JP5871249B2 - 成長因子のプロペプチド - Google Patents
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本発明は、プロペプチド(成長因子がBDNFの場合には配列番号3の19番アラニンから128
番のアルギニンに対応)に関連する技術を提供することを目的とする。
項1. 成長因子前駆体から成熟型成長因子部分を除いたプロペプチドの生理活性物質としての使用。
項2. 前記プロペプチドが成熟型成長因子の少なくとも1つの生理活性を抑制すること
を特徴とする、項1に記載の使用。
項3. 成長因子がBDNFである、項1または2に記載の使用。
項4. 成長因子前駆体から切断された前記プロペプチドと前記成熟型成長因子が切断後も強固な結合を有する、項1〜3のいずれかに記載の使用。
項5. 成長因子前駆体から成熟型成長因子部分を除いたプロペプチドを有効成分とする
前記成長因子の阻害剤。
項6. 成長因子がBDNFであり、BDNFのプロペプチドを有効成分とする、項5に記載の成長因子の阻害剤。
項7. in vivoまたはin vitroで細胞に成長因子前駆体から成熟型成長因子部分を除い
たプロペプチドを作用させ、次いで該細胞に候補化合物を作用させることを特徴とする前記プロペプチドの作用を抑制する薬物のスクリーニング方法。
項8. 前記プロペプチドがBDNFのプロペプチドであり、前記薬物が抗うつ薬である、項7に記載のスクリーニング方法。
因子(VEGF, NP_003369)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF, CAA2729)、顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子(GM-CSF, AAA52578)、血小板由来成長因子(PDGF, AAA60552)、エリスロポエチン(EPO, AAI43226)、トロンボポエチン(TPO, AAB33390)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF, AAA52534)、肝細胞増殖因子(HGF, AAA64297)、線維芽細
胞増殖因子(FGF, CAA28027)、骨形成タンパク質(BMP, P12643)、NT3 (NP_001096124)、NT4 (NP_006170)などが挙げられる。
チドに分かれて存在すると考えられるが、生理的pH条件下では両者は強い相互作用があり、結合した状態で存在すると考えられる。実際、BDNFプロペプチドは成熟型BDNFのLTD抑
制効果を阻害する。
BDNFプロペプチド遺伝子の作製
BDNFプロペプチド(図1と配列番号3:当該BDNFのアミノ酸番号では19番アラニンから128番のアルギニンに対応)と推定されるポリペプチドを大腸菌内で大量に発現させるため
に、制限酵素BamHIにより認識される配列及びPreScission Protease(GEヘルスケア社)認識配列をコードする塩基配列を含む合成DNA
5’-ggatccgctggaagtgctgtttcagggccccgcccccatgaaagaagcaaac-3’(配列番号1)
5’-ggatccctagcgccggaccctcatggaca-3’ (配列番号2)
を用いてPCR法により増幅した。増幅遺伝子をBamHIで分解し、発現ベクターpet19b(NOVAGEN社)のBamHIサイトに組み込んだ。大腸菌(XL-1Blue)(NOVAGEN)に形質転換し、BDNFプロペプチド発現ベクターを作成した。形質転換体は、(0.05 mg/ml アンピシリン)を含むLB寒天プレート上でのコロニー形成を指標に選択した。形質転換体からBDNFプロペプチド遺伝子含有プラスミドをアルカリ法で抽出した。
1.5ml容チューブ内に、大腸菌(E.Coli)Rosetta (DE3)株(Novagen社)のコンピテントセル0.04mlと、上記調製したBDNFプロペプチド遺伝子含有プラスミドDNA溶液0.003ml(プラスミドDNA 8.4ng)を加え氷中に30分間放置した後、42℃で30秒間ヒートショックを与えた。次いで、チューブ内にSOC 培地を0.25ml加え、37℃で1時間振とう培養した。次いで、アンピシリンを含むLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩培養することにより形質転換体を得た。
得られた形質転換体をアンピシリンを含むLB培地に接種し、600 nmにおける吸光度が0.5
に達するまで37℃で培養した後、発現を誘導するためIPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)を加え(最終濃度1mM)さらに一晩、培養した。培養液を8,000rpmで10min遠心
分離することにより集菌した。集菌した菌体10gに、緩衝液A(20mM Tris-Cl 6M 塩酸グ
アニジン pH 8.0)を100 mlを加え、菌体を90Wの出力で30分間超音波破砕した。破砕した
菌液を 15,000rpmで30分間遠心分離し、上清を採取した。緩衝液Aで平衡化した金属キレ
ートカラムHiTrap-Chelating(GEヘルスケア社)カラムを用いてカラムクロマトグラフィーを行った。溶出は0.5Mイミダゾールを含む緩衝液Aの直線グラジエントを用いた。得られ
た目的分画を透析チューブ(分画サイズMw.3500)に入れ、緩衝液B(20mM Tris-HCl、25mM NaCl pH8.5)溶液で一晩室温で透析を行なった。透析終了後、PreScission protease80μl
を加え、4℃で一晩放置した後、緩衝液で平衡化したイオン交換カラムHiTrap-Q(GEヘルスケア社)に添加し、1M NaClを含む緩衝液の直線グラジエントを用いて精製を行った。目的分画にはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを与える均一標品が含
まれていることを確認した後、緩衝液C(20mM リン酸,25mM NaCl)に透析し以下の実験に
用いた。この均一標品の精製度を銀染色キット(和光純薬)により確認し、プロペプチドを認識しうるproBDNF抗体(Koshimizu et al., Molecular Brain, vol.2: 27, pp.1-19, 2009)を用いたウエスタンブロット法で確認した(図2)。
精製したBDNFプロペプチドと成熟BDNFとの相互作用を定量的に解析するため(図4)、表面プラズモン共鳴法を利用したビアコア装置(GEヘルスケア社)を用いた(Uegaki et al.,
J. Mol. Biol. 297, 1121-1128, 2000)。センサーチップはCM5(GEヘルスケア社製)を用いた。固定化の方法はビアコアマニュアルに記載されている、アミンカップリング法を用いBDNFプロペプチドをセンサーチップ上に2000レゾナンスユニット固定化した。操作手順はすべてマニュアルにしたがった。HBS緩衝液(GEヘルスケア社)で段階的に希釈した成熟
型BDNF(60nM〜3.7nM)を用い、流速20μl/minで相互作用の解析を行った(図3)。解離定数Kdはビアコア装置の付属ソフトウエアを用いて算出した。図4に使用した。図4では、成熟型BDNFに結合するBDNFレセプターボディTrkB-IgG(R&Dシステム社)を用いた結合
阻害実験を行った。プロペプチドとBDNFの相互作用は本抗体により阻害されることを確認
した。この実験からプロペプチドは成熟型BDNFのレセプター結合部位と相互作用することが示唆された。
BDNFプロペプチドが神経伝達調節を行う可能性を知るために、海馬スライスを用いた電気生理学の実験を行った(図5)。スライスの調製および電気生理学的解析は既報に従い(Ishikawa et al., J. Neurosci., 28, 843-849, 2008)、人工脳脊髄液(以下ACSF, [m
M]: 125 NaCl, 2.6 KCl, 1.3 MgSO4・7H2O, 1.24 KH2PO4, 26 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 10 D-glucose) を95% O2/5% CO2で飽和した溶液(酸素飽和ACSF)中で行った。
生後3週齢オスマウス(日本SLC)から脳を取り出し速やかに氷冷酸素飽和ACSFにおいた
。脳を冷却後、堂阪リニアスライサーpro7を用い氷冷酸素飽和ACSFにて海馬を厚さ400um
で急性切片を作成した。作成した海馬スライスは酸素飽和ACSF中30℃で30分間回復させ、その後、電気生理学的解析を行うまで酸素飽和ACSF中、室温においた。
海馬スライスは連続的に28℃に加温された酸素飽和ACSFを還流(流速約2分)された記録チ
ャンバーにおいた。
海馬スライスはテスト化合物(BDNF, BDNFプロペプチド)の効果を測定すべく、双極ニクロム刺激電極によって電流パルス(0.1msec)で刺激しCA1ニューロンのシナプス中に終わる海馬CA3中のニューロンからのシェーファー側枝を励起させる。記録電極にはACSFを、
充填したガラス微小電極を用い刺激電流の強度は半最大fEPSP(約1〜2mV)を生じるよ
うに調節した。60秒毎に刺激パルスが与えた。増幅器(ER-1, Cygnus)で細胞外電位を測定し、LTP program( http://www.ltp-program.com/)にて記録した。
fEPSPの反応が安定化した後、30分間の間、酸素飽和ACSF に種々の濃度のテスト化合物(BDNF, BDNFプロペプチド) を含んだものに置換される。そのとき、低頻度刺激(1Hz,900発)を海馬スライスにあたえ、長期抑制現象(LTD)における効果を観察した。この効果
は、初期記録20分を基準(100%)としたfEPSPの傾き(mV/msec)における変化率計算をする。
プロペプチドの効果
図4に示した神経伝達の長期抑圧現象(LTD)の分子メカニズム(Sudhof & Malenka, Neuron, 60, 469-476, 2008)を知るため、細胞表層GluR1集積効果に対するBDNFプロペプチ
ドの効果をラット低密度海馬初代分散培養法(Takahashi et al., J. Neurosci., 23,6586-6595, 2003)を用いて検討した(図5)。培養3週後の海馬神経細胞にBDNFもしくはBDNFプロペプチドを50 ng/mlの濃度で30分間処理し、細胞表面に集積するGluR1の蛍光抗体染色を既報 (J. Neurosci., 23, 4567-4576,2003)に従い行った。GluR1特異的抗体(Calbiochem社)は15倍希釈で使用し、検出には蛍光2次抗体(Cappel社)を用いた。認識する特異的抗体を用いて免疫細胞科学的に処理し、蛍光顕微鏡を用いた蛍光シグナルの検出および定量解析は既報(Crump et al., J. Neurosci., 21, 5079-5088, 2001)に従い行った。BDNFの効果は既報(Narisawa-Saito, et al. J. Biol. Chem., 277, 40901-40910, 2002)に一致した。
Tukey's multiple comparison testの多重検定を行った。グラフデータは平均値±標準誤差で表した。
特開2007-306899で作製した遺伝子組み換えマウスは図1に示したproBDNF→mature BDNF
の反応が非効率となっている。一方、既報(Donovan et al., Development 127, 4531-4540, 2000)ではBDNFは血管新生への役割が報告され、BDNFの血中バイオマーカーとしての可能性が期待されている。そこで、特開2007-306899のマウスの生後12週令ホモ接合体
(図8中のホモ血漿)および同腹コントロールマウス(図8中のWild血漿)の末梢血を採取し、その遠心分離後の血漿分画を調製した。総タンパク濃度で補正した後、その希釈系列(1/4、1/8、1/16)を調製し、BDNFプロペプチドチップを装着したビアコア装置にロードした。ビアコア測定は、図3と同様に行った。結果を図8に示す。
Claims (4)
- BDNF前駆体から成熟型BDNF部分を除いたBDNFプロペプチドの、BDNFプロペプチドの成熟型BDNFに対する結合による成熟型BDNFの少なくとも1つの生理活性の阻害物質としての使用(但し、ヒトに対する使用を除く)。
- BDNF前駆体から成熟型BDNF部分を除いたBDNFプロペプチドの、LTD促進物質としての使用(但し、ヒトに対する使用を除く)。
- BDNF前駆体から成熟型BDNFを除いたBDNFプロペプチドを有効成分とする、BDNFプロペプチドの成熟型BDNFに対する結合による成熟型BDNF阻害剤。
- BDNF前駆体から成熟型BDNFを除いたBDNFプロペプチドを有効成分とする、LTD促進剤。
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