JP2022191233A - インスリンアナログ - Google Patents

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Gerbrandt Tasman Menting John
ブライアン・スミス
Bryan Smith
ダニー・フン－チー・チョウ
Hung-Chieh Chou Danny
ヘレナ・サファビ－ヘマミ
Safavi-Hemami Helena
マイケル・コリン・ローレンス
Colin Lawrence Michael
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M Olivera Baldomero
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Abstract

【課題】インスリンアナログ、特に短縮型Ｂ鎖を有するインスリンアナログを提供する。【解決手段】Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを含むインスリンアナログであって、前記Ｂ鎖は、ヒトインスリンのＢ鎖の特定の位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、および／またはヒトインスリンのＢ鎖の別の特定の位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、前記アナログは、ヒトインスリン中に見出される少なくとも１個のアミノ酸を含むがコヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）毒液インスリンの対応する位置では欠いており、前記Ａ鎖ペプチドおよび前記Ｂ鎖ペプチドは少なくとも１対のシステイン残基を介して互いに結合している、インスリンアナログを提供する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１６年７月２２日に出願された豪国仮特許出願第２０１６９０２８８３号明細書からの優先権を主張し、この明細書はその全体が参照により組み込まれる。本出願はまた、２０１７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８３，１１８号明細書からの優先権も主張し、この明細書はその全体が参照により組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する陳述
本発明はその一部がＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにより付与されたＧＭ ４８６７７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明の分野
本発明は概してインスリンアナログに関する。より具体的には、本発明は、短縮型Ｂ鎖を有する即時作用性インスリンアナログに関する。本発明はまた、イモガイの毒液由来のインスリンの結晶構造、ならびにこの結晶および関連する構造情報を使用して、インスリンレセプターと相互作用するまたはインスリンレセプターを調節するインスリンアナログをスクリーニングするおよび設計する方法にも関する。
インスリンは、グルコース代謝、生殖および認知の制御において中心的役割を果たすポリペプチドホルモンである。ヒトインスリン単量体は、２個のジスルフィド架橋（ＣｙｓＡ７－ＣｙｓＢ７およびＣｙｓＡ１９－Ｂ２０）で共有結合的に連結された２本のポリペプチド鎖（Ａ鎖およびＢ鎖）からなる。Ａ鎖は２１個のアミノ酸からなり、Ｂ鎖は３０個のアミノ酸からなる。Ａ鎖内には３番目のジスルフィド架橋が位置する（ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ１１）。身体内では、インスリンは単量体、二量体および六量体として存在する。この六量体は、２個の中心亜鉛イオンにより互いに保持された３個のインスリン二量体からなる。ヒトインスリンは六量体として膵臓β－細胞中に貯蔵されている。インスリンレセプターに結合する生物学的に活性な形態は単量体である。インスリンの六量体－単量体変換は、このインスリンの生物学的利用能にとって極めて重要である。
インスリン制御の妨害は、重篤な臨床症状（例えば糖尿病性脊髄炎（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｙｅｌｉｔｉｓ）、高血糖および他の類似の状態）と関連することが多い。真性糖尿病（糖尿病と呼ばれる）は、長期間にわたる高血糖レベルを特徴とする一群の障害である。膵臓がインスリンを十分に産生しない場合には、または身体がインスリンに適切に反応しない場合には、糖尿病が生じる可能性がある。インスリンまたはインスリンアナログの投与は、糖尿病等の状態を処置する最も有効な方法であり続けている。糖尿病の処置は、ホルモンの基礎レベルを維持するための、即時作用性の食前インスリンと長時間作用性インスリンとの組み合わせの投与を伴うことが多い。
即時作用性インスリンアナログは活性が速やかに発現される。典型的には、この即時作用性インスリンアナログは単量体である、または罹患した個体への注射時に単量体型へと迅速に解離する。構造的には、このインスリンアナログは、インスリン多量体化に有害であるＢ鎖Ｃ末端領域（残基Ｂ２６～Ｂ３０）内で改変を有することによって通常のヒトインスリンとは異なる。しかしながら、自己会合を消失させるためのＢ鎖のさらなるＣ末端トランケーションにより活性がほぼ完全に消失しており、なぜならばおそらく活性にはＰｈｅＢ２４が重要だからである。例えば、デス－オクタペプチド（ｄｅｓ－ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ）［Ｂ２３－Ｂ３０］インスリン（ＤＯＩ）（単量体アナログ）は、０．１％未満の生物活性を保持する（Ｂａｏ ａｔ ａｌ．，１９９７）。ＰｈｅＢ２４は、残基ＧｌｙＢ２０－ＧｌｕＢ２１－ＡｒｇＢ２２－ＧｌｙＢ２３により形成された１型β－ターンのすぐＣ末端に隣接し、トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）ＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６および１型β－ターンの両方が脊椎動物インスリンで高度に保存されている。
単量体であり、即時作用性であり且つヒトインスリンレセプターシグナル伝達活性を保持する新規のインスリンアナログおよびそのようなアナログを設計する方法が必要とされている。
本発明者らは、コヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）の毒液由来の新たに同定されたインスリンＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の特徴を明らかにしており、このインスリンは単量体ではあるが依然としてヒトインスリンレセプターに結合してシグナル伝達活性を保持することを示す。本発明者らはさらにＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結晶の作製に成功しており、Ｘ線結晶構造解析を使用してこの結晶の三次元構造を解明した。本明細書で提示された構造データは、ヒトインスリンの芳香族トリプレットＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６を欠いているにもかかわらずＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１がその活性を保持することを可能にする重要なアミノ酸位置および相互作用の同定を初めて可能にしている。
一態様では、本発明は、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを含むインスリンアナログであって、このＢ鎖は、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、このアナログは、ヒトインスリン中に見出される少なくとも１個のアミノ酸を含むがコヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）毒液インスリンの対応する位置では欠いており、これらＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは少なくとも１対のシステイン残基を介して互いに結合している、インスリンアナログを提供する。
いくつかの実施形態では、この芳香族残基は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンおよび４－メチルフェニルアラニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この大きい脂肪族残基は、イソロイシン、シクロヘキシルアラニン、シクロペンチルアラニンおよびメチオニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置での芳香族残基または大きい脂肪族残基は、チロシン、フェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、シクロペンチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置での芳香族残基または大きい脂肪族残基は、チロシン、フェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、シクロペンチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンと比較した場合にＣ末端でトランケートされている。いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンの９個のＣ末端アミノ酸のうちの１個または複数個または全てを欠いている。いくつかの実施形態では、このＢ鎖はヒトインスリンのＰｈｅＢ２４を少なくとも欠いている。いくつかの実施形態では、このＢ鎖はヒトＢ鎖の芳香族トリプレット（ヒトインスリンのアミノ酸ＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６）を少なくとも欠いている。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－ＸＡ３－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－ＸＡ１２－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－ＸＡ１６－ＸＡ１７－ＸＡ１８－ＸＡ１９－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１－ＸＡ２２－ＸＡ２３－ＸＡ２４－ＸＡ２５－ＸＡ２６－ＸＡ２７－ＸＡ２８－ＸＡ２９－ＸＡ３０－ＸＡ３１－ＸＡ３２－ＸＡ３３－ＸＡ３４（この配列中、ＸＡ２＝ＶａｌまたはＩｌｅ；ＸＡ３＝ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＡ４＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＡ５＝Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＨｉｓまたはＶａｌ；ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＡ１１は独立してＣｙｓまたはセレノシステインであり；ＸＡ８＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＶａｌ；ＸＡ９＝Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ；ＸＡ１０＝Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒ；ＸＡ１２＝ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＡ１３＝Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＡｓｐ；ＸＡ１４＝Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＸＡ１５＝Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；ＸＡ１６＝Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＡｌａ；ＸＡ１７＝Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒ；ＸＡ１８＝Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＸＡ１９＝ＴｙｒまたはＰｈｅ；ＣｙｓＡ２０＝Ｃｙｓ、セレノシステイン、アミド化Ｃｙｓまたはアミド化セレノシステイン；ＸＡ２１＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａまたは存在せず；ＸＡ２２＝Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２３＝Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２４＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＡ２６＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２７～ＸＡ３１は独立してＳｅｒであり、または存在せず；ＸＡ３２＝Ａｌａ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ３３＝Ａｌａ、Ｖａｌまたは存在せず；ならびにＸＡ３４＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号１）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、ＬｅｕまたはＧｌｙ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、アミド化Ｈｉｓ、アミド化Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号２）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号３）を含む。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ならびにＸＢ２４、ＸＢ２５、ＸＢ２６、ＸＢ２７、ＸＢ２８、ＸＢ２９、ＸＢ３０、ＸＢ３１、ＸＢ３２、ＸＢ３３、ＸＢ３４、ＸＢ３５、ＸＢ３６、ＸＢ３７、ＸＢ３８およびＸＢ３９は存在しない）（配列番号４）を含む。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号５）を含む。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝ＨｉｓまたはＴｙｒ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝ＶａｌまたはＬｅｕ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号６）を含む。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎ；ＸＢ７＝ＨｉｓまたはＴｙｒ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１３＝Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＰｒｏまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝Ｇｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１６＝Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＴｙｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＭｅｔまたはＶａｌ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＬｙｓ；ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＣｙｓＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝ＴｙｒまたはＧｌｙ；およびＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙまたは存在しない）（配列番号７）を含む。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ、ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号８）を含む。
いくつかの実施形態では、ＸＢ１７およびＸＢ２２はＴｙｒである。いくつかの実施形態では、ＸＢ２２はＴｙｒである。いくつかの実施形態では、ＸＢ１７はＴｙｒである。
いくつかの実施形態では、このＡ鎖ペプチドは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－ＸＡ３－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－ＸＡ１２－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－ＸＡ１９－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１－ＸＡ２２－ＸＡ２３－ＸＡ２４－ＸＡ２５－ＸＡ２６－ＸＡ２７－ＸＡ２８－ＸＡ２９－ＸＡ３０－ＸＡ３１－ＸＡ３２－ＸＡ３３－ＸＡ３４（この配列中、ＸＡ２＝ＶａｌまたはＩｌｅ；ＸＡ３＝ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＡ４＝Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメートまたはＣｙｓ；ＸＡ５＝Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＨｉｓまたはＶａｌ；ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＡ１１は独立してＣｙｓまたはセレノシステインであり；ＸＡ８＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＶａｌ；ＸＡ９＝Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓ；ＸＡ１０＝Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒ；ＸＡ１２＝ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＡ１３＝Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＡｓｐ；ＸＡ１４＝Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＸＡ１５＝Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；またはＡｌａ；ＸＡ１７＝Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒ；ＸＡ１８＝Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＸＡ１９＝ＴｙｒまたはＰｈｅ；ＣｙｓＡ２０＝Ｃｙｓ、セレノシステイン、アミド化Ｃｙｓまたはアミド化セレノシステイン；ＸＡ２１＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａまたは存在せず；ＸＡ２２＝Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２３＝Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２４＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＡ２６＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２７～ＸＡ３１は独立してＳｅｒであり、または存在せず；ＸＡ３２＝Ａｌａ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ３３＝Ａｌａ、Ｖａｌまたは存在せず；ならびにＸＡ３４＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号９）を含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－ＸＡ１６－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１６はＰｈｅまたはＬｅｕであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１０）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝ＧｌｙまたはＴｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１１）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１２）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－Ｔｙｒ－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１３）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１４）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－Ｉｌｅ－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－Ｌｅｕ－ＣｙｓＢ２１－Ｔｙｒ－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１５）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
一実施形態では、このインスリンアナログは、Ｃ末端でのトランケート型Ｂ鎖ならびにこのＢ鎖のアミノ酸番号１５および／または２０での芳香族残基または大きい脂肪族残基を除いてヒトインスリンと同一である。例として、Ｘａａが芳香族残基または大きい脂肪族残基である下記の３つの実施形態が提供されるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１６）を含むＡ鎖ペプチドと、配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号１７）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１８）を含むＡ鎖ペプチドと、配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号１９）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号２０）を含むＡ鎖ペプチドと、配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｇｌｕ（配列番号２１）（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは多くの改変アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、下記：
ｉ）ＸＡ４はガンマカルボキシグルタメートである、
ｉｉ）ＸＢ５＝ヒドロキシプロリン、および
ｉｉｉ）ＸＢ１２＝ガンマカルボキシグルタメート
のうちの１つまたは複数または全てを含む。
いくつかの実施形態では、Ｂ鎖ペプチドのＣｙｓＢ９はＡ鎖ペプチドのＣｙｓＡ６に結合している。いくつかの実施形態では、Ｂ鎖ペプチドのＣｙｓＢ２１はＡ鎖ペプチドのＣｙｓＡ２０に結合している。いくつかの実施形態では、ＣｙｓＡ７はＣｙｓＡ１１に結合している。
いくつかの実施形態では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは一対のそれらの各末端で互いに連結されている。いくつかの実施形態では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは両方の末端で互いに連結されている。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログはヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０が１０－６Ｍよりも低い。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログはヒトＩＧＦ－ＩＲに結合しない、またはＩＧＦ－ＩＲに弱く結合する。いくつかの実施形態では、このアナログはヒトＩＧＦ－ＩＲに対する親和性（Ｋｄ）が１００ｎＭよりも弱い。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは主に単量体である。いくつかの実施形態では、このアナログの少なくとも７５％は溶液中で単量体である。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンと比較した場合に、ヒトに投与された際に生物学的利用能が増加している。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトへの投与から０．５～３時間以内に生物学的利用能がピークになる。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは投与から１０分以内に活性を発現する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義されたインスリンアナログまたはその薬学的に許容される塩と、１種または複数種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、インスリンに関連する状態を処置するおよび／または予防する方法であって、必要とする対象に、本明細書で定義されたインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、このインスリンに関連する状態は高血糖、インスリン抵抗性、１型糖尿病、妊娠糖尿病または２型糖尿病である。
さらなる態様では、本発明は、血糖値を低減させる方法であって、必要とする対象に、本明細書で定義されたインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。
さらなる態様では、本発明は、対象のインスリンに関連する状態を処置するためのおよび／または予防するための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用を提供する。さらなる態様では、本発明は、対象の血糖値を低減させるための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用を提供する。
さらなる態様では、本発明は、対象のインスリンに関連する状態の処置および／または予防での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログを提供する。さらなる態様では、本発明は、対象の血糖値の低減での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログを提供する。
さらなる態様では、本発明は、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドを提供する。いくつかの実例では、このアミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙ、Ｇ２０ＦまたはＧ２０Ｐである。いくつかの実例では、このアミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅ、Ｈ１０ＤまたはＨ１０Ｑである。
いくつかの実施形態では、このペプチドはインスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含み、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含み、このＡ鎖ペプチド中に少なくとも１個の置換をさらに含む。いくつかの実例では、このＡ鎖ペプチド中の少なくとも１個の置換はＴ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫまたはＳ９Ｒである。
いくつかの実施形態では、このペプチドはインスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含み、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含み、このＡ鎖ペプチド中に少なくとも２個の置換をさらに含む。いくつかの実例では、このＡ鎖ペプチド中の少なくとも２個の置換は、Ｔ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫおよびＳ９Ｒから選択される置換のうちの２つである。
いくつかの実施形態では、このペプチドはデス－オクタペプチドインスリンである。いくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３０）の配列を含む。いくつかの実例では、このＡ鎖はＧＩＶＥＱＣＣＨＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３９）の配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは少なくとも１個のジスルフィド結合を介して結合している。いくつかの実施形態では、このペプチドは単量体である。
いくつかの実施形態では、このインスリンＡ鎖ペプチドは野生型ヒトインスリンＡ鎖ペプチドと少なくとも７０％同一である。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で定義されたインスリンアナログ、ペプチドまたは化合物を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、対象中でインスリンレセプター活性化を増加させる方法であって、本明細書で定義されたインスリンアナログ、ペプチドまたは化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象中でインスリンレセプター活性化を増加させる方法であって、必要とする対象に、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであり、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドの治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、対象の血糖を低下させる方法であって、本明細書で定義されたインスリンアナログ、ペプチドまたは化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象の血糖を低下させる方法であって、必要な対象に、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであり、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドの治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、対象の１型糖尿病を処置する方法であって、本明細書で定義されたインスリンアナログ、ペプチドまたは化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象の１型糖尿病を処置する方法であって、必要とする対象に、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであり、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドの治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実例では、この対象は、このペプチドの投与の前に１型糖尿病と診断されている。
さらなる態様では、少なくとも１個のジスルフィド結合を介してＢ鎖ペプチドに結合しているＡ鎖ペプチドを有する治療用タンパク質であって、このＡ鎖はＧＩＶＥＱＣＣＨＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３９）の配列を含み、このＢ鎖ペプチドはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３０）の配列を含む、治療用タンパク質が提供される。
さらなる態様では、本発明は、インスリンレセプター（ＩＲ）に結合することが知られているポリペプチドを再設計するまたは改変する方法であって、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造の、構造に基づく評価を実施すること、およびこの評価の結果としてポリペプチドを再設計するまたは化学的に改変することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この構造に基づく評価は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンの原子座標またはそのサブセットとの比較を含む。いくつかの実施形態では、この構造に基づく評価は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンレセプターの原子座標またはそのサブセットとの間に形成される複合体の分子モデリングをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、およびこのポリペプチドのＩＲに結合する能力を試験することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、および再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドのＩＲ活性化を調節する能力を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、および再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドの血糖値を低下させる能力を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＩＲに結合することが知られているポリペプチドはインスリンである。いくつかの実施形態では、このインスリンはヒトインスリンである。別の態様では、本明細書で定義された方法により再設計されているまたは改変されているポリペプチドも提供される。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは単量体である。
別の態様では、本発明は、ＩＲアゴニストである単離分子であって、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の３Ｄ構造に基づいて同定されているおよび／または設計されている分子を提供する。いくつかの実施形態では、この分子はペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物である。いくつかの実施形態では、この分子は単量体である。いくつかの実施形態では、この分子はヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０が１０－６Ｍよりも低い。
別の態様では、本発明は、ＩＲに結合する化合物を同定する方法であって、
ｉ）下記：
ａ）付録Ｉの原子座標もしくはそのサブセットにより定義される構造、または
ｂ）ａ）の対応する主鎖原子上で重ねた場合に約２．０Å未満の平均二乗偏差を有する構造
を有するポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、および
ｉｉ）このＩＲに潜在的に結合する化合物を設計するまたはスクリーニングすること
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、三次元構造モデルを作成することは、ＩＲまたはその領域に結合したポリペプチドのモデルを作成することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＩＲに潜在的に結合する化合物を合成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この化合物はＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する。いくつかの実施形態では、この化合物は単量体である。いくつかの実施形態では、この方法は、血糖値を調節する能力に関して、ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を試験することをさらに含む。いくつかの実施形態では、工程ｉ）およびｉｉ）をインシリコで実施する。
別の態様では、本発明は、インスリン活性を模倣する化合物を同定するコンピュータベースの方法であって、
ｉ）下記：
ａ）付録Ｉの原子座標もしくはそのサブセットにより定義される構造、または
ｂ）ａ）の対応する主鎖原子上で重ねた場合に約２．０Å未満の平均二乗偏差を有する構造
を有するポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、および
ｉｉ）インスリン活性を模倣する化合物を設計するまたはスクリーニングすること
を含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、三次元構造モデルを作成することは、ＩＲまたはその領域に結合するポリペプチドのモデルを作成することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＩＲに潜在的に結合する化合物を合成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この化合物はＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する。いくつかの実施形態では、この化合物は単量体である。いくつかの実施形態では、この方法は、血糖値を調節する能力に関して、ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を試験することをさらに含む。いくつかの実施形態では、工程ｉ）およびｉｉ）をインシリコで実施する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で定義された方法を使用して同定された化合物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、あらゆる格子寸法において変動が最大約２％であるａ＝ｂ＝ｃ＝７４．９１Åの単位格子寸法を有する空間群Ｐ４３２を有するＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ポリペプチドの結晶を提供する。
さらなる態様では、本発明は、付録Ｉの原子座標により定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ポリペプチドの構造を提供する。
さらなる態様では、本発明は、構造モデルとしての、付録Ｉの原子座標により定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ポリペプチドの構造の使用を提供する。いくつかの実施形態では、この構造モデルをインスリンアナログの同定に使用する。本発明はまた、本明細書で定義された使用により同定されたインスリンアナログも提供する。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で定義されたインスリンアナログ、ポリペプチド分子および／または化合物を含む医薬組成物を提供する。
本明細書中の任意の実施形態は、別途具体的に述べられていない限り、必要な変更を加えて任意の他の実施形態に適用されると解釈するものとする。例として、当業者が理解するように、本発明の方法に関して本明細書で概説されたインスリンアナログ、ペプチドおよび健康状態の例は、本発明の使用および医薬組成物にも同様に当てはまる。薬剤の製造における本化合物の医薬組成物への組込み等の製造工程を本発明の実施形態が含むことも意図されている。
本明細書全体にわたり、別途具体的に述べられていない限り、または文脈が要求しない限り、単一の工程、組成物、工程群または組成物群への言及は、これらの工程、組成物、工程群または組成物群のうちの１つおよび複数（即ち１つまたは複数）を包含すると解釈するものとする。
本開示の方法および組成物のさらなる利点は、下記の説明において一部が記載され且つこの説明から一部が理解され、または本開示の方法および組成物の実施により習得され得る。本開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘された要素および組み合わせにより実現され且つ達成される。
下記の非限定的な実施例により且つ添付の図面を参照して本発明を下記に説明する。本発明は、例示のみを目的として意図されている本明細書で説明された特定の実施形態により範囲が限定されるべきではない。本明細書で説明されているように、機能的に等価な製品、組成物および方法は明らかに本発明の範囲内である。
本明細書に組み込まれており且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を図示しており、本明細書と一緒に、本開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
ヒトインスリンとの配列比較を示す図である。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の配列およびヒトインスリンとの比較。保存されたシステイン残基および芳香族トリプレットに灰色の網掛けをしている。ジスルフィド結合を、２個のシステイン残基を結ぶ実線で示す。γ：γ－カルボキシル化グルタメート（γ－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ）；Ｏ：ヒドロキシプロリン；＊：Ｃ末端アミド化。 Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のキャラクタリゼーションを示すグラフである。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１（ｎ＝９）、ＰＴＭ－フリー ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１（ｎ＝９）およびヒトインスリン（ｎ＝２１）のヒトＩＲ（アイソフォームＢ）への競合結合分析。エラーバーはＳＥＭを表す（存在しない場合、エラーバーはマーカーサイズと比べて小さい）。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１：ＳｅｃＡ６とＳｅｃＡ１０との間にジセレニド結合を有するＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１。 Ａｋｔリン酸化分析により測定したインスリンシグナル伝達を示すグラフである。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１、ＰＴＭ－フリー ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１およびｈＩｎｓのＡｋｔリン酸化分析（ｎ＝４）。エラーバーはＳＥＭを表す（存在しない場合、エラーバーはマーカーサイズと比べて小さい）。 図４ａは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のｘ線結晶構造を示す図である。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１およびｈＩｎｓの重ね合わせ（ＰＤＢエントリー１ＭＳＯ）。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＢ鎖およびＡ鎖の主鎖は灰色であり、ｈＩｎｓのＢ鎖およびＡ鎖の主鎖は（それぞれ）黒色および白色である。 図４ｂは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の疎水性コアを示す図である。ｈＩｎｓのコア構造と比較したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のコア構造。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＢ鎖およびＡ鎖の主鎖は灰色であり、ｈＩｎｓのＢ鎖およびＡ鎖の主鎖は（それぞれ）黒色および白色である。 図４ｃ－ｅは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の翻訳後改変を示す図である。ＧｌａＡ４、ＧｌａＢ１０およびＨｙｐＢ３の側鎖相互作用（それぞれ、ｈＩｎｓ ＧｌｕＡ４のものと比較したＧｌａＡ４のものとの側鎖相互作用）。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＢ鎖およびＡ鎖の主鎖は灰色であり、ｈＩｎｓのＢ鎖およびＡ鎖の主鎖は（それぞれ）黒色および白色である。 Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のｘ線結晶構造を示す図である。結晶学的４回転軸の周りのＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１単量体の結晶内の配置を示す立体画像。４個の硫酸塩分子（中心）を、非拘束座標とそれぞれ０．２５の有効占有率とにより、４回転軸上の差電子密度の比較的特徴がない小塊へとモデル化している。硫酸イオンは、各Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１単量体からのＧｌｙＡ１のアミノ末端基およびＧｌａＡ４の側鎖カルボキシレートを含む電荷補償クラスタの一部を形成する。 ｈＩＲに結合するＣｏｎ－ｉｎｓ Ｇ１を示す図である。ヒトインスリンレセプターの一次インスリン結合部位に関連したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の分子モデル。ｈＩｎｓ残基Ｂ２２～Ｂ２７（ＰＤＢエントリー４ＯＧＡからのそれぞれのｈＩＲ結合形態）を黒色で重ねる。この図は、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ１５の側鎖は、そのレセプターフリーの立体配座から回転すると、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ／ ｈＩＲ複合体の形成においてｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４の側鎖の代わりとしてＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ２０の側鎖と一緒にどのようにして作用し得るかを示す。明確にするために、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＡ鎖（前景）は透明である。 ＴｙｒＢ１５およびＴｙｒＢ２０を示す図である。１．５σレベルで輪郭を描いた、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１残基ＴｙｒＢ１５およびＴｙｒＢ２０の近傍における（２ｍＦｏｂｓ－ＤＦｃａｌｃ）差電子密度の等値面表示（ｉｓｏｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）。これらの両方の残基の側鎖は、隣接する残基の側鎖（例えばＴｙｒＡ１９の側鎖）と比較して乱れているように見える。 Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＧｌａＡ４を示す図である。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１とｈＩＲの一次結合部位との複合体の分子モデル内で観測した、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＰＴＭ残基ＧｌａＡ４の側鎖とｈＩＲ αＣＴ残基Ａｓｎ７１１の側鎖との相互作用を示す概略図である。分子表面はｈＩＲ Ｌ１ドメインの分子表面である。 Ａｋｔリン酸化分析により測定したインスリンシグナル伝達を示すグラフである。ｈＩｎｓ、ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］のＡｋｔリン酸化分析。 Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のキャラクタリゼーションを示すグラフである。見掛け上のＭＷ ５３８０±５５ｇ／ｍｏｌの単一種に対する最良フィット（線）による、３０，０００ｒｐｍ（黒色点）および４５，０００ｒｐｍ（灰色点）でのＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の沈降平衡分析。 Ｆｖ８３－７．ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との共複合体中のＣｏｎ－ＩｎｓＧ１を示す図である。Ｆｖ８３－７．ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との共複合体中のＣｏｎ－ＩｎｓＧ１の複合体の結晶構造の非対称単位における２個のコピーの重ね合わせの２つの直交図。各パネル内では、一方のコピーを比較的厚い連結を有する灰色のＣαトレースとして示し、他方を比較的薄い連結を有する黒色のＣαトレースとして示す。この重ね合わせはＩＲ３１０．Ｔ部分内の共通の残基に基づく。明確にするために、ＣＲドメインおよびこのＣＲドメインの付着したＦｖ８３－７を省略する。 Ｆｖ８３－７．ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との共複合体中のＣｏｎ－ＩｎｓＧ１を示す図である。Ｆｖ８３－７．ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との共複合体中のＣｏｎ－ＩｎｓＧ１の結晶構造と、Ｆａｂ８３－７．ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との共複合体中のｈＩｎｓの結晶構造との重ね合わせ（ＰＤＢエントリー４ＯＧＡ）。このＣｏｎ－ＩｎｓＧ１複合体を薄い灰色のＣαトレース（および太線）で示し、ｈＩｎｓ複合体を黒色のＣαトレース（および細線、太い黒色で示す残基Ｂ２２～Ｂ３０を除く）で示す。この重ね合わせはＩＲ３１０．Ｔ部分内の共通の残基に基づく。明確にするためにＩＲ３１０．Ｔのシステインリッチドメインおよびこのドメインの付着した抗体断片を省略する。 ＴｙｒＢ１５およびＴｙｒＢ２０を示す図である。ＩＲ３１０．Ｔの共通ドメインＬ１に基づく、Ｆａｂ８３－７、ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との複合体（ＰＤＡエントリー４ＯＧＡ；標識付）中のｈＩｎｓと、Ｆｖ８３－７、ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９との複合体（下線付き標識）中のＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１との重ね合わせ。ＩＲ３１０．ＴのＬ１ドメインを漫画のリボン表現で示し、ｈＩｎｓ、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１およびＩＲ－Ａ７０４－７１９をＣαトレース表現で示す。明確にするために、ＩＲ３１０．ＴのＣＲドメインを省略する。ｈＩＲ Ｐｈｅ７１４、ｈＩｎｓ ＬｅｕＢ１５およびＰｈｅ Ｂ２４およびＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ１５の側鎖およびＣα原子をボールスティック表現（ｂａｌｌ－ａｎｄ－ｓｔｉｃｋ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）で示す。ｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４およびＣｏｎ－ＩｎｓＧ１ ＴｙｒＢ１５の側鎖の空間的対応は明白である。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ２０に関しては解釈可能な電子密度は存在しない。明確にするために、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１およびｈＩｎｓのそれぞれのＡ鎖を省略する。 ｈＩＲの一次結合部位（部位１）を含む構成成分に結合したｈＩｎｓ［ＤＯＩ］の分子モデリングを示す図である。ＩＲ Ｌ１ドメイン（残基Ｇｌｙ５～Ｃｙｓ１５５）およびＩＲ－Ａ７０４－７１９セグメント（ＩＲ－Ａアイソフォームの残基Ｐｈｅ７０５～Ｓｅｒ７１９）と複合体化したｈＩｎｓ［ＤＯＩ］の分子モデル。ＩＲ－Ａ７０４－７１９セグメントを漫画のリボン表現で示し且つ濃い灰色に着色する。ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］Ａ鎖およびＢ鎖を漫画のリボン表現で示し且つ標識を付す。透明な分子表面はｈＩＲ Ｌ１ドメインの分子表面である。ｈＩＲ Ｌ１ドメインを、Ｔｙｒ６７の側鎖を示した漫画のリボン表現で示す。 ｈＩＲの一次結合部位（部位１）を含む構成成分に結合したｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］の分子モデリングを示す図である。ＩＲ Ｌ１ドメイン（残基Ｇｌｙ５～Ｃｙｓ１５５）およびＩＲ－ＡセグメントＰｈｅ７０５～Ｓｅｒ７１９（ＩＲ－Ａ７０４－７１９）と複合体化したｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］の分子モデル。ＩＲ－Ａ７０４－７１９セグメントを漫画のリボン表現で示し且つ濃い灰色に着色する。ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］Ａ鎖およびＢ鎖を漫画のリボン表現で示し且つ標識を付す。分子表面はｈＩＲ Ｌ１ドメインの分子表面である。この図は、ＴｙｒＢ１５の側鎖が、そうでなければｈＩｎｓ ＬｅｕＢ１５に占められる空間を占めるＤＯＩ－（ＩＲ－Ａ７０４－７１９）－Ｌ１界面の疎水性コアへとどのようにして突出するかを示す。 ｈＩＲの一次結合部位（部位１）を含む構成成分に結合したｈＩｎｓ［ＤＯＩ，ＴｙｒＢ２０］の分子モデリングを示す図である。ＩＲ Ｌ１ドメイン（残基Ｇｌｙ５～Ｃｙｓ１５５）およびＩＲ－Ａ７０４－７１９と複合体化したｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］の分子モデル。この図は、ＴｙｒＢ２０の側鎖がどのようにしてｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４結合部位中に留まり、レセプターとの全ての他の相互作用が天然様に見えるかを示す。ＩＲ－Ａ７０４－７１９セグメントを漫画のリボン表示で示し且つ濃い灰色に着色する。ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］Ａ鎖およびＢ鎖を漫画のリボン表現で示し且つ標識を付す。透明な分子表面はｈＩＲ Ｌ１ドメインの分子表面である。ｈＩＲ Ｌ１ドメインを、Ｔｙｒ６７の側鎖を示した漫画のリボン表現で示す。 ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］の位置走査を示す表である。ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］の各部位での結果としての変異ΔΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）寄与。 ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］の位置走査を示す表である。ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］の各部位での結果としての変異ΔΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）寄与。 ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］の位置走査を示す表である。ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］の各部位での結果としての変異ΔΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）寄与。 インスリン多量体平衡の概要を示す図である。この図は、インスリン単量体化により吸収速度が遅くなることを示す。 ヒトＤＯＩインスリンの化学全合成を示す図である。この図は、ヒトＤＯＩインスリの化学全合成を示す。Ｔｈｒ－Ｓｅｒイソペプチド（赤枠）を使用して、インスリンＡ鎖の溶解性を増加させた。 例示したインスリンアナログによるインスリンシグナル伝達活性化を示す図である。この図は、ｈＩＲ活性化へのＢ１５ ＴｙｒおよびＢ２０ Ｔｙｒの効果を示す。使用した各ペプチドの配列も示す。 例示したインスリンアナログによるインスリンシグナル伝達活性化を示す図である。この図は、ｈＩＲ活性化へのＢ１０ Ｇｌｕ、Ｂ２０ Ｔｙｒの効果を示す。使用した各ペプチドの配列も示す。 例示したインスリンアナログによるインスリンシグナル伝達活性化を示す図である。図２４Ａおよび図２４Ｂはそれぞれ、ペプチド配列／インスリンシグナル伝達の活性化におけるＢ２０残基および改変アミノ酸の効果を示す。 例示したインスリンアナログによるインスリンシグナル伝達活性化を示す図である。この図は、ｈＩＲ活性化へのＡ８ Ｈｉｓ、Ａ９ Ａｒｇの効果を示す。使用した各ペプチドの配列も示す。 例示したインスリンアナログによるインスリンシグナル伝達活性化を示す図である。この図は、ｈＩＲ活性化へのＡ８、Ａ９、Ｂ１０およびＢ２０の個々の効果を示す。 毒液インスリンによるインスリンシグナル伝達活性化を示す図である。この図は、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１と同様の効力を有するいくつかの毒液インスリンのインスリンシグナル活性化を示す（上方のパネル）。これらの毒液インスリンの配列アラインメント（下方のパネル）。Ａ鎖の９位および１０位とＢ鎖の１０位および２０位での残基を強調して表す。γおよび＊は翻訳後改変（それぞれガンマ－カルボキシグルタメートおよびＣ末端アミド化）を表す。
配列表への手掛かり
配列番号１～４１：本開示の実施形態に係るインスリンアナログ、ペプチドおよび／または化合物。
全体的な技術および定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業（例えば、分子遺伝学、薬理学、タンパク質結晶学、タンパク質化学、生化学および同類のもの）者により一般に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
別途指示されない限り、本発明で利用される技術は当業者に公知の標準的な手順である。そのような技術は、下記等の出典における文献全体を通して記載されて説明されている：Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５および１９９６）、ならびにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編集者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までに全ての改訂を含む）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂を含む）。
本明細書全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変形（例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の包含を暗示するが、あらゆる他の要素、整数もしくは工程または要素、整数もしくは工程の群の排除は暗示しないと理解される。
用語「および／または」（例えば「Ｘおよび／またはＹ」）は「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解されるものとし、且つ両方の意味またはいずれかの意味を明示的に支持すると解釈されるものとする。加えて、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途明示されない限り、または文脈から単数形を対象とすることが明らかでない限り、「１つまたは複数」を意味すると概して解釈され得る。
用語「インスリン」は、ヒトインスリン、ブタインスリン、モルモットインスリン、ニワトリインスリン、マウスインスリン、ウシインスリンまたは毒液インスリンを意味する。いくつかの実施形態では、インスリンはヒトインスリンを意味する。用語「毒液インスリン」はイモガイの毒液インスリンを意味する。好ましくは、毒液インスリンはＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を意味する。
用語「インスリンアナログ」は、本明細書で使用される場合、インスリンの活性を模倣し得るあらゆる薬剤を指す。いくつかの実施形態では、インスリンアナログは少なくともインスリンレセプターアゴニストである。いくつかの実施形態では、インスリンアナログはインスリンレセプターに結合する。好ましくは、インスリンアナログは、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはペプチド模倣物であり得る。いくつかの実施形態では、インスリンアナログはペプチドである。当業者が理解するように、別途文脈が示さない限り、用語「インスリンアナログ」、「ペプチド」および「インスリンペプチド」は互換的に使用される。インスリンアナログとして、本明細書で開示された方法により同定されたＩＲアゴニスト、分子、化合物および同類のものも挙げられる。
用語「ペプチド」は、本明細書で使用される場合、２～約５０個のアミノ酸（例えば、４個、６個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個または４５個のアミノ酸の長さ）の範囲のアミノ酸のポリマーを指す。用語ペプチドは、非改変ペプチド、改変ペプチドおよび他の方法で化学的に誘導体化されたペプチド（例えばリン酸化、硫酸化、アミド化および同類のもの）の両方を包含する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｓａｄｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００５）およびＳａｄｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）で説明されたもの等の非天然ペプチドオリゴマーであり得る。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用される場合、約５０個のアミノ酸の全長と比べて概して大きい且つ安定した特徴的な二次構造および三次構造を典型的には有するアミノ酸のポリマーを指す。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、非共有結合的なまたは共有結合的な会合のいずれかを介して生じる安定した三次四次構造と会合するそのようなポリマー（例えば２種以上）の組み合わせも含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、処置する対象中に天然に存在するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、１種または複数種の非天然アミノ酸、改変アミノ酸または合成アミノ酸アナログを含む。そのようなアミノ酸として下記が挙げられるがこれらに限定されない：一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロペンチルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ－メチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎα－メチルアミノ酸および一般のアミノ酸アナログ。同様にこの範囲に含まれるのは、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）／保護（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結等により合成の最中にまたは合成後に差次的に改変されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質である。これらの改変は、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドの安定性および／または生物活性を増加させるのに役立ち得る。
用語アミノ酸「改変」は、アミノ酸の置換またはアミノ酸への／アミノ酸からの化学基の付加および／もしくは除去によるアミノ酸の誘導を指し、ヒトタンパク質中に一般に見出される２０種のアミノ酸のいずれかおよび非定型のまたは天然には存在しないアミノ酸による置換を含む。非定型アミノ酸の商業的供給源として、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、ＣｈｅｍＰｅｐ Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．）およびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）が挙げられる。非定型アミノ酸を商業的供給業者から購入し得る、新規に合成し得る、または天然に存在するアミノ酸から化学的に改変し得る、もしくは誘導体化し得る。
本明細書で使用される場合、アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸残基の異なるアミノ酸残基への置き換えを指す。置換アミノ酸は、ヒトタンパク質中で一般に見出される２０種のアミノ酸のいずれか、ならびに非定型のまたは天然には存在しないアミノ酸であり得る。
用語「Ａ鎖ペプチド」および「Ｂ鎖ペプチド」は、「インスリンＡ鎖ペプチド」および「インスリンＢ鎖ペプチド」と互換性がある。
本明細書で使用される場合、「その誘導体」である化合物への言及は、祖先の化合物から適合されており、または改変されており、祖先の化合物と類似するが新規の構造を有し且つ類似する生物学的活性を有する化合物を指す。いくつかの実施形態では、この祖先の化合物は、本明細書で説明された小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはインスリンアナログである。いくつかの実施形態では、この祖先の化合物は、任意の化学的改変を含むように改変され得るペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはインスリンアナログであり、この化学的改変は、このタンパク質またはペプチドと関連する任意の分子（例えば炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチド）の単一または複数の置換、欠失および／または付加を含む。一実施形態では、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「誘導体」として、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パラミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）／保護（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基の導入、タンパク質分解開裂、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から得られる改変アナログが挙げられる。
本出願全体を通して、文字および数字による特定のアミノ酸位置（例えばＡ５位またはＢ５位）への全ての言及は、コヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）由来の毒液インスリンＣｏｎ－Ｇ１ ＩｎｓのそれぞれのＡ鎖中におけるもしくはＢ鎖中におけるＡ鎖（例えばＡ５位）もしくはＢ鎖（例えばＢ５位）のいずれかの位置でのまたはその任意のアナログ中の対応するアミノ酸位置でのアミノ酸を指す。例えば、さらなる詳述が全くない本明細書での「Ｂ１７位」への言及は、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１が２個の追加のＮ末端のＢ鎖残基を有することから、ヒトインスリンのＢ鎖の対応するＢ１５位を意味するだろう。
本明細書で使用される場合、語句「アミノ酸番号に対応する位置で」は、定義されたアミノ酸配列に関して周囲のアミノ酸と比較したアミノ酸の相対位置を指す。例として、いくつかの実施形態では、ヒトインスリンと比較した場合（図１を参照されたい）、本発明のインスリンアナログのＢ鎖は、例えばＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１中に存在する１個または２個の追加のＮ末端アミノ酸を有し得る。一例では、タンパク質アラインメントを実施すると、当業者は、天然に存在するヒトインスリンのＢ鎖のロイシン（１５番目のアミノ酸）がＢ鎖Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の１７番目のアミノ酸に対応することを容易に理解するだろう（図１を参照されたい）。本発明の好ましい実施形態では、天然に存在するヒトインスリンのＢ鎖の１５番目のアミノ酸は芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基である、および／または天然に存在するヒトインスリンのＢ鎖の２０番目のアミノ酸は芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基である。
用語「単量体インスリン」は、ヒトインスリンと比べて高次の種（例えば二量体、四量体、六量体等）を形成しにくいインスリンおよびインスリンアナログを指す。好ましくは、インスリンまたはインスリンアナログは完全にまたは実質的に単量体であり、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％単量体である。
当業者に理解されるように、用語「治療的」は、疾患もしくは状態を処置し得るまたは疾患もしくは状態と関連する１種もしくは複数種の症状を寛解させ得る処置、治療または薬物を指す。本明細書で使用される場合、治療薬は、タンパク質、ペプチド、核酸（例えばＣｐＧオリゴヌクレオチド）、小分子、ワクチン、アレルギー性抽出物、抗体、遺伝子治療薬、他の生物製剤または小分子が挙げられるがこれらに限定されない治療用化合物を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、インスリン関連障害にかかりやすいあらゆる生物を指す。当業者に理解されるように、用語「対象」および「患者」は互換的に使用され得る。例えば、この対象は、哺乳動物、鳥類、節足動物、脊索動物、両生類または爬虫類であり得る。例示的な対象として下記が挙げられるがこれらに限定されない：ヒト、霊長類、家畜（例えばヒツジ、ウシ、ニワトリ、ウマ、ロバ、ブタ）、コンパニオン動物（例えばイヌ、ネコ）、実験室試験用動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲した野生動物（例えばキツネ、シカ）。一例では、対象は哺乳動物である。一例では、対象はヒトである。
用語「処置する」は、本明細書で使用される場合、特定の障害もしくは状態の予防、または特定の障害もしくは状態と関連する症状の軽減、および／または前記症状の予防もしくは排除を含む。例えば、本明細書で使用される場合、用語「糖尿病を処置する」は概して、血糖値を許容レベル内で維持することを指し、所与の状況に応じて血糖値を増加させるまたは低減させることを含み得る。
当業者が理解するように、インスリンアナログは治療上有効な量で投与されるだろう。用語「有効な量」または「治療上有効な量」は、本明細書で使用される場合、処置される疾患または状態の症状のうちの１つまたは複数をある程度まで軽減するのに十分に投与されるインスリンアナログの量を指す。この結果は、疾患の徴候、症状または原因の低減および／もしくは軽減、または生物学的システムの任意の他の所望の変更であり得る。例えば、１つの症状は高血糖の予防または処置であるだろう。インスリンアナログの「有効な量」は、過度に有害な副作用なしに所望の薬理学的効果または治療上の改善を達成するのに十分な量である。ほんの一例として、治療上有効な量は、用量漸増臨床試験が挙げられるがこれに限定されない日常的な実験により決定され得る。用語「治療上有効な量」として、例えば予防上有効な量が挙げられる。「有効な量」または「治療上有効な量」は、対象の年齢、体重、全身状態のいずれかによる化合物の代謝の変動、処置される状態、処置される状態の重症度、および処方医師の判断に起因して、対象毎に変動し得ることが理解される。そのため、正確な「有効な量」を特定することは必ずしも可能であるとは限らない。しかしながら、任意の個々の場合における適切な「有効な」量は、日常的な実験を使用して当業者により決定され得る。複数種の治療薬を組み合わせて使用する場合、各治療薬の「治療上有効な量」は、単独で使用した場合に治療上有効であるだろう治療薬の量を指し得る、または１種もしくは複数種の追加の治療薬との組み合わせにより治療上有効である低減量を指し得る。
活性の用語「発現」は、本明細書で使用される場合、インスリンが血流に到達して血糖値を下げ始める前の時間の長さを指し、「ピーク」はインスリンアナログが血糖値を最も低下させる期間を指し、「持続時間」は、インスリンが作用し続ける（即ち血糖値を下げ続ける）期間がどれくらいかを指す。当業者は、インスリンアナログの発現、ピークおよび持続期間が因子（例えば患者、患者の状態、および投与経路）に応じて変動し得ることを気付いているだろう。
用語「ＩＲ」は、本明細書で使用される場合、野生型ＩＲおよびそのバリアント（例えば対立遺伝子バリアント）、ならびに天然に存在する変異および遺伝子操作されたバリアントを含む。ＩＲが本明細書で具体的に開示されていない他の種に由来し得ることは当業者に容易に明らかであるだろう。さらに、原始的生物から哺乳動物およびヒトまでのＩＲ配列の既知の保存を前提として、当業者は、そのような他の適切なＩＲの同定に困難を伴わないであろう。
毒液インスリン結晶
一態様では、本発明は、毒液インスリンを含む結晶を提供する。本明細書で使用する場合、用語「結晶」は、平面が一定の角度で交差し且つ構成する化学種の規則的な構造（例えば内部構造）が存在する構造（例えば三次元（３Ｄ）固体凝集体）を意味する。用語「結晶」は、実験的に調製された結晶等の固体の物理的結晶形態を特に指す。
本発明に係る結晶を、コヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）およびコヌス・トゥリパ（Ｃｏｎｕｓ ｔｕｌｉｐａ）等のコヌス（Ｃｏｎｕｓ）属の生物由来の毒液インスリンを使用して調製し得る。いくつかの実施形態は、コヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）の毒液由来のインスリンに関する。しかしながら、この毒液インスリンは他の種にも由来し得る。典型的には、このインスリンは、２０個のアミノ酸のＡ鎖と２３個のアミノ酸のＢとを含むが、これらＡ鎖およびＢ鎖の長さは変動し得る。Ａ鎖およびＢ鎖のアミノ酸は翻訳後改変されてもよく、翻訳後改変の例として下記が挙げられるがこれらに限定されない：グルタミン酸がγ－カルボキシル化グルタミン酸（コンジュゲート塩基ガンマカルボキシグルタメートとも称される）に置き換えられ得ること、プロリンがヒドロキシプロリンに置き換えられ得ること、Ｃ末端がアミド化され得ること、システインがセレノシステインに置き換えられ得ること。当業者は他の翻訳後改変が可能であることを認識するだろう。
好ましい実施形態では、この毒液インスリンはＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１であり且つ下記に示す配列を有し：
Ａ鎖：ＧＶＶｙＨＣＣＨＲＰＣＳＮＡＥＦＫＫＹＣ＊（配列番号２２）
Ｂ鎖：ＴＦＤＴＯＫＨＲＣＧＳｙＩＴＮＳＹＭＤＬＣＹＲ（配列番号２３）
これらの配列中、ｙはγ－カルボキシル化グルタミン酸であり、Ｏはヒドロキシプロリンであり、＊Ａ鎖のＣ末端はアミド化されている。しかしながら、このインスリンポリペプチドはまた、他の種から得られてもよいし非天然の設計された配列であってもよい。
結晶を野生型配列またはそのバリアント（例えば、天然に存在する変異および遺伝子操作されたバリアント）で構築し得る。典型的には、バリアントは、対応する野生型毒液インスリンと少なくとも９０、９５または９８％の配列同一性を有する。
毒液インスリンを含む結晶の作製を下記に説明する。
好ましい実施形態では、本発明は、あらゆる格子寸法において変動が最大約２％であるａ＝ｂ＝ｃ＝７４．９１Åの単位格子寸法を有する空間群Ｐ４３２を有するＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結晶を提供する。
好ましい実施形態では、毒液インスリンを含む結晶は付録Ｉに記載した原子座標を有する。本明細書で使用する場合、用語「原子座標」は、軸系を参照して１個または複数個の原子の位置を定義する一連の値を指す。原子座標を、これから導き出されるモデルの正確さに大きく影響を及ぼすことなく変化させ得ることを当業者は理解し、そのため、本発明は好ましい原子構造の非常に正確な定義を提供するが、小さい変化が想定され、特許請求の範囲はそのような変化を包含することを意図されていることが理解されるだろう。水素以外の全ての主鎖原子に関するｘ座標、ｙ座標およびｚ座標の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）が付録Ｉに記載の座標と比較して２．０Å未満（好ましくは１．５Å、１．３Å、１Å、０．７Å未満または０．３Å未満）であるバリアントが好ましい。原子座標の３Ｄ剛体回転および／または並進は関連する分子の構造を変更しないことが当業者に容易に認識されるだろう。
毒液インスリンの結晶構造
さらなる態様では、毒液インスリンまたはその領域の結晶構造も提供される。いくつかの実施形態では、この毒液インスリンはＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１である。いくつかの実施形態では、毒液インスリンの結晶構造は、付録Ｉの原子座標で定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の構造である。
毒液インスリンに関して実験的に得られた原子座標を付録Ｉに示す。しかしながら、当業者は、Ｘ線結晶学により決定された一連の原子座標に標準誤差がないわけではないことを認識するだろう。従って、付録Ｉで列挙された原子座標上で（主鎖原子を使用して）重ねた場合に０．７５Å未満のタンパク質主鎖原子の平均二乗偏差を有する毒液インスリンに関する任意の組の構造座標は同一と見なすものとする。
本発明はまた、付録Ｉで列挙された原子座標に実質的に一致する毒液インスリンの原子座標も含む。所与の組の原子座標に「実質的に一致する」構造は、そのような構造の少なくとも約５０％が各ドメイン中の二次構造要素の主鎖原子に関して約２．０Å未満のＲＭＳＤを有する構造であり、好ましくは各ドメイン中の二次構造要素の主鎖原子に関して約１．５Å未満のＲＭＳＤを有する構造であり、より好ましくは各ドメイン中の二次構造要素の主鎖原子に関して約１．３Å未満（好ましさがより高くなると約１．０Å未満、約０．７Å未満、約０．５Å未満）のＲＭＳＤを有する構造であり、最も好ましくは各ドメイン中の二次構造要素の主鎖原子に関して約０．３Å未満のＲＭＳＤを有する構造である。
より好ましい実施形態では、所与の組の原子座標に実質的に一致する構造は、そのような構造の少なくとも約７５％が列挙のＲＭＳＤ値を有する構造であり、より好ましくはそのような構造の少なくとも約９０％が列挙のＲＭＳＤ値を有する構造であり、最も好ましくはそのような構造の約１００％が列挙のＲＭＳＤ値を有する構造である。
さらにより好ましい実施形態では、「実質的に一致する」の上記の定義を、アミノ酸側鎖の原子を含むように拡張し得る。本明細書で使用される場合、語句「共通のアミノ酸側鎖」は、所与の組の原子座標に実質的に一致する構造とそのような原子座標により実際に表される構造との両方に共通するアミノ酸側鎖を指す。
ポリペプチドに関する一組の原子座標は三次元での形状を定義する点の相対的な組であることが認識されるだろう。そのため、全く異なる組の座標が類似のまたは同一の形状を定義する可能性があり得る。さらに、個々の座標のわずかな変動は全体形状にほとんど影響を及ぼさないだろう。
座標の変動は構造座標の数学的操作に起因して生じる場合がある。例えば、付録Ｉに記載された構造座標を、この構造座標の結晶学的並べ替え、この構造座標の細分化、この構造座標の組への整数の加算もしくは減算、この構造座標の反転またはこれらの任意の組み合わせにより操作する可能性がある。
あるいは、アミノ酸の変異、付加、置換および／もしくは欠失、または結晶を構成する構成要素のうちのいずれかの他の変化に起因する結晶構造の改変が構造座標の変動を説明する可能性もある。
様々なコンピュータ解析を使用して、分子複合体またはその一部が上記で説明した毒液インスリンの構造の全てまたは一部と十分に類似するかどうかを決定する。そのような解析を、当業者に既知のソフトウェア（例えばＰＤＢｅＦＯＬＤ（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ ａｎｄ Ｈｅｎｒｉｃｋ，２００４）、ＤＡＬＩ（Ｈｏｌｍ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｓｔｒｏｅｍ，２０１０）、ＬＳＱＭＡＮ（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，１９９４）およびＣＨＩＭＥＲＡ（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００４）を使用して実行し得る。
比較は概して、指定の対の等価原子全体にわたるフィットの平均二乗偏差が絶対最小値であるように必要とされる最適な並進および回転の算出を含む。この数はオングストロームで付与される。従って、本発明の範囲内の毒液インスリンの構造座標は、全身の並進および／または回転により付録Ｉに列挙された原子座標に関連する構造座標を含む。従って、上記で列挙されたＲＭＳＤ値は、少なくとも構造の主鎖原子が最適に重ねられていると仮定し、ＲＭＳＤ値を算出するのに必要とされる最適なフィットを達成するために並進および／または回転を必要とする場合がある。
いくつかの実施形態では、付録Ｉで列挙された前記原子座標のサブセットおよびこのサブセットに実質的に一致するサブセットも提供される。好ましいサブセットは、毒液インスリンの１つまたは複数の領域（例えば、（ｉ）Ａ鎖、（ｉｉ）Ｂ鎖、（ｉｉｉ）疎水性コア（例えばＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１では、この疎水性コアは残基ＶａｌＡ２、ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ１１、ＰｈｅＡ１６、ＴｙｒＡ１９、ＡｒｇＢ６、ＩｌｅＢ１１、ＴｙｒＢ１５およびＬｅｕＢ１８の側鎖を含む）、（ｉｖ）ＰＴＭおよびこのＰＴＭと相互作用する残基、（ｖ）レセプター結合表面（例えばＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＩＲ結合表面）；（ｖｉ）ＴｙｒＢ１５およびＴｙｒＢ１５と相互作用する残基；（ｖｉｉ）ＴｙｒＢ２０およびＴｙｒＢ２０と相互作用する残基；（ｖｉｉｉ）ＰｈｅＡ１６およびＰｈｅＡ１６と相互作用する残基、（ｉｘ）それぞれのＡ鎖末端のすぐ近くの残基のサブセット）を画定する。
例えば下記のデータに由来する情報を使用して、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ Ｈｏｍｏｌｏｇｙソフトウェアパッケージ（Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（９７．０），ＭＳＩ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）により実行されるように、特定の組の原子座標に実質的に一致する毒液インスリンまたはその領域の三次元構造を適切なモデリングコンピュータプログラム（例えばＭＯＤＥＬＥＲ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，１９９３））によりモデル化し得る：（１）この毒液インスリンのアミノ酸配列；（２）三次元立体配置を有する特定の組の原子座標により表されるタンパク質の関連部分のアミノ酸配列、および（３）特定の三次元立体配置の原子座標。特定の組の原子座標に実質的に一致する毒液インスリンの三次元構造を分子の置き換え等の方法によっても算出し得、この方法を下記で詳細に説明する。
構造座標／原子座標を概して、後続のコンピュータ操作のために機械可読媒体にロードする。そのため、モデルおよび／または原子座標は機械可読媒体（例えば、磁気媒体または光学媒体、およびランダムアクセスメモリまたはリードオンリーメモリ、例えばテープ、ディスケット、ハードディスク、ＣＤ－ＲＯＭおよびＤＶＤ、フラッシュメモリーカードまたはチップ、サーバーおよびインターネット）に有利に保存される。この機械は概してコンピュータである。本発明はまた、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のモデルおよび／または原子座標を表すデータが記録されているコンピュータ可読媒体も提供する。同様に提供されるのは、付録Ｉに係る座標データまたはいずれかのそのサブセットが記録されているコンピュータ可読媒体であって、前記座標データはＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１またはＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の領域の三次元構造を定義する、コンピュータ記録媒体である。
本発明はまた、付録Ｉで示される一連の原子座標またはいずれかのそのサブセットであって、前記座標は毒液インスリンの三次元構造を定義する、一連の原子座標またはいずれかのそのサブセットも提供する。構造座標／原子座標をコンピュータで使用して、コンピュータにより示され得るおよび／または電子ファイル中に表され得るイモガイインスリン結晶の三次元構造の画像（例えばイメージ）を作成し得る。
構造座標／原子座標およびそれらに由来するモデルを様々な目的（例えば、創薬、生物学的試薬（結合タンパク質）の選択および他のタンパク質結晶のＸ線結晶学的解析）にも使用し得る。一態様では、構造モデルとしてのＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の構造の使用が提供される。いくつかの実施形態では、この構造モデルはインスリンアナログの同定に使用され得る。本発明はまた、構造モデルとしてＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の構造を使用して同定したインスリンアナログも包含する。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１またはその領域の三次元構造を使用して、薬物設計にならびにＩＲと相互作用するおよび／またはＩＲを調節する候補化合物のインシリコでのスクリーニングに有用なモデルを開発し得る。このモデルの開発では他の物理化学的特徴（例えば結合、静電気等）も使用し得る。
一般に、用語「インシリコ」はコンピュータメモリ中での作成を指し、即ち、シリコン上でのまたは他の同様のチップ上での作成を指す。別途述べない限り、「インシリコ」は「仮想的」を意味する。本明細書で使用される場合、用語「インシリコ」は、インビトロまたはインビボでの実験よりはむしろコンピュータモデルの使用に基づくスクリーニング方法を指すことを意図されている。
分子の置き換え
本明細書で提供されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結晶構造を使用して、分子の置き換えを使用して新規の結晶の構造もモデル化／解明し得る。
いくつかの態様では、本発明はまた、構造モデルとしての毒液インスリンの構造またはそのサブセットの使用も提供する。
いくつかの実施形態では、付録Ｉに記載されたもの等の毒液インスリンの原子座標または毒液インスリンの領域の原子座標を使用して、毒液インスリンに類似する少なくともいくつかの構造的特徴を含む分子複合体の三次元構造の少なくとも一部を決定し得る。具体的には、別の結晶化毒液インスリンまたはインスリンアナログについての構造情報を得ることができる。このことを、分子の置き換え等の多くの公知の技術のいずれかにより達成し得る。
分子の置き換えの方法（例えばＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．２００７））は概して当業者に既知である。分子の置き換えの方法は概して、Ｂｒｕｎｇｅｒ，１９９７；Ｎａｖａｚａ ａｎｄ Ｓａｌｕｄｊｉａｎ，１９９７；Ｔｏｎｇ ａｎｄ Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９９７；Ｂｅｎｔｌｅｙ，１９９７；Ｌａｔｔｍａｎ，１９８５；Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９７２で説明されている。
一般に、Ｘ線回折データは、結晶化した標的構造の結晶から収集される。このＸ線回折データを変換してＰａｔｔｅｒｓｏｎ関数を算出する。この結晶化した標的構造のＰａｔｔｅｒｓｏｎ関数を、既知の構造（本明細書では検索構造と称される）から算出されたＰａｔｔｅｒｓｏｎ関数と比較する。この結晶化した標的構造のＰａｔｔｅｒｓｏｎ関数を検索構造のＰａｔｔｅｒｓｏｎ関数に対して回転させて、結晶中の結晶化した標的構造の正しい配向を決定する。次に、並進関数を算出して、結晶軸に対する標的構造の位置を決定する。この結晶化した標的構造が単位格子内に正しく配置されると、実験データの初期位相を算出し得る。この位相は、構造の差違を観測し得る電子密度マップの算出および構造の精密化に必要である。好ましくは、検索分子の構造的特徴（例えばアミノ酸配列、保存されたジスルフィド結合、およびベータ－ストランドまたはベータ－シート）は、この結晶化した標的構造に関連している。
次に、この電子密度マップを、未知の結晶化した分子複合体の最終的で正確な構造を生成するために、任意の公知のモデル構築および構造精密化技術に供し得る（例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｂｒｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８を参照されたい）。
分子の置き換え以外の方法により位相の正確な値を得ることは、近似および精密化の反復サイクルを含む時間のかかるプロセスであり、結晶構造の解明を大きく妨げる。しかしながら、少なくとも相同部分を含むタンパク質の結晶構造が解明されると、既知の構造からの位相は、未知の構造に関する位相の満足のいく推定を可能にする。分子の置き換えを使用することにより、本明細書で提供された（および付録Ｉで記載された）毒液インスリンの構造座標の全てまたは一部を使用して、最初からそのような情報を決定しようとする試みと比べて迅速且つ効率的に、構造が未知である結晶化した分子／分子複合体の構造を決定し得る。
この方法により、毒液インスリンの任意の部分と十分に相同である任意の結晶化した分子／分子複合体の任意の部分の構造を解明し得る。この方法は、本明細書で説明された方法を使用して設計されたインスリンアナログの構造の決定で特に有用である。
本明細書で言及された分子／分子複合体の全ては公知のＸ線回折技術を使用して研究され得、１．５～３．５Åの分解能のＸ線データに対してコンピュータソフトウェア（例えば、Ｘ－ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．により配布されている；Ｂｒｕｅｎｇｅｒ，１９９６を参照されたい）、ＲＥＦＭＡＣ（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９７）、ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）およびＢＵＳＴＥＲ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄにより配布されている、Ｂｒｉｃｏｇｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１１））を使用して約０．２５以下のＲ値に精密化され得る。そのため、この情報を使用して既知のインスリンアナログを最適化し得、より重要なことに、新規のまたは改善されたインスリンアナログを設計し得る。
毒液インスリンを結晶化する方法
本発明はまた、毒液インスリンを含む結晶を作製する方法も提供する。本明細書で開示された毒液インスリンの結晶形を下記の結晶化方法により得ることができる。
一態様では、本発明は、毒液インスリンを結晶化する方法であって、
（ａ）毒液インスリンの水溶液を準備する工程、
（ｂ）任意選択で、工程（ａ）の溶液を濃縮する工程、および
（ｃ）この毒液インスリンの最終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲であるように工程（ａ）または工程（ｂ）の溶液を沈殿剤溶液で希釈する工程
を含む方法を提供する。
工程（ａ）で準備される毒液インスリンの水溶液は緩衝化されていてもよいし緩衝化されていなくてもよい。当業者に既知の任意の適切な緩衝液を使用し得る。毒液インスリン溶液用の非限定的な例として、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、リン酸ナトリウムおよびトリエタノールアミノ緩衝液が挙げられる。所望のｐＨ値が得られない場合、塩基または酸（例えば、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは塩酸）の添加によるｐＨの調整を実施し得る。好ましくは、工程（ａ）の溶液は１０ｍＭ ＨＣｌを含む。
任意選択で、次いでこの溶液を任意選択的に濃縮し得る。いくつかの実施形態では、この溶液を遠心ろ過により濃縮する。しかしながら、当業者に既知の任意の適切な技術を使用し得る。濃縮工程（ｂ）の後、毒液インスリンの濃度は１．０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの範囲であるべきである。好ましくは、この毒液インスリンの濃度は約４．０ｍｇ／ｍＬである。これは、工程（ｃ）の緩衝化沈殿剤溶液による希釈前の工程（ｂ）の最後での毒液インスリンの濃度である。工程（ｂ）の濃縮溶液中のまたは工程（ｂ）の濃縮の最中のまたは工程（ｂ）の濃縮後の毒液インスリンの濃度を、例えばＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイによりまたはＵＶ吸光度分光法等の他の常法により決定する可能性がある。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）の溶液に沈殿剤溶液を添加する。好ましくは、工程（ｂ）の溶液を１：４～４：１（工程（ｂ）の溶液：緩衝化沈殿剤溶液）の比で沈殿剤溶液により希釈し、より好ましくは１：１の比で沈殿剤溶液により希釈する。
この沈殿剤溶液は、少なくとも１種の小さい有機両親媒性分子および／または少なくとも１種の無機塩を含み得る。いくつかの実施形態では、この小さい有機両親媒性分子は、下記を含むまたは下記からなる群から選択され得る：グリセロール、エチレングリコール、ブチルエーテル、ベンズアミジン、ジオキサン、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、ペンタノール、メチルペンタンジオール、ペンタンジオール、ヘキサンジオール、ヘプタントリオール、ジチオスレイトール、ＭＥＳ、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ－ＨＣＩ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、イミダゾール、ビシン、トリメチルアミンＮ－オキシド、コハク酸、ＤＬ－マレート、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳ、グリシン、ＣＡＰＳＯ、ＡＤＡ、ＭＯＰＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓプロパン、ＳＰＧ、ＭＩＢ、ＰＣＢ、ＭＭＴ、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、ＴＲＩＳ、スクロースおよびこれらの組み合わせ。好ましい実施形態では、この小さい有機両親媒性分子はＤＬ－マレート、ＴＲＩＳおよびＭＥＳを含む。いくつかの実施形態では、この小さい有機両親媒性分子は緩衝液として作用し得る。いくつかの実施形態では、溶液中のこの小さい有機両親媒性分子のｐＨを約２．０～約１１．０に調整し得、例えば２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５および１１．０の間の任意のｐＨに調整し得る。いくつかの実施形態では、このｐＨは約８．０～約１０．０である。好ましい実施形態では、このｐＨは９．０である。
いくつかの実施形態では、この沈殿剤溶液中の全ての小さい有機両親媒性分子の量は、この緩衝化沈殿剤溶液の総重量に対して１重量／体積％～５０重量／体積％の小さい有機両親媒性分子であり、好ましくは５重量／体積％～２０重量／体積％の小さい有機両親媒性分子であり、より好ましくは８重量／体積％～１２重量／体積％の小さい有機両親媒性分子である。好ましい実施形態では、この緩衝化沈殿剤溶液は１０重量／体積％の小さい有機両親媒性分子を含む。
用語「少なくとも１種の小さい有機両親媒性分子」は、前述の小さい有機両親媒性分子の混合物を使用し得ることを意味する。小さい有機両親媒性分子の混合物を使用する場合、使用される量は、合わせた全ての小さい有機両親媒性分子の総量を指す。
この沈殿剤溶液は無機塩も含み得る。いくつかの実施形態では、この無機塩は、下記を含むまたは下記からなる群から選択される：塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、フッ化アンモニウム、臭化アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、窒化アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カドミウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化セシウム、硫酸セシウム、塩化コバルト、塩化鉄、酢酸リチウム、塩化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチウム、酢酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、塩化ニッケル、酢酸カリウム、臭化カリウム、フッ化カリウム、ギ酸カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、チオシアン酸カリウム、酒石酸カリウム／ナトリウム、酢酸ナトリウム、臭化ナトリウム、フッ化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、塩化マグネシウム、塩化ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸カリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、ギ酸アンモニウム、酒石酸二アンモニウム、マロン酸ナトリウム、酒石酸二ナトリウム、コハク酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムならびにこれらの組み合わせ。好ましい実施形態では、この無機塩は硫酸アンモニウムである。
いくつかの実施形態では、この沈殿剤溶液中の少なくとも１種の無機塩の量は約５０ｍＭ～約４０００ｍＭであり、約１０００ｍＭ～約３０００ｍＭであり、約１５００ｍＭ～約２５００ｍＭまたは約２０００ｍＭである。複数種の無機塩が使用される場合、前述の濃度は、合わせた全ての無機塩の濃度を指し、無機塩の混合物で使用される各単一の塩の濃度を指すものではない。
いくつかの実施形態では、この沈殿剤溶液を緩衝化し得る。人に知られているあらゆる緩衝液を使用し得る。いくつかの実施形態では、この緩衝液は、クエン酸、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、カコジル酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳナトリウム、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、リンゴ酸ナトリウム、ＭＥＳナトリウムおよび同類のものならびにこれらの組み合わせを含む、またはからなる。いくつかの実施形態では、この沈殿剤溶液はｐＨが約２．０～約１１．０であり得、例えば２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５および１１．０の間の任意のｐＨであり得る。いくつかの実施形態では、この沈殿剤溶液はｐＨが約８．０～約１０．０であり得る。好ましい実施形態では、この沈殿剤溶液はｐＨが９．０であり得る。
いくつかの実施形態では、この緩衝化沈殿剤溶液は、１Ｍ超の少なくとも１種の無機塩および／または５重量％～２０重量％の少なくとも１種の小さい有機両親媒性分子を含む。好ましい実施形態では、この沈殿剤溶液は２．０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０％ ＤＬ－リンゴ酸塩－ＭＥＳ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含む。
理論上、工程（ｃ）の希釈溶液中の少なくとも１種の沈殿剤は水に関してタンパク質分子と競合し、そのため、このタンパク質が過飽和となる。結晶は通常、過飽和状態からのみ成長するため、沈殿物から結晶が成長し得る。塩、ポリマーおよび有機溶媒は適切な沈殿剤である。上記で列挙した緩衝化沈殿剤溶液の成分に加えて、工程（ｃ）の溶液はさらなる沈殿剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、結晶化に懸滴法（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｍｅｔｈｏｄ）または座滴法（ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐ ｍｅｔｈｏｄ）を使用する。「懸滴蒸気拡散」技術は高分子の結晶化にとって最も一般的な方法である。この方法より、試料および試薬の混合物で構成された液滴を試薬の液体リザーバーにより蒸気平衡に置く。典型的には、この液滴はこのリザーバーと比べて低い試薬濃度を含む。平衡を達成するために、この液滴から水蒸気が離れ、最終的にはリザーバーに入る。この液滴から水が離れるにつれて、試料は相対的な過飽和の増加を受ける。水が液滴からリザーバーへと離れるにつれて、試料および試薬の両方は濃度が増加する。液滴中の試薬濃度がリザーバー中の試薬濃度とほぼ同一である場合に平衡に達する。
インスリンアナログ
野生型インスリンはＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを含む。野生型ヒトインスリンＡ鎖は配列ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号２４）で表される。野生型ヒトインスリンＢ鎖は配列ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２５）で表される。
本発明者らは、ヒトインスリンの芳香族トリプレットＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６に相当するものを欠く単量体インスリンであるＣｏｎ－Ｇ１ Ｉｎｓの三次元構造を決定している。理論に拘束されることを望まないが、ＴｙｒＢ１５の側鎖はＩＲ会合に関して重要なヒトインスリンＰｈｅＢ２４の欠如を補償し得ると考えられる。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ２０の側鎖がヒトインスリンＰｈｅＢ２４に相当するものの欠如の補償に関与し得るとも考えられる。これらの残基の潜在的重要性を、配列分析に基づいて予測し得なかった。本明細書に記載されている構造上の発見は、本質的に単量体であり且つ即時作用性である新規クラスの治療用ヒトインスリンアナログの設計のためのプラットフォームを提供する。
一態様では、本発明は、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを含むインスリンアナログであって、このＢ鎖は、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、このアナログは、ヒトインスリン中に見出される少なくとも１個のアミノ酸を含むがコヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）インスリンの対応する位置では欠いており、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは少なくとも１対のシステイン残基を介して互いに結合している、インスリンアナログを提供する。いくつかの実施形態では、この芳香族残基または大きい脂肪族残基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸であり得る。
インスリン－ＩＲ複合体の共結晶構造から、ＰｈｅＢ２４の側鎖が、ＩＲおよびインスリンＢ鎖により定義される無極性ポケット（Ｂ２４関連結合ポケットと称される）内の「アンカー」として独自の役割を果たすことが明らかになった（Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）。理論に拘束されることを望まないが、本発明は、ヒトインスリンのＢ鎖の１５位および／または２０位での大きい脂肪族置換または芳香族置換が、Ｂ２４関連結合ポケット中での挿入によりＰｈｅＢ２４の欠如を補償し得ることを想定する。大きい脂肪族残基または芳香族残基の側鎖はＢ２４関連結合ポケットと物理的におよび化学的に適合し得ると考えられる。
いくつかの実施形態では、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置での芳香族残基または大きい脂肪族残基は、チロシン、フェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、シクロペンチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置での芳香族残基または大きい脂肪族残基は、チロシン、フェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、シクロペンチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンからなる群から選択される。この芳香族残基または大きい脂肪族は天然アミノ酸であってもよいし非天然アミノ酸であってもよい。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置で芳香族残基を含む、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置で芳香族残基を含む。この芳香族残基は天然アミノ酸であってもよいし非天然アミノ酸であってもよい。例えば、この芳香族アミノ酸は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、４－アセチルフェニルアラニンおよび同類のものであり得る。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でチロシンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置でチロシンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でチロシンを有する、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置でチロシンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でフェニルアラニンを有する、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置でフェニルアラニンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でトリプトファンを有する、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置でトリプトファンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置で４－アセチルフェニルアラニンを有する、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置で４－アセチルフェニルアラニンを有する。
いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置で大きい脂肪族残基を含む、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置で大きい脂肪族残基を含む。本明細書で使用される場合「大きい脂肪族」残基は、ロイシン（１５位および２０位にてヒトインスリン中で天然に存在する）側鎖と比べて大きい側鎖を有する。例えば、いくつかの実施形態では、大きい脂肪族残基の側鎖は、ロイシンと比較して同数のまたはより多くの非水素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、大きい脂肪族残基の側鎖はロイシンと比較した場合に大きい側鎖体積を有する。いくつかの実施形態では、大きい脂肪族残基の側鎖はロイシンと比較した場合に分子量が大きい。いくつかの実施形態では、大きい脂肪族残基の側鎖はロイシンと比較した場合に立体配座の柔軟性が高い。「大きい脂肪族」残基は天然アミノ酸であってもよいし非天然アミノ酸であってもよい。例えば、大きい脂肪族残基は、メチオニン、イソロイシン、シクロペンチルアラニンまたはシクロヘキシルアラニンおよび同類のものであり得る。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でメチオニンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置でメチオニンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でシクロヘキシルアラニンを有する、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置でシクロヘキシルアラニンを有する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置でシクロペンチルアラニンを有する、および／またはヒトインスリンのＢ鎖の２０位に対応する位置でシクロペンチルアラニンを有する。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ＩＲ結合に必須であると考えられる芳香族トリプレットＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６を欠く改変Ｂ鎖を有し、且つほとんどの場合ではヒトインスリンと比較して短いＢ鎖を有する。いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンと比較した場合にＣ末端でトランケートされている。いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンの９個のＣ末端アミノ酸のうちの１個または複数個を欠いており、例えば、このＢ鎖は、ヒトインスリンの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個のＣ末端アミノ酸を欠いている。いくつかの実施形態では、このＢ鎖は、ヒトインスリンのＰｈｅＢ２４を少なくとも欠いている。いくつかの実施形態では、このＢ鎖はヒトＢ鎖芳香族トリプレット（ヒトインスリンのアミノ酸ＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６）を少なくとも欠いている。これらの残基は存在しなくてもよいし、ヒトインスリンのＢ酸のアミノ酸番号２４、２５および／または２６に対応する位置でのアミノ酸がそれぞれフェニルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンではないように置換されていてもよい。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－ＸＡ３－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－ＸＡ１２－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－ＸＡ１６－ＸＡ１７－ＸＡ１８－ＸＡ１９－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１－ＸＡ２２－ＸＡ２３－ＸＡ２４－ＸＡ２５－ＸＡ２６－ＸＡ２７－ＸＡ２８－ＸＡ２９－ＸＡ３０－ＸＡ３１－ＸＡ３２－ＸＡ３３－ＸＡ３４（この配列中、ＸＡ２＝ＶａｌまたはＩｌｅ；ＸＡ３＝ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＡ４＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ガンマカルボキシグルタメートまたはＣｙｓ；ＸＡ５＝Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＨｉｓまたはＶａｌ；ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＡ１１は独立してＣｙｓまたはセレノシステインであり；ＸＡ８＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＶａｌ；ＸＡ９＝Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ；ＸＡ１０＝Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒ；ＸＡ１２＝ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＡ１３＝Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＡｓｐ；ＸＡ１４＝Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＸＡ１５＝Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；ＸＡ１６＝Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＡｌａ；ＸＡ１７＝Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒ；ＸＡ１８＝Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＸＡ１９＝ＴｙｒまたはＰｈｅ；ＣｙｓＡ２０＝Ｃｙｓ、セレノシステイン、アミド化Ｃｙｓまたはアミド化セレノシステイン；ＸＡ２１＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａまたは存在せず；ＸＡ２２＝Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２３＝Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２４＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＡ２６＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２７～ＸＡ３１は独立してＳｅｒであり、または存在せず；ＸＡ３２＝Ａｌａ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ３３＝Ａｌａ、Ｖａｌまたは存在せず；ならびにＸＡ３４＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号１）を含むＡ鎖ペプチドと、
配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９
（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、ＬｅｕまたはＧｌｙ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、アミド化Ｈｉｓ、アミド化Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号２）
を含むＢ鎖ペプチドと
を含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号３）を含むＢ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ならびにＸＢ２４、ＸＢ２５、ＸＢ２６、ＸＢ２７、ＸＢ２８、ＸＢ２９、ＸＢ３０、ＸＢ３１、ＸＢ３２、ＸＢ３３、ＸＢ３４、ＸＢ３５、ＸＢ３６、ＸＢ３７、ＸＢ３８およびＸＢ３９は存在しない）（配列番号４）を含むＢ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号５）を含むＢ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝ＨｉｓまたはＴｙｒ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝ＶａｌまたはＬｅｕ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号６）を含むＢ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎ；ＸＢ７＝ＨｉｓまたはＴｙｒ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１３＝Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＰｒｏまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝Ｇｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１６＝Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＴｙｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＭｅｔまたはＶａｌ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＬｙｓ；ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＣｙｓＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝ＴｙｒまたはＧｌｙ；およびＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙまたは存在しない）（配列番号７）を含むＢ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ、ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号８）を含むＢ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ＸＢ１７位およびＸＢ２２位での残基はチロシンである。いくつかの実施形態では、ＸＢ２２はＴｙｒである。いくつかの実施形態ではＸＢ１７はＴｙｒである。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－ＸＡ３－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－ＸＡ１２－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－ＸＡ１９－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１－ＸＡ２２－ＸＡ２３－ＸＡ２４－ＸＡ２５－ＸＡ２６－ＸＡ２７－ＸＡ２８－ＸＡ２９－ＸＡ３０－ＸＡ３１－ＸＡ３２－ＸＡ３３－ＸＡ３４（この配列中、ＸＡ２＝ＶａｌまたはＩｌｅ；ＸＡ３＝ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＡ４＝Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメートまたはＣｙｓ；ＸＡ５＝Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＨｉｓまたはＶａｌ；ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＡ１１は独立してＣｙｓまたはセレノシステインであり；ＸＡ８＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＶａｌ；ＸＡ９＝Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓ；ＸＡ１０＝Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒ；ＸＡ１２＝ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＡ１３＝Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＡｓｐ；ＸＡ１４＝Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＸＡ１５＝Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；またはＡｌａ；ＸＡ１７＝Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒ；ＸＡ１８＝Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＸＡ１９＝ＴｙｒまたはＰｈｅ；ＣｙｓＡ２０＝Ｃｙｓ、セレノシステイン、アミド化Ｃｙｓまたはアミド化セレノシステイン；ＸＡ２１＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａまたは存在せず；ＸＡ２２＝Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２３＝Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２４＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＡ２６＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２７～ＸＡ３１は独立してＳｅｒであり、または存在せず；ＸＡ３２＝Ａｌａ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ３３＝Ａｌａ、Ｖａｌまたは存在せず；ならびにＸＡ３４＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号９）を含むＡ鎖ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－ＸＡ１６－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１６はＰｈｅまたはＬｅｕであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１０）を含むＡ鎖ペプチドと、
配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝ＧｌｙまたはＴｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１１）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１２）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－Ｔｙｒ－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１３）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１４）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－Ｉｌｅ－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－Ｌｅｕ－ＣｙｓＢ２１－Ｔｙｒ－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１５）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号２６）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－Ｔｙｒ－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝ＧｌｙまたはＴｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号２７）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号２８）を含むＡ鎖ペプチドと、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－Ｉｌｅ－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－Ｔｙｒ－ＸＢ１８－ＸＢ１９－Ｌｅｕ－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２２＝ＧｌｙまたはＴｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ（配列番号２９）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１６）を含むＡ鎖ペプチドと、配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号１７）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１８）を含むＡ鎖ペプチドと、配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号１９）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号２０）を含むＡ鎖ペプチドと、配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号２１）を含むＢ鎖ペプチドとを含む。
ＩＲに対するこのアナログの親和性を増加させるヒトインスリンの多くの改変が既に同定されている。例えば、ヒトインスリンのＴｈｒＡ８をヒスチジンに置き換えることにより、ＩＲに対する親和性が３倍増加する（Ｇｌｅｎｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．（２０１１）。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、ヒトインスリンのＴｈｒＡ８に対応する位置でヒスチジン残基を有する。
このインスリンアナログは、１個または複数個の非天然アミノ酸、改変アミノ酸または合成アミノ酸アナログを含み得、これらのうちのいくつかを本明細書中に配列で示す。例えば、そのようなアミノ酸として下記が挙げられるがこれらに限定されない：
一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ガンマカルボキシグルタメート、ヒドロキシプロリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロペンチルアラニン、セレノシステイン、アミド化システイン、アミド化セレノシステイン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ－メチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎα－メチルアミノ酸および一般のアミノ酸アナログ。同様にこの範囲に含まれるのは、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）／保護（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結等により合成の最中にまたは合成後に差次的に改変されるペプチドである。
本明細書で開示されているように、ＰＴＭを含むＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の合成アナログは、ＰＴＭフリーのアナログと比べてヒトＩＲ－Ｂに対する活性が４倍高かった（実施例を参照されたい）。いくつかの実施形態では、例えば様々なＡ鎖のＸＡ４またはＸＡ５ Ｇｌｕ位で、またはいくつかのＢ鎖のＸＢ１２ Ｇｌｕ位で、１個または複数個のＧｌｕ残基をガンマ－カルボキシグルタメート（Ｇｌａ）に置き換え得る。いくつかの実施形態では、例えばある特定のＢ鎖のＸＢ５ Ｐｒｏ位で１個または複数個のＰｒｏ残基をヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）に置き換え得る。いくつかの実施形態では、Ｃ末端をアミド化し得、例えば、数ある中でも様々なＡ鎖の末端でＣｙｓ（＊）をアミド化し得る。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは、下記のうちの１つまたは複数を含む：（ｉ）ＸＡ４はガンマカルボキシグルタメートである、ｉｉ）ＸＢ５＝ヒドロキシプロリン、およびｉｉｉ）ＸＢ１２＝ガンマカルボキシグルタメート。本発明者らは、これらのＰＴＭのうちの少なくともいくつかがＩＲへのＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結合に寄与することを発見している。
このインスリンアナログは、少なくとも１対のシステイン残基を介して互いに結合しているＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを有する。いくつかの実施形態では、Ｂ鎖ペプチドのＣｙｓＢ９はＡ鎖ペプチドのＣｙｓＡ６に結合しており、Ｂ鎖ペプチドのＣｙｓＢ２１はＡ鎖ペプチドのＣｙｓＡ２０に結合している、および／またはＣｙｓＡ７はＣｙｓＡ１１に結合している。
いくつかの実施形態では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは１つまたは複数の末端で互いに連結され得る。いくつかの実施形態では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは、ある末端で互いに連結されている。例えば、Ａ鎖ペプチドのＮ末端はＢ鎖ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に連結され得る、Ａ鎖ペプチドのＣ末端はＢ鎖ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に連結され得る、Ａ鎖ペプチドのＣ末端はＡ鎖ペプチドのＮ末端に連結され得る、またはＢ鎖ペプチドのＣ末端はＢ鎖ペプチドのＮ末端に連結され得る。いくつかの実施形態では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは両方の末端で互いに連結されている。そのため、いくつかの実施形態ではこのインスリンアナログは非環式ではあるが、他の場合では、このインスリンアナログは、説明されたＣｙｓ結合パターンを保持しつつ環式であり得る。そのような実施形態では、このインスリンアナログは環化主鎖を有し、その結果、Ａ鎖およびＢ鎖は遊離Ｎ末端または遊離Ｃ末端を有しない（この実施形態の場合、それにより両方の末端が連結されている）。１つまたは複数の末端での連結は、Ａ鎖ペプチド主鎖のアミノ酸とＢ鎖ペプチド主鎖のアミノ酸との間で直接的であり得る、またはそれらの間で結合した１個もしくは複数個のアミノ酸のリンカーまたは他のリンカー分子であり得る。
いくつかの実施形態では、安定性を改善することが当業者に知られている化学基、残基または残基の基をＣ末端および／またはＮ末端に付加し得る。いくつかの実施形態では、生物学的利用能を改善することが当業者に知られている化学基、残基または残基の基をＣ末端および／またはＮ末端に付加し得る。いくつかの実施形態では、Ｎ末端に付加され得るそのような残基または基で、このインスリンアナログ内のＧｌｙも置き換え得る。いくつかの実施形態では、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかに蛍光タグを付着させ得る。
本明細書で開示されたインスリンアナログペプチドを当業者に既知の任意の技術または方法で作製し得、そのような技術または方法のいずれも本範囲内であると見なされる。例えば、技術として、化学合成、固相ペプチド合成、組換え発現、ペプチド合成および組換え発現の組み合わせならびに同類のものが挙げられるがこれらに限定されない。例示的な技術を実施例セクションでさらに説明する。このインスリンアナログを、様々な形態（例えば天然型、融合型、グリコシル化型、脂質化型等）で調製し得る。
このインスリンアナログを好ましくは実質的に純粋な形態（即ち、宿主細胞タンパク質または他の混入物を実質的に含まない形態）で調製する。典型的には、このインスリンアナログは、存在する総タンパク質の少なくとも６０重量％である場合に実質的に純粋である。例えば、このインスリンアナログは、存在する総タンパク質の少なくとも７５重量％であり、少なくとも約８０重量％であり、少なくとも約８５重量％であり、少なくとも約９０重量％であり、少なくとも約９１重量％であり、少なくとも約９２重量％であり、少なくとも約９３重量％であり、少なくとも約９４重量％であり、少なくとも約９５重量％であり、少なくとも約９６重量％であり、少なくとも約９７重量％であり、少なくとも約９８重量％であり、少なくとも約９９重量％であり、より好ましくは少なくとも９０重量％である。
本開示はまた、このインスリンアナログの塩または誘導体も提供する。用語「塩」は、本明細書で使用される場合、無機または有機の酸および／または塩基と形成される酸性および／または塩基性の塩を示し、好ましくは塩基性塩を示す。特にこのインスリンアナログを薬剤として用いる場合には、薬学的に許容される塩が概して好ましいが、他の塩は、例えばこの化合物の処理においてまたは非薬剤型の用途が企図される場合に有用性を見出す。この化合物の塩を当業者に既知の任意の技術により調製し得る。
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用される場合、親化合物の生物学的活性を保持し且つ生物学的にまたは他の形で望ましくないものではない化合物の塩を指す。本明細書で開示された化合物の多くは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはこれらに類似の基の存在により酸性および／または塩基性の塩を形成し得る。薬学的に許容される塩基付加塩を無機塩基および有機塩基から調製し得る。無機塩基から誘導される塩として、ほんの一例としてナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が挙げられる。有機塩基から誘導される塩として、第一級アミン、第二級アミンおよび第三級アミンの塩が挙げられるがこれらに限定されない。薬学的に許容される酸付加塩を無機酸および有機酸から調製し得る。無機酸から誘導される塩として、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸および同類のものが挙げられる。有機酸から誘導される塩として、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸および同類のものが挙げられる。
用語「誘導体」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するアルファ－アミノ酸中に見出される１個または複数個の側基が改変されているアルファアミノ酸を含む。そのため、例えば、天然に存在するアミノ酸を、様々なコードされていないまたは改変されたアミノ酸（例えば、対応するＤ－アミノ酸またはＮメチルアミノ酸）に置き換え得る。他の改変は当業者に既知であり、化学的に類似の基によるヒドロキシル官能基、チオール官能基、アミノ官能基およびカルボキシル官能基の置換（例えば、システイン中における－ＳｅＨによる－ＳＨの置換）を含む。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体はＩＲに結合し得る。好ましくは、このＩＲはヒトＩＲ－Ｂレセプターである。いくつかの実施形態では、ヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０または親和性（Ｋｄ）は、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍよりも低い。好ましくは、ヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０は、１０－６Ｍよりも低い。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体はＩＧＦ－ＩＲに結合しない、またはＩＧＦ－ＩＲに弱く結合する。本明細書で使用される場合、「弱く」は、ＩＧＦ－ＩＲに十分な親和性で結合してＩＧＦ－ＩＲを活性化しないおよび／またはＩＧＦ－ＩＲを介したシグナル伝達を引き起こさないインスリンアナログを指す。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログはＩＧＦ－ＩＲに対するＩＣ５０またはｋｄが１０－９Ｍ、１０－８Ｍ、１０－７Ｍ、１０－６Ｍ、１０－５Ｍまたは１０－４Ｍよりも弱く、好ましくは、このインスリンアナログはＩＧＦ－ＩＲに対する親和性（Ｋｄ）が１００ｎＭよりも弱い。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体は溶液中で主に単量体である。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログの少なくとも５０％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも６０％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも７０％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも７５％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも８０％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも８５％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも９０％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも９５％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも９８％が単量体である、このインスリンアナログの少なくとも９９％が単量体である、またはこのインスリンアナログの約１００％が単量体である。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは単量体である。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは少なくとも部分的に単量体であり得、対象への投与時に単量体型へと解離し得る。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログは単量体である、または対象の血流中で単量体型へと解離する。
いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体は即時作用性インスリンアナログである。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体は、ヒトインスリンと比較した場合にヒトに投与した場合に生物学的利用能が増加している。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体は、ヒトへの投与から１０分～６時間以内に生物学的利用能がピークになる。いくつかの実施形態では、投与後のこのインスリンアナログの最大血漿濃度は、投与後のヒトインスリンの最大血漿濃度と比べて早く起こる。例えば、このインスリンアナログ、その塩または誘導体のピーク利用能は、投与から１０分～４時間以内、投与から１５分～３時間以内、投与から３０分～１時間以内または投与から４０～５５分以内に起こる。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログ、その塩または誘導体は、投与から２分、５分、１０分、１５分、２０分または３０分以内に活性が発現する。好ましくは、活性の発現は投与から１０～３０分以内である。
本発明のインスリンアナログはまた、本発明の方法を使用して設計されたまたは同定されたものおよび標的結合部位を認識して結合し得るものも含む。
標的結合部位として、ＩＲ等のインスリンの生理学的結合パートナーならびに生理学的結合パートナーの領域が挙げられる。例えば、標的結合部位は、エピトープ（例えば、標的結合部位として下記で同定するループ構造に対応する）を規定する短いポリペプチド、またはループ構造を模倣する模倣物（例えばペプチド模倣物）であり得る。
いくつかの実施形態では、この標的結合部位はインスリンレセプターであり、好ましくはヒトインスリンレセプターである。いくつかの実施形態では、この標的結合部位は、ＩＲにおいてレセプターへのインスリンドッキングに関与する領域である。いくつかの実施形態では、ＩＲの領域は、下記のうちの１つまたは複数を含む低親和性標的結合部位を含む：Ｌ１ドメイン、ＣＴペプチドおよびＩＲ外部ドメインのＣＲドメイン。Ｌ１ドメインに関して、この標的結合部位は、Ｌ１の中心β－シートの分子表面の部分、およびＬ１の４番目のＬＲＲ環中にＰｈｅ３９もしくはループまたは好ましくは両方を含む２番目のＬＲＲの分子表面の部分を好ましくは含む。ＣＲドメインに関して、この標的結合部位はＣＲドメインのモジュール６を好ましくは含む。
いくつかの実施形態では、この低親和性標的結合部位は、下記のアミノ酸配列のうちの１つまたは複数からの１個または複数個のアミノ酸を含み得る：（ｉ）アミノ酸１～１５６；（ｉｉ）アミノ酸７０４～７１９；および（ｉｉｉ）アミノ酸１５７～３１０。
アミノ酸１～１５６に関して、この標的結合部位は、アミノ酸配列１～６８から、好ましくは１～５５から、より好ましくはアミノ酸配列２７～５５から少なくとも１個のアミノ酸を好ましくは含む。この標的結合部位は、Ａｒｇ１４、Ａｓｎ１５、Ｇｌｎ３４、Ｌｅｕ３６、Ｌｅｕ３７、Ｐｈｅ３９、Ｐｒｏ４３～Ｐｈｅ４６、Ｐｈｅ６４、Ｌｅｕ８７、Ｐｈｅ８８、Ａｓｎ９０およびＰｈｅ８９から選択される少なくとも１個のアミノ酸を好ましくは含み、より好ましくはＡｒｇ１４、Ａｓｎ１５、Ｇｌｎ３４、Ｌｅｕ３７、Ｐｈｅ３９、Ｐｒｏ４３～Ｐｈｅ４６、Ｐｈｅ６４から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含み、さらにより好ましくはＰｈｅ３９およびＰｒｏ４３～Ｐｈｅ４６から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含み、最も好ましくは少なくともＰｈｅ３９を含む。
アミノ酸１５７～３１０に関して、この標的結合部位は、アミノ酸配列１９２～３１０から少なくとも１個のアミノ酸を好ましくは含み、より好ましくは配列２２７～３０３から少なくとも１個のアミノ酸を含み、さらにより好ましくは配列２５９～２８４から選択される少なくとも１個のアミノ酸を含む。
別の態様では、本発明はまた、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドも提供する。開示されているのは、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、このＢ鎖ペプチドは野生型ヒトインスリンと比較してアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチドである。いくつかの実例では、任意の保存的アミノ酸置換が１０位、２０位または両方の位置で存在し得る。例えば、別の親水性アミノ酸、極性アミノ酸または脂肪族アミノ酸を一方または両方の位置で置換する可能性がある。
本開示のペプチドのいくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙ、Ｇ２０ＦまたはＧ２０Ｐであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙである。いくつかの実例では、アミノ酸２０での置換はＧ２０Ｐであり得、このペプチドはアミノ酸２１で置換をさらに含み、アミノ酸２１での置換はＧ２１Ｈであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸置換はグリシンからの任意の保存的置換であり得る。
本開示のペプチドのいくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅ、Ｈ１０ＤまたはＨ１０Ｑであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅである。いくつかの実例では、このアミノ酸置換はヒスチジンからの任意の保存的置換であり得る。
いくつかの実例では、インスリンＡ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドの両方は野生型インスリンと比較して置換を含み得る。開示されているのは、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含み、Ａ鎖ペプチド中で少なくとも１個の置換をさらに含むペプチドである。いくつかの実例では、この少なくとも１個の置換を８位または９位置で見出し得る。いくつかの実例では、このＡ鎖ペプチド中での少なくとも１個の置換はＴ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫまたはＳ９Ｒであり得る。いくつかの実例では、任意の保存的アミノ酸置換が８位もしくは９位または両方の位置で存在し得る。例えば、別の親水性アミノ酸が置換される可能性がある、または他の極性アミノ酸が置換される可能性がある。
開示されているのは、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含み、Ａ鎖ペプチド中に少なくとも２個の置換をさらに含むペプチドである。いくつかの実例では、この少なくとも２個の置換を８位および９位で見出し得る。いくつかの実例では、このＡ鎖ペプチド中の少なくとも２個の置換は、Ｔ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫおよびＳ９Ｒから選択され得る。いくつかの実例では、任意の保存的アミノ酸置換が８位もしくは９位または両方の位置で存在し得る。例えば、一方のまたは両方の位置で、別の親水性アミノ酸が置換される可能性がある、または他の極性アミノ酸が置換される可能性がある。
いくつかの実例では、このＢ鎖ペプチドは、野生型と比較してＣ末端アミノ酸の１個または複数個（最大８個）を欠いている。そのため、本開示のペプチドはデス－オクタペプチドインスリンペプチド（ヒトインスリンＢ鎖のＣ末端の最後の８個のアミノ酸を欠いている）であり得る。例えば、いくつかの実例では、本開示のペプチドは、下記：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３０）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＦＥＲ（配列番号３１）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＰＥＲ（配列番号３２）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３３）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＹＬＶＣＦＥＲ（配列番号３４）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＤＬＶＥＡＬＹＬＶＣＰＥＲ（配列番号３５）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＱＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３６）、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＱＬＶＥＡＬＹＬＶＣＦＥＲ（配列番号３７）、または
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＱＬＶＥＡＬＹＬＶＣＰＥＲ（配列番号３８）
の配列を含むＢ鎖ペプチドを有し得る。
いくつかの実例では、本開示のペプチドは、ＧＩＶＥＱＣＣＨＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３９）、ＧＩＶＥＱＣＣＹＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号４０）またはＧＩＶＥＱＣＣＫＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号４１）の配列を含むＡ鎖を有し得る。
本開示のペプチドのいくつかの実例では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを、少なくとも１個のジスルフィド結合を介して結合し得る。いくつかの実例では、Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを、少なくとも２個のジスルフィド結合を介して結合し得る。
いくつかの実例では、本開示のペプチドは単量体である。換言すると、いくつかの実例では、本開示のペプチドは二量体、四量体、六量体等を形成する可能性が低い。
本開示のペプチドのいくつかの実例では、このインスリンＡ鎖ペプチドは、野生型ヒトインスリンＡ鎖ペプチドと少なくとも７０％同一であり得る。いくつかの実例では、このインスリンＡ鎖ペプチドは、野生型ヒトインスリンＡ鎖ペプチドと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％同一であり得る。いくつかの実例では、このパーセント同一性を、本開示のペプチドのＮ末端またはＣ末端からの１個または複数個のアミノ酸の欠失により達成し得る。
本開示のペプチドのいくつかの実例では、このインスリンＢ鎖ペプチドは、野生型ヒトインスリンＢ鎖ペプチドと少なくとも７０％同一であり得る。いくつかの実例では、このインスリンＢ鎖ペプチドは、野生型ヒトインスリンＢ鎖ペプチドと少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％同一であり得る。いくつかの実例では、このパーセント同一性を、本開示のペプチドのＮ末端またはＣ末端からの１個または複数個のアミノ酸の欠失により達成し得る。
いくつかの実例では、本開示のペプチドは、１個または複数個の非天然アミノ酸、改変アミノ酸または合成アミノ酸アナログを含み得る。そのようなアミノ酸として下記が挙げられるがこれらに限定されない：一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、シクロペンチルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβ－メチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎα－メチルアミノ酸および一般のアミノ酸アナログ。同様にこの範囲に含まれるのは、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）／保護（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、抗体分子または他の細胞リガンドへの連結等により合成の最中にまたは合成後に差次的に改変されるペプチドである。これらの改変は、このペプチドの安定性および／または生物活性を増加させるのに役立ち得る。
本開示のペプチドのさらなる実例では、提供されるのは、少なくとも１個のジスルフィド結合を介してＢ鎖ペプチドに結合したＡ鎖ペプチドを有する治療用タンパク質であって、このＡ鎖はＧＩＶＥＱＣＣＨＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３９）の配列を含み、このＢ鎖ペプチドはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３０）の配列を含む、治療用タンパク質である。
本開示の治療用タンパク質を医薬組成物中で用い得ること、および糖尿病等の障害の処置と関連して使用し得ることが認識される。
インスリンアナログの設計方法
本発明により提供される毒液インスリンの三次元構造を使用して、インスリンアナログ（本明細書ではＩＲアゴニスト、分子および化合物とも称される）を設計し得、特に即時作用性インスリンアナログを設計し得る。一態様では、構造モデルとしての、付録Ｉの原子座標により定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の構造の使用が提供される。いくつかの実施形態では、この構造モデルをインスリンアナログの同定に使用する。
いくつかの実施形態では、ＩＲと潜在的に相互作用し得る化合物を同定する、設計するまたはスクリーニングする方法が提供される。この方法は、化合物の、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の三次元構造またはそのサブセットにより定義されるＩＲ構造との相互作用に基づいて、この化合物の、構造に基づく同定、設計またはスクリーニングを実施することを含む。
本発明はまた、既知のＩＲ結合分子の特性の改善にも有用である。例えば、既知のＩＲ結合分子を、付録Ｉの原子座標またはその一部により定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の３Ｄ構造ならびに自己会合する能力およびＩＲと相互作用する可能性の評価に対してスクリーニングし得る。この評価を考慮して、既知のＩＲ結合分子を、下記の特性のうちの１つまたは複数を付与するように再設計する（即ち化学的に改変する）可能性がある：（ｉ）自己会合を低減させる、（ｉｉ）ＩＲの低親和性結合部位（即ち、選択性を支配する結合部位）に対する親和性を改善する、（ｉｉｉ）ＩＲに対する高親和性結合部位（即ち、シグナル伝達を支配する結合部位）に対する親和性を改善する、および（ｉｖ）ＩＧＦ－１Ｒへの結合に対する親和性を低下させる。
いくつかの実施形態では、ＩＲまたはＩＲの領域に結合することが知られているポリペプチドを再設計するまたは改変する方法が提供される。この方法は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造の、構造に基づく評価を実施すること、およびこの評価の結果としてポリペプチドを再設計するまたは化学的に改変することを含む。いくつかの実施形態では、構造に基づく評価は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンの原子座標またはそのサブセットとの比較を含む。いくつかの実施形態では、構造に基づく評価は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンレセプターの原子座標またはそのサブセットとの間に形成される複合体の分子モデリングをさらに含む。いくつかの実施形態では、このモデルは付録ＩＩの原子座標またはそのサブセットにより定義される。
いくつかの実施形態では、この方法は、再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、およびこのポリペプチドのＩＲに結合する能力を試験することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドがＩＲ活性化を調節する能力を決定する。いくつかの実施形態では、この再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドの血糖値を低下させる能力を決定し得る。
いくつかの実施形態では、ＩＲに結合することが知られているポリペプチドはインスリン様成長因子（ＩＧＦ）である。適切なＩＧＦとして、ヒト、ブタ、ウシ、トリ、マウスおよび同類のものに由来するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、このＩＧＦはヒトのＩＧＦ－ＩまたはＩＧＦ－ＩＩである。
好ましい実施形態では、ＩＲに結合することが知られているポリペプチドはインスリンである。適切なインスリンとして、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ヒツジインスリン、マウスインスリン、モルモットインスリンおよび同類のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、このインスリンはヒトインスリンである。
本明細書で使用される場合、用語「モデリング」は、原子構造情報および相互作用モデルに基づく分子構造および／または機能の定量的分析および定性的分析を含む。用語「モデリング」は、従来の数値に基づく分子動力学およびエネルギー最小化モデル、双方向コンピュータグラフィックモデル、改変分子力学モデル、距離幾何学および他の構造に基づく制約モデルを含む。
分子モデリング技術をＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１またはその領域の原子座標に適用して、様々な３Ｄモデルを導き出してＩＲおよび他のタンパク質標的の結合部位等の結合部位の構造を調べ得る。
本明細書で言及されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の領域は、単一アミノ酸（またはその側鎖）により、連続アミノ酸配列により、または２個以上の別々のアミノ酸および／またはアミノ酸のストレッチにより定義され得る。そのような別々のアミノ酸および／またはアミノ酸のストレッチは、三次元構造中で互いに密接に空間的に近接して存在し得る、または例えば適切なリガンドの結合時に密接に空間的に近接する可能性を有し得る。適切には、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の領域は、ＩＲの結合（ＩＲ二量体中の他の単量体への最初の選択的低親和性結合およびその後の高親和性結合の両方）に関与するアミノ酸配列を含む。
これらの技術を使用して、ＩＲに結合してＩＲの活性を調節し得る小さい化学物質および大きい化学物質もスクリーニングし得る、または設計し得る。このスクリーニングは、立体３Ｄスクリーニングシステムまたはコンピュータスクリニングシステムを用い得る。
いくつかの実施形態では、そのようなモデリング方法は、ＩＲの特定の領域に対して立体化学的な相補性を有する化学物質（例えばポリペプチド、ペプチド、ペプチド模倣物、化合物および同類のもの）を設計する、または選択する。「立体化学的な相補性」は、化合物またはその一部が、レセプターへの結合時に自由エネルギーの正味の減少を有するように、このレセプターとの十分な数のエネルギー的に望ましい接触を行うことを意味する。
ＩＲ外部ドメインと自然に相互作用する分子または複合体の結合を阻害するために化学物質とレセプター部位との間の相補性がレセプター部位の全ての残基にわたって広がる必要がないことが認識されるだろう。
ＩＲの領域に対して立体相補性を有する化学物質を同定するために多くの方法を使用し得る。例として、このプロセスは、機械可読記憶媒体から生成された付録Ｉ中のＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１またはその領域の原子座標に基づく、コンピュータスクリーン上でのＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１構造の目視検査により開始し得る。いくつかの実施形態では、このプロセスは、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンレセプターの原子座標またはそのサブセットとの間に形成される複合体の分子モデリングにより開始し得る。当分野で公知であり且つ入手可能であるモデリングソフトウェア（例えばＭＯＤＥＬＬＥＲ（ｖ９．１５）（Ｗｅｂｂ ａｎｄ Ｓａｌｉ，（２０１４））を使用し得る。このモデリング工程の後に、標準的な分子力学力場（例えばＣＨＡＲＭＭ（Ｇｕｖｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｂｅｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１２））によるエネルギー最小化が続いてもよい。モデリングおよびエネルギー最小化の後に、当分野で既知のソフトウェアを使用した分子動力学シミュレーション（例えばＮＡＭＤ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．２００５））が続いてもよい。加えて、本発明の結合部分を選択するプロセスを補助するための、多くのより特殊化されたコンピュータプログラムが存在する。
本明細書で定義されるポリペプチドを再設計するまたは改変する方法により再設計されているまたは改変されているポリペプチドまたはその塩もしくはアナログも提供される。好ましくは、この再設計されたまたは改変されたポリペプチドは単量体である、または対象に投与した場合に単量体に解離する。
ＩＲの好ましい領域は特異性を支配するものであり、例えば上記で標的結合部位として説明されているものである。
別の態様では、ＩＲアゴニストである単離分子であって、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の３Ｄ構造に基づいて同定されているおよび／または設計されている分子が提供される。適切な分子として、ペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物が挙げられる。
用語「ペプチド模倣物」は、本明細書で使用される場合、ペプチドの生物学的活性を模倣するが化学的性質においてはもはや完全にはペプチド性ではない分子である。厳密な定義により、ペプチド模倣物は、もはやいかなるペプチド結合（即ち、アミノ酸間のアミド結合）を含まない分子である。しかしながら、用語ペプチド模倣物を、天然ではもはや完全にはペプチド性ではない分子（例えば偽ペプチド、半ペプチドおよびペプトイド）を説明するために使用し得る。完全に非ペプチドか部分的に非ペプチドかにかかわらず、本発明のペプチド模倣物は、このペプチド模倣物が基づくペプチド中の活性基の三次元配置に非常に似ている反応性化学部分の空間配置をもたらす。この類似の活性部位の幾何学の結果として、このペプチド模倣物は、ペプチドの生物学的活性と類似の生物学的システムに影響を及ぼす。
毒液インスリンに基づく適切なペプチド模倣物を、本明細書で説明された容易に利用可能な技術および／または方法を使用して開発し得る。そのため、例えばペプチド結合を、ペプチド模倣物が元々のペプチドと類似の構造（従って生物学的活性）を採用するのを可能にする非ペプチド結合に置き換え得る。アミノ酸の化学基を同様の構造の他の化学基に置き換えることにより、さらなる改変も行い得る。毒液インスリンに由来するペプチド模倣物の開発を、付録Ｉに記載されたこれらの残基の三次元構造またはそのサブセットを参照することにより促進し得る。ＭＡＣＣＳ－３ＤおよびＩＳＩＳ／３Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）、ＣｈｅｍＤＢＳ－３Ｄ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）ならびにＳｙｂｙｌ／３ＤＢ Ｕｎｉｔｙ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）等のプログラムを使用し、この構造情報を使用して、三次元データベースを検索して類似の構造を有する分子を同定し得る。
当業者は、ペプチド模倣物の設計が、本発明の方法を使用して設計されたまたは同定された化学構造のわずかな構造の変更または調整を必要とする場合があることを認識するだろう。一般に、本発明の方法を使用して同定されたまたは設計された模倣物を化学的に合成し、次いで本明細書で説明された方法のいずれかを使用してインスリンレセプター活性を調節する能力に関して試験し得る。本発明の方法は特に有用であり、なぜならば、本発明の方法を使用して、インスリンレセプター活性を調節する能力に関してスクリーニングされなければならない潜在的な模倣物の数を大幅に減少させ得るからである。
いくつかの実施形態では、本単離分子はＩＲに結合し得る。好ましくは、このＩＲはヒトＩＲ－Ｂレセプターである。いくつかの実施形態では、このヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０またはＫｄは、１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍよりも強い。好ましくは、このヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０またはＫｄは１０－６Ｍよりも強い。いくつかの実施形態では、この単離分子はＩＧＦ－ＩＲに結合しない、またはＩＧＦ－ＩＲに弱く結合する。好ましくは、この単離分子はＩＧＦ－ＩＲに対する親和性（Ｋｄ）が１００ｎＭよりも弱い。
いくつかの実施形態では、この単離分子は溶液中で主に単量体である。いくつかの実施形態では、この単離分子の少なくとも５０％が単量体である、この単離分子の少なくとも６０％が単量体である、この単離分子の少なくとも７０％が単量体である、この単離分子の少なくとも７５％が単量体である、この単離分子の少なくとも８０％が単量体である、この単離分子の少なくとも８５％が単量体である、この単離分子の少なくとも９０％が単量体である、この単離分子の少なくとも９５％が単量体である、この単離分子の少なくとも９８％が単量体である、この単離分子の少なくとも９９％が単量体である、またはこの単離分子の約１００％が単量体である。いくつかの実施形態では、この単離分子は少なくとも部分的に単量体であり得、対象への投与時に単量体型へと解離し得る。いくつかの実施形態では、この単離分子は単量体である、または対象の血流中で単量体型へと解離する。
本発明はまた、ＩＧＦ－ＩＲに結合しないまたはＩＧＦ－ＩＲに弱く結合するだけであるインスリンアナログの同定および／または設計でも有用である。例えば、本発明の方法を使用して同定されたインスリンアナログを、ＩＧＦ－ＩＲに結合する能力に関してインシリコ、インビトロおよび／またはインビボでスクリーニングし得る。ＩＧＲ－ＩＲに結合することが発見されたまたは疑われる任意のインスリンアナログを、ＩＲに関してより選択的であるように再設計し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法により同定されたインスリンアナログ（単離された分子、化合物またはＩＲアゴニストを含む）はＩＧＦ－ＩＲに結合しない、またはＩＧＦ－ＩＲに弱く結合する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログはＩＧＦ－ＩＲに対するＩＣ５０またはＫｄが１０－９Ｍ、１０－８Ｍ、１０－７Ｍ、１０－６Ｍ、１０－５Ｍまたは１０－４Ｍよりも弱く、好ましくは、このインスリンアナログはＩＧＦ－ＩＲに対する親和性（Ｋｄ）が１００ｎＭよりも弱い。
本開示はまた、ＩＲに結合する化合物を同定する方法であって、
ｉ）下記：
ａ）付録Ｉの原子座標もしくはそのサブセットにより定義される構造、または
ｂ）ａ）の対応する主鎖原子上で重ねた場合に約２．０Å未満の平均二乗偏差を有する構造
を有するポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、および
ｉｉ）ＩＲに潜在的に結合する化合物を設計するまたはスクリーニングすること
を含む方法も提供する。
いくつかの実施形態では、三次元構造モデルを作成することは、ＩＲまたはその領域に結合するポリペプチドのモデルを作成することを含む。ＩＲの好ましい領域は特異性を支配するものであり、例えば上記で標的結合部位として説明されているものである。いくつかの実施形態では、このモデルは、付録ＩＩの原子座標またはそのサブセットにより定義される。
このモデルは、例えば側鎖または主鎖の小さな動きにより候補化合物とタンパク質との間の適合度を改善するためのわずかな表面変化を可能にするという意味で適応性があり得る。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＩＲと潜在的に結合する化合物を合成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、化合物はＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を、ＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する能力に関して試験することをさらに含み得る。例えば、この方法は、ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を、血糖値を調節する能力に関して試験することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では工程ｉ）およびｉｉ）をインシリコで実施する。
本発明はまた、インスリン活性を模倣する化合物を同定するコンピュータベースの方法であって、
ｉ）下記：
ａ）付録Ｉの原子座標もしくはそのサブセットにより定義される構造、または
ｂ）ａ）の対応する主鎖原子上で重ねた場合に約２．０Å未満の平均二乗偏差を有する構造
を有するポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、および
ｉｉ）インスリン活性を模倣する化合物を設計するまたはスクリーニングすること
を含む方法も提供する。
いくつかの実施形態では、三次元構造モデルを作成することは、ＩＲまたはその領域に結合したポリペプチドのモデルを作成することを含む。いくつかの実施形態では、このモデルは、付録ＩＩの原子座標またはそのサブセットにより定義される。ＩＲの好ましい領域は特異性を支配するものであり、例えば上記で標的結合部位として説明されているものである。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＩＲに潜在的に結合する化合物を合成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、化合物はＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する。いくつかの実施形態では、この方法は、ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を、ＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する能力に関して試験することをさらに含み得る。例えば、この方法は、ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を、血糖値を調節する能力に関して試験することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、工程ｉ）およびｉｉ）をインシリコで実施する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法により同定された化合物はＩＲに結合し得る。好ましくは、このＩＲはヒトＩＲ－Ｂレセプターである。いくつかの実施形態では、このヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０は１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍまたは１０－１０Ｍよりも低い。好ましくは、このヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０は１０－６Ｍよりも低い。
いくつかの実施形態では、本発明の方法により同定された化合物はＩＧＦ－ＩＲに結合しない、またはＩＧＦ－ＩＲに弱く結合する。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログはＩＧＦ－ＩＲに対するＩＣ５０またはＫｄが１０－９Ｍ、１０－８Ｍ、１０－７Ｍ、１０－６Ｍ、１０－５Ｍまたは１０－４Ｍよりも弱く、好ましくは、このインスリンアナログはＩＧＦ－ＩＲに対する親和性（Ｋｄ）が１００ｎＭよりも弱い。
いくつかの実施形態では、本発明の方法により同定された化合物は溶液中で主に単量体である。いくつかの実施形態では、この化合物の少なくとも５０％が単量体である、この化合物の少なくとも６０％が単量体である、この化合物の少なくとも７０％が単量体である、この化合物の少なくとも７５％が単量体である、この化合物の少なくとも８０％が単量体である、この化合物の少なくとも８５％が単量体である、この化合物の少なくとも９０％が単量体である、この化合物の少なくとも９５％が単量体である、この化合物の少なくとも９８％が単量体である、この化合物の少なくとも９９％が単量体である、またはこの化合物の約１００％が単量体である。いくつかの実施形態では、この化合物は少なくとも部分的に単量体であり得、対象への投与時に単量体型へと解離し得る。いくつかの実施形態では、この化合物は単量体である、または対象の血流中で単量体型へと解離する。
当業者に容易に理解されるように、本発明の方法は、インスリンレセプターと相互作用するインスリンアナログタンパク質を設計するためのおよび選択するための合理的方法を提供する。いくつかの場合では、このタンパク質は、活性を増大させるためにさらなる開発を必要とする場合がある。そのようなさらなる開発は当分野では日常的であり、本出願で提供される構造情報により支援されるだろう。特定の実施形態では、本発明の方法はそのようなさらなる開発工程を含むことを意図されている。
インスリンアナログを上記の方法により設計すると、または選択すると、このインスリンアナログがＩＲ等の標的に結合し得る効率を、コンピュータ評価により試験して最適化し得る。例えば、ＩＲに結合するように設計されているまたは選択されているインスリンアナログはまた、好ましくは、天然ＩＲに結合する場合に結合部位に占められるものと重複しない体積を横切らなければならない。ＩＲに結合するように設計されたまたは選択されたインスリンアナログを、その結合状態で標的タンパク質との反発的な静電気的相互作用を好ましくは欠くように、コンピュータによりさらに最適化し得る。そのような非相補的（例えば静電気的）相互作用として、反発的な電荷－電荷相互作用、双極子－双極子相互作用および電荷－双極子相互作用が挙げられる。具体的には、インスリンアナログがＩＲに結合した場合の化合物とインスリンアナログとの間の全ての静電気的相互作用の合計は、好ましくは結合のエンタルピーに対して中立的である、または有利な寄与を行う。
上記で説明したようにインスリンアナログを最適に選択すると、または設計すると、このインスリンアナログの結合特性を改善するためにまたは変更するために、このインスリンアナログの原子または側基のうちのいくつかで置換を行ってもよい。一般に、最初の置換は保存的であり、即ち置換基は元々の基とほぼ同一のサイズ、形状、疎水性および電荷を有するだろう。当然のことながら、立体配座を変更することが当分野で知られている構成要素を避けるべきであることを理解すべきである。次いで、そのような置換インスリンアナログを、上記で詳細に説明した同一のコンピュータ方法によりＩＲへの適合の効率について分析し得る。
当分野では、複合の変形エネルギーおよび静電気的相互作用を評価するために特定のコンピュータソフトウェアが利用可能である。そのような使用のために設計されたプログラムの例として、Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２，リビジョンＣ（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）；ＡＭＢＥＲ，バージョン４．０（Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）およびＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｓｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が挙げられる。
本発明は、本明細書で説明された方法を使用して同定されたインスリンアナログ（ＩＲアゴニスト、分子、化合物および同類のものを含む）を包含する。いくつかの実施形態ではまた、本明細書で説明された方法を使用して同定されたインスリンアナログ（ＩＲアゴニスト、分子、化合物および同類のものを含む）を含む医薬組成物にも関する。
結合および生物学的活性のスクリーニングアッセイおよび確認
本発明のインスリンアナログ（本開示の方法を使用して同定された化合物および分子を含む）を好ましくは、ＩＲおよび／またはＩＧＦ－１Ｒ機能の多くのインビトロおよびインビボでのアッセイにより評価して、ＩＲおよび／またはＩＧＦ－１Ｒ活性と相互作用するおよび調節する能力を確認する。例えば、化合物を、ＩＲおよび／もしくはＩＧＦ－１Ｒに結合する能力に関して試験し得る、ならびに／またはＩＲおよび／もしくはＩＧＦ－１Ｒのシグナル伝達を調節する（例えば活性化するもしくは破壊する）能力に関して試験し得る。
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、ＩＲまたはＩＧＦ－１Ｒを標識に結合させ得、この標識は検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に提供し得る。様々な標識として、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁気粒子、および同類のものが挙げられる。特異的結合分子として、例えばビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン等のペアが挙げられる。特異的結合メンバーに関して、相補的メンバーは通常、既知の手順に従って、検出される分子で標識されるだろう。
このスクリーニングアッセイに様々な他の試薬を含め得る。これらとして、例えば最適なタンパク質－タンパク質結合を容易にするためにおよび／または非特異的なもしくはバックグラウンドの相互作用を低減させるために使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤のような試薬が挙げられる。アッセイの効率を改善する試薬（例えばプロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤等）を使用し得る。成分を、必要な結合を生じさせる任意の順序で添加する。最適な活性を促進する任意の温度（概して４～４０℃）でインキュベーションを実施する。
ＩＲまたはＩＧＦ－１Ｒへの化合物の直接的結合を、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によっても行い得る（Ｍｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ，１９９８で概説されている）。ここで、アミンもしくはチオール－ジスルフィド交換カップリングを使用する直接化学カップリングにより（Ｎｉｃｅ ａｎｄ Ｃａｔｉｍｅｌ，１９９９）、または適切に誘導体化されたセンサー表面へのＦｃ融合タンパク質としてのレセプター外部ドメインの捕捉により（Ｍｏｒｔｅｎ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ，１９９８）、レセプターをＣＭ５上でまたは他のセンサーチップ上で固定する。潜在的なインスリンアナログ（分析物と呼ばれる）は、適切な流速および濃度範囲でセンサー表面上を通過する。古典的な分析方法は、広範囲の分析物濃度に対する応答を集めることである。濃度範囲は反応に関する十分な情報を提供し、ＣＬＡＭＰ（Ｍｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ，１９９８を参照されたい）等のフィッティングアルゴリズムを使用することにより速度定数を決定し得る（Ｍｏｒｔｏｎ ａｎｄ Ｍｙｓｚｋａ，１９９８；Ｎｉｃｅ ａｎｄ Ｃａｔｉｍｅｌ， １９９９）。通常、リガンド表面は各分析物の結合サイクルの最後に再生される。表面再生により、各サイクルの開始時に同数のリガンド結合部位が分析物にアクセス可能であることが確実になる。
インキュベーション期間は最適な活性のために選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最適化もされ得る。通常、０．１～１時間が十分であるだろう。一般に、複数のアッセイ混合物を様々な試験薬濃度と並行して実行し、これらの濃度に対する様々な応答を得る。典型的には、これらの濃度のうちの１つは陰性コントールとして（即ちゼロ濃度または検出レベル未満で）作用する。
天然インスリンのインスリンアナログ置き換えのための異種スクリーニングの基礎としてのインビトロでの競合レセプター結合アッセイの基本フォーマットは下記のとおりであり得る：ＩＲまたはＩＧＦ－１Ｒの活性部位の占有を、Ｄｅｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ（２００４）により説明されたように時間分解された蛍光検出（ＴＲＦＤ）により定量化する。Ｒ－ＩＲ－Ａ細胞、Ｒ－ＩＲ－Ｂ細胞およびＰ６細胞をそれぞれＩＲ－Ａ、ＩＲ－ＢおよびＩＧＦ－１Ｒの供給源として使用する。細胞を、４℃で１時間にわたり溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％（体積／体積）グリセロール、１％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）で溶解させる。溶解物を３５００ｒｐｍで１０分にわたり遠心分離し、次いで抗インスリンレセプター抗体８３－７または抗ＩＧＦ－１Ｒ抗体２４－３１で予めコーティングした白色Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００プレートに１ウェル当たり１００μｌを添加する。いずれの捕捉抗体も、インスリン、ＩＧＦ－ＩまたはＩＧＦ－ＩＩによるレセプター結合を妨げない。約１００，０００蛍光カウントのユーロピウム標識インスリンまたはユーロピウム標識ＩＧＦ－Ｉを様々な量の非標識競合インスリンアナログと一緒に各ウェルに添加し、４℃で１６時間にわたりインキュベートする。ウェルを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％（体積／体積）Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）で洗浄し、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（１００μｌ／ウェル）を添加する。ＢＭＧ Ｌａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｏｌａｒｓｔａｒ（商標）Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒまたはａ Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ，Ｉｎｃ．）により、３４０ｎｍ励起フィルタおよび６１２ｎｍ発光フィルタを使用して、時間分解された蛍光を測定する。
ＩＲに対する化合物の結合および生物学的活性を評価するために採用され得る他の適切なアッセイの例は当分野で公知である。例えば、適切なアッセイを国際公開第０３／０２７２４６号パンフレット中に見出し得る。適切なアッセイの例として下記が挙げられる：
（ｉ）（Ｄｅｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００４）により説明されているような）レセプター自己リン酸化。Ｒ－ＩＲ－Ａ細胞、Ｒ－ＩＲ－Ｂ細胞またはＰ６細胞を２．５×１０４個の細胞／ウェルでＦａｌｃｏｎ ９６ウェル平底プレートに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２で一晩増殖させる。細胞を血清フリー培地で４時間にわたり洗浄した後、３７℃、５％ＣＯ２で１０分にわたり、１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ １００μｌ中のインスリン、ＩＧＦ－ＩまたはＩＧＦ－ＩＩのいずれかのうちの１つで処理する。２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４および１ｍｇ／ｍｌ ＮａＦを含む溶解緩衝液を細胞に添加し、溶解物からのレセプターを抗体８３－７または２４－３１で予めコーティングした９６ウェルプレート上で捕捉し、１×ＴＢＳＴ／０．５％ＢＳＡでブロックする。４℃での一晩のインキュベーションの後、このプレートを１×ＴＢＳＴで洗浄する。リン酸化レセプターをユーロピウム標識抗ホスホチロシン抗体ＰＹ２０（１３０ｎｇ／ウェル、室温、２時間）で検出する。上記で説明したように、ＤＥＬＦＩＡ増強溶液（１００μｌ／ウェル）を添加して時間分解された蛍光を測定する。
（ｉｉ）（Ｏｌｅｆｓｋｙ，１９７８により説明されているような）２－デオキシ［Ｕ－１４Ｃ］グルコースを使用するグルコース取り込み。２４ウェルプレート中での分化後８～１２日の脂肪細胞を、１％（重量／体積）ＲＩＡグレードＢＳＡおよび２ｍＭピルビン酸ナトリウムが補充されたＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３および１．１５ｍＭ ＣａＣｌ２を含む２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で２回洗浄する。脂肪細胞を、インスリンの添加前に３７℃で９０分にわたりまたはアゴニストもしくはアンタゴニストの添加前に３０分にわたり平衡化する。インスリン（Ａｃｔｒａｐｉｄ，Ｎｏｖｏｇｅｎ）を、３７℃で３０分にわたり０．７～７０ｎＭの濃度範囲にわたり添加する。脂肪細胞にアゴニストまたはアンタゴニスト（０～５００ｍＭ）を９０分にわたり添加し、続いてアンタゴニストの場合には天然インスリンを添加する。１ウェル当たり５０ｍＭ ２－デオキシグルコースおよび０．５ｍＣｉ ２－デオキシ－［Ｕ－１４Ｃ］グルコース（ＮＥＮ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の取り込みを、シンチレーション計数によるアゴニスト刺激の最後の１０分にわたり測定する。
（ｉｉｉ）（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ（１９９２）およびＭａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５）により説明されているような）原形質膜ローン（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌａｗｎ）を使用したグルコース輸送体ＧＬＵＴ４トランスロケーション。
（ｉｖ）（Ｍａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．１９９５により説明されているような）原形質膜ローンを使用したＧＬＵＴ４トランスロケーション。３Ｔ３－Ｌ１繊維芽細胞を６ウェルプレート中にてカバーガラス上で増殖させ、脂肪細胞に分化させる。分化の８～１２日後、脂肪細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で１８時間にわたり血清飢餓状態にする。細胞をＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．４で２回洗浄し、３７℃で９０分にわたり平衡化した後にインスリン（１００ｎＭ）を添加する、または３０分にわたり平衡化した後に化合物（１００μＭ）を添加する。処理後、脂肪細胞をＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍｌポリ－Ｌ－リシンで洗浄し、氷上で１：３（体積／体積）膜緩衝液（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｕｆｆｅｒ）（７０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＥＧＴＡならびに新たに添加した１ｍＭ ＤＴＴおよび２ｍＭ ＰＭＳＦを含む３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２）で３回洗浄して低浸透圧ショックを与える。次いで、洗浄した細胞を、氷上で１：１（体積／体積）膜緩衝液中にて設定０でプローブソニケータ（Ｍｉｃｒｏｓｏｎ）を使用して超音波処理して、カバーガラスに付着したままである原形質膜断片のローンを生成する。この断片を、２２℃で２０分にわたり膜緩衝液中の２％（重量／体積）パラホルムアルデヒドで固定し、この固定剤をＰＢＳ中の１００ｍＭグリシンによりクエンチする。次いで、この原形質膜断片を２２℃で６０分にわたり膜緩衝液中の１％（重量／体積）Ｂｌｏｔｔｏでブロックし、インハウスのウサギアフィニティ精製抗ＧＬＵＴ４ポリクローナル抗体（クローンＲ１０、ＧＬＵＴ４のＣ末端の１９個のアミノ酸を包含するペプチドに対して生成する）およびＡｌｅｘａ ４８８ヤギ抗ウサギ二次抗体（分子プローブ、１：２００）で免疫標識する。カバーガラスを、ＦｌｕｏｒｏＳａｖｅ試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してスライド上にマウントし、ＯｐｔｉＳｃａｎ共焦点レーザー走査免疫蛍光顕微鏡（Ｏｐｔｉｓｃａｎ，ＶＩＣ．，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して撮像する。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）イメージングソフトウェアを使用してデータを分析する。各条件に関して各実験内で少なくとも６つの視野を調べ、実験期間にわたる共焦点顕微鏡ゲイン設定を維持して実験間の変動を最小限に抑える。
インスリンアナログ活性を、脂肪細胞アッセイを使用して決定し得る。インスリンは、３Ｈグルコースの脂肪細胞への取り込みおよびこのグルコースの脂質への変換を増加させる。脂質相への３Ｈの取り込みを、水溶性３Ｈ生成物を排除するシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）混合物への脂質相の分配により決定する。最大未満のインスリン用量での３Ｈグルコースの取り込みへのインスリンアナログの効果を決定する。この方法の出典はＭｏｏｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９７４）である。マウス精巣上体脂肪パッドを解剖し、消化緩衝液（Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４％ＨＳＡ、１．１ｍＭグルコース、０．４ｍｇ／ｍｌ １型コラゲナーゼ、ｐＨ７．４）へと細かく刻み、３６．５℃で最大１．５時間にわたり消化する。ろ過、洗浄（Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ、１％ＨＳＡ）およびアッセイ緩衝液（Ｋｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ ＨＥＰＥＳ、１％ＨＳＡ）への再懸濁の後、遊離脂肪細胞を、試験溶液が入った９６ウェルピコプレートにピペットで入れる。
このアッセイを、０．４５ｍＭグルコースの最終濃度での３Ｈグルコース（例えばｅｘ．Ａｍｅｒｓｈａｍ ＴＲＫ ２３９）の添加により開始させる。このアッセイを、Ｌａｂｓｈａｋｅｒインキュベーションタワー、４００ｒｐｍ中で３６．５℃にて２時間にわたりインキュベートし、次いで、Ｐｅｒｍａｂｌｅｎｄ／Ｔｏｌｕｅｎｅシンチラント（または等価物）の添加により停止させ、このプレートを密封した後に少なくとも１時間にわたり静置し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔｅｒまたは等価物で検出する。完全天然インスリン標準曲線（８用量）を各プレートへのコントロールとして実行する。
データを、天然インスリンの反応と比較したデータと共に、３Ｈグルコース取り込みへのインスリンアナログの効果としてグラフで示す。このアッセイを基礎インスリン濃度または最大インスリン濃度でも実行し得る。
インスリンアナログのインビボ活性を試験するために、静脈内血糖試験を下記のとおりにＷｉｓｔａｒラットで実行し得る。体重約３００ｇの雄Ｍｏｌ：Ｗｉｓｔａｒラットを２群に分ける。血糖濃度の測定のために尾静脈から血液サンプル１０μｌを採取する。次いで、このラットをｔ＝３０分で（例えばＨｙｐｎｏｒｍ／Ｄｏｒｍｉｃｕｍにより）麻酔し、ｔ＝－２０分およびｔ＝０分で血糖を再び測定する。ｔ＝０サンプルを採取した後、１ｍｌ／ｋｇの注射体積に相当する濃度にて等張水性緩衝液中のビヒクルまたは試験物質をラットの尾静脈に注射する。血糖を時間５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１２０および１８０分で測定する。麻酔薬投与を２０分間隔で繰り返す。
本発明の方法に従って設計されたまたは選択されたインスリンアナログ、化合物および／または分子を、多くの生物物理学的方法によっても評価し得る。適切な方法として、ｘ線結晶構造解析、分析的超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、等温熱量測定および同類のものが挙げられる。例えば、インスリンアナログ（本開示の方法を使用して同定された化合物および分子を含む）を、本明細書で説明したように、このアナログの結晶化および構造決定によるさらなる確認に供し得る。例えば、溶液中の多量体化状態を分析的超遠心分離により決定し得る。分析的超遠心分離を、１２ｍｍ路長セルでＢｅｃｋｍａｎ ＸＬＩ分析的遠心分離機を使用して２０℃で実行する。化合物を含む試料を、１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで１０ｍＭ ＨＣｌで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に希釈する。当業者は、他の緩衝液、塩および同類のものを使用し得ることを認識するだろう。例えば、０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）または０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む試料も調製し得る。等体積の１０ｍＭ ＮａＯＨを添加して任意のｐＨ変化を中和する。１００μＬの総試料体積を使用する。
放射状の濃度分布を２２０ｎｍでの吸光度により測定する。１時間間隔での連続吸光度走査により評価した場合、３０，０００ｒｐｍおよび４５，０００ｒｐｍで沈降平衡を確立した。両方の速度でのデータを、ＳＥＤＮＴＥＲＰ（Ｌａｕｅ ｅｔ ａｌ．１９９２）を使用して組成から推定される溶液密度および溶媒部分比体積の値を使用して、ＳＥＤＰＨＡＴ（Ｈｏｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００７）における単一の理想的な沈降物種に一緒にフィットさせる。ジスルフィドを除いて、全ての翻訳後改変を化合物部分比体積の推定において無視する。
臨床適応症、投与経路、投与量および医薬組成物
本開示が関係するインスリンアナログ、化合物および分子は、ＩＲの活性化および／または調節に反応する状態の処置で価値がある。この状態として、グルコース代謝および／または血糖値の調節を必要とするものが挙げられる。
ＩＲの活性化および／または調節に反応する状態として、糖尿病脊髄炎（例えば１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病）、高血糖、インスリン抵抗性、耐糖能障害および同類のものが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、この状態はインスリン関連状態である。インスリン関連状態として、高血糖、インスリン抵抗性、１型糖尿病、妊娠糖尿病または２型糖尿病が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明のインスリンアナログは、グルコース代謝を調節するための対象（例えばヒト等の哺乳動物）中での使用に適している。従って、グルクース代謝を調節する方法が提供される。いくつかの実施形態は、そのようなインスリンアナログの治療上有効な量の、必要とする対象への投与によりグルコース代謝を調節する方法に関する。いくつかの実施形態は、インスリン関連状態を処置する方法であって、必要とする対象に本明細書で定義したインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。いくつかの実施形態は、インスリンアナログの治療上有効な量の必要とする対象への投与により糖尿病を処置する方法に関する。糖尿病として、１型糖尿病、２型糖尿病または妊娠糖尿病が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態は、そのようなインスリンアナログの治療上有効な量の必要とする対象への投与により高血糖を処置する方法に関する。いくつかの実施形態は、そのようなインスリンアナログの治療上有効な量の必要とする対象への投与によりインスリン抵抗性を処置する方法に関する。いくつかの実施形態は、そのようなインスリンアナログの治療上有効な量の必要とする対象への投与により耐糖能障害を処置する方法に関する。いくつかの実施形態は、そのようなインスリンアナログの治療上有効な量の必要とする対象への投与により対象の血糖値を低減させる方法に関する。
例えば、開示されているのは、対象の１型糖尿病を処置する方法であって、必要とする対象に、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドの治療上有効な量を投与することであり、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、投与することを含む方法である。いくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙ、Ｇ２０ＦまたはＧ２０Ｐであり得る。本開示のペプチドのいくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅ、Ｈ１０ＤまたはＨ１０Ｑであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸１０および２０でのＢ鎖置換の任意の組み合わせが存在し得る。いくつかの実例では、投与されるペプチドのＡ鎖は少なくとも１個の置換も含み得る。例えば、いくつかの実例では、Ａ鎖ペプチド中の少なくとも１個の置換はＴ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫまたはＳ９Ｒであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸置換は８位もしくは９位または両方の位置で存在し得る。そのため、いくつかの実例では、本開示のＢ鎖ペプチド置換およびＡ鎖ペプチド置換の任意の組み合わせが存在し得る。同様に本明細書で開示されているのは、対象の１型糖尿病を処置する方法であって、本明細書で定義されたインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法である。いくつかの実例では、この対象は、このペプチドの投与前に１型糖尿病と診断されている。いくつかの実例では、この対象は、このペプチドの投与前に１型糖尿病を発症するリスクがあると診断されている。
薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログ、化合物または分子の使用も提供される。いくつかの実施形態は、対象中でのグルコース代謝を調節するための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象のインスリン関連状態の処置および／または予防のための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象の糖尿病の処置および／または予防のための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象の高血糖の処置および／または予防のための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象のインスリン抵抗性の処置および／または予防のための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象の耐糖能障害の処置および／または予防のための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。いくつかの実施形態は、対象の血糖値を低減させるための薬剤の製造における本明細書で定義されたインスリンアナログの使用に関する。
いくつかの実施形態はまた、対象中でのグルコース代謝の調節での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログにも関する。いくつかの実施形態は、対象のインスリン関連状態の処置および／または予防での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログに関する。いくつかの実施形態は、対象の糖尿病の処置および／または予防での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログに関する。いくつかの実施形態は、対象の高血糖の処置および／または予防での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログに関する。いくつかの実施形態は、対象のインスリン抵抗性の処置および／または予防での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログに関する。いくつかの実施形態は、対象の耐糖能障害の処置および／または予防での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログに関する。いくつかの実施形態は、対象の血糖値の低減での使用のための本明細書で定義されたインスリンアナログに関する。
いくつかの実施形態では、本インスリンアナログの投与により血糖値が低減される。好ましくは、このインスリンアナログは即時作用性インスリンアナログであり、その結果、このインスリンアナログの投与により、投与から６０分以内に血糖値が低減される。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログの投与により、投与から５０分、４０分、３０分、２０分、１０分または５分以内に血糖値が低減される。いくつかの実施形態では、このインスリンアナログの投与により、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間にわたり血糖値が低減される。本明細書で開示された方法のいずれかでは、本明細書で詳細に論じられている好ましい化合物を投与する可能性がある。血糖値を、当業者に既知の任意の手段により測定し得る。
インスリンレセプター活性化を増加させる方法
開示されているのは、対象中でのインスリンレセプター活性化を増加させる方法であって、必要とする対象に本開示のインスリンアナログ、ペプチド、化合物、分子または医薬組成物のいずれか１つの治療上有効な量を投与することを含む方法である。いくつかの実例では、必要とする対象は、標準的な活性化レベルと比較してインスリンレセプター活性化が低減されていることが分かっている対象であり得る。いくつかの実例では、インスリンレセプター活性化の標準的な活性化レベルは、健康な個体で確立されたレベルに基づき得る。いくつかの実例では、インスリンレセプター活性化の標準的な活性化レベルは、インスリンレセプター活性化の増加の必要性の決定前に処置される対象で確立されたレベルに基づき得る。
例えば、開示されているのは、対象中でのインスリンレセプター活性化を増加させる方法であって、必要とする対象に、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドの治療上有効な量を投与することであり、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、投与することを含む方法である。いくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙ、Ｇ２０ＦまたはＧ２０Ｐであり得る。本開示のペプチドのいくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅ、Ｈ１０ＤまたはＨ１０Ｑであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸１０および２０でのＢ鎖置換の任意の組み合わせが存在し得る。いくつかの実例では、投与されるペプチドのＡ鎖は少なくとも１個の置換も含み得る。例えば、いくつかの実例では、Ａ鎖ペプチド中の少なくとも１個の置換はＴ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫまたはＳ９Ｒであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸置換は８位もしくは９位または両方の位置で存在し得る。そのため、いくつかの実例では、本開示のＢ鎖ペプチド置換およびＡ鎖ペプチド置換の任意の組み合わせが存在し得る。同様に開示されているのは、対象中でのインスリンレセプター活性化を増加させる方法であって、本明細書で定義されたインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法である。
血糖を低下させる方法
開示されているのは、対象の血糖を低下させる方法であって、必要とする対象に本開示のインスリンアナログ、ペプチド、化合物または医薬組成物のいずれか１つの治療上有効な量を投与することを含む方法である。
いくつかの実例では、必要な対象は、標準的な血糖値と比較して血糖が増加していることが分かっている対象であり得る。いくつかの実例では、インスリンレセプター活性化の標準的な活性化レベルは、健康な個体で確立されたレベルに基づき得る。いくつかの実例では、インスリンレセプター活性化の標準的な活性化レベルは、インスリンレセプター活性化の増加の必要性の決定前に処置される対象で確立されたレベルに基づき得る。
例えば、開示されているのは、対象の血糖を低下させる方法であって、必要とする対象に、インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドの治療上有効な量を投与することであり、このＢ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、投与することを含む方法である。いくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙ、Ｇ２０ＦまたはＧ２０Ｐであり得る。本開示のペプチドのいくつかの実例では、Ｂ鎖ペプチドのアミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅ、Ｈ１０ＤまたはＨ１０Ｑであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸１０および２０でのＢ鎖置換の任意の組み合わせが存在し得る。いくつかの実例では、投与されるペプチドのＡ鎖は少なくとも１個の置換も含み得る。例えば、いくつかの実例では、Ａ鎖ペプチド中の少なくとも１個の置換はＴ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫまたはＳ９Ｒであり得る。いくつかの実例では、アミノ酸置換は８位もしくは９位または両方の位置で存在し得る。そのため、いくつかの実例では、本開示のＢ鎖ペプチド置換およびＡ鎖ペプチド置換の任意の組み合わせが存在し得る。同様に開示されているのは、対象の血糖を低下させる方法であって、本明細書で定義されたインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法である。
投与および投与量
説明されている投与経路および投与量は単なる目安として意図されている。当業者は、本明細書に記載された本開示に基づいて、本明細書に包含された組成物、製剤、方法および使用のための具体的な投与レジメンを臨床のおよび／または薬物動態の実験を通して経験的に決定し得ること、ならびにそのような投与量を予め指定された有効性および／または毒性の基準に従って調整し得ることを理解するだろう。任意の特定の患者に対する具体的な投与量および処置レジメンは様々な因子（例えば、用いられる具体的な化合物の活性および濃度、患者の特性、例えば年齢、体重および特定の患者の反応、活性の組み合わせ、処置を行う医師の判断、ならびに処置される状態の性質および重症度）に依存することも理解されるだろう。下記の投与量は平均的な場合の例である。当然のことながら、より高いまたはより低い投与量範囲に価値がある個々の実例が存在し得、そのようなものは本発明の範囲内である。
本明細書で説明された方法および使用に従って、対象に、１回または複数回の用量でインスリンアナログの治療上有効な量を投与し得る。投与される実際の量ならびに投与の経路および時間経過は、投与経路、必要とされる利益の性質、処置される状態の性質および重症度、処置される対象の状態により変動し、最終的には付き添いの獣医または医療従事者の裁量であるだろう。処置の指示（例えば、投与量、時期等に関する決定）は付き添いの獣医または医療従事者の責任の範囲内であり、典型的には障害の性質、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法および専門家に既知の他の因子を考慮する。
当業者は、１種または複数種のアナログを一緒にまたは別々に任意の適切なスケジュール（例えば１日当たり１回または複数回から１週当たり１回または複数回）で投与し得、例えば１日おきに、任意の日数または週数にわたりまたはその任意の変動にわたり投与し得ることを理解するだろう。通常、このインスリンアナログを１日に１回、２回、３回、４回またはより多くの回数で投与する。しかしなら、このインスリンアナログを必要に応じても投与し得、例えば血糖値が正常範囲を超えている場合または血糖値を低減させる必要がある場合にも投与し得る。一般に、本発明の化合物または組成物を食事の摂取と共に、食事の摂取前にまたは食事の摂取後に投与する。好ましくは、このインスリンアナログを全ての食事（例えば朝食、昼食および夕食）の前に投与する。いくつかの実施形態では、この化合物または組成物を食事の摂取の５分、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分または６０分前に投与する。いくつかの実施形態では、この化合物または組成物を食事の摂取直前に投与する。
本明細書で説明されたインスリンアナログおよび医薬組成物を当業者に既知の任意の経路で投与し得、非経口が最も重要である。従って、本発明の一実施形態では、このインスリンアナログを非経口経路（例えば注射または注入）により投与する。他の適切な投与経路（例えば経腸（例えば経口投与）は本発明の範囲内である。具体的な実施形態では、非経口経路が好ましく、この非経口経路として、静脈内、関節内、腹腔内、皮下、筋肉内、基質内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）の注射および注入、ならびに舌下、経皮、局所、鼻経路等の経粘膜によるまたは例えば肺吸入等の吸入による投与が挙げられる。
このインスリンアナログを適切なビヒクルで投与し得る、またはこのインスリンアナログを適切な医薬組成物の形態で投与し得る。そのような組成物も本発明の範囲内である。下記では適切な医薬組成物が説明されている。
医薬組成物
本明細書で説明されたインスリンアナログが医薬組成物に製剤化され得ることを当業者は認識するだろう。そのような組成物は、このインスリンアナログと１種または複数種の薬学的に許容される担体とを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」として、医薬品投与に適合するありとあらゆる固体または溶媒（例えばリン酸緩衝生理食塩水緩衝液、水、生理食塩水）分散媒、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤ならびに同類のものが挙げられる。薬学的に許容される担体は、本組成物の他の成分に適合し且つそのレシピエントに有害ではないという意味で「許容され」なければならない。適切な医薬用担体は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ），２０００；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＫｉｂｂｅ，ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９９９で説明されている。一般に、適切な薬学的に許容される担体は当分野で既知であり、最終用途に基づいて選択される。例えば、本発明で使用され得る薬学的に許容される担体として、注射可能なまたは注入用の組成物に適したものが挙げられるがこれに限定されない。この組成物には補充的な活性化合物も組み込まれ得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当分野で公知である。医薬組成物は、当業者に公知であり且つ容易に利用可能である多くの出典（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｔｉｎ Ｅ．Ｗ．，Ｅａｓｔｏｎ Ｐａ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５））で説明されている。
薬学的に許容される担体の量は、化合物および当業者が担体とは異なると分類するであろうあらゆる他の任意選択の成分（例えば他の活性剤）のレベルに依存するだろう。本発明の製剤は例えば、この組成物の重量で約５％～９９．９９％または２５％～約９９．９％または３０％～９０％の薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体は、他の補助剤の非存在下で、この組成物の残余を形成し得る。
任意選択で、本開示の医薬組成物は、他の追加の成分、例えば治療成分および／または予防成分をさらに含む。そのため、本発明は、さらなる態様において、本発明の化合物、１種または複数種の薬学的に許容される担体を１種または複数種の他の活性剤と一緒に含む医薬組成物に関する。一般に、この医薬組成物中に存在する他の活性剤の量は、単独でまたはこの組成物中の他の成分との組み合わせでさらなる利益をもたらすのに十分である。
これらの任意選択の成分は、それらの治療上のもしくは美観上の利益またはそれらの仮定された作用様式により分類され得ることを当業者は理解するだろう。しかしながら、これらの任意選択の成分は、いくつかの実例では複数種の治療上のもしくは美観上の利益をもたらし得るまたは複数種の作用様式を介して機能し得ることも理解される。従って、本明細書での分類は便宜のために行われており、成分を特定の用途または列挙された用途に限定することを意図されてはいない。同様に、適用可能である場合には、成分の薬学的に許容される塩は本明細書において有用である。
本発明の医薬製剤中に他の活性剤が存在する場合には、この化合物の用量は、他の追加の成分が存在しない場合に用いられるものと同一であってもよいし異なっていてもよい。適切な用量は当業者に容易に認識されるだろう。
医薬組成物は、その意図された投与経路（例えば局所または全身）に適合するように製剤化される。投与経路の例として、非経口投与、例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経鼻投与、局所投与、経皮投与、経粘膜投与および直腸投与が挙げられる。経口投与および経鼻投与は吸入による投与を含む。非経口適用、皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は下記の成分を含み得る：無菌希釈剤、例えば注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗微生物剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四作酸；緩衝液、例えばアセテート、シトレートまたはホスフェート、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の浸透圧の調整剤。ｐＨを塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整し得る。非経口用調製物を、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回用量バイアルに封入し得る。
注射用途に適した医薬組成物として、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、非水溶液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性であるべきである。この組成物は製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールならびに同類のもの）ならびにそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の予防を、様々な抗微生物剤および抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールおよび同類のものにより達成し得る。等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムもこの組成物に含まれ得る。この組成物に、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることにより、注射用組成物の持続的吸収をもたらし得る。
必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に必要量で活性化合物を組込み、続いて無菌ろ過することにより、無菌注射用溶液を調製し得る。一般に、塩基性分散媒および上記で列挙されたものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクルにポリヌクレオチドを組み込むことにより分散液を調製する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、適切な調製方法として真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、これらにより活性成分および無菌注射用溶液の予め無菌ろ過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
経口組成物は概して、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、本活性化合物に添加剤を組み込み、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤（例えばゼラチンカプセル剤）の形態で使用し得る。経口組成物を、口腔洗浄薬としての使用のための流体担体を使用しても調製し得る。薬学的に適合性がある結合剤および／またはアジュバント材料を、この組成物の一部として含め得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤および同類のものは、下記の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含み得る：結合剤、例えば微結晶セルロース、タラカントガムもしくはゼラチン；添加剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬもしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステローテ（ｓｔｅｒｏｔｅｓ）；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えばスクロースもしくはサッカリン；または香味料、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料。
経鼻吸入による投与に適した製剤は、担体が固体である場合には例えば約２０～約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含み、この粗粉末を、嗅ぎ薬を服用する方法で投与し、即ち、鼻のかなり近くで保持される粉末の容器から鼻腔を経由した急速の吸入により投与する。担体が噴霧器による投与のための液体である適切な製剤は、薬剤の水性または油性の溶液を含む。吸入による投与のために、薬剤を、適切な噴霧剤（例えば二酸化炭素等のガス）を含む加圧容器もしくはディスペンサまたは噴霧器からの液滴またはエアロゾールスプレーの形態でも送達し得る。そのような方法として、米国特許第６，４６８，７９８号明細書で説明されたものが挙げられる。
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段によるものでもあり得る。経粘膜的投与または経皮的投与の場合、浸透させる障壁に適した浸透剤をこの製剤で使用する。そのような浸透剤は概して当分野で既知であり、この浸透剤として例えば、経粘膜投与の場合には、界面活性剤、胆汁塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与を、経鼻スプレー剤、点滴剤または座薬の使用により達成し得る。経皮投与の場合、本活性化合物（例えば本発明のポリヌクレオチド）を、当分野で一般に知られているように軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化する。
本医薬組成物を、医薬製剤の当業者に公知の方法のいずれかにより調製し得る。一般に、この組成物を、インスリンアナログ、分子または化合物を液体担体もしくは微粉化固体担体または両方と均一にかつ密接に接触させることにより調製する。次いで、必要に応じて生成物を所望の製剤へと成形する。非経口投与の場合、一実施形態では、本発明のインスリンアナログ、化合物または分子を、単位投与注射形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で所望の純度にて薬学的に許容される担体と混合することにより製剤化し得る。
いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、本発明に係るインスリンアナログ、ペプチド、化合物または分子の治療上有効な量を含む。本発明の医薬組成物中の本発明のインスリンアナログ、ペプチド、化合物または分子の含有量は例えば、この医薬組成物の約０．１～約１００重量／重量％である。
キット
上記で説明した材料および他の材料を、本開示の方法の実施にまたは本開示の方法の実施の補助に有用なキットとして任意の適切な組み合わせで一緒に包装し得る。所与のキット中のキット構成要素が本開示の方法での一緒の使用のために設計されていて且つ適合されている場合には有用である。開示されているのは、本開示のインスリンアナログのうちの１つまたは複数を含むキットである。例えば、開示されているのは、本開示のインスリンアナログ、ペプチド、化合物または医薬組成物のうちの１つまたは複数を含むキットである。
これより下記の実施例を参照して本発明のさらに説明するが、この実施例は一例にすぎず限定するものではない。この実施例は図面を参照する。
実施例１－Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のペプチド合成
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の鎖Ａおよび鎖Ｂの固相ペプチド合成
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のＡ鎖およびＢ鎖の両方を、ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ １自動マイクロ波ペプチド合成機（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ＮＣ）によりＦｍｏｃ（９－フルオレンメチルオキシカルボニル）化学で合成した。Ａ鎖の合成の場合には、予め充填したＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（０．２１ｍｍｏｌ／ｇ）（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を使用し、Ｂ鎖の合成の場合には、予め充填したＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－Ｗａｎｇ樹脂（０．４ｍｍｏｌ／ｇ）（ＡｎａＳｐｅｃ，ＥＧＴ．，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用した。側鎖保護を有するＦｍｏｃ－Ｎα－保護アミノ酸は下記の商業的供給源由来であった：Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｐ３ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）およびＲｅａｎａｌ（Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ）。Ｆｍｏｃ－γ－カルボキシ－Ｌ－グルタミン酸γ，γ－ジ－ｔ－ブチルエステル（Ｆｍｏｃ－Ｇｌａ（ＯｔＢｕ）２－ＯＨ）をインハウスで合成した（Ｒｉｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．１９８７）。このアミノ酸の側鎖保護は下記のとおりであった：Ｌｙｓ、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；Ｈｙｐ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒ、ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ｔＢｕ）；Ａｓｎ、ＣｙｓおよびＨｉｓ トリチル（Ｔｒｔ）；Ａｒｇ ２，２，４，６，７－ペンタメチル－ジヒドロキシベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）；Ｇｌｕ、ＧｌａおよびＡｓｐ ｔｅｒｔ－ブチルエステル（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）；Ｃｙｓ、４－メトキシトリチル（Ｍｍｔ）；Ｃｙｓ、Ｓ－ｔｅｒｔ－ブチルチオニル（Ｓ－ｔ－Ｂｕ）。
正確な分子内ジスルフィド結合および分子間ジスルフィド結合の作成を可能にするために、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＢ７の側鎖保護基はＡｃｍであり、ＣｙｓＡ２０およびＣｙｓＢ１９の側鎖保護基はＴｒｔであり、ＣｙｓＡ１１の側鎖をＭｍｔで保護し、ＣｙｓＡ６の側鎖をＳ－ｔ－Ｂｕで保護した。両方の鎖を０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。２分にわたり０Ｗにて、次いで１０分にわたり６０℃の最高温度で３５ＷにてＨＡＴＵ［２－（１Ｈ－９－（アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチル－アミニウムヘキサフルオロホスフェート］：ＤＩＥＡ［Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン］：ＡＡ［保護アミノ酸］（０．９：２：１）により活性化し、ＤＭＦに溶解させた５倍モル過剰のＦｍｏｃ－保護アミノ酸の存在下で、この樹脂に対してカップリング反応を実施した（ＮＭＰ中のＨｉｓを除く）。Ａｒｇを常に、２５分にわたり室温で、次いで１２分にわたり５０℃の最高温度で１５Ｗにて二重にカップリングさせた。Ｃｙｓ、ＨｉｓおよびＧｌａを、６分にわたり５０℃の最高温度で４０Ｗにてカップリングさせた。２段階（各回で新鮮な試薬を使用する）でＤＭＦ中の０．１Ｍ ＨＯＢｔを含む２０％ピペリジンによりＦｍｏｃ基の脱保護（３５Ｗでの２分の最初の脱保護、続いて６０℃の最高温度で３５Ｗでの５分の脱保護）を実施した。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の鎖Ａ：分子内ジスルフィド結合の形成、開裂および精製。
ＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１との間の分子内ジスルフィド架橋を、非酸化的方法を使用してこの樹脂上に形成した（Ｇａｌａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．２００５）。最初の工程では、室温で一晩、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）８ｍＬ中の２０％メルカプトエタノール（ＭＥ）（Ｆｌｕｋａ）および１％Ｎ－メチルモルホリン（ＮＭＭ）で樹脂（７６０ｍｇ）を処理することにより、遊離チオールを遊離させる還元によりＣｙｓＡ６のＳ－ｔ－Ｂｕを除去した。この樹脂をＤＭＦで洗浄し、次いで乾燥させた。次いで、この樹脂を１時間にわたりジクロロメタン（ＤＣＭ）８ｍＬ中の１０倍過剰の２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）（ＤＴＮＢ）約１ｍｍｏｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と反応させて、Ｓ－５－ニトロピリジン－スフェニル（５－Ｎｐｙｓ）保護ＣｙｓＡ６を形成した。過剰の試薬をＤＣＭで洗い流した後、この樹脂を２０分にわたり捕捉剤としてのトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）２μＬの存在下でジクロロメタン（ＤＣＭ）８ｍＬ中の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理して、ＣｙｓＡ１１（Ｍｍ）を脱保護し、同時にＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１との間にジスルフィド架橋を形成した。
この樹脂を２時間にわたり（ＴＦＡ／水／ＴＩＳ：９５：２．５：２．５）を含む試薬１０ｍＬと共に撹拌することにより、この樹脂（７２０ｍｇ）からの開裂および鎖Ａの同時の脱保護を実施した。これに続いて、氷冷無水エチルエーテルを使用してペプチドを沈殿させ、次いで０．１％ＴＦＡ／４０％水／６０％アセトニトリルで抽出して凍結乾燥させた。このペプチドを、流速２０ｍＬ／分での６０分にわたる５％～６５％の溶媒Ｂの範囲の直線勾配による、溶媒系Ａ：０．１％ＴＦＡ／水、Ｂ：０．１％ＴＦＡ／４０％水／６０％ＡＣＮ中のＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（１５－２０μｍ粒径、３００Å）を充填したＷａｔｅｒｓ ＰｒｅｐＰａｋカートリッジ（２．５×１０ｃｍ）での分取Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）により精製した。鎖Ａ １８．７ｍｇ（７．７μｍｏｌ）を得た。このペプチドの質量を、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）機器で測定したエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）－ＭＳにより確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：２４２２．０３Ｄａ；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１値２４２２．０１Ｄａ）。
Ｃｏｍ－Ｉｎｓ Ｇ１の鎖Ｂ：開裂および精製。
樹脂５００ｍｇを２時間にわたり（ＴＦＡ／チオアニソール／３，６－ジオキサ－１，８－オクタンジチオール（３，６－Ｄｉｏｘａ－１，８－ｏｃｔａｎｅｄｉｔｈｏｌ）（ＤＯＤＴ，ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）／水：８７．５／５／２．５／５）を含む試薬１０ｍＬと共に撹拌することにより、この樹脂からの開裂および鎖Ｂの同時の脱保護を実施し、続いて氷冷無水エチルエーテルを使用してペプチドを沈殿させ、次いで０．１％ＴＦＡ／４０％水／６０％ＡＣＮで抽出して凍結乾燥させた。このペプチドを分取ＨＰＬＣ（６０分における２０～８０％の溶媒Ｂの範囲の勾配を除いて鎖Ａの精製に関して説明したもの）で精製して、鎖Ｂ ２５．９ｍｇ（９μｍｏｌ）を得た。このペプチドの質量をＥＳＩ－ＭＳにより確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１値２８６８．２４Ｄａ；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１値２８６８．２２Ｄａ）。
部分的に折り畳まれたＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１（１個のジスルフィド結合を含む）を形成するための、ＤＭＳＯに補助された鎖Ａおよび鎖Ｂのライゲーション。
鎖Ａおよび鎖Ｂ（それぞれ７μｍｏｌ）を０．１％ＴＦＡ／水溶液（７．１ｍＬ）に一緒に溶解させ、ＤＭＳＯ １４．５ｍＬ、水１４．２５ｍＬ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５ ３５．６ｍＬの混合物に添加した。分析ＨＰＬＣで酸化をモニタリングした。室温での２５時間後、この反応を８％ギ酸（１ｍＬ）でクエンチし、２２５ｍＬの総体積まで０．１％ＴＦＡで希釈し、６０分における１５～７５％Ｂの範囲の勾配で分取ＨＰＬＣにより精製した。ヘテロ二量体４．５ｍｇ（０．８５μｍｏｌ、７μｍｏｌの出発量に基づく１２．１％収率）を得た。このペプチドの同一性をＥＳＩ－ＭＳにより確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：５２８７．２５Ｄａ；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１：５２８７．１９Ｄａ）。
完全酸化Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を形成するための、Ｉ２により補助された酸化。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１（部分的に折り畳まれている）４．５ｍｇ（０．８５μｍｏｌ）を２．５％ＴＦＡ／水溶液６．２ｍＬに溶解させ、Ｉ２溶液５５μＬ（ＭｅＯＨ ５ｍＬ中にＩ２ ５０ｍｇ）を添加して６０分にわたり撹拌した。この溶液の黄色が透明になるまで１Ｍアスコルビン酸溶液の添加によりクエンチした。この反応物を水６０ｍＬで希釈し、分取ＲＰ－ＨＰＬＣカラムに充填した。完全酸化Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ １．５ｍｇ（０．２９μｍｏｌ）を得た（１個の鎖間ジスルフィド結合を含む部分的に折り畳まれた生成物の出発量に基づいて収率３５％、および精製済鎖Ａの出発量に基づいて４％）。このペプチドの同一性をＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）質量分析計でのＥＳＩ－ＭＳにより確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：５１４３．１６Ｄａ；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１：５１４３．１６Ｄａ）。
このペプチドの純度をＲＰ－ＨＰＬＣおよびキャピラリ電気泳動で評価した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ １０（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）およびＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）Ｋｉｎｅｔｅｘ ＸＢ－Ｃ１８カラム（４．６×１００ｍｍ、５．０μｍ粒径、１００Å孔径）を使用して定量的ＲＰ－ＨＰＬＣを実施した。溶媒系は、溶媒Ａ＝水中の０．１％ＴＦＡおよび溶媒Ｂ＝６０％ＡＣＮ、４０％Ａを含んだ。勾配を、１．０ｍＬ／分の流速で３０分にわたる２０から８０％へのＢで実施した。検出は２１４ｎｍおよび２８０ｎｍであった。このペプチドの純度は８９％であると決定した。Ｇｒｏｔｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧＰＡ １００機器（Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を使用してキャピラリ電気泳動（ＣＥ）を実施した。電気泳動緩衝液は０．１Ｍリン酸ナトリウム（１５％アセトニトリル）、ｐＨ２．５であった。キャピラリ（０．７５μｍ×１００ｃｍ）への２０ｋＶの印加により分離を達成した。検出は２１４ｎｍであった。評価したペプチドの純度は８０％であった。
ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の合成および精製。
Ａ鎖中にＣｙｓＡ６、Ａ１１～ＳｅｃＡ６、Ａ１１改変を含むＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１（ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１と称する；Ｓｅｃ＝セレノシステイン）をＳａｆａｖｉ－Ｈｅｍａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）で説明されているように化学的に合成し、精製し、そして酸化したが、Ｂ鎖（２，９８０Ｍ－１・ｃｍ－１）および完全酸化ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１（４，４７０Ｍ－１・ｃｍ－１）の定量に補正吸光係数（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）を使用した。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１に関して説明されているように（Ｓａｆａｖｉ－Ｈｅｍａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５））、ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］の合成を実施した。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］のジスルフィド結合の段階的形成を下記で詳細に説明する。
ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４］の鎖Ａ：開裂、ＤＴＴ還元および精製。
濃縮試薬Ｋ（ＴＦＡ／水／フェノール／チオアニソール／１，２－エタンジチオール、体積で８２．５／５．０／５．０／２．５）１ｍＬを使用して１．５時間にわたり樹脂１２５ｍｇからペプチドを開裂させ、この濃縮試薬Ｋを、ＴＦＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）２ｍＬ、Ｈ２Ｏ ６６μＬ、２，２－ジチオビス（５－ニトロピリジン）（ＤＴＮＰ：Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１２ｍｇおよびフェノール１５０ｍｇを使用して調製し、続いてチオアニソール２５μＬを添加した。この開裂混合物をろ過し、冷メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）１０ｍＬで沈殿させた。粗ペプチドを６分にわたる７，０００×ｇでの遠心分離により沈殿させ、冷ＭＴＢＥ １０ｍＬで一回洗浄した。分子内ジセレニド結合形成（ＳｅｃＡ６～ＳｅｃＡ１０）を誘導するために、洗浄したペプチドペレットを水中の５０％ＡＣＮ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）（体積／体積）および２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ｐＨ７．５ １ｍＬ中の１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ、ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）２ｍＬに溶解させ、水１ｍＬを添加し、緩やかにボルテックスし、この反応を２時間にわたり進行させた。次いで、この反応物を８％ギ酸（体積／体積）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）でクエンチし、水中の０．１％ＴＦＡ（体積／体積）で希釈し、流速４ｍＬ／分で３０分にわたる１０～４０％の溶媒Ｂの範囲の直線勾配で溶出させるセミ分取Ｃ１８Ｖｙｄａｃカラム（２１８ＴＰ５１０、２５０×１０ｍｍ、５－μｍ粒径；Ｇｒａｃｅ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用する逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ溶媒は、水中の０．１％（体積／体積）ＴＦＡ（溶媒Ａ）および９０％水性ＡＣＮ（体積／体積）中の０．１％ＴＦＡ（体積／体積）（溶媒Ｂ）であった。ＵＶ吸光度を２２０ｎｍおよび２８０ｎｍで測定して溶出液をモニタリングした。ペプチドの純度を、流速１ｍＬ／分による３０分にわたる１０～４０％の溶媒Ｂの範囲の直線勾配を使用するＣ１８ Ｖｙｄａｃカラム（２１８ＴＰ５４、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、Ｇｒａｃｅ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）での分析ＲＰ－ＨＰＬＣにより評価した。このペプチドを、１，４９０Ｍ－１・ｃｍ－１の吸光係数（ε）を使用して２８０ｎｍでのＵＶ吸光度により定量した。樹脂１３５ｍｇから鎖Ａ ３．８ｍｇを得た。このペプチドの質量をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）－ＭＳにより確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：２，４７３．６７４；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１ ２，４７２．９２４）。ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（バージョン５．１２．１）を使用して分子量を算出した。
ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］の鎖Ｂ：開裂および精製。
上記で説明したように、試薬Ｋ １ｍＬによる３時間の処理によって樹脂９４ｍｇからペプチドを開裂させ、続いてろ過し、沈殿させて洗浄した。洗浄したペプチドペレットを、勾配が１５～４５％の溶媒Ｂの範囲であることを除いて上記で説明したように精製した。同一の勾配を使用して上記で説明したように線状ペプチドの純度を評価し、ペプチド定量を、２，９８０Ｍ－１・ｃｍ－１のε値を使用して実行した。開裂樹脂９４ｍｇから鎖Ｂ ２．３７ｍｇを得た。このペプチドの質量をＥＳＩ－ＭＳで確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：２，８０８．２４、測定したモノアイソトピックＭＨ＋１：２，８０８．２５）。
ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］を形成するための、銅により補助された鎖Ａおよび鎖Ｂのライゲーション。
各鎖の合計１００ｎｍｏｌを組み合わせ、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥させた。このペプチド混合物を０．１％ＴＦＡ（体積／体積）１００μＬに溶解させ、ＣｕＣｌ２・Ｈ２Ｏ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）８００μＬ、１０ｎＭ ＥＤＴＡを含む１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５ １００μＬの混合物に添加した。最終ペプチド濃度は１００μＭであった。この反応物を室温で２４時間放置し、次いで８％ギ酸（体積／体積）でクエンチし、０．１％ＴＦＡで希釈し、流速４ｍＬ／分で３０分にわたる１５～４５％の溶媒Ｂの範囲の直線勾配で溶出させる分取Ｃ１８ Ｖｙｄａｃカラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の純度を、流速１ｍＬ／分でセミ分取精製の場合と同一の勾配を使用する分析ＲＰ－ＨＰＬＣにより評価した。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］を、４，４７０Ｍ－１・ｃｍ－１のε値を使用して２８０ｎｍで定量した。反応収率は２８％であった。鎖Ａおよび鎖Ｂの１：１混合物９００ｎｍｏｌから所望の生成物１．３６ｍｇを得た。ペプチドの同一性をＥＳＩ－ＭＳで確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：５，２７８．１５；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１：５２７８．１５）。
完全に折り畳まれたｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］のヨウ素（Ｉ２）により補助された形成。
Ｉ２（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｇｅｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の溶液を下記のように調製した：Ｉ２ １０ｍｇをＡＣＮ ５ｍＬに添加した。２０分の撹拌後、Ｉ２を完全に溶解させ、水１５ｍＬおよびＴＦＡ ６００μＬを添加した。このＩ２混合物の合計３００μＬを、それぞれ０．１％ＴＦＡ ３００μＬに溶解させた、部分的に折り畳まれたｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，Ｃｙｓ（Ａｃｍ）７，ＰｒｏＢ３，Ｃ（Ａｃｍ）Ｂ７，ＧｌｕＢ１０］１４９ｎｍｏｌ（９０％純度）および１０６ｎｍｏｌ（７２％純度）に添加した。反応物を５分にわたりインキュベートし、１Ｍ Ｌ－アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１０μＬでクエンチし、４．５ｍＬの総体積まで水中の０．１％ＴＦＡで希釈し、部分的に折り畳まれたｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］に関して説明したように精製した。最終生成物（完全に折り畳まれたｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］）の純度を、流速１ｍＬ／分でセミ分取精製の場合と同一の勾配を使用するＣ１８ Ｖｙｄａｃカラム（２１８ＴＰ５４、２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径）での分析ＲＰ－ＨＰＬＣにより評価し、９７％であると決定した。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１［ＧｌｕＡ４，ＰｒｏＢ３，ＧｌｕＢ１０］を、部分的に折り畳まれた生成物に関して説明したように定量した。この反応の収率は１４％であり、所望の生成物０．１８ｍｇを得た。このペプチドの同一性をＥＳＩ－ＭＳで確認した（算出したモノアイソトピックＭＨ＋１：５，１３４．８４；測定したモノアイソトピックＭＨ＋１：５，１３４．０７）。
ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］の合成および精製
ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］は、ヒトインスリンのＢ鎖の残基２３～３０を欠く単量体アナログである。ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］を標準的な手順に従って化学的に合成し、精製し、そして酸化させた。
実施例２－Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ヒトインスリンレセプター結合およびシグナル伝達活性化
インスリンレセプター結合。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１がヒトインスリンレセプター（ｈＩＲ）に結合する能力を結合競合アッセイにより測定した。既に説明されているように（Ｄｅｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．２００４）、ユーロピウム標識ヒトインスリンおよび漸増濃度の毒液インスリンを含む可溶化免疫捕捉ヒトＩＲ（アイソフォームＢ）を使用して競合結合アッセイを実施した。時間分解された蛍光を、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（ＢＭＧＬａｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｒｎｉｎｇｔｏｎ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により、３４０ｎｍ励起フィルタおよび６１２ｎｍ発光フィルタを使用して測定した。非線形回帰（１サイト）（ｏｎｅ－ｓｉｔｅ）分析による曲線の当てはめにより、Ｐｒｉｓｍ ６を使用してＩＣ５０値を算出した。１つのデータポイント当たり３回の反復で少なくとも３つのアッセイを実施した。
Ｃ．ジオグラフス（Ｃ．ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）毒液インスリンｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１は、ｈＩｎｓのＡｒｇＢ２３～ＴｈｒＢ３０に相当するものをいずれも欠いているにもかかわらず、ｈＩｎｓと比べてヒトＩＲ－Ｂレセプターに対して活性が３０倍低いだけであることが分かった（ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１：ｌｏｇ［ＩＣ５０（ｎＭ）］＝１．２４±０．０６；ｈＩｎｓ：ｌｏｇ［ＩＣ５０（ｎＭ）］＝－０．２６±０．０２）（図１および図２）。
インスリンシグナル伝達活性化アッセイ．
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１がインスリンシグナル伝達を誘導する能力をＡｋｔリン酸化分析により評価した。簡潔に言うと、ヒトＩＲ－Ｂを過剰発現するマウス線維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３でｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３レベルを測定した。この細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンおよび２μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。このアッセイのために、１ウェル当たり４０，０００個の細胞を、１％ＦＢＳを含む培養培地が入った９６ウェルプレートに蒔いた。２４時間後、元々の培地の除去後に各ウェルにインスリン溶液５０μＬをピペットで入れた。３０分の処理後、このインスリン溶液を除去し、ＨＴＲＦ ｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３キット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用してｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３の細胞内レベルを測定した。簡潔に言うと、この細胞を穏やかに振盪しつつ１時間にわたり細胞溶解緩衝液（１ウェル当たり５０μＬ）で最初に処理した。次いで、細胞溶解物１６μＬを白色３８４ウェルプレート中の検出試薬４μＬに添加した。４時間のインキュベーション後、このプレートをＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）で読み取り、製造業者のプロトコルに従ってデータを処理した。このアッセイを合計で４回繰り返した。非線形回帰（１サイト）分析による曲線の当てはめにより（Ｐｒｉｓｍ ６を使用して）ＥＣ５０値を算出した。
Ａｋｔリン酸化アッセイではＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１がｈＩｎｓと比べて活性が約１０倍低いだけであることが分かった（ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１：ｌｏｇ［ＥＣ５０（ｎＭ）］＝０．９０±０．０５；Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１：ｌｏｇ［ＥＣ５０（ｎＭ）］＝０．７８±０．１５；ｈＩｎｓ：ｌｏｇ［ＥＣ５０（ｎＭ）］＝－０．２０±０．２０；図３）。本発明者らの結果は、毒液タンパク質が基準の芳香族トリプレットまたは全体としてのＢ鎖Ｃ末端セグメントのいずれかに相当するものを欠いているにもかかわらず、強力な活性を可能にする構造モチーフのＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１内での存在を強調する。
実施例３－Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結晶構造
結晶化およびデータ収集。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を上記で説明したように合成した。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を、４ｍｇ／ｍＬの濃度での１０ｍＭ ＨＣｌ中における結晶化のために調製した。
最初の結晶化試験は、ＣＳＩＲＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で実行するロボット１９２条件低密度マトリックス懸滴スクリーン（ｒｏｂｏｔｉｃ １９２－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｓｐａｒｓｅ－ｍａｔｒｉｘ ｈａｎｇｉｎｇ－ｄｒｏｐ ｓｃｒｅｅｎ）を用いた。２，０Ｍ硫酸アンモニウムおよび１０％ＤＬ－リンゴ酸塩－ＭＥＳ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含む条件から単結晶を抽出し、次いでＡｕｓｔｒａｌｉａｎ ＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎでのＭＸ２ビームライン
Figure 2022191233000001
による１００Ｋでの回折データ収集のために低温ループ（ｃｒｙｏ－ｌｏｏｐ）で直接マウントした（低温保護剤（ｃｒｙｏ－ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）なし）。ＸＤＳを使用してデータを１．９５Åの分解能に処理した（Ｋａｂｓｃｈ（２０１０））。空間群は、単位格子寸法ａ＝ｂ＝ｃ＝７４．９１ÅであるＰ４３２である。１個の単量体当たり５１４３Ｄａの見掛け上の分子量および非対称単位当たり１分子から、溶媒含有量は６４％と推定される。
構造の解明および精密化
開始モデルとしてＰＤＢエントリー３Ｉ３Ｚからのインスリン単量体を使用し且つＰＨＡＳＥＲソフトウェアを使用して、分子置き換えにより構造を解明した（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ，２００７）。結晶学的精密化は、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ，２００４）内でのモデル構築で反復されるＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）を用いた。４回転軸付近で観測した単一の硫酸イオンを、この硫酸イオンの配向または位置を制限することなくモデル化し、この硫酸イオンの占有率を０．２５ではなく１に設定することによりＰＨＥＮＩＸでもたらされた。データ処理および精密化統計を表１に示す。最終モデルは０．２０８／０．２１７のＲｗｏｒｋ／Ｒｆｒｅｅを有した。この最終モデルでの全ての残基はＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの好ましい領域にある。
Figure 2022191233000002
実施例４－Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の構造
この構造から、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１全体の二次構造はｈＩｎｓの二次構造と類似していることが明らかとなり、Ｂ鎖のＮ末端残基は古典的なＴ状態のｈＩｎｓのＮ末端残基と類似の伸長経路をたどる（図４ａ）（このＴ状態は、伸長した立体配座中である残基Ｂ１～Ｂ８を特徴とし、Ａ鎖のらせん状集合体に対して折り返されている）。ｈＩｎｓ Ｂ２２～Ｂ３０に相当する残基が存在しないことから予測されるように、結晶学的単位格子内にはｈＩｎｓ二量体界面に類似する界面が存在しない。結晶内の全ての単量体－単量体界面はまばらであり、４回転軸の周りに充填されたＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１単量体の間に形成されたものを除いて、それぞれが分子表面の約４４０Å２を埋める。４個の単量体は４回転軸付近にある見掛け上の硫酸イオンを配位させ、この硫酸イオンはＧｌｙＡ１のアミドおよび各ＧｌａＡ４の単一の側鎖カルボキシレート基と荷電補償クラスタの一部を形成する（図５）。下記の沈降平衡データに基づいて、本発明者らは、この会合は結晶化のアーチファクトであるとの結論を下す。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の疎水性コアは残基ＶａｌＡ２、ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ１１、ＰｈｅＡ１６、ＴｙｒＡ１９、ＡｒｇＢ６、ＩｌｅＢ１１、ＴｙｒＢ１５およびＬｅｕＢ１８の側鎖を含む（図４ｂ）。これらのうち、３つはヒトインスリンで同一であり（ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ１１およびＴｙｒＡ１９）、３つは控えめに異なり（ＶａｌＡ２→Ｉｌｅ、ＩｌｅＢ１１→ＬｅｕおよびＬｅｕＢ１８→Ｖａｌ）、３つは著しく異なる（ＡｒｇＢ６→Ｌｅｕ、ＰｈｅＡ１６→ＬｅｕおよびＴｙｒＢ１５→Ｌｅｕ）。ｈＩｎｓでは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１中のＴｙｒＢ１５に相当するＬｅｕＢ１５はコアに対して部分的に且つｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４の側鎖に対して部分的に入り、Ｔｙｒ残基による置換により、ｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４に相当するものの非存在下でＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１単量体の露出した疎水性表面が若干減少する。（ｈＩｎｓ ＬｅｕＡ１６の側鎖と比較して）Ｃｏｎｓ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＰｈｅＡ１６の嵩高い側鎖はＴｙｒＢ１５での変化と関連しているように思われ、ＴｙｒＢ１５の側鎖はそのｈＩｎｓ対応物と比較してタンパク質のコアからさらに離れており、（より大きい）ＰｈｅＡ１６芳香環は充填の観点からこれを補う（図４ｂ）。
実施例５－相同性モデリングおよび分子動力学
重要なレセプター結合残基ｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４に相当するものの非存在下での脊椎動物インスリンレセプターに対するＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１活性を可能にする構造原理への洞察を得るために、本発明者らは、ホルモンへの主要な結合部位を形成するヒトインスリンレセプター（ｈＩＲ）の要素に結合したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のモデルを作成した。ＩＲ Ｌ１－ＣＲモジュール（残基Ｇｌｙ５～Ｌｙｓ３１０）およびＩＲ αＣＴセグメント（ＩＲ－Ａアイソフォームの残基Ｐｈｅ７０５～Ｓｅｒ７１９）と複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１のモデルをＭＯＤＥＬＬＥＲ（ｖ９．１５）（Ｗｅｂｂ ａｎｄ Ｓａｌｉ，（２０１４））を使用して作成し、テンプレートは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の上記の結晶構造、ｈＩｎｓと複合体化したＩＲ部位１構成成分の結晶構造（ＰＤＢエントリー４ＯＧＡ；Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）およびインスリンのＡ鎖のＮＭＲ構造（ＰＤＢエントリー２ＨＩＵ；Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．１９９５）であった。全てのモデルは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の翻訳後改変ならびにＩＲ残基Ａｓｎ１６、Ａｓｎ２５、Ａｓｎ１１１、Ａｓｎ２１５およびＡｓｎ２５５のそれぞれでの単一のＮ連結Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基を含んだ（Ｓｐａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．２００８）。
分子動力学（ＭＤ）シミュレーションは、ＣＨＡＲＭＭ３６力場（Ｇｕｖｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｂｅｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１２）を有するＧＲＯＭＡＣＳ（ｖ５．０．４）（Ｐｒｏｎｋ ｅｔ ａｌ．２０１３）を用い、モデラー目的関数が最も低いＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１／ＩＲ複合体のモデルでこのシミュレーションを開始した。カルボキシグルタミン酸等のイオン化可能残基はその荷電状態にあると仮定した。各系を、全原子を超えて１０Å延びる立体ボックス中でＴＩＰ３Ｐ水モデルを使用して溶媒和した。ナトリウムイオンおよび塩化物イオンを添加して、系を中和して０．１Ｍの最終イオン強度を付与した。タンパク質および溶媒（イオンを含む）を、０．１ｐｓのカップリング時間を適用した３００Ｋで熱浴に速度再スケーリング（ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｒｅｓｃａｌｉｎｇ）しつつ別々にカップリングした。全てのシミュレーションを、１０Åの単一非結合カットオフにより、および２５ステップ（５０ｆｓ）の近傍リスト更新頻度のＶｅｒｌｅｔ近傍探索カットオフスキーム（Ｖｅｒｌｅｔ ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｃｕｔ－ｏｆｆ ｓｃｈｅｍｅ）を適用して実施し、全てのシミュレーションで使用する時間ステップは２ｆｓであった。
１．２Åのグリッド幅および６次スプライン補間を適用して、長距離静電学を説明するために使用した粒子メッシュＥｗａｌｄ法と共に周期的境界条件を使用した。Ｐ－ＬＩＮＣＳアルゴリズムを使用して全ての結合長を制限した。シミュレーションは、最初の最小化およびその後の全てのタンパク質原子が拘束された５０ｐｓのＭＤからなった。位置が拘束されたＭＤに続いて、ＭＤシミュレーションを、αＣＴのＣ末端残基（残基Ｖａｌ７１５～Ｓｅｒ７１９）を除いてＩＲのＣα原子に位置の拘束を適用してさらに１０ｎｓにわたり継続した。Ｃα原子が拘束されたＭＤに続いて、このシミュレーションをさらに５０ｎｓにわたり拘束することなく継続した。最終モデルの座標を付録ＩＩに示す。
ＴｙｒＢ１５
このモデルから現れる顕著な特徴は、ｈＩＲ αＣＴ残基Ｐｈｅ７１４との立体衝突を回避するために、本発明者らの結晶構造においてＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ１５の側鎖がこのＴｙｒＢ１５の立体配座に関して回転していることである。この回転は、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ１５の側鎖をレセプター複合体中においてｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４に占められているポケットへと方向付け、そのためＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ１５はレセプター結合に関してｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４の代わりであることが示唆される（図６）。ＴｙｒＢ１５側鎖のそのような回転はまた、重要なｈＩＲ αＣＴ残基Ｐｈｅ７１４が毒液タンパク質コアと結合することも可能にする（図６）。対照的に、脊椎動物のインスリンはＢ１５位でロイシンを有し、このロイシンは厳密に保存されている。
ＴｙｒＢ２０
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ２０の側鎖はＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ１５の側鎖に隣接しており、ｈＩｎｓＰｈｅＢ２４に相当するものの欠如の補償にも関与し得る。本発明者らは、ＴｙｒＢ１５側鎖と関連する結晶学的に異なる電子密度はいくらか不十分に定義されており、そのような可動性に対応することに留意する（図７）。対照的に、脊椎動物のインスリンはＢ２０位でグリシンを有し、このグリシンは厳密に保存されている。
ＰＴＭ
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１は下記の４種の翻訳後改変（ＰＴＭ）を含む：残基Ａ４およびＢ１０は、ｈＩｎｓ中のＧｌｕおよびＨｉｓとは（それぞれ）対照的にγ－カルボキシグルタメート（Ｇｌａ）であり、残基Ｂ３はｈＩｎｓ中のＡｓｎとは対照的にヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）であり、Ａ鎖Ｃ末端残基ＣｙｓＡ２０はアミド化されており（図１）、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１Ｂ鎖のナンバリングは、ｈＩｎｓとの比較を可能にするために－１で始まることに留意されたい。そのような改変はコノトキシンで一般に観測されるが、インスリンではこれまで検出されていない（Ｓａｆａｖｉ－Ｈｅｍａｍｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ＰＴＭを含むＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の合成アナログはＰＴＭフリーのアナログと比べてヒトＩＲ－Ｂに対して活性が４倍高く（図２）、ＰＴＭフリーのアナログと比べて８倍高い効率でＡｋｔリン酸化を誘導した（図３）。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ構造内の４種のＰＴＭの調査により、ＣｙｓＡ２０のアミド化を除いて全てがＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の構造の安定化で役割を果たす可能性があることが明らかになる。ＧｌａＡ４の両方の側鎖のカルボキシレートは、ｈＩｎｓ ＧｌｕＡ４の単一の側鎖のカルボキシレートと同様にＧｌｙＡ１のＮ末端アミノ基と極性相互作用している（図４ｃ）。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１におけるこれらのさらなる相互作用は、短いＡ鎖Ｎ末端ヘリックスの安定化を補助し得る。ＧｌａＢ１０の一方の側鎖のカルボキシレート基はＣｙｓＢ７の主鎖アミドへの水素結合を形成し、Ｂ鎖Ｎ末端領域の安定化で役割を果たし得、ｈＩｎｓ内に同等の相互作用は存在せず、ｈＩｎｓ ＨｉｓＢ１０は六量体形成に関与している（図４ｄ）。ＨｙｐＢ３の側鎖ヒドロキシル基はｈＩｎｓ ＡｓｎＢ３の側鎖アミド酸素に同等に位置し、ＳｅｒＡ１２の主鎖アミドへの（長い）Ｈ結合を形成し得る（図４ｅ）。ＣｙｓＡ２０のＣ末端アミドは毒液タンパク質の残部と相互作用しない。
実施例５で示されたモデル内で、レセプターと相互作用する唯一のＰＴＭ残基はＧｌａＢ４であり、その相互作用はｈＩｎｓ ＧｌｕＢ４およびαＣＴ Ａｓｎ７１１の間のものと同等である（図８）。
実施例６－ｈＩｎｓ Ｇ１ ＤＯＩ Ｌ１５Ｙ．Ｇ２０Ｙシグナル伝達活性化
上記で説明したように、ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］のインスリンシグナル伝達を誘導する能力をＡｋｔリン酸化分析により評価した。簡潔に言うと、ヒトＩＲ－Ｂを過剰発現するマウス線維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３でｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３レベルを測定した。この細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－ストレプトマイシンおよび２μｇ／ｍＬピューロマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。このアッセイのために、１ウェル当たり４０，０００個の細胞を、１％ＦＢＳを含む培養培地が入った９６ウェルプレートに蒔いた。２４時間後、元々の培地の除去後に各ウェルにインスリン溶液５０μＬをピペットで入れた。３０分の処理後、このインスリン溶液を除去し、ＨＴＲＦ ｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３キット（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用してｐＡｋｔ Ｓｅｒ４７３の細胞内レベルを測定した。簡潔に言うと、この細胞を穏やかに振盪しつつ１時間にわたり細胞溶解緩衝液（１ウェル当たり５０μＬ）で最初に処理した。次いで、細胞溶解物１６μＬを白色３８４ウェルプレート中の検出試薬４μＬに添加した。４時間のインキュベーション後、このプレートをＳｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ，Ｖｅｒｍｏｎｔ，ＵＳＡ）で読み取り、製造業者のプロトコルに従ってデータを処理した。このアッセイを合計で４回繰り返した。非線形回帰（１サイト）分析による曲線の当てはめにより（Ｐｒｉｓｍ ６を使用して）ＩＣ５０値を算出した。
Ａｋｔリン酸化アッセイではｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］がｈＩｎｓ［ＤＯＩ］と比べて活性が約５倍高いことが分かった（図９）。本発明者らの結果は、ヒトインスリンＢ鎖の１５位および２０位での変異の８個のＣ末端残基の欠如を少なくとも部分的に補償する能力を強調する。
実施例７－Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の溶液特性
沈降平衡分析を使用して、１００μｇ／ｍＬでの溶液中におけるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の自己会合状態を分析した。簡潔に言うと、分析的超遠心分離を、１２ｍｍ路長セルでＢｅｃｋｍａｎ ＸＬＩ分析的遠心分離機を使用して２０℃で実行した。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を、１０ｍｇ／ｍＬストックから、１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで１０ｍＭ ＨＣｌで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に希釈した。等体積の１０ｍＭ ＮａＯＨを添加して任意のｐＨ変化を中和した。１００μＬの総試料体積を使用した。０．２ｍＭ ＺｎＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）または０．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む同一の試料も調製した。放射状の濃度分布を２２０ｎｍでの吸光度により測定した。１時間間隔での連続吸光度走査により評価した場合、３０，０００ｒｐｍおよび４５，０００ｒｐｍで沈降平衡を確立した。両方の速度でのデータを、ＳＥＤＮＴＥＲＰ（Ｌａｕｅ ｅｔ ａｌ．１９９２）を使用して組成から推定される溶液密度および溶媒部分比体積の値を使用して、ＳＥＤＰＨＡＴ（Ｈｏｕｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００７）における単一の理想的な沈降物種に一緒にフィットさせた。ジスルフィドを除いて、全ての翻訳後改変をＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１部分比体積の推定において無視した。報告した誤差は０．６８信頼水準でのフィットの精度を説明し、この誤差を、ＳＥＤＰＨＡＴで実行されるようにＭｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏシミュレーションから推定した。
データ（３０，０００ｒｐｍおよび４５，０００ｒｐｍで得た）は、見掛け上のＭＷ ５３８０±５５ｇ／ｍｏｌの単一の沈降種であるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１により十分に説明される（図１０）。フィットは良好であるが（減少（ｒｅｄｕｃｅｄ）Ｘ２＝０．９５）、最良フィット質量は予想よりもわずかに高い。このことは、存在する翻訳後改変を無視して本発明者らがアミノ酸組成から決定したタンパク質部分比体積の不正確な推定を反映すると思われる。しかしながら、予測した質量のこの増加は、存在する少量のより高い分子量種の結果である可能性がある。最大でも、これは５％の二量体Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の存在に相当するだろう。５１４３の算出した理論質量に基づいて、本発明者らは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１が溶液中で主に単量体であるとの結論を下す。従って、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の単量体の性質は、この単量体にはインスリンのオリゴマー化に重要であることが示されているヒトインスリン鎖ＢのＣ末端部分（アミノ酸Ｂ２２～Ｂ３０）に相当するものが欠如していることと一致している。
本発明者らはまた、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、ＳＯ４ ２－またはＰＯ４ ３－がＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の凝集状態を変更するかどうかも試験し、具体的には、Ｚｎ２＋の場合には、このイオンがｈＩｎｓの場合と同様にＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の多量体化を媒介し得るかどうかを試験し、ＳＯ４ ２－の場合には、このイオンが、結晶中に観測される四量体配置の媒介に関与し得るかどうかを試験した。これらのそれぞれのイオンの存在下で同様の沈降平衡プロファイルを観測し、単一の沈降種により同様に十分に説明され、見掛け上のＭＷの有意な変化を伴わない（データを示さない）。従って、本発明者らは、少なくとも最大１００μｇ／ｍＬの濃度でこれらのイオンのそれぞれの存在下にてＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１は主に単量体のままであるとの結論を下す。
実施例８－レセプターの一次ホルモン結合部位を再構成するヒトインスリンレセプター断片と複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結晶構造
結晶化およびデータ収集。
ヒトインスリンレセプター（ｈＩＲ）の一次インスリン結合部位（「部位１」）を、最小化され且つインスリンまたはインスリンアナログと部位１との相互作用の結晶学的分析に適したドメインに再作成し得る（Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１６）。このプロセスに不可欠なのは、結晶化を補助するためのモノクローナル抗体８３－７（Ｓｏｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８６）の断片のレセプター断片のＣＲドメインへのさらなる付着である。この技術を使用して、ｈＩＲ部位１を再作成する元素と共複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の結晶を生成した。
実施例１で説明したようにＣｏｎ－Ｉｎｇ Ｇ１を合成した。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を１０ｍＭ ＨＣｌに再懸濁させた。
ｈＩＲ構築物ＩＲ３１０．Ｔ（即ち、ｈＩＲの残基１～３１０および続いてトロンビン開裂部位のＮ末端残遺物Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇおよび集合バリアント（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔ）Ｔｙｒ１４４Ｈｉｓの包含）を、Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３で説明されているように製造して精製し、モノクローナル抗体８３－７（Ｓｏｏｓ ｅｔ ａｌ．１９８６）の可変ドメインモジュールであるＦｖ８３－７を（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１６）で説明されているように製造して精製した。次いで、ＩＲ３１０．ＴをＦｖ８３－７と複合体化させ、この複合体をＬａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１６で説明されているように精製した。次いで、このＦｖ８３－７．ＩＲ３１０．Ｔ複合体を、Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．２０１６で説明されているようにエンドグリコシダーゼＨ処理に供した。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（ＵＳＡ）との契約の下でｈＩＲのＡアイソフォームのペプチドＩＲ－Ａ７０４－７１９を合成した。
レセプターの一次ホルモン結合部位を再構成するヒトインスリンレセプター断片と複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を、表２に示すＥｎｄｏＨ－処理Ｆｖ８３．７．ＩＲ３１０．Ｔ、ＩＲ－Ａ７０４－７１９およびＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１を組み合わせることにより調製した。
Figure 2022191233000003
最初の結晶化試験は、ＣＳＩＲＯ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｓａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で実行するロボット５７６条件低密度マトリックス座滴スクリーン（ｒｏｂｏｔｉｃ ５７６－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｓｐａｒｓｅ－ｍａｔｒｉｘ ｓｉｔｔｉｎｇ－ｄｒｏｐ ｓｃｒｅｅｎ）を用いた。各滴は１：１ ウェル：複合体体積比を含んだ。結晶の成長を、１．８～２．０Ｍ 硫酸アンモニウムまたは１．８～２．０Ｍ 硫酸アンモニウムと、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５；ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．０およびＭＥＳ－ＮａＯＨ、ｐＨ６．５のいずれか１つとを使用して観察した。
結晶化条件を最適化し、同一のタンパク質：ペプチド：Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１混合物の単結晶を、Ｌｉｎｂｒｏ ２４プレート中で懸滴フォーマットを使用して、ならびに１．８～２．０Ｍ 硫酸アンモニウム、または１．８～２．０Ｍ 硫酸アンモニウム、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５からなるリザーバー緩衝液を使用して成長させた。他の緩衝液（例えば、ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．０およびＭＥＳ－ＮａＯＨ、ｐＨ６．５）も試験し、同様に回折結晶が生成された。１．７Ｍ 硫酸アンモニウム、５０ｍＭ ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ ｐＨ７．０の溶液中で成長させた単結晶から最良の回折データを得た。
ＩＲ－Ａ７０４－７１９およびＥｎｄｏＨ－処理Ｆｖ８３．７．ＩＲ３１０．Ｔ複合体と共複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の単結晶を、リザーバー緩衝液および３０％グリセロールからなる溶液に移して低温ループに抽出することにより低温保護した。次いで、このループを液体窒素浴に直接投入した。３．２５Å分化能までの回折データを、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）でビームラインＭＸ２にて収集した。ＸＤＳパッケージ（Ｋａｂｓｃｈ，２０１０）を使用してデータを統合して結合し、データ処理統計を表３に示す。空間群は、単位格子寸法ａ＝１０６．１６、ｂ＝２２７．１２およびｃ＝２２８．７０ÅのＩ２２２である。１個の複合体当たり６３４４０Ｄａの見掛け上の分子量および非対称単位当たり２個の複合体から、溶媒含有量は７７％と推定される。
構造の解明および精密化
ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌ．２００７）を使用する分子置き換えにより構造を解明し、探索モデルとしてＰＤＢエントリー４０ＧＡの単一Ｆｖ８３－７．ＩＲ３１０．Ｔ成分を用いた（Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）。非対称単位中には２個のコピーがあった。Ｃｏｎ－ＩｎｓＧ１の２個のコピー（ＩＲの２個のそれぞれのＬ１＋ＩＲ－Ａ７０４－７０９断片に別々に結合している）に対応する電子密度が差電子密度マップ中に現れた。次いで、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の残基をこの電子密度に客観的に組み込んだ。Ｘ線結晶学的精密化はＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）を用いた。精密化の最終段階は、ＴＬＳ精密化、個々のＢ因子精密化の制限、およびねじれＮＣＳ制限を含んだ。最終の精密化統計を表３に示す。最終モデルは、表４で詳述する残基を含んだ。
Figure 2022191233000004
Figure 2022191233000005
実施例９－ヒトインスリンレセプター断片と複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１
結晶学的非対称単位内のこの複合体の２個のコピーは全体構造においてほんのわずかな差違しか示さず（図１１）、そのため、ここでの説明は複合体１に限定されるだろう。
Ｃｏｎ－ＩｎｓＧ１複合体の結晶構造と、Ｆａｂ８３－７．ＩＲ３１０．ＴおよびＩＲ－Ａ７０４－７１９（ＰＤＢエントリー４ＯＧＡ；Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）との共複合体中のｈＩｎｓの結晶構造との重ね合わせを図１２に示す。ヒトインスリンレセプター断片と複合体化したＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の全体構造は、ＩＲ３１０．Ｔ、ＩＲ－Ａ７０４－７１９およびＦａｂ８３－７と複合体化したｈＩｎｓの構造内の同等の部分構造の全体構造と類似している。顕著な差違は、Ｃｏｎ－ＩｎｓＧ１複合体の場合に、解釈可能な電子密度がＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ Ｂ７に対してＮ末端の３個の残基について明らかであった。そのため、最終モデルはＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１残基Ｂ４、Ｂ５およびＢ６を含む。対照的に、ヒトインスリン共複合体構造では、ｈＩｎｓのＢ鎖は、Ｃ末端方向で前方の残基Ｂ７からのみモデル化される可能性がある。
図１３は、ここで決定されたＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１複合体の構造と、ＩＲ３１０．Ｔ、ＩＲ－Ａ７０４－７１９およびＦａｂ ８３－７と複合体化したヒトインスリンの構造との重ね合わせを示し、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の残基ＴｙｒＢ１５に焦点を合わせる。明らかなように、ＴｙｒＢ１５の側鎖は、そのレセプターフリーの位置から回転して、ヒトインスリン複合体中においてｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４の側鎖に占められている同じ位置に配置される。この複合体構造は、ＴｙｒＢ１５がＰｈｅＢ２４の欠如の補償に役立つという実施例５の結論を支持する。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ ＴｙｒＢ２０に関しては、解釈可能な電子密度は存在しない。
実施例１０－ヒトインスリンレセプターの一次結合部位（部位１）を含む構成成分によるｈＩｎｓ［ＤＯＩ］、ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］の分子モデリング
ＩＲ Ｌ１ドメイン（残基Ｇｌｙ５～Ｃｙｓ１５５）およびＩＲ－Ａ７０５－７１４と複合体化したデス－オクタ－インスリン（ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］：Ｂ鎖の８個のＣ末端残基を欠くヒトインスリン）のモデルを、ヒトインスリン（ｈＩｎｓ）と複合体化したＩＲ部位１構成成分の結晶構造（ＰＤＢエントリー４ＯＧＡ；Ｍｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１４）およびインスリンのＡ鎖のＮＭＲ構造（ＰＤＢエントリー２ＫＪＪ）を使用してＭＯＤＥＬＬＥＲ（ｖ９．１６）（Ｗｅｂｂ＆Ｓａｌｉ，２０１４）により作成した。全てのモデルは、ＩＲ残基Ａｓｎ１６、Ａｓｎ２５およびＡｓｎ１１１のそれぞれで単一のそれぞれのＮ－連結Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基の翻訳後改変を含んだ。
ＧＲＯＭＡＣＳ（ｖ５．１．２）（Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．２０１５）プログラム一式、およびＭＯＤＥＬＬＥＲ目的関数が最も低いｈＩｎｓ［ＤＯＩ］－ＩＲ複合体のモデルで開始されるＣＨＡＲＭＭ３６（Ｇｕｖｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｂｅｓｔ ｅｔ ａｌ．２０１２）力場の修正バージョンを使用して、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを行った。周期的境界条件を全ての軸に沿って使用して、各系を、全原子を超えて１０Å延びるＴＩＰ３Ｐ単一点水モデル溶媒和立体ボックスに入れた。イオン化可能残基はその荷電状態にあると思われ、系を中和して十分なナトリウムイオンおよび塩化物イオンを添加することにより０．１Ｍの最終イオン強度を得た。速度再スケーリング（Ｂｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．２００７）、３００Ｋでのサーモスタットに独立してカップリングさせたタンパク質および溶媒を用いて２つの群で温度カップリングを行い、両方の群は０．１ｐｓの時間定数を用いた。１バールの参照圧力および０．５ｐｓの時間定数を使用してＢｅｒｅｎｄｓｅｎ（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．１９８４）技術により等方圧カップリングを実施した。全てのシミュレーションを、１．０Åのグリッド幅および６次スプライン補間で粒子メッシュＥｗａｌｄ法（Ｅｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．１９９５）を使用するために説明される長距離静電学により、普遍的な１２Å非結合相互作用カットオフで実施した。Ｖｅｒｌｅｔ近傍探索カットオフスキームに２５ステップ（５０ｆｓ）の近傍リスト更新頻度を適用し、全てのシミュレーションで使用する時間ステップは２ｆｓであった。Ｐ－ＬＩＮＣＳアルゴリズム（Ｈｅｓｓ，２００８）により全ての結合長を制限した。シミュレーションは最初の最急降下最小化およびその後の全てのタンパク質原子が拘束された５０ｐｓのＭＤを経験した。位置的に拘束されたＭＤに続いて、ＭＤシミュレーションをさらに１００ｎｓにわたり継続した。
１００ｎｓ ＭＤ後にＦｏｌｄＸプロブラム一式（Ｓｃｈｙｍｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．２００５）を使用してインスリンアナログとレセプターとの相互作用の分析を行った。ＦｏｌｄＸ ＲｅｐａｉｒＰＤＢユーティリティを使用して構造に不合理なねじれ角やファンデルワールス衝突がないことを確実にした後に位置走査を実行し、ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］の各部位での得られた変異ΔΔＧの寄与を示す。
デス－オクタ－インスリン（ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］）
ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］により生じる相互作用は、天然ｈＩｎｓとレセプターとのＸ線結晶構造（ＰＤＢエントリー４ＯＧＡ）で観測されるインスリンとレセプターとの間の界面での類似の相互作用（特に、Ｂドメイン残基ＶａｌＢ１２、ＬｅｕＢ１５およびレセプター残基Ａｓｎ１５、Ｌｅｕ３７、Ｐｈｅ３９およびＰｈｅ７１４により作成される疎水性ポケット内で生じた相互作用）を保つ。Ｂ鎖Ｃ末端残基の非存在により、Ｂ鎖ヘリックスはもはや巻き戻さず、その結果、ＡｒｇＢ２２とＧｌｕＡ１７との間に一時的な塩架橋が生じる。このことはまた、Ｂ鎖ヘリックスがシフトしてＩＲ－Ｌ１にさらに近づくことも可能にし、その結果、ＴｙｒＢ１６とＩＲ－Ｌ１ Ｔｙｒ６７との間にπ－π平行置き換えスタッキング（ｐａｒａｌｌｅｌ ｄｉｓｐｌａｃｅｄ ｓｔａｃｋｉｎｇ）が生じる。この最終モデルを図１４に示す。
デス－オクタ－インスリン－ＴｙｒＢ１５（ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］）
１００ｎｓの期間にわたりｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］により観測される相互作用は、ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］により生じた相互作用と類似している。Ｂ鎖ヘリックスは、ＴｙｒＢ１６とＩＲ－Ｌ１ Ｔｙｒ６７との間で同様のπ－πスタッキングを有するＩＲ Ｌ１ドメインにより近いシフトを反映する。Ｃ末端Ｂ鎖残基の柔軟性は同様に、ＡｒｇＢ２２とＧｌｕＡ１７との間の一時的な塩架橋を可能にする。Ｂ１５位でのＴｙｒの存在は、そうでなければｈＩｎｓ ＬｅｕＢ１５に占められる空間を占めるＤＯＩ－（ＩＲ－Ａ７０４－７１９）－Ｌ１界面の疎水性コアへと突出する。最終モデルを図１５に示す。
デス－オクタ－インスリン－ＴｙｒＢ２０（ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］）
最初の比較モデルは、ＴｙｒＢ２０がｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４結合部位を確実に占有するための制限を含んだ。１００ｎｓのＭＤの後、ＴｙｒＢ２０はｈＩｎｓ ＰｈｅＢ２４結合部位中に残り、レセプターとの他の全ての相互作用は天然様に見えた。ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］とは異なり、ＴｙｒＢ１６とＩＲ Ｌ１ Ｐｈｅ３９との間の天然のπ－π平行置き換えスタッキングは維持されたが、ＡｒｇＢ２２とＧｌｕＡ１７との間でＢ鎖Ｃ末端残基の欠如により引き起こされる塩架橋はｈＩｎｓ［ＤＯＩ］で観測したものと同じであった。最終モデルを図１６に示す。
ＦｏｌｄＸ変異位置走査分析
ＦｏｌｄＸ位置走査ユーティリティは、変異に適応し得るｈＩｎｓ［ＤＯＩ］内の位置および適応し得ない位置に関する定性的解釈を提供する（図１７、図１８および図１９）。ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］内およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］内では、Ａ鎖内の溶媒露出残基（特に残基ＧｌｕＡ４、ＧｌｎＡ５およびＴｈｒＡ８）は、ほとんどの変異に対して少しの正味の正または負の効果を示す。このことは、代わりにこれらの残基の変異に対して正の影響を提示したｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］アナログとは異なる。相互作用面にて疎水性コア内で起こる変異は当然のことながら、全てのモデルによってより大きな効果を示唆するように見え、全てのモデルは、ジスルフィ結合したシステインが有意なΔΔＧアドバンテージを受け得ることを示唆したが、ジスルフィド相互作用がこのアナログの全体構造に対して重要であることから、このデータを除いた。残基ＴｙｒＡ１４、ＡｓｎＡ１８、ＨｉｓＢ５およびＧｌｕＢ２１での変異は、ＤＯＩ－ＴｙｒＢ２０アナログにおいてこれらの位置での変異が有利であることを示し、これらの変異にはＤＯＩアナログには存在せず、より好ましい相互作用を示す。しかしながら、ＤＯＩ－ＴｙｒＢ１５アナログはＤＯＩおよびＤＯＩ－ＴｙｒＢ２０の結果の混合と類似の結果を示し、ＨｉｓＢ１５を除いて全ての部位でほんのわずかな差違を示唆する。ＡｓｎＢ３位およびＧｌｎＢ４位での変異は逆を示したが、これはおそらく、このフレームでのＢ鎖ヘリックスに近接したＢ鎖の配向に起因しており、従って、サンプリング技術のアーチファクトである。
結論
ＩＲ Ｌ１ドメイン及びＩＲ－Ａ７０５－７１９と複合体化したｈＩｎｓアナログ、ｈＩｎｓ［ＤＯＩ］、ｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］およびｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］のＭＤシミュレーションならびにその後の変異分析は、重要なレセプター結合残基（特にＰｈｅＢ２４）の欠如にかかわらずｈＩｎｓ［ＤＯＩ］が結合するという本方法に関する洞察を提供する。このシミュレーションは、位置Ｂ２０でのチロシン置換がｈＩｎｓ中のＰｈｅＢ２４の代わりとして作用し得、ほぼ同じ位置を占め、シミュレートした時間にわたり安定であることを示す。インスリンレセプター断片と相互作用するｈＩｎｓ［ＤＯＩ］（ＰｈｅＢ２４、およびＢ１５またはＢ２０での変異によりＰｈｅＢ２４を置き換えるあらゆる試みを欠く）のシミュレーションは、これらの結合は、ＩＲ Ｌ１およびＩＲ－Ａ７０５－７１９とのｈＩｎｓの結合と全体的に類似することを示すが、ＩＲ Ｌ１ドメインとアナログＢ鎖との間の部位で僅かな差違がある。ＩＲ Ｌ１ドメインへのＢ鎖のシフトは、起こるであろう立体衝突に起因してｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ２０，ＤＯＩ］複合体中では観測されないがｈＩｎｓ［ＴｙｒＢ１５，ＤＯＩ］では観測され、このことは、Ｂ２０での置換の影響はＢ１５での置換の影響とは異なることを示唆する。変異ＦｏｌｄＸ算出は、同様に好ましい変異がＢ２０変異の際に生じる結合ポーズの変化による影響を受けない部位で存在することを示唆し、これらの差違は疎水性コアの遠位に局在した。
実施例１１－単量体ヒトインスリンアナログの開発
新規インスリンアナログの研究戦略
本明細書で説明したように、捕食性カタツムリの毒液中の単量体インスリンバリアント（Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１）の近年の発見は本開示のペプチドの背後の研究の推進を助けている。方法が開発され、どのようにしてＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１が二量体化を回避し、レセプター結合およびインスリンシグナル伝達を維持し、それにより非常に迅速に作用するかを説明するデータが得られている。さらに、基礎となる発見からの洞察を使用して、４箇所のアミノ酸位置でヒトインスリンの配列と異なるだけであり、単量体であり、即時作用性であり且つ本物のヒトインスリンの効力に匹敵する効力を示すタンパク質を開発している。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の研究から得られた洞察を使用して、ヒト「短縮型」タンパク質から４種のアミノ酸置換のみを示す単量体ヒトインスリンを開発した。
ヒトインスリンの構造の制約を回避するために自然から解決策を得、魚を狩るイモガイであるコヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）は、数秒以内に魚に麻痺性低血糖ショックを誘発する毒液から特殊なインスリンの使用を進化させている。毒液インスリンＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の配列を、ゲノム配列決定および質量分析の組み合わせを使用して解明した（図１）。特に、下記の４種の翻訳後改変を観測した：Ａ４ ＧｌｕおよびＢ１０ Ｇｌｕからガンマカルボキシグルタミン酸、Ｇｌａへ；Ｂ３ Ｐｒｏから２－ヒドロキシプロリンへ、ならびにＡ鎖上のＣ末端アミド。この毒液インスリンの低い存在量に起因して、この毒液インスリンを動物からは単離し得ない。代わりに、合成を容易にするためにジセレン結合がＡ鎖中の分子内ジスルフィド結合を置き換えた合成アナログ（ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１）を得た。ｓＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１は、魚に注射すると低血糖ショックを誘発し、水中に存在すると魚の運動性を遅らせる。魚へのこの効果以外に、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の最も特別な特徴は、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１は「短縮型」Ｂ鎖により今日まで報告されている最も短いインスリン分子であるということである。短縮型ヒトインスリン（デス－オクタペプチドインスリン、ＤＯＩ）は単量体であることから、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１は単量体であり且つＵＦＩ（超即時作用性インスリン）として使用され得ることが示された。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１は、ヒトインスリンにおいてヒトインスリンレセプター（ｈＩＲ）との結合に関与する下記の２種のセグメントを欠く：第１に、ヒトインスリンのＡ２１ ＡｓｎはｈＩＲ結合部位１と接触し、その除去により結合親和性が１００倍低下する。第２に、芳香族トリプレット（Ｂ２４～Ｂ２６）は、ヒトインスリンがｈＩＲ結合部位での接触を介してｈＩＲ結合部位１に結合するための一要素である。これらの残基の除去により、親和性が１，０００倍低下する。
これらの懸念にもかかわらず、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１（セレンアナログの代わり）を化学的に合成し、このＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１はヒトインスリンと比べてわずか３０倍低い親和性でｈＩＲに結合することを発見した。この驚くべき結果は下記の重要な問題を提起した：Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１はヒトインスリンにより使用される重要な芳香族残基なしでどのようにしてｈＩＲに結合するのか？Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の構造はヒトインスリンとほぼ同一の主鎖を示すことが分かった。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の構造を、公開されているヒトインスリン－ｈＩＲ共構造にフィットさせることにより、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１ Ｂ１５ Ｔｙｒ およびＢ２０ Ｔｙｒ（ヒトインスリン中のＬｅｕおよびＧｌｙ）はヒトＩＲと相互作用して、ヒトＢ２４ Ｐｈｅが果たす役割の代わりとなると推察した。これらの強力な結果は、カタツムリインスリン構造に基づいてヒト単量体ＵＦＩを開発するための合理的根拠を提供する。
治療リード（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｌｅａｄｓ）としてのヒト単量体インスリンアナログの開発
超即時作用性インスリン（ＵＦＩ）の開発は、インスリンアナログ開発における次の大きな進歩を表す。ヒトインスリンの再設計における基本的な課題は、レセプター結合に関与する同一の残基が二量体形成も媒介することである。そのため、毒液インスリンＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の発見は、単量体であり超即時作用性のインスリンの生成における重要な前進を表しており、なぜならば、このＣｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１はこれらの残基を欠いている（そのため二量体化しない）が、インスリンレセプターに結合して活性化する能力を保持しているからである。しかしながら、特に糖尿病が毎日のインスリン注射を必要とする慢性疾患であることを考慮すると、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１とヒトインスリンとの間の低い配列同一性は免疫応答を引き起こす可能性があることが懸念される。従って、毒液インスリンに基づいてＵＦＩを開発する代わりに、ヒトＤＯＩ（デス－オクタペプチド（Ｂ２３～３０）ヒトインスリン）の足場から始めることができ、なぜならば、このヒトＤＯＩは単量体であり、２個または３個の変異を示すインスリンアナログの現在の臨床的使用により示されるように、トランケート型ヒトインスリンの近いアナログはヒト免疫系に許容される可能性があるからである。しかしながら、ＤＯＩはほぼ不活性である（ヒトインスリンと比べて１，０００倍弱い）ことが課題である。データは、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１がＢ１５ Ｔｙｒおよび／またはＢ２０ Ｔｙｒを使用してＢ２４ Ｐｈｅの欠失を補償することを示し、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の親和性を増強するさらなる改変をさらに示す。これらの洞察を利用して、ＤＯＩを、糖尿病処置のための治療リードとして活性なＵＦＩアナログへと開発し得る。
ヒトＤＯＩの生理活性単量体インスリンへの開発
伝統的に、ＤＯＩはヒトインスリンのトリプシン開裂により酵素的に合成されたが、これはアナログ合成には適していない。従って、ＤＯＩにアクセスするためのモジュラー合成経路が開発されている。ヒトインスリンの合成の主な課題は、Ａ鎖の疎水性特性である。Ａ８－Ａ９ Ｔｈｒ－Ｓｅｒ上でイソアシルペプチド対を使用することにより、余分な荷電残基（アミン）をＡ鎖に導入して溶解性を高めた（図２１）。ジスルフィド結合の形成後、イソアシルペプチドはｐＨ８でＯからＮへのアシルシフトを受けてＤＯＩ配列が得られる。この合成ＤＯＩは、酵素的に合成されたＤＯＩと同一の分子量（ＭＡＬＤＩから）およびｈＩＲ活性化活性を有し、このことは本開発の方法の信頼性を証明する。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１のＢ１５およびＢ２０上の２個のＴｙｒはｈＩＲ活性化に重要であることが実証されている。これら２箇所の部位の変異がｈＩＲ活性化の効力を増加させるであろうという仮説を検証するために、Ｂ１５ Ｌｅｕおよび／またはＢ２０ ＧｌｙがＴｙｒに変異した３種のＤＯＩアナログを合成した。図２２に示すように、Ｂ２０ Ｔｙｒを有する２種のアナログはｈＩＲ活性化において効力が５倍増加しているが、Ｂ１５ Ｔｙｒ ＤＯＩアナログはＤＯＩに類似している。このことは、おそらくＢ２４ Ｐｈｅの欠失の補償に起因してＢ２０ ＴｙｒのみがＤＯＩの効力を増加させ得ることを実証している。効力をさらに増加させるために、Ｂ１０ Ｇｌｕをさらに提示するＤＯＩアナログを合成し、これは、最も強力なｈＩＲ結合を付与するＢ１０置換である。これによりＢ２０ Ｔｙｒ単独と比較して効力がさらに５倍増加し、Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１と同様の効力がもたらされる（図２３）。このことは、毒液インスリンからの変異をヒトＤＯＩに移植して生理活性アナログを開発し得ることを実証している。
Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１の結晶構造およびヒトインスリンレセプターの部位１断片と複合体化したＣｏｎＩｎｓ Ｇ１の結晶構造はＢ２０残基について明確な電子密度を欠いており、これはＢ２０残基が柔軟であり得ることを示す。この位置でのチロシン置換基の側鎖がインスリンレセプターに最適に結合し得ない可能性もある。従って、Ｔｙｒ以外の置換が効力をさらに増加させ得るという仮説を、Ｘが芳香族アミノ酸である一連のＢ１０Ｅアナログ、Ｂ２０Ｘ ＤＯＩアナログを合成することにより検証した（図２４Ａ）。興味深いことに、インドール（Ｔｒｏ）およびジフェニル基等の大きい置換基は、ｈＩＲ活性化においてより高い効力をもたらす（図２４Ｂ）。このビフェニルアナログはヒトインスリンの効力の１０％である（Ｎ１０Ｅ、Ｂ２０Ｙ ＤＯＩと比べて３倍高い）。このことは、タンパク質工学および構造生物学の両方を使用する学際的なアプローチの力を実証している。ＤＯＩの効力は、２箇所の位置を変異させることに１００倍増加している。Ｂ２０上のハロゲン置換ナフチルおよびジフェニル基を使用して、ＤＯＩアナログの効力をさらに最適化し得る。
Ａ８位置はｈＩＲ結合部位２との相互作用に重要であることから、Ａ８ Ｈｉｓ変異を現在のリードアナログ（ｌｅａｄ ａｎａｌｏｇｕｅ）に導入してｈＩＲ活性化についてアッセイし得る。Ａ８ ＨｉｓおよびＡ９ Ａｒｇ（Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１上の元々の残基）の両方を、リードアナログであるＢ１０ ＧｌｕおよびＢ２０ Ｔｙｒを有するＤＯＩアナログに導入した（図２３）。この四重ＤＯＩ変異体は、ヒトインスリンの効力に匹敵するｈＩＲ活性化に対する効力を有する（図２５）。Ｃｏｎ－Ｉｎｓ－Ｇ１上の変異はＩＲ部位２への結合を促進する。Ｘ線結晶学を使用してインスリンと結合部位２との間の相互作用を研究し得る。タンパク質工学の努力を、Ｂ２０への研究と同様の医薬化学アプローチを使用することにより、ｈＩＲ結合部位２との相互作用をさらに最適化するためにＡ８～Ａ１０トリプレットに拡大し得る。現在、最良のＤＯＩアナログはわずか４個の残基で親ヒトインスリン配列とは異なり、そのため、単量体ＤＯＩアナログの免疫原性は臨床的使用中のＦＡＤ承認インスリンアナログの免疫原性と同様であると思われる。
Ａ８、Ａ９、Ｂ１０およびＢ２０での各変異はｈＩＲ活性化に影響を及ぼすことにおいて個々の効果を有することが実証された（図２６）。
ＳＴＺで処置した糖尿病マウスモデルにおける単量体インスリンリードの評価
強力な単量体インスリンアナログを同定した後、インビボ特性を評価し得る。ＳＴＺ処置マウスでインスリン耐性試験を実施して、インビボでのグルコース低下能を確認し得る。ＵＦＩアナログの２つの重要な機能は早い発現および短い作用持続期間である。皮下注射後に糖尿病マウスにおいて質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせたＨＰＬＣを使用してＵＦＩアナログ血清レベルを測定し、ＵＦＩアナログの吸収速度を測定する（コントロールとしてインスリンシルプロを使用する）。単量体インスリンの場合、二量体インスリンリスプロと比較して早い吸収速度が見られ得る。さらに、血糖クランプ実験を使用して、標的グルコースレベルを維持するのに必要なグルコース注入量を決定することにより、インビボでのＵＦＩアナログの発現および持続時間を定量化し得る。グルコースクランプ試験は、ＵＦＩアナログが、皮下組織におけるそれらのデポー効果の低下に起因して作用のより短い発現および持続時間を有することを示し得る。これらの特性の組み合わせは、低血糖のリスクを大幅に低減し得る。
広く説明されている本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態で示されているように本発明に対して多数の変形および／または改変が行われ得ることを当業者は認識するだろう。従って、本実施形態は、あらゆる点で例示的であり限定的ではないと見なされるべきである。当業者は、本明細書で説明された方法および組成物の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するだろう、または日常的な実験だけを使用して確認し得る。そのような等価物は下記の特許請求に包含されることを意図されている。
本明細書で論じられたおよび／または参照された全ての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等のいかなる議論も、単に本発明の背景を提供することを目的としている。本出願の各請求項の優先日前に存在したからといって、これらの事項のいずれかまたは全てが先行技術のベースの一部を形成するとまたは本発明に関連する分野における共通の一般的知識であったと認めると受け取るできではない。
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Claims (94)

  1. Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドを含むインスリンアナログであって、前記Ｂ鎖は、ヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、および／またはヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸番号１５に対応する位置で芳香族残基もしくは大きい脂肪族残基を含み、前記アナログは、ヒトインスリン中に見出される少なくとも１個のアミノ酸を含むがコヌス・ジオグラフス（Ｃｏｎｕｓ ｇｅｏｇｒａｐｈｕｓ）毒液インスリンの対応する位置では欠いており、前記Ａ鎖ペプチドおよび前記Ｂ鎖ペプチドは少なくとも１対のシステイン残基を介して互いに結合している、インスリンアナログ。
  2. ヒトインスリンの前記Ｂ鎖のアミノ酸番号２０に対応する位置での前記芳香族残基または大きい脂肪族残基は、チロシン、フェニルアラニン、４－メチルフェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、シクロペンチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニンからなる群から選択される、請求項１に記載のインスリンアナログ。
  3. 前記Ｂ鎖は、ヒトインスリンと比較した場合にＣ末端でトランケートされている、請求項１または２に記載のインスリンアナログ。
  4. 前記Ｂ鎖はヒトインスリンの９個のＣ末端アミノ酸のうちの１個または複数個または全てを欠いている、請求項３に記載のインスリンアナログ。
  5. 前記Ｂ鎖はヒトインスリンのＰｈｅＢ２４を少なくとも欠いている、請求項３または４に記載のインスリンアナログ。
  6. 前記Ｂ鎖は前記ヒトＢ鎖の芳香族トリプレット（アミノ酸ＰｈｅＢ２４－ＰｈｅＢ２５－ＴｙｒＢ２６）を少なくとも欠いている、請求項１～５のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  7. 配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－ＸＡ３－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－ＸＡ１２－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－ＸＡ１６－ＸＡ１７－ＸＡ１８－ＸＡ１９－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１－ＸＡ２２－ＸＡ２３－ＸＡ２４－ＸＡ２５－ＸＡ２６－ＸＡ２７－ＸＡ２８－ＸＡ２９－ＸＡ３０－ＸＡ３１－ＸＡ３２－ＸＡ３３－ＸＡ３４
    （この配列中、ＸＡ２＝ＶａｌまたはＩｌｅ；ＸＡ３＝ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＡ４＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＡ５＝Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＨｉｓまたはＶａｌ；ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＡ１１は独立してＣｙｓまたはセレノシステインであり；ＸＡ８＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＡｌａまたはＶａｌ；ＸＡ９＝Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ；ＸＡ１０＝Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒ；ＸＡ１２＝ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＡ１３＝Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、ＡｒｇまたはＡｓｐ；ＸＡ１４＝Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＸＡ１５＝Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；ＸＡ１６＝Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＡｌａ；ＸＡ１７＝Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒ；ＸＡ１８＝Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＸＡ１９＝ＴｙｒまたはＰｈｅ；ＣｙｓＡ２０＝Ｃｙｓ、セレノシステイン、アミド化Ｃｙｓまたはアミド化セレノシステイン；ＸＡ２１＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａまたは存在せず；ＸＡ２２＝Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２３＝Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２４＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＡ２６＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２７～ＸＡ３１は独立してＳｅｒであり、または存在せず；ＸＡ３２＝Ａｌａ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ３３＝Ａｌａ、Ｖａｌまたは存在せず；ならびにＸＡ３４＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号１）
    を含むＡ鎖ペプチドと、
    配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９
    （この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、ＬｅｕまたはＧｌｙ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、アミド化Ｈｉｓ、アミド化Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号２）
    を含むＢ鎖ペプチドと
    を含む請求項１～６のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  8. 前記Ｂ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９
    （この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号３）
    を含む、請求項７に記載のインスリンアナログ。
  9. 前記Ｂ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－ＸＢ１０－ＸＢ１１－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９
    （この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１０＝Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１１＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ならびにＸＢ２４、ＸＢ２５、ＸＢ２６、ＸＢ２７、ＸＢ２８、ＸＢ２９、ＸＢ３０、ＸＢ３１、ＸＢ３２、ＸＢ３３、ＸＢ３４、ＸＢ３５、ＸＢ３６、ＸＢ３７、ＸＢ３８およびＸＢ３９は存在しない）（配列番号４）
    を含む、請求項７または８に記載のインスリンアナログ。
  10. 前記Ｂ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９
    （この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＩｌｅ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＬｙｓ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号５）
    を含む、請求項７または８に記載のインスリンアナログ。
  11. 前記Ｂ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３－ＸＢ２４－ＸＢ２５－ＸＢ２６－ＸＢ２７－ＸＢ２８－ＸＢ２９－ＸＢ３０－ＸＢ３１－ＸＢ３２－ＸＢ３３－ＸＢ３４－ＸＢ３５－ＸＢ３６－ＸＢ３７－ＸＢ３８－ＸＢ３９
    （この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３＝Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ４＝Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＧｌｙ；ＸＢ５＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｓｅｒまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ；ＸＢ７＝ＨｉｓまたはＴｙｒ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＬｙｓ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＡｓｐまたはＡｓｎ；ＸＢ１３＝Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＡｒｇ；ＸＢ１５＝Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＰｒｏまたはＧｌｕ；ＸＢ１６＝Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、ＡｓｎまたはＬｅｕ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＴｈｒ；ＸＢ２０＝ＶａｌまたはＬｅｕ；ＣＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ；ＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ２４＝Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２５＝Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ２６＝Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅまたは存在せず；ＸＢ２７＝Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕまたは存在せず；ＸＢ２８＝Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓまたは存在せず；ＸＢ２９＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒまたは存在せず；ＸＢ３０＝Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇまたは存在せず；ＸＢ３１＝Ｉｌｅ、Ｌｙｓまたは存在せず；ＸＢ３２＝Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎまたは存在せず；ＸＢ３３＝Ｃｙｓまたは存在せず；ＸＢ３４＝Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３６＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＢ３７＝Ｇｌｕ、Ｖａｌまたは存在せず；ＸＢ３８＝Ａｌａ、Ａｓｐまたは存在せず；およびＸＢ３９＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号６）
    を含む、請求項７または８に記載のインスリンアナログ。
  12. 前記Ｂ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－ＸＢ７－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒ、Ａｓｎまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎ；ＸＢ７＝ＨｉｓまたはＴｙｒ；ＸＢ８＝Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＣｙｓＢ９＝Ｃｙｓまたはセレノシステイン；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＰｒｏまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝Ｇｌｕ、Ｖａｌ、ＡｓｎまたはＡｓｐ；ＸＢ１６＝Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＴｙｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝Ｔｙｒ、Ａｓｐ、ＭｅｔまたはＶａｌ；ＸＢ１９＝Ｌｅｕ、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＬｙｓ；ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＣｙｓＢ２１＝Ｃｙｓ、アミド化Ｃｙｓ、セレノシステインまたはアミド化セレノシステイン；ＸＢ２２＝ＴｙｒまたはＧｌｙ；およびＸＢ２３＝Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙまたは存在しない）（配列番号７）を含む、請求項７に記載のインスリンアナログ。
  13. 前記Ｂ鎖ペプチドは、配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ、ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝Ｔｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号８）を含む、請求項１２に記載のインスリンアナログ。
  14. ＸＢ２２はＴｙｒである、請求項７～１２のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  15. 前記Ａ鎖ペプチドは、配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－ＸＡ３－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－ＸＡ１２－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－ＸＡ１９－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１－ＸＡ２２－ＸＡ２３－ＸＡ２４－ＸＡ２５－ＸＡ２６－ＸＡ２７－ＸＡ２８－ＸＡ２９－ＸＡ３０－ＸＡ３１－ＸＡ３２－ＸＡ３３－ＸＡ３４
    （この配列中、ＸＡ２＝ＶａｌまたはＩｌｅ；ＸＡ３＝ＶａｌまたはＡｌａ；ＸＡ４＝Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメートまたはＣｙｓ；ＸＡ５＝Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ガンマカルボキシグルタメート、ＨｉｓまたはＶａｌ；ＣｙｓＡ６、ＣｙｓＡ７およびＣｙｓＡ１１は独立してＣｙｓまたはセレノシステインであり；ＸＡ８＝Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＶａｌ；ＸＡ９＝Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓ；ＸＡ１０＝Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ＨｉｓまたはＴｈｒ；ＸＡ１２＝ＳｅｒまたはＴｈｒ；ＸＡ１３＝Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＶａｌまたはＡｓｐ；ＸＡ１４＝Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；ＸＡ１５＝Ｇｌｎ、ＧｌｕまたはＴｈｒ；またはＡｌａ；ＸＡ１７＝Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＳｅｒ；ＸＡ１８＝Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＧｌｕ；ＸＡ１９＝ＴｙｒまたはＰｈｅ；ＣｙｓＡ２０＝Ｃｙｓ、セレノシステイン、アミド化Ｃｙｓまたはアミド化セレノシステイン；ＸＡ２１＝Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａまたは存在せず；ＸＡ２２＝Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２３＝Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ２４＝Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２５＝Ｇｌｕ、Ｇｌｙまたは存在せず；ＸＡ２６＝Ｓｅｒ、Ｌｅｕまたは存在せず；ＸＡ２７～ＸＡ３１は独立してＳｅｒであり、または存在せず；ＸＡ３２＝Ａｌａ、Ｓｅｒまたは存在せず；ＸＡ３３＝Ａｌａ、Ｖａｌまたは存在せず；ならびにＸＡ３４＝Ａｌａまたは存在しない）（配列番号９）を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  16. 配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－ＸＡ１６－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１６はＰｈｅまたはＬｅｕであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１０）を含むＡ鎖ペプチドと、
    配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－ＸＢ２２－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；ＸＢ２２＝ＧｌｙまたはＴｙｒ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１１）を含むＢ鎖ペプチドと
    を含む請求項１～６のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  17. 配列Ｇｌｙ－ＸＡ２－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ２はＶａｌまたはＩｌｅであり、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１２）を含むＡ鎖ペプチドと、
    配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－ＸＢ８－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－ＸＢ１３－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－ＸＢ２０－ＣｙｓＢ２１－Ｔｙｒ－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ８＝ＡｒｇまたはＬｅｕ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１３＝ＩｌｅまたはＬｅｕ；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、ＸＢ２０＝ＬｅｕまたはＶａｌ；およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１３）を含むＢ鎖ペプチドと
    を含む請求項１５または１６に記載のインスリンアナログ。
  18. 配列Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－ＸＡ４－ＸＡ５－ＣｙｓＡ６－ＣｙｓＡ７－ＸＡ８－ＸＡ９－ＸＡ１０－ＣｙｓＡ１１－Ｓｅｒ－ＸＡ１３－ＸＡ１４－ＸＡ１５－Ｐｈｅ－ＸＡ１７－ＸＡ１８－Ｔｙｒ－ＣｙｓＡ２０－ＸＡ２１（この配列中、ＸＡ４はＧｌｕまたはガンマカルボキシグルタメートであり、ＸＡ５はＨｉｓまたはＧｌｎであり、ＸＡ８はＨｉｓまたはＴｈｒであり、ＸＡ９はＡｒｇまたはＳｅｒであり、ＸＡ１０はＰｒｏまたはＩｌｅであり、ＸＡ１３はＡｓｎまたはＬｅｕであり、ＸＡ１４はＡｌａまたはＴｙｒであり、ＸＡ１５はＧｌｕまたはＧｌｎであり、ＸＡ１７はＬｙｓまたはＧｌｕであり、ＸＡ１８はＬｙｓまたはＡｓｎであり、およびＸＡ２１はＡｓｎである、または存在しない）（配列番号１４）を含むＡ鎖ペプチドと、
    配列ＸＢ１－ＸＢ２－ＸＢ３－ＸＢ４－ＸＢ５－ＸＢ６－Ｈｉｓ－Ａｒｇ－ＣｙｓＢ９－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－ＸＢ１２－Ｉｌｅ－ＸＢ１４－ＸＢ１５－ＸＢ１６－ＸＢ１７－ＸＢ１８－ＸＢ１９－Ｌｅｕ－ＣｙｓＢ２１－Ｔｙｒ－ＸＢ２３（この配列中、ＸＢ１＝Ｔｈｒまたは存在せず；ＸＢ２＝Ｐｈｅまたは存在せず；ＸＢ３＝ＰｈｅまたはＡｓｐ；ＸＢ４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ５＝Ｐｒｏ、Ａｓｎまたはヒドロキシプロリン；ＸＢ６＝ＬｙｓまたはＧｌｎ；ＸＢ１２＝Ｈｉｓ、Ｇｌｕまたはガンマカルボキシグルタメート；ＸＢ１４＝ＴｈｒまたはＶａｌ；ＸＢ１５＝ＧｌｕまたはＡｓｎ；ＸＢ１６＝ＳｅｒまたはＡｌａ；ＸＢ１７＝ＴｙｒまたはＬｅｕ；ＸＢ１８＝ＴｙｒまたはＭｅｔ；ＸＢ１９＝ＬｅｕまたはＡｓｐ、およびＸＢ２３＝ＧｌｕまたはＡｒｇ）（配列番号１５）を含むＢ鎖ペプチドと
    を含む請求項１５～１７のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  19. 下記：
    ｉ）ＸＡ４はガンマカルボキシグルタメートである、
    ｉｉ）ＸＢ５はヒドロキシプロリンである、および
    ｉｉｉ）ＸＢ１２はガンマカルボキシグルタメートである、
    のうちの１つまたは複数または全てが当てはまる請求項１～１８のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  20. 配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１６）を含むＡ鎖ペプチドと、
    配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｘａａ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号１７）を含むＢ鎖ペプチドと
    を含む請求項１～１９のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  21. 配列Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｃｙｓ－Ｃｙｓ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｃｙｓ－Ｓｅｒ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｇｌｎ－Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｓｎ（配列番号１８）を含むＡ鎖ペプチドと、
    配列Ｐｈｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｇｌｕ（この配列中、Ｘａａは芳香族残基または大きい脂肪族残基である）（配列番号１９）を含むＢ鎖ペプチドと
    を含む請求項１～１９のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  22. 前記Ｂ鎖ペプチドのＣｙｓＢ９は前記Ａ鎖ペプチドのＣｙｓＡ６に結合している、請求項１～２１のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  23. 前記Ｂ鎖ペプチドのＣｙｓＢ２１は前記Ａ鎖ペプチドのＣｙｓＡ２０に結合している、請求項１～２２のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  24. ＣｙｓＡ７はＣｙｓＡ１１に結合している、請求項１～２３のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  25. 前記Ａ鎖ペプチドおよび前記Ｂ鎖ペプチドは一対のそれらの各末端で互いに連結されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  26. 前記Ａ鎖ペプチドおよび前記Ｂ鎖ペプチドは両方の末端で互いに連結されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  27. ヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０が１０－６Ｍよりも低い、請求項１～２６のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  28. 前記アナログの少なくとも７５％は溶液中で単量体である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  29. ヒトインスリンと比較した場合に、ヒトに投与された際に生物学的利用能が増加している、請求項１～２８のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  30. ヒトへの投与から０．５～３時間以内に生物学的利用能がピークになる、請求項２９に記載のインスリンアナログ。
  31. 投与から１０分以内に活性を発現する請求項２９または３０に記載のインスリンアナログ。
  32. 前記アナログはヒトＩＧＦ－ＩＲに結合しない、またはヒトＩＧＦ－ＩＲに弱く結合する、請求項１～３１のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  33. 前記アナログはヒトＩＧＦ－ＩＲに対する親和性（Ｋｄ）が１００ｎＭよりも弱い、請求項３２に記載のインスリンアナログ。
    （請求項３２）
    請求項１～３１のいずれか一項に記載のインスリンアナログまたはその薬学的に許容される塩と、１種または複数種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
    （請求項３３）
    インスリンに関連する状態を処置するおよび／または予防する方法であって、必要とする対象に、請求項１～３２のいずれか一項に記載のインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法。
  34. 前記インスリンに関連する状態は高血糖、インスリン抵抗性、１型糖尿病、妊娠糖尿病または２型糖尿病である、請求項３３に記載の方法。
  35. 血糖値を低減させる方法であって、必要とする対象に、請求項１～３２のいずれか一項に記載のインスリンアナログの治療上有効な量を投与することを含む方法。
  36. 対象のインスリンに関連する状態を処置するためのおよび／または予防するための薬剤の製造における請求項１～３２のいずれか一項に記載のインスリンアナログの使用。
  37. 対象の血糖値を低減させるための薬剤の製造における請求項１～３２のいずれか一項に記載のインスリンアナログの使用。
  38. 対象のインスリンに関連する状態の処置および／または予防での使用のための請求項１～３２のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  39. 対象の血糖値の低減での使用のための請求項１～３２のいずれか一項に記載のインスリンアナログ。
  40. インスリンレセプター（ＩＲ）に結合することが知られているポリペプチドを再設計するまたは改変する方法であって、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造の、構造に基づく評価を実施すること、および前記評価の結果として前記ポリペプチドを再設計するまたは化学的に改変することを含む方法。
  41. 構造に基づく評価は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンの原子座標またはそのサブセットとの比較を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 構造に基づく評価は、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義される構造とインスリンレセプターの原子座標またはそのサブセットとの間に形成される複合体の分子モデリングをさらに含む、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、および前記ポリペプチドのＩＲに結合する能力を試験することをさらに含む請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、および前記再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドのＩＲ活性化を調節する能力を決定することをさらに含む請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドを合成するまたは得ること、および前記再設計されたまたは化学的に改変されたポリペプチドの血糖値を低下させる能力を決定することをさらに含む請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＩＲに結合することが知られているポリペプチドはインスリンである、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記インスリンはヒトインスリンである、請求項４６に記載の方法。
  48. 請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法により再設計されているまたは改変されているポリペプチド。
  49. 単量体である請求項４８に記載のポリペプチド。
  50. ＩＲアゴニストである単離分子であって、付録Ｉの原子座標またはそのサブセットにより定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１の３Ｄ構造に基づいて同定されているおよび／または設計されている分子。
  51. 前記分子はペプチド、ポリペプチドまたはペプチド模倣物である、請求項５０に記載の分子。
  52. 単量体である請求項５０または５１に記載の分子。
  53. ヒトＩＲ－Ｂレセプターに対するＩＣ５０が１０－６Ｍよりも低い、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の分子。
  54. ＩＲに結合する化合物を同定する方法であって、
    ｉ）下記：
    ａ）付録Ｉの原子座標もしくはそのサブセットにより定義される構造、または
    ｂ）ａ）の対応する主鎖原子上で重ねた場合に約２．０Å未満の平均二乗偏差を有する構造
    を有するポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、および
    ｉｉ）前記ＩＲに潜在的に結合する化合物を設計するまたはスクリーニングすること
    を含む方法。
  55. 三次元構造モデルを作成することは、ＩＲまたはその領域に結合する前記ポリペプチドのモデルを作成することを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＩＲに潜在的に結合する化合物を合成することをさらに含む請求項５４または５５に記載の方法。
  57. 前記化合物はＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記化合物は単量体である、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 血糖値を調節する能力に関して、前記ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を試験することをさらに含む請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. ｉ）およびｉｉ）をインシリコで実施する、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. インスリン活性を模倣する化合物を同定するコンピュータベースの方法であって、
    ｉ）下記：
    ａ）付録Ｉの原子座標もしくはそのサブセットにより定義される構造、または
    ｂ）ａ）の対応する主鎖原子上で重ねた場合に約２．０Å未満の平均二乗偏差を有する構造
    を有するポリペプチドの三次元構造モデルを作成すること、および
    ｉｉ）インスリン活性を模倣する化合物を設計するまたはスクリーニングすること
    を含む方法。
  62. 三次元構造モデルを作成することはＩＲまたはその領域に結合する前記ポリペプチドのモデルを作成することを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ＩＲに潜在的に結合する化合物を合成することをさらに含む請求項６１または６２に記載の方法。
  64. 前記化合物はＩＲの少なくとも１種の生物学的活性を調節する、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記化合物は単量体である、請求項６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 血糖値を調節する能力に関して、前記ｉｉ）で設計されたまたはスクリーニングされた化合物を試験することをさらに含む請求項６１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. ｉ）およびｉｉ）をインシリコで実施する、請求項６１～６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 請求項５４～６７のいずれか一項に記載の方法を使用して同定された化合物。
  69. あらゆる格子寸法において変動が最大約２％であるａ＝ｂ＝ｃ＝７４．９１Åの単位格子寸法を有する空間群Ｐ４３２を有するＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ポリペプチドの結晶。
  70. 付録Ｉの原子座標により定義されるＣｏｎ－Ｉｎｓ Ｇ１ポリペプチドの構造。
  71. 構造モデルとしての請求項７０記載の構造の使用。
  72. インスリンアナログの同定のための請求項７１に記載の構造モデルの使用。
  73. 請求項７２の使用により同定されたインスリンアナログ。
  74. 請求項４８もしくは４９に記載のポリペプチド、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の分子、請求項６８に記載の化合物または請求項７２に記載のインスリンアナログを含む医薬組成物。
  75. インスリンＡ鎖ペプチドおよびインスリンＢ鎖ペプチドを含むペプチドであって、前記Ｂ鎖ペプチドはアミノ酸１０およびアミノ酸２０で置換を含む、ペプチド。
  76. 前記アミノ酸２０での置換はＧ２０Ｙ、Ｇ２０ＦまたはＧ２０Ｐである、請求項７５に記載のペプチド。
  77. 前記アミノ酸２０での置換はＧ２０Ｐであり、前記ペプチドはアミノ酸２１での置換をさらに含み、前記アミノ酸２１での置換はＧ２１Ｈである、請求項７６に記載のペプチド。
  78. 前記アミノ酸１０での置換はＨ１０Ｅ、Ｈ１０ＤまたはＨ１０Ｑである、請求項７５～７７のいずれか一項に記載のペプチド。
  79. 前記Ａ鎖ペプチド中に少なくとも１個の置換をさらに含む請求項７５～７８のいずれか一項に記載のペプチド。
  80. 前記Ａ鎖ペプチド中の前記少なくとも１個の置換はＴ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫまたはＳ９Ｒである、請求項７９に記載のペプチド。
  81. 前記Ａ鎖ペプチド中に少なくとも２個の置換をさらに含む請求項８０に記載のペプチド。
  82. 前記Ａ鎖ペプチド中の前記少なくとも２個の置換は、Ｔ８Ｈ、Ｔ８Ｙ、Ｔ８ＫおよびＳ９Ｒから選択される置換のうちの２つである、請求項７９に記載のペプチド。
  83. 前記ペプチドはデス－オクタペプチドインスリンである、請求項７５～８２のいずれか一項にペプチド。
  84. 前記Ｂ鎖ペプチドはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３０）の配列を含む、請求項７５～８３のいずれか一項に記載のペプチド。
  85. 前記Ａ鎖はＧＩＶＥＱＣＣＨＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３９）の配列を含む、請求項７５～８４のいずれか一項に記載のペプチド。
  86. 前記Ａ鎖ペプチドおよびＢ鎖ペプチドは少なくとも１個のジスルフィド結合を介して結合している、請求項７５～８５のいずれか一項に記載のペプチド。
  87. 前記ペプチドは単量体である、請求項７５～８６のいずれか一項に記載のペプチド。
  88. 前記インスリンＡ鎖ペプチドは野生型ヒトインスリンＡ鎖ペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項７５～８７のいずれか一項に記載のペプチド。
  89. 請求項７５～８８のいずれか一項に記載のペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  90. 対象中でインスリンレセプター活性化を増加させる方法であって、必要とする対象に、請求項７５～８８のいずれか一項に記載のペプチドのいずれか１つの治療上有効な量を投与することを含む方法。
  91. 対象の血糖を低下させる方法であって、必要とする対象に、請求項７５～８８のいずれか一項に記載のペプチドのいずれか１つの治療上有効な量を投与することを含む方法。
  92. 対象の１型糖尿病を処置する方法であって、必要とする対象に、請求項７５～８８のいずれか一項に記載のペプチドのいずれか１つの治療上有効な量を投与することを含む方法。
  93. 前記対象は前記ペプチドの投与の前に１型糖尿病と診断されている、請求項９２に記載の方法。
  94. 少なくとも１個のジスルフィド結合を介してＢ鎖ペプチドに結合しているＡ鎖ペプチドを有する治療用タンパク質であって、前記Ａ鎖はＧＩＶＥＱＣＣＨＲＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号３９）の配列を含み、前記Ｂ鎖ペプチドはＦＶＮＱＨＬＣＧＳＥＬＶＥＡＬＹＬＶＣＹＥＲ（配列番号３０）の配列を含む、治療用タンパク質。
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