KR20190039719A - 인슐린 유사체 - Google Patents

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KR20190039719A
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브라이언 스미스
데니 훙-치에 처우
헬레나 사파비-헤마미
마이클 콜린 로렌스
올리베라 엠 발도메로
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유타대학연구재단
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Abstract

본 발명은 인슐린 유사체, 특히 단축된 B 사슬을 갖는 인슐린 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 청자 고둥의 독액에서 유래된 인슐린의 결정 구조 및 인슐린 수용체와 상호작용하거나 또는 이를 조정하는 인슐린 유사체를 스크리닝하고 디자인하기 위해 이 결정 및 관련 구조 정보를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인슐린 유사체를 사용하는 치료적 및 예방적 방법에 관한 것이다.

Description

인슐린 유사체
본 출원은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는, 2016년 7월 22일 출원된, 호주 가출원 제AU2016902883호의 우선권을 청구한다. 본 출원은 또한 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입되는 2017년 4월 4일 출원된 미국 가출원 제62/483,118호의 우선권을 청구한다.
연방 정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 부분적으로 미국 국립 보건원이 수여하는 GM 48677 하의 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
본 발명은 일반적으로 인슐린 유사체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 단축된 B 사슬을 갖는 속효성 인슐린 유사체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 청자 고둥 (cone snail)의 독액에서 유래된 인슐린의 결정 구조 및 인슐린 수용체와 상호작용하거나 또는 조정하는 인슐린 유사체를 스크리닝 및 디자인하기 위해 결정 및 관련 구조 정보를 사용하는 방법에 관한 것이다.
인슐린은 포도당 대사, 재생 및 인식의 조절에서 중추적인 역할을 하는 폴리펩티드 호르몬이다. 인간 인슐린 단량체는 2개의 디술피드 브릿지 (CysA7-CysB7 및 CysA19-B20)에 의해 공유적으로 연결된, 2개 폴리펩티드 사슬인, A-사슬 및 B-사슬로 이루어진다. A-사슬은 21개 아미노산으로 이루어지고 B 사슬은 30개 아미노산으로 이루어진다. 제3의 디술피드 브릿지가 A 사슬 (CysA6-CysA11) 내에 위치한다. 체내에서, 인슐린은 단량체, 이량체 및 육량체로서 존재한다. 육량체는 2개의 중심 아연 이온에 의해 함께 유지되는 3개의 인슐린 이량체로 이루어진다. 인간 인슐린은 육량체로서 췌장 β-세포에 저장된다. 인슐린 수용체에 결합하는 생물학적 활성 형태는 단량체이다. 인슐린 육량체-단량체 전환은 이의 생체이용률에서 결정적이다.
인슐린 조절의 교란은 종종 중증 임상 징후, 예컨대 진성 당뇨병, 고혈당증을 비롯한 다른 유사한 병태와 연관된다. 진성 당뇨병 (당뇨병이라고 함)은 지속된 기간 동안 높은 혈당 수준을 특징으로 하는 질병군이다. 당뇨병은 췌장이 충분한 인슐린을 생산하지 않거나 또는 신체가 인슐린에 적절하게 반응하지 않으면 발생될 수 있다. 인슐린 또는 인슐린 유사체의 투여가 당뇨병과 같은 병태를 치료하는 가장 효과적인 방법으로 남아있다. 당뇨병의 치료는 종종 속효성의, 식전 인슐린을 비롯하여 호르몬의 기본 수준을 유지하기 위한 지속형 인슐린의 조합의 투여를 포함한다.
초속효형 인슐린 유사체는 신속한 활성 개시성을 갖는다. 전형적으로, 그들은 단량체이거나 또는 병이 있는 개체에게 주사시 단량체 형태로 신속하게 해리된다. 구조적으로, 이들 인슐린 유사체는 인슐린 다량체화에 유해한 B-사슬 C-말단 영역 내에 변형 (잔기 B26-B30)을 가짐으로써 정상 인간 인슐린과 상이하다. 그러나, 자기-회합을 없애기 위해서 B 사슬의 추가적인 C-말단 절단은 거의 완전한 활성 상실을 초래하였는데, 아마도 PheB24가 활성에 핵심적이기 때문인 듯 하다. 예를 들어, 단량체 유사체인 데스-옥타펩티드[B23-B30] 인슐린 (DOI)은 0.1% 미만의 생체활성을 보존한다 (Bao at al., 1997). PheB24는 잔기 GlyB20-GluB21-ArgB22-GlyB23에 의해 형성되는 제1형 β-턴의 바로 C-말단에 위치하고, 트리플렛 PheB24-PheB25-TyrB26 및 제1형 β-턴 둘 모두는 척추동물 인슐린에서 고도로 보존되어 있다.
단량체이고, 속효성이며, 인간 인슐린 수용체 신호전달 활성을 유지하는 신규한 인슐린 유사체, 및 이러한 유사체를 디자인하기 위한 방법에 대한 요구가 존재한다.
발명자는 코너스 지오그라퍼스 (Conus geographus)의 독액으로부터 유래하는 새롭게 동정된 인슐린 Con-Ins G1을 특징규명하였고 이것이 단량체이지만, 여전히 인간 인슐린 수용체에 결합하고 신호전달 활성을 유지한다는 것을 보여준다. 발명자는 더 나아가서 Con-Ins G1의 결정을 성공적으로 생성시켰고 X-선 결정학을 사용하여 이의 3차원 구조를 규명하였다. 본 명세서에 제시되는 구조 데이타는 이제 인간 인슐린의 방향족 트리플렛, PheB24-PheB25-TyrB26의 결여에도 불구하고, Con-Ins G1이 이의 활성을 유지할 수 있게 하는 핵심 아미노산 위치 및 상호작용을 최초로 동정할 수 있게 하였다.
일 양상에서, 본 발명은 A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드를 포함하는 인슐린 유사체를 제공하고, 여기서 B 사슬은 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 방향족 또는 거대 지방족 잔기 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 방향족 또는 거대 지방족 잔기를 포함하고, 유사체는 인간 인슐린에 존재하지만, 코너스 지오그라퍼스 독액 인슐린의 상응하는 위치에는 결여된 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 한쌍의 시스테인 잔기에 걸쳐 함께 결합된다.
일부 구체예에서, 방향족 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘 및 4-메틸페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 거대 지방족 잔기는 이소류신, 사이클로헥실알라닌, 사이클로펜틸알라닌 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치의 방향족 또는 거대 지방족 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 사이클로펜틸알라닌 및 사이클로헥실알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치의 방향족 또는 거대 지방족 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 사이클로펜틸알라닌 및 사이클로헥실알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린과 비교시 C 말단부에서 절단된다. 일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린의 9개 C-말단 아미노산 중 하나 이상 또는 전부가 결여된다. 일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린의 PheB24가 적어도 결여된다. 일부 구체예에서, B 사슬은 인간 B 사슬 방향족 트리플렛 (인간 인슐린의 아미노산 PheB24-PheB25-TyrB26)이 적어도 결여된다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34 [여기서, XA2 = Val 또는 Ile이고; XA3 = Val 또는 Ala이고; XA4 = Glu, Asp, Cys 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XA5 = Gln, Glu, 감마 카복시글루타메이트, His 또는 Val이고; CysA6, CysA7, 및 CysA11 은 독립적으로 Cys 또는 셀레노시스테인이고; XA8 = Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys, Ala 또는 Val이고; XA9 = Ser, Arg, Asn, Gly, His 또는 Lys이고; XA10 = Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Val, Phe, His 또는 Thr이고; XA12 = Ser 또는 Thr이고; XA13 = Leu, Asn, Val, Arg 또는 Asp이고; XA14 = Tyr, Ala, Gln, His, Asp 또는 Glu이고; XA15 = Gln, Glu 또는 Thr이고; XA16 = Phe, Leu, 또는 Ala이고; XA17 = Glu, Gln, Lys, Arg, Ile, Met, Thr 또는 Ser이고; XA18 = Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 또는 Glu이고; XA19 = Tyr 또는 Phe이고; CysA20 = Cys, 셀레노시스테인, 아미드화 Cys, 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XA21 = Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala이거나 또는 부재하고; XA22 = Pro, Asn, Thr, Leu, Ser이거나 또는 부재하고; XA23 = Thr, Leu, Val, Ser이거나 또는 부재하고; XA24 = Arg, Thr, Met, Gln, Leu이거나 또는 부재하고; XA25 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XA26 = Ser, Leu이거나 또는 부재하고; XA27 내지 XA31 은 독립적으로 Ser이거나 또는 부재하고; XA32 = Ala, Ser이거나 또는 부재하고; XA33 = Ala, Val이거나 또는 부재하고; XA34 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Ala, Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, 또는 His이고; XB4 = Ala, Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Lys, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Thr, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Thr, Tyr, Pro, Leu 또는 Gly이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg, Ser 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Val, Tyr, Phe, His, Gly, Gln, Leu, 아미드화 His, 아미드화 Val이거나 또는 부재하고; XB23 = Glu, Asp, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Ile, Leu, Ser, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Ala, Asp, Ser, Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 3)을 포함한다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24, XB25, XB26, XB27, XB28, XB29, XB30, XB31, XB32, XB33, XB34, XB35, XB36, XB37, XB38 및 XB39 는 부재함] (SEQ ID NO: 4)을 포함한다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 5)을 포함한다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His 또는 Tyr이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val 또는 Leu이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 6)을 포함한다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr, Asn이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Asn 또는 Gln이고; XB7 = His 또는 Tyr이고; XB8 = Arg, Ile 또는 Leu이고; XB12 = His, Asp, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB13 = Val, Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, 또는 Val이고; XB15 = Glu, Val, Asn 또는 Asp이고; XB16 = Ser, Gln, Tyr 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Asp, Met 또는 Val이고; XB19 = Leu, Asp, Gln 또는 Lys이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; CysB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr 또는 Gly이고; XB23 = Glu, Arg, Gly이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 7)을 포함한다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 8)을 포함한다.
일부 구체예에서, XB17 및 XB22 는 Tyr이다. 일부 구체예에서, XB22 는 Tyr이다. 일부 구체예에서, XB17 은 Tyr이다.
일부 구체예에서, A 사슬 펩티드는 서열 Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34 [여기서, XA2 = Val 또는 Ile이고; XA3 = Val 또는 Ala이고; XA4 = Glu, 감마 카복시글루타메이트 또는 Cys이고; XA5 = Gln, Glu, 감마 카복시글루타메이트, His 또는 Val이고; CysA6, CysA7, 및 CysA11 은 독립적으로 Cys 또는 셀레노시스테인이고; XA8 = Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys 또는 Val이고; XA9 = Ser, Arg, Asn, His 또는 Lys이고; XA10 = Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Phe, His 또는 Thr이고; XA12 = Ser 또는 Thr이고; XA13 = Leu, Asn, Val 또는 Asp이고; XA14 = Tyr, Ala, Gln, Asp 또는 Glu이고; XA15 = Gln, Glu 또는 Thr이거나; 또는 Ala이고; XA17 = Glu, Lys, Arg, Ile, Met, Thr 또는 Ser이고; XA18 = Lys, Thr, Asn, Gln 또는 Glu이고; XA19 = Tyr 또는 Phe이고; CysA20 = Cys, 셀레노시스테인, 아미드화 Cys, 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XA21 = Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala이거나 또는 부재하고; XA22 = Pro, Asn, Thr, Leu, Ser이거나 또는 부재하고; XA23 = Thr, Leu, Val, Ser이거나 또는 부재하고; XA24 = Arg, Thr, Met, Gln, Leu이거나 또는 부재하고; XA25 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XA26 = Ser, Leu이거나 또는 부재하고; XA27 내지 XA31 은 독립적으로 Ser이거나 또는 부재하고; XA32 = Ala, Ser이거나 또는 부재하고; XA33 = Ala, Val이거나 또는 부재하고; XA34 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 9)을 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA16 은 Phe 또는 Leu이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 10)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Gly 또는 Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 11)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 12)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-Tyr-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고, XB20 = Leu 또는 Val이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 13)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고, XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 14)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-Leu-CysB21-Tyr-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고, XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 15)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일 구체예에서, 인슐린 유사체는 C 말단에서 절단된 B-사슬 및 B 사슬의 아미노산 번호 15 및/또는 20의 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기를 제외하고 인간 인슐린과 동일하다. 제한없이, Xaa가 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기인 하기 3개의 구체예를 예로서 제공한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 16)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 17)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 18)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 19)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 20)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu (SEQ ID NO: 21) [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임]을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 수많은 변형된 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 다음 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다:
i) XA4 는 감마 카복시글루타메이트이고,
ii) XB5 = 하이드록시프롤린이고;
iii) XB12 = 감마 카복시글루타메이트이다.
일부 구체예에서, B 사슬 펩티드의 CysB9 는 A 사슬 펩티드의 CysA6 에 결합된다. 일부 구체예에서, B 사슬 펩티드의 CysB21 은 A 사슬 펩티드의 CysA20 에 결합된다. 일부 구체예에서, CysA7 은 CysA11 에 결합된다.
일부 구체예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 그들의 개별 말단부의 한 쌍에서 함께 연결된다. 일부 구체예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 양쪽 말단부에서 함께 연결된다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 10-6 M 미만의 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 IGF-IR에 약하게 결합한다. 일부 구체예에서, 유사체는 100 nM 보다 약한 인간 IGF-IR에 대한 친화성 (Kd)을 갖는다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 주로 단량체이다. 일부 구체예에서, 유사체의 적어도 75%는 용액 중에서 단량체이다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린과 비교하여 인간에게 투여시 증가된 생체이용률을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간에게 투여하고 0.5 내지 3시간 내에 피크 생체이용률을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 투여 10분 이내에 활성 개시성을 갖는다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 인슐린-관련 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기술된 바와 같은 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 인슐린 관련 병태는 고혈당증, 인슐린 저항증, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 제2형 당뇨병이다.
여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 혈중 포도당 수준을 감소시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 대상체에서 인슐린-관련 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도를 제공한다. 여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도를 제공한다.
여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 대상체에서 인슐린-관련 병태를 치료 및/또는 예방하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체를 제공한다. 여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체를 제공한다.
여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드를 제공하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. 일부 예에서, 아미노산 20의 치환은 G20Y, G20F 또는 G20P이다. 일부 예에서, 아미노산 10의 치환은 H10E, H10D 또는 H10Q이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함하고, A 사슬 펩티드에 적어도 하나의 치환을 더 포함한다. 일부 예에서, A 사슬 펩티드의 적어도 하나의 치환은 T8H, T8Y, T8K 또는 S9R이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함하고, A 사슬 펩티드에 적어도 2개의 치환을 더 포함한다. 일부 예에서, A 사슬 펩티드의 적어도 2개의 치환은 T8H, T8Y, T8K 및 S9R로부터 선택되는 2개 치환이다.
일부 구체예에서, 펩티드는 데스-옥타펩티드 인슐린이다. 일부 예에서, B 사슬 펩티드는 FVNQHLCGSELVEALYLVCYER (SEQ ID NO: 30)의 서열을 포함한다. 일부 예에서, A 사슬은 GIVEQCCHRICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 39)의 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 하나의 디술피드 결합을 통해서 결합된다. 일부 구체예에서, 펩티드는 단량체이다.
일부 구체예에서, 인슐린 A 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린 A 사슬 펩티드와 적어도 70%가 동일하다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체, 펩티드 또는 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체, 펩티드 또는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 인슐린 수용체 활성화를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 인슐린 수용체 활성화를 증가시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체, 펩티드 또는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 혈당을 저하시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 혈당을 저하시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체, 펩티드 또는 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 제1형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 대상체에서 제1형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. 일부 예에서, 대상체는 펩티드를 투여하기 이전에 제1형 당뇨병으로 진단받았다.
여전히 추가의 양상에서, 적어도 하나의 디술피드 결합을 통해서 B 사슬 펩티드에 결합된 A 사슬 펩티드를 갖는 치료적 단백질을 제공하고, 여기서 A 사슬은 GIVEQCCHRICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 39)의 서열을 포함하고, B 사슬 펩티드는 FVNQHLCGSELVEALYLVCYER (SEQ ID NO: 30)의 서열을 포함한다.
여전히 추가의 양상에서, 본 발명은 인슐린 수용체 (IR)에 결합하는 것으로 알려진 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 변형시키는 방법을 제공하고, 이 방법은 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 구조의 구조-기반 평가를 수행하는 단계 및 평가의 결과로서 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 화학적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 구조-기반 평가는 인슐린의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조의 비교를 포함한다. 일부 구체예에서,구조-기반 평가는 인슐린 수용체의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 구조 간에 형성된 복합체의 분자적 모델링 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 IR과 결합하는 이의 능력에 대해 시험하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 IR 활성화를 조정하는 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드의 능력을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 혈중 포도당 수준을 저하시키는 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드의 능력을 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, IR에 결합하는 것으로 알려진 폴리펩티드는 인슐린이다. 일부 구체예에서, 인슐린은 인간 인슐린이다. 다른 양상에서, 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 방법으로 재디자인되거나 또는 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 단량체이다.
다른 양상에서, 본 발명은 IR 효현제인 단리된 분자를 제공하고, 여기서 분자는 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 Con-Ins G1의 3D 구조를 기반으로 동정 및/또는 디자인된다. 일부 구체예에서, 분자는 펩티드, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체이다. 일부 구체예에서, 분자는 단량체이다. 일부 구체예에서, 분자는 10-6 M 미만의 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 을 갖는다.
다른 양상에서, 본 발명은 IR에 결합하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하고, 이 방법은
i) a) 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조, 또는
b) a)의 상응하는 골격 원자 상에 중첩시 약 2.0 Å 미만의 평균 제곱근 편차를 갖는 구조
를 갖는 폴리펩티드의 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계, 및
ii) IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 디자인하거나 또는 스크리닝하는 단계
를 포함한다.
일부 구체예에서, 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계는 IR 또는 이의 영역에 결합하는 폴리펩티드의 모델을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 합성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 화합물은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정한다. 일부 구체예에서, 화합물은 단량체이다. 일부 구체예에서, 방법은 혈중 포도당 수준을 조정하는 능력에 대해서 단계 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 시험하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 i) 및 ii)는 인 실리코 (in silico)로 수행된다.
다른 양상에서, 본 발명은 인슐린 활성을 모방하는 화합물을 동정하는 컴퓨터-기반 방법을 제공하고, 이 방법은
i) a) 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조, 또는
b) a)의 상응하는 골격 원자 상에 중첩시 약 2.0Å 미만의 평균 제곱근 편차를 갖는 구조
를 갖는 폴리펩티드의 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계, 및
ii) 인슐린 활성을 모방하는 화합물을 디자인하거나 또는 스크리닝하는 단계
를 포함한다.
일부 구체예에서, 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계는 IR 또는 이의 영역에 결합하는 폴리펩티드의 모델을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 합성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 화합물은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정한다. 일부 구체예에서, 화합물은 단량체이다. 일부 구체예에서, 방법은 혈중 포도당 수준을 조정하는 능력에 대해서 단계 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 시험하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 단계 i) 및 ii)는 인 실리코로 수행된다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 방법을 사용하여 동정된 화합물을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 유닛 셀 치수가 a = b = c = 74.91Å이고 임의의 셀 치수의 편차가 약 2% 이하인 공간군 P432를 갖는 Con-Ins G1 폴리펩티드의 결정을 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 부록 I의 원자 좌표에 의해 정의되는 Con-Ins G1 폴리펩티드의 구조를 제공한다.
추가 양상에서, 본 발명은 구조 모델로서 부록 I의 원자 좌표에 의해 정의되는 Con-Ins G1 폴리펩티드의 구조의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 구조 모델은 인슐린 유사체의 동정에 사용된다. 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 용도에 의해 동정된 인슐린 유사체를 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체, 폴리펩티드 분자 및/또는 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 구체예는 달리 특정하게 명시하지 않으면 임의의 다른 구체예에 준용하여 적용되어 질 수 있다. 예를 들어, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 발명의 방법에서 본 명세서에서 약술하는 인슐린 유사체, 펩티드 및 건강 상태의 예는 본 발명의 용도 및 약학 조성물에 균등하게 적용된다. 또한 본 발명의 구체예는 제조 단계 예컨대 약물의 제조에서 약학 조성물에 화합물을 유입하는 단계를 포함하는 것을 의도한다.
본 명세서 전반에서, 특별히 달리 명시하지 않거나 또는 내용에서 달리 요구하지 않으면, 단일 단계, 대상 조성물, 단계들의 군 또는 대상 조성물의 군에 대한 언급은 하나 및 다수 (즉, 하나 이상)의 그들 단계, 대상 조성물, 단계들의 군 또는 대상 조성물의 군을 포괄해야한다.
개시된 방법 및 조성물의 추가적인 장점은 하기의 설명에서 부분적으로 기재될 것이며, 부분적으로 설명을 통해서 이해하게 되거나 또는 개시된 방법 및 조성물의 실시를 통해 습득할 수 있을 것이다. 개시된 방법 및 조성물의 장점은 첨부된 청구항에서 구체적으로 지정하는 요소 및 조합을 통해서 인식되고 획득될 것이다.
본 발명은 다음의 비제한적인 예 및 첨부된 도면을 참조하여 하기에서 설명된다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정한 구체예의 범주에 의해 한정되지 않으며, 이는 단지 예시의 목적을 위한 것이다. 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본 명세서에 기술되는 바와 같이, 본 발명의 범주 내에 명백하게 속한다.
본 명세서에 편입되어 이의 일부분을 구성하는 첨부된 도면은 개시된 방법 및 조성물의 몇몇 구체예를 예시하고, 설명과 함께, 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하기 위해 제공된다.
도 1: 인간 인슐린과 서열 비교. Con-Ins G1의 서열 및 인간 인슐린과 비교. 보존된 시스테인 잔기 및 방향족 트리플렛은 회색으로 음영표시된다. 디술피드 결합은 2개 시스테인 잔기를 연결하는 실선으로 표시된다. γ: γ-카복실화된-글루타메이트; O: 하이드록시프롤린; *: C-말단 아미드화.
도 2: Con-Ins G1의 특징규명. Con-Ins G1 (n=9), PTM-무함유 sCon-Ins G1 (n=9) 및 인간 인슐린 (n=21)의 인간 IR (이소폼 B)에 대한 경쟁 결합 분석. 오차 바는 SEM (부재시 오차 바는 마커 크기보다 작음)을 나타낸다. sCon-Ins G1: SecA6 및 SecA10 사이에 디셀레니드 결합을 갖는 Con-Ins G1.
도 3: Akt 인산화 분석으로 측정된 인슐린 신호전달. sCon-Ins G1, PTM-무함유 sCon-Ins G1 및 hIns (n=4)의 Akt 인산화 분석. 오차 바는 SEM을 나타낸다 (부재시 오차 바는 마커 크기보다 작음).
도 4a: Con-Ins G1의 x-선 결정 구조. Con-Ins G1 및 hIns의 중첩 (PDB 등재 1MSO). Con-Ins G1 B 사슬 및 A 사슬의 골격은 회색이고, hIns B 사슬 및 A 사슬은 검은색 및 흰색 (각각)이다.
도 4b: Con-Ins G1의 소수성 코어. hIns와 비교한 Con-Ins G1의 코어 구조. Con-Ins G1 B 사슬 및 A 사슬의 골격은 회색이고, hIns B 사슬 및 A 사슬의 골격은 검은색 및 흰색 (각각)이다.
도 4c, 4d 및 4e: Con-Ins G1의 번역후 변형. GlaA4, GlaB10 및 HypB3 (각각, GlaA4의 경우는 hIns GluA4의 것과 비교)의 측쇄 상호작용. Con-Ins G1 B 사슬 및 A 사슬의 골격은 회색이고, hIns B 사슬 및 A 사슬의 골격은 검은색 및 흰색 (각각)이다.
도 5: Con-Ins G1의 x-선 결정 구조. 결정학상 4중축 주변에서 Con-Ins G1 단량체의 결정내 배열을 보여주는 입체 이미지. 4개 술페이트 분자 (중심)는 ―각각 0.25의 유효 점유 및 비제한적인 좌표로- 4중 축 상에 상이한 전자 밀도의 상대적으로 평범한 방울 부분으로서 모델링된다. 술페이트 이온은 각각의 Con-Ins G1 단량체로부터 GlaA4의 측쇄 카복실레이트 및 GlyA1의 아미노-말단 기를 포함하는 전하-보상 클러스터의 일부를 형성한다.
도 6: Con-ins G1의 hIR 결합. 인간 인슐린 수용체의 주요 인슐린 결합 부위에서 Con-Ins G1의 분자 모델. hIns 잔기 B22-B27 (PDB 등재 4OGA의 그들 hIR-결합 형태에서)은 검은색으로 오버레이된다. 도면은 Con-Ins G1 TyrB15의 측쇄가, 이의 수용체 무함유 입체형태로부터 회전시에, Con-Ins G1 TyrB20와 함께, Con-Ins G1/hIR 복합체의 형성에서 어떻게 hIns PheB24의 대리물로서 작용하게 되는지를 예시한다. Con-Ins G1 (최전면)의 A 사슬은 명료함을 위해 투명하다.
도 7: TyrB15 및 TyrB20. 1.5 σ 수준에서 윤곽이 그려지는, Con-Ins G1 잔기 TyrB15 및 TyrB20에 인접한 (2mF obs-DF calc) 편차 전자 밀도의 등위면 대표도. 양쪽 이들 잔기의 측쇄는 이웃하는 잔기들의 것 (예를 들어, TyrA19의 것)과 비교하여 무질서한 것으로 보인다.
도 8: Con-Ins G1의 GlaA4. hIR의 주요 결합 부위를 갖는 Con-Ins G1의 복합체의 분자 모델 내에서 관찰되는 바와 같이, Con-Ins G1 PTM 잔기 GlaA4의 측쇄와 hIR αCT 잔기 Asn711의 측쇄의 상호작용을 보여주는 계략적인 다이아그램. 분자 표면은 hIR L1 도메인의 것이다.
도 9: Akt 인산화 분석으로 측정된 인슐린 신호전달. hIns, hIns[DOI] 및 hIns[TyrB15, TyrB20, DOI]의 Akt 인산화 분석.
도 10: Con-Ins G1의 특징규명. 겉보기 MW 5380 ± 55 g/mol의 단일 종에 대한 최고 피트 (선)로 30,000 rpm (검은색 점) 및 45,000 rpm (회색 점)에서 Con-Ins G1의 침강 평형 분석.
도 11: Fv83 - 7.IR310.T 및 IR-A 704-719 와 공동 복합체로의 Con- InsG1. Fv83-7.IR310.T 및 IR-A704- 719 와의 공동 복합체로의 Con-InsG1의 복합체의 결정 구조의 비대칭 유닛에 있어서 2개 카피의 오버레이의 2개 직교 조망도. 각 패널에서, 한개 카피는 비교적 두꺼운 연결부를 갖는 회색 Cα 자취로서 도시되고 나머지는 비교적 얇은 연결부를 갖는 검은색 Cα 자취로서 도시된다. 오버레이는 IR310.T 모이어티 내 공통 잔기를 기반으로 한다. CR 도메인 및 그들의 부착된 Fv83-7은 명료함을 위해 생략된다.
도 12: Fv83 - 7.IR310.T 및 IR-A 704- 719 와의 공동 복합체로의 Con- InsG1. Fab83-7.IR310.T 및 IR-A704- 719 와의 공동 복합체로의 hIns의 결정 구조 (PDB 등재 4OGA)와 Fv83-7.IR310.T 및 IR-A704- 719 와의 공동 복합체로의 Con-InsG1의 결정 구조의 오버레이. Con-InsG1 복합체는 연회색 Cα 자취 (더 두꺼운 선)로서 도시되고 hIns 복합체는 검은색 Cα 자취 (보다 얇은 선, 두꺼운 검은색으로 도시된 잔기 B22-B30는 제외)로 도시된다. 오버레이는 IR310.T 모이어티 내 공통 잔기를 기반으로 한다. IR310.T의 시스테인-풍부 도메인 및 이의 부착된 항체 단편은 명료함을 위해 생략된다.
도 13: TyrB15 및 TyrB20. IR310.T의 공통 도메인 L1을 기반으로 하는 Fab83-7, IR310.T 및 IR-A704- 719 와의 복합체로의 hIns (PDB 등재 4OGA; 표지됨) 및 Fv83-7, IR310.T 및 IR-A704-719 (밑줄 표지)와의 복합체로의 Con-Ins G1의 오버레이. IR310.T의 L1 도메인은 카툰 리본 표시로 도시되는 반면, hIns, Con-Ins G1 및 IR-A704-719 는 Cα 자취 표시로 도시된다. IR310.T의 CR 도메인은 명료함을 위해 생략한다. hIR Phe714, hIns LeuB15 및 Phe B24 및 Con-Ins G1 TyrB15의 측쇄 및 Cα 원자는 공-막대 (ball-and-stick) 표시로 도시된다. hIns PheB24 및 Con-InsG1 TyrB15의 측쇄의 공간 대응은 명확하다. Con-Ins G1 TyrB20에 대해 해석가능한 전자 밀도는 존재하지 않는다. Con-Ins G1 및 hIns의 개별 A 사슬은 명료함을 위해 생략된다.
도 14: hIR의 주요 결합 부위 (부위 1)를 포함하는 성분에 결합된 hIns[DOI]의 분자 모델링. IR L1 도메인 (잔기 Gly5 내지 Cys155) 및 IR-A704-719 절편 (IR-A 이소폼의 잔기 Phe705 내지 Ser719)과의 복합체로의 hIns[DOI]의 분자 모델. IR-A704-719 절편은 카툰 리본 표시로 도시되고 진회색으로 표시된다. hIns[DOI] A 사슬 및 B 사슬은 카툰 리본 표시로 도시되고 표지된다. 투명한 분자 표면은 hIR L1 도메인의 것이다. hIR L1 도메인은 카툰 리본 표시로 도시되고 Tyr67의 측쇄가 도시되어 있다.
도 15: hIR의 1차 결합 부위 (부위 1)를 포함하는 성분에 결합된 hIns[TyrB15, DOI]의 분자 모델링. IR L1 도메인 (잔기 Gly5 내지 Cys155) 및 IR-A 절편 Phe705 내지 Ser719 (IR-A704-719)와의 복합체로서 hIns[TyrB15, DOI]의 분자 모델. IR-A704-719 절편은 카툰 리본 표시로 도시되고 진회색으로 표시된다. hIns[TyrB15, DOI] A 사슬 및 B 사슬은 카툰 리본 표시로 도시되고 표지된다. 분자 표면은 hIR L1 도메인의 것이다. 도면은 hIns LeuB15에 의해 점유된 것과 달리 TyrB15의 측쇄가 DOI-(IR-A704-719)-L1 계면 점유 공간의 소수성 코어로 어떻게 돌출되어 있는가를 예시한다.
도 16: hIR의 1차 결합 부위 (부위 1)를 포함하는 성분에 결합된 hIns[DOI, TyrB20]의 분자 모델링. IR L1 도메인 (잔기 Gly5 내지 Cys155) 및 IR-A704-719 와 복합체로의 hIns[TyrB20, DOI]의 분자 모델. 도면은 수용체와의 모든 다른 상호작용이 천연과 유사하게 나타나면서, 어떻게 TyrB20의 측쇄가 hIns B24 결합 부위에 남아 있는지를 예시한다. IR-A704-719 절편은 카툰 리본 표시로 도시되고 진회색으로 표시된다. hIns[TyrB20, DOI] A 사슬 및 B 사슬은 카툰 리본 표시로 도시되고 표지된다. 투명한 분자 표면은 hIR L1 도메인의 것이다. hIR L1 도메인은 카툰 리본 표시로 되시되고 Tyr67의 측쇄가 도시된다.
도 17: hIns[DOI]의 위치 스캔. hIns[DOI]의 각 부위에서 최종 돌연변이 ΔΔG (kcal/mol)의 기여도.
도 18: hIns[TyrB15, DOI]의 위치 스캔. hIns[TyrB15, DOI]의 각 부위에서 최종 돌연변이 ΔΔG (kcal/mol)의 기여도.
도 19: hIns[TyrB20, DOI]의 위치 스캔. hIns[TyrB20, DOI]의 각 부위에서 최종 돌연변이 ΔΔG (kcal/mol)의 기여도.
도 20: 인슐린 다량체 평형의 개략도. 도면은 인슐린 단량체화가 흡수율을 둔화시키는 것을 보여준다.
도 21: 인간 DOI 인슐린의 화학적 전합성. 도면은 인간 DOI 인슐린의 화학적 전합성을 도시한다. Thr-Ser 이소펩티드 (붉은 박스)는 인슐린 A 사슬의 가용성을 증가시키기 위해 사용되었다.
도 22: 예시된 인슐린 유사체에 의한 인슐린 신호전달 활성화. 도면은 hIR 활성화에 대한 B15 Tyr 및 B20 Tyr의 효과를 도시한다. 사용된 각 펩티드의 서열이 또한 도시되어 있다.
도 23: 예시된 인슐린 유사체에 의한 인슐린 신호전달 활성화. 도면은 hIR 활성화에 대한 B10 Glu, B20 Tyr의 효과를 도시한다. 사용된 각 펩티드의 서열이 또한 도시되어 있다.
도 24: 예시된 인슐린 유사체에 의한 인슐린 신호전달 활성화. 도 24A 및 24B는 각각 펩티드 서열/변형된 아미노산 및 인슐린 신호전달 활성화에서 B20 잔기의 효과를 도시한다.
도 25: 예시된 인슐린 유사체에 의한 인슐린 신호전달 활성화. 도면은 hIR 활성화에 대한 A8 His, A9 Arg의 효과를 도시한다. 사용된 각 펩티드의 서열이 또한 도시되어 있다.
도 26: 예시된 인슐린 유사체에 의한 인슐린 신호전달 활성화. 도면은 hIR 활성화에 대한 A8, A9, B10 및 B20의 개별 효과를 도시한다.
도 27: 독액 인슐린에 의한 인슐린 신호전달 활성화. 도면은 Con-Ins G1과 유사한 역가를 갖는 몇몇 독액 인슐린의 인슐린 신호전달 활성화를 도시한다 (상부 패널). 이들 독액 인슐린의 서열 정렬 (하부 패널). A 사슬의 위치 9 및 10의 잔기 및 B 사슬의 위치 10 및 20의 잔기가 강조되어 있다. γ 및 *는 번역후 변형 (각각 감마-카복시글루타메이트 및 C-말단 아미드화)을 나타낸다.
서열 목록의 핵심
SEQ ID NO: 1 - 41: 본 개시 내용의 구체예에 따른 인슐린 유사체, 펩티드 및/또는 화합물.
발명의 상세한 설명
일반 기술 및 정의
달리 특별히 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다 (예를 들어, 분자 유전학, 약리학, 단백질 결정학, 단백질 화학, 생화학 등).
달리 표시하지 않으면, 본 발명에서 이용되는 기술은 당업자에게 충분히 공지된 표준 절차이다. 이러한 기술은 하기와 같은 제공 문헌 전반에 기술되고 설명되어 있다: [J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)], [J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)], [T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)], [D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)], 및 [F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience] (1988, 현재까지의 모든 개정판 포함), [Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)], 및 [J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons] (현재까지의 모든 개정판 포함).
본 명세서 전반에서, 단어 "포함하다", 또는 변형 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군을 암시하는 것으로 이해하며, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군의 배제를 의미하는 것이 아니다.
용어 "및/또는", 예를 들어, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해해야 하며 양쪽 의미 또는 어느 한 의미에 대한 명백한 증거를 제공하는 것으로 이해해야 한다. 또한, 본 출원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 관사 "한" 및 "하나"는 일반적으로 달리 명시하지 않았거나 또는 문맥에서 단수형을 지정하는 것이 명확하지 않으면 "하나 이상"으로 해석될 수 있다.
용어 "인슐린"은 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 기니 피그 인슐린, 닭 인슐린, 마우스 인슐린, 소 인슐린 또는 독액 인슐린을 의미한다. 일부 구체예에서, 인슐린은 인간 인슐린을 의미한다. 용어 "독액 인슐린"은 청자 고둥 독액 인슐린을 의미한다. 바람직하게, 독액 인슐린은 Con-Ins G1을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "인슐린 유사체"는 인슐린의 활성을 모방할 수 있는 임의의 작용제를 의미한다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 적어도 인슐린 수용체 효현제이다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인슐린 수용체에 결합한다. 바람직하게 인슐린 유사체는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 펩티드모방체일 수 있다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 펩티드이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 문맥에서 달리 표시하지 않으면, 용어 "인슐린 유사체", "펩티드" 및 인슐린 펩티드"는 상호교환적으로 사용된다. 인슐린 유사체는 또한 본 명세서에 개시된 방법으로 동정된 IR 효현제, 분자, 화합물 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드"는 2개 내지 약 50개 아미노산 범위인 아미노산의 중합체 (예를 들어, 길이가 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 45개 아미노산)를 의미한다. 용어 펩티드는 미변형 펩티드, 변형 펩티드, 및 아니면 화학적으로 유도체화된 펩티드 (예를 들어, 인산화, 술페이트화, 아미드화 등)를 포괄한다. 일부 구체예에서, 펩티드는 비천연 펩티드 올리고머, 예컨대 문헌 [Sadowsky et al. (2005)] 및 [Sadowsky et al. (2007)]에 기술된 것들일 수 있다. 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 전체 길이가 일반적으로 약 50개 아미노산을 초과하고 전형적으로 안정한 특징적인 2차 및 3차 구조를 갖는 아미노산의 중합체를 의미한다. 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 또한 그들의 비공유 또는 공유 회합을 통한 결과로 안정한 3차 4차 구조와 회합되는 이러한 중합체 (예를 들어 둘 이상)의 조합을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드는 치료되는 대상체에서 천연적으로 발생되는 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 또는 합성 아미노산 유사체를 포함한다. 이러한 아미노산은 제한없이, 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥산산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 사이클로펜틸알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 일반적으로 포함한다. 또한 이 범주에는 바이오틴화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드와의 연결 등을 통해서, 합성 동안 또는 그 이후에 차등적으로 변형된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 포함된다. 이들 변형은 펩티드, 단백질 또는 폴리펩티드의 안정성 및/또는 생체활성을 증가시키기 위해 제공될 수 있다.
용어 아미노산 "변형"은 아미노산에/아미노산으로부터 화학기의 첨가 및/또는 제거에 의한 아미노산의 유도체화, 또는 아미노산의 치환을 의미하고, 인간 단백질에 통상적으로 존재하는 임의의 20개 아미노산에 의한 치환을 비롯하여, 비정형 또는 비천연 발생 아미노산에 의한 치환을 포함한다. 비정형 아미노산의 상업적 공급처는 Sigma-Aldrich (Milwaukee, Wis.), ChemPep Inc. (Miami, Fla.), 및 Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, Mass.)를 포함한다. 비정형 아미노산은 상업적 공급처에서 구매하거나, 새롭게 합성하거나, 또는 천연 발생 아미노산으로부터 화학적으로 변형시키거나 또는 유도체화시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용시 아미노산 "치환"은 상이한 아미노산 잔기에 의한 한 아미노산 잔기의 치환을 의미한다. 치환된 아미노산은 인간 단백질에 통상적으로 존재하는 임의의 20개 아미노산을 비롯하여, 비정형 또는 비천연 발생 아미노산일 수 있다.
용어 "A 사슬 펩티드" 및 "B 사슬 펩티드"는 "인슐린 A 사슬 펩티드" 및 "인슐린 B 사슬 펩티드"와 상호교환적이다.
본 명세서에서 사용시 "이의 유도체"인 화합물에 대한 언급은 선구 화합물로부터 적합화시키거나 또는 변형되고, 유사하지만 신규한 구조를 가지며 선구 화합물과 유사한 생물학적 활성을 갖는 화합물을 의미한다. 일부 구체예에서, 선구 화합물은 본 명세서에 기술된 바와 같이 소형 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 인슐린 유사체이다. 일부 구체예에서, 선구 화합물은 임의의 화학적 변형을 포함하고, 단백질 또는 펩티드와 회합된 임의 분자, 예컨대 탄수화물, 지질 및/또는 단백질 또는 펩티드의 단일 또는 다수 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하도록 변형될 수 있는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 인슐린 유사체이다. 일 구체예에서, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 "유도체"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 팔미토일화, 미리스토일화, 이소프레닐화, 지질화, 알킬화, 유도체화, 보호/차단 기의 도입, 단백질가수분해 절단 또는 항체 또는 다른 세포 리간드와의 결합에 의해 변형된 유사체를 포함한다.
본 출원의 전반에서, 글자 및 숫자 (예를 들어, 위치 A5 또는 B5)에 의한 특정 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 코너스 지오그라퍼스 유래의 독액 인슐린 Con-G1 Ins의 개별 A 사슬 또는 B 사슬에서 A 사슬 (예를 들어, 위치 A5) 또는 B 사슬 (예를 들어, 위치 B5)의 그 위치의 아미노산, 또는 이의 임의 유사체에서 상응하는 아미노산 위치를 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 임의의 추가의 상세한 표현없이 "위치 B17"에 대한 언급은 Con-Ins G1가 2개의 추가적인 N-말단 B 사슬 잔기를 가지므로 인간 인슐린의 B 사슬의 상응하는 위치 B15를 의미한다.
본 명세서에서 어구 "아미노산 번호에 상응하는 위치에서"는 정의된 아미노산 서열과 관련하여 주변 아미노산과 비교된 아미노산의 상대적 위치를 의미한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 인간 인슐린 (도 1 참조)과 비교시, 본 발명의 인슐린 유사체의 B 사슬은 예컨대 Con-Ins G1에 존재하는, 하나 또는 두개의 추가적인 N-말단 아미노산을 가질 수 있다. 일례에서, 단백질 정렬을 수행시, 당업자는 천연 발생 인간 인슐린의 B 사슬의 류신 (15번째 아미노산)이 B 사슬 Con-Ins G1의 17번째 아미노산에 상응한다는 것을 쉽게 이해할 것이다 (도 1 참조). 본 발명의 바람직한 구체예에서, 천연 발생 인간 인슐린의 B 사슬의 이러한 15번째 아미노산은 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기이고/이거나 천연 발생 인간 인슐린의 B 사슬의 20번째 아미노산은 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기이다.
용어 "단량체 인슐린"은 인간 인슐린보다 고차원 종 (예컨대 이량체, 사량체, 육량체 등)을 형성하는 경향이 덜한 인슐린 및 인슐린 유사체를 의미한다. 바람직하게, 인슐린 또는 인슐린 유사체는 완전하게 또는 실질적으로 단량체, 예를 들어 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 단량체이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "치료적"은 질환 또는 병태를 치료할 수 있거나 또는 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상을 경감시킬 수 있는 치료, 요법 또는 약물을 의미한다. 본 명세서에서 사용시, 치료적은 제한없이, 단백질, 펩티드, 핵산 (예를 들어, CpG 올리고뉴클레오티드), 소형 분자, 백신, 알레르겐 추출물, 항체, 유전자 요법, 다른 생물제 또는 소형 분자를 포함하는, 치료적 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용시, 용어 "대상체"는 인슐린 관련 장애에 감수성인 임의의 유기체를 의미한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 포유동물, 조류, 절지동물, 척색동물, 양서류 또는 파충류일 수 있다. 예시적인 대상체는 제한없이, 인간, 영장류, 가축 (예를 들어, 양, 소, 닭, 말, 당나귀, 돼지), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이), 실험실 실험 동물 (예를 들어, 쥐, 토끼, 래트, 기니 피그, 햄스터), 포획 야생 동물 (예를 들어, 여우, 사슴)을 포함한다. 일례에서, 대상체는 포유동물이다. 일례에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용시 용어 "치료하는"은 특별한 장애 또는 병태의 예방, 또는 특별한 장애 또는 병태와 연관된 증상의 완화 및/또는 상기 증상의 예방 또는 제거를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용시 용어 "당뇨병을 치료하는"은 일반적으로 허용가능한 수준 이내로 포도당의 혈중 수준을 유지시키는 것을 의미할 것이며 소정 상황에 따라서 혈중 포도당 수준의 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 인슐린 유사체는 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 치료되는 질환 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도로 완화시키기에 충분한 투여되는 인슐린 유사체의 양을 의미한다. 그 결과는 질환의 징후, 증상, 또는 원인의 감소 및/또는 경감, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 바람직한 변경일 수 있다. 예를 들어, 한 증상은 고혈당증의 예방 또는 치료일 것이다. 인슐린 유사체의 "유효량"은 과도한 부정적 부작용없이 바람직한 약리학적 효과 또는 치료적 호전을 획득하는데 유효한 양이다. 단지 예로서, 치료적 유효량은 제한없이 용량 점증 임상 시험을 포함하여, 통상의 실험을 통해 결정될 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은 예를 들어 예방적 유효량을 포함한다. "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 임의 연령, 체중, 일반 상태의 대상체의 화합물 물질대사의 편차, 치료하려는 병태, 치료하려는 병태의 중증도, 및 처방 의사의 판단에 기인하여, 대상체마다 다를 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것이 항상 가능한 것은 아니다. 그러나, 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효"량은 통상의 실험을 사용하여 당업자가 결정할 수 있다. 하나를 초과하는 치료제가 조합하여 사용되는 경우에, 각 치료제의 "치료적 유효량"은 그 자체로 사용시 치료적으로 유효한 치료제의 양을 의미할 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 이의 조합에 의한 치료적으로 유효한 감소된 양을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, 용어 활성의 "개시"는 인슐린이 혈류에 도달하여 혈중 포도당 수준을 저하시키기 시작하기 이전의 시간 길이를 의미하고, "피크"는 인슐린 유사체가 혈중 포도당 수준을 최고로 저하시킬 때의 시기를 의미하며 "지속기간"은 얼마나 오랜동안 인슐린이 작업을 지속하는가, 즉 혈중 포도당 수준의 저하를 지속하는가를 의미한다. 당업자는 인슐린 유사체의 개시, 피크 및 지속기간이 환자, 환자의 병태, 및 투여 경로와 같은 인자들에 따라서 다양할 수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
본 명세서에서 사용시 용어 "IR"은 야생형 IR, 및 대립유전자 변이체 및 천연 발생 돌연변이 및 유전자 조작 변이체를 포함한 이의 변이체를 포함한다. IR이 본 명세서에 특별히 개시되지 않은 다른 종으로부터 유래될 수 있다는 것이 당업자에게 쉽게 분명해질 것이다. 더 나아가서, 당업자는 원시 유기체부터 포유동물 및 인간까지 IR 서열에 관한 기지의 보존성이 제공되면 이러한 다른 적합한 IR을 동정하는데 어려움을 겪지 않을 것이다.
독액 인슐린 결정
일 양상에서, 본 발명은 독액 인슐린을 포함하는 결정을 제공한다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "결정"은 수평면이 뚜렷한 각도에서 교차하고 구성 화학 종의 규칙적인 구조 (예를 들어, 내부 구조)가 존재하는 구조 (예컨대, 3차원 (3D) 고체 응집체)를 의미한다. 용어 "결정"은 특히 고형 물리적 결정 형태 예컨대 실험적으로 제조된 결정을 의미한다.
본 발명에 따른 결정은 코너스 (Conus) 속의 유기체, 예컨대 코너스 지오그라퍼스 (Conus geographus) 및 코너스 툴리파 (Conus tulipa) 유래의 독액 인슐린을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구체예는 코너스 지오그라퍼스의 독액 유래 인슐린을 의미한다. 그러나, 독액 인슐린은 또한 다른 종으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 이들 인슐린은 20개 아미노산 A 사슬 및 23개 아미노산 B를 포함하지만, A 및 B 사슬의 길이는 다양할 수 있다. A 및 B 사슬의 아미노산은 번역후 변형될 수 있으며, 번역후 변형의 예는 제한없이 글루탐산이 γ-카복실화된 글루탐산 (공액 염기 감마 카복시글루타메이트라고도 함)으로 치환될 수 있는 것, 프롤린이 하이드록시프롤린으로 치환될 수 있는 것, C-말단이 아미드화될 수 있는 것, 시스테인이 셀레온시스테인으로 치환될 수 있는 것을 포함한다. 당업자는 다른 번역후 변형이 가능하다는 것을 인식하게 될 것이다.
바람직한 구체예에서, 독액 인슐린은 Con-Ins G1이고 하기에 표시된 서열을 갖는다:
A-사슬: GVVyHCCHRPCSNAEFKKYC* (SEQ ID NO: 22)
B-사슬: TFDTOKHRCGSyITNSYMDLCYR (SEQ ID NO: 23)
여기서 y는 γ-카복실화된 글루탐산이고, O는 하이드록시프롤린이며 *는 A-사슬의 C-말단이 아미드화된 것이다. 그러나, 인슐린 폴리펩티드는 또한 다른 종으로부터 수득될 수 있거나 또는 비천연 디자인된 서열일 수 있다.
결정은 야생형 서열 또는 천연 발생 돌연변이를 비롯하여 유전자 조작 변이체를 포함하는 이의 변이체에 의해 제작될 수 있다. 전형적으로, 변이체는 상응하는 야생형 독액 인슐린과 적어도 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖는다.
독액 인슐린을 포함하는 결정의 제조를 하기에서 기술한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 유닛 셀 치수가 a = b = c = 74.91Å이고 임의의 셀 치수의 편차가 약 2% 이하인 공간군 P432을 갖는 Con-Ins G1의 결정을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 독액 인슐린을 포함하는 결정은 부록 I에 기재된 원자 좌표를 갖는다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "원자 좌표"는 축의 체계와 관련하여 하나 이상의 원자의 위치를 정의한 값의 세트를 의미한다. 원자 좌표가 그로부터 유래된 모델의 정확도에 유의하게 영향을 미치지 않고, 가변적일 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이며, 따라서, 본 발명이 바람직한 원자 구조의 매우 정확한 정의를 제공하지만, 소수의 변동이 예상되며 청구항은 그러한 편차를 포괄하고자 한다는 것을 이해하게 될 것이다. 바람직한 것은 수소 이외의 모든 골격 원자에 대한 x, y 및 z 좌표의 평균 제곱근 편차 (RMSD)가 부록 I에 제공된 좌표와 비교하여 2.0Å 미만 (바람직하게, 1.5Å, 1.3Å, 1Å, 0.7Å 미만 또는 0.3Å 미만)인 변이이다. 원자 좌표의 번역 및/또는 3D 강체 회전은 관심 분자의 구조를 변경시키지 않는다는 것을 당업자는 쉽게 이해하게 될 것이다.
독액 인슐린의 결정 구조
추가 양상에서, 독액 인슐린, 또는 이의 영역의 결정 구조가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 독액 인슐린은 Con-Ins G1이다. 일부 구체예에서, 독액 인슐린의 결정 구조는 부록 I의 원자 좌표에 의해 정의되는 Con-Ins G1의 구조이다.
독액 인슐린에 대해 실험적으로 수득된 원자 좌표는 부록 I에 표시되어 있다. 그러나, 당업자는 X-선 결정학으로 결정된 원자 좌표 세트가 표준 오차가 없지 않다는 것을 이해하게 될 것이다. 따라서, 부록 I에 열거된 원자 좌표 상에 중첩 (골격 원자 사용)시 0.75Å 미만의 단백질 골격 원자의 평균 제곱근 편차를 갖는 독액 인슐린에 대한 임의의 구조 좌표 세트는 동일한 것으로 간주되어야 한다.
본 발명은 또한 부록 I에 열거된 원자 좌표와 실질적으로 일치하는 독액 인슐린의 원자 좌표를 포함한다. 소정 원자 좌표의 세트와 "실질적으로 일치하는" 구조는 그러한 구조의 적어도 약 50%가 각 도메인에서 2차 구조 요소의 골격 원자에 대해 약 2.0Å 미만, 바람직하게 각 도메인에서 2차 구조 요소의 골격 원자에 대해 약 1.5Å 미만, 및 보다 바람직하게, 각 도메인에서 2차 구조 요소의 골격 원자에 대해 약 1.3Å 미만, 및 높은 선호도로, 각 도메인에서 2차 구조 요소의 골격 원자에 대해 약 1.0Å 미만, 약 0.7Å 미만, 약 0.5Å 미만, 및 가장 바람직하게, 약 0.3Å 미만의 RMSD를 갖는 것인 구조이다.
보다 바람직한 구체예에서, 소정 원자 좌표의 세트와 실질적으로 일치하는 구조는 이러한 구조의 적어도 약 75%가 열거된 RMSD 값을 갖고, 보다 바람직하게, 이러한 구조의 적어도 약 90%가 열거된 RMSD 값을 가지며, 가장 바람직하게, 이러한 구조의 약 100%가 열거된 RMSD 값을 갖는 것인 구조이다.
보다 더 바람직한 구체예에서, "실질적으로 일치하다"의 상기 정의는 아미노산 측쇄의 원자를 포함하는 것으로 확대될 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 어구 "공통 아미노산 측쇄"는 원자 좌표의 소정 세트와 실질적으로 일치하는 구조 및 이러한 원자 좌표에 실제로 해당하는 구조 둘 모두에 공통인 아미노산 측쇄를 의미한다.
폴리펩티드에 대한 원자 좌표의 세트는 3차원의 형상을 정의하는 지점의 상대적 세트라는 것을 이해하게 될 것이다. 따라서, 전체적으로 상이한 좌표 세트가 유사하거나 또는 동일한 형상을 정의하는 것이 가능하다. 게다가, 개별 좌표에서 약간의 변동은 전체 형상에 대해 미미한 효과를 가지게 될 것이다.
좌표에서의 변동은 구조 좌표의 수학적 조작으로 인해 발생될 수 있다. 예를 들어, 부록 I에 기재된 구조 좌표는 구조 좌표의 결정학적 순열, 구조 좌표의 분할, 구조 좌표 세트에 정수의 첨가 또는 삭감, 구조 좌표의 도치, 또는 이의 임의 조합에 의해 조작될 수 있다.
대안적으로, 아미노산의 돌연변이, 첨가, 치환 및/또는 결실, 또는 결정을 구성하는 임의 성분의 다른 변화로 인한 결정 구조의 변형이 또한 구조 좌표의 변동을 설명할 수 있다.
다양한 컴퓨터 분석을 사용하여 분자 복합체 또는 이의 일부분이 상기 기술된 독액 인슐린 구조의 전부 또는 일부와 충분히 유사한지 여부를 결정한다. 이러한 분석은 당업자에게 공지된 소프트웨어, 예를 들어 PDBeFOLD (Krissinel and Henrick, 2004), DALI (Holm and Rosenstrom, 2010), LSQMAN (Kleywegt and Jones, 1994) 및 CHIMERA (Pettersen et al. 2004)를 사용하여 수행될 수 있다.
비교는 전형적으로 등가 원자의 명시된 쌍에 대한 적합도의 평균 제곱근 편차가 절대 최소이기 위해 요구되는 최적 번역 및 회전의 계산을 포함한다. 그 값은 옴스트롬으로 제공된다. 따라서, 본 발명의 범주 내에서 독액 인슐린의 구조 좌표는 전체 번역 및/또는 회전에 의한 부록 I에 열거된 원자 좌표와 관련된 구조 좌표를 포함한다. 따라서, 상기 열거된 RMSD 값은 적어도 구조의 골격 원자가 최적으로 중첩되는 것으로 가정하며 이것은 그로부터 RMSD 값을 계산하기 위해 필요한 최적 적합되를 회득하기 위해 번역 및/또는 회전을 요구할 수 있다.
일부 구체예에서, 또한 부록 I에 열거된 상기 원자 좌표의 서브셋 및 이와 실질적으로 일치하는 서브셋을 제공한다. 바람직한 서브셋은 독액 인슐린의 하나 이상의 영역, 예를 들어 (i) A 사슬, (ii) B 사슬, (iii) 소수성 코어 (예를 들어 Con-Ins G1에서 소수성 코어는 잔기 ValA2, CysA6, CysA11, PheA16, TyrA19, ArgB6, IleB11, TyrB15 및 LeuB18의 측쇄를 포함함), (iv) PTM 및 PTM과 상호작용하는 잔기, (v) 수용체 결합 표면 (예를 들어, Con-Ins G1의 IR 결합 표면); (vi) TyrB15 및 TyrB15와 상호작용하는 잔기; (vii) TyrB20 및 TyrB20과 상호작용하는 잔기; (viii) PheA16 및 PheA16과 상호작용하는 잔기. (ix) 개별 A-사슬 말단에 바로 인접되어 있는 잔기의 서브셋을 정의한다.
명시된 원자 좌표의 세트와 실질적으로 일치하는 독액 인슐린 또는 이의 영역의 3차원 구조는 예를 들어 하기의 데이타로부터 유래되는 정보를 사용하여, Insight II 상동성 소프트웨어 패키지 (Insight II (97.0), MSI, San Diego)로 실행되는, MODELER (Sali and Blundell, 1993)와 같은 적합한 모델링 컴퓨터 프로그램을 통해 모델링될 수 있다: (1) 독액 인슐린의 아미노산 서열; (2) 3차원 입체형태를 갖는 명시된 원자 좌표의 세트에 의해 묘사되는 단백질의 관련 부분(들)의 아미노산 서열; 및 (3) 명시된 3차원 입체형태의 원자 좌표. 명시된 원자 좌표의 세트와 실질적으로 일치하는 독액 인슐린의 3차원 구조는 또한 하기에 상세히 기술되는 방법 예컨대 분자 치환으로 산출될 수 있다.
구조 좌표/원자 좌표는 전형적으로 후속 컴퓨터 조작을 위해 기계 판독-매체 상에 로딩된다. 따라서 모델 및/또는 원자 좌표는 유리하게 기계-판독 매체, 예컨대 테이프, 디스켓, 하드 디스크, CD-ROM 및 DVD, 플래시 메모리 카드 또는 칩, 서버 및 인터넷을 포함하는, 자성 또는 광학 매체 및 무작위 접근 또는 읽기-전용 메모리에 저장된다. 기계는 전형적으로 컴퓨터이다. 본 발명은 또한 Con-Ins G1의 원자 좌표 및/또는 모델을 묘사하는 데이타가 기록된 컴퓨터 판독 매체를 제공한다. 또한 부록 I에 따른 좌표 데이타, 또는 이의 서브셋이 기록된 컴퓨터 판독 매체를 제공하고, 여기서 상기 좌표 데이타는 Con-Ins G1 또는 Con-Ins G1의 영역의 3차원 구조를 정의한다.
본 발명은 또한 부록 I에 표시된 바와 같은 원자 좌표의 세트, 또는 이의 서브셋 또는 둘 모두를 제공하고, 여기서 상기 좌표는 독액 인슐린의 3차원 구조를 정의한다. 구조 좌표/원자 좌표는 컴퓨터에 의해 디스플레이될 수 있고/있거나 전자 파일로 표시될 수 있는 청자고둥 인슐린 결정의 3차원 구조의 표상, 예를 들어 이미지를 생성하도록 컴퓨터에서 사용될 수 있다.
구조 좌표/원자 좌표 및 그로부도 유래된 모델은 또한 다양한 목적 예컨대 약물 개발, 생물학적 시약 (결합 단백질) 선별 및 다른 단백질 결정의 X-선 결정학적 분석에 사용될 수도 있다. 일 양상에서, 구조 모델로서 Con-Ins G1의 구조의 용도가 제공된다. 일부 구체예에서, 구조 모델은 인슐린 유사체의 동정에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 구조 모델로서 Con-Ins G1의 구조를 사용하여 동정된 인슐린 유사체를 포괄한다.
Con-Ins G1 또는 이의 영역의 3차원 구조는 IR과 상호작용하고/하거나 IR을 조정하는 후보 화합물의 약물 디자인 및 인 실리코 스크리닝에 유용한 모델을 개발하는데 사용될 수 있다. 다른 물리화학적 특징, 예를 들어 결합, 정전기 등이 모델을 개발하는데 사용될 수 있다.
일반적으로 용어 "인 실리코 (in silico)"는 컴퓨터 메모리, 즉 실리콘 또는 기타 칩과 같은 것에서의 생성을 의미한다. 달리 명시하지 않으면, "인 실리코"는 "가상 (virtual)"을 의미한다. 본 명세서에서 사용시 용어 "인 실리코"는 시험관내 또는 생체내 실험보다는 컴퓨터 모델의 사용을 기반으로 하는 스크리닝 방법을 의미하고자 한다.
분자 치환
본 명세서에서 제공되는 Con-Ins G1의 결정 구조는 또한 분자 치환을 사용하여 신규한 결정의 구조를 모델링/해석하는데 사용될 수도 있다.
일부 양상에서, 본 발명은 또한 구조 모델로서, 독액 인슐린의 구조, 또는 이의 서브셋의 용도를 제공한다.
일부 구체예에서, 독액 인슐린, 또는 독액 인슐린의 영역의 원자 좌표, 예컨대 부록 I에 기재된 것은 독액 인슐린과 유사한 적어도 일부 구조적 특성을 함유하는 분자 복합체의 3차원 구조의 적어도 일부분을 결정하는데 사용될 수 있다. 특히, 다른 결정화된 독액 인슐린 또는 인슐린 유사체에 관한 구조 정보가 수득될 수 있다. 이것은 분자 치환을 포함하여, 수많은 충분히 공지된 임의의 기술을 통해 획득될 수 있다.
분자 치환의 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 PHASER (McCoy et al. 2007)이다. 분자 치환의 방법은 일반적으로 문헌 [Brunger, 1997]; [Navaza and Saludjian, 1997]; [Tong and Rossmann, 1997]; [Bentley, 1997]; [Lattman, 1985]; [Rossmann, 1972]에 기술되어 있다.
일반적으로, X-선 회절 데이타는 결정화된 표적 구조의 결정으로부터 수집된다. X-선 회절 데이타는 패터슨 (Patterson) 함수를 계산하기 위해 변환된다. 결정화된 표적 구조의 패터슨 함수는 기지 구조 (본 명세서에서는 탐색 구조라고 함)로부터 산출된 패터슨 함수와 비교된다. 결정화된 표적 구조의 패터슨 함수는 탐색 구조 패터슨 함수 상에서 회전하여 결정 내 결정화된 표적 구조의 올바른 배향을 결정한다. 다음으로 결정 축에 대해서 표적 구조의 위치를 결정하기 위해서 번역 함수가 산출된다. 결정화된 표적 구조가 유닛 셀에서 올바르게 위치되면, 실험 데이타에 대한 초기 위상이 산출될 수 있다. 이들 위상은 구조적 차이가 관찰될 수 있는 전자 밀도 지도의 산출 및 구조의 정밀화를 위해 필요하다. 바람직하게, 탐색 분자의 구조적 특성 (예를 들어, 아미노산 서열, 보존된 디-술피드 결합, 및 베타-가닥 또는 베타-시트)은 결정화된 표적 구조와 관련된다.
전자 밀도 지도는 결국에 임의의 충분히 공지된 모델 구축 및 구조 정밀화 기술이 수행되어 미지의 결정화된 분자 복합체의 최종적인 정확한 구조를 제공할 수 있다 (예를 들어, [Jones et al. 1991]; [Brunger et al. 1998] 참조).
분자 치환 이외의 방법에 의한, 위상에 대한 정확한 값의 수득은 근사법 및 정밀화의 반복적인 주기를 포함하고 결정 구조의 해석을 상당히 방해하는 시간 소모적인 과정이다. 그러나, 적어도 상동성 부분을 함유하는 단백질의 결정 구조가 해석되면, 기지 구조로부터의 위상은 미지 구조에 대한 위상의 만족할만한 추정을 제공한다. 분자 치환을 사용하여, 본 명세서에서 제공되는 (그리고 부록 I에 기재되는) 독액 인슐린의 구조 좌표의 전부 및 일부는 그 구조가 알려지지 않은 결정화된 분자/분자 복합체의 구조를 처음부터 이러한 정보를 결정하려는 시도보다 더 신속하고 효율적으로 결정하기 위해서 사용될 수 있다.
독액 인슐린의 임의 부분과 충분히 상동성인 임의의 결정화된 분자/분자 복합체의 임의 부분의 구조가 이 방법을 통해 해석될 수 있다. 이 방법은 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 디자인된 인슐린 유사체의 구조를 결정하는데 특히 유용하다.
본 명세서에서 언급되는 분자/분자 복합체 전부는 충분히 공지된 X-선 회절 기술을 사용해 연구될 수 있고 1.5-3.5 A 분해 X-선 데이타에 대해서 약 0.25 이하의 R 값까지 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 X-PLOR (Yale University, Molecular Simulations, Inc.가 배포; Brunger, 1996 참조), REFMAC (Murshudov et al. 1997), PHENIX (Adams et al. 2010) 및 BUSTER (Global Phasing Ltd.가 배포, Bricogne et al. 2011)를 사용하여 정밀화시킬 수 있다. 따라서 이러한 정보는 기지의 인슐린 유사체를 최적화시키고, 보다 중요하게는, 신규하거나 또는 개선된 인슐린 유사체를 디자인하는데 사용될 수 있을 것이다.
독액 인슐린을 결정화하기 위한 방법
본 발명은 또한 독액 인슐린을 포함하는 결정을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 명세서에 개시된 독액 인슐린의 결정 형태는 하기의 결정화 방법으로 수득될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은
(a) 독액 인슐린의 수성 용액을 제공하는 단계;
(b) 임의로, 단계 (a)의 용액을 농축시키는 단계; 및
(c) 독액 인슐린의 최종 농도가 0.5 mg/mL 내지 10 mg/mL의 범위가 되도록 침전 용액으로 단계 (a) 또는 단계 (b)의 용액을 희석시키는 단계
를 포함하는 독액 인슐린을 결정화하기 위한 방법을 제공한다.
단계 (a)에서 제공되는 독액 인슐린의 수성 용액은 완충될 수 있거나 또는 완충되지 않을 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 완충제가 사용될 수 있다. 독액 인슐린 용액을 위한 비제한적인 예는 Tris-HCI, 소듐 포스페이트, 및 트리에탄올아민 완충제를 포함한다. 바람직한 pH 값이 얻어지지 않은 경우에, 염기 또는 산 예컨대 암모늄 클로라이드, 소듐 아세테이트, 소듐 하이드록시드, 포타슘 하이드록시드, 또는 염산의 첨가에 의한 pH의 조정이 수행될 수 있다. 바람직하게, 단계 (a)의 용액은 10 mM HCl을 함유한다.
임의로, 용액은 이후에 임의로 농축될 수 있다. 일부 구체예에서, 용액은 원심분리 여과에 의해 농축된다. 그러나, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 농축 단계 (b) 이후에, 독액 인슐린의 농도는 1.0 mg/mL 내지 20 mg/mL의 범위여야 한다. 바람직하게, 독액 인슐린의 농도는 대략 4.0 mg/mL이다. 이것은 단계 (c)의 완충된 침전물 용액으로 희석 이전에 단계 (b)의 종료시 독액 인슐린의 농도이다. 단계 (b)의 농축된 용액 중 또는 단계 (b) 또는 단계 (b)의 농축 단계 동안 또는 단계 (b)의 농축 이후에 독액 인슐린의 농도는 예를 들어 브래드포드 단백질 어세이에 의해서 또는 UV 흡광 분광법을 포함하는 다른 통상의 방법에 의해 결정될 수 있다.
단계 (c)에서, 침전 용액이 단계 (b)의 용액에 첨가된다. 바람직하게 단계 (b)의 용액은 1:4 내지 4:1 (단계 (b)의 용액 : 완충된 침전 용액)의 비율, 가장 바람직하게 1:1의 비율로 침전 용액으로 희석된다.
침전 용액은 적어도 하나의 소형 유기 양쪽성 분자 및/또는 적어도 하나의 무기 염을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 소형 유기 양쪽성 분자는 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 부틸 에테르, 벤즈아미딘, 디옥산, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올, 메틸 펜탄디올, 펜탄디올, 헥산디올, 헵탄트리올, 디티오트레이톨, MES, Tris, Tris-HCI, Bis-Tris, 이미다졸, 비신, 트리메틸아민 N-옥시드, 숙신산, DL-말레이트, CHES, CAPS, 글리신, CAPSO, ADA, MOPS, Bis-Tris 프로판, SPG, MIB, PCB, MMT, N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄술폰산] (HEPES), TRIS, 수크로스 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 소형 유기 양쪽성 분자는 DL-말레이트, TRIS 및 MES를 포함한다. 일부 구체예에서, 소형 유기 양쪽성 분자는 완충제로서 작용할 수 있다. 일부 구체예에서, 용액 중 소형 유기 양쪽성 분자의 pH는 약 2.0 내지 약 11.0, 및 그 사이의 임의의 pH, 예를 들어 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 및 11.0으로 조정될 수 있다. 일부 구체예에서, pH는 약 8.0 내지 약 10.0이다. 바람직한 구체예에서, pH는 9.0이다.
일부 구체예에서, 침전 용액 중 모든 소형 유기 양쪽성 분자의 양은 완충된 침전 용액의 총 중량에 대해서 1 중량%/부피 내지 50 중량%/부피, 바람직하게 5 중량%/부피 내지 20 중량%/부피, 보다 바람직하게 8 중량%/부피 내지 12 중량%/부피의 소형 유기 양쪽성 분자이다. 바람직한 구체예에서, 완충된 침전 용액은 10 중량%/부피의 소형 유기 양쪽성 분자를 포함한다.
용어 "적어도 하나의 소형 유기 양쪽성 분자"는 상기 언급된 소형 유기 양쪽성 분자의 혼합물이 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 소형 유기 양쪽성 분자의 혼합물이 사용되는 경우에서, 사용되는 양은 함께 모든 소형 유기 양쪽성 분자의 총량을 의미한다.
침전 용액은 또한 무기 염을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 무기 염은 암모늄 클로라이드, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 플루오라이드, 암모늄 브로마이드, 암모늄 아이오다이드, 암모늄 나이트라이드, 카드뮴 클로라이드, 카드뮴 술페이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 아세테이트, 세슘 클로라이드, 세슘 술페이트, 코발트 클로라이드, 제2철 클로라이드, 리튬 아세테이트, 리튬 클로라이드, 리튬 나이트레이트, 리튬 술페이트, 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 포르메이트, 마그네슘 나이트레이트, 니켈 클로라이드, 포타슘 아세테이트, 포타슘 브로마이드, 포타슘 플루오라이드, 포타슘 포르메이트, 포타슘 아이오다이드, 포타슘 나이트레이트, 포타슘 티오시아네이트, 포타슘/소듐 타르트레이트, 소듐 아세테이트, 소듐 브로마이드, 소듐 플루오라이드, 소듐 아이오다이드, 소듐 나이트레이트, 소듐 포스페이트, 소듐 술페이트, 소듐 티오시아네이트, 아연 클로라이드, 아연 술페이트, 아연 아세테이트, 마그네슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 소듐 카코딜레이트, 소듐 하이드록시드, 포타슘 클로라이드, 포타슘 하이드록시드, 포타슘 술페이트, 소듐 아세테이트, 소듐 타르트레이트, 암모늄 포르메이트, 디-암모늄 타르트레이트, 소듐 말로네이트, 디-소듐 타르트레이트, 소듐 숙시네이트, 및 소듐 숙시네이트 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 무기 염은 암모늄 술페이트이다.
일부 구체예에서, 침전 용액 중 적어도 하나의 무기 염의 양은 약 50 mM 내지 약 4000 mM, 약 1000 mM 내지 약 3000 mM, 약 1500 mM 내지 약 2500 mM 또는 약 2000　mM이다. 하나를 초과하는 무기 염이 사용되는 경우에서, 상기에 언급된 농도는 함께 모든 무기 염의 농도를 의미하며 무기 염의 혼합물에 사용되는 각각의 단일 염의 농도를 의미하는 것이 아니다.
일부 구체예에서, 침전 용액은 완충될 수 있다. 개인에게 알려져 있는 임의의 완충제가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 완충제는 시트르산, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 소듐 카코딜레이트, HEPES 소듐, TRIS HCl, CAPSO, CAPS, 소듐 말레이트, 소듐 MES 등 및 이의 조합을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구체예에서, 침전 용액은 약 2.0 내지 약 11.0의 pH 및 이 사이의 임의의 pH, 예를 들어 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 및 11.0을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 침전 용액은 약 8.0 내지 약 10.0의 pH를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 침전 용액은 9.0의 pH를 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 완충된 침전 용액은 1 M을 초과하는 적어도 하나의 무기 염 및/또는 5 중량% 내지 20 중량%의 적어도 하나의 소형 유기 양쪽성 분자를 함유한다. 바람직한 구체예에서, 침전 용액은 2.0 M 암모늄 술페이트 및 10% DL-말레이트-MES-Tris (pH 9.0)를 포함한다.
이론 상으로, 단계 (c)의 희석된 용액 중 적어도 하나의 침전제는 물에 대해 단백질 분자와 경쟁하고, 그리하여 단백질의 과포화를 초래한다. 결정은 정상적으로는 오직 과포화된 상태로부터만 성장할 수 있고, 따라서 그들은 침전물로부터 성장될 수 있다. 염, 중합체, 및 유기 용매는 적합한 침전제이다. 상기 열거된 완충된 침전 용액의 성분이외에도, 단계 (c)의 용액은 침전제를 더 함유해도 된다.
일부 구체예에서, 행잉 드롭 (hanging drop) 또는 시팅 드롭 (sitting drop)이 결정화에 사용된다. "행잉 드롭 증기 확산" 기술은 거대 분자의 결정화를 위한 가장 인기있는 방법이다. 이 방법에 의해서 샘플 및 시약의 혼합물로 구성된 액적이 시약의 액상 리저버와 증기 평형으로 위치된다. 전형적으로 액적은 리저버보다 낮은 시약 농도를 함유한다. 평형을 획득하기 위해서, 수증기는 액적을 떠나서 결국에 리저버에 도달하게 된다. 물이 액적을 떠나면서, 샘플은 상대적 과포화의 증가를 겪는다. 샘플과 시약 둘 모두는 물이 리저버를 향해 액적을 떠나면서 농도가 증가된다. 액적의 시약 농도가 대략 리저버의 것과 동일해질 때 평형에 도달된다.
인슐린 유사체
야생형 인슐린은 A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드를 포함한다. 야생형 인간 인슐린 A 사슬은 서열 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 24)로 표시된다. 야생형 인간 인슐린 B 사슬은 서열 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 25)로 표시된다.
본 발명자는 인간 인슐린의 방향족 트리플렛 PheB24-PheB25-TyrB26의 등가물이 결여된 단량체 인슐린, Con-G1 Ins의 3차원 구조를 결정하였다. 이론에 국한하고 싶지는 않지만, TyrB15의 측쇄가 IR 관여의 관점에서 핵심 인간 인슐린 PheB24의 부재를 보상할 수 있다고 여겨진다. 또한 Con-Ins G1 TyrB20의 측쇄는 인간 인슐린 PheB24의 등가물의 결여를 보상하는데 관여될 수 있다고 여겨진다. 이들 잔기의 잠재적인 중요성은 서열 분석을 기반으로는 예측할 수 없다. 본 명세서에서 제공되는 구조적 발견은 본질적으로 단량체이고 속효성인 치료적 인간 인슐린 유사체의 신규한 클래스의 디자인을 위한 플랫폼을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드을 포함하는 인슐린 유사체를 제공하고, 여기서 B 사슬은 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 방향족 또는 거대 지방족 잔기 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 방향족 또는 거대 지방족 잔기를 포함하고, 유사체는 인간 인슐린에 존재하지만 코너스 지오그라퍼스 인슐린의 상응하는 위치에서는 결여된 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 한 쌍의 시스테인 잔기에 걸쳐 함께 결합된다. 일부 구체예에서, 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기는 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
인슐린-IR 복합체의 공결정 구조는 PheB24의 측쇄가 IR 및 인슐린 B 사슬에 의해 한정되는 비극성 포켓 (B24 관련 결합 포켓이라고 함) 내에서 "앵커"로서 독특한 역할을 한다는 것을 밝혀 주었다 (Menting et al. 2014). 이론에 국한하고 싶지는 않으나, 본 발명은 인간 인슐린의 B 사슬의 위치 15 및/또는 위치 20에서 거대 지방족 또는 방향족 치환이 B24 관련 결합 포켓에 삽입되어 PheB24의 결여를 보상할 수 있을 것으로 예상한다. 거대 지방족 또는 방향족 잔기의 측쇄는 B24 관련 결합 포켓과 물리적 및 화학적으로 압축될 수 있다고 여겨진다. 일부 구체예에서, 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치의 방향족 또는 거대 지방족 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 사이클로펜틸알라닌 및 사이클로헥실알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치의 방향족 또는 거대 지방족 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 사이클로펜틸알라닌 및 사이클로헥실알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 방향족 잔기 또는 거대 지방족은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다.
일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 사응하는 위치에 방향족 잔기 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 사응하는 위치에 방향족 잔기를 포함한다. 방향족 잔기는 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 방향족 아미노산은 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 4-아세틸페닐알라닌 등일 수 있다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 티로신을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 티로신을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 티로신 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 티로신을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 페닐알라닌 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 페닐알라닌을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 트립토판 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 트립토판을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 4-아세틸페닐알라닌 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 4-아세틸페닐알라닌을 갖는다.
일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 거대 지방족 잔기 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 거대 지방족 잔기를 포함한다. 본 명세서에서 사용시, "거대 지방족" 잔기는 류신 (인간 인슐린의 위치 15 및 20에서 천연 발생) 측쇄보다 큰 측쇄를 갖는다. 예를 들어, 일부 구체예에서 거대 지방족 잔기의 측쇄는 류신과 비교하여 동일한 개수 또는 그 이상으로 수소 이외의 원자를 가질 수 있다. 일부 구체예에서 거대 지방족 잔기의 측쇄는 류신과 비교시 더 큰 측쇄 부피를 갖는다. 일부 구체예에서, 거대 지방족 잔기의 측쇄는 류신과 비교하여 더 큰 분자량을 갖는다. 일부 구체예에서, 거대 지방족 잔기의 측쇄는 류신과 비교하여 더 많은 입체형태적 유연성을 갖는다. "거대 지방족" 잔기는 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 거대 지방족 잔기는 메티오닌, 이소류신, 사이클로펜틸알라닌 또는 사이클로헥실알라닌 등일 수 있다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 메티오닌을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 메티오닌을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 사이클로헥실알라닌 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 사이클로헥실알라닌을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 사이클로펜틸알라닌 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 위치 20에 상응하는 위치에 사이클로펜틸알라닌을 갖는다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 IR 결합에 필수적으로 여겨지는 방향족 트리플렛 PheB24-PheB25-TyrB26이 결여된 변형된 B 사슬을 갖고, 대부분의 경우에서, 인간 인슐린과 비교하여 더 짧은 B-사슬을 갖는다. 일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린과 비교시 C-말단부에서 절단된다. 일부 구체예에서, B 사슬은 인간 인슐린의 9개 C-말단 아미노산 중 하나 또는 그 이상이 결여되고, 예를 들어, B 사슬은 인간 인슐린의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 C-말단 아미노산이 결여된다. 일부 구체예에서, B 사슬은 적어도 인간 인슐린의 PheB24가 결여된다. 일부 구체예에서, B 사슬은 적어도 인간 B 사슬 방향족 트리플렛 (인간 인슐린의 아미노산 PheB24-PheB25-TyrB26)이 결여된다. 이들 잔기는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 24, 25 및/또는 26에 상응하는 위치의 아미노산이 각각 페닐알라닌, 페닐알라닌 또는 티로신이 아니도록 치환될 수 있거나 또는 부재할 수 있다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34 [여기서, XA2 = Val 또는 Ile이고; XA3 = Val 또는 Ala이고; XA4 = Glu, Asp, 감마 카복시글루타메이트 또는 Cys이고; XA5 = Gln, Glu, 감마 카복시글루타메이트, His 또는 Val이고; CysA6, CysA7, 및 CysA11 은 독립적으로 Cys 또는 셀레노시스테인이고; XA8 = Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys, Ala 또는 Val이고; XA9 = Ser, Arg, Asn, Gly, His 또는 Lys이고; XA10 = Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Val, Phe, His 또는 Thr이고; XA12 = Ser 또는 Thr이고; XA13 = Leu, Asn, Val, Arg 또는 Asp이고; XA14 = Tyr, Ala, Gln, His, Asp 또는 Glu이고; XA15 = Gln, Glu 또는 Thr이고; XA16 = Phe, Leu, 또는 Ala이고; XA17 = Glu, Gln, Lys, Arg, Ile, Met, Thr 또는 Ser이고; XA18 = Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 또는 Glu이고; XA19 = Tyr 또는 Phe이고; CysA20 = Cys, 셀레노시스테인, 아미드화 Cys, 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XA21 = Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala이거나 또는 부재하고; XA22 = Pro, Asn, Thr, Leu, Ser이거나 또는 부재하고; XA23 = Thr, Leu, Val, Ser이거나 또는 부재하고; XA24 = Arg, Thr, Met, Gln, Leu이거나 또는 부재하고; XA25 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XA26 = Ser, Leu이거나 또는 부재하고; XA27 내지 XA31 는 독립적으로 Ser이거나 또는 부재하고; XA32 = Ala, Ser이거나 또는 부재하고; XA33 = Ala, Val이거나 또는 부재하고; XA34 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Ala, Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, 또는 His이고; XB4 = Ala, Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Lys, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Thr, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Thr, Tyr, Pro, Leu 또는 Gly이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg, Ser 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Val, Tyr, Phe, His, Gly, Gln, Leu, 아미드화 His, 아미드화 Val이거나 또는 부재하고; XB23 = Glu, Asp, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Ile, Leu, Ser, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Ala, Asp, Ser, Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 3)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24, XB25, XB26, XB27, XB28, XB29, XB30, XB31, XB32, XB33, XB34, XB35, XB36, XB37, XB38 및 XB39 는 부재함] (SEQ ID NO: 4)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 5)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His 또는 Tyr이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val 또는 Leu이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 6)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr, Asn이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Asn 또는 Gln이고; XB7 = His 또는 Tyr이고; XB8 = Arg, Ile 또는 Leu이고; XB12 = His, Asp, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB13 = Val, Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, 또는 Val이고; XB15 = Glu, Val, Asn 또는 Asp이고; XB16 = Ser, Gln, Tyr 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Asp, Met 또는 Val이고; XB19 = Leu, Asp, Gln 또는 Lys이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; CysB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr 또는 Gly이고; XB23 = Glu, Arg, Gly이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 7)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu, XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp, XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 8)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 위치 XB17 및 XB22 의 잔기는 티로신이다. 일부 구체예에서, XB22 는 Tyr이다. 일부 구체예에서, XB17 은 Tyr이다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34 [여기서, XA2 = Val 또는 Ile이고; XA3 = Val 또는 Ala이고; XA4 = Glu, 감마 카복시글루타메이트 또는 Cys이고; XA5 = Gln, Glu, 감마 카복시글루타메이트, His 또는 Val이고; CysA6, CysA7, 및 CysA11 은 독립적으로 Cys 또는 셀레노시스테인이고; XA8 = Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys 또는 Val이고; XA9 = Ser, Arg, Asn, His 또는 Lys이고; XA10 = Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Phe, His 또는 Thr이고; XA12 = Ser 또는 Thr이고; XA13 = Leu, Asn, Val 또는 Asp이고; XA14 = Tyr, Ala, Gln, Asp 또는 Glu이고; XA15 = Gln, Glu 또는 Thr이거나; 또는 Ala이고; XA17 = Glu, Lys, Arg, Ile, Met, Thr 또는 Ser이고; XA18 = Lys, Thr, Asn, Gln 또는 Glu이고; XA19 = Tyr 또는 Phe이고; CysA20 = Cys, 셀레노시스테인, 아미드화 Cys, 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XA21 = Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala이거나 또는 부재하고; XA22 = Pro, Asn, Thr, Leu, Ser이거나 또는 부재하고; XA23 = Thr, Leu, Val, Ser이거나 또는 부재하고; XA24 = Arg, Thr, Met, Gln, Leu이거나 또는 부재하고; XA25 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XA26 = Ser, Leu이거나 또는 부재하고; XA27 내지 XA31 는 독립적으로 Ser이거나 또는 부재하고; XA32 = Ala, Ser이거나 또는 부재하고; XA33 = Ala, Val이거나 또는 부재하고; XA34 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 9)을 포함하는 A 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA16 은 Phe 또는 Leu이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 10)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp, XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Gly 또는 Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 11)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 12)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-Tyr-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고, XB20 = Leu 또는 Val이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 13)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 14)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-Leu-CysB21-Tyr-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB14 = Thr, 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고, XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 15)를 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 26)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-Tyr-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp, XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Gly 또는 Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 27)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 28)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-Tyr-XB18-XB19-Leu-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp, XB22 = Gly 또는 Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 29)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 16)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 17)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 18)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 19)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 20)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및 서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 21)을 포함하는 B 사슬 펩티드를 포함한다.
IR에 대한 유사체의 친화성을 증가시키는 인간 인슐린의 수많은 변형이 이전에 동정되었었다. 예를 들어, 인간 인슐린의 ThrA8을 히스티딘으로 치환한 것은 IR에 대한 친화성을 3배로 증가시킨다 (Glendorf et al. (2011). 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 ThrA8에 상응하는 위치에 히스티딘 잔기를 갖는다.
인슐린 유사체는 하나 이상의 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 또는 합성 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 이들 중 일부는 본 명세서에서 서열이 표시되어 있다. 예를 들어, 이러한 아미노산은 제한없이, 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥산산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 감마 카복시글루타메이트, 하이드록시프롤린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 사이클로펜틸알라닌, 셀레노시스테인, 아미드화 시스테인, 아미드화 셀레노시스테인, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 일반적으로 포함한다. 또한, 예를 들어, 바이오틴화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드 등과의 연결에 의해서, 합성 동안 또는 그 이후에 차등적으로 변형되는 펩티드가 그 범주에 포함된다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, PTM을 함유하는 Con-Ins G1의 합성 유사체는 PTM-무함유 유사체보다 인간 IR-B에 대해서 4배 더 활성적이었다 (실시예 참조). 일부 구체예에서, 하나 이상의 Glu 잔기는 예를 들어 다양한 A 사슬의 XA4 또는 XA5 Glu 위치에서, 또는 일부 B 사슬의 XB12 Glu 위치에서 감마-카복시글루타메이트 (Gla)로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 Pro 잔기는 예를 들어 일정 B 사슬의 XB5 Pro 위치에서, 하이드록시프롤린 (Hyp)로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, C-말단부는 다른 것들 중에서도, 다양한 A 사슬의 말단부에서, 아미드화, 예컨대 아미드화 Cys (*)일 수 있다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 다음 중 하나 이상을 포함한다: (i) XA4 는 감마 카복시글루타메이트이고, ii) XB5 = 하이드록시프롤린이고; iii) XB12 = 감마 카복시글루타메이트이다. 본 발명자는 이들 PTM 중 적어도 일부가 IR과 Con-Ins G1의 결합에 기여한다는 것을 확인하였다.
인슐린 유사체는 적어도 한 쌍의 시스테인 잔기에 걸쳐서 함께 결합된 A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드를 갖는다. 일부 구체예에서, B 사슬 펩티드의 CysB9 는 A 사슬 펩티드의 CysA6 에 결합되고, B 사슬 펩티드의 CysB21 은 A 사슬 펩티드의 CysA20 에 결합되고/되거나 CysA7 은 CysA11 에 결합된다.
일부 구체예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 하나 이상의 말단부에서 함께 연결될 수 있다. 일부 구체예에서 A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 말단부에서 함께 연결된다. 예를 들어, A 사슬 펩티드의 N-말단은 B 사슬 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있거나, A 사슬 펩티드의 C-말단은 B 사슬 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있거나, A 사슬 펩티드의 C-말단은 A 사슬 펩티드의 N-말단에 연결될 수 있거나 또는 B 사슬 펩티드의 C-말단은 B 사슬 펩티드의 N-말단에 연결될 수 있다. 일부 구체예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 양쪽 말단부에서 함께 연결된다. 따라서, 일부 구체예에서 인슐린 유사체가 비환형이지만, 다른 경우에서 기술된 Cys-결합 패턴을 유지하면서, 인슐린 유사체가 환형일 수 있다. 이러한 구체예에서, 인슐린 유사체는 A 및 B 사슬이 자유 N-말단 또는 C-말단을 갖지 않도록 고리화된 골격을 갖는다 (이 구체예의 경우에 그리하여 양쪽 말단부가 연결됨). 하나 이상의 말단부에서의 연결은 A 및 B 사슬 펩티드 골격의 아미노산 간에 직접적일 수 있거나, 또는 하나 이상의 아미노산의 링커 또는 그 사이에 결합되는 다른 링커 분자가 존재할 수 있다.
일부 구체예에서, 안정성을 개선시키는 것으로 당업자에게 공지된 화학 기, 잔기 또는 잔기의 그룹이 C-말단 및/또는 N-말단에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 생체이용률을 개선시키는 것으로 당업자에게 공지된 화학 기, 잔기 또는 잔기의 그룹이 C-말단 및/또는 N-말단에 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, N-말단에 첨가될 수 있는 이러한 잔기 또는 기는 또한 인슐린 유사체 내 Gly을 치환할 수 있다. 일부 구체예에서, 형광발광성 태그가 C-말단 또는 N-말단에 부착될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 인슐린 유사체 펩티드는 당업자에게 공지된 임의의 기술 또는 방법으로 만들어질 수 있고, 임의의 이러한 기술 또는 방법은 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다. 예를 들어, 기술은 제한없이, 화학 합성, 고체상 펩티드 합성, 재조합 발현, 펩티드 합성 및 재조합 발현의 조합 등을 포함한다. 예시적인 기술이 실시예 부분에 더 기술되어 있다. 인슐린 유사체는 다양한 형태, 예를 들어 천연, 융합, 당화, 지질화 등으로 제조될 수 있다.
인슐린 유사체는 바람직하게 실질적으로 순수한 형태 (즉, 숙주 세포 단백질 또는 다른 오염물이 실질적으로 없음)로 제조된다. 전형적으로, 인슐린 유사체는 존재하는 총 단백질 중 적어도 60 중량%일 때 실질적으로 순수하다. 예를 들어, 인슐린 유사체는 존재하는 총 단백질의 적어도 75 중량%, 적어도 약 80 중량%, 적어도 약 85 중량%, 적어도 약 90 중량%, 적어도 약 91 중량%, 적어도 약 92 중량%, 적어도 약 93 중량%, 적어도 약 94 중량%, 적어도 약 95 중량%, 적어도 약 96 중량%, 적어도 약 97 중량%, 적어도 약 98 중량%, 적어도 약 99 중량%, 보다 바람직하게 적어도 90 중량%이다.
본 개시 내용은 또한 인슐린 유사체의 염 또는 유도체를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "염"은 무기 또는 유기 산 및/또는 염기와 형성되는, 산성 및/또는 염기성 염, 바람직하게 염기성 염을 의미한다. 특히 인슐린 유사체가 약물로서 적용될 때, 약학적으로 허용가능한 염이 일반적으로 바람직하지만, 다른 염은 예를 들어 이들 화합물의 프로세싱에서, 또는 비약물 유형 용도가 고려되는 경우에 이용된다. 이들 화합물의 염은 당업자에게 공지된 임의 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용시 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 부모 화합물의 생물학적 활성을 유지하고, 생물학적으로 또는 달리 비바람직하지 않은, 화합물의 염을 의미한다. 본 명세서에 개시된 많은 화합물은 아미노 및/또는 카복실 기 또는 이와 유사한 기의 존재에 의해서 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염은 단지 예로서, 소듐, 포타슘, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염을 포함한다. 유기 염기로부터 유래된 염은 제한없이, 1차, 2차 및 3차 아민의 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무기 및 유기 산으로부터 제조될 수 있다. 무기산으로부터 유래된 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 유기산으로부터 유래된 염은 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔-술폰산, 살리실산 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용시 용어 "유도체"는 천연 발생 알파-아미노산에 존재하는 하나 이상의 측기가 변형된 것인 알파 아미노산을 포함한다. 따라서, 예를 들어 천연 발생 아미노산은 다양한 비코딩되거나 또는 변형된 아미노산 예컨대 상응하는 D-아미노산 또는 N-메틸 아미노산으로 치환될 수 있다. 다른 변형은 당업자에게 공지되어 있고, 화학적으로 유사한 기로 하이드록실, 티올, 아미노 및 카보실 작용기의 치환, 예를 들어 시스테인에서 -SeH로 -SH의 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체는 IR에 결합할 수 있다. 바람직하게, IR은 인간 IR-B 수용체이다. 일부 구체예에서, 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 또는 친화성 (Kd)은 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만이다. 바람직하게, 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 은 10-6 M 미만이다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체는 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 IGF-IR에 약하게 결합한다. 본 명세서에서 사용되는 "약하게"는 IGF-IR의 활성화를 일으키고/키거나 IGF-IR을 통해서 신호 전달을 야기하기에 충분한 친화성으로 IGF-IR에 결합하지 않는 인슐린 유사체를 의미한다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M 또는 10-4 M 보다 약한 IGF-IR에 대한 IC50 또는 Kd 를 갖고, 바람직하게, 인슐린 유사체는 100 nM 보다 약한 IGF-IR에 대한 친화성 (Kd)을 갖는다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체는 주로 용액 중에서 단량체이다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체의 적어도 50%가 단량체이거나, 인슐린유사체의 적어도 60%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 70%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 75%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 80%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 85%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 90%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 95%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 98%가 단량체이거나, 인슐린 유사체의 적어도 99%가 단량체이거나 또는 인슐린 유사체의 대략 100%가 단량체이다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 단량체이다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 적어도 부분적으로 단량체일 수 있고 대상체에게 투여시 단량체 형태로 해리된다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 단량체이거나 또는 대상체의 혈류에서 단량체 형태로 해리된다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체는 속효성 인슐린 유사체이다. 일부 구체예에서, 인간 인슐린과 비교시 인간에게 투여되는 경우에 증가된 생체이용률을 갖는다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체는 인간에게 투여하고 10분 내지 6시간 이내에 피크 생체이용률을 갖는다. 일부 구체예에서, 투여 이후 인슐린 유사체의 최대 혈장 농도는 투여 이후 인간 인슐린의 최대 혈장 농도보다 더 초기에 발생된다. 예를 들어, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체의 피크 이용률은 투여 10분 내지 4시간 이내, 투여 15분 내지 3시간 이내, 투여 30분 내지 1시간 이내, 또는 투여 40분 내지 55분 이내에 발생된다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체, 이의 염 또는 유도체는 투여 2분, 5분, 10분, 15분, 20분 또는 30분 이내에 활성의 개시를 갖는다. 바람직하게, 활성의 개시는 투여 10분 내지 30분 이내이다.
본 발명의 인슐린 유사체는 또한 본 발명의 방법을 사용해 디자인되거나 또는 동정된 것 및 표적 결합 부위를 인식하여 결합할 수 있는 것을 포함한다.
표적 결합 부위는 인슐린의 생리학적 결합 파트너, 예컨대 IR을 비롯하여, 생리학적 결합 파트너의 영역을 포함한다. 예를 들어, 표적 결합 부위는 에피토프를 한정하는 짧은 폴리펩티드 (예를 들어, 표적 결합 부위로서 하기에 동정된 루프 구조에 상응) 또는 모방체, 예를 들어 루프 구조를 모방하는 펩티드 모방체일 수 있다.
일부 구체예에서, 표적 결합 부위는 인슐린 수용체, 바람직하게 인간 인슐린 수용체이다. 일부 구체예에서, 표적 결합 부위는 수용체에 대한 인슐린 도킹에 관여되는 IR의 영역이다. 일부 구체예에서, IR의 영역은 다음 중 하나 이상을 포함하는 저친화성 표적 결합 부위를 포함한다: L1 도메인, CT 펩티드 및 IR 엑토도메인의 CR 도메인. L1 도메인의 경우에, 표적 결합 부위는 바람직하게 L1의 중심 β-시트의 분자 표면의 일부분 및 Phe39를 함유하는 제2 LRR의 분자 표면의 일부분 또는 L1의 제4 LRR 가로대의 루프, 또는 바람직하게는 둘 모두를 포함한다. CR 도메인의 경우, 표적 결합 부위는 바람직하게 CR 도메인의 모듈 6을 포함한다.
일부 구체예에서, 저친화성 표적 결합 부위는 하기 아미노산 서열 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다: (i) 아미노산 1-156; (ii) 아미노산 704-719; 및 (iii) 아미노산 157-310.
아미노산 1-156과 관련하여, 표적 결합 부위는 바람직하게 아미노산 서열 1-68, 바람직하게 1-55, 및 보다 바람직하게 아미노산 서열 27-55로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 표적 결합 부위는 바람직하게 Arg14, Asn15, Gln34, Leu36, Leu37, Phe39, Pro43-Phe46, Phe64, Leu87, Phe88, Asn90 및 Phe89로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산, 보다 바람직하게 Arg14, Asn15, Gln34, Leu37, Phe39, Pro43-Phe46, Phe64로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산, 보다 더 바람직하게 Phe39 및 Pro43-Phe46으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산, 및 가장 바람직하게 적어도 Phe39를 포함한다.
아미노산 157-310과 관련하여, 표적 결합 부위는 바람직하게 아미노산 서열 192-310로부터의 적어도 하나의 아미노산, 보다 바람직하게 서열 227-303으로부터의 적어도 하나의 아미노산, 보다 더 바람직하게 서열 259-284로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 또한 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드를 제공하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드를 개시하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린과 비교하여 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. 일부 예에서, 임의의 보존성 아미노산 치환이 위치 10, 20, 또는 양쪽 위치 둘 모두에 존재할 수 있다. 예를 들어, 다른 친수성 아미노산, 극성 아미노산, 또는 지방족 아미노산이 한 위치 또는 두 위치에서 치환될 수 있다.
개시된 펩티드의 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 20의 치환은 G20Y, G20F 또는 G20P일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 20의 치환은 G20Y이다. 일부 예에서, 아미노산 20의 치환은 G20P일 수 있고 펩티드는 아미노산 21에 치환을 더 포함하고, 여기서 아미노산 21의 치환은 G21H일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 치환은 글리신으로부터 임의의 보존성 치환일 수 있다.
개시된 펩티드의 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 10의 치환은 H10E, H10D 또는 H10Q일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 10의 치환은 H10E이다. 일부 예에서, 아미노산 치환은 히스티딘으로부터 임의의 보존성 치환일 수 있다.
일부 예에서, 인슐린 A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드 둘 모두는 야생형 인슐린과 비교하여 치환을 함유할 수 있다. 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드를 개시하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함하고, A 사슬 펩티드에 적어도 하나의 치환을 더 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 치환은 위치 8 또는 9에 존재할 수 있다. 일부 예에서, A 사슬 펩티드 내 적어도 하나의 치환은 T8H, T8Y, T8K 또는 S9R일 수 있다. 일부 예에서, 임의의 보존성 아미노산 치환이 위치 8 또는 9 또는 양쪽 위치 둘 모두에 존재할 수 있다. 예를 들어, 다른 친수성 아미노산이 치환될 수 있거나 또는 다른 극성 아미노산이 치환될 수 있다.
인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드가 개시되고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함하고 A 사슬 펩티드에 적어도 2개의 치환을 더 포함한다. 일부 예에서, 적어도 2개의 치환은 위치 8 및 9에 존재할 수 있다. 일부 예에서, A 사슬 펩티드 중 적어도 2개 치환은 T8H, T8Y, T8K 및 S9R로부터 선택될 수 있다. 일부 예에서, 임의의 보존성 아미노산 치환은 위치 8 또는 9 또는 양쪽 위치 둘 모두에서 존재할 수 있다. 예를 들어, 다른 친수성 아미노산이 치환될 수 있거나 또는 다른 극성 아미노산이 한 위치 또는 양쪽 위치 둘 모두에서 치환될 수 있다.
일부 예에서, B 사슬 펩티드는 야생형과 비교하여 C-말단 아미노산 중 하나 이상, 8개 이하가 결여된다. 따라서, 개시된 펩티드는 데스-옥타펩티드 인슐린 펩티드 (인간 인슐린 B 사슬의 C-말단의 마지막 8개 아미노산이 누락)일 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, 개시된 펩티드는 하기의 서열을 포함하는 B 사슬 펩티드를 가질 수 있다:
Figure pct00001
일부 예에서, 개시된 펩티드는 하기의 서열을 포함하는 A 사슬을 가질 수 있다:
Figure pct00002
개시된 펩티드의 일부 예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 하나의 디술피드 결합을 통해 결합될 수 있다. 일부 예에서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 2개의 디술피드 결합을 통해 결합될 수 있다.
일부 예에서, 개시된 펩티드는 단량체이다. 달리 말해서, 일부 예에서, 개시된 펩티드는 이량체, 사량체, 육량체 등을 덜 형성할 듯하다.
개시된 펩티드의 일부 예에서, 인슐린 A 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린 A 사슬 펩티드와 적어도 70%가 동일할 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 A 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린 A 사슬 펩티드와 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%가 동일할 수 있다. 일부 예에서, 동일성 백분율은 개시된 펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부로부터 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 도달될 수 있다.
개시된 펩티드의 일부 예에서, 인슐린 B 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린 B 사슬 펩티드와 적어도 70%가 동일할 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 B 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린 B 사슬 펩티드와 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%가 동일할 수 있다. 일부 예에서, 동일성 백분율은 개시된 펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부로부터 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 도달될 수 있다.
일부 예에서, 개시된 펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산, 변형된 아미노산 또는 합성 아미노산 유사체를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산은 제한없이, 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, α-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥산산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 사이클로펜틸알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산 예컨대 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 일반적으로 포함한다. 또한 예를 들어, 바이오틴화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 기지의 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백질가수분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드와의 연결 등을 통해서, 합성 동안 또는 그 이후에 차등적으로 변형되는 펩티드가 이러한 범주 내에 포함된다. 이들 변형은 펩티드의 안정성 및/또는 생체활성을 증가시키기 위해 제공될 수 있다.
개시된 펩티드의 추가 예에서, 적어도 하나의 디술피드 결합을 통해서 B 사슬 펩티드에 연결된 A 사슬 펩티드를 갖는 치료적 단백질이 제공되고, 여기서 A 사슬은 GIVEQCCHRICSLYQLENYCN의 서열 (SEQ ID NO: 39)을 포함하고, B 사슬 펩티드는 FVNQHLCGSELVEALYLVCYER의 서열 (SEQ ID NO: 30)을 포함한다.
개시된 치료적 단백질은 약학 조성물에 적용될 수 있고 당뇨병을 포함한 장애의 치료와 관련하여 사용될 수 있다는 것을 이해한다.
인슐린 유사체를 디자인하기 위한 방법
본 발명에 의해 제공되는 독액 인슐린의 3차원 구조는 인슐린 유사체 (본 명세서에서는 또한 IR 효현제, 분자 및 화합물이라고 함), 특히 속효성 인슐린 유사체를 디자인하는데 사용될 수 있다. 일 양상에서, 구조 모델로서 부록 I의 원자 좌표에 의해 정의되는 Con-Ins G1의 구조의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 구조 모델은 인슐린 유사체의 동정에 사용된다.
일부 구체예에서, IR과 잠재적으로 상호작용할 수 있는 화합물의 동정, 디자인 또는 스크리닝 방법이 제공된다. 방법은 Con-Ins G1의 3차원 구조, 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 IR 구조와 화합물의 상호작용을 기반으로 화합물의 구조-기반 동정, 디자인 또는 스크리닝을 수행하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 기지의 IR 결합 분자의 특성을 개선시키는데 유용하다. 예를 들어, 기지의 IR 결합 분자는 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 일부분에 의해 정의되는 Con-Ins G1의 3D 구조에 대하여 스크리닝할 수 있고, IR과 상호작용하는 잠재성 및 자가-회합되는 능력을 평가할 수 있다. 이러한 평가 관점에서, 하기의 특성 중 하나 이상을 부여하도록 기지의 IR 결합 분자가 재디자인 (즉, 화학적으로 변형)될 수 있다: (i) 자가-회합 감소, (ii) IR의 저친화성 결합 부위에 대한 이의 친화성 개선 (즉, 선택성을 통제하는 결합 부위), (iii) IR을 위한 고친화성 결합부위에 대한 이의 친화성 개선 (즉, 신호 전달을 통제하는 결합 부위) 및 (iv) IGF-1R와의 결합에 대한 이의 친화성 저하.
일부 구체예에서, IR, 또는 IR의 영역과 결합하는 것으로 공지된 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 변형시키는 방법이 제공된다. 방법은 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 구조의 구조-기반 평가를 수행하는 단계, 및 평가의 결과로서 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 화학적으로 변형시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 구조-기반 평가는 인슐린의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과, 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조의 비교를 포함한다. 일부 구체예에서, 구조-기반 평가는 인슐린 수용체의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조 간에 형성된 복합체의 분자 모델링 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 모델은 부록 II의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된다.
일부 구체예에서, 방법은 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 IR과 결합하는 이의 능력을 시험하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, IR 활성화를 조정하는 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드의 능력이 결정된다. 일부 구체예에서, 혈중 포도당 수준을 저하시키는 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드의 능력이 결정될 수 있다.
일부 구체예에서, IR에 결합하는 것으로 공지된 폴리펩티드는 인슐린-유사 성장 인자 (IGF)이다. 적합한 IGF는 인간, 돼지, 소, 새, 마우스 등에서 유래된 것들을 포함한다. 일부 구체예에서 IGF는 인간 IGF-I 또는 IGF-II이다.
바람직한 구체예에서, IR에 결합하는 것으로 공지된 폴리펩티드는 인슐린이다. 적합한 인슐린은 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 소 인슐린, 양 인슐린, 쥐 인슐린, 기니 피그 인슐린 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 인슐린은 인간 인슐린이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "모델링"은 원자 구조 정보 및 상호작용 모델을 기반으로 분자 구조 및/또는 기능의 정량적 및 정성적 분석을 포함한다. 용어 "모델링"은 통상적인 수치-기반 분자 역학 및 에너지 최소화 모델, 대화식 컴퓨터 그래픽 모델, 변형된 분자 메카닉스 모델, 거리 기하학 및 다른 구조-기반 구속 모델을 포함한다.
분자 모델링 기술은 다양한 3D 모델을 이끌어내고, 결합 부위, 예컨대 IR 및 다른 단백질 표적의 결합 부위의 구조를 조사하기 위해서 Con-Ins G1 또는 이의 영역의 원자 좌표에 적용될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 Con-Ins G1의 영역은 단일 아미노산 (또는 이의 측쇄)에 의해, 연속되는 아미노산 서열에 의해 또는 둘 이상의 별개 아미노산 및/또는 아미노산의 스트레치에 의해 정의될 수 있다. 이러한 별개 아미노산 및/또는 아미노산의 스트레치는 3차원 구조에서 서로 밀접한 공간적 근접성으로 존재할 수 있거나 또는 예를 들어, 적합한 리간드의 결합 시, 밀접한 공간적 근접성을 가질 잠재성을 가질 수 있다. 적합하게, Con-Ins G1의 영역은 초기 선택적 저친화성 결합 및 후속하여 IR 이량체 중 다른 단량체와의 고친화성 결합, 둘모두의 IR 결합에 관여하는 아미노산 서열을 포함한다.
이들 기술은 또한 IR에 결합할 수 있고 IR의 활성을 조정할 수 있는 소형 및 대형 화학 독립체를 스크리닝하거나 또는 디자인하는데 사용될 수도 있다. 스크린은 솔리드 3D 스크리닝 시스템 또는 컴퓨터 스크리닝 시스템을 적용할 수 있다.
일부 구체예에서, 이러한 모델링 방법은 IR의 특정 영역에 대한 입체화학적 상보성을 보유하는 화학적 독립체 (예를 들어, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드모방체, 화합물 등)를 디자인하거나 또는 선택하기 위한 것이다. "입체화학적 상보성"이란 화합물 또는 이의 일부분이 수용체에 결합시 자유 에너지의 순 감소를 갖도록 수용체와 충분한 수의 에너지 호의적 접촉이 일어나는 것을 의미하려는 것이다.
화학적 독립체와 수용체 부위 간 상보성이 IR 엑토도메인과 천연적으로 상호작용하는 분자 또는 복합체의 결합을 억제하기 위해서 수용체 부위의 모든 잔기에 걸쳐 확대될 필요가 없다는 것을 이해하게 될 것이다.
IR의 영역과의 입체-상보성을 보유하는 화학적 독립체를 동정하기 위해 많은 방법들이 사용될 수 있다. 예를 들어, 방법은 기계-판독 저장 매체로부터 생성된 부록 I의 Con-Ins G1, 또는 이의 영역의 원자 좌표를 기반으로 컴퓨터 스크린 상에서 Con-Ins G1 구조의 육안 검사를 통해 시작될 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 인슐린 수용체의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조 간에 형성된 복합체의 분자 모델링을 통해 시작될 수 있다. 당분야에 충분히 공지되어 이용가능한 모델링 소프트웨어, 예를 들어, MODELLER (v9.15)를 사용할 수 있다 (Webb and Sali, (2014)). 이러한 모델링 단계는 표준 분자 메카닉스 역장 예컨대 CHARMM에 의한 에너지 최소화가 후속될 수 있다 (Guvench et al. 2011; Best et al. 2012). 모델링 및 에너지 최소화는 당분야에 공지된 소프트웨어, 예를 들어 NAMD를 사용하는 분자 역학이 후속될 수 있다 (Phillips et al. 2005). 또한, 본 발명의 결합 모이어티를 선택하는 방법을 보조하기 위한 수많은 더욱 특수화된 컴퓨터 프로그램들이 존재한다.
또한 본 명세서에서 정의된 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 변형시키는 방법으로 재디자인되거나 또는 변형된 폴리펩티드 또는 이의 염 또는 유사체가 제공된다. 바람직하게, 재디자인되거나 또는 변형된 폴리펩티드는 단량체이거나, 또는 대상체에게 투여시 단량체로 해리된다.
IR의 바람직한 영역은 특이성을 통제하는 것, 예를 들어 상기에 표적 결합 부위로서 기술된 것이다.
다른 양상에서, IR 효현제인 단리된 분자를 제공하고, 여기서 분자는 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 Con-Ins G1의 3D 구조를 기반으로 동정되고/되거나 디자인된다. 적합한 분자는 펩티드, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드모방체"는 펩티드의 생물학적 활성을 모방하지만 화학적 성질이 더 이상 완전히 펩티드는 아닌 분자이다. 엄격한 정의로서, 펩티드모방체는 임의의 펩티드 결합 (즉, 아미노산 사이의 아미드 결합)을 더 이상 함유하지 않는 분자이다. 그러나, 용어 펩티드 모방체는 성질이 더 이상 완전히 펩티드가 아닌 분자, 예컨대 슈도-펩티드, 세미-펩티드 및 펩토이드를 설명하는데 사용될 수 있다. 완전히 또는 부분적으로 비펩티드이건 간에, 본 발명의 펩티드모방체는 그 펩티드모방체가 기반으로 하는 펩티드의 활성기의 3차원 배열과 매우 유사한 반응성 화학 모이어티의 공간 배열을 제공한다. 이러한 유사한 활성-부위 기하학의 결과로서, 펩티드모방체는 펩티드의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 시스템에 대한 효과를 갖는다.
독액 인슐린을 기반으로 하는 적합한 펩티드모방체는 본 명세서에 기술된 용이하게 이용가능한 기술 및/또는 방법을 사용해 개발될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 펩티드 결합은 펩티드모방체가 본래 펩티드와 유사한 구조, 및 그에 따른 생물학적 활성을 채택할 수 있게 하는 비펩티드 결합으로 치환될 수 있다. 유사한 구조의 다른 화학 기로 아미노산의 화학 기를 치환시켜서 추가의 변형을 또한 만들 수 있다. 독액 인슐린으로부터 유래된 펩티드모방체의 개발은 부록 I 또는 이의 서브셋에서 제공되는 바와 같은 이들 잔기의 3차원 구조를 참조하여 도움을 받을 수 있다. 이러한 구조 정보는 프로그램 예컨대 MACCS-3D 및 ISIS/3D (Molecular Design Ltd., San Leandro, CA), ChemDBS-3D (Chemical Design Ltd., Oxford, U.K.), 및 Sybyl/3DB Unity (Tripos Associates, St. Louis, MO)를 사용하여, 유사한 구조를 갖는 분자를 동정하기 위해 3차원 데이타베이스를 검색하는데 사용될 수 있다.
당업자는 펩티드모방체의 디자인이 본 발명의 방법을 사용하여 디자인되거나 또는 동정된 화학 구조의 약간의 구조적 변경 또는 조정을 필요로 할 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법을 사용하여 동정되거나 또는 디자인된 모방체는 화학적으로 합성되어서 본 명세서에 기술된 임의의 방법을 사용하여 인슐린 수용체 활성을 조정하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 본 발명의 방법은 그들을 사용하여 인슐린 수용체 활성을 조정하는 그들 능력에 대해서 스크리닝되어야만 하는 잠재적인 모방체의 수를 상당히 감소시킬 수 있기 때문에 특히 유용하다.
일부 구체예에서, 단리된 분자는 IR에 결합할 수 있다. 바람직하게, IR은 인간 IR-B 수용체이다. 일부 구체예에서, 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 또는 Kd 는 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 보다 더 강력하다. 바람직하게, 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 또는 Kd 는 10-6 M 보다 더 강력하다. 일부 구체예에서, 단리된 분자는 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 IGF-IR에 약하게 결합한다. 바람직하게, 단리된 분자는 100 nM보다 약한 IGF-IR에 대한 친화성 (Kd)을 갖는다.
일부 구체예에서, 단리된 분자는 용액 중에서 주로 단량체이다. 일부 구체예에서, 단리된 분자의 적어도 50%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 60%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 70%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 75%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 80%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 85%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 90%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 95%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 98%가 단량체이거나, 단리된 분자의 적어도 99%가 단량체이거나 또는 단리된 분자의 대략 100%가 단량체이다. 일부 구체예에서, 단리된 분자는 적어도 부분적으로 단량체일 수 있고 대상체에게 투여시 단량체로 해리된다. 일부 구체예에서, 단리된 분자는 단량체이거나 또는 대상체의 혈류에서 단량체 형태로 해리된다.
본 발명은 또한 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 약하게만 결합하는 인슐린 유사체의 동정 및/또는 디자인에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 사용해 동정된 인슐린 유사체는 IGF-IR과 결합하는 그들의 능력에 대해 인 실리코, 시험관내 및/또는 생체내에서 스크리닝될 수 있다. IGF-IR에 결합하는 것으로 확인되거나 또는 의심되는 임의의 인슐린 유사체는 IR에 대해 더욱 선택적이게 되도록 재디자인될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서의 방법으로 동정된 인슐린 유사체 (단리된 분자, 화합물 또는 IR 효현제를 포함함)는 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 IGF-IR에 약하게 결합한다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M 또는 10-4 M 보다 약한 IGF-IR에 대한 IC50 또는 Kd 를 가지며, 바람직하게, 인슐린 유사체는 100 nM 보다 약한 IGF-IR에 대한 친화성 (Kd)을 갖는다.
본 개시 내용은 또한 IR에 결합하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하고, 이 방법은
i) a) 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 구조, 또는
b) a)의 상응하는 골격 원자 상에 중첩시 약 2.0 Å 미만의 평균 제곱근 편차를 갖는 구조
를 갖는 폴리펩티드의 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계, 및
ii) IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 디자인하거나 또는 스크리닝하는 단계
를 포함한다.
일부 구체예에서, 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계는 IR 또는 이의 영역에 결합된 폴리펩티드의 모델을 생성시키는 단계를 포함한다. IR의 바람직한 영역은 특이성을 통제하는 것, 예를 들어 상기에 표적 결합 부위로서 기술된 것이다. 일부 구체예에서, 모델은 부록 II의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된다.
모델은 예를 들어, 측쇄 또는 주쇄에서의 작은 이동을 통해서, 후보 화합물 및 단백질 사이의 적합도를 개선시키도록 약간의 표면 변화가 가능하다는 의미에서 적용될 수 있다.
일부 구체예에서, 방법은 IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 합성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 화합물은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정한다. 일부 구체예에서, 방법은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정하는 그 능력에 대해서 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 혈중 포도당 수준을 조정하는 그 능력에 대해서 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단계 i) 및 ii)는 인 실리코로 수행된다.
본 발명은 또한 인슐린 활성을 모방하는 화합물을 동정하는 컴퓨터-기반 방법을 제공하고, 이 방법은
i) a) 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 구조, 또는
b) a)의 상응하는 골격 원자 상에 중첩시 약 2.0 Å 미만의 평균 제곱근 편차를 갖는 구조
를 갖는 폴리펩티드의 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계, 및
ii) 인슐린 활성을 모방하는 화합물을 디자인하거나 또는 스크리닝하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계는 IR 또는 이의 영역에 결합된 폴리펩티드의 모델을 생성시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 모델은 부록 II의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된다. IR의 바람직한 영역은 특이성을 통제하는 것, 예를 들어, 상기에 표적 결합 부위로서 기술된 것이다.
일부 구체예에서, 방법은 IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 합성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 화합물은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정한다. 일부 구체예에서, 방법은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정하는 그 능력에 대해서 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 혈중 포도당 수준을 조정하는 그 능력에 대해서 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 시험하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단계 i) 및 ii)는 인 실리코로 수행된다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법으로 동정된 화합물은 IR에 결합할 수 있다. 바람직하게, IR은 인간 IR-B 수용체이다. 일부 구체예에서, 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 은 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만이다. 바람직하게, 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 은 10-6 M 미만이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법으로 동정된 화합물은 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 IGF-IR에 약하게 결합한다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체는 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M 또는 10-4 M 보다 약한 IGF-IR에 대한 IC50 또는 Kd 를 갖고, 바람직하게, 인슐린 유사체는 100 mM 보다 약한 IGF-IR에 대한 친화성 (Kd)을 갖는다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법으로 동정된 화합물은 용액 중에서 주로 단량체이다. 일부 구체예에서, 화합물의 적어도 50%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 60%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 70%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 75%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 80%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 85%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 90%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 95%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 98%는 단량체이거나, 화합물의 적어도 99%는 단량체 또는 화합물의 대략 100%는 단량체이다. 일부 구체예에서, 화합물은 적어도 부분적으로 단량체일 수 있고 대상체에게 투여 시 단량체로 해리될 수 있다. 일부 구체예에서, 화합물은 단량체이거나 또는 대상체의 혈류에서 단량체 형태로 해리된다.
당업자가 용이하게 이해하게 되는 바와 같이 본 발명의 방법은 인슐린 수용체와 상호작용하는 인슐린 유사체 단백질을 디자인하고 선택하기 위한 합리적인 방법을 제공한다. 일부 경우에서 이들 단백질은 활성을 증가시키기 위해서 추가 개발을 필요로 할 수 있다. 이러한 추가 개발은 당 분야에서 통상적이며 본 출원에서 제공되는 구조 정보에 의해 도움 받게 될 것이다. 특정 구체예에서 본 발명의 방법은 이러한 추가 개발 단계를 포함하고자 한다.
인슐린 유사체가 상기 방법에 의해 디자인되거나 또는 선택되면, 인슐린 유사체가 표적 예컨대 IR에 결합할 수 있는 효능이 컴퓨터 평가에 의해 시험되어 최적화될 수 있다. 예를 들어, IR에 결합하도록 디자인되거나 또는 선택된 인슐린 유사체는 또한 바람직하게 천연 IR에 결합시 결합 부위가 점유하는 것과 중복되는 것이 아니라 부피를 관통해야만 한다. IR에 결합하는 것으로 디자인되거나 또는 선택된 인슐린 유사체는 이의 결합 상태에서 바람직하게 표적 단백질과의 반발성 정전기 상호작용이 결여되도록 컴퓨터로 더욱 최적화될 수 있다. 이러한 비상보적 (예를 들어, 정전기적) 상호작용은 반발성 전하-전하, 쌍극자-쌍극자 및 전하-쌍극자 상호작용을 포함한다. 특히, 인슐린 유사체가 IR에 결합시 인슐린 유사체와 화합물 간 모든 정전기 상호작용의 총합은 바람직하게 결합 엔탈피에 중성 또는 바람직한 기여를 만든다.
상기에 기술된 바와 같이, 인슐린 유사체가 최적으로 선택되거나 또는 디자인되면, 이어서 이의 결합 특성을 개선시키거나 또는 변형시키기 위해서 이의 원자 또는 측기의 일부에 치환이 만들어 질 수 있다. 일반적으로, 초기 치환은 보존성이고, 즉, 치환 기가 본래 기와 대략 동일한 크기, 형상, 소수성 및 전하를 가지게 될 것이다. 물론, 입체형태를 변경시키는 것으로 알려진 성분은 피해야 한다는 것을 이해해야 한다. 다음으로 이러한 치환된 인슐린 유사체는 상기에 상술된 동일한 컴퓨터 방법에 의해 IR과의 적합도의 효율에 대해 분석될 수 있다.
화합물 변형 에너지 및 정전기적 상호작용을 평가하기 위한 특별한 컴퓨터 소프트웨어가 당분야에서 이용가능하다. 이러한 용도로 디자인된 프로그램의 예는 Gaussian 92, 개정판 C (Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA); AMBER, 버전 4.0 (Kollman, University of California at San Francisco); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA); 및 Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA)를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 동정된 인슐린 유사체 (IR 효현제, 분자, 화합물 등을 포함)를 포괄한다. 일부 구체예는, 또한 본 명세서에 기술된 방법을 사용해 동정된 인슐린 유사체 (IR 효현제, 분자, 화합물 등을 포함)를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
결합 및 생물학적 활성의 스크리닝 어세이 및 확인
본 발명의 인슐린 유사체 (본 개시내용의 방법을 사용하여 동정된 화합물 및 분자를 포함)는 바람직하게 상호작용하여 IR 및/또는 IGF-IR 활성을 조정하는 그들의 능력을 확인하기 위해 IR 및/또는 IGF-1R 기능에 대한 수많은 시험관내 및 생체내 어세이를 통해 평가된다. 예를 들어, 화합물은 IR 및/또는 IGF-1R과 결합하는 그들의 능력 및/또는 IR 및/또는 IGF-1R 신호 전달을 조정, 예를 들어 활성화 또는 파괴하는 그들 능력에 대해 시험될 수 있다.
스크리닝 어세이가 결합 어세이일 때, IR 또는 IGF-1R은 표지에 연결될 수 있고, 여기서 표지는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있다. 다양한 표지는 방사성동위원소, 형광발광성 분자, 화학발광성 분자, 효소, 특이적 결합 분자, 입자, 예를 들어 자성 입자 등을 포함한다. 특이적 결합 분자는 쌍, 예컨대 바이오틴 및 스트렙타비딘, 딕옥신 및 안티딕옥신 등을 포함한다. 특이적 결합 구성원의 경우, 상보적 구성원은 기지의 절차에 따라서, 검출에 제공되는 분자로 정상적으로 표지될 수 있다.
다양한 다른 시약이 스크리닝 어세이에 포함될 수 있다. 이들은 최적 단백질-단백질 결합을 촉진하고/하거나 비특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키는데 사용되는, 염, 중성 단백질, 예를 들어 알부민, 세제 등과 같은 시약을 포함한다. 어세이의 효율을 개선시키는 시약, 예컨대 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물제 등이 사용될 수 있다. 성분은 필요한 결합을 생성시키는 임의 순서로 첨가된다. 인큐베이션은 최적 활성을 촉진하는 임의 온도, 전형적으로 4 내지 40℃에서 수행된다.
IR 또는 IGF-1R과 화합물의 직접 결합은 또한 표면 플라스몬 공명법 (BIAcore) (문헌 [Morton and Myszka, 1998]에서 고찰함)으로 수행될 수 있다. 여기서 수용체는 아민 또는 티올-디술피드 교환 커플링을 사용하는 직접 화학 커플링 (Nice and Catimel, 1999)에 의해서 또는 적절하게 유도체화된 센서 표면에 Fc 융합 단백질로서 수용체 엑토도메인을 포획 (Morten and Myszka, 1998)하여서 CM5 또는 다른 센서 칩 상에 고정된다. 잠재적인 인슐린 유사체 (피분석물이라고 함)는 적절한 유속 및 다양한 농도로 센서 표면을 통과한다. 고전적인 분석 방법은 광범위한 피분석물 농도에 대한 반응을 수집하는 것이다. 다양한 농도는 반응에 관한 충분한 정보를 제공하고, 적합화 알고리즘 예컨대 CLAMP (문헌 [Morton and Myszka, 1998] 참조)를 사용하여, 속도 상수를 결정할 수 있다 (Morton and Myszka, 1998; Nice and Catimel, 1999). 정상적으로, 리간드 표면은 각각의 피분석물 결합 사이클의 종결 시에 재생된다. 표면 재생은 동일 수의 리간드 결합 부위가 각 사이클의 시작 시에 피분석물에게 접근가능하도록 보장한다.
인큐베이션 기간은 최적 활성을 위해 선택되고, 또한 고속 대량 스크리닝을 촉진하도록 최적화될 수 있다. 정상적으로, 0.1 내지 1시간이면 충분할 것이다. 일반적으로, 다수의 어세이 혼합물이 상이한 시험 작용제 농도와 동시에 제공되어 이들 농도에 대한 차등적 반응을 수득한다. 전형적으로, 이들 농도 중 하나는 음성 대조군, 즉 0 농도 또는 검출 수준 이하로 제공된다.
천연 인슐린에 대한 인슐린 유사체 대체물을 위한 이종성 스크리닝의 기본으로서 시험관내 경쟁적 수용체 결합 어세이의 기본 포맷은 다음과 같다: IR 또는 IGF-1R의 활성 부위의 점유는 Denley 등 (2004)이 기술한 대로 시간-분해 형광 검출 (TRFD)을 통해 정량하였다. R-IR-A, R-IR-B 및 P6 세포는 각각 IR-A, IR-B 및 IGF-1R의 공급원으로서 사용된다. 세포는 용해 완충액 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 10% (v/v) 글리세롤, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA pH 7.5)으로 1시간 동안 4℃에서 용해시켰다. 용해물을 10분 동안 3500 rpm에서 원심분리시킨 후 웰 당 100 ㎕을 항-인슐린 수용체 항체 83-7 또는 항-IGF-1R 항체 24-31로 사전 코팅된 흰색 Greiner Lumitrac 600 플레이트에 첨가한다. 어떠한 포획 항체도 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II에 의한 수용체 결합을 방해하지 않는다. 대략 100,000 형광 계측치의 유로퓸-표지된 인슐린 또는 유로퓸-표지된 IGF-I을 다양한 양의 미표지된 경쟁자 인슐린 유사체와 함께 각 웰에 첨가하고 16시간 동안 4℃에서 인큐베이션한다. 웰을 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween 20 (TBST)로 세척하고 DELFIA 강화 용액 (100 ㎕/웰)을 첨가한다. 시간-분해 형광도는 340 nm 여기 및 612 nm 발광 필터를 사용하여 BMG Lab Technologies Polarstar™ 형광계 또는 Wallac Victor II (EG & G Wallac, Inc.)로 측정한다.
IR 및 화합물과의 결합 및 생물학적 활성을 평가하는데 적용될 수 있는 다른 적합한 어세이의 예는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 어세이는 PCT 국제 공개 특허 출원 WO 03/027246에서 확인할 수 있다. 적합한 어세이의 예는 다음을 포함한다:
(i) 수용체 자가인산화 (문헌 [Denley et al. (2004)]에 기술된 바와 같음). R- IR-A, R-IR-B 세포 또는 P6 세포를 Falcon 96웰 평편 바닥 플레이트에 2.5 x 104 세포/웰로 플레이팅하고 밤새 37℃, 5% CO2 에서 성장시켰다. 세포는 4시간 동안 혈청-무함유 배지에서 세척한 후에 1% BSA가 포함된 100 ㎕ DMEM 중 인슐린, IGF-I 또는 IGF-II 중 하나로 10분 동안 37℃, 5% CO2 에서 처리한다. 2 mM Na3VO4 및 1 mg/mL NaF를 함유하는 용해 완충액을 세포에 첨가하고 용해물 유래 수용체를 항체 83-7 또는 24-31이 사전 코팅된 96웰 플레이트 상에서 포획하고 1xTBST/0.5% BSA로 차단한다. 밤새 4℃에서 인큐베이션 후에, 플레이트를 1xTBST로 세척한다. 인산화된 수용체는 유로퓸-표지된 항-포스포티로신 항체 PY20 (130 ng/웰, 실온, 2시간)로 검출한다. DELFIA 강화 용액 (100 ㎕/웰)을 첨가하고 시간 분해 형광성을 상기 기술한 대로 검출한다.
(ii) 2-데옥시-[U-14C] 포도당 (문헌 [by Olefsky, 1978] 참조)을 사용한 포도당 흡수. 24웰 플레이트 중에서 분화 후 8 내지 12일 사이에 지방세포를 2회 1% (w/v) RIA-등급 BSA 및 2 mM 소듐 피루베이트가 보충된 크렙스-링거 (Krebs-Ringer) 중탄산염 완충액 (130 mM NaCl, 5 mM KCl, KH2PO4, 1.3 mM MgSO4.7H2O, 25 mM NaHCO3 및 1.15 mM CaCl2 를 함유하는 25 mM Hepes, pH 7.4)으로 세척한다. 지방세포를 인슐린 첨가 이전 90분동안 37℃에서, 또는 효현제 또는 길항제 첨가 이전 30분 동안 평형화시킨다. 인슐린 (Actrapid, Novogen)은 0.7 내지 70 nM의 농도 범위로 30분 동안 37℃에서 첨가한다. 효현제 또는 길항제 (0 내지 500 mM)를 지방세포에 90분 동안 첨가하고 나서 길항제의 경우에 천연 인슐린을 첨가한다. 웰 당 50 mM 2-데옥시 포도당 및 0.5 mCi 2-데옥시-[U-14C] 포도당 (NEN, PerkinElmer Life Sciences)을 섬광 계측기를 통해서 최종 10분 간 효현제 자극 동안 측정한다.
(iii) 원형질막 론을 사용한 포도당 수송체 GLUT4 전좌 (문헌 [Robinson and James (1992)] 및 [Marsh et al. (1995)]에 기술된 바와 같음).
(iv) 원형질막 론을 사용한 GLUT4 전좌 (문헌 [Marsh et al. 1995]에 기술된 바와 같음). 3T3-L1 섬유아세포는 6웰 플레이트의 유리 커버슬립 상에서 성장시키고 지방세포로 분화시킨다. 분화 후 8 내지 12일 이후에, 지방세포를 0.5% FBS를 함유하는 DMEM에서 18시간 동안 혈청-고갈시킨다. 세포를 크렙스-링거 중탄산염 완충액, pH 7.4로 세척하고 인슐린 (100 nM) 첨가 이전에 90분동안 37℃에서, 또는 화합물 (100 μM) 첨가 이전에 30분 동안 평형화시킨다. 처리 후, 지방 세포는 PBS 중 0.5 mg/mL 폴리-L-리신으로 세척하고, 얼음에서 1:3 (v/v) 막 완충액 (70 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM EGTA 및 신선하게 첨가된 1 mM DTT 및 2 mM PMSF를 함유하는 30 mM Hepes, pH 7.2)으로 3회 세척을 통해 저장성 충격을 주었다. 다음으로 세척된 세포는 얼음 상에서 1:1 (v/v) 막 완충액 중에서 0으로 설정된 프로브 초음파 처리기 (Microson)를 사용해 초음파처리하여 커버슬립에 부착된 채로 원형질막 단편의 론을 생성시킨다. 단편은 막 완충액 중 2% (w/v) 파라포름알데히드에서 20분 동안 22℃에서 고정시키고 PBS 중 100 mM 글리신으로 고정액을 켄칭한다. 다음으로 원형질막 단편은 막 완충액 중 1% (w/v) Blotto로 60분 동안 22℃에서 차단하고 인하우스 토끼 친화성 정제된 항-GLUT4 다클론 항체 (클론 R10, GLUT4의 C-말단 19 아미노산을 포괄하는 펩티드에 대해 생성) 및 Alexa 488 염소 항-토끼 2차 항체 (Molecular Probes; 1:200)로 면역표지시킨다. FluoroSave 시약 (Calbiochem)을 사용하여 커버슬립을 슬라이드 상에 고정시키고, OptiScan 공초점 레이저 스캐닝 면역형광 현미경 (Optiscan, VIC., Australia)을 사용해 이미지화시킨다. 데이타는 ImageJ (NIH) 이미지화 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 각 조건에 대한 각 실험에서 적어도 6개 시야를 조사하고, 실험 기간 동안 공초점 현미경 획득 설정은 실험간 가변성을 최소화하기 위해 유지된다.
인슐린 유사체 활성은 지방세포 어세이를 사용해 결정될 수 있다. 인슐린은 지방세포로 3H 포도당의 흡수 및 지질로 이의 전환을 증가시킨다. 지질층으로 3H의 유입은 수용성 3H 생성물은 배제시키는, 섬광 혼합물로 지질층의 분할을 통해 결정된다. 최대밑 인슐린 용량에서 3H 포도당의 유입에 대한 인슐린 유사체의 효과를 결정한다. 방법은 문헌 [Moody et. al. (1974)]으로부터 적합화시킨다. 마우스 부고환 지방 패드를 절개해서 분해 완충액 (크렙스-링거 25 mM HEPES, 4% HSA, 1.1 mM 포도당, 0.4 mg/mL 콜라게나제 1형, pH 7.4)에 다져서 넣고 1.5시간 이하 동안 36.5℃에서 분해시킨다. 여과, 세척 (크렙스-링거 HEPES, 1% HSA) 및 어세이 완충액 (크렙스-링거 HEPES, 1% HSA)에 재현탁 이후, 자유 지방 세포를 시험 용액을 함유하는 96웰 피코플레이트에 파이펫팅해 넣는다.
어세이는 0.45 mM 포도당의 최종 농도로, 3H 포도당 (예를 들어, Amersham TRK 239)을 첨가하여 시작된다. 어세이는 400 rpm, 랩쉐이커 인큐베이션 타워에서 36.5℃로 2시간 동안 인큐베이션하고 나서, 퍼마블렌더/톨루엔 섬광제 (또는 등가물)를 첨가하여 종료시키고, 플레이트를 밀봉후 적어도 1시간 동안 정치시키고 Packard Top 계측기 또는 등가물에서 검출한다. 완전 천연 인슐린 표준 그래프 (8 용량)가 각 플레이트에서 대조군으로서 제공된다.
3H 포도당 흡수에 대한 인슐린 유사체의 효과로서, 데이타를 그래프로 표시하고, 데이타는 천연 인슐린 반응과 비교된다. 또한 어세이는 기본 또는 최대 인슐린 농도로 제공될 수 있다.
인슐린 유사체의 생체내 활성을 시험하기 위해서, 정맥내 혈중 포도당 시험이 다음과 같이 Wistar 래트에서 수행될 수 있다. 체중이 약 300 g인 숫컷 Mol:Wistar 래트를 2개 그룹으로 나눈다. 10 ㎕의 혈액 샘플을 혈중 포도당 농도의 결정을 위해 꼬리 정맥에서 채혈한다. 다음으로 래트는 t = 30분에 마취 (예를 들어, Hypnorm/Dormicum 사용)시키고 다시 혈중 포도당을 t = -20분 및 t = 0분에 측정한다. t = 0 샘플을 채혈한 후, 래트는 1 mL/kg 부피의 주사에 상응하는 농도로 등장성 수성 완충액 중 비히클 또는 시험 물질로 꼬리 정맥에 주사된다. 혈중 포도당은 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 120, 및 180분의 시간에 측정된다. 마취제 투여는 20분 간격으로 반복된다.
본 발명의 방법에 따라 디자인되거나 또는 선택된 인슐린 유사체, 화합물 및/또는 분자는 또한 많은 생물리적 방법으로 평가될 수 있다. 적합한 방법은 x-선 결정학, 분석적 초원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 등온 열량측정법 등을 포함한다. 예를 들어, 인슐린 유사체 (본 개시 내용의 방법을 사용해 동정된 화합물 및 분자 포함)는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 유사체의 결정화 및 구조 결정을 통한 추가의 확인을 겪을 수 있다. 예를 들어, 용액 중 다량체화 상태는 분석적 초원심분리로 결정될 수 있다. 분석적 초원심분리는 12 mm 경로-길이 셀에서 Beckan XLI 분석적 원심분리를 사용하여 20℃에서 수행된다. 화합물을 함유하는 샘플은 100 μg/mL의 최종 농도로 10 mM HCl 중에서 10 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.4로 희석된다. 당업자는 다른 완충액, 염 등이 사용될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 예를 들어, 샘플은 또한 0.2 mM ZnCl2, 2 mM CaCl2, 1 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.4) 또는 0.1 M 암모늄 술페이트를 함유하는 것이 제조될 수 있다. 10 mM NaOH의 동일 부피가 첨가되어 임의의 pH 변화를 중화시킨다. 100 μL의 총 샘플 부피가 사용된다.
방사상 농도 분포는 220 nm에서 흡광도로 측정된다. 침강 평형은 1 시간 단위로 순차적 흡광도 스캔으로 평가하여, 30,000 및 45,000 rpm에서 확립되었다. 양쪽 스피드에서의 데이타는 함께 SEDNTERP (Laue et al. 1992)를 사용하여 조성물로부터 추정된 용액 밀도 및 용매 부분 비부피의 값을 사용해 SEDPHAT (Houtman et al. 2007)에서 단일한 이상적 침강 종에 대해 적합화된다. 디술피드를 제외하고, 모든 번역후 변형은 화합물 부분 비부피의 추정에서 무시된다.
임상적 징후, 투여 경로, 용량 및 약학 조성물
본 개시 내용에서 관심있는 인슐린 유사체, 화합물 및 분자는 IR의 활성화 및/또는 조정에 반응성인 병태의 치료에서 가치있다. 이들 병태는 혈중 포도당 수준 및/또는 포도당 물질대사의 조절이 지시되는 것들을 포함한다.
IR의 활성화 및/또는 조정에 반응성인 병태는 제한없이, 진성 당뇨병 (예를 들어, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 임신성 당뇨병), 고혈당증, 인슐린 저항증, 손상된 포도당 내성 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 병태는 인슐린-관련 병태이다. 인슐린 관련 병태는 제한없이, 고혈당증, 인슐린 저항증, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 포함한다.
본 발명의 인슐린 유사체는 포도당 물질대사를 조절하기 위해서, 대상체, 예컨대 인간을 포함하는 포유동물에서 사용하기 적합하다. 따라서, 포도당 물질대사를 조절하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예는 이러한 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 포도당 물질대사를 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구체예는 인슐린-관련 병태를 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예는 당뇨병을 치료하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의한다. 당뇨병은 제한없이, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨를 포함한다. 일부 구체예는 고혈당증을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 이러한 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의한다. 일부 구체예는 인슐린 저항증을 치료하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 이러한 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의한다. 일부 구체예는 손상된 포도당 내성을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 이러한 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의한다. 일부 구체예는 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 이러한 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계에 의한다.
예를 들어, 대상체에서 제1형 당뇨병을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법이 개시되고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 20의 치환은 G20Y, G20F 또는 G20P일 수 있다. 개시된 펩티드의 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 10의 치환은 H10E, H10D 또는 H10Q일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 10 및 20에서 B 사슬 치환의 임의 조합이 존재할 수 있다. 일부 예에서, 투여된 펩티드의 A 사슬이 또한 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, A 사슬 펩티드의 적어도 하나의 치환은 T8H, T8Y, T8K 또는 S9R일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 치환은 위치 8 또는 9 또는 둘 모두의 위치에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 개시된 B 사슬 펩티드 치환 및 A 사슬 펩티드 치환의 임의 조합이 존재할 수 있다. 또한 본 명세서는 대상체에서 제1형 당뇨병을 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 개시한다. 일부 예에서, 대상체는 펩티드를 투여하는 단계 이전에 제1형 당뇨병으로 진단받았다. 일부 예에서, 대상체는 펩티드를 투여하는 단계 이전에 제1형 당뇨병이 발생될 위험성이 있는 것으로 진단받았다.
약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체, 화합물 또는 분자의 용도가 또한 제공된다. 일부 구체예는 대상체에서 포도당 물질대사를 조절하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 인슐린-관련 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 당뇨병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 고혈당증을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 인슐린 저항증을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 손상된 포도당 내성을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키기 위한 약물의 제조에서 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 용도에 관한 것이다.
일부 구체예는 또한 대상체에서 포도당 물질대사를 조절하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 인슐린-관련 병태를 치료 및/또는 예방하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 당뇨병을 치료 및/또는 예방하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 고혈당증을 치료 및/또는 예방하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 인슐린 저항증을 치료 및/또는 예방하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 손상된 포도당 내성을 치료 및/또는 예방하는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다. 일부 구체예는 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키는데 사용을 위한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 인슐린 유사체의 투여 결과로 혈중 포도당 수준이 감소된다. 바람직하게, 인슐린 유사체는 인슐린 유사체의 투여 결과로 투여 60분 이내에 혈중 포도당 수준의 감소가 일어나게 되는 속효성 인슐린 유사체이다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체의 투여 결과로 투여의 수 분, 40분, 30분, 20분, 10분 또는 5분 이내에 혈중 포도당 수준의 감소가 일어난다. 일부 구체예에서, 인슐린 유사체의 투여 결과로 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간 동안 혈중 포도당 수준의 감소가 일어난다. 본 명세서에 개시된 임의 방법에서, 본 명세서에 상세하게 기술된 바람직한 화합물이 투여될 수 있다. 혈중 포도당 수준은 당업자에게 공지된 임의 수단으로 측정할 수 있다.
인슐린 수용체 활성화를 증가시키는 방법
대상체에서 인슐린 수용체를 증가시키는 방법이 개시되고, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 개시된 인슐린 유사체, 펩티드, 화합물, 분자 또는 약학 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 표준 활성화 수준과 비교하여 인슐린 수용체 활성화가 감소된 것으로 알려진 대상체일 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 수용체 활성화의 표준 활성화 수준은 건강한 개체에서 확립된 수준을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 수용체 활성화의 표준 활성화 수준은 증가된 인슐린 수용체 활성화에 대한 필요의 결정 이전에 치료되는 대상체의 확립된 수준을 기반으로 할 수 있다.
예를 들어, 대상체에서 인슐린 수용체 활성화를 증가시키는 방법이 개시되고, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 20에서 치환은 G20Y, G20F 또는 G20P일 수 있다. 개시된 펩티드의 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 10에서 치환은 H10E, H10D 또는 H10Q일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 10 및 20에서 B 사슬 치환의 임의 조합이 존재할 수 있다. 일부 예에서, 투여된 펩티드의 A 사슬이 또한 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, A 사슬 펩티드의 적어도 하나의 치환은 T8H, T8Y, T8K 또는 S9R일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 치환은 위치 8 또는 9 또는 둘 모두의 위치에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 개시된 B 사슬 펩티드 치환 및 A 사슬 펩티드 치환의 임의 조합이 존재할 수 있다. 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 인슐린 수용체 활성화를 증가시키는 방법이 개시된다.
혈당을 저하시키는 방법
대상체에서 혈당을 저하시키는 방법을 개시하고, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 개시된 인슐린 유사체, 펩티드, 화합물 또는 약학 조성물 중 어느 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 표준 혈당 수준과 비교하여 증가된 혈당을 갖는 것으로 알려진 대상체일 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 수용체 활성화의 표준 활성화 수준은 건강한 개체에서 확립된 수준을 기반으로 할 수 있다. 일부 예에서, 인슐린 수용체 활성화의 표준 활성화 수준은 증가된 인슐린 수용체 활성화에 대한 필요의 결정 이전에 치료되는 대상체에서 확립된 수준을 기반으로 할 수 있다.
예를 들어, 대상체에서 혈당을 저하시키는 방법을 개시하고, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에게 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함한다. 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 20의 치환은 G20Y, G20F 또는 G20P일 수 있다. 개시된 펩티드의 일부 예에서, B 사슬 펩티드의 아미노산 10의 치환은 H10E, H10D 또는 H10Q일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 10 및 20에서 B 사슬 치환의 임의 조합이 존재할 수 있다. 일부 예에서, 투여되는 펩티드의 A 사슬은 또한 적어도 하나의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 예에서, A 사슬 펩티드의 적어도 하나의 치환은 T8H, T8Y, T8K 또는 S9R일 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 치환은 위치 8 또는 9 또는 둘 모두의 위치에 존재할 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 개시된 B 사슬 펩티드 치환 및 A 사슬 펩티드 치환의 임의 조합이 존재할 수 있다. 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 혈당을 저하시키는 방법이 개시된다.
투여 및 용량
기술되는 투여의 경로 및 용량은 오직 지침으로서 제공하고자 한다. 당업자는, 본 명세서에 기재된 개시 내용을 기반으로, 본 명세서에 포괄되는 조성물, 제제, 방법 및 용도에 대한 특별한 용량 용법이 임상적 및/또는 약동학적 실험을 통해 경험적으로 결정될 수 있고, 이러한 용량이 사전명시된 유효성 및/또는 독성 기준에 따라 조정될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 또한 임의의 특정 환자를 위한 특별한 용량 및 치료 용법은 적용되는 특별한 화합물의 활성 및 농도, 환자의 특징 예컨대 특정한 환자의 연령, 체중 및 반응, 활성 조합, 치료 의사의 판단 및 치료되는 병태의 성질 및 중증도를 포함하는 다양한 인자들에 따라 좌우될 것이라는 것을 이해하게 될 것이다. 하기의 용량은 평균 사례의 예시이다. 더 높거나 또는 더 낮은 용량 범위를 받을 만한 개별 예가 물론 존재할 수 있고, 그러한 범위는 본 발명의 범주 내에 속한다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 방법 및 용도에 따라서, 대상체는 하나 이상의 용량으로 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 수용할 수 있다. 투여되는 실제량, 및 투여 속도 및 시간 과정은 투여 경로, 필요한 이득의 성질, 치료되는 병태의 성질 및 중증도, 치료되는 대상체의 병태에 따라 가변적이게 될 것이고 궁극적으로 참관 수의사 또는 의사의 판단에 따르게 될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 용량, 시기에 대한 결정 등은 참관 수의사 또는 의사의 책임 하에 있고 전형적으로 장애의 성질, 개별 환자의 병태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 공지된 다른 인자들을 고려한다.
당업자는 하나 이상의 유사체(들)가 함께 또는 개별적으로 임의의 적절한 스케줄로, 예를 들어, 임의 일수 또는 주간 동안, 또는 그의 임의 변동 동안, 2일마다 1회를 포함하여, 1일 1회 이상 내지 주당 1회 이상으로 투여될 수 있다. 정상적으로, 인슐린 유사체는 1일 1회, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 투여된다. 그러나, 또한 인슐린 유사체는 필요에 따라서, 예를 들어 혈중 포도당이 정상 범위 이상일 때 또는 혈중 포도당 수준을 감소시킬 필요가 있을 때 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 음식 섭취와 함께, 그 이전에 또는 그 이후에 투여된다. 바람직하게, 인슐린 유사체는 매 식사, 예를 들어 아침, 점심 및 저녁 이전에 투여된다. 일부 구체예에서, 화합물 또는 조성물은 음식 섭취 이전 5분, 10분, 20분, 30분, 40분, 50분 또는 60분에 투여된다. 일부 구체예에서, 화합물 또는 조성물은 음식 섭취 직전에 투여된다.
본 명세서에 기술된 바와 같은 인슐린 유사체를 비롯하여 약학 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 경로로 투여될 수 있고, 비경구가 가장 관심있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서 인슐린 유사체는 비경구 경로를 통해서, 예컨대 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 다른 적합한 투여 경로, 예를 들어 장관 (예를 들어, 경구 투여)이 본 발명의 범주에 속한다. 특정한 구체예에서, 비경구 경로가 바람직하고 정맥내, 관절내, 복강내, 피하, 근육내, 줄기내 주사 및 주입을 비롯하여 설하, 경피, 국소, 비내 경로를 포함한 경점막에 의한 투여, 또는 흡입 예컨대, 예를 들어 폐흡입에 의한 투여를 포함한다.
인슐린 유사체는 적합한 비히클로 투여될 수 있거나 또는 그들은 적합한 약학 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 본 발명의 범주 내이다. 하기에서 적합한 약학 조성물을 기술한다.
약학 조성물
당업자는 본 명세서에 기술된 인슐린 유사체가 약학 조성물로 제제화될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 이러한 조성물은 인슐린 유사체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여와 상용성인, 임의의 모든 고체 또는 용매 (예컨대 포스페이트 완충 염수 완충액, 물, 염수) 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용자에게 유해하지 않다는 의미에서 '허용가능'해야만 한다. 적합한 약학 담체는 하기의 문헌에 기술되어 있다: "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa.); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, (Lippincott, Williams and Wilkins), 2000; Liberman, et al. Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Kibbe, et al. Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients (3rd Ed.), American Pharmaceutical Association, Washington, 1999. 일반적으로, 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 당분야에 공지되어 있고 최종 사용 용도를 기반으로 선택된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용할 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 제한없이 주사 또는 주입 조성물에 적합한 것들을 포함한다. 보충적인 활성 화합물이 또한 조성물에 도입될 수 있다. 약학적으로 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 약학 조성물은 당업자에게 충분히 공지되어 있고 쉽게 입수할 수 있는 많은 공급원, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin E. W., Easton Pa., Mack Publishing Company, 19th ed., 1995)]에 기술되어 있다.
약학적으로 허용가능한 담체의 양은 화합물 및 당업자가 담체와 별개로 분류하게 되는 임의의 다른 선택 성분 (예를 들어, 다른 활성제)의 수준에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 제제는 조성물의 중량 기준으로, 예를 들어 약 5% 내지 99.99%, 또는 25% 내지 약 99.9 % 또는 30% 내지 90%의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 다른 보조제의 부재 하에서, 조성물의 균형을 형성할 수 있다.
임의로, 본 개시 내용의 약학 조성물은 다른 추가의 성분, 예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 성분을 더 포함한다. 따라서, 본 발명은 추가 양상에서 본 발명의 화합물, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 하나 이상의 다른 활성제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일반적으로, 약학 조성물에 존재하는 다른 활성제의 양은 단독으로 또는 조성물 중 다른 성분과 조합하여 추가의 이득을 제공하는데 충분하다.
이들 임의 성분이 그들의 치료적 또는 심미적 이득 또는 그들의 가정된 작용 기전에 의해 분류될 수 있다는 것을 당업자가 이해하게 될 것이다. 그러나, 또한 이들 임의 성분이 일부 예에서, 하나를 초과하는 치료적 또는 심미적 이득을 제공할 수 있거나 또는 하나를 초과하는 작용 기전을 통해 작동될 수 있다는 것을 이해한다. 그러므로, 본 명세서에서 분류는 편의를 위한 것이고 성분을 열거된 특정한 용도 또는 용도들에 제한하려는 것이 아니다. 또한, 적용시, 성분의 약학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에서 유용하다.
다른 활성제가 본 발명의 약학 제제에 존재할 때, 화합물의 용량은 나머지 추가 성분이 존재하지 않을 때 적용되는 것과 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 적절한 용량은 당업자가 쉽게 이해하게 될 것이다.
약학 조성물은 이의 의도하는 투여 경로, 예를 들어 국부 또는 전신과 상용성이도록 제제화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피부내, 피하, 경구, 비내, 국소, 경피, 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 경구 및 비내 투여는 흡입을 통한 투여를 포함한다. 비경구, 피부내, 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 다음의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석액, 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이술파이트; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정용 작용제 예컨대 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 소듐 히드록시드로 조정될 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 1회용 시린지 또는 다수 용량 바이알에 밀봉될 수 있다.
주사 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 비수성 용액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리학적 염수, 정균수, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에서, 조성물은 멸균되어야만 하고 용이한 실린지이용성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야만 하고 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어, 코팅제 예컨대 레시틴의 사용에 의해서, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해서 그리고 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로살 등에 의해 획득될 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당류, 다가알콜 예컨대 만니톨, 솔비톨, 소듐 클로라이드가 조성물에 포함될 수도 있다. 주사 조성물의 장기간 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시켜 유발시킬 수 있다.
멸균 주사 용액은 필요에 따라서 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그 조합과 적절한 용매 중에 필요량으로 활성 화합물을 도입시킨 후, 여과 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균된 비히클에 폴리뉴클레오티드를 도입시켜 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 적합한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 활성 성분과 임의의 추가적인 바람직한 성분의 분말이 생기는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 치료적 경구 투여의 목적을 위해서, 활성 화합물은 부형제와 함께 도입될 수 있고 정제, 트로키 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강 세정액으로서 사용을 위한 유동성 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 상용성인 결합제, 및/또는 보조제 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로키 등이 임의의 하기 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제 예컨대 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, PRIMOGEL, 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활택제 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 풍미제.
비내 흡입에 의한 투여에 적합한 제제는 담체가 고체인 경우에, 코로 흡입하는 방식으로, 즉 코 가까이에서 분말이 수용된 용기로부터 비강을 통한 빠른 흡입을 통해서 투여되는, 예를 들어, 약 20 내지 약 500 미크론 범위의 입자 크기를 갖는 조분말을 포함한다. 담체가 네뷸라이저에 의한 투여를 위한 액체인 적합한 제제는 작용제의 수성 또는 유성 용액을 포함한다. 흡입에 의한 투여의 경우에, 작용제(들)는 또한 적합한 추진제, 예를 들어 가스 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이저로부터 액적 또는 에어로졸 스프레이의 형태로 전달될 수 있다. 이러한 방법은 U.S. 6,468,798에 기술된 것을 포함한다.
전신 투여가 또한 경점막 또는 경피 수단에 의할 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우에, 투과하려는 장벽에 적합한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여의 경우에, 세제, 담즙산염 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비내 스프레이, 점안액, 또는 좌제의 사용을 통해 수행될 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물 (예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드)은 당분야에서 일반적으로 공지된 바와 같은, 연고, 샐브, 겔 또는 크림으로 제제화된다.
약학 조성물은 약학 제제의 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 인슐린 유사체, 분자 또는 화합물을 균일하게 그리고 친밀하게 액상 담체 또는 미분 고형 담체 또는 둘 모두와 접촉시켜 제조된다. 다음으로, 필요하면, 생성물을 바람직한 제제로 성형시킨다. 비경구 투여의 경우, 일 구체예에서, 본 발명의 인슐린 유사체, 화합물 또는 분자는 약학적으로 허용가능한 담체와, 단위 주사 제형 (용액제, 현탁액 또는 에멀션)으로, 이의 바람직한 정도의 순도로 혼합되어 제제화될 수 있다.
일부 구체예에서, 약학 조성물은 본 발명에 따른 인슐린 유사체, 펩티드, 화합물 또는 분자의 치료적 유효량을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물 중 본 발명의 인슐린 유사체, 펩티드, 화합물 또는 분자의 함량은 예를 들어, 약학 조성물의 약 0.1 내지 약 100% w/w이다.
키트
상기 기술된 재료를 비롯하여 다른 재료가 개시된 방법의 실행을 수행하거나, 또는 보조하는데 유용한 키트로서 임의의 적합한 조합으로 함께 포장될 수 있다. 소정 키트의 키트 성분이 개시된 방법에서 함께 사용을 위해 디자인되고 적합화된다면 유용하다. 하나 이상의 개시된 인슐린 유사체를 포함하는 키트가 개시된다. 예를 들어, 하나 이상의 개시된 인슐린 유사체, 펩티드, 화합물 또는 약학 조성물을 포함하는 키트가 개시된다.
본 발명은 이제 하기 실시예를 참조하여 더욱 설명할 것이지만, 단지 예시이고 제한하는 것이 아니다. 실시예는 도면을 참조한다.
실시예
실시예 1 - Con-Ins G1의 펩티드 합성
Con-Ins G1 사슬 A 및 사슬 B의 고체상 펩티드 합성.
Con-Ins G1의 A 사슬 및 B 사슬 둘 모두는 Fmoc (9-플루오렌메틸옥시카르보닐) 화학을 사용하여 CEM Liberty 1 자동화 마이크로웨이브 펩티드 합성기 (CEM Corporation, Matthews, NC) 상에서 합성되었다. A 사슬의 합성을 위해서 사전-적재된 Fmoc-Cys(Trt)-Rink 아미드 MBHA 레진 (0.21 mmol/g) (Peptides International, Louisville, KY) 및 B 사슬의 합성을 위해서 사전-적재된 Fmoc-Arg(Pbf)-Wang 레진 (0.4 mmol/g) (AnaSpec, EGT., Freemont, CA)이 사용되었다. 측쇄 보호되는 Fmoc-Nα-보호된 아미노산은 다음의 상업적 공급처로부터 얻었다: Bachem Inc. (Torrance, CA), Chem-Impex International (Wood Dale, IL), Genzyme (Cambridge, MA), Novabiochem (San Diego, CA), P3 Biosystem (Louisville, KY) 및 Reanal (Budapest, Hungary). Fmoc-γ-카복시-L-글루탐산 γ,γ-디-t-부틸 에스테르 (Fmoc-Gla(OtBu)2-OH)는 내부에서 자체 합성하였다 (Rivier et al. 1987). 아미노산에 대한 측쇄 보호는 다음과 같이 하였다: Lys, tert-부틸옥시카르보닐 (Boc); Hyp, Ser, Thr 및 Tyr, tert-부틸 에테르 (tBu); Asn, Cys, 및 His 트리틸 (Trt); Arg 2,2,4,6,7-펜타메틸-디하이드록시벤조퓨란-5-술포닐 (Pbf); Glu, Gla, 및 Asp tert-부틸 에스테르 (OtBu); Cys, 아세트아미도메틸 (Acm); Cys, 4-메톡시트리틸 (Mmt); Cys, S-tert-부틸티오닐 (S-t-Bu).
올바른 분자내 및 분자간 디술피드 결합을 만들 수 있기 위해서, CysA7 및 CysB7의 측쇄 보호기는 Acm였고, CysA20 및 CysB19의 측쇄 보호기는 Trt이었으며, CysA11의 측쇄는 Mmt 보호되었고, CysA6의 측쇄는 S-t-Bu 보호되었다. 양쪽 사슬은 0.1 mmol 규모로 합성되었다. 커플링 반응은 DMF (NMP 중 His는 예외) 중에 용해된 Fmoc-보호된 아미노산의 5배 몰 과량의 존재 하에 레진 상에서 HATU [2-(1H-9-(아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-아미늄 헥사플루오로포스페이트]: DIEA [N,N-디이소프로필에틸아민] : AA [보호된 아미노산] (0.9 : 2 : 1)에 의해 0 W에서 2분 동안 이후에 35 W에서 60℃의 최대 온도로 10분 동안 활성화시켜 수행되었다. Arg은 항상 실온에서 25분 동안 이후에 15 W에서 50℃의 최대 온도로 12분 동안 이중-커플링되었다. Cys, His, 및 Gla는 40 W에서 50℃의 최대 온도로 6분 동안 커플링되었다. Fmoc 기의 탈보호는 DMF 중 0.1 M HOBt를 함유하는 20% 피페리딘을 사용하여 2 단계 (각 회차에 신선한 시약을 사용함)로, 즉, 35 W에서 2분의 초기 탈보호와 이어서 60℃의 최대 온도로 35 W에서 5분의 탈보호로 수행되었다.
Con-Ins G1 사슬 A: 분자내 디술피드 결합 형성, 절단 및 정제.
CysA6 및 CysA11 사이의 분자내 디술피드 브릿지는 비산화적 방법을 사용하여 레진 상에서 수행하였다 (Galande et al. 2005). 제1 단계에서, CysA6의 S-t-Bu는 레진 (760 mg)을 8 mL의 디메틸포름아미드 (DMF) 중 20% 머캅토에탄올 (ME) (Fluka) 및 1% N-메틸몰폴린 (NMM)으로 밤새 실온에서 처리하여 자유 티올을 방출시켜 환원에 의해 제거시켰다. 레진은 DMF로 세척하였고 건조시켰다. 이어서 레진을 디클로로메탄 (DCM) 8 mL 중 2,2'-디티오비스(5-니트로피리딘) (DTNB)의 10배 과량 ∼ 1 mmol (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)과 1시간 동안 반응시켜 S-5-니트로피리딘-술페닐 (5-Npys) 보호된 CysA6을 형성시켰다. DCM으로 과량의 시약을 세척해 버린 후, 레진은 스캐빈저로서 2 μL 트리이소프로필실란 (TIS)의 존재 하에 디클로로메탄 (DCM) 8 mL 중 1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 20분 동안 처리하여 CysA11(Mmt)을 탈보호시키는 동시에 CysA6 및 CysA11 사이에 디술피드 브릿지를 형성시켰다.
사슬 A의 레진으로부터의 절단 (720 mg) 및 동시 탈보호는 레진을 (TFA/물/TIS : 95/2.5/2.5)을 함유하는 10 mL의 시약과 2시간 동안 교반시켜 수행하였다. 빙냉 무수 에틸 에테르를 사용하여 펩티드의 침전을 후속한 후, 0.1% TFA/40% 물/60% 아세토니트릴로 추출하고 동결건조시켰다. 펩티드는 용매계 A: 0.1% TFA/물, B: 0.1% TFA/40% 물/60% ACN의 5% 내지 65% 범위의 선형 농도구배의 용매 B 중에서 Bondapak C18 (15-20 μm 입자 크기, 300Å)로 충전된 Waters PrepPak 카트리지 (2.5 x 10 cm) 상에서 60분 간 20 mL/분의 유속으로 분취형 Waters HPLC (Milford, MA)에 의해 정제하였다. 18.7 mg (7.7 μmol)의 사슬 A을 수득하였다. 펩티드의 질량은 ThermoScientific LTQ Orbitrap XL (Waltham, MA) 장비 상에서 측정되는 전자분무 이온화 (ESI)-MS를 통해 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 2422.03 Da; 실측된 단일 동위원소 MH+1 값 2422.01 Da).
Con-Ins G1 사슬 B: 절단 및 정제.
사슬 B의 레진으로부터의 절단 및 동시 탈보호는 500 mg 레진을 (TFA/티오아니솔/3,6-디옥사-1,8-옥탄디톨 (DODT, TCI America, Portland, OR)/물: 87.5/5/2.5/5)을 함유하는 10 mL 시약과 2시간 동안 교반하여 수행하였고, 이후에 빙냉 무수 에틸 에테르를 사용하여 펩티드를 침전시킨 후, 0.1% TFA/40% 물/60% ACN로 추출하고 동결건조하였다. 펩티드는 분취용 HPLC (20 내지 80% 범위의 농도구배의 용매 B에서 60분인 것을 제외하고, 사슬 A의 정제에 기술된 바와 같음)에 의해 정제하였다. 25.9 mg (9 μmol)의 사슬 B를 수득하였다. 펩티드의 질량은 ESI-MS에 의해 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1 값 2868.24 Da; 실측된 단일 동위원소 MH+1 값 2868.22 Da).
부분 폴딩된 Con-Ins G1 (1개 디술피드 결합 함유)을 형성하기 위한 DMSO-보조된 사슬 A 및 사슬 B 라이게이션.
사슬 A 및 사슬 B (각각 7 μmol)는 0.1% TFA/물 용액 (7.1 mL) 중에 함께 용해시켰고 14.5 mL DMSO, 14.25 mL 물, 2 mM EDTA를 함유하는 35.6 mL 0.2 M Tris, pH 7.5의 혼합물에 첨가하였다. 산화는 분석용 HPLC를 통해 모니터링하였다. 실온에서 25시간 이후에, 반응을 8% 포름산 (1 mL)으로 켄칭시켰고, 225 mL의 총 부피까지 0.1% TFA로 희석하였으며 15 내지 75% 범위의 농도구배의 B에 의해 60분간 분취용 HPLC로 정제하였다. 4.5 mg (0.85 μmol, 7 μmol의 출발량 기준으로 12.1% 수율)의 이종이량체를 수득하였다. 펩티드의 정체는 ESI-MS로 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 5287.25 Da; 실측된 단일 동위원소 MH+1: 5287.19 Da).
완전-산화된 Con-Ins G1을 형성하기 위한 I 2 -보조된 산화.
4.5 mg (0.85 μmol)의 Con-Ins G1 (부분 폴딩)을 6.2 mL의 2.5% TFA/물 용액에 용해시켰고 55 μL의 I2 용액 (5 mL MeOH 중 50 mg I2)을 첨가하였으며 60분간 교반하였다. 용액의 노란 색상이 투명하게 될 때까지 1M 아스코르브산 용액을 첨가하여 켄칭하였다. 반응물을 60 mL 물로 희석하여 분취용 RP-HPLC 컬럼 상에 적재하였다. 1.5 mg (0.29 μmol)의 완전하게 산화된 Con-Ins G1이 수득되었다 (하나의 사슬간 디술피드 결합을 함유하는 부분 폴딩된 생성물의 출발량을 기준으로 35% 수율 및 정제된 사슬 A의 출발량을 기준으로 4% 수율). 펩티드의 정체는 ThermoScientific LTQ Orbitrap XL (Waltham, MA) 질량 분광계 상에서 ESI-MS를 통해서 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 5143.16 Da; 실측된 단일 동위원소 MH+1: 5143.16 Da).
펩티드의 순도는 RP-HPLC 및 모세관 전기영동으로 평가하였다. 정량적 RP-HPLC는 GE Healthcare AKTApurifier 10 (Pittsburgh, PA) 및 Phenomenex (Torrance, CA) Kinetex XB-C18 컬럼 (4.6 x 100 mm, 5.0 μm 입자 크기, 100Å 포어 크기)을 사용하여 수행하였다. 용매계는 수 중 용매 A = 0.1% TFA 및 용매 B = 60% ACN, 40% A를 포함하였다. 농도구배는 20 내지 80%의 B로 30분간 1.0 mL/분의 유속으로 수행되었다. 검출은 214 및 280 nm에서 수행하였다. 펩티드의 순도는 89%로 결정되었다. 모세관 전기영동 (CE)은 Groton Biosystems GPA 100 장비 (Boxborough, MA)를 사용해 수행하였다. 전기영동 완충액은 0.1 M 소듐 포스페이트 (15% 아세토니트릴), pH 2.5였다. 분리는 20 kV를 모세관 (0.75 μm x 100 cm)에 인가하여 수행하였다. 검출은 214 nm에서 수행하였다. 펩티드의 평가된 순도는 80%였다.
sCon-Ins G1의 합성 및 정제.
B 사슬 (2,980 M-1·cm-1) 및 완전 산화된 sCon-Ins G1 (4,470 M-1·cm-1)의 정량에 보정된 소광 계수를 사용한 것을 제외하고, A 사슬에 CysA6, A11에서 SecA6, A11 변형을 함유하는 Con-Ins G1 (sCon-Ins G1이라고 함; Sec=셀레노시스테인)은 문헌 [Safavi-Hemami et al. (2015)]에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성하고, 정제 및 산화시켰다. sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]의 합성은 sCon-Ins G1 (Safavi-Hemami et al. (2015))에 대해 기술된 대로 수행하였다. sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]의 디술피드 결합의 단계식 형성은 하기에 상세하게 기술되어 있다.
sCon-Ins G1[GluA4] 사슬 A: 절단, DTT 환원 및 정제.
펩티드는 1.5시간 동안 2 mL TFA (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), 66 μL H2O, 12 mg 2,2-디티오비스(5-니트로피리딘) (DTNP; Aldrich; Saint Louis, MO), 및 150 mg 페놀을 사용하여 제조된 1 mL의 농축 시약 K (TFA/물/페놀/티오아니솔/1,2-에탄디티올, 부피 기준 82.5/5.0/5.0/5.0/2.5)를 사용하고, 이어서 25 μL 티오아니솔의 첨가를 후속하여 125 mg의 레진으로부터 절단하였다. 절단 혼합물을 여과하였고 10 mL의 차가운 메틸-tert-부틸 에테르 (MTBE; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)로 침전시켰다. 미정제 펩티드는 7,000 Х g에서 6분 동안 원심분리를 통해 침전시켰고 1회 10 mL의 차가운 MTBE로 세척하였다. 분자내 디셀레니드 결합 형성 (SecA6에서 SecA10로)을 유도하기 위해서, 세척된 펩티드 펠렛을 수중 50% ACN (Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ) (vol/vol), 및 2 mM EDTA (Mallinckrodt, St. Louis, MO)를 함유하는 1 mL 0.2 M Tris·HCl (Sigma, St Louis, MO), pH 7.5 중 100 mM 디티오트레이톨 (DTT, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ) 2 mL에 용해시켰고, 1 mL의 물을 첨가하고 약하게 와류시켰으며, 2시간 동안 반응이 진행될 수 있게 두었다. 다음으로 8% 포름산 (vol/vol) (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)으로 켄칭하였고, 수중 0.1% TFA (vol/vol)로 희석하였으며, 4 mL/분의 유속으로 30분 동안 10 내지 40% 범위의 선형 농도구배의 용매 B로 용리되는 세미-분취용 C18 Vydac 컬럼 (218TP510, 250 Х 10 mm, 5-μm 입자 크기; Grace, Columbia, MD)을 사용하여 역상 (RP) HPLC로 정제하였다. HPLC 용매는 수중 0.1% (vol/vol) TFA (용매 A) 및 90% 수성 ACN (vol/vol) 중 0.1% TFA (vol/vol) (용매 B)였다. UV 흡광도를 220 및 280 nm에서 측정하여 용리액을 모니터링하였다. 펩티드의 순도는 1 mL/분의 유속으로 30분 동안 용매 B의 10 내지 40% 범위의 선형 농도구배를 사용하여 C18 Vydac 컬럼 (218TP54, 250 Х 4.6 mm, 5 μm 입자 크기, Grace, Columbia, MD) 상에서 분석용 RP-HPLC에 의해 평가하였다. 펩티드는 1,490 M-1·cm-1의 소광 계수 (ε)를 사용하여 280 nm에서 UV 흡광도에 의해 정량되었다. 135 mg의 레진으로부터, 3.8 mg의 사슬 A를 수득하였다. 펩티드의 질량은 전자분무 이온화 (ESI)-MS를 통해 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 2,473.674, 실측된 단일 동위원소: MH+1 2,472.924). 분자 질량은 ProteinProspector (버전 5.12.1)를 사용해 계산하였다.
sCon-Ins G1[ProB3, GluB10] 사슬 B: 절단 및 정제.
펩티드는 1 mL의 시약 K로 3시간 처리를 통해 94 mg 레진으로부터 절단시켰고 상기 기술된 대로 후속하여 여과, 침전 및 세척하였다. 세척된 펩티드 펠렛은 용매 B의 농도구배가 15 내지 45% 범위인 것을 제외하고는 상기에 기술된 대로 정제하였다. 동일한 농도 구배를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 선형 펩티드의 순도를 평가하였고, 펩티드 정량은 2,980 M-1·cm-1의 ε 값을 사용해 수행하였다. 94 mg의 절단된 레진으로부터, 2.37 mg의 사슬 B를 수득하였다. 펩티드의 질량은 ESI-MS로 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 2,808.24, 실측된 단일 동위원소 MH+1: 2,808.25).
sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]를 형성시키기 위한 구리-보조된 사슬 A 및 사슬 B 라이게이션.
총 100 nmol의 각 사슬을 조합하고 SpeedVac을 사용해 건조하였다. 펩티드 혼합물을 100 μL의 0.1% TFA (vol/vol)에 용해시켰고 800 μL CuCl2·H2O (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)와 100 μL의 10 nM EDTA를 함유하는 100 μL의 1M Tris·HCl, pH 7.5에 첨가하였다. 최종 펩티드 농도는 100 μM이었다. 반응물은 24시간 동안 실온에 방치한 후에 8% 포름산 (vol/vol)으로 켄칭시키고, 0.1% TFA로 희석하고 15 내지 45% 범위의 선형 농도구배의 용매 B로 30분 동안 4 mL/분의 유속으로 용리하는 분취용 C18 Vydac 컬럼을 사용해 RP-HPLC로 정제하였다. sCon-Ins G1의 순도는 1 mL/분의 유속으로, 세미-분취용 정제와 동일한 농도구배를 사용하여 분석용 RP-HPLC로 평가하였다. sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]는 4,470 M-1·cm-1의 ε 값을 사용해 280 nm에서 정량하였다. 반응 수율은 28%였다. 900 nmol의 사슬 A 및 B의 1:1 혼합물로부터, 1.36 mg의 바람직한 생성물을 수득하였다. 펩티드의 정체는 ESI-MS로 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 5,278.15; 실측된 단일 동위원소 MH+1: 5278.15).
완전 폴딩된 sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]의 요오드 (I 2 )-보조 형성.
I2 의 용액 (Acros Organics, Geel, Belgium)은 다음과 같이 제조하였다: 10 mg의 I2 를 5 mL의 ACN에 첨가하였다. 20분 교반 후에, I2 가 완전하게 용해되었고, 15 mL의 물 및 600 μL의 TFA를 첨가하였다. 총 300 μL의 I2 혼합물을 각각 300 μL의 0.1% TFA에 용해된 149 nmol (90% 순도) 및 106 nmol (72% 순도)의 부분 폴딩된 sCon-Ins G1[GluA4, Cys(Acm)7, ProB3, C(Acm)B7, GluB10]에 첨가하였다. 반응물을 5분간 인큐베이션시켰고, 10 μL의 1 M L-아스코르브산 (Sigma, St. Louis, MO)으로 켄칭하고, 수중 0.1% TFA로 4.5 mL의 총 부피로 희석하였고 부분 폴딩된 sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]에 대해 기술된 바와 같이 정제하였다. 최종 생성물 (완전 폴딩된 sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10])의 순도는 1 mL/분의 유속으로, 세미-분취용 정제에서와 동일한 농도구배를 사용하여 C18 Vydac 컬럼 (218TP54, 250 Х 4.6 mm, 5 μm 입자 크기) 상에서 분석용 RP-HPLC에 의해 평가하였고, 97%로 결정되었다. sCon-Ins G1[GluA4, ProB3, GluB10]은 부분 폴딩된 생성물에 대해 기술된 바와 같이 정량하였다. 반응물의 수율은 14%였고, 0.18 mg의 바람직한 생성물이 수득되었다. 펩티드의 정체는 ESI-MS로 확인하였다 (산출된 단일 동위원소 MH+1: 5,134.84; 실측된 단일 동위원소 MH+1: 5,134.07).
hIns[DOI] 및 hIns[TyrB15, TyrB20, DOI]의 합성 및 정제
hIns [DOI]는 인간 인슐린의 B 사슬의 잔기 23 내지 30이 결여된 단량체 유사체이다. hIns[DOI] 및 hIns[TyrB15, TyrB20, DOI]는 표준 절차에 따라서 화학적으로 합성하고, 정제하여 산화시켰다.
실시예 2 - Con-Ins G1 인간 인슐린 수용체 결합 및 신호전달 활성화
인슐린 수용체 결합.
인간 인슐린 수용체 (hIR)에 결합하는 Con-Ins G1의 능력은 결합 경쟁 어세이에 의해 측정되었다. 경쟁 결합 어세이는 이전에 기술된 바와 같이 유로퓸-표지된 인간 인슐린 및 상승 농도의 독액 인슐린으로 가용화된 면역-포획 인간 IR (이소폼 B)을 사용해 수행하였다 (Denley et al. 2004). 시간-분해 형광발광성은 340-nm 여기 및 612-nm 발광 필터를 사용하여 Polarstar 형광측정계 (BMGLab Technologies, Mornington, Australia)로 측정하였다. IC50 값은 비선형 회귀 (1-부위) 분석에 의한 곡선-맞춤을 통해서, Prism 6을 사용해 계산하였다. 데이타 지점 당 3회 반복실험으로 적어도 3회 어세이를 수행하였다.
씨. 지오그라퍼스 독액 인슐린 sCon-Ins G1은 hIns의 ArgB23 내지 ThrB30에 대한 임의 등가물의 결여에도 불구하고 hIns보다 인간 IR-B 수용체에 대하여 단지 30배 낮은 활성인 것으로 확인되었다 (sCon-Ins G1: log [IC50　(nM)] = 1.24 ± 0.06; hIns: log [IC50　(nM)] = -0.26 ± 0.02) (도 1 및 2).
인슐린 신호전달 활성화 어세이.
인슐린 신호전달을 유도하는 Con-Ins G1의 능력은 Akt 인산화 분석으로 평가하였다. 간략하게, pAkt Ser473 수준은 인간 IR-B를 과발현하는 마우스 섬유아세포의 세포주인 NIH 3T3에서 측정하였다. 세포주는 10% 태아 소 혈청 (FBS), 100　U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2 μg/mL 푸로마이신이 포함된 DMEM에서 배양하였다. 어세이를 위해서, 웰 당 40,000 세포를 1% FBS를 함유하는 배양 배지가 있는 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 이후에, 50 μL의 인슐린 용액을 본래 배지의 제거 이후에 각 웰에 파이펫팅하여 넣었다. 30분 처리 이후, 인슐린 용액을 제거하였고 HTRF pAkt Ser473 키트 (Cisbio, Massachusetts, USA)를 사용하여 pAkt Ser473의 세포내 수준을 측정하였다. 간략하게, 세포를 세포 용해 완충액 (웰 당 50 μL)으로 1시간 동안 약한 진탕 하에서 먼저 처리하였다. 다음으로 16 μL의 세포 용해물을 흰색 384웰 플레이트 중 4 μL의 검출 시약에 첨가하였다. 4시간 인큐베이션 이후에, 플레이트를 Synergy Neo 플레이트 판독기 (BioTek, Vermont, USA)에서 판독하였고 제조사의 프로토콜에 따라 데이타를 처리하였다. 어세이는 총 4회 반복하였다. EC50 값은 비선형 회귀 (1-부위) 분석으로 곡선-맞춤하여 계산하였다 (Prism 6 사용).
Con-Ins G1은 Akt 인산화 어세이에서 hIns보다 단지 약 10배 덜 활성인 것으로 확인되었다 (sCon-Ins G1: log [EC50　(nM)] = 0.90 ± 0.05; Con-Ins G1: log [EC50　(nM)] = 0.78 ± 0.15; hIns: log [EC50　(nM)] = -0.20 ± 0.20; 도 3). 이러한 결과는 독액 단백질이 전체로서 B-사슬 C-말단 절편 또는 정규 방향족 트리플렛에 대한 등가물이 결여되어 있음에도 불구하고 강력한 활성이 가능한 구조적 모티프의 Con-Ins G1 내 존재를 강조한다.
실시예 3 - Con-Ins G1의 결정 구조
결정화 및 데이타 수집.
Con-Ins G1을 상기 기술된 대로 합성하였다. Con-Ins G1은 4 mg/mL의 농도로 10 mM HCl 중에 결정화를 위해 제조되었다.
초기 결정화 시도는 CSIRO 협동 결정화 센터 (Parkville, Australia)에서 수행된 로봇식 192-조건 희소-매트릭스 행잉-드롭 스크린을 적용하였다. 단일 결정은 2.0　M 암모늄 술페이트와 10% DL-말레이트-MES-Tris (pH 9.0)을 포함하는 조건으로부터 추출하였고 이어서 오스트레일리안 싱크로트론 (λ= 0.9537Å)에서 MX2 빔라인 상에 100K에서 회절 데이타 수집을 위해 저온-루프에 직접적으로 (저온-보존제 없이) 고정시켰다. 데이타는 XDS를 사용하여 1.95Å의 분해능까지 처리하였다 (Kabsch (2010)). 공간군은 P432이고 유닛 셀 치수는 a=b=c=74.91Å이다. 비대칭 유닛 당 1분자 및 단량체 당 5143 Da의 겉보기 분자 질량으로부터, 용매 함량은 64%로 추정된다.
구조 해석 및 정밀화
구조는 출발 모델로서 PDB 등재 3I3Z로부터의 인슐린 단량체를 사용하고 PHASER 소프트웨어를 사용하여 분자 치환에 의해 해석하였다 (McCoy et al, 2007). 결정학적 정밀화는 COOT (Emsley and Cowtan, 2004) 내에서 모델 구축을 반복하는 PHENIX (Adams et al. 2010)를 적용하였다. 4중 축 가까이서 관찰되는 단일 술페이트 이온은 이의 배향 또는 위치에 대한 제한없이 모델링되었고, 이의 점유를 0.25 보다는 유니티로 설정하여 PHENIX에서 실시하였다. 데이타 처리 및 정밀화 통계는 표 1에 표시되어 있다. 최종 모델은 0.208 / 0.217의 R work / R free 를 가졌다. 최종 모델의 모든 잔기는 라마찬드란 조사구의 선호 영역 내에 놓여진다.
표 1: X-선 데이타 프로세싱 및 정밀화 통계
Figure pct00003
a 괄호안의 수는 외부 분해 쉘을 의미한다.
b 데이타는 p=0.001의 유의성 수준에서 CC 1/2 상관 통계가 유의한 채로 남아있는 최대 분해능에 포함시켰다.
실시예 4 - Con-Ins G1 구조
구조는 전체적인 Con-Ins G1 2차 구조가 hIns의 것과 유사하다는 것을 밝혀주는데, B-사슬의 N-말단 잔기가 고전적인 T-상태 hIns의 것과 유사하게 연장된 경로를 따라간다 (도 4a) (T-상태는 A-사슬 나선형 조립부에 대해서 되접혀진, 연장된 입체형태의 잔기 B1-B8을 특징으로 함). hIns B22-B30의 등가 잔기의 부재로 예상되는 바와 같이, hIns 이량체 계면과 닮은 결정학적 유닛 셀 내 계면은 존재하지 않는다. 결정 내 모든 단량체-단량체 계면은, 각각 분자 표면의 ∼440Å2 에 숨겨진, 4중 축 주변에 채워진 Con-Ins G1 단량체 사이에 형성된 것을 제외하고는, 희소하다. 4개 단량체는 각각의 GlaA4의 단일 측쇄 카복실레이트 기 및 GlyA1의 아미드와 전하-보상된 클러스터의 일부를 형성하는, 4중 축에 가까이 위치된 분명한 술페이트 이온과 배위 결합된다 (도 5). 하기의 침강 평형 데이타를 기반으로 발명자는 이러한 회합이 결정화의 오류라고 결론내렸다.
Con-Ins G1의 소수성 코어는 잔기 ValA2, CysA6, CysA11, PheA16, TyrA19, ArgB6, IleB11, TyrB15 및 LeuB18의 측쇄를 포함한다 (도 4b). 이들 중에서, 3개는 인간 인슐린과 동일하고 (CysA6, CysA11 및 TyrA19), 3개는 보존적으로 상이하며 (ValA2→Ile, IleB11→Leu 및 LeuB18→Val), 3개는 현격하게 상이하다 (ArgB6→Leu, PheA16→Leu 및 TyrB15→Leu). hIns에서, Con-Ins G1 내 TyrB15의 등가물인 LeuB15는 부분적으로 코어에 대해 팩킹되어 있고 부분적으로는 hIns PheB24의 측쇄에 대해 팩킹되어 있으며, Tyr에 의한 치환은 hIns B24의 등가물의 부재 하에서 Con-Ins G1 단량체의 노출된 소수성 표면을 어느 정도 감소시킨다. hIns LeuA16과 비교하여 Cons-Ins G1 PheA16의 보다 큰 측쇄는 TyrB15의 전하와 회합되는 것으로 보이며, TyrB15의 측쇄는 이의 hIns 대응부와 비교하여 단백질의 코어로부터 훨씬 더 멀리 있어서, (더 큰) PheA16 방향족 고리가 팩킹에서 이를 보상한다 (도 4b).
실시예 5 - 상동성 모델링 및 분자 역학
핵심 수용체-관여 잔기 hIns PheB24의 등가물의 부재 하에서 척추동물 인슐린 수용체에 대한 Con-Ins G1 활성을 가능하게 하는 구조적 원리에 대한 통찰력을 얻기 위해서, 발명자는 호르몬을 위한 주요 결합 부위를 형성하는 인간 인슐린 수용체 (hIR)의 요소에 결합된 Con-Ins G1 모델을 만들었다. IR L1-CR 모듈 (잔기 Gly5 내지 Lys310) 및 IR αCT 절편 (IR-A 이소폼의 잔기 Phe705 내지 Ser719)과의 복합체로의 Con-Ins G1의 모델은 Con-Ins G1의 상기 결정 구조, hIns와의 복합체로의 IR 부위 1 성분의 결정 구조 (PDB 등재 4OGA; Menting et al. 2014), 및 인슐린의 A-사슬의 NMR 구조 (PDB 등재 2HIU; Hua et al. 1995)를 주형으로 하여 MODELLER (v9.15) (Webb and Sali, (2014))을 사용해 생성시켰다. 모든 모델은 각각의 IR 잔기 Asn16, Asn25, Asn111, Asn215 및 Asn255에서 단일 N-연결 N-아세틸-D-글루코사민 잔기 및 Con-Ins G1의 번역후 변형을 포함하였다 (Sparrow et al. 2008).
분자 역학 (MD) 시뮬레이션은 CHARMM36 역장 (Guvench et al. 2011; Best et al. 2012)을 사용하여 GROMACS (v5.0.4) (Pronk et al. 2013)를 적용하였고 최저 모델러 목적 함수를 갖는 Con-Ins G1 / IR 복합체의 모델을 사용해 개시하였다. 카복시-글루탐산을 포함한 이온화가능한 잔기는 그들의 전하 상태인 것으로 가정하였다. 각 시스템은 모든 원자를 모든 원자보다 10Å 이상으로 연장한 큐빅 박스에서 TIP3P 물 모델을 사용해 용매화되었다. 소듐 및 클로라이드 이온이 첨가되어 시스템을 중화시켰고 0.1 M의 최종 이온 강도가 제공되었다. 단백질 및 용매 (이온 포함)는 0.1 ps의 커플링 시간으로 인가된 300 K의 온열 배쓰에 대해 재축적되는 속도로 개별적으로 커플링되었다. 모든 시뮬레이션은 10Å의 단일 비결합 컷-오프로 수행되었고 25 스텝 (50 fs)의 근접원자-목록 업데이트 빈도로 Verlet 근접원자 탐색 컷-오프 계획을 적용하였으며, 모든 시뮬레이션에서 사용된 시간 스텝은 2 fs였다.
주기적 경계 조건이 1.2Å의 격자 너비 및 6차 스플라인 보간법을 적용하여, 원거리 정전기학을 설명하는데 사용되는 입자-메쉬 Ewald 방법과 함께 사용되었다. 모든 결합 길이는 P-LINCS 알고리즘을 사용하여 제한하였다. 시뮬레이션은 초기 최소화와, 그 이후에 모든 단백질 원자를 제한하는 50 ps의 MD로 이루어졌다. 위치-제한된 MD 이후에, MD 시뮬레이션은 αCT의 C-말단 잔기 (잔기 Val715 내지 Ser719)를 제외하고 IR의 Cα 원자 상에서 위치 제한을 적용하는 추가 10 ns 동안 계속되었다. Cα 원자-제한된 MD 이후에, 시뮬레이션은 추가 50 ns 동안 제한없이 계속되었다. 최종 모델의 좌표는 부록 II에 제공된다.
TyrB15
모델에서 출현된 특징은 Con-Ins G1 TyrB15의 측쇄가 hIR αCT 잔기 Phe714와의 입체 충돌을 피하기 위해 이러한 결정 구조에서 이의 입체형태에 대해 회전한다는 것이다. 회전은 Con-Ins G1 TyrB15의 측쇄를 수용체 복합체에서 hIns PheB24에 의해 점유된 포켓으로 유도하며, 따라서 Con-Ins G1 TyrB15가 수용체 관여 관점에서 hIns PheB24에 대한 대리자라는 것을 시사한다 (도 6). TyrB15 측쇄의 이러한 회전은 또한 핵심 hIR αCT 잔기 Phe714를 독액 단백질 코어에 관여할 수 있게 한다 (도 6). 대조적으로, 척추동물 인슐린은 위치 B15에 류신을 가지는데, 이것은 엄격하게 보존된다.
TyrB20
Con-Ins G1 TyrB20의 측쇄는 Con-Ins G1 TyrB15의 것에 인접하고 또한 hInsPheB24의 등가물의 결여를 보상하는데 관여될 수 있다. TyrB15 측쇄와 연관된 결정학적 편차 전자 밀도가 어느정도 불충분하게 정의되고, 이러한 이동성과 양립될 수 있다는 것에 주목한다 (도 7). 대조적으로, 척추동물 인슐린은 위치 B20에 글리신을 가지며, 이것은 엄격하게 보존된다.
PTM
Con-Ins G1은 하기의 2종의 번역후 변형 (PTM)을 함유한다: 잔기 A4 및 B10은 hIns의 Glu 및 His (개별적으로)와 대조적으로 γ-카복시글루타메이트 (Gla)이고, 잔기 B3은 hIns의 Asn과 대조적으로 하이드록시프롤린 (Hyp)이며, A-사슬 C-말단 잔기 CysA20은 아미드화되고 (도 1); Con-Ins G1 B-사슬 번호매김은 hIns와 비교가능하도록 -1에서 시작된다는 것을 주의한다. 이러한 변형은 코노톡신에서 통상적으로 관찰되지만 이전에 인슐린에서는 검출되지 않았다 (Safavi-Hemami et al. 2015). PTM을 함유하는 Con-Ins G1의 합성 유사체는 PTM-무함유 유사체보다 인간 IR-B에 대해서 4배 더 활성이고 (도 2) PTM-무함유 유사체보다 8배 더 큰 효율로 Akt 인산화를 유도한다 (도 3).
Con-Ins 구조내 4종 PTM의 조사는 CysA20의 아미드화를 제외하고, 전부가 Con-Ins G1의 구조를 안정화시키는데서 역할을 한다는 것을 밝혀준다. GlaA4의 양쪽 측쇄 카복실레이트는 hIns GluA4의 단일한 측쇄 카복실레이트처럼, GlyA1의 N-말단 아미노 기와 극성 상호작용한다 (도 4c). Con-Ins G1에서 이들의 추가적인 상호작용은 짧은 A-사슬 N-말단 나선을 안정화시키는 것을 보조할 수 있다. GlaB10의 하나의 측쇄 카복실레이트 기는 CysB7의 골격 아미드와 수소 결합을 형성하고 B-사슬 N-말단 영역을 안정화시키는데서 역할을 할 수 있으며, hIns에서는 등가의 상호작용이 존재하지 않고, hIns HisB10은 육량체 형성에 관여한다 (도 4d). HypB3의 측쇄 하이드록실 기는 hIns AsnB3의 측쇄 아미드 산소와 동등하게 위치되며 SerA12의 골격 아미드와 (긴) H-결합을 형성할 수 있다 (도 4e). CysA20의 C-말단 아미드는 독액 단백질의 나머지 부분과 상호작용하지 않는다.
실시예 5에 제시된 모델 내에서, 수용체와 상호작용하는 유일한 PTM 잔기는 GlaB4이고, 이의 상호작용은 hIns GluB4 및 αCT Asn711 간의 것과 등가이다 (도 8).
실시예 6 - hIns G1 DOI L15Y.G20Y 신호전달 활성화
인슐린 신호전달을 유도하는 hIns[DOI] 및 hIns[TyrB15, TyrB20, DOI]의 능력은 상기 기술된 바와 같이 Akt 인산화 분석으로 평가하였다. 간략하게, pAkt Ser473 수준은 인간 IR-B를 과발현하는 마우스 섬유아세포주, NIH 3T3에서 측정하였다. 세포주는 10% 태아 소 혈청 (FBS), 100　U/mL 페니실린-스트렙토마이신 및 2 μg/mL 푸로마이신이 포함된 DMEM에서 배양되었다. 어세이를 위해서, 웰 당 40,000 세포를 1% FBS를 함유하는 배양 배지가 포함된 96웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에, 50 μL의 인슐린 용액을 본래 배지를 제거한 이후에 각 웰에 파이펫팅하여 넣어주었다. 30분 처리 후, 인슐린 용액을 제거하였고 HTRF pAkt Ser473 키트 (Cisbio, Massachusetts, USA)를 사용하여 pAkt Ser473의 세포내 수준을 측정하였다. 간략하게, 세포는 먼저 약한 진탕 하에서 1시간 동안 세포 용해 완충액 (웰 당 50 μL)으로 처리하였다. 다음으로, 16 μL의 세포 용해물을 흰색 384-웰 플레이트 중 4 μL의 검출 시약에 첨가하였다. 4시간 인큐베이션 이후에, 플레이트는 Synergy Neo 플레이트 판독기 (BioTek, Vermont, USA)에서 판독하였고 데이타는 제조사의 프로토콜에 따라 처리하였다. 어세이는 총 4회 반복하였다. EC50 값은 비선형 회귀 (1-부위) 분석과 곡선-적합화시켜 산출하였다 (Prism 6 사용).
hIns[TyrB15, TyrB20, DOI]는 Akt 인산화 어세이에서 hIns[DOI] 보다 약 5배 더 활성이 있는 것으로 확인되었다 (도 9). 본 결과는 8개 C-말단 잔기의 결여를 적어도 부분적으로 보상하는 인간 인슐린 B 사슬의 위치 15 및 20의 돌연변이의 능력을 강조한다.
실시예 7 - Con-Ins G1의 용액 특성
100 μg/mL의 용액 중 Con-Ins G1의 자가-회합 상태를 침강 평형 분석을 사용해 분석하였다. 간략하게, 분석적 초원심분리를 12 mm 경로-길이 셀의 Beckman XLI 분석용 원심분리기를 사용해 20℃에서 수행하였다. Con-Ins G1은 10 mM HCl 중 10 mg/mL 스톡으로부터 100 μg/mL의 최종 농도가 되게 10 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.4에 희석되었다. 동일 부피의 10 mM NaOH를 첨가하여 임의의 pH 변화를 중화시켰다. 100 μL의 총 샘플 부피를 사용하였다. 또한 0.2 mM ZnCl2, 2 mM CaCl2, 1 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.4) 또는 0.1 M 암모늄 술페이트를 함유하는 동일한 샘플을 제조하였다. 방사상 농도 분포를 220 nm의 흡광도로 측정하였다. 침강 평형은 1시간 간격으로 순차적 흡광도 스캔을 통해 평가하여 30,000 및 45,000 rpm에서 확립하였다. 양쪽 속도에서의 데이타는 SEDNTERP (Laue et al. 1992)를 사용하여 조성물로부터 추정된 용매 부분 비부피 및 용액 밀도의 값을 사용해 SEDPHAT (Houtman et al. 2007)에서 단일한 이상적인 침강 종에 대해 함께 적합화시켰다. 디술피드를 제외하고, 모든 번역후 변형은 Con-Ins G1 부분 비부피의 추정에서 무시하였다. 기록된 오차는 SEDPHAT에서 실행되는 Monte Carlo 시뮬레이션으로 추정된, 0.68 신뢰 수준으로 적합도의 정밀성을 설명한다.
데이타 (30,000 및 45,000 rpm에서 수득)는 모두 Con-Ins G1이 겉보기 MW 5380 ± 55 g/mol의 단일 침강 종이라는 것을 충분히 설명해 준다 (도 10). 적합도가 우수하지만 (감소 χ2 = 0.95), 최고-적합도 질량은 예상보다 약간 높다. 아마도 이것은 본 발명자가 번역후 변형 존재를 무시하고, 아미노산 조성물로부터 결정한, 단백질 부분 비부피의 부정확한 추정치를 반응하는 것인 듯 하다. 그러나 예측된 질량에서 이러한 증가는 소량의 고분자량 종이 존재하는 결과일 수도 있다. 많아봐야 이것은 5%의 이량체 Con-Ins G1의 존재와 동일할 것이다. 5143의 산출된 이론적 질량을 기반으로, 본 발명자는 Con-Ins G1이 용액 중에서 주로 단량체라고 결론지었다. 그러므로 Con-Ins G1의 단량체 성질은 인슐린의 올리고머화에 핵심적인 것으로 나타난, 인간 인슐린 사슬 B의 C-말단 부분 (아미노산 B22-B30)의 등가물의 결여와 일치한다.
본 발명자는 또한 Zn2+, Ca2+, SO4 2- 또는 PO4 3- 가 Con-Ins G1의 응집 상태를 변경시키는지 여부를 시험하였는데, 특히 Zn2+ 의 경우에는 hIns에 대한 것처럼 이 이온이 Con-Ins G1 다량체화를 매개할 수 있는지 여부를 시험하였고, SO4 2- 의 경우에는 이 이온이 결정에서 관찰된 사량체 배열을 매개하는데 관여하는지 여부를 시험하였다. 이들 각각의 개별 이온의 존재 하에서 단일한 침강 종에 의해 균등하게 충분히 설명되는, 유사한 침강 평형 프로파일이 관찰되었고 겉보기 MW에서 유의한 변화는 존재하지 않았다 (데이타는 도시하지 않음). 따라서, 본 발명자는 Con-Ins G1이 적어도 최대 100 μg/mL의 농도에서, 각각의 이들 이온의 존재 하에서 주로 단량체로 남아있는다고 결론지었다.
실시예 8 - 수용체의 주요 호르몬 결합 부위를 재구성한 인간 인슐린 수용체 단편과 복합체로의 Con-Ins G1의 결정 구조
결정화 및 데이타 수집.
인간 인슐린 수용체 (hIR)의 주요 인슐린 결합 부위 ("부위 1")는 부위 1과 인슐린 또는 인슐린 유사체의 상호작용에 관한 결정학적 분석을 위해 적합화되고 최소화된 도메인으로 재생성시킬 수 있다 (Menting et al. 2013) (Lawrence et al. 2016). 이 과정에 필수적인 것은, 결정화를 보조하기 위한 수용체 단편의 CR 도메인에 단일클론 항체 83-7 (Soos et al. 1986)의 단편의 추가적인 부착이다. 이 기술은 hIR 부위 1을 재생성시키는 요소와의 공동-복합체로의 Con-Ins G1의 결정을 생성시키는데 사용되었다.
Con-Ins G1은 실시예 1에 기술된 바와 같이 합성하였다. Con-Ins G1은 10 mM HCl에 재현탁시켰다.
hIR 구성체 IR310.T (즉, hIR의 잔기 1-310와 이어서 트롬빈 절단 부위의 N-말단의 나머지 Leu-Val-Pro-Arg 및 개체군 변이체 Tyr144His 포함)를 문헌 [Menting et al. 2013]에 기술된 대로 제조하고 정제하였다. 단일클론 항체 83-7의 가변 도메인 모듈, Fv83-7 (Soos et al. 1986)은 문헌 [Lawrence et al. 2016]에 기술된 대로 제조 및 정제하였다. 다음으로 IR310.T은 Fv83-7와 복합체를 형성하였고 그 복합체는 문헌 [Lawrence et al. 2016]에 기술된 대로 정제하였다. 다음으로 Fv83-7.IR310.T 복합체에 대해서 문헌 [Lawrence et al. 2016]에 기술된 대로 엔도글리코시다제 H 처리를 수행하였다.
hIR의 A 이소폼의 펩티드 IR-A704-719 는 Genscript (USA)와의 계약 하에 합성하였다.
수용체의 주요 호르몬 결합 부위를 재구성한 인간 인슐린 수용체 단편과의 복합체로의 Con-Ins G1은 표 2에 표시한 바와 같이 EndoH-처리된 Fv83.7.IR310.T, IR-A704-719 및 Con-Ins G1을 조합하여 제조되었다.
표 2: 인간 인슐린 수용체 단편과의 복합체로의 Con-Ins G1의 제조
Figure pct00004
초기 결정화 시험은 CSIRO 협동 결정화 센터 (Parkville, Australia)에서 수행된 로봇식 576-조건 희소-매트릭스 시팅-드롭 스크린을 적용하였다. 각각의 액적은 1:1 웰:복합체 부피 비율을 함유하였다. 결정 성장은 1.8 내지 2.0 M 암모늄 술페이트 또는 1.8 내지 2.0 M 암모늄 술페이트와 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5; MOPS-NaOH pH 7.0 및 MES-NaOH, pH 6.5 중 어느 하나를 사용하여 관찰하였다.
결정화 조건을 최적화하였고 동일한 단백질:펩티드:Con-Ins G1 혼합물의 단일 결정은 1.8 내지 2.0 M 암모늄 술페이트 또는 1.8 내지 2.0 M 암모늄 술페이트, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5로 이루어진 리저버 완충액 및 Linbro 24 플레이트에서 행잉 드롭 방식을 사용해 성장시켰다. 다른 완충액 (예를 들어, MOPS-NaOH pH 7.0 및 MES-NaOH, pH 6.5)이 또한 시도되었고 유사하게 회절된 결정이 생성되었다. 1.7 M 암모늄 술페이트, 50 mM MOPS-NaOH pH 7.0의 용액에서 성장된 단일 결정이 최고의 회절 데이타를 제공하였다.
IR-A704-719 및 EndoH-처리된 Fv83.7.IR310.T 복합체와 공동-복합체로의 Con-Ins G1의 단일 결정은 30% 글리세롤이 첨가된 리저버 완충액으로 이루어진 용액으로 운반하고 냉동-루프로 추출하여 냉동-보호하였다. 이어서 루프를 직접 액체 질소 배쓰에 집어넣었다. 3.25Å 분해능에 대한 회절 데이타는 오스트레일리안 싱크로트론 (Melbourne, Australia)의 빔라인 MX2에서 수집하였다. 데이타는 XDS 패키지 (Kabsch, 2010)를 사용하여 통합 및 병합하였다. 데이타 처리 통계는 표 3에 표시되어 있다. 공간군은 I222이고 유닛 셀 치수는 a = 106.16, b = 227.12 및 c = 228.70Å이었다. 비대칭 유닛 당 2개 복합체 및 복합체 당 63440 Da의 겉보기 분자 질량으로부터, 용매 함량은 77%로 추정된다.
구조 해석 및 정밀화
구조는 PDB 등재 4OGA (Menting et al. 2014)의 단일 Fv83-7.IR310.T 성분을 검색 모델로 적용하여, PHASER (McCoy et al. 2007)을 사용해 분자 치환에 의해 해석하였다. 2개 카피가 비대칭 유닛으로 위치되었다. Con-InsG1의 2개 카피 (IR의 2개의 개별적인 L1+IR-A704-709 단편에 별개로 결합됨)에 상응하는 전자 밀도는 편차 전자 밀도 맵으로 가시화되었다. 다음으로 Con-Ins G1의 잔기가 전자 밀도로 객관적으로 구축되었다. X-선 결정학 정밀화는 PHENIX (Adams et al. 2010)를 적용하였다. 정밀화의 최종 단계는 TLS 정밀화, 제한된 개별 B-계수 정밀화 및 비틀림 NCS 제한을 포함한다. 최종 정밀화 통계는 표 3에 표시되어 있다. 최종 모델에는 표 4에 상술된 잔기들이 포함되었다.
표 3: X-선 데이타 프로세싱 및 정밀화 통계학
Figure pct00005
Figure pct00006
a 괄호안의 수는 외부 분해능 쉘을 의미한다.
b 데이타는 p=0.001의 유사성 수준에서 CC 1/2 상관 통계가 유의한 채로 남아 있는 최대 분해능에 포함시켰다.
표 4: Fv83-7.IR310.T 및 IR-A704-719 와 복합체로의 Con-Ins G1의 최종 모델에 포함된 잔기. 최종 모델은 비대칭 유닛으로 복합체의 2개 카피 (복합체 1 및 복합체 2)를 함유한다.
Figure pct00007
실시예 9 - 인간 인슐린 수용체 단편과의 복합체로의 Con-Ins G1
결정학적 비대칭 유닛 내 복합체의 2개 카피는 전체 구조의 오직 제한된 편차만을 보여주었고 (도 11) 따라서 여기서의 설명은 복합체 1에 제한될 것이다.
Fab83-7.IR310.T 및 IR-A704-719 (PDB 등재 4OGA; Menting et al. 2014)와의 공동-복합체로의 hIns의 결정 구조와 Con-InsG1 복합체의 결정 구조의 오버레이가 도 12에 제공되어 있다. 인간 인슐린 수용체 단편과 복합체로의 Con-Ins G1의 전체 구조는 IR310.T, IR-A704-719 및 Fab 83-7과 복합체를 형성한 hIns의 구조 내 균등한 하부 구조와 유사하다. 두드러진 차이는 Con-InsG1 복합체의 경우 해석가능한 전자 밀도가 Con-Ins G1 B7의 N-말단 3개 잔기에 대해 분명했다는 것이다. 따라서 최종 모델은 Con-Ins G1 잔기 B4, B5 및 B6을 포함한다. 대조적으로 인간 인슐린 공동-복합체 구조에서, hIns의 B 사슬은 잔기 B7로부터 C-말단 방향쪽으로만 모델링될 수 있었다.
도 13은 Con-Ins G1의 잔기 TyrB15에 집중시킨, IR310.T, IR-A704-719 및 Fab 83-7과 복합체를 형성한 인간 인슐린의 것과 여기서 결정된 Con-Ins G1 복합체 구조의 오버레이를 보여준다. 분명하게, TyrB15의 측쇄는 이의 수용체-무함유 위치로부터 인간 인슐린 복합체에서 hIns PheB24에 의해 점유되는 것과 동일한 위치로 위치되게 회전된다. 복합체 구조는 TyrB15가 PheB24의 결여를 보상하는데 도움이 된다는 실시예 5의 결론을 뒷받침한다. Con-Ins G1 TyrB20에 대해 해석가능한 전자 밀도는 존재하지 않는다.
실시예 10 - 인간 인슐린 수용체의 주요 결합 부위 (부위 1)를 포함하는 성분과 hIns[DOI], hIns[TyrB15, DOI] 및 hIns[TyrB20, DOI]의 분자 모델링
IR L1 도메인 (잔기 Gly5 내지 Cys155) 및 IR-A705- 714 와의 복합체로의 데스-옥타-인슐린 (hIns[DOI]: B 사슬의 8개 C-말단 잔기가 결여된 인간 인슐린)의 모델은 인간 인슐린 (hIns)과 복합체를 형성한 IR 부위 1 성분의 결정 구조 (PDB 등재 4OGA; Menting et al. 2014) 및 인슐린의 A 사슬의 NMR 구조 (PDB 등재 2KJJ)를 사용하여 MODELLER (v9.16) (Webb & Sali, 2014)에 의해 생성되었다. 모든 모델은 각각의 IR 잔기 Asn16, Asn25 및 Asn111에서 단일한 개별적인 N-연결된 N-아세틸-D-글루코사민의 번역후 변형을 포함하였다.
분자 역학 (MD) 시뮬레이션은 최저 MODELLER 목적 함수를 갖는 hIns[DOI]-IR 복합체의 모델에 의해 개시되는, CHARMM36 (Guvench et al. 2011; Best et al. 2012) 역장의 변형된 버전 및 GROMACS (v5.1.2) (Abraham et al. 2015) 프로그램 세트를 사용해 수행되었다. 각각의 시스템은 모든 축을 따라서 주기적 경계 조건을 사용하고 모든 원자보다 10Å 이상 연장되는 TIP3P 단일 지점 물 모델 용매화 큐빅 박스에 위치시켰다. 이온화가능한 잔기는 그들의 전하 상태인 것으로 가정하였고 0.1 M의 최종 이온 강도는 시스템을 중화시키고 충분한 소듐 및 클로라이드 이온을 첨가하여 수득하였다. 속도 재축척 (Bussi et al. 2007), 300 K의 온도조절장치에 대해 독립적으로 커플링되는 단백질 및 용매와 2개 그룹으로 온도 커플링을 수행하였고, 양쪽 그룹은 0.1 ps의 시간 상수를 이용하였다. 등방성 압력 커플링은 1 bar의 기준 압력 및 0.5 ps의 시간 상수를 사용하여 Berendsen (Berendsen et al. 1984) 기술에 의해 실행하였다. 모든 시뮬레이션은 일반적인 12Å 비결합 상호작용 컷오프와, 1.0Å의 격자 너비 및 6차 스플라인 보간법에 의한 입자-메쉬 Ewald 방법 (Essmann et al. 1995)을 사용하여 설명되는 원거리 정전기학에 의해 수행되었다. Verlet 근접원자 탐색 컷-오프 계획은 25 스텝 (50 fs)의 근접원자-목록 업데이트 빈도로 적용되었고, 모든 시뮬레이션에서 사용된 시간 스텝은 2 fs였다. 모든 결합 길이는 P-LINCS 알고리즘 (Hess, 2008)으로 제한하였다. 시뮬레이션은 초기 최급 강하 최소화를 겪은 후에 모든 단백질 원자를 제한하는 50 ps의 MD가 후속되었다. 위치 제한된 MD 이후에, MD 시뮬레이션은 추가 100 ns 동안 계속되었다.
수용체와 인슐린 유사체 상호작용의 분석은 100 ns MD 이후에 FoldX 프로그램 세트 (Schymkowitz, et al. 2005)를 사용해 수행하였다. FoldX RepairPDB 유틸리티를 사용하여, 구조가, hIns[DOI]의 각 부위에서 결과적인 돌연변이 ΔΔG 기여도를 나타내는, 위치 스캔을 수행하기 이전에 타당하지 않은 뒤틀림각 또는 반 데르 발스 충돌을 갖지 않도록 보장하였다.
데스-옥타-인슐린 (hIns[DOI])
hIns[DOI]에 의한 상호작용은 수용체와 천연 hIns의 X-선 결정 구조 (PDB 등재 4OGA)에서 관찰되는 수용체와 인슐린 사이의 계면에서 유사한 상호작용을 보존하며, 특히 상호작용은 B 도메인 잔기 ValB12, LeuB15 및 수용체 잔기 Asn15, Leu37, Phe39, 및 Phe714에 의해 생성되는 소수성 포켓 내에서 일어났다. B-사슬 C-말단 잔기의 부재는 그 결과로 B-사슬 나선이 더 이상 꼬이지 않아서, ArgB22 및 GluA17 사이에 일시적인 염 브릿지가 형성된다. 이것은 또한 B 사슬 나선이 IR-L1에 더 가깝게 이동할 수 있게 하고, 그 결과로 TyrB16 및 IR-L1 Tyr67 간에 π-π 평행 이동 적층이 일어난다. 최종 모델은 도 14에 도시되어 있다.
데스-옥타-인슐린-TyrB15 (hIns[TyrB15, DOI])
100ns 시간 기간에 걸쳐 hIns[TyrB15, DOI]에 의해 관찰된 상호작용은 hIns[DOI]에 의한 것과 유사하다. B-사슬 나선은 TyrB16 및 IR-L1 Tyr67 간의 유사한 π-π 적층과 함께 IR L1 도메인에 더 가까운 이동을 반영한다. C-말단 B-사슬 잔기의 유연성은 유사하게 ArgB22 및 GluA17 사이의 일시적 염 브릿지를 가능하게 한다. B15 위치에 Tyr의 존재는 hIns LeuB15에 의해 점유되는 것과 달리 DOI-(IR-A704-719)-L1 계면 점유 공간의 소수성 코어로 돌출된다. 최종 모델은 도 15에 도시되어 있다.
데스-옥타-인슐린-TyrB20 (hIns[TyrB20, DOI])
초기 비교 모델은 TyrB20가 hInsB24 결합 부위를 점유하는 것을 보장하기 위한 제한을 포함하였다. 100 ns의 MD 이후에 TyrB20은 hIns B24 결합 부위에 남아있었고, 수용체와의 모든 다른 상호작용은 천연과 유사하게 나타났다. hIns[DOI]와 달리, TyrB16 및 IR L1 Phe39 사이의 천연 π-π 평형 이동 적층은 유지되었지만, ArgB22 및 GluA17 사이의 B-사슬 C-말단 잔기의 결여로 야기되는 염 브릿지는 hIns[DOI]에서 관찰된 것과 동일하였다. 최종 모델은 도 16에 도시되어 있다.
FoldX 돌연변이 위치 스캔 분석
FoldX 위치 스캔 유틸리티는 돌연변이를 수용할 수 있는 hIns[DOI] 내 위치, 및 그렇지 않은 위치에 대한 정성적 해석을 제공한다 (도 17, 18 및 19). hIns[DOI] 및 hIns[TyrB20, DOI] 내에서, A 사슬 내 용매-노출된 잔기, 특히 잔기 GluA4, GlnA5 및 ThrA8은 대부분의 돌연변이에 대해 적은 순수 긍정 또는 부정 효과를 나타낸다. 이것은 대신 이들 잔기의 돌연변이에 대한 긍정적 영향을 제안하는 hIns[TyrB15, DOI] 유사체와는 상이하다. 상호작용 면에서 소수성 코어 내에 발생된 돌연변이는 놀랍지도 않게 모든 모델에서 상당한 효과를 시사하는 것으로 보이고, 디술피드 결합된 시스테인을 제안한 모든 모델은 상당한 ΔΔ G 장점을 겪을 수 있었지만 이 데이타는 유사체의 전체 구조에 대해 갖는 디술피드 상호작용의 중요성으로 인해 제거되었다. 잔기 TyrA14, AsnA18, HisB5 및 GluB21에서의 돌연변이는 DOI-TyrB20 유사체에서 이들 위치의 돌연변이가 유리하다는 것을 의미하였고, 그들이 DOI 유사체에 존재하지 않는 경우는, 보다 호의적인 상호작용을 의미한다. 그러나 DOI-TyrB15 유사체는 DOI 및 DOI-TyrB20의 결과의 혼합과 유사한 결과를 제공하여, HisB5를 제외하고, 모든 부위에서 단지 소수의 차이를 시사하였다. 위치 AsnB3 및 GlnB4의 돌연변이는 그 반대를 의미하지만, 이것은 아마도 이러한 프레임에서 B 사슬 나선에 근접한 B 사슬의 배향에 기인한 듯하고, 그러므로 샘플추출 기술의 오류이다.
결론
IR L1 도메인 및 IR-A705- 719 와의 복합체로의 hIns 유사체, hIns[DOI], hIns[TyrB15, DOI] 및 hIns[TyrB20, DOI]의 MD 시뮬레이션, 및 후속 돌연변이 분석은 핵심 수용체 관여 잔기, 특히 PheB24의 결여에도 불구하고 hIns[DOI] 결합 방법에 관한 통찰력을 제공한다. 시뮬레이션은 위치 B20의 티로신 치환이 대략 동일 위치를 점유하는, PheB24에 대한 대체물로서 작용할 수 있으며, 시뮬레이션된 시간 동안 안정하다는 것을 나타낸다. 인슐린 수용체 단편과 상호작용하는 hIns[DOI] (PheB24가 결여되고 B15 또는 B20에서 돌연변이에 의해 이를 대체하려는 임의 시도 없음)의 시뮬레이션은 이의 관여가 hIns와 IR L1 및 IR-A705-719 에 의한 것과 전체적으로 유사하지만 IR L1 도메인 및 유사체 B 사슬 사이의 부위에서 약간의 차이가 있다는 것을 보여준다. IR L1 도메인쪽으로 B 사슬의 이동은 발생할 수 있는 입체 충돌로 인하여 hIns[TyrB20, DOI] 복합체에서는 관찰되지 않지만, hIns[TyrB15, DOI]에서는 관찰되어, B20의 치환의 영향이 B15에서의 것과는 다르다는 것을 시사한다. 돌연변이 FoldX 산출법은 유사하게 호의적인 돌연변이가 B20 돌연변이시 결합 상태의 최종적 변화에 의해 영향받지 않는 부위에 존재하고, 이들 차이는 소수성 코어에서 먼 쪽에 위치된다는 것을 시사한다.
실시예 11 - 단량체 인간 인슐린 유사체의 개발
신규 인슐린 유사체의 연구 전략
본 명세서에 기술된 바와 같이, 포식성 달팽이의 독액 중 단량체 인슐린 변이체 (Con-Ins-G1)의 최근 발견은 개시된 펩티드를 뒷받침하여 연구를 추진하는데 도움을 주었다. Con-Ins-G1이 어떻게 이량체화를 피하여 수용체 결합 및 인슐린 신호전달을 유지하여서, 매우 신속하게 작용하는지를 설명하는 방법이 개발되었고 데이타가 수집되었다. 더 나아가서, 기초적인 발견으로부터의 통찰력을 이용하여 4개 아미노산 위치만 인간 인슐린의 서열과 상이하지만, 단량체이고 속효성이며, 정식 인간 인슐린과 비슷한 역가를 나타내는 단백질을 개발하였다.
Con-Ins-G1의 연구로 얻은 통찰력을 사용하여 인간 "단축" 단백질로부터 오직 4개 아미노산 치환을 보여주는 단량체 인간 인슐린을 개발하였다.
인간 인슐린 구조의 제한을 피하기 위해서, 자연계로부터 해결책을 얻었다: 어류-사냥 청자고둥, 코너스 지오그라퍼스는 수 초 내에 어류에서 마비성 저혈당 쇼크를 유도하는 그들의 독액으로부터 특수화된 인슐린의 사용을 진화시켜왔다. 독액 인슐린, Con-Ins-G1의 서열은 게놈 시퀀싱 및 질량 분광법의 조합을 사용해 밝혀졌다 (도 1). 특히, 4종의 번역후 변형이 관찰되었다: A4 Glu 및 B10 Glu가 감마카복시글루탐산, Gla로 변형; B3 Pro가 2-하이드록실프롤린으로 변형, 및 A-사슬 상의 C-말단 아미드. 이러한 독액 인슐린의 낮은 존재비로 인하여, 동물로부터 단리할 수 없다. 대신, 합성의 용이함을 위해, 디셀레늄-결합으로 A 사슬의 분자내 디술피드 결합을 치환한, 합성 유사체 (sCon-Ins-G1)를 수득하였다. sCon-Ins-G1은 어류에 주사되면 저혈당 쇼크를 유도하고, 물에 존재할 때 어류 운동성을 둔화시킨다. 어류에 대한 이의 효과 이외에, Con-Ins-G1의 가장 특별한 특성은 "단축된" B 사슬을 갖는 지금까지 보고된 가장 짧은 인슐린 분자라는 것이다. 단축된 인간 인슐린 (데스-옥타펩티드 인슐린, DOI)이 단량체이기 때문에, 이는 Con-Ins-G1가 단량체이고 UFI (초속효성 인슐린)로서 사용될 수 있다는 것을 의미한다. Con-Ins-G1은 인간 인슐린에서 인간 인슐린 수용체 (hIR)와의 결합에 관여되는 2개 절편이 결여되어 있다: 첫번째, 인간 인슐린의 A21 Asn는 hIR 결합 부위 1과 접촉하고 이의 제거는 결합 친화성의 100배 감소를 초래한다. 두번째, 방향족 트리플렛 (B24-B26)은 hIR 결합 부위 1에서 접촉을 통해서 인간 인슐린이 hIR 결합에 결합하게 하는 한 요소이다. 이들 잔기의 제거는 친화성의 1,000배 감소를 초래한다.
이들 우려에도 불구하고, Con-Ins-G1 (셀레늄 유사체 대신)을 화학적으로 합성하였고 인간 인슐린보다 단지 30배 덜한 친화성으로 hIR에 결합한다는 것을 발견하였다. 이러한 놀라운 결과는 다음의 핵심 질문을 제기하였다: 인간 인슐린이 이용하는 핵심 방향족 잔기없이 Con-Ins-G1은 어떻게 hIR에 결합하는가? Con-Ins-G1의 구조는 인간 인슐린과 거의 동일한 골격을 나타내는 것으로 확인되었다. Con-Ins-G1 구조를 공개된 인간 인슐린-hIR 공동-구조에 적합화시킴으로서, Con-Ins-G1 B15 Tyr 및 B20 Tyr (인간 인슐린의 Leu 및 Gly)이 인간 B24 Phe가 수행하는 역할을 대신하여 인간 IR과 상호작용하는 것으로 추론되었다. 이들 강력한 결과는 달팽이 인슐린 구조를 기반으로 인간 단량체 UFI를 개발하기 위한 합리적인 기준을 제공한다.
치료적 선도체로서 인간 단량체 인슐린 유사체의 개발.
초속효성 인슐린 (UFI)의 개발은 인슐린 유사체 개발에서 다음의 주요한 진보를 나타낸다. 인간 인슐린을 재디자인하는데 있어 근본적인 도전은 수용체 결합에 관여하는 동일한 잔기가 또한 이량체 형성을 매개한다는 것이다. 따라서, 독액 인슐린 Con-Ins-G1의 발견은 이것이 이들 잔기가 결여 (따라서 이량체화하지 않음)되어 있지만 인슐린 수용체에 결합하여 활성화시키는 능력은 유지하기 때문에 단량체, 속효성 인슐린의 생성을 위한 중요한 단계를 의미한다. 그러나, Con-Ins-G1 및 인간 인슐린 간의 낮은 서열 동일성이, 특히 당뇨병이 매일 인슐린 주사를 필요로 하는 만성 질환이라는 점을 고려하면, 면역 반응을 야기시킬 수 있다는 우려가 존재한다. 그러므로, 독액 인슐린을 기반으로 UFI를 개발하는 대신, 2 또는 3개 돌연변이를 나타내는 인슐린 유사체의 최근의 임상적 사용에서 의미하는 바와 같이, 단량체이기 때문에 그리고 이러한 절단된 인간 인슐린의 비슷한 유사체가 아마도 인간 면역계에 의해 내성일 수 있기 때문에 인간 DOI (데스-옥타펩티드 (B23-30) 인간 인슐린)의 스캐폴드로부터 출발할 수 있다. 그러나, DOI가 거의 불활성 (인간 인슐린보다 1,000배 약함)이라는 것이 도전이다. 데이타는 Con-Ins-G1가 B24 Phe의 상실을 보상하기 위해서 B15 Tyr 및/또는 B20 Tyr을 사용한다는 것을 보여주며, Con-Ins-G1의 친화성을 강화시키는 추가적인 변형을 더욱 보여준다. 이들 통찰력을 통해서, DOI가 당뇨병 치료를 위한 치료적 선도체로서 활성 UFI 유사체로 개발될 수 있다.
생체활성 단량체 인슐린으로 인간 DOI의 개발
전통적으로, DOI는 인간 인슐린의 트립신 절단을 통해 효소적으로 합성되었으나, 이것은 유사체 합성에 적합하지 않다. 그러므로, DOI에 접근하는 모듈식 합성 경로가 개발되었다. 인간 인슐린의 합성에 대한 주요한 도전은 A 사슬의 소수성 특징이다. A8-A9 Thr-Ser 상에서 이소아실 펩티드 쌍을 사용하여, 추가로 하전된 잔기 (아민)를 A 사슬에 유입시켜서 이의 가용성을 증가시켰다 (도 21). 디술피드 결합 형성 이후에, 이소아실 펩티드는 pH 8에서 O-에서 -N 아실 이동을 겪어서 DOI 서열이 생성된다. 이러한 합성 DOI는 효소적으로 합성된 DOI와 동일한 분자량 (MALDI에 의함) 및 hIR 활성화 활성을 가져서, 개발된 방법의 신뢰성을 증명한다.
Con-Ins-G1의 B15 및 B20의 2개 Tyr이 hIR 활성화에 중요한 것으로 입증되었다. 이들 2개 부위 상의 돌연변이가 hIR 활성화의 역가를 증가시킬 것이라는 가설을 시험하기 위해서, B15 Leu 및/또는 B20 Gly가 Tyr로 돌연변이된 3종의 DOI 유사체를 합성하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, B20 Tyr을 갖는 2개 유사체는 hIR 활성화에서 5배 증가된 역가를 갖는데 반해 B15 Tyr DOI 유사체는 DOI와 비슷하다. 이것은 아마도 B24 Phe의 상실의 보상에 기인하여, B20 Tyr이 단독으로 DOI의 역가를 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다. 역가를 더 증가시키기 위해서, B10 Glu를 추가적으로 나타내는 DOI 유사체를 합성하였고, B10 치환은 가장 강력한 hIR 결합을 제공한다. 이것은 B20 Tyr 단독과 비교하여 역가에 또 다른 5배 증가를 제공하였고, Con-Ins-G1과 유사한 역가를 갖는다 (도 23). 이것은 독액 인슐린으로부터의 돌연변이가 생물활성 유사체를 개발하기 위해 인간 DOI 상에 이식될 수 있다는 것을 입증한다.
인간 인슐린 수용체의 부위 1 단편과 복합체를 형성한 ConIns G1 및 Con-Ins-G1의 결정 구조는 B20 잔기에 대한 명확한 전자 밀도가 결여되어서, 이것이 유연적일 수 있다는 것을 의미한다. 또한 이 위치에서 티로신 치환체의 측쇄가 인슐린 수용체에 최적으로 관여하지 않을 수 있다는 것도 가능하다. 그러므로, Tyr 이외의 치환이 역가를 더 증가시킬 수 있다는 가설은 일련의 B10E, B20X DOI 유사체를 합성하여 시험하였고 여기서 X는 방향족 아미노산이다 (도 24A). 흥미롭게도, 거대 치환체 예컨대 인돌 (Trp) 및 비페닐 기가 hIR 활성화에서 더 높은 역가를 야기시킨다 (도 24B). 비페닐 유사체는 인간 인슐린의 역가의 10% (N10E, B20Y DOI 보다 3배 더 높음)이다. 단백질 조작 및 구조 생물학 둘 모두를 사용하는 학제간 접근법의 영향력을 입증한다. DOI의 역가는 2개 위치를 돌연변이시켜 100배까지 증가되었다. B20 상의 할로겐-치환된 나프틸 및 비페닐 기는 DOI 유사체의 역가를 더욱 최적화시키는데 사용될 수 있다.
A8 위치가 hIR 결합 부위 2와 상호작용하는데 중요하기 때문에, A8 His 돌연변이가 현행 선도 유사체에 도입될 수 있고 hIR 활성화에 대해 어세이될 수 있다. A8 His 및 A9 Arg (Con-Ins-G1 상의 본래 잔기) 둘 모두가 선도 유사체인, B10 Glu 및 B20 Tyr를 갖는 DOI 유사체에 도입되었다 (도 23). 이러한 4중 DOI 돌연변이체는 인간 인슐린의 것과 비슷한 hIR 활성화에 대한 역가를 갖는다 (도 25). Con-Ins-G1 상의 돌연변이는 IR 부위 2와의 결합을 촉진한다. X-선 결정학은 인슐린과 결합 부위 2 사이의 상호작용을 연구하는데 사용될 수 있다. B20에 대한 작업과 유사한 의약 화학 접근법을 사용하여 hIR 결합 부위 2와의 상호작용을 더욱 최적화하기 위해서 단백질 조작 노력이 A8-A10 트리플렛에 까지 확대될 수 있다. 현재, 최고 DOI 유사체는 오직 4개 잔기만 부모 인간 인슐린 서열과 달라서, 아마도 단량체 DOI 유사체의 면역원성은 임상적 사용이 FDA-승인된 인슐린 유사체와 유사할 것이다.
A8, A9, B10 및 B20 상에서의 각각의 돌연변이가 hIR 활성화의 영향에서 개별 효과를 갖는다는 것을 입증하였다 (도 26).
STZ 처리된 당뇨병 마우스 모델에서 단량체 인슐린 선도체의 평가.
강력한 단량체 인슐린 유사체를 동정한 이후에, 생체내 특성을 평가할 수 있다. 인슐린 내성 시험을 STZ-처리된 마우스에서 수행하여 생체내 포도당-저하 능력을 확인할 수 있다. UFI 유사체의 2가지 핵심 특징은 빠른 개시 및 짧은 작용 지속기간이다. UFI 유사체 혈청 수준은 이의 흡수율을 측정하기 위해 피하 주사 이후 당뇨병 마우스에서 질량 분광법과 커플링된 HPLC (LC/MS/MS)를 사용해 측정될 것이다 (대조군으로서 인슐린 Lispro를 사용). 단량체 인슐린의 경우, 이량체 인슐린 lispro와 비교하여 더 빠른 흡수율을 확인할 수 있다. 더 나아가서, 혈당 클램프 실험이 표적으로 하는 포도당 수준을 유지하는데 필요한 포도당 주입량을 결정함으로써 생체내에서 UFI 유사체의 개시 및 지속기간을 정량하는데 사용될 수 있다. 포도당 클램프 실험은 UFI 유사체가 피하 조직에서 그들의 감소된 저장소 효과에 기인하여 보다 짧아진 개시 및 작용 지속 기간을 갖는다는 것을 보여줄 수 있다. 이들 특성의 조합은 저혈당증의 위험성을 상당히 감소시킬 수 있다.
광범위하게 기술된 본 발명의 사조 또는 범주를 벗어나지 않고 특정한 구체예에서 확인된 바와 같이 본 발명에 많은 변동 및/또는 변형이 만들어질 수 있다는 것을 당업자가 이해할 것이다. 그러므로, 본 구체예는 예시로서 모든 양상에서 고려되어야 하고 제한적인 것으로 간주되지 않는다. 당업자는 단지 통상의 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물의 특정한 구체예에 대한 많은 균등물을 인식하게 되거나 또는 확인할 수 있게 될 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구항에 포괄하고자 한다.
본 명세서에서 기술되고/되거나 참조된 모든 공개물은 그들 전체를 본 명세서에 편입시킨다.
본 명세서에 포함되는 모든 문서, 행위, 재료, 장치, 물품 등에 관한 임의의 설명은 단독으로 본 발명에 대한 내용을 제공하려는 목적이다. 임의의 또는 전체의 이들 대상이 종래 기술의 일부를 형성하거나 또는 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하는 본 발명과 관련된 분야의 통상의 일반 지식이라고 인정하는 것이 아니다.
참조문헌
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Figure pct00009
부록 I: CON-INS G1 인슐린의 원자 좌표 (사슬 A 및 사슬 B)
포맷은 하기의 콜론-구분 영역을 포함한다: (1) 원자 명칭, (2) 잔기 유형, (3) 사슬 명칭,(4) 잔기 개수,(5-7) xyz 좌표,(8) 열적 B-계수.
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Figure pct00016
부록 II: 인슐린 수용체 (사슬 E, F 및 X)에 결합된 CON-INS G1 인슐린 (사슬 A 및 B) 모델의 원자 좌표
포맷은 하기의 콜론-구분 영역을 포함한다: (1) 원자 명칭, (2) 잔기 유형, (3) 사슬 명칭, (4) 잔기 개수, (5-7) xyz 좌표.
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Figure pct00048
SEQUENCE LISTING <110> The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research La Trobe University University of Utah Research Foundation <120> Insulin Analogs <130> 525952 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Val or Ala <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu, Asp, Cys or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Gln, Glu, gamma carboxyglutamate, His or Val <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys, Ala or Val <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Ser, Arg, Asn, Gly, His or Lys <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Val, Phe, His or Thr <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> Ser or Thr <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Leu, Asn, Val, Arg or Asp <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Tyr, Ala, Gln, His, Asp or Glu <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Gln, Glu or Thr <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Phe, Leu, or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Glu, Gln, Lys, Arg, Ile, Met, Thr or Ser <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys, Ser, Thr, Asn, Gln or Glu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Tyr or Phe <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Cys, selenocysteine, amidated Cys, or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala, or is absent <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Pro, Asn, Thr, Leu, Ser or is absent <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Thr, Leu, Val, Ser or is absent <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> Arg, Thr, Met, Gln, Leu or is absent <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (26)..(26) <223> Ser, Leu or is absent <220> <221> X <222> (27)..(31) <223> Ser or absent <220> <221> X <222> (32)..(32) <223> Ala, Ser or is absent <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> Ala, Val or is absent <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> Ala or is absent <400> 1 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr, Asn, Ser or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe, Ser, Asn, Thr, Gln or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Ala, Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, or His <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Ala, Thr, Pro, Asp, Val or Gly <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln or Gly <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> His, Tyr, Arg or Ile <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr or Lys <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Gly, Gln or Asp <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Ser, Leu, Gly or Pro <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu, gamma carboxyglutamate, Asp, or Asn <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile, Leu, Asp, Val or Ala <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, Ala, Pro, Val or Arg <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro or Glu <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg or Gly <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Thr, Tyr, Pro, Leu or Gly <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn or Leu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg or Thr <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Val, Leu or Lys <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, amidated Cys, selenocysteine or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Val, Tyr, Phe, His, Gly, Gln, Leu, amidated His, amidated Val or is absent <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Ser, Gly or is absent <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> Arg, Asp, Val or is absent <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> Gly, Leu, Val or is absent <220> <221> X <222> (26)..(26) <223> Phe, Val, Ile or is absent <220> <221> X <222> (27)..(27) <223> Phe, Asn, Pro, Glu or is absent <220> <221> X <222> (28)..(28) <223> Tyr, Cys, His or is absent <220> <221> X <222> (29)..(29) <223> Thr, His, Ile, Leu, Ser, Tyr or is absent <220> <221> X <222> (30)..(30) <223> Pro, Glu, Leu, Ile, Arg or is absent <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> Ile, Lys or is absent <220> <221> X <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Ser, Thr, Lys, Leu, Gln or is absent <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> Cys or is absent <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> Glu, Pro, Val or is absent <220> <221> X <222> (35)..(35) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (36)..(36) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (37)..(37) <223> Glu, Val or is absent <220> <221> X <222> (38)..(38) <223> Ala, Asp or is absent <220> <221> X <222> (39)..(39) <223> Ala or is absent <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr, Asn, Ser or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe, Ser, Asn, Thr, Gln or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, or His <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr, Pro, Asp, Val or Gly <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln or Gly <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> His, Tyr, Arg or Ile <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr or Lys <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Gly, Gln or Asp <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Ser, Leu, Gly or Pro <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu, gamma carboxyglutamate, Asp, or Asn <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile, Leu, Asp, Val or Ala <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, Ala, Pro, Val or Arg <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro or Glu <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg or Gly <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn or Leu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg or Thr <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Val, Leu or Lys <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, amidated Cys, selenocysteine or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Tyr, Phe or His <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Ser, Gly or is absent <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> Arg, Asp, Val or is absent <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> Gly, Leu, Val or is absent <220> <221> X <222> (26)..(26) <223> Phe, Val, Ile or is absent <220> <221> X <222> (27)..(27) <223> Phe, Asn, Pro, Glu or is absent <220> <221> X <222> (28)..(28) <223> Tyr, Cys, His or is absent <220> <221> X <222> (29)..(29) <223> Thr, His, Leu, Tyr or is absent <220> <221> X <222> (30)..(30) <223> Pro, Glu, Leu, Ile, Arg or is absent <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> Ile, Lys or is absent <220> <221> X <222> (32)..(32) <223> Thr, Lys, Leu, Gln or is absent <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> Cys or is absent <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> Glu, Pro, Val or is absent <220> <221> X <222> (35)..(35) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (36)..(36) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (37)..(37) <223> Glu, Val or is absent <220> <221> X <222> (38)..(38) <223> Ala, Asp or is absent <220> <221> X <222> (39)..(39) <223> Ala or is absent <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr, Asn, Ser or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe, Ser, Asn, Thr, Gln or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, or His <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr, Pro, Asp, Val or Gly <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln or Gly <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> His, Tyr, Arg or Ile <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr or Lys <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Gly, Gln or Asp <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Ser, Leu, Gly or Pro <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu, gamma carboxyglutamate, Asp, or Asn <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile, Leu, Asp, Val or Ala <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, Ala, Pro, Val or Arg <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro or Glu <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg or Gly <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn or Leu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg or Thr <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Val, Leu or Lys <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, amidated Cys, selenocysteine or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Tyr, Phe or His <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Ser, Gly or is absent <220> <221> X <222> (24)..(39) <223> absent <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr, Asn, Ser or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe, Ser, Asn, Thr, Gln or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, or His <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr, Pro, Asp, Val or Gly <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln or Gly <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> His, Tyr, Arg or Ile <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr or Lys <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu, gamma carboxyglutamate, Asp, or Asn <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile, Leu, Asp, Val or Ala <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, Ala, Pro, Val or Arg <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro or Glu <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg or Gly <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn or Leu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg or Thr <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Val, Leu or Lys <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, amidated Cys, selenocysteine or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Tyr, Phe or His <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Ser, Gly or is absent <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> Arg, Asp, Val or is absent <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> Gly, Leu, Val or is absent <220> <221> X <222> (26)..(26) <223> Phe, Val, Ile or is absent <220> <221> X <222> (27)..(27) <223> Phe, Asn, Pro, Glu or is absent <220> <221> X <222> (28)..(28) <223> Tyr, Cys, His or is absent <220> <221> X <222> (29)..(29) <223> Thr, His, Leu, Tyr or is absent <220> <221> X <222> (30)..(30) <223> Pro, Glu, Leu, Ile, Arg or is absent <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> Ile, Lys or is absent <220> <221> X <222> (32)..(32) <223> Thr, Lys, Leu, Gln or is absent <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> Cys or is absent <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> Glu, Pro, Val or is absent <220> <221> X <222> (35)..(35) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (36)..(36) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (37)..(37) <223> Glu, Val or is absent <220> <221> X <222> (38)..(38) <223> Ala, Asp or is absent <220> <221> X <222> (39)..(39) <223> Ala or is absent <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr, Asn, Ser or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe, Ser, Asn, Thr, Gln or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Asp, Gly, Pro, Leu, Phe, or His <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr, Pro, Asp, Val or Gly <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln or Gly <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> His or Tyr <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr or Lys <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu, gamma carboxyglutamate, Asp, or Asn <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile, Leu, Asp, Val or Ala <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, Ala, Pro, Val or Arg <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro or Glu <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg or Gly <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn or Leu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg or Thr <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Val or Leu <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, amidated Cys, selenocysteine or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Tyr, Phe or His <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Ser, Gly or is absent <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> Arg, Asp, Val or is absent <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> Gly, Leu, Val or is absent <220> <221> X <222> (26)..(26) <223> Phe, Val, Ile or is absent <220> <221> X <222> (27)..(27) <223> Phe, Asn, Pro, Glu or is absent <220> <221> X <222> (28)..(28) <223> Tyr, Cys, His or is absent <220> <221> X <222> (29)..(29) <223> Thr, His, Leu, Tyr or is absent <220> <221> X <222> (30)..(30) <223> Pro, Glu, Leu, Ile, Arg or is absent <220> <221> X <222> (31)..(31) <223> Ile, Lys or is absent <220> <221> X <222> (32)..(32) <223> Thr, Lys, Leu, Gln or is absent <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> Cys or is absent <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> Glu, Pro, Val or is absent <220> <221> X <222> (35)..(35) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (36)..(36) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (37)..(37) <223> Glu, Val or is absent <220> <221> X <222> (38)..(38) <223> Ala, Asp or is absent <220> <221> X <222> (39)..(39) <223> Ala or is absent <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr, Asn or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe, Ser or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys, Asn or Gln <220> <221> X <222> (7)..(7) <223> His or Tyr <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg, Ile or Leu <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Asp, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Val, Ile or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, Ala, Pro, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, Val, Asn or Asp <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser, Gln, Tyr or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr, Asp, Met or Val <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu, Asp, Gln or Lys <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Leu or Val <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, amidated Cys, selenocysteine or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Tyr or Gly <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Gly or is absent <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg or Leu <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, or Asn <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr or Met <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu or Asp <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Leu or Val <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Tyr <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu, Arg, Gly or is absent <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Cys Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 20 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Val or Ala <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu, gamma carboxyglutamate or Cys <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Gln, Glu, gamma carboxyglutamate, His or Val <220> <221> X <222> (6)..(7) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys or Val <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Ser, Arg, Asn, His or Lys <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Phe, His or Thr <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> Ser or Thr <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Leu, Asn, Val or Asp <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Tyr, Ala, Gln, Asp or Glu <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Gln, Glu or Thr; or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Glu, Lys, Arg, Ile, Met, Thr or Ser <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys, Thr, Asn, Gln or Glu <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Tyr or Phe <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Cys, selenocysteine, amidated Cys, or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala, or is absent <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Pro, Asn, Thr, Leu, Ser or is absent <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Thr, Leu, Val, Ser or is absent <220> <221> X <222> (24)..(24) <223> Arg, Thr, Met, Gln, Leu or is absent <220> <221> X <222> (25)..(25) <223> Glu, Gly or is absent <220> <221> X <222> (26)..(26) <223> Ser, Leu or is absent <220> <221> X <222> (27)..(31) <223> Ser or is absent <220> <221> X <222> (32)..(32) <223> Ala, Ser or is absent <220> <221> X <222> (33)..(33) <223> Ala, Val or is absent <220> <221> X <222> (34)..(34) <223> Ala or is absent <400> 9 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> His or Gln <220> <221> X <222> (6)..(7) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> His or Thr <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Arg or Ser <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Pro or Ile <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Asn or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Ala or Tyr <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu or Gln <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Phe or Leu <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Lys or Glu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys or Asn <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Cys, selenocysteine, amidated Cys, or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn or absent <400> 10 Gly Xaa Val Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 11 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg or Leu <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, or Asn <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr or Met <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu or Asp <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Leu or Val <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Cys, selenocysteine, amidated Cys, or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Gly or Tyr <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu or Arg <400> 11 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Cys Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> His or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> His or Thr <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Arg or Ser <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Pro or Ile <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Asn or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Ala or Tyr <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu or Gln <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Lys or Glu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys or Asn <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn or absent <400> 12 Gly Xaa Val Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg or Leu <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, or Asn <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr or Met <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu or Asp <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Leu or Val <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu or Arg <400> 13 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Cys Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Tyr Xaa 20 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> His or Gln <220> <221> X <222> (6)..(7) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> His or Thr <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Arg or Ser <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Pro or Ile <220> <221> X <222> (11)..(11) <223> Cys or selenocysteine <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Asn or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Ala or Tyr <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu or Gln <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Lys or Glu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys or Asn <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Cys, selenocysteine, amidated Cys, or amidated selenocysteine <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn or absent <400> 14 Gly Val Val Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys or Gln <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, or Asn <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser or Ala <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Tyr or Leu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr or Met <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu or Asp <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu or Arg <400> 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Arg Cys Gly Ser Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Leu Cys Tyr Xaa 20 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 16 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 17 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> aromatic residue or large aliphatic residue <400> 17 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Xaa Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu 20 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 18 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> aromatic residue or large aliphatic residue <400> 19 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Xaa Glu 20 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 20 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> aromatic residue or large aliphatic residue <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> aromatic residue or large aliphatic residue <400> 21 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Xaa Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Xaa Glu 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Conus geographus <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> gamma-carboxylated glutamic acid <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> amidated Cys (at N-terminus) <400> 22 Gly Val Val Xaa His Cys Cys His Arg Pro Cys Ser Asn Ala Glu Phe 1 5 10 15 Lys Lys Tyr Xaa 20 <210> 23 <211> 23 <212> PRT <213> Conus geographus <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> hydroxyproline <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> gamma-carboxylated glutamic acid <400> 23 Thr Phe Asp Thr Tyr Lys His Arg Cys Gly Ser Xaa Ile Thr Asn Ser 1 5 10 15 Tyr Met Asp Leu Cys Tyr Arg 20 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210> 26 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Val or Ile <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu or gamma carboxyglutamate, <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> His or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> His or Thr <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Arg or Ser <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Pro or Ile, <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Asn or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Ala or Tyr <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu or Gln <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Lys or Glu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys or Asn <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn or absent <400> 26 Gly Xaa Val Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> Arg or Leu <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Ile or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, or Asn <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser or Ala <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr or Met <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu or Asp <220> <221> X <222> (20)..(20) <223> Leu or Val <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Gly or Tyr <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu or Arg <400> 27 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Xaa Cys Gly Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 20 <210> 28 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> His or Gln <220> <221> X <222> (8)..(8) <223> His or Thr <220> <221> X <222> (9)..(9) <223> Arg or Ser <220> <221> X <222> (10)..(10) <223> Pro or Ile <220> <221> X <222> (13)..(13) <223> Asn or Leu <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Ala or Tyr <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu or Gln <220> <221> X <222> (17)..(17) <223> Lys or Glu <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Lys or Asn <220> <221> X <222> (21)..(21) <223> Asn or absent <400> 28 Gly Val Val Xaa Xaa Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Ser Xaa Xaa Xaa Phe 1 5 10 15 Xaa Xaa Tyr Cys Xaa 20 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <220> <221> X <222> (1)..(1) <223> Thr or is absent <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Phe or is absent <220> <221> X <222> (3)..(3) <223> Phe or Asp <220> <221> X <222> (4)..(4) <223> Thr or Val <220> <221> X <222> (5)..(5) <223> Pro, Asn or hydroxyproline <220> <221> X <222> (6)..(6) <223> Lys or Gln <220> <221> X <222> (12)..(12) <223> His, Glu or gamma carboxyglutamate <220> <221> X <222> (14)..(14) <223> Thr, or Val <220> <221> X <222> (15)..(15) <223> Glu, or Asn <220> <221> X <222> (16)..(16) <223> Ser or Ala <220> <221> X <222> (18)..(18) <223> Tyr or Met <220> <221> X <222> (19)..(19) <223> Leu or Asp <220> <221> X <222> (22)..(22) <223> Gly or Tyr <220> <221> X <222> (23)..(23) <223> Glu or Arg <400> 29 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa His Arg Cys Gly Ser Xaa Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Leu Cys Xaa Xaa 20 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B Chain <400> 30 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Tyr Glu Arg 20 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 31 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Phe Glu Arg 20 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 32 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Pro Glu Arg 20 <210> 33 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 33 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Tyr Glu Arg 20 <210> 34 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 34 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Phe Glu Arg 20 <210> 35 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 35 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Pro Glu Arg 20 <210> 36 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 36 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Gln Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Tyr Glu Arg 20 <210> 37 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 37 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Gln Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Phe Glu Arg 20 <210> 38 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain <400> 38 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser Gln Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Pro Glu Arg 20 <210> 39 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 39 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys His Arg Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 40 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 40 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Tyr Arg Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 41 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain <400> 41 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Lys Arg Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20

Claims (96)

  1. A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드를 포함하는 인슐린 유사체로서, B 사슬은 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에 방향족 또는 거대 지방족 잔기 및/또는 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 15에 상응하는 위치에 방향족 또는 거대 지방족 잔기를 포함하고, 유사체는 인간 인슐린에서 발견되지만 코너스 지오그라퍼스 (Conus geographus) 독액 인슐린의 상응하는 위치에는 결여된 적어도 하나의 아미노산을 포함하고, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 한 쌍의 시스테인 잔기에 걸쳐 함께 결합된 것인 인슐린 유사체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 인슐린의 B 사슬의 아미노산 번호 20에 상응하는 위치에서 방향족 또는 거대 지방족 잔기는 티로신, 페닐알라닌, 4-메틸페닐알라닌, 히스티딘, 트립토판, 메티오닌, 사이클로펜틸알라닌 및 사이클로헥실알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인슐린 유사체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, B 사슬은 인간 인슐린과 비교시 C-말단부에서 절단되는 것인 인슐린 유사체.
  4. 제3항에 있어서, B 사슬은 인간 인슐린의 9개 C-말단 아미노산 중 하나 이상 또는 전부가 결여되는 것인 인슐린 유사체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, B 사슬은 인간 인슐린의 PheB24 가 적어도 결여되는 것인 인슐린 유사체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, B 사슬은 인간 B 사슬 방향족 트리플렛 (아미노산 PheB24-PheB25-TyrB26)이 적어도 결여되는 것인 인슐린 유사체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34 [여기서, XA2 = Val 또는 Ile이고; XA3 = Val 또는 Ala이고; XA4 = Glu, Asp, Cys 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XA5 = Gln, Glu, 감마 카복시글루타메이트, His 또는 Val이고; CysA6, CysA7, 및 CysA11 은 독립적으로 Cys 또는 셀레노시스테인이고; XA8 = Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys, Ala 또는 Val이고; XA9 = Ser, Arg, Asn, Gly, His 또는 Lys이고; XA10 = Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Val, Phe, His 또는 Thr이고; XA12 = Ser 또는 Thr이고; XA13 = Leu, Asn, Val, Arg 또는 Asp이고; XA14 = Tyr, Ala, Gln, His, Asp 또는 Glu이고; XA15 = Gln, Glu 또는 Thr이고; XA16 = Phe, Leu, 또는 Ala이고; XA17 = Glu, Gln, Lys, Arg, Ile, Met, Thr 또는 Ser이고; XA18 = Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 또는 Glu이고; XA19 = Tyr 또는 Phe이고; CysA20 = Cys, 셀레노시스테인, 아미드화 Cys, 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XA21 = Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala이거나 또는 부재하고; XA22 = Pro, Asn, Thr, Leu, Ser이거나 또는 부재하고; XA23 = Thr, Leu, Val, Ser이거나 또는 부재하고; XA24 = Arg, Thr, Met, Gln, Leu이거나 또는 부재하고; XA25 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XA26 = Ser, Leu이거나 또는 부재하고; XA27 내지 XA31 은 독립적으로 Ser이거나 또는 부재하고; XA32 = Ala, Ser이거나 또는 부재하고; XA33 = Ala, Val이거나 또는 부재하고; XA34 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 1)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
    서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Ala, Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Ala, Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Lys, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Thr, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Thr, Tyr, Pro, Leu 또는 Gly이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg, Ser 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Val, Tyr, Phe, His, Gly, Gln, Leu, 아미드화 His, 아미드화 Val이거나 또는 부재하고; XB23 = Glu, Asp, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Ile, Leu, Ser, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Ala, Asp, Ser, Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 2)을 포함하는 B 사슬 펩티드
    를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  8. 제7항에 있어서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 3)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB10 = Gly, Gln 또는 Asp이고; XB11 = Ser, Leu, Gly 또는 Pro이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24, XB25, XB26, XB27, XB28, XB29, XB30, XB31, XB32, XB33, XB34, XB35, XB36, XB37, XB38 및 XB39 는 부재함] (SEQ ID NO: 4)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His, Tyr, Arg 또는 Ile이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp, 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val, Leu 또는 Lys이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 5)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39 [여기서, XB1 = Thr, Asn, Ser이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser, Asn, Thr, Gln이거나 또는 부재하고; XB3 = Asp, Gly, Pro, Leu, Phe 또는 His이고; XB4 = Thr, Pro, Asp, Val 또는 Gly이고; XB5 = Asn, Pro, His, Thr, Arg, Ser 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Glu, Asn, Asp, Arg, Gln 또는 Gly이고; XB7 = His 또는 Tyr이고; XB8 = Arg, Thr, Ile, Ser, Leu, Tyr 또는 Lys이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Glu, 감마 카복시글루타메이트, Asp 또는 Asn이고; XB13 = Ile, Leu, Asp, Val 또는 Ala이고; XB14 = Thr, Ala, Pro, Val 또는 Arg이고; XB15 = Asn, Asp, Ala, Val, Thr, Pro 또는 Glu이고; XB16 = Ala, Ser, Gln, His, Tyr, Arg 또는 Gly이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Met, Val, Gln, Ile, Asp, Gly, Asn 또는 Leu이고; XB19 = Leu, Asp, Gln, Gly, Lys, Glu, Arg 또는 Thr이고; XB20 = Val 또는 Leu이고; CB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr, Phe 또는 His이고; XB23 = Glu, Arg, Ser, Gly이거나 또는 부재하고; XB24 = Arg, Asp, Val이거나 또는 부재하고; XB25 = Gly, Leu, Val이거나 또는 부재하고; XB26 = Phe, Val, Ile이거나 또는 부재하고; XB27 = Phe, Asn, Pro, Glu이거나 또는 부재하고; XB28 = Tyr, Cys, His이거나 또는 부재하고; XB29 = Thr, His, Leu, Tyr이거나 또는 부재하고; XB30 = Pro, Glu, Leu, Ile, Arg이거나 또는 부재하고; XB31 = Ile, Lys이거나 또는 부재하고; XB32 = Thr, Lys, Leu, Gln이거나 또는 부재하고; XB33 = Cys이거나 또는 부재하고; XB34 = Glu, Pro, Val이거나 또는 부재하고; XB35 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB36 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XB37 = Glu, Val이거나 또는 부재하고; XB38 = Ala, Asp이거나 또는 부재하고; XB39 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 6)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  12. 제7항에 있어서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr, Asn이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe, Ser이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys, Asn 또는 Gln이고; XB7 = His 또는 Tyr이고; XB8 = Arg, Ile 또는 Leu이고; CysB9 = Cys 또는 셀레노시스테인이고; XB12 = His, Asp, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Val, Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr, Ala, Pro 또는 Val이고; XB15 = Glu, Val, Asn 또는 Asp이고; XB16 = Ser, Gln, Tyr 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr, Asp, Met 또는 Val이고; XB19 = Leu, Asp, Gln 또는 Lys이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; CysB21 = Cys, 아미드화 Cys, 셀레노시스테인 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XB22 = Tyr 또는 Gly이고; XB23 = Glu, Arg, Gly이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 7)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  13. 제12항에 있어서, B 사슬 펩티드는 서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23, [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 8)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, XB22 는 Tyr인 인슐린 유사체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 펩티드는 서열 Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34 [여기서, XA2 = Val 또는 Ile이고; XA3 = Val 또는 Ala이고; XA4 = Glu, 감마 카복시글루타메이트 또는 Cys이고; XA5 = Gln, Glu, 감마 카복시글루타메이트, His 또는 Val이고; CysA6, CysA7, 및 CysA11 은 독립적으로 Cys 또는 셀레노시스테인이고; XA8 = Thr, His, Asp, Gln, Tyr, Lys 또는 Val이고; XA9 = Ser, Arg, Asn, His 또는 Lys이고; XA10 = Ile, Pro, Tyr, Ala, Ser, Phe, His 또는 Thr이고; XA12 = Ser 또는 Thr이고; XA13 = Leu, Asn, Val 또는 Asp이고; XA14 = Tyr, Ala, Gln, Asp 또는 Glu이고; XA15 = Gln, Glu 또는 Thr이거나; 또는 Ala이고; XA17 = Glu, Lys, Arg, Ile, Met, Thr 또는 Ser이고; XA18 = Lys, Thr, Asn, Gln 또는 Glu이고; XA19 = Tyr 또는 Phe이고; CysA20 = Cys, 셀레노시스테인, 아미드화 Cys, 또는 아미드화 셀레노시스테인이고; XA21 = Asn, Pro, His, Ser, Gly, Ala이거나 또는 부재하고; XA22 = Pro, Asn, Thr, Leu, Ser이거나 또는 부재하고; XA23 = Thr, Leu, Val, Ser이거나 또는 부재하고; XA24 = Arg, Thr, Met, Gln, Leu이거나 또는 부재하고; XA25 = Glu, Gly이거나 또는 부재하고; XA26 = Ser, Leu이거나 또는 부재하고; XA27 내지 XA31 은 독립적으로 Ser이거나 또는 부재하고; XA32 = Ala, Ser이거나 또는 부재하고; XA33 = Ala, Val이거나 또는 부재하고; XA34 = Ala이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 9)을 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  16. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA16 은 Phe 또는 Leu이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 10)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
    서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu, 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; XB22 = Gly 또는 Tyr이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 11)을 포함하는 B 사슬 펩티드
    를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    서열 Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA2 는 Val 또는 Ile이고, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 12)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
    서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-Tyr-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB8 = Arg 또는 Leu이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB13 = Ile 또는 Leu이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고; XB20 = Leu 또는 Val이고; XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 13)을 포함하는 B 사슬 펩티드
    를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21 [여기서, XA4 는 Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고, XA5 는 His 또는 Gln이고, XA8 은 His 또는 Thr이고, XA9 는 Arg 또는 Ser이고, XA10 은 Pro 또는 Ile이고, XA13 은 Asn 또는 Leu이고, XA14 는 Ala 또는 Tyr이고, XA15 는 Glu 또는 Gln이고, XA17 은 Lys 또는 Glu이고, XA18 은 Lys 또는 Asn이고 XA21 은 Asn이거나 또는 부재함] (SEQ ID NO: 14)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
    서열 XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-Leu-CysB21-Tyr-XB23 [여기서, XB1 = Thr이거나 또는 부재하고; XB2 = Phe이거나 또는 부재하고; XB3 = Phe 또는 Asp이고; XB4 = Thr 또는 Val이고; XB5 = Pro, Asn 또는 하이드록시프롤린이고; XB6 = Lys 또는 Gln이고; XB12 = His, Glu 또는 감마 카복시글루타메이트이고; XB14 = Thr 또는 Val이고; XB15 = Glu 또는 Asn이고; XB16 = Ser 또는 Ala이고; XB17 = Tyr 또는 Leu이고; XB18 = Tyr 또는 Met이고; XB19 = Leu 또는 Asp이고, XB23 = Glu 또는 Arg임] (SEQ ID NO: 15)을 포함하는 B 사슬 펩티드
    를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 중 하나 이상 또는 전부가 적용되는 것인 인슐린 유사체:
    i) XA4 는 감마 카복시글루타메이트이고,
    ii) XB5 는 하이드록시프롤린이고;
    iii) XB12 는 감마 카복시글루타메이트임.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 16)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
    서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 17)을 포함하는 B 사슬 펩티드
    를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 18)을 포함하는 A 사슬 펩티드; 및
    서열 Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu [여기서, Xaa는 방향족 잔기 또는 거대 지방족 잔기임] (SEQ ID NO: 19)을 포함하는 B 사슬 펩티드
    를 포함하는 것인 인슐린 유사체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, B 사슬 펩티드의 CysB9 는 A 사슬 펩티드의 CysA6 에 결합되는 것인 인슐린 유사체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, B 사슬 펩티드의 CysB21 은 A 사슬 펩티드의 CysA20 에 결합되는 것인 인슐린 유사체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, CysA7 은 CysA11 에 결합되는 것인 인슐린 유사체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 그들의 개별 말단부의 한쌍에서 함께 연결되는 것인 인슐린 유사체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 양쪽 말단부에서 함께 연결되는 것인 인슐린 유사체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 10-6 M 미만의 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 을 갖는 것인 인슐린 유사체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중에서 유사체의 적어도 75%가 용액 중 단량체인 인슐린 유사체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 인슐린과 비교시 인간에게 투여되는 경우에 증가된 생체이용률을 갖는 것인 인슐린 유사체.
  30. 제29항에 있어서, 인간에게 투여 0.5 내지 3시간 이내에 피크 생체이용률을 갖는 것인 인슐린 유사체.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 투여 10분 이내에 활성의 개시를 갖는 것인 인슐린 유사체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 유사체는 인간 IGF-IR에 결합하지 않거나 또는 인간 IGF-IR에 약하게 결합하는 것인 인슐린 유사체.
  33. 제32항에 있어서, 유사체는 100 nM 보다 약한 인간 IGF-IR에 대한 친화성 (Kd)을 갖는 것인 인슐린 유사체.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  35. 인슐린-관련 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 인슐린 관련 병태는 고혈당증, 인슐린 저항증, 제1형 당뇨병, 임신성 당뇨병 또는 제2형 당뇨병인 방법.
  37. 혈중 포도당 수준을 감소시키기 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  38. 대상체에서 인슐린-관련 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체의 용도.
  39. 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키기 위한 약물의 제조에서의 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항의 인슐린 유사체의 용도.
  40. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 인슐린-관련 병태를 치료 및/또는 예방하는데서 사용을 위한 것인 인슐린 유사체.
  41. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 혈중 포도당 수준을 감소시키는데서 사용을 위한 것인 인슐린 유사체.
  42. 인슐린 수용체 (IR)에 결합하는 것으로 알려진 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 변형시키는 방법으로서, 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조의 구조-기반 평가를 수행하는 단계 및 평가의 결과로서 폴리펩티드를 재디자인하거나 또는 화학적으로 변형시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 구조-기반 평가는 인슐린의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조의 비교를 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 구조-기반 평가는 인슐린 수용체의 원자 좌표 또는 이의 서브셋과 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조 간에 형성된 복합체의 분자 모델링 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 IR에 결합하는 이의 능력에 대해 시험하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  46. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 IR 활성화를 조정하는 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드의 능력을 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  47. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 합성하거나 또는 수득하는 단계 및 혈중 포도당 수준을 저하시키는 재디자인되거나 또는 화학적으로 변형된 폴리펩티드의 능력을 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  48. 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, IR에 결합하는 것으로 알려진 폴리펩티드는 인슐린인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 방법.
  50. 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 의해 재디자인되거나 또는 변형된 폴리펩티드.
  51. 제50항에 있어서, 단량체인 폴리펩티드.
  52. IR 효현제인 단리된 분자로서, 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 Con-Ins G1의 3D 구조를 기반으로 동정 및/또는 디자인된 것인 분자.
  53. 제52항에 있어서, 분자는 펩티드, 폴리펩티드 또는 펩티드모방체인 분자.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 단량체인 분자.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 10-6 M 미만의 인간 IR-B 수용체에 대한 IC50 을 갖는 것인 분자.
  56. IR에 결합하는 화합물을 동정하는 방법으로서, 방법은
    i) a) 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의된 구조, 또는
    b) a)의 상응하는 골격 원자 상에 중첩시 약 2.0Å 미만의 평균 제곱근 편차를 갖는 구조
    를 갖는 폴리펩티드의 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계, 및
    ii) IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 디자인하거나 또는 스크리닝하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계는 IR 또는 이의 영역에 결합하는 폴리펩티드의 모델을 생성시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 합성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정하는 것인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 단량체인 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 혈중 포도당 수준을 조정하는 이의 능력에 대해서 시험하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 및 ii)는 인 실리코 (in silico)로 수행되는 것인 방법.
  63. 인슐린 활성을 모방하는 화합물을 동정하는 컴퓨터-기반 방법으로서, 방법은
    i) a) 부록 I의 원자 좌표 또는 이의 서브셋에 의해 정의되는 구조, 또는
    b) a)의 상응하는 골격 원자 상에 중첩시 약 2.0Å 미만의 평균 제곱근 편차를 갖는 구조
    를 갖는 폴리펩티드의 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계, 및
    ii) 인슐린 활성을 모방하는 화합물을 디자인하거나 또는 스크리닝하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 3차원 구조 모델을 생성시키는 단계는 IR 또는 이의 영역에 결합하는 폴리펩티드의 모델을 생성시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, IR에 잠재적으로 결합하는 화합물을 합성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 IR의 적어도 하나의 생물학적 활성을 조정하는 것인 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물은 단량체인 방법.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)에서 디자인되거나 또는 스크리닝된 화합물을 혈중 포도당 수준을 조정하는 이의 능력에 대해서 시험하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 및 ii)는 인 실리코로 수행되는 것인 방법.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 동정된 화합물.
  71. 임의의 셀 치수의 편차가 약 2% 이하이고 유닛 셀 치수는 a = b = c = 74.91Å인 공간군 P432를 갖는 Con-Ins G1 폴리펩티드의 결정.
  72. 부록 I의 원자 좌표로 정의되는 바와 같은 Con-Ins G1 폴리펩티드의 구조.
  73. 구조 모델로서의 제72항의 구조의 용도.
  74. 제73항에 있어서, 인슐린 유사체의 동정을 위한 것인 구조 모델의 용도.
  75. 제74항의 용도에 의해 동정되는 인슐린 유사체.
  76. 제50항 또는 제51항의 폴리펩티드, 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 분자, 제70항의 화합물, 또는 제74항의 인슐린 유사체를 포함하는 약학 조성물.
  77. 인슐린 A 사슬 펩티드 및 인슐린 B 사슬 펩티드를 포함하는 펩티드로서, B 사슬 펩티드는 아미노산 10 및 아미노산 20에 치환을 포함하는 것인 펩티드.
  78. 제77항에 있어서, 아미노산 20에서 치환은 G20Y, G20F 또는 G20P인 펩티드.
  79. 제78항에 있어서, 아미노산 20에서 치환은 G20P이고, 펩티드는 아미노산 21에서 치환을 더 포함하고, 아미노산 21에서 치환은 G21H인 펩티드.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 10에서 치환은 H10E, H10D 또는 H10Q인 펩티드.
  81. 제77항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 펩티드에 적어도 하나의 치환을 더 포함하는 것인 펩티드.
  82. 제81항에 있어서, A 사슬 펩티드에서 적어도 하나의 치환은 T8H, T8Y, T8K 또는 S9R인 펩티드.
  83. 제82항에 있어서, A 사슬 펩티드에서 적어도 2개의 치환을 더 포함하는 것인 펩티드.
  84. 제81항에 있어서, A 사슬 펩티드에서 적어도 2개의 치환은 T8H, T8Y, T8K 및 S9R로부터 선택되는 2개 치환인 펩티드.
  85. 제77항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 데스-옥타펩티드 인슐린인 펩티드.
  86. 제77항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, B 사슬 펩티드는 FVNQHLCGSELVEALYLVCYER (SEQ ID NO: 30)의 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  87. 제77항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬은 GIVEQCCHRICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 39)의 서열을 포함하는 것인 펩티드.
  88. 제77항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, A 사슬 펩티드 및 B 사슬 펩티드는 적어도 하나의 디술피드 결합을 통해서 결합되는 것인 펩티드.
  89. 제77항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 단량체인 펩티드.
  90. 제77항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 A 사슬 펩티드는 야생형 인간 인슐린 A 사슬 펩티드와 적어도 70%가 동일한 것인 펩티드.
  91. 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  92. 대상체에서 인슐린 수용체 활성화를 증가시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항의 펩티드 중 어느 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  93. 대상체에서 혈당을 저하시키는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항의 펩티드 중 어느 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  94. 대상체에서 제1형 당뇨병을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제77항 내지 제90항 중 어느 한 항의 펩티드 중 어느 하나의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 대상체는 펩티드를 투여하기 이전에 제1형 당뇨병으로 진단받은 것인 방법.
  96. 적어도 하나의 디술피드 결합을 통해서 B 사슬 펩티드에 결합된 A 사슬 펩티드를 갖는 치료적 단백질로서, A 사슬은 GIVEQCCHRICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 39)의 서열을 포함하고, B 사슬 펩티드는 FVNQHLCGSELVEALYLVCYER (SEQ ID NO: 30)의 서열을 포함하는 것인 치료적 단백질.
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