JP2011518791A - ソルチリンに対する特異的リガンドの設計 - Google Patents

Abstract

本発明は、ソルチリン結晶および前記結晶を成長させるための方法を提供する。本発明はさらに、ソルチリンの結晶構造に基づいて特異的なリガンドを設計するための方法を提供する。本発明はまた、中枢神経系および末梢神経系の疾患、損傷、または障害の処置用の薬物を調製するためのそのようなリガンドの調製および使用に関する。

Description

出願または本出願に引用された全ての特許および非特許文献は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。

本発明は、ヒト受容体ソルチリン（ｓｏｒｔｉｌｉｎ）のＸ線結晶解析によって得られた原子座標により記載されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体の３次元構造に関する。本発明はさらに、ソルチリンの結晶を成長させる方法に関する。３次元構造に基づいて、ソルチリンの特異的な機能性に関する詳細な情報が得られる。本発明はさらに、ソルチリンの結晶構造に基づいたＶｐｓ１０ｐ−ドメインの特異的リガンドのスクリーニング方法、同定、および／または設計に関する。本発明はさらに、ソルチリン、ｐ７５^ＮＴＲと、ｐｒｏＮＧＦおよびｐｒｏＢＤＮＦなどのプロニューロトロフィンとの三元複合体の形成を阻害するための前記リガンドの調製および使用に関する。本発明はさらに、ソルチリンのアゴニストとして作用する能力があるリガンドの同定に関する。本発明はまた、中枢神経系および末梢神経系の疾患、損傷または障害を処置するためのそのようなリガンドの調製および使用に関する。

ニューロテンシン受容体３（ＮＴＲ３）、糖タンパク質９５（Ｇｐ９５）、またはＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ．Ｑ９９５２３の１００ｋＤａ ＮＴ受容体と呼ばれることもあるソルチリンは、数あるリガンドの中でも、神経栄養因子およびニューロペプチドを結合する独特なＶｐｓ１０ｐ−ドメイン（Ｖｐｓ１０ｐ−Ｄ）によって定義される（４〜８）ニューロン受容体の哺乳類ファミリーの原型メンバーである（１〜３）。このドメインは、ソルチリンの全体的な管腔部分を構成し（ｓソルチリン）、リガンド結合のために酵素的プロペプチド切断により活性化される（４、５）。ソルチリンは、エンドサイトーシスおよび細胞内選別の能力がある多機能性１型受容体であり（９〜１１）、最近示されたように、ｐ７５^ＮＴＲ媒介性神経細胞アポトーシスのプロニューロトロフィン誘導をトリガーすることによるシグナル伝達にも関与している（６、７、１２、１３）。ソルチリンは、プロタンパク質として合成され、それは酵素的切断および短いＮ末端プロペプチドの除去によって成熟ソルチリンへ変換される。成熟受容体だけがリガンドを結合し、興味深いことに、全てのその既知のリガンド、例えば、ニューロテンシン（ＮＴ）、リポタンパク質リパーゼ、神経成長因子−βの前駆体（ｐｒｏＮＧＦ）および脳由来神経栄養因子の前駆体（ｐｒｏＢＤＮＦ）、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）およびそれ自体のプロペプチドが結合において競合し（５〜７、１０）、多様なリガンドが共有された、または部分的に共有された結合部位を標的にすることを示している。

米国特許第６，０１３，４７８号 米国特許第４，５５４，１０１号 米国特許第４，８１６，２５８号 米国特許第４，９２７，４０８号 米国特許第４，９０４，４７５号 米国特許第４，５８８，５８０号 米国特許第４，７８８，０６２号

KyteおよびDoolittle、1982年 Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85巻、2149〜2146頁、1963年 SmithおよびWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2巻、482頁 NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48巻、443頁 PearsonおよびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85巻、2444頁 Rusinko (1993) Chem. Des. Auto. News 8巻、44〜47頁 GoodsellおよびOlsen (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics、8巻、195〜201頁 Kuntzら、(1982) J. Mol. Biol. 161巻、269〜288頁 Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives、HadgraftおよびGuy（編）、Marcel Dekker, Inc.、(1989) Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications、RobinsonおよびLee（編）、Marcel Dekker Inc.(1987) Transdermal Delivery of Drugs、1〜3巻、KydonieusおよびBerner（編）、CRC Press、(1987)

ＮＴはトリデカペプチドであり、ソルチリン、ＳｏｒＬＡ（別のＶｐｓ１０ｐ−Ｄ受容体）、ならびに２つのＧタンパク質共役型受容体ＮＴＲ１およびＮＴＲ２に結合する（４、１４〜１６）。ソルチリンとの関連でのＮＴの生理学的役割は十分には解明されていないが（１７）、やはりＮＴは、全ての他のリガンドがソルチリンＶｐｓ１０ｐ−Ｄに結合するのを阻害するため、重要なツールである。

主要な態様において、本発明は
ａ）配列番号１のポリペプチド；
ｂ）変異体が前記配列番号１と少なくとも６０％の配列相同性を有する、前記ポリペプチドの配列変異体；
ｃ）ａ）〜ｂ）のいずれかの少なくとも２００個の連続したアミノ酸を含む断片であって、前記断片がソルチリン活性を示す、断片；
ｄ）少なくとも１つのリガンドと複合体を形成したａ）〜ｃ）のいずれか
を含む結晶に関する。

さらなる態様において、本発明はさらに、結晶を成長させる方法であって、
ａ．５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中に配列番号１のポリペプチドまたはその断片もしくは変異体の４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬを含む組成物を得る段階と、
ｂ．ｉ．１：１．５〜１：１５（ｓソルチリン：ＮＴ）または
ｉｉ．１：４（ｓソルチリン：プロペプチド）
のモル比でニューロテンシンと前記組成物を混合する段階と、
ｃ．前記組成物および結晶化溶液、それぞれ等容量を曝す段階であって、前記結晶化溶液が
ｉ．１８〜２１％ ｗ／ｖのＰＥＧ６０００、および
ｉｉ．０〜１５％のグリセロール、および
ｉｉｉ．Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２〜７．８（４０〜９３ｍＭのＴｒｉｓおよび１００ｍＭのＨＥＰＥＳ）または１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９、３〜６％のグリセロール、および
ｉｖ．３００〜９００ｍＭのＮａＣｌ、またはマロン酸でｐＨ６〜７．５に調整されている１５０〜４００ｍＭのＣ_３Ｈ_２Ｎａ_２Ｏ_４、または３００〜５００ｍＭのＬｉＳＯ_４、また５００〜７００ｍＭのＫＣｌ
を含む段階と、
ｄ．配列番号１またはその断片もしくは変異体を含む結晶を得る段階と
を含む結晶を成長させる方法に関する。

別の態様において、本発明は、図１７〜２０のいずれかに示されているソルチリンの構造座標の少なくとも一部でコードされるデータ記憶材料を含むコンピュータ可読データ記憶媒体に関する。

さらに別の態様において、本発明は、
ａ．結合部位１、もしくは
ｂ．結合部位２、もしくは
ｃ．結合部位３、
またはａ〜ｃの断片もしくは変異体
の１つまたは複数に結合する能力があるリガンドを同定する方法における、図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標の使用に関する。

さらなる態様において、本発明は、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する能力があるリガンドを同定する方法に関し、前記方法は
ａ）図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標を用いてコンピュータスクリーン上で結合部位の空間的構造を作成する段階と、
ｂ）コンピュータスクリーン上で空間的構造を有する可能性のあるリガンドを作成する段階と、
ｃ）立体障害なしに結合相互作用部位セットの少なくとも１つのアミノ酸残基に結合することができるリガンドを選択する段階と
を含む。

別の態様において、本発明は、プロセッサー、データ記憶システム、データ入力装置、およびデータ出力装置を含むプログラムされたコンピュータを用いて、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する能力があるソルチリンのリガンドを同定するためのコンピュータ支援方法であって、
ａ）前記ソルチリンの原子のサブセットの原子座標を含むデータを、前記入力装置を通してプログラムされたコンピュータへ入力し、それによって基準データセットを作成する段階であって、前記原子座標が図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から選択され、または原子座標が３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される段階と、
ｂ）前記プロセッサーを用いて、データ記憶システムに記憶された低分子量有機化学構造およびペプチド断片のコンピュータデータベースと基準データセットを比較する段階と、
ｃ）前記データベースから、コンピュータによる手段を用いて、基準データセットと構造的に相補的である部分を有し、受容体ソルチリンとの立体障害を含まない化学構造を選択する段階
を含む方法に関する。

さらに別の態様において、本発明はリガンドを同定するための方法に関し、前記方法は、
ａ）コンピュータモデリングと連動した原子座標を用いて、コンピュータモデリングによって作成された配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体における１セットの結合相互作用部位へ可能性のあるリガンドを結合し、ソルチリンの前記セットの結合相互作用部位における少なくとも１つのアミノ酸に結合する能力がある可能性のあるリガンドを選択することにより、可能性のあるリガンドを選択する段階であって、前記原子座標が、図１７〜２０のいずれかに提示された原子座標であり、または原子座標が、３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される段階と
ｂ）前記可能性のあるリガンドおよび前記受容体ソルチリンを供給する段階と、
ｃ）可能性のあるリガンドを前記受容体ソルチリンと接触させる段階と、
ｄ）可能性のあるリガンドによる前記受容体ソルチリンの結合を検出する段階と
を含む。

さらなる態様において、本発明は、ソルチリンの結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体の可能性のあるリガンドを同定する方法に関し、前記方法は、
ａ）３次元構造決定に基づいた、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体の立体構造を定義する原子座標から引き出される情報をコンピュータへ導入する段階であって、それにより、コンピュータプログラムが前記立体構造の構造をコンピュータスクリーン上で利用またはディスプレイし、前記原子座標が図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から選択され、または原子座標が３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかによって表された３次元構造のいずれか１つから偏位する３次元構造から選択される段階と、
ｂ）コンピュータスクリーン上で前記コンピュータプログラムによってソルチリンの結合部位１、結合部位２、または結合部位３の３次元表示を作成する段階と、
ｃ）前記結合部位１、結合部位２、および結合部位３の表示上に可能性のあるリガンドのモデルを重ねる段階と、
ｄ）ソルチリンの結合部位１（高親和性ニューロテンシン結合部位）、結合部位２（低親和性ニューロテンシン結合部位）、結合部位３（プロニューロトロフィン結合部位）、またはそれらの断片もしくは変異体との可能性のあるリガンドの結合の可能性および立体障害の非存在を評価する段階と、
ｅ）前記受容体ソルチリンの結合アッセイにおいて前記可能性のあるリガンド化合物を組み入れる段階と、
ｆ）配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）、および配列番号１２（ＮＴ６９Ｌ）からなる群から選択される競合するリガンドの結合を前記可能性のあるリガンドが阻害するかどうかを決定する段階
を含む。

別の態様において、本発明は、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体タンパク質分子の原子モデルを構築するための方法であって、
ａ．配列番号１と少なくとも２０％の配列相同性を有する、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体またはその断片もしくは変異体を同定する段階と、
ｂ．図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標を利用して、相同性モデリングによって同定されたＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体の原子モデルを得る段階と
を含む方法に関する。

重要な態様において、本発明は、本明細書の上記に定義された方法によって同定されるリガンド化合物に関する。

一態様において、本発明は、本明細書の上記に記載された方法によって同定されたリガンドであって、前記リガンドが前記結合部位１の少なくとも１つの相互作用点に結合する能力があり、前記相互作用点が図１４のＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｊ_１、Ｊ_２、およびＪ_３を含み、
Ｘ_１が配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、およびＹ３５１を含み、
Ｘ_２がＹ３５１のバックボーンカルボニルを含み、
Ｘ_３がＩ３５３のバックボーンを含み、
Ｘ_４がＫ２６０のアミノ基を含み、
Ｒ_１がアミノ酸残基Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｙ３５１、Ｉ３５３、およびＭ３６３を含み、
Ｒ_２がＦ３５０、およびアミノ酸残基Ｔ３９７〜Ｅ４０１を含むループ由来の少なくとも１つのアミノ酸を含み、
Ｊ_１がＳ３０５を含み、
Ｊ_２がＦ３０６のバックボーンアミドを含み、
Ｊ_３がＦ３０６のバックボーンカルボニルを含む
リガンドに関する。

別の態様において、本発明は、本明細書の上記で記載されているように同定されたソルチリンの阻害剤を含む薬剤に関する。

さらなる態様において、本発明は、薬剤の製造のための、本明細書の上記で記載された方法によって同定された少なくとも１つのリガンドの使用であって、前記薬剤が、個体の神経系の疾患、障害、または損傷の処置用である使用に関する。

重要な態様において、本発明は、本明細書で定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、以下の式（Ｉ）の一般構造を有するリガンドに関する：

［式中、Ｘは水素供与体として働く原子であり、前記原子がＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択される水素結合受容体として働く電気陰性原子であり、
Ｒ_１は、Ｃ３〜６アルキル、Ｃ４〜６シクリル、それぞれが４〜６員環の１つの環および１〜３つのヘテロ原子を有する複素環式または複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_０〜２からなる群から選択される１〜３つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
Ｒ_２は、水素、Ｃ１〜１２のアルキル、またはそれぞれが３〜８員環の１〜３つの環および０〜４つのヘテロ原子を有する芳香族、炭素環式、複素環式、もしくは複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_０〜２からなる群から選択される１〜８つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
Ｒ_３は、水素、ＳＨ、イミダゾール、Ｃ１〜１２アルキル、またはそれぞれが３〜８員環の１〜３つの環および０〜４つのヘテロ原子を有する芳香族、炭素環式、複素環式、もしくは複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される１〜８つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
Ｒ_４は、官能基Ｃ１〜１００直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐アルケニル、直鎖または分岐アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、ハロホルミル、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、炭酸エステル、カルボン酸、カルボキシル、エーテル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、アンモニウム、第一級ケチミン、第二級ケチミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ（ジイミド）、シアン酸、イソシアン化物、イソチオシアン酸、硝酸、ニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、ホスフィノ、リン酸、ホスホノ、スルホニル、スルフィニル、スルフィドリル（ＳＨ）、チオシアン酸、ジスルフィド、リンカーＬ２またはＬ３、および配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列またはその断片から選択される］。

さらなる重要な態様において、本発明は、本明細書で定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、以下の式（ＩＩ）の一般構造を有するリガンドに関する：

［式中、Ｚは、カルボニル、ヒドロキシル、アミノ、イミノ、アミド、スルフィドリル、クロロ、フルオロからなる群から選択される水素結合供与体または受容体であり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_３、およびリンカーＬ２からなる群から選択され、
Ｒ_６は、Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_３、および−ＯＣＨ_３からなる群から選択され、
Ｒ_７は、グルタミン酸、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、メチオニン、システイン、脂肪族Ｃ４〜６基の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_８は、チロシン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、フェニルアラニン、ヨードチロシン、および−ＣＨ_２−ＮＨ_２の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_９は、リシン、アルギニン、グルタミン、Ｃ３〜８脂肪族基およびヘテロ脂肪族基、５員環または６員環を含む炭素環式基および複素環式基の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_１０は、ピログルタミン酸、ポリ炭水化物、および１０以上の長さのポリペプチドからなる群から選択され、
Ｒ_１１およびＲ_１２は個々に、Ｈ、Ｃ１〜１２直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐アルケニル、直鎖または分岐アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、ハロホルミル、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、炭酸エステル、カルボン酸、カルボキシル、エーテル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、アンモニウム、第一級ケチミン、第二級ケチミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ（ジイミド）、シアン酸、イソシアン化物、イソチオシアン酸、硝酸、ニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、ホスフィノ、リン酸、ホスホノ、スルホニル、スルフィニル、スルフィドリル（ＳＨ）からなる群から選択され、
共有結合（１）および（２）は個々に、一重結合および二重結合からなる群から選択される］。

非常に重要な態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、以下の式（ＩＩＩ）の一般構造を有するリガンドに関する：

［式中、Ｒ_１３は、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、アルケニル、アルキニル、およびリンカーＬ３からなる群から選択され、
Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｒ_１７、Ｒ_１９、Ｒ_２０は個々に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され、
Ｒ_１６は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、リシン、および脂肪族Ｃ３〜７の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_１８は、Ｈ、−ＣＨ_３、および−ＣＨ_２ＯＨからなる群から選択され、
共有結合（１）および（２）は個々に、一重結合および二重結合からなる群から選択される］。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｃｈｇ）である。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたｉｏｄｏＹＩＬである。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＱＩＬであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＹＣＬである。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたｄＹＩＬである。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＹＨＬであるに関し、ここで、リガンドは。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ａｃｃ）である。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｎＭｅ）Ｌである。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、ここで、リガンドは図２６に示されたＹＩＬである。

別の態様において、本発明は、対象における病的状態の処置方法であって、それを必要とする個体に本明細書の上記の治療有効量の薬剤を投与することを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類神経細胞においてアポトーシスを防ぐ方法であって、本明細書の上記に定義されているリガンド分子に前記神経細胞を曝すことを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類神経細胞の生存を増強する方法であって、本明細書の上記に定義されているリガンド分子に前記神経細胞を曝すことを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類細胞の組織を増殖させる方法であって、本明細書の上記に定義されているリガンド分子を前記組成物に投与することを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類細胞の組織を分化させる方法であって、本明細書の上記に定義されているリガンド分子を前記組成物に投与することを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、配列番号１の結合部位１に結合する能力がある抗体に関する。

さらなる態様において、本発明は、配列番号１の結合部位２に結合する能力がある抗体に関する。

さらなる態様において、本発明は、配列番号１の結合部位３に結合する能力がある抗体に関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書の上記に記載された抗体を含むイムノコンジュゲートに関し、コンジュゲートは、化学療法剤、毒素、または放射性同位元素などの細胞傷害性薬剤；アビジンもしくはストレプトアビジンまたは抗原などの特異的結合ペアのメンバー；検出可能な生成物を生じる活性がある酵素からなる群から選択される。

発明の詳細な説明
定義
アジュバント：投与される免疫原性決定因子／抗原との混合が前記決定因子に対する免疫応答を増加させる、または別の形で改変する任意の物質。

親和性：たいていのリガンドのそれらの結合部位との相互作用は、結合親和性に関して特徴づけることができる。一般的に、高親和性リガンド結合は、リガンドとその受容体とのより強い分子間力から生じるが、低親和性リガンド結合は、リガンドとその受容体とのより弱い分子間力を伴う。一般的に、高親和性結合は、低親和性結合の場合より、リガンドのその受容体結合部位でのより長い滞留時間を伴う。リガンドの受容体への高親和性結合は、結合エネルギーの一部を用いて受容体に立体構造的変化を引き起こすことができ、結果として、関連イオンチャネルまたは酵素の挙動の変化を生じる場合、生理学的に重要であることが多い。受容体に結合し、受容体の機能を変化させ、生理的応答をトリガーすることができるリガンドは、その受容体のアゴニストと呼ばれる。アゴニストの受容体への結合は、どれくらい生理的応答をトリガーすることができるかということ、および生理的応答を生じるのに必要とされるアゴニストの濃度の両方に関して特徴づけることができる。高親和性リガンド結合は、比較的低濃度のリガンドが、最大限にリガンド結合部位を占有して、生理的応答をトリガーするのに十分であることを意味する。低親和性結合は、結合部位が最大限に占有され、リガンドに対する最大生理的応答が達成されるには比較的高い濃度のリガンドが必要とされることを意味する。リガンド結合は、解離定数（ｋ_ｄ）として知られている、受容体結合部位の半分が占有される時点のリガンドの濃度に関して特徴づけられることが多い。

アルコール：１つまたは複数のヒドロキシル基（ＯＨ）を含む有機化合物の類。この状況において、飽和または不飽和、分岐または分岐していない炭水化物基がより大きい分子上の置換基として位置する。

脂環式基：用語「脂環式基」は、脂肪族基の特性に似た特性を有する環式炭水化物基を意味する。

脂肪族基：本発明の文脈において、用語「脂肪族基」は、飽和または不飽和の直鎖または分岐の炭水化物基を意味する。この用語は、例えば、アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基を含むように用いられる。

アルキル基：用語「アルキル基」は、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ヘプチル、ドデシル、オクタデシル、アミル、２−エチルヘキシルなどを含む飽和の直鎖または分岐の炭水化物基を意味する。

アルケニル基：用語「アルケニル基」は、ビニル基などの１つまたは複数の炭素−炭素二重結合を有する不飽和の直鎖または分岐の炭水化物基を意味する。

アルキニル基：用語「アルキニル基」は、１つまたは複数の炭素−炭素三重結合を有する不飽和の直鎖または分岐の炭水化物基を意味する。

両親媒性物質：極性水溶性基と非極性不水溶性基の両方を含む物質。

アゴニスト：アゴニストは、受容体などのエフェクターの活性を増加させる能力がある化合物である。具体的には、ソルチリンアゴニストは、結合部位１、２、および３の１つまたは複数に結合し、それにより、所与の内因性アゴニストリガンド化合物と同じ生理的応答を誘導する能力がある化合物である。

アンタゴニスト：アンタゴニストは、受容体などのエフェクターの活性を減少させる能力がある化合物である。具体的には、ソルチリンアンタゴニストは、結合部位１、２、および３の１つまたは複数に結合し、それにより別のリガンドの結合を阻害し、それに従って、生理的応答を阻害する能力がある化合物である。

アポトーシス：アポトーシスは、多細胞生物体における細胞による自殺の過程である。それは、プログラム細胞死（ＰＣＤ）の主な型の１つであり、特徴的な細胞形態および細胞死をもたらす組織化された一連の生化学的事象を含む。

アポトーシス阻害剤：アポトーシスの過程を減少させる能力がある化合物。

芳香族基：用語「芳香族基」または「アリール基」は、単環式または多環式芳香族炭水化物基を意味する。

結合：用語「結合」または「と会合した」とは、化学的実体もしくは化合物、またはそれらの部分の間での近接の状態を指す。その結びつきは、近位が水素結合またはファンデルワールス相互作用もしくは静電相互作用によってエネルギー的に有利である非共有結合であってもよいし、共有結合であってもよい。

結合部位：本明細書に用いられる場合、用語「結合部位」または「結合ポケット」は、その形状の結果として、もう１つの分子、分子複合体、化学的実体、または化合物と有利に会合する分子または分子複合体の領域を指す。本明細書に用いられる場合、ポケットは少なくとも深い空洞、および任意で、浅い空洞を含む。

結合部位１：ニューロテンシンの高親和性結合部位または同義の結合部位１は、ニューロテンシンまたはニューロテンシンの断片もしくは変異体への高親和性を有し、かつソルチリンプロペプチドまたはその断片（配列番号１のアミノ酸残基３４〜７７）への親和性を有するソルチリン（配列番号１）の結合部位であり、前記結合部位が、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、Ｔ３９８〜Ｇ４００、Ｉ３０３〜Ｇ３０９、Ｑ３４９〜Ａ３５６、Ｙ３９５、およびＴ４０２を含む。より好ましくは、結合部位１は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、およびＴ３９８〜Ｇ４００を含む。最も好ましくは、ソルチリンの結合部位１は、配列番号１のアミノ酸Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、およびＦ３５０〜Ｍ３６３を含む。結合部位１は不規則で複雑な（promiscuous）結合部位である。

結合部位２：ニューロテンシンまたはニューロテンシンの断片もしくは変異体への低親和性を有するソルチリンの結合部位であり、前記結合部位が、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、Ｗ５９７、Ｔ１６８〜Ｉ１７４、Ｌ５７２、Ａ５７３、およびＳ５８４〜Ｆ５８８を含む。より好ましくは、ニューロテンシンのソルチリン低親和性結合部位は、配列番号１のアミノ酸Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、およびＷ５９７を含む。最も好ましくは、ニューロテンシンのソルチリン低親和性結合部位は、アミノ酸Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２を含む。結合部位２は不規則で複雑であり、ソルチリンのプロペプチド（配列番号１のアミノ酸残基３４〜７７）を結合する場合もある。

結合部位３：配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｓ４２０、Ｄ４２２、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｅ４２６、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｅ４７０、Ｉ４９８、Ｓ４９９、およびＶ５００を含み、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含み、最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含むソルチリンの不規則で複雑な結合部位。

生物活性剤：本明細書に用いられる場合、用語「生物活性剤」は、例えば、患者において疾患の存在または非存在を診断するための方法、および／または患者において疾患の処置のための方法においてなど、治療的または診断的である適用に関連して用いることができる任意の物質を指す。「生物活性剤」は、インビトロおよび／またはインビボで生物学的効果を発揮する能力がある物質を指す。生物活性剤は、中性、正荷電、または負荷電であり得る。適切な生物活性剤として、例えば、プロドラッグ、診断剤、治療剤、医薬品、薬物、酸素運搬剤、代用血液、合成有機分子、ポリペプチド、ペプチド、ビタミン、ステロイド、ステロイド類似体、ならびに、ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチドを含む遺伝的決定因子が挙げられる。

脳虚血：全脳虚血は、脳が、正常な神経機能を維持するのに十分な血流を受けていない虚血状態である。

カチオン性基：化学基を含む化合物が、溶媒に溶解している場合、好ましくは、水に溶解している場合、プロトン供与体として機能する能力がある化学基。

複合体：本明細書に用いられる場合、用語「複合体」は、化学的実体と会合した、分子またはタンパク質、その保存的類似体もしくは切断型の組み合わせを指す。

座標：本明細書で用いられる場合、用語「座標」は、タンパク質構造に寄与する原子の３次元組織化の情報を指す。結晶の成分の原子座標を含む最終マップは、データ記憶媒体に保存してもよい；典型的には、データは、ＰＤＢフォーマットまたはｍｍＣＩＦフォーマットで保存され、それらのどちらも当業者に知られている。しかしながら、結晶座標はなお、単純な表またはテキストフォーマットで保存してもよい。ＰＤＢフォーマットは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙによって提供された使用説明書およびガイドラインに従って構成されている。

結晶：用語「結晶」は、物質の秩序状態を指す。タンパク質は、その性質からして、均一になるまで精製することは困難である。高度に精製されたタンパク質でさえも、修飾、リガンドの結合、または多数の他の効果により恒常的にに不均一であり得る。加えて、タンパク質は、標的分子だけでなく、緩衝液、塩、沈殿剤、水、およびいくつもの小さな結合タンパク質を含み得る一般的に複雑な溶液から結晶化される。タンパク質結晶が、タンパク質だけでなく、溶媒分子、特に水の大部分でも構成されていることに注意することは重要である。これらは、３０％から９０％までも、様々であり得る。タンパク質結晶は、より大量で、様々な不純物を蓄積する可能性があり、その不純物は、ここで列挙し、または詳細に予想することはできない。しばしば、不均一な塊が、核形成中心としての役割を果たし、結晶がそれらの周りに容易に成長する。当業者は、ある結晶が他のものより良く回折することを知っている。結晶は、かろうじて目に見える２０ミクロンから１ミリメートルまで、またはそれ以上、サイズは様々である。Ｘ線解析に有用な結晶は、典型的には、単一で、０．０５ｍｍ以上、かつ亀裂および欠損がない。

環式基：用語「環式基」は、脂環式基、芳香族基、または複素環式基として分類される閉環炭化水素基を意味する。

シクロアルケニル：環あたり３〜８つの炭素の１つ、２つ、または３つの環からなる一価不飽和炭素環式遊離基を意味し、任意で、ヒドロキシ、シアノ、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、アルケニルチオ、ハロ、ハロアルケニル、ヒドロキシアルケニル、ニトロ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルケニルアミノ、アルケニルスルホニル、アリールスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、アルケニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルケニルカルボニルアミノ、およびアリールカルボニルアミノからなる群から選択される１つまたは２つの置換基で置換することができる。

シクロアルキル：環あたり３〜８つの炭素の１つ、２つ、または３つの環からなる一価飽和炭素環式遊離基を意味し、任意で、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトロ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、およびアリールカルボニルアミノからなる群から選択される１つまたは２つの置換基で置換することができる。

双極子相互作用：本明細書で用いられる場合、用語「双極子相互作用」は、２つ以上の極性分子の間で起こり得る引力を指す。したがって、「双極子相互作用」は、第１の極性分子の非荷電の部分的陽性末端の、第２の極性分子の非荷電の部分的陰性末端への引力を指す。「双極子相互作用」はまた、分子間水素結合も指す。

静電相互作用：本明細書で用いられる場合、用語「静電相互作用」は、反対の電荷の成分がお互いに引きつけ合う場合の引力によって、荷電した成分、分子、またはイオンの間で起こる任意の相互作用を指す。例としては、イオン性相互作用、共有結合性相互作用、イオンと双極子（イオンと極性分子）の間の相互作用、２つの双極子（極性分子の部分的電荷）間の相互作用、水素結合、およびロンドン分散結合（分極性分子の誘起双極子）が挙げられるが、それらに限定されない。したがって、例えば、「イオン性相互作用」または「静電相互作用」は、第１の正荷電分子と第２の負荷電分子の間の引力を指す。イオン性相互作用または静電相互作用として、例えば、負荷電生物活性剤の間の引力が挙げられる。

環を形成する：環構造が形成される場合、言及された原子が、結合を通して連結されていることを意味する。

断片：本発明によるポリペプチド断片は、その任意の機能性等価物を含めて、一実施形態において、４５０個未満のアミノ酸残基などの５００個未満のアミノ酸残基、例えば、３５０個未満のアミノ酸残基などの４００個未満のアミノ酸残基、例えば、３００個未満のアミノ酸残基などの３５０個未満のアミノ酸残基、例えば、２４０個未満のアミノ酸残基などの２５０個未満のアミノ酸残基、例えば、２００個未満のアミノ酸残基などの２２５個未満のアミノ酸残基、例えば、１６０個未満のアミノ酸残基などの１８０個未満のアミノ酸残基、例えば、１４０個未満のアミノ酸残基などの１５０個未満のアミノ酸残基、例えば、１２０個未満のアミノ酸残基などの１３０個未満のアミノ酸残基、例えば、１００個未満のアミノ酸残基などの１１０個未満のアミノ酸残基、例えば、８５個未満のアミノ酸残基などの９０個未満のアミノ酸残基、例えば、７５個未満のアミノ酸残基などの８０個未満のアミノ酸残基、例えば、６５個未満のアミノ酸残基などの７０個未満のアミノ酸残基、例えば、５５個未満のアミノ酸残基などの６０個未満のアミノ酸残基、例えば、５０個未満のアミノ酸残基を含む。ニューロテンシンの断片としては、ニューロテンシンＰＹＩＬおよびＹＩＬのＣ末端アミノ酸が挙げられるが、それらに限定されない。

基（部分／置換）：当技術分野においてよく理解されているように、高程度の置換は許容されるだけでなく、得策であることが多い。置換は、本発明の物質において予測される。本出願を通して用いられる特定の専門用語の議論および詳述を簡素化する手段として、用語「基」および「部分」は、置換を可能にさせる、または置換することができる化学種と、置換を可能にさせない、または置換することができない化学種とを区別するために用いられる。したがって、用語「基」が化学的置換基を記載するために用いられる場合、記載された化学物質は、未置換基、およびカルボニル基または他の通常の置換に加えて鎖中に、例えば、Ｏ、Ｎ、またはＳ原子を有する基を含む。用語「部分」が化合物または置換基を記載するために用いられる場合、未置換化学物質のみが含まれるものとする。例えば、用語「アルキル基」は、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルなどの純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなどの当技術分野において知られたさらなる置換基を有するアルキル置換基も含むものとする。したがって、「アルキル基」は、エーテル基、ハロアルキル、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、スルホアルキルなどを含む。他方、用語「アルキル部分」は、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチルなどの純粋な開鎖飽和炭化水素アルキル置換基のみの包含に限定される。同じ定義は、「アルケニル基」と「アルケニル部分」；「アルキニル基」と「アルキニル部分」；「環式基」と「環式部分」；「脂環式群」と「脂環式部分」；「芳香族基」または「アリール基」と「芳香族部分」または「アリール部分」；さらに、「複素環式基」と「複素環式部分」に適用される。

複素環式基：用語「複素環式基」は、環における原子の１つまたは複数が炭素以外の要素（例えば、窒素、酸素、イオウなど）である閉環炭化水素を意味する。

ヘテロシクリル：（Ｎ、Ｏ、またはＳ（Ｏ）_０〜２から選択される）１つまたは２つの環ヘテロ原子を組み入れた、環あたり３〜８つの原子の１〜２つの環からなる一価飽和環式遊離基を意味し、任意で、ヒドロキシル、オキソ、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトロ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、またはアリールカルボニルアミノからなる群から選択される１つまたは２つの置換基で置換されてもよい。

ヘテロアリール：環内に（窒素、酸素、またはイオウから選択される）１つまたは２つのヘテロ原子を組み入れた、環あたり４〜８つの原子の１〜３つの環を有する一価芳香族環式遊離基を意味し、任意で、ヒドロキシ、シアノ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、ニトロ、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、およびアリールカルボニルアミノからなる群から選択される１つまたは２つの置換基で置換されてもよい。

相同性：アミノ酸配列間の相同性は、周知のスコアリングマトリックスを用いて計算することができる。例えば、ＢＬＯＳＵＭ ３０、ＢＬＯＳＵＭ ４０、ＢＬＯＳＵＭ ４５、ＢＬＯＳＵＭ ５０、ＢＬＯＳＵＭ ５５、ＢＬＯＳＵＭ ６０、ＢＬＯＳＵＭ ６２、ＢＬＯＳＵＭ ６５、ＢＬＯＳＵＭ ７０、ＢＬＯＳＵＭ ７５、ＢＬＯＳＵＭ ８０、ＢＬＯＳＵＭ ８５、およびＢＬＯＳＵＭ ９０のいずれか１つなどが挙げられる。

配列番号１〜１３の断片と、各々相同性を共有する断片は、それらが前記所定の断片配列と、各々、好ましくは、少なくとも約６０パーセントの相同性、例えば、少なくとも６５パーセントの相同性、例えば、少なくとも７０パーセントの相同性、例えば、少なくとも７５パーセントの相同性、例えば、少なくとも８０パーセントの相同性、例えば、少なくとも８５パーセントの相同性、例えば、少なくとも９０パーセントの相同性、例えば、少なくとも９４パーセントの相同性などの少なくとも９２パーセントの相同性、例えば、少なくとも９６パーセントの相同性などの少なくとも９５パーセントの相同性、例えば、少なくとも９８パーセントの相同性などの少なくとも９７パーセントの相同性、例えば、少なくとも９９パーセントの相同性を有する場合場合、本発明の範囲内にあるとみなすことができる。本発明の一実施形態によれば、相同性パーセンテージは同一性パーセンテージを指す。

ペプチド断片の構造と機能の関係を決定するためのさらに適切に対応できる方法は、参照により本明細書に組み入れられた米国特許第６，０１３，４７８号（特許文献１）に記載されている。また、アミノ酸配列の受容体部分への結合をアッセイする方法は当業者に知られている。

好ましい所定のプロニューロトロフィン活性モジュレーターまたはその断片の任意の位置へ導入される保存的置換に加えて、そのようなプロニューロトロフィン活性モジュレーターの任意の１つまたは複数の位置に非保存的な置換を導入することが望ましい場合もある。

プロニューロトロフィン活性モジュレーターの機能的等価断片の形成をもたらす非保存的な置換は、例えば、ｉ）極性が実質的に異なる、例えば、非極性側鎖を有する残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＭｅｔ）がＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、もしくはＧｌｎなどの極性側鎖を有する残基またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、もしくはＬｙｓなどの荷電アミノ酸に対して置換する、または荷電もしくは極性残基を非極性残基の代わりに用いる；および／またはｉｉ）ＰｒｏもしくはＧｌｙの置換またはＰｒｏもしくはＧｌｙの代わりに別の残基による置換などのポリペプチドバックボーン配向への効果が実質的に異なる；および／またはｉｉｉ）電荷が実質的に異なる、例えば、ＧｌｕもしくはＡｓｐなどの負荷電残基のＬｙｓ、Ｈｉｓ、もしくはＡｒｇなどの正荷電残基の代わりとしての置換（および逆もまた同様）；および／またはｉｖ）立体容積が実質的に異なる、例えば、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、もしくはＴｙｒなどの大きな残基の、より小さい側鎖を有する残基、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、もしくはＳｅｒを有する残基の代わりとしての置換（および逆もまた同様）である。

アミノ酸の置換によって得られる変異体は、１つの好ましい実施形態において、電荷、サイズなどを含むアミノ酸側鎖置換基の疎水性値および親水性値ならびに相対的類似性に基づいて作製することができる。様々な前述の特徴を考慮する例示的なアミノ酸置換は、当業者によく知られており、それらには、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシン、とイソロイシンが挙げられる。

本明細書に記載された変異体に加えて、立体的に類似した変異体を、変異体構造の重要な部分を模倣するように組み立ててもよく、そのような化合物もまた、本発明の変異体と同じ様式で用いることができる。これは、当業者に公知のモデリングおよび化学的設計の技術によって達成することができる。全てのそのような立体的に類似した構築物は本発明の範囲内にあることは理解されているであろう。

さらなる実施形態において、本発明は、それが置換したアミノ酸の値の＋／−４．９内、例えば、＋／−４．５内などの＋／−４．７内、例えば、＋／−４．１内などの＋／−４．３内、例えば、＋／−３．７内などの＋／−３．９内、例えば、＋／−３．３内などの＋／−３．５内、例えば、＋／−２．９内などの＋／−３．１内、例えば、＋／−２．５内などの＋／−２．７内、例えば、＋／−２．１内などの＋／−２．３内、例えば、＋／−１．８内などの＋／−２．０内、例えば、＋／−１．５内などの＋／−１．６内、例えば、＋／−１．３内などの＋／−１．４内、例えば、＋／−１．１内などの＋／−１．２内、例えば、＋／−０．９内などの＋／−１．０内、例えば、＋／−０．７内などの＋／−０．８内、例えば、＋／−０．５内などの＋／−０．６内、例えば、＋／−０．３内などの＋／−０．４内、例えば、＋／−０．２内などの＋／−０．２５内である親水性値またはヒドロパシー指標を有する置換アミノ酸を含む、機能性変異体に関する。

相互作用的な生物学的機能のタンパク質への付与における親水性およびヒドロパシーのアミノ酸指標の重要性は、当技術分野においてよく理解されている（KyteおよびDoolittle、1982年（非特許文献１）、ならびにHopp、米国特許第４，５５４，１０１号（特許文献２）、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている）。

本明細書に用いられる場合、アミノ酸ヒドロパシー指標値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である（KyteおよびDoolittle、1982年（非特許文献１））。

アミノ酸親水性値は、アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０＋／−１）；グルタミン酸（＋３．０＋／−１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５＋／−１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）である（米国特許第４，５５４，１０１号（特許文献２））。

本明細書に記載されたペプチジル化合物に加えて、立体的に類似した化合物を、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように組み立ててもよく、そのような化合物もまた、本発明のペプチドと同じ様式で用いることができる。これは、当業者に公知のモデリングおよび化学的設計の技術によって達成することができる。例えば、エステル化および他のアルキル化を利用して、例えば、ジアルギニンペプチドバックボーンのアミノ末端を修飾し、テトラペプチド構造を模倣することができる。全てのそのような立体的に類似した構築物は本発明の範囲内にあることは理解されているであろう。

Ｎ末端アルキル化およびＣ末端エステル化を有するペプチドもまた、本発明内に含まれる。機能的等価物もまた、二量体または非関連化学的部分を含む、同じまたは他のプロニューロトロフィン活性モジュレーター断片および／またはプロニューロトロフィン活性モジュレーター分子で形成されたグリコシル化の共有結合性または集合性コンジュゲートも含む。そのような機能的等価物は、当技術分野において公知の手段によって、Ｎ末端およびＣ末端のいずれか１つまたは両方における基を含む断片に見出される基への官能性の連結によって調製される。

したがって、機能的等価物は、カルボキシル末端、アルキルアミン、またはカルボキシル側鎖を含む残基の脂肪族またはアシルのエステルまたはアミドにコンジュゲートした断片、例えば、アスパラギン酸残基におけるアルキルアミンへのコンジュゲート；ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体およびアミノ末端アミノ酸残基またはアミノ基含有残基のＮ−アシル誘導体、例えば、ｆＭｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅまたは免疫原性タンパク質とのコンジュゲートを含み得る。アシル基の誘導体は、（Ｃ３〜Ｃ１０直鎖アルキルを含む）アルキル部分の群から選択され、それにより、アルカノイル種を形成し、炭素環式または複素環式化合物の群から選択され、それによりアロイル種を形成する。反応性基は、好ましくは、それ自体、反応性側基を通して不溶性マトリックスへ架橋結合するタンパク質に用いるものとして知られた二官能性化合物である。それらの共有結合性または集合性の機能的等価物および誘導体は、イムノアッセイにおける試薬として、またはアフィニティー精製手順のために有用である。例えば、本発明によるプロニューロトロフィン活性モジュレーターの断片は、それ自体の公知の方法による臭化シアン活性化セファロースへの共有結合によって不溶化しても、または抗ニューロトロフィン活性モジュレーター抗体または細胞表面受容体のアッセイまたは精製に用いるグルタルアルデヒド架橋有りもしくは無しのいずれかでポリオレフィン表面へ吸着させてもよい。断片はまた、例えば、クロラミンＴ手順により放射ヨウ素標識し、希土類キレートに共有結合し、または例えば、診断アッセイに用いる別の蛍光部分にコンジュゲートするなど、検出可能な基で標識してもよい。

プロニューロトロフィン活性モジュレーターの好ましい所定の断片の突現変異誘発を、通常約１〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは約１〜５個のアミノ酸残基くらいのアミノ酸を挿入し、または約２〜５個の残基などの約１〜１０個の残基を削除することによって行うことができる。

一実施形態において、結合部位１、２、３のリガンドは、自動合成によって合成されたオリゴペプチドである。市販されている固相技術のいずれかを用いることができ、例えば、アミノ酸が増大していくアミノ酸鎖に順々に付加される、メリフィールド固相合成などがある（Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85巻、2149〜2146頁、1963年（非特許文献２）参照）。

ポリペプチドの自動合成の装置は、カリフォルニアのフォスターシティーのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．などの供給業者から市販されており、一般的に、製造会社の使用説明書に従って操作することができる。固相合成は、本発明によるプロニューロトロフィン活性モジュレーターの任意の断片への所望のアミノ酸置換の組み入れを可能にする。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意のサブコンビネーションを組み合わせて、機能的等価物の最終配列に達し得ることは理解されているであろう。挿入は、例えば、疎水性もしくは免疫原性タンパク質、または担体として作用する能力がある任意のポリペプチドまたはスキャフォールド構造などの担体との、アミノ末端および／またはカルボキシル末端融合を含むものと理解されるものとする。

本発明によるソルチリン阻害剤の断片のホモ二量体およびヘテロ二量体を含む二量体を含むオリゴマーもまた提供され、本発明の範囲内にある。プロニューロトロフィン活性モジュレーター機能的等価物および変異体は、他のアミノ酸配列または天然のソルチリン阻害剤配列とのホモ二量体またはヘテロ二量体として作製することができる。ヘテロ二量体には、免疫反応性ソルチリン阻害性断片、およびいかなる生物活性も有する必要がない、または生物活性を示す必要がないソルチリン阻害性断片を含む二量体が挙げられる。

ソルチリン阻害性ペプチド断片は、インビトロおよびインビボの両方で合成することができる。インビトロ合成の方法はよく知られており、ソルチリン阻害剤のインビボでの合成に適している、または適切に順応できる方法もまた先行技術に記載されている。インビボで合成される場合、宿主細胞は、ソルチリンペプチド阻害剤またはその断片をコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換される。ベクターは、複製可能な核酸構築物として定義される。ベクターは、プロニューロトロフィン活性モジュレーターの発現を媒介するために用いられる。発現ベクターは、所定のソルチリン阻害性断片をコードする核酸配列またはインビボで発現することができるその任意の機能的等価物が、適切な宿主において断片または等価物の発現をもたらす能力がある適切な調節配列に作動可能に連結されている、複製可能なＤＮＡコンストラクトである。そのような調節配列は当技術分野においてよく知られている。原核細胞および真核細胞のどちらも、リガンドを合成するために用いることができる。

しかしながら、多細胞生物体由来の細胞の培養物は好ましい宿主細胞と言える。原理的には、任意の高等真核細胞培養物が、脊椎動物培養物であろうと無脊椎動物培養物であろうと、実行可能である。有用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ならびにＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、およびＭＤＣＫ細胞系である。好ましい宿主細胞は、内因性ソルチリン阻害剤を合成することが知られた真核細胞である。そのような宿主細胞の培養物は、単離されて断片の供給源として用いることができ、または成長状態を促進もしくは阻害することを目的とした治療方法を含む処置の治療方法、またはヒトもしくは動物の身体上で実行される診断方法に用いることができる。

疎水結合：本明細書で用いられる場合、用語「水素結合」は、電気陰性原子、例えば、酸素、イオウ、または窒素に共有結合している水素原子と別の電気陰性原子との間で起こり得る引力または架橋を指す。水素結合は、第１の分子内の水素と第２の分子の電気陰性原子との間で起こり得る（分子間水素結合）。また、水素結合は、単一の分子に両方が含まれる水素原子と電気陰性原子との間で起こり得る（分子内水素結合）。

疎水性相互作用：本明細書で用いられる場合、用語「疎水性相互作用」は、極性環境（例えば、水）においてお互いの引力範囲内に位置した本質的に非極性（疎水性）の成分間に起こる任意の相互作用を指す。本明細書で用いられる場合、引力範囲は、０．１ｎｍから２ｎｍまでのスケールにある。特定の型の疎水性相互作用は、「ファンデルワールス力」、すなわち、量子力学によって説明される非極性分子間の引力によって働く。ファンデルワールス力は、一般的に、隣接分子によって誘導され、かつ電子分布の変化を伴う瞬間の双極子モーメントに関連している。

阻害：本明細書で用いられる場合、用語「阻害」は、２つ以上の成分の間の結合の阻止を指す。本発明によって同定されたリガンドは、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体とプロニューロトロフィンとの間の結合を阻害する能力がある。

結合の阻害：本明細書で用いられる場合、プロニューロトロフィンとソルチリンとの間の結合の阻害という用語は、ソルチリンの結合部位３へのプロニューロトロフィンの結合を阻止し、それに従って、ソルチリン、ｐｒｏＮＧＦ、およびｐ７５^ＮＴＲの間の三元複合体の形成を阻止する能力がある、本発明によって同定されたリガンドまたはその断片もしくは変異体を供給する方法に関する。結合の阻害という用語はまた、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体ソルチリンの結合部位１または２へのニューロテンシンおよび／またはソルチリンプロペプチドの結合の阻害を指す。

インビトロ／インビボ：それらの用語は通常の意味で用いられる。

インシリコ：コンピュータシミュレーションによってインビトロまたはインビボ操作を実行する方法。

虚血：結果として生じる組織の機能障害または損傷を伴う血液供給の制限。

虚血組織損傷：虚血による組織損傷。

リガンド：生体分子に結合し、それとの複合体を形成して生物学的目的に適うことができる物質または化合物。狭い意味では、それは、イオン結合、水素結合、およびファンデルワールス力などの分子間力によって標的タンパク質上の部位への分子結合をトリガーするシグナルである。結合（会合）は、通常、可逆性（解離）である。リガンドとその標的分子との間の実際の不可逆性共有結合は、生物学的系においてはまれである。有機金属化学および無機化学における意味に反して、ヘモグロビンにおける場合のように、リガンドが実際に金属部位で結合するかどうかは無関係である。受容体へのリガンド結合は、化学的立体構造、すなわち、受容体タンパク質の３次元形を変化させることができる。受容体タンパク質の立体構造状態は受容体の機能状態を決定する。結合の傾向または強度は親和性と呼ばれる。リガンドとして、基質、阻害剤、活性化剤、および神経伝達物質が挙げられる。放射性リガンドは、放射性同位元素標識化合物であり、インビボでＰＥＴ研究におけるトレーサーとして、およびインビトロの結合研究のために用いられる。

特定の化合物の部分は、前記特定化合物の（１つまたは複数の）基または（１つまたは複数の）パートを網羅する。

医薬品：用語「医薬品」または「薬物」または「薬剤」は、患者における病弊、苦痛、状態、疾患、または傷害の（予防、診断、軽減、または治癒を含む）処置に用いることができる任意の治療剤または予防剤を指す。治療的に有用な遺伝的決定基、ペプチド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドは、医薬品または薬物という用語の意味の中に含むことができる。本明細書で定義されているように、「治療剤」、「医薬品」、または「薬物」、または「薬剤」は一種の生物活性剤である。

薬学的組成物：または薬物、薬剤、もしくは作用物質は、患者に適切に投与された場合、所望の治療効果を誘導する能力がある任意の化学的または生物学的な物質、化合物、または組成物を指す。一部の薬物は、インビボで薬学的活性を有する代謝物へ変換される不活性型で販売されている。本発明の目的として、用語「薬学的組成物」および「薬剤」は、不活性薬物および活性代謝物の両方を含む。

ポリペプチド：本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、少なくとも２つのアミノ酸を含む分子を指す。アミノ酸は天然でも合成でもよい。「オリゴペプチド」は、１００個以下のアミノ酸の長さのポリペプチドとして本明細書で定義される。用語「ポリペプチド」はまた、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子を含むものとする；少なくとも２つのポリペプチドを含む場合、これらは、共有結合した複合体を形成してもよいし、非共有結合性に連結していてもよい。タンパク質におけるポリペプチドは、グリコシル化し、および／または脂質付加し、および／または補欠分子族を含むことができる。

ポリヌクレオチド：本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つの核酸を含む分子を指す。核酸は、天然に存在していてもよいし、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などのように改変されていてもよい。本明細書で用いられる場合のポリヌクレオチドは、一般的に
ｉ）所定のコード配列を含むポリヌクレオチド、または
ｉｉ）所定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、または
ｉｉｉ）ポリヌクレオチド（ｉ）または（ｉｉ）によってコードされるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドであって、前記断片が本明細書で特定化されている少なくとも１つの所定の活性を有する、ポリヌクレオチド、ならびに
ｉｖ）相補鎖が（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）のいずれか１つに定義されているポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本明細書で特定化されている少なくとも１つの所定の活性を有するポリペプチドもしくはその断片をコードする、ポリヌクレオチド、ならびに
ｖ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列に対する縮重であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
またはそのようなポリヌクレオチドの相補鎖
に属する。

精製抗体：用語「精製抗体」は、その少なくとも６０重量パーセントがポリペプチドおよびそれが天然で付随している天然の有機分子を含まない抗体である。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量パーセント、より好ましくは少なくとも９０重量パーセント、最も好ましくは少なくとも９９重量パーセントの量で抗体を含む。

二乗平均平方根偏差：用語「二乗平均平方根偏差」（ｒｍｓｄ）は、２つの密接に関係した構造を比較する手段として用いられ、２つの構造の関連した原子間の距離における、整列した時のこの距離を構造的に最小化した後の偏差に関する。密接に関係した構造を有する関連タンパク質は、相対的に低いＲＭＳＤ値を特徴とするのに対して、より大きな差はＲＭＳＤ値の増加を生じるであろう。

配列相同性：配列相同性は、一実施形態において、少なくとも２５個の連続したアミノ酸を含み、かつ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列とそれぞれ、８５％などの少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、例えば、９２％などの少なくとも９１％、例えば、少なくとも９３％、例えば、９５％などの少なくとも９４％、例えば、９７％などの少なくとも９６％、例えば、９９％などの少なくとも９８％、同一であるアミノ酸配列を有するプロニューロトロフィン活性モジュレーターペプチドの断片または前記配列番号のいずれかの断片を利用することによって決定され、パーセント相同性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０におけるアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、またはＦＡＳＴＡでデフォルトギャップ重みを用いて決定される。

以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を記載するために用いられる：「所定の配列」、「比較ウィンドウ」、「配列相同性」、「配列相同性のパーセンテージ」、および「実質的相同性」。

「所定の配列」は、配列比較のための基本として用いられる定義済み配列である；所定の配列は、例えば、配列番号１のポリヌクレオチド配列などの配列リストに示された完全長ＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントとしての、より大きな配列のサブセットであり得、または完全ＤＮＡもしくは遺伝子配列を含み得る。一般的に、所定の配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長、頻繁には少なくとも２５ヌクレオチド長、多くの場合、少なくとも５０ヌクレオチド長である。

２つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）その２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含み、かつ（２）その２つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、その２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」を通じて比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。本明細書で用いられる場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド位置の概念的セグメントであって、ポリヌクレオチド配列が、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの所定の配列と比較することができ、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、（付加または欠失を含まない）所定の配列と比較して、その２つの配列の最適なアラインメントとして、２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、セグメントを指す。

比較ウィンドウを整列させるための最適な配列のアラインメントは、SmithおよびWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2巻、482頁（非特許文献３）の局所相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48巻、443頁（非特許文献４）の相同性アライメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85巻、2444頁（非特許文献５）の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により、または洞察により行うことができ、様々な方法によって作成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウに関して相同性が最大となる）が選択される。

用語「配列相同性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウに関して同一である（すなわち、ヌクレオチドずつを基本として）ことを意味する。用語「配列相同性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウに関して２つの最適に整列した配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を出し、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列相同性のパーセンテージを出すことによって計算される。本明細書で用いられる場合、用語「実質的相同性」は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウィンドウに関して、頻繁には少なくとも２５〜５０個のヌクレオチドのウィンドウに関して、所定の配列と比較して、少なくとも８５パーセント配列相同性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセント配列相同性、より通常には少なくとも９９パーセント相同性を有する配列を含み、配列相同性のパーセンテージは、比較のウィンドウに関して、所定の配列の合計２０パーセント以下になる欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と所定の配列を比較することによって計算される。所定の配列は、例えば、本明細書に示された完全長配列番号１ポリヌクレオチド配列のセグメントとしての、より大きな配列のサブセットであり得る。

ポリペプチドに適用されたように、アミノ酸配列の相同性の程度は、アミノ酸配列によって共有された位置における同一のアミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性の程度は、アミノ酸配列によって共有された位置における、すなわち、構造的に関連したアミノ酸の数の関数である。

「関連していない」または「非相同性」配列は、本発明のプロニューロトロフィン活性モジュレーターポリペプチド配列の１つと４０％未満の相同性、しかしながら、好ましくは２５％未満の相同性を共有する。用語「実質的相同性」は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重みを用いてのプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで、最適に整列した場合、少なくとも８０パーセント配列相同性、好ましくは少なくとも９０パーセント配列相同性、より好ましくは少なくとも９５パーセント配列相同性またはそれ以上（例えば、９９パーセント配列相同性）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

保存的アミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。

さらに、変異体はまた、本明細書の下記に定義されているように、保存的アミノ酸置換の所定の数に基づいて決定される。本明細書で用いられる場合、保存的アミノ酸置換とは、（所定のアミノ酸群内の）１つのアミノ酸を（同じ群内の）別のアミノ酸の代わりに用いることに関し、それらのアミノ酸は類似した、または実質的に類似した特徴を示す。

本明細書で適用される場合の用語「保存的アミノ酸置換」の意味の範囲内において、１つのアミノ酸は、本明細書の下記に示されたアミノ酸群内の別のアミノ酸に対して置換することができる：
ｉ）極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓ）
ｉｉ）非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔ）
ｉｉｉ）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
ｉｖ）環状側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
ｖ）芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
ｖｉ）酸性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
ｖｉｉ）塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
ｖｉｉｉ）アミド側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
ｉｘ）ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘ）イオウ含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
ｘｉ）中性の弱疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
ｘｉｉ）親水性の酸性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、および
ｘｉｉｉ）疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）

したがって、本発明によるその変異体または断片は、その配列もしくは断片の同じ変異体内に、またはその配列もしくは断片の異なる変異体の中で、お互い無関係に導入される複数の置換などの少なくとも１つの置換を含んでもよい。

それの同じ変異体または断片が、本明細書の上記に定義されている保存的アミノ酸の１つより多い群由来の１つより多い保存的アミノ酸置換を含んでもよいことは、上記の概要から明らかである。

少なくとも１つのアミノ酸の付加または欠失は、好ましくは、１０〜２０個のアミノ酸などの２〜２５０個のアミノ酸、例えば、４０〜５０個のアミノ酸などの２０〜３０個のアミノ酸の付加または欠失であり得る。しかしながら、５０〜１００個のアミノ酸の付加、１００〜１５０個のアミノ酸の付加、１５０〜２５０個のアミノ酸の付加などの５０個より多いアミノ酸の付加または欠失もまた、本発明内に含まれる。欠失および／または付加は、お互い無関係に、配列内および／または配列の末端における欠失および／または付加であり得る。

置換された低級アルキルは、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、カルボキシル、アシル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、およびチオールからなる群から選択される１〜３つの置換基を有する低級アルキルを意味する。

処置：本明細書で用いられる場合、用語「処置」は、ヒトまたは動物の身体を含む個体において臨床状態の手術を含む治療を伴う方法に関する。治療は、寛解、治癒、または予防、すなわち、疾患に罹るリスクを低下させることであり得る。

変異体：本明細書で用いられる場合、用語「変異体」は、所定の配列のいずれかと、好ましくは、少なくとも６０％の相同性、例えば、少なくとも６６％の相同性などの少なくとも６３％の相同性、例えば、少なくとも７０％の配列相同性、例えば、少なくとも７２％の配列相同性、例えば、少なくとも７５％の配列相同性、例えば、少なくとも８５％の配列相同性などの少なくとも８０％の配列相同性、例えば、少なくとも９１％の配列相同性などの少なくとも９０％の配列相同性、例えば、少なくとも９２％の配列相同性などの少なくとも９１％の配列相同性、例えば、少なくとも９４％の配列相同性などの少なくとも９３％の配列相同性、例えば、少なくとも９６％の配列相同性などの少なくとも９５％の配列相同性、例えば、少なくとも９８％の配列相同性などの少なくとも９７％の配列相同性、例えば、９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列変異体を指す。ニューロテンシンの変異体および断片の例は図２６に列挙されており、それらにはＲＲＰＹＩ（ｃｈｇ）、ｉｏｄｏＹＩＬ、ＱＩＬ、ＹＣＬ、ｄＹＩＬ、ＹＨＬ、ＲＲＰＹＩ（ａｃｃ）、ＲＲＰＹＩ（ｎＭｅ）Ｌ、ＹＩＬが挙げられるが、それらに限定されない。本発明の一実施形態において、リガンドはＮＴ６９Ｌ、ＮＴ８−１３、または天然ニューロテンシンではない。

発現の上方制御：遺伝子、好ましくは内因性遺伝子の発現の増加をもたらす過程。

ソルチリン結晶
Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン、特にヒトソルチリンのＶｐｓ１０ｐ−ドメインの構造的組織化およびリガンド結合を明らかにするために、本発明者らは、ＮＴと複合体を形成した、およびそれ自体のプロペプチドの残基４〜２９と複合体を形成したｓソルチリンの結晶構造（それぞれ、２．０Åおよび３．２Åの分解能で）を決定している。ｓソルチリン：ＮＴ複合体に関するデータは、わずかな過剰（モル比１：１．５）ＮＴ、および大過剰（モル比１：１５）のＮＴで増大した結晶から得られた（例５参照）。本発明者らはさらに、神経成長因子（ＮＧＦ）のプロドメインと複合体を形成したｓソルチリンの構造を決定している。

したがって、一実施形態において、本発明は
ａ）配列番号１のポリペプチド；および／または
ｂ）前記配列番号１と少なくとも６０％の配列相同性を有する、前記ポリペプチドの配列変異体；および／または
ｃ）ソルチリン活性を示す、ａ）〜ｂ）のいずれかの少なくとも２００個の連続したアミノ酸を含む断片、および
ｄ）任意で、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成したａ）〜ｃ）のいずれか
を含む結晶に関する。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも５０％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも６０％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも６３％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも６５％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも７０％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも７５％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも８０％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも８５％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９０％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９１％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９２％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９３％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９４％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９５％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９６％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９７％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９８％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１と少なくとも９９％の配列相同性を有する、配列番号１の配列変異体を含む。

一実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも５０個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも１００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも２００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも３００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも４００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも５００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも６００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

さらなる実施形態において、本発明の結晶は、配列番号１のいずれかの少なくとも７００個の連続したアミノ酸を含む断片を含む。

本発明の好ましい実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、およびＴ３９８〜Ｇ４００を含む結合部位１（高親和性ニューロテンシン結合部位およびソルチリンプロペプチド結合部位）に結合している。

本発明のより好ましい実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、およびＦ３５０〜Ｍ３６３を含む結合部位１（高親和性ニューロテンシン結合部位およびソルチリンプロペプチド結合部位）に結合している。

本発明の非常に好ましい実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、およびＦ３５０〜Ｍ３６３を含む結合部位１（高親和性ニューロテンシン結合部位およびソルチリンプロペプチド結合部位）に結合している。

本発明の別の実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、Ｗ５９７、Ｔ１６８〜Ｉ１７４、Ｌ５７２、Ａ５７３、およびＳ５８４〜Ｆ５８８を含む結合部位２（低親和性ニューロテンシン結合部位およびソルチリンプロペプチド結合部位）に結合している。

本発明のさらに別の実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、およびＷ５９７を含む結合部位２（低親和性ニューロテンシン結合部位およびソルチリンプロペプチド結合部位）に結合している。

好ましい実施形態において、本発明の少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、およびＶ１１２を含む結合部位２（低親和性ニューロテンシン結合部位およびソルチリンプロペプチド結合部位）に結合している。

本発明の別の好ましい実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｓ４２０、Ｄ４２２、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｅ４２６、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｅ４７０、Ｉ４９８、Ｓ４９９、およびＶ５００を含む結合部位３（ニューロトロフィン−プロペプチド結合部位）に結合している。結合部位３がニューロトロフィンのプロドメインを結合するため、前記結合部位３はまた、プロニューロトロフィン全体を結合する。したがって、結合部位３は、プロニューロトロフィン結合部位もしくはニューロトロフィンプロドメイン結合部位、または同一生化学的意味の同義的表現で呼んでもよい。

より好ましい実施形態において、本発明の少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含む結合部位３（ニューロトロフィン−プロペプチド結合部位）に結合している。

本発明の非常に好ましい実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、配列番号１のアミノ酸残基Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含む結合部位３（ニューロトロフィン−プロペプチド結合部位）に結合している。

本発明の別の実施形態において、結合部位３（プロニューロトロフィン結合部位）はｐｒｏＮＧＦ結合部位である。

本発明の別の実施形態において、結合部位３（プロニューロトロフィン結合部位）はｐｒｏＢＤＮＦ結合部位である。

本発明の別の実施形態において、結合部位３（プロニューロトロフィン結合部位）はｐｒｏＮＴ３結合部位である。

本発明の別の実施形態において、結合部位３（プロニューロトロフィン結合部位）はｐｒｏＮＴ４／５結合部位である。

ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸残基７８〜７５５番を含む、請求項１に記載の結晶。

別の実施形態において、本明細書の上記に定義された結晶は、単斜晶空間群である。

一実施形態において、単斜晶空間群の結晶は、空間群Ｃ２に属する。

別の実施形態において、本明細書の上記に定義された結晶は、斜方晶空間群である。

一実施形態において、斜方晶空間群の結晶は、Ｐ２_１２_１２_１である。

別の実施形態において、本明細書の上記に定義された結晶は、三斜晶空間群である。

一実施形態において、三斜晶空間群の結晶はＰ１である。

本発明の別の実施形態において、本明細書の上記に定義されている結晶は、配列番号１のアミノ酸残基７８〜７５５（ｓソルチリン）を含むポリペプチド変異体またはその断片もしくは変異体を含む。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に定義されている結晶は、１つまたは複数または全部のメチオニンがＳｅ−メチオニン（セレノ−メチオニン）に置き換えられている、ソルチリンポリペプチドを含む。

本発明の別の実施形態において、本明細書の上記に定義されている結晶は、配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）からなる群から選択されるポリペプチドリガンド、またはそれらの断片もしくは変異体を含む。

ソルチリン結晶を成長させる方法
さらなる態様において、本発明はさらに、ソルチリン結晶を成長させる方法であって、
ａ．４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬの配列番号１のポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液に含む組成物を得る段階と、
ｂ．ｉ．１：１．５〜１：１５（ｓソルチリン：ＮＴ）または
ｉｉ．１：４（ｓソルチリン：プロペプチド）
のモル比で前記組成物をニューロテンシンと混合する段階と、
ｃ．前記組成物および結晶化溶液、それぞれ等容量を曝す段階であって、前記結晶化溶液が
ｉｉｉ．１８〜２１％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００、および
ｉｖ．０〜１５％のグリセロール、および
ｖ．Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２〜７．８（４０〜９３ｍＭのＴｒｉｓおよび１００ｍＭのＨＥＰＥＳ）、または１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、３〜６％のグリセロール、および
ｖｉ．３００〜９００ｍＭのＮａＣｌ、またはマロン酸によってｐＨ６〜７．５へ調整されている１５０〜４００ｍＭのＣ_３Ｈ_２Ｎａ_２Ｏ_４、または３００〜５００ｍＭのＬｉＳＯ_４、または５００〜７００ｍＭのＫＣｌ
を含む段階と、
ｄ．配列番号１またはその断片もしくは変異体を含む結晶を得る段階と
を含む方法に関する。

本発明のさらなる実施形態において、配列番号１のシステイン残基は、セレノ−メチオニンに置き換えられている。

本発明の別の実施形態において、本明細書の上記に定義されている結晶を得る方法は、
ａ．最初の沈殿物を単離する段階と、
ｂ．懸滴（ハンギングドロップ）からの蒸気拡散によりこれらを成長させる段階と
をさらに含む。

本発明のさらにもう一つの実施形態において、本明細書の上記に定義されている結晶はさらに、ソルチリンまたはその断片もしくは変異体のリガンドと複合体を形成した３次元構造の決定のためにソルチリンに結合したリガンドを含む。

ソルチリン構造
本発明者らは、ソルチリン（配列番号１）の残基７８〜６０９が、１０翼を有するβ−プロペラの最初の例を構成することを見出している。長い延長部が、４つの鎖の上下の翼の間と、翼の個々のβ鎖の間の両方に見出される（図１Ａ）。より小さい、１０個のシステインを含むＣ末端パート（１０ＣＣ）である、残基６１０〜７５８は、ｐ７５^ＮＴＲに見出されるシステインリッチドメインに似た全体的形および構造を有する２つの類似した構造ドメインとして現れる（１８）（図１Ｂ）。２つの１０ＣＣドメインとプロペラドメインとの間の境界面は、広範な疎水性相互作用および静電相互作用を含み、プロペラの１つの面の約１８０°を網羅する。

全体的に見て、プロペラドメインは、卵形であり、１０ＣＣ相互作用面側に向かって狭くなっている、広くわずかに円錐形のトンネルを形成する。赤道面において、トンネルの断面積は、約２５×４０Åである（図１Ｃ＋Ｄ）。狭い１０ＣＣ相互作用側からトンネルへのアクセスは、翼７の鎖１の末端の内側縁に位置したＡｓｎ４０６連結型グリコシル化によってさらに部分的にブロックされている（図１Ｃ＋Ｄ）。さらに２つのグリコシル化が、Ａｓｎ１６２およびＡｓｎ５８２に見出され、両方とも外側縁にあり、かつ両方ともプロペラの１０ＣＣ相互作用側にある。顕著には、翼１および翼１０の鎖２および３を接続する２つの突出した疎水性ループが反対面から現れており（図１Ｂ）、この面、特にループは、細胞膜との接触を媒介し、または他のタンパク質との相互作用において機能し得ることを示唆する。

ＮＴと複合体を形成したｓソルチリンの両方の構造において、本発明者らは、ＮＴの４つのＣ末端残基（Ｐｒｏ１０−Ｔｙｒ１１−Ｉｌｅ１２−Ｌｅｕ１３）が、（本明細書では高親和性ＮＴ結合部位と呼ばれる）翼６の鎖１への短いβ鎖を形成することを見出している。Ｔｙｒ１１のヒドロキシル基は、ソルチリンのＬｙｓ２６０への水素結合を形成し、Ｃ末端ロイシンは、Ｐｈｅ３１４、Ｉｌｅ３２７、およびＩｌｅ３５３によって形成された疎水性ポケットに適合する。しかしながら、結合への主な寄与は、明らかに、ＮＴのＣ末端カルボン酸であり、それは、Ａｒｇ３２５のグアニジニウム基との塩橋ならびにＳｅｒ３１６の側鎖およびＴｙｒ３５１の主鎖アミドへの水素結合を形成する（図２Ｂ）。

大過剰のＮＴで決定される構造において、２つの追加の結合部位が見出される。結合部位２（図２Ａ）は、プロペラの内側縁に見出される。ここでは、ニューロテンシンのＮ末端側半分（残基２〜６）は、翼１の第１鎖と相互作用する短いβ鎖としてモデル化される。受容体との特異的な側鎖相互作用はこの部位では観察されない（図２Ｂ）。Ｌｙｓ６のＣαからＰｒｏ１０のＣαまでの距離は１７．７Åであり、介在領域に電子密度は存在しない。したがって、本発明者らは、高濃度のＮＴにおいて、２つの分子はプロペラの内側で結合していると結論づける。

上記で提示された結果は、ソルチリンが、ＮＴのＣ末端に対する高親和性結合部位を有し、第２の低親和性サブサイトがそのペプチドのＮ末端部を会合することを示している。したがって、本発明者らは、ＮＴ由来断片がソルチリンのそれ自体のプロペプチド（Ｓｏｒｔ−ｐｒｏ）の結合を阻害する能力を調べた。Ｓｏｒｔ−ｐｒｏの結合は５倍過剰のＮＴの存在下で完全に無効にされ、Ｃ末端ペプチドＡｒｇ９−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３が同等に効果がある（図３Ａ）ことが以前に示されている（５）。対照的に、本発明者らは、Ｎ末端ペプチドＮＴ（１〜８）およびＡｒｇ８−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３−ＮＨ２、すなわち、末端カルボン酸がアミドに置き換わっているものの両方が、Ｓｏｒｔ−ｐｒｏ結合を阻害することができないが（図３Ａ＋Ｂ）、Ｃ末端トリペプチドＴｙｒ１１−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３がそれの完全阻害に十分であることが証明されることを見出している（図３Ｂ）。Ｔｙｒ１１−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３はまた、ＮＧＦのプロドメイン（図３Ｃ）およびＲＡＰ（図３Ｄ）の結合を妨げるが、完全長ＮＴほど効率的ではない。後者により、ｐｒｏＮＧＦおよびＲＡＰが立体障害を受けやすく、Ｔｙｒ１１−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３とは異なる、またはより延長した結合部位を有することが示されている。

ニューロテンシンとＳｏｒｔ−ｐｒｏは配列類似性がない。しかし、Ｓｏｒｔ−ｐｒｏの断片（残基４〜２９）と複合体を形成したｓソルチリンの構造は、プロペラの内側の両方の結合部位が占有されることが示されている（図２Ｃ〜Ｅ）。ペプチドの密度は強いが、ペプチドのモデリングを可能にするほど十分には定義されていない。しかしながら、ｓソルチリン：ＮＴ構造とのオーバーレイは、明らかに、Ｓｏｒｔ−ｐｒｏ密度が、ＮＴのＣ末端部およびＮ末端部の密度と重なり（図２Ｃ＋Ｄ）、その間の空洞を満たしている（図２Ｅ）ことを示す。プロペプチドはＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕモチーフを含まず、その結合は遊離Ｃ末端に依存しないので（８）、Ｓｏｒｔ−ｐｒｏまたは他のリガンド、例えば、ｐｒｏＮＧＦにおける内因性酸性残基が、ＮＴのＣ末端Ｌｅｕ−カルボン酸のと類似した、結合における役割を想定することができる。

これを調べるために、本発明者らは、Ｓｅｒ３１６またはＡｒｇ３２５のいずれかがそれぞれ、ＧｌｕおよびＡｌａと交換されているｓソルチリン突然変異体構築物を作製した。その後、Ｓ３１６Ｅ突然変異体を発現させ、精製したが、Ｒ３２５Ａ突然変異体は、不安定で、精製手順の間に分解することがわかった。興味深いことに、両方の突然変異体は、分泌が著しく遅れ（図４Ａ）、ソルチリンについて観察される効果もまた、プロペプチドなしで発現した（８）。Ｓ３１６ＥはＳｏｒｔ−ｐｒｏの結合を示さなかったが、ＮＧＦ−プロドメインおよびＢＤＮＦをｗｔソルチリンのと類似した親和性で結合した。予想通り、ＮＴの存在は、ＮＧＦ−プロドメインのＳ３１６Ｅ突然変異体への結合に効果を生じなかった。これらの結果は、Ｓｏｒｔ−ｐｒｏおよびＮＴが同じ構造的部位（結合部位１および２）を結合すること、ならびに他のリガンド、例えば、限定されないが、ＮＧＦ−プロドメインおよび完全ｐｒｏ−ＮＧＦなどのニューロトロフィンのプロドメインが、近接して位置するが、独立した別々の部位（結合部位３）で結合することの所見を強く支持している。

したがって、本発明の実施形態において、リガンドは、ソルチリンの３つの結合部位の１つまたは複数へ特異的に結合するように設計される。したがって、前記リガンドは、内因性リガンドの同じ部位への結合を阻害する能力がある。前記内因性リガンドは、ニューロテンシン、ソルチリンのプロペプチド、ｐ７５^ＮＴＲ、およびプロニューロトロフィンからなる群から選択され、前記プロニューロトロフィンは、ｐｒｏ−ＮＧＦ、ｐｒｏＢＤＮＦ、ｐｒｏ−ＮＴ３、およびｐｒｏＮＴ４／５からなる群から選択される。

８つの種由来のソルチリン間のペアワイズ配列相同性は６０〜９５％内である。配列アラインメント（図５）は、プロペラ空洞の内部表面への保存的残基の大きな区画、および外側縁および１０ＣＣドメインへのより小さい散らばった区画を位置づける（図１Ｅ）。空洞における保存のパターンは、追加的または補足的な結合部位の存在と一致するであろうし、そのような代替の部位が、β鎖相互作用の形成における他のプロペラ翼を関係づけることを示唆する。代替部位の存在は、明らかに、いくつかのリガンドがソルチリンを標的にする場合の重要な点である。完全長リガンドが全て、結合において競合するが、競合の効率は様々であり、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕトリペプチドによって全てが効果的にアンタゴナイズされるわけではないことがよく知られている。したがって、全リガンドは、重複部位におけるプロペラ空洞の内側に結合しなければならない可能性が高い。それゆえに、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕのような小さなペプチドは、高特異的共有部位を占有することによって阻害することができるが、より大きなリガンドは、空洞の限定空間へのアクセスをブロックすることによって追加の阻害を提供することができる。

要約すれば、本発明者らは、Ｖｐｓ１０ｐ−Ｄタンパク質ファミリーのメンバーおよびＮＴ結合受容体の最初に知られた構造を検討した。この結果は、Ｖｐｓ１０ｐ−Ｄが２つ別々だが、構造的に相互依存的なドメイン、すなわち、１０翼β−プロペラの最初の例と２つの類似した構造ドメインで構成される１０ＣＣからなることを開示するものである。プロペラトンネルは、ソルチリンのリガンド結合領域を含み、本発明者らは、ＮＴおよびそれ自体のプロペプチドとのその相互作用のための特異的部位を位置づけている。加えて、本発明者らは、プロニューロトロフィンに対する認識部位の必須部分もまたこの領域内に位置することを実証した。トリペプチドＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕが高親和性でソルチリンを標的にするという所見は、ソルチリン、ＳｏｒＬＡ、およびＧタンパク質共役型ＮＴＲの間を識別する潜在能力を有する最初のＮＴ由来リガンドを提供し、それは、ソルチリン：ｐ７５^ＮＴＲ：ｐｒｏＮＧＦ複合体により媒介されるアポトーシスを低下させる可能性がある特定の阻害剤の設計を受け入れる態勢にある。最後に、本発明者らの構造および結合分析は、他のＶｐｓ１０ｐ−Ｄ受容体の構造および相互作用の将来的モデリングにおいて、ならびに糖尿病およびアルツハイマー病のような疾患におけるそれらの推定的役割の研究において有用であることが証明される可能性がある（１９〜２１）。

別の態様において、本発明は、図１７〜２０のいずれかに示されているソルチリンの構造座標の少なくとも一部でコードされるデータ記憶材料を含むコンピュータ可読データ記憶媒体に関する。

さらなる態様において、本発明は、
ａ．結合部位１、もしくは
ｂ．結合部位２、もしくは
ｃ．結合部位３、
またはａ〜ｃの断片もしくは変異体
の１つまたは複数に結合する能力があるリガンドを同定するための方法における、図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標の使用に関する。

さらに別の態様において、本発明は、ソルチリン、またはその断片もしくは変異体の３次元構造の決定のための本明細書の上記に記載されている結晶の使用に関する。

さらに別の態様において、本発明は、
ａ．結合部位１、もしくは
ｂ．結合部位２、もしくは
ｃ．結合部位３、
またはａ〜ｃの断片もしくは変異体
の１つまたは複数に結合する能力があるリガンドを同定するための方法における、図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標の使用に関する。

リガンド同定および設計の方法
本発明は、本明細書の上記で定義されているソルチリンの３つの結合部位（１、２、および３）のいずれかに特異的に結合する能力があるリガンドの同定および設計のための方法を提供する。

好ましい実施形態において、同定および設計されたリガンドは、ニューロトロフィンのプロドメイン、特にｐｒｏＮＧＦおよびｐｒｏＢＤＮＦのプロドメインへのソルチリンの結合をそれによって阻止するソルチリンの可能性のある阻害剤である。

その後、可能性のある阻害剤は、コンピュータモデリングと連動して新たに設計することができる。化学構造または分子断片のモデルは、コンピュータデータベース内に記憶された既知の低分子量有機化学構造から引き出された情報を用いてコンピュータスクリーン上で作成してもよいし、または結合型、立体構造などに関する有機化学者の一般的な知識を用いて構築される。適切なコンピュータプログラムは、現実的な幾何学の化学構造を構築するためのこの過程において役立つ。化学構造または分子断片は、前記サブセットへの有利な相互作用または基準データセットが可能になるように可能性のある阻害剤を構築するように選択および／または使用することができる。可能になる有利な相互作用が多ければ多いほど、可能性のある阻害剤がソルチリンに結合するのが強くなる。好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸残基への有利な相互作用が可能になるべきである。そのような有利な相互作用は、アミノ酸残基のいずれかの原子、例えば、ペプチドバックボーンの原子または／および側鎖の原子と生じることができる。

有利な相互作用は、疎水性相互作用またはファンデルワールス相互作用、および水素結合、塩橋などの極性相互作用などの化学構造間に存在し得る任意の非共有結合性の引力である。疎水性−親水性相互作用などの不利な相互作用は、避けるべきであるが、それらが引力の総和より弱い場合には、受け入れることができる。選択されることになっている、またはタンパク質部分と構築されることになっている阻害剤の部分の衝突または重なりなどの立体障害は、立体構造変化によって解決できない限り結合を阻止するであろう。このように作製された可能性のある阻害剤の結合強度は、コンピュータスクリーン上で有利な相互作用と不利な相互作用を比較することによって、または市販のコンピュータプログラムで実行される計算法を用いることによって、評価することができる。

可能性のある阻害剤の立体構造的自由およびソルチリンのアミノ酸側鎖は考慮されるべきである。可能性のある阻害剤のアクセス可能な立体構造は、分子幾何学の既知の規則、特にねじれ角を用いて、または分子力学および／もしくは分子動力学、もしくは量子力学、もしくはそれらの組み合わせの実行手順を有するコンピュータプログラムを用いて計算的に決定することができる。

可能性のある阻害剤は、形に関して、および親水性または疎水性に関して、ソルチリンの結合部位１、結合部位２、または結合部位３の少なくとも一部に少なくとも部分的に相補的である。

化学構造のデータベース（例えば、ケンブリッジ構造データベースまたはＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅから；概説として、Rusinko (1993) Chem. Des. Auto. News 8巻、44〜47頁（非特許文献６）参照）は、様々な範囲に用いることができる。全体的に自動化された実施形態において、データベースにおける全構造は、コンピュータのプロセッサーおよび適切なコンピュータプログラムを計算的に用いて、相補性および立体障害の欠如についてソルチリンの活性部位または結合ポケットと比較することができる。この場合、コンピュータスクリーンでの手作業のユーザー対話を含むコンピュータモデリングは必要ではない可能性がある。あるいは、分子断片が、データベースから選択され、コンピュータスクリーン上で、例えば、手作業で、組み立てられ、または構築されてもよい。また、選択の過程における自動化対当業者による手作業での共同作業の比率は、大いに異なり得る。薬物設計およびお互いとの分子の結合についてのコンピュータプログラムが良くなってきているため、手作業の必要性は減少している。

コンピュータモデリングに使用可能なプログラムとして、Ｑｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）およびＳｉｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）が挙げられる。他の有用なプログラムはＡｕｔｏｄｏｃｋ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、GoodsellおよびOlsen (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics、8巻、195〜201頁（非特許文献７）に記載）、Ｄｏｃｋ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Kuntzら、(1982) J. Mol. Biol. 161巻、269〜288頁（非特許文献８）に記載）である。

さらなる態様において、本発明は、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する能力があるリガンドを同定する方法であって、
ａ．図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標を用いてコンピュータスクリーン上で結合部位の空間構造を作成する段階と、
ｂ．コンピュータスクリーン上で空間的構造を有する可能性のあるリガンドを作成する段階と、
ｃ．立体障害なしにセットの結合相互作用部位の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合することができるリガンドを選択する段階と
を含む方法に関する。

別の態様において、本発明は、プロセッサー、データ記憶システム、データ入力装置、およびデータ出力装置を含むプログラムされたコンピュータを用いて、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３またはその断片もしくは変異体に結合する能力があるソルチリンのリガンドを同定するためのコンピュータ支援方法であって、
ａ．前記ソルチリンの原子のサブセットの原子座標を含むデータを、前記入力装置を通してプログラムされたコンピュータに入力し、それによって基準データセットを作成する段階であって、前記原子座標が、図１７〜２０のいずれかに提示された原子座標であり、または原子座標が、３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される段階と、
ｂ．前記プロセッサーを用いて、低分子量有機化学構造のコンピュータデータベースに設定された基準データとデータ記憶システムに保存されたペプチド断片を比較する段階と、
ｃ．前記データベースから、コンピュータ方法を用いて、基準データセットに構造的に相補的である部分を有し、受容体ソルチリンとの立体障害がない化学構造を選択する段階と
を含む方法に関する。

さらに別の態様において、本発明は、リガンドを同定するための方法であって、
ａ．コンピュータモデリングと連動した原子座標を用いて、コンピュータモデリングによって作成された、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体における１セットの結合相互作用部位へ可能性のあるリガンドを結合し、ソルチリンの前記セットの結合相互作用部位における少なくとも１つのアミノ酸に結合する能力がある可能性のあるリガンドを選択することにより、可能性のあるリガンドを選択する段階であって、前記原子座標が、図１７〜２０のいずれかに提示された原子座標であり、または原子座標が、３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される段階と、
ｂ．前記可能性のあるリガンドおよび前記受容体ソルチリンを供給する段階と、
ｃ．可能性のあるリガンドを前記受容体ソルチリンと接触させる段階と、
ｄ．前記受容体ソルチリンの可能性のあるリガンドによる結合を検出する段階と
を含む方法に関する。

本発明の一実施形態において、可能性のあるリガンド分子の結合は、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造の原子座標によって定義された３次元構造を用いることによって、かつ前記可能性のあるリガンドが配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体における少なくとも３つのアミノ酸に結合する能力があるように実行される。

さらなる態様において、本発明は、ソルチリンの結合部位１、結合部位２、もしくは結合部位３、またはその断片もしくは変異体の可能性のあるリガンドを同定する方法であって、
ａ．３次元構造決定に基づいた、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体の立体構造を定義する原子座標から引き出される情報をコンピュータへ導入する段階であって、それにより、コンピュータプログラムが前記立体構造の構造をコンピュータスクリーン上で利用またはディスプレイし、前記原子座標が図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から選択され、または原子座標が３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかによって表された３次元構造のいずれか１つから偏位する３次元構造から選択される段階と、
ｂ．コンピュータスクリーン上で前記コンピュータプログラムによってソルチリンの結合部位１、結合部位２、または結合部位３の３次元表示を作成する段階と、
ｃ．前記ソルチリンの結合部位１、結合部位２、もしくは結合部位３、またはその断片もしくは変異体の表示上に可能性のあるリガンドのモデルを重ねる段階と、
ｄ．ソルチリンの高親和性ニューロテンシン結合部位、低親和性ニューロテンシン結合部位、ソルチリンプロペプチド結合部位、またはプロニューロトロフィン結合部位との可能性のあるリガンドの結合の可能性および立体障害の非存在を評価する段階と、
ｅ．前記受容体ソルチリンの結合アッセイにおいて前記可能性のあるリガンド化合物を組み入れる段階と、
ｆ．限定されないが、配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、および配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）からなる群から選択される競合するリガンドの結合を前記可能性のあるリガンドが阻害するかどうかを決定する段階と
を含む方法に関する。

本発明のさらなる実施形態において、結合部位１の以下のアミノ酸残基の少なくとも１つの原子座標から引き出される情報が用いられる：配列番号１のＲ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、Ｔ３９８〜Ｇ４００、Ｉ３０３〜Ｇ３０９、Ｑ３４９〜Ａ３５６、Ｙ３９５、およびＴ４０２。

本発明のさらなる実施形態において、結合部位２の以下のアミノ酸残基の少なくとも１つの原子座標から引き出される情報が、リガンド予想および／または設計に用いられる：配列番号１のＬ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、Ｗ５９７、Ｔ１６８〜Ｉ１７４、Ｌ５７２、Ａ５７３、およびＳ５８４〜Ｆ５８８。

本発明のさらなる実施形態において、結合部位３の以下のアミノ酸残基の少なくとも１つの原子座標から引き出される情報が用いられる：配列番号１のＤ４０３、Ｓ４２０、Ｄ４２２、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｅ４２６、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｅ４７０、Ｉ４９８、Ｓ４９９、およびＶ５００。

本発明のさらなる実施形態において、データ基準セットまたは結合相互作用セットは、同定された群から選択される少なくとも３つのアミノ酸残基を含む。

本発明のさらなる実施形態において、原子座標は、少なくとも５Åの分解能まで決定される。

本発明のさらなる実施形態において、原子座標は、少なくとも４Åの分解能まで決定される。

本発明のさらなる実施形態において、原子座標は、少なくとも３Åの分解能まで決定される。

本発明のさらなる実施形態において、原子座標は、少なくとも２Åの分解能まで決定される。

本発明のさらなる実施形態において、原子座標は、少なくとも１．５Åの分解能まで決定される。

Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドの特性
本明細書の上記に定義された方法によって同定されたリガンドは、ソルチリンの結晶構造を通して同定された結合部位へ特異的に結合する。Ｖｐｓ１０ｐ−ドメインファミリーの５つのメンバー間でのＶｐｓ１０ｐ−ドメインの相同性により、ソルチリンの結合部位１〜３に結合すると同定されたリガンドは、他のＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体のＶｐｓ１０ｐ−ドメインとも相互作用する可能性が高い。

本発明の一実施形態において、可能性のあるリガンド分子は、少なくとも配列番号１の高親和性ニューロテンシン結合部位におけるアミノ酸と相互作用する。

本発明のさらなる実施形態において、可能性のあるリガンド分子は、少なくとも配列番号１の低親和性ニューロテンシン結合部位におけるアミノ酸と相互作用する。

本発明のさらなる実施形態において、可能性のあるリガンド分子は、少なくとも配列番号１のソルチリンプロペプチド結合部位におけるアミノ酸と相互作用する。

本発明のさらなる実施形態において、可能性のあるリガンド分子は、少なくとも配列番号１のプロニューロトロフィン結合部位におけるアミノ酸と相互作用する。

本発明のさらなる実施形態において、可能性のあるリガンドは、非加水分解性ペプチドおよびペプチド類似体、有機化合物および無機化合物からなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態において、有機小分子のライブラリーがスクリーニングされる。

本発明のさらなる実施形態において、可能性のあるペプチドリガンドのライブラリーがスクリーニングされる。

さらなる態様において、本発明は、本明細書の上記の方法によって同定されたリガンドに関し、前記リガンドは、前記結合部位１の少なくとも１つの相互作用点に結合する能力があり、前記相互作用点は、図１４のＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｊ_１、Ｊ_２、およびＪ_３を含み、
Ｘ_１が配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、およびＹ３５１を含み、
Ｘ_２がＹ３５１のバックボーンカルボニルを含み、
Ｘ_３がＩ３５３のバックボーンを含み、
Ｘ_４がＫ２６０のアミノ基を含み、
Ｒ_１がアミノ酸残基Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｙ３５１、Ｉ３５３、およびＭ３６３を含み、
Ｒ_２がＦ３５０およびアミノ酸残基Ｔ３９７〜Ｅ４０１を含むループ由来の少なくとも１つのアミノ酸を含み、
Ｊ_１がＳ３０５を含み、
Ｊ_２がＦ３０６のバックボーンアミドを含み、
Ｊ_３がＦ３０６のバックボーンカルボニルを含む。

本発明のさらなる実施形態において、相互作用点Ｘ_１は、負電荷および／または水素受容体特性を含み、前記負荷電および／または水素受容体特性は、カルボン酸、スルホン酸、負電荷を失ってアルギニンの正電荷を相殺するジフルオロ、負電荷を失ってアルギニンの正電荷を相殺するジクロロからなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されているリガンドは、相互作用点Ｘ_２に、ヒドロキシル、アミノ、およびアミドからなる群から選択される水素結合供与体を含む。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されているリガンドは、相互作用点Ｘ_３に、カルボニル、クロロ、およびフルオロからなる群から選択される水素結合受容体を含む。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されているリガンドは、相互作用点Ｒ_１に、シクロヘキシル−アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される大きな疎水性基を含む。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されているリガンドは、相互作用点Ｒ_２に、イソロイシン、ロイシン、システインからなる群から選択される疎水性アミノ酸残基、またはヒスチジン、グルタミン、リシン、アルギニン、およびグルタミン酸からなる群から選択される部分的疎水性基を含む。

重要な態様において、本発明は、本明細書で定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、前記リガンドは下記の式（Ｉ）の一般構造を有する：

［式中、Ｘは水素供与体として働く原子であり、前記原子がＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐからなる群から選択され、
Ｙは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択される水素結合受容体として働く電気陰性原子であり、
Ｒ_１は、Ｃ３〜６アルキル、Ｃ４〜６シクリル、それぞれが４〜６員環の１つの環および１〜３つのヘテロ原子を有する複素環式または複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_０〜２からなる群から選択される１〜３つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
Ｒ_２は、水素、Ｃ１〜１２のアルキル、またはそれぞれが３〜８員環の１〜３つの環および０〜４つのヘテロ原子を有する芳香族、炭素環式、複素環式、もしくは複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_０〜２からなる群から選択される１〜８つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
Ｒ_３は、水素、ＳＨ、イミダゾール、Ｃ１〜１２アルキル、またはそれぞれが３〜８員環の１〜３つの環および０〜４つのヘテロ原子を有する芳香族、炭素環式、複素環式、もしくは複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される１〜８つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
Ｒ_４は、官能基Ｃ１〜１００直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐アルケニル、直鎖または分岐アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、ハロホルミル、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、炭酸エステル、カルボン酸、カルボキシル、エーテル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、アンモニウム、第一級ケチミン、第二級ケチミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ（ジイミド）、シアン酸、イソシアン化物、イソチオシアン酸、硝酸、ニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、ホスフィノ、リン酸、ホスホノ、スルホニル、スルフィニル、スルフィドリル（ＳＨ）、チオシアン酸、ジスルフィド、リンカーＬ２またはＬ３、および配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列またはその断片から選択される］。

さらなる重要な態様において、本発明は、本明細書で定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、前記リガンドは以下の式（ＩＩ）の一般構造を有する：

［式中、Ｚは、カルボニル、ヒドロキシル、アミノ、イミノ、アミド、スルフィドリル、クロロ、フルオロからなる群から選択される水素結合供与体または受容体であり、
Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_３、およびリンカーＬ２からなる群から選択され、
Ｒ_６は、Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_３、および−ＯＣＨ_３からなる群から選択され、
Ｒ_７は、グルタミン酸、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、メチオニン、システイン、脂肪族Ｃ４〜６基の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_８は、チロシン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、フェニルアラニン、ヨードチロシン、および−ＣＨ_２−ＮＨ_２の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_９は、リシン、アルギニン、グルタミン、Ｃ３〜８脂肪族基およびヘテロ脂肪族基、５員環または６員環を含む炭素環式基および複素環式基の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_１０は、ピログルタミン酸、ポリ炭水化物、および１０以上の長さのポリペプチドからなる群から選択され、
Ｒ_１１およびＲ_１２は個々に、Ｈ、Ｃ１〜１２直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐アルケニル、直鎖または分岐アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、ハロホルミル、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、炭酸エステル、カルボン酸、カルボキシル、エーテル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、アンモニウム、第一級ケチミン、第二級ケチミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ（ジイミド）、シアン酸、イソシアン化物、イソチオシアン酸、硝酸、ニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、ホスフィノ、リン酸、ホスホノ、スルホニル、スルフィニル、スルフィドリル（ＳＨ）からなる群から選択され、
共有結合（１）および（２）は個々に、一重結合および二重結合からなる群から選択される］。

非常に重要な態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドに関し、前記リガンドは、以下の式（ＩＩＩ）の一般構造を有する：

［式中、Ｒ_１３は、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、アルケニル、アルキニル、およびリンカーＬ３からなる群から選択され、
Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｒ_１７、Ｒ_１９、Ｒ_２０は個々に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され、
Ｒ_１６は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、リシン、および脂肪族Ｃ３〜７の側鎖からなる群から選択され、
Ｒ_１８は、Ｈ、−ＣＨ_３、および−ＣＨ_２ＯＨからなる群から選択され、
共有結合（１）および（２）は個々に、一重結合および二重結合からなる群から選択される］。

本発明の一実施形態において、式（Ｉ）のリガンドは、式（ＩＩ）のリガンドにリンカーＬ２によって連結され、それにより以下の一般式（ＩＶ）
［式（Ｉ）］−［リンカーＬ２］−［式（ＩＩ）］ （ＩＶ）
を形成し、前記式（ＩＶ）は、ソルチリンの結合部位１および２を同時にブロックする能力があり、本明細書の上記で言及されたリンカーＬ２は、５〜６個の残基のペプチドバックボーン、Ｃ１５〜２０アルキル、Ｃ１５〜２０アルケニル、およびＣ１５〜２０アルキニルからなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、式（Ｉ）のリガンドは、式（ＩＩＩ）のリガンドにリンカーＬ３によって連結され、それにより以下の一般式（Ｖ）
［式（Ｉ）］−［リンカーＬ３］−［式（ＩＩＩ）］ （Ｖ）
を形成し、前記式（Ｖ）は、ソルチリンの結合部位１および３を同時にブロックする能力があり、リンカーＬ３は、１２〜２０個の残基のペプチドバックボーン、Ｃ３０〜６０アルキル、Ｃ３０〜６０アルケニル、Ｃ３０〜６０アルキニルからなる群から選択される。

さらなる実施形態において、本発明の方法によって同定されるリガンドは、図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｃｈｇ）、ｉｏｄｏＹＩＬ、ＱＩＬ、ＹＣＬ、ｄＹＩＬ、ＹＨＬ、ＲＲＰＹＩ（ａｃｃ）、ＲＲＰＹＩ（ｎＭｅ）Ｌ、ＹＩＬからなる群から選択される。

さらなる態様において、本発明は、本明細書で定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｃｈｇ）であるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたｉｏｄｏＹＩＬであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＱＩＬであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＹＣＬであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたｄＹＩＬであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＹＨＬであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ａｃｃ）であるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｎＭｅ）Ｌであるリガンドに関する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義された方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、図２６に示されたＹＩＬであるリガンドに関する。

一実施形態において、リガンドは、天然のニューロテンシン、ＮＴ（８〜１３）、またはＮＴ６９Ｌからなる群から選択されない。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書に記載された方法によって同定されているリガンドは、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体ソルチリンの結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体への結合を阻害する能力がある。

別の態様において、本発明は、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体タンパク質分子の原子モデルを構築するための方法であって、
ａ．配列番号１と少なくとも２０％の配列相同性を有する、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体またはその断片もしくは変異体を同定する段階と、
ｂ．図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標を利用して、相同性モデリングによって同定されたＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体の原子モデルを得る段階と
を含む方法に関する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義された方法に従って構築され得るＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体は、配列番号２（ＳｏｒＬＡ）、配列番号３（ＳｏｒＣＳ１）、配列番号４（ＳｏｒＣＳ２）、および配列番号５（ＳｏｒＣＳ３）、またはそれらの断片もしくは変異体からなる群から選択される。

さらなる態様において、本発明は、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体、またはその断片もしくは変異体の可能性のあるリガンドを同定する方法に関し、前記方法は、
ａ）３次元構造決定に基づいた、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に対して少なくとも２０％の配列相同性を有する結合部位の立体構造を定義する原子座標から引き出される情報をコンピュータへ導入する段階であって、それにより、コンピュータプログラムが前記立体構造の構造をコンピュータスクリーン上で利用またはディスプレイし、前記原子座標が図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から選択され、または原子座標が３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかによって表された３次元構造のいずれか１つから偏位する３次元構造から選択される段階と、
ｂ）コンピュータスクリーン上で前記コンピュータプログラムによってソルチリンの結合部位１、結合部位２、もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に対して少なくとも２０％の配列相同性を有する結合部位の３次元表示を作成する段階と、
ｃ）ソルチリンの結合部位１、結合部位２、または結合部位３に対して少なくとも２０％の配列相同性を有する前記結合部位の表示の上に可能性のあるリガンドのモデルを重ねる段階と、
ｄ）ソルチリンの結合部位１、結合部位２、結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に対して少なくとも２０％の配列相同性を有する結合部位との可能性のあるリガンドの結合の可能性および立体障害の非存在を評価する段階と、
ｅ）前記Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体の結合アッセイにおいて前記可能性のあるリガンド化合物を組み入れる段階と、
ｆ）前記可能性のあるリガンドが、配列番号１の結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３に対して少なくとも２０％の配列相同性を有する前記結合部位に結合する能力があるかどうかを生化学的または生物物理学的競合結合アッセイを実施することによって決定する段階であって、競合するリガンドが、配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）、および配列番号１２（ＮＴ６９Ｌ）、または前記競合リガンドの断片もしくは変異体からなる群から選択される段階
を含む。

適応症
一態様において、本発明は、ソルチリンおよび／またはソルチリン：ｐｒｏＮＧＦ：ｐ７５^ＮＴＲ誘導性アポトーシスの阻害剤を含む薬剤に関する。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された方法によって同定されている少なくとも１つのリガンドが、薬剤の製造に用いられ、前記薬剤が、個体の神経系の疾患、障害、または損傷に対する処置用、ならびに予防または処置用、ならびに予防および／または保護用である。

本発明のさらなる実施形態において、上記で言及された個体は、ヒトである。

本発明のさらなる実施形態において、上記で言及された薬剤は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経への傷害を含む疾患、障害、または損傷の処置用である。

本発明の実施形態において、本明細書の上記で定義された傷害は、脳卒中、脳外傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、およびてんかんに起因する。

本発明の実施形態において、神経系障害は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンおよびそれらの突起の変性を含む。

本発明のさらなる実施形態において、ニューロンの変性は、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および多発性硬化症に関連したニューロン傷害に起因する。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された神経変性疾患はパーキンソン病である。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された神経変性疾患はハンチントン病である。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された神経変性疾患は筋萎縮性側索硬化症である。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された神経系障害は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷である。

本発明のさらなる実施形態において、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む上記で言及された疾患、障害、または損傷は、代謝疾患、栄養障害、毒性傷害、悪性腫瘍によって引き起こされる状態、ならびに／または、限定されないが、糖尿病、腎機能障害、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、および感染を含む遺伝的もしくは特発性状態からなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、神経系障害は、グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷であり、前記グリアは、脳、脳幹、脊髄、および末梢神経におけるオリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびシュワン細胞からなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、前記グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷は、多発性硬化症、視神経炎、脳硬化症、麻疹後脳脊髄炎、およびてんかんからなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、疾患または障害は、多発硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、およびアルコール依存症である。

本発明の一実施形態において、神経系障害、疾患、または損傷は、網膜、視細胞、および関連神経に関わる。

本発明の一実施形態において、網膜、視細胞、および関連神経に関わる神経系障害、疾患、または損傷は、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、神経系障害、疾患、または損傷は、聴神経（vestibuloacoustic）複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる。

本発明の一実施形態において、前記聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる神経系障害、疾患、または損傷は、騒音性難聴、聴覚消失、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性および蝸牛前庭萎縮（cochleovestibular atrophies）、およびメニエール病からなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記で定義されている薬剤は、任意で、薬学的に許容可能な担体を含む。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された薬剤は、配列番号１の高親和性ニューロテンシン結合部位（結合部位１）に結合する能力があるリガンド、配列番号１の低親和性ニューロテンシン結合部位（結合部位２）に結合する能力があるリガンド、ソルチリンプロペプチド結合部位（結合部位１および２）に結合する能力があるリガンド、配列番号１のプロニューロトロフィン結合部位（結合部位３）に結合する能力があるリガンドからなる群から選択される第２の活性成分を含む。

投与型
処置方法における薬物送達の主な経路は、静脈内、経口、および局所である。薬物を標的部位へ送達するのに効果的、または薬物を血流へ導入するのに効果的である皮下注射または吸入によるなどの他の薬物投与方法もまた企図される。

本発明の薬学的調製が投与される粘膜は、生物活性物質が、例えば、鼻、膣、眼、口、生殖器、肺、胃腸管、または直腸において与えられることになっている哺乳動物の任意の粘膜、好ましくは、鼻、口、または膣の粘膜であってもよい。

本発明の化合物は、非経口で、すなわち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内、または腹腔内投与によって、投与されてもよい。非経口投与の皮下型および筋肉内型が一般的に好ましい。そのような投与のための適切な剤形は、通常の技術によって調製することができる。化合物はまた、鼻腔内吸入および経口吸入投与による吸入によって投与されてもよい。エアロゾル製剤または定量噴霧式吸入器などのそのような投与のための適切な剤形は通常の技術によって調製することができる。

本発明による化合物は、少なくとも１つの他の化合物と共に投与されてもよい。化合物は、別個の製剤として、もしくは単位剤形に組み合わされて、同時に投与されてもよく、連続的に投与してもよい。

製剤
本発明の化合物または塩が粗化学物質として投与されることは可能であるが、薬学的製剤の形でそれらを提供することが好ましい。したがって、本発明はさらに、薬剤適用のための、本明細書に定義されている本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、およびそのための薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的製剤を提供する。

本発明の化合物は、幅広い種類の経口投与剤形に製剤化することができる。薬学的組成物および剤形は、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容可能な塩、またはその結晶型を活性成分として含んでもよい。薬学的に許容可能な担体は、固体または液体のいずれでもあり得る。固形調製物として、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ剤、坐剤、および分散性顆粒が挙げられる。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁剤、結合剤、保存剤、湿潤化剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化材料として機能し得る１つまたは複数の物質であり得る。

好ましくは、組成物は、本発明の化合物（複数可）の約０．５重量％〜７５重量％であり、残りは適切な薬学的賦形剤からなる。経口投与について、そのような賦形剤として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。

粉末において、担体は、微粉活性成分との混合物である微粉固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形およびサイズに圧縮される。粉末および錠剤は、好ましくは、１パーセントから約７０パーセントまでの活性成分を含む。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバターなどである。用語「調製物」は、カプセル内に、担体を含む含まないに関わらず、活性成分が、それと共同する担体に囲まれているカプセルを提供する担体としてのカプセル化材料との活性成分の製剤を含むものとする。同様に、カシェ剤およびトローチ剤が含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カシェ剤、およびトローチ剤は、経口投与に適した固形としてあり得る。

本発明による滴剤は、滅菌または非滅菌の水性または油性の溶液または懸濁液を含み得、適切な水溶液に活性成分を溶解することによって調製してもよく、任意で殺細菌剤および／もしくは殺真菌剤、ならびに／または任意の他の適切な保存剤を含み、任意で表面活性剤を含む。その後、生じた溶液は、濾過によって透明にされ、適切な容器に移され、その容器は密封されて、９８〜１００℃で半時間、オートクレーブし、または維持することによって滅菌される。あるいは、溶液は、濾過によって滅菌され、無菌で容器に移されてもよい。滴剤への含有に適した殺細菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、および酢酸クロルヘキシジン（０．０１％）である。油性溶液の調製のための適切な溶媒として、グリセロール、希釈アルコール、およびプロピレングリコールが挙げられる。

経口投与のための液体形調製物へ使用直前に変換されることが意図される固形調製物もまた挙げられる。そのような液体形として、溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられる。これらの調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香味剤、安定剤、緩衝剤、人工および天然甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。

経口投与に適した他の形として、乳濁液、シロップ、エリキシル、水溶液、水性懸濁液、を含む液体形調製物、練り歯磨き、ゲル歯磨剤、チューイングガム、液体形調製物へ使用直前に変換されることが意図される固形調製物が挙げられる。乳濁液は、水性プロピレングリコール溶液に溶解して調製してもよく、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアラビアゴムなどの乳化剤を含めてもよい。水溶液は、活性成分を水に溶解し、適切な着色剤、香味剤、安定剤、および増粘剤を加えることによって調製することができる。水性懸濁液は、微粉活性成分を、天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および他の周知の懸濁剤などの粘性材料と共に水に分散させることによって調製することができる。固形調製物には、溶液、懸濁液、および乳濁液が挙げられ、活性成分に加えて、着色剤、香味剤、安定剤、緩衝剤、人工および天然甘味剤、分散剤、増粘剤、可溶化剤などを含んでもよい。

本発明の化合物は、（例えば、ボーラス注入または持続点滴などの注射による）非経口投与用に製剤化することができ、保存剤が添加された、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器における単位用量型で、または複数回用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液のような形をとることができる。油性または非水性担体、希釈剤、溶媒、または媒体の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられ、それらは、保存剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。あるいは、活性成分は、滅菌固体の無菌的単離により、または適切な媒体、例えば、発熱物質を含まない滅菌水を用いる使用前の構成として溶液からの凍結乾燥により、得られる粉末形であってもよい。

非経口製剤に有用な油として、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。そのような製剤に有用な油の具体的な例として、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、石油、および鉱油が挙げられる。非経口製剤に用いる適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。

非経口製剤に用いる適切なセッケンとして、脂肪アルカリ金属塩、アンモニウム塩、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な界面活性剤として、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物およびアルキルピリジニウムハロゲン化物などの陽イオン界面活性剤；（ｂ）例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、ならびにスルホサクシネートなどの陰イオン界面活性剤；（ｃ）例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体などの非イオン性界面活性剤；（ｄ）例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸および２−アルキルイミダゾリン第四アンモニウム塩などの両性界面活性剤、ならびに（ｅ）それらの混合物が挙げられる。

非経口製剤は、典型的には、溶液中に約０．５重量％から約２５％重量％までの活性成分を含む。保存剤および緩衝剤を用いてもよい。注射部位での刺激を最小限にし、または排除するために、そのような組成物は、約１２から約１７までの親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。そのような製剤における界面活性剤の量は、典型的には、約５重量％から約１５重量％までの範囲である。適切な界面活性剤として、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびプロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合によって形成される疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量の密封された容器で提供することができ、使用直前に、注射用に、滅菌液体賦形剤、例えば、水の添加だけを必要とする凍結乾燥（freeze-dried）（凍結乾燥（lyophilized））状態で保存することができる。即時注射溶液および懸濁液は、前に記載した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。

本発明の化合物はまた、局所的に送達することができる。局所投与のための領域として、皮膚表面、ならびにまた膣、直腸、鼻、口、およびのどの粘膜組織が挙げられる。皮膚および粘膜を経由する局所投与のための組成物は、腫脹または発赤などの刺激の徴候を生じるべきではない。

局所組成物は、局所投与に適応した薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。したがって、組成物は、例えば、懸濁液、溶液、軟膏、ローション、性的潤滑剤、クリーム、泡、エアロゾル、スプレー、坐剤、インプラント、吸入薬、錠剤、カプセル、乾燥粉末、シロップ、バルム剤またはトローチ剤の形をとることができる。そのような組成物を調製するための方法は、製薬産業においてよく知られている。

本発明の化合物は、軟膏、クリーム、もしくはローションとして、または経皮パッチとして表皮への局所投与のために製剤化してもよい。軟膏およびクリームは、例えば、適切な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して、水性または油性基剤を用いて製剤化することができる。ローションは、水性または油性基剤を用いて製剤化することができ、一般的に、１つまたは複数の乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、または着色剤も含む。口における局所投与に適した製剤には、香味をつけた基剤、通常には、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント中に活性剤を含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に活性成分を含む香錠；ならびに適切な液体担体中に活性成分を含むうがい薬が挙げられる。

本発明によるクリーム、軟膏、またはペーストは、外用の活性成分の半固体製剤である。それらは、単独の、または水性もしくは非水性液体における溶液もしくは懸濁液中の微粉形または粉末形の活性成分を、適切な機械類の助けを借りて、脂肪性または非脂肪性基剤と混合することによって作製することができる。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィン、または流動パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属セッケン；粘漿剤；アーモンド油、コーン油、落花生油、ヒマシ油、またはオリーブ油などの天然起源の油；羊毛脂もしくはその誘導体、またはプロピレングリコールなどのアルコールもしくはマクロゲルと組み合わせたステアリン酸もしくはオレイン酸などの脂肪酸などの炭化水素を含んでもよい。製剤は、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などの陰イオン性、陽イオン性、または非イオン性界面活性剤などの任意の適切な界面活性剤を組み入れてもよい。天然ガム、セルロース誘導体、またはシリカ性シリカなどの無機材料などの懸濁剤、およびラノリンなどの他の成分もまた含まれてもよい。

本発明によるローションには、皮膚または眼への適用に適したものが挙げられる。点眼薬は、任意で殺細菌剤を含む滅菌水溶液を含んでもよく、滴剤の調製の方法と類似した方法によって調製することができる。皮膚用のローションまたはリニメント剤はまた、アルコールもしくはアセトンなどの乾燥を早め、かつ皮膚を冷やすための作用物質、および／またはグリセロール、もしくはヒマシ油もしくは落花生油などの油などの保湿剤を含んでもよい。

経皮送達
本明細書に記載された医薬品−化学修飾剤複合体は、経皮的に投与することができる。経皮投与は典型的には、患者の体循環への薬物の経皮的通過のための医薬品の送達に関わる。皮膚部位として、薬物を経皮的に投与するための解剖学的領域が挙げられ、前腕、腹部、胸部、背中、臀部、乳様突起部などがある。

経皮送達は、長期間、その複合体の供給源を患者の皮膚へ曝すことによって達成される。経皮パッチは、医薬品−化学修飾剤複合体の身体への制御性送達を提供するという追加の利点を有する。Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives、HadgraftおよびGuy（編）、Marcel Dekker, Inc.、(1989)（非特許文献９）；Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications、RobinsonおよびLee（編）、Marcel Dekker Inc.、(1987)（非特許文献１０）；ならびにTransdermal Delivery of Drugs、1〜3巻、KydonieusおよびBerner（編）、CRC Press、(1987)（非特許文献１１）を参照。そのような剤形は、エラストマーマトリックス材料などの適切な媒質中に医薬品−化学修飾剤複合体を溶解、分散、または別の形で組み入れることによって作製することができる。吸収促進剤もまた、皮膚を通しての化合物の流入を増加させるために用いることができる。そのような流入速度は、速度制御性膜を供給するか、またはポリマーマトリックスもしくはゲル内に化合物を分散させるかのいずれかによって制御することができる。

受動的経皮薬物送達
本明細書に記載された方法に様々な型の経皮パッチを用いることができる。例えば、単純な接着パッチは、裏当て材およびアクリル酸系接着剤から調製することができる。医薬品−化学修飾剤複合体および任意の促進剤を、粘着性成形溶液中へ製剤化して、十分混合するようにする。溶液を裏当て材上へ直接流し込み、成形溶媒をオーブン内で蒸発させ、粘着フィルムを残す。剥離ライナーを付着させて、系を完成させることができる。

あるいは、ポリウレタンマトリックスパッチを、医薬品−化学修飾剤複合体を送達するのに用いることができる。このパッチの層は、裏当て、ポリウレタン薬物／促進剤マトリックス、膜、接着剤、および剥離ライナーを含む。ポリウレタンマトリックスは、ポリウレタンプレポリマーを硬化させる室温を用いて調製される。プレポリマーへの水、アルコール、および複合体の添加により、裏当て材上に直接成形され得る粘着性フィルムエラストマーの形成を生じる。

本発明のさらなる実施形態は、ハイドロゲルマトリックスパッチを利用する。典型的には、ハイドロゲルマトリックスは、アルコール、水、薬物、およびいくつかの親水性ポリマーを含む。このハイドロゲルマトリックスは、経皮パッチへ裏当てと接着剤層の間に組み入れることができる。

液体貯留パッチもまた本明細書に記載された方法に用いることができる。このパッチは、不透性または半透性のヒートシール可能な裏当て材、ヒートシール可能な膜、アクリル酸系感圧皮膚接着剤、およびシリコン処理した剥離ライナーを含む。裏当ては、膜へヒートシールされ、貯留層を形成し、それを、その後、複合体、促進剤、ゲル化剤、および他の賦形剤の溶液で満たすことができる。

泡マトリックスパッチは、ゲル状医薬品−化学修飾剤溶液が薄い泡層、典型的にはポリウレタン内に拘束されていることを除けば、液体貯留層システムと設計および構成要素の点で類似している。この泡層は、裏当てと、パッチ周辺部でヒートシールされている膜との間に位置する。

受動的送達系について、放出速度は、典型的には、貯留層と皮膚の間に置かれた膜によって、モノシリック装置からの拡散によって、または送達系において速度制御バリアとして働く皮膚自体によって、制御される。米国特許第４，８１６，２５８号（特許文献３）；第４，９２７，４０８号（特許文献４）；第４，９０４，４７５号（特許文献５）；第４，５８８，５８０号（特許文献６）；第４，７８８，０６２号（特許文献７）などを参照。薬物送達の速度は、膜の性質に一部依存している。例えば、身体内での膜を通しての薬物送達の速度は、一般的に、皮膚バリアを通してよりも高い。複合体が装置から膜へ送達される速度は、貯留層と皮膚の間に置かれている速度制限膜の使用によって最も有利に制御される。皮膚が複合体に対して十分な透過性がある（すなわち、皮膚を通しての吸収は膜を通しての通過速度より大きい）と仮定すれば、膜は、患者が経験する投薬速度を制御するように働くであろう。

適切な透過性膜材料は、所望の程度の透過性、複合体の性質、および装置を構築することに関連した力学的考察に基づいて選択することができる。例示的な透過性膜材料として、ポリジメチルシロキサン（シリコーンゴム）、酢酸エチレンビニル共重合体（ＥＶＡ）、ポリウレタン、ポリウレタン−ポリエーテル共重合体、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、セルロース系材料、例えば、三酢酸セルロースおよび硝酸／酢酸セルロース、ならびにハイドロゲル、例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）などの幅広い種類の天然および合成重合体が挙げられる。

所望の装置の特徴に依存して、治療用製造物の他の通常の成分などの他のアイテムを装置に含んでもよい。例えば、本発明による組成物はまた、１つまたは複数の保存剤または静菌剤、例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウムなどを含んでもよい。これらの薬学的組成物はまた、抗菌剤、特に、抗生物質、麻酔剤、鎮痛剤、および鎮痒剤などの他の活性成分を含むことができる。

本発明の化合物は、坐剤としての投与のために製剤化することができる。脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物などの低融点ワックスを、最初に融解し、活性成分を、例えば、撹拌によって均一に分散させる。その後、溶融した均一な混合物を、都合のよいサイズの型へ注ぎ、冷えて固まるようにしておく。

活性化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）担体（例えば、ＰＥＧ １０００［９６％］およびＰＥＧ ４０００［４％］）中に配置された、例えば、約０．５％〜約５０％の本発明の化合物を含む坐剤へ製剤化することができる。

本発明の化合物は、膣投与用に製剤化することができる。活性成分に加えて、適切であることが当技術分野において知られている担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡、またはスプレー。

本発明の化合物は、経鼻投与用に製剤化することができる。溶液または懸濁液は、通常の手段、例えば、スポイト、ピペット、またはスプレーを用いて鼻腔へ直接適用される。製剤は、単一用量または複数用量の形で提供することができる。スポイトまたはピペットの後者の場合、これは、適切な所定の容量の溶液または懸濁液を患者が投与することによって達成することができる。スプレーの場合、これは、例えば、定量噴霧スプレーポンプを用いて達成することができる。

本発明の化合物は、エアロゾル投与用に、特に鼻腔内投与を含む呼吸器への投与用に製剤化することができる。化合物は、一般的に、例えば、５ミクロン以下くらいの小さな粒子サイズである。そのような粒子サイズは、当技術分野において知られた手段、例えば、微粒子化によって得ることができる。活性成分は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、もしくはジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスなどの適切な噴射剤と共に加圧されたパックで提供される。エアロゾルは、便利には、レシチンなどの界面活性剤も含んでもよい。薬物の用量は、定量バルブによって調整することができる。あるいは、活性成分は、乾燥粉末、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのデンプン誘導体、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの適切な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形をとって提供することができる。粉末担体は、鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、粉末が吸入器を用いて投与することができる、例えば、ゼラチンなどのカプセルもしくはカートリッジ、またはブリスター・パックにおいて、単位用量の形で提供してもよい。

必要な場合、製剤は、活性成分の徐放性または放出制御性投与に適応した腸溶コーティングで調製することができる。

薬学的調製物は、好ましくは、単位剤形である。そのような形において、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位用量へ細分される。単位剤形は、パッケージングされた調製物であり得、そのパッケージは、パッケージングされた錠剤、カプセル、およびバイアルまたはアンプル中の粉末などの別個の量の調製物を含む。また、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、またはトローチ剤自体であり得、またはそれは、これらのいずれかの適当な数をパッケージングされた形であり得る。

薬学的に許容可能な塩
本化合物の薬学的に許容可能な塩もまた、それらが調製することができる場合、本発明に網羅されるものとする。これらの塩は、薬学的用途に適用することが容認できるものである。つまり、塩は、親化合物の生物活性を保持し、かつ塩は、疾患を処置するのにそれを適用および使用するにおいて、厄介または有害な効果を生じないであろうことを意味する。

薬学的に許容可能な塩は、標準方法で調製される。親化合物が塩基の場合には、それは、適切な溶媒中で過剰の有機酸または無機酸で処理される。親化合物が酸の場合には、それは、適切な溶媒中で無機塩基または有機塩基で処理される。

本発明の化合物は、経口、直腸、または（皮下を含む）非経口経路に関わらず、有効量を、それらのアルカリ金属塩または土類アルカリ金属塩の形で、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と同時に、一斉に、または共に、特にかつ好ましくは、それらの薬学的組成物の形で、投与してもよい。

本発明の薬学的組成物に用いる薬学的に許容可能な酸付加塩の例として、塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、および硫酸などの鉱酸、ならびに、例えば、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびアリールスルホン酸などの有機酸由来のものが挙げられる。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記の薬剤組成物のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ９である。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された薬剤は、注射による投与、坐剤、経口投与、舌下錠もしくはスプレー、皮膚投与、または吸入用に製剤化される。

本発明の一実施形態において、前記薬剤は、注射による投与用に製剤化され、注射は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス投与または連続投与である。

一実施形態において、本発明による薬剤は、３０分間〜２４時間の間隔で投与される。

一実施形態において、本発明による薬剤は、１時間〜６時間の間隔で投与される。

本発明による一実施形態において、本明細書の上記に記載された薬剤の投与の持続期間は、６時間〜７２時間である。

本発明による一実施形態において、本明細書の上記で定義されている薬剤の用量は、１ｋｇの体重あたり１０μｇ〜１０ｍｇである。

処置方法
さらなる態様において、本発明は、薬剤の製造のための本明細書の上記の方法によって同定された少なくとも１つのリガンドの使用であって、前記薬剤が、個体における神経系の疾患、障害、または損傷の処置用である、使用に関する。

別の態様において、本発明は、対象における病的状態の処置の方法であって、本明細書の上記の薬剤の治療有効量をそれを必要としている個体に投与することを含む方法に関する。

本発明の一実施形態において、前記薬剤は、神経系に関連する疾患、障害、または損傷の処置用である。

本発明の別の実施形態において、前記薬剤は、限定されないが、脳卒中、脳外傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、およびてんかんなどの状態を含む、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経への傷害を含む疾患、障害、または損傷の処置用である。

本発明の別の実施形態において、前記薬剤は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経への傷害を含む疾患、障害、または損傷の処置用である。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記の神経系障害は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンおよびそれらの突起の変性を含む。

本発明のさらなる実施形態において、前記ニューロンの変性は、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および多発性硬化症に関連したニューロン傷害に起因する。

本発明の一実施形態において、前記神経変性疾患はパーキンソン病である。

本発明のさらなる実施形態において、前記神経変性疾患はハンチントン病である。

本発明のさらなる実施形態において、前記神経変性疾患は筋萎縮性側索硬化症である。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で開示された神経系障害は、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷である。

本発明のさらなる実施形態において、前記脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷は、代謝疾患、栄養障害、毒性傷害、悪性腫瘍によって引き起こされる状態、ならびに／または、限定されないが、糖尿病、腎機能障害、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、および感染を含む遺伝的もしくは特発性状態からなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態において、前記神経系障害は、グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷であり、前記グリアは、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるオリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびシュワン細胞からなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態において、前記グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷は、多発性硬化症、視神経炎、脳硬化症、麻疹後脳脊髄炎、およびてんかんからなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態において、前記疾患または障害は、多発硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、およびアルコール依存症である。

本発明のさらなる実施形態において、前記神経系障害、疾患、または損傷は、網膜、視細胞、および関連神経に関わり、前記網膜、視細胞、および関連神経に関わる神経系障害、疾患、または損傷は、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される。

本発明のさらなる実施形態において、前記神経系障害、疾患、または損傷は、聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる。

本発明のさらなる実施形態において、前記聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる神経系障害、疾患、または損傷は、騒音性難聴、聴覚消失、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性および蝸牛前庭萎縮、およびメニエール病からなる群から選択される。

本発明の一実施形態において、本明細書の上記に記載された対象はヒトである。

アポトーシス
アポトーシスは、細胞が修復不可能に損傷を受ける、ウイルスに感染する、または飢餓などのストレス状態を起こしている場合、生じ得る。アポトーシスの「決定」は、細胞自体から、周囲組織から、または免疫系の一部である細胞からもたらされる。これらの場合、アポトーシスは、損傷細胞を除去して、それが生物体からさらなる栄養分を奪うのを防ぐように、またはウイルス感染の伝播を防ぐように機能する。

ソルチリンは、エンドサイトーシスおよび細胞内ソーティングの能力がある多機能性１型受容体であり（９〜１１）、最近示されているように、それはまた、ｐ７５^ＮＴＲ媒介性ニューロンアポトーシスのプロニューロトロフィン誘導をトリガーすることによるシグナル伝達に関与している（６、７、１２、１３）。

本発明は、ソルチリンの結合部位１、結合部位２、および結合部位３、それぞれに特異的に結合するリガンドを設計するための方法を提供する。

本明細書の上記で定義されているソルチリンの結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３に結合する能力があるリガンド分子を設計および提供し、それにより、ソルチリンとｐｒｏＮＧＦとｐ７５^ＮＴＲとの三元複合体の形成を防ぎ、それによってアポトーシスを阻害することは本発明の範囲内である。

したがって、一実施形態において、本発明に従って設計されたリガンドは、アポトーシスを阻害する能力がある。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類神経細胞においてアポトーシスを防ぐ方法に関し、前記方法は、前記神経細胞を本明細書の上記で定義されたリガンド分子に曝すことを含む。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類神経細胞の生存を増強する方法であって、前記神経細胞を本明細書の上記で定義されているリガンド分子に曝すことを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類細胞の組織を増殖させる方法であって、前記組成物を本明細書の上記で定義されているリガンド分子を投与することを含む方法に関する。

さらなる態様において、本発明は、哺乳類細胞の組織を分化させる方法であって、前記組成物に本明細書の上記で定義されているリガンド分子を投与することを含む方法に関する。

抗体
抗体は、特定の標的分子にしっかりと結合し、それにより、それを直接不活性化させるか、またはそれを破壊すべきものとして標識する。抗体は、水素結合、疎水性力およびファンデルワールス力、ならびにイオン性相互作用を含む多くの化学的力の総和によって指示される顕著な特異性および強度でそれの標的（抗原）を認識する。一般的に、標的が化学的に複雑になればなるほど、それは免疫原性が強くなる。抗原決定基は、短い線状アミノ酸ヒト配列、またはより複雑な３次元タンパク質モジュールを含み得る。概念的には、標的受容体に対して方向付けられた抗体は、競合的またはアロステリックという２つの方法でリガンド結合を阻害することができる。競合的阻害は、受容体上のリガンド結合部位へ、またはその近くへの抗体の直接的結合を含み、それにより、リガンドがその受容体から追放され、またはリガンドのリガンド結合部位へのアプローチを立体的に阻害する。アロステリック阻害は、リガンド結合エピトープとは異なる受容体ポリペプチド上の部位への抗体の結合を含む。しかしながら、この部位への結合は、受容体の全体的構造における立体構造変化を引き起こし、それが、リガンドがその同族認識部位に結合するのをより困難、またはさらに不可能にさせる。

したがって、本発明の一つの重要な態様において、抗体が産生されており、前記抗体は配列番号１の結合部位１に特異的に結合する能力がある。

さらなる実施形態において、産生された抗体は、配列番号１の結合部位１に結合する能力がある内因性または外因性リガンドのエピトープに特異的に結合する能力があり、それに従って、配列番号１の前記結合部位１への前記リガンドの結合を立体的に妨げる。

本発明の別の態様において、抗体が産生されており、前記抗体は配列番号１の結合部位２に特異的に結合する能力がある。

さらなる実施形態において、産生された抗体は、配列番号１の結合部位２に結合する能力がある内因性または外因性リガンドのエピトープに特異的に結合する能力があり、それに従って、配列番号１の前記結合部位２への前記リガンドの結合を立体的に妨げる。

本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、抗体が産生されており、前記抗体は配列番号１の結合部位３に特異的に結合する能力がある。

さらなる実施形態において、産生された抗体は、配列番号１の結合部位３に結合する能力がある内因性または外因性リガンドのエピトープに特異的に結合する能力があり、それに従って、配列番号１の前記結合部位３への前記リガンドの結合を立体的に妨げる。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＲ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、Ｔ３９８〜Ｇ４００、Ｉ３０３〜Ｇ３０９、Ｑ３４９〜Ａ３５６、Ｙ３９５、およびＴ４０２を含む結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＲ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、およびＴ３９８〜Ｇ４００を含む結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＲ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、およびＦ３５０〜Ｍ３６３を含む結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＬ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、Ｗ５９７、Ｔ１６８〜Ｉ１７４、Ｌ５７２、Ａ５７３、およびＳ５８４〜Ｆ５８８を含む結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＬ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、およびＷ５９７を含む結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＬ５７２、Ｌ１１４、およびＶ１１２を含む結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＤ４０３、Ｓ４２０、Ｄ４２２、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｅ４２６、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｅ４７０、Ｉ４９８、Ｓ４９９、およびＶ５００を含む結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＤ４０３、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含む結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記で定義されている抗体は、限定されないが、配列番号１のＴ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含む結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基またはその周辺に結合する。

本発明のさらなる実施形態において、本明細書の上記に記載された抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、組換え抗体からなる群から選択される。

さらなる態様において、本発明は、本明細書の上記に記載された抗体、および化学療法剤、毒素、または放射性同位元素などの細胞傷害性薬剤；アビジンもしくはストレプトアビジンまたは抗原などの特異的結合ペアのメンバー；検出可能な生成物を生じる能力がある酵素からなる群から選択されるコンジュゲートを含むイムノコンジュゲートに関する。

ソルチリン構造の概略を示す図である。Ａ）トンネルの開口側からプロペラ軸の下へと見た時の２．６Å分解能におけるｓソルチリン：ＮＴの図解。個々のプロペラ翼は、外側縁に沿って番号付けされている。翼６における高親和性ＮＴ結合部位（結合部位１）におけるＮＴ（Ｐｒｏ１０−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３）および翼１における結合部位２におけるＮＴ（Ｌｅｕ２−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ６）がスティックとして示されている。Ａｓｎ２０６、Ａｓｎ４５０、およびＡｓｎ６２６におけるグリコシル化のオリゴ糖部分もまたスティックとして示されている。Ｂ）水平軸を中心とする９０°回転後のｓソルチリン（ａ）の図。プロペラは、灰色で表面表現として示されている。翼１および１０から伸びる疎水性ループは濃い灰色である。１０ＣＣドメインは模式図の表現で示されている。Ｃ）（ａ）に示されたｓソルチリン：ＮＴ複合体の表面表現。プロペラの表面は薄い灰色であり、ＮＴの１０ＣＣドメイン、Ｎ末端部、およびＣ末端部は濃い灰色であり、疎水性ループは黒色である。赤道面における破線に沿ったトンネルの寸法が示されている。灰色の線は、ｄに示された横断面の位置を示す。Ｄ）スティックとして示されたＮＴを有するプロペラの横断面。（ｃ）におけるのと同じ配色が用いられている。この図は、（ｂ）で用いられた図について垂直軸を中心に１８０°回転している。破線は、赤道面における最大寸法を示す。Ｅ）配列保存（図５）によって彩色されたｓソルチリンの表面表現。不変の位置は濃い灰色で彩色されている。１５倍過剰のＮＴおよびグリコシル化を有する２．６Åソルチリン：ＮＴ構造に見出される全ての３つのペプチド断片はスティックとして示されている。左：ｓソルチリンの上面図、すなわち、Ｃと同じ配向。右：ｓソルチリンの下面図、すなわち、垂直軸を中心に上面図の１８０°回転。 リガンド結合の詳細を示す図である。Ａ）２．６Å構造に見られる場合のＮＴのＮ末端部のｓソルチリンへの結合。原子型は灰色の暗度によって示されている；炭素（ｓソルチリン）−薄い灰色、窒素−より濃い灰色、酸素−より濃い灰色、および炭素（ＮＴ）−最も濃い灰色。ニューロテンシン残基は、金網として示された最終の２．６Å ２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップの１σレベルでオーバーレイされている。破線は、水素結合の位置を示す。Ｂ）２．０Å構造に見られる場合のＮＴのＣ末端部のソルチリンへの結合。残基Ｐｒｏ１０−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ１３、および結合ポケットを形成するｓソルチリンの残基がスティックとして示されている。（ａ）の場合と同様の色コード化。１σで等高線を示された電子密度マップは、２．０Å構造の最終３Ｆｏ−２Ｆｃマップである。Ｃ）プロペラ結合部位２におけるプロペプチドの電子密度。パネル（ａ）におけるのと同じｓソルチリンの原子セットが、ｓソルチリン：プロペプチドの翼１の鎖に重ねられている。パネル（ａ）の場合と同様の色コード化。最終３．２Å ３Ｆｃ−２Ｆｏ電子密度の１σ表面が、結合したプロペプチドの位置を指して示されている。Ｄ）プロペラ高親和性ＮＴ結合部位におけるプロペプチドの電子密度。パネル（ｂ）においてと同じセットのｓソルチリンの原子が、ｓソルチリン：プロペプチドの翼６の鎖１に重ねられる。最後の３．２Å ３Ｆｃ−２Ｆｏ電子密度の１σ表面が、結合したプロペプチドの位置を指示して示されている。Ｅ）トンネルにわたって結合するプロペプチド。図１ｄの場合と同様の、ｓソルチリン：プロペプチド構造の横断面。最後の３．２Å ３Ｆｃ−２Ｆｏ電子密度の１σ表面が示されている。 ｓソルチリン結合へのＮＴおよび由来ペプチドの効果を示す図である。ニューロテンシン由来ペプチドの非存在または存在下における、リガンドの固定化ｓソルチリンへの結合の表面プラズモン共鳴分析。番号付けは、個々のペプチドにＮＴ（１〜１３）のどのアミノ酸が含まれるかを示す。Ｃ末端トリペプチド１１−ＹＩＬ−１３（ＮＴ１１〜１３）の存在下における結合が示されている。Ａ）〜Ｂ）ＧＳＴタグ付きソルチリンプロペプチドの結合（ＧＳＴ−Ｓｏｒｔ−ｐｒｏ）；Ｃ）ＮＧＦのＧＳＴタグ付きプロペプチドの結合；Ｄ）ＲＡＰの結合。 ｓソルチリン受容体およびｓソルチリン突然変異受容体の分泌およびリガンド結合を示す図である。Ａ）ＣＨＯ細胞における^３５Ｓ生体標識ｓソルチリンのパルス追跡。野生型受容体または示されたアミノ酸置換を有する突然変異受容体である受容体を、示された時間における細胞可溶化液または培地から免疫沈殿させた。Ｂ）ＢＤＮＦおよびソルチリンプロペプチドの、野生型ｓソルチリンへの結合および精製されたＳ２８３Ｅ突然変異体への結合。その受容体を同じような濃度（０．０６ｐＭ／ｍｍ^２）で固定化し、結合をＳＰＲによって分析した。精製された突然変異受容体の銀染色は、挿入図として示されている。Ｃ）過剰ニューロテンシンの非存在下または存在下におけるＮＧＦ−プロドメインの、野生型ｓソルチリンへの結合（上部パネル）およびＳ３１６Ｅ突然変異体への結合（下部パネル）。 ソルチリン配列の配列アラインメント。番号付けは、配列番号１によるプレプロソルチリンの番号付けに対応する。以下の配列を、ＮＣＢＩの非重複性タンパク質データベースにおけるＢＬＡＳＴ検索によって同定し：Ｂｏｓ＿ｔａｕｒｕｓ：ｒｅｆ｜ＸＰ＿５８８９５６．３｜；Ｃａｎｉｓ＿ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ：ｒｅｆ｜ＸＰ＿５３７０４１．２｜；Ｒａｔｔｕｓ＿ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ：ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１０７６１５０．１｜；Ｍｕｓ＿ｍｕｓｃｕｌｕｓ：ｒｅｆ｜ＮＰ＿０６４３５６．２｜；Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ＿ａｎａｔｉｎｕｓ：ｒｅｆ｜ＸＰ＿００１５０５２４３．１；Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ＿ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ：ｅｍｂ｜ＣＡＧ０７５００．１｜；Ｄａｎｉｏ＿ｒｅｒｉｏ：ｒｅｆ｜ＮＰ＿９９８３９５．１｜その後、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いてｓソルチリン構築物に対して整列させた。ｓソルチリン構築物に対応する領域のみが、Ｃ末端Ｈｉｓタグを取り除いて示されている。アラインメント図は、Ｊａｌｖｉｅｗ（３４）を用いて作成し、各位置における保存に従って灰色の影をつけた。配列より下の太いバーは、ＤＳＳＰ（３４）によって割り当てられる二次構造の位置を示す。この線より下の翼１〜１０と表示されたバーは、プロペラの個々の翼の位置を示し、または１０ＣＣの２つのドメインの範囲を示す。ジスルフィド結合は、２つのシステインを連結する細い線かまたはジスルフィドパートナーの残基番号で表示するかのいずれかによって配列より上に示されている。青色バーは、２つの疎水性ループの位置を示す。アスタリスクは、グリコシル化アスパラギン残基を特定する。大文字Ｎは、ニューロテンシンのＣ末端部の結合に関与する残基を特定し、小文字ｎは、ニューロテンシンのＮ末端部の結合に関与する残基を特定する。 発現および結晶化の概要を示す図である。 ２Å分解能のＸ線回折パターンを示す図である。 精密化統計およびラマチャンドランプロットを示す図である。 １０翼のソルチリンβ−プロペラが独特で、新規で、かつ予想外であることを実証するβ−プロペラ構造の統計を示す図である。 野生型（ＷＴ）と比較した、ソルチリン突然変異体構造Ｓ３１６ＥおよびＲ３２５ＡへのＰＹＩＬリガンドの結合の概観を示す図である。 ソルチリンプロペプチドの断片を含むソルチリン結晶の最適化を示す図である。 ニューロテンシンと複合体を形成した管腔ソルチリンの２．０Å構造に見られる場合のＰｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕとして示されたニューロテンシンのＣ末端からの水素結合配置およびソルチリンを示す図である。ニューロテンシンロイシンの水素結合だけが不変であり、イソロイシン−３５３およびリシン−２６０のニューロテンシンチロシンへの水素結合は可変である。ソルチリンとニューロテンシンの間の疎水性相互作用を図示するために、４．２Åのニューロテンシン炭素原子内の炭素原子を有するソルチリン残基がそれらの相互作用パートナーの隣に列挙されている。 結合したニューロテンシン（ＮＴ）のＣ末端との結合部位１の特異的相互作用のマッピングを示す図である。 結合した人工ペプチドＮＴ６９Ｌ（配列番号１２）との結合部位１の特異的相互作用のマッピングを示す図である。 ソルチリンの２つの結合部位における密度の概観を示す図である。神経成長因子のプロドメインに対する新規な結合部位は部位３である。 ２．６Åで示された部位３におけるＦｏ−Ｆｃ密度を示す図である。スティックとして示されて、アミノ酸型および残基番号で表示された、結合に関与するソルチリンの残基。神経成長因子のプロドメインのペプチドバックボーンが電子密度でオーバーレイされて示されている。 ＮＧＦプロドメインの断片と複合体を形成したｓソルチリンの原子座標を示す図である。このｐｄｂファイルの最初に構築されたソルチリンアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１のＣ８６に対応するＣ９であり、Ｃ８６は本出願の出願日のものとしてＥｘｐａｓｙデータベースエントリーＱ９９５２３に従って番号付けされている。 結合部位１の占有を生じる１：１．５のモル比で提供されたニューロテンシンと複合体を形成したｓソルチリンの高分解能（２Å）における原子座標を示す図である。このｐｄｂファイルの最初に構築されたソルチリンアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１のＧ８７に対応するＧ１０であり、Ｇ８７は本出願の出願日のものとしてＥｘｐａｓｙデータベースエントリーＱ９９５２３に従って番号付けされている。 結合部位１（高親和性部位）および結合部位２（低親和性部位）の両方の占有を生じる１：１５のモル比で提供されたニューロテンシンと複合体を形成したｓソルチリンの原子座標を示す図である。このｐｄｂファイルの最初に構築されたソルチリンアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１のＧ５４に対応するＧ５４であり、Ｇ５４は本出願の出願日のものとしてＥｘｐａｓｙデータベースエントリーＱ９９５２３に従って番号付けされている。 ソルチリン自体のプロペプチドと複合体を形成して結晶化されたｓソルチリンの原子座標を示す図である。プロペプチドはこのモデルにおいて省略されている。このｐｄｂファイルの最初に構築されたソルチリンアミノ酸残基の番号付けは、配列番号１のＤ８３に対応するＤ６であり、Ｄ８３は本出願の出願日のものとしてＥｘｐａｓｙデータベースエントリーＱ９９５２３に従って番号付けされている。 プロペプチド全体を網羅するように合成されたＮＧＦプロペプチドの６つのイコサペプチドの概要を示す図である。 固定化ｓソルチリンに対するＮＧＦｐｒｏペプチドおよびイコサペプチドの結合親和性の表面プラズモン共鳴分析を示す図である。 表面表現として示されたｓソルチリン−ペプチド４複合体の概観を示す図である。Ｖｓｐ１０ｐ−Ｄの表面は薄い灰色であり、１０ＣＣドメインは灰色であり、ＮＧＦｐｒｏ由来のペプチド４は黒色であり、グリコシル化は、原子型によって彩色された「ボール・アンド・スティック」表示を用いて示される。 ＮＧＦプロドメインの結合（部位３）を示す図である。Ａ）ＮＧＦｐｒｏ由来のペプチド−４は、原子型によって彩色された「ボール・アンド・スティック」モデルとして示されている。ペプチドなしに計算され、かつ２．６σで等高線を示されたＦｏ−Ｆｃ電子密度マップがペプチドに重ねられている。ｓソルチリンは表面表現を用いて示されている。Ｂ）結合したペプチド４は、ヘキサアラニン断片としてモデル化され、ｓソルチリンの相互作用残基と共に「ボール・アンド・スティック」モデルとして示されている。 ＮＧＦプロドメイン（部位１／ＮＴＳ部位）の結合を示す図である。Ａ）ＮＧＦｐｒｏ由来のペプチド−４は、原子型によって彩色された「ボール・アンド・スティック」モデルとして示されている。示された電子密度マップは、図２４に示されているように計算されており、ペプチドに重ねられている。ｓソルチリンは表面表現を用いて示されている。Ｂ）結合したペプチド４は、テトラアラニン断片としてモデル化され、ｓソルチリンの相互作用残基と共に表示されている。 ＧＳＴ Ｃ末端タグ付きＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（ＹＩＬ）とのペプチドの競合を示す図である。固定化ｓソルチリンへの結合については、表面プラズモン共鳴によって測定した。１００％は、競合するペプチドの非存在下で１００ｎＭのＧＳＴ−ＹＩＬについて得られる測定された応答単位に対応する。ＥＣ５０値は、ＧＳＴ−ＹＩＬ結合が５０％まで低下するペプチドの濃度である。配列は、ペプチド、および非天然アミノ酸を含むペプチドについて示されており、構造もまた示されている。

配列の概要
配列番号１：ソルチリン
配列番号２：ＳｏｒＬＡ
配列番号３：ＳｏｒＣＳ１
配列番号４：ＳｏｒＣＳ２
配列番号５：ＳｏｒＣＳ３
配列番号６：ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＮＧＦ
配列番号７：ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＢＤＮＦ
配列番号８：ニューロトロフィン−３
配列番号９：ニューロトロフィン−４／５
配列番号１０：ニューロテンシン（１〜１３）
配列番号１１：ＰＹＩＬ（ニューロテンシンのＣ末端）

例
例１：ソルチリンの発現および精製
Ｃ末端にＨｉｓ６を融合した、ソルチリンの膜貫通セグメントまたは細胞質側末端ではない管腔ドメイン全体（アミノ酸１〜７５８）を含む可溶性ソルチリン（ｓソルチリン）を、以前に記載されているように（５）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞で安定的に発現させた。ＣＨＯ−トランスフェクタントを、５００ｃｍ^３のＮｕｎｃｌｏｎ（商標）ＴｒｉｐｌｅＦｌａｓｋ内の血清を含まないＨｙＱ−ＣＣＭ５ ＣＨＯ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）中で培養した。セレノ−メチオニン（ＳｅＭｅｔ）の取り込みは、ほんの少しだけ改変して、以前に記載された手順に従った（２２）。天然タンパク質およびＳｅＭｅｔ置換タンパク質の両方を、以前に記載されているように（１）、ＲＡＰアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ｓ３１６ＥおよびＲ３２５Ａソルチリン突然変異体を、ＣＨＯ細胞で安定的に発現させ、その後、フューリンプロペプチド切断部位において突然変異したソルチリンについて以前に記載されている（５）のと同じ方法でＨｉｓ_６−タグアフィニティークロマトグラフィーによって培地から精製した。ニューロテンシンは、Ｓｉｇｍａから購入し、残基３７〜６１のソルチリンプロペプチド断片および様々なニューロテンシン断片をＢＩＯＭＯＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌ．Ｐ．（ＵＫ）から購入した。全てのペプチドは、９５％より高い純度であった。発現および精製は、ＧＳＴ（５）およびＮＧＦプロドメイン（６）に融合したソルチリンプロペプチドについて以前に記載されている。成熟ＢＤＮＦ（配列番号７、アミノ酸残基１２８〜２４６）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から購入した。

例２：表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を、２０℃に維持されＣＭ５センサーチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ ２０００計器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｗｅｄｅｎ）において実施した。センサー表面の上を通過するＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）の連続流を５μｌ／分に維持した。センサーチップフローセル１〜３のカルボキシル化デキストランマトリックスを、水中に０．２ＭのＮ−エチル−Ｎ−（３ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドおよび０．０５ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを含む溶液の注入によって活性化させた。その後、ソルチリン溶液（３２０μｌ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム ｐＨ４．０中に５μｇ／ｍｌ）を、１５μｌ／分の流速でフローセル１および２に注入した。全ての３つのフローセルにおける残りの結合部位を、７０μｌの１Ｍ エタノールアミン ｐＨ８．５の注入（５μｌ／分）によってブロックした。固定化ソルチリンからの表面プラズモン共鳴シグナルは、４９ｆｍｏｌ／ｍｍ２および６９ｆｍｏｌ／ｍｍ２に相当する４４１９および６１６６ＢＩＡｃｏｒｅ応答単位（ＲＵ）を生じた。０．１〜８μＭの濃度の５０μｌのアリコートを５μｌ／分の流速で全フローセルを通して注入することにより試料のスクリーニングを行った。特に指定のない限り、試料を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０に溶解した。試料緩衝液をまた、ランニング緩衝液として用いた。ＢＩＡｃｏｒｅ応答は、相対的応答単位（ＲＵ）、すなわち、固定化タンパク質フローセルと対応する対照フローセル（活性化かつブロックされているが、タンパク質を含まない）との応答の差で表されている。分析の各サイクル後のセンサーチップの再生を、１０ｍＭのグリシン／ＨＣｌ ｐＨ４．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、および０．００５％の界面活性剤Ｐ２０の２０μｌを注入することによって行った。カルシウムを含まない条件について、２０ｍＭのＥＤＴＡを含むＨＢＳを、ランニング緩衝液としてだけでなく、試料としても用いた。速度パラメーターをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．０ソフトウェアを用いることによって決定した。突然変異体および野生型のｓソルチリンについて測定された応答の比較について、それらを、同じＢＩＡｃｏｒｅチップ上の異なるフローセル中に固定し、同じような濃度の（ＧＳＴ）Ｓｏｒｔ−ｐｒｏ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ−ｐｒｏ、およびＮＴに曝した。

阻害効果の測定
トリペプチドＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ（ＹＩＬ）による（ＧＳＴ）Ｓｏｒｔ−ｐｒｏ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ−ｐｒｏ、およびＮＴ結合の阻害を、個々の試料へ増加性濃度のＹＩＬを添加することによって測定した。その後、阻害効果の測定は、９０％減少した結合が観察される場合のＹＩＬの濃度として示される。

例３：蛍光測定
全ての固有蛍光測定を、ＳＦＭ−２５、Ｋｏｎｔｒｏｎ計器で２０℃で１ｎｍ単位で増加する２８０ｎｍから５００ｎｍまでの測定を用いて行った。全て５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液中の０．５５μＭのｓソルチリン、５μＭのＮＴ、および５μＭのＮＴとの０．５５μＭのｓソルチリンについて、データを収集した。ＮＴとのｓソルチリンについては、０．１Ｍのストック溶液からのＮＴを０．５５μＭのｓソルチリン溶液へ添加することによって調製し、希釈は無視できた。

例４：代謝標識
代謝標識を、以前に詳細に記載されているように（５）、培地１ｍｌあたり２００ｍＣｉのＬ−［^３５Ｓ］システインおよびＬ−［^３５Ｓ］メチオニンを用いて、１０ｍｇ／ｍｌのＢＦＡの存在下で行った。ＢＦＡの非存在下で追跡を行い、所定の時点で受容体を、培地から、および対応する溶解細胞から免疫沈殿させた。沈殿したタンパク質を還元ＰＡＧＥによって分析し、ジフェニルオキサゾール−フルオログラフィー化ゲルを−７０℃で露光した。

例５：結晶化、凍結保護、およびＨＡ誘導体化
精製されたタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液へ透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）またはＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｌｔｄ．）濃縮装置を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定される場合の４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬへ濃縮した。結晶化実験を始める数分前に、ニューロテンシン（ｓソルチリン：ＮＴ比１：１．５または１：１５）またはプロペプチド（ｓソルチリン：プロペプチド比１：４）との混合を行った。結晶化滴下を２０℃で、２μＬのタンパク質溶液、ならびにマロン酸によってｐＨ６〜７．５に調整された、１８〜２１％ｗ／ｖのＰＥＧ６０００、Ｔｒｉｓ−Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．２〜７．８（４０〜９３ｍＭのＴｒｉｓおよび１００ｍＭのＨｅｐｅｓ）または１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９、３〜６％のグリセロール、および６００ｍＭのＮａＣｌかまたは２５０〜４００ｍＭのＣ_３Ｈ_２Ｎａ_２Ｏ_４（マロン酸ナトリウム）かのいずれかを含む２μＬのリザーバ溶液を用いて設定した。３．２Åへ回折するセレノ−メチオニン（Ｓｅ−Ｍｅｔ）標識ｓソルチリン：ＮＴ結晶が同じ条件で得られた。データ収集のための結晶を脱水し、リザーバのグリセロール濃度を１２〜１５％へ増加させることによって凍結保護した。一晩の平衡化後、結晶を液体窒素中で急速冷凍した。結晶は通常には約３．３〜３．０Åへ回折するが、若干の過剰のＮＴと、リザーバ塩としてのＮａＣｌで成長した結晶として、本発明者らは、珍しくも、かなり良く（約２．５〜２．０Å）回折し、かつ単位格子パラメーターの変化を示す結晶を得た（表１）。Ｈｇ誘導体およびＰｔ誘導体の調製について、サリチル酸水銀およびシス−Ｐｔ（ＮＨ_３）_２Ｃｌ_２の粉末を、結晶が形成されている滴へ直接加えた。Ｈｇ誘導体についての浸漬時間は１ヶ月で、Ｐｔ誘導体については１日であった。Ｔａ誘導体を、水中に溶解した１μＬの１ｍＭ Ｔａ６Ｂｒ１２を脱水化結晶の滴へ、２日間の浸漬時間、加えることによって調製し、その後、それは目に見えて緑色に変わった。誘導体化結晶のいずれも再浸漬しなかった。

例６：データ収集および処理
シンクロトロンＭＡＸ−ｌａｂ（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＳＬＳ（Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＤＥＳＹ／ＥＭＢＬ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でデータ収集を行い、ＸＤＳを用いて処理した（２３）（表１参照）。Ｈｇ誘導体、Ｐｔ誘導体、およびＴａ誘導体に関するデータを、個々の要素の吸収端近くで収集し、ＳｅＭｅｔ標識結晶についてのデータセットを、蛍光スキャンによって決定される場合のＳｅピーク波長（０．９７８５３Å）で直接収集した。ニューロテンシン（ｓＳｏｒｔ：ＮＴ）と複合体を形成したｓソルチリン結晶についてのデータセットを、大過剰のＮＴを用いて決定し、回折異方性サーバーを用いて異方性効果について補正した（２４）。

例７：位相決定およびモデル構築
本発明者らは、ＳｈｅｌｘＤ（２５）を用いてｓソルチリンに存在する１４個のメチオニンのうち１３個のＳｅ部位を見出した。ＣＮＳ（２６）を用いて計算されたＳｅＭｅｔ ＳＡＤ位相を、Ｐｔ誘導体、Ｈｇ誘導体、およびＴａ誘導体における重原子部位を同定するために用いた。本発明者らは、ＳＨＡＲＰ（２７）におけるＭＩＲＡＳ位相決定についての入力としてニューロテンシン類似体と複合体を形成したｓソルチリンの同形２．８Åネイティブデータセットと共に全ての４つの誘導体を用いた。部分的ＣαトレースをＲＥＳＯＬＶＥ（２８）で作成し、それをＯ（２９）における手作業での再構築によって拡張および補正した。その後、この部分的モデルを、わずかな過剰のＮＴで成長したｓソルチリン：ＮＴ結晶に関して収集された２．０ÅネイティブデータセットへのＭＯＬＲＥＰ（３０）を用いる分子置換に用いた。完全モデルを、ＣＮＳにおける精密化のサイクルおよびＯにおける手作業での再構築によって作成した。大過剰のＮＴで成長したｓＳｏｒｔ：ＮＴ結晶に関して収集されたデータの位相決定およびｓＳｏｒｔ：プロペプチド断片に関して収集されたデータの位相決定を、ＭＯＬＲＥＰの入力として２．０Å構造（ＮＴを含まない）についての未完成モデルを用いる分子置換によって行った。その後、Ｏにおけるモデル構築の引き続きのサイクルおよびＣＮＳを用いる精密化によってモデルを完成した。最後の精密化について、本発明者らは、２．０Å ｓＳｏｒｔ：ＮＴ構造についてのＴＬＳ Ｂ因子補正を用いるＲＥＦＭＡＣ（３１）、２．６Å ｓＳｏｒｔ：ＮＴ構造についてのＴＬＳ Ｂ因子補正を用いるＰＨＥＮＩＸ（３２）精密、３．２Å ｓＳｏｒｔ：プロペプチド構造についてのＣＮＳを利用した（表２）。

例８：プロニューロトロフィン結合部位（結合部位３）の同定
ｓソルチリン精製
Ｃ末端にＨｉｓ_６を融合した、配列番号１（アミノ酸７８〜７５５）を含む可溶性ソルチリン（ｓソルチリン）を、以前に記載されているように（５）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に安定的に発現させた。ＣＨＯトランスフェクタントを、５００ｃｍ^３のＮｕｎｃｌｏｎ（商標）ＴｒｉｐｌｅＦｌａｓｋ内の血清を含まないＨｙＱ−ＣＣＭ５ ＣＨＯ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）中で培養した。ｓソルチリンを、以前に記載されているように（１）、ＣＮＢｒ活性化セファロースビーズ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）上に固定化された受容体関連タンパク質を有するアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

ＮＧＦｐｒｏ精製
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ ＲＩＰＬ細胞を、Ｎ末端ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ_６）、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶ）部位、および神経成長因子のプロペプチド（ＮＧＦｐｒｏ）のオープンリーディングフレームを含むｐＥＴ−３０ Ｅｋ／ＬＩＣベクターで形質転換した。細胞を、１ｍＭのＩＰＴＧでの誘導の前に一晩（Ｏ／Ｎ）２０℃で０．８のＯＤ_{６００ｎｍ}まで増殖した。細胞を、溶解緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝８．０、１ＭのＫＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのＢＭＥ、５ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、および１つのプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ）中に再懸濁した。細胞を高圧ホモゲナイザー（ＨＰＨ）で破壊し、溶解物を、１８４．０００ｘｇでの遠心分離によって透明化した。Ｎｉ^２＋−カラム（ＨｉｓＴｒａｐ １ｍｌ ＦＦ、ＧＥ）を緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝８．０、２００ｍＭのＫＣｌ、および５ｍＭのＢＭＥ）で平衡化した。透明化可溶化物を添加し、ＮＧＦｐｒｏを、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝８．０、２００ｍＭのＫＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール、および５ｍＭのＢＭＥ）を含む４０カラム容量（ＣＶ）イミダゾール（１０ｍＭ〜５００ｍＭ）勾配で溶出した。最初のＮｉ^２＋カラムからのＮＧＦｐｒｏを含む画分をプールし、緩衝液を、ＴＥＶ適合性緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝８．０、２００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＢＭＥ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）に交換した。ＴＥＶ消化をＲＴ Ｏ／Ｎで行った。Ｈｉｓ_６タグを、４０カラム容量（ＣＶ）イミダゾール（０ｍＭ〜２５０ｍＭ）勾配を有するＮｉ^２＋カラム（ＨｉｓＴｒａｐ １ｍｌ ＦＦ、ＧＥ）上で除去した。第２のＮｉ^２＋カラムからのＮＧＦｐｒｏを、１０ｋＤａカットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ ６カラムを用いて濃縮した。調製用ゲル濾過を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ）で緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．６および１５０ｍＭのＮａＣｌ）中０．４ｍｌ／分の流速で行った。

ＮＧＦプロペプチドのペプチドの調製
図２１に示されているように、神経成長因子のプロペプチドのイコサペプチド（２０個のアミノ酸）を、Ｃａｓｌｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｓ（ｗｗｗ．ｃａｓｌｏ．ｃｏｍ）で固相化学法によって合成した。ペプチドをＣ末端でアミド化し、３個のアミノ酸重複を有する全ＮＧＦｐｒｏを網羅した。ペプチド（純度＞９５％）を緩衝液Ｅ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．０および５０ｍＭのＮａＣｌ）中に溶解した。

表面プラズモン共鳴分析
全ての測定を、２０℃に維持されたＢＩＡｃｏｒｅ ３０００計器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｗｅｄｅｎ）において実施した。緩衝液Ｆ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ＝７．４、１５０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１．５ｍＭのＣａＣｌ_２、１．５ｍＭのＥＧＴＡ、および０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０）の連続流を５μｌ／分でＣＭ５チップセンサー表面の上を通過させた。固定化ｓソルチリンに対するＮＧＦｐｒｏとペプチドの親和性を決定した。ＮＧＦｐｒｏの解離定数（Ｋ_ｄ）は約１０ｎＭであり、ペプチド−４については約５μＭであった。ｓソルチリンへの結合についてＮＧＦｐｒｏと競合するペプチドの能力も試験した。結果は図２２に示されている。

リガンドとのｓソルチリンの結晶化
精製したｓソルチリンを緩衝液Ｇ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０および１５０ｍＭのＮａＣｌ）へ透析し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｌｔｄ．）濃縮装置においてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定される場合の４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬへ濃縮した。ｓソルチリンおよびＮＧＦｐｒｏを１：２のモル比で混合し、氷上で１時間インキュベートした。その複合体を、シッティングドロップ法を用いる蒸気拡散実験で結晶化した。結晶化滴下を、１μＬの複合体溶液、ならびに２０〜２８％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０００モノメチルエーテル、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５、および２００ｍＭのＬｉ_２ＳＯ_４を含む１μＬのリザーバ溶液を用いて２０℃で開始した。ｓソルチリンおよびペプチド−４を、１：５から１：２８までの範囲の様々なモル比で混合し、氷上で１時間、インキュベートした。その複合体を、シッティングドロップ法を用いる蒸気拡散実験で結晶化した。結晶化滴下を、１μＬの複合体溶液、ならびに２０〜２８％のＰＥＧ ６０００、１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ＝７．５、および２００〜６００ｍＭのＬｉ_２ＳＯ_４を含む１μＬのリザーバ溶液を用いて２０℃で開始した。液体窒素中で急速冷凍する前に、リザーバにスクロースまたはグリセロールを加える（２０％ｖ／ｖまで）ことによる結晶の脱水を行った。

データ収集および処理
ｓソルチリン：ＮＧＦｐｒｏ複合体のＸ線回折データをＥＳＲＦ Ｇｒｅｎｏｂｌｅ（Ｆｒａｎｃｅ）のステーションＩＤ２９で収集し、ｓソルチリン：ペプチド−４複合体結晶の回折データをＭａｘ−ｌａｂ Ｌｕｎｄ（Ｓｗｅｄｅｎ）のステーションＩ９１１〜３のシンクロトロン放射を用いて凍結状態で収集した。ＸＤＳ（２３）を用いてデータにインデックスを付け、処理した。ＮＧＦｐｒｏまたはペプチド−４と複合体を形成したｓソルチリンの結晶は、非対称ユニットにおいて１つのｓソルチリン分子を有する正方晶空間群Ｐ４_１２_１２に属する同形であった（表３）。構造を、Ｐｈａｓｅｒ（３６）を用いる分子置換によて決定した。全てのリガンドを除去されたｓソルチリンおよびニューロテンシンの構造を位相決定の初期モデルとして用いた。Ｐｈｅｎｉｘ（３２）において、生じたモデルをシミュレーテッドアニーリングにかけ、モデル偏りおよび精密化を低減した。差フーリエマップＦ_ｏｂｓ−Ｆ_ｃａｌｃを用いて、ＮＧＦｐｒｏの結合した部分ならびにｓソルチリンのループおよびグリコシル化の立体構造的変化を位置づけた。

例９：結合およびインシリコのスクリーニング
Ｍａｅｓｔｒｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０ ｗｉｔｈ Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｓａｍｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｏｐｔｉｍｉｚｅ Ｈ−ｂｏｎｄｓを用いて、０．３Å内の最小構造を有する１つのグリッドとソルチリン−リガンド複合体のそれぞれの有効な精密構造を最小化していない１つのグリッドの２つのグリッドを計算した。Ｓｅｒ３５２の−ＯＨの水素およびＩｌｅ３５３のＮＨの水素を可能性のある拘束として特定化した。バウンディングボックスを、標準値次元を有する残基３２５、２６０、および３５２の重心として定義した。Ｍａｅｓｔｒｏにおいて、リガンドを、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕから１つの残基が置換されているトリペプチドとして構築し、６０個の天然ペプチドを生じた。Ｍａｃｒｏ−ＭｏｄｅｌにおいてＯＰＬＳ＿２００５力場および１００００に設定された最大反復でリガンドをエネルギー最小化した。ＸＰスコアリング機能を用いて作成された全てのグリッドへ結合を実行した。リガンド由来の水素結合が、前に特定化された２つの水素のうちの１つに形成されなければならないように拘束を適用した。結合ポーズの合成およびＧスコアと手作業での洞察の両方に基づいた生化学的特徴づけについてペプチドを選択した。さらに、合成について選択されたものと非常に類似した、一貫して弱いスコアリング／結合リガンドもまた陰性対照として合成した。

結合に用いられた構造からの結合グリッドの作成
Ｗｏｒｋｆｌｏｗｓメニューへ行き、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄを選ぶ。構造をインポートし、その後、Ｆｉｘ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅにおけるデフォルト設定を残すか、または結合部位に構造的水を有しない場合にはＤｅｌｅｔｅ Ｗａｔｅｒｓを０．１Ａへ変化させ、Ｓｅｔｕｐを押す。ワークスペースにおいていずれの構造的水も除去されなかったことをチェックする。いかなる非構造的水も手作業で除去する。次に、Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｓａｍｐｌｉｎｇのためのラジオボタンをオンにし、Ｏｐｔｉｍｉｚｅ Ｈ−ｂｏｎｄｓをクリックする。結合ポケットにリガンドを有しない場合には、Ｍｉｎｉｍｉｚｅ…ボタンを無視する。結合ポケットにリガンドを有する場合には、２つのグリッドを作成するべきであり、１つはデフォルト設定でＭｉｎｉｍｉｚｅ…を実行する場合のグリッドであり、１つは最小化しないかまたは水素のみを最小化する場合のグリッドである。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓメニューへ行き、Ｇｌｉｄｅ、それからＲｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｒｉｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを選ぶ。結合ポケットにリガンドがある場合には、それはグリッド作成から排除されなければならず、これは、Ｒｅｃｅｐｔｏｒタブをアクティブにしながらワークスペースにおいてそれをクリックすることによって行われる。それがまだ黄色でないならば、「Ｐｉｃｋ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｌｉｇａｎｄ」をクリックする。リガンドセットをバウンディングボックスに選択し、結合したいリガンドが最初のものよりはるかに大きい場合には、今、グリッドを作成することができ、その後、タブＳｉｔｅへ行くべきであり、「Ｄｏｃｋ ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ｌｅｎｇｔｈ ＜＝」をクリックして、スライダーを調整する。最初の構造にリガンドがない場合には、「Ｃｅｎｔｒｏｉｄ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ」をクリックするべきであり、ワークスペースにおいて、結合部位付近の残基をクリックする。Ａｒｇ２４８（／３２５／２９２）部位にペプチドを有するソルチリンを実行している場合には、Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓタブへ行き、Ｓｅｒ２７５（／３５２／３１９）のヒドロキシルの水素およびＩｌｅ２７６（／３５３／３２０）の極性水素を選択する。それからＳｔａｒｔをクリックする。

リガンドの作成およびエネルギー最小化
Ｂｕｉｌｄ Ｐａｎｅｌボタンをクリックして構築パネルを開く。プロジェクト表における全エントリーを非選択状態にする。空白のワークスペースにおいて、構築パネルを用いてリガンドを構築する。正しい電荷を有するかを確認し（しかし、ＬｉｇＰｒｅｐは、正しい電荷を割当て、互変異性体についての追加のリガンドおよび複数の電荷状態を作成し、加えて、エネルギーを最小化する）、Ａｄｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｎｓをダブルクリックする。Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｅｎｔｒｙ Ｆｒｏｍ Ｗｏｒｋｓｐａｃｅボタンを押し、リガンドに名前を付ける。次のリガンドが最初のものと類似している場合には、プロジェクト表へ行き、それの複製を作成し、新たに名前を付ける。最初のリガンドを構築したように、新しいエントリーを編集する。それが非常に類似している場合には、単に、プロジェクト表における全てを非選択状態にし、最初に行った通りに行う。リガンドのＳＭＩＬＥＳを有する場合には、ＯｐｅｎＢａｂｅｌを用いてｍｏｌ２フォーマットへそれらを変換し、それらをプロジェクト表へインポートすることはより速い。．ｐｄｂｓは、結合次数を認識するためにＭａｅｓｔｒｏについて特定化された水素を有しなければならず、．ｓｄｆｓはキラリティー情報を含まない。

エネルギー最小化について２つの選択肢：ＬｉｇＰｒｅｐまたはＭａｃｒｏＭｏｄｅｌがある。
ａ）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓメニューへ行き、ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ、それから、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎを選ぶ。
プロジェクト表から全てのリガンドを選択し、ドロップダウンメニューをＰｒｏｊｅｃｔ Ｔａｂｌｅ（選択されたエントリー）に設定する。Ｐｏｔｅｎｔｉａｌタブにおいて、Ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ： ＯＰＬＳ＿２００５（それはデフォルトであるはずである）を選ぶ。Ｍｉｎｉ下でＭｅｔｈｏｄ：ＰＲＣＧ（デフォルト）およびＭａｘｉｍｕｍ ｉｔｅｒａｔｉｏｎｓ：１００００を選ぶ。リガンドをファイルへ保存しており、それらをそこから直接用いたい場合には、Ｍｕｌｔタブでそのファイルを特定し、スタートする。
ｂ）Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓメニューへ行き、ＬｉｇＰｒｅｐを選ぶ。
プロジェクト表から全てのリガンドを選択し、または全てのリガンドを有するファイルを選び、ドロップダウンメニューをそれに応じて設定する。標的ｐＨを７．４＋／−２未満に設定したい可能性がある。キラリティーを保持し、スタートする。最小化後、リガンドを忘れずに調べて、それらが正しいかどうかを、特に、キラル中心が、最初のリガンドで明らかには定義されなかった場合には両方の鏡像異性体に存在するかどうかを確認する。ＬｉｇＰｒｅｐはＭａｃｒｏＭｏｄｅｌより好ましく、これは、それが自動的にヒスチジンの全状態を作成するからである。

結合
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓメニューへ行き、Ｇｌｉｄｅ、それからＬｉｇａｎｄ Ｄｏｃｋｉｎｇを選ぶ。Ｒｅｃｅｐｔｏｒグリッドファイルを選択する。ＰｒｅｃｉｓｉｏｎをＸＰに設定する。柔軟に結合させ、環反転を可能にする。詳細な設定において、コンジュゲート段階のＭａｘｉｍｕｍ数を５０００に設定する。Ｌｉｇａｎｄｓタブへ行き、エネルギー最小化段階に作成したファイルを選び、または単に、プロジェクト表においてそれらを選び、Ｓｅｌｅｃｔｅｄエントリーをオンに設定する。Ｏｕｔｐｕｔタブにおいて、Ｗｒｉｔｅ ｏｕｔをリガンドあたり多くても５ポーズに設定する。非常に多数のリガンドを有する場合には、結合実行あたりのリガンドを調整する。Ａｒｇ２４８（／３２５／２９２）部位にペプチドを有するソルチリンを実行している場合には、Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｓタブへ行き、Ｇｒｏｕｐ １において、２つのｈ結合拘束を加え、Ｍｕｓｔ ｍａｔｃｈ：Ａｔ ｌｅａｓｔ：１を設定する。その２つのうちの１つへの水素結合を含むポーズのみが含まれるであろう。Ｍａｅｓｔｒｏが、天然では見られず、かつ構造において観察されたことがない多くの渦巻いたペプチドを報告するためにこれが追加された−これが観察されていなかったならば、正しいアプローチは拘束なしに結合させていたであろう。

段階１および３が全ての有効な構造について繰り返される。段階２からの最小化リガンドは再使用される。

結果の評価
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓメニューへ行き、Ｇｌｉｄｅ、それからＰｏｓｅｖｉｅｗｅｒを選ぶ。手作業で、最高スコアリングリガンドの結合を比較し、他の構造において同じリガンドを比較し、合理的に思われるもの、加えて、陰性対照に対してスコアリング／結合が弱い非常に関連した化合物を合成する。

例１０：阻害剤の検証のための方法
有機化学の当業者によく知られた方法によって実施された、同定されたリガンドの合成に引き続いて、リガンド候補がアンタゴニスト性を有するかどうか、すなわち、前記リガンドがソルチリンの結合部位１、２、３のいずれかへの内因性リガンドの結合を防ぐ能力があるかどうかを検証することは重要である。提案されたリガンドを、例２に記載されているように、固定化ｓソルチリン上での表面プラズモン共鳴測定によって阻害効果を試験する。提案されたリガンドを放射標識し、スライスオートラジオグラフィーに用いる。発現した画像を、放射標識されたソルチリンモノクローナル抗体を用いるスライスオートラジオグラフィーと比較する。モノクローナル抗体と共存するリガンドを、ソルチリンノックアウトマウスのスライスを用いるスライスオートラジオグラフィーにおいて再び試験する。ソルチリンを十分に画像化するリガンドをマウスに注射し、脳ホモジネートを、放射活性について試験し、または非標識リガンドをＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴのいずれかに適した放射性同位元素で標識し、マウスもしくはブタに注射し、それらの脳をインビボで画像化する。内因性安定性実験を脳ホモジネートについて実施する。非血液脳関門透過性化合物は、非ＣＮＳ画像化に適しており、ソルチリンおよびＢＢＢ透過性化合物におけるこの結合部位の阻害は、ソルチリンのインビボレベルおよび分布を調べる脳スキャンに適している。

参考文献
1. C. M. Petersen et al., J Biol Chem 272, 3599 (1997).
2. L. Jacobsen et al., J Biol Chem 271, 31379 (1996).
3. W. Hampe, M. Rezgaoui, I. Hermans-Borgmeyer, H. C. Schaller,
Hum Genet 108, 529 (2001).
4. J. Mazella et al., J Biol Chem 273, 26273 (1998).
5. C. Munck Petersen et al., Embo J 18, 595 (1999).
6. A. Nykjaer et al., Nature 427, 843 (2004).
7. H. K. Teng et al., J Neurosci 25, 5455 (2005).
8. U. B. Westergaard et al., J Biol Chem 279, 50221 (2004).
9. S. Maeda et al., J Cell Physiol 193, 73 (2002).
10. M. S. Nielsen, C. Jacobsen, G. Olivecrona, J. Gliemann, C. M. Petersen,
J Biol Chem 274, 8832 (1999).
11. M. S. Nielsen et al., Embo J 20, 2180 (2001).
12. K. Nakamura, K. Namekata, C. Harada, T. Harada,
Cell Death Differ 14, 1552 (2007).
13. P. Jansen et al., Nat Neurosci 10, 1449 (2007).
14. P. Chalon et al., FEBS Lett 386, 91 (1996).
15. L. Jacobsen et al., J Biol Chem 276, 22788 (2001).
16. K. Tanaka, M. Masu, S. Nakanishi, Neuron 4, 847 (1990).
17. J. P. Vincent, J. Mazella, P. Kitabgi, Trends Pharmacol Sci 20, 302 (1999).
18. X. L. He, K. C. Garcia, Science 304, 870 (2004).
19. O. M. Andersen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13461 (2005).
20. S. M. Clee et al., Nat Genet 38, 688 (2006).
21. E. Rogaeva et al., Nat Genet 39, 168 (2007).
22. J. W. Lustbader et al., Endocrinology 136, 640 (Feb, 1995).
23 W. Kabsch, in International Tables for Crystallography
E. Arnold, Ed. (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2001).
24. M. Strong et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8060 (May 23, 2006).
25 T. R. Schneider, G. M. Sheldrick,
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 1772 (Oct, 2002).
26 A. T. Brunger et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54, 905 (Sep 1, 1998).
27 G. Bricogne, C. Vonrhein, C. Flensburg, M. Schiltz, W. Paciorek,
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59, 2023 (Nov, 2003).
28 T. C. Terwilliger, Acta Crystallogr. D 59, 38 (2003).
29 T. A. Jones, J. Y. Zou, S. W. Cowan, M. Kjeldgaard,
Acta Crystallogr A 47 ( Pt 2), 110 (Mar 1, 1991).
30. A. Vagin, A. Teplyakov,
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56, 1622 (Dec, 2000).
31 G. N. Murshudov, A. A. Vagin, E. J. Dodson,
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240 (May 1, 1997).
32. P. D. Adams et al.,
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 1948 (Nov, 2002).
33. W. L. DeLano, The PyMOL Molecular Graphics System
(DeLanoScientific, Palo Alto, CA, USA., 2002), pp.
34. M. Clamp, J. Cuff, S. M. Searle, G. J. Barton,
Bioinformatics 20, 426 (Feb 12, 2004).
35. W. Kabsch, C. Sander,
Biopolymers 22, 2577 (Dec, 1983).
35 A. C. Wallace, R. A. Laskowski, J. M. Thornton, Protein Eng 8, 127 (Feb, 1995).
36. A. J. McCoy, R. W. Grosse-Kunstleve, P. D. Adams, M. D. Winn, L. C. Storoni and R. J. Read
J. Appl. Cryst. (2007). 40, 658-674

Claims (152)

1. ａ）配列番号１のポリペプチド；および／または
   ｂ）前記ポリペプチドの配列変異体であって、前記配列番号１に対して少なくとも６０％の配列相同性を有する変異体；および／または
   ｃ）ａ）〜ｂ）のいずれかの少なくとも２００個の連続したアミノ酸を含む断片であって、ソルチリン活性を示す断片；および
   ｄ）任意で、少なくとも１つのリガンドと複合体を形成したａ）〜ｃ）のいずれか
   を含む結晶。
2. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、Ｔ３９８〜Ｇ４００、Ｉ３０３〜Ｇ３０９、Ｑ３４９〜Ａ３５６、Ｙ３９５、およびＴ４０２を含む結合部位１に結合している、請求項１に記載の結晶。
3. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、およびＴ３９８〜Ｇ４００を含む結合部位１に結合している、請求項１に記載の結晶。
4. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、およびＦ３５０〜Ｍ３６３を含む結合部位１に結合している、請求項１に記載の結晶。
5. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、Ｗ５９７、Ｔ１６８〜Ｉ１７４、Ｌ５７２、Ａ５７３、およびＳ５８４〜Ｆ５８８を含む結合部位２に結合している、請求項１に記載の結晶。
6. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、およびＷ５９７を含む結合部位２に結合している、請求項１に記載の結晶。
7. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ５７２、Ｌ１１４、およびＶ１１２を含む結合部位２に結合している、請求項１に記載の結晶。
8. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｓ４２０、Ｄ４２２、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｅ４２６、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｅ４７０、Ｉ４９８、Ｓ４９９、およびＶ５００を含む結合部位３に結合している、請求項１に記載の結晶。
9. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含む結合部位３に結合している、請求項１に記載の結晶。
10. 少なくとも１つのリガンドが、配列番号１のアミノ酸残基Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｉ４９８、およびＶ５００を含む結合部位３に結合している、請求項１に記載の結晶。
11. 前記リガンドが結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合している、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の結晶。
12. 前記リガンドが結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合している、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の結晶。
13. 前記リガンドが結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合している、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の結晶。
14. 前記結合部位３がｐｒｏＮＧＦ結合部位である、請求項８〜１３のいずれか一つに記載の結晶。
15. 前記結合部位３がｐｒｏＢＤＮＦ結合部位である、請求項８〜１３のいずれか一つに記載の結晶。
16. 前記結合部位３がｐｒｏＮＴ３結合部位である、請求項１２に記載の結晶。
17. 前記結合部位３がｐｒｏＮＴ４／５結合部位である、請求項１２に記載の結晶。
18. ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸残基７８〜７５５番を含む、請求項１に記載の結晶。
19. 三斜晶系空間群である、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の結晶。
20. 前記三斜晶系空間群がＰ１である、請求項１９に記載の結晶。
21. 単斜晶系空間群である、請求項１〜２０のいずれか一つに記載の結晶。
22. 前記単斜晶系空間群がＣ２である、請求項２１に記載の結晶。
23. 斜方晶系空間群である、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の結晶。
24. 斜方晶系空間群がＰ２_１２_１２_１である、請求項２３に記載の結晶。
25. ポリペプチド変異体が配列番号１のアミノ酸残基７８〜７５５（ｓソルチリン）またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１に記載の結晶。
26. １つまたは複数のメチオニンがＳｅ−メチオニンに置き換えられている、請求項１に記載の結晶。
27. 配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）、および配列番号１２（ＮＴ６９Ｌ）、またはそれらの断片もしくは変異体からなる群から選択されるポリペプチドリガンドを含む、請求項１〜２６のいずれか一つに記載の結晶。
28. 請求項１に記載の結晶を成長させる方法であって、
    ａ．緩衝液に４．５〜５．５ｍｇ／ｍＬの配列番号１のポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む組成物を得る段階
    ｂ．前記組成物をリガンドと混合する段階、ならびに
    ｃ．所定の容量の前記組成物および結晶化溶液を曝す段階、ならびに
    ｄ．配列番号１またはその断片もしくは変異体を含む結晶を得る段階
    を含む方法。
29. 前記緩衝液が５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９および１５０ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記リガンドが、配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）、および配列番号１２（ＮＴ６９Ｌ）を含む群から選択される、請求項２８に記載の方法。
31. ニューロテンシンリガンドが、前記組成物に１：１．５〜１：１５（ｓソルチリン：ニューロテンシン）のモル比で加えられる、請求項２８〜３０のいずれか一つに記載の方法。
32. ソルチリンプロペプチドリガンドが、前記組成物に１：４（ｓソルチリン：ソルチリンのプロペプチド）のモル比で加えられる、請求項２８〜３０のいずれか一つに記載の方法。
33. 前記結晶化溶液が１８〜２１％ｗ／ｖのＰＥＧ ６０００を含む、請求項２８に記載の方法。
34. 前記結晶化溶液が０〜１５％のグリセロールを含む、請求項２８に記載の方法。
35. 前記結晶化溶液がＴｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２〜７．８（４０〜９３ｍＭのＴｒｉｓおよび１００ｍＭのＨＥＰＥＳ）または１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．９を含む、請求項２８に記載の方法。
36. 前記結晶化溶液が３〜６％のグリセロールを含む、請求項２８に記載の方法。
37. 前記結晶化溶液が、３００〜９００ｍＭのＮａＣｌ、またはマロン酸でｐＨ６〜７．５に調整されている１５０〜４００ｍＭのＣ_３Ｈ_２Ｎａ_２Ｏ_４、または３００〜５００ｍＭのＬｉＳＯ_４、または５００〜７００ｍＭのＫＣｌを含む、請求項２８に記載の方法。
38. 配列番号１のメチオニン残基がセレノ−メチオニンに置き換えられている、請求項２８に記載の方法。
39. ａ．最初の沈殿物を単離する段階と、
    ｂ．懸滴（ハンギングドロップ）から蒸気拡散によってこれらを成長させる段階と
    をさらに含む、請求項２８〜３８のいずれか一つに記載の方法。
40. ソルチリンまたはその断片もしくは変異体の３次元構造の決定のための、請求項１〜２７のいずれか一つに記載の結晶の使用。
41. 結晶が、リガンドと複合体を形成したソルチリンまたはその断片もしくは変異体の３次元構造の決定のための、ソルチリンに結合した前記リガンドをさらに含む、請求項４０に記載の使用。
42. 図１７〜２０のいずれかに示された構造座標の少なくとも一部でコードされるデータ記憶材料を含むコンピュータ可読データ記憶媒体。
43. ａ．結合部位１、もしくは
    ｂ．結合部位２、もしくは
    ｃ．結合部位３、
    またはａ〜ｃの断片もしくは変異体
    の１つまたは複数に結合する能力があるリガンドを同定するための方法における、図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標の使用。
44. 配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する能力があるリガンドを同定する方法であって、
    ａ．図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標を用いてコンピュータスクリーン上で結合部位の空間的構造を作成する段階と、
    ｂ．コンピュータスクリーン上で空間的構造を有する潜在的なリガンドを作成する段階と、
    ｃ．立体障害なしにセットの結合相互作用部位の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合することができるリガンドを選択する段階と
    を含む方法。
45. プロセッサー、データ記憶システム、データ入力装置、およびデータ出力装置を含むプログラムされたコンピュータを用いて、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３またはその断片もしくは変異体に結合する能力があるソルチリンのリガンドを同定するためのコンピュータ支援方法であって、
    ａ．前記ソルチリンの原子のサブセットの原子座標を含むデータを、前記入力装置を通してプログラムされたコンピュータへ入力し、それによって基準データセットを作成する段階であって、前記原子座標が図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から選択され、または原子座標が３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される段階と、
    ｂ．前記プロセッサーを用いて、データ記憶システムに記憶された低分子量有機化学構造およびペプチド断片のコンピュータデータベースと基準データセットを比較する段階と、
    ｃ．前記データベースから、コンピュータ方法を用いて、基準データセットと構造的に相補的である部分を有し、受容体ソルチリンとの立体障害を含まない化学構造を選択する段階と
    を含む方法。
46. リガンドを同定するための方法であって、
    ａ．コンピュータモデリングと連動した原子座標を用いて、コンピュータモデリングによって作成された、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体における１セットの結合相互作用部位へ可能性のあるリガンドを結合し、ソルチリンの前記セットの結合相互作用部位における少なくとも１つのアミノ酸に結合する能力がある可能性のあるリガンドを選択することにより、可能性のあるリガンドを選択する段階であって、前記原子座標が、図１７〜２０のいずれかに提示された原子座標であり、または原子座標が、３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される段階と、
    ｂ．前記可能性のあるリガンドおよび前記受容体ソルチリンを供給する段階と、
    ｃ．可能性のあるリガンドを前記受容体ソルチリンと接触させる段階と、
    ｄ．前記受容体ソルチリンの可能性のあるリガンドによる結合を検出する段階と
    を含む方法。
47. 可能性のあるリガンド分子の結合が、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造の原子座標によって定義された３次元構造を用いることによって、かつ前記可能性のあるリガンドが配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体における少なくとも３つのアミノ酸に結合する能力があるように実行される、請求項４６に記載の方法。
48. ソルチリンの結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体の可能性のあるリガンドを同定する方法であって、
    ａ．３次元構造決定に基づいた、配列番号１（ソルチリン）の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体の立体構造を定義する原子座標から引き出される情報をコンピュータへ導入する段階であって、それにより、コンピュータプログラムが前記立体構造の構造をコンピュータスクリーン上で利用またはディスプレイし、前記原子座標が図１７〜２０のいずれかに提示されている３次元構造から選択され、または原子座標が３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかによって表された３次元構造のいずれか１つから偏位する３次元構造から選択される段階と、
    ｂ．コンピュータスクリーン上で前記コンピュータプログラムによってソルチリンの結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３の３次元表示を作成する段階と、
    ｃ．前記結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３の表示上に可能性のあるリガンドのモデルを重ねる段階と、
    ｄ．結合部位１および／または結合部位２および／または結合部位３との可能性のあるリガンドの結合の可能性および立体障害の非存在を評価する段階と、
    ｅ．前記受容体ソルチリンの結合アッセイにおいて前記可能性のあるリガンド化合物を組み入れる段階と、
    ｆ．配列番号６のアミノ酸残基１９〜２４１（ｐｒｏＮＧＦ）、配列番号６のアミノ酸残基１９〜１２１（ＮＧＦプロドメイン）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜２４６（ｐｒｏＢＤＮＦ）、配列番号７のアミノ酸残基１９〜１２７（ＢＤＮＦプロドメイン）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜２５７（ｐｒｏＮＴ３）、配列番号８のアミノ酸残基１７〜１４０（ＮＴ３プロドメイン）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜２１０（ｐｒｏＮＴ４／５）、配列番号９のアミノ酸残基２５〜８０（ＮＴ４／５プロドメイン）、配列番号１０（ニューロテンシン）、配列番号１１（ＰＹＩＬ）、配列番号１０のアミノ酸残基１１〜１３（ＹＩＬ）、および配列番号１２（ＮＴ６９Ｌ）からなる群から選択される競合するリガンドの結合を前記可能性のあるリガンドが阻害するかどうかを決定する段階、または
    ｇ．前記可能性のあるリガンドが、配列番号１の結合部位１および／もしくは結合部位２および／もしくは結合部位３、またはそれらの断片もしくは変異体への結合によってアゴニスト効果を示すかどうかを決定する段階と
    を含む方法。
49. 以下の結合部位１のアミノ酸残基：配列番号１のＲ３２５、Ｓ３１６、Ｙ３５１、Ｉ３５３、Ｋ２６０、Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｆ３５０〜Ｍ３６３、Ｓ３０５、Ｆ３０６、Ｔ３９８〜Ｇ４００、Ｉ３０３〜Ｇ３０９、Ｑ３４９〜Ａ３５６、Ｙ３９５、およびＴ４０２の少なくとも１つの原子座標から引き出される情報が用いられる、請求項４３〜４８のいずれか一つに記載の方法。
50. 以下の結合部位２のアミノ酸残基：配列番号１のＬ５７２、Ｌ１１４、Ｖ１１２、Ｒ１０９〜Ｓ１１１、Ｓ１１５〜Ｇ１１８、Ｔ５７０、Ｇ５７１、Ｗ５８６、Ｗ５９７、Ｔ１６８〜Ｉ１７４、Ｌ５７２、Ａ５７３、およびＳ５８４〜Ｆ５８８の少なくとも１つの原子座標から引き出される情報が用いられる、請求項４３〜４８のいずれか一つに記載の方法。
51. 以下の結合部位３のアミノ酸残基：配列番号１のＤ４０３、Ｓ４２０、Ｄ４２２、Ｎ４２３、Ｓ４２４、Ｉ４２５、Ｅ４２６、Ｔ４５１、Ｙ４６６、Ｅ４７０、Ｉ４９８、Ｓ４９９、およびＶ５００の少なくとも１つの原子座標から引き出される情報が用いられる、請求項４３〜４８のいずれか一つに記載の方法。
52. データ基準セットまたは結合相互作用セットが、同定された群から選択される少なくとも３つのアミノ酸残基を含む、請求項４８〜５１のいずれか一つに記載の方法。
53. 原子座標が少なくとも５Åの分解能まで決定される、請求項４８〜５１のいずれか一つに記載の方法。
54. 原子座標が少なくとも４Åの分解能まで決定される、請求項４８〜５１のいずれか一つに記載の方法。
55. 原子座標が少なくとも３Åの分解能まで決定される、請求項４８〜５１のいずれか一つに記載の方法。
56. 原子座標が少なくとも２Åの分解能まで決定される、請求項４８〜５１のいずれか一つに記載の方法。
57. 原子座標が少なくとも１．５Åの分解能まで決定される、請求項４８〜５１のいずれか一つに記載の方法。
58. 可能性のあるリガンド分子が、少なくとも配列番号１の高親和性ニューロテンシン結合部位におけるアミノ酸と相互作用する、請求項４２〜５７のいずれか一つに記載の方法。
59. 可能性のあるリガンド分子が、少なくとも配列番号１の低親和性ニューロテンシン結合部位におけるアミノ酸と相互作用する、請求項４２〜５７のいずれか一つに記載の方法。
60. 可能性のあるリガンド分子が、少なくとも配列番号１のソルチリンプロペプチド結合部位におけるアミノ酸と相互作用する、請求項４２〜５７のいずれか一つに記載の方法。
61. 可能性のあるリガンド分子が、少なくとも配列番号１のプロニューロトロフィン結合部位におけるアミノ酸と相互作用する、請求項４２〜５７のいずれか一つに記載の方法。
62. 可能性のあるリガンドが、非加水分解性ペプチドおよびペプチド類似体、有機化合物、および無機化合物からなる群から選択される、請求項４２〜６１のいずれか一つに記載の方法。
63. 有機小分子のライブラリーがスクリーニングされる、請求項４２〜６２のいずれか一つに記載の方法。
64. 可能性のあるペプチドリガンドのライブラリーがスクリーニングされる、請求項４２〜６２のいずれか一つに記載の方法。
65. 請求項１〜６４のいずれか一つに記載の方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、前記リガンドが前記結合部位１の少なくとも１つの相互作用点に結合する能力があり、前記相互作用点が、配列番号１の図１４に提示されているＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｊ_１、Ｊ_２、およびＪ_３を含み、
    Ｘ_１がアミノ酸残基Ｒ３２５、Ｓ３１６、およびＹ３５１を含み、
    Ｘ_２がＹ３５１のバックボーンカルボニルを含み、
    Ｘ_３がＩ３５３のバックボーンを含み、
    Ｘ_４がＫ２６０のアミノ基を含み、
    Ｒ_１がアミノ酸残基Ｉ３２７、Ｆ３１４、Ｙ３５１、Ｉ３５３、およびＭ３６３を含み、
    Ｒ_２がＦ３５０、およびアミノ酸残基Ｔ３９７〜Ｅ４０１を含むループ由来の少なくとも１つのアミノ酸を含み、
    Ｊ_１がＳ３０５を含み、
    Ｊ_２がＦ３０６のバックボーンアミドを含み、
    Ｊ_３がＦ３０６のバックボーンカルボニルを含むリガンド。
66. 前記リガンドが、相互作用点Ｘ_１に負電荷および／または水素受容体特性を含み、前記負電荷および／または水素受容体特性がカルボン酸およびスルホン酸からなる群から選択される、請求項６５に記載のリガンド。
67. 相互作用点Ｘ_２に、ヒドロキシル、アミノ、およびアミドからなる群から選択される水素結合供与体を含む、請求項６５に記載のリガンド。
68. 相互作用点Ｘ_３に、カルボニルまたはヒドロキシルからなる群から選択される水素結合受容体を含む、請求項６５に記載のリガンド。
69. 相互作用点Ｒ_１に、シクロヘキシル−アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される大きな疎水性基を含む、請求項６５に記載のリガンド。
70. 相互作用点Ｒ_２に、イソロイシン、ロイシン、システインからなる群から選択される疎水性アミノ酸残基、またはヒスチジン、グルタミン、リシン、アルギニン、およびグルタミン酸からなる群から選択される部分的疎水性基を含む、請求項６５に記載のリガンド。
71. 請求項４３〜６４のいずれか一つに記載の方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、以下の式（Ｉ）の一般構造を有するリガンド
    

    

    ［式中、Ｘは水素供与体として働く原子であり、前記原子がＮ、Ｏ、Ｓ、Ｐからなる群から選択され、
    Ｙは、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉからなる群から選択される水素結合受容体として働く電気陰性原子であり、
    Ｒ_１は、Ｃ３〜６アルキル、Ｃ４〜６シクリル、それぞれが４〜６員環の１つの環および１〜３つのヘテロ原子を有する複素環式または複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_０〜２からなる群から選択される１〜３つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
    Ｒ_２は、水素、Ｃ１〜１２のアルキル、またはそれぞれが３〜８員環の１〜３つの環および０〜４つのヘテロ原子を有する芳香族、炭素環式、複素環式、もしくは複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）_０〜２からなる群から選択される１〜８つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
    Ｒ_３は、水素、ＳＨ、イミダゾール、Ｃ１〜１２アルキル、またはそれぞれが３〜８員環の１〜３つの環および０〜４つのヘテロ原子を有する芳香族、炭素環式、複素環式、もしくは複素環式芳香族構造、またはＮ、Ｏ、Ｓからなる群から選択される１〜８つのヘテロ原子を含むヘテロアルキルであり、
    Ｒ_４は、官能基Ｃ１〜１００直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐アルケニル、直鎖または分岐アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、ハロホルミル、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、炭酸エステル、カルボン酸、カルボキシル、エーテル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、アンモニウム、第一級ケチミン、第二級ケチミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ（ジイミド）、シアン酸、イソシアン化物、イソチオシアン酸、硝酸、ニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、ホスフィノ、リン酸、ホスホノ、スルホニル、スルフィニル、スルフィドリル（ＳＨ）、チオシアン酸、ジスルフィド、リンカーＬ２またはＬ３、および配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列またはその断片から選択される］。
72. 請求項４３〜６４のいずれか一つに記載の方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、以下の式（ＩＩ）の一般構造を有するリガンド
    

    

    ［式中、Ｚは、カルボニル、ヒドロキシル、アミノ、イミノ、アミド、スルフィドリル、クロロ、フルオロからなる群から選択される水素結合供与体または受容体であり、
    Ｒ_５は、Ｈ、ＣＨ_３、およびリンカーＬ２からなる群から選択され、
    Ｒ_６は、Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_３、および−ＯＣＨ_３からなる群から選択され、
    Ｒ_７は、グルタミン酸、グルタミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、メチオニン、システイン、脂肪族Ｃ４〜６基の側鎖からなる群から選択され、
    Ｒ_８は、チロシン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、フェニルアラニン、ヨードチロシン、および−ＣＨ_２−ＮＨ_２の側鎖からなる群から選択され、
    Ｒ_９は、リシン、アルギニン、グルタミン、Ｃ３〜８脂肪族基およびヘテロ脂肪族基、５員環または６員環を含む炭素環式基および複素環式基の側鎖からなる群から選択され、
    Ｒ_１０は、ピログルタミン酸、ポリ炭水化物、および１０以上の長さのポリペプチドからなる群から選択され、
    Ｒ_１１およびＲ_１２は個々に、Ｈ、Ｃ１〜１２直鎖または分岐アルキル、直鎖または分岐アルケニル、直鎖または分岐アルキニル、フェニル、ベンジル、ハロアルカン、クロロアルカン、ブロモアルカン、ヨードアルカン、ハロホルミル、ヒドロキシル、カルボニル、アルデヒド、炭酸エステル、カルボン酸、カルボキシル、エーテル、エステル、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキサミド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、アンモニウム、第一級ケチミン、第二級ケチミン、第一級アルジミン、第二級アルジミン、イミド、アジド、アゾ（ジイミド）、シアン酸、イソシアン化物、イソチオシアン酸、硝酸、ニトリル、ニトロソオキシ、ニトロ、ニトロソ、ピリジル、ホスフィノ、リン酸、ホスホノ、スルホニル、スルフィニル、スルフィドリル（ＳＨ）からなる群から選択され、
    共有結合（１）および（２）は個々に、一重結合および二重結合からなる群から選択される］。
73. 請求項４３〜６４のいずれか一つに記載の方法によって同定されるＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンドであって、以下の式（ＩＩＩ）の一般構造を有するリガンド
    

    

    ［式中、Ｒ_１３は、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、アルケニル、アルキニル、およびリンカーＬ３からなる群から選択され、
    Ｒ_１４、Ｒ_１５、Ｒ_１７、Ｒ_１９、Ｒ_２０は個々に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、アルケニル、およびアルキニルからなる群から選択され、
    Ｒ_１６は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、ヒスチジン、システイン、リシン、および脂肪族Ｃ３〜７の側鎖からなる群から選択され、
    Ｒ_１８は、Ｈ、−ＣＨ_３、および−ＣＨ_２ＯＨからなる群から選択され、
    共有結合（１）および（２）は個々に、一重結合および二重結合からなる群から選択される］。
74. リンカーＬ２が、５〜６個の残基のペプチドバックボーン、Ｃ１５〜２０アルキル、Ｃ１５〜２０アルケニル、およびＣ１５〜２０アルキニルからなる群から選択される、請求項７１または７２に記載のリガンド。
75. 請求項７４に記載のリンカーによって請求項７２に記載のリガンドに連結し、それにより以下の一般式（ＩＶ）
    ［式（Ｉ）］−［リンカーＬ２］−［式（ＩＩ）］ （ＩＶ）
    を形成する、請求項７１に記載のリガンド。
76. リンカーＬ３が１２〜２０個の残基のペプチドバックボーン、Ｃ３０〜６０アルキル、Ｃ３０〜６０アルケニル、Ｃ３０〜６０アルキニルからなる群から選択される、請求項７１または７３に記載のリガンド。
77. 請求項７６に記載のリンカーによって請求項７３に記載のリガンドに連結され、それにより以下の一般式（Ｖ）
    ［式（Ｉ）］−［リンカーＬ３］−［式（ＩＩＩ）］ （Ｖ）
    を形成する、請求項７１に記載のリガンド。
78. 図２６に示された、ＲＲＰＹＩ（ｃｈｇ）、ｉｏｄｏＹＩＬ、ＱＩＬ、ＹＣＬ、ｄＹＩＬ、ＹＨＬ、ＲＲＰＹＩ（ａｃｃ）、ＲＲＰＹＩ（ｎＭｅ）Ｌ、ＹＩＬからなる群から選択される、請求項６５〜７７のいずれか一つに記載のリガンド。
79. 図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｃｈｇ）である、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
80. 図２６に示されたｉｏｄｏＹＩＬである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
81. 図２６に示されたＱＩＬである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
82. 図２６に示されたＹＣＬである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
83. 図２６に示されたｄＹＩＬである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
84. 図２６に示されたＹＨＬである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
85. 図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ａｃｃ）である、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
86. 図２６に示されたＲＲＰＹＩ（ｎＭｅ）Ｌである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
87. 図２６に示されたＹＩＬである、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
88. ソルチリン（配列番号１）の結合部位１またはその断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
89. ソルチリン（配列番号１）の結合部位２またはその断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
90. ソルチリン（配列番号１）の結合部位３またはその断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
91. ソルチリン（配列番号１）の結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
92. ソルチリン（配列番号１）の結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
93. ソルチリン（配列番号１）の結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
94. ソルチリン（配列番号１）の結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基および結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
95. 薬剤として用いる、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のリガンド。
96. 個体における神経系の疾患、障害、または損傷の処置の方法に用いる、請求項６５〜８７のいずれか一つに記載のＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体リガンド。
97. 前記個体がヒトである、請求項９６に記載のリガンド。
98. 前記疾患、障害、または損傷が、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経への傷害を含む、請求項９６に記載のリガンド。
99. 前記傷害が、脳卒中、脳外傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、およびてんかんに起因する、請求項９８に記載のリガンド。
100. 神経系障害が、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンおよびそれらの突起の変性を含む、請求項９６に記載のリガンド。
101. 前記ニューロンの変性がパーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および多発性硬化症に関連したニューロン傷害に起因する、請求項９６に記載のリガンド。
102. 神経系の疾患が神経変性疾患である、請求項９６に記載のリガンド。
103. 神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項１０２に記載のリガンド。
104. 神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１０２に記載のリガンド。
105. 神経変性疾患が多発性硬化症である、請求項１０２に記載のリガンド。
106. 神経系障害が、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷である、請求項９６に記載のリガンド。
107. 前記脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷害、悪性腫瘍によって引き起こされる状態、ならびに／または、限定されないが、糖尿病、腎機能障害、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、および感染を含む遺伝的もしくは特発性状態からなる群から選択される、請求項１０６に記載のリガンド。
108. 神経系障害が、グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷であり、前記グリアが、脳、脳幹、脊髄、および末梢神経におけるオリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびシュワン細胞からなる群から選択される、請求項９６に記載のリガンド。
109. 前記グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷が、多発性硬化症、視神経炎、脳硬化症、麻疹後脳脊髄炎、およびてんかんからなる群から選択される、請求項１０８に記載のリガンド。
110. 疾患または障害が、多発硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、およびアルコール依存症である、請求項１０８に記載のリガンド。
111. 神経系障害、疾患、または損傷が、網膜、視細胞、および関連神経に関わる、請求項９６に記載のリガンド。
112. 網膜、視細胞、および関連神経に関わる神経系障害、疾患、または損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項１１１に記載のリガンド。
113. 神経系障害、疾患、または損傷が、聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる、請求項９６に記載のリガンド。
114. 前記聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる神経系障害、疾患、または損傷が、騒音性難聴、聴覚消失、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性および蝸牛前庭萎縮、およびメニエール病からなる群から選択される、請求項１１３に記載のリガンド。
115. 任意で、薬学的に許容可能な担体を含む、請求項９５に記載の薬剤。
116. 第２の活性成分を含む、請求項９５に記載の薬剤。
117. 第２の活性成分が、ソルチリン（配列番号１）の結合部位１に結合する能力があるリガンド、および／または結合部位２に結合する能力があるリガンド、および／または結合部位３に結合する能力があるリガンドから選択される、請求項１１６に記載の薬剤。
118. 組成物のｐＨがｐＨ５〜ｐＨ９である、請求項１１５〜１１７のいずれか一つに記載の薬剤。
119. 注射による投与、坐剤、経口投与、舌下錠もしくはスプレー、皮膚投与、または吸入用に、または埋め込み型生体適合性カプセルを用いる局所投与用に製剤化される、請求項１１５〜１１８のいずれか一つに記載の薬剤。
120. 注射が、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス投与または連続投与である、請求項１１９に記載の薬剤。
121. 投与が３０分間〜２４時間の間隔で行われる、請求項１１５〜１２０のいずれか一つに記載の薬剤。
122. 投与が１時間〜６時間の間隔で行われる、請求項１１５〜１２０のいずれか一つに記載の薬剤。
123. 処置の持続時間が６時間〜７２時間である、請求項１１５〜１２２のいずれか一つに記載の薬剤。
124. 薬剤の用量が１ｋｇの体重あたり１０μｇ〜５０ｍｇである、請求項１１５〜１２３のいずれか一つに記載の薬剤。
125. 対象における病的状態の処置の方法であって、それを必要とする個体に、治療有効量の請求項１１５〜１２４のいずれか一つに記載の薬剤を投与することを含む方法。
126. 前記薬剤が、神経系に関連した疾患、障害、または損傷の処置用である、請求項１２５に記載の方法。
127. 前記薬剤が、限定されないが、脳卒中、脳外傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、およびてんかんなどの状態を含む、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経への傷害を含む疾患、障害、または損傷の処置用である、請求項１２６に記載の方法。
128. 神経系障害が、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンおよびそれらの突起の変性を含む、請求項１２６に記載の方法。
129. 前記ニューロンの変性が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、および多発性硬化症に関連したニューロン傷害に起因する、請求項１２８に記載の方法。
130. 脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンおよびそれらの突起の変性を含む神経系障害が、神経変性疾患または障害である、請求項１２６に記載の方法。
131. 神経変性疾患または障害がパーキンソン病である、請求項１３０に記載の方法。
132. 神経変性疾患または障害がハンチントン病である、請求項１３０に記載の方法。
133. 神経変性疾患または障害が多発性硬化症（ＡＬＳ）である、請求項１３０に記載の方法。
134. 神経系障害が、脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷である、請求項１２６に記載の方法。
135. 前記脳、脳幹、脊髄、および／または末梢神経におけるニューロンの機能障害および／または喪失を含む疾患、障害、または損傷が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷害、悪性腫瘍によって引き起こされる状態、ならびに／または、限定されないが、糖尿病、腎機能障害、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、および感染を含む遺伝的もしくは特発性状態からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
136. 神経系障害が、グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷であり、前記グリアが、脳、脳幹、脊髄、および末梢神経におけるオリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびシュワン細胞からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
137. 前記グリアの変性または硬化を含む疾患、障害、または損傷が、多発性硬化症、視神経炎、脳硬化症、麻疹後脳脊髄炎、およびてんかんからなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。
138. 疾患または障害が、多発硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、およびアルコール依存症である、請求項１３６に記載の方法。
139. 神経系障害、疾患、または損傷が、網膜、視細胞、および関連神経に関わる、請求項１３６に記載の方法。
140. 網膜、視細胞、および関連神経に関わる神経系障害、疾患、または損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、請求項１３９に記載の方法。
141. 神経系障害、疾患、または損傷が、聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる、請求項１３６に記載の方法。
142. 前記聴神経複合体の感覚上皮および関連神経節に関わる神経系障害、疾患、または損傷が、騒音性難聴、聴覚消失、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性および蝸牛前庭萎縮、およびメニエール病からなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。
143. 哺乳類神経細胞においてアポトーシスを防ぐ方法であって、請求項６５〜８７のいずれか一つに定義されているリガンド分子に前記神経細胞を曝すことを含む方法。
144. 哺乳類神経細胞の生存を増強する方法であって、請求項６５〜８７のいずれか一つに定義されているリガンド分子に前記神経細胞を曝すことを含む方法。
145. 哺乳類細胞の組織を増殖させる方法であって、請求項６５〜８７のいずれか一つに定義されているリガンド分子を前記組成物に投与することを含む方法。
146. 哺乳類細胞の組織を分化させる方法であって、請求項６５〜８７のいずれか一つに定義されているリガンド分子を前記組成物に投与することを含む方法。
147. 配列番号１の結合部位１の少なくとも１つのアミノ酸残基および／もしくは結合部位２の少なくとも１つのアミノ酸残基および／もしくは結合部位３の少なくとも１つのアミノ酸残基、またはそれらの断片もしくは変異体に結合する能力がある抗体。
148. 配列番号１のＳ４２０〜Ｉ４２５、Ａ４９７〜Ｖ５０２、Ｓ４６９〜Ｐ４７５、およびＤ４４９〜Ｎ４５４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基またはそれらの断片もしくは変異体に結合する能力がある抗体。
149. ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、組換え抗体からなる群から選択される、請求項１４７〜１４８のいずれか一つに記載の抗体。
150. 請求項１４７〜１４９のいずれか一つに記載の抗体、および化学療法剤、毒素、または放射性同位元素などの細胞傷害性薬剤；アビジンもしくはストレプトアビジンまたは抗原などの特異的結合ペアのメンバーからなる群から選択されるコンジュゲートを含むイムノコンジュゲート。
151. Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体タンパク質分子の原子モデルを構築するための方法であって、
     ａ．配列番号１と少なくとも２０％の配列相同性を有する、Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体またはその断片もしくは変異体を同定する段階、および
     ｂ．図１７〜２０のいずれかに提示されている原子座標、または３Å以下のタンパク質バックボーン原子に関する二乗平均平方根偏差だけ、図１７〜２０のいずれかに提示された３次元構造から偏位する３次元構造から選択される原子座標を利用して、相同性モデリングによって同定されたＶｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体の原子モデルを得る段階
     を含む方法。
152. 前記Ｖｐｓ１０ｐ−ドメイン受容体が、配列番号２（ＳｏｒＬＡ）、配列番号３（ＳｏｒＣＳ１）、配列番号４（ＳｏｒＣＳ２）、および配列番号５（ＳｏｒＣＳ３）、またはそれらの断片もしくは変異体からなる群から選択される、請求項１５１に記載の方法。

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