KR20180026669A - 캡슐화된 유도성 맥락총 세포를 사용한 cns 질환의 치료 - Google Patents

캡슐화된 유도성 맥락총 세포를 사용한 cns 질환의 치료 Download PDF

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재클린 은영 이
케네스 마틴 테일러
루파 헤만트 월란지
보울 보울 제니스 람
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리빙 셀 테크놀로지스 뉴질랜드 리미티드
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Abstract

하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분의 변경된 (및 특정 구현예에서 증가된) 수준을 생성하도록 유도된 캡슐화된 병원체 비함유 이종 맥락총(CP) 세포를 함유하는 CNS 이식된 반투과성 생체적합성 캡슐을 사용하는 신경계 질환 및 장애의 개선된 치료와 관련되는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 캡슐은 면역학적 거부, 염증 또는 이물질 반응을 유발하지 않고 현저하게 (이식 후 16개월 초과) 수명이 긴 CP 세포에 의해 상승된 CSF 생산 수준을 유도할 수 있도록 개시된 바와 같이 선택된다.

Description

캡슐화된 유도성 맥락총 세포를 사용한 CNS 질환의 치료
관련 출원의 상호 참조
본원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2015년 5월 15일에 출원된 미국 가출원 제62/162,390호에 대한 이익을 주장하고, 이 출원은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
기술 분야
본 개시는 일반적으로 신경퇴행성 질환을 포함하는 신경학적 질환 및 장애의 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 뇌척수액(CSF) 성분의 변경된(예: 통계학적으로 유의한 방식으로 증가되거나 감소된) 수준을 생성하도록 예기치 않게 유도될 수 있는 놀랍게도 수명이 긴 이종 맥락총(choroid plexus: CP) 세포를 함유하는 반투과성 캡슐을 포함하는 중추신경계(CNS)에 관련되는 조성물 및 방법이 개시되고, 이는 특정의 바람직한 구현예에서, 특정 CSF 성분의 수준을 증가시킬 것이다. 캡슐은 국소 염증 반응을 최소화하고 보조 면역억제 요법의 필요성을 피하기 위해 비면역원성이다.
관련 기술의 설명
신경계의 질환 및 장애는 효과적인 섭생이 달성하기 어려운 중요한 의학적, 사회적 및 경제적 도전을 나타낸다. 신경퇴행성 질환은 종종 노화와 관련이 있고, 종종 다른 신경학적 결손과 함께 우울증 또는 치매 및 기억력, 운동 능력, 인지 능력 및 감각 능력 중의 하나 이상의 퇴화 또는 손실이 동반되는 중추신경계(CNS) 및/또는 말초신경계(PNS)의 신경 세포의 점차적인 소실을 특징으로 한다(참조: Suksuphew et al., 2015 World J. Stem Cells 7:502; Schadt et al., 2014 Front. Pharmacol. 5:252). 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 정신분열증 및 다른 신경계 질환은 유병률의 증가 및 의료 비용에 대한 영향을 증대시키는 사회적 부담이 되고 있다.
건강한 개체에서 정상적인 신경계 유지 및 활동에 중요한 기여자인 신경계 세포의 질환 관련 변성은 유해한 결과를 갖는 손상된 신경계 기능을 유발할 수 있다. 예를 들면, 성장 인자, 분화 인자, 조직 복구 인자, 신경 전달 물질, 해독 단백질, 단백질 샤프론 등과 같은 중요한 생체 활성 분자를 분비하는 신경계 세포의 손상 또는 손실은 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 다른 상태와 같은 치명적인 질환을 초래할 수 있다. 손실된 세포의 정상적인 기능이 생리학적 상태의 항상성 유지 또는 변화하는 생리학적 신호에 대한 적절한 반응을 포함할 때, 조절되지 않은 방식으로 환자에게 하나 또는 소수의 다량 고갈 인자를 단순히 복원하려고 시도하는 치료 전략은 전형적으로 성공하지 못한다. 대신에, 효과적인 질환 변형 요법은 생리학적 농도에서 생물학적 반응성 조절 방식으로 이러한 세포에 의해 정상적으로 분비되는 모든 인자의 공급을 끊임없이 재조정하는 단계를 포함해야 한다.
따라서, 신경퇴행을 치료하기 위한 최근의 대체 접근법은 손상된 세포를 복원하거나, 복구하거나 기능적으로 대체할 수 있는 CNS 생존 가능한 치료적 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 이러한 접근법에 의해, 대체 세포는 지역 환경에 의해, 예를 들면, CNS 세포 및 조직 성장, 분화, 복구 및/또는 리모델링이 진행될 수 있을 때 그들의 유전자 발현 및 단백질 분비 프로파일을 통해 정량적 및/또는 정성적 변화를 통해 진행함으로써 공급되는 환경적 신호에 유연하고 다면 발현성으로 반응할 수 있을 것으로 간주된다. 이러한 CNS 세포 대체 요법은 파킨슨병 환자에서 한번 이식된 도파민 생산 뉴런으로 분화할 수 있는 태아 중뇌 조직 이식체와 같은 1차 이펙터 세포와 직접 질환으로 인해 손실된 세포를 대체하려는 시도를 포함했다(참조: Kordower et al., 1995 N Engl J Med . 332(17):1118; Lindvall, 1998 Mov Disord . 13 Suppl 1:83; Roitberg et al., 2004 Neurol Res. 26(4):355; Kefalopoulou et al., 2014 JAMA Neurol . 71(1):83; Bega et al., 2014 JAMA 311(6):617).
직접적인 CNS 세포 대체 요법으로부터 출발하여, 다른 최근에 동정된 대체 요법은 손상된 CNS 조직 부위에 CNS 결핍을 간접적으로 개선할 수 있는 세포를 공급하는데 초점을 맞춘다. 예를 들면, 맥락총(CP) 세포는 CSF 생산에서 이러한 특수화된 CNS 세포의 인지된 역할을 고려하여 특히 주목을 받았다(예: Damkier et al., 2013 Physiol . Rev. 93:1847). 맥락총(CP)은 뇌심실내 특수화된 상피 조직이다. 이의 핵심 기능 중 하나는 다양한 작은 동물 및 비-인간 영장류 질환 모델 연구로부터 거동 개선 및 조직학적 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 신경영양적, 신경보호 및 신경 복원 인자를 제공하는 뇌척수액(CSF)을 분비하는 것이다(참조: Redzic et al., 2005 Curr Top Dev Biol. 71:1; Borlongan et al., 2004 Stroke 35(9):2206; Emerich et al., 2006 Neurobiol Dis. 23(2):471; Borlongan et al., 2008 Cell Transplant 16(10):987; Luo et al., 2013 J Parkinsons Dis. 3(3):275).
CNS에서 CSF의 기능 및 전환율은 노령화시 상당히 감소하고, 이는 노인들 사이에서 발생하는 많은 신경퇴행성 질환에 기여할 수 있다(참조: Redzic et al., 2005 Curr Top Dev Biol. 71:1; Chen et al., 2009 Exp Gerontol. 44(4):289; Chen et al., 2012 Exp Gerontol. 47(4):323). 최근 발견은, 뇌내의 간질 공간을 통한 CSF 순환은 동물의 수면 주기 동안 보다 효과적으로 발생하며(참조: Xie et al., 2013 Science 342(6156):373), 수면 감소가 신경퇴화(참조: Iliff et al., 2014 J Neurosci . 34(49):16180)에 기여하는 것으로 공지되어 있는 폐기물의 제거 감소 및 증가된 플라그 형성에 기여할 수 있다는 것을 암시하는 것을 나타낸다. 그러나, 이러한 발견은 또한 전체 일일주기 동안 뇌의 손상된 부위 내에서 국소적으로 CSF의 연속 생산이 임상적으로 바람직하지 않은 결과를 초래할 수 있음을 암시한다. 예를 들면, 손상된 CNS 부위에서 과도한 CSF 생산은 시냅스 영역에서 잠재적으로 차선의 농도로 활성 시냅스 단백질 또는 신경 전달 물질을 희석시킬 수 있다. 따라서, 증가하는 CSF 생산이 CNS 질환의 치료를 위한 실행 가능한 치료 적략이 될지를 예측하는 것은 어렵다.
그럼에도 불구하고, CP-유도된 CSF 성분 또는 다른 CP 과정, 생성물 또는 대사산물이 대부분의 경우 이식 부위 내외부의 다양한 세포 유형의 재프로그래밍 및/또는 복원에 의해 손상된 숙주 조직을 복원하기 위한 2차 이펙터로서 작용할 수 있는 CNS에서 이식에 의한 맥락총(CP) 세포 이식체의 사용에 대한 다수의 노력이 지시되어 왔다. 실제적이고 윤리적인 이유로, CP 이식체는 전형적으로 이종 CP 세포를 사용하였고, 따라서 이종 이식체에 대한 면역 거부 반응 및/또는 숙주 염증(예: 이물 반응)에 대항하기 위한 면역억제성, 항염증성 척도의 실행이 요구된다. 생체적합성 반투과성 알기네이트 캡슐은 용해된 세포 생성물이 이식된 캡슐을 둘러싸는 조직으로 확산되는 것을 허용하는 동안(예: US6322804, US5834001, US6083523, US2007/134224, US5869463, US2004/213768, US2009/0047325), 치료용 세포를 뇌에 도입하여 그러한 반응을 최소화하는 비면역원성 비히클로서 공지되어 있다. CNS 질환 치료용 생체적합성 캡슐 내의 맥락총 조직 단편의 뇌에서 특정 이식은, 예를 들면, US2007/134224, US2004/213768 및 US2009/0047325 및 관련 특허 출원 공보에 기재되어 있다. 예를 들면, US2009/0047325에 기재된 바와 같이, CNS 조직 손상의 이식 부위에서 국소적으로 캡슐화된 이종이식된 CP 세포에 의한 CSF 생산 이외에, 신생아 CP 세포의 사용은, 신생아 포유동물의 CSF가 전형적으로 CSF 성분이 풍부하다는 점을 고려하면, 성인 CP 세포에 의해 공급되는 것보다 더 높은 농도의 생물학적 활성 CSF 분자를 제공할 수 있다.
그러나, 치료용 이종 이식체의 개발에서 이러한 진보에도 불구하고, 충족되지 않은 다수의 과제가 남아 있다. 예를 들면, 이종 이식 CP 조직은 제한된 양으로 이용할 수 있고, 신생아 CP 세포가 사용될 때조차 이종이식 후 정교화된 CSF 성분의 양은 신경계 결손의 교정을 수행하기에 적절하지 않을 수 있다.
유사하게, 광범위한 신경계 조직 손상이 존재하는 경우 및/또는 수용자에서의 CP 함유 캡슐 배치를 위한 제한된 공간만이 존재하는 경우 및/또는 높은 수준의 CSF 성분 생산이 목적시 되는 경우, 다수의 캡슐이 CNS 부위에 이식되어야 하고/하거나 다수의 CNS 이식 부위 또는 반복적인 침습적 절차가 목적하는 수준의 CSF 생산 능력을 전달하는데 필요하면 캡슐화된 이종 이식 CP 세포를 위한 이식 부위(예: 뇌 조직에 직접 CP-캡슐 이식을 위한 CNS 부위)를 추가로 손상시킬 실질적인 위험이 존재한다.
CP 이종 이식체의 수명은 또한 이전 보고서로부터 불명확하지만, 만성 신경퇴행성 질환은 장기간 치료가 필요할 수 있다. 고갈된 캡슐화된 CP 이식체를 대체하기 위한 반복된 외과적 개입은 환자에게 불편하고, 잠재적으로 해롭고 비용이 많이 든다. 추가로, 이종 이식은 이식 수용자에게 공여자 CP 조직에 존재하는 유해한 병원체를 바람직하지 않게 도입할 위험을 동반한다.
현존하는 방법론의 이러한 단점 및 다른 단점은, 특히 본 개시 이전에, 캡슐화 CP 세포의 손상된 CNS 부위로의 이식이 장기간 유익한 임상적 결과를 초래할지를 예측할 수 없었던 경우에, CNS 요법을 위한 이종 이식체의 개발을 방해하였다, 현재 개시된 구현예는 이러한 요구를 해결하고 다른 관련 이점들을 제공한다.
본 발명은 특정 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서, (a) 직경이 약 50㎛ 내지 약 200㎛이고, CP 상피 세포를 포함하는 CP 세포 클러스터를 수득하기 위해 포유동물 맥락총 조직의 기계적 및 효소적 분리(dissociation) 중 하나 또는 둘 다에 의해 수득되는 캡슐화된 맥락총(CP) 조직 단편인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실질적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개 CP 세포를 갖는, 단계, (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 대상체의 하나의 중추신경계(CNS) 주입 부위(injection site)에 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 CNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및 (c) 투여하는 상기 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 다수의 캡슐 중의 맥락총 조직 세포를, 맥락총 조직 세포가 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 없이 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된(예: 통계적으로 유의한 방식으로 증가되거나 감소된) 수준으로 생성하도록 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계로서, 이 수준은 특정 구현예에서, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 없이 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준보다 하나 이상의 CSF 성분에 대해 더 높은, 단계를 포함하는, 치료 방법을 제공한다.
특정의 다른 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서, (a) 다능성 세포 집단을 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 배양함으로써 수득되는 캡슐화된 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실직적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개 CP 세포를 갖는, 단계, (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 대상체의 하나의 중추신경계(CNS) 주입 부위에 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 CNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및 (c) 투여하는 상기 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 복수의 캡슐 중의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를, 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포가 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 없이 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된(예: 통계적으로 유의한 방식으로 증가되거나 감소된) 수준으로 방출하도록 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계로서, 이 수준은 특정 구현예에서, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 이전에 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준보다 하나 이상의 CSF 성분에 대해 더 높은, 단계를 포함하는, 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, CP 세포를 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계는 투여하는 상기 단계 (b) 이전에 발생한다. 특정 구현예에서, 맥락총 유도제는 (a) Wnt 신호전달 경로 작동제, (b) GSK3β 억제제, (c) 베타-카테닌 활성화제, (d) 산화방지제 및 (e) 1,25-디하이드록시비타민 D3으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함한다. 특정 구현예에서, (1) Wnt 신호전달 경로 작동제는 WAY-316606 (SFRP 억제제), IQ1 (PP2A 활성화제), QS11 (ARFGAP1 활성화제), (헤테로)아릴피리미딘, 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, 노린, R-스폰딘-1, R-스폰딘-2, R-스폰딘-3, R-스폰딘-4로부터 선택되고, (2) GSK3β 억제제는 SB-216763, BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심), 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 양이온성 리튬을 포함하는 다른 리튬 염으로부터 선택되고, (3) 베타-카테닌 활성화제는 데옥시콜산(DCA) 및 도 5의 화합물로부터 선택되고, (4) 산화방지제는 10-(6'-우비퀴노일)데실트리페닐포스포늄 염(미토퀴놀, MITOQ®), 우비퀴놀(코엔자임 Q), 토코페롤, 토코트리에놀(비타민 E), α-토코페롤, γ-토코페롤, 2-아미노에탄설폰산(타우린), 아스코르브산, 글루타티온 및 멜라토닌으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 포유동물 맥락총 조직은 대상체와 관련하여 이종 또는 동종이계인 포유류로부터 유래된다. 특정 구현에에서, 포유동물 맥락총 조직은 돼지, 양, 소, 염소 또는 비-인간 영장류 맥락총 조직을 포함한다. 특정 구현예에서, 돼지 맥락총 조직은 태아 또는 신생아 맥락총 조직을 포함하고, 이는, 특정의 추가의 구현예에서, 인간 병원체를 실질적으로 함유하지 않는다. 특정의 관련 구현예에서, 태아 또는 신생아 맥락총 조직은 실질직으로 인간-지향 전염성 돼지 내인성 레트로바이러스를 함유하지 않고, 특정 구현예에서, 태아 또는 신생아 맥락총 조직은 실질적으로 감염성 인간지향성 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV)를 생성할 수 없거나, 태아 또는 신생아 맥락총 조직은 PERV 유전자가 결여된 동물로부터 수득될 수 있다. 특정의 추가의 구현예에서, 태아 또는 신생아 맥락총 조직은 PERV-A env 유전자와 재조합할 수 있는 PERV-C env 유전자가 결여된 동물로부터 수득된다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 다능성 세포 집단은 배아 세포, 제대혈 세포, 태반 세포, 신경 능선 전구 세포, 성인 조직 줄기 세포 및 체세포 조직 세포로부터 선택된 공급원으로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 다능성 세포 집단은 골 형태형성 단백질(BMP) 또는 BMP 신호전달 경로 작동제, 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 슈퍼패밀리 구성원 또는 TGF-β 신호전달 경로 작동제, 결절 단백질 또는 결절 신호전달 경로 작동제, 포유동물 성장 및 분화 인자(GDF) 또는 GDF 신호전달 경로 작동제, Wnt 단백질 리간드 또는 Wnt 신호전달 경로 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 또는 FGF 신호전달 경로 작동제, 및 소닉 헤지혹(sonic hedgehog: Shh) 또는 Shh 신호전달 경로 작동제로부터 선택된 하나 이상의 시험관내 CP 분화제를 포함하는 배양 배지에서 상기 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 배양한다. 특정의 추가 구현예에서, Wnt 신호전달 경로 작동제는 WAY-316606 (SFRP 억제제), IQ1 (PP2A 활성화제), QS11 (ARFGAP1 활성화제), 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, 노린, R-스폰딘-1, R-스폰딘-2, R-스폰딘-3, 또는 R-스폰딘-4, 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 양이온성 리튬을 포함하는 다른 리튬 염으로부터 선택된다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 캡슐화된 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포는 대상체에 대해 이종 또는 동종이계이다. 특정 구현예에서, (i) 캡슐은 CNS 주입 부위에서 만성 염증을 유발하지 않거나, (ii) 대상체에게 면역억제제의 투여는 CNS 주입 부위에서 캡슐의 면역학적 거부를 개선하는 데 요구되지 않거나, 또는 둘 다이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 CSF 성분은 (i) 하나 이상의 성장 인자, (ii) 하나 이상의 CSF 산화방지제, (iii) 하나 이상의 화학 주성 인자, (iv) 하나 이상의 샤프론 단백질 또는 (v) 도 7a 내지 j에 제시된 하나 이상의 CP 생성물 중의 적어도 하나를 포함한다. 특정의 추가 구현예에서, (a) 하나 이상의 성장 인자는 IGF-1, IGF-II, FGF-1, bFGF (FGF-2), FGF-9, FGF-12, FGF-18, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, VEGF, VEGF-2, VEGF-B, VEGF-C, EGF, 성장 호르몬(GH), BMP-1, BMP-2, BMP-4, BMP7, BMP-11, BMP-15, GDF-1, GDF-7, GDF-8, GDF-9, 신경 성장 인자(NGF), PEDF(색소 상피 유도 인자, SerpinF1로도 공지됨), 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1), IGF2, BDNF, NT-3, NT-4, GDF-15, GDNF, 결합 조직 성장 인자(CTGF), 엑소트로핀, 헤파린 결합 EGF형 성장 인자(HB-EGF), 혈소판 유래 성장 인자-알파(PDGF-α), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 또는 신경 돌기 성장-촉진 인자-2/미드카인(NEGF2)을 포함할 수 있지만, 이에 국한될 필요가 없는 성장 인자로부터 선택되고; (b) 하나 이상의 CSF 산화방지제는 세룰로플라스민, 슈퍼옥사이드 디스무타제-1(SOD-1), 슈퍼옥사이드 디스무타제-2(SOD-2, Mn형), 슈퍼옥사이드 디스무타제 구리 샤프론(CCS), DJ-1/PARK7, 카탈라제, 셀레노단백질(I, M, N, P, S, T, W, X, 15kDa), 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 글루타티온 리덕타제, 글루타티온 퍼옥시다제, 하이드록시아실 글루타티온 하이드롤라제 또는 티오레독신으로부터 선택되고; (c) 하나 이상의 화학 주성 인자는 폐포(alveolar) 마크로파지-유래 화학 주성 인자-I(AMCF-I), AMCF-II, 간질 세포-유래 인자-2, 케모카인 (CXC 모티프) 리간드 2, 케모카인(CCL8, CCL16, CCL19, CCL21, CCL25, CXCL2, CXCL4, CXCL9, CXCL12, CXCL13, CXCL14), 케모카인 (CXC 모티프) 수용체-4, 케모카인형 인자 슈퍼 패밀리(CKLF-3, -6, -7), 또는 신경 돌기 성장-촉진 인자-2/미드카인(NEGF2)을 포함할 수 있지만, 이에 국한될 필요가 없는 화학 주성 인자로부터 선택되거나; (d) 샤프론 단백질은 트랜스티레틴, 리포칼린형 프로스타글란딘 D 신타제/β-트레이스(L-PGDS), 아포지단백질(A, B, C, D, E, H, J, M, N, R), 리포칼린-6, 리포칼린-7, 시스타틴 B, 시스타틴 C, 시스타틴 EM, 시스타틴 11, 열 충격 단백질(HSP) 계열 구성원, 또는 DJ-1/PARK7을 포함할 수 있지만, 이에 국한될 필요가 없는 단백질로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각 캡슐 내 CP 세포는 1㎕ 미만의 코어 용적으로 존재한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 각각 적어도 약 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500 또는 9000개, 및 약 10,000개 이하의 CP 세포를 함유하는 하나 이상의 캡슐을 투여하는 단계를 포함한다. 특정의 추가 구현예에서, 하나 이상의 캡슐은 각각 적어도 약 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000 또는 7500개, 및 약 8000개 이하의 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 투여하는 단계는 치료적 유효량의 캡슐을 CNS 주입 부위에 투여하는 단계를 포함하고, 이는, 특정의 추가 구현에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450,500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000개 이하의 캡슐을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 CNS 주입 부위에 투여하는 단계를 포함한다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 캡슐화된 CP 세포의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50%는 투여 단계 후 적어도 6개월 동안 생존 가능하다. 특정 구현예에서, 생체적합성 캡슐의 외부 표면은 투여 단계 후 적어도 1년 동안 세포외 기질 침착(deposition)을 실질적으로 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, CNS 주입 부위에 캡슐을 투여하는 단계는 담체 용액에 캡슐을 포함하는 현탁물을 전달하는 단계를 포함하고, 이는, 특정의 추가 구현예에서, NaCl, 인공 뇌척수액(CSF), 아스코르베이트 또는 항염증제 중의 적어도 하나를 포함한다. 특정의 또 다른 구현예에서, 항염증제는 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 스테로이드 항염증성 약물 및 코넥신 길항제로부터 선택된다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 대상체는 인간 또는 비-인간 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되어 있고, 이는 특정의 추가 구현예에서 (a) 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환, 및 (b) 파킨슨병, 알츠하이머벙, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS, 운동 뉴런 질환으로도 공지됨), 운동 실조-모세혈관 확장증, 진행성 연수 마비, 진행성 근육 위축증, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 척수소뇌 운동 실조증 1형(SCA 1) 또는 노화-관련 신경퇴행성 장애로부터 선택된 신경계 질환으로부터 선택된다. 특정의 다른 구현예에서, 신경계 질환은 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는 질환, 및 (b) 파킨슨병(도파민성 뉴런), 알츠하이머병(노르아드레날린성 뉴런, Adori et al. 2015, Acta Neuropathol 129(4):541), 헌팅톤병(중간 가시 GABA 뉴런, MSN), 근위축성 측삭 경화증(운동 뉴런 질환) 및 우울증(세로토닌성 뉴런)으로부터 선택된 (a)의 질환으로부터 선택된다. 특정의 다른 구현예에서, 신경계 질환은 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는 질환, 및 (b) 정신병, 정신 분열증(과민성 도파민 신호 전달), 간질 발작(글루탐산성 흥분 독성), 허혈성 뇌졸중(글루탐산성 흥분 독성) 및 하지 불안 증후군과 관련된 불면증(과활동성 글루탐산 활성)으로부터 선택된 (a)의 질환으로부터 선택된다. 특정의 다른 구현예에서, 신경계 질환은 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 뇌척수액(CSF) 성분 또는 성분들의 수준에 비해 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분들의 변경된 수준을 포함하는 뇌척수액(CSF)의 대상체에서의 존재를 특징으로 하는 질환, 및 (b) 알츠하이머병 및 진성 당뇨병으로부터 선택된 (a)의 질환으로부터 선택된다. 특정의 다른 구현예에서, 신경계 질환은 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 맥락총 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 맥락총 기능의 변경된 수준의 대상체에서의 존재를 특징으로 하는 질환, (b) 스터지-베버 증후군(Sturge-Weber syndrome) 및 클리펠-트레노우네이-베버 증후군(Klippel-Trenaunay-Weber syndrome)으로부터 선택된 (a)의 질환, (c) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 비정상적으로 폴딩된 단백질 침착물의 수준에 비해 대상체의 뇌 조직에서 비정상적으로 폴딩된 단백질 침착물의 수준의 증가를 특징으로 하는 질환, 및 (d) 뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증-아이슬란드형 유전성 뇌출혈(HCHWA-I), 아밀로이드증-네덜란드형 뇌출혈(HCHWA-D), 수막뇌혈관 및 안구연수막 아밀로이드증, 겔솔린-관련 척수 및 뇌 아밀로이드 맥관병증, 가족성 아밀로이드증-핀란드형(FAF), 혈관 변이체 프리온 뇌 아밀로이드증, 가족성 영국형 치매(FBD)(또한, 가족성 뇌 아밀로이드 맥관병증-영국형 또는 뇌혈관 아밀로이드증-영국형으로 공지됨), 가족성 덴마크형 치매(또한, 유전병 옵탈모-오토-엔세팔리카(heredopathia ophthalmo-oto-encephalica)로서 공지됨), 가족성 트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증 및 PrP 뇌 아밀로이드 맥관병증(PrP-CAA)으로부터 선택된 (c)의 질환으로부터 선택된다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 신경계 질환은 중추신경계(CNS) 질환이고, 이는, 특정 구현예에서, (i) CNS 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 및 (ii) CNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 CNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 CNS 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는 CNS 질환, 및 iii) CNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 CNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 CNS 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는 CNS 질환 중의 적어도 하나이고, 여기서 상기 CNS 뉴런 및 CNS 신경 세포는 뇌, 척수, 망막, 시신경, 뇌신경, 후각 신경 또는 후각 상피 중 적어도 하나에 존재한다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 신경계 질환은 말초신경계(PNS) 질환이고, 이는, 특정 구현예에서, (i) PNS 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환, 및 (ii) PNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 PNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 PNS 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는 PNS 질환, 및 iii) PNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 PNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 PNS 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는 PNS 질환 중의 적어도 하나이고, 여기서 상기 PNS 뉴런 및 PNS 신경 세포는 말초 신경절 또는 말초 신경 중 적어도 하나에 존재한다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, CNS 주입 부위는 대상체의 뇌 조직에 존재한다. 특정 구현예에서, CNS 주입 부위는 대상체의 뇌실에 존재한다. 특정 구현예에서, 대상체의 CNS 주입 부위는 (a) CNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환에 의해 영향을 받는 신경 세포 섬유에 대한 표적 부위를 포함하는 CNS 주입 부위, (b) CNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환으로 인해 죽을 위험이 있는 신경 세포를 함유하는 CNS 주입 부위, (c) CNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 감소 위험이 있는 신경 세포를 함유하는 CNS 주입 부위, (d) CNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 증가 위험이 있는 신경 세포를 함유하는 CNS 주입 부위, (e) CNS 부위, 바람직하게는 캡슐이 실질적으로 혈액과 접촉하지 않도록 선택되는 CNS 주입 부위 및 (f) CNS 부위, 바람직하게는 투여 단계에 이어 캡슐에 의해 분비된 CSF 성분이 대상체의 뇌 전반에 걸쳐 CSF 순환에 의해 분포되도록 선택되는 CNS 주위 부위로부터 선택된다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 투여는 PNS 주입 부위와 같은 PNS 부위에서 일어난다. 특정 구현예에서, 대상체의 PNS 주입 부위는 (a) PNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환에 의해 영향을 받는 신경 세포 섬유에 대한 표적 부위를 포함하는 PNS 주입 부위, (b) PNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환으로 인해 죽을 위험이 있는 신경 세포를 함유하는 PNS 주입 부위, (c) PNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 감소 위험이 있는 신경 세포를 함유하는 PNS 주입 부위, (d) PNS 부위, 바람직하게는 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 증가 위험이 있는 신경 세포를 함유하는 PNS 주입 부위, (e) PNS 부위, 바람직하게는 캡슐이 실질적으로 혈액과 접촉하지 않도록 선택되는 PNS 주입 부위 및 (f) PNS 부위, 바람직하게는 투여 단계에 이어 캡슐에 의해 분비된 CSF 성분이 PNS 주입 부위 부근의 PNS 조직 내 또는 주위에 분포되도록 선택되는 PNS 주위 부위로부터 선택된다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 생체적합성 캡슐은 양이온성 가교결합제와 가교결합된 높은 만누론산 알기네이트의 코어 층, 반투막을 형성하는 폴리양이온의 중간 층, 및 양이온성 가교결합제와 가교결합된 높은 만누론산 알기네이트의 외부 층을 포함하고, 여기서, 코어 및 외부 층 중의 높은 만누론산 알기네이트는 동일하거나 상이하고, 약 50% 내지 약 95%의 만누론산 잔기를 함유하고, 폴리양이온 층은 폴리-L-리신으로 구성되지 않는다. 특정의 추가 구현예에서, 높은 만누론산 알기네이트는 약 300 kDa 초과, 1000 kDa 이하의 평균 분자량을 갖고, 폴리양이온 층은 10 내지 40 kDa의 평균 분자량을 갖는 폴리양이온성 제제로부터 형성된다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 캡슐을 CNS 주입 부위(또는 특정의 다른 구현예에서, PNS 주입 부위)에 투여하는 단계는 카테터를 통해 캡슐을 전달하는 단계를 포함한다. 특정의 추가 구현예에서, 전달하는 단계는 정위(stereotactic) 장치를 사용하여 카테터를 제어가능하게 위치시키는 단계를 포함한다. 특정의 또 다른 구현예에서, 정위 장치는 정위 장치 또는 변형된 정위 장치를 포함할 수 있고, 예시적 예로써, 제한 없이, 심뇌 자극기(DBS) 마이크로드라이버, "무테(frameless)" 정위 헤드 프레임, 두개골 장착 조준(skull-mounted aiming) 장치, 렉셀 프레임(Leksell frame), 코스만-로버츠-웰스 (Cosman-Roberts-Wells) 프레임 또는 다른 유사한 변형 정위 장치 등 또는 임의의 등가물일 수 있다. 특정 구현예에서, 카테터는 외부 카테터, 옵듀레이터(obdurator), 플런저 및 전달 카테터를 포함한다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 신경계 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 프리온병, 운동 뉴런 질환, 척수소뇌 실조증, 척수성 근위축증, 다계통 위축증-파킨슨 타입, 다계통 위축증-소뇌 타입, 본태성 진전, 진행성 핵상 마비, 이상운동증, 루이소체 치매, 본태성 진전, 약물-유발 파킨슨증, 운동 실조-모세혈관확장증, 척수소뇌 실조증, 소뇌 변성, 뇌 위축증, 올리브교소뇌 위축증, 피질 기저핵 변성증, 마이오클로누스성 소뇌 근실조(dyssynergia cerebellaris myoclonica), 프리드리히 실조증(Friedreich's ataxia); 정적 신경 질환, 뇌졸중, 중추 통증 증후군, 만성 통증, 편두통, 혀인두 신경통, 발작 장애, 간질, 뇌성 마비; 외상 관련 CNS 질환, 게르스트만 증후군(Gerstmann's syndrome), 락트-인 증후군(locked-in syndrome), 척수 손상, 진행성 신경퇴행성 질환, 노화 및 치매와 관련된 진행성 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 전두측두엽 치매, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 거대 축삭 신경병증, 유전성 신경병증, 영아 신경축삭 디스트로피, 크라베병, 랜도-크래프너 증후군(Landau-Kleffner syndrome), 척수 매독, 운동 뉴런 및 신경근 접합부 질환, 척수성 근위축증, 케네디병, 단일사지 근위축증, 근긴장이상증, 유전성 강직성 하지마비, 이삭 증후군(Isaacs' syndrome), 램버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 운동신경 질환, 하지 불안 증후군, 투렛 증후군; CNS의 염증성 질환, 다발성 경화증; 약물 또는 독소-유발성 CNS 질환, 신경이완 악성 증후군, 지연성 운동 장애, 윌슨병, 신경독성; 대사 부전의 신경계 질환, 레프섬병, 신경계 감염성 질환, 수막염, 급성 파종성 뇌척수염, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), AIDS의 신경학적 합병증, 보툴리누스 중독, 파상풍, 신경매독, 회색질척수염, 광견병, HIV/AIDS, 프리온병, 네글레리아 파울러리(Naegleria fowleri)(아메바성 뇌 감염); 뇌유낭미충증(neurocysticerosis); 신경정신병 질환, 우울증, 기분 장애; 강박성 장애, 섭식 장애, 중독, 불안-관련 장애, 양극성 장애, 주의력 결핍 과다행동 장애, 자폐증, 정신분열증; 신경내분비 질환, 기면증, 불면증, 하나 이상의 신경세포사와 관련 있거나 특징으로 하는 질환, 글루타메이트 독성, 단백질 응집체 또는 침착물, 또는 아밀로이드 플라크 형성, 뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증-아이슬란드형 유전성 뇌출혈(HCHWA-I), 아밀로이드증-네덜란드형 뇌출혈(HCHWA-D), 수막뇌혈관 및 안구연수막 아밀로이드증, 겔솔린-관련 척수 및 뇌 아밀로이드 맥관병증, 가족성 아밀로이드증-핀란드형(FAF), 혈관 변이체 프리온 뇌 아밀로이드증, 가족성 영국형 치매(FBD)(또한, 가족성 뇌 아밀로이드 맥관병증-영국형 또는 뇌혈관 아밀로이드증-영국형으로 공지됨), 가족성 덴마크형 치매(또한, 유전병 옵탈모-오토-엔세팔리카(heredopathia ophthalmo-oto-encephalica)로서 공지됨), 가족성 트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증 및 PrP 뇌 아밀로이드 맥관병증(PrP-CAA); 미토콘드리아 기능 장애의 신경계 질환, 정상적인 건강한 대조군 대상체에서 발견되는 반응성 산소 종(ROS) 생산 수준을 초과하는 ROS 생산 수준을 포함하는 미토콘드리아 기능 장애의 신경계 질환; 뇌 유래 신경영양 인자 관련 장애, 양극성 장애, 레트 증후군(Rett Syndrome) 및 루빈스타인-테이비 증후군(Rubinstein-Taybi Syndrome)으로부터 선택된다.
또 다른 양태로 전환하면, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서, (a) 직경이 약 50㎛ 내지 약 200㎛이고, CP 상피 세포를 포함하는 CP 세포 클러스터를 수득하기 위해 포유동물 맥락총 조직의 기계적 및 효소적 분리 중 하나 또는 둘 다에 의해 수득되는 캡슐화된 맥락총(CP) 조직 단편인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실질적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개 CP 세포를 갖는, 단계, (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 말초신경계(PNS) 주입 부위에 또는 대상체에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 PNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및 (c) 투여하는 상기 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 다수의 캡슐 중의 맥락총 조직 세포를, 맥락총 조직 세포가 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 없이 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된 수준으로 생성하도록 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료 방법이 제공된다.
특정의 다른 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서, (a) 다능성 세포 집단을 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 배양함으로써 수득되는 캡슐화된 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실직적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개 CP 세포를 갖는, 단계, (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 말초신경계(PNS) 주입 부위에 또는 대상체에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 PNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및 (c) 투여하는 상기 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 복수의 캡슐 중의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를, 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포가 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 이전에 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된 수준으로 방출하도록 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 치료 방법이 제공된다.
특정의 추가 구현예에서, 맥락총 유도제는 상기 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 없이 상기 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생산하는 수준보다 높은 수준으로 하나 이상의 CSF 성분의 생산을 유도한다.
본원에 기재된 발명 구현예의 이들 및 다른 국면은 다음 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해질 것이다. 본 명세서에서 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국(비-미국) 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공보는 모두 마치 각각이 개별적으로 인용된 바와 같이 그들의 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다. 본 발명의 국면 및 구현예는, 필요한 경우, 추가의 구현예들을 제공하기 위해 다양한 특허들, 출원들 및 공보들의 개념을 사용하도록 변형될 수 있다.
도 1은 본원에 기재된 바와 같이 선택된 알기네이트-캡슐화된 돼지 맥락총(CP) 세포를 포함하는 캡슐과 비교하여 알기네이트 캡슐화된 돼지 맥락총(CP) 세포를 포함하는 캡슐의 무작위 샘플(비선택됨)에 의한 시험관내 배양 배지로의 VEGF 분비(pg VEGF/㎍ DNA)를 도시한다.
도 2는 지시된 후보 CP 유도제에의 72시간 노출에 의해 자극된 돼지 맥락총(CP) 세포 클러스터의 전체 산화방지능(TAC)을 도시한다.
도 3(3a)은 배지 대조군 값에 대해 표준화된 지시된 농도의 염화리튬(LiCl)에의 72시간 노출에 의해 자극된 돼지 맥락총(CP) 세포 클러스터의 전체 산화방지능(TAC)을 도시한다. 도 3b는 지시된 농도의 염화리튬(LiCl), 탄산리튬, 타우린 및 미토퀴놀(MitoQ®)에의 72시간 노출에 의해 자극된 캡슐화된 돼지 맥락총(CP) 세포 클러스터의 전체 산화방지능(TAC)을 도시한다.
도 4는 선택된 알기네이트 캡슐화된 CP 세포가 12개월(도 4a) 또는 16개월(도 4b) 동안 이식한 랫트 뇌의 대표적인 조직학적 단면에서 PEDF(색소 상피 유도 인자, 작은 화살표)의 면역퍼옥시다제 염색을 도시하며, 캡슐 내의 CP 세포가 CP 기능적 특성을 유지하면서 16개월 동안 생체 내에서 생존했음을 나타낸다. 캡슐 벽(큰 화살표)은 섬유성 흉터 또는 세포 면역 반응의 어떠한 증거도 나타내지 않는다.
도 5(a-kk)는 미국 특허 공보 제US/2014/0187510호에 개시되어 있는 예시적인 베타-카테닌 활성화제를 도시한다.
도 6(a-c)은 예시적인 시험관내 CP 분화제를 도시한다.
도 7(a-j)은 CSF 성분으로서 발생할 수 있는 예시적인 CP 생성물을 도시한다.
도 8(a-k)은 유도제(LiCl)를 사용하는 72시간 동안의 노출에 의해 자극된 맥락총(CP) 세포 클러스터에서 발현이 변경된(예: 대조군에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 증가된(8a-e) 또는 감소된(8f-k)) 예시적인 CSF 성분-코딩 유전자를 도시한다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예에서 신경퇴행성 및 다른 신경학적 질환을 포함하는 신경계 질환 또는 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
이들 및 관련 구현예는 포유동물 맥락총, 특히 본원에 기재된 바와 같이 적합하게 선택된 비면역원성 캡슐화된 이종 및/또는 동종이계 맥락총(CP) 세포 함유 중추신경계 이식체가 본원에 제공된 바와 같은 맥락총 유도제와 접촉됨으로써 유도되어 변경된, 특정의 바람직한 구현예에서 증가된 수준의 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성할 수 있다는 예기치 않은 발견에 기초한다. 캡슐화된 이종이식된 (및/또는 동종이식된) 맥락총 세포는 놀랍게도 중추신경계 부위(예: 뇌 조직)로 이식 후 수명이 길고, 바람직하게는 실질적으로 인간 병원체를 함유하지 않는 공여체 포유류로부터 수득된 이종 및/또는 동종이계 맥락총 세포를 함유한다. 본 구현예는 유리하게는 필요로 하는 이식 부위 및 이식된 캡슐의 수를 감소시키면서 맥락총 이종이식체 및/또는 동종이식체의 효능 및 유효력을 증가시키고; 바람직한 구현예는 또한 수령자로의 병원체 전달 위험을 감소시킨다.
따라서, 캡슐의 조성 및 크기, 본원에 함유된 세포의 공급원, 제조 및 수, 및 CP 세포에 의한 CSF 성분 생산을 변경하는, 특정의 바람직한 CSF 성분의 경우 증가시키는 맥락총 유도체의 사용을 포함하여 본 명세서에 따라서 맥락총 세포 함유 캡슐의 적합한 선택 및 유도는 신경계 질환의 치료를 위한 CP 캡슐화에 대한 새롭고 유용한 개선을 나타내며, 이 개선은 당업계의 이전 지식으로부터 예측될 수 없었다.
본원에서 처음 개시된 바와 같이, 선택된 캡슐화된 이종 및/또는 동종이계 맥락총(CP) 세포를 맥락총 유도제와 접촉시킨 후, 하나 이상의 CSF 성분은 변경된(예: CP 유도제와의 접촉 이전 또는 부재하의 수준에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 증가되거나 감소된), 특정의 바람직한 CSF 성분의 경우, 이종이식된 및/또는 동종이식된 CP 세포가 맥락총 유도제와 접촉되지 않고 CSF 성분(들)을 생산하는 수준보다 높은 수준으로 이러한 세포에 의해 생성될 수 있다.
놀랍게도, 중추신경계(CNS)(또는 특정 구현예에서 말초신경계(PNS))에서 선택된 캡슐화된 이종 및/또는 동종이계 맥락총(CP) 세포 함유 이식체에 의한 CSF 생산의 이러한 증가된(예: 통계적으로 유의한 방식으로 비유도된 수준보다 더 높은) 수준을 유도하는 효과는 이식 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24개월 또는 그 이상의 개월 동안 실질적으로 CP 세포 함유 캡슐의 면역 거부, 캡슐 상의 숙주 세포외 기질 침착 또는 캡슐에 대한 이물질 반응과 같은 국소화된 면역학적 또는 염증성 반응의 유도 없이 반투과성 캡슐에서 생존 가능하게 잔류하는 CP 세포를 사용하여 달성할 수 있다.
특히, 본 개시는 본원에 또한 기재된 바와 같이 선택된 캡슐화된 CP 세포에 대한 본원에 제공된 바와 같은 맥락총 유도제의 직접적인 효과가 신경보호와 같은 CNS에서 유리한 결과를 갖는 특정 CSF 성분의 CP에 의한 생산 증가를 포함하여 공지된 CSF 성분(예를 들면, 도 8에 도시된 바와 같음)을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 변경한다고 처음으로 기재한다. 따라서, 증가된 CSF 생산의 유익한 효과는 본 개시에 따르는 맥락총 유도제를 사용함으로써 달성될 수 있고, 하나 이상의 CSF 성분의 변경된, 특정의 바람직한 구현예에서, 증가된 생산이 바람직할 수 있는 임의의 수의 신경계 질환 또는 장애 또는 다른 상태를 치료하는데 사용하기 위해 개발될 수 있다. 예를 들면, 예시로써 제한 없이, 본원에 개시된 구현예는 하나 이상의 CSF 성분의 정상 이하, 부적합하거나 차선의 수준 및/또는, 예를 들면, 노화 과정, 독소에의 노출, 또는 질환에 기인할 수 있는 하나 이상의 CNS 활성의 결핍을 특징으로 하고, 증가된 CSF 생산에 의해 적어도 부분적으로 회복될 수 있는 특정 CNS 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
CP 유도제
따라서, 특정 구현예에서, CSF가 CNS에서 지속적으로 생성된다는 당업계의 일반적인 이해에도 불구하고, 본 개시는 부분적으로 본원에 기재된 CP 유도제가 CP 세포를 유도하여 특정 CSF 성분의 생산을 증가시킬 수 있고, 특정의 다른 CSF 성분(예: 도 8)의 감소된 생산을 유도할 수도 있다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 이론에 결부시키고자 하지 않고, 따라서 신경보호성 성분과 같은 특정 CSF 성분의 높은 생산 수준을 촉진시키기 위해 CP 상에서 작용함으로써, 본 CP 유도제는 이러한 CP 세포의 치료적 유효량을 달성하는 것이 가능하다고 이전에 믿어졌던 것보다 적은 캡슐화된 이종 이식된 및/또는 동종 이식된 CP 세포의 이식을 허용하는 것으로 간주된다. 추가로, 비제한적인 이론에 따라서, 유도된 CP 세포 이종이식체 및/또는 동종이식체가 CSF 성분을 생산하기 때문에, 본 발명은 보다 많은 수의 CNS 이식 부위에서 보다 많은 수의 이식된 캡슐에 대한 필요성을 피하고, 또한 효과가 다른 세포 유형과의 상호 작용을 통해 중화되거나 희석될 수 있는 CP 유도제의 고용량의 전신 투여의 필요성을 피함으로써 전례 없는 효율 및 안전성을 제공한다.
추가로, 본 개시에 따라서, 뉴런에 직접 작용하여 신경 보호 효과를 갖는 것으로 이전에 간주될 수 있었던 제제가 본원에서 예기치 않게 CP 유도제로서 유리하게 작용하는 것으로 나타난다. 본원에 제공된 CP 유도제는, CP 조직 세포와 접촉될 때, CP 세포가 변경되도록(예: CP 유도제가 도입되지 않은 대조군 상황에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 증가되거나 감소되도록), 특정의 바람직한 구현예에서, 즉 CP 세포가 하나 이상의 CSF 성분의 증가된 수준(예: CP 유도제를 도입하지 않고 생성된 것들보다 통계적으로 유의한 방식으로 더 높은 수준)을 생성하도록 유도함으로써 CSF 성분 생산을 증가시키도록 유도할 수 있는 임의의 제제를 포함한다. 이어서, CSF 성분(예를 들어, 대표적인 예는 도 7 및 8에 개시되어 있다)은 뉴런에 보호 효과를 부여할 수 있고/있거나 신경계 질환을 치료하기 위한 다른 유익한 효과를 산출할 수 있다. 그러나, 현재 고려되는 구현예는 CP 세포를 CP 유도제와 접촉하는 것이, 즉 CP 세포가 하나 이상의 CSF 성분의 감소된 수준(예: CP 유도제를 도입하지 않고 생산된 것들보다 통계적으로 유의한 방식으로 더 낮은 수준)을 생산하도록 유도함으로써 CP 세포가 CSF 성분 생산을 감소시키도록 유도할 수 있고, 이에 의해 치료를 받는 대상체에게 임상적 이점을 부여할 수 있는 예상된 구현예가 또한 존재하도록 제한되는 것을 의도하지 않는다.
예를 들면, 실시예(예: 도 8)를 포함하여 본원의 다른 곳에서 보다 상세히 기술된 바와 같이, 알칼리 금속 리튬은 CP 세포가 리튬(예: 염화리튬(LiCl) 또는 탄산리튬)과 접촉되기 전에 CSF 성분을 생성하는 수준에 비해 증가된(도 8a-e) 수준으로 CP 세포가 특정의 CSF 성분을 생성하도록 유도하면서 CP 세포가 리튬과 접촉되기 전에 CSF 성분을 생성하는 수준에 비해 특정의 다른 CSF 성분의 감소된(도 8f-k) 발현을 유도하는 맥락총 유도제인 것으로 처음으로 본원에서 제시된다.
리튬은 오랫 동안 신경 보호 효과를 부여하는 제제로서 간주되어 왔지만, 이의 작용 부위 및 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다. 비제한적인 이론에 의해, 리튬은 뉴런에 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA)-수용체 매개된 칼슘 유입을 간접적으로 억제함으로써 적어도 부분적으로 글리코겐 신타제 키나제-3베타((GSK3β)의 억제제로서 작용하는 것으로 간주되고(예: Chiu et al., 2011 Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 36(6):461 (PMID 21743136); Chiu et al., 2010 Pharmacol . Ther. 128:281; Rowe et al., 2004 Expert Rev. Mol . Med. 6:1), 양극성 기분 장애를 치료하는데 있어서 이의 현재 임상적 사용뿐만 아니라 다양한 CNS 손상 및 신경퇴행성 질환을 치료를 위한 이의 제안된 사용에 기초하는 신경 보호 효과가 예상된다(Id.).
CNS에서 리튬 활성은 뉴런 및 맥락총(CP)에 의한 전해질 수송을 포함하는 CNS 전해질 수송에 대한 이의 영향과 관련되지만, CP에 의한 CSF 성분의 강화된 생산에 대한 리튬의 영향은 본원에서 처음으로 개시된 효과 이전에 인식되지 않았다. 예를 들면, 문헌(참조: Pulford et al. (2006 Neuropsychiatr . Dis . Treat. 2(4):549))은 임상적 우울증에서 검출된 감소된 트랜스티레틴 수준을 모방하는 주요CSF 성분인 트랜스티레틴의 랫트 CP에서의 리튬 유도된 하향 조절을 기재한다. 그러나, 이러한 관찰로부터, 그리고 리튬 또는 CP 조절의 신경 보호 메카니즘에 대한 일반적인 이해 부족을 고려하여, 본원에 개시된 CP 세포에 의한 특정 CSF 성분의 생산에 있어서 현재 기재된 리튬 유도된 증가는 예상되지 않았을 것이다.
따라서, 특정의 구현예는 임의의 적합한 리튬 염, 즉, 양이온성 리튬을 포함하고 독성이 없거나 최소한의 독성을 갖는 세포와 접촉될 수 있는 리튬 화합물, 예를 들면, 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 관련 분야의 숙련가에게 공지될 수 있는 임의의 다른 리튬 염을 포함할 수 있는 CP 유도제를 예상한다.
유사하게, 본원에서 제공된 다른 CP 유도제는 놀랍게도 CP 세포가 증가된 수준의 CSF 성분을 생산하도록 유도하고, 특정 구현예에 따라서, 본원에 기재된 캡슐화된 CP 이식체의 효능을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 고려된 CP 유도제는 Wnt 신호전달 경로 작동제, 베타-카테닌 활성화제, 산화방지제 및 1,25-디하이드록시비타민 D3을 포함한다. Wnt 신호전달 경로 작동제는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, WAY-316606(Bodine et al., 2009 Bone 44:1063; SFRP 억제제, 5-(페닐설포닐)-N-4-피페리디닐-2-(트리플루오로메틸)벤젠 설폰아미드 하이드로클로라이드, Cat. No. 4767 available from Tocris Bioscience, Bristol, UK), IQ1(Miyabayashi et al., 2007 Proc . Nat. Acad . Sci . USA 104:5668; PP2A 활성화제), QS11(Zhang et al., 2007 Proc . Nat. Acad . Sci . USA 104:7444; ARFGAP1 활성화제), (헤테로)아릴피리미딘 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, 노린(예: Ohlmann et al., 2012 Prog . Retin Eye Res. 31:243; Rey et al., 2010 Dev . Dyn 239:102; erratum 2010 Dev . Dyn . 239:1034; GenBank Acc. No. NM_000266), R-스폰딘-1(예: Peng et al., 013 Cell Rep. 3:1885; GenBank Acc. No. NM_001038633; NM_001242910.1), R-스폰딘-2(예: GenBank Acc. No. NM_178565; NM_178565.4; NM_001282863.1), R-스폰딘-3(예: GenBank Acc. No. NM_032784) 및 R-스폰딘-4(예: GenBank Acc. No. NM_001029871.3)를 포함한다. 예를 들면, 문헌(참조: Dodge et al., 2011 Ann. Rev. Pharmacol . Toxicol . 51:289; Chen et al., 2010 Am. J. Physiol . Gastrointest . Liv . Physiol. 299:G293; Barker et al., 2006 Nat. Rev. Dr㎍ Discov. 5:997; Meijer et al., 2004 Trends Pharmacol . Sci . 25:471; website of laboratory of Dr. R. Nusse, Stanford Univ., Palo Alto, CA at the URL: web.stanford.edu /group/nusselab/cgi-bin/wnt/smallmolecules)도 또한 참조한다.
특정의 구현예에서, 맥락총 유도제(CP 유도제)는 GSK3β 억제제, 예를 들면, 염화리튬 또는 탄산리튬과 같은 리튬 염, 또는 임의의 적합한 리튬 염, 즉 양이온성 리튬을 포함하고 독성이 없거나 최소한의 독성을 갖는 세포와 접촉될 수 있는 리튬 화합물, 예를 들면, 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 관련 분야의 숙련가에게 공지될 수 있는 임의의 다른 리튬 염일 수 있다.
특정 구현예에서, 맥락총 유도제(CP 유도제)는 SB-216763(참조: Coghlan et al., 2000 Chem . Biol . 7:793) 또는 BIO(6-브로모인디루빈-3'-옥심; Sato et al., 2004 Nat. Med. 10:55)와 같은 또 다른 GSK3β 억제제일 수 있다.
특정의 고려된 구현예에 포함되지만, 특정의 다른 고려된 구현예에서 명백하게 제외되면, 맥락총 유도제(CP 유도제)는 산화방지제, 예를 들면, 미토퀴놀(예: 10-(6'-우비퀴노일)데실트리페닐포스포늄 염, Nierobisz et al., 2010 Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol . 158(2):125, 뉴질랜드 오클랜드 주의 안티포디언 파마슈티칼스, 인코포레이티드(Antipodean Pharmaceuticals, Inc., Auckland, NZ)로부터 상표명 MITOQ®하에 이용가능, 또는 WO/05/019232, 미국 특허 제7,888,335호, WO/05/019233, 또는 미국 특허 제7,888,334호에 개시된 임의의 다른 미토콘드리아 표적화된 산화방지제), 우비퀴놀(코엔자임 Q, Wang et al., 2013 Crit Rev Biochem Mol Biol . 48(1):69), 토코페롤, 토코트리에놀(비타민 E, Traber et al., 2011 Free Radic Biol Med . 51(5):1000), α-토코페롤, γ-토코페롤, 2-아미노에탄설폰산(타우린), 아스코르브산, 글루타티온 또는 멜라토닌일 수 있다.
특정의 고려된 구현예에 포함되지만, 특정의 다른 고려된 구현예에서 명백하게 제외되면, 맥락총 유도제(CP 유도제)는 베타-카테닌 활성화제, 예를 들면, 데옥시콜산(DCA) 또는 도 5에서 본원에서 제시된 임의의 화합물일 수 있고, 이 화합물은 미국 출원 공보 제US2014/0187510호에 기재되어 있다.
특정의 고려된 구현예에 포함되지만, 특정의 다른 고려된 구현예에서 명백하게 제외되면, 맥락총 유도제(CP 유도제)는 타우린(도 3b)일 수 있다. 타우린 또는 2-아미노에탄설폰산은 아미노산 시스테인의 유도체이다. 타우린은 신경계의 발달과 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있지만(예: Gebara et al., 2015 Stem Cell Res. 14(3):369; Shivaraj et al., 2012 PLoS One 7(8):e42935; Xu et al., 2015 Neurosci Lett . 590:52; El Idrissi et al., 2013 Amino Acids 45(4):735; Jong et al., 2012 Amino Acids 42(6):2223; Schaffer et al., 2009 Can J Physiol Pharmacol . 87(2):91) Gebara et al., 2015; Shivaraj et al., 2012; Xu et al., 2015; El Idrissi et al, 2013), 본원에 제공된 CP 유도제로서 이의 활성을 포함하여 CP 기능에 대한 이의 효과는 본 개시 이전에 기재되지 않았다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 개시의 CP 유도제는 CP 세포가 하나 이상의 CSF 성분의 생산(코딩 유전자 발현, 생합성, 분비, 수출, 수송 및/또는 세포외 환경으로 방출 포함)을 CP 유도제와 접촉되지 않고 CP 세포에 의해 이러한 CSF 성분(들)의 생산 수준과 상이한(즉, 통계적으로 유의한 방식으로) 수준으로 변경하도록(예: 증가시키거나 감소시키도록, 특정의 바람직한 구현예에서, 증가시키도록) 유도하고, 이는 CP 세포와 CP 유도제를 접촉시키는 단계가 생략될 때 생산 수준보다 더 높은 수준일 것이다. 당업자는 CP 세포에 의해 생성된 CSF 성분이 다수의 정의되고 충분히 특성화된 펩티드, 단백질 및 확립된 기술 및 통상적인 방법론을 사용하여 검출될 수 있는 규정된 화학적 구조를 갖는 다른 생물학적 활성 물질(예: Redzic et al., 2005 Curr . Topics Dev . Biol . 71:1; 참조: 예를 들면, 도 7)을 포함한다는 것을 인식할 것이다.
예를 들면, 펩티드 또는 단백질인 다수의 CSF 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이러한 펩티드 또는 단백질의 코딩된 아미노산 서열에 대한 공개 데이터베이스(예: GenBank®, 국립 생명 공학 정보 센터, 국립 보건원, 메릴랜드주 베테스다) 수탁 번호는 도 7(도 7a-7j)에 제시되어 있다. 따라서, 하나 이상의 특정 CSF 성분의 CP 세포에 의한 생산의 측정은 임의의 다양한 접근법, 예를 들면, 핵산 하이브리드화 기반 기술에 의한 CSF 성분 코딩 유전자 발현의 검출, 예를 들면, CSF 성분 코딩 RNA 서열의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 증폭(예: Wang et al., 2009 Nat. Rev. Genet. 10(1):57); 및/또는 프로브 서열 어레이에 존재하는 상보성 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열로 CSF 성분 코딩 RNA 또는 cDNA 하이브리드화(예: GENECHIP® arrays, Affymetrix, Santa Clara, CA); 및/또는 RNA 서열분석(또는 "RNA-seq", 예를 들면, 합성(SBS) 화학에 의한 일루미나 서열분석을 사용하는 차세대 서열분석(NGS), Illumina, Inc., San Diego, CA)(참조: Bentley et al., 2008 Nature, 456:53); 및/또는 동일 반응계 하이브리드화(예: Yin et al., 1998 Brain Res. 783:347; Swanger et al., 2011 Meths . Mol . Biol . 714:103) 또는 본원에 제공된 임의의 CSF 성분(예: 도 7 및 8)을 코딩하는 임의의 하나 이상의 RNA 서열 또는 이들의 상응하는 DNA 서열의 모두 또는 일부와 같은 특정 핵산 서열의 존재를 측정하기 위한 당업계에 공지된 다른 핵산 검출 기술에 의해 달성될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 하나 이상의 특정 CSF 성분(예: 도 7 또는 도 8)의 CP 세포에 의한 생산의 측정은 이러한 CSF 성분을 포함하는 펩티드 또는 단백질, 관련 전해질, 또는 대사산물 또는 이화생성물의, 예를 들면, 특정의 면역화학적, 생화학적 또는 방사성화학적 검정에 의해 또는 다른 검출가능한 지시제 잔기를 통한 검출, 액체 크로마토그래피 및/또는 질량 분석법(예: Holtta et al., 2015 J. Proteome Res. 14:654; Chiasserini et al. 2014 J. Proteomics 106:191; Naureen et al., 2014 Childs Nerv . Syst. 30:1155; Davidsson et al., 2005 Dis . Markers 21:81; Aluise et al. 2008 Biochim . Biophys . Acta 1782:549; Bonk et al., 2001 Neuroscientist 7:6; Casado et al., 2014 Electrophoresis 35:1181)에 의해, 기능적 자기 공명 이미징(fMRI, 예: Jasanoff, 2007 Curr . Opin . Neurobiol . 17:593; Bell et al., 2000 Gene Therap. 7:1259) 등에 의해 또는 다른 적용가능한 검출 기술에 의해 달성될 수 있다. CSF 성분은 또한, 예를 들면, 문헌(참조: R.A. Fishman, Cerebrospinal Fluid in Diseases of the Nervous System, W.B. Saunders, Philadelphia, PA, 1980; Cutler et al., 1982 Ann. Neurol. 11:1; and Hershey et al., 1980 Ann. Neurol. 8:426)에 기재되어 있다.
CSF 성분
뇌척수액(CSF)은 다중 전해질 수송 채널을 보유하는 기저 외측 및 정점 막 도메인으로의 분극화 및 구성적 CSF 분비 활성이 주목할 만한 뇌실막을 라이닝하는 전문화된 뇌실막 세포인 맥락총 상피 세포에 의해 중추신경계(CNS)에서 생산된다. CSF는 다양하게 다수의 성장 인자, 화학 주성 인자, 샤프론 단백질, 아포지단백질, 면역글로불린, 헤모글로빈, 효소, 디펜신, 히스톤, 케라틴 및 다른 세포 골격 관련 단백질을 포함하여 전해질, 산화방지제, 대사산물, 매개체 및 단백질을 제한 없이 포함할 수 있는 CSF 분자 성분의 복잡한 혼합물을 포함한다.
CSF 프로테옴을 포함하는 CSF 조성물은 광범위하게 특성화되었고, 다양한 병리와 관련된 바이오마커가 기재되었다(예: Bora et al., 2012 J. Proteome Res. 11:3143; Whitin et al., 2012 PLoS One 7(11):e49724; Perrin et al., 2013 PLoS One 8(5):364314; Naureen et al., 2013 Fluid Barriers CNS 10:34; Fraisier et al., 2014 PLoS One 9(4):e93637).
따라서, 하나 이상의 CSF 성분의 정량적 표현에서 관련된 변경(예: 통계적으로 유의한 증가 또는 감소)의 검출은, 예를 들면, 인간 또는 동물 조직으로부터 수득된 CSF를 함유하고 또한 CSF를 생성할 수 있고 CSF 또는 하나 이상의 CSF 성분을 생산하기 위한 조건하 및 충분한 시간 동안 시험관내에서 유지된 세포(예: CP 세포) 또는 조직(예: CP 조직 또는 조직 단편)으로부터 상청액 또는 조절된 배양 배지 등을 포함하는 생물학적 샘플에서 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 그리고 본 개시를 고려하여, CP 유도제에 의한 유도에 반응하여 CP 조직 세포에 의한 하나 이상의 CSF 성분의 변경된(예: 적절한 대조군에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 증가되거나 감소된), 특정의 바람직한 CSF 성분의 경우, 증가된 생산은 기존의 방법론의 사용을 통해 통상적으로 결정될 수 있다.
특정 구현예에 따라서, 본원에 제공된 맥락총 유도제는 CP 조직 세포 또는 시험관내 분화된 CP 세포가 다음 중의 하나 이상을 포함하고, 도 7 및/또는 8에 제시된 CP 생성물 및/또는 CSF 성분과 같은 하나 이상의 CSF 성분의 변경된(예: 대조군에 비해 통계적으로 유의한 방식으로 증거되거나 감소된), 특정의 바람직한 구현예에서, 증가된 수준을 생산하도록 유도할 수 있음이 고려된다:
IGF-1, IGF-II, FGF-1, bFGF(FGF-2), FGF-9, FGF-12, FGF-18, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C/VEGF-2, EGF, 성장 호르몬(GH), BMP-1, BMP-2, BMP-4, BMP-7, BMP-11, BMP-15, GDF-1, GDF-7, GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, 신경 성장 인자(NGF), PEDF(색소 상피 유도 인자, SerpinF1로 공지되기도 함), 글루카곤형 펩티드-1(GLP-1), IGF2, BDNF, NT-3, NT-4, GDF-15, GDNF, 결합 조직 성장 인자(CTGF), 악소트로핀, 헤파린 결합 EGF형 성장 인자(HB-EGF), 혈소판 유도 성장 인지-알파(PDGF-α), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 또는 신경 돌기 성장-촉진 인자-2/미드카인(NEGF2)일 수 있는 성장 인자;
세룰로플라스민, 슈퍼옥사이드 디스무타제-1(SOD-1), 슈퍼옥사이드 디스무타제-2(SOD-2, Mn형), 슈퍼옥사이드 디스무타제 구리 샤프론(CCS), DJ-1/PARK7, 카탈라제, 셀레노단백질(I, M, N, P, S, T, W, X, 15kDa), 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 mu 2(근육), 글루타티온 리덕타제, 글루타티온 퍼옥시다제, 하이드록시아실 글루타티온 하이드롤라제 또는 티오레독신일 수 있는 CSF 산화방지제;
폐포 마크로파지-유래 화학 주성 인자-I(AMCF-I), AMCF-II, 간질 세포-유래 인자-2, 케모카인(CXC 모티프) 리간드 2, 케모카인(예: CCL8, CCL16, CCL19, CCL21, CCL25, CXCL2, CXCL4, CXCL9, CXCL12, CXCL13, CXCL14), 케모카인(CXC 모티프) 수용체-2, 케모카인(CXC 모티프) 수용체-4, 케모카인형 인자 슈퍼 패밀리(예: CKLF-3, -6, -7) 또는 신경 돌기 성장-촉진 인자-2/미드카인(NEGF2)일 수 있는 화학 주성 인자; 및/또는
트랜스티레틴, 리포칼린형 프로스타글란딘 D 신타제/β-트레이스(L-PGDS), 아포지단백질(예: 아포지단백질 A, B, C, D, E, H, J, M, N, O, 또는 R), 리포칼린-6, 리포칼린-7, 리포칼린-15, 시스타틴 B, 시스타틴 C, 시스타틴 EM, 시스타틴 11, 열 충격 단백질(HSP) 계열 구성원, 또는 DJ-1/PARK7일 수 있는 샤프론 단백질.
임의의 제시된 CSF 성분은 본원에 개시된 아미노산 서열(예: 수탁 번호에 의해 또는 본원에 참고로 인용되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 참조 공보에서의 개시에 의해, 등)을 갖는 것으로 발생될 수 있거나, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 서열(예: 수탁 번호에 의해 또는 본원에 참고로 인용되거나 당업자에게 공지된 바와 같은 참조 공보에서의 개시에 의해, 등)에 의해 코딩될 수 있고, 또한 임의의 제시된 CSF 성분이 아미노산 서열을 가질 수 있거나, 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열(예: 수탁 번호에 의해 또는 참조 공보 중의 개시에 의해, 등)에 각각 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다는 것이 이해될 것이다(참조: Stevens et al., 2005 J Mol Recognit 18(2):150). 이와 관련하여, 본원에 개시된 서열(예: 수탁 번호 등에 의해)에 100% 미만 동일한 CSF 성분 또는 코딩 서열은 그 때문에 변이체로서 고려되고, 여기서 이러한 변이체는 축적되거나 획득된 돌연변이의 생산물, 대립유전자 변이, 번역후 또는 전사후 처리, 번역 또는 전사 오류 등으로부터 생성될 수 있다. 동종이계 또는 이종 조직이 CP 세포의 공급원인, 예를 들면, 본원에 개시된 CSF 성분의 동종이계 또는 이종 동족체가 본원에 개시된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열(예: 수탁 번호 등에 의해)에 각각 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 동일할 수 있는 변이체도 또한 고려된다.
폴리펩티드(아미노산) 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 때, 두 서열 중의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 서열이 이하 기재된 바와 같이 최대 일치를 위해 정렬될 때 동일하다면 두 서열은 "동일하다"고 간주된다. 두 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부적 영역을 동정하고 비교하기 위해 비교 창에 대해 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에 사용되는 "비교 창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 서열이 동일한 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교될 수 있는 적어도 약 20개의 연속 위치, 일반적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 세그먼트를 의미한다.
비교용 서열의 최적의 정렬은 기본 매개 변수를 사용하여 bioinformatics 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)의 Lasergene™ 스위트 중의 Megalign™ 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 다음 참조 문헌에 기재된 다수의 정렬 계획을 구현한다: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345; Hein J., 1990 Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626; Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989 CABIOS 5:151; Myers, E.W. and Muller W.,1988 CABIOS 4:11; Robinson, E.D., 1971 Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, 1987 M., Mol . Biol . Evol. 4:406; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.,1973 Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J.,1983 Proc . Natl . Acad ., Sci . USA 80:726.
대안적으로, 비교용 서열의 최적의 정렬은 문헌(참조: Smith and Waterman, 1981 Add. APL . Math 2:482)의 국부적 동일성 알고리즘, 문헌(참조: Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol . Biol. 48:443)의 동일성 정렬 알고리즘, 문헌(참조: Pearson and Lipman,1988 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85: 2444)의 유사성 방법을 위한 검색, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화 구현(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 중의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사에 의해 수행될 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 각각 문헌(참조: Altschul et al.,1977 Nucl . Acids Res. 25:3389) 및 문헌(참조: Altschul et al., 1990 J. Mol . Biol. 215:403)에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 두 개 이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위해, 예를 들면, 본원에 기재된 매개변수와 함께 사용될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수 가능하다.
하나의 예시적인 예에서, 누적 점수는 뉴클레오티드 서열의 경우, 매개변수 M(매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수: 항상 >0) 및 N(불일치 잔기의 패널티 점수: 항상 <0)을 사용하여 계산될 수 있다. 누적 정열 점수가 최대 달성 값으로부터 양 X만큼 떨어지면, 각 방향에서 단어 히트의 확장이 중단되고; 누적 점수는 하나 이상의 음성 점수 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하가 되거나; 두 서열 중 하나의 말단에 도달한다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 기대 값(E) 10, 및 BLOSUM62 점수 매트릭스(참조: Henikoff and Henikoff, 1989 Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915) 정렬, (B) 50, 기대 값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
대안적으로, RNA 서열 분석으로부터 수득된 서열(예: RNA-seq, 상기 및 실시예에 기재됨)은 참조 게놈에 정렬된다. 예를 들면, 각 샘플에 대한 RNA 서열 판독치는 RNA-seq 판독치를 참조 게놈으로 정렬하기 위한 Tophat(v2.0.13) 소프트웨어, 조립된 전사체를 생성하기 위해 Tophat에 의해 매핑된 판독치를 잠재적인 전사물로 조립하기 위한 CuffLinks 소프트웨어, 및 둘 이상의 상이한 생물학적 조건으로부터 조립된 판독치를 수용하고 그들을 상이한 조건(예: 유도된 조건 대 대조군 조건)하에 유전자 및 전사물의 시차 발현에 대해 분석하기 위한 CuffDiff 소프트 웨어을 사용하여 참조 게놈에 매핑시킬 수 있다(예: Ensembl Sscrofa10.2, and Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), Samborski et al., Transcriptome changes in the porcine endometrium during the preattachment phase, 2013 Biol Reprod. 2013 Dec 12;89(6):134); Dennis et al., DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery, 2003 Genome Biol . 4(5):P3; Huang et al., DAVID Bioinformatics Resources: expanded annotation database and novel algorithms to better extract biology from large gene lists. 2007 Nucleic Acids Res. 2007 Jul; 35(Web Server issue):W169-75; Huang et al., Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources, 2009 Nat Protoc . 2009;4(1):44-57). (예를 들면, 문헌(참조: Ghosh et al., Analysis of RNA-Seq Data Using TopHat and Cufflinks. 2016 Methods Mol . Biol . 2016;1374:339-61)을 참조한다). 라이브러리 표준화를 위해, 다양한 교차-복제 분산 추정 방법(예: 풀링, 조건별, 블라인, 또는 포아송 방법, 참조: 예를 들면, http website: //cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffdiff/#library-normalization-methods)과 조합된 다양한 방법, 예를 들면, 클래식-fpkm, 기하학적, 사분위수 또는 다른 방법이 적용될 수 있다(참조: 예를 들면, http website: //cole-trapnell-lab.github.io/ cufflinks/cuffdiff/ #library-normalization-methods).
비제한적인 예시적 예로써, 시차 발현 유전자(DEG)는 Cuffdiff 소프트웨어 프로그램으로부터 'gene_exp.diff' 출력을 사용하여 동정될 수 있다. 대조군과 '유도된' 샘플 사이의 DEG를 검출하기 위해, 두 개의 여과 과정을 적용할 수 있다. 먼저, Cuffdiff 상태 코드를 사용하여 각 샘플에서 "OK" 상태만 갖는 유전자가 수득된다. 상태 코드 'OK'는 각 조건이 발현 수준의 신뢰가능한 계산을 위한 유전자좌에 충분한 서열 판독치를 함유하고, 시험이 그 샘플에서 유전자 발현 수준을 계산하는데 성공적이었음을 나타낸다. 두 번째 여과의 경우, 발현 수준의 2배 변화가 계산되고, 비교되는 샘플(대조군 대 유도됨) 사이에 2배 이상의 변화를 나타내는 유전자만이 선택된다. 존재론 분석을 위해, 선택된 유전자 리스트는 포괄적인 일련의 기능적 주석을 수득하기 위해 DAVID 소프트웨어(Huang et al. 2009 Nat Protoc . 2009;4(1):44-57; Huang et al. 2007 Nucleic Acids Res. 2007 35(Web Server issue):W169-75; Dennis et al., 2003 Genome Biol . 4(5):P3)에 적용된다. 유전자 질환 관련, 상동체 일치, 유전자 존재론 또는 경로 카테고리 등과 같은 카테고리가 선택될 수 있다. 이어서, DAVID는 주석 용어 및 그들의 관련 유전자를 나열하는 기능적 주석 챠트를 생성한다.
특정의 구현예에서, "서열 동일성의 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 창에 대해 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 창 중의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 부분은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 추가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은, 동일한 아미노산 잔기 또는 핵산 염기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참조 서열중의 총 위치 수(즉, 창 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
유전자 코드의 퇴화의 결과로서, 본원에 기재된 바와 같은 특정 CSF 성분 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 다수의 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중의 일부는 본원에 개시된 아미노산 서열을 갖는 CSF 성분 폴리펩티드를 코딩하는 원래의 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 최소한의 서열 동일성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 개시에 의해 명백하게 고려된다. 특정의 구현예에서, 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화된 서열이 구체적으로 고려된다.
CP 세포 공급원
현재 개시된 구현예는 CNS에 투여하기 위한 치료적 이종 및/또는 동종이계 CP 세포를 함유하는 개선된 생체적합성, 비면역원성, 반투과성 알기네이트 캡슐에 관한 것이다. 특정의 구현예에서, CP 이종이식에 관한 이전의 교시를 변형시킴으로써, CP 조직 단편이 제조될 수 있고, CP 세포 함유 캡슐이 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이 선택될 수 있다. 이러한 캡슐의 제조 및 사용을 위한 일반적인 방법론은, 예를 들면, US6322804, US5834001, US6083523, US2007/134224, US5869463, US2004/213768, US2009/0214660 및 US2009/0047325에 기재되어 있다. CNS 질환의 치료를 위한 생체적합성 캡슐 내의 이종 맥락총 조직 단편의 뇌에서의 이식은, 예를 들면, US2007/134224, US2004/213768, US2005/0265977, US6083523, 및 US2009/0047325 및 관련 특허 출원 공보에 기재되어 있다. US2009/0047325는 이종 이식을 위한 신생아 CP 세포의 예시적인 제조를 기재한다.
그러나, CP 조직 및/또는 CP 세포의 생물학적 공급원과 관련하여, 본 구현예는 포유동물 맥락총 조직이 치료적 이종 CP 세포를 함유하는 본원에 기재된 선택되고 유도된 생체적합성, 비면역원성 반투과성 알기네이트 캡슐로 치료되는 대상체에 비해 이종인 포유류로부터 수득될 수 있는 현재 고려된 구현예가 또한 존재하도록 그렇게 제한되는 것을 의도하지 않는다. 따라서, CP 조직은 돼지, 양, 소, 염소, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특정의 다른 구현예에서, CP 세포는 치료를 받는 대상체에 동종인 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있고, 예를 들면, 공급원은 대상체와 동일한 종의 비유전적으로 동일한 개체로부터의 조직일 수 있다.
특정의 예시적인 구현예에서, CP 세포로 분화할 수 있는 동종이계 또는 이종 다능성 세포는 복수의 시험관내 분화된 CP 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 시험관내에서 배양될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포(ESC)로부터의 인간 CP 세포 및 뮤린 ESC로부터의 마우스 CP 세포의 시험관내 생성을 위한 조건은, 예로써, 문헌(참조: Watanabe et al., 2012 J. Neurosci . 32(45):15934 and Sternberg et al., 2014 Regen Med 9(1):53)에 기재되어 있다. 이들 및 관련 구현예에 사용하기 위한 다능성 세포는 배아 줄기 세포, 배아 줄기 세포 유래된 클론 배아 전구체 세포주, 신경관 전구체와 같은 배아 세포를 포함할 수 있고/있거나 제대 세포, 태반 세포, 치과용 펄프 세포, 성체 조직 줄기 세포 및/또는 체세포 조직으로부터의 간엽 줄기 세포와 같은 하나 이상의 비배아 세포를 또한 포함할 수 있고, 제조 방법은 당업자에게 공지될 것이다(예: Loeffler et al., 2002 Cells Tissues Organs 171(1):8-26).
이들 및 관련 구현예에서, 다능성 세포는 도 6(도 6a-6c)에 개시된 임의의 시험관내 CP 분화제와 같은 하나 이상의 시험관내 CP 분화제를 포함하는 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 다능성 세포는 상기한 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 하나 이상의 골 형태형성 단백질(BMP) 또는 BMP 신호전달 경로 작동제, 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 슈퍼패밀리 구성원 또는 TGF-β 신호전달 경로 작동제, 포유동물 성장 및 분화 인자(GDF) 또는 GDF 신호전달 경로 작동제, VEGF, Wnt 단백질 리간드 또는 Wnt 신호전달 경로 작동제, 소닉 헤지혹(Shh), Shh 신호전달 경로 작동제(예: 합성 소분자 작동제, 예를 들면, 푸르모르파민 및/또는 SAG, 참조: Stanton et al. 2009 Mol . BioSyst 6:44), 및 섬유아세포 성장 인자(FGF) 또는 FGF 신호전달 경로 작동제를 포함하는 배양 배지에서 배양할 수 있다(참조: 예를 들면, Watanabe et al., 2012 Jl . Neurosci . 32(45):15934; Sternberg et al. 2014, Regen Med, 9(1):53; see also, e.g., Ward et al. 2015 Neuroscience S0306-4522(15)00415; Liddelow, 2015 Front. Neurosci. 9 (32):1); Huang et al. 2009 Development 340(2):430); Schober et al., 2001 J Comp Neurol 439(1):32).
예를 들면, Wnt 신호전달 경로 작동제는 하나 이상의 WAY-316606(SFRP 억제제, 5-(페닐설포닐)-N-4-피페리디닐-2-(트리플루오로메틸)벤젠 설폰아미드 하이드로클로라이드, Bodine et al., 2009 Bone 44:1063), IQ1(PP2A 활성화제, Miyabayashi et al., 2007 Proc . Nat. Acad . Sci . USA 104:5668), QS11(ARFGAP1 활성화제, Zhang et al., 2007 Proc . Nat. Acad . Sci . USA 104:7444), (헤테로)아릴피리미딘 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐) 피리미딘, 노린(예: Ohlmann et al., 2012 Prog . Retin Eye Res. 31:243; Rey et al., 2010 Dev . Dyn 239: 102; erratum 2010 Dev . Dyn . 239:1034; GenBank Acc. No. NM_000266), R-스폰딘-1(예: Peng et al., 013 Cell Rep. 3:1885; GenBank Acc. No. NM_001038633; NM_001242910.1), R-스폰딘-2(예: GenBank Acc. No. NM_178565; NM_178565.4; NM_001282863.1), R-스폰딘-3(예: GenBank Acc. No. NM_032784) 및 R-스폰딘-4(예: GenBank Acc. No. NM_001029871.3)를 포함할 수 있다. Wnt 신호전달 경로 작동제는 또한 특정 구현예에서 임의의 적합한 리튬 염, 즉, 양이온성 리튬을 포함하고 독성이 없거나 최소한의 독성을 갖는 세포와 접촉될 수 있는 리튬 화합물, 예를 들면, 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 관련 분야의 숙련가에게 공지될 수 있는 임의의 다른 리튬 염을 포함할 수 있다.
특정의 다른 바람직한 구현예는 치료를 받는 대상체에 대해 이종인 조직으로부터 제조된 캡슐화된 맥락총 조직 단편을 고려한다. 예를 들면, 인간의 치료를 위해, 이종 캡슐화된 CP 세포가 비-인간 공급원, 바람직하게는 비-인간 포유동물 공급원으로부터 수득될 수 있다고 생각된다. 이러한 특정의 구현예에서, 본원에 기재된 반투과성 생체적합성(예: 알기네이트) 캡슐에 캡슐화된 CP 세포를 함유하는 CP 조직의 비-인간 포유동물 공급원은 돼지 조직일 수 있다. 특정의 추가 구현예는 본 방법에서 사용하기 위해 캡슐화되어야 하는 CP 세포의 공급원으로서 신생아 돼지 CP 조직에 관한 것이고, 여기서 "신생아"는 출생 직후부터 3개월까지의 임의의 시점에서 수득된 조직을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
본 개시의 특정 구현예에 따라서, 실질적으로 인간 병원체를 함유하지 않는, 특히 실질적으로 인간-지향 전염성 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV)를 함유하지 않을 수 있는 태아 또는 신생아 CP 조직(예: 태아 또는 신생아 돼지 CP 조직)의 사용으로부터 유도되는 놀라운 이점이 또한 제공된다. "실질적으로 함유하지 않는"은 인간 병원체를 검출하기 위한 통상적인 수단 또는 인간-지향 전염성 PERV를 검출하기 위한 통상적인 수단이 통계적으로 유의한 방식으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 정도의 신뢰도로 이러한 병원체 또는 PERV를 검출하는데 실패한 상황을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이와 관련하여, PERV는 돼직 조직과 세포를 이러한 이식에 충분히 적합하도록 하는 많은 특성에도 불구하고 돼지 조직과 세포를 인간에게 이종이식용으로 사용하는데 동반되는 심각한 건강 및 안전성 위험을 나타낸다. 특히, 이식용으로 사용되는 돼지 공여체 세포에 존재할 수 있는 PERV는 인간 세포를 감염시킬 수 있다(참조: Fishman, 1998 Ann. NY Acad . Sci . 862:52; Elliott et al., U.S. 8,088,969; Park et al., 2008 J. Microbiol . Biotechnol . 18:1735; Hector et al. 2007 Xenotransplant . 14:222). 대조적으로, 뉴질랜드 오클랜드 섬에서는 정의된 기준의 세트에 의해 병원체를 함유하지 않는 것으로 나타났고, 인간 세포를 감염시키는 PERV의 능력과 이전에 관련된 전장 PERV-C 유전자좌가 그들의 게놈으로부터 누락된 사육 돼지(Sus scrofa domesticus)의 집단이 동정되었다(참조: Garkavenko et al., 2008 Cell Transplant. 17:1381; Hector et al. 2007 Xenotransplant . 14:222). 병원체를 함유하지 않는 동물에는 PERV-A env 유전자와 재조합될 수 있는 PERV-C env 유전자가 결여된 돼지의 하위집합이 포함된다(Id.).
따라서, 본 개시의 특정의 구현예의 실시에 있어서, 본원에 기재된 바와 같이 선택되고, 투여되고 유도된 반투과성 생체적합성 캡슐에 존재하는 CP 세포의 이종 조직 공급원은 실질적으로 인간 지향성 PERV를 함유하지 않는 태아 또는 신생아 돼지 CP 조직을 포함할 것이다. 특정의 추가 구현예에서, CP 조직은 PERV-A env 유전자와 재조합될 수 있는 PERV-C env 유전자가 결여되거나, 확립된 유전자 편집 기술, 예를 들면, Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9 편집(예: Jinek et al., 2012 Science 337:816; Doudna et al., 2014 Science 346:1258096)을 사용하여 임의의 또는 모든 PERV 유전자가 결여되도록 유전자 조작된 동물로부터 수득된다.
CP 제조 및 캡슐화
일반적으로, 현재 개시된 특정 구현예를 실시하는데 사용될 수 있는 물질, 방법 및 기술은 본원에 기재된 개선점을 맥락총 조직 및 세포 제제, 알기네이트 캡슐 등과 같은 반투과성 생체적합성 캡슐, 및/또는 모두 참고 문헌으로 인용되었지만, 개별적으로 또는 임의의 조합으로 현재 개시된 조합에 따르는 개선점을 교시하거나 시사하지 못하는 다음 공보 중 하나 이상에서 발견될 수 있는 캡슐의 뇌 이식을 포함하는 CNS 투여에 관한 교시의 적용에 통함함으로써 달성될 수 있다: Elliott and colleagues(예: US 2009/0047325; US 8,129,186), Vasconcellos et al.(예: US 2009/0214660), Dionne et al.(예: US 6,322,804; US 6,083,523), Major et al.(예: US 5,753,491), Monuki et al.(예: US 8,748,176; 참조: Watanabe et al., 2012 Jl . Neurosci . 32(45):15934) 및/또는 US 2007 /0134224 (Harlow et al.), US 4,892,538 (Aebischer et al.) 및/또는 US 2012/0003190 (Yamoah et al.).
본원에 처음으로 개시된 특정의 바람직한 구현예에 따라서, 놀랍게도 현재 인용된 치료 방법에 따라 캡슐화된 CP 조직 단편 및/또는 시험관내 분화된 CP 세포인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐(예: 알기네이트 캡슐)을 선택하는 단계를 포함함으로써 특정 이점이 수득될 수 있다는 것이 발견되었다.
구체적으로, 그리고 본 개시 이전에 예측할 수 없었던 방식으로, CNS 부위에 투여될 캡슐의 치수 및 각 캡슐에 함유된 CP 세포의 수는 세포당 기준으로 캡슐화된 세포에 의한 세포 CSF 성분 생산 수준에 기여한다. 직관적으로, 비제한적인 이론에 따라서 CP 유도제에 의한 유도 후 세포당 CSF 성분을 포함하여 세포당 증가된 CSF 성분 생산은 간단하게 그리고 각 캡슐에 존재하는 세포의 수에 직접적으로 비례하지 않지만, 대신 약 400㎛ 내지 약 800㎛의 직경을 갖도록 선택되고, 전형적으로 약 1㎕ 미만의 내부 용적으로 갖고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개 세포를 함유하는 캡슐을 사용하여 달성되는 것으로 밝혀졌고, 여기서 "약"은 50% 미만, 더욱 바람직하게는 40% 미만, 더욱 바람직하게는 30% 미만, 더욱 바람직하게는 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만으로 인용된 양보다 많거나 적을 수 있는 정량적 변화를 나타내는 것으로 이해될 수 있다.
따라서, 특정의 바람직한 구현예에서, 각각 적어도 약 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500 또는 9000개 및 약 10,000개 이하의 CP 세포를 함유하는 반투과성 생체적합성 캡슐이 선택된다. 특정의 바람직한 구현예에서, 각각 적어도 약 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 또는 7500개 및 약 8000개 이하의 세포를 함유하는 캡슐이 선택된다.
특정의 바람직한 구현예에서, 약 400㎛ 내지 약 800㎛, 약 500㎛ 내지 약 700㎛, 약 450㎛ 내지 약 750㎛, 또는 약 400㎛ 내지 약 700㎛의 직경을 갖고, 전형적으로 각각 약 1㎕ 미만의 내부 용적을 갖는 반투과성 생체적합성(예: 알기네이트) 캡슐이 제조될 수 있다.
선택은 당업자가 친숙한 임의의 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 그리고 인용된 참고 문헌에 기재된 확립된 방법에 따라서 제조된 반투과성 생체적합성 캡슐은 현미경하에 가시화될 수 있고, 현미 조작기, 마이크로 바늘, 마이크로모세관 피펫, 패치-클램프 장치 등을 사용하여 포함된 용적의 세포(예: 실험적으로 확립된 일관된 캡슐 점유율 및/또는 착색법 또는 DNA 결합 염료 등과 같은 비색계 또는 형광성 마커를 사용함으로써)에 의한 교정된점유율에 따라서 수동적으로 선택된다. 대안적으로, 대형 입자 유동 선별기(예: COPAS™ FlowPilot™ 플랫폼, Union Biometrica Inc., Holliston, MA, USA), 입자 크기 분석기, 디지털 이미지 분석기, 유동 세포 분석기 등과 같은 자동화된 장치가 캡슐화된 CP 세포를 함유하는 반투과성 생체적합성 캡슐의 제제를 처리하는 데 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, "캡슐화된" CP 조직 단편 및/또는 시험관내 분화된 CP 세포인 본 발명의 반투과성 생체적합성 캡슐은 가시적 현미경 검사시, 캡슐의 외부 표면에서 검출가능한 세포 또는 세포의 부분을 실질적으로 나타내지 않고, 캡슐 내부로부터 캡슐 표면으로 돌출하는 세포 또는 세포의 부분을 실질적으로 나타내지 않는 캡슐을 포함한다.
비제한적인 이론에 따라서, 캡슐 직경, 캡슐화된 CP 세포의 수, 및 캡슐 내부로부터 외부 캡슐 표면으로 돌출하는 세포 또는 세포의 부분으로부터를 포함하는 세포 또는 세포의 부분으로부터 캡슐 외부 표면의 실질적인 자유도의 현재 기재된 기준에 따르는 선택은 유리하게는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 포유동물 대상체의 뇌조직에서의 이식과 같은, 대상체의 중추신경계(CNS) 부위로 캡슐의 투여 또는 이식 후 검출가능한 조직 거부(예: 면역 거부) 또는 염증성 반응(예; 이물질 반응)을 거의 또는 전혀 유발하지 않는 캡슐을 초래하는 것으로 간주된다. 추가로, 본 방법에 따라 생체내 CNS 부위에 이식함으로써 대상체에게 투여되는 캡슐화된 CP 세포는 놀랍고 예기치 않은 수명을 나타내고, 반투과성 생체적합성(예: 알기네이트) 캡슐에서 이식 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 24개월 또는 그 이상의 개월 동안 실질적으로 CP 함유 캡슐의 면역 거부, 캡슐 상의 숙주 세포외 기질 침착 또는 캡슐에 대한 이물질 반응과 같은 국소화된 면역학적 또는 만성 염증성 반응을 유도하지 않고 생존할 수 있다. 따라서, 특정의 구현예에서, 캡슐은 투여 과정에서의 이식 후 CNS 부위에서 만성 염증을 유발하지 않고/않거나 대상체에게 면역억제제(예: Craft et al., 2005 Exp . Opin . Ther . Targets 9:887; Jha et al., 2014 Recent Pat. Inflamm . Allergy Dr㎍ Discov. 8:118; Bellavance et al., 2014 Front. Immunol . 5:136; Lossinsky et al., 2004 Histol . Histopath . 19:535, 및 본원에서 인용된 참고 문헌)의 투여는 CNS 부위에서 캡슐의 면역학적 거부를 개선시키는 데 필요하지 않다.
또한, 본원에 개시된 바와 같이 선택된 반투과성 생체적합성(예: 알기네이트) 캡슐의 작은 밀폐 용적은 캡슐화된 CP 세포 이식체의 제조 및 전달에서의 효율 및 경제성을 허용하고, 본원에 기재된 CP 유도제와의 접촉 단계에 의해, 이식 부위에서 최소 조직 공간을 차지하면서 뇌 조직에 강력한 CSF 공급원을 전달하여 투여 단계에 수반되는 조직 파괴의 양을 최소화하는 능력을 추가로 제공한다.
신경계 장애
당업자는 본원에 기재된 캡슐화된 CP 세포 조성물의 임상적 적합성을 나타낼 수 있고/있거나 투여에 적용할 수 있는 임의의 수의 진단, 수술 및/또는 다른 임상 기준에 친숙할 것이다. 문헌(참조: 예를 들면, Sontheimer, Diseases of the Nervous System, 2015 Academic Press/Elsevier, Waltham, MA; ”Neurologic Disorders” in The Merck Manual of Diagnosis and Therapy 19th Ed.(R.S.Porter,Ed.,2011,Merck,Inc.,NJ);“Neurological Diagnostic Tests and Procedures”at the website of the National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Bethesda, MD, www.ninds.nih.gov/disorders/misc/diagnostic_tests.htm;Neurology in Clinical Practice Vol. II, 4th Edition, Bradley et al., (Eds), 2004 Butterworth Heinemann/Elsevier, Philadelphia, PA; Non-Neoplastic Diseases of the Central Nervous System (Atlas of Nontumor Pathology- First Series Fascicle), D.N. Lewis et al., (eds.), 2010 Amer. Registry of Pathology, Annapolis Junction, MD; Bradley’s Neurology in Clinical Practice (6thEd.), R.B. Daroff et al. (eds.), 2012 Saunders/Elsevier, Waltham, MA)을 참조한다. 따라서, 신경계 장애 또는 질환을 갖거나 갖고 있는 것으로 의심되는 환자의 진단 및 임상 모니터링을 위한 기준은 당업자에게 익히 공지되어 있다.
따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 대상체가 갖는 존재 또는 위험이 숙련된 임상의에게 명백해지는 광범위한 신경계 질환에서 유익한 용도를 찾을 수 있다는 것이 고려된다. 따라서, 본원에서 밝혀진 교시에 따라서 치료되는 신경계 질환의 비제한적인 예에는, 예를 들면, 파킨슨병, 다계통 위축-파킨슨 유형, 다계통 위축-소뇌형, 진행성 핵상 마비, 루이소체 치매, 본태성 진전, 약물 유래 파킨슨증, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 프리온병, 운동 뉴런 질환, 척수소뇌성 운동 실조증, 척수성 근위축증, 뇌졸중, CNS 외상, 간질을 포함하는 발작 장애와 같은 정적 신경 질환; 노화 및 치매와 관련된 것들을 포함하는 진행성 신경퇴행성 질환, 예를 들면, 알츠하이머병, 파킨슨병 등; 운동 뉴런 및 신경근 접합부의 질환; 헌팅톤병; 다발성 경화증; CNS 종양, 특히 신경아세포종, 신경아교종, 성상 세포종을 포함하는 뇌 종양; 수막염, 보툴리누스 중독, 파상풍, 신경매독, 회색질척수염, 광견병, HIV/AIDS, 프리온병, 네글레리아 파울러리(Naegleria fowleri)(아메바성 뇌 감염)을 포함하는 신경계의 감염성 질환; 뇌유낭미충증(neurocysticerosis); 우울증, 기분 장애를 포함하는 신경정신병 질환; 강박성 장애, 정신분열증; 하나 이상의 신경세포사와 관련 있거나 특징으로 하는 질환, 글루타메이트 독성, 단백질 응집체 또는 침착물(예: 아밀로이드 플라크 형성), 정상적인 건강한 대조군 대상체에서 발견되는 것들을 초과하는 반응성 산소 종(ROS) 생산 수준을 포함하는 미토콘드리아 기능 장애; 뇌 유래 신경영양 인자 관련 장애, 및 다른 신경계 질환이 포함된다.
따라서, 특정의 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환인, 치료 방법이 제공된다. 예를 들면, 이들 및 관련 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS, 다르게는 운동 뉴런 질환으로 공지됨), 진행성 구마비, 진행성 근육 위축증, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 척수소뇌 운동 실조증 1형(SCA 1), 또는 노화-관련 신경퇴행성 장애 중의 적어도 하나일 수 있는, 치료 방법을 고려한다. 그러나, 포괄적인 구현예는, 방법이 또한 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 다른 신경퇴행성 질환의 치료를 예상할 수 있도록 그렇게 제한되는 것을 의도하지 않는다.
특정의 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는, 치료 방법이 제공된다. 예를 들면, 이들 및 관련 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 파킨슨병(도파민성 뉴런의 기능 수준이 감소하는 경우), 알츠하이머병(노르아드레날린성 뉴런의 기능 수준이 감소하는 경우, 참조: 예를 들면, Adori et al. 2015, Acta Neuropathol 129(4):541), 헌팅톤병(중간 가시 GABA 뉴런(MSN)의 기능 수준이 감소하는 경우), 근위축성 측삭 경화증(ALS, 운동 뉴런의 기능 수준이 감소하는 경우), 및 우울증(세로토닌성 뉴런의 기능 수준이 감소하는 경우) 중의 적어도 하나일 수 있는, 치료 방법을 고려한다.
특정의 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는, 치료 방법이 제공된다. 예를 들면, 이들 및 관련 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 정신병, 정신분열증(과활동성 도파민 신호전달로서 나타날 수 있는 신경 세포의 수준이 증가되는 경우); 간질성 발작(글루탐산성 흥분독성으로서 나타날 수 있는 신경 세포의 수준이 증가되는 경우), 허혈성 뇌졸중(글루탐산성 흥분독성으로서 나타날 수 있는 신경 세포의 수준이 증가되는 경우) 및 하지 불안 증후군과 관련된 불면증(과민성 글루탐산성 활성으로서 나타날 수 있는 신경 세포의 수준이 증가되는 경우) 중의 적어도 하나일 수 있는, 치료 방법을 고려한다..
특정의 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 CSF 성분 또는 성분들의 수준에 비해 대상체에서 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분의 변경된 수준을 포함하는 뇌척수액(CSF)의 존재를 특징으로 하는, 치료 방법이 제공된다. 대표적인 CSF 성분은 도 7에 제시되어 있다. 예를 들면, 이들 및 관련 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 알츠하이머병 및 진성 당뇨병 중의 적어도 하나일 수 있는, 치료 방법을 고려한다.
특정의 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 맥락총 기능 수준에 비해 대상체에서 적어도 하나의 맥락총 기능의 변경된 수준의 존재를 특징으로 하는, 치료 방법이 제공된다. 예를 들면, 이들 및 관련 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 스터지-베버 증후군 또는 클리펠-트레노우네이-베버 증후군, 또는 인식된 진단 신호 및 증상을 갖는 임의의 수의 다른 임상적으로 동정가능한 선천적인 신경계 질환일 수 있는, 치료 방법을 고려한다.
특정의 구현예에서, 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체의 상기 신경계 질환이 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 상기 침착물의 수준에 비해, 대상체의 신경계에서 내피 세포 및 평활근 세포에서 증가된(예: 통계적으로 유의한 방식으로) 아밀로이드 침작물의 2차 효과(예: Ghiso et al., 2001 J. Alzheimer’s Dis. 3:65)인, 치료 방법이 제공된다. 예를 들면, 이들 및 관련 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 신경계 질환이 뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증-아이슬란드형 유전성 뇌출혈(HCHWA-I), 아밀로이드증-네덜란드형 뇌출혈(HCHWA-D), 수막뇌혈관 및 안구연수막 아밀로이드증, 겔솔린-관련 척수 및 뇌 아밀로이드 맥관병증, 가족성 아밀로이드증-핀란드형(FAF), 혈관 변이체 프리온 뇌 아밀로이드증, 가족성 영국형 치매(FBD)(다르게는, 가족성 뇌 아밀로이드 맥관병증-영국형 또는 뇌혈관 아밀로이드증-영국형으로 공지됨), 가족성 덴마크형 치매(또한, 유전병 옵탈모-오토-엔세팔리카로서 공지됨), 가족성 트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증 및 PrP 뇌 아밀로이드 맥관병증(PrP-CAA)일 수 있는(참조: Ghiso et al. 2001 J Alzheimer’s Dis 3:65), 치료 방법이 고려된다.
치료 방법
바람직한 구현예는 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 인간 또는 비-인간 포유류인 대상체의 치료 방법을 고려한다. 따라서, 포유류는 인간을 포함할 수 있고, 또한 실험실 동물, 가축 및 애완 동물(예: 설치류, 고양이, 개, 토끼 및 다른 토끼목, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 기타 유제류 등)과 같은 사육 동물, 및 또한 야생동물 등과 같은 비사육 동물을 포함할 수 있다.
"치료적 유효량"은 포유류, 바람직하게는 인간에게 투여될 때, 포유류, 바랒믹하게는 인간에서 신경계 질환 또는 상태의 치료를 수행하기에 충분한 본 개시에 따르는 조성물 또는 제제의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"을 구성하는 본원에 기재된 캡슐화된 맥락총(CP) 세포 및/또는 본원에 제공된 맥락총 유도제인 하나 이상의 선택된 반투과성 생체적합성 캡슐과 같은 이러한 조성물 또는 제제의 양은 조성물 또는 제제, 신경게 질환 또는 상태 및 이의 중증도, 및 치료될 포유류의 나이에 따라 달라질 것이지만, 당업자가 그러한 자신의 지식 및 본 개시를 고려하여 통상적으로 결정할 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료"는 관심 있는 질환 또는 장애(예: 신경퇴행성 질환)을 갖는 포유류, 바람직하게는 인간에서 관심 있는 신경계 질환, 장애 또는 상태에 기여하거나 이의 원인인 기본적인 결함을 치유하고, 증상을 완화하고/하거나 교정하는 요법을 의미하고, 신경계 질환, 장애 또는 상태에 기여하는 결함이 있는 분자, 세포 및/또는 조직 성분 및/또는 신경계 질환, 장애 또는 상태에 기여하는 유해한 과정을 실질적이고 통계적으로 유의한 정도의 억제 또는 회복으로(반드시 완료할 필요는 없지만), 예를 들면, 적절한 미치료된 대조군에 비해 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 억제 또는 회복으로 억제하거나(예: 통계적 유의한 방식으로 감소시키는 것과 같이 손상시키고, 감소시키거나 예방하거나) 또는 회복하는(예: 교체, 보충 또는 치환하는) 단계를 포함하고; 또한 질환, 장애 또는 상태로부터 생성되는 징후 또는 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화시키는 단계, 예를 들면, 질환과 관련된 염증성 병변을 감소시키는 단계, 하나 이상의 정상적인 신경 및/또는 신경아교 세포 구조 및/또는 기능 등을 회복하는 단계를 포함한다.
CP 세포를 함유하는 생체적합성의 반투과성 알기네이트 캡슐의 제조 및 CNS 부위로의 이식을 위한 일반적인 방법론은, 예를 들면, US6322804, US5834001, US6083523, US2007/134224, US5869463, US2004/213768, US2009/0047325, 및 본원에 인용된 참고문헌을 포함하는 관련 공보에 기재되어 있고, 본원의 교시에 따라 변형될 수 있다. 따라서, 당업계에 공지된 외과적 절차는, 본 개시의 견지에서, 캡슐을 CNS 주입 부위에 투여하는 단계가 캡슐을, 예를 들면, 외부 카테터, 옵듀레이터, 플런저 또는 전달 카테터를 포함할 수 있는 카테터를 통해 전달하는 단계를 포함하는 특정 구현예에의 적용을 고려한다. 특정의 추가 구현예에서, 전달 단계는, 특정의 추가 구현예에서, 심뇌 자극기(DBS) 마이크로드라이버 또는 본 방법에 사용하기 위해 변형될 수 있는 유사한 장치를 포함할 수 있는 정위 장치로 카테터를 제어 가능하게 위치시키는 단계를 포함한다.
상기한 방법의 특정 구현예에서, 캡슐을 CNS 주입 부위(또는 특정의 다른 구현예에서, PNS 주입 부위)에 투여하는 단계는 캡슐을 카테터를 통해 전달하는 단계를 포함한다. 특정의 추가 구현예에서, 투여하는 단계는 카테터를 정위 장치로 제어 가능하게 위치시킴으로써 전달하는 단계를 포함한다. 특정의 또 다른 구현예에서, 정위 장치는 예시적인 예로써 제한 없이 심뇌 자극기(DBS) 마이크로드라이버, "무테" 정적 헤드 프레임, 두개골 장착 조준 장치, 렉셀 프레임, 코스만-로버츠-웰스 프레임 또는 다른 유사한 변형 정위 장치 등 또는 임의의 등가물, 예를 들면, 문헌(참조: Bot et al., 2015 Stereotact . Funct . Neurosurg . 93:316; Sharma et al., 2014 Neurol . India 62:503; Larson et al., 2012 Neurosurg . 70(1 Suppl Operative):95; Kelman et al., 2010 Stereotact. Funct . Neurosurg . 88:288; Starr et al., 2010 J. Neurosurg . 112:479; Starr et al., 2009 Neurosurg. Clin . N. Am. 20:193)에 기재된 임의의 장치를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 카테터는 외부 카테터, 옵듀레이터, 플런저 및 전달 카테터를 포함한다.
이들 및 관련 구현예에서, 본원에 기재된 캡슐 중 하나 또는 복수의 투여는 특정의 바람직한 구현예에서 본원에 제공된 바와 같은 CNS 주입 부위(또는 PNS 주입 부위)로서 본원에 지칭되는 목적하는 해부학적 위치로의 전달을 포함할 수 있다. 투여는, 예를 들면, 치료되는 특정 의학적 징후 및/또는 전달을 위한 표적 주입 부위에 대해 특이적일 수 있는 이중 카테터 전달 시스템을 통한 전달을 포함할 수 있다. 예시적인 이중 카테터 전달 시스템은 외부 가이드 카테터 시스템 및 내부 캡슐 전달 시스템을 포함할 수 있다. 외부 가이드 카테터 시스템은 무딘-말단일 수 있고, CNS 조직 또는 PNS 조직에 삽입시 조직 손상을 감소시키도록 설계되고, 또한 카테터가 조직으로부터 부분적으로 또는 완전히 회수될 때 주입 부위에 캡슐 전달 후 전달된 캡슐 중 하나 또는 복수에 의해 점유되도록 적절한 표적(수령자) 조직 내에 공간을 생성하도록 설계된다. 캡슐은 플런저 시스템을 사용하여 내부 카테터로 적재한 다음, 그렇게 적재된 내부 카테터 시스템을, 예를 들면, 그리고 특정의 바람직한 구현예에서, 정위 장치와 같은 표적화/가이드/조준 장치를 사용하여 가이드된 전달을 위해 외부 가이드 카테터 시스템에 삽입한다.
예를 들면, 치료될 징후에 특이적인 조절된 캡슐 전달을 보장하기 위해, CNS 또는 PNS 조직 중 표적화 부위에서의 전체 캡슐 전달 장치는 마이크로드라이브 시스템을 사용하여 단계적 방식으로 정확하게 증분으로 서서히 수축될 수 있어 본원에서 주입 부위로서 지칭되고 캡슐 전달 장치에 의해 제어 가능하게 방출되는 하나 이상의 전달된 캡슐을 수용할 수 있는 CNS(또는 PNS) 조직 내에 공간을 생성할 수 있다. 전달 장치의 각 증분 수축 사이에서, 내부 카테터의 플런저는 압착되어 하나 이상의 캡슐을 외부 카테터의 회수에 의해 생성된 공간 위치(예: 주입 부위)의 공간으로 서서히 전달할 수 있다. 하나 또는 복수의 캡슐을 주입 부위(예: CNS 주입 부위 또는 PNS 주입 부위)로 전달하기 위해 내부 카테터의 플런저를 압착시킨 다음 전체 캡슐 전달 장치를 점차적으로 수축하는 이 과정은 주입 부위로의 전달이 목적시 되는 모든 또는 실질적으로 모든 캡슐이 표적화 부위로 전달될 때까지 반복될 수 있다. 내부 카테터 내 및/또는 캡슐 전달 장치의 회수에 의해 생성된 공간 위치(예: 주입 부위)의 공간에서 캡슐 배열의 구성은 일부 구현예에서 각 층이 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1, 5, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 캡슐을 포함하는 주입 부위 중의 캡슐의 층 구성으로서 제공될 수 있고/있거나, 특정의 다른 구현예에서, 층당 하나의 캡슐만을 수용할 수 있는 직경을 갖도록 균형 잡힌 주입 부위에서 적층된 단일 캡슐의 1차원 기둥 형상으로 제공될 수 있다. 주입 부위 및 이러한 주입 부위 내의 캡슐 배열의 바람직한 배치는 치료가 목적시되는 특정 의학적 증상의 함수로서 및/또는 목적하는 주입 부위의 특정 해부학적 위치의 함수로서 변할 수 있고/있거나 각 부위에서 전달되는 캡슐의 수에 대해 적절할 수 있다. 주입 부위에서 캡슐의 배치는 또한, 예를 들면, 내부 카테터의 플런저를 압착시켜 목적하는 수의 캡슐을 주입 부위로 제어 가능하게 방출하는 거리에 비해, 전체 캡슐 전달 장치가 수축되는 거리를 변화시킴으로써 제어될 수 있다.
예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 반투과성 생체적합성 캡슐은 주입 부위에서 적층된 캡슐의 컬럼을 수득하기 위해 카테터로부터 단일 카테터 전달 시스템의 말단에서 전달로로 형성된 CNS 주입 부위로의 방출에 의해 파킨슨병 환자의 조가비핵으로 투여되었다(참조: Snow et al., June 2015, Safety and clinical effects of NTCELL ® [ immunoprotected (alginate-encapsulated) porcine choroid plexus cells for xenotransplantation ] in patients with Parkinson's disease (PD): 26 weeks follow-up. Poster session presented at 19th International Congress of Parkinson's Disease and Movement Disorders, San Diego, CA, USA).
본원의 다른 곳에서 주시된 바와 같이, 특정의 고려된 구현예는 본원에 기재된 CP 세포를 함유하는 생체적합성 캡슐을 PNS 주입 부위와 같은 하나 이상의 말초신경계(PNS) 부위에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 PNS 주입 부위로의 투여는 PNS의 치료를 위해 관련된 기술 분야에서 개발된 방법론을 사용함으로써 수행될 수 있다. PNS 주입 부위로의 투여는 가이드된 카테터 또는, 예를 들면, CNS 부위를 위해 본원에서 기재된 바와 같은 기구/장치에 상응하는 다른 적합한 기구를 통해 CP 함유 캡슐을 도입함으로써 달성될 수 있다. PNS 주입 부위로의 투여를 위해, 당업자는 다수의 국소 및 지역적 마취 기술이, 예를 들면, 약리학적 제제를 임의로 초음파 유도로 신경 또는 신경절 및 주위 영역으로 주입시킴으로써 통상적으로 수행되는 것들을 포함하여 PNS가 접근될 수 있는 임의의 다수의 해부학적 위치를 인식할 것이다.
주입은, 예를 들면, (비제한적인 예로써, 직경이 400 내지 800㎛일 수 있는) 본원에 기재된 생체적합성 캡슐을 수용하기에 충분히 큰 내부 직경을 갖는 17 내지 22 게이지 바늘로 수행될 수 있다. 반면에, CNS로의 캡슐의 도입은 바람직하게는 CNS 혈관을 손상시키지 않고 뇌에 주입할 수 있는 특수 카테터를 이용할 수 있고, PNS 주입 부위로의 전달을 위해 접근할 수 있는 말초 부위의 경우, 주입 부위 근방의 중간엽 조직에서의 혈관의 손상과 같은 부수적인 혈관 손상은 특별한 관심이 덜할 수 있다.
PNS 주입 부위로의 투여는 바람직하게는 피부 및/또는 다른 인접 조직을 통해 PNS 부위로 침투할 수 있는 바늘을 사용할 것이다. 예를 들면, 문헌(참조: Hadzic’s Peripheral Nerve Blocks and Anatomy for Ultrasound-Guided Regional Anesthesia (New York School or Regional Anesthesia) (2011). Edited by Admir Hadzic, 722 pp. McGraw-Hill, New York, N.Y., ISBN-13:978-0-0715-4961-5)을 참조한다. 예를 들면, 문헌(참조: Textbook of Regional Anesthesia and Acute Pain Management (2007) Edited by Admir Hadzic, 1259 pp., McGraw-Hill Education, New York, N.Y., ISBN 007144906X, 9780071449096)도 또한 참조한다. 예를 들면, 문헌(참조: Carneiro HM, Teixeira KI, de Avila MP, Limongi RM, Magacho L. (2016) Comparison of Needle Path, Anesthetic Dispersion, and Quality of Anesthesia in Retrobulbar and Peribulbar Blocks. Reg Anesth Pain Med . 41(1):37-42)도 또한 참조한다. 예를 들면, 문헌(참조: Jeganathan VS1, Jeganathan VP. (2009) Sub-Tenon's anaesthesia: a well tolerated and effective procedure for ophthalmic surgery. Curr Opin Ophthalmol. 20(3):205-9)도 또한 참조한다.
바람직한 구현예에서, 투여하는 단계는 본원에 기재된 CP 세포를 함유하는 생체적합성 반투과성 알기네이트 캡슐의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 이는 특정의 구현예에서, 각각 적어도 약 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500 또는 9000개 및 약 10,000개 이하의 CP 세포를 함유하는 하나 이상의 캡슐을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정의 구현예에서, 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000개의 캡슐이 CNS (또는 PNS) 주입 부위에 투여될 수 있다. 특정의 구현예에서, 캡슐은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 또는 그 이상의 CNS (또는 PNS) 주입 부위에 투여될 수 있다.
특정의 구현예에서, 캡슐을 하나 이상의 CNS (또는 PNS) 주입 부위에 투여하는 단계는, 예를 들면, NaCl, 인공 뇌척수액(CSF), 아스코르베이트 또는 항염증제 중 적어도 하나를 포함할 수 있는 담체 용액에 캡슐을 포함하는 현탁물을 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 항염증제는 당업계에 공지된 바와 같은 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID) 또는 스테로이드 항염증성 약물(예: Brunton et al., (Eds.), Goodman & Gilman ’s The Pharmacological Basis of Therapeutics-12th Ed. 2011 McGraw-Hill, New York)로부터 선택될 수 있고/있거나, 코넥신 길항제(예: Chen et al. 2014 Brain 137(Pt 8):2193; Zhang et al. 2014 FEBS Lett, 588(8):1365; Davidson et al. 2014 PLoS One 9(5):e96588)를 포함할 수도 있다.
바람직하게는, 캡슐화된 CP 세포의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50%는 투여 단계 후 적어도 6개월 동안 생존 가능하다. 더욱 바람직하게는, 캡슐화된 CP 세포의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50%는 투여 단계 후 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개월 동안 생존 가능하다. 더욱 바람직하게는, 캡슐화된 CP 세포의 적어도 5, 10, 20, 30, 40 또는 50%는 투여 단계 후 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개월 동안 생존 가능하다. 더욱 바라직하게는, 캡슐화된 CP 세포의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50%는 투여 단계 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 동안 생존 가능하다. 바람직하게는, 생체적합성 캡슐의 외부 표면은 투여 단계 후 적어도 6개월 동안, 더욱 바람직하게는 투여 단계 후 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개월 동안, 더욱 바람직하게는 투여 단계 후 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 동안 실질적으로 세포외 매트릭스(EC) 침착이 존재하지 않는다.
이식된 캡슐화된 CP 세포의 생존력 및 상태의 모니터링은 임의의 다수의 기존의 기술에 의해 직접 또는 간접적으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 대상체의 신경학적 기능의 임상적 평가, 또는 뉴런 18F-플루오로도파 및/또는 11C-테트라벤진 대사에 의한 도파민성 신경 기능의 양성자 방출 단층 촬영(PET) 평가, CSF의 생화학적 분석 또는 사후 분석은 유도된 CP 이식체에 의한 증가된 CSF 생산으로부터 유래되는 복원된 기능성의 간접적 지표일 수 있다. 또 다른 예로서, 생체 내에서 CNS 염증은 자기 공명 영상(MRI) 기술(참조: Sibson et al., 2011 Meths . Mol . Biol . 711:379; McAteer et al., 2011 Meths . Mol . Biol . 680:103) 또는 CSF 및/또는 하나 이상의 바이오마커, 예를 들면, C-반응성 단백질(CRP), 단구 화학 주성 단백질-1(MCP-1), IL-6 또는 다른 마커(예: Lindqvist et al., 2013 Brain Behav . Immun. 33:183; Frodl et al., 2014 Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 48:295-303; Polachini et al., 2014 Neurosci . 266:266; Satizabal et al., 2012 Neurol. 78:720)의 순환에서 수준을 결정하는 방법에 의해 평가될 수 있다. 이들 및 관련 기술은, 절차 관련 염증이 사라진 후, 이식된 캡슐화된 CP 세포가 ECM 침착을 동반하는 이물질 반응을 수반할 것으로 예상되는 염증 반응을 유발할 수 있는지의 여부를 결정하는데 이용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 CNS 이식 후 캡슐화된 CP 세포의 놀라운 수명에 비출어 볼 때, 특정의 추가 구현예는 이러한 CP 세포를 CNS 주입 부위에 캡슐화된 세포를 투여하는 단계와 동시에 또는 이어서 본원에서 제공된 바와 같은 CP 유도제와 접촉시키는 단계를 고려한다. 특정의 이러한 구현예에서, 옴마야(Ommaya) 저장소(참조: Ommaya, 1963 Lancet 2:98; Dudrick, 2006 J. Parenter . Enteral . Nutr . 30 (1 Suppl):S47)는 대상자의 두피 아래에 피하 이식되어 저장소로부터 캡슐 이식의 CNS 부위에 또는 부근에 위치한 카테터로 유체 전달을 제공할 수 있다. 이러한 저장소를 통해, 또는 CNS 부위의 근방으로의 유체 전달이 달성될 수 있는 다른 유사한 장치를 통해, 캡슐화된 CP 조직 세포는 대상체가 CP 유도제를 유익하게 수용하는 것으로 동정될 수 있는 임의의 시간 간격(예: 매일, 주당 2, 3, 4, 5 또는 6회. 매주, 격주, 매월, 2개월 마다, 분기별로, 반년마다, 매년, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15년 이상의 기간 동안 임의의 다른 간격)으로 1회 또는 복수회 CP 유도제와 접촉시킬 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현예의 실시는, 반대로 구체적으로 명시하지 않는 한, 당업계의 기술 범위 내에 있는 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술에서의 통상적인 방법을 사용할 것이고, 이중 다수는 예시 목적으로 이하 기재된다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌(참조: Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) 및 다른 유사 참고문헌)을 참조한다.
표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성, 및 조직 배양 및 형질 전환(예: 전기천공, 리포펙션)을 위해 사용될 수있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 설명서에 따라서 또는 당업계에서 통상 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 이들 및 관련 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 익히 공지된 통상적인 방법에 따라서 및 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 더욱 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 특정 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분자 생물학, 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 실험실 절차 및 기술은 당업계에 익히 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술이 재조합 기술, 분자 생물학적, 미생물학적, 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제조, 제형화 및 전달, 및 환자의 치료용으로 사용될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서 전반에 결쳐, 문맥이 다르게 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 포함하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소들 또는 정수들의 그룹을 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서의 각각의 구현예는 명백하게 다르게 명시되지 않는 한 모든 다른 구현예에 대해 준용된다.
등가물: 본 발명의 특정 단계들, 요소들, 구현예들 및 적용들이 예시 목적으로 본원에 제시되고 기재되었지만, 변형이 특히 상기 교시에 비추어 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 당업자에 의해 수행될 수 있기 때문에 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것이 물론 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 경우를 제외하고는 제한되지 않는다.
다음 실시예는 제한이 아니라 예시로서 제시된다.
실시예
실시예 1
높은 뇌척수액(CSF) 생산을 위한 맥락총(CP) 세포 함유 캡슐의 선택
이 실시예는 CSF 생산의 대표적인 지표로서 CSF 성분 VEGF를 사용하는 높은 CSF 생산을 위한 CP 세포 함유 캡슐의 선택을 기재한다.
신생아 돼지 맥락총 조직을 처리하고, US2009/0047325 및 US2009/0214660에 기재된 바와 같이 본질적으로 알기네이트 캡슐에 캡슐화하였다. 간단하게, CP 조직을 신생아 돼지 뇌로부터 무균적으로 절개하고, 가위로 미세하게 쪼개고, 콜라게나제 및 서몰리신으로 소화시키고, 550㎛ 스테인레스 강 필터를 통해 통과시키고, 펠렛화하고, 완만하게 재현탁시켜 직경 약 50 내지 200㎛의 세포 클러스터를 포함하는 조직 단편을 수득했다. CP 세포 클러스터를 실온에서 40분 동안 단위 중력 침강에 의해 혈액 세포로부터 2회 분리시켰다. 침강된 CP 세포를 약 3,000개 클러스터/mL의 밀도로 RPMI 배지/2% 신생아 돼지 혈청에 재현탁시키고, 상기한 바와 같이 6 내지 7일 동안 초저 부착 플라스크에서 배양하여 구형, 타원형 및 분지된 CP 세포 클러스터를 수득했다. 세포 클러스터를 알기네이트를 함유하는 높은 만누론산을 함유하는 무균 생리 식염수 용액에서 배양하고, 액적 생성기를 통해 109mM 염화칼슘 겔화 용액에 액적 분무하고, 연속적으로 폴리-L-오르니틴 및 알기네이트로 코팅하여 실질적으로 모두가 직경 약 400㎛ 내지 약 800㎛인 반투과성 캡슐을 수득했다. 이어서, 캡슐을 롤링 50mL 튜브에서 2분 동안 55mM 등삼투성(iso-osmolar) 나트륨 시트레이트로 처리하였다. 캡슐을 혈청을 함유하는 배양 배지에서 유지시키고, 세포 생존력을 확인하기 위해 분액을 샘플링했다.
세포당 분비된 VEGF의 양은 선택되지 않은 (무작위) CP 세포 함유 캡슐 및 선택된 CP 세포 함유 캡슐의 동등한 수의 분액에서 비교하였다. 선택된 CP 세포 함유 캡슐을 직접 현미경 관찰에 기초하여 캡슐당 200 내지 10,000개 캡슐화된 세포의 존재에 대해 손으로 채취하였고, 이때 상기 캡슐은 캡슐 내부로부터 세포 또는 세포 과정을 돌출시킴으로써 또는 피상적으로 부착된 세포 또는 조직 단편에 의해 차단되지 않는 매끄러운 외부 표면을 나타냈다. 24-웰 다중-웰 플레이트의 배양 웰을 500개의 선택되지 않은 (무작위) CP 세포 함유 캡슐 또는 500개의 선택된 캡슐로 씨딩하고, 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 상청액의 분액을 수집하고, 제조업자의 지침에 따라 ELISA 키트(Human VEGF Quantikine™ ELISA, Cat. #DVE00, R & D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 VEGF에 대해 검정했다. 세포 배양액의 분액을 또한 각 웰 중의 세포의 상대적 수를 결정하기 위해 공급업자의 지침(Cat. # P7589, Life Technologies, Inc./Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY)에 따라서 Quant iT™ Picogreen dsDNA 검정을 사용하는 DNA 정량화용으로 수집하였다.
배양 웰의 비교용 DNA 정량화는 500개의 선택된 캡슐(캡슐당 200 내지 10,000개의 캡슐화된 세포)을 수용한 웰이 500개의 선택되지 않은 (무작위) 캡슐이 수용된 웰보다 3배 더 많은 DNA를 함유하였음을 나타냈다. 놀랍게도, 500개의 선택된 캡슐을 수용한 웰의 상청액이 선택되지 않은 (무작위) 캡슐 배양물로부터의 상청액보다 6배 더 많은 VEGF를 함유했다. 샘플을 세포당 기준으로 분비된 VEGF의 양을 반영하여 DNA 함량으로 표준화시켰을 때, 선택된 캡슐은 놀랍게도 선택되지 않은 캡슐보다 DNA ㎍당 2배보다 약간 더 많은 VEGF를 분비하는 것으로 밝혀졌다(도 1). 이 결과는 세포당 증가된 VEGF 생산과 더 높은 세포 밀도 사이의 대응이 이전에 보고되지 않는 한에 있어서는 예상외였다.
실시예 2
맥락총 유도제의 동정
이 실시예는 포유동물 맥락총(CP) 세포가, CP 세포가 유도제의 부재하에 CSF 성분을 생산하는 수준보다 더 높은 수준으로 CSF 성분을 생산하도록 유도하는 제제의 동정을 기재한다. CSF는 산화방지제로서 기능하는 다수의 성분을 함유하는 것으로 공지되어 있고(예: Kolmakova et al., 2010 Neurochem . J. 4:41); 총체적으로, 이들 성분의 산화방지성은 전체 산화방지능(TAC)으로서 지칭될 수 있다.
CP 세포(5 x 103 클러스터/mL)를 포함하는 맥락총(CP) 세포 클러스터는 캡슐화가 없는 것 이외에는 실시예 1에서 상기한 바와 같이 제조하고, 24-웰 초저 (세포) 부착 플레이트 중의 시험관내에서 24시간 또는 72시간 동안 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양하고, 배양 상청액을 제조업자의 지침에 따라서 OxiSelect™ TAC 검정(Cat. No. STA-360, Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA)을 사용하여 전체 산화방지능(TAC)에 대해 시험했다. 배지 성분으로부터 TAC 검정에서의 간섭을 피하기 위해, 배양물을 10mM 니코틴아미드로 보충된 무혈청 페놀 비함유 RPMI 배지에서 배양했다. 후보 CP 유도제의 패널을 CP 세포에 의한 TAC 정교화에 대한 효과에 대해 시험했다. 배양 배지를 단독으로 또는 각각의 후보 CP 유도제와 함께 수용하고 CP 세포 클러스터를 갖지 않는 대조군 웰을 또한 배양하고, TAC에 대해 시험하였다. 대표적인 후보 CP 유도제는 표 1에 나타낸 바와 같았다:
후보 CP 유도제
후보 유도제 농도 1 농도 2 농도 3
LiCl 2mM 4mM 8mM
시프록신 4㎍/ml 8㎍/ml 16㎍/ml
아스코르브산 1μM 5μM 10μM
락트산 3mM 10mM 25mM
N 아세틸 시스테인 7.5μM 15μM 30μM
글루타티온 3μM 6μM 12μM
니코틴아미드 10mM 20mM 40mM
TAC 검정 결과는 도 2에 도시된다. 시험된 후보 CP 유도제 중에서, 염화리튬은 72시간 후에 용이하게 검출가능했던 높은 TAC 수준의 CP 세포에 의한 방출을 촉진시켰다.
따라서, 추가의 실험에서, CP 클러스터(5 x 103 클러스터/mL)를 CP 세포가 용량 의존 방식으로 LiCl에 반응하여 상청액으로 산화방지성을 방출하는지의 여부를 결정하기 위해 다양한 LiCl 농도의 존재하에 10mM 니코틴아미드를 함유하는 무혈청 페놀 비함유 RPMI 배지에서 72시간 동안 배양했다. 결과는 도 3a에 제시되어 있고, 이때 LiCl의 부재하의 CP 클러스터에 의해 방출된 배경 TAC 수준을 빼고 제공된 CP 없이 각각의 배지/LiCl 중에서 검출된 임의의 TAC 신호를 보정한 후, LiCl에 반응하여 CP 클러스터에 의해 방출된 검출가능한 TAC 수준이 제공된다.
특정의 유도제가 캡슐화된 CP에 의해 CSF 성분의 분비를 증가시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 1000개 CP 함유 캡슐을 37℃에서 24시간 동안 LiCl을 포함하는 다양한 유도제를 포함하거나 포함하지 않는 24-웰 다중-웰 플레이트에서 배양했다. 상청액의 분액을 수집하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 VEGF에 대해 검정했다. 세포 배양물의 분액도 또한 DNA 정량화용으로 수집하여 실시예 1에 기재된 바와 같은 각 웰 중의 세포의 상대적 수를 결정했다. 결과는 도 3b에 제시되어 있고, 이때 LiCl뿐만 아니라 탄산리튬 모두가 유도제 없이 배양된 캡슐화된 CP에 의해 분비된 수준 이상으로 캡슐화된 CP에 의한 VEGF 분비를 유도했다. 또한, 두 개의 다른 제제, 타우린 및 MitoQ도 또한 캡슐화된 CP에 의해 VEGF 분비를 유도했다.
발현 수준이 본원에 제공된 유도제와 접촉 후 CP 세포에서 변경된 유전자를 동정하기 위한 추가의 실험에서, 12 내지 13일령 피그렛으로부터 수득되고 시험관내에서 20 내지 22일 동안 배양된, CP 세포를 함유하는 CP 클러스터(5 x 103 클러스터/mL)를 12mM LiCl의 부재(대조군) 또는 존재(유도제 처리됨)하에 10mM 니코틴아미드를 함유하는 무혈청 페놀 비함유 RPMI 배지에서 72시간 동안 배양했다. 세포 펠렛을 수거하고, 0.25ml의 TRI™ 시약(Catalog # T9424, Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 약 10배 위 아래로 피펫팅하고, RNA-Seq 분석까지 -80℃에서 저장했다. 대조군 및 처리된 CP 클러스터로부터의 결과를 비교하였고, 도 8에 제시되어 있는데, 이는 발현 수준이 LiCl에 노출 후 CP 세포에서 증가된(도 8a-e) 또는 감소된(도 8f-k) 다수의 돼지 유전자를 나열하고, 이 유전자는 공지된 CSF 성분을 코딩하는 유전자로서 동정되었다. 인간 CSF 성분을 코딩하는 상응하는 인간 유전자는 확립된 오솔로지(orthology) 분석에 의해 동정되었다(참조: Groenen et al., 2012 Nature 491(7424):393-8).
실시예 3
면역억제 섭생 없이 CNS-이식된 캡슐화된 이종 맥락총(CP) 세포의 장기간 생체내 생존
캡슐당 200 내지 10,000개 CP 세포를 포함하는 알기네이트 캡슐화된 신생아 돼지 맥락총(CP) 클러스터를 상기 및 US2009/0047325 및 US2009/0214660에 기재된 바와 같이 제조했다. 캡슐(수령자당 10개)을 설치류 뇌 이식용으로 설계된 카테터를 사용하여 다중 마취된 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트의 선조체로 외과적으로 이식했다. 동물은 1 내지 16개월 동안 유지시켰고(초기 실험의 경우, 1개월부터 시작하여 월별 시점으로 수집하였고; 이후의 실험은 12개월에 시작하여 확인 데이터를 제공했다), 매월 간격으로 샘플 동물을 사후 뇌의 조직 검사를 위해 인위적으로 희생시켰다. 항염증성 또는 면역억제성 치료는 투여하지 았았다.
조직학적 발견은 희생의 각 시점(9, 12 또는 16개월)에서, 살아 있는 세포가 이식된 캡슐 내에 존재하였고, 캡슐에 대한 숙주 면역 거부, 염증성 반응 또는 이물질 반응(예: 섬유성 흉터)의 검출 가능한 증거가 거의 없거나 전혀 없었음을 나타냈다. 도 4를 참조한다. 사후 뇌 조직은 CP 세포에 의해 생성된 다작용성 CSF 성분인 색소 상피 유도 인자(PEDF, SerpinF1로도 공지됨)의 면역조직학적 염색을 위해 처리했다(참조: Fernandez-Garcia et al., 2007 J. Mol . Med . ( Berl .) 85:15-22; Barnstable et al., 2004 Prog . Retin . Eye Res. 23:561; Becerra et al., 1995 J. Biol . Chem. 270:25992; Orgaz et al., 2011 Melanoma Res. 21:285). PEDF는 주위 랫트 뇌 조직뿐만 아니라 클러스터 내의 클러스터에 존재하는 CP 세포(도 4)에서 용이하게 검출 가능했다.
상기한 다양한 구현예는 추가의 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서에서 지칭되고/되거나 출원 데이터 시트에 나열된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공보 모두는 전체가 본원에 참조로 인용된다. 구현예의 양상은 추가의 구현예를 제공하기 위해,다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 사용할 필요가 있는 경우, 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변화가 상기 상세한 설명에 비추어, 상기 구현예에서 수행될 수 있다. 일반적으로, 다음 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 기재된 특정 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되고, 이러한 청구범위가 권리가 있는 전체 범위의 균등물과 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 명세서에 의해 제한되지 않는다.

Claims (53)

  1. 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) 직경이 약 50㎛ 내지 약 200㎛이고, 맥락총(CP) 상피 세포를 포함하는 CP 세포 클러스터를 수득하기 위해 포유동물 맥락총 조직의 기계적 및 효소적 분리 중 하나 또는 둘 다에 의해 수득되는 캡슐화된 맥락총(CP) 조직 단편인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실질적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개의 CP 세포를 갖는, 단계,
    (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 대상체의 하나의 중추신경계(CNS) 주입 부위에 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 CNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 투여 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 복수의 캡슐 중의 맥락총 조직 세포를, 맥락총 조직 세포가 접촉 단계 부재 하에서 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된 수준으로 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하도록 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) 다능성 세포 집단을 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 배양함으로써 수득되는 캡슐화된 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실직적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개의 CP 세포를 갖는, 단계,
    (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 대상체의 하나의 중추신경계(CNS) 주입 부위에 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 CNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 투여 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 복수의 캡슐 중의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를, 맥락총 조직 세포가 접촉 단계 이전에 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된 수준으로 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 방출하도록 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 내지 제2항에 있어서, 상기 맥락총 유도제가, 상기 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 부재 하에서 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준보다 더 높은 수준으로 하나 이상의 CSF 성분의 생산을 유도하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CP 세포와 상기 맥락총 유도제를 접촉시키는 단계가 상기 투여 단계 (b) 이전에 발생하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 맥락총 유도제가
    (a) Wnt 신호전달 경로 작동제,
    (b) GSK3β 억제제,
    (c) 베타-카테닌 활성화제,
    (d) 산화방지제 및
    (e) 1,25-디하이드록시비타민 D3으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (1) 상기 Wnt 신호전달 경로 작동제가 WAY-316606 (SFRP 억제제), IQ1 (PP2A 활성화제), QS11 (ARFGAP1 활성화제), (헤테로)아릴피리미딘, 또는 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, 노린(Norrin), R-스폰딘-1, R-스폰딘-2, R-스폰딘-3, R-스폰딘-4로부터 선택되고,
    (2) 상기 GSK3β 억제제가 SB-216763, BIO (6-브로모인디루빈-3'-옥심), 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 양이온성 리튬을 포함하는 다른 리튬 염으로부터 선택되고,
    (3) 상기 베타-카테닌 활성화제가 데옥시콜산(DCA) 및 도 5의 화합물로부터 선택되고,
    (4) 상기 산화방지제가 10-(6'-우비퀴노일)데실트리페닐포스포늄 염(미토퀴놀, MITOQ®), 우비퀴놀(코엔자임 Q), 토코페롤, 토코트리에놀(비타민 E), α-토코페롤, γ-토코페롤, 2-아미노에탄설폰산(타우린), 아스코르브산, 글루타티온 및 멜라토닌으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 맥락총 조직이 대상체에 대해 이종 또는 동종이계인 포유류로부터 유래되는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 포유동물 맥락총 조직이 돼지, 양, 소, 염소 또는 비-인간 영장류 맥락총 조직을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 돼지 맥락총 조직이 태아 또는 신생아 맥락총 조직을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 태아 또는 신생아 맥락총 조직이 실질적으로 인간 병원체를 함유하지 않는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 태아 또는 신생아 맥락총 조직이 실질직으로 인간-지향 전염성 돼지 내인성 레트로바이러스를 함유하지 않는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, (i) 상기 태아 또는 신생아 맥락총 조직이 실질적으로 감염성 인간-지향 돼지 내인성 레트로바이러스(PERV)를 생성할 수 없거나, (ii) 상기 태아 또는 신생아 맥락총 조직이 PERV 유전자가 결여된 동물로부터 수득되는 것 중의 적어도 하나인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 태아 또는 신생아 맥락총 조직이 PERV-A env 유전자와 재조합될 수 있는 PERV-C env 유전자가 결여된 동물로부터 수득되는, 방법.
  14. 제2항에 있어서,
    (i) 상기 다능성 세포 집단이 배아 세포, 제대 세포, 태반 세포, 신경 능선 전구 세포, 성인 조직 줄기 세포 및 체세포 조직 세포로부터 선택된 공급원으로부터 수득되거나,
    (ii) 상기 다능성 세포 집단이 골 형태형성 단백질(BMP) 또는 BMP 신호전달 경로 작동제, 전환 성장 인자-베타(TGF-β) 슈퍼패밀리 구성원 또는 TGF-β 신호전달 경로 작동제, 결절 단백질 또는 결절 신호전달 경로 작동제, 포유동물 성장 및 분화 인자(GDF) 또는 GDF 신호전달 경로 작동제, Wnt 단백질 리간드 또는 Wnt 신호전달 경로 작동제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 또는 FGF 신호전달 경로 작동제, 및 소닉 헤지혹(Shh) 또는 Shh 신호전달 경로 작동제로부터 선택된 하나 이상의 시험관내 CP 분화제를 포함하는 배양 배지에서 상기 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 배양되거나, 또는 둘 다인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 Wnt 신호전달 경로 작동제가 WAY-316606 (SFRP 억제제), IQ1 (PP2A 활성화제), QS11 (ARFGAP1 활성화제), 2-아미노-4-[3,4-(메틸렌디옥시)벤질-아미노]-6-(3-메톡시페닐)피리미딘, 노린, R-스폰딘-1, R-스폰딘-2, R-스폰딘-3, 또는 R-스폰딘-4, 염화리튬, 탄산리튬, 리튬 시트레이트, 리튬 오로테이트, 브롬화리튬, 불소화리튬, 요오드화리튬, 리튬 아세테이트, 수산화리튬, 수소화리튬알루미늄, 과염소산리튬, 질산리튬, 리튬 디이소프로필아미드, 수소화붕소리튬, 산화리튬, 황산리튬, 헥사플루오로인산리튬, 사산화리튬, 황화리튬, 수소화리튬, 리튬 아미드, 리튬 락테이트, 테트라플루오로붕산리튬, 리튬 디메틸아미드, 인산리튬, 과산화리튬, 산화리튬망간, 리튬 메톡사이드, 메타붕산리튬, 리튬 스테아레이트, 또는 양이온성 리튬을 포함하는 다른 리튬 염으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 캡슐화된 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포가 대상체에 대해 이종 또는 동종이계인, 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) 상기 캡슐이 CNS 주입 부위에서 만성 염증을 유발하지 않거나,
    (ii) 상기 대상체에게 면역억제제의 투여가 CNS 주입 부위에서 상기 캡슐의 면역학적 거부를 개선하는 데 요구되지 않거나, 또는 둘 다인, 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 CSF 성분이 (i) 하나 이상의 성장 인자, (ii) 하나 이상의 CSF 산화방지제, (iii) 하나 이상의 화학 주성 인자, (iv) 하나 이상의 샤프론 단백질 또는 (v) 도 7a 내지 j에 제시된 바와 같은 하나 이상의 CP 생성물 중의 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    (a) 상기 하나 이상의 성장 인자가 IGF-1, IGF-II, FGF-1, bFGF (FGF-2), FGF-9, FGF-12, FGF-18, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, VEGF, VEGF-2, VEGF-B, VEGF-C, EGF, 성장 호르몬(GH), BMP-1, BMP-2, BMP-4, BMP7, BMP-11, BMP-15, GDF-1, GDF-7, GDF-8, GDF-9, 신경 성장 인자(NGF), PEDF(색소 상피 유도 인자, SerpinF1로도 공지됨), 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1), IGF2, BDNF, NT-3, NT-4, GDF-15, GDNF, 결합 조직 성장 인자(CTGF), 엑소트로핀, 헤파린 결합 EGF형 성장 인자(HB-EGF), 혈소판 유래 성장 인자-알파(PDGF-α), 케라티노사이트 성장 인자(KGF), 또는 신경 돌기 성장-촉진 인자-2/미드카인(NEGF2)으로부터 선택되고;
    (b) 상기 하나 이상의 CSF 산화방지제가 세룰로플라스민, 슈퍼옥사이드 디스무타제-1(SOD-1), 슈퍼옥사이드 디스무타제-2(SOD-2, Mn형), 슈퍼옥사이드 디스무타제 구리 샤프론(CCS), DJ-1/PARK7, 카탈라제, 셀레노단백질(I, M, N, P, S, T, W, X, 15kDa), 글루타티온 S-트랜스퍼라제, 글루타티온 리덕타제, 글루타티온 퍼옥시다제, 하이드록시아실 글루타티온 하이드롤라제 또는 티오레독신으로부터 선택되고;
    (c) 상기 하나 이상의 화학 주성 인자가 폐포 마크로파지-유래 화학 주성 인자-I(AMCF-I), AMCF-II, 간질 세포-유래 인자-2, 케모카인 (CXC 모티프) 리간드 2, 케모카인(CCL8, CCL16, CCL19, CCL21, CCL25, CXCL2, CXCL4, CXCL9, CXCL12, CXCL13, CXCL14), 케모카인 (CXC 모티프) 수용체-4, 케모카인형 인자 슈퍼 패밀리(CKLF-3, -6, -7), 또는 신경 돌기 성장-촉진 인자-2/미드카인(NEGF2)으로부터 선택되거나;
    (d) 상기 샤프론 단백질이 트랜스티레틴, 리포칼린형 프로스타글란딘 D 신타제/β-트레이스(L-PGDS), 아포지단백질(A, B, C, D, E, H, J, M, N, R), 리포칼린-6, 리포칼린-7, 시스타틴 B, 시스타틴 C, 시스타틴 EM, 시스타틴 11, 열 충격 단백질(HSP) 계열 구성원, 또는 DJ-1/PARK7로부터 선택되는, 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 각 캡슐 내 상기 CP 세포가 1㎕ 미만의 코어 용적으로 존재하는, 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 각각 적어도 약 200, 400, 600, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500 또는 9000개, 및 약 10,000개 이하의 CP 세포를 함유하는 하나 이상의 캡슐을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 캡슐이 각각 적어도 약 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000 또는 7500개, 및 약 8000개 이하의 세포를 함유하는, 방법.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 치료적 유효량의 상기 캡슐을 상기 CNS 주입 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450,500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 또는 2000개 이하의 캡슐을 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 CNS 주입 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캡슐화된 CP 세포의 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40 또는 50%가 상기 투여 단계 후 적어도 6개월 동안 생존 가능한, 방법.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 캡슐의 외부 표면이 투여 단계 후 적어도 1년 동안 세포외 기질 침착을 실질적으로 함유하지 않는, 방법.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, CNS 주입 부위에 상기 캡슐을 투여하는 단계가 담체 용액에 상기 캡슐을 포함하는 현탁물을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 담체 용액이 NaCl, 인공 뇌척수액(CSF), 아스코르베이트 또는 항염증제 중의 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 항염증제가 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 스테로이드 항염증성 약물 및 코넥신 길항제로부터 선택되는, 방법.
  30. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체가 인간 또는 비-인간 포유류인, 방법.
  31. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체가 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되어 있는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 신경계 질환이 (a) 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환, 및 (b) 파킨슨병, 알츠하이머벙, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS, 운동 뉴런 질환으로도 공지됨), 운동 실조-모세혈관 확장증, 진행성 연수 마비, 진행성 근육 위축증, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 척수소뇌 운동 실조증 1형(SCA 1) 또는 노화-관련 신경퇴행성 장애로부터 선택된 신경계 질환으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 신경계 질환이 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는 질환, 및 (b) 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증 및 우울증으로부터 선택된 (a)의 질환으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 신경계 질환이 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는 질환, 및 (b) 정신병, 정신 분열증, 간질 발작, 허혈성 뇌졸중 및 하지 불안 증후군과 관련된 불면증으로부터 선택된 (a)의 질환으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 신경계 질환이 (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 뇌척수액(CSF) 성분 또는 성분들의 수준에 비해 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분들의 변경된 수준을 포함하는 뇌척수액(CSF)의 대상체에서의 존재를 특징으로 하는 질환, 및 (b) 알츠하이머병 및 진성 당뇨병으로부터 선택된 (a)의 질환으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 신경계 질환이
    (a) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 맥락총 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 맥락총 기능의 변경된 수준의 대상체에서의 존재를 특징으로 하는 질환,
    (b) 스터지-베버 증후군(Sturge-Weber syndrome) 및 클리펠-트레노우네이-베버 증후군(Klippel-Trenaunay-Weber syndrome)으로부터 선택된 (a)의 질환,
    (c) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 비정상적으로 폴딩된 단백질 침착물의 수준에 비해 대상체의 뇌 조직에서 비정상적으로 폴딩된 단백질 침착물 수준의 증가를 특징으로 하는 질환, 및
    (d) 뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증-아이슬란드형 유전성 뇌출혈(HCHWA-I), 아밀로이드증-네덜란드형 뇌출혈(HCHWA-D), 수막뇌혈관 및 안구연수막 아밀로이드증, 겔솔린-관련 척수 및 뇌 아밀로이드 맥관병증, 가족성 아밀로이드증-핀란드형(FAF), 혈관 변이체 프리온 뇌 아밀로이드증, 가족성 영국형 치매(FBD)(또한, 가족성 뇌 아밀로이드 맥관병증-영국형 또는 뇌혈관 아밀로이드증-영국형으로 공지됨), 가족성 덴마크형 치매(또한, 유전병 옵탈모-오토-엔세팔리카(heredopathia ophthalmo-oto-encephalica)로도 공지됨), 가족성 트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증 및 PrP 뇌 아밀로이드 맥관병증(PrP-CAA)으로부터 선택된 (c)의 질환으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경계 질환이 중추신경계(CNS) 질환인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 CNS 질환이 (i) CNS 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 및 (ii) CNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 CNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 CNS 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는 CNS 질환, 및 iii) CNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 CNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 CNS 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는 CNS 질환 중의 적어도 하나이고, 상기 CNS 뉴런 및 CNS 신경 세포가 뇌, 척수, 망막, 시신경, 뇌신경, 후각 신경 또는 후각 상피 중 적어도 하나에 존재하는, 방법.
  39. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 신경계 질환이 말초신경계(PNS) 질환인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 PNS 질환이 (i) PNS 뉴런의 사멸을 특징으로 하는 신경퇴행성 질환, 및 (ii) PNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 PNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 PNS 신경 세포 기능의 수준의 감소를 특징으로 하는 PNS 질환, 및 iii) PNS 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 PNS 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 PNS 신경 세포 기능의 수준의 증가를 특징으로 하는 PNS 질환 중의 적어도 하나이고, 상기 PNS 뉴런 및 PNS 신경 세포가 말초 신경절 또는 말초 신경 중 적어도 하나에 존재하는, 방법.
  41. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CNS 주입 부위가 대상체의 뇌 조직에 존재하는, 방법.
  42. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CNS 주입 부위가 대상체의 뇌실에 존재하는, 방법.
  43. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대상체의 CNS 주입 부위가
    (a) 신경계 질환에 의해 영향을 받는 신경 세포 섬유에 대한 표적 부위를 포함하는 CNS 부위,
    (b) 신경계 질환으로 인해 죽을 위험이 있는 뉴런 세포를 함유하는 CNS 부위,
    (c) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 감소 위험이 있는 뉴런 세포를 함유하는 CNS 부위,
    (d) 신경계 질환이 없는 것으로 공지된 대조군 대상체에서의 신경 세포 기능의 수준에 비해 적어도 하나의 신경 세포 기능의 수준의 증가 위험이 있는 뉴런 세포를 함유하는 CNS 부위,
    (e) 상기 캡슐이 실질적으로 혈액과 접촉하지 않도록 선택되는 CNS 부위 및
    (f) 투여 단계 후 상기 캡슐에 의해 분비되는 CSF 성분이 대상체의 뇌 전반에 걸쳐 CSF 순환에 의해 분포되도록 선택되는 CNS 부위로부터 선택되는, 방법.
  44. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체적합성 캡슐이 양이온성 가교결합제와 가교결합된 높은 만누론산 알기네이트의 코어 층, 반투막을 형성하는 폴리양이온의 중간 층, 및 양이온성 가교결합제와 가교결합된 높은 만누론산 알기네이트의 외부 층을 포함하고, 상기 코어 및 외부 층 중의 높은 만누론산 알기네이트가 동일하거나 상이하고 약 50% 내지 약 95%의 만누론산 잔기를 함유하고, 상기 폴리양이온 층이 폴리-L-리신으로 구성되지 않는, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 높은 만누론산 알기네이트가 약 300 kDa 초과, 1000 kDa 이하의 평균 분자량을 갖고, 상기 폴리양이온 층이 10 내지 40 kDa의 평균 분자량을 갖는 폴리양이온성 제제로부터 형성되는, 방법.
  46. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 캡슐을 CNS 부위에 투여하는 단계가 카테터를 통해 상기 캡슐을 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 전달 단계가 정위 장치를 사용하여 상기 카테터를 제어가능하게 위치시키는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 정위 장치가 심뇌 자극기(DBS) 마이크로드라이버, 무테(frameless) 정위 헤드 프레임, 두개골 장착 조준 장치, 렉셀 프레임(Leksell frame) 및 코스만-로버츠-웰스(Cosman-Roberts-Wells) 프레임인 정위 장치 또는 변형된 정위 장치를 포함하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 상기 카테터가 외부 카테터, 옵듀레이터, 플런저 및 전달 카테터를 포함하는, 방법.
  50. 제31항에 있어서, 상기 신경계 질환이 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 프리온병, 운동 뉴런 질환, 척수소뇌 실조증, 척수성 근위축증, 다계통 위축증-파킨슨 타입, 다계통 위축증-소뇌 타입, 본태성 진전, 진행성 핵상 마비, 이상운동증, 루이소체 치매, 본태성 진전, 약물-유발 파킨슨증, 운동 실조-모세혈관확장증, 척수소뇌 실조증, 소뇌 변성, 뇌 위축증, 올리브교소뇌 위축증, 피질 기저핵 변성증, 마이오클로누스성 소뇌 근실조(dyssynergia cerebellaris myoclonica), 프리드리히 실조증(Friedreich's ataxia); 정적 신경 질환, 뇌졸중, 중추 통증 증후군, 만성 통증, 편두통, 혀인두 신경통, 발작 장애, 간질, 뇌성 마비; 외상 관련 CNS 질환, 게르스트만 증후군(Gerstmann's syndrome), 락트-인 증후군(locked-in syndrome), 척수 손상, 진행성 신경퇴행성 질환, 노화 및 치매와 관련된 진행성 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 전두측두엽 치매, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 병(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease), 거대 축삭 신경병증, 유전성 신경병증, 영아 신경축삭 디스트로피, 크라베병, 랜도-크래프너 증후군(Landau-Kleffner syndrome), 척수 매독, 운동 뉴런 및 신경근 접합부 질환, 척수성 근위축증, 케네디병, 단일사지 근위축증, 근긴장이상증, 유전성 강직성 하지마비, 이삭 증후군(Isaacs' syndrome), 램버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 운동신경 질환, 하지 불안 증후군, 투렛 증후군; CNS의 염증성 질환, 다발성 경화증; 약물 또는 독소-유발성 CNS 질환, 신경이완 악성 증후군, 지연성 운동 장애, 윌슨병, 신경독성; 대사 부전의 신경계 질환, 레프섬병, 신경계 감염성 질환, 수막염, 급성 파종성 뇌척수염, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), AIDS의 신경학적 합병증, 보툴리누스 중독, 파상풍, 신경매독, 회색질척수염, 광견병, HIV/AIDS, 프리온병, 네글레리아 파울러리(Naegleria fowleri)(아메바성 뇌 감염); 뇌유낭미충증(neurocysticerosis); 신경정신병 질환, 우울증, 기분 장애; 강박성 장애, 섭식 장애, 중독, 불안-관련 장애, 양극성 장애, 주의력 결핍 과다행동 장애, 자폐증, 정신분열증; 신경내분비 질환, 기면증, 불면증, 하나 이상의 신경세포사와 관련 있거나 특징으로 하는 질환, 글루타메이트 독성, 단백질 응집체 또는 침착물, 또는 아밀로이드 플라크 형성, 뇌 아밀로이드 맥관병증, 아밀로이드증-아이슬란드형 유전성 뇌출혈(HCHWA-I), 아밀로이드증-네덜란드형 뇌출혈(HCHWA-D), 수막뇌혈관 및 안구연수막 아밀로이드증, 겔솔린-관련 척수 및 뇌 아밀로이드 맥관병증, 가족성 아밀로이드증-핀란드형(FAF), 혈관 변이체 프리온 뇌 아밀로이드증, 가족성 영국형 치매(FBD)(또한, 가족성 뇌 아밀로이드 맥관병증-영국형 또는 뇌혈관 아밀로이드증-영국형으로 공지됨), 가족성 덴마크형 치매(또한, 유전병 옵탈모-오토-엔세팔리카로도 공지됨), 가족성 트랜스티레틴(TTR) 아밀로이드증, PrP 뇌 아밀로이드 맥관병증(PrP-CAA); 미토콘드리아 기능 장애의 신경계 질환, 정상적인 건강한 대조군 대상체에서 발견되는 반응성 산소 종(ROS) 생산 수준을 초과하는 ROS 생산 수준을 포함하는 미토콘드리아 기능 장애의 신경계 질환; 뇌 유래 신경영양 인자 관련 장애, 양극성 장애, 레트 증후군(Rett Syndrome) 및 루빈스타인-테이비 증후군(Rubinstein-Taybi Syndrome)으로부터 선택되는, 방법.
  51. 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) 직경이 약 50㎛ 내지 약 200㎛이고 맥락총(CP) 상피 세포를 포함하는 CP 세포 클러스터를 수득하기 위해 포유동물 맥락총 조직의 기계적 및 효소적 분리 중 하나 또는 둘 다에 의해 수득되는 캡슐화된 맥락총(CP) 조직 단편인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실질적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개의 CP 세포를 갖는, 단계,
    (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 대상체의 하나의 말초신경계(PNS) 주입 부위에 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 PNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 투여 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 복수의 캡슐 중의 맥락총 조직 세포를, 맥락총 조직 세포가 접촉 단계 부재 하에서 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된 수준으로 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하도록 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 신경계 질환을 갖는 것으로 공지되거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서,
    (a) 다능성 세포 집단을 복수의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 수득하기에 충분한 조건하 및 시간 동안 배양함으로써 수득되는 캡슐화된 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포인 하나 이상의 반투과성 생체적합성 캡슐을 선택하는 단계로서, 실직적으로 모든 상기 캡슐의 직경이 약 400㎛ 내지 약 800㎛이고, 캡슐당 약 200 내지 약 10,000개의 CP 세포를 갖는, 단계,
    (b) 하나 또는 복수의 상기 캡슐을 대상체의 하나의 말초신경계(PNS) 주입 부위에 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 PNS 주입 부위에 투여하는 단계; 및
    (c) 상기 투여 단계 (b) 이전에, 동시에 또는 이후에, 하나 또는 복수의 캡슐 중의 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를, 맥락총 조직 세포가 접촉 단계 이전에 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준에 비해 변경된 수준으로 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 방출하도록 시험관내 분화된 맥락총(CP) 세포를 유도하는 맥락총 유도제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 맥락총 유도제가, 맥락총 조직 세포가 상기 접촉 단계 부재 하에서 하나 이상의 뇌척수액(CSF) 성분을 생성하는 수준보다 높은 수준으로 하나 이상의 CSF 성분의 생산을 유도하는, 방법.
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