ES2609927T3

ES2609927T3 - Composiciones y métodos para tratamientos durante periodos no agudos después de lesiones neurológicas del SNC

Info

Publication number: ES2609927T3
Application number: ES09806990.9T
Authority: ES
Inventors: Anthony Caggiano; Jennifer Iaci
Original assignee: Acorda Therapeutics Inc
Current assignee: Acorda Therapeutics Inc
Priority date: 2008-08-15
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2017-04-25
Anticipated expiration: 2029-08-17
Also published as: EP2328606A1; ES2827923T3; EP2328606A4; AU2016213899B2; EP3777878A1; RU2646507C2; CA2734766A1; RU2011109546A; US20200368318A1; AU2018201973A1; WO2010019275A9; AU2019275508B2; AU2021261848A1; EP2328606B1; AU2019275508A1; RU2501564C2; CN104707130A; RU2013140560A; US20170252406A1; AU2009282455B2

Abstract

Un polipéptido que comprende un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (tipo EGF) para su uso en el tratamiento de: (i) una lesión neuronal a un mamífero, en donde el polipéptido que comprende un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (tipo EGF) se administra después de una lesión neuronal en dicho mamífero; y en donde la administración se inicia después de la ventana semi-aguda después de la lesión neuronal; (ii) una lesión neuronal a un mamífero, en donde el polipéptido que comprende un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (tipo EGF) se administra después de una lesión neuronal en dicho mamífero; la administración se inicia en menos de seis horas después de la lesión neuronal; y la administración continúa en un periodo de tiempo de más de 72 horas después de la lesión; (iii) una lesión neuronal isquémica del sistema nervioso central en un mamífero, en donde el péptido se administra después de una lesión neuronal en dicho mamífero; y la administración se inicia después de que el mamífero ha alcanzado un volumen completo de muerte celular por lesión isquémica después de la lesión; o (iv) una lesión neuronal a un mamífero, en donde el polipéptido que comprende un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (tipo EGF) se administra después de una lesión neuronal en dicho mamífero; y en donde la administración se inicia durante la ventana semi-aguda y después todavía continúa, después de la lesión neuronal, en donde el dominio tipo EGF es codificado por el gen de la neuregulina (NRG)-1, gen (NRG)-2, gen (NRG)-3 o gen (NRG)-4.

Description

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La Figura 15 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del fragmento alfa tipo factor de crecimiento epidérmico (EGFL) de NRG-1.

La Figura 16 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del fragmento alfa tipo factor de crecimiento epidérmico (EGFL) de NRG-2 alfa.

La Figura 17 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del fragmento alfa tipo factor de crecimiento epidérmico (EGFL) de NRG-2 beta.

La figura 18 muestra las alineaciones de la secuencia de aminoácidos de diversos péptidos tipo EGF. El dominio tipo EGF se puede definir como subdominios de NRG para los que la alineación de secuencias revela al menos 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45% de homología en la secuencia de aminoácidos en comparación con la molécula de EGF humana (secuencia P01133971-1023, en la parte inferior de la alineación en la figura). Los aminoácidos homólogos tienen propiedades estructurales físico-químicas idénticas, conservadas o semi-conservadas y, como se indica mediante los símbolos "*",":", y ''.", respectivamente.

Descripción detallada de la invención

Como se indica en el presente documento, el tratamiento no paliativo del accidente cerebrovascular isquémico hasta ahora se ha limitado a productos terapéuticos administrados en la fase aguda después de la apoplejía.

La muerte inmediata celular debido, al menos en parte, a la falta de oxígeno se observa durante la fase aguda. Además, como se muestra en la Figura 1, la oclusión del flujo de sangre da como resultado la liberación de almacenamientos intracelulares de radicales libres, glutamato y de calcio y sodio que se entiende que destruyen el tejido cerebral y amplían el área de la lesión.

La fase semi-aguda, de aproximadamente seis horas a dos días (o tres días por algunas definiciones) post-lesión neuronal, se caracteriza por la continua liberación de radicales libres, descarga de glutamato, liberación de calcio y de sodio, privación de oxígeno de la región ocluida, e inmediata muerte celular localizada. Hasta la fecha, no hay agentes clínicamente aprobados conocidos para uso en seres humanos durante la fase semi-aguda después de un accidente cerebrovascular.

Como se muestra en la Figura 1, la ventana limitada para la terapia post-lesión neuronal farmacéutica se explica al menos parcialmente por la patofisiología y la progresión temporal de la lesión. En cuestión de minutos, por ejemplo, de una oclusión, las neuronas en el núcleo del infarto se destruyen. A las horas después de la oclusión, los radicales libres, los agentes excitotóxicos e inflamatorios son liberados/producidos y estas moléculas continúan destruyendo el tejido cerebral y ampliando el área de la lesión. La extensión de la lesión puede ser limitada, como se describe anteriormente, mediante la restauración de flujo sanguíneo (utilizando un destructor de coágulos clínicamente aprobado, es decir, tPA) que logra así la re-oxigenación de la zona afectada.

Como se indica en la literatura científica, diversos compuestos parecen exhibir eficacia en los períodos agudos y semi-agudos. Sin embargo, después de las marcas a las 24, 36 ó 48 horas posteriores a una lesión neuronal del SNC, las potenciales terapias pierden progresivamente la capacidad de tratar la lesión. De hecho, algunas de las modalidades terapéuticas, tales como tPA, que tienen un efecto en el período agudo, empiezan a tener contraindicaciones graves y potencialmente mortales según pasa el tiempo después de la lesión.

Días, semanas o meses después de un evento isquémico, durante la fase crónica después de un accidente cerebrovascular, las terapias deben estar dirigidas a promover la recuperación neuronal. La promoción de la recuperación neuronal después de un evento traumático, tal como un accidente cerebrovascular, en el sistema nervioso central implica claramente diferentes fenómenos fisiológicos y estrategias terapéuticas que se emplean en la ventana pre-crónica. Los tratamientos pre-crónicos generalmente implican agentes que tienen como objetivo restablecer el flujo sanguíneo y reducir la muerte celular aguda. En contraste, un agente terapéutico que puede ser administrado eficazmente a las 48 horas o más, o 72 horas o más después de la lesión se diferencia de la terapéutica de la fase aguda por su capacidad para restaurar la función sin alterar el tamaño de la lesión isquémica. En una realización, el tratamiento comienza esencialmente después de la muerte completa después de la lesión de una lesión isquémica del SNC; por "esencialmente muerte completa después de la lesión de una lesión isquémica del SNC" se pretende la muerte de las células del SNC que son directamente resultantes del evento isquémico; otra muerte celular debido a la edad o a terapias (tanto si la terapia está diseñada para abordar la isquemia, como no) no está dentro del alcance de esta definición.

Como se muestra en el presente documento, los presentes inventores demostraron que las neuregulinas son eficaces en la restauración de la función neurológica durante la fase crónica de una lesión neurotraumática. En una realización, la lesión neurotraumática es un accidente cerebrovascular isquémico. Como se describe en el presente documento, los presentes inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que la neuregulina es eficaz cuando se inicia la dosificación durante la fase crónica después de un evento isquémico. Aún más sorprendente es el descubrimiento de que la neuregulina sea eficaz incluso cuando se inicia la dosificación inclusive 7 días después del evento isquémico.

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Los presentes datos muestran que los resultados favorables obtenidos no han ocurrido por los mismos mecanismos que se encuentran que son eficaces en el tratamiento post-isquémico inmediato. El tratamiento con neuregulina durante la fase crónica después del accidente cerebrovascular no altera el tamaño de la lesión isquémica (véase la Tabla 1). Esto demuestra claramente que las fases aguda y semi-aguda de la fisiopatología están completas en estas fases, y que la neuregulina que se administra durante la fase crónica está promoviendo la recuperación neuronal, en lugar de establecer la reperfusión y proteger las neuronas.

Tabla 1 Infarto volumen (%)

bFGF 21,3 ± 3,3

NRG 1,0 g/kg 26,8 ± 3,0

GGF2 6,5 g/kg 27,1 ± 3,7

GGF2 100 g/kg 26,3 ± 3,5

Vehículo 25,0 ± 3,5

Composiciones de la invención:

Como se indicó anteriormente, las neuregulinas son polipéptidos codificados por los genes NRG-1, NRG-2, NRG-3 o NRG-4 y poseen dominios tipo EGF que les permiten unirse y activar los receptores ErbB. Holmes et al. (Science

256: 1205-1210, 1992) han demostrado que el dominio tipo EGF solo es suficiente para unirse y activar el receptor p185erbB2. En consecuencia, cualquier producto polipéptido codificado por el gen NRG-1, NRG-2, NRG-3 o NRG-4,

o cualquier polipéptido tipo neuregulina, por ejemplo, un polipéptido que tiene un dominio tipo EGF codificado por un gen de neuregulina o ADNc ( por ejemplo, un dominio tipo EGF que contiene los subdominios del péptido NRG-1 CC/D o CC/D', como se describe en la patente de EE.UU. Nº 5.530.109, patente de EE.UU. Nº 5.716.930, y patente de EE.UU. Nº 7.037.888; o un dominio tipo EGF como se describe en el documento WO 97/09425) se puede utilizar en los métodos descritos. Una composición de la invención puede estar en forma de dosificación unitaria. Los kits que comprenden las composiciones de la invención y/o las instrucciones de acuerdo con la invención están dentro del alcance de la presente invención también.

Las composiciones de la invención se pueden administrar a los pacientes con un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. La práctica farmacéutica convencional se emplea para proporcionar formulaciones o composiciones para administrar tales composiciones a pacientes o animales de experimentación. Aunque se prefiere la administración intravenosa, se puede emplear cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, parenteral, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, oral, o transdérmica (por ejemplo, mediante la aplicación de un parche adhesivo que lleve una formulación capaz de atravesar la dermis y entrar en el torrente sanguíneo) o la administración tópica.

Las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para la administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para las formulaciones intranasales, en forma de polvos, gotas nasales, o aerosoles. Métodos bien conocidos en la técnica para preparar las formulaciones se encuentran, por ejemplo, en "Remington’s Pharmaceutical Sciences." Las formulaciones para la administración parenteral pueden, por ejemplo, contener excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, o naftalenos hidrogenados. Otros sistemas de administración parenteral potencialmente útiles para la administración de moléculas de la invención incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para la administración en forma de gotas nasales, o como un gel.

Con respecto a las inyecciones intravenosas, los niveles de dosis están generalmente en un intervalo de un valor de la lista siguiente a un valor más alto en la lista: aproximadamente 0,001 mg/kg, aproximadamente 0,01 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. La periodicidad de la dosificación está generalmente en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 24, 48, 72, o 96 horas. En una realización alternativa, la periodicidad de dosificación está generalmente en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, días. En una realización alternativa, la periodicidad de dosificación está generalmente en intervalos de tiempo regulares de aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, ó 5 semanas. Después de un período de tal dosificación, puede ser empleada una dosificación menos frecuente, por ejemplo, mensualmente, cada tres meses, cada cuatro meses o al año.

Se seleccionan dosis transdérmicas para proporcionar niveles fisiológicos esencialmente idénticos, similares o inferiores (plasma, tejidos, LCR) que se consiguen utilizando dosis de inyección.

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Los polipéptidos se pueden administrar como un único agente activo o pueden administrarse en combinación con otros agentes, incluyendo otros compuestos que se pueden encontrar que muestran la misma actividad terapéutica o similar y que están determinados que son seguros y eficaces para tal administración combinada. Otros tales compuestos contemplados para su uso en el tratamiento de lesiones neuronales agudas o semi-agudas incluyen factores hematopoyéticos (por ejemplo, G-CSF y/o GM-CSF); sustancias que tienen actividades trombolíticas, por ejemplo, tPA, estreptoquinasa, uroquinasa, y/o Ancrod; antiagregantes plaquetarios, tales como el ácido acetilsalicílico (aspirina), clopidogrel (Plavix), aspirina combinada con dipiridamol de liberación prolongada (Aggrenox); anticoagulantes tales como la warfarina (Coumadin) o heparina; y/o sustancias que interfieren con la señalización de la apoptosis (por ejemplo, inhibidores de caspasas) o progesterona. Se entiende, sin embargo, que los compuestos anteriores se administran con propósitos preventivos y de antemano al accidente cerebrovascular (por ejemplo, para los agentes antiplaquetarios o anticoagulantes), o durante la fase aguda después de un accidente cerebrovascular (tPA).

Con el fin de evaluar los déficits motores, sensoriales o cognitivos que son tratados de manera efectiva de acuerdo con la presente invención, hay varias herramientas disponibles en la técnica. Los indicios bien conocidos para la controlar la eficacia del tratamiento incluyen el Mini Examen del Estado Mental (MMSE), el Mini Examen del Estado Mental Modificado (3MS), Medición del deterioro funcional (FIM, Prueba de Barthel, puntuación motora de Fugl-Meyer, Prueba de la función motora de Wolf, Prueba de la función de la mano de Jebsen-Taylor, Parte 1 del perfil de salud de Nottingham y Escala de Evaluación motora (MAS), Escala de Evaluación Motora de Sødring (SMES), la escala de equilibrio de Berg (BBS) y Actividades de la Vida diaria de Barthel (AVD), y otras pruebas clínicas, tales como medidas de afectos, habla, deglución, cognición, coordinación motora, fuerza, sensaciones y función autonómica, así como las tasas de supervivencia y las tasas de hospitalización se pueden utilizar para evaluar la progresión de la enfermedad.

Después de una lesión, enfermedad, infección u otra alteración del sistema nervioso, el cerebro, la médula espinal o los nervios periféricos no funcionan correctamente debido a una combinación cualquiera de destrucción intensa, apoptosis, vías y sinapsis alteradas, inflamación, ambiente químico alterado, cambios en el metabolismo de las células y cambios en la transcripción celular y la traducción. Tal como se utiliza en este documento, la expresión "recuperación neuronal" se utiliza para referirse al proceso mediante el cual el sistema nervioso restaura su funcionamiento hacia un estado normal. Este proceso se puede producir por la corrección, la elusión, la inversión o eliminación de cualquiera de las causas mencionadas anteriormente.

Además, se cree ahora que una recuperación neuronal significativa puede ocurrir a través de un proceso conocido como "plasticidad" mediante el cual el sistema nervioso forma nuevas conexiones para compensar o adaptarse a otros cambios. Las lesiones del sistema nervioso central causan la alteración de las conexiones locales y de larga distancia resultantes de la función alterada y la discapacidad. La plasticidad es un evento donde se forman nuevas conexiones entre las neuronas existentes. La plasticidad se ha demostrado que es un mecanismo de recuperación neuronal en los sistemas del SNC incluyendo el sistema visual (Pizzorusso et al,.) y la médula espinal (Fawcett JW (2009) Brain 132: 1417-1418). En la plasticidad, se forman nuevas sinapsis o las sinapsis existentes se fortalecen, se debilitan o se retiran para dar lugar a estructuras y sistemas existentes que compensen los que se han destruido

o alterado en la lesión. Otras formas de plasticidad pueden incluir la alteración de la neuroquímica de las células existentes en cambios de la señalización sináptica directa y la señalización paracrina. La plasticidad también puede tomar la forma de alteración de los niveles de receptores que hacen a las neuronas y a otras células más o menos sensibles a la señalización sináptica directa o paracrina. Estos procesos están bien aceptados como mecanismos de aprendizaje y memoria.

La discusión de documentos, protocolos, materiales, dispositivos, artículos y similares se incluye en esta memoria descriptiva únicamente con el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No se sugiere o se representa que cualquiera o todos estos materiales formaban parte de la base de la técnica anterior o fueran el conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención, antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de la presente solicitud.

Los siguientes ejemplos ayudarán a los expertos en la técnica a comprender mejor la invención y sus principios y ventajas. Se pretende que estos ejemplos sean ilustrativos de la invención y no limiten el alcance de la misma.

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y Métodos:

Preparación de los animales:

Cincuenta (50) Sprague-Dawley machos adultos fueron utilizadas para el estudio (10 animales adicionales fueron pedidos). Todas las ratas fueron alojadas y manipuladas para su evaluación del comportamiento durante siete (7) días antes de la cirugía para los propósitos de aclimatación. Al final del período de tratamiento, las ratas se asignaron al azar y se asignaron a diferentes grupos. A las ratas se les dio un número de identificación único por marcado de la cola. También se trataron diez ratas adicionales.

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Preparación quirúrgica:

Oclusión de la arteria cerebral media (MCAO), Modelo Tamura:

Este modelo de lesión quirúrgica en la rata es un modelo bien aceptado de accidente cerebrovascular en el campo (Tamura et al, 1981, J Cereb Blood Flow Metab. l (l): 53-60; Tamura et al, 1981, J Cereb Blood Flow Metab. l (l): 619). Fueron hechos infartos cerebrales focales por la oclusión permanente de la arteria cerebral media proximal derecha (MCA) usando una modificación del método de Tamura et al. Ratas macho Sprague-Dawley (300-400 g en el momento de la cirugía) se anestesiaron con 2-3% de halotano en la mezcla de N2O:O2 (2:1), y se mantuvieron con 1-1,5% de halotano en la mezcla de N2O:O2 (2:1). El músculo temporal se dividió y se reflejó a través de una incisión realizada a medio camino entre el ojo y el canal del tímpano. El MCA proximal se expuso a través de una craniectomía subtemporal sin quitar el arco cigomático y sin transección del nervio facial. A continuación, la arteria se ocluye por coagulación microbipolar desde justo el tracto proximal al olfativo a la vena cerebral inferior, y se corta transversalmente. La temperatura corporal se mantuvo a 37,5ºC ± 0,5ºC durante todo el procedimiento. Se dio por vía intraperitoneal (i.p.) cefazolina (40 mg/kg; Baxter, Lote 06014,1, Exp. Ene 2009) un día antes de MCAO y justo después de MCAO para prevenir las infecciones. Se le dio burprenorfina (NDC 12496-0757-1, Lote Nº 700Y02, exp 1 enero, 2010) por vía subcutánea (0,05-0,1 mg/kg) antes de la cirugía MCAO como analgesia.

Preparación de compuesto y dosificación:

GGF2 y NRG-1 (NRG-EGF):

Las soluciones madre se prepararon en Acorda Therapeutics y se almacenaron a 0-5ºC. Las dosis se realizaron como se describe a continuación:

Clonación, expresión y purificación de NRG-1 [dominio NRG1b2 EGF (156Q)]

ADN: el dominio NRGIb2 EGF fue clonado a partir de ADNc de cerebro humano y clonado en el vector pet 15b (Novagen cat Nº. 69661-3) usando los sitios de restricción NdeI y BamHI. La proteína resultante es un marcador de 6,92 kDa + ~ 3kDa His (= 9,35 kDa).

Secuencia de ADN del clon NRG1b2 EGF pet 15

Las secuencias subrayadas son los sitios de clonación (NdeI y BamHI)

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La proteína traducida final del vector petl5b se muestra más abajo. El dominio EGF está subrayado.

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pI teórico/PM: 7,69/9349,58

Expresión de proteínas

El clon se transformó en células B121 para la expresión de proteínas utilizando el Sistema Overnight Express Autoinduction System 1 (Novagen) en medio LB a 25ºC durante 24 horas. La expresión es principalmente en cuerpos de inclusión insolubles.

Replegamiento de proteínas: Adaptado del Kit de replegamiento de proteínas de Novagen, 70123-3.

Purificación de proteínas: La proteína se carga en una columna de intercambio aniónico DEAE a 2,5 ml/min. El fragmento de NRG-1 se mantiene en el flujo a través, mientras que los contaminantes se unen y se eluyen en una sal más alta. El tampón de carga y lavado es Tris 50 mM pH 7,9 y el tampón de elución es Tris 50 mM pH 7,9 con NaCl 1M. El flujo a través se reúne y se concentra con Centriprep YM-3 de Millipore.

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-A la temperatura ambiente, preparar el volumen calculado de tampón de solubilización 1 x suplementado con 0,3% de N-laurilsarcosina (hasta 2% se puede utilizar si es necesario en una mayor optimización) (tampón 300 mg/100 ml) y DTT 1 mM.

-Añadir la cantidad calculada de tampón de solubilización 1 x de la etapa 2 a los cuerpos de inclusión y mezclar suavemente. Los residuos de gran tamaño pueden ser disueltos mediante pipeteo repetido.

-Incubar en el agitador refrigerador a 25ºC, 50-100 rpm durante 4-5 horas.

-Aclarar por centrifugación a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

C. Protocolo de diálisis para el replegamiento de la proteína

-Preparar el volumen requerido de tampón para la diálisis de la proteína solubilizada. La diálisis se debe realizar con al menos 2 cambios de tampón, mayor de 50 veces el volumen de la muestra. -Diluir el tampón de diálisis 50 x a 1 x en el volumen deseado y completar con DTT 0,1 mM. -Dializar durante al menos 4 horas a 4ºC. Cambiar el tampón y continuar. Dializar durante 4 horas o más. -Preparar tampón de diálisis adicional tal como se determina en el paso 1, pero omitiendo TDT. -Continuar la diálisis a través de dos cambios adicionales (min. 4 horas cada uno), con tampón de diálisis sin TDT.

D. Tampón de replegamiento redox para promover la formación de un enlace disulfuro -Preparar un tampón de diálisis que contiene glutatión reducido 1 mM (1,2 g/4L) y glutatión oxidado 0,2 mM (0,48

g/4L) en tampón de diálisis 1 x. El volumen debe ser 25 veces mayor que el volumen de la muestra de proteína solubilizada. Enfriar a 4ºC. -Dializar la proteína replegada desde el paso 1 toda la noche a 4ºC. Purificación Todos los procedimientos se realizaron a 4ºC. Productos químicos: Hidrocloruro de Trizma (Sigma T5941-500G) Solución de cloruro de sodio 5M (Sigma S6546-4L) Hidróxido de sodio 10 N (JT Baker 5674-02)

E. Purificación en Columna anión DEAE HiPrep 16/10 de 20 mI (GE Healthcare) Tampón A: Tris-HCl 50 mM pH 8,0 Tampón B: Tris-HCl 50 mM con NaCl 1M pH 8,0 Equilibración de la columna: Tampón A-5CV, Tampón B-5CV, Tampón A-10CV -Cargar 50 ml de muestra por cada procesamiento en la columna de 20 ml a 2,0 ml/min (NRG-1 está en el flujo a

través). -Lavar columna de 20 ml con 5CV de tampón A columna de 20 ml con gradiente a 100% de B con 5CV. Esto es para eluir los contaminantes. -Limpiar con 10CV del 100% de tampón B. -Equilibrar con 15CV de Tampón A -Analizar las fracciones con un SDS-PAGE tinción de plata -Agrupar las fracciones con NRG-1 (10 kDa)

F. Concentración de NRG-1 -Concentrar con un concentrador Millipore Centriprep 3000 de MWCO de 15 ml (ULTRACEL YM-3, 4320) -Utilizar el ensayo de proteínas de Lowry modificado para determinar la concentración.

G. Eliminación de His-Tag

La eliminación de His-Tag se lleva a cabo con un kit de captura de escisión de trombina de Novagen (Nº Cat 690223). Sobre la base de pruebas anteriores, las mejores condiciones son la temperatura ambiente durante 4 horas con trombina a 0,005U de enzima por l para cada 10 μg de la proteína NRG-1. Después de cuatro horas de incubación,

5 añadir 16μl de suspensión de estreptavidina agarosa por unidad de enzima trombina. Agitar la muestra durante 30 minutos a temperatura ambiente. Recuperar el NRG-1 a través de filtración por centrifugación o filtración estéril (dependiendo del volumen). La escisión completa se determina con un EGF y anti-His western.

H. Almacenamiento en tampón final

Almacenado en 1 x PBS con BSA al 0,2% a 4ºC.

10 Expresión y purificación de GGF2

Para la clonación y para obtener la información de fondo para GGF2, véase el documento de patente de EE.UU. Nº

5.530.109. La línea celular se describe en la patente de EE.UU. Nº 6.051.401.

Línea celular CHO (Alpha2HSG)-GGF: Esta línea celular fue diseñada para producir cantidades suficientes de fetuina (alpha2HSG humana) para soportar altas velocidades de producción de rhGGF2 en condiciones libres de

15 suero.

Las células CHO (dhfr) se transfectaron con el vector de expresión que se muestra a continuación (pSV-AHSG). Las células estables se cultivaron bajo presión de ampicilina. Se designó la línea celular (dhfr-/α2HSGP). Las células dhfr-/α2HSGP luego se transfectaron con el vector pCMGGF2 que se muestra a continuación que contiene la secuencia de codificación para GGF2 humano utilizando el reactivo DMRIE-C lípido catiónico (Life Technologies Nº

20 10459-014).

PM SV40 temprano

Líneas celulares estables y altas productoras se obtuvieron bajo protocolos estándar utilizando metotrexato (100 nM, 200 nM, 400 nM, 1 M) a intervalos de 4-6 semanas. Las células fueron deshabituadas gradualmente del medio que contenía suero. Los clones se aislaron mediante metodologías estándar de dilución limitante. Los detalles de los

25 requisitos de los medios se encuentran en los informes mencionados anteriormente.

Para mejorar la transcripción, la secuencia de codificación de GGF2 fue colocada después de la secuencia intermedia de EBV-I BMLF (MIS). Véanse las figuras siguientes.

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Tabla 3: Medio 2

Elemento: Proveedor Número de Catálogo Concentración final

CD-CHO: Invitrogen 10743-029 50% (-50 ml primero)

HyQ SFX-CHO: HyClone SH30187.02 50% (-50 ml primero)

FeSO4.EDTA: Sigma F-0518 1x (10 ml/L)

L-Glutamina: Cellgro 25-005-CI 4 mM (20 ml/L)

Insulina Humana Recombinante: Sigma I-9278 290 U/L (1 ml/L)

Aminoácido no esencial: Cellgro 25-025-CI 1x (10 ml/L)

Soja-HySoy Peptona Tipo 4: Sigma P0521 Polvo -hecho 20X en CD-CHO (50 ml/L)

Gentamicina: Invitrogen 15750-078 100pg (2 ml/L)

Protocolo de purificación para GGF2 Todos los procedimientos se realizaron a 4ºC.

5 Productos químicos: Acetato de sodio Ácido acético glacial (para ajuste de pH) NaOH 10 N (para ajuste del pH) NaCl

10 Sulfato de sodio L-arginina (JT Baker Nº cat: 2066-06) Manitol (JT Baker Nº cat: 2553-01)

Material de partida: sobrenadante del medio acondicionado. Ajustar el pH a 6,5. Paso 1:

15 Cromatografía de captura-intercambio catiónico HiPrep SP 16/10 (Amersham Biosciences) Equilibrado de la columna: Tampón A -5CV, tampón B -5CV, tampón 15% B -5CV Tampón A: acetato sódico 20 mM, pH 6,0 Tampón B: acetato sódico 20 mM, pH 6,0, NaCl 1M

20 Cargar la muestra a 2 ml/min con una carga continua durante la noche si es posible. La unión es mejor con carga continua.

Capacidad máxima de una muestra de partida: 5 mg de GGF2/ml medio Caudal: 3 ml/min Primer lavado: 15% de B, 10CV Segundo lavado: 35% de B, 10CV

5 Elución GGF2: 60% de B, 8CV

Lavado de la columna: 100% de B, 8CV Tampones: Composición Conductividad Uso 15% B acetato de Na 20 mM, pH 6,0, NaCl 150 mM Preequilibrado

10 primer lavado 35% B acetato de Na 20 mM, pH 6,0, 350 mM NaCl segundo lavado 60% B acetato de Na 20 mM, pH 6,0, 600 mM NaCl GGF2 elución 100% B acetato sódico 20 mM, pH 6,0, NaCl 100 mM 88 mS/cm Columna de lavado

15 Paso 2:

Refinamiento -Cromatografía de filtración en gel Sephacryl S200 26/60 Tampón de elución: acetato de Na 20 mM, sulfato de sodio 100 mM, 1% de manitol, L-arginina 10 mM, pH

6,5

20 Conductividad del tampón: Muestra: combinación de elución SP GGF2 concentrada hasta ~ AU280 1.0 Caudal: 1,3 ml/min Elución de pico: a ~ 0,36CV del comienzo de la inyección

Paso 3: Eliminación de ADN y endotoxina -filtración a través de la membrana de Intercept Q.

25 Tampón de preequilibrado: acetato de Na 20 mM, sulfato de sódio 100 mM, 1% de manitol, L-arginina 10 mM, pH 6,5 Recoger el flujo a través Etapa 4: formulación final y preparación de muestras Añadir L-arginina 90 mM adicional a la muestra

30 Concentrar Filtrar estéril El artículo vehículo/control que se utiliza en el presente documento es albúmina de suero bovino al 0,2% (BSA),

fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,6 o fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,6, como se indica. FGF básica: 35 El bFGF (PeproTech Inc., 100-18B, Lote 1206CY08 G2407) se reconstituyó según las indicaciones de PeproTech a una solución madre de 0,1 mg/ml y se almacenó a -20ºC antes de su uso. En el día de la inyección, 100 g/ml de solución de BSA (Roche Diagnostics, Lote 12403328 exp. 31 de Mar, 2008) se hizo como diluyente, para hacer una concentración final de bFGF de 20 g/ml (1 g/50 l). Este material fue utilizado solamente en el estudio 1.

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Ejemplo 5: Tratamiento de accidente cerebrovascular y de la consiguiente paralización de la mano derecha

Un paciente se presenta al servicio de urgencias con una parálisis de la mano derecha. Tras la evaluación y la visualización de la formación de imágenes se determina que el paciente ha sufrido un accidente cerebrovascular isquémico. El paciente recibe tPA de acuerdo con los métodos aprobados, y el flujo sanguíneo se restaura a través de la trombosis. Sin embargo, una semana después del tratamiento con tPA, el paciente tiene parálisis residual de la mano derecha tal como se mide por medidas neurológicas estándar de la actividad motora de la mano. Este paciente se trata con neuregulina (de 0,01 a 1,0 mg/kg, IV) una vez por semana durante 4 semanas. La mejora de la función de la mano se mide periódicamente por un neurólogo u otro médico con pruebas neurológicas estándar, incluyendo el dinamómetro y otra prueba de fuerza. El paciente recupera satisfactoriamente la función sensorial y motora en la mano derecha sin el uso concomitante de terapia ocupacional o física. Esta recuperación es mejor que se habría predicho clínicamente sin terapia con neuregulina. Esta recuperación es mejor que se habría predicho clínicamente sin el uso de terapia ocupacional o física.

Ejemplo 6: Tratamiento de accidente cerebrovascular isquémico

Un paciente se presenta a un centro médico con signos y síntomas de un accidente cerebrovascular isquémico. Se encontró que tenía parálisis de su lado izquierdo. El paciente no llega a tiempo para la terapia de revascularización. Tras la evaluación clínica se encuentra que se ha producido alguna lesión cerebral. Tres días después de la lesión el paciente es evaluado neurológicamente y se demuestra que tiene déficits sensoriales y motores medibles. Este paciente se trata con neuregulina en una dosis de entre 0,01 y 1,0 mg/kg por dosis, por vía intravenosa cada día durante cuatro semanas; a partir de entonces recibe dosis semanales durante seis meses. También recibe terapia física. La mejoría se notó ya en la segunda semana de tratamiento; la recuperación continúa durante todo el período de la terapia de la neuregulina. El paciente recupera satisfactoriamente la función sensorial y motora de su lado izquierdo. Esta recuperación se ve como excelente; y es mucho mejor que la que se había predicho clínicamente sin el uso de la terapia física por sí sola.

Ejemplo 7 : Tratamiento de accidente cerebrovascular isquémico

Un paciente se presenta al servicio de urgencias con una parálisis de la mano izquierda. El paciente informa de que el problema con su mano comenzó "hace más de una semana". Tras la evaluación y la formación de imágenes se determina que el paciente ha sufrido un accidente cerebrovascular isquémico. El paciente no recibe tPA. En el examen neurológico se encuentra que el paciente tiene parálisis residual de la mano izquierda, como se mide por medidas neurológicas normales de la actividad motora de la mano; el paciente tiene un déficit sensorial también. El paciente se niega a participar en la terapia física u ocupacional. El paciente se trata con neuregulina (de 0,01 a 1,0 mg/kg, IV) una vez por semana durante 12 semanas. La mejora de la función de la mano se mide periódicamente por un neurólogo u otro médico con pruebas neurológicas estándar, incluyendo el dinamómetro y otras pruebas de fuerza. La mejoría se notó ya en la segunda semana de tratamiento; una recuperación continúa durante todo el período de la terapia de la neuregulina. El paciente recupera satisfactoriamente la función motora y sensitiva en su mano izquierda sin el uso concomitante de terapia ocupacional o física. Esta recuperación es mejor que se habría predicho clínicamente sin terapia con neuregulina. Esta recuperación es mejor que se habría predicho clínicamente sin el uso de terapia ocupacional o física.

Ejemplo 8: Lesión cerebral traumática

Un paciente se presenta en un centro médico después de un evento traumático con signos y síntomas de una lesión en la cabeza y lesión cerebral resultante. Un cierto nivel de lesión cerebral se ha producido según la evaluación de imágenes y las pruebas neurológicas incluyendo la Escala de Glasgow Coma y pruebas neurocognitivas más detalladas. Cinco días después de la lesión, el paciente es evaluado neurológicamente y se demuestra que tiene déficits sensoriales y motores medibles. Este paciente se trata con neuregulina a una dosis de entre 0,01 y 1,0 mg/kg por dosis, por vía intravenosa durante 3 meses. Inicialmente, el paciente no está dispuesto a participar en la terapia física. La mejora de la función cerebral se nota ya en la primera semana de tratamiento; la recuperación continúa durante todo el período de la terapia con neuregulina. Esta recuperación es mejor que se habría predicho clínicamente sin terapia con neuregulina. A partir de los tres meses, el paciente comienza a recibir neuregulina una vez por semana, y también comienza a recibir terapia física. Las terapias concomitantes continúan durante hasta un año desde el día de la lesión original. En el aniversario de la lesión del paciente su recuperación es extraordinaria. Clínicamente es mucho mejor que la que habría sido anticipada en ausencia de cualquier terapia y es también mejor que la que se habría esperado con la utilización de la terapia física.

Ejemplo 9: Tratamiento de hemorragia cerebral:

Un paciente se presenta en un centro médico con signos y síntomas compatibles con un accidente cerebrovascular isquémico o hemorragia cerebral. El paciente se estabiliza. Tras la evaluación neurológica se encuentra que se ha producido algún nivel de lesión cerebral. Una semana después de la lesión se evalúa de nuevo al paciente neurológicamente y se demuestra que tiene déficits sensoriales y/o motores medibles. Este paciente se trata con neuregulina a una dosis de entre 0,01 y 1,0 mg/kg al día, por vía intravenosa durante 10 días, seguido de la administración de esta dosis semanalmente durante 2 meses, momento en el que se interrumpe todo el tratamiento.

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