CN102131826A - 人类分拣蛋白的晶体结构及其用于鉴定分拣蛋白的配体的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了分拣蛋白晶体和生长所述晶体的方法。本发明还提供了基于分拣蛋白的晶体结构设计特异性配体的方法。本发明还涉及这类配体的制备及其在制备用于治疗中枢和外周神经系统疾病、损伤或病症的药物中的用途。

Description

人类分拣蛋白的晶体结构及其用于鉴定分拣蛋白的配体的用途
本申请或现在这个申请中引用的所有专利和非专利文献通过引用将其全部内容并入本文。
技术领域
本发明涉及由原子坐标描述的Vps10p-结构域受体的三维结构，所述原子坐标通过人类受体分拣蛋白的X-射线晶体学获得。本发明还涉及生长分拣蛋白的晶体的方法。基于所述三维结构获得了关于分拣蛋白的特定功能的详细信息。本发明还涉及基于分拣蛋白的晶体结构来筛选、鉴定和/或设计Vps10p-结构域受体的特异性配体的方法。本发明还涉及所述配体的制备及其用于抑制在分拣蛋白、p75NTR和神经营养素前体(例如proNGF和proBDNF)之间形成三元复合物的用途。本发明还涉及能够作为分拣蛋白激动剂的配体的鉴定。本发明还涉及这类配体的制备及其用于治疗中枢和外周神经系统疾病、损伤或病症的用途。
背景技术
分拣蛋白有时也被称作神经降压素受体3(NTR3)、糖蛋白95(Gp95)或Swiss Prot ID No.Q99523的100kDa NT受体，其是由独特的Vps10p-结构域(Vps10p-D)定义的哺乳动物神经元受体家族的典型成员(1-3)，所述Vps10p-结构域与其它配体一样与神经营养因子和神经肽结合(4-8)。该结构域构成分拣蛋白的整个腔的部分(sSortilin)，并且通过酶促的前肽切割被激活而与配体结合(4，5)。分拣蛋白是多功能的1类受体，其能够进行内吞作用以及细胞内分选(9-11)，最近表明，其还通过激发神经营养素前体诱导的p75NTR介导的神经元细胞凋亡而参与信号传导(6，7，12，13)。分拣蛋白作为蛋白前体合成，所述蛋白前体通过酶促切割并除去短的N末端前肽而被转化为成熟分拣蛋白。只有成熟受体才结合配体，有意思的是，其所有的已知配体(例如神经降压素(NT)、脂蛋白脂酶、神经生长因子-β的前体(proNGF)和脑衍生的神经营养因子的前体(proBDNF)、受体结合的蛋白(RAP))及其自身的前肽，竞争结合(5-7，10)，这表明不同的受体靶向共有的或部分共有的结合位点。NT是一种十三肽，其结合分拣蛋白、SorLA(另一种Vps10p-D受体)和两种G蛋白偶联的受体NTR1和NTR2(4，14-16)。NT与分拣蛋白相关的生理功能尚未被完全阐明(17)，但NT仍然是一种重要的工具，因为它抑制所有其它配体与分拣蛋白Vps10p-D的结合。
发明内容
在主要的方面，本发明涉及一种晶体，其包括：
a)SEQ ID NO.1的多肽；
b)所述多肽的序列变体，其中所述变体与所述的SEQ ID NO.1具有至少60％序列同一性；
c)包含a)至b)任一项的至少200个连续氨基酸的片段，其中所述片段显示出分拣蛋白活性；
d)与至少一种配体复合的a)至c)任一项。
在另一个方面，本发明进一步涉及生长晶体的方法，其包括以下步骤：
a.在含有50mM Tris-HCl pH7.9和150mM NaCl的缓冲液中获得包含4.5至5.5mg/mL的SEQ ID NO.1的多肽或其片段或变体的组合物；
b.将所述组合物与神经降压素以下列摩尔比混合：
i.1∶1.5至1∶15(sSortilin∶NT)或，
ii.1∶4(sSortilin∶前肽)；
c.分别提供等体积的所述组合物和结晶溶液(subjecting equal volumes of said composition and a crystallization solution respectively)，所述结晶溶液包含：
i.18-21％w/v PEG 6000，和
ii.0-15％甘油，和
iii.Tris-HEPES pH 7.2-7.8(40-93mM Tris和100mM HEPES)或100mM Tris-HCl pH 7.9，3-6％甘油和
iv.300-900mM NaCl或150-400mM C3H2Na2O4(其中通过丙二酸将所述C3H2Na2O4调节至pH 6-7.5)或300-500mM LiSO4或500-700mM KCl；以及
d.获得包含SEQ ID NO.1或其片段或变体的晶体。
在另一个方面，本发明涉及计算机可读数据存储介质，其包括如图17-20任一项所示分拣蛋白的至少一部分结构坐标编码的数据存储材料。
在另一个方面，本发明涉及原子坐标在用于鉴定能够与下列一项或多项结合的配体的方法中的用途：
a.结合位点1，或
b.结合位点2，或
c.结合位点3，
或a至c的片段或变体；
其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过的三维结构。
在另一个方面，本发明涉及鉴定配体的方法，所述配体能够结合SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体，所述方法包括以下步骤：
a)使用原子坐标在计算机屏幕上产生结合位点的空间结构，所述原子坐标如图17-20任一项所示，或所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400032
的三维结构；
b)在计算机屏幕上产生具有其空间结构的潜在配体；和
c)选择能够结合至结合相互作用位点的集合的至少一个氨基酸残基而无空间位阻的配体。
在另一个方面，本发明涉及计算机辅助的鉴定分拣蛋白的配体的方法，所述配体能够结合SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体，所述方法使用包含处理器、数据存储系统、数据输入设备和数据输出设备的程序计算机，所述方法包括以下步骤：
a)通过所述输入设备向所述程序计算机输入包括下列内容的数据：所述分拣蛋白的原子子集的原子坐标，从而产生标准数据集合；其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过的三维结构；
b)使用所述处理器，将所述标准数据集合与储存在所述数据存储系统中的低分子量有机化学结构和肽片段的计算机数据库进行对比；和
c)使用计算机方法，从所述数据库中选择具有在结构上与所述标准数据集合互补的部分且与受体分拣蛋白没有空间位阻的化学结构。
在另一个方面，本发明涉及鉴定配体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使用与计算机模拟相结合的原子坐标选择潜在配体，其中所述原子坐标是如图17-20任一项所示的原子坐标，或其中所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400042
的三维结构，所述选择通过这样进行：将潜在配体对接进入SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的结合相互作用位点的集合，所述结合相互作用通过计算机模拟产生；选择能够与所述分拣蛋白的结合相互作用位点的集合中的至少一个氨基酸结合的潜在配体；
b)提供所述潜在配体和所述受体分拣蛋白；
c)将所述潜在配体与所述受体分拣蛋白接触；和
d)检测所述潜在配体与所述受体分拣蛋白的结合。
在另一个方面，本发明涉及鉴定分拣蛋白的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的潜在配体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将源自原子坐标的信息导入计算机，所述原子坐标基于三维结构测定定义SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的构象，从而计算机程序利用或在计算机屏幕上显示所述构象的结构；其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的任一个三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400043
的三维结构；
b)通过所述计算机程序在计算机屏幕上产生分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3的三维图示；
c)将潜在配体的模型重叠到所述结合位点1、结合位点2和结合位点3的图示上；
d)评估所述潜在配体与分拣蛋白的结合位点1(高亲和力神经降压素结合位点)、结合位点2(低亲和力神经降压素结合位点)、结合位点3(神经营养素前体结合位点)或其片段或变体的结合以及不存在空间位阻的可能性；
e)将所述潜在配体化合物引入所述受体分拣蛋白的结合测定中；和
f)确定所述潜在配体是否抑制选自下列的竞争性配体的结合：SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-121(NGF前结构域(pro domain))、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)、SEQ ID NO.10的氨基酸残基11-13(YIL)和SEQ ID NO.12(NT69L)。
在另一个方面，本发明涉及建立Vps10p-结构域受体蛋白分子的原子模型的方法，其包括以下步骤：
a.鉴定与SEQ ID NO.1具有至少20％序列同一性的Vps10p-结构域受体，或其片段或变体；和
b.使用原子坐标通过同源性模拟获得所鉴定的Vps10p-结构域受体的原子模型，其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400051
的三维结构。
在重要的方面，本发明涉及通过上文定义的方法鉴定的配体化合物。
在一个方面，本发明涉及通过上文描述的方法鉴定的配体，所述配体能够结合所述结合位点1的至少一个相互作用点，所述相互作用点包含图14的X1、X2、X3、X4、R1、R2、J1、J2和J3，其中
X1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316和Y351，并且其中
X2包括Y351的骨架羰基，并且其中
X3包括I353的骨架，并且其中
X4包括K260的氨基，并且其中
R1包括氨基酸残基I327、F314、Y351、I353和M363，并且其中
R2包括F350和来自包含氨基酸残基T397至E401的环的至少一个氨基酸，并且其中
J1包括S305，并且其中
J2包括F306的骨架酰胺，并且其中
J3包括F306的骨架羰基。
在另一个方面，本发明涉及包含如上文描述所鉴定的分拣蛋白的抑制剂的药物。
在另一个方面，本发明涉及通过上文描述的方法所鉴定的至少一种配体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗个体的神经系统疾病、病症或损伤。
在重要方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(I)的一般结构：
Figure BPA00001284386400061
其中X是作为氢供体的原子，所述原子选自N、O、S、P，并且其中，
Y是作为氢键受体的电负性原子，其选自O、N、S、F、Cl、Br、I，并且其中，
R1是C3-6烷基；C4-6环基；杂环或杂芳族结构，其具有一个环，每个环中含有4-6个成员，且含有1-3个杂原子；或杂烷基，其含有1-3个选自N、O、S(O)0-2的杂原子，并且其中，
R2是氢；C1-12烷基；或芳族、碳环、杂环或杂芳族结构，其具有1-3个环，每个环中含有3-8个成员，且含有0-4个杂原子；或杂烷基，其含有1-8个选自N、O、S(O)0-2的杂原子，并且其中，
R3是氢，SH，咪唑，C1-12烷基；或芳族、碳环、杂环或杂芳族结构，其具有1-3个环，每个环中含有3-8个成员，且含有0-4个杂原子；或杂烷基，其含有1-8个选自N、O、S的杂原子，并且其中，
R4选自官能团C1-100线性或支链的烷基、线性或支链的烯基、线性或支链的炔基、苯基、苄基、卤代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、卤代甲酰、羟基、羰基、醛、碳酸酯、羧酸酯、羧基、醚、酯、过氧氢基(hydroperoxy)、过氧基、氨甲酰(carboxamide)、伯胺、仲胺、叔胺、铵、伯酮亚胺、仲酮亚胺、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、氰酸酯、异氰化物、异硫代氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、priidyl、膦基、磷酸酯、膦酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基(SH)、硫氰酸酯、二硫化物、接头L2或L3，以及与SEQ ID NO.10为至少50％同一性的氨基酸序列或其片段。
在另一个重要方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(II)的一般结构：
Figure BPA00001284386400071
其中Z是氢键供体或受体，其选自羰基、羟基、氨基、亚氨基、酰胺、巯基、氯、氟，并且其中，
R5选自H、CH3和接头L2，并且其中，
R6选自H、-CH3、-CH2CH3和-OCH3，并且其中，
R7选自谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸的侧链、脂肪族C4-6基团，并且其中，
R8选自酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、碘-酪氨酸的侧链、和-CH2-NH2，并且其中，
R9选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺的侧链、C3-8脂肪族和杂脂肪族基团、含有5元或6元环的碳环和杂环基团，并且其中，
R10选自焦谷氨酸、聚-烃和长度大于等于10的多肽，并且其中，
R11和R12各自选自H、C1-12线性或支链的烷基、线性或支链的烯基、线性或支链的炔基、苯基、苄基、卤代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、卤代甲酰、羟基、羰基、醛、碳酸酯、羧酸酯、羧基、醚、酯、过氧氢基、过氧基、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺、铵、伯酮亚胺(primary ketimine)、仲酮亚胺、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、氰酸酯、异氰化物、异硫代氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、priidyl、膦基、磷酸酯、膦酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基(SH)，并且其中，
共价键(1)和(2)各自选自单键和双键。
在非常重要的方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(III)的一般结构：
Figure BPA00001284386400081
其中R13选自H、C1-12烷基、烯基、炔基和接头L3，并且其中，
R14、R15、R17、R19、R20各自选自H、C1-12烷基、烯基、炔基，并且其中，
R16选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸的侧链和脂肪族C3-7，并且其中，
R18选自H、-CH3和-CH2OH，并且其中，
共价键(1)和(2)各自选自单键和双键。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是图26所示的RRPYI(chg)。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的碘YIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的QIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的YCL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的dYIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的YHL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的RRPYI(acc)。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的RRPYI(nMe)L。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是图26所示的YIL。
在另一个方面，本发明涉及治疗受试者中的病理性病状的方法，其包括向有此需要的个体给予治疗上有效量的如上文描述的药物。
在另一个方面，本发明涉及阻止哺乳动物神经元细胞的细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于如上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及增强哺乳动物神经元细胞的存活的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于如上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及扩大哺乳动物细胞的构成的方法，其包括向所述构成给予如上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及使哺乳动物细胞的构成分化的方法，其包括向所述构成给予如上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及能够与SEQ ID NO.1的结合位点1结合的抗体。
在另一个方面，本发明涉及能够与SEQ ID NO.1的结合位点2结合的抗体。
在另一个方面，本发明的涉及能够与SEQ ID NO.1的结合位点3结合的抗体。
在另一个方面，本发明涉及免疫缀合物，其包含上文描述的抗体和选自下列的缀合物：细胞毒试剂，例如化疗剂、毒素或放射性同位素；特定结合对的成员，例如亲和素或链霉亲和素或抗原；能够产生可检测产物的酶。
具体实施方式
定义
佐剂：与所施用的免疫原性决定簇/抗原混合时增加或改变对所述决定簇的免疫应答的任何物质。
亲和力：多数配体与其结合位点的相互作用可以通过术语结合亲和力来表征。一般地，高亲和力配体结合来自于配体和其受体之间较大的分子间力；而低亲和力配体结合包括配体和其受体之间较小的分子间力。一般地，相对于对于低亲和力结合的情况，高亲和力结合涉及配体在其受体结合位点的较长驻留时间。当一些结合能可用于引起受体的构象改变，从而导致相关的离子通道或酶的行为改变时，配体与受体的高亲和力结合通常具有生理上的重要意义。能够结合至受体、改变受体的功能并激发生理应答的配体被称为该受体的激动剂。激动剂与受体的结合可以通过“生理应答被激发得多大”以及“产生该生理应答所需的激动剂的浓度”来表征。高亲和力配体结合暗示相对低浓度的配体足以最大化地占据配体结合位点并激发生理应答。低亲和力配体结合暗示在最大化地占据结合位点并达到的对配体的最大生理应答之前需要相对高浓度的配体。配体结合通常以“占据半数受体结合位点时的配体浓度”来表征，其被称作解离常数(kd)。
醇：一类含有一个或多个羟基(OH)的有机化合物。在本文上下文中，饱和的或不饱和的、支链的或非支链的烃基作为较大分子上的取代基。
脂环族基团：术语“脂环族基团”意思是具有类似于脂肪族基团的性质的环状烃基。
脂肪族基团：在本发明的上下文中，术语“脂肪族基团”意思是饱和的或不饱和的、线性或支链的烃基。该术语用于包括例如烷基、烯基和炔基。
烷基基团：术语“烷基基团”意思是饱和的线性或支链的烃基，其包括例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、庚基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等。
烯基基团：术语“烯基基团”意思是不饱和的线性或支链的具有一个或多个碳-碳双键的烃基，例如乙烯基。
炔基基团：术语“炔基基团”意思是不饱和的线性或支链的具有一个或多个碳-碳三键的烃基。
两性分子：同时含有极性、可溶于水的和非极性、不溶于水的基团的物质。
激动剂：激动剂是能够增加效应物(例如受体)的活性的化合物。具体地，分拣蛋白激动剂是能够结合至结合位点1、2和3中的一个或多个、从而诱导与给定的内源激动剂配体化合物相同的生理应答的化合物。
拮抗剂：拮抗剂是能够降低效应物(例如受体)的活性的化合物。具体地，分拣蛋白拮抗剂是能够结合至结合位点1、2和3中的一个或多个、从而抑制另一种配体的结合从而抑制生理应答的化合物。
细胞凋亡：细胞凋亡是多细胞生物体中细胞的自杀过程。它是程序性细胞死亡(PCD)的主要类型之一，并且涉及有组织的一系列生化事件，导致特征性的细胞形态和死亡。
细胞凋亡抑制剂：任何能够减少细胞凋亡过程的化合物。
芳族基团：术语“芳族基团”或“芳基基团”意思是单环或多环芳族烃基。
结合：术语“结合”或“与......结合”是指化学实体或化合物或其部分之间的邻近状况。结合可以是非共价的，其中并置受到氢键或范德华力或静电相互作用在能量上的促进，或者，结合可以是共价的。
结合位点：本文使用的术语“结合位点”或“结合袋”是指分子或分子复合物的这样的区域：由于其形状的缘故而有利地与另一种分子、分子复合物、化学实体或化合物结合。本文使用的袋包括至少一个深洞和任选的浅洞。
结合位点1：神经降压素的高亲和力结合位点或同义的结合位点1是分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点，其对于神经降压素或神经降压素的片段或变体具有高亲和力，并且对于分拣蛋白前肽或其片段(SEQ ID NO.1的氨基酸残基34-77)具有高亲和力，所述结合位点包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306、T398至G400、I303-G309、Q349-A356、Y395和T402。更优选地，结合位点1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306和T398至G400。最优选地，分拣蛋白的结合位点1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314和F350至M363。结合位点1是混杂的结合位点。
结合位点2：对于神经降压素或神经降压素的片段或变体具有低亲和力的分拣蛋白的结合位点，所述结合位点包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586、W597、T168-I174、L572、A573和S584至F588。更优选地，神经降压素的分拣蛋白低亲和力结合位点包括SEQ ID NO.1的氨基酸L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586和W597。最优选地，神经降压素的分拣蛋白低亲和力结合位点包括氨基酸L572、L114和V112。结合位点2是混杂的并且可以结合分拣蛋白的前肽(SEQ ID NO.1的氨基酸残基34-77)。
结合位点3：分拣蛋白的混杂结合位点，其包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基D403、S420、D422、N423、S424、I425、E426、T451、Y466、E470、I498、S499和V500，更优选包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基D403、N423、S424、I425、T451、Y466、I498和V500，最优选地包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基T451、Y466、I498和V500。
生物活性试剂：本文使用的术语“生物活性试剂”是指可用于治疗性或诊断性应用有关的任何物质，例如，例如，用于诊断患者中疾病存在与否的方法和/或用于治疗患者中的疾病的方法。“生物活性试剂”是指这样的物质，其能够在体外和/或体内发挥生物学效应。生物活性试剂可以是中性的、带正电的或带负电的。适当的生物活性试剂包括例如前药、诊断剂、治疗剂、药学试剂、药物、氧运输剂、血液代用品、合成的有机分子、多肽、肽、维生素、甾、甾类似物和遗传决定子，包括核苷、核苷酸和多核苷酸。
脑缺血：全局性脑缺血是指脑接受不到足以维持正常神经功能的血流的缺血状况。
阳离子基团：当包含化学基团的化合物溶解于溶剂中时，优选溶解于水中时，能够作为质子供体的化学基团。
复合物：本文使用的的术语“复合物”是指分子或蛋白、其保守性类似物或截短物与化学实体结合后的组合。
坐标：本文使用的术语“坐标”是指构成蛋白结构的原子的三维构架的信息。含有晶体的要素的原子坐标的最终图谱可以储存在数据载体上；通常所述数据以PDB格式或mmCIF格式储存，二者对于本领域技术人员均是已知的。但是，晶体坐标还可以以简单的表格或文本格式储存。PDB格式根据Research Collaboratory for Structural Biology提供的说明和指南进行组织。
晶体：术语“晶体”是指物质的有序状态。蛋白的本性使其难以被纯化至均一态。即使高度纯化的蛋白也可能由于修饰、配体的结合或其它效应物的容纳而慢慢变成不均一态。此外，蛋白通常由复合物溶液结晶而来，所述复合物溶液可能不仅包括靶分子而且还包括缓冲剂、盐、沉淀剂、水和任意数目的小的结合蛋白。重要的是注意：蛋白晶体不仅仅由蛋白组成，而且还有大比例的溶剂分子，特别是水。这些可介于30％直至90％。蛋白晶体可能积聚本文不能详尽列出或预见的更大量和多种杂质。通常，非均一物质作为核心，晶体仅仅在其周围生长。技术人员知晓，一些晶体比其它晶体衍射好。晶体的尺寸从肉眼可见的20微米至1毫米或更多毫米。用于X-射线分析的晶体通常是单晶，0.05mm或更大，且没有裂缝和破损。
环基：术语“环基”意思是分类为脂环族基团、芳族基团或杂环基的闭合环烃基。
环烯基：意思是一价的不饱和碳环基团，其由一个、两个或三个环组成，每个环有3-8个碳，其任选可被一个或两个选自下列的取代基取代：羟基、氰基、低级烯基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、硫代烯基、卤素、卤代烯基、羟基烯基、硝基、烷氧基羰基(alkoxycarbonenyl)、氨基、烯基氨基、烯基磺酰基、芳基磺酰基、烯基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烯基氨基羰基、芳基氨基羰基、烯基羰基氨基和芳基羰基氨基。
环烷基：意思是一价的饱和的碳环基团，其由一个、两个或三个环组成，每个环有3-8个碳，其任选可被一个或两个选自下列的取代基取代：羟基、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、硫代烷基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基和芳基羰基氨基。
偶极-偶极相互作用：本文使用的术语“偶极-偶极相互作用”是指可以发生在两个或更多个极性分子之间的引力。因此，“偶极-偶极相互作用”是指第一个极性分子的不带电的、部分带正电的末端与第二个极性分子的不带电的、部分带负电的末端的引力。“偶极-偶极相互作用”还指分子间氢键。静电相互作用：本文使用的术语“静电相互作用”是指，当相反电荷的组分彼此吸引时，带电组分、分子或离子之间由于引力而发生的任意相互作用。实例包括但不限于：离子相互作用、共价相互作用、离子和偶极(离子和极性分子)之间的相互作用、两个偶极(极性分子的部分电荷)之间的相互作用、氢键和伦敦分散力(可极化分子的诱导的偶极)。因此，例如“离子相互作用”或“静电相互作用”是指第一个带正电的分子和第二个带负电的分子之间的引力。离子或静电相互作用包括例如带负电的生物活性试剂之间的引力。
形成环：意思是，当形成环结构时，所述的原子通过键连接。
片段：在一个实施方式中，根据本发明的多肽片段(包括其任意功能等同物)可以包括500个以下的氨基酸残基，例如450个以下的氨基酸残基，例如400个以下的氨基酸残基，例如350个以下的氨基酸残基，例如300个以下的氨基酸残基，例如250个以下的氨基酸残基，例如240个以下的氨基酸残基，例如225个以下的氨基酸残基，例如200个以下的氨基酸残基，例如180个以下的氨基酸残基，例如160个以下的氨基酸残基，例如150个以下的氨基酸残基，例如140个以下的氨基酸残基，例如130个以下的氨基酸残基，例如120个以下的氨基酸残基，例如110个以下的氨基酸残基，例如100个以下的氨基酸残基，例如90个以下的氨基酸残基，例如85个以下的氨基酸残基，例如80个以下的氨基酸残基，例如75个以下的氨基酸残基，例如70个以下的氨基酸残基，例如65个以下的氨基酸残基，例如60个以下的氨基酸残基，例如55个以下的氨基酸残基，例如50个以下的氨基酸残基。神经降压素的片段包括但不限于神经降压素的C末端氨基酸PYIL和YIL。
基团(部分/取代基)：如本技术领域熟知，大量的取代不仅是可以的，而且通常是可取的。可以预见取代发生在本发明的材料上。作为简化讨论和提及在本申请全文中使用的一些术语的方式，术语“基团”和“部分”用于区分允许进行取代或可以进行取代的化学物质和那些不允许进行取代或不可以进行取代的化学物质。因此，当术语“基团”用于描述化学取代基时，所描述的化学材料包括未经取代的基团和在链上含有例如O、N或S原子以及羰基或其它常规取代基的基团。当术语“部分”用于描述化学化合物或取代基时，意在仅包括未经取代的化学材料。例如，术语“烷基基团”意指不仅包括纯开链饱和烃烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，还包括具有本领域已知的另外的取代基的烷基取代基，所述另外的取代基例如羟基、烷氧基、烷基磺酰基、卤素原子、氰基、硝基、氨基、羧基等。因此，“烷基基团”包括醚基团、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、硫代烷基等。另一方面，术语“烷基部分”仅限于包括纯开链饱和烃烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等。相同的定义适用于“烯基基团”和“烯基部分”；适用于“炔基基团”和“炔基部分”；适用于“环基团”和“环部分”；适用于“脂环族基团”和“脂环族部分”；适用于“芳族基团”或“芳基基团”和适用于“芳族部分”或“芳基部分”；也适用于“杂环基团”和“杂环部分”。
杂环基团：术语“杂环基团”意思是闭合环烃，其中环中的一个或多个原子是碳以外的元素(例如氮、氧、硫等)。
杂环基意思是一价饱和的环状基团，其由1至2个环组成，每个环有3至8个原子，其含有1或2个环杂原子(选自N、O或S(O)0-2)，并且其任选可被1或2个选自下列的取代基取代：羟基、氧、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、硫代烷基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基farbonyl(alkylaminofarbonyl)、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基或芳基羰基氨基。
杂芳基意思是一价芳族环状基团，其具有1至3个环，每个环有4至8个原子，环中含有1或2个杂原子(选自N、O或S)，其任选可被1或2个选自下列的取代基取代：羟基、氰基、低级烷基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、硫代烷基、卤素、卤代烷基、羟基烷基、硝基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷基氨基磺酰基、芳基氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷基羰基氨基和芳基羰基氨基。
同源性：氨基酸序列之间的同源性可以使用熟知的评分矩阵来计算，所述评分矩阵例如下列任一种：BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85和BLOSUM 90。当它们优选与所述的预先确定的片段序列分别为至少约60％同源，例如至少65％同源，例如至少70％同源，例如至少75％同源，例如至少80％同源，例如至少85％同源，例如至少90％同源，例如至少92％同源，例如至少94％同源，例如至少95％同源，例如至少96％同源，例如至少97％同源，例如至少98％同源，例如至少99％同源时，与SEQ ID NO.1至13的片段分别具有同源性的片段被认为落在本发明的范围内。根据本发明的一个实施方式，同源性百分率是指同一性百分率。
另一种适宜适用的用于确定肽片段的结构和功能关系的方法在US6,013,478中描述，其通过引用并入本文。同样，检验氨基酸序列与受体部分结合的方法是本领域技术人员已知的。
除了向优选的预先确定的神经营养素前体活性调节剂或其片段的任意位置引入保守性替换之外，还可以希望向这样的神经营养素前体活性调节剂的任意一个或多个位置引入非保守性替换。
引起形成神经营养素前体活性调节剂的功能等价片段的非保守性替换是例如i)极性实质上不同，例如具有非极性侧链的残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe或Met)替换具有极性侧链的残基，例如Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn或Gln，或替换带电的氨基酸，例如Asp、Glu、Arg或Lys，或者，用带电的或极性残基替换非极性残基；和/或ii)对于多肽骨架方向的效应实质上不同，例如以另一个残基替换Pro或Gly或替换为Pro或Gly；和/或iii)带电情况实质上不同，例如用带负电的残基例如Glu或Asp替换带正电的残基，例如Lys、His或Arg(反之亦然)；和/或iv)空间大小实质上不同，例如用大残基例如His、Trp、Phe或Tyr替换具有小侧链的残基，例如Ala、Gly或Ser(反之亦然)。
在一个优选的实施方式中，通过氨基酸替换获得的变体可以基于疏水性和亲水性值以及氨基酸侧链取代基的相对相似性(包括电荷、尺寸等)来制备。考虑到前述各特征的示例性氨基酸替换是本领域技术人员熟知的，且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
除了本文描述的变体之外，空间相似的变体可以配制成模拟变体结构的关键部分，这样的化合物也可以与本发明的变体相同的方式使用。这可以通过本领域技术人员已知的模拟和化学设计技术来实现。能够理解，所有的此类空间相似的构建体落入本发明的范围。
在进一步的实施方式中，本发明涉及包括替换的氨基酸的功能变体，所述替换的氨基酸的亲水性值或亲水性指数处于它所替换的氨基酸的值的+/-4.9以内，例如+/-4.7以内，例如+/-4.5以内，例如+/-4.3以内，例如+/-4.1以内，例如+/-3.9以内，例如+/-3.7以内，例如+/-3.5以内，例如+/-3.3以内，例如+/-3.1以内，例如+/-2.9以内，例如+/-2.7以内，例如+/-2.5以内，例如+/-2.3以内，例如+/-2.1以内，例如+/-2.0以内，例如+/-1.8以内，例如+/-1.6以内，例如+/-1.5以内，例如+/-1.4以内，例如+/-1.3以内，例如+/-1.2以内，例如+/-1.1以内，例如+/-1.0以内，例如+/-0.9以内，例如+/-0.8以内，例如+/-0.7以内，例如+/-0.6以内，例如+/-0.5以内，例如+/-0.4以内，例如+/-0.3以内，例如+/-0.25以内，例如+/-0.2以内。
亲水性和亲水性氨基酸指数在赋予蛋白相互反应生物学功能方面的重要性是本领域熟知的(Kyte&Doolittle，1982和Hopp，美国专利号4,554,101，每篇皆通过引用并入本文)。
本文中使用的氨基酸亲水性指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)(Kyte&Doolittle，1982)。
氨基酸亲水性值为：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)(U.S.4,554,101)。
除了本文描述的肽基化合物之外，空间相似的化合物可以配制成模拟肽结构的关键部分，这样的化合物也可以与本发明的肽相同的方式使用。这可以通过本领域技术人员已知的模拟和化学设计技术来实现。例如，可以应用酯化和其它烷基化来修饰例如二精氨酸肽骨架的氨基末端，以模拟四肽结构。能够理解，所有的此类空间相似的构建体落入本发明的范围。
具有N末端烷基化和C末端酯化的肽也包括在本发明内。功能等同物还包括糖基化的和共价的或聚集的缀合物，其从相同的或其它神经营养素前体活性调节剂片段和/或神经营养素前体活性调节剂分子形成，包括二体或不相关的化学部分。这样的功能等同物通过本领域已知的方法通过将官能团连接至片段中的基团(包括在N和C末端中的任一个或二者)来制备。
因此，功能变体可以包括缀合至脂肪族或酰基酯或羧基末端的酰胺、含有羧基侧链的烷基胺或残基的片段，例如，在天冬氨酸残基与烷基胺缀合；含有羟基基团的残基的O-酰基衍生物和氨基末端氨基酸或含有氨基基团的残基的N-酰基衍生物，例如与fMet-Leu-Phe或免疫原性蛋白的缀合物。酰基基团的衍生物选自烷基部分的基团(包括C3-C10正常烷基，从而形成烷酰基物质)以及碳环或杂环化合物(从而形成芳酰基物质)。反应性基团优选是双官能化合物，其本身已知用于将蛋白与不溶性基质通过反应性侧基团交联。
共价的或聚集的功能等同物和其衍生物可用作免疫测定中的试剂或用于亲和纯化程序。例如，根据本发明的神经营养素前体活性调节剂的片段可以通过本身已知的方法共价结合至溴化氰激活的Sepharose或吸附至聚烯烃表面(通过或不通过戊二醛交联)而使其不溶，以用于测定或用于抗神经营养素活性调节剂抗体或细胞表面受体的纯化。还可以以可检测基团标记片段，例如通过氯胺T程序进行放射性碘标记，共价结合至稀土螯合物或缀合至另一种荧光部分，以用于例如诊断测定。
神经营养素前体活性调节剂的优选的预先确定片段的突变可以通过氨基酸插入来构建，通常是约1至10个氨基酸残基的量级，优选约1至5个氨基酸残基，或约1至10个残基的删除，例如约2至5个残基。
在一个实施方式中，结合位点1、2或3的配体是通过自动合成法合成的寡肽。可以使用任何商业可获得的固相技术，例如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被依次添加到生长中的氨基酸链上(参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963)。
用于多肽的自动合成的仪器可从供应商诸如Applied Biosystems，Inc.of Foster City，Calif.商业上获得，通常可以根据生产商的说明书操作。固相合成将使想要的氨基酸替换掺入根据本发明的神经营养素前体活性调节剂的任意片段中。将会理解，可以组合替换、删除、插入或其任意亚组合以获得功能等同物的最终序列。插入应该被理解为包括氨基末端和/或羧基末端融合，例如与疏水性或免疫原性蛋白或诸如任意多肽的载体或能够作为载体的支架结构融合。
还提供了根据本发明的分拣蛋白抑制剂的片段的寡聚体，包括二聚体，所述二聚体包括同二聚体和异二聚体，这些落在本发明的范围内。神经营养素前体活性调节剂功能等同物和变体可以作为同二聚体或异二聚体来产生，其具有其它的氨基酸序列或具有原始分拣蛋白抑制剂序列。异二聚体包括含有免疫反应性分拣蛋白抑制片段以及无需具有或发挥任何生物学活性的分拣蛋白抑制片段的二聚体。
分拣蛋白抑制肽片段可以在体外和体内合成。体外合成的方法是熟知的，现有技术中也描述了适宜于或适用于体内合成分拣蛋白抑制剂的方法。当在体内合成时，使用含有编码分拣蛋白肽抑制剂或其片段的DNA的载体转化宿主细胞。载体定义为可复制的核酸构建体。载体用于调节神经营养素前体活性调节剂的表达。表达载体是可复制的DNA构建体，其中可以在体内表达的编码预先确定的分拣蛋白抑制片段或其任意功能等同物的核酸序列可操作地连接至适宜的能够影响该片段或等同物在合适的宿主内表达的控制序列。这样的控制序列是本领域熟知的。原核和真核细胞均可用于合成配体。
但是，源自多细胞生物体的细胞培养物是优选的宿主细胞。原则上，任何高等真核细胞培养物都可使用，无论是来自脊椎动物还是无脊椎动物培养物。有用的宿主细胞系的实例有VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、和WI38、BHK、COS-7、293和MDCK细胞系。优选的宿主细胞是已知的用于合成内源性分拣蛋白抑制剂的真核细胞。可以分离这样的宿主细胞的培养物并用作片段的来源，或用于处理的治疗性方法，包括旨在促进或抑制生长状态的治疗性方法，或者在人类或动物体上进行的诊断方法。
疏水键：本文使用的术语“氢键”是指引力或桥，其可发生在与电负性原子(例如氧、硫或氮)共价结合的氢原子和另一个电负性原子之间。氢键可以发生在第一个分子中的氢原子和第二个分子中的电负性原子之间(分子间氢键)。另外，氢键也可以发生在同为包含在单个分子内的氢原子和电负性原子之间(分子内氢键)。
疏水相互作用：本文使用的术语“疏水相互作用”是指极性环境(例如水)中彼此处于吸引范围内的基本上非极性(疏水性)成分之间发生的任何相互作用。本文使用的吸引范围是0.1直至2nm的范围。特定类型的疏水相互作用通过“范德华力”施加，即由量子力学计算的非极性分子间的引力。范德华力通常与瞬间偶极力矩相关联，瞬间偶极力矩是邻近分子诱导的且其参与电子分布的改变。
抑制：本文使用的术语抑制是指阻止两个或更多个成分之间的结合。通过本发明鉴定的配体能够抑制Vps10p-结构域受体和神经营养素前体之间的结合。
抑制结合：本文使用的术语抑制神经营养素前体和分拣蛋白之间的结合是指提供由本发明鉴定的配体的方法，所述配体能够阻止神经营养素前体与分拣蛋白结合位点3的结合，从而阻止在分拣蛋白、proNGF和p75NTR或其任意片段或变体之间形成三元复合物。术语抑制结合还可以指抑制神经降压素和/或分拣蛋白前肽与Vps10p-结构域受体分拣蛋白的结合位点1或2的结合。
体外/体内：该术语以其通常的含义使用。
计算机内：通过计算机模拟进行体外或体内操作的方法。
缺血：血液供给的限制，其导致组织的功能失调或损伤。
缺血性组织损伤：由于缺血导致的组织损伤。
配体：能够与生物分子结合并与其形成复合物从而发挥生物学目的的物质或化合物。在更窄的意义上，其是通过分子间力(例如离子键、氢键和范德华力)与靶蛋白上的位点结合的信号激发分子。对接(结合)通常是可逆的(分离)。配体及其靶分子之间的实际不可逆的共价结合在生物系统中是罕见的。与金属有机和无机化学中的意思相反，配体是否实际在金属位点结合是无关的，如血红蛋白中的情况。配体与受体的结合可能改变化学构象，即受体蛋白的三维形状。受体蛋白的构象状态决定受体的功能状态。结合的趋势或强度被称作亲和力。配体包括底物、抑制剂、激活剂和神经传导剂。放射性配体是放射性同位素标记的化合物，在PET研究中作为体内示踪物和用于体外结合研究。
特定化合物的部分包括所述特定化合物的基团或部分。
药学试剂：术语“药学试剂”或“药物”或“药剂”是指可用于治疗(包括预防、诊断、减缓或治愈)患者中的疾病(malady)、痛苦、病状、疾病(disease)或损伤的任意治疗性或预防性试剂。治疗上有用的遗传决定簇、肽、多肽和多核苷酸可以包括在术语药剂或药物的意思内。如本文定义的“治疗剂”、“药学试剂”或“药物”或“药剂”是一类生物活性剂。
药物组合物：或药物、药剂或试剂是指，当正确给予患者时，能够诱导想要的治疗效应的任意化学或生物材料、化合物或组合物。一些药物以无活性形式售卖，其在体内被转化为具有药学活性的代谢物。为了本发明的目的，术语“药物组合物”和“药剂”包含无活性药物和活性代谢物。
多肽：本文使用的术语“多肽”是指包含至少两个氨基酸的分子。氨基酸可以是天然的或合成的。“寡肽”在本文中定义为长度不超过100个氨基酸的多肽。术语“多肽”还包括蛋白质，即包含至少一个多肽的功能性生物分子；当包含至少两个多肽时，它们可以形成复合物，是共价连接或可以是非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂化的和/或包括辅基。
多核苷酸：本文使用的“多核苷酸”是指包含至少两个核酸的分子。核酸可以是天然存在的或修饰的，例如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)。本文使用的多核苷酸一般涉及
i)包括预先确定的编码序列的多核苷酸，或
ii)编码预先确定的氨基酸序列的多核苷酸，或
iii)编码由多核苷酸(i)或(ii)编码的多肽的片段的多核苷酸，其中所述片段具有本文指定的至少一种预先确定的活性；和
iv)多核苷酸，其互补链在严格条件下与(i)、(ii)和(iii)中任一项定义的多核苷酸杂交，并且它编码具有本文指定的至少一种预先确定的活性的多肽或其片段；以及
v)包含简并于多核苷酸(iii)或(iv)的核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；
或这样的多核苷酸的互补链。
纯化的抗体：术语“纯化的抗体”是指这样的抗体，其至少60重量％不含与其天然结合的多肽和天然存在的有机分子。优选地，制备物包括数量为至少75重量％，更优选至少90重量％和最优选至少99重量％的抗体。
均方根偏差：术语“均方根偏差”(rmsd)用作比较两个密切相关的结构的方法，并且涉及在比对中对距离进行结构上的最小化之后，两个结构的相关原子之间的距离的偏差。具有密切相关结构的相关蛋白将被表征为相对低的RMSD值，而较大的差异将产生RMSD值的增加。
序列同一性：在一个实施方式中，序列同一性是这样确定的：使用神经营养素前体活性调节剂肽的片段，其包含至少25个连续氨基酸并且具有与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的任一项的氨基酸序列或所述SEQ ID NO的任一项的片段分别具有至少80％，例如85％，例如90％，例如91％，例如92％，例如93％，例如94％，例如95％，例如96％，例如97％，例如98％，例如99％的同一性的氨基酸序列，其中使用Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的算法GAP、BESTFIT或FASTA来测定所述同一性百分比，使用缺省空隙量。
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸之间的序列关系：“预先确定的序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分率”和“实质上的同一性”。
“预先确定的序列”是用作序列比较的基础的确定的序列；预先确定的序列可以是更大序列的子集，例如，全长DNA或序列表中给出的基因序列的区段，例如SEQ ID NO.1的多核苷酸序列，或可以包含完整DNA或基因序列。一般地，预先确定的序列的长度是至少20个核苷酸，通常长度是至少25个核苷酸，通常长度是至少50个核苷酸。
由于两个多核苷酸每个可以(1)包含在两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整多核苷酸序列的一部分)和(2)还可包含在两个多核苷酸之间不同的序列，所以两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常这样进行：将两个多核苷酸的序列在“比较窗口”进行对比以鉴定并比较序列相似性的局部区域。本文使用的“比较窗口”是指至少20个连续核苷酸位置的概念区段，其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的预先确定的序列相比较，并且，其中，相对于两个序列的最佳比对的预先确定的序列(其不包含添加或删除)，比较窗口中的多核苷酸序列的一部分可以包含20％或更少的添加或删除(即空隙)。
可以通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444的相似性搜索方法，通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过检查，来进行序列的最佳比对以与比较窗口比对，并且选择通过各种方法产生的最佳比对(即，在比较窗口产生最高百分率的同源性)。
术语“序列同一性”意思是，在比较窗口上两个多核苷酸序列是相同的(即基于逐个氨基酸)。术语“序列同一性百分率”是通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来计算的：确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)的位置的数目以产生匹配位置的数目、将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目(即窗口大小)、并将结果乘以100以产生序列同一性百分率。本文使用的术语“实质上的同一性”代表多核苷酸序列的特征，其中在至少20个核苷酸位置的比较窗口中，通常在至少25-50个核苷酸的窗口中，相对于预先确定的序列，所述多核苷酸包含具有至少85％序列同一性，优选至少90-95％序列同一性，更通常为至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性的百分率这样计算：在比较窗口中将预先确定的序列与多核苷酸序列进行对比，其中所述多核苷酸序列可以包括占该预先确定序列的总共20％或更少的删除或添加。预先确定的序列可以是更大序列的子集，例如，本文示例的全长SEQ ID NO.1多核苷酸序列的区段。
当适用于多肽时，氨基酸序列的同一性程度是氨基酸序列共有的位置上相同氨基酸的数目的函数。氨基酸序列的同源性或相似性的程度是氨基酸序列共有的位置上的氨基酸(即结构相关的氨基酸)的数目的函数。
“非相关的”或“非同源的”序列与本发明的神经营养素前体活性调节剂多肽序列之一共有40％以下的同一性，虽然优选25％以下的同一性。术语“实质上的同一性”意思是两个肽序列，当进行最佳比对时(例如通过程序GAP或BESTFIT，使用缺省空隙量)，共有至少80％序列同一性，优选至少90％序列同一性，更优选至少95％序列同一性或更多(例如99％序列同一性)。优选地，不相同的残基位置的区别在于保守性氨基酸替换。
保守性氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的相互替换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸，具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸的组是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守性氨基酸替换组是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
另外，变体也基于下文定义的预先确定数目的保守性氨基酸替换来确定。本文使用的保守性氨基酸替换是指一个氨基酸(处于预先确定的氨基酸组内)替换另一个氨基酸(处于同一组内)，其中氨基酸表现出相似的或基本上相似的特征。
在本文适用的术语“保守性氨基酸替换”的含义之内，一个氨基酸可以替换如下所示的氨基酸的组中的另一个氨基酸：
i)具有极性侧链的氨基酸(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)
ii)具有非极性侧链的氨基酸(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)
iii)具有脂肪族侧链的氨基酸(Gly、Ala Val、Leu、Ile)
iv)具有环状侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp、His、Pro)
v)具有芳族侧链的氨基酸(Phe、Tyr、Trp)
vi)具有酸性侧链的氨基酸(Asp、Glu)
vii)具有碱性侧链的氨基酸(Lys、Arg、His)
viii)具有酰胺侧链的氨基酸(Asn、Gln)
ix)具有羟基侧链的氨基酸(Ser、Thr)
x)具有含硫侧链的氨基酸(Cys、Met)
xi)中性、弱疏水性的氨基酸(Pro、Ala、Gly、Ser、Thr)
xii)亲水性、酸性的氨基酸(Gln、Asn、Glu、Asp)，和
xiii)疏水性氨基酸(Leu、Ile、Val)。
因此，在序列的相同变体或其片段内，或在序列的不同变体或其片段中，根据本发明的变体或其片段可以包括至少一个替换，例如引入多个彼此独立的替换。
从上文记载可以清晰看出，相同的变体或其片段可以包括来自上文定义的保守性氨基酸一个以上的组的一个以上的保守性氨基酸替换。
至少一个氨基酸的添加或删除可以是添加或删除优选2至250个氨基酸，例如10至20个氨基酸，例如20至30个氨基酸，例如40至50个氨基酸。但是，50个氨基酸以上的添加或删除，例如50至100个氨基酸的添加，100至150个氨基酸的添加，150-250个氨基酸的添加，也包括在本发明内。删除和/或添加可以(彼此独立地)是序列内和/或在序列末端的删除和/或添加。
取代的低级烷基意思是具有1至3个取代基的低级烷基，所述取代基选自羟基、烷氧基、氨基、酰胺基、羧基、酰基、卤素、氰基、硝基和硫醇。
治疗：本文使用的术语“治疗”是指涉及治疗的方法，包括个体(包括人类和动物体)中的临床病状的手术。治疗可以是减缓、治愈或预防性的，即降低患病风险。
变体：本文使用的术语“变体”是指氨基酸序列变体，所述变体优选与任意预先确定的序列具有至少60％同一性，例如至少63％同一性，例如至少66％同一性，例如至少70％序列同一性，例如至少72％序列同一性，例如至少75％序列同一性，例如至少80％序列同一性，例如至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少91％序列同一性，例如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，例如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，例如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，例如至少98％序列同一性，例如至少99％序列同一性。神经降压素的变体和片段的实例列举在图26中，包括但不限于RRPYI(chg)、碘YIL、QIL、YCL、dYIL、YHL、RRPYL(acc)、RRPYI(nMe)L、YIL。在本发明的一个实施方式中，配体不是NT69L、NT8-13或原始神经降压素。
表达的上调：引起基因，优选内源基因的表达升高的过程。
分拣蛋白晶体
为了搞清楚Vps10p-结构域，尤其是人类分拣蛋白的Vps10p-结构域的结构组织和配体结合，本发明人确定了sSortilin与NT的复合物以及与其自己的前肽的残基4-29的复合物的晶体结构(分别在2.0和的分辨率)。sSortilin∶NT复合物的数据获自以稍微过量的NT(摩尔比为1∶1.5)以及以大量过量的NT(摩尔比为1∶15)生长的晶体(见实施例5)。本发明人进一步确定了sSortilin与神经生长因子(NGF)的前结构域的复合物的结构。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种晶体，其包括：
a)SEQ ID NO.1的多肽；和/或
b)所述多肽的序列变体，其中所述变体与所述SEQ ID NO.1具有至少60％序列同一性；和/或
c)包含a)至b)任一项的至少200个连续氨基酸的片段，其中所述片段表现出分拣蛋白活性，以及
d)任选地a)至c)任一项与至少一种配体形成的复合物。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少50％序列同一性。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少60％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少63％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少65％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少70％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少75％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少80％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少85％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少90％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少91％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少92％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少93％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少94％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少95％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少96％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少97％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少98％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括SEQ ID NO.1的序列变体，其中所述变体与SEQ ID NO.1具有至少99％序列同一性。
在一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少50个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少100个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少200个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少300个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少400个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少500个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少600个连续氨基酸的片段。
在另一个实施方式中，本发明的晶体包括包含SEQ ID NO.1的任意至少700个连续氨基酸的片段。
在本发明的优选的实施方式中，所述至少一种配体与结合位点1(高亲和力神经降压素结合位点和分拣蛋白前肽结合位点)结合，所述结合位点1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306和T398至G400。
在本发明的更优选的实施方式中，所述至少一种配体与结合位点1(高亲和力神经降压素结合位点和分拣蛋白前肽结合位点)结合，所述结合位点1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314和F350至M363。
在本发明的高度优选的实施方式中，所述至少一种配体与结合位点1(高亲和力神经降压素结合位点和分拣蛋白前肽结合位点)结合，所述结合位点1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314和F350至M363。
在本发明的另一个实施方式中，所述至少一种配体与结合位点2(低亲和力神经降压素结合位点和分拣蛋白前肽结合位点)结合，所述结合位点2包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586、W597、T168-I174、L572、A573和S584至F588。
在本发明的另一个实施方式中，所述至少一种配体与结合位点2(低亲和力神经降压素结合位点和分拣蛋白前肽结合位点)结合，所述结合位点2包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586和W597。
在优选的实施方式中，本发明的所述至少一种配体与结合位点2(低亲和力神经降压素结合位点和分拣蛋白前肽结合位点)结合，所述结合位点2包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114和V112。
在本发明的另一个优选的实施方式中，所述至少一种配体与结合位点3(神经营养素前肽结合位点)结合，所述结合位点3包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基D403、S420、D422、N423、S424、I425、E426、T451、Y466、E470、I498、S499和V500。由于结合位点3结合神经营养素的前结构域，所以所述结合位点3也可以结合完整的神经营养素前体。因此，结合位点3可以称为神经营养素前体结合位点或神经营养素前结构域结合位点或具有相同生化含义的同义表述。
在更优选的实施方式中，本发明的所述至少一种配体与结合位点3(神经营养素前肽结合位点)结合，所述结合位点3包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基D403、N423、S424、I425、T451、Y466、I498和V500。
在本发明的高度优选的实施方式中，所述至少一种配体与结合位点3(神经营养素前肽结合位点)结合，所述结合位点3包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基T451、Y466、I498和V500。
在本发明的另一个实施方式中，结合位点3(神经营养素前体结合位点)是proNGF结合位点。
在本发明的另一个实施方式中，结合位点3(神经营养素前体结合位点)是proBDNF结合位点。
在本发明的另一个实施方式中，结合位点3(神经营养素前体结合位点)是proNT3结合位点。
在本发明的另一个实施方式中，结合位点3(神经营养素前体结合位点)是proNT4/5结合位点。
根据权利要求1的晶体，其中所述多肽包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基78至755。
在另一个实施方式中，上文定义的晶体是单斜空间群。
在一个实施方式中，单斜空间群的晶体属于空间群C2。
在另一个实施方式中，上文定义的晶体是斜方空间群。
在一个实施方式中，所述斜方空间群的晶体是P212121。
在另一个实施方式中，上文定义的晶体是三斜空间群。
在一个实施方式中，所述三斜空间群的晶体是P1。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的晶体包括包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基78至755(sSortilin)或其片段或变体的多肽变体。
在本发明的一个实施方式中，上文定义的晶体包括分拣蛋白多肽，其中一个或多个或所有的蛋氨酸被Se-蛋氨酸(硒代蛋氨酸)替换。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的晶体包括选自下列的多肽配体：SEQ ID NO 6的氨基酸残基19至241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19至121(NGF前结构域)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19至246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19至127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17至257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17至140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25至210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25至80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)、SEQ ID NO.10的氨基酸残基11至13(YIL)，或其片段或变体。
生长分拣蛋白晶体的方法
在另一个方面，本发明进一步涉及生长分拣蛋白晶体的方法，其包括以下步骤：
a.在含有50mM Tris-HCl pH 7.9和150mM NaCl的缓冲液中获得包含4.5至5.5mg/mL的SEQ ID NO.1的多肽或其片段或变体的组合物；
b.将所述组合物与神经降压素以下列摩尔比混合：
i.1∶1.5至1∶15(sSortilin∶NT)或，
ii.1∶4(sSortilin∶前肽)；
c.分别提供等体积的所述组合物和结晶溶液，所述结晶溶液包含：
iii.18-21％w/v PEG 6000，和
iv.0-15％甘油，和
iv.Tris-HEPES pH 7.2-7.8(40-93mM Tris和100mM HEPES)或100mM Tris-HCl pH 7.9，3-6％甘油和
vi.300-900mM NaCl或150-400mM C3H2Na2O4(其中通过丙二酸将所述C3H2Na2O4调节至pH 6-7.5)，或300-500mM LiSO4或500-700mM KCl；和
d.获得包含SEQ ID NO.1或其片段或变体的晶体。
在本发明的另一个方面，SEQ ID NO.1的半胱氨酸残基被硒代蛋氨酸替换。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的获得晶体的方法还包括以下步骤：
a.分离原始沉淀物；和
b.通过蒸气扩散从悬滴使其生长。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的晶体还包括与分拣蛋白结合的配体，用于确定分拣蛋白或其片段或变体与所述配体的复合物的三维结构。
分拣蛋白结构
本发明人发现分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的残基78-609构成10叶片的β-螺旋桨的第一个实例。在4折叠上和下叶片之间以及在叶片的单个β-折叠之间都发现长的延伸(图1A)。含有较小的10个半胱氨酸(10CC)的C末端部分(残基610-758)，其自身显示为具有p75NTR中见到的富含半胱氨酸的结构域(18)的总体形状和构架的两个相似结构域(图1B)。两个10CC结构域和螺旋桨结构域之间的界面包含广阔的疏水性和静电相互作用并覆盖螺旋桨的一个面的大约180°。
总体上，螺旋桨结构域是卵形的并形成向10CC-界面侧缩窄的宽的轻微圆锥形通道。在赤道面上，该通道的截面是大约25乘
Figure BPA00001284386400311
(图1C+D)。从窄的10CC-界面侧与该通道的连通进一步被位于叶片7的折叠1末端的内边缘的Asn406连接的糖基化部分阻断(图1C+D)。在Asn162和Asn582发现另外两个糖基化，二者均位于外边缘并且二者均处于螺旋桨的10CC界面侧。值得注意的是，连接叶片1和10的折叠2和3的两个突出的疏水环出现在相对的面(图1B)，这提示该面尤其是该环可能介导与细胞膜的接触或者在与其它蛋白的相互作用中发挥作用。
在sSortilin与NT形成的复合物的两个结构中，本发明人发现NT的4个C末端残基(Pro10-Tyr11-Ile12-Leu13)形成短的β-折叠至叶片6的折叠1(本文称作高亲和力NT结合位点)。Tyr11的羟基基团与分拣蛋白的Lys260形成氢键，C末端亮氨酸进入由Phe313、Ile327和Ile353形成的疏水袋。但是，对结合的主要贡献显然是NT的C末端羧酸酯，其与Arg325的胍盐基团形成盐桥，与Ser316的侧链和Tyr351的主链酰胺形成氢键(图2B)。
在以大量过量的NT确定的结构中，发现另外两个结合位点。在螺旋桨的内边缘发现了结合位点2(图2A)。在那里神经降压素的N末端部分(残基2-6)模拟为与叶片1的第1个折叠相互作用的短的β折叠。在该位点没有观察到与受体相互作用的特异性侧链(图2B)。Lys6的Cα至Pro10的Cα的距离是
Figure BPA00001284386400321
并且在介入区不存在电子密度。因此，本发明人得出结论：在高浓度的NT，两个分子在螺旋桨内结合。
上述结果表明分拣蛋白具有针对NT的C末端的高亲和力结合位点，和结合该肽的N末端部分的次级低亲和力亚位点。因此，本发明人检查了NT衍生的片段抑制分拣蛋白与其自身前肽(Sort-pro)结合的能力。以前已经证明(5)：在存在5倍过量的NT的情况下，Sort-pro的结合被完全消除，并且C末端肽Arg9-Pro-Tyr-Ile-Leu13是等效的(图3A)。相反，本发明人发现：N末端肽NT(1-8)和Arg8-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu13-NH2(即末端羧酸酯被酰胺替换)二者都不能抑制(图3A+B)，而C末端三肽Tyr11-Ile-Leu13证明对于完全抑制Sort-pro结合是足够的(图3B)。Tyr11-Ile-Leu13也妨碍NGF前结构域(图3C)和RAP(图3D)的结合，虽然不如全长NT那样有效。后者表明proNGF和RAP可能遇到空间位阻并且具有不同于Tyr11-Ile-Leu13或比其更加延伸的结合位点。
神经降压素和Sort-pro没有序列相似性。但是，sSortilin与Sort-pro的片段(残基4-29)的复合物的结构显示出在螺旋桨内待占据的两个结合位点(图2C-E)。肽的密度虽强，但确定程度不足以模拟肽。但是，sSortilin∶NT结构覆盖清楚地显示：Sort-pro的密度与NT的C和N末端部分重叠(图2C+D)并填充其中的腔(图2E)。由于前肽不包含Tyr-Ile-Leu基序并且其结合不依赖于游离的C末端(8)，所以可以推论，Sort-pro或其它配体例如proNGF中的内在的酸性残基可能在结合中具有类似于NT的C末端Leu-羧酸酯的作用。
为了研究这一点，本发明人制备了sSortilin-突变体构建体，其中，Ser316或Arg325之一分别替换为Glu和Ala。然后使S316E突变体表达并纯化，而R325A突变体在纯化过程中证明其是不稳定的并且分解。有趣的是，两个突变体在分泌中均严重延迟(图4A)，并且对于没有前肽的表达的分拣蛋白也观察到了效应(8)。S316E显示不与Sort-pro结合但是确实与NGF-前结构域和BDNF结合，其亲和力类似于野生型分拣蛋白。如预料中的那样，NT的存在对于NGF-前结构域与S316E突变体的结合没有影响。这些结果强烈支持以下发现：Sort-pro和NT结合至相同的结构位点(结合位点1和2)，并且其它配体，例如神经营养素的前结构域，例如但不限于NGF前结构域和全长pro-NGF，结合至紧密相邻但独立的另外的位点(结合位点3)。
因此，在本发明的一个实施方式中，将配体设计为特异性结合分拣蛋白的三个结合位点中的一个或多个。因此，所述配体能够抑制内源性配体与相同位点的结合。所述内源性配体选自神经降压素、分拣蛋白的前肽、p75NTR和神经营养素前体，所述神经营养素前体选自pro-NGF、proBDNF、pro-NT3和proNT4/5。
来自8个物种的分拣蛋白的成对序列同一性在60-95％之间。序列比对(图5)将保守性残基的大的片绘制到螺旋桨腔的内表面，并且将较小的分散的片绘制到外边缘和10CC结构域(图1E)。腔中的保守性的模式与另外的或补充的结合位点的存在相一致，并且提示这样的替代性位点可能会使其它螺旋桨叶片参与β-折叠相互作用的形成。替代性位点的存在显然是重要的一点，因为数个配体都靶向分拣蛋白。众所周知，全长配体均竞争结合，但是竞争效率不同，不是所有的都被Tyr-Ile-Leu三肽有效地拮抗。因此，有可能的是，所有的配体必须结合螺旋桨腔内的重叠位点。因此，小肽例如Tyr-Ile-Leu可能通过占据高特异性共有位点来抑制，而较大配体可能通过阻断通入腔的限制空间来提供另外的抑制。
总之，本发明人确定了Vps10p-D蛋白家族成员和NT结合受体的第一个已知结构。结果揭示，事实上，Vps10p-D由两个不同的但结构上相互依赖的结构域组成，即10叶片的β-螺旋桨的第一个实例和由两个相似结构域组成的10CC。螺旋桨通道包括分拣蛋白的配体结合区，我们绘制了其与NT及其自身前肽相互作用的特异性位点。另外，我们证明神经营养素前体的识别位点的必需的部分也位于该区域内。关于“三肽Tyr-Ile-Leu以高亲和力靶向分拣蛋白”的发现提供了具有区分分拣蛋白、SorLA和G蛋白偶联的NTR的潜力的第一个NT衍生的配体，并且使得可以设计能减少分拣蛋白：p75NTR:proNGF复合物介导的细胞凋亡的特异性抑制剂。最后，我们的结构和结合分析可以用于将来模拟其它Vps10p-D受体的结构和相互作用，并用于研究它们在诸如糖尿病和阿尔茨海默病等疾病中的潜在作用(19-21)。
在另一个方面，本发明涉及计算机可读数据存储介质，其包括如图17-20任一项所示的分拣蛋白的结构坐标的至少一部分编码的数据存储材料。
在另一个方面，本发明涉及原子坐标在用于鉴定能够与下列一项或多项结合的配体的方法中的用途：
a.结合位点1，或
b.结合位点2，或
c.结合位点3，
或a至c的片段或变体；
其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400341
的三维结构。
在另一个方面，本发明涉及上文所述的晶体在用于确定分拣蛋白或其片段或变体的三维结构中的用途。
在另一个方面，本发明涉及原子坐标在用于鉴定能够与下列一项或多项结合的配体的方法中的用途：
a.结合位点1，或
b.结合位点2，或
c.结合位点3，
或a至c的片段或变体；
其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400351
的三维结构。
配体鉴定和设计的方法
本发明提供了鉴定和设计能够特异性结合上文定义的分拣蛋白的三个结合位点(1、2和3)中的任一个的配体的方法。
在优选的实施方式中，鉴定和设计的配体是分拣蛋白的潜在抑制剂，从而阻止分拣蛋白与神经营养素的前结构域，尤其是与proNGF和proBDNF的前结构域的结合。
然后可以联合计算机模拟从新设计潜在抑制剂。可以使用信息在计算机屏幕上产生化学结构或分子片段的模型，所述信息源自已知的储存在计算机数据库中的低分子量有机化学结构，或使用有关键合类型、构象等的有机化学家的一般知识来构建。适宜的计算机程序可以辅助该过程，以便建立真实几何学化学结构。可以选择化学结构或分子片段和/或将其用于构建潜在抑制剂，从而对所述子集或标准数据集合有利的相互作用成为可能。越有利的相互作用成为可能，潜在抑制剂与分拣蛋白的结合越强烈。优选地，与至少一个氨基酸残基的有利的相互作用应该成为可能。这样的有利的相互作用可以与氨基酸残基的任意原子发生，例如，肽骨架的原子或/和侧链的原子。
有利的相互作用是可以存在于化学结构之间的任何非共价引力，例如疏水或范德华力相互作用和极性相互作用，例如氢键、盐桥等。应该避免不利的相互作用例如疏水-亲水相互作用，但是如果它们比引力的总和弱，则是可以接受的。空间位阻例如所选的或以蛋白部分构建的抑制剂的部分的冲撞或重叠将阻止结合，除非通过构象变化可以解决。由此产生的潜在抑制剂的结合强度可以在计算机屏幕上通过比较有利的和不利的相互作用或者通过使用商售计算机程序中执行的计算方法来评估。
应该考虑潜在抑制剂的构象自由度和分拣蛋白的氨基酸侧链。可以使用已知的分子几何学尤其是扭转角，或者使用计算机程序(其具有分子力学和/或动态或量子力学或其组合的执行程序)通过计算机方式来确定潜在抑制剂的可接近的构象。
就形状和就亲水性或疏水性而言，潜在抑制剂至少部分互补于分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3的至少一部分。
可在不同程度上使用化学结构的数据库(例如剑桥结构数据库或来自Chemical Abstracts Service的数据库；综述见Rusinko(1993)Chem.Des.Auto.News 8，44-47)。在完全自动化的实施方式中，可以使用计算机的处理器和适宜的计算机程序，就互补性和无空间位阻而言，将数据中的所有结构与活性位点或与分拣蛋白的结合袋进行对比。在这种情况下，可能不需要包含在计算机屏幕前的人工用户相互作用的计算机模拟。或者，可以从数据库中选择分子片段并在计算机屏幕上组装或构建，例如人工进行。另外，在选择过程中，本领域技术人员的自动/人工相互作用之比也可以有巨大差异。随着用于药物设计和分子彼此间对接的计算机程序变得更好，人工相互作用的需要降低了。
用于计算机模拟的程序包括Quanta(Molecular Simulations，Inc.)和Sibyl(Tripos Associates)。其它有用的程序有Autodock(Scripps Research Institute，La Jolla，描述于Goodsell和Olsen(1990)Proteins：Structure，Function and Genetics，8，195-201)、Dock(University of California，San Francisco，描述于Kuntz等人(1982)J.Mol.Biol.161，269-288)。
在另一个方面，本发明涉及鉴定配体的方法，所述配体能够结合SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体，所述方法包括以下步骤：
a.使用原子坐标在计算机屏幕上产生结合位点的空间结构，所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400361
的三维结构；
b.在计算机屏幕上产生具有其空间结构的潜在配体；和
c.选择能够结合至结合相互作用的集合的至少一个氨基酸残基而无空间位阻的配体。
在另一个方面，本发明涉及计算机辅助的鉴定分拣蛋白的配体的方法，所述配体能够结合SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体，所述方法使用包含处理器、数据存储系统、数据输入设备和数据输出设备的程序计算机，所述方法包括以下步骤：
a.通过所述输入设备向所述程序计算机输入包括下列内容的数据：所述分拣蛋白的原子子集的原子坐标，从而产生标准数据集合；其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400371
的三维结构；
b.使用所述处理器，将所述标准数据集合与储存在数据存储系统中的低分子量有机化学结构和肽片段的计算机数据库进行对比；和
c.使用计算机方法，从所述数据库中选择具有在结构上与所述标准数据集合互补的部分且与受体分拣蛋白没有空间位阻的化学结构。
在另一个方面，本发明涉及鉴定配体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使用与计算机模拟相结合的原子坐标选择潜在配体，其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或其中所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400372
的三维结构，所述选择这样进行：将潜在配体对接进入SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的结合相互作用位点的集合，其中所述结合相互作用通过计算机模拟产生；选择能够与所述分拣蛋白的结合相互作用位点的集合中的至少一个氨基酸结合的潜在配体；
b.提供所述潜在配体和所述受体分拣蛋白；
c.将所述潜在配体与所述受体分拣蛋白接触；和
d.检测所述潜在配体与所述受体分拣蛋白的结合。
在本发明的一个实施方式中，潜在配体分子的对接通过应用图17-20任一项所示的三维结构的原子坐标定义的三维结构而进行，从而所述潜在配体能够结合至SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体中的至少三个氨基酸。
在另一个方面，本发明涉及鉴定分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3或其片段或变体的潜在配体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将源自原子坐标的信息导入计算机，所述原子坐标基于三维结构测定定义SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的构象，从而计算机程序利用或在计算机屏幕上显示所述构象的结构；其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400381
的三维结构；
b.通过所述计算机程序在计算机屏幕上产生分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3的三维图示；
c.将潜在配体的模型重叠到所述的分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3或其片段或变体的图示上；
d.评估所述潜在配体与分拣蛋白的高亲和力神经降压素结合位点、低亲和力神经降压素结合位点、分拣蛋白前肽结合位点或神经营养素前体结合位点的结合以及不存在空间位阻的可能性；
e.将所述潜在配体化合物引入所述受体分拣蛋白的结合测定中；和
f.确定所述潜在配体是否抑制竞争性配体的结合，所述竞争性配体选自但不限于：SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-121(NGF前结构域)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)和SEQ ID NO.10的氨基酸残基11-13(YIL)。
在本发明的另一个实施方式中，使用源自结合位点1的下列氨基酸残基中的至少一个的原子坐标的信息：SEQ ID NO.1的R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306、T398至G400、I303-G309、Q349-A356、Y395和T402。
在本发明的另一个实施方式中，源自结合位点2的下列氨基酸残基中的至少一个的原子坐标的信息用于配体预测和/或设计：SEQ ID NO.1的L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586、W597、T168-I174、L572、A573和S584至F588。
在本发明的另一个实施方式中，使用源自结合位点3的下列氨基酸残基中的至少一个的原子坐标的信息：SEQ ID NO.1的D403、S420、D422、N423、S424、I425、E426、T451、Y466、E470、I498、S499和V500。
在本发明的另一个实施方式中，数据标准集合或结合相互作用集合包含选自鉴定的组的至少3个氨基酸残基。
在本发明的另一个实施方式中，原子坐标确定至至少的分辨率。
在本发明的另一个实施方式中，原子坐标确定至至少
Figure BPA00001284386400392
的分辨率。
在本发明的另一个实施方式中，原子坐标确定至至少
Figure BPA00001284386400393
的分辨率。
在本发明的另一个实施方式中，原子坐标确定至至少
Figure BPA00001284386400395
的分辨率。
在本发明的另一个实施方式中，原子坐标确定至至少
Figure BPA00001284386400396
的分辨率。
Vps10p-结构域受体配体的特征
通过上文定义的方法鉴定的配体特异性结合至通过分拣蛋白的晶体结构鉴定的结合位点。由于Vps10p-结构域家族的5个成员之间的Vps10p-结构域的同源性，鉴定为与分拣蛋白的结合位点1-3结合的配体也可能与其它Vps10p-结构域受体的Vps10p-结构域相互作用。
在本发明的一个实施方式中，潜在配体分子与SEQ ID NO.1的高亲和力神经降压素结合位点中的至少氨基酸相互作用。
在本发明的另一个实施方式中，潜在配体分子与SEQ ID NO.1的低亲和力神经降压素结合位点中的至少氨基酸相互作用。
在本发明的另一个实施方式中，潜在配体分子与SEQ ID NO.1的分拣蛋白前肽结合位点中的至少氨基酸相互作用。
在本发明的另一个实施方式中，潜在配体分子与SEQ ID NO.1的神经营养素前体结合位点中的至少氨基酸相互作用。
在本发明的另一个实施方式中，潜在配体选自非水解性肽和肽类似物、有机化合物和无机化合物。
在本发明的另一个实施方式中，筛选有机小分子的文库。
在本发明的另一个实施方式中，筛选潜在肽配体的文库。
在另一个方面，本发明涉及通过上文描述的方法鉴定的配体，所述配体能够结合所述结合位点1的至少一个相互作用点，所述相互作用点包含图14的X1、X2、X3、X4、R1、R2、J1、J2和J3，其中
X1包括SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316和Y351，并且其中
X2包括Y351的骨架羰基，并且其中
X3包括I353的骨架，并且其中
X4包括K260的氨基，并且其中
R1包括氨基酸残基I327、F314、Y351、I353和M363，并且其中
R2包括F350和来自包含氨基酸残基T397至E401的环的至少一个氨基酸，并且其中
J1包括S305，并且其中
J2包括F306的骨架酰胺，并且其中
J3包括F306的骨架羰基。
在本发明的另一个实施方式中，相互作用点X1包括负电荷和/或氢受体特征，所述负电荷和/或氢受体特征选自羧酸盐、磺酸、二氟(所述二氟缺少补偿精氨酸的正电荷的负电荷)、二氯(所述二氯缺少补偿精氨酸的正电荷的负电荷)。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的配体在相互作用点X2包括选自羟基、氨基和酰胺基的氢键供体。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的配体在相互作用点X3包括选自羰基、氯和氟的氢键受体。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的配体在相互作用点R1包括大的疏水性基团，其选自环己基-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的配体在相互作用点R2包括选自异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸的疏水性氨基酸残基，或者选自组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和谷氨酸的部分疏水性的基团。
在重要的方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(I)的一般结构：
Figure BPA00001284386400401
其中X是作为氢供体的原子，所述原子选自N、O、S、P，并且其中，
Y是作为氢键受体的电负性原子，所述原子选自O、N、S、F、Cl、Br、I，并且其中，
R1是C3-6烷基；C4-6环基；杂环或杂芳族结构，其具有一个环，每个环中含有4-6个环成员，且含有1-3个杂原子；或含有1-3个选自N、O、S(O)0-2的杂原子的杂烷基，并且其中，
R2是氢；C1-12烷基或芳族、碳环、杂环或杂芳族结构，其具有1-3个环，每个环中含有3-8个环成员，且含有0-4个杂原子；或含有1-8个选自N、O、S(O)0-2的杂原子的杂烷基，并且其中，
R3是氢；SH；咪唑；C1-12烷基；或芳族、碳环、杂环或杂芳族结构，其具有1-3个环，每个环中含有3-8个环成员，且含有0-4个杂原子；或含有1-8个选自N、O、S的杂原子的杂烷基，并且其中，
R4选自官能团C1-100线性或支链的烷基、线性或支链的烯基、线性或支链的炔基、苯基、苄基、卤代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、卤代甲酰、羟基、羰基、醛、碳酸酯、羧酸酯、羧基、醚、酯、过氧氢基、过氧基、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺、铵、伯酮亚胺、仲酮亚胺、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、氰酸酯、异氰化物、异硫代氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、priidyl、膦基、磷酸酯、膦酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基(SH)、硫氰酸酯、二硫化物、接头L2或L3，以及与SEQ ID NO.10为至少50％同一性的氨基酸序列或其片段。
在另一个重要方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(II)的一般结构：
Figure BPA00001284386400421
其中Z是氢键供体或受体，其选自羰基、羟基、氨基、亚氨基、酰胺、巯基、氯、氟，并且其中，
R5选自H、CH3和接头L2，并且其中，
R6选自H、-CH3、-CH2CH3和-OCH3，并且其中，
R7选自谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸的侧链、脂肪族C4-6基团，并且其中，
R8选自酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、碘-酪氨酸的侧链、和-CH2-NH2，并且其中，
R9选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺的侧链、C3-8脂肪族和杂脂肪族基团、含有5元或6元环的碳环和杂环基团，并且其中，
R10选自焦谷氨酸、聚-烃和长度大于等于10的多肽，并且其中，
R11和R12各自选自H、C1-12线性或支链的烷基、线性或支链的烯基、线性或支链的炔基、苯基、苄基、卤代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、卤代甲酰、羟基、羰基、醛、碳酸酯、羧酸酯、羧基、醚、酯、过氧氢基、过氧基、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺、铵、伯酮亚胺、仲酮亚胺、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、氰酸酯、异氰化物、异硫代氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、priidyl、膦基、磷酸酯、膦酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基(SH)，并且其中，
共价键(1)和(2)各自选自单键和双键。
在非常重要的方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(III)的一般结构：
Figure BPA00001284386400431
其中R13选自H、C1-12烷基、烯基、炔基和接头L3，并且其中，
R14、R15、R17、R19、R20各自选自H、C1-12烷基、烯基和炔基，并且其中，
R16选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸的侧链和脂肪族C3-7，并且其中，
R18选自H、-CH3和-CH2OH，并且其中，
共价键(1)和(2)各自选自单键和双键。
在本发明的一个实施方式中，式(I)的配体通过接头L2与式(II)的配体连接，从而形成通式(IV)：
[式(I)]-[接头L2]-[式(II)]    (IV)
其中所述式(IV)能够同时阻断分拣蛋白的结合位点1和2，并且其中上文提及的接头L2选自5至6个残基的肽骨架、C15-20烷基、C15-20烯基和C15-20炔基。
在本发明的一个实施方式中，式(I)的配体通过接头L3与式(III)的配体连接，从而形成通式(V)：
[式(I)]-[接头L3]-[式(III)]    (V)
其中所述式(V)能够同时阻断分拣蛋白的结合位点1和3，并且其中上文提及的接头L3选自12至20个残基的肽骨架、C30-60烷基、C30-60烯基和C30-60炔基。
在另一个实施方式中，通过本发明的方法鉴定的配体选自图26中显示的RRPYI(chg)、碘YIL、QIL、YCL、dYIL、YHL、RRPYI(acc)、RRPYI(nMe)L、YIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的RRPYI(chg)。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的碘YIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的QIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的YCL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的dYIL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的YHL。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的RRPYI(acc)。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的RRPYI(nMe)L。
在另一个方面，本发明涉及通过本文定义的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体，其中所述配体是如图26所示的YIL。
在一个实施方式中，所述配体不选自天然神经降压素、NT(8-13)或NT69L。
在本发明的另一个实施方式中，通过上文描述的方法鉴定的配体能够抑制结合Vps10p-结构域受体分拣蛋白的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体。
在另一个方面，本发明涉及建立Vps10p-结构域受体蛋白分子的原子模型的方法，其包括以下步骤：
a.鉴定与SEQ ID NO.1具有至少20％序列同一性的Vps10p-结构域受体，或其片段或变体；和
b.使用原子坐标通过同源性模拟获得所鉴定的Vps10p-结构域受体的原子模型，所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400451
的三维结构。
在本发明的另一个实施方式中，根据上文定义的方法建立的Vps10p-结构域受体选自SEQ ID NO.2(SorLA)、SEQ ID NO.3(SorCS1)、SEQ ID NO.4(SorCS2)和SEQ ID NO.5(SorCS3)或其片段或变体。
在另一个方面，本发明涉及鉴定Vps10p-结构域受体的潜在配体或其片段或变体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将源自原子坐标的信息导入计算机，所述原子坐标基于三维结构测定定义与SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体具有至少20％序列同一性的结合位点的构象，从而计算机程序利用或在计算机屏幕上显示所述构象的结构；其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的任一个三维结构的偏差不超过
Figure BPA00001284386400452
的三维结构；
b)通过所述计算机程序在计算机屏幕上产生与分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3或其片段或变体具有至少20％序列同一性的结合位点的三维图示；
c)将潜在配体的模型重叠到所述与分拣蛋白的位点1、结合位点2或结合位点3具有至少20％序列同一性的结合位点的图示上；
d)评估所述潜在配体和与分拣蛋白的结合位点1、结合位点2或结合位点3或其片段或变体具有至少20％序列同一性的结合位点的结合以及不存在空间位阻的可能性；
e)将所述潜在配体化合物引入所述Vps10p-结构域受体的结合测定中；和
f)通过进行生物化学或生物物理的竞争性结合测定来确定所述潜在配体是否能够结合至所述与SEQ ID NO.1的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3具有至少20％序列同一性的结合位点，其中所述竞争性配体选自：SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-121(NGF前结构域)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)、SEQ ID NO.10的氨基酸残基11-13(YIL)和SEQ ID NO.12(NT69L)，或所述竞争性配体的片段或变体。
适应症
在一个方面，本发明涉及包含分拣蛋白和/或分拣蛋白：proNGF:p75NTR诱导的细胞凋亡的抑制剂的药物。
在本发明的一个实施方式中，通过上文描述的方法鉴定的所述至少一种配体用于制备药物，其中所述药物用于治疗、预防或治疗和预防和/或针对下列的保护：个体的神经系统的疾病、病症或损伤。
在本发明的另一个实施方式中，上述个体是人类。
在本发明的另一个实施方式中，上述药物用于治疗涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经损伤的疾病、病症或损伤。
在本发明的一个实施方式中，上文定义的损伤是由中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、弥漫性轴索损伤和癫痫症造成的。
在本发明的一个实施方式中，神经系统病症涉及神经元及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的进程的退化。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经元的退化是由帕金森病、阿尔茨海默病、老年痴呆、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化和与多发性硬化相关的神经元损伤造成的。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的神经退行性疾病是帕金森病。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的神经退行性疾病是亨廷顿病。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的神经系统病症是涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤。
在本发明的另一个实施方式中，以上提及的涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤选自由代谢疾病、营养缺乏、毒性损伤、恶性肿瘤引起的病况和/或遗传性或先天性病况，其包括但不限于糖尿病、肾功能失调、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏和感染。
在本发明的一个实施方式中，所述神经系统病症是涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤，其中所述神经胶质细胞选自脑、脑干、脊髓和外周神经中的少突细胞、星细胞和施沃恩细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤选自多发性硬化、眼神经炎、脑硬化、感染后脑脊髓炎和癫痫症。
在本发明的一个实施方式中，所述疾病或病症是多发性硬化、感觉共济失调、神经退行性脊髓小脑病症、遗传性共济失调、小脑萎缩和酒精中毒。
在本发明的一个实施方式中，所述神经系统病症、疾病或损伤涉及视网膜、感光器和相关的神经。
在本发明的一个实施方式中，涉及视网膜、感光器和相关的神经的神经系统病症、疾病或损伤选自色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼和糖尿病性视网膜病。
在本发明的一个实施方式中，所述神经系统病症、疾病或损伤涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞的神经系统病症、疾病或损伤选自噪声诱导的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩和梅尼埃病。
在本发明的一个实施方式中，上文定义的药物任选地包含药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的药物包含选自下列的第二种活性成分：能够与SEQ ID NO.1的高亲和力神经降压素结合位点(结合位点1)结合的配体、能够与SEQ ID NO.1的低亲和力神经降压素结合位点(结合位点2)结合的配体、能够与SEQ ID NO.1的分拣蛋白前肽结合位点(结合位点1和2)结合的配体以及能够与SEQ ID NO.1的神经营养素前体结合位点(结合位点3)结合的配体。
给药形式
治疗方法中的药物输送的主要途经是静脉内、口服和局部。也考虑到其它的给药方法，例如皮下注射或通过吸入，它们可有效将药物输送到靶位点或将药物导入血流。
本发明的药物制备物所施用至的粘膜可以是待给予生物学活性物质的哺乳动物的任意粘膜，例如，鼻、阴道、眼、口、生殖道、肺、胃肠道或直肠中，优选鼻、口或阴道的粘膜。
本发明的化合物可以非肠道给药，即通过静脉内、肌内、皮下、鼻内、直肠内、阴道内或腹膜内给药。一般优选是非肠道给药的皮下和肌内形式。这种给药方式的合适剂型可以通过常规技术制备。化合物还可以通过吸入给药，即通过鼻内和口吸入给药。这种给药方式的合适剂型(例如气雾剂制剂或计量式吸入器)可以通过常规技术制备。
根据本发明的化合物可以与至少一种其它化合物一起给予。化合物可以同时给予，可以作为分开的制剂，也可以组合在单元剂型中，或依次给予。
制剂
虽然本发明的化合物或盐可以作为原始化学物质给予，但优选是将其以药物制剂的形式呈现。因此，本发明进一步提供了用于医学用途的药物制剂，其包含本文定义的本发明的化合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体。
本发明的化合物可以以很多种口服给药剂型来配制。药物组合物和剂型可以包含本发明的化合物或其药学上可接受的盐或晶体形式作为活性成分。药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式的制备物包括粉末、药片、药丸、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒。固体载体可以是一种或多种物质，其还可以用作稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、润湿剂、药片分解剂或封装材料。
优选地，所述组合物含有约0.5％至75％重量的本发明的一种或多种化合物，其余由适宜的药学赋形剂组成。对于口服给药，这样的赋形剂包括药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。
在粉末中，载体是精细分割的固体，其是与精细分割的活性成分的混合物。在药片中，活性成分以适当的比例与具有必要的结合能力的载体混合，并压缩成想要的形状和大小。粉末和药片优选含有1％至约7％的活性化合物。适宜的载体是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制备物”意指包括活性化合物与作为载体的封装材料的制剂，提供一种胶囊，其中含有或不含载体的活性成分被载体包围，载体与它结合。类似的，包括扁囊剂和锭剂。药片、粉末、胶囊、药丸、扁囊剂和锭剂可作为适合于口服给药的固体形式。
根据本发明的滴液可以包含无菌的或非无菌的水性或油性溶液或悬浮液，可以通过将活性成分溶解在合适的水性溶液中来制备，所述水性溶液任选包括杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂，并任选包括表面活性剂。然后可以通过过滤使得到的溶液澄清，将其转移到合适的容器中，然后密封并通过高压灭菌或在98-100℃维持半小时来灭菌。或者，该溶液可以通过过滤来灭菌并无菌地转移到容器中。适合包括在滴液中的杀细菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制备油性溶液的合适的溶剂包括甘油、稀释的醇和丙二醇。
还包括这样的固体形式的制备物，其在使用之前的短时间内被转化为液体形式的制备物以用于口服给药。这样的液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。除了活性成分之外，这些制备物可以包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
适合于口服给药的其它形式包括液体形式的制备物，包括乳液、糖浆、酏剂、水性溶液、水性悬浮液、牙膏、凝胶洁牙剂、咀嚼胶或旨在使用前短时间内转化为液体形式制备物的固体形式制备物。乳液可以在水性丙二醇溶液中的溶液中制备，或者可以含有乳化剂，例如卵磷脂、单油酸山梨糖醇酐酯或阿拉伯树胶。水性溶液可以通过将活性成分溶解在水中并加入合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。水性悬浮液可以通过将精细分割的活性成分分散在水与粘性材料(例如，天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它熟知的悬浮剂)中来制备。固体形式的制备物包括溶液、悬浮液和乳液，除了活性成分之外，可以包括着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人造和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
本发明的化合物可以配制为非肠道给药(例如通过注射，例如弹丸注射或持续注入)，可以以安瓿、预注入的注射器、小体积注射的单元剂型或具有添加的防腐剂的多剂容器来呈现。组合物可以采用下列形式，例如油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液，例如水性聚乙二醇中的溶液。油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或介质的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)，并且可以包含制剂试剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，通过无菌分离无菌固体或者通过从溶液中冻干(在使用前以合适的介质，例如无菌的无热源的水进行复原)而获得。
用于非肠道制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。用于这样的制剂的油的具体实例包括花生油、豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。用于非肠道制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯的实例有油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。
用于非肠道制剂的合适的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，合适的去污剂包括(a)阳离子去污剂，例如，例如，二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶盐；(b)阴离子去污剂，例如，例如，烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基、烯烃、醚和硫酸单甘油酯，和磺基琥珀酸盐；(c)非离子去污剂，例如，例如，脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺，和聚氧乙烯聚丙稀共聚物；(d)两性去污剂，例如，例如，烷基-β-氨基丙酸盐，和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)上述物质的混合物。
非肠道制剂通常含有约0.5％至约25％重量的溶液中的活性成分。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了使注射位点的刺激最小化或使其消除，此类组合物可以包含一种或多种非离子型表面活性剂，其具有大约12至大约17的亲水-亲脂平衡(HLB)。此类制剂中表面活性剂的量通常介于约5％至约15％重量。合适的表面活性剂包括聚乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如单油酸山梨糖醇酐酯和氧化乙烯与疏水性碱的高分子量加成物(通过氧化丙稀与丙二醇的缩合形成)。非肠道制剂可以是单元剂量或多剂密封的容器，例如安剖和管，可以储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，在临使用前只需加入无菌的液体赋形剂，例如水，以进行注射。即用型注射液和悬浮液可以从前述类型的无菌粉末、颗粒和药片来制备。
本发明的化合物还可以局部输送。局部给药的方案包括皮肤表面，还有阴道、直肠、鼻、口和咽喉的粘膜组织。通过皮肤和粘膜局部给药的组合物不应产生刺激迹象，例如肿胀或红色。
局部组合物可以包括适用于局部给药的药学上可接受的载体。因此，组合物可以采取例如悬浮液、溶液、膏、洗液、性润滑剂、霜、泡沫、气雾剂、喷雾剂、栓剂、植入物、吸入物、药片、胶囊、干粉、糖浆、香膏(balm)或锭剂的形式。用于制备此类组合物的方法是制药学领域熟知的。
本发明的化合物可以配制用于局部给药至表皮，作为膏、霜或洗液，或作为透皮贴剂。膏和霜可以例如在水性或油性基底中加入合适的增稠剂和/或凝胶化剂来配制。洗液可以以水性或油性基底配制，并且通常还将含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。适合于口中局部给药的制剂包括：在调味的基底(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)中包含活性试剂的锭剂(lozenge)；在惰性基底(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含活性成分的锭剂(pastille)；和在适当的液体载体中包含活性成分的口腔洗液。
根据本发明的霜、膏或糊是用于外部施用的活性成分的半固体制剂。它们可以通过将精细分割的或粉末形式的活性成分(单独的，或者在水性或非水性液体的溶液或悬浮液中)在合适的机器的帮助下与油脂或非油脂基底混合来制备。该基底可以包括烃，例如硬的、软的或液体石蜡，甘油，蜂蜡，金属皂；粘胶；天然来源的油，例如杏仁油、玉米油、落花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或脂肪酸，例如硬脂酸或油酸，以及醇，例如丙二醇或大粒凝胶。制剂可以掺入任意合适的表面活性剂，例如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，例如山梨糖醇酐酯或其聚氧乙烯衍生物。还可以包括悬浮剂，例如天然树胶、纤维素衍生物或无机材料，所述无机材料例如硅石(silicaceous silica)和其它成分例如羊毛脂。
根据本发明的洗液包括适合施用至皮肤或眼睛的那些。眼睛洗液可以包含无菌水溶液，其任选地包含杀细菌剂并且可以通过类似于制备滴液的那些方法来制备。应用于皮肤的洗液或擦剂还可以包括加速干燥和使皮肤冷却的试剂，例如醇或丙酮，和/或保湿液，例如甘油或油，所述油例如蓖麻油或落花生油。
透皮输送
本文描述的药学试剂-化学修饰剂复合物可以透皮给药。透皮给药通常涉及输送药学试剂以使药物穿过皮肤进入患者的全身循环。皮肤位点包括透皮给予药物的解剖学区域，并且包括前臂、腹部、胸部、背部、屁股、乳头区域等。
透皮输送通过将复合物来源暴露于患者的皮肤持续延长的时间段来进行。透皮贴剂具有提供药学试剂-化学修饰剂复合物的受控输送至身体的额外优点。参见Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and Research Initiatives，Hadgraft和Guy(编)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications，Robinson和Lee(编)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；以及Transdermal Delivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(编)，CRC Press，(1987)。这样的剂型可以通过将药学试剂-化学修饰剂复合物溶解、分散或掺入到合适的介质(例如弹性基质材料)来制备。还可以使用吸附增强剂以加速化合物穿过皮肤的流动。此流动的速率可以通过提供速控膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中加以控制。
被动透皮药物输送
多种类型的透皮贴剂可用于本文描述的方法中。例如，可以从里衬(backing)材料和丙烯酸酯粘合剂制备简单的粘合贴剂。将药学试剂-化学修饰剂复合物和任何增强剂配制进入粘合浇铸液中并使其充分混合。然后将所述溶液直接浇到里衬材料上，然后使浇铸溶剂在烤箱中蒸发，留下粘合膜。可以贴上释放衬(release liner)以完成系统。
或者，可以应用聚氨酯基质贴剂来输送药学试剂-化学修饰剂复合物。该贴剂的层包含里衬、聚氨酯药物/增强剂基质、膜、粘合剂和释放衬。使用室温固化的聚氨酯预聚物来制备聚氨酯基质。向该预聚物中加入水、醇和复合物引起粘的稳定弹性体的形成，该弹性体其可直接浇到仅有里衬材料上。
本发明的另一个实施方式将利用水凝胶基质贴剂。通常，水凝胶基质将包含醇、水、药物和几种亲水性聚合物。这种水凝胶基质可以掺入到里衬和粘合层之间的透皮贴剂中。
液体储库型贴剂也可用于本文描述的方法中。这种贴剂包含不渗透性的或半渗透性的、可热封的里衬材料、可热封的膜、基于丙烯酸酯的压感皮肤粘合剂和硅化释放衬。将里衬热封至膜以形成储库，然后以复合物、增强剂、凝胶化剂和其它赋形剂的溶液填充所述储库。
泡沫基质贴剂在设计和成分上类似于液体储库系统，不同之处在于成胶的药学试剂-化学修饰剂溶液被限制在细的泡沫层内，该泡沫层通常是聚氨酯。该泡沫层位于里衬和膜(已经在贴剂的外围热封)之间。
对于被动输送系统，释放速率通常由置于储库和皮肤之间的膜通过从单块装置扩散进行控制，或通过皮肤自身作为输送系统中的速控屏障进行控制。参见美国专利号4,816,258、4,927,408、4,904,475、4,588,580、4,788,062等。药物输送的速率部分取决于膜的性质。例如，跨越体内膜的药物输送速率一般比跨越真皮屏障的快。复合物从装置输送至膜的速率最有利地是通过使用限速膜进行控制，所述限速膜置于储库和皮肤之间。假设皮肤对于复合物是足够通透的(即通过皮肤的吸收大于穿过膜的速率)，膜将发挥控制患者体验的剂量速率的作用。
合适的通透性膜材料可以基于想要的通透性程度、复合物的性质和与构建该装置相关的力学考虑来进行选择。示例性的通透膜材料包括多种天然和合成的聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(硅橡胶)、乙烯醋酸乙烯共聚物(EVA)、聚氨酯、聚氨酯-聚醚共聚物、聚乙烯、聚酰胺、聚氯乙烯(PVC)、聚丙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE)、纤维素材料(例如三醋酸纤维素和硝酸纤维素/醋酸纤维素)以及水凝胶，例如甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)。
其它物质可以包括在装置中，例如其它常规的治疗产品的成分，这取决于想要的装置特性。例如，根据本发明的组合物还可以包括一种或多种防腐剂或抑细菌剂，例如羟苯甲酯、羟苯丙酯、氯化甲酚、苯扎氯铵等。这些药物组合物还可以包含其它活性成分，例如抗微生物剂，特别是抗生素，麻醉剂，止痛剂和止痒剂。
本发明的化合物可以配制为作为栓剂给药。首先将低熔点的蜡，例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔化，然后通过例如搅拌将活性成分均匀分散。然后将熔化的均匀混合物倒入方便的尺寸模具，使其冷却并固化。
可以将活性化合物配制进入栓剂，该栓剂包含例如大约0.5％至大约50％的本发明的化合物，其分布在聚乙二醇(PEG)载体(例如PEG 1000[96％]和PEG 4000[4％])中。
本发明的化合物可以配制为阴道给药。除了活性成分之外含有此类载体的阴道栓剂、卫生棉条、霜、凝胶、糊、泡沫或喷雾剂是本领域已知适当的。
本发明的化合物可以配制为鼻给药。通过常规方式，例如使用点滴器、吸管或喷雾器，将溶液或悬浮液直接施用至鼻腔。可以以单剂或多剂形式提供制剂。在使用点滴器或吸管的后一种情况下，这可以通过患者给予适当的、体积预先确定的溶液或悬浮液来进行。在使用喷雾器的情况下，这可以通过例如计量式雾化喷雾器泵来进行。
本发明的化合物可以配制为气雾剂给药，尤其是向呼吸道给药，且包括鼻内给药。化合物通常将具有小的颗粒尺寸，例如5微米或更小的数量级。这样的颗粒尺寸可以通过本领域已知的方式获得，例如通过微粉化。在加压包中提供活性成分与合适的推进剂，例如氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。气雾剂还可以方便地包含表面活性剂，例如卵磷脂。可以通过计量阀控制药物的剂量。或者，可以以干粉的形式提供活性成分，例如化合物在适当的粉末基底(例如乳糖、淀粉、淀粉衍生物，例如羟丙甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷(PVP))中的粉末混合物。粉末载体将在鼻腔内形成凝胶。粉末组合物可以以单元剂型呈现，例如，例如明胶的胶囊或药筒，或泡罩包装，从中可以通过吸入器的方式给予粉末。
如果需要，可以以肠衣包被来制备制剂，所述肠衣包被适用于活性成分的缓释或控释给药。
药物制备物优选是单元剂型。在这样的形式中，制备物被再分成含有合适量的活性成分的单元剂量。单元剂型可以是包装的制备物，该包装含有不连续数量的制备物，例如包装的药片、胶囊和小瓶或安剖中的粉末。同样，单元剂型可以是胶囊、药片、扁囊剂或锭剂本身，或者其可以是包装形式的合适数目的这些中的任一项。
药学上可接受的盐
当可以制备时，本发明化合物的药学上可接受的盐也包括在本发明内。这些盐是其应用被药学用途接受的那些。意思是，所述盐将保持母体化合物的生物学活性，并且该盐对于其治疗疾病的应用和用途没有不利的或有害的效应。
药学上可接受的盐以标准方式制备。如果母体化合物是碱，则以适当溶剂中的过量的有机或无机酸处理它。如果母体化合物是酸，则以适当溶剂中的无机或有机碱处理它。
本发明的化合物可以以其碱金属或碱土金属盐的形式与药学上可接受的载体或稀释剂并行、同时或一起给药，尤其并优选是其药物组合物的形式，可以以有效的量通过口服、直肠或非肠道(包括皮下)途经给予。
用于本发明的药物组合物的药学上可接受的酸加成盐的实例包括例如从矿物酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)和有机酸(例如酒石酸、醋酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸、对甲基苯磺酸和芳基磺酸)衍生的那些。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的药物组合物的pH介于pH 5和pH 9。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的药物配制为通过注射、栓剂、口服给药、舌下药片或喷雾剂、皮肤给药或吸入给药。
在本发明的一个实施方式中，所述药物配制为通过注射给药，其中所述注射为静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、弹丸注射或持续给药。
在一个实施方式中，根据本发明的药物以30分钟至24小时的间隔给药。
在一个实施方式中，根据本发明的药物以1至6小时的间隔给药。
在本发明的一个实施方式中，上文定义的药物的给药持续时间为6至72小时。
在本发明的一个实施方式中，上文定义的药物的剂量是每千克体重10μg至10mg。
治疗方法
在另一个方面，本发明涉及通过上文描述的方法鉴定的至少一种配体用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗个体的神经系统疾病、病症或损伤。
在另一个方面，本发明涉及治疗受试者中的病理性状况的方法，其包括向有此需要的个体给予治疗上有效量的上文描述的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述药物用于治疗与神经系统有关的疾病、病症或损伤。
在本发明的另一个实施方式中，所述药物用于治疗涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经的损伤的疾病、病症或损伤，其包括但不限于下列病况，例如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、弥漫性轴索损伤和癫痫症。
在本发明的另一个实施方式中，所述药物用于治疗涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经的损伤的疾病、病症或损伤。
在本发明的另一个实施方式中，上文描述的神经系统病症涉及神经元及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的进程的退化。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经元的退化是由帕金森病、阿尔茨海默病、老年痴呆、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化和与多发性硬化相关的神经元损伤造成的。
在本发明的一个实施方式中，所述神经退行性疾病是帕金森病。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经退行性疾病是亨廷顿病。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化。
在本发明的另一个实施方式中，上文公开的神经系统病症是涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤。
在本发明的另一个实施方式中，所述涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤选自由代谢疾病、营养缺乏、毒性损伤、恶性肿瘤引起的病况，和/或遗传性或先天性病况，包括但不限于糖尿病、肾功能失调、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏和感染。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经系统病症是涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤，其中所述神经胶质细胞选自脑、脑干、脊髓和外周神经中的少突细胞、星细胞和施沃恩细胞。
在本发明的另一个实施方式中，所述涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤选自多发性硬化、眼神经炎、脑硬化、感染后脑脊髓炎和癫痫症。
在本发明的另一个实施方式中，所述疾病或病症是多发性硬化、感觉共济失调、神经退行性脊髓小脑病症、遗传性共济失调、小脑萎缩和酒精中毒。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经系统病症、疾病或损伤涉及视网膜、感光器和相关的神经，其中所述涉及视网膜、感光器和相关的神经的神经系统病症、疾病或损伤选自色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼和糖尿病性视网膜病。
在本发明的另一个实施方式中，所述神经系统病症、疾病或损伤涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞。
在本发明的另一个实施方式中，所述涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞的神经系统病症、疾病或损伤选自噪声诱导的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩和梅尼埃病。
在本发明的一个实施方式中，上文描述的受试者是人类。
细胞凋亡
当细胞受到可修复之外的损伤时、受到病毒感染时或经历诸如饥饿等压力条件时，会发生细胞凋亡。细胞凋亡的“决定”可以来自细胞自身，或来自周围组织，或来自作为免疫系统一部分的细胞。在这些情况下，细胞凋亡的功能在于除掉损伤的细胞，从而防止其消耗来自生物体的其它营养物，或者防止病毒感染的传播。
分拣蛋白是多功能1型受体，其能够进行细胞内吞作用以及细胞内分选(9-11)，最近表明，其还通过激发神经营养素前体诱导的p75NTR介导的神经元细胞凋亡而参与信号传导(6，7，12，13)。
本发明提供了设计配体的方法，所述配体分别特异性结合至分拣蛋白的结合位点1、结合位点2和结合位点3。
设计和提供如上文定义的能够结合至分拣蛋白结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3、从而阻止分拣蛋白、proNGF和p75NTR之间形成三元复合物、从而抑制细胞凋亡的配体分子，落在本发明的范围内。
因此在一个实施方式中，根据本发明设计的配体能够抑制细胞凋亡。
在另一个方面，本发明涉及阻止哺乳动物神经元细胞中的细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及增强哺乳动物神经元细胞的存活的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于如上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及扩大哺乳动物细胞的构成的方法，其包括向所述构成给予如上文定义的配体分子。
在另一个方面，本发明涉及使哺乳动物细胞的构成分化的方法，其包括向所述构成给予如上文定义的配体分子。
抗体
抗体与特定的靶分子紧密结合，从而将其间接灭活或将其标记以进行破坏。抗体以显著的特异性和强度识别其靶标(抗原)，所述强度通过很多化学力的和来指示，所述化学力包括氢键、疏水和范德华力，以及离子相互作用。一般地，靶标在化学上越复杂，其免疫原性越高。抗原决定簇可以包括短的线性氨基酸段或更复杂的、三维蛋白模块。
概念上，针对靶受体的抗体可以以两种方式抑制配体结合：竞争性的或变构的。竞争性抑制涉及抗体直接结合至受体上的配体结合位点或结合到其附近，从而使配体与其受体分离或在空间上抑制配体与配体结合位点的靠近。变构抑制涉及抗体与受体多肽上的不同于配体结合表位的位点的结合。但是，与该位点的结合将诱导受体的总体结构发生构象变化，这使得配体与其同源识别位点的结合变得更加困难，甚至不可能结合。
因此，在本发明的一个重要方面产生了抗体，所述抗体能够与SEQ ID NO.1的结合位点1特异性结合。
在另一个实施方式中，产生的抗体能够与能够结合至SEQ ID NO.1的结合位点1的内源性或外源性的配体的表位特异性结合，从而在空间上阻碍所述配体与所述SEQ ID NO.1的结合位点1的结合。
在本发明的另一个方面产生了抗体，所述抗体能够与SEQ ID NO.1的结合位点2特异性结合。
在另一个实施方式中，产生的抗体能够与能够结合至SEQ ID NO.1的结合位点2的内源性或外源性的配体的表位特异性结合，从而在空间上阻碍所述配体与所述SEQ ID NO.1的结合位点2的结合。
在本发明的另一个高度优选的实施方式中产生了抗体，所述抗体能够与SEQ ID NO.1的结合位点3特异性结合。
在另一个实施方式中，产生的抗体能够与能够结合至SEQ ID NO.1的结合位点3的内源性或外源性的配体的表位特异性结合，从而在空间上阻碍所述配体与所述SEQ ID NO.1的结合位点3的结合。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点1的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306、T398至G400、I303-G309、Q349-A356、Y395和T402。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点1的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306和T398至G400。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点1的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314和F350至M363。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点2的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的L572，L114，V112，R109至S111，S115至G118，T570，G571，W586，W597，T168-I174，L572，A573和S584至F588。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点2的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586和W597。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点2的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的L572、L114和V112。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点3的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID N 0.1的D403、S420、D422、N423、S424、I425、E426、T451、Y466、E470、I498、S499和V500。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点3的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的D403、N423、S424、I425、T451、Y466、I498和V500。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体结合至结合位点3的或其附近的至少一个氨基酸残基，包括但不限于SEQ ID NO.1的T451、Y466、I498和V500。
在本发明的另一个实施方式中，上文定义的抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、重组抗体。
在另一个方面，本发明涉及免疫缀合物，其包含上文描述的抗体和选自下列的缀合物：细胞毒试剂，例如化疗剂、毒素或放射性同位素；特定结合对的成员，例如亲和素或链霉亲和素或抗原；能够产生可检测产物的酶。
附图说明
图1：分拣蛋白结构总览
A)在
Figure BPA00001284386400601
的分辨率，从通道的开口侧从螺旋桨轴向下看到的sSortilin∶NT的卡通示意图。沿着外边缘将各个螺旋桨叶片编号。叶片6上的高亲和力NT结合位点(结合位点1)中的NT(Pro10-Tyr-Ile-Leu13)和叶片1上的结合位点2中的NT(Leu2-Tyr-Glu-Asn-Lys6)显示为棍。Asn206、Asn450和Asn626上的糖基化的寡糖部分也显示为棍。
B)围绕水平轴旋转90°后sSortilin(a)的示意图。螺旋桨以灰色显示为表面示意图。从叶片1和10延伸的疏水环显示为深灰色。10CC结构域显示为卡通示意图。
C)(a)中显示的sSortilin∶NT复合物的表面示意图。螺旋桨的表面是浅灰色；10CC结构域、NT的N和C末端部分是深灰色；疏水环是黑色。显示了沿着赤道面上的虚线的通道的维度。灰线指明了d中显示的剖面的位置。
D)螺旋桨的断面，NT显示为棍。与(c)中使用相同的颜色方案。该示意图是相对于(b)中显示的示意图沿着纵轴旋转180°。
虚线显示了赤道面上最大的维度。
E)sSortilin的表面示意图，以序列保守性着色(图5)。不变的位置着深灰色。
Figure BPA00001284386400602
发现的以15倍NT过量获得的Sortilin∶NT结构中的所有三个肽片段以及糖基化都显示为棍。左侧：sSortilin的俯视图，即与C中的方向相同；右侧：sSortilin的仰视图，即俯视图沿着纵轴旋转180°。
图2：配体结合的详细情况
A)
Figure BPA00001284386400603
结构中见到的NT的N末端部分与sSortilin的结合。原子类型以灰色阴影表示：碳(sSortilin)-浅灰色；氮-较深的灰色；氧-较深的灰色；碳(NT)：最深的灰色。神经降压素的残基被1σ水平的最终的2Fo-Fc电子密度图(显示为丝网)覆盖。虚线代表氢键的位置。
B)
Figure BPA00001284386400612
结构中见到的NT的C末端部分与分拣蛋白的结合。残基Pro 10-Tyr-Ile-Leu13和形成结合袋的sSortilin的残基显示为棍。如(a)中所述进行颜色编码。在1σ成形的电子密度图是
Figure BPA00001284386400613
结构的最终的3Fo-2Fc图。
C)螺旋桨结合位点2上的前肽的电子密度。将与图板(a)中的sSortilin相同的原子集合重叠到sSortilin∶前肽的叶片1的螺旋1上。
如图板(a)中进行颜色编码。显示了最终的
Figure BPA00001284386400614
3Fc-2Fo电子密度的1σ表面，指明了结合的前肽的位置。
D)螺旋桨高亲和力NT结合位点上的前肽的电子密度。将与图板(b)中的sSortilin相同的原子集合重叠到sSortilin∶前肽的叶片6的螺旋1上。显示了最终的3Fc-2Fo电子密度的1σ表面，指明了结合的前肽的位置。
E)跨越通道的前肽结合。sSortilin∶前肽结构的断面如图1d。显示了最终的
Figure BPA00001284386400616
3Fc-2Fo电子密度的1σ表面。
图3：NT和衍生的肽对于sSortilin结合的效应
在不存在或存在神经降压素衍生的肽的情况下，结合至固定化的sSortilin的配体的表面等离子共振分析。编号代表包含于单个肽内的NT的氨基酸(1-13)。标明了在存在C末端三肽11-YIL-13(NT 11-13)的情况下的结合。A-B)GST标记的分拣蛋白前肽(GST-Sort-pro)的结合；C)NGF的GST-标记的前肽的结合；D)RAP的结合。
图4：sSortilin和sSortilin突变体受体的分泌及配体结合
A)CHO细胞中35S-生物标记的sSortilin的脉冲追踪。在指明的时间，从细胞裂解液或培养基中免疫沉淀的野生型受体或具有指明的氨基酸替换的突变受体。
B)BDNF和分拣蛋白前肽与野生型sSortilin的结合以及与纯化的S283E突变体的结合。在相似的浓度(0.06pM/mm2)固定受体，并通过SPR分析结合情况。以图中插图的形式显示了纯化的突变体受体的银染。C)在不存在或存在过量的神经降压素的情况下，NGF前结构域与野生型sSortilin的结合(上面的图板)以及与S316E突变体的结合(下面的图板)。
图5：分拣蛋白序列的序列比对。编号对应于pre-pro-Sortilin的编号(根据SEQ ID NO.1)。通过BLAST搜索在NCBI的非冗余蛋白数据库中鉴定序列：
Bos_taurus:ref|XP_588956.3|；
Canis_familiaris:ref|XP_537041.2|；
Rattus_norvegicus:ref|XP_001076150.1|；
Mus_musculus:ref|NP_064356.2|；
Ornithorhynchus_anatinus:ref|XP_001505243.1；
Tetraodon_nigroviridis:emb|CAG07500.1|；
Danio_rerio:ref|NP_998395.1|
然后使用ClustalW与sSortilin构建体进行比对。只显示对应于sSortilin构建体的区域，省略C末端His标签。使用Jalview(34)产生比对视图，根据每个位置上的保守情况进行灰色阴影着色。在序列下面，粗线指示由DSSP(34)分配的二级结构的位置。在该线下面，条线标记的叶片1至10指示了螺旋桨的各个叶片的位置或者指示了10CC的两个结构域的范围。通过细线在序列上方指示了二硫键，其连接两个半胱氨酸或以二硫化物伴侣的残基编号进行标记。蓝条显示了两个疏水环的位置。星号标出了糖基化的天冬酰胺残基。
大写的N标出了参与神经降压素的C末端部分结合的残基，而小写的n标出了参与神经降压素的N末端部分结合的残基。
图6：表达和结晶情况的概览。
图7：
Figure BPA00001284386400621
分辨率的X-射线衍射图样。
图8：优化统计和Ramachandran图。
图9：β-螺旋桨结构的统计，其显示了10叶片的分拣蛋白β-螺旋桨是独特的、新颖的和未预料到的。
图10：PYIL配体与分拣蛋白突变体结构S316E和R325A的结合情况概览，与野生型(WT)加以对比。
图11：包含分拣蛋白前肽的片段的分拣蛋白晶体的优化。
图12：图代表来自神经降压素C末端的氢键排列，显示为Pro-Tyr-Ile-Leu，以及在腔分拣蛋白与神经降压素的复合物的
Figure BPA00001284386400622
结构中见到的分拣蛋白。只有神经降压素亮氨酸的氢键是不变的，而异亮氨酸-353和赖氨酸-260与神经降压素酪氨酸的氢键是可变的。
为了显示分拣蛋白和神经降压素之间的疏水相互作用，在它们的相互作用伴侣之后列出了具有处于神经降压素碳原子
Figure BPA00001284386400631
之内的碳原子的分拣蛋白残基。
图13：结合位点1与神经降压素(NT)C末端结合的特异性相互作用的图示。
图14：结合位点1与人工肽NT69L(SEQ ID NO.12)结合的特异性相互作用的图示。
图15：分拣蛋白的2个结合位点上的密度的概览。神经生长因子的前结构域的新的结合位点是位点3。
图16：在2.6□处显示的位点3上的Fo-Fc密度。参与结合的分拣蛋白残基显示为棍并且以氨基酸类型和残基编号标出。以电子密度覆盖显示了神经生长因子的前结构域的肽骨架。
图17：sSortilin与NGF前结构域的片段的复合物的原子坐标。该pdb文件的第一个构造的分拣蛋白氨基酸残基的编号是C9，其对应于SEQ ID NO.1的C86，其根据本申请的申请日之时的Expasy数据库条目Q99523进行编号。
图18：以1∶1.5的摩尔比提供的sSortilin与神经降压素的复合物(使结合位点1被占据)在高分辨率
Figure BPA00001284386400632
时的原子坐标。该pdb文件的第一个构造的分拣蛋白氨基酸残基的编号是G10，其对应于SEQ ID NO.1的G87，其根据本申请的申请日之时的Expasy数据库条目Q99523进行编号。
图19：以1∶15的摩尔比提供的sSortilin与神经降压素的复合物(使结合位点1(高亲和力位点)和结合位点2(低亲和力位点)都被占据)的原子坐标。该pdb文件的第一个构造分拣蛋白氨基酸残基的编号是G54，其对应于SEQ ID NO.1的G54，其根据本申请的申请日之时的Expasy数据库条目Q99523进行编号。
图20：sSortilin与分拣蛋白自身的前肽的结晶复合物的原子坐标。该模型中省略了前肽。该pdb文件的第一个构造的分拣蛋白氨基酸残基的编号是D6，其对应于SEQ ID NO.1的D83，其根据本申请的申请日之时的Expasy数据库条目Q99523进行编号。
图21：为了覆盖整个前肽而合成的NGF前肽的6个二十肽的概览。
图22：NGF前肽和二十肽与固定化的sSortilin结合亲和力的表面等离子共振分析。
图23：显示为表面示意图的sSortilin-肽4复合物的概览。Vsp10p-D的表面是浅灰色，10CC结构域是灰色，来自NGFpro的肽4是黑色，糖基化以“球和棍”图显示，以原子类型着色。
图24：NGF前结构域的结合(位点3)。A)来自NGFpro的肽4显示为“球和棍”模型，以原子类型着色。以不含肽计算并在2.6σ成形的Fo-Fc电子密度图重叠到肽上。使用表面示意图显示sSortilin。B)结合的肽4模拟为六-丙氨酸片段并与sSortilin的相互作用残基一起显示为“球和棍”模型。
图25：NGF前结构域的结合(位点1/NTS-位点)。A)来自NGFpro的肽4显示为“球和棍”模型，以原子类型着色。按照图24计算显示的电子密度图并重叠到肽上。使用表面示意图显示sSortilin。B)结合的肽4模拟为四-丙氨酸片段并与sSortilin的相互作用残基显示。
图26：以Tyr-Ile-Leu(YIL)C末端标记的GST与肽的竞争。通过表面等离子共振测定与固定的sSortilin的结合。100％对应于在不存在竞争性肽的情况下，以100nM GST-YIL获得的测定的响应单位。EC50值是GST-YIL的结合减少至50％时肽的浓度。给出了肽和包含非天然氨基酸的肽的序列，也显示了结构。
序列概述
SEQ ID NO 1：分拣蛋白
SEQ ID NO 2：SorLA
SEQ ID NO 3：SorCS1
SEQ ID NO 4：SorCS2
SEQ ID NO 5：SorCS3
SEQ ID NO 6：pre-pro-NGF
SEQ ID NO 7：pre-pro-BDNF
SEQ ID NO 8：神经营养素-3
SEQ ID NO 9：神经营养素-4/5
SEQ ID NO 10：神经降压素(1-13)
SEQ ID NO 11：PYIL(神经降压素的C末端)
实施例
实施例1：分拣蛋白的表达和纯化
按照以前的描述(5)，在CHO-K1细胞中稳定表达可溶性分拣蛋白(sSortilin)，其包含完整的腔结构域(氨基酸1至758)但不含跨膜部分或分拣蛋白的细胞质的尾巴，其在C末端融合至His6。在无血清的HyQ-CCM5 CHO培养基(HyClone，Logan，UT)中，在500cm3 NunclonTM TripleFlasks中培养CHO-转染子。按照以前描述的程序稍加修改(22)，掺入硒代蛋氨酸(SeMet)。按照以前的描述(1)，通过RAP亲和色谱法纯化原始的和SeMet替换的蛋白。在CHO-细胞中稳定表达S316E和R325A分拣蛋白突变体，然后按照以前在furin前肽切割位点突变的分拣蛋白所描述的相同方式(5)通过His6-标签亲和色谱法从培养基中进行纯化。神经降压素购自Sigma，分拣蛋白前肽的残基37-61的片段以及各种神经降压素片段购自BIOMOL International L.P.(UK)。所有的肽纯度在95％以上。以前曾经描述了融合至GST的分拣蛋白前肽(5)和NGF前结构域(6)的表达和纯化。成熟的BDNF(SEQ ID NO.7，氨基酸残基128至246)购自R&D Systems，Inc.(USA)。
实施例2：表面等离子共振
表面等离子共振(SPR)测定在BIAcore 2000仪器(Biacore Sweden)上进行，所述仪器装备有维持在20℃的CM5感应器芯片。将通过感应器表面的持续流动的HBS缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，3.4mM EDTA，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)维持在5μl/分钟。通过注射含有0.2M N-乙基-N-(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液来激活感应器芯片流动池1-3的羧化葡聚糖基质。然后将分拣蛋白溶液(320μl，5μg/ml，处于10mM醋酸钠中，pH 4.0)以15μl/分钟的流速注射通过流动池1和2。通过注射(5μl/分钟)70μl的pH 8.5的1M乙醇胺封闭所有三个流动池中的其余结合位点。来自固定化的分拣蛋白的表面等离子共振信号产生了4419和6166 BIAcore响应单位(RU)，等于49和69fmol/mm2。通过将浓度为0.1-8μM的50μl的等分式样以5μl/分钟的流速注射通过所有流动池来筛选样品。除非另有指明，否则样品溶解于10mM HEPES pH 7.4，150mMNaCl，1.5mM CaCl2，1mM EGTA，0.005％表面活性剂P20。样品缓冲液也用作运行缓冲液。BIAcore响应表示为相对响应单位(RU)，即固定化的蛋白流动池和相应的对照流动池(激活且封闭的，但不含蛋白)之间的响应差异。分析的每次循环之后通过注射20μl的10mM甘氨酸/HCl pH 4.0，500mMNaCl，20mM EDTA和0.005％表面活性剂P20进行感应器芯片的复原。对于不含钙的条件，使用含有20mM EDTA的HBS作为样品以及运行缓冲液。使用软件BIAevaluation 3.0确定动力学参数。为了比较突变体和野生型sSortilin所测的响应，将它们固定化在相同的BIAcore芯片上的不同流动池中，并经历相似浓度的(GST)Sort-pro、BDNF、NGF-pro和NT。
抑制性效应的测定
通过向各个样品中加入浓度渐增的YIL来测定三肽Tyr-Ile-Leu(YIL)对(GST)Sort-pro、BDNF、NGF-pro和NT的结合的抑制。然后将抑制性效应的测定值表达为观察到90％的减少的结合时YIL的浓度。
实施例3：荧光测定
所有的内部荧光测定均在20℃在SFM-25，Kontron Instruments上进行，以1nm的渐增从280nm至500nm测定。在0.55μM sSortilin、5μM NT以及0.55μM sSortilin与5μM NT(均处于50mM Tris-HCl pH 7.6，150mM NaCl缓冲液中)上收集数据。通过向0.55μM sSortilin溶液中加入来自0.1M贮液的NT(忽略稀释)来制备sSortilin与NT。
实施例4：代谢标记
按照以前的详细描述(5)，在存在10mg/ml BFA的情况下，使用200mCi的L-[35S]半胱氨酸和L-[35S]蛋氨酸/毫升培养基进行代谢标记。在不存在BFA的情况下进行追踪，在确定的时间点，从培养基中以及从相应的裂解细胞中免疫沉淀受体。通过还原型PAGE分析沉淀的蛋白，在-70℃将二苯基噁唑-荧光摄影的凝胶曝光。
实施例5：结晶、冷冻保护和HA衍生
将纯化的蛋白透析进入含有50mM Tris-HCl pH 7.9和150mM NaCl的缓冲液，并使用Centricon(Millipore Corp.)或Vivaspin(Sartorius Ltd.)浓缩器浓缩至4.5-5.5mg/mL(按照Bradford测定法测定)。在进行结晶实验之前数分钟内进行与神经降压素(sSortilin∶NT摩尔比为1∶1.5或1∶15)或与前肽(sSortilin∶前肽的比为1∶4)的混合。在20℃使用2μL蛋白溶液和2μL储存液(reservoir solution)设立结晶液滴，所述储存液含有18-21％w/v PEG 6000，Tris-Hepes pH 7.2-7.8(40-93mM Tris和100mM Hepes)或100mM Tris-HClpH 7.9，3-6％甘油和600mM NaCl或250-400mM C3H2Na2O4(丙二酸钠，通过丙二酸调节至pH 6-7.5)。在相同的条件下获得衍射至
Figure BPA00001284386400671
的硒代蛋氨酸(Se-Met)标记的sSortilin∶NT晶体。将用于数据收集的晶体脱水并通过增加储液的甘油浓度至12-15％来冷冻保护。过夜平衡之后，将晶体速冻于液氮中。晶体通常衍射至大约
Figure BPA00001284386400672
但是对于以稍微过量的NT和以NaCl作为储盐生长的晶体，我们几乎没有获得衍射显著较好(约
Figure BPA00001284386400673
)并表现出晶胞参数变化(表1)的晶体。为了制备Hg和Pt衍生物，直接向已经形成晶体的液滴中加入水杨酸汞和顺式Pt(NH3)2Cl2的粉末。Hg衍生物的浸泡时间是1个月，Pt衍生物的浸泡时间是1天。通过向脱水晶体的液滴中加入溶于水中的1μL的1mM Ta6Br12并浸泡2天的时间来制备Ta衍生物，然后它变成可见的绿色。衍生的晶体都不进行回浸。
实施例6：数据收集和处理
在同步加速器MAX-lab(Lund，Sweden)，SLS(Zurich，Switzerland)和DESY/EMBL(Hamburg，Germany)上进行数据收集，并使用XDS(23)进行处理(见表1)。在各个元素的吸收边缘附近收集Hg、Pt和Ta衍生物的数据，直接在硒峰值波长
Figure BPA00001284386400674
处，通过荧光扫描测定，收集SeMet标记的晶体的数据集合。以大量过量的NT确定sSortilin与神经降压素的复合物(sSort∶NT)晶体的数据集合，使用Diffraction Anisotropy Server(24)校正各向异性效应。
表1：数据收集和处理统计
Figure BPA00001284386400681
实施例7：定相和模型建立
本发明人使用ShelxD(25)发现了存在于sSortilin中的14个蛋氨酸中的13个硒位点。使用CNS(26)计算的SeMet SAD相用于鉴定Pt、Hg和Ta衍生物中的重原子位点。我们使用所有4个衍生物以及sSortilin与神经降压素类似物的复合物的同形
Figure BPA00001284386400682
原始数据集合作为SHARP(27)中MIRAS定相的输入。使用RESOLVE(28)制备部分Cα痕迹，通过在O(29)中人工重建进行延伸和校正。然后使用MOLREP(30)将该部分模型用于分子置换进入
Figure BPA00001284386400683
原始数据集合(在以稍微过量的NT生长的sSortilin∶NT晶体上收集)。通过CNS中的优化与O中的人工重建的循环创建完整模型。使用未完成的
Figure BPA00001284386400684
结构的模型(NT未包括在内)作为MOLREP的输入，通过分子置换进行在以大量过量的NT生长的sSort∶NT晶体上收集的数据以及在sSort∶前肽片段上收集的数据的定相。然后通过后续的在O中建立模型和使用CNS进行优化的循环来完成该模型。为了进行最终的优化，本发明人应用了REFMAC(31)，TLS B-因子校正用于
Figure BPA00001284386400685
sSort∶NT结构，PHENIX(32)优化与TLS B-因子校正用于
Figure BPA00001284386400691
sSort∶NT结构以及CNS用于sSort∶前肽结构(表2)。
表2：数据收集、处理、模型建立和优化统计
Figure BPA00001284386400693
实施例8：神经营养素前体结合位点(结合位点3)的鉴定
sSortilin的纯化
按照以前的描述(5)，在CHO-K1细胞中稳定表达可溶性分拣蛋白(sSortilin)，其包含SEQ ID NO.1(氨基酸78至755)，其在C末端融合至His6。在无血清的HyQ-CCM5 CHO培养基(HyClone，Logan，UT)中，在500cm3 NunclonTM TripleFlasks中培养CHO-转染子。按照以前的描述(1)，使用固定化在CNBr-激活的Sepharose珠子(GE health care)上的受体结合蛋白通过亲和色谱法纯化sSortilin。
NGFpro的纯化
使用pET-30Ek/LIC载体转化BL21(DE3)star RIPL细胞，所述载体包含N末端组氨酸标签(His6)、烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶蛋白酶位点和神经生长因子前肽(NGFpro)的开放读码框。使细胞生长至OD600nm为0.8，然后在20℃以1mM IPTG过夜(O/N)诱导。将细胞重悬于以下裂解缓冲液：50mM TrisHCl pH＝8.0，1M KCl，10mM咪唑，5mM BME，5mM PMSF，2mg/ml DNase I和1个蛋白酶抑制剂片(Complete，Roche)。将细胞在高压匀浆器(HPH)中破碎，通过在184,000xg离心使裂解液澄清。使用缓冲液A(50mM TrisHCl pH＝8.0，200mM KCl和5mM BME)平衡Ni2+-柱(HisTrap 1mlFF，GE)。装载澄清的裂解液，以40倍柱体积(CV)的咪唑(10mM至500mM)梯度和缓冲液B(50mM TrisHCl pH＝8.0，200mM KCl，500mM咪唑和5mMBME)洗脱NGFpro。将含有来自第一个Ni2+柱的NGFpro的级份合并，将缓冲液换成TEV相容性缓冲液C(50mM TrisHCl pH＝8.0，200mM KCl，5mMBME，0.5mM EDTA)。在室温O/N进行TEV消化。在Ni2+柱(HisTrap 1ml FF，GE)上以40倍柱体积(CV)的咪唑(0mM至250mM)梯度除去His6标签。使用Vivaspin 6柱以10kDa截止膜浓缩来自第二个Ni2+柱的NGFpro。在Superdex75 10/300GL柱(GE)上以0.4ml/分钟的流速在缓冲液D(50mM TrisHClpH＝7.6和150mM NaCl)中进行制备型凝胶过滤。
NGF前肽的肽的制备
如图21所示，在Caslo Laboratory Aps(www.caslo.com)通过固相化学技术合成神经生长因子的前肽的二十肽(20个氨基酸)。肽在C末端进行酰胺化并以3个氨基酸的重叠覆盖整个NGFpro。将肽(纯度＞95％)溶解于缓冲液E(10mM HEPES pH＝7.0和50mM NaCl)中。
表面等离子共振分析
所有测定在维持在20℃的BIAcore 3000仪器(Biacore Sweden)上进行。使缓冲液F(10mM HEPES pH＝7.4，150mM(NH4)2SO4，1.5mM CaCl2，1.5mMEGTA和0.005％Tween-20)的持续流以5μl/分钟通过CM5芯片感应器。测定NGFpro和肽对于固定华的sSortilin的亲和力。NGFpro的解离常数(Kd)是～10nM，肽-4的解离常数是～5μM。也测定了肽与NGFpro竞争性地结合至sSortilin的能力。结果显示于图22。
sSortilin与配体的结晶
将纯化的sSortilin透析进入缓冲液G(50mM Tris-HCl pH 8.0和150mMNaCl)，并在Vivaspin(Sartorius Ltd.)浓缩器中浓缩至4.5-5.5mg/mL(按照Bradford测定法测定)。将sSortilin和NGFpro以1∶2的摩尔比混合并在冰上孵育1个小时。使用坐滴法在蒸气扩散实验中使复合物结晶。在20℃使用1μL复合物溶液和1μL储液(含有20-28％聚乙二醇(PEG)5000单甲基醚，100mM TrisHCl pH＝7.5和200mM Li2SO4)设立结晶液滴。以1∶5至1∶28范围的不同摩尔比将sSortilin和肽-4混合并在冰上孵育1个小时。使用坐滴法在蒸气扩散实验中使复合物结晶。
在20℃使用1μL复合物溶液和1μL储液(含有20-28％PEG 6000，100mM TrisHCl pH＝7.5和200-600mM Li2SO4)设立结晶液滴。
通过向贮库中加入蔗糖或甘油(直至20％v/v)使晶体脱水，然后将其速冻于液氮中。
数据收集和处理
在ESRF Grenoble(France)的工作站ID29收集sSortilin∶NGFpro复合物的X-射线衍射数据，使用同步加速器辐射在Max-lab Lund(Sweden)的工作站I911-3在冷冻条件下收集sSortilin∶肽-4复合物晶体的衍射数据。将数据做索引并使用XDS(23)处理。sSortilin与NGFpro或肽-4的复合物的晶体是同形的，属于四角形空间群P41212，在不对称单元中有一个sSortilin分子(表3)。使用Phaser(36)通过分子置换法确定结构。去掉其所有配体之后的sSortilin和神经降压素的结构用作定相的最初模型。然后将得到的模型进行模拟退火以减少模型偏差并在Phenix(32)中优化。差别傅立叶图Fobs-Fcalc用于定位NGFpro的边界部分以及sSortilin的环和糖基化的构象变化。
表3：数据收集和处理
Figure BPA00001284386400711
实施例9：对接和计算机内筛选
使用Maestro 8.0版(具有Optimize H-bonds的Exhaustive Sampling)计算两个网格，一个网格具有
Figure BPA00001284386400721
内的最小化结构，一个不具有分拣蛋白-配体复合物的每个可获得的优化结构的最小化。Ser352的-OH的氢和Ile353的氢指定为可能的限制。
结合框定义为残基325、260和352的质心，具有标准值维度。
在Maestro以三肽来构建配体，一个残基从Tyr-Ile-Leu中替换，得到60个天然配体。在MacroModel中(具有OPLS_2005力场，最大叠代设定为10000)使配体的能量最小化。对接进入使用XP评分功能产生的所有网格中。应用限制，以致于来自配体的氢键需要形成于先前指定的两个氢中的一个。选择肽用于合成和基于对接姿势的G评分和人工检查的生化表征。另外，还合成了评分/对接持续较差的配体，它们非常类似于选做合成的那些，将它们用作阴性对照。
从用于对接的结构产生对接网格
在Workflows菜单中选择Protein Preparation Wizard。
输入你的结构，然后使Fix Structure保持缺省设定，或者，如果在结合位点中没有结构水，将Delete Waters改为0.1A，然后按Setup。检查工作区中任何未被出去的结构水。人工除掉任何非结构水。
然后打开Exhaustive Sampling按钮并点击Optimize H-bonds。
如果结合袋中没有配体，则忽略Minimize...按钮。如果结合袋中有配体，你应该制备两个网格，一个是你以缺省设置运行Minimize...，一个是你不最小化或者你只使氢最小化。
在Applications菜单中选择Glide，然后是Receptor Grid Generation。
如果你的结合袋中有配体，则必须将其从网格产生中排除，这通过当Receptor标签是激活状态时在工作区中点击它来完成。如果它不已是黄色，则点击“Pick to identify ligand”。为配体集合选择结合框，你现在可以产生网格，如果你想对接的配体比最初的那个大得多，则你应该去标签Site，点击“Dock ligand with length＜＝”并调节游标。如果原始结构中没有配体，你应该点击“Centroid of selected residues”，并在工作区点击结合位点周围的残基。
如果你在Arg248(/325/292)位点运行分拣蛋白和肽，到Constraints标签并选择Ser275(/352/319)的羟基的氢和Ile276(/353/320)的极性氢。
现在点击Start。
配体的产生和能量最小化
点击Build Panel按钮以打开构建面板。
反选工作表中的所有条目。在空白工作区内，使用构建面板来建立你的配体。要保证你具有正确的电荷(LigPrep将分配正确的电荷并为互变异构体产生另外的配体和多个电荷状态以及使能量最小化)并双击Add Hydrogens。按Generate Entry From Workspace按钮并给你的配体命名。
如果你的下一个配体类似于第一个，到工作表中并复制，然后重命名它。随着你构建第一个配体，编辑新的条目。如果它极不相似，则简单地反选工作表中的各项并按照你第一个那样进行。如果你的配体具有SMILES，则以OpenBabel将其较快地转化为mol2格式并将其进入到工作表中。.pdbs必须具有为Maestro指定的氢以识别键级，.sdfs不含手性信息。
能量最小化有两个选择：LigPrep或MacroModel。
a)到Applications菜单中并选择MacroModel，然后选择Multiple Minimization。
从工作表中选择你的所有配体并将下拉菜单设定为Project Table(所选的条目)。在Potential标签中选择力场：OPLS_2005(其应该是缺省的)。在Mini中选择方法：PRCG(缺省)和最大叠代：10000。如果你已经将你的配体保存到文件中并想从该文件中直接使用它，则在Mult标签中指定该文件并点Start。
b)到Applications菜单中并选择LigPrep。
从工作表中选择你的所有配体或选择含有你的配体的文件并据此设定下拉菜单。你可能想将目标pH设定为7.4并+/-2以内。保持手性并开始。记得在最小化之后检查你的配体以确保它们是正确的，尤其手性中心将存在于两个对应异构体中(如果它们不是在最初的配体中明确定义的话)。LigPrep比MacroModel优选，因为LigPrep自动产生组氨酸的所有状态。
对接
到Applications菜单并选择Glide，然后选择Ligand Docking。
选择Receptor网格文件。将Precision设定为XP。灵活地进行对接并允许ring-flips。在高级设定中，将缀合步骤的最大值设定为5000。去Ligands标签并选择在能量最小化步骤中产生的文件或简单地在工作表中选择它们并将Selected entries打开。在Output标签中，将Write out设定为每个配体最多5个姿势。如果你具有很多配体，调节每个对接运行的配体数。
如果你在Arg248(/325/292)位点中运行分拣蛋白与肽，去Constraints标签并在Group 1中添加两个氢键限制，将Must match：At least：设定为1。只有包括至两个中的一个的氢键的姿势被包括在内。加入这个是因为Maestro报道很多卷曲的肽，它们不是天然出现的并且在结构中未观察到—如果这个未被观察到，则需要正确的方法是无限制对接。
对于所有的结构重复步骤1和3。重复使用来自步骤2的最小化配体。
结果的评估
到Applications菜单中并选择Glide，然后选择Poseviewer。
人工比较最高评分的配体的对接，比较其它结构中的相同配体，合成那些似乎合理的以及对于阴性对照评分/对接差的非常相关的化合物。
实施例10：验证抑制剂的方法
在通过有机化学领域技术人员熟知的方法进行鉴定的配体的合成之后，重要的是验证配体候选物是否具有拮抗特性，即，所述配体是否能够阻止内源性配体与分拣蛋白的结合位点1、2或3中任一个的结合。
在如实施例2中描述的固定化的sSortilin上通过表面等离子共振测定法来测试提议的配体的抑制性效应。
将提议的配体进行放射性标记并用于切片放射自显影。将显色的图像与应用放射标记的单克隆分拣蛋白抗体的切片放射自显影图像进行比较。将那些与单克隆抗体共定位的配体和分拣蛋白敲除小鼠的切片在切片放射自显影图像中进行再次测试。
将使分拣蛋白满意地成像的配体注射进入小鼠中并测定脑匀浆物的放射性活性，或者，以适合于PET或SPECT的放射性同位素标记未标记的配体，并注射进入小鼠或猪中，在体内进行它们的脑的成像。
在脑匀浆物中进行内源稳定性实验。非血液-脑屏障通透性化合物适合于非-CNS图像，分拣蛋白中该结合位点和BBB通透性化合物的抑制适合于检查分拣蛋白的体内水平和分布的脑扫描。
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Figure IPA00001284385900271
Figure IPA00001284385900281
Figure IPA00001284385900291
Figure IPA00001284385900301
Figure IPA00001284385900311
Figure IPA00001284385900321
Figure IPA00001284385900331
Figure IPA00001284385900351
Figure IPA00001284385900371
Figure IPA00001284385900381

Claims (152)

1.晶体，其包括：
a)SEQ ID NO.1的多肽；和/或
b)所述多肽的序列变体，其中所述变体与所述的SEQ ID NO.1具有至少60％序列同一性；和/或
c)包含a)至b)任一项的至少200个连续氨基酸的片段，其中所述片段显示出分拣蛋白活性；和
d)任选的a)至c)任一项与至少一种配体的复合物。
2.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306、T398至G400、I303-G309、Q349-A356、Y395和T402的结合位点1。
3.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306和T398至G400的结合位点1。
4.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314和F350至M363的结合位点1。
5.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586、W597、T168-I174、L572、A573和S584至F588的结合位点2。
6.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586和W597的结合位点2。
7.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基L572、L114和V112的结合位点2。
8.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基D403、S420、D422、N423、S424、I425、E426、T451、Y466、E470、I498、S499和V500的结合位点3。
9.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基D403、N423、S424、I425、T451、Y466、I498、S499和V500的结合位点3。
10.根据权利要求1的晶体，其中所述至少一种配体结合至包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基T451、Y466、I498和V500的结合位点3。
11.根据前述权利要求任一项的晶体，其中所述配体结合至结合位点1的至少一个氨基酸残基和结合位点2的至少一个氨基酸残基。
12.根据前述权利要求任一项的晶体，其中所述配体结合至结合位点1的至少一个氨基酸残基和结合位点3的至少一个氨基酸残基。
13.根据前述权利要求任一项的晶体，其中所述配体结合至结合位点2的至少一个氨基酸残基和结合位点3的至少一个氨基酸残基。
14.根据权利要求8至13任一项的晶体，其中所述结合位点3是proNGF结合位点。
15.根据权利要求8至13任一项的晶体，其中所述结合位点3是proBDNF结合位点。
16.根据权利要求12的晶体，其中所述结合位点3是proNT3结合位点。
17.根据权利要求12的晶体，其中所述结合位点3是proNT4/5结合位点。
18.根据权利要求1的晶体，其中所述多肽包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基78至755。
19.根据前述权利要求任一项的晶体，其中所述晶体是三斜空间群。
20.根据权利要求19的晶体，其中所述三斜空间群是P1。
21.根据前述权利要求任一项的晶体，其中所述晶体是单斜空间群。
22.根据权利要求21的晶体，其中所述单斜空间群是C2。
23.根据权利要求1-18任一项的晶体，其中所述晶体是斜方空间群。
24.根据权利要求23的晶体，其中所述斜方空间群是P212121。
25.根据权利要求1的晶体，其中所述多肽变体包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基78至755(sSortilin)，或其片段或变体。
26.根据权利要求1的晶体，其中一个或多个蛋氨酸被硒代蛋氨酸替换。
27.根据前述权利要求任一项的晶体，其包括选自下列的多肽配体：SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-121(NGF前结构域)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)、SEQ ID NO.10的氨基酸残基11-13(YIL)和SEQ ID NO.12(NT69L)，或其片段或变体。
28.一种生长权利要求1的晶体的方法，其包括以下步骤：
a.在缓冲液中获得包含4.5至5.5mg/mL的SEQ ID NO.1的多肽或其片段或变体的组合物；
b.将所述组合物与配体混合；和
c.提供预先确定体积的所述组合物和结晶溶液；和
d.获得包含SEQ ID NO.1或其片段或变体的晶体。
29.权利要求28的方法，其中所述缓冲液含有50mM Tris-HCl pH7.9和150mM NaCl。
30.权利要求28的方法，其中所述配体选自SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-121(NGF前结构域)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)、SEQ ID NO.10的氨基酸残基11-13(YIL)和SEQ ID NO.12(NT69L)。
31.权利要求28至30的方法，其中以1∶1.5至1∶15(sSortilin∶神经降压素)的摩尔比将神经降压素配体加入到所述组合物中。
32.权利要求28至30的方法，其中以1∶4(sSortilin∶分拣蛋白的前肽)的摩尔比将分拣蛋白前肽配体加入到所述组合物中。
33.权利要求28的方法，其中所述结晶溶液含有18-21％w/v PEG 6000。
34.权利要求28的方法，其中所述结晶溶液含有0-15％甘油。
35.权利要求28的方法，其中所述结晶溶液含有Tris-HEPES pH 7.2-7.8(40-93mM Tris和100mM HEPES)或100mM Tris-HCl pH 7.9。
36.权利要求28的方法，其中所述结晶溶液含有3-6％甘油。
37.权利要求28的方法，其中所述结晶溶液含有300-900mM NaCl或150-400mM C3H2Na2O4或300-500mM LiSO4或500-700mM KCl，其中通过丙二酸将所述C3H2Na2O4调节至pH 6-7.5。
38.权利要求28的方法，其中SEQ ID NO.1的蛋氨酸残基被硒代蛋氨酸替换。
39.根据权利要求28-38任一项的方法，其还包括以下步骤：
a.分离原始沉淀物；和
b.通过蒸气扩散从悬滴使其生长。
40.根据权利要求1-27任一项的晶体用于确定分拣蛋白或其片段或变体的三维结构的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述晶体还包含与分拣蛋白结合的配体，用于确定分拣蛋白或其片段或变体与所述配体的复合物的三维结构。
42.一种计算机可读数据存储介质，其包括如图17-20任一项所示的结构坐标的至少一部分编码的数据存储材料。
43.原子坐标在用于鉴定能够与下列一项或多项结合的配体的方法中的用途：
a.结合位点1，或
b.结合位点2，或
c.结合位点3，
或a至c的片段或变体；
其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure FPA00001284386300041
的三维结构。
44.一种鉴定配体的方法，所述配体能够结合SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体，所述方法包括以下步骤：
a.使用原子坐标在计算机屏幕上产生所述结合位点的空间结构，所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure FPA00001284386300051
的三维结构；
b.在计算机屏幕上产生具有其空间结构的潜在配体；和
c.选择能够结合至结合相互作用位点的集合的至少1个氨基酸残基而无空间位阻的配体。
45.一种计算机辅助的鉴定分拣蛋白的配体的方法，所述配体能够结合SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3，或其片段或变体，所述方法使用包含处理器、数据存储系统、数据输入设备和数据输出设备的程序计算机，所述方法包括以下步骤：
a.通过所述输入设备向所述程序计算机输入包括下列内容的数据：
所述分拣蛋白的原子的子集的原子坐标，从而产生标准数据集合；
其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure FPA00001284386300052
的三维结构；
b.使用所述处理器，将所述标准数据集合与储存在所述数据存储系统中的低分子量有机化学结构和肽片段的计算机数据库进行对比；和
c.使用计算机方法，从所述数据库中选择具有在结构上与所述标准数据集合互补的部分且与受体分拣蛋白没有空间位阻的化学结构。
46.一种鉴定配体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使用与计算机模拟相结合的原子坐标选择潜在配体，其中所述原子坐标是如图17-20任一项所示的三维结构，或其中所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过
Figure FPA00001284386300053
的三维结构，所述选择这样进行：将潜在配体对接进入SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体中的结合相互作用位点的集合，其中所述结合相互作用通过计算机模拟产生；并选择能够与所述分拣蛋白的结合相互作用位点的集合中的至少一个氨基酸结合的潜在配体；
b.提供所述潜在配体和所述受体分拣蛋白；
c.将所述潜在配体和所述受体分拣蛋白接触；和
d.检测所述潜在配体与所述受体分拣蛋白的结合。
47.根据权利要求46的方法，其中潜在配体分子的对接通过应用图17-20任一项所示的三维结构的原子坐标定义的三维结构而进行，从而所述潜在配体能够结合至SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体中的至少三个氨基酸。
48.一种鉴定分拣蛋白的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的潜在配体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将源自原子坐标的信息导入计算机，所述原子坐标基于三维结构测定定义SEQ ID NO.1(分拣蛋白)的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体的构象，从而计算机程序利用或在计算机屏幕上显示所述构象的结构；
其中所述原子坐标选自如图17-20任一项所示的三维结构，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的任一个三维结构的偏差不超过
Figure FPA00001284386300061
的三维结构；
b.通过所述计算机程序在计算机屏幕上产生分拣蛋白的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3的三维图示；
c.将潜在配体的模型重叠到所述结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3的图示上；
d.评估所述潜在配体与结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3的结合以及不存在空间位阻的可能性；
e.将所述潜在配体化合物引入所述受体分拣蛋白的结合测定中；和
f.确定所述潜在配体是否抑制选自下列的竞争性配体的结合：SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-241(proNGF)、SEQ ID NO 6的氨基酸残基19-121(NGF前结构域)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-246(proBDNF)、SEQ ID NO 7的氨基酸残基19-127(BDNF前结构域)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-257(proNT3)、SEQ ID NO 8的氨基酸残基17-140(NT3前结构域)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-210(proNT4/5)、SEQ ID NO 9的氨基酸残基25-80(NT4/5前结构域)、SEQ ID NO.10(神经降压素)、SEQ ID NO.11(PYIL)、SEQ ID NO.10的氨基酸残基11-13(YIL)和SEQ ID N O.12(NT69L)；或
g.确定所述潜在配体是否通过结合至所述SEQ ID NO.1的结合位点1和/或结合位点2和/或结合位点3或其片段或变体而表现出激动效应。
49.根据上述权利要求43-48任一项的方法，其中使用源自结合位点1的下列氨基酸残基中的至少一个的原子坐标的信息：SEQ ID NO.1的R325、S316、Y351、I353、K260、I327、F314、F350至M363、S305、F306、T398至G400、I303-G309、Q349-A356、Y395和T402。
50.根据上述权利要求43-48任一项的方法，其中使用源自结合位点2的下列氨基酸残基中的至少一个的原子坐标的信息：SEQ ID NO.1的L572、L114、V112、R109至S111、S115至G118、T570、G571、W586、W597、T168-I174、L572、A573和S584至F588。
51.根据上述权利要求43-48任一项的方法，其中使用源自结合位点3的下列氨基酸残基中的至少一个的原子坐标的信息：SEQ ID NO.1的D403、S420、D422、N423、S424、I425、E426、T451、Y466、E470、I498、S499和V500。
52.根据上述权利要求48-51任一项的方法，其中所述数据标准集合或结合相互作用集合包含选自鉴定的组的至少3个氨基酸残基。
53.根据上述权利要求48-51任一项的方法，其中所述原子坐标确定至至少
Figure FPA00001284386300071
的分辨率。
54.根据上述权利要求48-51任一项的方法，其中所述原子坐标确定至至少的分辨率。
55.根据上述权利要求48-51任一项的方法，其中所述原子坐标确定至至少
Figure FPA00001284386300073
的分辨率。
56.根据上述权利要求48-51任一项的方法，其中所述原子坐标确定至至少
Figure FPA00001284386300074
的分辨率。
57.根据上述权利要求48-51任一项的方法，其中所述原子坐标确定至至少
Figure FPA00001284386300075
的分辨率。
58.根据上述权利要求42-57任一项的方法，其中所述潜在配体分子与SEQ ID NO.1的高亲和力神经降压素结合位点中的至少一个氨基酸相互作用。
59.根据上述权利要求42-57任一项的方法，其中所述潜在配体分子与SEQ ID NO.1的低亲和力神经降压素结合位点中的至少一个氨基酸相互作用。
60.根据上述权利要求42-57任一项的方法，其中所述潜在配体分子与SEQ ID NO.1的分拣蛋白前肽结合位点中的至少一个氨基酸相互作用。
61.根据上述权利要求42-57任一项的方法，其中所述潜在配体分子与SEQ ID NO.1的神经营养素前体结合位点中的至少一个氨基酸相互作用。
62.根据上述权利要求42-61任一项的方法，其中所述潜在配体选自非水解性肽和肽类似物、有机化合物和无机化合物。
63.根据上述权利要求42-62任一项的方法，其中筛选有机小分子的文库。
64.根据上述权利要求42-62任一项的方法，其中筛选潜在肽配体的文库。
65.通过权利要求1至64任一项的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体能够结合所述结合位点1的至少一个相互作用点，所述相互作用点包含SEQ ID NO.1的如图14所示的X1、X2、X3、X4、R1、R2、J1、J2和J3，其中
X1包括氨基酸残基R325、S316和Y351，并且其中
X2包括Y351的骨架羰基，并且其中
X3包括I353的骨架，并且其中
X4包括K260的氨基，并且其中
R1包括氨基酸残基I327、F314、Y351、I353和M363，并且其中
R2包括F350和来自包含氨基酸残基T397至E401的环的至少一个氨基酸，并且其中
J1包括S305，并且其中
J2包括F306的骨架酰胺，并且其中
J3包括F306的骨架羰基。
66.权利要求65的配体，其中所述配体在相互作用点X1包括负电荷和/或氢受体特征，所述负电荷和/或氢受体特征选自羧酸盐和磺酸。
67.权利要求65的配体，其中所述配体在相互作用点X2包括选自羟基、氨基和酰胺基的氢键供体。
68.权利要求65的配体，其中所述配体在相互作用点X3包括选自羰基或羟基的氢键受体。
69.权利要求65的配体，其中所述配体在相互作用点R1包括大的疏水性基团，其选自环己基-丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸。
70.权利要求65的配体，其中所述配体在相互作用点R2包括选自异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸的疏水性氨基酸残基，或者选自组氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和谷氨酸的部分疏水性的基团。
71.通过权利要求43-64任一项的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(I)的一般结构：
Figure FPA00001284386300091
其中X是作为氢供体的原子，所述原子选自N、O、S、P，并且其中，
Y是作为氢键受体的电负性原子，所述原子选自O、N、S、F、Cl、Br、I，并且其中，
R1是C3-6烷基；C4-6环基；杂环或杂芳族结构，其具有一个环，每个环中有4-6个成员，且含有1-3个杂原子；或含有1-3个选自N、O、S(O)0-2的杂原子的杂烷基，并且其中，
R2是氢；C1-12烷基；或芳族、碳环、杂环或杂芳族结构，其具有1-3个环，每个环中含有3-8个成员，且含有0-4个杂原子；或含有1-8个选自N、O、S(O)0-2的杂原子的杂烷基，并且其中，
R3是氢；SH；咪唑；C1-12烷基；或芳族、碳环、杂环或杂芳族结构，其具有1-3个环，每个环中含有3-8个成员，且含有0-4个杂原子；或含有1-8个选自N、O、S的杂原子的杂烷基，并且其中，
R4选自官能团C1-100线性或支链的烷基、线性或支链的烯基、线性或支链的炔基、苯基、苄基、卤代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、卤代甲酰、羟基、羰基、醛、碳酸酯、羧酸酯、羧基、醚、酯、过氧氢基、过氧基、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺、铵、伯酮亚胺、仲酮亚胺、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、氰酸酯、异氰化物、异硫代氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、priidyl、膦基、磷酸酯、膦酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基(SH)、硫氰酸酯、二硫化物、接头L2或L3，以及与SEQ ID NO.10具有至少50％同一性的氨基酸序列或其片段。
72.通过权利要求43-64任一项的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(II)的一般结构：
Figure FPA00001284386300101
其中Z是氢键供体或受体，其选自羰基、羟基、氨基、亚氨基、酰胺、巯基、氯、氟，并且其中，
R5选自H、CH3和接头L2，并且其中，
R6选自H、-CH3、-CH2CH3和-OCH3，并且其中，
R7选自谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸的侧链、脂肪族C4-6基团，并且其中，
R8选自酪氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、碘-酪氨酸的侧链、和-CH2-NH2，并且其中，
R9选自赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺的侧链、C3-8脂肪族和杂脂肪族基团、含有5元或6元环的碳环和杂环基团，并且其中，
R10选自焦谷氨酸、聚-烃和长度大于等于10的多肽，并且其中，
R11和R12各自选自H、C1-12线性或支链的烷基、线性或支链的烯基、线性或支链的炔基、苯基、苄基、卤代烷烃、氯代烷烃、溴代烷烃、碘代烷烃、卤代甲酰、羟基、羰基、醛、碳酸酯、羧酸酯、羧基、醚、酯、过氧氢基、过氧基、氨甲酰、伯胺、仲胺、叔胺、铵、伯酮亚胺、仲酮亚胺、伯醛亚胺、仲醛亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮(二酰亚胺)、氰酸酯、异氰化物、异硫代氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝基氧基、硝基、亚硝基、priidyl、膦基、磷酸酯、膦酰基、磺酰基、亚磺酰基、巯基(SH)，并且其中，
共价键(1)和(2)各自选自单键和双键。
73.通过权利要求43-64的方法鉴定的Vps10p-结构域受体配体，所述配体具有式(III)的一般结构：
Figure FPA00001284386300111
其中R13选自H、C1-12烷基、烯基、炔基和接头L3，并且其中，
R14、R15、R17、R19、R20各自选自H、C1-12烷基、烯基和炔基，并且其中，
R16选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、组氨酸、半胱氨酸、赖氨酸的侧链和脂肪族C3-7，并且其中，
R18选自H、-CH3和-CH2OH，并且其中，
共价键(1)和(2)各自选自单键和双键。
74.权利要求71或72的配体，其中所述接头L2选自5至6个残基的肽骨架、C15-20烷基、C15-20烯基和C15-20炔基。
75.权利要求71的配体通过权利要求74的接头与权利要求72的配体连接，从而形成通式(IV)：
[式(I)]-[接头L2]-[式(II)]    (IV)
76.权利要求71或73的配体，其中所述接头L3选自12至20个残基的肽骨架、C30-60烷基、C30-60烯基、C30-60炔基。
77.权利要求71的配体通过权利要求76的接头与权利要求73的配体连接，从而形成通式(V)：
[式(I)]-[接头L3]-[式(III)]    (V)
78.权利要求65-77任一项的配体，其中所述配体选自图26中显示的RRPYI(chg)、碘YIL、QIL、YCL、dYIL、YHL、RRPYI(acc)、RRPYI(nMe)L、YIL。
79.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的RRPYI(chg)。
80.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的碘YIL。
81.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的QIL。
82.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的YCL。
83.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的dYIL。
84.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的YHL。
85.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的RRPYI(acc)。
86.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的RRPYI(nMe)L。
87.一种Vps10p-结构域受体配体，其中所述配体是如图26所示的YIL。
88.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点1或其片段或变体。
89.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点2或其片段或变体。
90.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点3或其片段或变体。
91.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点1或其片段或变体的至少一个氨基酸和分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点3或其片段或变体的至少一个氨基酸。
92.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点1或其片段或变体的至少一个氨基酸和分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点2或其片段或变体的至少一个氨基酸。
93.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点2或其片段或变体的至少一个氨基酸和分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点3或其片段或变体的至少一个氨基酸。
94.权利要求65-87任一项的配体，其中所述配体结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点1或其片段或变体的至少一个氨基酸和分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点2或其片段或变体的至少一个氨基酸和分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点3或其片段或变体的至少一个氨基酸。
95.权利要求65-87任一项的配体的配体用作药物。
96.权利要求65-87任一项的Vps10p-结构域受体配体用于治疗个体的神经系统疾病、病症或损伤的方法中。
97.权利要求96的配体，其中所述个体是人。
98.权利要求96的配体，其中所述疾病、病症或损伤涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经损伤。
99.权利要求98的配体，其中所述损伤是由中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、弥漫性轴索损伤和癫痫症造成的。
100.权利要求96的配体，其中所述神经系统病症涉及神经元及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的进程的退化。
101.权利要求96的配体，其中所述神经元的退化是由帕金森病、阿尔茨海默病、老年痴呆、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS)和与多发性硬化相关的神经元损伤造成的。
102.权利要求96的配体，其中所述神经系统疾病是神经退行性疾病。
103.权利要求102的配体，其中所述神经退行性疾病是帕金森病。
104.权利要求102的配体，其中所述神经退行性疾病是阿尔茨海默病。
105.权利要求102的配体，其中所述神经退行性疾病是多发性硬化。
106.权利要求96的配体，其中所述神经系统病症是涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤。
107.权利要求106的配体，其中所述涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤选自由代谢疾病、营养缺乏、毒性损伤、恶性肿瘤引起的病况，和/或遗传性或先天性病况，包括但不限于糖尿病、肾功能失调、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏和感染。
108.权利要求96的配体，其中所述神经系统病症是涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤，其中所述神经胶质细胞选自脑、脑干、脊髓和外周神经中的少突细胞、星细胞和施沃恩细胞。
109.权利要求108的配体，其中所述涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤选自多发性硬化、眼神经炎、脑硬化、感染后脑脊髓炎和癫痫症。
110.权利要求108的配体，其中所述疾病或病症是多发性硬化、感觉共济失调、神经退行性脊髓小脑病症、遗传性共济失调、小脑萎缩和酒精中毒。
111.权利要求96的配体，其中所述神经系统病症、疾病或损伤涉及视网膜、感光器和相关的神经。
112.权利要求111的配体，其中所述涉及视网膜、感光器和相关的神经的神经系统病症、疾病或损伤选自色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼和糖尿病性视网膜病。
113.权利要求96的配体，其中所述神经系统病症、疾病或损伤涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞。
114.权利要求113的配体，其中所述涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞的神经系统病症、疾病或损伤选自噪声诱导的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩和梅尼埃病。
115.权利要求95的药物，其任选还包含药学上可接受的载体。
116.权利要求95的药物，其包含第二种活性成分。
117.权利要求116的药物，其中所述第二种活性成分选自能够结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点1的配体，和/或能够结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点2的配体，和/或能够结合至分拣蛋白(SEQ ID NO.1)的结合位点3的配体。
118.根据权利要求115-117任一项的药物，其中组合物的pH介于pH 5和pH 9。
119.根据权利要求115-118任一项的药物，其配制为通过注射、栓剂、口服给药、舌下药片或喷雾剂、皮肤给药、吸入给药，或使用可移植的生物相容性胶囊用于局部给药。
120.权利要求119的药物，其中所述注射为静脉内、肌内、脊柱内、腹膜内、皮下、弹丸注射或持续给药。
121.根据权利要求115-120任一项的药物，其中以30分钟至24小时的间隔给药。
122.根据权利要求115-120任一项的药物，其中以1至6小时的间隔给药。
123.根据权利要求115-122任一项的药物，其中治疗的持续时间为6至72小时。
124.根据权利要求115-123任一项的药物，其中药物的剂量是每千克体重10μg至50mg。
125.一种治疗受试者中的病理性状况的方法，其包括向有此需要的个体给予治疗上有效量的根据权利要求115至124的药物。
126.权利要求125的方法，其中所述药物用于治疗与神经系统有关的疾病、病症或损伤。
127.权利要求126的方法，其中所述药物用于治疗涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经损伤的疾病、病症或损伤，包括但不限于例如中风、外伤性脑损伤、脊髓损伤、弥漫性轴索损伤和癫痫症的病况。
128.权利要求126的方法，其中所述神经系统病症涉及神经元及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的进程的退化。
129.权利要求128的方法，其中所述神经元的退化是由帕金森病、阿尔茨海默病、老年痴呆、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化和与多发性硬化相关的神经元损伤造成的。
130.权利要求126的方法，其中所述涉及神经元及其在脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的进程的退化的神经系统病症是神经退行性疾病或病症。
131.权利要求130的方法，其中所述神经退行性疾病是帕金森病。
132.权利要求130的方法，所述神经退行性疾病是亨廷顿病。
133.权利要求130的方法，所述神经退行性疾病或病症是肌萎缩侧索硬化(ALS)。
134.权利要求126的方法，其中所述神经系统病症是涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤。
135.权利要求126的方法，其中所述涉及脑、脑干、脊髓和/或外周神经中的神经元功能失调和/或丧失的疾病、病症或损伤选自由代谢疾病、营养缺乏、毒性损伤、恶性肿瘤引起的病况，和/或遗传性或先天性病况，包括但不限于糖尿病、肾功能失调、酒精中毒、化疗、化学试剂、药物滥用、维生素缺乏和感染。
136.权利要求126的方法，其中所述神经系统病症是涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤，其中所述神经胶质细胞选自脑、脑干、脊髓和外周神经中的少突细胞、星细胞和施沃恩细胞。
137.权利要求136的方法，其中所述涉及神经胶质细胞退化或硬化的疾病、病症或损伤选自多发性硬化、眼神经炎、脑硬化、感染后脑脊髓炎和癫痫症。
138.权利要求136的方法，其中所述疾病或病症是多发性硬化、感觉共济失调、神经退行性脊髓小脑病症、遗传性共济失调、小脑萎缩和酒精中毒。
139.权利要求136的方法，其中所述神经系统病症、疾病或损伤涉及视网膜、感光器和相关的神经。
140.权利要求139的方法，其中所述涉及视网膜、感光器和相关的神经的神经系统病症、疾病或损伤选自色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼和糖尿病性视网膜病。
141.权利要求136的方法，其中所述神经系统病症、疾病或损伤涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞。
142.权利要求141的方法，其中所述涉及感觉上皮和前庭听觉复合体的相关神经胶质细胞的神经系统病症、疾病或损伤选自噪声诱导的听力丧失、耳聋、耳鸣、耳炎、迷路炎、遗传性和耳蜗前庭萎缩、和梅尼埃病。
143.一种阻止哺乳动物神经元细胞的细胞凋亡的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于权利要求65至87任一项定义的配体分子。
144.一种增强哺乳动物神经元细胞的存活的方法，所述方法包括将所述神经元细胞暴露于权利要求65至87任一项定义的配体分子。
145.一种扩大哺乳动物细胞的组成的方法，其包括向所述组成给予权利要求65至87任一项定义的配体分子。
146.一种使哺乳动物细胞的组成分化的方法，其包括向所述组成给予权利要求65至87任一项定义的配体分子。
147.一种抗体，其能够与SEQ ID NO.1的结合位点1或其片段或变体的至少一个氨基酸残基和/或SEQ ID NO.1的结合位点2或其片段或变体的至少一个氨基酸残基和/或SEQ ID NO.1的结合位点3或其片段或变体的至少一个氨基酸残基结合。
148.一种抗体，其能够结合至选自SEQ ID NO.1的S420至I425、A497至V502、S469至P475、和D449至N454或其片段或变体的至少一个氨基酸残基。
149.权利要求147-148任一项的抗体，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体、重组抗体。
150.一种免疫缀合物，其包含权利要求147-149任一项的抗体和选自下列的缀合物：细胞毒试剂，例如化疗剂、毒素或放射性同位素；特定结合对的成员，例如亲和素或链霉亲和素或抗原。
151.一种建立Vps10p-结构域受体蛋白分子的原子模型的方法，其包括以下步骤：
a.鉴定与SEQ ID NO.1具有至少20％序列同一性的Vps10p-结构域受体或其片段或变体；和
b.使用原子坐标通过同源性模拟获得所鉴定的Vps10p-结构域受体的原子模型，其中所述原子坐标如图17-20任一项所示，或者所述原子坐标选自就蛋白骨架原子的均方根偏差而言与图17-20任一项所示的三维结构的偏差不超过的三维结构。
152.权利要求151的方法，其中所述Vps10p-结构域受体选自SEQ ID NO.2(SorLA)、SEQ ID NO.3(SorCS1)、SEQ ID NO.4(SorCS2)和SEQ ID NO.5(SorCS3)或其片段或变体。
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