ES2730972T3

ES2730972T3 - Estructura cristalina de sortilina humana y sus usos para identificar ligandos de sortilina

Info

Publication number: ES2730972T3
Application number: ES09737762T
Authority: ES
Inventors: Petersen Jens Claus Munck; Poul Nissen; Madsen Peder Søndergaard; Høgh Quistgaard Esben Meldgaard; Grøftehauge Morten Keller; Thirup Søren Skou; Cramer Jacob Flyvholm; Andersen Jacob Lauwring
Original assignee: H Lundbeck AS
Current assignee: H Lundbeck AS
Priority date: 2008-04-27
Filing date: 2009-04-27
Publication date: 2019-11-13
Anticipated expiration: 2029-04-27
Also published as: US20110160439A1; US8377701B2; KR20110018324A; CN102131826B; EP2274327B1; EP2274327A2; WO2009132656A3; JP5715045B2; KR101614558B1; CN102131826A; WO2009132656A2; JP2011518791A; HK1160148A1

Abstract

Un cristal de un complejo de sSortilina con un ligando; en donde el cristal se selecciona del grupo que consiste en: (a) un cristal tetragonal de sSortilina y el ligando: prodominio de NGF, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en la SEQ ID NO. 1 (aminoácidos 78 a 755), fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial P41212 con dimensiones de la celdilla unidad de a=b=159.97 Å, c=106.55 Å, α=ß=γ=90°; (b) un cristal tetragonal de sSortilina y el ligando: péptido-4, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en la SEQ ID NO. 1 (aminoácidos 78 a 755), fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial P41212 con dimensiones de la celdilla unidad de a=b=159.37 Å, c=108.72 Å, α=ß=γ=90°; (c) un cristal monoclínico de la sSortilina y el ligando: neurotensina, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en el dominio luminal entero (aminoácidos 1 a 758) pero no el segmento transmembrana o la cola citoplasmática de la Sortilina, fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial C2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=145.8 Å, b=74.5 Å, c=108.3 Å, α=γ=90°, ß=131.87°; (d) un cristal monoclínico de la sSortilina y el ligando: neurotensina, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en el dominio luminal entero (aminoácidos 1 a 758) pero no el segmento transmembrana o la cola citoplasmática de la Sortilina, fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial C2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=162.1 Å, b=78.7 Å, c=111.1 Å, α=γ=90°, ß=126.61°; y (e) un cristal monoclínico de la sSortilina y el ligando: sSort-propéptido, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en el dominio luminal entero (aminoácidos 1 a 758) pero no el segmento transmembrana o la cola citoplasmática de la Sortilina, fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial C2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=162.1 Å, b=78.1 Å, c=111.7 Å, α=γ=90°, ß=127.20°.

Description

DESCRIPCIÓN

Estructura cristalina de sortilina humana y sus usos para identificar ligandos de sortilina

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a la estructura tridimensional de un receptor con dominio Vps10p descrito por las coordenadas atómicas obtenidas por cristalografía de rayos X del receptor humano sortilina. La descripción se refiere además a métodos de crecimiento de cristales de sortilina. Basándose en la estructura tridimensional, se obtiene información detallada sobre las funcionalidades específicas de la sortilina. La descripción se refiere además a métodos para la selección, identificación y/o diseño de ligandos específicos de receptores con dominio Vps10p basados en la estructura cristalina de la sortilina. La presente descripción se refiere además a la preparación y uso de dichos ligandos para inhibir la formación de un complejo ternario entre sortilina, p75NTR y proneurotrofinas tales como pro-NGF y proBDNF. La descripción se refiere además a la identificación de ligandos capaces de actuar como agonistas de la sortilina. La presente descripción también se refiere a la preparación y uso de dichos ligandos para tratar el daño o los trastornos de enfermedades de los sistemas nerviosos central y periférico.

Antecedentes de la invención

La sortilina denominada a veces también receptor de neurotensina 3 (NTR3), glicoproteína 95 (Gp95) o receptor de NT de 100 kDa de Swiss Prot de ID N° Q99523 es el miembro arquetípico de una familia de receptores neuronales (1-3) de mamíferos definida por el dominio único Vps10p (Vps10p-D) que, entre otros ligandos, se une a factores neurotróficos y a neuropéptidos (4-8). Este dominio constituye la parte luminal completa de la sortilina (sSortilina) y se activa para la unión del ligando por la escisión del propéptido enzimático (4, 5). La sortilina es un receptor tipo 1 multifuncional capaz de endocitosis, así como de clasificación intracelular (9-11), y como se ha mostrado recientemente, también se implica en la señalización al desencadenar la inducción de proneurotrofinas de la apoptosis neuronal mediada por p75NTR (6, 7, 12, 13). La sortilina es sintetizada como una proproteína, que se convierte en sortilina madura por escisión enzimática y eliminación de un propéptido N-terminal corto. Solo el receptor maduro se une a los ligandos y, es interesante que todos sus ligandos conocidos, p. ej., neurotensina (NT), lipoproteína lipasa, las proformas del factor de crecimiento nervioso p (proNGF) y el factor neurotrófico derivado del cerebro (proBDNF), la proteína asociada al receptor (RAP), y su propio propéptido, compiten por la unión (5-7, 10), lo que indica que los diversos ligandos se dirigen a un sitio de unión compartido o parcialmente compartido. NT es un tridecapéptido, que se une a la sortilina, SorLA (otro receptor Vps10p-D) y los dos receptores acoplados a proteína G NTR1 y NTR2 (4, 14-16). La función fisiológica de la NT en relación con la sortilina no se ha aclarado por completo (17), pero la NT es una herramienta importante, ya que inhibe la unión de todos los demás ligandos al Vps10p-D de la sortilina.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una estructura cristalina como se expone en las reivindicaciones

En un aspecto principal, la presente descripción se refiere a un cristal que comprende

a) un polipéptido de SEQ ID NO. 1;

b) una variante de secuencia de dicho polipéptido en donde la variante tiene al menos 60% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID NO. 1;

c) un fragmento que comprende al menos 200 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), en donde el fragmento presenta actividad de sortilina,

d) cualquiera de a) a c) en complejo con al menos un ligando.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere además a un método de crecimiento de un cristal que comprende las etapas de:

a. obtener una composición que comprende de 4.5 a 5.5 mg/ml de un polipéptido de SEQ ID NO. 1 o uno de sus fragmentos o variantes, en un tampón que contiene Tris-HCl 50 mM, pH 7.9 y NaCl 150 mM,

b. mezclar dicha composición con neurotensina en una relación molar de:

i. 1:1.5 a 1:15 (sSortilina:NT) o,

ii. 1:4 (sSortilina:propéptido),

c. someter volúmenes iguales de dicha composición y una solución de cristalización respectivamente, conteniendo dicha solución de cristalización

i. 18-21% p/v de PEG 6000, y

ii. 0-15% de glicerol, y

iii. Tris-HEPES pH 7.2-7.8 (Tris 40-93 mM y HEPES 100 mM) o Tris-HCl 100 mM pH 7.9, 3-6% de glicerol y iv. NaCl 300-900 mM o C3H2Na2O4150-400 mM en donde dicho C3H2Na2O4 se ajusta a pH 6-7.5 mediante ácido malónico, o LiSO4300-500 mM o KCl 500-700 mM y,

d. obtener cristales que comprenden la SEQ ID NO. 1 o uno de sus fragmentos o variantes.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un medio de almacenamiento de datos legible por ordenador que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con al menos una parte de las coordenadas de estructura de la sortilina como se indica en cualquiera de las figuras 17 a 20.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere al uso de coordenadas atómicas como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A en un método de identificación de un ligando capaz de unirse a uno o más de:

a. sitio de unión 1, o

b. sitio de unión 2, o

c. sitio de unión 3,

o un fragmento o variante de a a c.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método de identificación de un ligando capaz de unirse al sitio de unión 1 y/o al sitio de unión 2 y/o al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) generar la estructura espacial del sitio de unión en una pantalla de ordenador usando coordenadas atómicas como se presentan en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A, b) generar potenciales ligandos con su estructura espacial en la pantalla del ordenador, y

c) seleccionar ligandos que pueden unirse a al menos 1 resto de aminoácido del conjunto de sitios de interacción de unión sin interferencia estérica.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método asistido por ordenador para identificar un ligando de sortilina capaz de unirse al sitio de unión 1 y/o al sitio de unión 2 y/o al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, que usa un ordenador programado que comprende un procesador, un sistema de almacenamiento de datos, un dispositivo de entrada de datos y un dispositivo de salida de datos, que comprende las siguientes etapas:

a) introducir en el ordenador programado a través de dicho dispositivo de entrada, datos que comprenden: coordenadas atómicas de un subconjunto de los átomos de dicha sortilina, generando así un conjunto de datos de criterios; en donde dichas coordenadas atómicas se seleccionan de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A,

b) comparar, usando dicho procesador, el conjunto de datos de criterios con una base de datos computarizada de estructuras químicas orgánicas de bajo peso molecular y fragmentos de péptidos almacenados en el sistema de almacenamiento de datos; y

c) seleccionar de dicha base de datos, usando métodos informáticos, una estructura química que tenga una parte que sea estructuralmente complementaria al conjunto de datos de criterios y que esté libre de interferencia estérica con el receptor sortilina.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a un método para identificar un ligando, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) seleccionar un ligando potencial usando coordenadas atómicas junto con modelización por ordenador, en donde dichas coordenadas atómicas son las coordenadas atómicas presentadas en cualquiera de las figuras 17 a 20 o en donde las coordenadas atómicas se seleccionan de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A, mediante acoplamiento de ligandos potenciales en un conjunto de sitios de interacción de unión en el sitio de unión 1 y/o el sitio de unión 2 y/o sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, generada dicha interacción de unión por la modelización por ordenador y seleccionando un ligando potencial capaz de unirse a al menos un aminoácido en dicho conjunto de sitios de interacción de unión de la sortilina,

b) proporcionar dicho ligando potencial y dicho receptor sortilina

c) poner en contacto el ligando potencial con dicho receptor sortilina, y

d) detectar la unión de dicho receptor sortilina por el ligando potencial.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para identificar un ligando potencial del sitio de unión 1 y/o el sitio de unión 2 y/o el sitio de unión 3 de la sortilina, o uno de sus fragmentos o variantes, comprendiendo dicho método las etapas de

a) introducir en un ordenador, información derivada de coordenadas atómicas que definen una conformación del sitio de unión 1 y/o el sitio de unión 2 y/o el sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, basado en la determinación de la estructura tridimensional, mediante la cual un programa informático usa o muestra en la pantalla del ordenador la estructura de dicha conformación; en donde dichas coordenadas atómicas se seleccionan de la estructura tridimensional como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de cualquiera de las estructuras tridimensionales representadas por cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A;

b) generar una representación tridimensional del sitio de unión 1, el sitio de unión 2 o el sitio de unión 3 de la sortilina mediante dicho programa informático en una pantalla de ordenador;

c) superponer un modelo de un ligando potencial sobre la representación de dicho sitio de unión 1, sitio de unión 2 y sitio de unión 3,

d) evaluar la posibilidad de enlace y la ausencia de interferencia estérica del ligando potencial con el sitio de unión 1 (el sitio de unión de neurotensina de alta afinidad), sitio de unión 2 (el sitio de unión de neurotensina de baja afinidad), sitio de unión 3 (el sitio de unión de pro-neurotrofina) de la sortilina o un fragmento o una variante de la misma;

e) incorporar dicho compuesto ligando potencial en un ensayo de unión de dicho receptor sortilina y

f) determinar si dicho ligando potencial inhibe la unión de un ligando competidor seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 19 a 241 de la SEQ ID NO 6 (proNGF), restos de aminoácidos 19 a 121 de la SEQ ID NO 6 (pro dominio de NGF), restos de aminoácidos 19 a 246 de la SEQ ID NO 7 (proBDNF), restos de aminoácidos 19 a 127 de la SEQ ID NO 7 (pro dominio de BDNF), restos de aminoácidos 17 a 257 de la SEQ ID NO 8 (proNT3), restos de aminoácidos 17 a 140 de la SEQ ID NO 8 (pro dominio NT3), restos de aminoácidos 25 a 210 de la SEQ ID NO 9 (proNT4/5), restos de aminoácidos 25 a 80 de la SEQ ID NO 9 (prodominio NT4/5), SEQ ID NO. 10 (Neurotensina), SEQ ID NO. 11 (PYIL), restos de aminoácidos 11 a 13 de la SEQ ID NO. 10 (YIL) y SEQ ID NO. 12 (NT69L).

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para construir un modelo atómico de una molécula de proteína receptora con dominio Vps10p que comprende las etapas de:

a. identificar un receptor con dominio Vps10p, o un fragmento o variante del mismo, que tenga al menos 20% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1, y

b. usar las coordenadas atómicas como se presentan en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de proteína de no más de 3 A,

para obtener un modelo atómico del receptor con dominio Vps10p identificado mediante modelización por homología.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un ligando identificado por el método descrito antes en la presente memoria, dicho ligando capaz de unirse a al menos un punto de interacción de dicho sitio de unión 1, comprendiendo dichos puntos de interacción X1, X2, X3, X4, R1, R2, J1, J2 y J3 de la SEQ ID NO. 1 en donde

X1 comprende los restos de aminoácidos R325, S316 y Y351, y

en donde

X2 comprende el carbonilo de la cadena principal de Y351 y en donde

X3 comprende la cadena principal de I353 y en donde

X4 comprende el grupo amino de K260 y en donde

R1 comprende los restos de aminoácido I327, F314, Y351, I353 y M363 y

en donde

R2 comprende F350 y al menos un aminoácido del bucle que comprende los restos de aminoácidos T397 a E401 y en donde

J1 comprende S305 y en donde

J2 comprende la amida de la cadena principal de F306 y en donde

J3 comprende el carbonilo de la cadena principal de F306.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un medicamento que comprende un inhibidor de sortilina identificado como se ha descrito antes en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere al uso de al menos un ligando identificado por el método descrito anteriormente en la presente memoria, para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso en un individuo. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método de tratamiento de una afección patológica en un sujeto que comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento descrito anteriormente en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para prevenir la apoptosis en una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a la molécula de ligando como se ha definido antes en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para mejorar la supervivencia de una célula neuronal de mamífero, comprendiendo dicho método exponer dicha célula neuronal a la molécula de ligando como se ha definido antes en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para expandir una composición de células de mamífero, que comprende administrar a dicha composición la molécula de ligando como se ha definido antes en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para diferenciar una composición de células de mamíferos, que comprende administrar a dicha composición la molécula de ligando como se ha definido antes en la presente memoria.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un anticuerpo capaz de unirse al sitio de unión 1 de la SEQ ID NO. 1.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un anticuerpo capaz de unirse al sitio de unión 2 de la SEQ ID NO. 1.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un anticuerpo capaz de unirse al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo como se ha descrito antes en la presente memoria y un conjugado seleccionado del grupo que consiste en: un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo radiactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina o estreptavidina o un antígeno; una enzima capaz de producir un producto detectable.

Descripción detallada de la descripción

Definiciones

Adyuvante: cualquier sustancia cuya mezcla con un determinante inmunogénico/antígeno administrado aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmunitaria a dicho determinante.

Afinidad: La interacción de la mayoría de los ligandos con sus sitios de unión se puede caracterizar en términos de una afinidad de unión. En general, la unión del ligando de alta afinidad es resultado de una mayor fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor, mientras que la unión del ligando de baja afinidad implica menos fuerza intermolecular entre el ligando y su receptor. En general, la unión de alta afinidad implica un tiempo de permanencia más largo para el ligando en su sitio de unión al receptor que en el caso de la unión de baja afinidad. La unión de alta afinidad de los ligandos a los receptores a menudo es fisiológicamente importante cuando parte de la energía de unión se puede usar para causar un cambio conformacional en el receptor, dando como resultado un comportamiento alterado de un canal iónico o enzima asociados.

Un ligando que se puede unir a un receptor, alterar la función del receptor y desencadenar una respuesta fisiológica se denomina agonista de ese receptor. La unión del agonista a un receptor se puede caracterizar tanto en términos de cuánta respuesta fisiológica se puede activar como de la concentración del agonista que se requiere para producir la respuesta fisiológica. La unión del ligando de alta afinidad implica que una concentración relativamente baja de un ligando es adecuada para ocupar al máximo el sitio de unión de un ligando y desencadenar una respuesta fisiológica. La unión de baja afinidad implica que se requiere una concentración relativamente alta de un ligando antes de que el sitio de unión esté ocupado al máximo y se logre la máxima respuesta fisiológica al ligando. La unión del ligando se caracteriza a menudo en términos de la concentración del ligando a la que están ocupados la mitad de los sitios de unión al receptor, conocida como la constante de disociación (kd).

Alcohol: Una clase de compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos hidroxilo (OH). En este contexto, un grupo hidrocarbonado saturado o insaturado, ramificado o no ramificado que se sitúa como sustituyente en una molécula más grande.

Grupo alicíclico: la expresión "grupo alicíclico" significa un grupo hidrocarbonado cíclico que tiene propiedades similares a las de los grupos alifáticos.

Grupo alifático: en el contexto de la presente descripción-descripción, la expresión "grupo alifático" significa un grupo hidrocarbonado lineal o ramificado, saturado o insaturado. Este término se usa para abarcar grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, por ejemplo.

Grupo alquilo: la expresión "grupo alquilo" significa un grupo hidrocarbonado lineal o ramificado saturado que incluye, por ejemplo, metilo, etilo, isopropilo, t-butilo, heptilo, dodecilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexilo y similares. Grupo alquenilo: la expresión "grupo alquenilo" significa un grupo hidrocarbonado insaturado, lineal o ramificado con uno o más dobles enlaces carbono-carbono, tal como un grupo vinilo.

Grupo alquinilo: la expresión "grupo alquinilo" significa un grupo hidrocarbonado insaturado, lineal o ramificado con uno o más enlaces triples carbono-carbono.

Anfifílico: sustancia que contiene grupos polares, solubles en agua y no polares, insolubles en agua.

Agonista: un agonista es un compuesto capaz de aumentar la actividad de un efector tal como un receptor. Específicamente, un agonista de sortilina es un compuesto capaz de unirse a uno o más de los sitios de unión 1,2 y 3, induciendo así la misma respuesta fisiológica que un compuesto de ligando agonista endógeno dado.

Antagonista: un antagonista es un compuesto capaz de disminuir la actividad de un efector tal como un receptor. Específicamente, un antagonista de sortilina es un compuesto capaz de unirse a uno o más de los sitios de unión 1, 2 y 3, inhibiendo así la unión de otro ligando, inhibiendo así una respuesta fisiológica.

ARN antiparalelo: una molécula de ARN capaz de causar silenciamiento génico mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.

ADN antiparalelo: una molécula de ADN capaz de causar silenciamiento génico mediante la unión específica a una molécula de ARNm de interés.

Apoptosis: la apoptosis es un proceso de suicidio por una célula en un organismo multicelular. Es uno de los principales tipos de muerte celular programada (PCD) e implica una serie de eventos bioquímicos orquestados que conducen a una morfología celular característica y la muerte.

Inhibidor de apoptosis: cualquier compuesto capaz de disminuir el proceso de apoptosis.

Grupo aromático: la expresión "grupo aromático" o "grupo arilo" significa un grupo hidrocarbonado aromático mono o policíclico.

Unión: el término "unión" o "asociado con" se refiere a un estado de proximidad entre entidades o compuestos químicos, o partes de los mismos. La asociación puede ser no covalente, en la que la yuxtaposición está favorecida energéticamente por enlaces de hidrógeno o interacciones van der Waals o electrostáticas, o puede ser covalente. Sitio de unión: el término "sitio de unión" o "bolsillo de unión", como se usa en la presente memoria, se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su forma, se asocia favorablemente con otra molécula, complejo molecular, entidad o compuesto químico. Como se usa en la presente memoria, el bolsillo comprende al menos una cavidad profunda y, opcionalmente, una cavidad poco profunda.

Sitio de unión 1: un sitio de unión de alta afinidad de neurotensina o sitio de unión sinónimo 1 es un sitio de unión de sortilina (SEQ ID NO. 1) que tiene una alta afinidad por la neurotensina o un fragmento o variante de la neurotensina, y que tiene afinidad por el propéptido de sortilina o un fragmento del mismo (restos de aminoácidos 34-77 de la SEQ ID NO. 1) comprendiendo dicho sitio de unión los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306, T398 a G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 y T402 de la SEQ ID NO.

1. Más preferiblemente, el sitio de unión 1 comprende los aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306 y T398 a G400 de la SEQ ID NO. 1. Lo más preferiblemente, el sitio de unión 1 de la sortilina comprende los aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 y F350 a M363 de la SEQ ID NO. 1. El sitio de unión 1 es un sitio de unión promiscuo.

Sitio de unión 2: Un sitio de unión de la sortilina que tiene baja afinidad por la neurotensina o un fragmento o variante de la neurotensina, comprendiendo dicho sitio de unión los restos de aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-1174, L572, A573 y S584 a F588 de la SEQ ID NO. 1. Más preferiblemente, el sitio de unión de baja afinidad de la sortilina de la neurotensina comprende los aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586 y W597 de la SEQ ID NO. 1. Lo más preferiblemente, el sitio de unión de baja afinidad de la sortilina de la neurotensina comprende los aminoácidos L572, L114 y V112. El sitio de unión 2 es promiscuo y puede unirse al propéptido de sortilina (restos de aminoácidos 34-77 de la SEQ ID NO 1).

Sitio de unión 3: Un sitio de unión promiscuo de la sortilina que comprende los restos de aminoácidos D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de SEQ ID NO. 1, que comprende más preferiblemente los restos de aminoácidos D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1, comprendiendo más preferiblemente los restos de aminoácidos T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1.

Agente biorreactivo: el término "agente bioactivo", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sustancia que se pueda usar en relación con una aplicación que sea terapéutica o diagnóstica, tal como por ejemplo, en métodos para diagnosticar la presencia o ausencia de una enfermedad en un paciente y/o métodos para el tratamiento de una enfermedad en un paciente. "Agente bioactivo" se refiere a sustancias que son capaces de ejercer un efecto biológico in vitro y/o in vivo. Los agentes bioactivos pueden tener carga neutra, positiva o negativa. Los agentes bioactivos adecuados incluyen, por ejemplo, profármacos, agentes de diagnóstico, agentes terapéuticos, agentes farmacéuticos, fármacos, agentes de administración de oxígeno, sustitutos de la sangre, moléculas orgánicas sintéticas, polipéptidos, péptidos, vitaminas, esteroides, análogos de esteroides y determinantes genéticos, incluyendo nucleósidos, nucleótidos y polinucleótidos.

Isquemia cerebral: la isquemia cerebral global es una afección isquémica donde el cerebro no recibe suficiente flujo sanguíneo para mantener la función neurológica normal.

Coma: Un período prolongado de inconsciencia después de una lesión cerebral o trastornos metabólicos. La persona en coma puede tener un reflejo simple en respuesta al tacto o al dolor, pero esencialmente no hay una respuesta significativa a los estímulos externos.

Grupo catiónico: un grupo químico capaz de funcionar como un donador de protones cuando un compuesto que comprende el grupo químico se disuelve en un disolvente, preferiblemente cuando se disuelve en agua.

Complejo: como se usa en la presente memoria, el término "complejo" se refiere a la combinación de una molécula o una proteína, análogos o truncamientos conservadores de la misma asociados con una entidad química.

Coordenadas: el término "coordenadas", como se usa en la presente memoria, se refiere a la información de la organización tridimensional de los átomos que contribuyen a la estructura de una proteína. El mapa final que contiene las coordenadas atómicas de los constituyentes del cristal se puede almacenar en un soporte de datos; típicamente, los datos se almacenan en formato PDB o en formato mmCIF, los cuales son ambos conocidos por el experto en la técnica. Sin embargo, las coordenadas de cristal también se pueden almacenar en tablas simples o formatos de texto. El formato PDB se organiza de acuerdo con las instrucciones y directrices dadas por el Research Collaboratory for Structural Biology.

Cristal: El término "cristal" se refiere a un estado ordenado de la materia. Las proteínas, por su naturaleza, son difíciles de purificar hasta homogeneidad. Incluso las proteínas altamente purificadas pueden ser crónicamente heterogéneas debido a modificaciones, la unión de ligandos o una serie de otros efectos. Además, las proteínas cristalizan en disoluciones generalmente complejas que pueden incluir no solo la molécula diana sino también tampones, sales, agentes de precipitación, agua y cualquier número de proteínas de unión pequeñas. Es importante tener en cuenta que los cristales de proteínas están compuestos no solo de proteína, sino también de un gran porcentaje de moléculas de disolventes, en particular agua. Estos pueden variar desde 30 hasta incluso 90%. Los cristales de proteínas pueden acumular mayores cantidades y una variedad diversa de impurezas que no se pueden enumerar aquí o anticipar en detalle. Con frecuencia, las masas heterogéneas sirven como centros de nucleación y los cristales simplemente crecen alrededor de ellos. El experto en la técnica sabe que algunos cristales difractan mejor que otros. Los cristales varían en tamaño desde apenas 20 micrómetros apenas observables hasta 1 o más milímetros. Los cristales útiles para el análisis de rayos X típicamente son monocristales, de 0.05 mm o más, y no tienen fisuras ni defectos.

Grupo cíclico: la expresión "grupo cíclico" significa un grupo hidrocarbonado de anillo cerrado que se clasifica como un grupo alicíclico, grupo aromático o grupo heterocíclico.

Cicloalquenilo: significa un radical carbocíclico insaturado monovalente que consiste en uno, dos o tres anillos, de tres a ocho carbonos por anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquenilo inferior, alcoxilo inferior, halogenoalcoxi inferior, alqueniltio, halógeno, halogenoalquenilo, nitro, alcoxicarbonenilo, amino, alquenilamino, alquenilsulfonilo, arilsulfonilo, alquenilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquenilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquenilcarbonilamino y arilcarbonilamino.

Cicloalquilo: significa un radical carbocíclico saturado monovalente que consiste en uno, dos o tres anillos, de tres a ocho carbonos por anillo, que pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogenoalcoxi inferior, alquiltio, halógeno, halogenoalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino y arilcarbonilamino.

Interacción dipolo-dipolo: la expresión "interacción dipolo-dipolo", como se usa en la presente memoria, se refiere a la atracción que puede ocurrir entre dos o más moléculas polares. Por lo tanto, "interacción dipolo-dipolo" se refiere a la atracción del extremo positivo parcial no cargado de una primera molécula polar al extremo negativo parcial, no cargado de una segunda molécula polar. "Interacción dipolo-dipolo" también se refiere a enlaces de hidrógeno intermoleculares.

Interacción electrostática: la expresión "interacción electrostática", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier interacción que se produce entre componentes cargados, moléculas o iones, debido a las fuerzas de atracción cuando componentes de carga eléctrica opuesta se atraen entre sí. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: interacciones iónicas, interacciones covalentes, interacciones entre un ion y un dipolo (ion y molécula polar), interacciones entre dos dipolos (cargas parciales de moléculas polares), enlaces de hidrógeno y enlaces de dispersión de London (dipolos inducidos de moléculas polarizables). Así, por ejemplo, "interacción iónica" o "interacción electrostática" se refiere a la atracción entre una primera molécula con carga positiva y una segunda molécula con carga negativa. Las interacciones iónicas o electrostáticas incluyen, por ejemplo, la atracción entre un agente bioactivo con carga negativa.

Formar un anillo: significa que los átomos mencionados se conectan mediante enlace cuando se forma la estructura del anillo.

Fragmentos: Los fragmentos de polipéptido de acuerdo con la presente descripción-descripción, incluyendo cualquier equivalente funcional de los mismos, en una realización pueden comprender menos de 500 restos de aminoácidos, tal como menos de 450 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 400 restos de aminoácidos, tal como menos de 350 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 300 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 250 restos de aminoácidos, tal como menos de 240 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 225 restos de aminoácidos, tal como menos de 200 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 180 restos de aminoácidos, tal como menos de 160 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 150 restos de aminoácidos, tal como menos de 140 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 130 restos de aminoácidos, tal como menos de 120 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 110 restos de aminoácidos, tal como menos de 100 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 90 restos de aminoácidos, tal como menos de 85 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 80 restos de aminoácidos, tal como menos de 75 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 70 restos de aminoácidos, tal como menos de 65 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 60 restos de aminoácidos, tal como menos de 55 restos de aminoácidos, por ejemplo menos de 50 restos de aminoácidos. Los fragmentos de neurotensina incluyen, pero no se limitan a los aminoácidos C-terminales de neurotensina PYIL y YIL.

Equivalencia funcional: la "equivalencia funcional" como se usa en la presente descripción-descripción se establece, de acuerdo con una realización preferida, por referencia a la funcionalidad correspondiente de un fragmento predeterminado de la secuencia.

Se entenderá que los equivalentes funcionales o variantes de un modulador de la actividad de la proneurotrofina presentan secuencias de aminoácidos que difieren gradualmente de la secuencia del modulador de la actividad de la proneurotrofina predeterminada preferida, a medida que aumenta el número y alcance de las inserciones, eliminaciones y sustituciones que incluyen sustituciones conservadoras. Esta diferencia se mide como una reducción en la homología entre la secuencia predeterminada preferida y el fragmento o equivalente funcional.

Todos los fragmentos o equivalentes funcionales del modulador de la actividad proneurotrofina de SEQ ID NO: están incluidos dentro del alcance de esta descripción-descripción, independientemente del grado de homología que muestran con las respectivas secuencias del modulador de la actividad de la proneurotrofina predeterminadas, descritas en la presente memoria. La razón de esto es que algunas regiones del modulador de la actividad de la proneurotrofina son fácilmente mutables, o pueden ser eliminadas por completo, sin ningún efecto significativo sobre la actividad de unión del fragmento resultante.

Una variante funcional obtenida por sustitución bien puede presentar alguna forma o grado de actividad de modulador de la actividad de la proneurotrofina natural, y aún así ser menos homóloga, si los restos que contienen cadenas laterales de aminoácidos funcionalmente similares están sustituidos. Funcionalmente similar en este sentido se refiere a las características dominantes de las cadenas laterales tales como hidrófobas, básicas, neutras o ácidas, o la presencia o ausencia de impedimento estérico. Por consiguiente, en una realización de la descripcióndescripción, el grado de identidad no es una medida principal de que un fragmento sea una variante o equivalente funcional de un fragmento predeterminado preferido según la presente descripción-descripción.

"Silenciamiento" génico: un proceso que conduce a la expresión reducida de genes endógenos. El silenciamiento génico es preferiblemente el resultado de la reducción postranscripcional de la expresión génica.

Isquemia global: anoxia resultante de la interrupción del suministro de sangre a todo el cuerpo que produce daño tisular a través de una variedad de mecanismos que incluyen la apoptosis.

Isquemia cerebral global: anoxia resultante de la interrupción del suministro de sangre a todo el cerebro que produce daño tisular a través de una variedad de mecanismos que incluyen apoptosis. La isquemia cerebral global es la isquemia de todo el cerebro, a diferencia de, p. ej., accidente cerebrovascular que causa isquemia solo en partes del cerebro.

Grupo: (Resto/sustitución) como se entiende bien en este campo técnico, no solo se tolera un alto grado de sustitución, sino que a menudo es aconsejable. La sustitución se prevé en los materiales de la presente descripcióndescripción. Como un medio para simplificar la descripción y la cita de determinada terminología usada a lo largo de esta solicitud, los términos "grupo" y "resto" se usan para diferenciar entre especies químicas que permiten la sustitución o que pueden estar sustituidas y las que no permiten o no pueden estar sustituidas. Así, cuando el término "grupo" se usa para describir un sustituyente químico, el material químico descrito incluye el grupo no sustituido y ese grupo con átomos de O, N o S, por ejemplo, en la cadena, así como grupos carbonilo u otra sustitución convencional. Cuando el término "resto" se usa para describir un compuesto químico o sustituyente, se pretende que incluya solo un material químico no sustituido. Por ejemplo, la frase "grupo alquilo" se pretende que incluya no solo sustituyentes alquilo hidrocarbonados saturados puros de cadena abierta puros, tales como metilo, etilo, propilo, t-butilo, y similares, sino también sustituyentes alquilo que llevan sustituyentes adicionales conocidos en la técnica, tales como hidroxi, alcoxi, alquilsulfonilo, átomos de halógeno, ciano, nitro, amino, carboxilo, etc. Así, "grupo alquilo" incluye grupos éter, halogenoalquilos, nitroalquilos, carboxialquilos, hidroxialquilos, sulfoalquilos, etc. Por otro lado, la frase "resto alquilo" se limita a la inclusión de solo sustituyentes alquilo hidrocarbonados saturados de cadena abierta puros, tales como metilo, etilo, propilo, t-butilo y similares. Las mismas definiciones se aplican a "grupo alquenilo" y "resto alquenilo"; a "grupo alquinilo" y "resto alquinilo"; a "grupo cíclico" y "resto cíclico" a "grupo alicíclico" y "resto alicíclico"; a "grupo aromático" o "grupo arilo" y a "resto aromático" o "resto arilo", así como a "grupo heterocíclico" y "resto heterocíclico".

Grupo heterocíclico: la expresión "grupo heterocíclico" significa un hidrocarburo de anillo cerrado en el que uno o más de los átomos en el anillo es un elemento distinto del carbono (p. ej., nitrógeno, oxígeno, azufre, etc.).

Heterociclilo significa un radical cíclico saturado monovalente, que consiste en uno a dos anillos, de tres a ocho átomos por anillo, que incorpora uno o dos heteroátomos en el anillo (elegidos de N, O o S (O)0-2, y que puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, oxo, ciano, alquilo inferior, alcoxi inferior, halogenoalcoxi inferior, alquiltio, halógeno, halogenoalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminofarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino o arilcarbonilamino.

Heteroarilo significa un radical cíclico aromático monovalente que tiene de uno a tres anillos, de cuatro a ocho átomos por anillo, que incorpora uno o dos heteroátomos (elegidos de nitrógeno, oxígeno o azufre) dentro del anillo que puede estar opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, ciano, alquilo inferior, alcoxilo inferior, haloagenoalcoxi inferior, alquiltio, halógeno, halogenoalquilo, hidroxialquilo, nitro, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonilamino, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alquilcarbonilamino o arilcarbonilamino.

Homología: la homología entre secuencias de aminoácidos se puede calcular usando matrices de puntuación bien conocidas, tal como una cualquiera de BLOSUM 30, BLOs Um 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85 y BLOSUM 90. Los fragmentos que comparten homología con fragmentos de la SEQ ID NO: 1 a 13, respectivamente, debe considerarse como que están dentro del alcance de la presente descripción-descripción cuando preferiblemente son al menos aproximadamente 60 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 65 por ciento homólogos, por ejemplo, al menos 70 por ciento de homólogos, por ejemplo al menos 75 por ciento de homólogos, por ejemplo al menos 80 por ciento de homólogos, por ejemplo al menos 85 por ciento de homólogos, por ejemplo al menos 90 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 92 por ciento homólogos, por ejemplo como al menos 94 por ciento homólogos, por ejemplo, al menos 95 por ciento homólogos, tal como al menos 96 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 97 por ciento homólogos, tal como al menos 98 por ciento homólogos, por ejemplo al menos 99 por ciento homólogos con dichas secuencias de fragmentos predeterminados, respectivamente. Según una realización de la descripción-descripción, los porcentajes de homología se refieren a porcentajes de identidad.

Un método adicional adecuadamente adaptable para determinar las relaciones de estructura y función de los fragmentos peptídicos se describe en el documento US 6013478, que se incorpora en la presente memoria como referencia. Además, los expertos en la técnica conocen métodos para ensayar la unión de una secuencia de aminoácidos a un resto receptor.

Además de las sustituciones conservadoras introducidas en cualquier posición de un modulador de la actividad de la proneurotrofina predeterminada preferida, o un fragmento del mismo, también puede ser deseable introducir sustituciones no conservadoras en una o más posiciones de dicho modulador de la actividad de la proneurotrofina. Una sustitución no conservadora que conduce a la formación de un fragmento funcionalmente equivalente del modulador de la actividad de la proneurotrofina, por ejemplo i) se diferenciaría sustancialmente en la polaridad, por ejemplo, un resto con una cadena lateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn o Gln o un aminoácido con carga tal como Asp, Glu, Arg o Lys, sustituido por un resto con una cadena lateral no polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe o Met), o la sustitución de un resto no polar por uno con carga o polar; y/o ii) difieren sustancialmente en su efecto sobre la orientación de la cadena principal del polipéptido, tal como la sustitución de o por Pro o Gly por otro resto; y/o iii) difieren sustancialmente en la carga eléctrica, por ejemplo, la sustitución de un resto con carga positiva, tal como Lys, His o Arg por un resto con carga negativa, tal como Glu o Asp (y viceversa); y/o iv) difieren sustancialmente en el impedimento estérico, por ejemplo, la sustitución por un resto voluminoso tal como His, Trp, Phe o Tyr de uno que tiene una cadena lateral menor, p. ej., Ala, Gly o Ser (y viceversa).

Las variantes obtenidas por sustitución de aminoácidos en una realización preferida se pueden hacer basándose en los valores de hidrofobicidad e hidrofilicidad y la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácido, incluyendo carga, tamaño y similares. Las sustituciones de aminoácidos de ejemplo que tienen en cuenta varias de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

Además de las variantes descritas en la presente memoria, se pueden formular variantes estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura variante y que dichos compuestos también se pueden usar de la misma manera que las variantes de la descripción.

Esto se puede lograr mediante técnicas de modelización y diseño químico conocidas por los expertos en la técnica. Se entenderá que todas estas construcciones estéricamente similares están dentro del alcance de la presente descripción.

En una realización adicional, la presente descripción se refiere a variantes funcionales que comprenden aminoácidos sustituidos que tienen valores hidrófilos o índices hidropáticos que están dentro de /-4.9, por ejemplo dentro de /-4.7, tal como dentro de /-4.5, por ejemplo dentro de /-4.3, tal como dentro de /-4.1, por ejemplo dentro de /-3.9, tal como dentro de /-3.7, por ejemplo dentro de /- 3.5, tal como dentro de /-3.3, por ejemplo dentro de /- 3.1, tal como dentro de /- 2.9, por ejemplo dentro de /- 2.7, tal como dentro de /-2.5, por ejemplo dentro de /- 2.3, tal como dentro de /- 2.1, por ejemplo dentro de /- 2.0, tal como dentro de /-1.8, por ejemplo dentro de /- 1.6, tal como dentro de /- 1.5, por ejemplo dentro de /- 1.4, tal como dentro de /- 1.3 por ejemplo dentro de /- 1.2, tal como dentro de /- 1.1, por ejemplo dentro de /- 1.0, tal como dentro de /- 0.9, por ejemplo dentro de /- 0.8, tal como dentro de /-0.7, por ejemplo dentro de /- 0.6, tal como dentro de /- 0.5, por ejemplo dentro de /- 0.4, tal como dentro de /- 0.3, por ejemplo dentro de /- 0.25, tal como dentro de /- 0.2 del valor del aminoácido que ha sustituido.

La importancia de los índices hidrófilo e hidropático de aminoácidos en conferir función biológica interactiva a una proteína es bien conocida en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982 y Hopp, patente de EE.UU. n° 4554101).

Los valores del índice hidropático de aminoácidos usados en la presente memoria son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) (Kyte y Doolittle, 1982).

Los valores de hidrofilicidad de aminoácidos son: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0.+-0.1); glutamato (+3.0.+-0.1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5.+-.1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4) (documento U.S. 4554101).

Además de los compuestos de peptidilo descritos en la presente memoria, se pueden formular compuestos estéricamente similares para imitar las porciones clave de la estructura peptídica y dichos compuestos también se pueden usar de la misma manera que los péptidos de la descripción-descripción. Esto se puede lograr mediante técnicas de modelización y diseño químico conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar la esterificación y otras alquilaciones para modificar el extremo amino de, p. ej., una cadena principal de péptido diarginina, para imitar una estructura tetrapeptídica. Se entenderá que todas estas construcciones estéricamente similares están dentro del alcance de la presente descripción.

Los péptidos con alquilaciones N-terminales y esterificaciones C-terminales también están incluidas dentro de la presente descripción-descripción. Los equivalentes funcionales también comprenden conjugados glicosilados y covalentes o agregados formados con los mismos u otros fragmentos de moduladores de la actividad de la proneurotrofina y/o moléculas moduladoras de la actividad de la proneurotrofina, incluyendo dímeros o restos químicos no relacionados. Dichos equivalentes funcionales se preparan por unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en el fragmento que incluyen uno cualquiera o ambos de los extremos N y C, por medios conocidos en la técnica.

Los equivalentes funcionales pueden comprender, por lo tanto, fragmentos conjugados a ésteres o amidas alifáticos o acílicos del extremo carboxilo, alquilaminas o restos que contienen cadenas laterales con carboxilo, p. ej., conjugados a alquilaminas en restos de ácido aspártico; derivados O-acilo de restos que contienen grupos hidroxilo y derivados N-acilo del aminoácido amino terminal o restos que contienen grupos amino, p. ej., conjugados con fMet-Leu-Phe o proteínas inmunogénicas. Los derivados de los grupos acilo se seleccionan del grupo de restos alquilo (incluyendo los alquilos normales C3 a C10), formando de este modo especies de alcanoilo, y compuestos carbocíclicos o heterocíclicos, formando así especies de aroilo. Los grupos reactivos son preferiblemente compuestos difuncionales conocidos por sí mismos para usar en la reticulación de proteínas a matrices insolubles a través de grupos laterales reactivos.

Los equivalentes funcionales covalentes o agregados y sus derivados son útiles como reactivos en inmunoensayos o para procedimientos de purificación por afinidad. Por ejemplo, un fragmento del modulador de la actividad de la proneurotrofina de acuerdo con la presente descripción se puede insolubilizar por enlace covalente a sefarosa activada con bromuro de cianógeno por métodos conocidos por sí mismos o adsorbidos a superficies de poliolefina, con o sin reticulación de glutaraldehído, para usar en un ensayo o purificación de anticuerpos anti-moduladores de la actividad de la neurotrofina o receptores de la superficie celular. Los fragmentos también se pueden marcar con un grupo detectable, p. ej., radioyodado por el procedimiento de cloramina T, unir covalentemente a quelatos de tierras raras o conjugar con otro resto fluorescente para usar en, por ejemplo, ensayos de diagnóstico.

La mutagénesis de un fragmento predeterminado preferido del modulador de la actividad de la proneurotrofina se puede realizar haciendo inserciones de aminoácidos, normalmente del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoácidos, preferiblemente de aproximadamente 1 a 5 restos de aminoácidos, o eliminaciones de aproximadamente de 1 a 10 restos, tal como de aproximadamente 2 a 5 restos.

En una realización, el ligando del sitio de unión 1, 2 o 3 es un oligopéptido sintetizado por síntesis automatizada. Se puede usar cualquiera de las técnicas de fase sólida disponibles en el mercado, tal como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos se añaden secuencialmente a una cadena de aminoácidos en crecimiento (véase, Merrifield, ^{J. A m . C hem . Soc.} 85: 2149-2146, 1963).

El equipo para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible en el mercado de proveedores tales como Applied Biosystems, Inc. de Foster City, California, y en general se puede trabajar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La síntesis en fase sólida permitirá la incorporación de sustituciones de aminoácidos deseables en cualquier fragmento del modulador de la actividad de la proneurotrofina de acuerdo con la presente descripción. Se entenderá que se pueden combinar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier subcombinación de las mismas para llegar a una secuencia final de un equivalente funcional. Se entenderá que las inserciones incluyen fusiones amino-terminales y/o carboxilo-terminales, p. ej., con una proteína hidrófoba o inmunogénica o un soporte tal como cualquier polipéptido o estructura de armazón capaz de servir como soporte.

También se proporcionan oligómeros que incluyen dímeros que incluyen homodímeros y heterodímeros de fragmentos de inhibidores de sortilina de acuerdo con la descripción y se proporcionan y están dentro del alcance de la descripción. Se pueden producir equivalentes funcionales y variantes de moduladores de la actividad de la proneurotrofina como homodímeros o heterodímeros con otras secuencias de aminoácidos o con secuencias inhibidoras de la sorbilina natural. Los heterodímeros incluyen dímeros que contienen fragmentos inhibidores de sortilina inmunorreactivos, así como fragmentos inhibidores de sortilina que no necesitan tener o ejercer ninguna actividad biológica.

Los fragmentos peptídicos inhibidores de la sortilina se pueden sintetizar tanto in vitro como in vivo. El método para la síntesis in vitro es bien conocido, y también se describen métodos que son adecuados o convenientemente adaptables a la síntesis in vivo de inhibidores de sortilina en la técnica anterior. Cuando se sintetizan in vivo, se transforma una célula hospedante con vectores que contienen ADN que codifica un inhibidor de péptido de sortilina o un fragmento del mismo. Un vector se define como una construcción de ácido nucleico que se puede replicar. Los vectores se usan para mediar la expresión del modulador de la actividad de la proneurotrofina. Un vector de expresión es una construcción de ADN replicable en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento inhibidor de sortilina predeterminado, o cualquier equivalente funcional del mismo que se pueda expresar in vivo, está operativamente unido a secuencias de control adecuadas capaces de realizar la expresión del fragmento o equivalente en un hospedante adecuado. Dichas secuencias de control son bien conocidas en la técnica. Se pueden usar tanto células procariotas como eucariotas para sintetizar ligandos.

Los cultivos de células derivadas de organismos multicelulares, sin embargo, representan células hospedantes preferidas. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es viable, ya sea de cultivo de vertebrados o invertebrados. Ejemplos de líneas celulares hospedantes útiles son las células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y líneas celulares WI38, BHK, COS-7, 293 y MDCK. Las células hospedantes preferidas son células eucariotas conocidas por sintetizar inhibidores de sortilina endógenos. Los cultivos de dichas células hospedantes se pueden aislar y usar como fuente del fragmento, o usar en métodos terapéuticos de tratamiento, incluyendo métodos terapéuticos destinados a promover o inhibir un estado de crecimiento, o métodos de diagnóstico realizados en el cuerpo humano o animal.

Enlace hidrófobo: la expresión "enlace de hidrógeno", como se usa en la presente memoria, se refiere a una fuerza atractiva, o puente, que puede ocurrir entre un átomo de hidrógeno que está unido covalentemente a un átomo electronegativo, por ejemplo, oxígeno, azufre o nitrógeno, y otro átomo electronegativo. El enlace de hidrógeno puede ocurrir entre un átomo de hidrógeno en una primera molécula y un átomo electronegativo en una segunda molécula (enlace de hidrógeno intermolecular). Además, el enlace de hidrógeno puede ocurrir entre un átomo de hidrógeno y un átomo electronegativo que están ambos contenidos en una sola molécula (enlace de hidrógeno intramolecular).

Interacción hidrófoba: la expresión "interacción hidrófoba", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier interacción que se produce entre componentes esencialmente no polares (hidrófobos) situados dentro del intervalo de atracción entre sí en un entorno polar (p. ej., agua). Como se usa en la presente memoria, el intervalo de atracción está en la escala de 0.1 a 2 nm. Un tipo particular de interacción hidrófoba es ejercido por las "fuerzas de Van der Waal", es decir, las fuerzas de atracción entre moléculas no polares que se explican por la mecánica cuántica. Las fuerzas de Van der Waal en general están asociadas con momentos dipolares instantáneos que son inducidos por moléculas vecinas y que implican cambios en la distribución de electrones.

Inhibición: el término inhibición, como se usa en la presente memoria, se refiere a la prevención de la unión entre dos o más componentes. Los ligandos identificados por la presente descripción-descripción son capaces de inhibir la unión entre un receptor con dominio Vps10p y una proneurotrofina.

Inhibición de la unión: la expresión inhibición de la unión entre una proneurotrofina y sortilina como se usa en la presente memoria se refiere a un método para proporcionar un ligando identificado por la presente descripcióndescripción, siendo capaz dicho ligando de prevenir la unión de una proneurotrofina al sitio de unión 3 de la sortilina evitando así la formación de un complejo ternario entre sortilina, proNGF y p75NTR o cualquier fragmento o variante de los mismos. La expresión inhibición de la unión también puede referirse a la inhibición de la unión de neurotensina y/o propéptido de sortilina al sitio de unión 1 o 2 del receptor sortilina con dominio Vps10p.

In vitro/in vivo: los términos se usan en su significado normal.

En silico: un método para llevar a cabo una operación in vitro o in vivo mediante simulación por ordenador.

Isquemia: restricción en el suministro de sangre con disfunción o daño del tejido resultante.

Daño tisular isquémico: daño tisular debido a isquemia.

Acidosis láctica: la acidosis láctica es una afección causada por la acumulación de ácido láctico en el cuerpo. Una causa importante de la acidosis láctica es el suministro inadecuado de oxígeno a los tejidos. La acidosis láctica conduce a la acidificación de la sangre (acidosis), y se considera una forma distinta de la acidosis metabólica.

Ligando: una sustancia o compuesto que es capaz de unirse a y formar un complejo con una biomolécula para cumplir un propósito biológico. En un sentido más estrecho, es una molécula activadora de señales que se une a un sitio en una proteína diana, por fuerzas intermoleculares tales como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. El acoplamiento (asociación) normalmente es reversible (disociación). La unión covalente irreversible real entre un ligando y su molécula diana es rara en sistemas biológicos. A diferencia del significado en la química metalorgánica e inorgánica, es irrelevante si el ligando se une o no a un sitio metálico, como es el caso en la hemoglobina. La unión del ligando a receptores puede alterar la conformación química, es decir, la forma tridimensional de la proteína receptora. El estado conformacional de una proteína receptora determina el estado funcional de un receptor. La tendencia o fuerza de unión se llama afinidad. Los ligandos incluyen sustratos, inhibidores, activadores y neurotransmisores. Los radioligandos son compuestos marcados con radioisótopos y se usan in vivo como trazadores en estudios de PET y para estudios de unión in vitro.

Los restos de un compuesto particular cubren grupo(s) o parte(s) de dicho compuesto particular.

Agente farmacéutico: las expresiones "agente farmacéutico" o "fármaco" o "medicamento" se refieren a cualquier agente terapéutico o profiláctico que se puede usar en el tratamiento (incluyendo la prevención, diagnóstico, alivio o cura) de un padecimiento, dolencia, afección, enfermedad o lesión en un paciente. Los determinantes genéticos, péptidos, polipéptidos y polinucleótidos terapéuticamente útiles se pueden incluir dentro del significado del término producto farmacéutico o fármaco. Como se define en la presente memoria, un "agente terapéutico", "agente farmacéutico" o "fármaco" o "medicamento" es un tipo de agente bioactivo.

Composición farmacéutica: o fármaco, medicamento o agente se refiere a cualquier material, compuesto o composición química o biológica capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Algunos fármacos se venden en una forma inactiva que se convierte in vivo en un metabolito con actividad farmacéutica. Para los fines de la presente descripción, los términos "composición farmacéutica" y "medicamento" abarcan tanto el fármaco inactivo como el metabolito activo.

Polipéptido: el término "polipéptido", como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula que comprende al menos dos aminoácidos. Los aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos. Los "oligopéptidos" se definen en la presente memoria como polipéptidos de longitud no superior a 100 aminoácidos. El término "polipéptido" también se pretende que incluya proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar unidos covalentemente o pueden estar unidos no covalentemente. Los polipéptidos en una proteína pueden estar glicosilados y/o lipidados y/o comprender grupos prostéticos.

Polinucleótido: "Polinucleótido" como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula que comprende al menos dos ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser naturales o modificados, como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o ácidos nucleicos peptídicos (PNA). El polinucleótido como se usa en la presente memoria en general se refiere a

i) un polinucleótido que comprende una secuencia codificante predeterminada, o

ii) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos predeterminada, o

iii) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por polinucleótidos (i) o (ii), en donde dicho fragmento tiene al menos una actividad predeterminada como se especifica en la presente memoria; y iv) un polinucleótido cuya cadena complementaria hibrida en condiciones restrictivas con un polinucleótido como se define en cualquiera de (i), (ii) y (iii), y codifica un polipéptido, o un fragmento del mismo, que tiene al menos una actividad predeterminada como se especifica en la presente memoria; y

v) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que está degenerada respecto a la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos (iii) o (iv),

o la cadena complementaria de dicho polinucleótido.

Anticuerpo purificado: la expresión "anticuerpo purificado" es un anticuerpo al menos 60 por ciento en peso del cual está exento de los polipéptidos y moléculas orgánicas naturales con las que está naturalmente asociado. Preferiblemente, la preparación comprende anticuerpo en una cantidad de al menos 75 por ciento en peso, más preferiblemente al menos 90 por ciento en peso, y lo más preferiblemente al menos 99 por ciento en peso.

Desviación cuadrática media: la expresión "desviación cuadrática media" (rmsd) se usa como una media para comparar dos estructuras estrechamente relacionadas y se refiere a una desviación en la distancia entre los átomos relacionados de las dos estructuras después de minimizar estructuralmente esta distancia en un alineamiento. Las proteínas relacionadas con estructuras estrechamente relacionadas se caracterizarán por valores de RMSD relativamente bajos, mientras que diferencias más grandes darán como resultado un aumento del valor de RMSD. Identidad de la secuencia: la identidad de secuencia se determina en una realización usando fragmentos de péptidos moduladores de la actividad de la proneurotrofina que comprenden al menos 25 aminoácidos contiguos y que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, tal como 85%, por ejemplo 90%, tal como 95%, por ejemplo 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 respectivamente, en donde el porcentaje de identidad se determina con el algoritmo GAP, BESTFIT o FASTA en el paquete de software de Wisconsin Genetics versión 7.0, usando los pesos por hueco por defecto.

Las siguientes expresiones se usan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia predeterminada", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial".

Una "secuencia predeterminada" es una secuencia definida usada como una base para una comparación de secuencias; una secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADN o gen de longitud completa dada en una lista de secuencias, tal como una secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, o puede comprender una secuencia de ADN o génica completa. En general, una secuencia predeterminada tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, con frecuencia al menos 25 nucleótidos de longitud, y con frecuencia al menos 50 nucleótidos de longitud.

Puesto que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia de polinucleótido completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos a lo largo de una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en la presente memoria, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguas en donde una secuencia de polinucleótido se puede comparar con una secuencia predeterminada de al menos 20 nucleótidos contiguos y en donde la parte de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) de 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia predeterminada (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) ^{A dv. A pp l. M ath .} 2: 482, por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) ^{J. M ol. Biol.} 48: 443, por el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) ^{Proc. N a tl A c a d Sci.} (EE. UU.) 85: 2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en la versión 7.0 del paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), o por inspección, y se selecciona el mejor alineamiento (es decir, que da el porcentaje más alto de homología a lo largo de la ventana de comparación) generado por los diversos métodos.

La expresión "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, nucleótido a nucleótido) a lo largo de la ventana de comparación. La expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico es idéntica (p. ej., A, T, C, G, U o I) en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Las expresiones "identidad sustancial" como se usan en la presente memoria denotan una característica de una secuencia de polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos de 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más habitualmente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia predeterminada a lo largo de una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, con frecuencia a lo largo de una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia predeterminada con la secuencia de polinucleótido que puede incluir eliminaciones o adiciones que suman 20 por ciento o menos de la secuencia predeterminada a lo largo de la ventana de comparación. La secuencia predeterminada puede ser un subconjunto de una secuencia mayor, por ejemplo, como un segmento de la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 1 de longitud completa ilustrada en la presente memoria.

Según se aplica a los polipéptidos, un grado de identidad de las secuencias de aminoácidos es función del número de aminoácidos idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos. Un grado de homología o similitud de secuencias de aminoácidos es una función del número de aminoácidos, es decir, relacionados estructuralmente, en posiciones compartidas por las secuencias de aminoácidos.

Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos de 40% de identidad, aunque preferiblemente menos de 25% de identidad, con una de las secuencias de polipéptido modulador de la actividad de la proneurotrofina de la presente descripción-descripción. La expresión "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que usan los pesos de huecos por defecto, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencia o más (p. ej., 99% de identidad de secuencia). Preferiblemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la capacidad de intercambio de restos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de alifáticas-hidroxilo es serina y treonina, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alaninavalina y asparagina-glutamina.

Además, las variantes también se determinan basándose en un número predeterminado de sustituciones de aminoácidos conservadoras como se define a continuación en la presente memoria. La sustitución conservadora de aminoácidos, como se usa en la presente memoria, se refiere a la sustitución de un aminoácido (dentro de un grupo predeterminado de aminoácidos) por otro aminoácido (dentro del mismo grupo), en donde los aminoácidos presentan características similares o sustancialmente similares.

Dentro del significado de la expresión "sustitución de aminoácidos conservadora" como se aplica en la presente memoria, un aminoácido puede ser sustituido por otro dentro de los grupos de aminoácidos indicados en la presente memoria a continuación:

i) Aminoácidos que tienen cadenas laterales polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr y Cys) ii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro y Met)

iii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (Gly, Ala Val, Leu, Ile)

iv) Aminoácidos que tienen cadenas laterales cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro)

v) Aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (Phe, Tyr, Trp)

vi) Aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (Asp, Glu)

vii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (Lys, Arg, His)

viii) Aminoácidos que tienen cadenas laterales amida (Asn, Gln)

ix) Aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxi (Ser, Thr)

x) Aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (Cys, Met),

xi) aminoácidos neutros, débilmente hidrófobos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr)

xii) aminoácidos hidrófilos, ácidos (Gln, Asn, Glu, Asp), y

xiii) Aminoácidos hidrófobos (Leu, Ile, Val)

Por consiguiente, una variante o un fragmento de la misma según la descripción puede comprender, dentro de la misma variante de la secuencia o fragmentos de la misma, o entre diferentes variantes de la secuencia o fragmentos del mismo, al menos una sustitución, tal como una pluralidad de sustituciones introducidas independientemente entre sí.

Está claro a partir del esquema anterior que la misma variante o fragmento de la misma puede comprender más de una sustitución de aminoácidos conservadora de más de un grupo de aminoácidos conservadores como se ha definido antes en la presente memoria.

La adición o eliminación de al menos un aminoácido puede ser una adición o eliminación de preferiblemente de 2 a 250 aminoácidos, tal como de 10 a 20 aminoácidos, por ejemplo de 20 a 30 aminoácidos, tal como de 40 a 50 aminoácidos. Sin embargo, las adiciones o eliminaciones de más de 50 aminoácidos, tales como adiciones de 50 a 100 aminoácidos, adición de 100 a 150 aminoácidos, adición de 150-250 aminoácidos, también están comprendidas dentro de la presente descripción. La eliminación y/o la adición pueden ser, independientemente entre sí, una eliminación y/o una adición dentro de una secuencia y/o al final de una secuencia.

ARNip: el "ARN interferente pequeño" (ARNip) es una molécula de ARN bicatenario corto (a menudo, pero no restringido a, de menos de 30 nucleótidos de longitud) capaz de causar silenciamiento específico de genes en células de mamíferos.

Alquilo inferior sustituido significa un alquilo inferior que tiene de uno a tres sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxi, amino, amido, carboxilo, acilo, halógeno, ciano, nitro y tiol.

Tratamiento: el término "tratamiento", como se usa en la presente memoria, se refiere a un método que implica terapia que incluye cirugía de una afección clínica en un individuo que incluye un cuerpo humano o animal. La terapia puede ser de mejora, cura o profiláctica, es decir, reduce el riesgo de adquirir una enfermedad.

Variantes: el término "variantes" como se usa en la presente memoria se refiere a variantes de secuencias de aminoácidos, teniendo preferiblemente dichas variantes al menos 60% de identidad, por ejemplo al menos 63% de identidad, tal como al menos 66% de identidad, por ejemplo al menos 70% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 72% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 75% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 80% de identidad de secuencia, tal como al menos 85% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 90% de identidad de secuencia, tal como al menos 91% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 91% de identidad de secuencia, tal como al menos 92% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 93% de identidad de secuencia, tal como al menos 94% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 95% de identidad de secuencia, tal como al menos 96% de identidad de secuencia, por ejemplo al menos 97% de identidad de secuencia, tal como al menos 98% de identidad de secuencia, por ejemplo 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias predeterminadas. Las variantes de neurotensina incluyen, pero no se limitan a variantes artificiales de neurotensina tales como NT69L.

Regulación por aumento de la expresión: un proceso que conduce a una mayor expresión de genes, preferiblemente de genes endógenos.

Cristal de sortilina

Para aclarar la organización estructural y la unión del ligando del dominio Vps10p y de la sortilina humana en particular, los autores de la presente invención han determinado las estructuras cristalinas de sSortilina en complejo con NT y con los restos 4-29 de su propio propéptido (con resoluciones de 2.0 y 3.2 A respectivamente). Los datos sobre el complejo sSortilina:NT se obtuvieron de cristales crecidos con un ligero (relación molar 1:1.5), así como con un gran exceso (relación molar 1:15) de NT. (Véase el ejemplo 5) Los autores de la invención además han determinado la estructura de sSortilina en complejo con el prodominio del factor de crecimiento nervioso (NGF). Por consiguiente, en una realización, la presente descripción se refiere a un cristal que comprende

a) un polipéptido de la SEQ ID NO. 1; y/o

b) una variante de secuencia de dicho polipéptido en donde la variante tiene al menos 60% de identidad de secuencia con dicha SEQ ID NO. 1; y/o

c) un fragmento que comprende al menos 200 aminoácidos contiguos de cualquiera de a) a b), en donde el fragmento presenta actividad de sortilina, y

d) opcionalmente cualquiera de a) a c) en complejo con al menos un ligando.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 50% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 60% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 63% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 65% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende una variante de secuencia de la SEQ ID NO. 1 en donde la variante tiene al menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1.

En una realización, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 200 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 300 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 400 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 500 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 600 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el cristal de la presente comprende un fragmento que comprende al menos 700 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO. 1.

En una realización preferida de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 1 (sitio de unión de neurotensina de alta afinidad y sitio de unión de propéptido de sortilina) que comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306 y T398 a G400 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización más preferida de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 1 (sitio de unión de neurotensina de alta afinidad y sitio de unión de propéptido de sortilina) que comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 y F350 a M363 de la SEQ ID NO. 1.

En realización muy preferida de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 1 (sitio de unión de neurotensina de alta afinidad y sitio de unión de propéptido de sortilina) que comprende los restos de aminoácidos R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 y F350 a M363 de la SEQ ID NO. 1.

En otra realización de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 2 (sitio de unión de neurotensina de baja afinidad y sitio de unión de propéptido de sortilina) que comprende los restos de aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 y S584 a F588 de la SEQ ID NO. 1.

En otra realización más de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 2 (sitio de unión de neurotensina de baja afinidad y sitio de unión de propéptido de sortilina) que comprende los restos de aminoácidos L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586 y W597 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización preferida, al menos un ligando de la presente descripción descripción se une al sitio de unión 2 (sitio de unión de neurotensina de baja afinidad y sitio de unión de propéptido de sortilina) que comprende los restos de aminoácidos L572, L114 y V112 de la SEQ ID NO. 1.

En otra realización preferida de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 3 (sitio de unión de propéptido de neurotrofina) que comprende los restos de aminoácidos D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de la SEQ ID NO. 1. Como el sitio de unión 3 se une al prodominio de las neurotrofinas, dicho sitio de unión 3 también puede unir la pro-neurotrofina entera. Por consiguiente, el sitio de unión 3 se puede denominar sitio de unión de pro-neurotrofina o sitio de unión de prodominio de neurotrofina o una expresión sinónima de significado bioquímico idéntico.

En una realización más preferida, el al menos un ligando de la presente descripción se une al sitio de unión 3 (sitio de unión de propéptido de neurotrofina) que comprende los restos de aminoácidos D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1

En una realización muy preferida de la presente descripción, el al menos un ligando se une al sitio de unión 3 (sitio de unión de propéptido de neurotrofina) que comprende los restos de aminoácidos T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1.

En otra realización de la presente descripción, el sitio de unión 3 (el sitio de unión de pro-neurotrofina) es un sitio de unión de proNGF.

En otra realización de la presente descripción, el sitio de unión 3 (el sitio de unión de pro-neurotrofina) es un sitio de unión de proBDNF.

En otra realización de la presente descripción, el sitio de unión 3 (el sitio de unión de pro-neurotrofina) es un sitio de unión de proNT3.

En otra realización de la presente descripción, el sitio de unión 3 (el sitio de unión de pro-neurotrofina) es un sitio de unión de proNT4/5.

El cristal de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende el resto de aminoácido n° 78 a 755 de la SEQ ID NO. 1.

En otra realización, el cristal definido anteriormente en la presente memoria es de un grupo espacial monoclínico.

En una realización, el cristal del grupo espacial monoclínico pertenece al grupo espacial C2.

En otra realización, el cristal definido anteriormente en la presente memoria es de un grupo espacial ortorrómbico. En una realización, el cristal del grupo espacial ortorrómbico es P2-|2-|21.

En otra realización de la presente descripción, el cristal como se ha definido anteriormente en la presente memoria comprende una variante de polipéptido que comprende los restos de aminoácidos 78 a 755 (sSortilina) de la SEQ ID NO. 1, o uno de sus fragmentos o variantes.

En una realización de la presente descripción, el cristal como se ha definido anteriormente en la presente memoria comprende un polipéptido de sortilina donde una o más o todas las metioninas han sido sustituidas por Se-metionina (seleno-metionina).

En otra realización de la presente descripción, el cristal como se ha definido anteriormente en la presente memoria comprende un ligando polipeptídico seleccionado del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 19 a 241 de la SEQ ID NO 6 (proNGF), restos de aminoácidos 19 a 121 de la SEQ ID NO 6 (prodominio de NGF), restos de aminoácidos 19 a 246 de la SEQ ID NO 7 (proBDNF), restos de aminoácidos 19 a 127 de la SeQ ID NO 7 (prodominio de BDNF), restos de aminoácidos 17 a 257 de la SEQ ID NO 8 (proNT3), restos de aminoácidos 17 a 140 de la SEQ ID NO 8 (prodominio de NT3), restos de aminoácidos 25 a 210 de la ^sE^qID NO 9 (proNT4/5), restos de aminoácidos 25 a 80 de la SEQ ID NO 9 (prodominio de NT4/5), SEQ ID NO. 10 (Neurotensina), SEQ ID NO. 11 (PYIL), restos de aminoácidos 11 a 13 de la SEQ ID NO. 10 (YIL) y SEQ ID NO. 12 (NT69L), o un fragmento o variante de los mismos.

Método de crecimiento de un cristal de sortilina

En un aspecto adicional, la presente descripción además se refiere a un método de crecimiento de un cristal de sortilina que comprende las etapas de:

a. obtener una composición que comprende de 4.5 a 5.5 mg/ml de un polipéptido de SEQ ID NO. 1 o uno de sus fragmentos o variantes, en un tampón que contiene

Tris-HCl 50 mM, pH 7.9 y NaCl 150 mM,

b. mezclar dicha composición con neurotensina en una relación molar de:

i. de 1:1.5 a 1:15 (sSortilina:NT) o,

ii. 1:4 (sSortilina:propéptido),

c. someter volúmenes iguales de dicha composición y una disolución de cristalización respectivamente, conteniendo dicha disolución de cristalización

iii. 18-21% en p/v de PEG 6000, y

iv. 0-15% de glicerol, y

v. Tris-HEPES pH 7.2-7.8 (Tris 40-93 mM y HEPES 100 mM) o Tris-HCl 100 mM pH 7.9, 3-6% de glicerol y vi. NaCl 300-900 mM o C3H2Na2O4150-400 mM en donde dicho C3H2Na2O4 se ajusta a pH 6-7.5 mediante ácido malónico, o LiSO4300-500 mM o KCl 500-700 mM y,

En una realización adicional de la presente descripción, los restos de cisteína de la SEQ ID NO. 1 se sustituyen por seleno-metionina.

En otra realización de la presente descripción, el método para obtener cristales como se ha definido antes en la presente memoria comprende además las etapas de:

a. aislar un precipitado inicial y

b. hacerlo crecer por difusión de vapor de gotas colgantes.

En otra realización más de la presente descripción, el cristal como se ha definido antes en la presente memoria comprende además un ligando unido a la sortilina para la determinación de la estructura tridimensional de la sortilina o uno de sus fragmentos o variantes en complejo con dicho ligando.

Estructura de la sortilina

Los autores de la invención han encontrado que los restos 78-609 de la sortilina (SEQ ID NO. 1) constituyen el primer ejemplo de una hélice p de 10 hojas. Las extensiones largas se encuentran tanto entre las hojas ascendentes y descendentes de cuatro cadenas como entre las cadenas p individuales de las hojas (Fig. 1A). La parte más pequeña C-terminal que contiene 10 cisteínas (10CC), restos 610-758, se presenta ella misma como dos dominios estructurales similares con una forma general y una arquitectura que recuerda a los dominios ricos en cisteína encontrados en p75NTR (18) (Fig. 1B). La interfase entre los dos dominios 10CC y el dominio de hélice comprende interacciones hidrófobas y electrostáticas extensas y cubre aproximadamente 180° de una cara de la hélice.

En general, el dominio de la hélice tiene forma ovalada y forma un túnel ancho ligeramente cónico que se estrecha hacia el lado de la cara de interacción de 10CC. En el plano ecuatorial, la sección transversal del túnel es de aproximadamente 25 por 40 A (Fig. 1C+D). El acceso al túnel desde el lado estrecho de interacción de 10CC está además parcialmente bloqueado por una glicosilación unida a Asn406 situada en el borde interior en el extremo de la cadena uno de la hoja 7 (Fig. 1C+D). Se encuentran dos glicosilaciones más en Asn162 y Asn582, ambas en el borde exterior y ambas en el lado de interacción de 10CC de la hélice. En particular, dos bucles hidrófobos que sobresalen que conectan la cadena dos y tres de las hojas 1 y 10 emergen de la cara opuesta (Fig. 1B), lo que sugiere que esta cara, y los bucles en particular, pueden mediar el contacto con la membrana celular o servir en interacciones con otras proteínas.

En ambas estructuras de la sSortilina en complejo con NT, los autores de la invención han encontrado que los cuatro restos C-terminales (Pro10-Tyr11-Ile12-Leu13) de NT forman una cadena p corta a la cadena uno de la hoja 6 (denominada en la presente memoria como el sitio de unión de NT de alta afinidad). El grupo hidroxilo de Tyr11 forma un enlace de hidrógeno con Lys260 de la sortilina, y la leucina C-terminal encaja en un bolsillo hidrófobo formado por Phe314, Ile327 e Ile353. Sin embargo, la principal contribución a la unión es claramente el carboxilato C-terminal de NT, que forma un puente salino con el grupo guanidinio de Arg325 y los enlaces de hidrógeno a la cadena lateral de Ser316 y la amida de la cadena principal de Tyr351 (Fig. 2B).

En la estructura determinada con un gran exceso de NT, se encuentran dos sitios de unión adicionales. El sitio de unión 2 (Fig. 2A) se encuentra en el borde interior de la hélice. Aquí la mitad N-terminal de la neurotensina (restos 2 6) se modeliza como una cadena p corta que interacciona con la primera cadena de la hoja 1. No se observan interacciones específicas de la cadena lateral con el receptor en este sitio (Fig. 2B). La distancia de Ca de Lys6 a Ca de Pro10 es de 17,7 A y no hay densidad de electrones presente en la región intermedia. Por lo tanto, los autores de la invención concluyen que con una alta concentración de NT se unen dos moléculas dentro de la hélice.

Los resultados presentados antes indican que la sortilina tiene un sitio de unión de alta afinidad para el extremo C de NT, y un subsitio secundario de baja afinidad en el que interviene la parte N-terminal del péptido. Por consiguiente, los autores de la invención examinaron la capacidad de los fragmentos derivados de NT para inhibir la unión de sortilinas de su propio propéptido (Sort-pro). Anteriormente se ha demostrado (5) que la unión de Sort-pro se suprime completamente en presencia de un exceso de 5 veces de NT y el péptido C-terminal Arg9-Pro-Tyr-Ile-Leu13 es igualmente efectivo (Fig. 3A). En contraste, los autores de la presente invención han encontrado que tanto el péptido N-terminal de NT (1-8) como el Arg8-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu13-NH2, es decir, con el carboxilato terminal sustituido por amida, no pueden inhibir (Fig. 3A+B), mientras que el tripéptido C-terminal Tyr11-Ile-Leu13 demuestra ser suficiente para la inhibición completa de la unión de Sort-pro (Fig. 3B). Tyr11-Ile-Leu13 también dificulta la unión del prodominio de NGF (Fig. 3C) y RAP (Fig. 3D) aunque no tan eficientemente como la NT de longitud completa. Esto último indica que proNGF y RAP podrían estar sujetos a impedimento estérico y tener sitios de unión diferentes o más extendidos que Tyr11-Ile-Leu13.

La neurotensina y Sort-pro no tienen similitud de secuencia. Sin embargo, la estructura de sSortilina en complejo con un fragmento de Sort-pro (restos 4-29) muestra ambos sitios de unión dentro de la hélice a ocupar (Fig. 2C-E). La densidad para el péptido es fuerte pero no está lo suficientemente definida para permitir la modelización del péptido. Sin embargo, una superposición con la estructura de sSortilina:NT muestra claramente que la densidad de Sort-pro se superpone con la de las partes C y N terminales de NT (Fig. 2C+D) y llena la cavidad entre ellas (Fig. 2E). Dado que el propéptido no contiene un motivo Tyr-Ile-Leu y su unión no depende de un extremo C libre (8), se podría especular que un resto ácido intrínseco en Sort-pro u otros ligandos, p. ej., proNGF, puede asumir una función en la unión similar al de leu-carboxilato C-terminal de la NT.

Para investigar esto, los autores de la invención generaron construcciones de mutantes de sortilina en las que tanto Ser316 como Arg325 se intercambiaron por Glu y Ala, respectivamente. El mutante S316E posteriormente se expresó y purificó, mientras que el mutante R325A demostró ser inestable y se desintegró durante el procedimiento de purificación. Es interesante que ambos mutantes se retrasaron verdaderamente en la secreción (Fig. 4A), un efecto también observado para la sortilinaa expresada sin el propéptido (8). El S316E no mostraba unión de Sortpro, pero sí se unía al prodominio de NGF y BDNF con afinidades similares a la de wt-sortilina. Como se esperaba, la presencia de NT no tenía efecto en la unión del prodominio de NGF al mutante S316E. Estos resultados apoyan firmemente el hallazgo de que Sort-pro y NT se unen al mismo sitio estructural (sitio de unión 1 y 2), y que otros ligandos, por ejemplo, prodominios de neurotrofinas, tales como pero no limitados a prodominio de NGF y el pro NGF completo, se unen en un sitio muy cercano pero separado independiente (sitio de unión 3).

Por consiguiente, en una realización de la presente descripción, los ligandos están diseñados para unirse específicamente a uno o más de los tres sitios de unión de la sortilina. Por consiguiente, dichos ligandos son capaces de inhibir la unión de ligandos endógenos al mismo sitio. Dichos ligandos endógenos se seleccionan del grupo que consiste en neurotensina, propéptido de sortilina, p75NTR y pro-neurotrofinas, dichas pro-neurotrofinas seleccionadas del grupo que consiste en pro-NGF, proBDNF, pro-NT3 y proNT4/5.

La identidad de secuencia por pares entre sortilinas de ocho especies está dentro del 60-95%. El alineamiento de secuencias (Fig. 5) asigna grandes parches de restos conservados a la superficie interna de la cavidad de la hélice y parches más pequeños dispersos al borde exterior y al dominio 10CC (Fig. 1E). El patrón de conservación en la cavidad estaría de acuerdo con la presencia de sitios de unión adicionales o suplementarios y sugiere que dichos sitios alternativos podrían implicar a otras hojas de hélice en la formación de interacciones de la cadena p. La existencia de sitios alternativos es evidentemente un punto importante ya que varios ligandos se dirigen a la sortilina. Es bien sabido que todos los ligandos de longitud completa compiten por la unión, pero la eficiencia de la competencia varía y no todos son antagonizados de manera eficaz por el tripéptido Tyr-Ile-Leu. Por consiguiente, es probable que todos los ligandos deban unirse dentro de la cavidad de la hélice en sitios que se solapan. Por lo tanto, péptidos pequeños como Tyr-Ile-Leu, pueden inhibir al ocupar sitios compartidos muy específicos, mientras que los ligandos más grandes pueden proporcionar una inhibición adicional al bloquear el acceso al espacio confinado de la cavidad.

En resumen, los autores de la invención han determinado la primera estructura conocida de un miembro de la familia de proteínas Vps10p-D y de un receptor que se une a NT. Los resultados revelan que, de hecho, el Vps10p-D consta de dos dominios distintos, pero estructuralmente interdependientes, es decir, el primer ejemplo de una hélice p de 10 hojas y el 10CC compuesto de dos dominios estructurales similares. El túnel de la hélice comprende la región de unión al ligando de la sortilina, y han cartografiado los sitios específicos para su interacción con la NT y su propio propéptido. Además, han demostrado que una parte esencial del sitio de reconocimiento para las proneurotrofinas también se encuentra dentro de esta zona. El descubrimiento de que el tripéptido Tyr-Ile-Leu se dirige a la sortilina con alta afinidad, proporciona el primer ligando derivado de la NT con potencial para discriminar entre sortilina, SorLA y las NTR acopladas a la proteína G y se abre para el diseño de inhibidores específicos que pueden reducir la apoptosis mediada por el complejo sortilina:p75NTR:proNGF. Finalmente, el análisis de estructura y unión de los autores de la invención puede resultar útil en futuras modelizaciones de estructuras e interacciones de otros receptores Vps10p-D, y en el estudio de sus funciones putativas en enfermedades como la diabetes y la enfermedad de Alzheimer (19-21).

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un medio de almacenamiento de datos legible por ordenador que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con al menos una parte de las coordenadas de la estructura de la sortilina como se indica en cualquiera de las figuras 17 a 20.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere al uso de las coordenadas atómicas como se presentan en cualquiera de las figuras 17 a 20 o las coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína en no más de 3 A en un método para identificar un ligando capaz de unirse a uno o más de:

a. sitio de unión 1, o

b. sitio de unión 2, o

c. sitio de unión 3,

o un fragmento o variante de a a c.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere al uso del cristal como se ha descrito antes en la presente memoria para la determinación de la estructura tridimensional de la sortilina o uno de sus fragmentos o variantes. En otro aspecto más, la presente descripción se refiere al uso de coordenadas atómicas como se presentan en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de proteína en no más de 3 A en un método para identificar un ligando capaz de unirse a uno o más de:

a. sitio de unión 1, o

b. sitio de unión 2, o

c. sitio de unión 3,

o un fragmento o variante de a a c.

Métodos de identificación y diseño de ligandos

La presente descripción proporciona métodos para la identificación y diseño de ligandos capaces de unirse específicamente a cualquiera de los tres sitios de unión (1, 2 y 3) de la sortilina como se ha definido antes en la presente memoria.

En una realización preferida, los ligandos identificados y diseñados son inhibidores potenciales de la sortilina, que evitan así la unión de la sortilina al prodominio de neurotrofinas, en especial a los prodominios de proNGF y proBDNF.

Se puede diseñar entonces un nuevo inhibidor potencial conjuntamente con la modelización por ordenador. Se pueden generar modelos de estructuras químicas o fragmentos de moléculas en una pantalla de ordenador usando información derivada de estructuras químicas orgánicas de bajo peso molecular conocidas almacenadas en una base de datos de ordenador o se construyen usando el conocimiento general de un químico orgánico con respecto a los tipos de enlaces, conformaciones, etc. Los programas informáticos adecuados pueden ayudar en este proceso para construir estructuras químicas de geometrías realistas. Las estructuras químicas o fragmentos de moléculas se pueden seleccionar y/o usar para construir un inhibidor potencial de modo que sean posibles interacciones favorables para dicho subconjunto o conjunto de datos de criterios. Cuantas más interacciones favorables sean posibles, más fuerte se unirá el inhibidor potencial a la sortilina. Preferiblemente, deberían ser posibles interacciones favorables para al menos un resto de aminoácido. Dichas interacciones favorables pueden ocurrir con cualquier átomo del resto de aminoácido, p. ej., átomos de la cadena principal del péptido y/o átomos de las cadenas laterales. Las interacciones favorables son cualquier fuerza de atracción no covalente que pueda existir entre estructuras químicas tales como interacciones hidrófobas o de van-der-Waals e interacciones polares tales como enlaces de hidrógeno, puentes salinos, etc. Las interacciones desfavorables tales como interacciones hidrófobas-hidrófilas se deben evitar, pero se pueden aceptar si son más débiles que la suma de las fuerzas de atracción. La interferencia estérica, como las colisiones o los solapamientos de partes del inhibidor que se seleccionan o construyen con restos de proteínas, evitará la unión a menos que se resuelvan mediante cambios conformacionales. La fuerza de unión de un inhibidor potencial creado de este modo se puede evaluar comparando las interacciones favorables y desfavorables en la pantalla del ordenador o usando métodos computacionales implementados en programas informáticos comerciales.

Se debe tener en cuenta la libertad conformacional del inhibidor potencial y las cadenas laterales de aminoácidos de la sortilina. Las conformaciones accesibles de un inhibidor potencial se pueden determinar usando reglas conocidas de geometría molecular, en particular ángulos de torsión, o computacionalmente usando programas informáticos que tienen procedimientos implementados de mecánica molecular y/o dinámica o mecánica cuántica o combinaciones de los mismos.

Un inhibidor potencial es al menos parcialmente complementario a al menos una parte del sitio de unión 1, el sitio de unión 2 o el sitio de unión 3 de la sortilina en términos de forma y en términos de propiedades hidrófilas o hidrófobas. Las bases de datos de estructuras químicas (p. ej., base de datos estructurales de Cambridge o del Chemical Abstracts Service; para una revisión, véase: Rusinko (1993) ^{C hem . Des. A u to . N e w s} 8,44-47) se pueden usar en diferentes grados. En una realización totalmente automática, todas las estructuras en una base de datos se pueden comparar con el sitio activo o con los bolsillos de unión de la sortilina en cuanto a la complementariedad y falta de interferencia estérica computacionalmente mediante el uso del procesador del ordenador y un programa informático adecuado. En este caso, la modelización por ordenador que comprende la interacción manual del usuario en una pantalla de ordenador puede no ser necesaria. Alternativamente, los fragmentos moleculares se pueden seleccionar de una base de datos y ensamblar, o construir en una pantalla de ordenador, p. ej., manualmente. También, la relación entre la automatización y la interacción manual para un experto en la técnica en el proceso de selección puede variar mucho. A medida que mejoran los programas de ordenador para el diseño de fármacos y el acoplamiento de moléculas entre sí, disminuye la necesidad de interacción manual.

Los programas que se pueden usar para la modelización por ordenador incluyen Quanta (Molecular Simulations, Inc.) y Sibyl (Tripos Associates). Otros programas útiles son Autodock (Scripps Research Institute, La Jolla, descrito en Goodsell y Olsen (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics, 8, 195-201), Dock (University of California, San Francisco, descrito en: Kuntz et al. (1982) J. Mol. B io l. 161,269-288.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para identificar un ligando capaz de unirse al sitio de unión 1 y/o al sitio de unión 2 y/o al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. generar la estructura espacial del sitio de unión en una pantalla de ordenador usando coordenadas atómicas como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A, b. generar ligandos potenciales con su estructura espacial en la pantalla del ordenador, y

c. seleccionar ligandos que se pueden unir a al menos 1 resto de aminoácido del conjunto de sitios de interacción de unión sin interferencia estérica.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método asistido por ordenador para identificar un ligando de sortilina capaz de unirse al sitio de unión 1 y/o al sitio de unión 2 y/o al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, usando un ordenador programado que comprende un procesador, un sistema de almacenamiento de datos, un dispositivo de entrada de datos y un dispositivo de salida de datos, que comprende las siguientes etapas:

a. introducir en el ordenador programado a través de dicho dispositivo de entrada, datos que comprenden: coordenadas atómicas de un subconjunto de los átomos de dicha sortilina, generando así un conjunto de datos de criterios; en donde dichas coordenadas atómicas se seleccionan de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A,

b. comparar, usando dicho procesador, el conjunto de datos de criterios con una base de datos informática de estructuras químicas orgánicas de bajo peso molecular y fragmentos de péptidos almacenados en el sistema de almacenamiento de datos; y

c. seleccionar de dicha base de datos, usando métodos informáticos, una estructura química que tiene una parte que es estructuralmente complementaria al conjunto de datos de criterios y carece de interferencia estérica con el receptor sortilina.

a. seleccionar un ligando potencial usando coordenadas atómicas conjuntamente con la modelización por ordenador, en donde dichas coordenadas atómicas son las coordenadas atómicas presentadas en cualquiera de las figuras 17 a 20 o en donde las coordenadas atómicas se seleccionan de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A, acoplando ligandos potenciales en un conjunto de sitios de interacción de unión en el sitio de unión 1 y/o sitio de unión 2 y/o sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, generada dicha interacción de unión por modelización por ordenador y seleccionando un ligando potencial capaz de unirse a al menos un aminoácido en dicho conjunto de sitios de interacción de unión de la sortilina,

b. proporcionar dicho ligando potencial y dicho receptor sorilina

c. poner en contacto el ligando potencial con dicho receptor sortilina y

d. detectar la unión de dicho receptor sortilina por el ligando potencial.

En una realización de la presente descripción, el acoplamiento de moléculas de ligando potenciales se lleva a cabo usando una estructura tridimensional definida por coordenadas atómicas de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 y de modo que dicho ligando potencial es capaz de unirse a al menos tres aminoácidos en el sitio de unión 1 y/o el sitio de unión 2 y/o el sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para identificar un ligando potencial del sitio de unión 1, el sitio de unión 2 o el sitio de unión 3 de la sortilina, o uno de sus fragmentos o variantes, comprendiendo dicho método las etapas de

a. introducir en un ordenador información derivada de coordenadas atómicas que definen una conformación del sitio de unión 1 y/o sitio de unión 2 y/o sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, basado en la determinación de estructura tridimensional, mediante lo cual un programa de ordenador usa o presenta en la pantalla del ordenador la estructura de dicha conformación; en donde dichas coordenadas atómicas se seleccionan de la estructura tridimensional como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de una cualquiera de las estructuras tridimensionales representadas por cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A;

b. generar una representación tridimensional del sitio de unión 1, sitio de unión 2 o sitio de unión 3 de la sortilina mediante dicho programa informático en una pantalla de ordenador;

c. superponer un modelo de un ligando potencial sobre la representación de dicho sitio de unión 1, sitio de unión 2 o sitio de unión 3 de la sortilina o uno de sus fragmentos o variantes,

d. evaluar la posibilidad de unión y la ausencia de interferencia estérica del ligando potencial con el sitio de unión de neurotensina de alta afinidad, el sitio de unión de neurotensina de baja afinidad, el sitio de unión del propéptido de sortilina o el sitio de unión de pro-neurotrofina de la sortilina;

e. incorporar dicho compuesto de ligando potencial en un ensayo de unión de dicho receptor sortilina y

f. determinar si dicho ligando potencial inhibe la unión de un ligando competidor seleccionado del grupo que consiste en, pero no se limita a los restos de aminoácidos 19 a 241 de la SEQ ID NO 6 (proNGF), restos de aminoácidos 19 a 121 de la SEQ ID NO 6 (prodominio de NGF), restos de aminoácidos 19 a 246 de la SEQ ID NO 7 (proBDNF), restos de aminoácidos 19 a 127 de la SEQ ID NO 7 (prodominio de BDNF), restos de aminoácidos de 17 a 257 de la SEQ ID NO 8 (proNT3), restos de aminoácidos 17 a 140 de la SEQ ID n O 8 (prodominio NT3), restos de aminoácidos 25 a 210 de la SEQ ID NO 9 (proNT4/5), restos de aminoácidos 25 a 80 de la SEQ ID ⁿO 9 (prodominio de NT4/5), SEQ ID NO. 10 (Neurotensina), SEQ ID NO. 11 (PYIL), restos de aminoácidos 11a 13 de la SEQ ID NO. 10 (YIL) y SEQ ID NO. 12 (NT69L).

En una realización adicional de la presente descripción, se usa la información derivada de las coordenadas atómicas de al menos uno de los siguientes restos de aminoácidos del sitio de unión 1: R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306, T398 a G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 y T402 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, se usa la información derivada de las coordenadas atómicas de al menos uno de los siguientes restos de aminoácidos del sitio de unión 2: L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 y S584 a F588 de la SEQ ID NO. 1 para la predicción y/o diseño de ligandos.

En una realización adicional de la presente descripción, se usa información derivada de las coordenadas atómicas de al menos uno de los siguientes restos de aminoácidos del sitio de unión 3: D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el conjunto de criterios de datos o conjunto de interacción de unión comprende al menos 3 restos de aminoácidos seleccionados de los grupos identificados.

En una realización adicional de la presente descripción, las coordenadas atómicas se determinan en una resolución de al menos 5 A.

En una realización adicional de la presente descripción, las coordenadas atómicas se determinan en una resolución de al menos 4 A.

En una realización adicional de la presente descripción, las coordenadas atómicas se determinan en una resolución de al menos 3 A.

En una realización adicional de la presente descripción, las coordenadas atómicas se determinan en una resolución de al menos 2 A.

En una realización adicional de la presente descripción, las coordenadas atómicas se determinan en una resolución de al menos 1,5 A.

En una realización adicional de la presente descripción, la molécula de ligando potencial interacciona con al menos aminoácidos en el sitio de unión de neurotensina de alta afinidad de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, la molécula de ligando potencial interacciona con al menos aminoácidos en el sitio de unión a neurotensina de baja afinidad de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, la molécula de ligando potencial interacciona con al menos aminoácidos en el sitio de unión del propéptido de sortilina de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, la molécula de ligando potencial interacciona con al menos aminoácidos en el sitio de unión pro-neurotrofina de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el ligando potencial se selecciona del grupo que consiste en péptidos no hidrolizables y análogos de péptidos, compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos.

En una realización adicional de la presente descripción, se criba una biblioteca de moléculas orgánicas pequeñas. En una realización adicional de la presente descripción, se criba una biblioteca de ligandos peptídicos potenciales. En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un ligando identificado por el método descrito en la presente memoria antes, dicho ligando capaz de unirse a al menos un punto de interacción de dicho sitio de unión 1, comprendiendo dichos puntos de interacción X1, X2, X3, X4, R1, R2, J1, J2 y J3 de SEQ ID NO. 1 en donde

X1 comprende los restos de aminoácidos R325, S316 y Y351, y

en donde

X2 comprende el carbonilo de la cadena principal de Y351 y en donde

X3 comprende la cadena principal de I353 y en donde

X4 comprende el grupo amino de K260 y en donde

R1 comprende los restos de aminoácido I327, F314, Y351, I353 y M363 y en donde

J1 comprende S305 y en donde

J2 comprende la amida de la cadena principal de F306 y en donde

J3 comprende el carbonilo de la cadena principal de F306.

En una realización adicional de la presente descripción, el punto de interacción X1 comprende una carga negativa y/o propiedades de aceptor de hidrógeno, dicha carga negativa y/o propiedades de aceptor de hidrógeno seleccionadas del grupo que consiste en carboxilato, ácido sulfónico, difluoro, careciendo dicho difluoro de carga negativa para compensar la carga positiva de la arginina, dicloro careciendo dicho dicloro de una carga negativa para compensar la carga positiva de la arginina.

En una realización adicional de la presente descripción, el ligando como se ha definido antes en la presente memoria comprende en el punto de interacción X2 un donador de enlace de hidrógeno seleccionado del grupo que consiste en hidroxilo, amino y amido.

En una realización adicional de la presente descripción, el ligando como se ha definido antes en la presente memoria comprende en el punto de interacción X3 comprende un aceptor de enlace de hidrógeno seleccionado del grupo que consiste en carbonilo, cloro y flúor.

En una realización adicional de la presente descripción, el ligando como se ha definido antes en la presente memoria comprende en el punto de interacción R1 un grupo hidrófobo voluminoso seleccionado del grupo que consiste en ciclohexil-alanina, leucina, isoleucina metionina y fenilalanina.

En una realización adicional de la presente descripción, el ligando como se ha definido antes en la presente memoria comprende en el punto de interacción R2 un resto de aminoácido hidrófobo seleccionado del grupo que consiste en isoleucina, leucina, cisteína o un grupo parcialmente hidrófobo seleccionado del grupo que consiste en histidina, glutamina, lisina, arginina y glutamato.

En una realización adicional de la presente descripción, el ligando identificado por el método descrito antes en la presente memoria es capaz de inhibir la unión al sitio de unión 1 y/o sitio de unión 2 y/o sitio de unión 3 del receptor sortilina con dominio Vps10p, o uno de sus fragmentos o variantes.

c. identificar un receptor con dominio Vps10p, o uno de sus fragmentos o variantes, que tenga al menos 20% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO. 1, y

d. usando las coordenadas atómicas como se presentan en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de la estructura tridimensional presentada en cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de proteína de no más de 3 A,

En una realización adicional de la presente descripción, el receptor con dominio Vps10p que se construirá de acuerdo con el método definido anteriormente en la presente memoria, se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 (SorLA), SEQ ID NO. 3 (SorCS1), SEQ ID NO. 4 (SorCS2) y SEQ ID NO. 5 (SorCS3) o uno de sus fragmentos o variantes.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para identificar un ligando potencial de un receptor con dominio Vps10p, o uno de sus fragmentos o variantes, comprendiendo dicho método las etapas de: a) introducir en un ordenador, información derivada de coordenadas atómicas que definen una conformación de un sitio de unión que tiene al menos 20% de identidad de secuencia con el sitio de unión 1 y/o 2 y/o el sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 (sortilina), o uno de sus fragmentos o variantes, basado en la determinación de estructura tridimensional, mediante lo cual un programa informático usa o presenta en la pantalla del ordenador la estructura de dicha conformación; en donde dichas coordenadas atómicas se seleccionan de la estructura tridimensional como se presenta en cualquiera de las figuras 17 a 20 o coordenadas atómicas seleccionadas de una estructura tridimensional que se desvía de cualquiera de las estructuras tridimensionales representadas por cualquiera de las figuras 17 a 20 por una desviación cuadrática media a lo largo de los átomos de la cadena principal de la proteína de no más de 3 A

b) generar una representación tridimensional de un sitio de unión que tiene al menos 20% de identidad de secuencia con el sitio de unión 1, el sitio de unión 2 o el sitio de unión 3 de la sortilina, o uno de sus fragmentos o variantes, mediante dicho programa informático en una pantalla de ordenador;

c) superponer un modelo de un ligando potencial sobre la representación de dicho sitio de unión que tiene al menos 20% de identidad de secuencia con el sitio 1, el sitio de unión 2 o el sitio de unión 3 de la sortilina,

d) evaluar la posibilidad de unión y la ausencia de interferencia estérica del ligando potencial con el sitio de unión que tiene al menos 20% de identidad de secuencia con el sitio de unión 1, el sitio de unión 2 o el sitio de unión 3 de la sortilina o uno de sus fragmentos o variantes;

e) incorporar dicho potencial compuesto ligando en un ensayo de unión de dicho receptor con dominio Vps10p y f) determinar si dicho ligando potencial es capaz de unirse a dicho sitio de unión que tiene al menos 20% de identidad de secuencia con el sitio de unión 1 y/o el sitio de unión 2 y/o el sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1 llevando a cabo un ensayo de unión competitiva bioquímica o biofísica en donde el ligando competitivo se selecciona del grupo que consiste en los restos de aminoácidos 19 a 241 de la SEQ ID NO 6 (proNGF), restos de aminoácidos 19 a 121 de la SEQ ID NO 6 (prodominio de NGF), restos de aminoácidos 19 a 246 de la SEQ ID NO 7 (proBDNF), restos de aminoácidos 19 a 127 de la SEQ ID NO 7 (prodominio de BDNF), restos de aminoácidos 17 a 257 de la SEQ ID NO 8 (proNT3), restos de aminoácidos 17 a 140 de la SEQ ID NO 8 (prodominio de NT3), restos de aminoácidos 25 a 210 de la SEQ ID NO 9 (proNT4/5), restos de aminoácidos 25 a 80 de la SEQ ID NO 9 (prodominio de NT4/5), SEQ ID NO. 10 (neurotensina), s Eq ID NO. 11 (PYIL), restos de aminoácidos 11 a 13 de la SeQ ID NO. 10 (YIL) y SEQ ID NO. 12 (Nt69L) o un fragmento o variante de dicho ligando competitivo.

Medicamento

En un aspecto, la presente descripción se refiere a un medicamento que comprende un inhibidor de sortilina identificado como se ha descrito antes en la presente memoria.

En una realización de la presente descripción, el al menos un ligando identificado por los métodos descritos antes en la presente memoria se usa para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento es para el tratamiento, y la prevención o tratamiento y prevención y/o protección frente a una enfermedad, trastorno o daño del sistema nervioso en un individuo.

En una realización adicional de la presente descripción, el individuo mencionado antes es un ser humano.

En una realización adicional de la presente descripción, el medicamento mencionado antes es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño que implica una lesión en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos.

En una realización de la presente descripción, la lesión definida antes en la presente memoria se debe a accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, lesión axonal difusa, epilepsia, neuropatía o neuropatía periférica y dolor asociado.

En una realización de la presente descripción, el trastorno del sistema nervioso implica la degeneración de las neuronas y sus procesos en el cerebro, el tronco encefálico, médula espinal y/o los nervios periféricos.

En una realización adicional de la presente descripción, la degeneración de las neuronas se debe a la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y lesión neuronal asociada con la esclerosis múltiple.

En una realización de la presente descripción, la enfermedad neurodegenerativa como se ha descrito antes en la presente memoria es la enfermedad de Parkinson.

En una realización de la presente descripción, la enfermedad neurodegenerativa como se ha descrito antes en la presente memoria es la enfermedad de Huntington.

En una realización de la presente descripción, la enfermedad neurodegenerativa como se ha descrito antes en la presente memoria es la esclerosis lateral amiotrófica.

En una realización de la presente descripción, el trastorno del sistema nervioso como se ha descrito antes en la presente memoria es una enfermedad, trastorno o daño que implica una disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos.

En una realización adicional de la presente descripción, la enfermedad, trastorno o daño mencionados antes que implican disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos, se seleccionan del grupo que consiste en afecciones causadas por enfermedades metabólicas, deficiencias nutricionales, lesión tóxica, neoplasias malignas y/o afecciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no se limitan a diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, drogadicción, deficiencia de vitaminas e infecciones.

En una realización de la presente descripción, la enfermedad es la neuropatía periférica y el dolor asociado.

En otra realización de la presente descripción, la enfermedad es dolor general que incluye dolor asociado con el sistema nervioso central.

En una realización de la presente descripción, el trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño que implica degeneración o esclerosis de la glía, en donde dicha glía se selecciona del grupo que consiste en oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, tallo encefálico, médula espinal, y los nervios periféricos.

En una realización de la presente descripción, dicha enfermedad, trastorno o daño que implica degeneración o esclerosis de la glía se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis postinfecciosa y epilepsia.

En una realización de la presente descripción, la enfermedad o trastorno es la esclerosis múltiple, ataxia sensorial, trastornos espinocerebelosos neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelosas y alcoholismo.

En una realización de la presente descripción, el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados.

En una realización de la presente descripción, el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso que implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados se selecciona del grupo que consiste en retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma y retinopatía diabética.

En una realización de la presente descripción, el trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica el epitelio sensorial y los ganglios asociados del complejo del vestíbulo auricular.

En una realización de la presente descripción, dicho trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso que implica el epitelio sensorial y los ganglios asociados del complejo vestíbulo auricular se selecciona del grupo que consiste en pérdida de audición inducida por ruido, sordera, acúfenos, otitis, laberintitis, atrofias hereditarias y cocleovestibulares y enfermedad de Menieres.

En una realización de la presente descripción, el medicamento como se ha definido antes en la presente memoria comprende opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización de la presente descripción, el medicamento como se ha descrito antes en la presente memoria comprende un segundo ingrediente activo seleccionado del grupo que consiste en un ligando capaz de unirse al sitio de unión de la neurotensina de alta afinidad (sitio de unión 1), un ligando capaz de unirse al sitio de unión de la neurotensina de baja afinidad (sitio de unión 2), un ligando capaz de unirse a los sitios de unión del propéptido de sortilina (sitios de unión 1 y 2) y un ligando capaz de unirse al sitio de unión de la pro-neurotrofina (sitio de unión 3) de la SEQ ID NO. 1.

Formas de administración

Las principales vías de administración del fármaco en el método de tratamiento, son intravenosa, oral y tópica. También están contemplados otros métodos de administración de fármacos, como la inyección subcutánea o por inhalación, que son eficaces para administrar el fármaco en un sitio objetivo o para introducir el fármaco en el torrente sanguíneo.

La membrana mucosa en la que se administra la preparación farmacéutica de la descripción puede ser cualquier membrana mucosa del mamífero al que se va a administrar la sustancia biológicamente activa, p. ej., en la nariz, vagina, ojo, boca, tracto genital, pulmones, tracto gastrointestinal o recto, preferiblemente la mucosa de la nariz, boca o vagina.

Los compuestos de la descripción se pueden administrar por vía parenteral, es decir, por administración intravenosa, intramuscular, subcutánea intranasal, intrarrectal, intravaginal o intraperitoneal. En general se prefieren las formas subcutáneas e intramusculares de administración parenteral. Las formas de dosificación adecuadas para dicha administración se pueden preparar por técnicas convencionales. Los compuestos también se pueden administrar por inhalación, que es por administración intranasal y por inhalación oral. Las formas de dosificación adecuadas para dicha administración, tales como una formulación de aerosol o un inhalador de dosis medida, se pueden preparar por técnicas convencionales.

Los compuestos de acuerdo con la descripción se pueden administrar con al menos otro compuesto. Los compuestos se pueden administrar simultáneamente, ya sea como formulaciones separadas o combinados en una forma de dosificación unitaria, o administrar secuencialmente.

Formulaciones

Aunque los compuestos o sales de la presente descripción se administren como el producto químico solo, se prefiere presentarlos en forma de una formulación farmacéutica. Por consiguiente, la presente descripción proporciona además una formulación farmacéutica, para aplicación medicinal, que comprende un compuesto de la presente descripción o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en la presente memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para ello.

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular en una amplia variedad de formas farmacéuticas de administración oral. Las composiciones farmacéuticas y formas farmacéuticas pueden comprender los compuestos de la descripción o su sal farmacéuticamente aceptable o una forma cristalina de los mismos como el componente activo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispersables. Un vehículo sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, conservantes, agentes humectantes, agentes de disgregación de comprimidos o un material de encapsulación.

Preferiblemente, la composición será de aproximadamente de 0.5% a 75% en peso de un compuesto o compuestos de la descripción, consistiendo el resto en excipientes farmacéuticos adecuados. Para administración oral, dichos excipientes incluyen calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares.

En polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que es una mezcla con el componente activo finamente dividido. En comprimidos, el componente activo se mezcla con el vehículo que tiene la capacidad aglutinante necesaria en proporciones adecuadas y se compacta en la forma y tamaño deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente de uno a aproximadamente setenta por ciento del compuesto activo. Los vehículos adecuados son carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. El término "preparación" pretende incluir la formulación del compuesto activo con material de encapsulación como vehículo que proporciona una cápsula en la que el componente activo, con o sin vehículos, está rodeado por un vehículo, que está en asociación con él. Igualmente, están incluidos sellos y pastillas. Los comprimidos, polvos, cápsulas, píldoras, sellos y pastillas pueden estar en formas sólidas adecuadas para la administración oral.

Las gotas según la presente descripción pueden comprender soluciones o suspensiones acuosas u oleosas estériles o no estériles, y se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una disolución acuosa adecuada, que incluye opcionalmente un agente bactericida y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, y que incluye opcionalmente un agente tensioactivo. La disolución resultante después se puede clarificar por filtración, transferir a un recipiente adecuado que después se sella y esteriliza mediante autoclave o se mantiene a 98-100°C durante media hora. Alternativamente, la solución se puede esterilizar por filtración y transferir al recipiente de forma aséptica. Los ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para incluir en las gotas son nitrato o acetato fenilmercúrico (0.002%), cloruro de benzalconio (0.01%) y acetato de clorhexidina (0.01%). Los disolventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y propilenglicol.

También se incluyen preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse, poco antes de su uso, en preparaciones en forma líquida para administración oral. Dichas formas líquidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, además del componente activo, colorantes, sabores, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

Otras formas adecuadas para la administración oral incluyen preparaciones en forma líquida que incluyen emulsiones, jarabes, elixires, soluciones acuosas, suspensiones acuosas, pasta de dientes, gel dentífrico, goma de mascar o preparaciones en forma sólida que están destinadas a convertirse poco antes de usar en preparaciones en forma líquida. Las emulsiones se pueden preparar en disoluciones en soluciones acuosas de propilenglicol o pueden contener agentes emulsionantes tales como lecitina, monooleato de sorbitán o goma arábiga. Las soluciones acuosas se pueden preparar disolviendo el componente activo en agua y añadiendo colorantes, aromas, agentes estabilizantes y espesantes adecuados. Las suspensiones acuosas se pueden preparar dispersando el componente activo finamente dividido en agua con material viscoso, como gomas naturales o sintéticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y otros agentes de suspensión bien conocidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, y pueden contener, además del componente activo, colorantes, aromas, estabilizantes, tampones, edulcorantes artificiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes solubilizantes y similares.

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular para administración parenteral (p. ej., por inyección, por ejemplo, inyección de bolo o infusión continua) y se pueden presentar en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, por ejemplo soluciones en polietilenglicol acuoso. Los ejemplos de vehículos, diluyentes, disolventes o vehículos oleosos o no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables (p. ej., oleato de etilo), y pueden contener agentes de formulación tales como agentes conservantes, humectantes, emulsionantes o de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico del sólido estéril o por liofilización de la solución para constituir antes de usar con un vehículo adecuado, p. ej., agua sin pirógenos, estéril. Los aceites útiles en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites útiles en dichas formulaciones incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y minerales. Los ácidos grasos adecuados para usar en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para usar en formulaciones parenterales incluyen sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio; (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicéridos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros como, por ejemplo, alquil-p-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquilimidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán típicamente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 25% en peso del ingrediente activo en solución. Se pueden usar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, dichas composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dichas formulaciones variará típicamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos y sorbitán polietilénicos, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitarias o de dosis múltiples, tales como ampollas y viales, y se puede almacenar en un estado liofilizado (congelación-secado) que requiere solo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito previamente.

Los compuestos de la descripción también se pueden administrar por vía tópica. Las regiones para administración tópica incluyen la superficie de la piel y también los tejidos de la membrana mucosa de la vagina, recto, nariz, boca y garganta. Las composiciones para administración tópica a través de la piel y las membranas mucosas no deben dar lugar a signos de irritación, tales como hinchazón o enrojecimiento.

La composición tópica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable adaptado para la administración tópica. Por lo tanto, la composición puede tener la forma de una suspensión, solución, pomada, loción, lubricante sexual, crema, espuma, aerosol, pulverizador, supositorio, implante, inhalante, comprimido, cápsula, polvo seco, jarabe, bálsamo o pastilla, por ejemplo. Los métodos para preparar dichas composiciones son bien conocidos en la industria farmacéutica.

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular para administración tópica en la epidermis como pomadas, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Las pomadas y cremas se pueden formular, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones se pueden formular con una base acuosa u oleosa y en general también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes o agentes colorantes. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden agentes activos en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado.

Las cremas, pomadas o pastas de acuerdo con la presente descripción son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Se pueden hacer mezclando el ingrediente activo en forma finamente dividida o en polvo, solo o en solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, con la ayuda de maquinaria adecuada, con una base grasa o no grasa. La base puede comprender hidrocarburos tales como parafina dura, blanda o líquida, glicerol, cera de abeja, un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como aceite de almendra, maíz, cacahuete, ricino u oliva; grasa de lana o sus derivados o un ácido graso tal como ácido estérico u oleico junto con un alcohol tal como propilenglicol o un macrogel. La formulación puede incorporar cualquier agente tensioactivo adecuado, tal como un tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, tal como un éster de sorbitán o un derivado polioxietilénico del mismo. También se pueden incluir agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silicáceas, y otros ingredientes tales como lanolina.

Las lociones de acuerdo con la presente descripción incluyen aquellas adecuadas para la aplicación en la piel u ojo. Una loción ocular puede comprender una solución acuosa estéril que contiene opcionalmente un bactericida y se puede preparar por métodos similares a los de la preparación de gotas. Las lociones o linimentos para aplicar en la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y enfriar la piel, tal como un alcohol o acetona, y/o un humectante tal como el glicerol o un aceite tal como el aceite de ricino o aceite de cacahuete.

Suministro transdérmico

Los complejos de agente farmacéutico-modificador químico descritos en la presente memoria se pueden administrar por vía transdérmica. La administración transdérmica típicamente implica el suministro de un agente farmacéutico para el paso percutáneo del fármaco a la circulación sistémica del paciente. Los sitios de la piel incluyen regiones anatómicas para la administración por vía transdérmica del fármaco e incluyen el antebrazo, abdomen, tórax, espalda, nalgas, área mastoidea y similares.

El suministro transdérmico se lleva a cabo exponiendo una fuente del complejo a la piel de un paciente durante un período de tiempo prolongado. Los parches transdérmicos tienen la ventaja adicional de proporcionar suministro controlado de un complejo de agente farmacéutico-modificador químico al cuerpo. Véase, ^{T ransd e rm a l D ru g D e live ry : D e ve lo p m e n ta l Issue s a n d R e sea rch In itia tives,} Hadgraft y Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); ^{C o n tro lle d D ru g D e live ry : F u n d a m e n tá is a n d A pp lica tion s ,} Robinson y Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); y ^{T ra n sd e rm a l D e liv e ry o f D rugs,} Vols. 1-3, Kydonieus y Berner (eds.), CRC Press, (1987). Dichas formas farmacéuticas se pueden hacer disolviendo, dispersando o incorporando de otra manera el complejo de agente farmacéutico-modificador químico en un medio apropiado, tal como un material de matriz elastómera. También se pueden usar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad de dicho flujo se puede controlar proporcionando una membrana que controla la velocidad o dispersando el compuesto en una matriz polimérica o gel.

Suministro transdérmico pasivo de fármacos

Una variedad de tipos de parches transdérmicos serán útiles en los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede preparar un parche adhesivo simple a partir de un material de soporte y un adhesivo de acrilato. El complejo de agente farmacéutico-modificador químico y cualquier potenciador se formulan en la solución de moldeo adhesiva y se dejan mezclar completamente. La solución se moldea directamente sobre el material de soporte y el disolvente de moldeo se evapora en un horno, dejando una película adhesiva. El forro desprendible se puede adjuntar para completar el sistema.

Alternativamente, se puede usar un parche de matriz de poliuretano para suministrar el complejo de agente farmacéutico-modificador químico. Las capas de este parche comprenden un soporte, una matriz de fármaco/potenciador de poliuretano, una membrana, un adhesivo y un forro desprendible. La matriz de poliuretano se prepara usando un prepolímero de poliuretano de curado a temperatura ambiente. La adición de agua, alcohol y complejo al prepolímero da como resultado la formación de un elastómero firme y pegajoso que se puede moldear directamente solo en el material de soporte.

Una realización adicional de esta descripción usará un parche de matriz de hidrogel. Típicamente, la matriz de hidrogel comprenderá alcohol, agua, fármaco y varios polímeros hidrófilos. Esta matriz de hidrogel se puede incorporar en un parche transdérmico entre el soporte y la capa adhesiva.

El parche de depósito de líquido también encontrará uso en los métodos descritos en la presente memoria. Este parche comprende un material de soporte impermeable o semipermeable, termosellable, una membrana termosellable, un adhesivo para la piel sensible a la presión basado en acrilato y un forro desprendible siliconado. El soporte se sella térmicamente a la membrana para formar un depósito que después se puede llenar con una solución del complejo, potenciadores, agente gelificante y otros excipientes.

Los parches de matriz de espuma son similares en diseño y componentes al sistema de depósito de líquido, excepto que la solución de agente farmacéutico-modificador químico gelificada está restringida en una capa de espuma delgada, típicamente un poliuretano. Esta capa de espuma está situada entre el soporte y la membrana que se han sellado térmicamente en la periferia del parche.

En los sistemas de suministro pasivo, la velocidad de liberación se controla típicamente mediante una membrana colocada entre el depósito y la piel, por difusión desde un dispositivo monolítico, o por la propia piel que funciona como una barrera que controla la velocidad en el sistema de administración. Véanse las patentes de EE.UU. N° 4 816 258; 4 927 408; 4 904 475; 4 588 580, 4 788 062; y similares. La velocidad de suministro del fármaco dependerá, en parte, de la naturaleza de la membrana. Por ejemplo, la tasa de suministro de fármaco a través de las membranas dentro del cuerpo es generalmente más alta que a través de las barreras dérmicas. La velocidad a la que se suministra el complejo desde el dispositivo a la membrana se controla más ventajosamente usando membranas limitantes de la velocidad que se colocan entre el depósito y la piel. Suponiendo que la piel es suficientemente permeable al complejo (es decir, la absorción a través de la piel es mayor que la velocidad de paso a través de la membrana), la membrana servirá para controlar la velocidad de dosificación experimentada por el paciente.

Los materiales de membrana permeables adecuados se pueden seleccionar basándose en el grado deseado de permeabilidad, la naturaleza del complejo y las consideraciones mecánicas relacionadas con la construcción del dispositivo. Los materiales de membrana permeables de ejemplo incluyen una amplia variedad de polímeros naturales y sintéticos, tales como polidimetilsiloxanos (cauchos de silicona), copolímero de etileno-acetato de vinilo (EVA), poliuretanos, copolímeros de poliuretano-poliéter, polietilenos, poliamidas, poli(cloruros de vinilo) (PVC), polipropilenos, policarbonatos, politetrafluoroetilenos (PTFE), materiales celulósicos, p. ej., triacetato de celulosa y nitrato/acetato de celulosa e hidrogeles, p. ej., metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA).

Pueden estar contenidos otros elementos en el dispositivo, tales como otros componentes convencionales de productos terapéuticos, dependiendo de las características del dispositivo deseado. Por ejemplo, las composiciones de acuerdo con esta descripción también pueden incluir uno o más conservantes o agentes bacteriostáticos, p. ej., hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, clorocresol, cloruros de benzalconio y similares. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener otros ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, en particular antibióticos, anestésicos, analgésicos y agentes antipruríticos.

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular para administración como supositorios. Primero se funde una cera de bajo punto de fusión, tal como una mezcla de glicéridos de ácidos grasos o manteca de cacao, y el componente activo se dispersa de manera homogénea, por ejemplo, por agitación. La mezcla homogénea fundida después se vierte en moldes de tamaño conveniente, se deja enfriar y solidificar.

El compuesto activo se puede formular en un supositorio que comprende, por ejemplo, de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 50% de un compuesto de la descripción, dispuesto en un vehículo de polietilenglicol (PEG) (p. ej., PEG 1000 [96%] y PEG 4000 [4%].

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular para administración vaginal. Los pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen, además del ingrediente activo, dichos vehículos se conocen en la técnica como adecuados.

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular para administración nasal. Las soluciones o suspensiones se aplican directamente en la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo con un cuentagotas, pipeta o pulverizador. Las formulaciones se pueden proporcionar en forma de dosis unitaria o múltiple. En este último caso, de un cuentagotas o pipeta, esto se puede lograr si el paciente administra un volumen adecuado y predeterminado de la solución o suspensión. En el caso de un pulverizador, esto se puede lograr, por ejemplo, mediante una bomba de pulverización por atomización dosificadora.

Los compuestos de la presente descripción se pueden formular para administración en aerosol, particularmente para el tracto respiratorio e incluyendo la administración intranasal. El compuesto generalmente tendrá un tamaño de partículas pequeño, por ejemplo, del orden de 5 micrones o menos. Dicho tamaño de partícula se puede obtener por medios conocidos en la técnica, por ejemplo, por micronización. El ingrediente activo se proporciona en un envase presurizado con un propulsor adecuado, tal como un clorofluorocarbono (CFC), por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano o diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol también puede contener convenientemente un tensioactivo tal como lecitina. La dosis de fármaco se puede controlar mediante una válvula dosificadora. Alternativamente, los ingredientes activos se pueden proporcionar en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla en polvo del compuesto en una base en polvo adecuada tal como lactosa, almidón, derivados de almidón tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidina (PVP). El vehículo en polvo formará un gel en la cavidad nasal. La composición en polvo se puede presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cápsulas o cartuchos de, p. ej., gelatina o envases tipo blíster a partir de los cuales se puede administrar el polvo mediante un inhalador.

Cuando se desee, las formulaciones se pueden preparar con recubrimientos entéricos adaptados para la administración de liberación sostenida o controlada del ingrediente activo.

Las preparaciones farmacéuticas están preferiblemente en formas de dosificación unitaria. En dicha forma, la preparación se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo. La forma de dosificación unitaria puede ser una preparación envasada, conteniendo el envase cantidades discretas de preparación, tales como comprimidos, cápsulas y polvos envasados en viales o ampollas. Además, la forma de dosificación unitaria puede ser una cápsula, comprimido, sello o pastilla, o puede ser el número adecuado de cualquiera de estos en forma envasada.

Sales farmacéuticamente aceptables

Las sales farmacéuticamente aceptables de los presentes compuestos, cuando se pueden preparar, también se pretende que estén cubiertas por esta descripción. Estas sales serán las que sean aceptables en su aplicación para un uso farmacéutico. Por eso se entiende que la sal retendrá la actividad biológica del compuesto original y que la sal no tendrá efectos adversos o perjudiciales en su aplicación y uso en el tratamiento de enfermedades.

Las sales farmacéuticamente aceptables se preparan de una manera convencional. Si el compuesto original es una base, se trata con un exceso de un ácido orgánico o inorgánico en un disolvente adecuado. Si el compuesto original es un ácido, se trata con una base inorgánica u orgánica en un disolvente adecuado.

Los compuestos de la descripción se pueden administrar en forma de una sal de metal alcalino o metal alcalinotérreo de los mismos, de forma concurrente, simultánea o junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, en especial y preferiblemente en forma de una composición farmacéutica de los mismos, ya sea por vía oral, rectal o parenteral (incluso subcutánea), en una cantidad eficaz.

Los ejemplos de sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables para usar en la composición farmacéutica de la presente invención incluyen los derivados de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico, p-toluenosulfónico y arilsulfónico, por ejemplo.

En una realización de la presente descripción, el pH de la composición de medicamento como se ha descrito antes en la presente memoria está entre pH 5 y pH 9.

En una realización de la presente descripción, el medicamento como se ha descrito antes en la presente memoria se formula para administración por inyección, supositorio, administración oral, comprimido sublingual o pulverizador, administración cutánea o inhalación.

En una realización de la presente descripción, dicho medicamento se formula para administración por inyección en donde la inyección es intravenosa, intramuscular, intraespinal, intraperitoneal, subcutánea, un bolo o una administración continua.

En una realización, el medicamento de acuerdo con la presente descripción se administra en intervalos de 30 minutos a 24 horas.

En una realización, el medicamento de acuerdo con la presente descripción se administra en intervalos de 1 a 6 horas.

En una realización de acuerdo con la presente descripción, la duración de la administración del medicamento como se ha definido antes en la presente memoria es de 6 a 72 horas.

En una realización de acuerdo con la presente descripción, la dosis del medicamento definido antes en la presente memoria está entre 10 |jg y 10 mg por kg de masa corporal.

Método de tratamiento

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere al uso de al menos un ligando identificado mediante el método descrito antes en la presente memoria, para la fabricación de un medicamento, en donde dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno, o daño del sistema nervioso en un individuo. En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método de tratamiento de una afección patológica en un sujeto que comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz del medicamento descrito antes en la presente memoria.

En una realización de la presente descripción, dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño asociado con el sistema nervioso.

En otra realización de la presente descripción, dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño que implica lesión en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos, que incluye, pero no se limita a afecciones tales como como accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, lesión axonal difusa, epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado.

En otra realización de la presente descripción, dicho medicamento es para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o daño que implica una lesión en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos, que incluye, pero no se limita a dolor general, Incluyendo dolor asociado con el sistema nervioso central.

En una realización adicional de la presente descripción, el trastorno del sistema nervioso descrito antes en la presente memoria implica la degeneración de las neuronas y sus procesos en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos.

En una realización adicional de la presente descripción, dicha degeneración de las neuronas se debe a la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, demencia senil, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica la lesión neuronal asociada con la esclerosis múltiple.

En una realización de la presente descripción, dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson. En una realización adicional de la presente descripción, dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Huntington.

En una realización adicional de la presente descripción, dicha enfermedad neurodegenerativa es la esclerosis lateral amiotrófica.

En una realización adicional de la presente descripción, el trastorno del sistema nervioso descrito antes en la presente memoria es una enfermedad, trastorno o daño que implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos.

En una realización adicional de la presente descripción, dicha enfermedad, trastorno o daño que implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, tallo encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos se selecciona del grupo que consiste en afecciones causadas por enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesión tóxica, neoplasia maligna y/o afecciones genéticas o idiopáticas que incluyen, pero no se limitan a diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, drogadicción, deficiencia de vitaminas e infección.

En una realización adicional de la presente descripción, dicha enfermedad es neuropatía periférica y dolor asociado. En una realización adicional de la presente descripción, dicho trastorno del sistema nervioso es una enfermedad, trastorno o daño que implica degeneración o esclerosis de la glía, en donde dicha glía se selecciona del grupo que consiste en oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y nervios periféricos.

En una realización adicional de la presente descripción, dicha enfermedad, trastorno o daño que implica degeneración o esclerosis de la glía se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis postinfecciosa y epilepsia.

En una realización adicional de la presente descripción, dicha enfermedad o trastorno es esclerosis múltiple, ataxia sensorial, trastornos espinocerebelosos neurodegenerativos, ataxia hereditaria, atrofias cerebelosas y alcoholismo. En una realización adicional de la presente descripción, dicho trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados, en donde dicho trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso que implica la retina, fotorreceptores y nervios asociados se selecciona del grupo que consiste en retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma y retinopatía diabética.

En una realización adicional de la presente descripción, dicho trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso implica el epitelio sensorial y los ganglios asociados del complejo vestíbulo-auricular.

En una realización adicional de la presente descripción, dicho trastorno, enfermedad o daño del sistema nervioso que implica el epitelio sensorial y los ganglios asociados del complejo vestíbulo-auricular se selecciona del grupo que consiste en pérdida de audición inducida por ruido, sordera, acúfenos, otitis, laberintitis, atrofias hereditarias y cocleovestibulares y enfermedad de Menieres.

En una realización de la presente descripción, el sujeto como se ha descrito antes en la presente memoria es un ser humano.

Apoptosis

La apoptosis puede ocurrir cuando una célula se daña más allá de la reparación, es infectada por un virus o sufre condiciones de estrés tales como la inanición. La "decisión" para la apoptosis puede provenir de la propia célula, del tejido circundante o de una célula que forma parte del sistema inmunitario. En estos casos, la apoptosis funciona para eliminar la célula dañada, evitando así que absorba nutrientes adicionales del organismo, o para prevenir la propagación de una infección vírica.

La sortilina es un receptor tipo 1 multifuncional capaz de endocitosis así como de clasificación intracelular (9-11), y como se ha mostrado recientemente, también está implicada en la señalización produciendo la inducción por proneurotrofina de apoptosis neuronal mediada por p75NTR (6, 7, 12, 13).

La presente descripción proporciona métodos para diseñar ligandos que se unen específicamente al sitio de unión 1, sitio de unión 2 y sitio de unión 3, respectivamente, de la sortilina.

Está dentro del alcance de la presente descripción diseñar y proporcionar moléculas de ligando capaces de unirse al sitio de unión 1 y/o al sitio de unión 2 y/o al sitio de unión 3 de la sortilina como se ha definido antes en la presente memoria, evitando así la formación de un complejo ternario entre la sortilina, proNGF y p75NTR, inhibiendo así la apoptosis.

Por consiguiente, en una realización, los ligandos diseñados de acuerdo con la presente descripción son capaces de inhibir la apoptosis.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un método para diferenciar una composición de células de mamífero, que comprende administrar a dicha composición la molécula de ligando como se ha definido antes en la presente memoria.

Anticuerpos

Un anticuerpo se une fuertemente a una molécula objetivo particular, inactivándola así directamente o marcándola para su destrucción. El anticuerpo reconoce su objetivo (antígeno) con notable especificidad y fuerza dictada por la suma de muchas fuerzas químicas, que incluyen enlaces de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y de van der Waal, así como interacciones iónicas. En general, cuanto más complejo sea el objetivo químicamente, más inmunogénico será. El determinante antigénico puede abarcar tramos de aminoácidos lineales cortos o un módulo de proteína tridimensional más complicado.

Conceptualmente, los anticuerpos dirigidos contra un receptor objetivo pueden inhibir la unión del ligando de dos maneras: competitiva o alostérica. La inhibición competitiva implica la unión directa del anticuerpo en o cerca del sitio de unión del ligando en el receptor, desplazando así el ligando de su receptor o inhibiendo estéricamente el acercamiento del ligando al sitio de unión del ligando. La inhibición alostérica implica la unión del anticuerpo en un sitio en el polipéptido receptor que es distinto del epítopo de unión del ligando. Sin embargo, la unión a este sitio inducirá un cambio conformacional en la estructura general del receptor que hace que sea más difícil o incluso imposible que el ligando se una a su sitio de reconocimiento asociado.

Por consiguiente, en un aspecto importante de la presente descripción, se ha generado un anticuerpo, dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente al sitio de unión 1 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el anticuerpo generado es capaz de unirse específicamente al epítopo del ligando endógeno o exógeno capaz de unirse al sitio de unión 1 de la SEQ ID NO. 1, lo que dificulta estéricamente la unión de dicho ligando a dicho sitio de unión 1 de la SEQ ID NO. 1.

En otro aspecto de la presente descripción, se ha generado un anticuerpo, dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente al sitio de unión 2 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el anticuerpo generado es capaz de unirse específicamente al epítopo del ligando endógeno o exógeno capaz de unirse al sitio de unión 2 de la SEQ ID NO. 1, lo que dificulta estéricamente la unión de dicho ligando a dicho sitio de unión 2 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional muy preferida de la presente descripción, se ha generado un anticuerpo, dicho anticuerpo es capaz de unirse específicamente al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional, el anticuerpo generado es capaz de unirse específicamente al epítopo del ligando endógeno o exógeno capaz de unirse al sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1, lo que dificulta estéricamente la unión de dicho ligando a dicho sitio de unión 3 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 1 que incluye pero no se limita a R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306, T398 a G400, I303-G309, Q349-A356, Y395 y T402 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 1, que incluye pero no se limita a R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314, F350 a M363, S305, F306 y T398 a G400 de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 1, que incluye pero no se limita a R325, S316, Y351, I353, K260, I327, F314 y F350 a M363 de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 2, que incluye, entre otros, L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586, W597, T168-I174, L572, A573 y S584 a F588 de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 2 que incluye pero no se limita a L572, L114, V112, R109 a S111, S115 a G118, T570, G571, W586 y W597 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 2, que incluye pero no se limita a L572, L114 y V112 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 3, que incluye pero no se limita a D403, S420, D422, N423, S424, I425, E426, T451, Y466, E470, I498, S499 y V500 de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 3, que incluye pero no se limita a D403, N423, S424, I425, T451, Y466, I498 y V500 de SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha definido antes en la presente memoria se une a al menos un resto de aminoácido de o alrededor del sitio de unión 3, que incluye pero no se limita a T451, Y466, I498 y V500 de la SEQ ID NO. 1.

En una realización adicional de la presente descripción, el anticuerpo como se ha descrito antes en la presente memoria se selecciona del grupo que consiste en: anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos recombinantes.

En un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo como se ha descrito antes en la presente memoria y un conjugado seleccionado del grupo que consiste en: un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, una toxina o un isótopo radioactivo; un miembro de un par de unión específico, tal como avidina o estreptavidina o un antígeno; una enzima capaz de producir un producto detectable.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Vista general de la estructura de sortilina

A) Ilustración en dibujo de sSortilina:NT con una resolución de 2.6 A, vista hacia abajo del eje de la hélice desde el lado abierto del túnel. Las hojas individuales de la hélice están numeradas a lo largo del borde exterior. NT (Pro10-Tyr-Ile-Leu13) en el sitio de unión de NT de alta afinidad (sitio de unión 1) en la hoja 6 y NT (Leu2-Tyr-Glu-Asn-Lys6) en el sitio de unión 2 en la hoja 1 se muestra como barras. Los restos oligosacáridos de la glicosilación en Asn206, Asn450 y Asn626 también se muestran como barras.

B) Vista de sSortilina (a) después de una rotación de 90° alrededor de un eje horizontal. La hélice se muestra como una representación de superficie en gris. Los bucles hidrófobos que se extienden desde las hojas 1 y 10 están en gris oscuro. Los dominios 10CC se muestran como una representación de dibujo ilustrado.

C) Representación de superficie del complejo sSortilina:NT que se muestra en (a). La superficie de la hélice es gris clara, los dominios 10CC, las partes N y C-terminales de NT son gris oscuro, los bucles hidrófobos son negros. Se muestran las dimensiones del túnel a lo largo de las líneas discontinuas en el plano ecuatorial. La línea gris indica la posición de la sección transversal mostrada en d.

D) La sección transversal de la hélice con NT se muestra como barras. Se usa el mismo esquema de color que en (c). Esta vista está girada 180° alrededor de un eje vertical con respecto a la vista usada en (b).

La línea discontinua muestra la dimensión más grande en el plano ecuatorial.

E) La representación en la superficie de sSortilina coloreada por conservación de secuencia (Fig. 5). Las posiciones invariantes son de color gris oscuro. Los tres fragmentos de péptidos encontrados en la estructura de sortilina:NT de 2.6 A con un exceso de 15 veces de NT, así como las glicosilaciones, se muestran como barras. Izquierda: vista superior de sSortilina, es decir, la misma orientación que en C Derecha: vista inferior de sSortilina, es decir, 180° de rotación de la vista superior alrededor de un eje vertical.

Figura 2: Detalles de la unión del ligando

A) Unión de la parte N-terminal de la NT a sSortilina como se ve en la estructura de 2.6 A. Los tipos de átomos se indican con tonos de gris: Carbono (sSortilina) - gris claro,, Nitrógeno - gris oscuro, Oxígeno - gris más oscuro, y Carbono (NT) - el gris más oscuro. Los restos de neurotensina se superponen con el nivel 1a del mapa de densidad electrónica final de 2Fo-Fc de 2.6 A que se muestra como una malla de alambre. Las líneas discontinuas indican las posiciones de los enlaces de hidrógeno.

B) Unión de la parte C-terminal de NT a sortilina como se ve en la estructura de 2.0 A. Los restos Pro10-Tyr-Ile-Leu13 y los restos de sSortilina que forman el bolsillo de unión se muestran como barras. Codificación de colores como en (a). El mapa de densidad electrónica contorneado en 1a es el mapa final de 3Fo-2Fc de la estructura de 2.0 A.

C) Densidad electrónica del propéptido en el sitio de unión 2 de la hélice. El mismo conjunto de átomos de sSortilina que en el panel (a) se superpone a la cadena 1 de la hoja 1 de sSortilina:propéptido.

Codificación de colores como en el panel (a). La superficie 1a de la densidad electrónica final de 3Fc-2Fo de 3.2 A se muestra indicando la posición del propéptido unido.

D) Densidad electrónica del propéptido en la hélice en el sitio de unión de NT de alta afinidad. El mismo conjunto de átomos de sSortilina que en el panel (b) se superpone a la cadena 1 de la hoja 6 de la sSortilina:propéptido. La superficie 1a de la densidad electrónica final de 3Fc-2Fo de 3.2A se muestra indicando la posición del propéptido unido.

E) Unión del propéptido a través del túnel. Sección transversal de la estructura de sSortilina:propéptido como en la figura 1d. Se muestra la superficie 1a de la densidad de electrones final de 3Fc-2Fo de 3.2 A.

Figura 3: Efectos de NT y péptidos derivados en la unión de sSortilina.

Análisis de resonancia de plasmón de superficie de unión de ligando a sSortilina inmovilizada en ausencia o presencia de péptidos derivados de neurotensina. La numeración indica qué aminoácidos de NT (1-13) están contenidos en los péptidos individuales. Se indica la unión en presencia del tripéptido C-terminal 11-YIL-13 (NT 11 13). A-B) Unión del propéptido de sortilina marcado con GST (GST-Sort-pro); C) Unión del propéptido de NGF marcado con GST; D) Unión de RAP.

Figura 4: Secreción y unión de ligandos de receptores sSortilina y mutante de sSortilina

A) Rastreo de pulso de sortilina biomarcada con 35S en células CHO. Los receptores, wt o mutantes con las sustituciones de aminoácidos indicadas, inmunoprecipataron de lisados celulares o medio en los tiempos indicados. B) Unión de BDNF y el propéptido de sortilina a la sortilina y al mutante S283E purificado. Los receptores se inmovilizaron en concentraciones similares (0.06 pM/mm2) y la unión se analizó mediante SPR. Una mancha de plata del receptor mutante purificado se muestra como un recuadro. C) Unión del prodominio de NGF a sSortilina wt (panel superior) y al mutante S316E (panel inferior) en ausencia o presencia de un excedente de neurotensina. Figura 5: Alineamiento de secuencias de secuencias de sortilina. La numeración corresponde a la numeración de pre-pro-sortilina (de acuerdo con la SEQ ID NO 1. Las secuencias se identificaron mediante una búsqueda BLAST en la base de datos de proteínas no redundantes en NCBI: Bos_taurus:

ref|XP_588956.3|;

Canis_familiaris: ref|XP_537041.2|;

Rattus_norvegicus: ref|XP_001076150.1|;

Mus_musculus: ref|NP_064356.2|;

Ornithorhynchus_anatinus: ref|XP_001505243.1;

Tetraodon_nigroviridis: emb|CAG07500.1|;

Danio_rerio: ref|NP_998395.1|

y posteriormente se alinean con la construcción de sSortilina usando ClustalW. Solo se muestra la región correspondiente a la construcción de sSortilina con el marcador His C-terminal omitido. La vista del alineamiento se creó usando Jalview (34) y tonos coloreados de gris según la conservación en cada posición. Debajo de las secuencias, las barras gruesas indican la posición de la estructura secundaria asignada por DSSP (34). Debajo de esta línea las barras marcadas hoja 1 a 10 indican la posición de las hojas individuales de la hélice o indican la extensión de los dos dominios de 10CC. Los enlaces disulfuro se indican encima de las secuencias mediante líneas finas que conectan las dos cisteínas o están marcadas con el número de resto de la pareja disulfuro. Las barras azules muestran la posición de los dos bucles hidrófobos. Los asteriscos identifican los restos de asparagina glicosilados.

La N mayúscula identifica los restos implicados en la unión de la parte C-terminal de la neurotensina, mientras que la n minúscula identifica los restos implicados en la unión de la parte N-terminal de la neurotensina.

Figura 6: Vista general de la expresión y cristalización

Figura 7: Patrón de difracción de rayos X para resolución de 2 A

Figura 8: Estadísticas de refinamiento y diagrama de Ramachandran

Figura 9: Estadísticas de estructuras de hélice p que demuestran que la hélice p de la sortilina de 10 hojas es única, nueva e inesperada.

Figura 10: vista general de la unión del ligando PYIL a las estructuras mutantes de sortilina S316E y R325A en comparación con el tipo natural (WT).

Figura 11: Optimización de cristales de sortilina que comprenden un fragmento de propéptido de sortilina.

Figura 12: La figura representa la disposición de enlaces de hidrógeno del extremo C-terminal de la neurotensina, mostrada como Pro-Tyr-Ile-Leu, y la sortilina como se ve en la estructura 2.0 A de la sortilina luminal en complejo con la neurotensina. Solo los enlaces de hidrógeno de la leucina de la neurotensina son invariables, mientras que los de la isoleucina-353 y la lisina-260 con la tirosina de la neurotensina son variables.

Para ilustrar las interacciones hidrófobas entre sortilina y neurotensina, los restos de sortilina con átomos de carbono dentro de 4.2 A de los átomos de carbono de neurotensina se han enumerado junto a sus parejas de interacción. Figura 13: Cartografía de interacciones específicas del sitio de unión 1 con el extremo C-terminal de la neurotensina (NT) unida.

Figura 14: Cartografía de interacciones específicas del sitio de unión 1 con el péptido artificial NT69L (SEQ ID NO.

12) unido.

Figura 15: Vista general de la densidad en los dos sitios de unión de sortilina. El nuevo sitio de unión para el prodominio del factor de crecimiento nervioso es el sitio 3.

Figura 16: densidad de Fo-Fc en el sitio 3 que se muestra en 2.6. Los restos de sortilina implicados en la unión se muestran como barras y se están marcados con el tipo de aminoácido y el número de resto. La cadena principal de péptido del prodominio del factor de crecimiento nervioso se muestra superpuesta con la densidad electrónica. Figura 17: Coordenadas atómicas de sSortilina en complejo con un fragmento del prodominio de NGF.

Figura 18: Coordenadas atómicas a alta resolución (2 A) de sSortilina en complejo con neurotensina proporcionada en una relación molar 1:1.5 que da como resultado la ocupación del sitio de unión 1.

Figura 19: Coordenadas atómicas de sSortilina en complejo con la neurotensina proporcionada en una relación molar 1:15 que da como resultado la ocupación del sitio de unión 1 (sitio de alta afinidad) y el sitio de unión 2 (sitio de baja afinidad).

Figura 20: Coordenadas atómicas de sSortilina cristalizadas en complejo con el propio propéptido de sortilina. El propéptido se omite en este modelo.

Figura 21: Descripción general de los seis icosapéptidos del propéptido de NGF sintetizados para cubrir todo el propéptido.

Figura 22: Análisis de resonancia de plasmón de superficie de la afinidad de unión del propéptido de NGF e icosapéptidos para sSortilina inmovilizada.

Figura 23: Vista general del complejo sSortilina-peptide4 mostrado como representación de superficie. La superficie de Vsp10p-D es gris clara, el dominio 10CC es gris, el péptido 4 de NGFpro es negro y las glicosilaciones se muestran usando la representación de "bolas y barras" coloreadas por tipo de átomo.

Figura 24: Unión del prodominio de NGF (sitio 3). A) El péptido-4 de NGFpro se muestra como un modelo de "bolas y barras" coloreadas por tipo de átomo. Se superpone sobre el péptido un mapa de densidad electrónica de Fo-Fc, calculado sin los péptidos y contorneado en 2.6a. La sSortilina se muestra usando la representación de superficie. B) El péptido-4 unido se modeliza como un fragmento de hexa-alanina y se muestra como un modelo de "bolas y barras" junto con los restos que interaccionan de la sSortilina.

Figura 25: Unión del prodominio de NGF (sitio 1/sitio NTS). A) El péptido-4 de NGFpro se muestra como un modelo de "bolas y barras" coloreado por tipo de átomo. El mapa de densidad electrónica mostrado se ha calculado como se indica en la figura 24 y se superpone al péptido. La sSortilina se muestra usando la representación de superficie. B) El péptido-4 unido se modeliza como fragmento de tetra-alanina y se muestra con restos que interaccionan de sortilina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un cristal de un complejo de sSortilina con un ligando; en donde el cristal se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un cristal tetragonal de sSortilina y el ligando: prodominio de NGF, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en la SEQ ID NO. 1 (aminoácidos 78 a 755), fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial P4i2i2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=b=159.97 A, c=106.55 A, a=p=Y=90°; (b) un cristal tetragonal de sSortilina y el ligando: péptido-4, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en la SEQ ID NO. 1 (aminoácidos 78 a 755), fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial P4i2i2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=b=159.37 A, c=l08.72 A, a=p=Y=90°;

(c) un cristal monoclínico de la sSortilina y el ligando: neurotensina, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en el dominio luminal entero (aminoácidos 1 a 758) pero no el segmento transmembrana o la cola citoplasmática de la Sortilina, fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial C2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=145.8 A, b=74.5 A, c=108.3 A, a=Y=90°, p=131.87°;

(d) un cristal monoclínico de la sSortilina y el ligando: neurotensina, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en el dominio luminal entero (aminoácidos 1 a 758) pero no el segmento transmembrana o la cola citoplasmática de la Sortilina, fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial C2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=162.1 A, b=78.7 A, c=111.1 A, a=Y=90°, p=126.61°; y

(e) un cristal monoclínico de la sSortilina y el ligando: sSort-propéptido, en donde la sSortilina es un fragmento que consiste en el dominio luminal entero (aminoácidos 1 a 758) pero no el segmento transmembrana o la cola citoplasmática de la Sortilina, fusionado de forma C-terminal a His6, y en donde dicho cristal está en el grupo espacial C2 con dimensiones de la celdilla unidad de a=162.1 A, b=78.1 A, c=111.7 A, a=Y=90°, p=127.20°.