (timolol maleate, 0.5%) and
  • Pilocarpine ® (pilocarpine, 2%) were studied applying a volume of 40 ⁇ l. Since the tonometry causes some discomfort in the rabbits, the corneas were anesthetized by applying 10 ⁇ l of 1: 10 (v: v) of oxybuprocaine / tetracaine (4 mg and 1 mg respectively, from Alcon-Cusi, Barcelona, Spain).
  • the experiments were performed following a blind protocol: no visible indication was given to the experimenter of the solution to be applied (agent or vehicle).
  • the IOP measurements were made using a contact tonometer, Tonopen ® XL, at a zero time (baseline or pretreatment) and at the indicated intervals, after the application of the compound.
  • the evolution of the IOP was followed up to 6 hours, in order to study the development of the effects. In one day only a single dose was studied in a given animal, which was washed a minimum of twice in a two-day period between different doses.
  • EXAMPLE 2 Comparative study of the effects of PTD4-Pfnl with other commercial compounds.
  • the hypotensive effects of PTD4-Pfnl were comparable with other commercial anti-glaucoma agents.

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Abstract

Los inventores proporcionan una formulación oftálmica tópica para el tratamiento preventivo y/o terapéutico del glaucoma y/o de la hipertensión ocular, que comprende una cantidad oftálmicamente efectiva de un compuesto que comprende la secuencia aminoacídica del dominio de transducción de proteínas PTD4 y la secuencia aminoacídica de la Profilina I o un fragmento de la misma, y cantidades apropiadas de excipientes oftálmicamente aceptables para constituir una formulación tópica. La formulación oftálmica tópica cruza el epitelio corneal y el resto de capas celulares para llegar a la cámara anterior del ojo y, una vez dentro, el compuesto PTD4-PfnI es capaz de actuar disminuyendo la presión intraocular.

Description

Formulación tópica para el tratamiento de Ia hipertensión ocular y el glaucoma.
La presente invención se relaciona con el campo de Ia medicina, y específicamente con el campo de Ia oftalmología. En particular Ia invención se relaciona con formulaciones tópicas para el tratamiento del glaucoma y Ia hipertensión ocular.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El glaucoma se caracteriza por producir una lesión en Ia cabeza del nervio óptico acompañada por una disminución en el campo visual normal. Una presión intraocular elevada (en adelante IOP) constituye un factor de riesgo para Ia pérdida de campo visual glaucomatosa. Alrededor de 70 millones de personas en el mundo tienen glaucoma y entre 5 y 8 millones de ellas son ciegas. Según algunas estimaciones, unos 100 millones más de personas tienen hipertensión ocular y estarían en riesgo de padecer importantes problemas en Ia visión.
Aunque las causas del glaucoma no se conocen completamente, sus síntomas, en Ia mayoría de los casos, incluyen una IOP elevada que puede ser causada por sobreproducción o por una eliminación inadecuada del humor acuoso. La elevación de Ia IOP se asocia con manifestaciones clínicas características de Ia neuropatía óptica glaucomatosa. La disfunción del nervio óptico podría ser el resultado de los cambios producidos en Ia presión a nivel de Ia estructura de Ia cabeza del nervio óptico y/o de un bajo aporte sanguíneo en Ia cabeza del nervio óptico y Ia retina. La ausencia de tratamiento o un tratamiento inadecuado del glaucoma pueden llevar a una pérdida significativa de visión o a ceguera total.
En los casos donde Ia cirugía no está aconsejada, diversos fármacos son útiles para el tratamiento del glaucoma. Estos incluyen: mióticos (p.ej. pilocarpina, carbacol, e inhibidores de Ia acetilcolinesterasa); simpaticomiméticos (p.ej. epinefrina, dipivalilepinefrina y apraclonidina); beta- bloqueantes (p.ej. betaxolol, levobunolol y timolol); e inhibidores de Ia anhidrasa carbónica (p.ej. dorzolamida cloridrato, acetazolamida, metazolamida y etoxzolamida). Se acepta que los mióticos y simpaticomiméticos disminuyen Ia 1OP incrementando el flujo de evacuación del humor acuoso, mientras que los beta-bloqueantes y los inhibidores de Ia anhidrasa carbónica disminuirían Ia 1OP al reducir Ia formación de humor acuoso. Los cuatro tipos de fármacos presentan potencialmente serios efectos secundarios. Los mióticos como Ia pilocarpina pueden producir visión borrosa y otros efectos secundarios en Ia visión, Io cual conduce a un malestar del enfermo o al abandono del tratamiento. Los inhibidores de Ia anhidrasa carbónica pueden producir también importantes efectos secundarios que afectan al bienestar del paciente y/o al abandono del tratamiento. Además, al menos un beta-bloqueante, el timolol, se ha asociado con frecuencia a importantes efectos secundarios pulmonares que se atribuyen a su efecto en los receptores beta-2 presentes en el tejido pulmonar. Recientemente, los análogos de prostaglandina se han mostrado útiles en el tratamiento del glaucoma por vía tópica. Estos compuestos disminuyen Ia 1OP al incrementar el flujo de evacuación del humor acuoso por Ia vía uveoescleral. En consecuencia existe una continua necesidad de nuevas terapias para controlar Ia elevación de Ia 1OP asociada al glaucoma.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores proporcionan una nueva estrategia para el tratamiento del glaucoma y Ia hipertensión ocular, que implica Ia administración tópica corneal de un compuesto basado en el dominio de transducción de proteínas PTD4 y Ia proteína Profilina I.
La Profilina I y su función en las células de Ia red trabecular ha sido investigada previamente por los inventores como una nueva estrategia para incrementar el flujo del humor acuoso y de esta manera, tratar Ia 1OP (cfr. A. Gómez-Cabrero et al. "Use of transduction proteins to target trabecular meshwork cells: outflow modulation by profilin I", Mol. Vis. 2005, vol. 9, pp. 1071-82). La red trabecular es una estructura ocular situada en el ángulo ¡ridocorneal y se cree que juega un papel importante en Ia regulación del flujo de evacuación del humor acuoso y Ia IOP. La dinámica del citoesqueleto se ha implicado en Ia función de Ia red trabecular y Ia regulación del humor acuoso. Una de las proteínas capaces de reorganizar el citoesqueleto de actina es Profilina I. Profilina I es una pequeña proteína (12-15 kDa) abundantemente expresada en todas las células eucariotas que une monómeros de actina, catalizando el intercambio de ADP a ATP-actina, Io que promueve Ia polimerización de filamentos de actina y contribuye de esta manera a Ia regulación de su dinámica.
Incluso teniendo un buen candidato a fármaco, el direccionamiento eficiente y selectiva del fármaco hacia las células oculares deseadas a través de sus membranas es crucial para el desarrollo de nuevas terapias. Hoy en día se están investigando diferentes sistemas de administración de fármacos (cfr. C. Andrieu-Soler et al., "Ocular gene therapy: a review of non-viral strategies", Mol. Vision 2006, vol. 12, pp. 1334-47). Profilina I no se desarrollado como nueva estrategia para los tratamientos antiglaucomatosos actuales. Por si misma no es capaz inherentemente de cruzar membranas celulares. Los inventores han encontrado previamente que Ia construcción PTD4-Pfnl (Profilina I abreviada como Pfnl) es capaz de penetrar a través de Ia membrana de las células de Ia red trabecular en cultivo y cuando es perfundida en segmentos anteriores oculares bovinos modula el flujo de evacuación del humor acuoso a través de este tejido (cfr. A. Gómez-Cabrero et al. referenciada anteriormente). Estos estudios se realizaron utilizando cultivos de células trabeculares bovinas y segmentos anteriores oculares bovinos donde Ia administración de PTD4-Pfnl se realizó directamente en el medio de cultivo.
PTD4 es un dominio de transducción de proteínas no natural (PTD) derivado del PTD natural incluido en Ia proteína TAT. La proteína TAT trans-activa ciertos genes del HIV y es esencial para Ia replicación vírica. Se ha demostrado que el TAT PTD media Ia introducción de péptidos heterólogos y proteínas en células de mamífero in vitro e in vivo. Mientras que Ia proteína HIV-1 TAT completa tiene 86 aminoácidos, el PTD incluido tiene 11 aminoácidos (aminoácidos 47-57). La secuencia de aminoaácidos del PTD4 es YARAAARQARA (cfr. A. Ho et al., "Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential ¡n vitro and in vivo", Cáncer Res. 2001 , vol. 61 , pp. 474-7).
En oftalmología es deseable una vía de administración de fármacos confortable y fácil de manera que los obstáculos para Ia administración de fármacos indicados anteriormente son cruciales para el éxito de nuevas terapias. La vía de administración preferida es Ia vía tópica corneal. La córnea es una estructura donde las células y las proteínas presentan una alta organización en cinco capas básicas: epitelio, membrana de Bowman, estroma, membrana de Descemet y endotelio. El epitelio cubre Ia superficie de Ia cornea y tiene un grosor de entre 5-6 capas de células. La membrana de Bowman se encuentra justo por debajo del epitelio y, debido a que esta capa es resistente y difícil de penetrar, protege a Ia córnea de posibles lesiones. El estroma es Ia capa más gruesa y se encuentra justo por debajo de Ia membrana de Bowman. Está compuesta por pequeñas fibras de colágeno dispuestas en paralelo unas con otras. La membrana de Descemet se encuentra entre el estroma y el endotelio que, a su vez, está compuesto por una sola capa de células.
Se ha descrito anteriormente que las células epiteliales de Ia córnea podrían actuar como barrera a Ia penetración de proteínas de transducción como en el caso del uso de TAT-β-galactosidasa (cfr. X. Guo et al., "Transduction of functionally active TAT fusión proteins into cornea", Exp Eve Res 2004, vol. 78, pp. 997-1005), y que esta barrera puede ser superada rasgando el endotelio corneal. Contrariamente a esto y de manera sorprendente, los inventores han encontrado que el compuesto PTD4-Pfnl de Ia invención es capaz de cruzar el epitelio corneal y el resto de capas celulares para alcanzar Ia cámara anterior del ojo. Una vez allí, el compuesto PTD4-Pfnl es capaz de actuar disminuyendo Ia IOP. De esta manera, el compuesto PTD4-Pfnl preserva Ia actividad biológica de Ia Pfnl tras Ia transducción a través de las estructuras oculares. El efecto del compuesto PTD4-Pfnl reduce Ia IOP en un grado similar a otros fármacos comerciales en términos de efecto máximo. El tiempo medio del efecto del compuesto PTD4-Pfnl es remarcablemente más largo comparado con otros compuestos probados. El efecto observado sobre Ia IOP sugiere que Ia diana más probable del compuesto PTD4-Pfnl tras su aplicación tópica corneal sea Ia red trabecular aunque no se pueden descartar otros efectos sobre otras estructuras oculares relacionadas con Ia producción o Ia evacuación del humor acuoso.
Como se usa aquí, el término "compuesto PTD4-Pfnl" se refiere a un compuesto que comprende Ia secuencia de aminoácidos del domino de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia de aminoácidos de Profilina I o un fragmento de Ia misma. El compuesto PTD4-Pfnl reduce Ia 1OP alrededor de un 20% como se muestra en los resultados adjuntos. Hay que destacar Ia ausencia de efecto sobre Ia 1OP cuando se ensayó únicamente el dominio de transducción (PTD4-HA) o Ia proteína recombinante sin el domino de transducción (Pfn I). PTD4 puede atravesar las diferentes capas corneales pero el péptido en si mismo no tiene efectos detectables sobre Ia 1OP. Por el contrario, Ia falta de efecto de Ia Pfnl sola se puede atribuir a su imposibilidad de cruzar membranas biológicas o Ia estructura corneal.
Las propiedades bioquímicas y farmacológicas del compuesto PTD4-Pfnl son especialmente interesantes. La combinación de estas dos moléculas proporciona un nuevo concepto en claro contraste con los fármacos disponibles para el tratamiento de Ia hipertensión ocular. Des del punto de vista químico, son proteínas, y no compuestos orgánicos. La proteína Pfnl no actúa estimulando un receptor (como el carbacol) o antagonizándolo (como el timolol) ni tampoco inhibiendo un enzima (como Ia dorzolamida). De hecho, Pfnl actuaría modulando Ia citoarquitectura y en consecuencia, las propiedades de los tejidos para aumentar el flujo de evacuación del humor acuoso. Este mecanismo de acción es similar a otros fármacos antiglaucomatosos actualmente en desarrollo como las latrunculinas. Otro aspecto relevante es Ia naturaleza de Ia proteína transportadora PTD4. En este caso, los inventores han encontrado que esta proteína proporciona un extraordinario mecanismo para administrar proteínas o péptidos dentro del ojo y, al mismo tiempo, preservar Ia actividad de Pfnl para reducir Ia 1OP.
De esta manera, Ia presente invención se refiere a una formulación oftálmica tópica para el tratamiento preventivo y/o terapéutico del glaucoma y/o de Ia hipertensión ocular, que comprende una cantidad oftálmicamente efectiva de un compuesto que comprende Ia secuencia aminoacídica del dominio de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia aminoacídica de Ia Profilina I o un fragmento de Ia misma, y cantidades apropiadas de excipientes oftálmicamente aceptables para constituir una formulación tópica.
La invención puede expresarse alternativamente como relacionada con un método para el tratamiento terapéutico y/o preventivo del glaucoma y/o de Ia hipertensión ocular en un mamífero, incluyendo un humano, que comprende Ia administración en los ojos afectados de dicho mamífero o humano, de una cantidad efectiva de Ia formulación oftálmica tópica de Ia invención.
La Profilina I adecuada para el uso de Ia invención incluye el polipéptido de Profilina I natural, sintético o recombinante o fragmentos del mismo biológicamente activos; variantes del polipéptido de Profilina I o fragmentos del mismo biológicamente activos, incluyendo proteínas de fusión híbridas o dímeros; o polipéptidos análogos de Profilina I o fragmentos de los mismos biológicamente activos. Los análogos incluyen productos donde uno o más aminoácidos han sido reemplazados por un aminoácido diferente. Sustituciones de aminoácidos conservados son preferibles.
La Profilina I es de origen mamífero y preferentemente de origen humano. La secuencia de nucleótidos de Ia Profilina I humana se describe en el número de acceso del GenBank NM_05022. En una realización particular, Ia Profilina I de Ia invención comprende Ia secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
En otra realización particular, el compuesto además comprende un espaciador entre Ia secuencia aminoacídica del dominio de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia aminoacídica de Ia Profilina I o un fragmento de Ia misma. El espaciador facilita el libre movimiento del PTD4 respecto a Ia Profilina I. Como ejemplo, los espaciadores pueden ser secuencias de aminoácidos o dominios de proteasas (cfr. G.P.H. Dietz et al., "Delivery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach", Molecular and Cellular Neuroscience 2004, vol. 27, pp. 85-131). En una realización particular, el espaciador es una secuencia de glicinas. En otra realización, el compuesto de Ia invención comprende Ia secuencia SEQ ID NO: 4. En otra realización, el espaciador es una secuencia de cuatro glicinas, una leucina y un glutámico.
Adicionalmente, el compuesto de Ia invención puede incluir otras secuencias como secuencias de histidinas para permitir Ia purificación de proteínas o secuencias antigénicas como hematoglutinina, T7 y myc para el reconocimiento del compuesto de Ia invención.
El compuesto PTD4-Pfnl de Ia invención puede ser producido por síntesis química, pero preferiblemente por métodos de DNA recombinante. Ambos métodos son ampliamente conocidos por los expertos en Ia materia. El compuesto PTD4-Pfnl también puede ser producido purificando Profilina I natural de hígado o cerebro bovino, sintetizando químicamente el PTD4 y uniendo covalentemente ambos elementos.
El término "oftálmicamente aceptable" como se usa aquí, significa adecuado para el uso en contacto con tejidos oculares sin producir toxicidad, irritación, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica o similar.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a un procedimiento de preparación de una formulación oftálmica tópica, que comprende mezclar cantidades oftálmicamente efectivas del compuesto PTD4-Pfnl, junto con cantidades apropiadas de excipientes oftálmicamente aceptables para constituir una formulación tópica.
La cantidad de compuesto de Ia invención puede determinarse por una persona experta en Ia materia sin experimentación excesiva. Debido a Ia transducción directa de PTD4-Pfnl por aplicación tópica corneal, Ia cantidad efectiva de PTD4-Pfnl necesaria para obtener un efecto terapéutico es menor que para otros fármacos antiglaucomatosos que deben alcanzar el cuerpo ciliar donde se produce el humor acuoso. En general, para Ia administración tópica, una cantidad entre 0.1 y 100 μM y, preferentemente entre 1 y 10 μM, se puede usar en las formulaciones.
Las formulaciones de Ia presente invención pueden comprender adicionalmente componentes para permitir Ia liberación sostenida y/o un mejor bienestar. Estos componentes incluyen polímeros mucomiméticos, polisacáridos formadores de geles y sustratos con micro- o nanopartículas. Además, las formulaciones de Ia invención pueden comprender varios ingredientes como conservantes antimicrobianos o agentes para ajustar Ia osmolaridad de las formulaciones. Las formulaciones pueden comprender el compuesto PTD4-Pfnl como compuesto activo único para el tratamiento de Ia hipertensión ocular y el glaucoma, combinaciones de diferentes compuestos activos, o combinaciones con otros agentes terapéuticos dependiendo del caso. Como apreciarán los expertos en Ia materia, las formulaciones pueden formularse en varias formas de dosificación para administración tópica oftálmica adecuada, incluyendo soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, cremas, ungüentos y sprays.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los comúnmente entendidos por una persona experta en el campo de Ia invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en Ia práctica de Ia presente invención. A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes realizaciones particulares y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 muestra Ia relación temporal de los cambios producidos por PTD4- Pfnl sobre Ia presión intraocular (IOP) después de una instilación única. Una dosis única de PTD4-Pfnl (1.5 μM,10 μl) produjo una disminución de Ia IOP (de 22.0 ± 0.6 a 18.1 ± 0.9 mmHg) que permaneció por debajo del valor control durante más de 5 horas (cuadrados negros). La aplicación de PTD4 sola (PTD4-HA; cuadrados claros) o de Profilina I sola (triángulos claros) no modificó Ia IOP comparada con el vehículo (salino, círculos claros). Los valores representan Ia media ± S. E. M. de seis experimentos independientes. * p<0.05 vs. el efecto del vehículo solo. "T(h)" significa tiempo en horas.
La FIG. 2 muestra los efectos comparativos entre PTD4-Pfnl y otros fármacos comerciales. Aplicaciones únicas de PTD4-Pfnl, Xalatan®, Trusopt®1 Timoftol® y Pilocarpine® ("C" significa Compuesto) en las mismas condiciones, produjeron disminuciones máximas variables en Ia 1OP dependiendo del compuesto ensayado. Los valores representan Ia media ± S. E. M. de seis experimentos independientes. **p<0.01 , *p<0.05 vs. el grupo control. La FIG. 3 muestra los efectos comparativos entre el tiempo medio de duración de PTD4-Pfnl y otros fármacos comerciales. Aplicaciones únicas de PTD4-Pfnl, Xalatan®, Trusopt®' Timoftol® y Pilocarpine® ("C" significa Compuesto). El tiempo medio de duración del efecto es el parámetro que define Ia duración del efecto de un compuesto probado sobre Ia 1OP. Los valores representan Ia media ± S. E. M. de seis experimentos independientes. **p<0.01 , *p<0.05 vs. el grupo control. "MTE (h)" significa tiempo medio del efecto en horas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIONES PARTICULARES
Animales
Conejos albinos de Nueva Zelanda de un peso entre 2 y 2.5 Kg se mantuvieron en jaulas individuales con agua y comida ad libitum. Los animales fueron sometidos a un ciclo luz/oscuridad de 12 horas. Todos los protocolos experimentales cumplen con el ARVO Statement for the Use of Animáis in Ophthalmology and Vision Research y también las directrices de European Communities Council Directive (86/609/EEC).
Clonaje v purificación de Ia profilina recombinate
El cADN de Ia secuencia humana de Profilina I se clonó en una versión modificada del vector de expresión pRSETA (cfr. A. Gómez-Cabrero et al., antes referenciada). El vector se creó previamente para permitir Ia generación de proteínas recombinantes fusionadas al dominio PTD4 (dominio de transducción de proteínas 4, secuencia: YARAAARQARA, SEQ ID NO: 1). El clon de Ia Profilina I humana fue una donación de los Drs Hitomi Mimuro y Tadaomi Takenawa, Universidad de Tokyo, Japan. La expresión y Ia purificación de Ia proteína se realizó como se describe en A. Gómez-Cabrero et al. Brevemente, los pellets de un cultivo de bacterias BL21-PLys expresando el vector modificado conteniendo Pfnl, fueron aislados y usados. La proteína recombinante se purificó usando una resina de Ni-NTA (Quiagen, Hilden, GmgH) y se eluyó mediante imidazol. El cambio de solución tampón y Ia concentración de Ia proteína eluida se realizó mediante centrifugación usando un filtro de centrifugación Amicon Ultra-15 10000 MWCO (Millipore Ibérica, Madrid, España). Las proteínas se congelaron en N2 líquido y se mantuvieron a -80 0C en una solución 10-15% glicerol-PBS. PTD4-HA, el dominio de transducción unido a una secuencia antigénica HA ( Hematoglutinina, secuenciaΥARAAARQARAGEQKLISEEDL, SEQ ID NO: 2) se compró a Ia compañía GenScript (Piscataway, NJ EEUU).
Formulación y método de administración
PTD4-Pfnl se formuló en solución salina a una concentración final de 1.5 μM. El compuesto se añadió unilateralmente a Ia cornea en un volumen fijo de 10 μl. El ojo contralateral recibió el mismo volumen de salino (NaCI 0.9%, vehículo). Para comprobar si PTD4-HA o Ia Profilina I por si solas producen algún efecto en Ia presión intraocular (IOP), ambos compuestos fueron ensayados de Ia misma manera que PTD4-Pfnl (1.5 μM, 10 μl). Agentes hipotensivos comerciales, Xalatan® (latanoprost, 0.005%), Trusopt® (dorzolamida chlorhidrato, 2%), Timoftol® (timolol maleato, 0.5%) y
Pilocarpine® (pilocarpina, 2%) fueron estudiados aplicando un volumen de 40 μl. Dado que Ia tonometría produce cierto malestar en los conejos, las corneas fueron anestesiadas aplicando 10 μl de 1 :10 (v:v) de oxibuprocaina / tetracaina (4 mg y 1 mg respectivamente, de Alcon-Cusi, Barcelona, España).
Los experimentos se realizaron siguiendo un protocolo ciego: ninguna indicación visible se Ie dio al experimentador de Ia solución a aplicar (agente o vehículo). Las medidas de Ia IOP se realizaron usando un tonómetro por contacto, Tonopen® XL, a un tiempo cero (línea base o pretratamiento) y a los intervalos indicados, después de Ia aplicación del compuesto. La evolución de Ia IOP se siguió hasta 6 horas, para poder estudiar el desarrollo de los efectos. En un día sólo se estudió una dosis única en un animal determinado, el cual se lavó un mínimo de dos veces en un espacio de dos días entre diferentes dosis.
Análisis de los datos
Los datos numéricos se proporcionan como media ± S. E. M. Las medias de cada grupo se compararon usando un test estadístico Student's t-test (no pareados y de dos colas) con un 5% de significancia. EJEMPLO 1 : Efecto de PTD4-Pfnl en Ia presión intraocular en conejo
Para poder comparar los efectos de PTD4-Pfnl en Ia IOP de los ojos de conejo, se probaron dosis únicas del compuesto en las condiciones antes mencionadas. Tal como se observa en Ia FIG. 1 Ia aplicación de PTD4-Pfnl produce una reducción significativa de Ia IOP que fue máxima tras dos horas de Ia aplicación del compuesto. PTD4-Pfnl produce una reducción de un 20% en Ia IOP comparada con el vehículo, manteniéndose significativamente por debajo del valor control durante, al menos, las siguientes cinco horas (n=6).
Como control, el mismo experimento se realizó aplicando de manera independiente únicamente el dominio de transducción fusionado al dominio de Hematoglutinina (PTD4-HA) o bien Profilina I sin el dominio PTD4. En ninguna de estas condiciones Ia 1OP mostró cambios significativos comparados con el vehículo (n=4, FIG. 1). Estos resultados, junto a los obtenidos con PTD4-Pfnl, ilustran que solo Profilina I fusionada al dominio de transducción era capaz de reducir Ia IOP en conejos albinos de Nueva Zelanda.
EJEMPLO 2: Estudio comparativo de los efectos de PTD4-Pfnl con otros compuestos comerciales.
Dado que PTD4-Pfnl era capaz de reducir Ia IOP en conejos, se compararon los efectos de otros compuestos usados comúnmente en el tratamiento de Ia presión intraocular. Se estudió Ia habilidad para modificar Ia IOP (n=6) de cuatro productos farmacéuticos con diferentes mecanismos farmacológicos: Xalatan®, Trusopt®, Timoftol® y Pilocarpine®. En Ia FIG. 2 se muestra el máximo efecto de cada una de las sustancias examinadas. Todos los fármacos examinados redujeron Ia IOP significativamente , siendo el mejor Timoftol®. La reducción de Ia IOP varió entre un 35% (Timoftol®) a un 18% (Trusopt®), comparadas con el vehículo (salino).
Considerando el intervalo de efectos mostrado por PTD4-Pfnl y comparándolo con los fármacos comerciales , Ia proteína presentaba un tiempo medio de efecto de 6.8 ± 1.1 horas mientras que Xalatan®, Trusopt®, Timoftol® and Pilocarpine® presentaban un tiempo medio de 5.5 ± 1.3 horas, 4.3 ± 0.8 horas, 5.1 ± 1.0 y 4.5 ± 0.9 horas, respectivamente (n=6, FIG. 3). Así, los efectos hipotensivos de PTD4-Pfnl eran comparables con otros antiglaucomatosos comerciales.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Formulación oftálmica tópica para el tratamiento preventivo y/o terapéutico del glaucoma y/o de Ia hipertensión ocular, que comprende una cantidad oftálmicamente efectiva de un compuesto que comprende Ia secuencia aminoacídica del dominio de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia aminoacídica de Ia Profilina I o un fragmento de Ia misma, y cantidades apropiadas de excipientes oftálmicamente aceptables para constituir una formulación tópica.
2. Formulación según Ia reivindicación 1 , donde Ia secuencia aminoacídica de Profilina I es SEQ ID NO: 3.
3. Formulación según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el compuesto además comprende un espaciador entre Ia secuencia aminoacídica del dominio de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia aminoacídica de Ia Profilina I o un fragmento de Ia misma.
4. Formulación según Ia reivindicación 3, donde el espaciador comprende tres glicinas.
5. Formulación según Ia reivindicación 4, donde el compuesto comprende Ia SEQ ID NO: 4.
6. Formulación según Ia reivindicación 1 , donde Ia cantidad de compuesto en Ia formulación está entre 1 y 10 μM.
7. Uso de un compuesto que comprende Ia secuencia aminoacídica del dominio de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia amioacídica de Ia Profilina I o un fragmento de Ia misma, para Ia fabricación de una formulación oftálmica tópica para el tratamiento preventivo y/o terapéutico del glaucoma y/o de Ia hipertensión ocular en un mamífero incluyendo un humano.
8. Procedimiento de preparación de una formulación oftálmica tópica, que comprende mezclar cantidades oftálmicamente efectivas de un compuesto que comprende Ia secuencia aminoacídica del domino de transducción de proteínas PTD4 y Ia secuencia aminoacídica de Ia Profilina I o un fragmento de la misma, junto con cantidades apropiadas de excipientes oftálmicamente aceptables para constituir una formulación tópica.
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