CN110072884A - 胰岛素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胰岛素类似物，特别是具有缩短的B链的胰岛素类似物。本发明还涉及来自芋螺毒液的胰岛素的晶体结构，并且涉及使用该晶体和相关结构信息以筛选和设计胰岛素类似物的方法，该胰岛素类似物与胰岛素受体相互作用或调节胰岛素受体。本发明还涉及使用胰岛素类似物的治疗性方法和预防性方法。

Description

胰岛素类似物
本申请要求2016年7月22日提交的澳大利亚临时申请号AU 2016902883的优先权，将其通过引用以其全文特此并入。本申请要求于2017年4月4日提交的美国临时申请号62/483,118的优先权，将其通过引用以其全文特此并入。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明部分地根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的GM 48677在政府支持下进行。美国政府享有本发明的一定的权利。
技术领域
本发明总体上涉及胰岛素类似物。更具体地，本发明涉及使具有缩短的B链的速效胰岛素类似物。本发明还涉及来自芋螺毒液的胰岛素的晶体结构以及涉及使用该晶体和相关结构信息以筛选和设计胰岛素类似物的方法，该胰岛素类似物与胰岛素受体相互作用或调节胰岛素受体。
背景技术
胰岛素是一种多肽激素，在葡萄糖代谢、再生和认知的调节中起着重要作用。人胰岛素单体由两条多肽链(A链和B链)组成，它们通过两个二硫桥(CysA7-CysB7和CysA19-B20)共价连接。A链由21个氨基酸组成，并且B链由30个氨基酸组成。第三个二硫桥位于A链(CysA6-CysA11)内。在体内，胰岛素以单体、二聚体和六聚体存在。六聚体由三个胰岛素二聚体组成，这些二聚体由两个中心锌离子结合在一起。人胰岛素作为六聚体储存在胰腺β-细胞中。结合胰岛素受体的生物活性形式是单体的。胰岛素六聚体-单体转化对其生物利用度至关重要。
胰岛素调节的紊乱与通常严重的临床表现(比如，糖尿病、高血糖症以及其他类似病症)相关联。糖尿病(diabetes mellitus)(称为糖尿病(diabetes))是以长时间高血糖水平为特征的一组障碍。如果胰腺不能产生足够的胰岛素，或如果身体对胰岛素的响应不正确，就会引起糖尿病。胰岛素或胰岛素类似物的给予仍然是治疗比如糖尿病的病症的最有效的方法。糖尿病的治疗通常涉及给予速效、餐前胰岛素以及长效胰岛素的组合以维持激素的基础水平。
速效胰岛素类似物具有快速的活性起效。通常，它们在注射到受影响的个体中时是单体的或快速解离成单体形式。在结构上，这些胰岛素类似物与正常人胰岛素的不同之处在于具有在B链C-末端区域(残基B26-B30)内对胰岛素多聚化有害的修饰。然而，B链的进一步C-末端截短以消除自我结合导致活性几乎完全丧失，可能是因为PheB24对活性至关重要。例如，去八肽[B23-B30]胰岛素(DOI)，单体类似物，保留低于0.1％的生物活性(Bao等人，1997)。PheB24直接位于由残基GlyB20-GluB21-ArgB22-GlyB23形成的1型β转角的C-末端，其中三联体PheB24-PheB25-TyrB26和1型β转角二者在脊椎动物胰岛素中是高度保守的。
存在对新颖的胰岛素类似物以及对用于设计此类类似物的方法的需要，这些类似物是单体的、速效的，并且保持人胰岛素受体信号传导活性。
发明内容
诸位发明人已经表征了新鉴定的来自地纹芋螺(Conus geographus)毒液的胰岛素Con-Ins G1，并且示出该胰岛素是单体的，但仍与人胰岛素受体结合并且保持信号传导活性。诸位发明人进一步成功地制备了Con-Ins G1的晶体，并且使用X射线晶体学阐明了其三维结构。尽管缺少人胰岛素的芳香族三联体PheB24-PheB25-TyrB26，本文提供的结构数据现在首次能够鉴定允许Con-Ins G1保持其活性的关键氨基酸位置和相互作用。
在一方面，本发明提供了包含A链肽和B链肽的胰岛素类似物，其中该B链包含在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的芳香族或大脂肪族残基和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的芳香族或大脂肪族残基，其中该类似物包含在人胰岛素中发现但在地纹芋螺(Conus geographus)毒液胰岛素的相应的位置中缺少的至少一个氨基酸，并且其中该A链肽和B链肽跨过至少一对半胱氨酸残基结合在一起。
在一些实施例中，该芳香族残基选自下组，该组由以下组成：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸和4-甲基苯丙氨酸。在一些实施例中，该大脂肪族残基选自下组，该组由以下组成：异亮氨酸、环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸和甲硫氨酸。在一些实施例中，在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的芳香族或大脂肪族残基选自下组，该组由以下组成：酪氨酸、苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、环戊基丙氨酸和环己基丙氨酸。在一些实施例中，在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的芳香族或大脂肪族残基选自下组，该组由以下组成：酪氨酸、苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、环戊基丙氨酸和环己基丙氨酸。
在一些实施例中，当与人胰岛素相比时，该B链在C-末端是截短的。在一些实施例中，该B链缺少人胰岛素的九个C-末端氨基酸中的一个或多个或全部。在一些实施例中，该B链至少缺失人胰岛素的PheB24。在一些实施例中，该B链至少缺失人B链芳香族三联体(人胰岛素的氨基酸PheB24-PheB25-TyrB26)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A肽链包含序列Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34，其中XA2＝Val或Ile；XA3＝Val或Ala；XA4＝Glu、Asp、Cys或γ羧基谷氨酸；XA5＝Gln、Glu、γ羧基谷氨酸、His或Val；CysA6、CysA7、和CysA11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；XA8＝Thr、His、Asp、Gln、Tyr、Lys、A1a或Val；XA9＝Ser、Arg、Asn、Gly、His或Lys；XA10＝Ile、Pro、Tyr、Ala、Ser、Val、Phe、His或Thr；XA12＝Ser或Thr；XA13＝Leu、Asn、Val、Arg或Asp；XA14＝Tyr、Ala、Gln、His、Asp或Glu；XA15＝Gln、Glu或Thr；XA16＝Phe、Leu或Ala；XA17＝Glu、Gln、Lys、Arg、Ile、Met、Thr或Ser；XA18＝Lys、Ser、Thr、Asn、Gln或Glu；XA19＝Tyr或Phe；CysA20＝Cys、硒代半胱氨酸、酰胺化的Cys、或酰胺化的硒代半胱氨酸；XA21＝Asn、Pro、His、Ser、Gly、Ala或不存在；XA22＝Pro、Asn、Thr、Leu、Ser或不存在；XA23＝Thr、Leu、Val、Ser或不存在；XA24＝Arg、Thr、Met、Gln、Leu或不存在；XA25＝Glu、Gly或不存在；从XA26＝Ser、Leu或不存在；XA27至XA31独立地是Ser或不存在；XA32＝Ala、Ser或不存在；XA33＝Ala、Val或不存在；并且XA34＝Ala或不存在(SEQ ID NO：1)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Ala、Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Ala、Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Lys、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Thr、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Thr、Tyr、Pro、Leu或Gly；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg、Ser或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Val、Tyr、Phe、His、Gly、Gln、Leu、酰胺化的His、酰胺化的Val或不存在；XB23＝Glu、Asp、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Ile、Leu、Ser、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Ala、Asp、Ser、Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：2)。
在一些实施例中，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：3)。
在一些实施例中，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；并且XB24、XB25、XB26、XB27、XB28、XB29、XB30、XB31、XB32、XB33、XB34、XB35、XB36、XB37、XB38和XB39是不存在的(SEQ ID NO：4)。
在一些实施例中，B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：5)。
在一些实施例中，B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His或Tyr；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val或Leu；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：6)。
在一些实施例中，B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr、Asn或不存在；XB2＝Phe、Ser或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Asn或Gln；XB7＝His或Tyr；XB8＝Arg、Ile或Leu；XB12＝His、Asp、Glu或γ羧基谷氨酸；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB13＝Val、Ile或Leu；XB14＝Thr、Ala、Pro或Val；XB15＝Glu、Val、Asn或Asp；XB16＝Ser、Gln、Tyr或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Asp、Met或Val；XB19＝Leu、Asp、Gln或Lys；XB20＝Leu或Val；CysB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr或Gly；并且XB23＝Glu、Arg、Gly或不存在(SEQ ID NO：7)。
在一些实施例中，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：8)。
在一些实施例中，XB17和XB22是Tyr。在一些实施例中，XB22是Tyr。在一些实施例中，XB17是Tyr。
在一些实施例中，A链肽包含序列Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34，其中XA2＝Val或Ile；XA3＝Val或Ala；XA4＝Glu、γ羧基谷氨酸或Cys；XA5＝Gln、Glu、γ羧基谷氨酸、His或Val；CysA6、CysA7、和CysA11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；XA8＝Thr、His、Asp、Gln、Tyr、Lys或Val；XA9＝Ser、Arg、Asn、His或Lys；XA10＝Ile、Pro、Tyr、Ala、Ser、Phe、His或Thr；XA12＝Ser或Thr；XA13＝Leu、Asn、Val或Asp；XA14＝Tyr、Ala、Gln、Asp或Glu；XA15＝Gln、Glu或Thr；或Ala；XA17＝Glu、Lys、Arg、Ile、Met、Thr或Ser；XA18＝Lys、Thr、Asn、Gln或Glu；XA19＝Tyr或Phe；CysA20＝Cys、硒代半胱氨酸、酰胺化的Cys、或酰胺化的硒代半胱氨酸；XA21＝Asn、Pro、His、Ser、Gly、Ala或不存在；XA22＝Pro、Asn、Thr、Leu、Ser或不存在；XA23＝Thr、Leu、Val、Ser或不存在；XA24＝Arg、Thr、Met、Gln、Leu或不存在；XA25＝Glu、Gly或不存在；从XA26＝Ser、Leu或不存在；XA27至XA31独立地是Ser或不存在；XA32＝Ala、Ser或不存在；XA33＝Ala、Val或不存在；并且XA34＝Ala或不存在(SEQ ID NO：9)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA16是Phe或Leu；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：10)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Gly或Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：11)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XAl5-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：12)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-Tyr-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：13)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：14)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-Leu-CysB21-Tyr-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：15)。
在一个实施例中，除了C-末端处的截短的B链以及B链的氨基酸编号15和/或20的芳香族残基或大脂肪族残基之外，胰岛素类似物与人胰岛素相同。提供了实例，但不限于以下的三个实施例，其中Xaa是芳香族残基或大脂肪族残基。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQID NO：16)；和B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ ID NO：17)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQID NO：18)；和B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ ID NO：19)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQID NO：20)；和B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu(SEQ ID NO：21)，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含许多经修饰的氨基酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物包含以下项中的一个或多个或全部：
i)XA4是γ羧基谷氨酸；
ii)XB5＝羟脯氨酸；并且
iii)XB12＝γ羧基谷氨酸。
在一些实施例中，该B链肽的CysB9与该A链肽的CysA6结合。在一些实施例中，该B链肽的CysB21与该A链肽的CysA20结合。在一些实施例中，CysA7与CysA11结合。
在一些实施例中，该A链肽和该B链肽在一对它们各自末端处连接在一起。在一些实施例中，该A链肽和该B链肽在两个末端处连接在一起。
在一些实施例中，该胰岛素类似物具有针对人IR-B受体的小于10-6M的IC50。在一些实施例中，该胰岛素类似物不结合人IGF-IR或弱结合IGF-IR。在一些实施例中，该类似物对人IGF-IR具有弱于100nM的亲和力(Kd)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物主要是单体的。在一些实施例中，至少75％的类似物在溶液中是单体的。
在一些实施例中，当给予人时，当与人胰岛素相比时，该胰岛素类似物具有增加的生物利用度。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在给予至人的0.5至3小时内的峰生物利用度。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在给予的10分钟内的活性起效。
在另一方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含如本文所定义的胰岛素类似物或其药学上可接受的盐，和一种或多种药学上可接受的载体。
在仍另一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防胰岛素相关病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物。在一些实施例中，该胰岛素相关病症是高血糖症、胰岛素抵抗、1型糖尿病、妊娠糖尿病或2型糖尿病。
在仍另一方面，本发明提供了用于降低血糖水平的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物。
在仍另一方面，本发明提供了如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素相关病症的药物中的用途。在仍另一方面，本发明提供了如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中降低血糖水平的药物中的用途。
在仍另一方面，本发明提供了如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素相关病症。在仍另一方面，本发明提供了如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中降低血糖水平。
在仍另一方面，本发明提供了包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，在氨基酸20处的该取代是G20Y、G20F或G20P。在一些情况下，在氨基酸10处的取代是H10E、H10D或H10Q。
在一些实施例中，这些肽包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代，进一步包含A链肽中的至少一个取代。在一些情况下，A链肽中的至少一个取代是T8H、T8Y、T8K或S9R。
在一些实施例中，这些肽包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代，进一步包含A链肽中的至少两个取代。在一些情况下，A链肽中的至少两个取代是选自T8H、T8Y、T8K和S9R的取代中的两个。
在一些实施例中，该肽是去八肽胰岛素。在一些情况下，该B链肽包含FVNQHLCGSELVEALYLVCYER的序列(SEQ ID NO：30)。在一些情况下，该A链包含GIVEQCCHRICSLYQLENYCN的序列(SEQ ID NO：39)。
在一些实施例中，A链肽和B链肽经至少一个二硫键结合。在一些实施例中，该肽是单体。
在一些实施例中，该胰岛素A链肽与野生型人胰岛素A链肽具有至少70％同一性。
在又另一方面，本发明提供了包含如本文所定义的胰岛素类似物、肽或化合物的药物组合物。在一些实施例中，本发明提供了包含肽以及药学上可接受的载体的药物组合物，该肽包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。
在又另一方面，本发明提供了在受试者中增加胰岛素受体激活的方法，该方法包括给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物、肽或化合物。在一些实施例中，本发明提供了在受试者中增加胰岛素受体激活的方法，该方法包括对其有需要的受试者给予治疗有效量的包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。
在又另一方面，本发明提供了在受试者中降低血糖的方法，该方法包括给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物、肽或化合物。在一些实施例中，本发明提供了在受试者中降低血糖的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。
在又另一方面，本发明提供了在受试者中治疗1型糖尿病的方法，该方法包括给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物、肽或化合物。在一些实施例中，本发明提供了在受试者中治疗1型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，在给予肽之前，受试者已经被诊断为患有1型糖尿病。
在仍另一方面，提供了具有经至少一个二硫键与B链肽结合的A链肽的治疗性蛋白质，其中该A链包含GIVEQCCHRICSLYQLENYCN的序列(SEQ ID NO：39)，并且其中该B链肽包含FVNQHLCGSELVEALYLVCYER的序列(SEQ ID NO：30)。
在仍一方面，本发明提供了重新设计或修饰已知与胰岛素受体(IR)结合的多肽的方法，该方法包括对由附录I的原子坐标或其子集定义的结构进行基于结构的评估，并且依照评估的结果，重新设计或化学修饰多肽。在一些实施例中，该基于结构的评估包括将由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素的原子坐标或其子集定义的结构进行比较。在一些实施例中，该基于结构的评估进一步包括在由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素受体的原子坐标或其子集定义的结构之间形成的复合物的分子建模。在一些实施例中，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测试该多肽结合IR的能力。在一些实施例中，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测定经重新设计或化学修饰的多肽调节IR激活的能力。在一些实施例中，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测定该经重新设计或化学修饰的多肽降低血糖水平的能力。在一些实施例中，已知与IR结合的该多肽是胰岛素。在一些实施例中，该胰岛素是人胰岛素。在另一方面，还提供了一种多肽，该多肽通过如本文所定义的方法该多肽已经被重新设计或修饰。在一些实施例中，该多肽是单体的。
在另一方面，本发明提供了作为IR激动剂的分离的分子，其中该分子基于由附录I的原子坐标或其子集定义的Con-Ins G1的3D结构被鉴定和/或设计。在一些实施例中，该分子是肽、多肽或肽模拟物。在一些实施例中，该分子是单体的。在一些实施例中，该分子具有针对人IR-B受体的小于10-6M的IC50。
在另一方面，本发明提供了鉴定结合IR的化合物的方法，该方法包括：
i)产生多肽的三维结构模型，该多肽具有：
a)由附录I的原子坐标或其子集定义的结构、或
b)当叠加在相应的a)中的主链原子上时具有小于约的均方根偏差的结构，和
ii)设计或筛选潜在结合该IR的化合物。
在一些实施例中，产生三维结构模型包括产生与IR或其区域结合的多肽的模型。在一些实施例中，该方法进一步包括合成潜在结合IR的化合物。在一些实施例中，该化合物调节IR的至少一种生物活性。在一些实施例中，该化合物是单体的。在一些实施例中，该方法进一步包括测试在ii)中设计或筛选的化合物其调节血糖水平的能力。在一些实施例中，步骤i)和ii)是计算机模拟进行的。
在另一方面，本发明提供了鉴定模拟胰岛素活性的化合物的基于计算机的方法，该方法包括：
i)产生多肽的三维结构模型，该多肽具有：
a)由附录I的原子坐标或其子集定义的结构、或
b)当叠加在相应的a)中的主链原子上时具有小于约2.0A的均方根偏差的结构，和
ii)设计或筛选模拟胰岛素活性的化合物。
在一些实施例中，产生三维结构模型包括产生与IR或其区域结合的多肽的模型。在一些实施例中，该方法进一步包括合成潜在结合IR的化合物。在一些实施例中，该化合物调节IR的至少一种生物活性。在一些实施例中，该化合物是单体的。在一些实施例中，该方法进一步包括测试在ii)中设计或筛选的化合物其调节血糖水平的能力。在一些实施例中，步骤i)和ii)是计算机模拟进行的。
在另一方面，本发明提供了使用本文所定义的方法鉴定的化合物。
在另一方面，本发明提供了具有空间群P432的Con-Ins G1多肽的晶体，其中晶胞大小为其中任何晶胞大小中存在高达约2％变异。
在另一方面，本发明提供了如由附录I的原子坐标定义的Con-Ins G1多肽的结构。
在另一方面，本发明提供了如由附录I的原子坐标所定义的Con-Ins G1多肽的结构作为结构模型的用途。在一些实施例中，该结构模型被用于鉴定胰岛素类似物。本发明还提供了通过本文所定义的用途鉴定的胰岛素类似物。
在又另一方面，本发明提供了包含如本文所定义的胰岛素类似物、多肽分子和/或化合物的药物组合物。
除非另外特别说明，否则本文的任何实施例应对任何其他的实施例加上必要的修正。例如，如技术人员将理解，针对本发明方法的本文概述的胰岛素类似物、肽和健康状况的实例同样适用于本发明的用途和药物组合物。还预期的是，本发明的实施例包括制备步骤，比如在制备药物时将化合物掺入药物组合物中。
在整个说明书中，除非另外特别说明或上下文另有要求，否则关于单一步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应涵盖那些步骤、物质组成、步骤组
或物质组成组中的一个和多个(即，一个或多个)。
所披露的方法和组合物的另外的优点将部分地在以下描述中列出，并且部分地将从描述中理解，或可以通过实践所披露的方法和组合物来学习。将借助于在所附权利要求中特别指出的元件和组合来实现和获得所披露的方法和组合物的优点。
通过以下非限制性实例并且参考附图在下文中描述本发明。本发明不限于本文所述的具体实施例的范围，这些实施例仅用于示例目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法明显在本发明的范围内。
附图说明
附图并入本说明书中并且构成本说明书的一部分，说明了所披露的方法和组合物的若干实施例，并且与说明书一起用于解释所披露的方法和组合物的原理。
图1：与人胰岛素的序列比较。Con-Ins G1的序列以及与人胰岛素的比较。保守的半胱氨酸残基和芳香族三联体呈灰色阴影。二硫键用连接两个半胱氨酸残基的实线表示。γ：γ-羧化的-谷氨酸；O：羟脯氨酸；*：C-末端酰胺化。
图2Con-Ins Gl的表征。Con-Ins G1的人IR(同种型B)(n＝9)、不含PTM的sCon-InsG1(n＝9)和人胰岛素(n＝21)的竞争结合分析。误差条描绘SEM(当缺失的误差条小于标记大小时)。sCon-Ins G1：Con-Ins G1具有SecA6和SecA10之间的二硒键。
图3：通过Akt磷酸化作用分析测量的胰岛素信号传导。sCon-Ins G1、不含PTM的sCon-Ins G1和hIns(n＝4)的Akt磷酸化作用分析。误差条描绘SEM(当缺失的误差条小于标记大小时)。
图4a：Con-Ins G1的x射线晶体结构。Con-Ins G1和hIns的叠加(PDB条目1MSO)。Con-Ins G1 B链和A链的主链以灰色表示，并且hIns B链和A链的主链以黑色和白色表示(分别)。
图4b：Con-Ins G1的疏水核。与hIns的核结构相比的Con-Ins G1的核结构。Con-Ins G1 B链和A链的主链以灰色表示，并且hIns B链和A链的主链以黑色和白色表示(分别)。
图4c、4d和4e：Con-Ins G1的翻译后修饰。GlaA4、GlaB10和HypB3的侧链相互作用(分别地，其中将GlaA4的相互作用与hIns GluA4的相互作用相比)。Con-Ins G1 B链和A链的主链以灰色表示，并且hIns B链和A链的主链以黑色和白色表示(分别)。
图5：Con-Ins G1的x射线晶体结构。立体图像显示在晶体四折叠轴周围的Con-InsG1单体晶体内的排列。四个硫酸盐分子(中心)被模拟-其中无限制的坐标和有效占有率各自为0.25--为四折叠轴上差异电子密度的相对无特征的斑团。硫酸盐离子形成电荷补偿簇的一部分，该电荷补偿簇包含来自每个Con-Ins G1单体的GlyA1的氨基末端基团和GlaA4的侧链羧酸。
图6：结合hIR的Con-ins G1。在人胰岛素受体的初始胰岛素结合位点的背景下的Con-Ins G1的分子模型。hIns残基B22-B27(以其来自PDB条目4OGA的hIR结合形式)以黑色覆盖。该图说明了Con-Ins G1 TyrB15的侧链一旦从其受体自由构象旋转，如何可以与Con-Ins G1 TyrB20的侧链一起作为形成Con-Ins G1/hIR复合物中的hIns PheB24的侧链的替代物。为清晰起见，Con-Ins G1的A链(前景)是透明的。
图7：TyrB15和TyrB20。Con-Ins G1残基TyrB 15和TyrB20附近的(2mFobs-DFcalc)差异电子密度的等值面表示，轮廓在1.5σ水平处。与相邻残基的侧链(例如，TyrA19的侧链)相比，这两种残基的侧链看起来是无序的。
图8：Con-Ins G1的GlaA4。原理图显示Con-Ins G1 PTM残基GlaA4的侧链与hIR αCT残基Asn711的侧链的相互作用，如在Con-Ins G1与hIR的初始结合位点的复合物的分子模型内观察到的。该分子表面是hIR L1结构域的分子表面。
图9：通过Akt磷酸化作用分析测量的胰岛素信号传导。hIns、hIns[DOI]和hIns[TyrB15、TyrB20、DOI]的Akt磷酸化作用分析。
图10：Con-Ins G1的表征。在30，000rpm(黑色点)和45，000rpm(灰色点)下进行Con-Ins G1的沉降平衡分析，其中最佳拟合(线)至表观MW 5380±55g/mol的单一物质。
图11：与Fv83-7.IR310.T和IR-A704-719共复合的Con-InsG1。在与Fv83-7.IR310.T和iR-A704-719共复合的Con-InsG1的复合物的晶体结构的不对称单元中两个拷贝叠加的两个正交视图。在每个小图内，一个拷贝被显示为具有相对粗连接的灰色Cα迹线，并且另一个拷贝显示为具有相对细连接的黑色Cα迹线。叠加基于IR310.T部分内的共同残基。为清晰起见，省略CR结构域及其附加的Fv83-7。
图12：与Fv83-7.IR310.T和IR-A704-719共复合的Con-InsG1。与Fv83-7.IR310.T和IR-A704-719共复合的Con-InsG1的晶体结构和与Fab83-7.IR310.T和IR-A704-719共复合的hIns的晶体结构的叠加(PDB条目4OGA)。Con-InsG1复合物被显示为浅灰色Cα迹线(以较粗的线)并且hIns复合物被表示为黑色Cα迹线(以较细的线，除了以粗黑显示的残基B22-B30)。叠加基于IR310.T部分内的共同残基。为清晰起见，省略IR310.T的富含半胱氨酸的结构域及其附接的抗体片段。
图13：TyrB15和TyrB20。基于IR310.T的共同结构域L1，与Fab83-7、IR310.T以及IR-A704-719(PDB条目4OGA；标记的)复合的hIns和与Fv83-7、IR310.T以及IR-A704-719复合的Con-Ins G1(下划线标记的)的叠加。IR310.T的L1结构域以卡通丝带表示显示，而hIns、Con-Ins G1和IR-A704-719以Cα迹线表示来显示。为清晰起见，省略IR310.T的CR结构域。hIRPhe714、hIns LeuB15和Phe B24以及Con-Ins G1 TyrB15的侧链和Cα原子以球-棍表示显示。hIns PheB24和Con-InsG1 TyrB15的侧链的空间对应性是明显的。对于Con-Ins G1TyrB20，不存在可说明的电子密度。为清晰起见，省略Con-Ins G1和hIns各自A链。
图14：与包含hIR的初始结合位点(位点1)的组分结合的hIns[DOI]的分子建模。与IR L1结构域(残基Gly5至Cys155)和IR-A704-719区段(IR-A同种型的残基Phe705至Ser719)复合的hIns[DOI]的分子模型。IR-A704-719区段以卡通丝带表示显示并且为深灰色。hIns[DOI]A链和B链以卡通丝带表示显示并且进行标记。透明的分子表面是hIR L1结构域的分子表面。hIR L1结构域以卡通丝带表示显示，其中显示Tyr67的侧链。
图15：与包含hIR的初始结合位点(位点1)的组分结合的hIns[TyrB15，DOI]的分子建模。与IR L1结构域(残基Gly5至Cys155)和IR-A区段Phe705至Ser719(IR-A704-719)复合的hIns[TyrB15，DOI]的分子模型。IR-A704-719区段以卡通丝带表示显示并且为深灰色。hIns[TyrB15，DOI]A链和B链以卡通丝带表示显示并且进行标记。该分子表面是hIR L1结构域的分子表面。该图说明了TyrB15的侧链如何投射到占有如下空间的DOI-(IR-A704-719)-L1界面的疏水核中，其他情况下该空间由hIns LeuB15占有。
图16：与包含hIR的初始结合位点(位点1)的组分结合的hIns[DOI，TyrB20]的分子建模与IR L1结构域(残基Gly5至Cys155)和IR-A704-719复合的hIns[TyrB20，DOI]的分子模型。该图说明了TyrB20的侧链如何保留在hIns B24结合位点中，其中与受体的所有其他相互作用呈现原始样。IR-A704-719区段以卡通丝带表示显示并且为深灰色。hIns[TyrB20，DOI]A链和B链以卡通丝带表示显示并且进行标记。透明的分子表面是hIR L1结构域的分子表面。hIR L1结构域以卡通丝带表示显示，其中显示Tyr67的侧链。
图17：hIns[DOI]的位置扫描。在hIns[DOI]的每个位点处所得的突变ΔΔG(kcal/mol)贡献。
图18：hIns[TyrB15，DOI]的位置扫描。在hIns[TyrB15，DOI]的每个位点处所得的突变ΔΔG(kcai/mol)贡献。
图19：hIns[TyrB20，DOI]的位置扫描。在hIns[TyrB20，DOI]的每个位点处所得的突变ΔΔG(kcal/mol)贡献。
图20：胰岛素多聚体平衡的原理图。图显示了胰岛素单体化减缓吸收速率。
图21：人DOI胰岛素的化学总合成。图显示了人DOI胰岛素的化学总合成。将Thr-Ser异肽(用红色框)用于增加胰岛素A链的溶解性。
图22：通过示例性胰岛素类似物的胰岛素信号传导激活。图显示了B15 Tyr和B20Tyr对hIR激活的作用。还显示了使用的每种肽的序列。
图23：通过示例性胰岛素类似物的胰岛素信号传导激活。图显示了B10 Glu，B20Tyr对hIR激活的作用。还显示了使用的每种肽的序列。
图24：通过示例性胰岛素类似物的胰岛素信号传导激活。图24A和24B分别显示肽序列/经修饰的氨基酸以及在激活胰岛素信号传导中B20残基的作用。
图25：通过示例性胰岛素类似物的胰岛素信号传导激活。图显示了A8His，A9Arg对hIR激活的作用。还显示了使用的每种肽的序列。
图26：通过示例性胰岛素类似物的胰岛素信号传导激活。图显示A8、A9、B10和B20对hIR激活的个体作用。
图27：通过毒液胰岛素的胰岛素信号传导激活。图显示了具有与Con-Ins G1相似效力的若干毒液胰岛素的胰岛素信号传导激活(上图)。这些毒液胰岛素的序列比对(下图)。A链中位置9和10处以及B链中10和20处的残基被突出表示。γ和*表示翻译后修饰(分别是γ-羧基谷氨酸和C-末端酰胺化)。
序列表的检索表
SEQ ID NO：1-41：根据本披露的实施例的胰岛素类似物、肽和/或化合物。
具体实施方式
一般技术和定义
除非另有明确定义，本文所使用的所有技术和科学术语应视为具有与本领域的普通技术人员通常理解的相同含义(例如，分子遗传学、药理学、蛋白质晶体学、蛋白质化学、生物化学等方面)。
除非另有说明，否则本发明中使用的技术是对于本领域技术人员熟知的标准程序。这样的技术被描述并且解释于在以下原始资料的整个文献中，比如，J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning[分子克隆的实用指南]，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1984)；J.Sambrook等人.Molecular Cloning：A LaboratoryManual[分子克隆：实验室手册]，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour LaboratoryPress)(1989)；T.A.Brown(编辑)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach[基本分子生物学：实用方法]，第1和2卷，IRL出版社(IRL Press)(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNA Cloning：A Practical Approach[DNA克隆：实用方法]，第1-4卷，IRL出版社(IRL Press)(1995和1996)；和F.M.Ausubel等人.(编辑)，Current Protocolsin Molecular Biology[分子生物学现代方法]，格林出版联盟和威利国际科学出版公司(Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience)(1988，包括目前为止的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies：A Laboratory Manual[抗体：实验室手册]，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbour Laboratory)，(1988)；以及J.E.Coligan等人.(编辑)Current Protocols in Immunology[免疫学现代方法]，约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons)(包括目前为止的所有更新)。
贯穿本说明书，“包含(comprise)”一词或变化形式如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组，但不排除任何其他元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤的组。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。另外，除非另有说明或从上下文清楚地指向单数形式，如在本申请和所附权利要求中使用的冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”通常可以解释为意指“一个/种或多个/种”。
术语“胰岛素”意指人胰岛素、猪胰岛素、豚鼠胰岛素、鸡胰岛素、小鼠胰岛素、牛胰岛素或毒液胰岛素。在一些实施例中，胰岛素意指人胰岛素。术语“毒液胰岛素”意指芋螺毒液胰岛素。优选地，毒液胰岛素意指Con-Ins G1。
如本文使用的，术语“胰岛素类似物”是指能够模拟胰岛素活性的任何试剂。在一些实施例中，该胰岛素类似物至少是胰岛素受体激动剂。在一些实施例中，该胰岛素类似物与胰岛素受体结合。优选地，胰岛素类似物可以是肽、多肽、蛋白质或肽模拟物。在一些实施例中，该胰岛素类似物是肽。如本领域技术人员将理解的，除了上下文另有说明，术语“胰岛素类似物”、“肽”和“胰岛素肽”可互换地使用。胰岛素类似物还包括通过本文披露的方法鉴定的IR激动剂、分子、化合物等。
如本文使用的，术语“肽”是指在从两个至约五十个氨基酸(例如，4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40或45个氨基酸长度)范围内的氨基酸的聚合物。术语肽同时涵盖未经修饰的肽、修饰的肽和其他化学衍生的肽(例如磷酸化的、硫酸化的、酰胺化的等)。在一些实施例中，该肽可以是非天然的肽寡聚体，比如在Sadowsky等人(2005)和Sadowsky等人(2007)中描述的那些。如在本文中可互换使用的术语“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸的聚合物，该氨基酸的聚合物总长度通常大于约50个氨基酸，并且通常具有稳定的特征性二级和三级结构。术语“多肽”或“蛋白质”还可以包括与稳定的三级四级结构关联的这样的聚合物(例如两种或更多种)的组合，该三级四级结构通过它们的非共价或共价结合产生。
在一些实施例中，肽、蛋白质或多肽包含在待治疗的受试者中天然存在的氨基酸。在一些实施例中，该肽或多肽包含一个或多个非天然的氨基酸、经修饰的氨基酸或合成氨基酸类似物。这样的氨基酸包括但不限于：共同氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、戊氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计的氨基酸(比如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)以及通常的氨基酸类似物。在该范围内还包括在合成期间或之后经以下作用差异修饰的肽、多肽或蛋白质，例如：生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白质水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等。这些修饰可用于增加肽、蛋白质或多肽的稳定性和/或生物活性。
术语氨基酸“修饰”是指通过向/从氨基酸中添加和/或去除化学基团来取代氨基酸或衍生氨基酸，并且包括用通常存在于人蛋白质中的20种氨基酸、以及非典型的或非天然存在的氨基酸中的任何一种的取代。非典型氨基酸的商业来源包括西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密尔沃基，威斯康星州)、ChemPep公司(ChemPep Inc.)(迈阿密，佛罗里达州)和健赞制药公司(Genzyme Pharmaceuticals)(剑桥，马萨诸塞州)。非典型氨基酸可以购自商业供应商，从头合成，或从天然存在的氨基酸进行化学修饰或衍生。
如本文使用的，氨基酸“取代”是指一个氨基酸残基被不同的氨基酸残基置换。经取代的氨基酸可以是通常存在于人蛋白质中的20种氨基酸中，以及非典型或非天然存在的氨基酸的任何一种。
术语“A链肽”和“B链肽”可与“胰岛素A链肽”和“胰岛素B链肽”互换。
如本文使用的，提及作为“其衍生物”的化合物是指从祖先化合物适应或修饰并且具有相似但新的结构并且具有与祖先化合物相似生物活性的化合物。在一些实施例中，祖先化合物是如本文所述的小分子、肽、多肽、蛋白质或胰岛素类似物。在一些实施例中，祖先化合物是肽、多肽、蛋白质或胰岛素类似物，它们可以被修饰以包括任何化学修饰，包括与蛋白质或肽相关的任何分子(比如碳水化合物、脂质、和/或蛋白质或肽)的单个或多个取代、缺失和/或添加。在一个实施例中，蛋白质、多肽或肽的“衍生物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、保护/封闭基团的引入、蛋白质水解切割或与抗体或另一种细胞配体的结合而产生的那些经修饰的类似物。
在整个申请中，所有通过字母和数字(例如，位置A5或B5)对特定氨基酸位置的引用是指在来自地纹芋螺毒液胰岛素Con-G1 Ins的各自A链或B链中的A链(例如，位置A5)或B链(例如，位置B5)的位置处或在任何其类似物中相应的氨基酸位置处的氨基酸。例如，在没有任何进一步阐述的情况下，本文提及“位置B17”将意指着作为Con-Ins G1的人胰岛素B链的相应位置B15具有两个另外的N-末端B链残基。
如本文使用的，短语“在对应于氨基酸编号的位置处”是指参考所定义的氨基酸序列，与附近的氨基酸相比氨基酸的相对位置。例如，在一些实施例中，当与人胰岛素(参见图1)相比时，本发明的胰岛素类似物的B链可以具有比如存在于Con-Ins G1中的一个或两个另外的N-末端氨基酸。在一个实例中，在进行蛋白质比对时，技术人员将容易地理解天然存在的人胰岛素B链的亮氨酸(第15个氨基酸)对应于B链Con-Ins G1的第17个氨基酸(参见图1)。在本发明的优选的实施例中，天然存在的人胰岛素B链的第15个氨基酸是芳香族残基或大脂肪族残基，和/或天然存在的人胰岛素B链的第20个氨基酸是芳香族残基或大脂肪族残基。
术语“单体胰岛素”是指与人胰岛素相比更不易形成更高级物质(比如二聚体、四聚体、六聚体等)的胰岛素和胰岛素类似物。优选地，该胰岛素或胰岛素类似物完全是或大体上是单体的，例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％是单体的。
如本领域技术人员所理解的，术语“治疗”是指可以治疗疾病或病症或可以改善与疾病或病症相关联的一种或多种症状的治疗、疗法或药物。如本文使用的，治疗可以指治疗化合物，包括但不限于：蛋白质、肽、核酸(例如，CpG寡核苷酸)、小分子、疫苗、过敏原提取物、抗体、基因疗法、其他生物制剂或小分子。
如本文使用的，术语“受试者”是指对胰岛素相关障碍易感的任何生物。如本领域技术人员所理解的，术语“受试者”和“患者”可互换地使用。例如，受试者可以是哺乳动物、禽类、节肢动物、脊索动物、两栖动物或爬行动物。示例性受试者包括但不限于：人，灵长类，家畜(例如绵羊、牛、鸡、马、驴、猪)，伴侣动物(例如，狗，猫)，实验室测试动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)，圈养野生动物(例如，狐狸，鹿)。在一个实例中，受试者是哺乳动物。在一个实例中，受试者是人。
如本文使用的，术语“治疗”包括预防特定障碍或病症，或减轻与特定障碍或病症相关联的症状，和/或预防或消除所述症状。例如，如本文使用的，术语“治疗糖尿病”通常是指将血糖水平维持在可接受的水平内，并且可包括根据给定情况增加或降低血糖水平。
如技术人员所理解的，胰岛素类似物将以治疗有效量给予。如本文使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以在一定程度上缓解所治疗的疾病或病症的一种或多种症状的所给予的胰岛素类似物的量。结果可为征象、症状或疾病原因的减少和/或缓和，或者任何其他需要的生物系统变化。例如，一种症状将是高血糖症的预防或治疗。胰岛素类似物的“有效量”是有效实现所需药理学效果或治疗改进而没有过度不良副作用的量。仅举例来说，治疗有效量可通过常规实验确定，包括但不限于剂量递增临床试验。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。应理解的是，“有效量”或“治疗有效量”可因受试者而异，这是由于受试者的任何年龄、体重、一般状况的化合物的代谢变化，待治疗的病症，所治病症的严重性，以及处方医师的判断。因此，它不总是能够指定精确的“有效量”。然而，由本领域的普通技术人员使用常规实验可确定在任何个别情况下的适当的“有效”量。当组合使用不止一种治疗剂时，每种治疗剂的“治疗有效量”可以是指在单独使用时治疗有效的治疗剂的量，或可以是指凭借其与一种或多种另外的治疗剂组合而治疗有效的减少的量。
如本文使用的，术语活性“起效”是指胰岛素到达血流并且开始降低血糖水平之前的时间长度，“峰”是指胰岛素类似物最佳降低血糖水平的时间段，以及“持续时间”指胰岛素持续作用(即，降低血糖水平)多长时间。本领域技术人员将意识到胰岛素类似物的起效、峰和持续时间可以根据以下因素而变化：比如患者、患者的病症和给予途径。
如本文使用的，术语“IR”包括野生型IR及其变体，包括等位基因变体和天然存在的突变以及基因工程化的变体。对于本领域技术人员显而易见的是，IR可以衍生自本文未具体披露的其他物质。此外，鉴于从原始生物到哺乳动物和人的IR序列的已知保守性，本领域技术人员将没有困难鉴定这种其他合适的IR。
毒液胰岛素晶体
在一方面，本发明提供了包含毒液胰岛素的晶体。如本文使用的，术语“晶体”意指结构(比如三维(3D)固体聚集体)，其中平面以特定角度相交并且其中存在组成型化学物质的规则结构(例如，内部结构)。术语“晶体”特别是指固体物理晶体形式(比如实验制备的晶体)。
可以使用来自芋螺属中的生物(比如，地纹芋螺和郁金香芋螺(Conus tulipa))的毒液胰岛素制备根据本发明所述的晶体。一些实施例涉及来自地纹芋螺毒液的胰岛素。然而，毒液胰岛素还可以来自其他物质。典型地，这些胰岛素包含20个氨基酸的A链和23个氨基酸的B链，然而，A链和B链的长度可以发生变化。A链和B链中的氨基酸可以被翻译后修饰；翻译后修饰的实例包括但不限于：谷氨酸可以被γ-羧化的谷氨酸(还被称为共轭碱γ羧基谷氨酸)置换，脯氨酸可以被羟脯氨酸置换，C-末端可以是酰胺化的，半胱氨酸可以被硒代半胱氨酸置换。本领域技术人员将认识到其他翻译后修饰是可能的。
在优选的实施例中，该毒液胰岛素是Con-Ins G1，并且具有以下示出的序列：
A链：GVVyHCCHRPCSNAEFKKYC*(SEQ ID NO：22)
B链：TFDTOKHRCGSyITNSYMDLCYR(SEQ ID NO：23)
其中y是γ-羧化的谷氨酸，O是羟脯氨酸，并且*A链的C-末端是酰胺化的。然而，胰岛素多肽还可以从其他物质或非天然设计的序列获得。
可以用野生型序列或其变体构建晶体，这些变体包括天然存在的突变以及基因工程化的变体。典型地，变体与相应的野生型毒液胰岛素具有至少90％、95％或98％序列同一性。
以下描述了包含毒液胰岛素的晶体的产物。
在优选的实施例中，本发明提供了具有空间群P432的Con-Ins G1的晶体，其中晶胞大小为其中任何晶胞大小中存在高达约2％变异。
在优选的实施例中，包含毒液胰岛素的晶体具有在附录I中列出的原子坐标。如本文使用的，术语“原子坐标”是参考轴系统定义一个或多个原子的位置的一组值。本领域技术人员将理解，原子坐标可以变化，而不会显著影响由其衍生的模型的准确性；因此，尽管本发明提供了对优选原子结构的非常精确的定义，但是应该理解，设想了微小的变化，并且权利要求旨在涵盖这样的变化。与在附录I中给出的坐标相比，优选的是如下变体，在这些变体中除氢之外，所有主链原子的x、y和z坐标的均方根偏差(RMSD)小于(优选小于或小于)。本领域技术人员将容易地理解，原子坐标的3D刚体旋转和/或平移不会改变所涉及的分子的结构。
毒液胰岛素的晶体结构
在另外的方面，还提供了毒液胰岛素的晶体结构或其区域。在一些实施例中，该毒液胰岛素是Con-Ins G1。在一些实施例中，如通过附录I的原子坐标所定义的，毒液胰岛素的晶体结构是Con-Ins G1的结构。
实验获得的毒液胰岛素的原子坐标显示在附录I中。然而，本领域技术人员将理解，由X射线晶体学确定的原子坐标集不是没有标准误差。因此，当在附录I中列出的原子坐标上叠加(使用主链原子)时，具有小于的蛋白质主链原子的均方根偏差的毒液胰岛素的结构坐标的任何组应被认为是相同的。
本发明还包括毒液胰岛素的原子坐标，这些原子坐标基本上符合附录I中列出的原子坐标。“基本上符合”给定原子坐标组的结构是如下结构，其中至少约50％的这样的结构具有如下RMSD：对于每个结构域中二级结构元件中的主链原子小于约 优选地，对于每个结构域中二级结构元件中的主链原子小于约并且更优选地，对于每个结构域中二级结构元件中的主链原子小于约并且在递增的偏好中，对于每个结构域中二级结构元件中的主链原子小于约小于约小于约以及最优选小于约
在更优选的实施例中，基本上符合给定原子坐标组的结构是如下结构，其中至少约75％的这样的结构具有列举的RMSD值，并且更优选地至少约90％的这样的结构具有列举的RMSD值，并且最优选地，约100％的这样的结构具有列举的RMSD值。
在甚至更优选的实施例中，“基本上符合”的上述定义可以被扩展以包括氨基酸侧链的原子。如本文使用的，短语“共同氨基酸侧链”是指对于基本上符合给定原子坐标组的结构和实际由这样的原子坐标表示的结构二者而言是共同的氨基酸侧链。
应当理解，多肽的原子坐标组是定义三维形状的点的相对组。因此，完全不同的坐标组可以定义相似或相同的形状是可能的。此外，各个坐标的微小变化将对整体形状几乎没有作用。
由于结构坐标的数学处理可以产生坐标的变化。例如，附录I中所列出的结构坐标可以通过结构坐标的晶体学排列、结构坐标的分级、结构坐标组的整数加法或减法、结构坐标的反转或其任何组合来处理。
可替代地，由于氨基酸的突变、添加、取代和/或缺失，或构成晶体的任何组分的其他变化，对晶体结构的修饰还可以解释结构坐标的变化。
各种计算分析用于确定分子复合物或其部分是否与上述毒液胰岛素的全部或部分结构足够相似。可以使用对于本领域技术人员已知的软件进行这样的分析，例如PDBeFOLD(Krissinel和Henrick，2004)、DALI(Holm和2010)、LSQMAN(Kleywegt和Jones，1994)和CHIMERA(Pettersen等人，2004)。
比较通常涉及计算所需的最佳平移和旋转，使得在特定等效原子对上的拟合的均方根差是绝对最小值。这个数字以埃为单位给出。因此，通过全身平移和/或旋转，在本发明范围内的毒液胰岛素的结构坐标包括与附录I中列出的原子坐标相关的结构坐标。因此，上面列出的RMSD值假设至少结构的主链原子是最佳叠加的，这可能需要平移和/或旋转以实现从中计算RMSD值的所需的最佳拟合。
在一些实施例中，还提供了附录I中列出的所述原子坐标的子集和与之基本上符合的子集。优选的子集定义毒液胰岛素的一个或多个区域，例如、(i)A链、(ii)B链、(iii)疏水核(例如，在Con-Ins G1中，该疏水核包含残基ValA2、CysA6、CysA11、PheA16、TyrA19、ArgB6、IleB11、TyrB15和LeuB18的侧链)、(iv)与PTM相互作用的PTM和残基、(v)受体结合表面(例如，Con-Ins G1的IR结合表面)；(vi)TyrB15和与TyrB15相互作用的残基；(vii)TyrB20和与TyrB20相互作用的残基；(viii)PheA16和与PheA16相互作用的残基；(ix)各自A链末端紧邻的残基的子集。
可以通过适合的建模计算机程序，比如MODELER(Sali和Blundell、1993)，如在Insight II同源软件包(Insight II(97.0)、MSI、圣地亚哥)中实施，使用例如来源于以下数据的信息对基本上符合特定原子坐标组的毒液胰岛素或其区域的三维的结构建模：(1)毒液胰岛素的氨基酸序列；(2)由具有三维构型的特定原子坐标组代表的蛋白质的一个或多个相关部分的氨基酸序列；和(3)特定三维构型的原子坐标。基本上符合特定原子坐标组的毒液胰岛素的三维结构还可以通过比如分子置换的方法计算，该方法将在下文详细描述。
通常将结构坐标/原子坐标加载到机器可读介质上以用于随后的计算操作。因此，模型和/或原子坐标有利地存储在机器可读介质上，例如磁性或光学介质和随机存取或只读存储器(包括磁带、磁盘、硬盘、CD-ROM和DVD、闪存卡或芯片、服务器和互联网)。该机器典型地是计算机。本发明还提供了一种计算机可读介质，该介质具有记录其上的表示Con-InsG1的模型和/或原子坐标的数据。还提供了一种计算机可读介质，该介质具有记录其上的根据附录I的坐标数据或其中任一个的子集，其中所述坐标数据定义了Con-Ins G1或Con-InsG1的区域的三维结构。
本发明还提供了如在附录I中所示的原子坐标组，或其子集或其中任一个，其中所述坐标定义了毒液胰岛素的三维结构。结构坐标/原子坐标可以用在计算机中以产生芋螺胰岛素晶体三维结构的代表，例如，图像，该代表可以由计算机显示和/或以电子文件表示。
结构坐标/原子坐标和由其衍生的模型还可用于各种目的，比如药物发现、生物试剂(结合蛋白)选择和其他蛋白质晶体的X射线晶体学分析。在一方面，提供了Con-Ins G1的结构作为结构模型的用途。在一些实施例中，该结构模型可以被用于鉴定胰岛素类似物。本发明还涵盖使用Con-Ins G1的结构作为结构模型鉴定的胰岛素类似物。
可以将Con-Ins G1或其区域的三维结构用于开发可用于药物设计和计算机模拟筛选与IR相互作用和/或调节IR的候选化合物的模型。其他物理化学特征也可用于开发模型，例如，粘接，静电等。
通常，术语“计算机模拟”是指在计算机存储器中，即在硅或其他类似芯片上的创建。除非另有说明，否则“计算机模拟”意指“虚拟的”。在本文中使用时，术语“计算机模拟”旨在是指基于使用计算机模型而不是体外或体内实验的筛选方法。
分子置换
使用分子置换，还可以将本文提供的Con-Ins G1的晶体结构用于模拟/解析新晶体的结构。
在一些方面，本发明还提供了毒液胰岛素或其子集的结构作为结构模型的用途。
在一些实施例中，毒液胰岛素、或毒液胰岛素的区域的原子坐标(比如在附录I中列出的那些)可用于确定至少含有类似于毒液胰岛素的一些结构特征的分子复合物的三维结构的至少一部分。特别地，可以获得关于另一种结晶的毒液胰岛素或胰岛素类似物的结构信息。这可以通过许多熟知的技术中的任一种(包括分子置换)来实现。
分子置换的方法对于本领域技术人员通常是已知的，例如PHASER(McCoy等人，2007)。分子置换的方法通常描述于Brunger，1997；Navaza和Saludjian，1997；Tong和Rossmann，1997；Bentley，1997；Lattman，1985；Rossmann，1972中。
通常，从结晶靶结构的晶体中收集X射线衍射数据。转换X射线衍射数据以计算Patterson函数。将结晶靶结构的Patterson函数与从已知结构(在本文中被称为搜索结构)计算的Patterson函数进行比较。结晶靶结构的Patterson函数在搜索结构Patterson函数上旋转，以确定晶体中结晶靶结构的正确方向。然后计算平移函数以确定靶结构相对于晶轴的位置。一旦结晶靶结构已正确定位在晶胞中，就可以计算实验数据的初始相位。这些相对于计算电子密度图和结构的精化所必需的，从该电子密度图可以观察到结构差异。优选地，搜索分子的结构特征(例如，氨基酸序列、保守的二硫键、和β-链或β-折叠)与结晶的靶结构相关。
进而，电子密度图可以经受任何熟知的模型构建和结构精化技术，以提供未知结晶分子复合物的最终、精确的结构(例如，参见Jones等人.1991；Brunger等人.1998)。
通过除分子置换之外的方法获得相的准确值是耗时的过程，该过程涉及近似和精化的迭代循环并且极大地阻碍晶体结构的溶解。然而，当已经解析了含有至少一个同源部分的蛋白质的晶体结构时，来自已知结构的多种相提供了对未知结构的多种相的令人满意的估计。通过使用分子置换，本文提供的(并且在附录I中列出的)毒液胰岛素的全部或部分结构坐标可用于确定结构未知的晶体化分子/分子复合物的结构，其比试图从头开始确定这些信息更快并且更有效。
可以通过该方法解析与毒液胰岛素的任何部分足够同源的任何结晶分子/分子复合物的任何部分的结构。该方法尤其可用于确定使用本文所述方法设计的胰岛素类似物的结构。
本文提到的所有分子/分子复合物可以使用熟知的X射线衍射技术进行研究，并且可以使用计算机软件，比如X-PLOR(耶鲁大学，由分子模拟公司(Molecular Simulations，Inc.)分配；参见Brünger、1996)、REFMAC(Murshudov等人.1997)、PHENIX(Adams等人.2010)和BUSTER(由全球定相公司(Global Phasing Ltd)分配、Bricogne等人.2011)相对于1.5-3.5A分辨率的X射线数据精化至约0.25或更小的R值。因此可以将该信息用于优化已知的胰岛素类似物，并且更重要地以设计新的或改进的胰岛素类似物。
用于使毒液胰岛素结晶的方法
本发明还提供了用于产生包含毒液胰岛素的晶体的方法。通过以下结晶方法可以获得本文披露的毒液胰岛素晶形。
在一方面，本发明提供了用于使毒液胰岛素结晶的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供毒液胰岛素的水溶液；
(b)任选地，浓缩步骤(a)的溶液；以及
(c)用沉淀剂溶液稀释步骤(a)或步骤(b)的溶液，使得该毒液胰岛素的终浓度是在0.5mg/mL至10mg/mL的范围内。
步骤(a)中提供的毒液胰岛素的水溶液可以是经缓冲的或未经缓冲的。可以使用对于本领域技术人员已知的任何适合的缓冲液。毒液胰岛素溶液的非限制性实例包括Tris-HCl、磷酸钠和三乙醇胺缓冲液。在未获得所需pH值的情况下，可以通过添加碱或酸(比如氯化铵、乙酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或盐酸)来调节pH。优选地，步骤(a)中的溶液含有10mM HCl。
任选地，然后可以将该溶液任选地进行浓缩。在一些实施例中，通过离心过滤浓缩该溶液。然而，可以使用对于本领域技术人员已知的任何适合的技术。浓缩步骤(b)后，该毒液胰岛素的浓度应该在1.0mg/mL至20mg/mL的范围内。优选地，该毒液胰岛素的浓度大约是4.0mg/mL。这是用步骤(c)的经缓冲的沉淀剂溶液稀释之前，步骤(b)结束时毒液胰岛素的浓度。例如，通过Bradford蛋白质测定或通过其他常规方法(包括UV吸光度光谱法)可以测定在步骤(b)的浓缩溶液中或步骤(b)的浓缩过程中或步骤(b)的浓缩之后该毒液胰岛素的浓度。
在步骤(c)中，将沉淀剂溶液添加至步骤(b)的溶液中。优选地，以在1∶4至4∶1之间的比率(步骤(b)的溶液：经缓冲的沉淀剂溶液)，最优选地以1∶1的比率用沉淀剂溶液稀释步骤(b)的溶液。
该沉淀剂溶液可以包含至少一种有机两亲性小分子和/或至少一种无机盐。在一些实施例中，该有机两亲性小分子可以选自下组，该组包含以下或由以下组成：甘油、乙二醇、丁基醚、苄脒、二噁烷、乙醇、异丙醇、丁醇、戊醇、甲基戊二醇、戊二醇、己二醇、庚三醇、二硫苏糖醇、MES、Tris、Tris-HCI、Bis-Tris、咪唑、二甘氨酸、三甲胺N-氧化物、琥珀酸、DL-苹果酸盐、CHES、CAPS、甘氨酸、CAPSO、ADA、MOPS、Bis-Tris丙烷、SPG、MIB、PCB、MMT、N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES)、TRIS、蔗糖及其组合。在优选的实施例中，该有机两亲性小分子包含DL-苹果酸盐、TRIS和MES。在一些实施例中，该有机两亲性小分子可以充当缓冲剂。在一些实施例中，溶液中有机两亲性小分子的pH可以被调节至在约2.0和约11.0之间，以及在例如2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0之间的任何pH。在一些实施例中，pH在约8.0和约10.0之间。在优选的实施例中，pH是9.0。
在一些实施例中，沉淀剂溶液中所有有机两亲性小分子的量是相对于经缓冲的沉淀剂溶液的总重量的有机两亲性小分子的在1％重量/体积和50％重量/体积之间，优选地在5％重量/体积和20％重量/体积之间，和更优选地在8％重量/体积和12％重量/体积之间。在优选的实施例中，该经缓冲的沉淀剂溶液包含10％重量/体积的有机两亲性小分子。
术语“至少一个有机两亲性小分子”意指可以使用前述有机两亲性小分子的混合物。在使用有机两亲性小分子的混合物的情况下，使用的量是指所有有机两亲性小分子在一起时的总量。
该沉淀剂溶液还可以包含无机盐。在一些实施例中，这些无机盐选自下组，该组由包含以下或由以下组成：氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、氟化铵、溴化铵、碘化铵、氮化铵、氯化镉、硫酸镉、氯化镉、乙酸钙、氯化铯、硫酸铯、氯化钴、氯化铁、乙酸锂、氯化锂、硝酸锂、硫酸锂、乙酸镁、甲酸镁、硝酸镁、氯化镍、乙酸钾、溴化钾、氟化钾、甲酸钾、碘化钾、硝酸钾、硫氰酸钾、酒石酸钾/钠、乙酸钠、溴化钠、氟化钠、碘化钠、硝酸钠、磷酸钠、硫酸钠、硫氰酸钠、氯化锌、硫酸锌、乙酸锌、氯化镁、氯化钠、二甲胂酸钠、氢氧化钠、氯化钾、氢氧化钾、硫酸钾、乙酸钠、酒石酸钠、甲酸铵、酒石酸二铵、丙二酸钠、酒石酸二钠、琥珀酸钠及其组合。在优选的实施例中，该无机盐是硫酸铵。
在一些实施例中，沉淀剂溶液中至少一种无机盐的量是在约50mM和约4000mM之间、在约1000mM和约3000mM之间、在约1500mM和在约2500mM或约2000mM之间。在使用不止一种无机盐的情况下，前述浓度是指在一起的所有无机盐的浓度，而不是无机盐混合物中使用的每种单一盐的浓度。
在一些实施例中，该沉淀剂溶液可以是经缓冲的。可以使用技术人员已知的任何缓冲液。在一些实施例中，该缓冲液包含以下或由以下组成：柠檬酸、乙酸钠、柠檬酸钠、二甲胂酸钠、HEPES钠、TRIS HCl、CAPSO、CAPS、苹果酸钠、MES钠等及其组合。在一些实施例中，该沉淀剂溶液可以具有在约2.0和约11.0之间的pH，并且任何pH在例如2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0之间。在一些实施例中，该沉淀剂溶液可以具有在约8.0和约10.0之间的pH。在优选的实施例中，该沉淀剂溶液可以具有pH为9.0。
在一些实施例中，该经缓冲的沉淀剂溶液包含多于1M的至少一种无机盐和/或在按重量计5％和按重量计20％之间的至少一种有机两亲性小分子。在优选的实施例中，该沉淀剂溶液包含2.0M硫酸铵和10％的DL-苹果酸盐-MES-Tris(pH 9.0)。
理论上，步骤(c)的经稀释的溶液中至少一种沉淀剂与蛋白质分子竞争水，从而导致蛋白质的过饱和。晶体通常只能从过饱和状态生长，并且因此它们可以从沉淀物中生长。盐、聚合物和有机溶剂是适合的沉淀剂。除了以上列出的经缓冲的沉淀剂溶液的组分之外，步骤(c)的溶液可以含有其他沉淀剂。
在一些实施例中，使用悬滴或坐滴方法进行结晶。“悬滴蒸气扩散”技术是最常用的大分子结晶方法。通过该方法，将由样品和试剂的混合物组成的液滴与液体试剂储存器置于蒸气平衡中。通常，液滴含有比储存器更低的试剂浓度。为了达到平衡，水蒸气离开液滴并且最终到达储存器。当水离开液滴时，样品的相对过饱和度增加。随着水离开液滴进入储存器，样品和试剂二者的浓度都增加。当液滴中的试剂浓度与储存器中的试剂浓度大致相同时达到平衡。
胰岛素类似物
野生型胰岛素包含A链肽和B链肽。野生型人胰岛素A链由序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：24)代表。野生型人胰岛素B链由序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO：25)代表。
本发明的诸位发明人已经确定了Con-G1Ins的三维结构，该结构是缺少与人胰岛素的芳香族三联体PheB24-PheB25-TyrB26的等效物的单体胰岛素。不希望受理论的束缚，认为TyrB15的侧链可以在IR结合方面补偿关键人胰岛素PheB24的不存在。还认为Con-InsG1 TyrB20的侧链可以参与补偿对人胰岛素PheB24的等效物的缺少。基于序列分析不能预测这些残基的潜在重要性。本文提供的结构发现提供了用于设计新颖型治疗性人胰岛素类似物的平台，该胰岛素类似物在本质上是单体的并且是速效的。
在一方面，本发明提供了包含A链肽和B链肽的胰岛素类似物，其中该B链包含在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的芳香族或大脂肪族残基和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的芳香族或大脂肪族残基，其中该类似物包含在人胰岛素中发现但在地纹芋螺胰岛素的相应的位置中缺少的至少一个氨基酸，并且其中该A链肽和B链肽跨过至少一对半胱氨酸残基结合在一起。在一些实施例中，该芳香族残基或大脂肪族残基可以是天然的或非天然的氨基酸。
胰岛素-IR复合物的共晶体结构揭示了PheB24的侧链作为由IR和胰岛素B链定义的非极性口袋(被称为B24相关的结合口袋)内的“锚”发挥独特作用(Menting等人，2014)。不希望受理论的束缚，本发明设想在人胰岛素B链的位置15和/或位置20处的大脂肪族或芳香族取代可通过插入B24相关的结合口袋来补偿PheB24的缺少。预期大脂肪族或芳香族残基的侧链可与B24相关的结合口袋在物理和化学上相容。
在一些实施例中，在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的芳香族或大脂肪族残基选自下组，该组由以下组成：酪氨酸、苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、环戊基丙氨酸和环己基丙氨酸。在一些实施例中，在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的芳香族或大脂肪族残基选自下组，该组由以下组成：酪氨酸、苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、环戊基丙氨酸和环己基丙氨酸。该芳香族残基或大脂肪族可以是天然的或非天然的氨基酸。
在一些实施例中，该B链包含在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的芳香族残基和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的芳香族残基。该芳香族残基可以是天然的或非天然的氨基酸。例如，该芳香族氨基酸可以是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、4-乙酰基苯丙氨酸等。
在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的酪氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的酪氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的酪氨酸和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的酪氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的苯丙氨酸和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的苯丙氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的色氨酸和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的色氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的4-乙酰基苯丙氨酸和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的4-乙酰基苯丙氨酸。
在一些实施例中，该B链包含在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的大脂肪族残基和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的大脂肪族残基。如本文使用的，“大脂肪族”残基具有比亮氨酸(人胰岛素中在位置15和20处天然存在的)侧链更大的侧链。例如，在一些实施例中，与亮氨酸相比，大脂肪族残基的侧链可以具有相同数目或更多的非氢原子。在一些实施例中，当与亮氨酸相比时，大脂肪族残基的侧链具有更大的侧链体积。在一些实施例中，当与亮氨酸相比时，大脂肪族残基的侧链具有更高的分子量。在一些实施例中，当与亮氨酸相比时，大脂肪族残基的侧链具有更强的构象灵活性。该大脂肪族”残基可以是天然的或非天然的氨基酸。例如，该大脂肪族残基可以是甲硫氨酸、异亮氨酸、环戊基丙氨酸或环己基丙氨酸等。
在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的甲硫氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的甲硫氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的环己基丙氨酸和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的环己基丙氨酸。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的环戊基丙氨酸和/或在对应于人胰岛素B链的位置20的位置处的环戊基丙氨酸。
在一些实施例中，该胰岛素类似物具有经修饰的B链，该B链缺少对IR结合必需的芳香族三联体PheB24-PheB25-TyrB26，并且在大多数情况下，该胰岛素类似物与人胰岛素相比具有更短的B链。在一些实施例中，当与人胰岛素相比时，该B链在C-末端是截短的。在一些实施例中，该B链缺少人胰岛素的九个C-末端氨基酸中的一个或多个，例如该B链缺少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个人胰岛素的C-末端氨基酸。在一些实施例中，该B链至少缺失人胰岛素的PheB24。在一些实施例中，该B链至少缺失人B链芳香族三联体(人胰岛素的氨基酸PheB24-PheB25-TyrB26)。这些残基可以是不存在的或可以被取代，使得在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号24、25和/或26的位置处的氨基酸分别不是苯丙氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34，其中XA2＝Val或Ile；XA3＝Val或Ala；XA4＝Glu、Asp、γ羧基谷氨酸或Cys；XA5＝Gln、Glu、γ羧基谷氨酸、His或Val；CysA6、CysA7、和CysA11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；XA8＝Thr、His、Asp、Gln、Tyr、Lys、Ala或Val；XA9＝Ser、Arg、Asn、Gly、His或Lys；XA10＝Ile、Pro、Tyr、A1a、Ser、Val、Phe、His或Thr；XA12＝Ser或Thr；XA13＝Leu、Asn、Val、Arg或Asp；XA14＝Tyr、Ala、Gln、His、Asp或Glu；XA15＝Gln、Glu或Thr；XA16＝Phe、Leu或Ala；XA17＝Glu、Gln、Lys、Arg、Ile、Met、Thr或Ser；XA18＝Lys、Ser、Thr、Asn、Gln或Glu；XA19＝Tyr或Phe；CysA20＝Cys、硒代半胱氨酸、酰胺化的Cys、或酰胺化的硒代半胱氨酸；XA21＝Asn、Pro、His、Ser、Gly、Ala或不存在；XA22＝Pro、Asn、Thr、Leu、Ser或不存在；XA23＝Thr、Leu、Val、Ser或不存在；XA24＝Arg、Thr、Met、Gln、Leu或不存在；XA25＝Glu、Gly或不存在；从XA26＝Ser、Leu或不存在；XA27至XA31独立地是Ser或不存在；XA32＝Ala、Ser或不存在；XA33＝Ala、Val或不存在；并且XA34＝Ala或不存在(SEQ ID NO：1)；和
B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Ala、Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Ala、Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Lys、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Thr、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Thr、Tyr、Pro、Leu或Gly；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg、Ser或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Val、Tyr、Phe、His、Gly、Gln、Leu、酰胺化的His、酰胺化的Val或不存在；XB23＝Glu、Asp、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Ile、Leu、Ser、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Ala、Asp、Ser、Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：2)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含B链肽，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：3)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；并且XB24、XB25、XB26、XB27、XB28、XB29、XB30、XB31、XB32、XB33、XB34、XB35、XB36、XB37、XB38和XB39是不存在的(SEQ ID NO：4)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17一XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：5)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His或Tyr；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val或Leu；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：6)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr、Asn或不存在；XB2＝Phe、Ser或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Asn或Gln；XB7＝His或Tyr；XB8＝Arg、Ile或Leu；XB12＝His、Asp、Glu或γ羧基谷氨酸；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB13＝Val、Ile或Leu；XB14＝Thr、Ala、Pro或Val；XB15＝Glu、Val、Asn或Asp；XB16＝Ser、Gln、Tyr或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Asp、Met或Val；XB19＝Leu、Asp、Gln或Lys；XB20＝Leu或Val；CysB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr或Gly；并且XB23＝Glu、Arg、Gly或不存在(SEQ IDNO：7)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：8)。
在一些实施例中，在位置XB17和XB22上的残基是酪氨酸。在一些实施例中，XB22是Tyr。在一些实施例中，XB17是Tyr。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34，其中XA2＝Val或Ile；XA3＝Val或Ala；XA4＝Glu、γ羧基谷氨酸或Cys；XA5＝Gln、Glu、γ羧基谷氨酸、His或Val；CysA6、CysA7、和CysA11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；XA8＝Thr、His、Asp、Gln、Tyr、Lys或Val；XA9＝Ser、Arg、Asn、His或Lys；XA10＝Ile、Pro、Tyr、Ala、Ser、Phe、His或Thr；XA12＝Ser或Thr；XA13＝Leu、Asn、Val或Asp；XA14＝Tyr、Ala、Gln、Asp或Glu；XA15＝Gln、Glu或Thr；或Ala；XA17＝Glu、Lys、Arg、Ile、Met、Thr或Ser；XA18＝Lys、Thr、Asn、Gln或Glu；XA19＝Tyr或Phe；CysA20＝Cys、硒代半胱氨酸、酰胺化的Cys、或酰胺化的硒代半胱氨酸；XA21＝Asn、Pro、His、Ser、Gly、Ala或不存在；XA22＝Pro、Asn、Thr、Leu、Ser或不存在；XA23＝Thr、Leu、Val、Ser或不存在；XA24＝Arg、Thr、Met、Gln、Leu或不存在；XA25＝Glu、Gly或不存在；从XA26＝Ser、Leu或不存在；XA27至XA31独立地是Ser或不存在；XA32＝Ala、Ser或不存在；XA33＝Ala、Val或不存在；并且XA34＝Ala或不存在(SEQ ID NO：9)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA16是Phe或Leu；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：10)；和
B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Gly或Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：11)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：12)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-Tyr-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：13)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：14)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-Leu-CysB21-Tyr-XB23；其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：15)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：26)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-Tyr-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Gly或Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：27)。
在一些实施例中，胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：28)；和B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-Tyr-XB18-XB19-Leu-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp、XB22＝Gly或Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：29)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQID NO：16)；和B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ ID NO：17)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQID NO：18)；和B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ ID NO：19)。
在一些实施例中，该胰岛素类似物包含A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQID NO：20)；和B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ ID NO：21)。
人胰岛素的许多修饰先前已经被鉴定出，这些修饰增加类似物对IR的亲和力。例如，用组氨酸置换人胰岛素的ThrA8导致对IR的亲和力的三倍增加(Glendorf等人，(2011))。在一些实施例中，该胰岛素类似物在对应于人胰岛素的ThrA8的位置处具有组氨酸残基。
这些胰岛素类似物可以包含一个或多个非天然的氨基酸、经修饰的氨基酸或合成的氨基酸类似物，它们中的一些用本文的序列指示。例如，这样的氨基酸包括但不限于：共同氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、戊氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、γ羧基谷氨酸、羟脯氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、硒代半胱氨酸、酰胺化的半胱氨酸、酰胺化的硒代半胱氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计的氨基酸(比如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)以及通常的氨基酸类似物。在该范围内还包括在合成期间或之后经以下作用差异修饰的肽，例如：生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白质水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等。
如本文披露的，相比不含PTM的类似物，针对人IR-B的含有PTM的Con-Ins G1的合成的类似物具有高出四倍的活性(参见实例)。在一些实施例中，一个或多个Glu残基可以被γ-羧基谷氨酸(Gla)置换，例如在各种A链的XA4或XAsGlu位置或在一些B链的XB12Glu位置处。在一些实施例中，一个或多个Pro残基可以被羟脯氨酸(Hyp)置换，例如在某些B链的XB5Pro位置处。在一些实施例中，C-末端可以被酰胺化，比如尤其在各种A链的末端处酰胺化的Cys(*)等。在一些实施例中，该胰岛素类似物包含以下的一种或多种：(i)XA4是γ羧基谷氨酸、ii)XB5＝羟脯氨酸；并且iii)XB12＝γ羧基谷氨酸。本发明的诸位发明人已经发现这些PTM中的至少一些有助于Con-Ins G1与IR结合。
这些胰岛素类似物具有跨至少一对半胱氨酸残基结合在一起的A链肽和B链肽。在一些实施例中，该B链肽的CysB9与该A链肽的CysA6结合，该B链肽的CysB21与该A链肽的CysA20结合和/或CysA7与CysA11结合。
在一些实施例中，A链肽和B链肽可以在一个或多个末端处连接在一起。在一些实施例中，A链肽和B链肽在末端处连接在一起。例如，A链肽的N-末端可以与B链肽的N-或C-末端连接，A链肽的C-末端可以与B链肽的N-或C-末端连接，A链肽的C-末端可以与A链肽的N-末端连接或B链肽的C-末端可以与B链肽的N-末端连接。在一些实施例中，该A链肽和该B链肽在两个末端处连接在一起。因此，虽然在一些实施例中，胰岛素类似物是非环状的，但在其他情况下，胰岛素类似物可以是环状的，同时保留所述的Cys-结合模式。在这样的实施例中，该胰岛素类似物具有环化主链，使得A链和B链不具有游离的N-或C-末端(对于两个末端连接的实施例)。一个或多个末端的连接可以直接在A链和B链肽主链的氨基酸之间，或可以存在一个或多个氨基酸的接头或其间结合的其他接头分子。
在一些实施例中，可以将对于本领域技术人员已知的以改进稳定性的化学基团、残基或残基基团添加至C-末端和/或N-末端。在一些实施例中，可以将对于本领域技术人员已知的以改进生物利用度的化学基团、残基或残基基团添加至C-末端和/或N-末端。在一些实施例中，可以被添加至N-末端的这样的残基或基团还可以在胰岛素类似物中置换Gly。在一些实施例中，可以将荧光标记附接至C-末端或N-末端。
本文披露的胰岛素类似物肽可以通过本领域技术人员已知的任何技术或方法制备，并且任何这样的技术或方法都被认为在本发明的范围内。例如，技术包括但不限于：化学合成、固相肽合成、重组表达、肽合成和重组表达的组合等。技术的实例在实例部分中被进一步描述。胰岛素类似物可以按各种形式，例如天然的、融合的、糖基化的、脂质化的等进行制备。
胰岛素类似物优选以基本上纯的形式(即基本上不含宿主细胞蛋白质或其他污染物)进行制备。通常，当胰岛素类似物按重量计占存在的总蛋白质的至少60％时，其基本上是纯的。例如，该胰岛素类似物按重量计占存在的总蛋白质的至少75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、更优选地至少90％。
本披露还提供了胰岛素类似物的盐或衍生物。如本文使用的，术语“盐”表示与无机酸或有机酸和/或碱形成的酸性盐和/或碱性盐，优选碱性盐。尽管通常优选的是药学上可接受的盐，特别是当使用胰岛素类似物作为药物时，其他盐可在例如用于加工这些化合物，或考虑非药物类用途。这些化合物的盐可以通过本领域技术人员已知的任何技术来制备。
如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”是指如下化合物的盐，其保留母体化合物的生物活性，并且在生物学上或其他方面不是非希望的。凭借存在氨基和/或羧基基团或与其类似的基团，本文披露的许多化合物能够形成酸性盐和/或碱盐。药学上可接受的碱加成盐可以从无机碱和有机碱制备。从无机碱衍生的盐仅通过举例的方式包括钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。从有机碱衍生的盐包括但不限于：伯胺、仲胺和叔胺的盐。药学上可接受的酸加成盐可以从无机酸和有机酸制备。从无机酸衍生的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。从有机酸衍生的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
如本文使用的，术语“衍生物”包括α氨基酸，其中在天然存在的α-氨基酸中发现的一个或多个侧基已经被修饰。因此，例如天然存在的氨基酸可以被各种各样未编码的或经修饰的氨基酸，比如相应的D-氨基酸或N-甲基氨基酸置换。其他修饰是本领域技术人员已知的，并且包括用化学上相似的基团取代羟基、硫醇、氨基和羧基官能团，例如在半胱氨酸中用-SeH取代-SH。
在一些实施例中，该胰岛素衍生物、其盐或衍生物能够结合IR。优选地，该IR是人IR-B受体。在一些实施例中，针对人IR-B受体的IC50或亲和力(Kd)小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M。优选地，针对人IR-B受体的IC50小于10-6M。
在一些实施例中，胰岛素类似物、其盐或衍生物不结合IGF-IR或弱结合IGF-IR。如本文使用的，“弱地”是指未以足够的亲和力与IGF-IR结合的胰岛素类似物，从而导致IGF-IR的激活和/或引起经IGF-IR的信号转导。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有针对IGF-IR的弱于10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M或10-4M的IC50或Kd，优选地，该胰岛素类似物具有针对IGF-IR的弱于100nM的亲和力(Kd)。
在一些实施例中，该胰岛素衍生物、其盐或衍生物在溶液中主要是单体的。在一些实施例中，至少50％的胰岛素类似物是单体，至少60％的胰岛素类似物是单体，至少70％的胰岛素类似物是单体，至少75％的胰岛素类似物是单体，至少80％的胰岛素类似物是单体，至少85％的胰岛素类似物是单体，至少90％的胰岛素类似物是单体，至少95％的胰岛素类似物是单体，至少98％的胰岛素类似物是单体，至少99％的胰岛素类似物是单体或大约100％的胰岛素类似物是单体。在一些实施例中，该胰岛素类似物是单体的。在一些实施例中，在给予受试者时，该胰岛素类似物可以至少部分地是单体的并且解离成单体形式。在一些实施例中，该胰岛素类似物是单体的或在受试者血流中解离成单体形式。
在一些实施例中，该胰岛素衍生物、其盐或衍生物是速效胰岛素类似物。在一些实施例中，当给予人时，当与人胰岛素相比时，该胰岛素类似物具有增加的生物利用度。在一些实施例中，该胰岛素类似物、其盐或衍生物具有在给予至人的10分钟至6小时内的峰生物利用度。在一些实施例中，给予后胰岛素类似物的最大血浆浓度比给予后人胰岛素的最大血浆浓度更早出现。例如，该胰岛素衍生物、其盐或衍生物的峰有效性在给予的10分钟至4小时内，在给予的15分钟至3小时内，在给予的30分钟至1小时内或在给予的40至55分钟内出现。在一些实施例中，该胰岛素衍生物、其盐或衍生物具有在给予的2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或30分钟内的活性起效。优选地，活性起效是在给予的10至30分钟内。
本发明的胰岛素类似物还包括使用本发明的方法设计或鉴定的那些以及能够识别并且与靶结合位点结合的那些。
靶结合位点包括胰岛素的生理结合配偶体(比如IR)，以及生理结合配偶体的区域。例如，靶结合位点可以是限定表位的短多肽(例如，对应于下文鉴定为靶结合位点的环结构)或模拟环结构的模拟物，例如，肽模拟物。
在一些实施例中，该靶结合位点是胰岛素受体，优选人胰岛素受体。在一些实施例中，该靶结合位点是涉及胰岛素与受体对接的IR区域。在一些实施例中，IR的区域包括低亲和力靶结合位点，这些位点包含以下的一种或多种：IR胞外域的L1结构域、CT肽和CR结构域。关于L1结构域，靶结合位点优选包含L1的中央β-折叠分子表面的部分和第二LRR的分子表面的部分，该第二LRR包含Phe39或L1的第四LRR梯级中的环，或优选两者。关于CR结构域，靶结合位点优选包含CR结构域的模块6。
在一些实施例中，低亲和力靶结合位点可以包含一个或多个氨基酸，该氨基酸来自以下氨基酸序列中的一个或多个：(i)氨基酸1-156；(ii)氨基酸704-719；和(iii)氨基酸157-310。
关于氨基酸1-156，靶结合位点优选地包含来自氨基酸序列1-68、优选地1-55，和更优选地氨基酸序列27-55的至少一个氨基酸。该靶结合位点优选地包含选自Arg14、Asn15、Gln34、Leu36、Leu37、Phe39、Pro43-Phe46、Phe64、Leu87、Phe88、Asn90和Phe89的至少一个氨基酸，更优选地选自Arg14、Asn15、Gln34、Leu37、Phe39、Pro43-Phe46、Phe64的至少一个氨基酸，又更优选地选自Phe39和Pro43-Phe46的至少一个氨基酸，以及最优选地至少Phe39。
关于氨基酸157-310，靶结合位点优选地包含来自氨基酸序列192-310的至少一个氨基酸，更优选地来自序列227-303的至少一个氨基酸，又更优选地选自序列259-284的至少一个氨基酸。
在另一方面，本发明还提供了包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。披露的是包含A链肽和B链肽的肽，其中与野生型人胰岛素相比，该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，任何保守氨基酸取代可以存在于位置10、20处或同时两个位置处。例如，另一个亲水性氨基酸、极性氨基酸或脂肪族氨基酸可以在一个或两个位置处被取代。
在所披露的肽的一些情况下，在B链肽的氨基酸20处的取代可以是G20Y、G20F或G20P。在一些情况下，在氨基酸20处的取代是G20Y。在一些情况下，在氨基酸20处的取代可以是G20P，并且该肽进一步包含在氨基酸21处的取代，其中在氨基酸21处的取代可以是G21H。在一些情况下，氨基酸取代可以是来自甘氨酸的任何保守取代。
在所披露的肽的一些情况下，在B链肽的氨基酸10处的取代可以是H10E、H10D或H10Q。在一些情况下，在氨基酸10处的取代是H10E。在一些情况下，氨基酸取代可以是来自组氨酸的任何保守取代。
在一些情况下，与野生型胰岛素相比，胰岛素A链肽和B链肽均可以包含取代。披露了肽，这些肽包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，并且进一步包含A链肽中的至少一个取代，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，至少一个取代可以发现于位置8或9处。在一些情况下，A链肽中的至少一个取代可以是T8H、T8Y、T8K或S9R。在一些情况下，任何保守的氨基酸取代可以存在于位置8或9处或同时两个位置处。例如，另一个亲水性氨基酸可以被取代或其他极性氨基酸可以被取代。
披露了肽，这些肽包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，并且进一步包含A链肽中的至少两个取代，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，至少两个取代可以发现于位置8和9处。在一些情况下，A链肽中的至少两个取代可以选自：T8H、T8Y、T8K和S9R。在一些情况下，任何保守的氨基酸取代可以存在于位置8或9处或同时两个位置处。例如，在一个或两个位置处，另一个亲水性氨基酸可以被取代，或其他极性氨基酸可以被取代。
在一些情况下，与野生型相比，该B链肽缺少一个或多个，多达八个C-末端氨基酸。因此，所披露的肽可以是去八肽胰岛素肽(缺少人胰岛素B链的C-末端的8个氨基酸)。例如，在一些情况下，所披露的肽可以具有B链肽，该B链肽包含以下序列：
FVNQHLCGSELVEALYLVCYER(SEQ ID NO：30)、
FVNQHLCGSELVEALYLVCFER(SEQ ID NO：31)、
FVNQHLCGSELVEALYLVCPER(SEQ ID NO：32)、
FVNQHLCGSDLVEALYLVCYER(SEQ ID NO：33)、
FVNQHLCGSDLVEALYLVCFER(SEQ ID NO：34)、
FVNQHLCGSDLVEALYLVCPER(SEQ ID NO：35)、
FVNQHLCGSQLVEALYLVCYER(SEQ ID NO：36)、
FVNQHLCGSQLVEALYLVCFER(SEQ ID NO：37)、或
FVNQHLCGSQLVEALYLVCPER(SEQ ID NO：38)。
在一些情况下，所披露的肽可以具有A链，该A链包含以下序列：GIVEQCCHRICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：39)、
GIVEQCCYRICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：40)、或
GIVEQCCKRICSLYQLENYCN(SEQ ID NO：41)。
在所披露的肽的一些情况下，A链肽和B链肽可以经至少一个二硫键结合。在一些情况下，A链肽和B链肽可以经至少两个二硫键结合。
在一些情况下，所披露的肽是单体。换言之，在一些情况下，所披露的肽形成二聚体、四聚体、六聚体等的可能性较小。
在所披露的肽的一些情况下，胰岛素A链肽可以与野生型人胰岛素A链肽具有至少70％同一性。在一些情况下，胰岛素A链肽可以与野生型人胰岛素A链肽具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性。在一些情况下，可以通过从所披露的肽的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸来实现百分比同一性。
在所披露的肽的一些情况下，胰岛素B链肽可以与野生型人胰岛素B链肽具有至少70％同一性。在一些情况下，胰岛素B链肽可以与野生型人胰岛素B链肽具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性。在一些情况下，可以通过从所披露的肽的N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸来实现百分比同一性。
在一些情况下，所披露的肽可以包含一个或多个非天然氨基酸、经修饰的氨基酸或合成氨基酸类似物。这样的氨基酸包括但不限于：共同氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、戊氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计的氨基酸(比如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)以及通常的氨基酸类似物。在该范围内还包括在合成期间或之后经以下作用差异修饰的肽，例如：生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白质水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的连接等。这些修饰可用于增加肽的稳定性和/或生物活性。
在所披露的肽的另外的情况下，提供了具有经至少一个二硫键与B链肽结合的A链肽的治疗性蛋白质，其中该A链包含GIVEQCCHRICSLYQLENYCN的序列(SEQ ID NO：39)，并且其中该B链肽包含FVNQHLCGSELVEALYLVCYER的序列(SEQ ID NO：30)。
应理解，所披露的治疗性蛋白质可用于药物组合物中并且与包括糖尿病在内的障碍的治疗联合使用。
用于设计胰岛素类似物的方法
可以将由本发明提供的毒液胰岛素的三维结构用于设计胰岛素类似物(本文中还被称为IR激动剂、分子和化合物)，特别是速效胰岛素类似物。在一方面，提供了如通过附录I的原子坐标定义的Con-Ins G1的结构作为结构模型的用途。在一些实施例中，该结构模型被用于鉴定胰岛素类似物。
在一些实施例中，提供了鉴定、设计或筛选可潜在地与IR相互作用的化合物的方法。该方法包括基于化合物与由Con-Ins G1的三维结构或其子集定义的IR结构的相互作用进行化合物的基于结构的鉴定、设计或筛选。
本发明还可用于改进已知IR结合分子的特性。例如，可以针对由附录I的原子坐标或其部分定义的Con-Ins G1的3D结构筛选已知的IR结合分子，并且评估自我结合的能力和与IR相互作用的潜能。鉴于该评估，可以重新设计(即，经化学修饰)已知的IR结合分子，以赋予以下一种或多种特性：(i)减少自我结合，(ii)针对IR的低亲和力结合位点(即，控制选择性的结合位点)改进该结合分子的亲和力，(iii)针对IR的高亲和力结合位点(即，控制信号转导的结合位点)改进该结合分子的亲和力，以及(iv)降低该结合分子的结合IGF-1R的亲和力。
在一些实施例中，提供了重新设计或修饰已知与IR或IR的区域结合的多肽的方法。该方法包括对由附录I的原子坐标或其子集定义的结构进行基于结构的评估，并且依照评估的结果，重新设计或化学修饰多肽。在一些实施例中，基于结构的评估包括将由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素的原子坐标或其子集定义的结构进行比较。在一些实施例中，基于结构的评估进一步包括在由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素受体的原子坐标或其子集定义的结构之间形成的复合物的分子建模。在一些实施例中，该模型由附录II的原子坐标或其子集定义。
在一些实施例中，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测试该多肽结合IR的能力。在一些实施例中，测定了经重新设计或化学修饰的多肽的调节IR激活的能力。在一些实施例中，可以测定经重新设计或化学修饰的多肽降低血糖水平的能力。
在一些实施例中，已知与IR结合的多肽是胰岛素样生长因子(IGF)。适合的IGF包括来自人、猪、牛、鸟、小鼠等的那些。在一些实施例中，该IGF是人IGF-I或IGF-II。
在优选的实施例中，已知与IR结合的该多肽是胰岛素。适合的胰岛素包括人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、绵羊胰岛素、鼠胰岛素、豚鼠胰岛素等。在一些实施例中，该胰岛素是人胰岛素。
如本文使用的，术语“建模”包括基于原子结构信息和相互作用模型的分子结构和/或功能的定量和定性分析。术语“建模”包括传统的基于数字的分子动态和能量最小化模型、交互式计算机图形模型、改进的分子力学模型、距离几何学以及其他基于结构的约束模型。
可以将分子建模技术应用于Con-Ins G1的原子坐标或其区域以得到一系列3D模型并且研究结合位点，例如IR和其他蛋白质靶标的结合位点的结构。
本文提及的Con-Ins G1的区域可以由单个氨基酸(或其侧链)、由连续氨基酸序列或由两个或更多个单独的氨基酸和/或氨基酸段定义。这种单独的氨基酸和/或氨基酸段可以在三维结构中彼此空间紧密接近地存在，或可以具有使其空间紧密接近的潜能，例如，在适合的配体结合时。适合地，Con-Ins G1的区域包含参与IR结合的氨基酸序列，该结合是与IR二聚体中其他单体的初始选择性低亲和力结合和随后的高亲和力结合二者。
这些技术还可用于筛选或设计能够结合IR并且调节IR活性的小型和大型化学实体。筛选可以使用实体3D筛选系统或计算筛选系统。
在一些实施例中，此类建模方法是设计或选择与IR的特定区域具有立体化学互补的化学实体(例如多肽、肽、肽模拟物、化合物等)。“立体化学互补性”意指化合物或其部分与受体产生足够数量的能量上有利的接触，以便在与受体的结合时具有自由能的净减少。
应当理解，化学实体和受体位点之间的互补性不必延伸跨过受体位点的所有残基，以便于抑制与IR胞外域天然相互作用的分子或复合物的结合。
可以使用许多方法鉴定与IR的区域具有立体化学互补性的化学实体。例如，该过程可以通过基于Con-Ins G1的原子坐标或其区域在计算机屏幕上目视检查Con-Ins G1结构来开始，该Con-Ins G1的原子坐标或其区域在附录I中从机器可读存储介质中生成。在一些实施例中，该方法可以通过在由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素受体的原子坐标或其子集定义的结构之间形成的复合物的分子建模来开始。可以使用本领域熟知并且可获得的建模软件，例如MODELLER(v9.15)(Webb和Sali(2014))。该建模步骤之后可以使用标准分子力学力场(如CHARMM)进行能量最小化(Guvench等人，2011；Best等人，2012)。建模和能量最小化之后可以使用本领域已知的软件，例如NAMD进行分子动力学模拟(Phillips等人，2005)。另外，有许多更专业的计算机程序有助于选择本发明的结合部分的方法。
还提供了通过本文所定义的重新设计或修饰多肽的方法已经被重新设计或修饰的多肽或其盐或类似物。优选地，该重新设计或经修饰的多肽是单体的，或当给予受试者时解离成单体。
IR的优选区域是控制特异性的那些区域，例如被描述为上述靶结合位点的区域。
在另一方面，提供了作为IR激动剂的分离的分子，其中该分子基于由附录I的原子坐标或其子集定义的Con-Ins G1的3D结构被鉴定和/或设计。适合的分子包括肽、多肽或肽模拟物。
如本文使用的，术语“肽模拟物”是模拟肽的生物活性但在化学性质上不再完全是肽的分子。通过严格的定义，肽模拟物是不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子。然而，可以将术语肽模拟物用于描述在性质上不再完全是肽的分子，例如假肽、半肽和类肽。无论是完全还是部分非肽，本发明的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，该空间排列非常类似于肽模拟物所基于的肽中的活性基团的三维排列。由于这种类似的活性位点几何结构，肽模拟物对生物系统具有作用，这种作用类似于肽的生物活性。
使用本文所述的容易获得的技术和/或方法可以开发基于毒液胰岛素的适合的肽模拟物。因此，例如，肽键可以被非肽键置换，该非肽键允许肽模拟物对原始肽采用类似的结构，并且因此具有生物活性。通过用类似结构的其他化学基团取代氨基酸的化学基团也可以进行进一步的修饰。可以通过参考附录I中提供的这些残基的三维结构或其子集来辅助衍生自毒液胰岛素的肽模拟物的开发。使用以下程序，可以将该结构信息用于搜索三维数据库来鉴定具有相似结构的分子，比如MACCS-3D和ISIS/3D(分子设计公司(MolecularDesign Ltd.)，圣莱安德罗，加利福尼亚州)、ChemDBS-3D(化学品设计公司(ChemicalDesign Ltd.)，牛津，英国)和Sybyl/3DB Unity(卓普斯联合公司(Tripos Associates)，圣路易斯，密苏里州)。
本领域技术人员将认识到，肽模拟物的设计可能需要对使用本发明的方法设计或鉴定的化学结构进行轻微的结构改变或调整。通常，使用本发明的方法鉴定或设计的模拟物可以化学合成，并且然后使用本文所述的任何方法测试调节胰岛素受体活性的能力。本发明的方法特别有用，因为它们可用于大大减少必须筛选其调节胰岛素受体活性能力的潜在模拟物的数量。
在一些实施例中，该分离的分子能够结合IR。优选地，该IR是人IR-B受体。在一些实施例中，针对人IR-B受体的强于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的IC50或Kd。优选地，针对人IR-B受体的强于10-6M的IC50或Kd。在一些实施例中，该分离的分子不结合IGF-IR或弱结合IGF-IR。优选地，该分离的分子对IGF-IR具有弱于100nM的亲和力(Kd)。
在一些实施例中，分离的分子在溶液中主要是单体的。在一些实施例中，至少50％的分离的分子是单体，至少60％的分离的分子是单体，至少70％的分离的分子是单体，至少75％的分离的分子是单体，至少80％的分离的分子是单体，至少85％的分离的分子是单体，至少90％的分离的分子是单体，至少95％的分离的分子是单体，至少98％的分离的分子是单体，至少99％的分离的分子是单体或大约100％的分离的分子是单体。在一些实施例中，该分离的分子可以至少部分地是单体的并且在给予受试者时解离成单体形式。在一些实施例中，该分离的分子是单体的或在受试者血流中解离成单体形式。
本发明还可用于鉴定和/或设计不结合IGF-1R或弱结合IGF-1R的胰岛素类似物。例如，使用本发明的方法鉴定的胰岛素类似物可以按计算机模拟、在体外和/或在体内针对其结合IGF-IR的能力进行筛选。可以重新设计发现或怀疑与IGF-IR结合的任何胰岛素类似物，以便对IR更具选择性。
在一些实施例中，通过本文的方法鉴定的胰岛素类似物(该胰岛素类似物包括分离的分子、化合物或IR激动剂)不结合IGF-IR或弱结合IGF-IR。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有针对IGF-IR的弱于10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M或10-4M的IC50或Kd，优选地，该胰岛素类似物具有针对IGF-IR的弱于100nM的亲和力(Kd)。
本披露还提供了鉴定结合IR的化合物的方法，该方法包括：
i)产生多肽的三维结构模型，该多肽具有：
a)由附录I的原子坐标或其子集定义的结构、或
b)当叠加在相应的a)中的主链原子上时具有小于约的均方根偏差的结构，和
ii)设计或筛选潜在结合该IR的化合物。
在一些实施例中，产生三维结构模型包括产生与IR或其区域结合的多肽的模型。IR的优选区域是控制特异性的那些区域，例如被描述为上述靶结合位点的区域。在一些实施例中，该模型由附录II的原子坐标或其子集定义。
该模型在某种意义上可以是适应性的，其允许轻微的表面改变(例如，通过侧链或主链中的小移动)以改进候选化合物和蛋白质之间的配合。
在一些实施例中，该方法进一步包括合成潜在结合IR的化合物。在一些实施例中，该化合物调节IR的至少一种生物活性。在一些实施例中，该方法可以进一步包括测试ii)中设计或筛选的化合物调节IR的至少一种生物活性的能力。例如，该方法可以进一步包括测试在ii)中设计或筛选的化合物其调节血糖水平的能力。在一些实施例中，步骤i)和ii)是计算机模拟进行的。
本发明还提供了鉴定模拟胰岛素活性的化合物的基于计算机的方法，该方法包括：
i)产生多肽的三维结构模型，该多肽具有：
a)由附录I的原子坐标或其子集定义的结构、或
b)当叠加在相应的a)中的主链原子上时具有小于约的均方根偏差的结构，和
ii)设计或筛选模拟胰岛素活性的化合物。
在一些实施例中，产生三维结构模型包括产生与IR或其区域结合的多肽的模型。在一些实施例中，该模型由附录II的原子坐标或其子集定义。IR的优选区域是控制特异性的那些区域，例如被描述为上述靶结合位点的区域。
在一些实施例中，该方法进一步包括合成潜在结合IR的化合物。在一些实施例中，该化合物调节IR的至少一种生物活性。在一些实施例中，该方法可以进一步包括测试ii)中设计或筛选的化合物调节IR的至少一种生物活性的能力。例如，该方法可以进一步包括测试在ii)中设计或筛选的化合物其调节血糖水平的能力。在一些实施例中，步骤i)和ii)是计算机模拟进行的。
在一些实施例中，通过本发明的方法鉴定的这些化合物能够结合IR。优选地，该IR是人IR-B受体。在一些实施例中，针对人IR-B受体的小于10-4M、10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的IC50。优选地，针对人IR-B受体的小于10-6M的IC50。
在一些实施例中，通过本发明的方法鉴定的这些化合物不结合IGF-IR或弱结合IGF-IR。在一些实施例中，该胰岛素类似物具有针对IGF-IR的弱于10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M或10-4M的IC50或Kd，优选地，该胰岛素类似物具有针对IGF-IR的弱于100nM的亲和力(Kd)。
在一些实施例中，通过本发明的方法鉴定的这些化合物在溶液中主要是单体的。在一些实施例中，至少50％的化合物是单体，至少60％的化合物是单体，至少70％的化合物是单体，至少75％的化合物是单体，至少80％的化合物是单体，至少85％的化合物是单体，至少90％的化合物是单体，至少95％的化合物是单体，至少98％的化合物是单体，至少99％的化合物是单体或大约100％的化合物是单体。在一些实施例中，该化合物可以至少部分地是单体的并且在给予受试者时解离成单体形式。在一些实施例中，该化合物是单体的或在受试者血流中解离成单体形式。
如本领域技术人员将容易理解的，本发明的方法提供了用于设计和选择与胰岛素受体相互作用的胰岛素类似物蛋白质的合理方法。在某些情况下，这些蛋白质可能需要进一步开发以增加活性。这种进一步的开发在该领域中是常规的，并且将由本申请中提供的结构信息辅助。在特定的实施例中，预期本发明的方法包括这些进一步的开发步骤。
一旦通过上述方法设计或选择了胰岛素类似物，就可以通过计算评估测试和优化胰岛素类似物可以与靶标(比如IR)结合的效率。例如，已经设计或选择用于结合IR的胰岛素类似物在与天然IR结合时还必须优选地穿过被结合位点占用的体积不重叠的体积。设计或选择为与IR结合的胰岛素类似物可以进一步被计算优化，使得在该胰岛素类似物结合的状态下，它优选缺少与靶蛋白的排斥静电相互作用。这种非互补(例如，静电)相互作用包括排斥电荷-电荷，偶极-偶极和电荷-偶极相互作用。具体地，当该胰岛素类似物与IR结合时，化合物与胰岛素类似物之间的所有静电相互作用的总和优选地对结合焓产生中性或有利的贡献。
一旦已经最佳地选择或设计了胰岛素类似物，如上所述，然后可以在其原子或侧基团中的一些中进行取代以改进或修饰其结合特性。通常，初始取代是保守的，即置换基团将具有与原始基团大致相同的大小、形状、疏水性和电荷。当然，应该理解的是应该避免本领域已知的改变构象的组分。然后可以通过以上详细描述的相同计算机方法分析这种经取代的胰岛素类似物与IR匹配的效率。
特定的计算机软件在本领域中是可获得的，用来评估化合物变形能和静电相互作用。针对这样的用途所设计的程序包括Gaussian 92，修订版C(Frisch，高斯公司(Gaussian，Inc.)，匹兹堡，宾夕法尼亚州)；AMBER，版本4.0(Kollman，加州大学旧金山分校)；QUANTA/CHARMM(分子模拟公司(Molecular Simulations，Inc.)，柏林顿，马萨诸塞州)；以及Insight II/Discover(生物系统技术公司(Biosysm Technologies Inc.)，圣地亚哥，加利福尼亚州)。
本发明涵盖使用本文所述的方法鉴定的胰岛素类似物(包括IR激动剂、分子、化合物等)。一些实施例还涉及包含使用本文所述的方法鉴定的胰岛素类似物(包括IR激动剂、分子、化合物等)的药物组合物。
筛选测定和结合的构象以及生物活性
通过许多IR和/或IGF-1R功能的体外和体内测定优选地评估本发明的胰岛素类似物(这些胰岛素类似物包括使用本披露的方法鉴定的化合物和分子)以确认这些胰岛素类似物与IR和/或IGF-1R相互作用和调节IR和/或IGF-1R活性的能力。例如，可以测试化合物其与IR和/或IGF-1R结合的能力和/或其调节(例如，激活或破坏IR和/或IGF-1R信号转导)的能力。
在筛选测定是结合测定的情况下，IR或IGF-1R可以与标记物连接，其中该标记物可以直接或间接地提供可检测的信号。各种标记包括放射性同位素、荧光分子、化学发光分子、酶、特异性结合分子、颗粒(例如，磁性颗粒)等。特异性结合分子包括对，例如生物素和链霉抗生物素蛋白、地高辛和抗地高辛等。对于特异性结合成员，通常根据已知程序用被提供用于检测的分子标记互补成员。
筛选测定中可包括多种其他的试剂。这些包括如下试剂像盐、中性蛋白质例如白蛋白，洗涤剂等，这些试剂用于促进最佳蛋白质-蛋白质结合和/或减少非特异性或背景相互作用。可以使用提高测定效率的试剂，比如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。以任何产生必需结合的顺序添加组分。在任何促进最佳活性的温度(通常在4℃到40℃之间)下进行孵育。
化合物与IR或IGF-1R的直接结合还可以通过表面等离子体共振(BIAcore)进行(综述于Morton和Myszka，1998中)。在此，通过以下方法将受体固定在CM5或其他传感器芯片上：使用胺或硫醇-二硫化物交换偶联的直接化学偶联(Nice和Catimel，1999)或将受体胞外域作为Fc融合蛋白捕获到适当衍生的传感器表面(Morten和Myszka，1998)。潜在的胰岛素类似物(称为分析物)以适当的流速和一系列的浓度通过传感器表面。经典的分析方法是收集各种分析物浓度的响应。一系列浓度提供了关于反应的充分信息，并且通过使用比如CLAMP的拟合算法(参见Morton和Myszka，1998)，可以确定速率常数(Morton和Myszka，1998；Nice和Catimel，1999)。通常，配体表面在每个分析物结合循环结束时再生。表面再生确保在每个循环开始时分析物可以获得相同数量的配体结合位点。
选择孵育期以获得最佳活性，但也可以优化孵育期以促进快速高通量筛选。通常，在0.1和1小时之间就足够了。通常，多种测定混合物与不同的测试剂浓度平行进行，以获得对这些浓度的差异响应。通常，这些浓度中的一种用作阴性对照，即在零浓度或低于检测水平。
作为用于针对天然胰岛素的胰岛素类似物置换的异质筛选的基础，体外竞争性受体结合测定的基本形式可以如下：如Denley等人(2004)所述，通过时间分辨荧光检测(TRFD)定量IR或IGF-1R活性位点的占据。R-IR-A、R-IR-B和P6细胞分别用作IR-A、IR-B和IGF-1R的来源。在4℃下，用裂解缓冲液(20mM HEPES、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、10％(v/v)甘油、1％(v/v)Triton X-100、1mM EGTA pH7.5)将细胞裂解1小时。将裂解物在3500rpm下离心10分钟，并且然后将向先前被抗胰岛素受体抗体83-7或抗IGF-1R抗体24-31涂覆的white Greiner Lumitrac 600板每孔添加100μl。捕获抗体均不会干扰胰岛素IGF-I或IGF-II的受体结合。将铕标记的胰岛素或铕标记的IGF-I的大约100，000个荧光计数连同各种数量的未经标记的竞争者胰岛素类似物添加至每个孔中，并且在4℃下孵育16小时。用20mMTris、150mM NaCl、0.05％(v/v)Tween 20(TBST)洗涤孔，并且添加DELFIA增强溶液(100μl/孔)。用BMG Lab Technologies PolarstarTM荧光计或Wallac Victor II(EG & G Wallac公司)，使用340nm激发和612nm发射光滤光器测量时间分辨荧光。
可以用于评估化合物与IR结合以及化合物在IR上的生物活性的其他适合的测定的实例是本领域熟知的。例如，适合的测定可以发现于PCT国际公开号WO 03/027246中。适合的测定的实例包括以下：
(i)受体自身磷酸化(如通过Denley等人.(2004)所述)。按2.5x104个细胞/孔，将R-IR-A、R-IR-B细胞或P6细胞置于Falcon 96孔板平底板中，并且在37℃、5％CO2下生长过夜。将细胞在无血清培养基中洗涤4小时，然后在37℃、5％CO2下用在具有1％BSA的100μlDMEM中的胰岛素IGF-I或IGF-II的其中之一处理10分钟。将含有2mM Na3VO4和1mg/ml NaF的裂解缓冲液添加至细胞中，并且将来自裂解物的受体捕获在用抗体83-7或24-31预涂覆的96孔板上并且用1x TBST/0.5％BSA阻断。在4℃下过夜孵育后，用1x TBST洗涤这些板。用铕标记的抗磷酸酪氨酸抗体PY20检测磷酸化的受体(130ng/孔，室温，2小时)。添加DELFIA增强溶液(100μl/孔)并且如以上所述检测时间分辨荧光。
(ii)使用2-脱氧-[U-14C]葡萄糖进行葡萄糖吸收(如通过Olefsky，1978所描述)。将24孔板中在分化后8-12天之间的脂肪细胞在补充有1％(w/v)RIA级BSA和2mM丙酮酸钠的克-林二氏(Krebs-Ringer)重碳酸盐缓冲液(含有130mM NaCl、5mM KCl、KH2PO4、1.3mMMgSO47H2O、25mM NaHCO3和1.15mM CaCl2的25mM Hepes(pH7.4))中洗涤两次。在37℃下将脂肪细胞平衡90分钟，然后添加胰岛素，或平衡30分钟然后添加激动剂或拮抗剂。在37℃下，在0.7nM至70nM的浓度范围内添加胰岛素(Actrapid，Novogen)持续30分钟。将激动剂或拮抗剂(0至500mM)添加至脂肪细胞持续90分钟，随后在拮抗剂的情况下添加天然胰岛素。通过闪烁计数，经最终的10分钟激动剂刺激测量50mM 2-脱氧葡萄糖和0.5mCi 2-脱氧-[U-14C]葡萄糖(NEN，珀金埃尔默生命科学公司(PerkinElmer Life Sciences))/孔的摄取。
(iii)使用质膜菌苔的葡糖转运蛋白GLUT4易位(如通过Robinson和James(1992)以及Marsh等人(1995)所描述)。
(iv)使用质膜菌苔的GLUT4易位(如通过Marsh等人，1995的描述)。使3T3-L1成纤维细胞在6孔板中的玻璃盖玻片上生长，并且分化成脂肪细胞。分化后8至12天后，将脂肪细胞在含有0.5％FBS的DMEM中血清饥饿处理18小时。将细胞在克-林二氏重碳酸盐缓冲液(pH7.4)中洗涤两次，并且在37℃下平衡90分钟，然后添加胰岛素(100nM)，或平衡30分钟然后添加化合物(100μM)。处理后，将脂肪细胞在PBS中的0.5mg/ml聚-L-赖氨酸里洗涤，通过在冰上在1∶3(v/v)膜缓冲液(含有70mM KCl、5mM MgCl2、3mM EGTA的30mM Hepes(pH 7.2)并且新鲜添加1mM DTT和2mM PMSF)中三次洗涤进行低渗振荡。然后使用探头超声波仪(Microson)按设置0在冰上的1∶1(v/v)膜缓冲液中对经洗涤的细胞进行超声处理，以产生保留与盖玻片附接的质膜片段的菌苔。在22℃下将这些片段固定在膜缓冲液中的2％(w/v)多聚甲醛里持续20分钟，并且通过PBS中的100mM甘氨酸进行固定剂猝灭。然后在22℃下，将质膜片段在膜缓冲液中的1％(w/v)Blotto里阻断60分钟并且用内部兔亲和力纯化的抗GLUT4多克隆抗体(针对涵盖GLUT4的C-末端19个氨基酸的肽产生的克隆R10)和Alexa 488山羊抗兔第二抗体(分子探针；1：200)进行免疫标记。使用FluoroSave试剂(Calbiochem)将盖玻片固定在载玻片上，并且使用OptiScan共聚焦激光扫描免疫荧光显微镜(Optiscan，维多利亚州，澳大利亚)成像。使用ImageJ(NIH)成像软件分析数据。在每个实验中针对每种病症检查至少六个视野，并且保持实验期间的共聚焦显微镜增益设置以最小化实验间的变异性。
使用脂肪细胞测定可以测定胰岛素类似物活性。胰岛素增加3H葡萄糖摄取到脂肪细胞中及其转化为脂质。通过将脂相分配到闪烁剂混合物中来确定将3H掺入脂相中，该闪烁剂混合物不包括水溶性3H产物。在次最大胰岛素剂量下测定胰岛素类似物对3H葡萄糖掺入的作用。该方法改编自Moody等人(1974年)。将小鼠附睾脂肪垫解剖出来，切碎置于消化缓冲液(Krebs-Ringer 25mM HEPES、4％HSA、1.1mM葡萄糖、0.4mg/ml的1型胶原酶(pH7.4))中，并且在36.5℃下消化长达1.5小时。过滤后，洗涤(Krebs-Ringer HEPES，1％HSA)并且重悬于测定缓冲液(Krebs-RingerHEPES，1％HSA)中，将游离脂肪细胞移液到含有测试溶液的96孔皮可板(Picoplate)中。
通过以0.45mM葡萄糖的终浓度添加3H葡萄糖(例如，前安玛西亚公司(ex.Amersham)TRK 239)开始测定。将该测定在36.5℃下在Labshaker孵育塔中以400rpm孵育2小时，然后通过添加Permablend/甲苯闪烁剂(或等同物)终止，并且密封这些板然后静置至少1小时，并且在Packard高级计数器或等同物中检测。在每个板上进行作为对照的完整的天然胰岛素标准曲线(8剂量)。
数据以图的方式呈现为胰岛素类似物对3H葡萄糖摄取的作用，其中将数据与天然胰岛素反应相比较。该测定还可以在基础胰岛素浓度或最大胰岛素浓度下进行。
为了测试胰岛素类似物的体内活性，可以如下对Wistar大鼠进行静脉内血糖测试。称重约300g的雄性Mol：Wistar大鼠被分为两组。从尾静脉取10μl血样用于测定血糖浓度。然后在t＝30分钟时麻醉大鼠(例如，用Hypnorm/Dormicum)并且在t＝-20分钟和在t＝0分钟时再次测量血糖。在取t＝0样品后，将大鼠用媒介物或测试物质在等渗水性缓冲液中按对应于1ml/kg注射体积的浓度注射到尾静脉中。在时间5、10、20、30、40、60、80、120和180分钟处测量血糖。在20分钟间隔处重复麻醉的给予。
还可以通过许多生物物理方法评估根据本发明的方法设计或选择的胰岛素类似物、化合物和/或分子。适合的方法包括X射线晶体学、分析性超速离心、尺寸排阻色谱法、等温量热法等。例如，胰岛素类似物(其包括使用本披露的方法鉴定的化合物和分子)可以通过如本文所述的结晶类似物和结构测定进一步确认。例如，溶液中的多聚化状态可以通过分析性超速离心来确定。在20℃下使用Beckman XLl分析离心机在12mm路径长度的细胞中进行分析性超速离心。将在10mM HCl中的含有化合物的样品稀释到10mM Tris、50mM NaCl(pH 7.4)中，至100μg/mL的终浓度。本领域技术人员将理解可以使用其他缓冲液、盐等。例如，还可以制备含有0.2mM ZnCl2、2mM CaCl2、1mM磷酸钠(pH 7.4)或0.1M硫酸铵的样品。添加相等体积的10mM NaOH以中和任何pH变化。使用100μL的总样本体积。
通过220nm处的吸光度测量径向浓度分布。如通过间隔1小时的连续吸光度扫描评估的，在30，000rpm和45，000rpm下建立沉降平衡。在SEDPHAT(Houtman等人，2007)中，使用从组合物估算的溶液密度和溶剂微分比容的值，使用SEDNTERP(Laue等人，1992)，将处于两种速率的数据共同适用于单个理想沉降物质。除二硫化物外，在估算化合物微分比容时，忽略所有翻译后修饰。
临床指征、给予途径、剂量和药物组合物
本披露涉及的胰岛素类似物、化合物和分子在对IR的激活和/或调节有响应的病症的治疗中是有价值的。这些病症包括指示的用于调节葡萄糖代谢和/或血糖水平的那些病症。
对IR的激活和/或调节响应的病症包括但不限于：糖尿病(例如，1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病)、高血糖症、胰岛素抵抗、糖耐量减低等。在一些实施例中，该病症是胰岛素相关病症。胰岛素相关病症包括但不限于：高血糖症、胰岛素抵抗、1型糖尿病、妊娠糖尿病或2型糖尿病。
本发明的胰岛素类似物在受试者(比如包括人的哺乳动物)中是有用的，以便于调节葡萄糖代谢。因此，提供了用于调节葡萄糖代谢的方法。一些实施例涉及通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的这种胰岛素类似物用于调节葡萄糖代谢的方法。一些实施例涉及用于治疗胰岛素相关病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物。一些实施例涉及通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的胰岛素类似物用于治疗糖尿病的方法。糖尿病，包括但不限于：1型糖尿病、2型糖尿病或妊娠糖尿病。一些实施例涉及通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的这种胰岛素类似物用于治疗高血糖症的方法。一些实施例涉及通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的这种胰岛素类似物用于治疗胰岛素抵抗的方法。一些实施例涉及通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的这种胰岛素类似物用于治疗糖耐量减低的方法。一些实施例涉及通过向对其有需要的受试者给予治疗有效量的这种胰岛素类似物用于在受试者中降低血糖水平的方法。
例如，披露了在受试者中治疗1型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，在B链肽的氨基酸20处的取代可以是G20Y、G20F或G20P。在所披露的肽的一些情况下，在B链肽的氨基酸10处的取代可以是H10E、H10D或H10Q。在一些情况下，可以存在在氨基酸10和20处的B链取代的任何组合。在一些情况下，给予的肽的A链还可以包含至少一个取代。例如，在一些情况下，A链肽中的至少一个取代可以是T8H、T8Y、T8K或S9R。在一些情况下，氨基酸取代可以存在于位置8或9处或同时两个位置处。因此，一些情况下，可以存在披露的B链肽取代和A链肽取代的任何组合。本文中还披露了在受试者中治疗1型糖尿病的方法，该方法包括给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物。在一些情况下，在给予肽之前，受试者已经被诊断为患有1型糖尿病。在一些情况下，在给予肽之前，受试者已经被诊断为处于患有发展为1型糖尿病的风险。
还提供了如本文所定义的胰岛素类似物、化合物或分子在药物制备中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中调节葡萄糖代谢的药物中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素相关病症的药物中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防糖尿病的药物中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防高血糖症的药物中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素抵抗的药物中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防糖耐量减低的药物中的用途。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物在制备用于在受试者中降低血糖水平的药物中的用途。
一些实施例还涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中调节葡萄糖代谢。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素相关病症。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防糖尿病。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防高血糖症。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素抵抗。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防糖耐量减低。一些实施例涉及如本文所定义的胰岛素类似物，用于在受试者中降低血糖水平。
在一些实施例中，给予胰岛素类似物导致血糖水平的降低。优选地，该胰岛素类似物是速效胰岛素类似物，使得给予胰岛素类似物导致在给予的60分钟内血糖水平的降低。在一些实施例中，该胰岛素类似物的给予导致在给予的分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟或5分钟内血糖水平的降低。在一些实施例中，该胰岛素类似物的给予导致血糖水平的降低持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。在本文披露的任何方法中，可以给予已经在本文中详细讨论的优选的化合物。可以通过本领域技术人员已知的任何手段测量血糖水平。
增加胰岛素受体激活的方法
披露了在受试者中增加胰岛素受体激活的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的所披露的胰岛素类似物、肽、化合物或药物组合物中的任一项。在一些情况下，对其有需要的受试者可以是与标准激活水平相比已知具有减少的胰岛素受体激活的受试者。在一些情况下，胰岛素受体激活的标准激活水平可以基于在健康个体中确立的水平。在一些情况下，胰岛素受体激活的标准激活水平可以基于在确定需要增加的胰岛素受体激活之前所治疗的受试者中确立的水平。
例如，披露了在受试者中增加胰岛素受体激活的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，在B链肽的氨基酸20处的取代可以是G20Y、G20F或G20P。在所披露的肽的一些情况下，在B链肽的氨基酸10处的取代可以是H10E、H10D或H10Q。在一些情况下，可以存在在氨基酸10和20处的B链取代的任何组合。在一些情况下，给予的肽的A链还可以包含至少一个取代。例如，在一些情况下，A链肽中的至少一个取代可以是T8H、T8Y、T8K或S9R。在一些情况下，氨基酸取代可以存在于位置8或9处或同时两个位置处。因此，一些情况下，可以存在披露的B链肽取代和A链肽取代的任何组合。还披露了在受试者中增加胰岛素受体激活的方法，该方法包括给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物。
降低血糖的方法
披露了在受试者中降低血糖的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的所披露的胰岛素类似物、肽、化合物或药物组合物中的任一项。
在一些情况下，对其有需要的受试者可以是与标准血糖水平相比已知具有增加的血糖的受试者。在一些情况下，胰岛素受体激活的标准激活水平可以基于在健康个体中确立的水平。在一些情况下，胰岛素受体激活的标准激活水平可以基于在确定需要增加的胰岛素受体激活之前所治疗的受试者中确立的水平。
例如，披露了在受试者中降低血糖的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。在一些情况下，在B链肽的氨基酸20处的取代可以是G20Y、G20F或G20P。在所披露的肽的一些情况下，在B链肽的氨基酸10处的取代可以是H10E、H10D或H10Q。在一些情况下，可以存在在氨基酸10和20处的B链取代的任何组合。在一些情况下，给予的肽的A链还可以包含至少一个取代。例如，在一些情况下，A链肽中的至少一个取代可以是T8H、T8Y、T8K或S9R。在一些情况下，氨基酸取代可以存在于位置8或9处或同时两个位置处。因此，一些情况下，可以存在披露的B链肽取代和A链肽取代的任何组合。还披露了在受试者中降低血糖的方法，该方法包括给予治疗有效量的如本文所定义的胰岛素类似物。
给予和剂量
所描述的给予途径和剂量仅意图用作指导。基于本文列出的披露内容，本领域技术人员将理解，本文涵盖的组合物、配制品、方法和用途的具体剂量方案可以通过临床和/或药代动力学实验凭经验确定，并且可以根据预先规定的有效性和/或毒性标准调整这些剂量。还应理解的是，针对任何具体患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性和浓度；患者的特征(如年龄、体重和特定患者的反应)；活性组合；治疗医师的判断以及所治疗病症的性质和严重性。以下剂量是一般情况的示例。当然，可以有个别情况，其中更高或更低的剂量范围是应当的，并且这些都在本发明的范围内。
根据本文所述的方法和用途，受试者可以一次或多次剂量接受治疗有效量的胰岛素类似物。给予的实际量，给予的速率和时程将随给予途径、所需益处的性质、所治疗的病症的性质和严重性、所治疗的受试者的病症而变化，并且最终将由服务员兽医或医疗专业人员自行决定。治疗的处方，例如，关于剂量、时间等的决定由服务人员兽医或医疗专业人员负责，并且通常考虑障碍的性质、个体患者的病症、递送的部位、给予方法以及从业者知道的其他因素。
本领域技术人员将理解，一种或多种类似物可以在任何适当的时间表上被一起或分开地给予，例如，从一次或多次/天至一次或多次/周；包括每隔一天一次，任何数天或数周，或其任何变化。通常，该胰岛素类似物被每天给予一次、两次、三次、四次或更多次。然而，例如当血糖水平高于正常范围时或当需要降低血糖水平时，胰岛素类似物还可以根据需要给予。通常，将本发明的化合物或组合物在摄取食物的同时、之前或之后给予。优选地，将该胰岛素类似物在每餐(例如，早餐、午餐和晚餐)前给予。在一些实施例中，在摄取食物之前5、10、20、30、40、50或60分钟给予该化合物或组合物。在一些实施例中，将该化合物或组合物在摄取食物之前立即给予。
胰岛素类似物以及如本文所述的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何途径给予，肠胃外是最感兴趣的。因此，在本发明的一个实施例中，这些胰岛素类似物通过肠胃外途径(比如通过注射或输注)给予。其他适合的给予途径，例如肠内(例如，口服给予)，也在本发明的范围内。在具体的实施例中，肠胃外途径是优选的，并且包括静脉内、关节内、腹膜内、皮下、肌肉内、胸骨内注射和输注，以及通过舌下、经皮肤、局部、经粘膜(包括鼻途径)给予，或通过吸入给予(例如像，肺部吸入)。
可以将这些胰岛素类似物在合适的媒介物中给予，或可以将它们按适合的药物组合物形式给予。这些组合物也在本发明的范围内。在下文中描述了适合的药物组合物。
药物组合物
本领域技术人员将理解的是，本文所述的胰岛素类似物可以被配制成药物组合物。这样的组合物可以包括胰岛素类似物和一种或多种药学上可接受的载体。
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”包括与药物给予可相容的任何和所有固体或溶剂(比如磷酸盐缓冲盐水缓冲液、水、盐水)、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在与组合物的其他成分相容的意义上，药学上可接受的载体必须是“可接受的”，并且对其接受者无害。适合的药物载体被描述于以下：由E.W.Martin编辑的“Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药学大全]”(马克出版有限公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州)；Gennaro，A.R.，Remington：The Science andPractice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第20版(Lippincott，Williams和Wilkins)，2000；Liberman等人编辑，Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型]，MarcelDecker，纽约，纽约州，1980；以及Kibbe，等人编辑，Handbook of PharmaceuticalExcipients[药物赋形剂手册](第3版)，美国药学会(American PharmaceuticalAssociation)，华盛顿，1999。通常，适合的药学上可接受的载体是本领域已知的并且基于最终的用途应用来选择。例如，可用于本发明的药学上可接受的载体包括但不限于适用于可注射或输注组合物的那些。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。用于药物活性物质的此类介质和药剂的使用是本领域中熟知的。药物组合物在熟知且本领域技术人员容易获得的许多来源中被描述，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药学大全](Martin E.W.，伊斯顿，宾夕法尼亚州，马克出版有限公司，第19版，1995)。
药学上可接受的载体的量将取决于化合物的水平和本领域技术人员将分类为与载体不同的任何其他任选的成分(例如，其他活性剂)。本发明的这些配制品可以包含例如，按重量计从约5％至99.99％、或25％至约99.9％或从30％至90％的组合物、药学上可接受的载体。在不存在其他助剂的情况下，药学上可接受的载体可形成组合物的余量。
任选地，本披露的药物组合物进一步包含其他另外的组分，例如治疗性和/或预防性成分。因此，本发明在另外的方面涉及药物组合物，该药物组合物包含本发明化合物、一种或多种药学上可接受的载体以及一种或多种其他的活性剂。通常，药物组合物中存在的其他活性剂的量足以单独地或与组合物中其他成分组合地提供额外的益处。
本领域技术人员将理解的是，这些任选的组分可以通过其治疗益处或美学益处或其假定的作用方式被分类。然而，还应理解，在一些情况下，这些任选的组分可以提供不止一种的治疗益处或美学益处，或通过不止一种作用方式起作用。因此，本文中的分类是出于方便的目的而进行的，并且非旨在将组分限制于所列出的一种或多种特定应用中。此外，当适用时，这些组分的药学上可接受的盐在本文中是有用的。
当其他活性剂存在于本发明的药物配制品中时，该化合物的剂量与不存在其他另外的组分时所用的剂量可以相同或不同。本领域技术人员将容易地理解适当的剂量。
将药物组合物配制成与其预期的给予途径(例如，局部或全身给予)相容。给予途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服、鼻腔、局部、经皮肤、经粘膜和直肠给予。口服和鼻腔给予包括通过吸入给予。用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节pH值，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体、非水溶液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内给予，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、克列莫佛(Cremophor)EL(BASF，派西派尼，新泽西州(Parsippany，NJ))或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下应该稳定并且抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。该载体可以是包含以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其适合的混合物。可以例如通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过在分散情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇，山梨醇)、氯化钠也可以被纳入组合物中。可以通过在组合物中包括延迟吸收的一种药剂(比如单硬脂酸铝或明胶)而使可注射组合物的吸收延长。
按照需要，可以通过将活性化合物以需要的量加入具有以上列举的组分中的一种或多种组合的适当溶剂中，随后进行无菌过滤来制备无菌注射液。通常，通过将多核苷酸加入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体包含基础分散介质以及来自以上列举的那些所需的其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，适合的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，所述方法产生活性成分的粉末以及来自其先前的无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。
口服的组合物通常包括一种惰性稀释剂或一种可食用的载体。出于口服治疗性给予的目的，可以将活性化合物随赋形剂一起加入并且以片剂、锭剂或胶囊剂(例如明胶胶囊剂)的形式使用。口服组合物还可以使用一种用作嗽口水的液体载体而被制备。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：粘合剂，如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖，崩解剂，如海藻酸、PRIMOGEL、或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品。
适于通过鼻腔吸入给予的配制品(其中载体是固体)包括具有例如在约20至约500微米范围内的粒度的粗粉末，该粗粉以给予嗅剂(即，通过快速吸入)的方式从保持靠近鼻子的粉末容器通过鼻通道而给予。适合的配制品(其中载体是用于通过喷雾器给予的液体)包括该药剂的水性或油性溶液。对于通过吸入给予，一种或多种药剂还可以从加压容器或分配器(其包含合适的推进剂，例如气体(如二氧化碳))、或喷雾器以液滴或气溶胶喷雾形式递送。这样的方法包括U.S.6,468,798中描述的那些。
全身性给予还可以通过经粘膜的或经皮肤的方式进行。对于经粘膜或经皮肤给予，在该配制品中使用适合有待渗透的障碍的渗透剂。这样的渗透剂通常是本技术领域所熟知的，并且对于经粘膜给予包括，例如洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经黏膜给予可通过使用鼻喷剂、液滴或栓剂来完成。对于经皮肤给予，如本领域公知的，将活性化合物(例如，本发明的多核苷酸)配制成软膏剂、药膏、凝胶剂、或乳膏。
药物组合物可以通过药物配制品领域的技术人员熟知的任何方法制备。通常，通过使胰岛素类似物、分子或化合物与液体载体或精细分离的固体载体或两者均匀且紧密地接触来制备组合物。然后，如果需要，将产品定型为所需的配制品。对于肠胃外给予，在一个实施例中，本发明的胰岛素类似物、化合物或分子可以将其通过以所需纯度，以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液或乳液)与药学上可接受的载体混合来配制。
在一些实施例中，该药物组合物包含治疗有效量的根据本发明的胰岛素类似物、肽、化合物或分子。本发明的药物组合物中本发明的胰岛素类似物、肽、化合物或分子的含量是例如占药物组合物的从约0.1至约100％w/w。
试剂盒
以上所述的材料以及其他材料可以按任何合适的组合包装在一起，作为用于进行或辅助实施所披露的方法的试剂盒。如果在给定试剂盒中试剂盒组分被设计并且适于在所披露的方法中一起使用，则它是有用的。披露了包含一种或多种所披露的胰岛素类似物的试剂盒。例如，披露了包含一种或多种所披露的胰岛素类似物、肽、化合物或药物组合物的试剂盒。
现在将参考以下实例进一步描述本发明，这些实例仅是说明性的而非限制性的。这些实例参考了图。
实例
实例1-Con-Ins G1的肽合成
Con-Ins G1链A和链B的固相肽合成。
在CEM Liberty 1自动化微波肽合成仪(CEM公司，马修斯(Matthews)，北卡罗来纳州)上用Fmoc(9-芴甲氧羰基)化学品同时合成Con-Ins G1的A链和B链。使用针对A链合成的预加载的Fmoc-Cys(Trt)-Rink酰胺MBHA树脂(0.21mmol/g)(肽国际公司(PeptidesInternational)，路易斯维尔，肯塔基州)以及针对B链合成的预加载的Fmoc-Arg(Pbf)-Wang树脂(0.4mmol/g)(AnaSpec，EGT.，弗里蒙特，加利福尼亚州)。具有侧链保护的Fmoc-Nα-保护性氨基酸来自以下商业来源：巴赫姆公司(Bachem Inc.)(托伦斯，加利福尼亚州)、国际化学进出口公司(Chem-Impex International)(伍德戴尔，伊利诺伊州)、健赞公司(Genzyme)(坎布里奇，马萨诸塞州)、诺瓦生物化学公司(Novabiochem)(圣地亚哥，加利福尼亚州)、P3生物系统公司(Biosystem)(路易斯维尔，肯塔基州)和Reanal(布达佩斯，匈牙利)。在室内合成Fmoc-γ-羧基-L-谷氨酸γ，γ-二-叔丁基酯(Fmoc-Gla(OtBu)2-OH)(Rivier等人，1987)。用于氨基酸的侧链保护如下：Lys，叔丁氧羰基(Boc)；Hyp、Ser、Thr和Tyr，叔丁基醚(tBu)；Asn、Cys和His三苯甲基(Trt)；Arg 2，2，4，6，7-五甲基-二羟基苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；Glu、Gla和Asp叔丁基酯(OtBu)；Cys，乙酰胺基甲基(Acm)；Cys，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)；Cys，S-叔丁基亚硫酰基(S-t-Bu)。
为了能够制备正确的分子内和分子间二硫键，CysA7和CysB7的侧链保护基团为Acm，CysA20和CysB19的侧链保护基团为Trt，CysA11的侧链是Mmt保护的，并且CysA6的侧链是S-t-Bu保护的。两种链均以0.1mmol规模合成。偶联反应按如下进行：在树脂上在溶解于DMF中的5倍摩尔过量的Fmoc-保护性氨基酸(除了在NMP中的His)的存在下，在通过HATU[2-(1H-9-(氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-六氟磷酸铵]：DIEA[N，N-二异丙基乙胺]：AA[保护性氨基酸](0.9∶2∶1)在0W下激活2分钟，然后在35W下，在60℃的最高温度下，激活10分钟的情况下。通常将Arg在室温下双偶联25分钟，然后在15W下在50℃的最高温度下双偶联12分钟。将Cys、His和Gla在40W下在50℃的最高温度下偶联6分钟。用在DMF中含有20％哌啶的0.1M HOBt以两个阶段(每次使用新鲜的试剂)进行Fmoc基团的脱保护：其中在35W下进行2分钟的初始脱保护，随后在35W下在60℃的最高温度下进行5分钟的脱保护。
Con-Ins G1链A：分子内二硫键形成、切割和纯化。
在树脂上使用非氧化的方法形成CysA6和CysA11之间的分子内二硫桥(Galande等人，2005)。在第一个步骤，通过经由在室温下用20％巯基乙醇(ME)(Fluka)和在二甲基甲酰胺(DMF)8mL中的1％N-甲基吗啉(NMM)处理树脂(760mg)过夜进行还原来释放游离硫醇来去除CysA6的S-t-Bu。将该树脂用DMF洗涤并且干燥。然后将该树脂与在二氯甲烷(DCM)8mL中的10倍过量的2，2’-二硫代双(5-硝基吡啶)(DTNB)约lmmol(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-A1drich)，圣路易斯，密苏里州)反应1小时以形成S-5-硝基吡啶-亚磺酰基(5-Npys)保护性CysA6。在用DCM洗涤出过量的试剂后，在作为清除剂的2μL三异丙基硅烷(TIS)的存在下，用在二氯甲烷(DCM)8mL中的1％三氟乙酸(TFA)将树脂处理20分钟来脱保护CysA11(Mmt)并且在同时形成CysA6和CysA11之间的二硫桥。
通过将树脂与含(TFA/水/TIS：95/2.5/2.5)的10mL的树脂一起搅拌2小时进行从树脂(720mg)的切割以及链A的同时的脱保护。这之后使用冰冷的无水乙醚进行肽沉淀，然后用0.1％TFA/40％水/60％乙腈提取并且冷冻干燥。将肽如下进行纯化：通过制备型Waters HPLC(米尔福德，加利福尼亚州)，在包装有Bondapak C18(15-20μm粒度，300A)的Waters PrepPak柱(2.5x10cm)上，以溶剂系统A：0.1％TFA/水，B：0.1％TFA/40％水/60％ACN，在60分钟内，以流速20mL/分钟，以范围从5％至65％溶剂B的线性梯度。获得18.7mg(7.7μmol)的链A。通过在ThermoScientific LTQ Orbitrap XL(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)仪器上测量电喷射离子化(ESI)-MS，确认肽的质量(经计算的单一同位素的MH+1：2422.03Da；确定的单一同位素的MH+1值2422.01Da)。
Con-Ins G1链B：切割和纯化。
通过将500mg树脂与含有(TFA/苯甲硫醚/3，6-二氧杂-1，8-辛二酚(DODT，TCI美国，波特兰，俄勒冈州)/水：87.5/5/2.5/5)的10mL试剂搅拌2小时进行从树脂的切割以及链B的同时脱保护，随后使用冰冷的无水乙醚沉淀肽，然后用0.1％TFA/40％水/60％ACN提取并且冷冻干燥。通过制备型HPLC将该肽进行纯化(如针对链A纯化的描述，除了在60分钟内范围从20％至80％溶剂B的梯度)，获得25.9mg(9μmol)的链B。通过ESI-MS确认肽的质量(经计算的单一同位素的MH+1值2868.24Da；确定的单一同位素的MH+1值2868.22Da)。
DMSO辅助的链A和链B连接以形成部分折叠的Con-Ins G1(含有一个二硫键)。
将链A和链B(各自7μmol)一起溶解于0.1％TFA/水溶液(7.1mL)中，并且添加至14.5mL DMSO、14.25mL水、含有2mM EDTA的35.6mL 0.2M Tris的混合物(pH 7.5)中。通过分析性HPLC监测氧化。在室温下25小时后，将该反应用8％甲酸(1mL)淬灭，用0.1％ TFA稀释至总体积为225mL，并且通过制备型HPLC以在60分钟内范围从15％至75％B的梯度进行纯化。获得4.5mg(0.85μmol，基于7μmol的起始量的12.1％产率)异二聚体。通过ESI-MS确认肽的同一性(经计算的单一同位素的MH+1：5287.25Da；确定的单一同位素的MH+1：5287.19Da)。
I2辅助氧化以形成完全氧化的Con-Ins G1。
将4.5mg(0.85μmol)的Con-Ins G1(部分折叠的)溶解于6.2mL的2.5％TFA/水溶液中，并且添加55μL的I2溶液(50mg I2于5mL MeOH中)，并且搅拌60分钟。通过添加1M抗坏血酸溶液将其淬灭直到溶液的黄色变澄清。将该反应用60mL水稀释并且加载到制备型RP-HPLC柱上。获得1.5mg(0.29μmol)完全氧化的Con-Ins G1(产率35％，基于含有一个链间二硫键部分折叠的产物的起始量，以及4％，基于经纯化的链A的起始量)。通过ESI-MS在ThermoScientific LTQ Orbitrap XL(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)质谱仪上确认肽的同一性(经计算的单一同位素的MH+1：5143.16Da；确定的单一同位素的MH+1：5143.16Da)。
通过RP-HPLC和毛细管电泳评估肽的纯度。使用GE Healthcare AKTA纯化仪10(匹兹堡，宾夕法尼亚州)和Phenomenex(托兰斯，加利福尼亚州)Kinetex XB-C18柱(4.6x100mm，5.0μm粒度，孔径)进行定量型RP-HPLC。溶剂系统包含溶剂A＝在水中的0.1％TFA和溶剂B＝60％ACN，40％A。在30分钟内，以1.0mL/分钟的流速，进行从20％至80％B的梯度。在214nm和280nm处进行检测。肽的纯度被测定为89％。使用Groton BiosystemsGPA 100仪器(巴克斯柏路，马萨诸塞州)进行毛细管电泳(CE)。电泳缓冲液是0.1M磷酸钠(15％乙腈)(pH 2.5)。通过将20kV应用至毛细管(0.75μmx100cm)实现分离。在214nm处进行检测。该肽经评估的纯度是80％。
sCon-Ins G1的合成和纯化。
A链中含有CysA6、A11至SecA6、A11修饰的Con-Ins G1(被称为sCon-Ins G1；Sec＝硒代半胱氨酸)如通过Safavi-Hemami等人.(2015)的描述被化学合成、纯化并且氧化，除了将校正的消光系数用于B链(2，980M-1·cm-1)和完全氧化的sCon-Ins G1(4，470M-1·cm-1)的定量。如针对sCon-Ins G1所描述的进行sCon-Ins G1[GluA4、ProB3、GluB10]的合成(Safavi-Hemami等人.(2015))。以下详细描述了sCon-InsG1[GluA4、ProB3、GluB10]二硫键的逐步形成。
sCon-Ins G1[GluA4]链A：切割、DTT还原和纯化。
使用1mL富集的试剂K(TFA/水/苯酚/硫代苯甲醚/1，2-乙二硫醇，按体积82.5/5.0/5.0/5.0/2.5)将该肽从125mg的树脂中裂解1.5小时，该试剂K是使用2mL TFA(赛默飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，费尔劳恩，新泽西州)、66μL H2O、12mg 2，2-二硫代双(5-硝基吡啶)(DTNP；西格玛-奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州)和150mg苯酚，随后添加25μL苯甲硫醚制备的。将经切割混合物过滤并且用10mL冷的甲基-叔丁基醚(MTBE；赛默飞世尔科技公司，费尔劳恩，新泽西州)沉淀。通过在7，000×g下离心6分钟将粗肽沉淀并且用10mL冷的MTBE洗涤一次。为诱导分子内二硒键形成(SecA6至SecA10)，将经洗涤的肽球粒溶解于在水中的50％ACN(赛默飞世尔科技公司；费尔劳恩，新泽西州)(vol/vol)和在含有2mMEDTA(马林克罗制药公司(Mallinckrodt)，圣路易斯，密苏里州)的1mL 0.2M Tris·HCl(西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)中的2mL的100mM二硫苏糖醇(DTT，EMD化学品公司，吉布斯敦，新泽西州)(pH 7.5)中，添加1mL水并且轻微涡旋，并且允许该反应进行2小时。然后用8％甲酸(vol/vol)(赛默飞世尔科技公司，费尔劳恩，新泽西州)将该反应淬灭，用在水中的0.1％TFA(vol/vol)稀释，并且如下进行纯化：通过反相(RP)HPLC，使用半制备型C18Vydac柱(218TP510，250×10mm，5-μm粒度；Grace，吉布斯敦，新泽西州)，该柱在30分钟内，以流速4mL/分钟，以范围从10％至40％溶剂B的线性梯度进行洗脱。HPLC溶剂是在水中的0.1％(vol/vol)TFA(溶剂A)和在90％水性ACN(vol/vol)中的0.1％TFA(vol/vol)(溶剂B)。在220nm和280nm处测量UV吸光度以监测洗脱液。如下评估肽的纯度：通过分析型RP-HPLC，在C18Vydac柱(218TP54，250×4.6mm，5μm粒度，Grace，吉布斯敦，新泽西州)上，在30分钟内，以流速1mL/分钟，使用范围从10％至40％溶剂B的线性梯度。使用1，490M-1·cm-1的消光系数(ε)，在280nm处通过UV吸光度定量肽。从135mg的树脂中获得3.8mg的链A。通过电喷射离子化(ESI)-MS确认肽的质量(经计算的单一同位素的MH+1：2，473.674，确定的单一同位素的：MH+12，472.924)。使用ProteinProspector(版本5.12.1)计算分子量。
sCon-Ins G1[ProB3，GluB10]链B：切割和纯化。
通过用1mL试剂K处理3小时将肽从94mg树脂上切下，并且随后如上所述进行过滤、沉淀并且洗涤。如上所述将经洗涤的肽球粒纯化，不同之处在于梯度范围从15％至45％溶剂B。使用相同的梯度评估如上所述的线性肽的纯度，并且使用2，980M-1·cm-1的ε值进行肽定量。从94mg裂解的树脂中，获得2.37mg的链B。通过ESI-MS确认肽的质量(经计算的单一同位素的MH+1：2，808.24，确定的单一同位素的MH+1：2，808.25)。
铜辅助链A和链B连接以形成sCon-Ins G1[GluA4、ProB3、GluB10]。
将总共100nmol的每条链合并，并且使用SpeedVac干燥。将肽混合物溶解于100μL的0.1％TFA(vol/vol)中并且添加至800μL CuCl2·H2O(J.T.Baker，菲利普斯堡，新泽西州)，含有10nM EDTA的100μL 1M Tris·HCl(pH 7.5)的混合物中。终肽浓度是100μM。将该反应在室温下放置24小时，并且然后用8％甲酸(vol/Vol)淬灭，用0.1％TFA稀释，并且如下进行纯化：通过RP-HPLC，使用制备型C18Vydac柱，该柱在30分钟内，以流速4mL/分钟，以范围从15％至45％溶剂B的线性梯度进行洗脱。如下评估sCon-Ins G1的纯度：通过分析型RP-HPLC，使用与半制备型纯化相同的梯度，以流速1mL/分钟。使用4，470M-1·cm-1的ε值，在280nm处定量sCon-Ins G1[GluA4、ProB3、GluB10]。该反应的产率是28％。从900nmol的链A和链B的1∶1混合物中，获得1.36mg所希望的产物。通过ESI-MS确认肽的同一性(经计算的单一同位素的MH+1：5，278.15；确定的单一同位素的MH+1：5278.15)。
碘(I2)-辅助的完全折叠的sCon-Ins G1[GluA4、ProB3、GluB10]的形成。
将I2的溶液(阿克罗斯有机物公司(Acros Organics)，赫尔，比利时)制备如下：将10mg的I2添加至5mL的ACN中。搅拌20分钟后，I2完全溶解，并且添加15mL的水和600μL的TFA。将总共300μL的I2混合物添加至149nmol(90％纯度)和106nmol(72％纯度)的部分折叠的sCon-Ins G1[GluA4、Cys(Acm)7、ProB3、C(Acm)B7、GluB10](其各自溶解于300μL的0.1％TFA)中。将反应物孵育5分钟，用10μL的1M L-抗坏血酸(西格玛公司(Sigma)，圣路易斯，密苏里州)淬灭，用在水中的0.1％TFA稀释至总体积为4.5mL，并且如针对部分折叠的sCon-Ins G1[GluA4、ProB3、GluB10]所描述的进行纯化。如下评估终产物(完全折叠的sCon-InsG1[GluA4、ProB3、GluB10])的纯度：通过分析型RP-HPLC，在C18Vydac柱(218TP54，250×4.6mm，5μm粒度)上，使用与半制备型纯化相同的梯度，以流速1mL/分钟，并且该纯度被确定为97％。如针对部分折叠的产物所描述的，定量sCon-Ins G1[GluA4、ProB3、GluB10]。该反应的产率是14％，其中获得0.18mg所需的产物。通过ESI-MS确认肽的同一性(经计算的单一同位素的MH+1：5，134.84；确定的单一同位素的MH+1：5，134.07)。
hIns[DOI]和hIns[TyrB15、TyrB20、DOI]的合成和纯化
hIns[DOI]是缺少人胰岛素B链的残基23至30的单体类似物。遵循标准的程序，将hIns[DOI]和hIns[TyrB15，TyrB20，DOI]化学合成、纯化和氧化。
实例2-Con-Ins G1人胰岛素受体结合和信号传导激活
胰岛素受体结合。
通过结合竞争测定测量Con-Ins G1与人胰岛素受体(hIR)结合的能力。使用具有铕标记的人胰岛素的溶解的免疫捕获的人IR(同种型B)和增加浓度的毒液胰岛素(如先前所述)进行竞争结合测定(Denley等人，2004)。使用具有Polarstar荧光计(BMG实验室科技公司(BMGLab Technologies)，莫宁顿，澳大利亚)的340-nm激发和612-nm发射滤光器测量时间分辨荧光。通过曲线拟合用非线性回归(单点)，使用Prism 6，分析计算IC50值。进行至少三次测定，其中每个数据点重复三次。
尽管缺少与hIns的ArgB23到ThrB30的等效物，相比hIns(sCon-Ins G1：log[IC50(nM)]＝1.24±0.06；hIns：log[IC50(nM)]＝-0.26±0.02)，发现地纹芋螺毒液胰岛素Con-Ins G1针对人IR-B受体仅低出三十倍活性(图1和2)。
胰岛素信号传导激活测定。
通过Akt磷酸化作用分析评估Con-Ins G1诱导胰岛素信号传导的能力。简言之，在过表达人IR-B的小鼠成纤维细胞系NIH 3T3中测量pAkt Ser473水平。将该细胞系在具有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素-链霉素和2μg/mL嘌呤霉素的DMEM中培养。对于测定，将40，000个细胞/孔置于具有1％FBS的培养基的96孔板中。24小时后，在去除原始培养基后，将50μL胰岛素溶液移液到每个孔中。处理30分钟后，去除胰岛素溶液，并且使用HTRFpAkt Ser473试剂盒(Cisbio，马萨诸塞州，美国)测量pAkt Ser473的细胞内水平。简言之，首先用细胞裂解缓冲液(50μL/孔)在温和摇动下将细胞处理1小时。然后将16μL细胞裂解物添加到白色384孔板中的4μL检测试剂中。孵育4小时后，在Synergy Neo板读数器(伯腾公司(BioTek)，佛蒙特州，美国)中读板，并且根据制造商的方案处理数据。测定总共重复四次。通过曲线拟合用非线性回归(单点)(使用Prism 6)分析计算EC50值。
在Akt磷酸化作用测定中，发现Con-Ins G1具有比hIns仅低出十倍的活性(sCon-Ins G1：log[EC50(nM)]＝0.90±0.05；Con-Ins G1：log[EC50(nM)]＝0.78±0.15；hIns：log[EC50(nM)]＝-0.20±0.20；图3)。我们的结果突出了Con-Ins G1中结构基序的存在，尽管毒液蛋白缺少与规范的芳香族三联体或B链C-末端区段作为整体的等效物，但这些结构基序仍能够实现强效活性。
实例3-Con-Ins G1的晶体结构
结晶和数据收集。
如以上所述合成Con-Ins G1。制备Con-Ins G1用于在10mM HCl中以4mg/mL的浓度结晶。
初步结晶试验使用在CSIRO共结晶中心(帕克维尔，澳大利亚)进行的机器人192条件稀疏矩阵悬滴筛。从包含2.0M硫酸铵加10％DL-苹果酸盐-MES-Tris(pH9.0)的条件中提取单晶，并且然后直接(在没有低温保护剂的情况下)安装在低温环中，用于在100K下在澳大利亚同步加速器的MX2光束线上进行衍射数据收集。使用XDS(Kabsch(2010))，将数据处理为的分辨率。空间群是具有晶胞大小的P432。根据5143Da/单体和1分子/不对称单元的表观分子量，溶剂含量被估计为64％。
结构溶液和精化
使用来自PDB条目3I3Z的胰岛素单体作为起始模型并且使用PHASER软件(McCoy等人，2007)，通过分子置换来解析该结构。晶体精化使用PHENIX(Adams等人，2010)，在COOT(Emsley和Cowtan，2004)内与模型构建进行迭代。在靠近四折叠轴处观察到的单个硫酸根离子在不受其取向或位置的限制的情况下进行建模，通过将其占有率设定统一而不是0.25在PHENIX中来实现。表1中呈现了数据处理和精化统计。终模型具有0.208/0.217的R工作/R游离。终模型中的所有残基都位于拉马钱德兰图的优选区域中。
表1：X射线数据处理和精化统计
a圆括号中的数字是指外部分辨率壳层(outer resolution shell)。
b将数据包括在最大分辨率下，在该最大分辨率下，CC1/2相关统计量在p＝0.001的显著性水平上仍然显著。
实例4-Con-Ins G1结构
结构显示整体Con-Ins G1二级结构与hIns的结构相似，其中B链的N-末端残基遵循类似于经典T-状态hIns的扩展路径(图4a)(T-状态的特征在于残基B1-B8处于扩展构象，相对于A链螺旋组件向后折叠)。如从不存在相当于hIns B22-B30的残基所预期的，晶体晶胞内没有类似于hIns二聚体界面的界面。晶体内的所有单体-单体界面都是稀疏的，除了在四折叠轴周围填充的Con-Ins G1单体之间形成的那些(其中每个埋藏约的分子表面)外。这四种单体配位于靠近四折叠轴的表观硫酸盐离子，该硫酸盐离子形成具有ClyA1的酰胺和每个GlaA4的单个侧链羧酸基团的带电补偿簇的一部分(图5)。基于以下的沉降平衡数据，诸位发明人得出结论，这种结合是结晶的假象。
Con-Ins G1的疏水核涉及残基ValA2、CysA6、CysA11、PheA16、TyrA19、ArgB6、IleB11、TyrB15和LeuB18的侧链(图4b)。在这些残基中，三个在人胰岛素中是相同的(CysA6、CysA11和TyrA19)，三个保守地不同(ValA2→Ile、IleB11→Leu和LeuB18→Val)和三个明显不同(ArgB6→Leu、PheA16→Leu和TyrB15→Leu)。在hIns中，Con-Ins G1中TyrB15的LeuB15等效物部分与hIns PheB24的核心相对填充，并且部分与hIns PheB24的侧链相对填充；在不存在hIns B24的等效物的情况下，由Tyr取代稍微减少了Con-Ins G1单体的暴露的疏水表面。Cons-Ins G1 PheA16的较大侧链(与hIns LeuA16的侧链相比)似乎与TyrB15的变化相关联：与其hIns对应物相比，TyrB15的侧链远离蛋白质的核心，其中(较大的)PheA16芳香族环在填充方面补偿了这一点(图4b)。
实例5-同源建模和分子动力学
为了深入了解在不存在关键受体结合残基hIns PheB24的等效物的情况下针对脊椎动物胰岛素受体能够实现Con-Ins G1活性的结构原理，诸位发明人创建了一个Con-InsG1模型，该模型与形成激素的初始结合位点的人胰岛素受体(hIR)的元件结合。使用MODELLER(v9.15)(Webb和Sali，(2014))创建了与IR L1-CR模块(残基Gly5至Lys310)和IRαCT区段(IR-A同种型的残基Phe705至Ser719)复合的Con-Ins G1的模型，其中模板是Con-Ins G1的以上晶体结构、与hIns(PDB条目4OGA；Menting等人，2014)复合的IR位点1组分的晶体结构，以及胰岛素A链的NMR结构(PDB条目2HIU；Hua等人，1995)。所有的模型包括Con-Ins G1的翻译后修饰和在每个IR残基Asn16、Asn25、Asn111、Asn215和Asn255处的单个N-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺残基(Sparrow等人，2008)。
分子动力学(MD)模拟使用GROMACS(v5.0.4)(Pronk等人，2013)与CHARMM36力场(Guvench等人，2011；Best等人，2012)，并且用具有最低的建模器目标函数的Con-Ins G1/IR复合体的模型启动。假定可电离的残基(包括羧基-谷氨酸)处于其带电荷的状态。每个系统使用TIP3P水模型在一个立方体盒中溶剂化，该盒子延伸超过所有原子添加钠离子和氯离子以中和系统并且提供0.1M的终离子强度。将蛋白质和溶剂(包括离子)分别偶联，其中将速度重新缩放至在300K下的热浴，应用的偶联时间为0.1ps。所有模拟均使用10A的单个非结合截止值进行，并且将Verlet邻居搜索截止方案与25步(50fs)的邻居列表更新频率一起应用；在所有模拟中使用的时间步骤是2fs。
周期性边界条件与粒子网格Ewald方法一起使用，用于解释远程静电，应用的网格宽度和六阶样条插值。使用P-LINCS算法约束所有键长。模拟包括初始最小化，然后是50ps的MD(其中所有蛋白质原子受限制)。在位置限制的MD之后，MD模拟继续进行另外10ns，对除αCT的C-末端残基(残基Val715至Ser719)之外的IR的Cα原子施加位置限制。在Cα原子限制的MD之后，在没有限制的情况下模拟继续再进行持续50ns。最终模型的坐标提供在附录II中。
TyrB15
从模型中得出的一个突出特征是Con-Ins G1 TyrB15的侧链相对于它在我们的晶体结构中的构象旋转，以避免与hIR αCT残基Phe714的空间碰撞。旋转将Con-Ins G1TyrB15的侧链引入受体复合物中hIns PheB24占据的口袋中，表明Con-Ins G1 TyrB15因此在受体结合方面是hIns PheB24的替代品(图6)。TyrB15侧链的这种旋转还允许关键的hIRαCT残基Phe714与毒液蛋白核结合(图6)。相比之下，脊椎动物胰岛素在B15位置处具有亮氨酸，其是严格保守的。
TyrB20
Con-Ins G1 TyrB20的侧链与Con-Ins G1 TyrB15的侧链相邻，并且也可能参与补偿hInsPheB24的等效物的缺少。我们注意到与TyrB15侧链相关的晶体学差异电子密度定义稍微不明确，与这种迁移率相容(图7)。相比之下，脊椎动物胰岛素在B20位置处具有甘氨酸，其是严格保守的。
PTM
Con-Ins G1含有以下四种翻译后修饰(PTM)：残基A4和B10是与hIns中的Glu和His(分别地)相反的γ-羧基谷氨酸(Gla)，残基B3是与hIns中的Asn相反的羟脯氨酸(Hyp)，并且A链C-末端残基CysA20是酰胺化的(图1)；注意到Con-Ins G1B链编号从-1开始，以便与hIns进行比较)。这种修饰通常在芋螺毒素中观察到，但之前未在胰岛素中检测到(Safavi-Hemami等人，2015)。含有PTM的Con-Ins G1的合成类似物对人IR-B的活性比无PTM的类似物高4倍(图2)，并且诱导Akt磷酸化作用的效率比无PTM的类似物高8倍(图3)。
对Con-Ins结构中的四个PTM的检查表明，除了CysA20的酰胺化之外，所有PTM都可能在稳定Con-Ins G1的结构中发挥作用。GlaA4的两个侧链羧酸都与ClyA1的N-末端氨基基团极性相互作用，hIns GluA4的单侧链羧酸也是如此(图4c)。Con-Ins G1中的这些另外的相互作用可有助于稳定短A链N-末端螺旋。GlaB10的一个侧链羧酸基团与CysB7的主链酰胺形成氢键，并且可以在稳定B链N-末端区域中发挥作用；在hIns内没有等效的相互作用，hIns HisB10参与六聚体形成(图4d)。HypB3的侧链羟基基团等效地位于hIns AsnB3的侧链酰胺氧，并且可能能够与SerA12的主链酰胺形成(长)H-键(图4e)。CysA20的C-末端酰胺不与毒液蛋白的其余部分相互作用。
在实例5所呈现的模型中，与受体相互作用的唯一PTM残基是GlaB4，其相互作用相当于hIns GluB4和αCT Asn711之间的相互作用(图8)。
实例6-hIns G1 DOI L15Y.G20Y信号传导激活
通过如上所述的Akt磷酸化作用分析评估hIns[DOI]和hIns[TyrB15、TyrE20、DOI]诱导胰岛素信号传导的能力。简言之，在过表达人IR-B的小鼠成纤维细胞系NIH 3T3中测量pAkt Ser473水平。将该细胞系在具有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素-链霉素和2μg/mL嘌呤霉素的DMEM中培养。对于测定，将40,000个细胞/孔置于具有1％FBS的培养基的96孔板中。24小时后，在去除原始培养基后，将50μL胰岛素溶液移液到每个孔中。处理30分钟后，去除胰岛素溶液，并且使用HTRF pAkt Ser473试剂盒(Cisbio，马萨诸塞州，美国)测量pAktSer473的细胞内水平。简言之，首先用细胞裂解缓冲液(50μL/孔)在温和摇动下将细胞处理1小时。然后将16μL细胞裂解物添加到白色384孔板中的4μL检测试剂中。孵育4小时后，在Synergy Neo板读数器(伯腾公司(BioTek)，佛蒙特州，美国)中读板，并且根据制造商的方案处理数据。测定总共重复四次。通过曲线拟合用非线性回归(单点)(使用Prism6)分析计算EC50值。
在Akt磷酸化作用测定中，发现hIns[TyrB15、TyrE20、DOI]比hIns[DOI]具有高大约五倍的活性(图9)。我们的结果突出了人胰岛素B链的位置15和20处的突变以至少部分地补偿缺少8个C-末端残基的能力。
实例7-Con-Ins G1的溶液特性
使用沉降平衡分析对在100μg/mL下的在溶液中的Con-Ins G1的自我结合进行分析。简言之，在20℃下使用Beckman XLI分析离心机在12mm路径长度的细胞中进行分析性超速离心。将Con-Ins G1从在10mM HCl中的10mg/mL储液稀释到10mM Tris、50mM NaCl(pH7.4)中至100μg/mL的终浓度。添加等体积的10mM NaOH以中和任何pH变化。使用100μL的总样品体积。制备相同的样品，该样品也含有0.2mM ZnCl2、2mM CaCl2、1mM磷酸钠(pH 7.4)或0.1M硫酸铵。通过220nm处的吸光度测量径向浓度分布。如通过间隔1小时的连续吸光度扫描评估的，在30,000rpm和45,000rpm下建立沉降平衡。在SEDPHAT(Houtman等人，2007)中，使用从组合物估算的溶液密度和溶剂微分比容的值，使用SEDNTERP(Laue等人，1992)，将处于两种速率的数据共同适用于单个理想沉降物质。除二硫化物外，在估算Con-Ins G1微分比容时，忽略所有翻译后修饰。报告的误差描述了为在0.68置信水平上拟合的精度，根据SEDPHAT中实施的蒙特卡罗模拟估算。
由Con-Ins G1是表观MW 5380±55g/mol的单一沉降物质(图10)很好地描述了数据(在30,000和45,000rpm下获得的)。虽然拟合非常好(减少χ2＝0.95)，但最佳拟合质量略高于预期。这可能反映了蛋白质微分比容的不准确估计，这已被诸位发明人从氨基酸组成确定，忽略了存在的翻译后修饰。然而，预测质量的这种增加是存在少量较高分子量物质的结果。这至多相当于存在5％二聚体Con-Ins G1。基于5143的计算的理论质量，诸位发明人得出结论Con-Ins G1在溶液中主要是单体的。因此，Con-Ins G1的单体性质与其缺少与人胰岛素链B的C-末端部分(氨基酸B22-B30)的等效物一致，这已被证明对胰岛素的寡聚化至关重要。
诸位本发明人还测试了Zn2+、Ca2+、SO4 2-或PO4 3-是否改变了Con-Ins G1的聚集状态；特别是，在Zn2+的情况下，测试离子是否可以介导Con-Ins G1多聚化，就像它对hIns一样，并且在SO4 2-的情况下，测试该离子是否可能参与介导在晶体中观察到的四聚体排列。在这些各自离子存在的情况下，观察到类似的沉降平衡分布图，由单一沉降物质同样良好地描述并且其中在表观MW上无显著变化(数据未显示)。因此，诸位发明人得出结论，Con-InsG1在这些离子中的每一种存在下，至少在高达100μg/mL的浓度下，仍然主要是单体的。
实例8-重构受体的初始激素结合位点的与人胰岛素受体片段复合的Con-Ins G1 的晶体结构
结晶和数据收集。
人胰岛素受体(hIR)的初始胰岛素结合位点(“位点1”)可以在最小化的结构域中重建，并且适合于晶体学分析胰岛素或胰岛素类似物与位点1的相互作用(Menting等人2013)(Lawrence等人，2016年)。对该过程不可或缺的是将单克隆抗体83-7(Soos等，1986)的片段进一步附着到受体片段的CR结构域中以辅助结晶。该技术用于生成与重建hIR位点1的元件共复合的Con-Ins G1的晶体。
如实例1中所述合成Con-Ins G1。将Con-Ins G1重悬浮于10mM HCl中。
如Menting等人，2013所述产生并且纯化hIR构建体IR310.T(即，hIR的残基1-310，随后是凝血酶切割位点的N-末端残余Leu-Val-Pro-Arg，并且包括群体变体Tyr144His)。如在(Lawrence等人，2016)中所述产生并且纯化Fv83-7，单克隆抗体83-7的可变结构域模块(Soos等人，1986)。然后将IR310.T与Fv83-7复合，并且如Lawrence等人，2016所述纯化复合物。然后如在Lawrence等人，2016中所述，将Fv83-7.IR310.T复合物进行内切糖苷酶H处理。
由金思特公司(Genscript)(美国)根据合同，合成hIR的A同种型的肽IR-A704-719。
通过将如表2中显示的经EndoH-处理的Fv83.7.IR310.T、IR-A704-719和Con-Ins G1组合来制备与人胰岛素受体片段复合的Con-Ins G1，该复合物重构受体的初始激素结合位点。
表2：与人胰岛素受体片段复合的Con-Ins G1的制备
初步结晶试验使用在CSIRO共结晶中心(帕克维尔，澳大利亚)进行的机器人576条件稀疏矩阵坐滴筛。每个液滴含有1：1孔：复合物体积比。使用1.8M至2.0M硫酸铵或1.8M至2.0M硫酸铵，与0.1M Tris-HCl(pH 7.5)；MOPS-NaOH(pH 7.0)和MES-NaOH(pH 6.5)中的任一者观察到晶体生长。
优化结晶条件，并且使用悬滴形式，在Linbro 24板中，并使用由1.8M至2.0M硫酸铵或1.8M至2.0M硫酸铵、0.1M Tris-HCl(pH 7.5)组成的储液缓冲液，使相同蛋白质：肽：Con-Ins G1混合物的单晶生长。还试验了其他缓冲液(例如，MOPS-NaOH(pH 7.0)和MES-NaOH(pH 6.5))并且产生类似的衍射晶体。在1.7M硫酸铵、50mM MOPS-NaOH(pH 7.0)的溶液中生长的单晶给出最佳衍射数据。
将与iR-A704-719复合的Con-Ins G1的单晶和经EndoH-处理的Fv83.7.IR310.T复合物通过转移至由储液缓冲液加30％甘油组成的溶液中进行低温保护，并且提取进低温环中。然后将环直接投入液氮浴中。在澳大利亚同步加速器(墨尔本，澳大利亚)的光束线MX2处率的衍射收集到分辨数据。使用XDS软件包整合并且合并数据(Kabsch，2010)；表3中呈现了数据处理统计。空间群是具有晶胞大小a＝106.16、b＝227.12和的I222。根据63440Da/复合物和2个复合物/不对称单元的表观分子量，溶剂含量被估计为77％。
结构溶液和精化
将PDB条目4OGA的单个Fv83-7.IR310.T组分使用作为搜索模型(Menting等人，2014)，使用PHASER(McCoy等人，2007)，通过分子置换解析结构。两个拷贝位于不对称单元中。对应于Con-InsG1的两个拷贝(分别与IR的两个各自L1+IR-A704-709片段结合)的电子密度在差异电子密度图中是可见的。然后将Con-Ins G1的残基客观地建立成电子密度。X射线晶体学精化使用PHENIX(Adams等人，2010)。精化的最后阶段包括TLS精化、限制性个体B因子精化和扭转的NCS限制。表3中呈现了最终的精化统计。最终的模型包括表4中详述的残基。
表3：X射线数据处理和精化统计
a圆括号中的数字是指外部分辨率壳层。
b将数据包括在最大分辨率下，在该最大分辨率下，CC1/2相关统计量在p＝0.001的显著性水平上仍然显著。
表4：残基包括在与Fv83-7.IR310.T和IR-A704-719复合的Con-Ins G1的终模型中。最终的模型含有在不对称单元中的复合物的两个拷贝(复合物1和复合物2)。
实例9-与人胰岛素受体片段复合的Con-Ins G1
晶体学不对称单元内的复合物的两个拷贝仅显示出总体结构的有限差异(图11)，并且因此这里的描述将限于复合物1。
图12中提供了Con-InsGl复合物的晶体结构和与Fab83-7.IR310.T和IR-A704-719复合的hIns的晶体结构(PDB条目4OGA；Menting等人，2014)的叠加。与人胰岛素受体片段复合的Con-Ins G1的整体结构类似于与IR310.T、IR-A704-719和Fab 83-7复合的hIns的结构内的等效亚结构的整体结构。一个突出的差异是，对于Con-InsGl复合物，可解释的电子密度对于Con-Ins G1 B7的N-末端的三个残基是明显的。因此，最终模型因此包括Con-Ins G1残基B4、B5和B6。相反，在人胰岛素共复合结构中，hIns的B链可以仅在C-末端方向上从残基B7向前建模。
图13显示了在此确定的Con-Ins G1复合物的结构和与IR310.T、IR-A704-719和Fab83-7复合的人胰岛素的结构的叠加，该叠加聚焦于Con-Ins G1的残基TyrB15。很明显，TyrB15的侧链从其无受体的位置旋转以定位在人胰岛素复合物中hIns PheB24的侧链所占据的相同位置中。复合物结构支持实例5的结论，即TyrB15有助于弥补PheB24的缺失。对于Con-Ins G1 TyrB20，不存在可说明的电子密度。
实例10-具有包含人胰岛素受体的初始结合位点(位点1)的组分的hIns[DOI]、 hIns[TyrB 15，DOI]和hIns[TyrB20，DOI]的分子建模
用MODELLER(v9.16)(Webb&Sali，2014)，使用与人胰岛素(hIns)(PDB条目4OGA；Menting等人，2014)复合的IR位点1组分的晶体结构以及胰岛素A链(PDB条目2KJJ)的NMR结构创建与IR L1结构域(残基Gly5至Cys155)和IR-A705-714复合的去-八-胰岛素(hIns[DOI]：一种缺少B链的八个C-末端残基的人胰岛素)的模型。所有的模型包括在每个IR残基Asn16、Asn25和Asn111处的单个各自N-连接的N-乙酰基-D-葡糖胺残基的翻译后修饰。
使用GROMACS(v5.1.2)(Abraham等人，2015)程序套件和CHARMM36修订版(Guvench等人，2011；Best等人，2012)力场进行分子动力学(MD)模拟，该力场用具有最低的MODELLER目标函数的hIns[DOI]-IR复合物的模型启动。将每个系统放置在TIP3P单点水模型溶剂化的立方体盒中，该盒延伸超过所有原子其中沿所有轴使用周期性边界条件。假定可电离的残基处于其带电状态，并且通过中和系统和添加足够的钠和氯离子获得0.1M的最终离子强度。温度偶联分两组进行，其中蛋白质和溶剂独立地偶联到速度重新缩放(Bussi等人，2007)，恒温器在300K，两组利用0.1ps的时间常数。用Berendsen(Berendsen等人，1984)技术使用1巴的参考压力和0.5ps的时间常数实施各向同性压力偶联。所有模拟均用通用的非键合相互作用截止值进行，其中使用具有的网格宽度和六阶样条插值的粒子网格Ewald方法(Essmann等人，1995)进行长程静电。将Verlet邻居搜索截止方案与25步(50fs)的邻居列表更新频率的一起应用；在所有模拟中使用的时间步骤是2fs。用P-LINCS算法(Hess，2008)约束所有键长。模拟经历了初始最速下降的最小化，然后是50ps的MD(其中所有蛋白质原子受限制)。在位置受限制的MD之后，MD模拟继续再进行持续100ns。
在100ns MD之后，使用FoldX程序套件(Schymkowitz，等人2005)分析胰岛素类似物与受体的相互作用。在进行位置扫描之前，将FoldX RepairPDB实用程序用于确保结构没有不合理的扭转角或范德瓦尔斯碰撞，表明在hIns[DOI]的每个位置处的产生的突变ΔΔG贡献。
去-八-膜岛素(hIns[DOI])
由hIns[DOI]产生的相互作用在具有受体(PDB条目4OGA)的天然hIns的X射线晶体结构中观察到的在胰岛素和受体之间的界面上保留相似的相互作用，特别是在由B结构域残基ValB12、LeuB15和受体残基Asn15、Leu37、Phe39和Phe714产生的疏水口袋内进行的相互作用。B链C-末端残基的不存在导致B链螺旋不再解旋，导致ArgB22和GluA17之间的瞬时盐桥。这也允许B链螺旋移动更接近IR-L1，导致TyrB16和IR-L1 Tyr67之间的π-π平行移位堆叠。该最终的模型示出在图14中。去-八-膜岛素-TyrB15(hIns[TyrB15，DOI])
在100ns的时间段内，由hIns[TyrB15，DOI]观察到的相互作用与由hIns[DOI]所发生的作用相似。B链螺旋反映了更靠近IR L1结构域的移动，其中在TyrB16和IR-L1 Tyr67之间具有类似的π-π堆叠。C-末端B链残基的灵活性类似地允许ArgB22和GluA17之间的瞬时盐桥。在B15位置存在Tyr投射到占有如下空间的DOI-(IR-A704-719)-L1界面的疏水核中，其他情况下该空间由hIns LeuB15占有。该最终的模型示出在图15中。
去-八-胰岛素-TyrB20(hIns[TyrB20，DOI])
最初的比较模型包括确保TyrB20占据hInsB24结合位点的限制。在100ns的MDTyrB20保留在hIns B24结合位点之后，其中与受体的所有其他相互作用呈现原始样。与hIns[DOI]不同，TyrB16和IR L1 Phe39之间的天然π-π平行位移堆积得以维持，然而，由ArgB22和GluA17之间缺少B链C-末端残基引起的盐桥与在hIns[DOI]情况下观察到的盐桥相同。该最终的模型示出在图16中。
FoldX突变位置扫描分析
FoldX位置扫描实用程序提供了关于hIns[DOI]内可以容纳突变的位置和不能突变的位置的定性解释(图17、18和19)。在hIns[DOI]和hIns[TyrB20，DOI]内，A链内的溶剂暴露的残基(特别是残基GluA4、GlnA5和ThrA8)表明对大多数突变具有很小的净正或负作用。这与hIns[TyrB15，DOI]类似物不同，该类似物相反提出了对这些残基的突变产生的积极影响。在相互作用面上疏水核内发生的突变不出意外地表明在所有模型的情况下都有更大的作用，并且所有模型均表明二硫键结合的半胱氨酸可能具有显著的ΔΔG优势，然而由于二硫化物相互作用对类似物整体结构的重要性，这一数据被剔除了。在残基TyrA14、AsnA18、HisB5和GluB21上的突变表明，在DOI-TyrB20类似物中，这些位置上的突变是有利的，其中它们不在DOI类似物中；表明更有利的相互作用。然而，DOI-TyrB15类似物提供了类似于DOI和DOI-TyrB20结果的汞齐的结果，表明除HisB5外，在所有位点上仅有微小差异。AsnB3和GlnB4位置上的突变表明相反，然而这可能是由于在该框架处接近B链螺旋的B链的取向，并且因此是采样技术的假象。
结论
与IR L1结构域和IR-A705-719的复合的hIns类似物hIns[DOI]、hIns[TyrB15，DOI]和hIns[TyrB20，DOI]的MD模拟，以及随后的突变分析提供了关于方法的见解，尽管缺少关键的受体结合残基，hIns[DOI]特别地结合PheB24。该模拟表明，在B20位的酪氨酸取代可以作为hIns中PheB24的取代，占据大致相同的位置，并且在模拟时间内是稳定的。模拟hIns[DOI]与胰岛素受体片段的相互作用中(缺少PheB24以及任何通过B15或B20突变取代它的尝试)表明其结合在整体上与具有IR L1和IR-A705-719的hIns相似，但在IR L1结构域和类似物B链之间的位点上存在细微差异。由于可能发生的空间碰撞，在hIns[TyrB20，DOI]复合物中没有观察到B链向IR L1结构域的移动，然而在hIns[TyrB15，DOI]中观察到，这表明在B20上的取代的影响与B15上的不同。突变FoldX计算表明，类似的有利突变存在于在B20突变时不受结合姿势的所得变化影响的位点，其中这些差异位于疏水核的远端。
实例11-单体人胰岛素类似物的开发新胰岛素类似物的研究策略
如本文所述，在捕食性螺的毒液中的单体胰岛素变体(Con-Ins-G1)的最近发现有助于推动所披露的肽背后的研究。已经开发了方法并且已经获得如下数据，该数据解释了Con-Ins-G1如何既避免二聚化又维持受体结合和胰岛素信号传导，从而非常快速地起作用。此外，已经使用来自基础发现的见解来开发如下蛋白质，该蛋白质仅在四个氨基酸位置处与人胰岛素序列不同，但仍是单体的，速效并且显示出与真实人胰岛素效力相当的效力。
从Con-Ins-G1研究中获得的见解被用于开发单体人胰岛素，该人胰岛素仅显示来自人“缩短的”蛋白质的四个氨基酸取代。
为了规避人胰岛素结构的约束，解决方案取自自然：渔捕的芋螺，地纹芋螺，已经进化出使用来自其毒液的专门胰岛素，它们的毒液在几秒钟内引起鱼类瘫痪的低血糖休克。使用基因组测序和质谱法的组合阐明了毒性胰岛素Con-Ins-G1的序列(图1)。值得注意的是，观察到四种翻译后修饰：A4 Glu和B10 Glu对γ羧基谷氨酸，Gla；B3 Pro对2-羟脯氨酸，和A链上的C-末端酰胺。由于这种有毒胰岛素的低丰度，它不能从动物体内分离出来。相反，获得了合成类似物(sCon-Ins-G1)，其中为了便于合成，二硒键置换了A链中的分子内二硫键。当sCon-Ins-G1被注入鱼中时，它会引起低血糖休克，并且当它存在于水中时会减慢鱼的运动性。除了对鱼的作用外，Con-Ins-G1最特殊的特点在于它是迄今为止被报道具有“缩短的”B链的最短的胰岛素分子。因为缩短的人胰岛素(去八肽胰岛素，DOI)是单体的，表明Con-Ins-G1是单体的并且可以被用作UFI(超速效胰岛素)。Con-Ins-G1缺少在人胰岛素中参与与人胰岛素受体(hIR)结合的两个区段：首先，人胰岛素的A21Asn与hIR结合位点1接触并且其去除导致结合亲和力降低100倍。其次，芳香族三联体(B24-B26)是用于通过在hIR结合位点1处的接触将人胰岛素结合hIR结合的一种元件。这些残基的去除导致亲和力降低1，000倍。
尽管存在这些问题，但Con-Ins-G1(代替硒类似物)是化学合成的，并且发现它以比人胰岛素仅低30倍的亲和力与hIR结合。该令人惊讶的结果提出了一个关键问题：Con-Ins-G1如何在没有人胰岛素使用的关键芳香族残基的情况下与hIR结合？发现Con-Ins-G1的结构显示出与人胰岛素几乎相同的主链。通过将Con-Ins-G1结构匹配到公开的人胰岛素-hIR共结构中，推断出Con-Ins-G1 B15 Tyr和B20 Tyr(人胰岛素中的Leu和Gly)与人IR相互作用以取代由人B24Phe发挥的作用。这些强有力的结果为基于螺胰岛素结构开发人单体UFI提供了合理的基础。
开发作为治疗先导的人单体胰岛素类似物。
超速效胰岛素(UFI)的开发代表了胰岛素类似物开发的下一个重大进步。重新设计人胰岛素的基本挑战是参与受体结合的相同残基还介导二聚体形成。因此，有毒胰岛素Con-Ins-G1的发现代表了在产生单体、超速作用胰岛素方面向前迈出的重要一步，因为它缺少这些残基(并且因此不会二聚化)但保留了结合和激活胰岛素受体的能力。然而，令人担心的是，Con-Ins-G1和人胰岛素之间的低序列同一性可能引起免疫应答，特别是考虑到糖尿病是需要每日胰岛素注射的慢性疾病。因此，代替基于毒性胰岛素开发UFI，人们可以从人DOI(去八肽(B23-30)人胰岛素)的支架开始，因为它是单体的，并且因为这种截短的人胰岛素的近似类似物很可能是人体免疫系统可以耐受的，如目前临床使用显示两个或三个突变的胰岛素类似物所指示的。然而，挑战是DOI几乎失活(比人胰岛素弱1，000倍)。数据表明，Con-Ins-G1使用B15Tyr和/或B20Tyr来补偿B24Phe的损失，并且进一步表明增强Con-Ins-G1亲和力的另外的修饰。利用这些见解，DOI可以发展成为一种有活性的UFI类似物，作为糖尿病治疗的治疗先导。
将人DOI开发成具有生物活性的单体胰岛素
传统上，DOI是通过人胰岛素的胰蛋白酶裂解酶促合成的，这不适合于类似物合成。因此，已经开发了用于访问DOI的模块化合成路线。用于合成人胰岛素的主要挑战是A链的疏水特性。通过在A8-A9Thr-Ser上使用异酰基肽对，将额外带电荷的残基(胺)引入A链以增加其溶解度(图21)。在形成二硫键后，异酰基肽在pH8下经历O-至-N酰基移动以产生DOI序列。该合成的DOI具有与酶促合成DOI相同的分子量(来自MALDI)和hIR激活活性，这证明了所开发的方法的可靠性。
已经证明，Con-Ins-G1的B15和B20上的两个Tyr对于hIR激活是重要的。为了测试这两个位点上的突变将增加hIR激活效力的假设，合成了三种DOI类似物，其中B15Leu和/或B20Gly突变为Tyr。如图22所示，具有B20Tyr的两种类似物在hIR激活中具有5倍增加的效力，而B15 Tyr DOI类似物与DOI相似。这表明单独的B20 Tyr可以增加DOI的效力，可能是由于补偿了B24 Phe的损失。为进一步增加效力，合成了另外显示B10 Glu的DOI类似物，该B10Glu是产生最强hIR结合的B10取代。与单独的B20Tyr相比，这提供了效力的另外5倍的增加，并且具有与Con-Ins-G1相似的效力(图23)。这表明来自毒性胰岛素的突变可以移植到人DOI上以开发生物活性类似物。
与人胰岛素受体的位点1片段复合的Con-Ins-G1和ConIns G1的晶体结构缺少B20残基的清晰的电子密度，这表明该晶体结构可能是柔性的。还可能的是在该位置处的酪氨酸取代的侧链也可能不能最佳地与胰岛素受体结合。因此，通过合成一系列B10E，B20X DOI类似物(其中X为芳香族氨基酸)，测试了除Tyr之外的取代可进一步增加效力的假设(图24A)。有趣的是，大的取代基(如吲哚(Trp)和联苯基团)导致在hIR激活方面的更高效力(图24B)。联苯类似物是人胰岛素效力的10％(比N10E，B20Y DOI高3倍)。这证明了使用蛋白质工程和结构生物学的跨学科方法的力量。通过使两个位置突变，DOI的效力增加了100倍。B20上的经卤素取代的萘基和联苯基可用于进一步优化DOI类似物的效力。
因为A8位置对于与hIR结合位点2相互作用是重要的，所以可以将A8His突变引入用于hIR激活的当前的先导类似物和测定中。将A8His和A9Arg(Con-Ins-G1上的原始残基)与B10 Glu和B20 Tyr一起引入DOI类似物，先导类似物中(图23)。这种四重DOI突变体具有与人胰岛素相当的hIR激活的效力(图25)。Con-Ins-G1上的突变促进与IR位点2的结合。X射线晶体学可用于研究胰岛素和结合位点2之间的相互作用。通过使用类似于B20工作的药物化学方法，蛋白质工程的努力可以扩展到A8-A10三联体以进一步优化与hIR结合位点2的相互作用。目前，最好的DOI类似物仅在4个残基处与亲本人胰岛素序列不同，因此单体DOI类似物的免疫原性可能类似于临床使用的经FDA批准的胰岛素类似物的免疫原性。
已经证明A8、A9、B10和B20上的每个突变在影响hIR激活中具有个体效应(图26)。
在STZ处理的糖尿病小鼠模型中评估单体胰岛素先导。
在鉴定有效的单体胰岛素类似物后，可以评估体内特性。可以在STZ处理的小鼠中进行胰岛素耐量测试以确认体内葡萄糖降低能力。UFI类似物的两个关键特征是起效快且作用持续时间短。在皮下注射后，在糖尿病小鼠使用HPLC结合质谱(LC/MS/MS)测量UFI类似物血清水平，以测量其吸收速率(使用赖脯胰岛素作为对照)。对于单体胰岛素，与二聚体赖脯胰岛素相比，可以看到更快的吸收速率。此外，血糖钳实验可用于通过测定维持目标葡萄糖水平所需的葡萄糖输注量来在体内定量UFI类似物的起效和持续时间。葡萄糖钳研究可以显示UFI类似物由于其在皮下组织中的储库效应降低而具有较短的起效和持续时间。这些特性的组合可以大大降低低血糖症的风险。
本领域技术人员将理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对如具体实施例中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。使用不超过常规的实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的方法和组合物的具体实施例的许多等效方案。此类等效方案旨在由以下权利要求所涵盖。
本文所讨论和/或引用的所有出版物均以其全部内容并入本文。
已经包括在本说明书中的文献、法规、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于提供本发明背景的目的。不应将其视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或是与本发明相关的领域中的公知常识，因为它存在于本申请的每个权利要求的优先权日之前。
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附录I：CON-INS G1胰岛素的原子坐标
(A链和B链)
格式包含以下冒号隔开的字段：(1)原子名称；(2)残基类型；(3)链名称；(4)残基数；(5-7)xyZ坐标；(8)热B因子。
N：GLY：A：1：15.439：38.785：34.309：26.76 CA：VAL：A：3：14.092：44.414：32.525：22.38
CA：GLY：A：1：14.11：39.14：33.733：22.21 C：VAL：A：3：15.618：44.365：32.529：26.64
C：GLY：A：1：14.251：39.976：32.492：21.3 O：VAL：A：3：16.283：45.246：31.982：21.94
O：GLY：A：1：15.353：40.312：32.093：22.73 CB：VAL：A：3：13.517：44.989：33.842：28.85
H1：GLY：A：1：15.395：38.813：35.197：32.11 CG1：VAL：A：3：14.192：46.325：34.21：23.35
H2：GLY：A：1：15.666：37.965：34.049：32.11 CG2：VAL：A：3：11.967：45.154：33.731：22.25
H3：GLY：A：1：16.051：39.366：34.024：32.11 H：VAL：A：3：13.276：42.642：32.928：31.58
HA2：GLY：A：1：13.625：38.331：33.508：26.65 HA：VAL：A：3：13.816：44.998：31.802：26.85
HA3：GLY：A：1：13.595：39.639：34.386：26.65 HB：VAL：A：3：13.695：44.361：34.559：34.62
N：VAL：A：2：13.113：40.325：31.895：21.05 HG11：VAL：A：3：13.808：46.654：35.037：28.02
CA：VAL：A：2：13.122：41.169：30.72：22.11 HG12：VAL：A：3：15.144：46.176：34.323：28.02
C：VAL：A：2：13.696：42.561：31.01：20.41 HG13：VAL：A：3：14.039：46.963：33.496：28.02
O：VAL：A：2：14.274：43.187：30.116：20.06 HG21：VAL：A：3：11.628：45.515：34.565：26.7
CB：VAL：A：2：11.698：41.225：30.132：25.46 HG22：VAL：A：3：11.767：45.762：33.001：26.7
CG1：VAL：A：2：10.72：41.927：31.074：21.3 HG23：VAL：A：3：11.569：44.287：33.558：26.7
CG2：VAL：A：2：11.725：41.902：28.839：27.88 N：CGU：A：4：16.193：43.318：33.099：21.34
H：VAL：A：2：12.33：40.084：32.154：25.26 CA：CGU：A：4：17.68：43.233：33.107：21.52
HA：VAL：A：2：13.693：40.756：30.053：26.54 CB：CGU：A：4：18.136：42.041：33.939：22.15
HB：VAL：A：2：11.38：40.32：29.989：30.55 CG：CGU：A：4：17.867：42.164：35.47：27.83
HG11：VAL：A：2：9.841：41.939：30.665：25.56 CD1：CGU：A：4：16.419：42.187：35.88：25.08
HG12：VAL：A：2：10.688：41.442：31.914：25.56 OE12：CGU：A：4：16.135：42.812：36.937：28.6
HG13：VAL：A：2：11.026：42.835：31.227：25.56 OE11：CGU：A：4：15.531：41.542：35.211：22.71
HG21：VAL：A：2：10.824：41.931：28.48：33.45 CD2：CGU：A：4：18.45：40.98：36.25：48.38
HG22：VAL：A：2：12.061：42.804：28.963：33.45 OE21：CGU：A：4：18.448：39.819：35.754：54.62
HG23：VAL：A：2：12.306：41.412：28.238：33.45 OE22：CGU：A：4：18.871：41.181：37.42：85.42
N：VAL：A：3：13.604：43.056：32.249：26.31 C：CGU：A：4：18.255：43.089：31.618：20.98
O：CGU：A：4：19.303：43.691：31.269：21.08 C：CYS：A：7：17.553：48.188：30.41：23.78
HG：CGU：A：4：18.338：43.105：35.863：33.4 O：CYS：A：7：18.103：49.215：30.042：30.88
HB3：CGU：A：4：17.661：41.115：33.568：26.58 CB：CYS：A：7：15.098：48.081：30.895：21.43
HB2：CGU：A：4：19.22：41.867：33.754：26.58 SG：CYS：A：7：15.221：49.718：31.732：27.59
HA：CGU：A：4：18.079：44.185：33.551：25.82 H：CYS：A：7：16.14：45.864：29.941：25.26
N：HIS：A：5：17.548：42.333：30.786：21.02 HA：CYS：A：7：16.016：48.446：29.103：26.09
CA：HIS：A：5：18.007：41.966：29.443：20.65 HB2：CYS：A：7：14.229：48.033：30.465：25.71
C：HIS：A：5：17.659：43.013：28.373：19.86 HB3：CYS：A：7：15.165：47.394：31.576：25.71
O：HIS：A：5：18.285：43.07：27.334：23.44 N：HIS：A：8：18.157：47.348：31.264：28.49
CB：HIS：A：5：17.391：40.584：29.071：20.16 CA：HIS：A：8：19.509：47.657：31.747：25.02
CG：HIS：A：5：18.115：39.864：27.981：47.58 C：HIS：A：8：20.564：47.453：30.657：30.05
ND1：HIS：A：5：19.277：39.15：28.201：43.05 O：HIS：A：8：21.558：48.179：30.604：34.16
CD2：HIS：A：5：17.832：39.734：26.661：45.41 CB：HIS：A：8：19.847：46.811：32.972：27.96
CE1：HIS：A：5：19.678：38.617：27.058：50.46 CG：HIS：A：8：18.916：47.03：34.125：33.4
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HG3：ARG：B：21：-2.258：35.94：17.327：79.9 HH12：ARG：B：21：-7.017：34.764：15.855：164.05
HD2：ARG：B：21：-4.462：36.672：16.495：104.64 HH21：ARG：B：21：-4.571：32.628：15.17：138.98
HD3：ARG：B：21：-3.698：36.842：15.117：104.64 HH22：ARG：B：21：-6.049：32.738：15.311：138.98
附录II：与胰岛素受体(链E、F和X)结合的CON-INS G1胰岛素(链A和B)的模型的原 子坐标
格式包含以下冒号隔开的字段：(1)原子名称；(2)残基类型；(3)链名称；(4)残基数；(5-7)xyZ坐标。
N：GLY：A：1：50.25：62.37：57.42 HG22：VAL：A：3：46.13：63.62：52.26
CA：GLY：A：1：50.21：62.09：55.93 HG23：VAL：A：3：44.4：63.97：52.44
C：GLY：A：1：50.37：63.37：55.13 C：VAL：A：3：47.13：66.53：54.97
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N：VAL：A：2：50.36：63.33：53.84 N：CGU：A：4：47.56：65.91：56.11
CA：VAL：A：2：50.39：64.45：52.97 CA：CGU：A：4：47.83：66.64：57.38
CB：VAL：A：2：50.68：64.02：51.52 CB：CGU：A：4：48.2：65.74：58.59
CG1：VAL：A：2：49.47：63.39：50.84 CG：CGU：A：4：47.15：64.64：59.01
HG11：VAL：A：2：49.15：62.42：51.28 CD1：CGU：A：4：46.83：63.56：58.09
HG12：VAL：A：2：48.57：64.02：50.95 OE11：CGU：A：4：45.67：63.06：58.15
HG13：VAL：A：2：49.67：63.37：49.74 OE12：CGU：A：4：47.69：63.15：57.27
CG2：VAL：A：2：51.09：65.27：50.71 CD2：CGU：A：4：47.66：63.83：60.16
HG21：VAL：A：2：51.18：64.92：49.66 OE21：CGU：A：4：48.79：63.44：60.04
HG22：VAL：A：2：50.29：66.03：50.8 OE22：CGU：A：4：47.02：63.74：61.23
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C：VAL：A：2：49.28：65.39：53.13 O：CGU：A：4：48.88：68.76：57.7
O：VAL：A：2：49.47：66.66：53.13 N：HSP：A：5：49.99：67.35：56.35
N：VAL：A：3：48.03：64.83：53.43 CA：HSP：A：5：51.16：68.26：56.32
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HG13：VAL：A：3：44.46：66.82：53.53 CE1：HSP：A：5：55.24：69.11：57.01
CG2：VAL：A：3：45.4：64.44：52.42 C：HSP：A：5：50.95：69.36：55.26
HG21：VAL：A：3：45.44：65.23：51.65 O：HSP：A：5：51.53：70.39：55.44
N：CYS：A：6：50.13：69.07：54.23 CD：PRO：A：10：50.86：77.07：53.54
CA：CYS：A：6：50.12：70.02：53.1 CA：PRO：A：10：51.91：75.19：52.5
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C：CYS：A：7：45.9：71.97：53.55 C：CYS：A：11：55.53：72.94：51.45
O：CYS：A：7：45.19：72.7：52.82 O：CYS：A：11：55.12：73.21：50.35
N：HIS：A：8：46.4：72.37：54.71 N：SER：A：12：56.8：72.88：51.78
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O6：NAG：X：724：47.57：20.51：48.06

Claims (96)

1.一种包含A链肽和B链肽的胰岛素类似物，其中该B链包含在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的芳香族或大脂肪族残基和/或在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号15的位置处的芳香族或大脂肪族残基，其中该类似物包含在人胰岛素中发现但在地纹芋螺(Conus geographus)毒液胰岛素的相应的位置中缺少的至少一个氨基酸，并且其中该A链肽和B链肽跨过至少一对半胱氨酸残基结合在一起。
2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中在对应于人胰岛素B链的氨基酸编号20的位置处的该芳香族或大脂肪族残基选自下组，该组由以下组成：酪氨酸、苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、环戊基丙氨酸和环己基丙氨酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的胰岛素类似物，其中当与人胰岛素相比时，该B链在C-末端是截短的。
4.根据权利要求3所述的胰岛素类似物，其中该B链缺少人胰岛素的九个C-末端氨基酸中的一个或多个或全部。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的胰岛素类似物，其中该B链至少缺少人胰岛素的PheB24。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的胰岛素类似物，其中该B链至少缺少人B链芳香族三联体(氨基酸PheB24-PheB25-TyrB26)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物包含：
A链肽，该A链肽包含序列Gly—XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34，
其中XA2＝Val或Ile；XA3＝Val或Ala；XA4＝Glu、Asp、Cys或γ羧基谷氨酸；XA5＝Gln、Glu、γ羧基谷氨酸、His或Val；CysA6、CysA7、和CysA11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；XA8＝Thr、His、Asp、Gln、Tyr、Lys、Ala或Val；XA9＝Ser、Arg、Asn、Gly、His或Lys；XA10＝Ile、Pro、Tyr、Ala、Ser、Val、Phe、His或Thr；XA12＝Ser或Thr；XA13＝Leu、Asn、Val、Arg或Asp；XA14＝Tyr、Ala、Gln、His、Asp或Glu；XA15＝Gln、Glu或Thr；XA16＝Phe、Leu或Ala；XA17＝Glu、Gln、Lys、Arg、Ile、Met、Thr或Ser；XA18＝Lys、Ser、Thr、Asn、Gln或Glu；XA19＝Tyr或Phe；CysA20＝Cys、硒代半胱氨酸、酰胺化的Cys、或酰胺化的硒代半胱氨酸；XA21＝Asn、Pro、His、Ser、Gly、Ala或不存在；XA22＝Pro、Asn、Thr、Leu、Ser或不存在；XA23＝Thr、Leu、Val、Ser或不存在；XA24＝Arg、Thr、Met、Gln、Leu或不存在；XA25＝Glu、Gly或不存在；从XA26＝Ser、Leu或不存在；XA27至XA31独立地是Ser或不存在；XA32＝Ala、Ser或不存在；XA33＝Ala、Val或不存在；并且XA34＝Ala或不存在(SEQ ID NO：1)；和
B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Ala、Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Ala、Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Lys、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Thr、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Thr、Tyr、Pro、Leu或Gly；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg、Ser或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Val、Tyr、Phe、His、Gly、Gln、Leu、酰胺化的His、酰胺化的Val或不存在；XB23＝Glu、Asp、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Ile、Leu、Ser、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Ala、Asp、Ser、Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝G1u、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：2)。
8.根据权利要求7所述的胰岛素类似物，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、G1n、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：3)。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的胰岛素类似物，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB10＝Gly、Gln或Asp；XB11＝Ser、Leu、Gly或Pro；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；并且XB24、XB25、XB26、XB27、XB28、XB29、XB30、XB31、XB32、XB33、XB34、XB35、XB36、XB37、XB38和XB39是不存在的(SEQ ID NO：4)。
10.根据权利要求7或权利要求8所述的胰岛素类似物，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His、Tyr、Arg或Ile；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val、Leu或Lys；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝G1u、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：5)。
11.根据权利要求7或权利要求8所述的胰岛素类似物，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-XB10-XB11-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23-XB24-XB25-XB26-XB27-XB28-XB29-XB30-XB31-XB32-XB33-XB34-XB35-XB36-XB37-XB38-XB39，
其中XB1＝Thr、Asn、Ser或不存在；XB2＝Phe、Ser、Asn、Thr、Gln或不存在；XB3＝Asp、Gly、Pro、Leu、Phe或His；XB4＝Thr、Pro、Asp、Val或Gly；XB5＝Asn、Pro、His、Thr、Arg、Ser或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Glu、Asn、Asp、Arg、Gln或Gly；XB7＝His或Tyr；XB8＝Arg、Thr、Ile、Ser、Leu、Tyr或Lys；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Glu、γ羧基谷氨酸、Asp或Asn；XB13＝Ile、Leu、Asp、Val或Ala；XB14＝Thr、Ala、Pro、Val或Arg；XB15＝Asn、Asp、Ala、Val、Thr、Pro或Glu；XB16＝Ala、Ser、Gln、His、Tyr、Arg或Gly；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Met、Val、Gln、Ile、Asp、Gly、Asn或Leu；XB19＝Leu、Asp、Gln、Gly、Lys、Glu、Arg或Thr；XB20＝Val或Leu；CB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr、Phe或His；XB23＝Glu、Arg、Ser、Gly或不存在；XB24＝Arg、Asp、Val或不存在；XB25＝Gly、Leu、Val或不存在；XB26＝Phe、Val、Ile或不存在；XB27＝Phe、Asn、Pro、Glu或不存在；XB28＝Tyr、Cys、His或不存在；XB29＝Thr、His、Leu、Tyr或不存在；XB30＝Pro、Glu、Leu、Ile、Arg或不存在；XB31＝Ile、Lys或不存在；XB32＝Thr、Lys、Leu、Gln或不存在；XB33＝Cys或不存在；XB34＝Glu、Pro、Val或不存在；XB35＝Glu、Gly或不存在；XB36＝Glu、Gly或不存在；XB37＝Glu、Val或不存在；XB38＝Ala、Asp或不存在；并且XB39＝Ala或不存在(SEQ ID NO：6)。
12.根据权利要求7所述的胰岛素类似物，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-XB7-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr、Asn或不存在；XB2＝Phe、Ser或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys、Asn或Gln；XB7＝His或Tyr；XB8＝Arg、Ile或Leu；CysB9＝Cys或硒代半胱氨酸；XB12＝His、Asp、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Val、Ile或Leu；XB14＝Thr、Ala、Pro或Val；XB15＝Glu、Val、Asn或Asp；XB16＝Ser、Gln、Tyr或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr、Asp、Met或Val；XB19＝Leu、Asp、Gln或Lys；XB20＝Leu或Val；CysB21＝Cys、酰胺化的Cys、硒代半胱氨酸或酰胺化的硒代半胱氨酸；XB22＝Tyr或Gly；并且XB23＝Glu、Arg、Gly或不存在(SE IDNO：7)。
13.根据权利要求12所述的胰岛素类似物，其中该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：8)。
14.根据权利要求7至12中任一项所述的胰岛素类似物，其中XB22是Tyr。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的胰岛素类似物，其中该A链肽包含序列Gly-XA2-XA3-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-XA12-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-XA19-CysA20-XA21-XA22-XA23-XA24-XA25-XA26-XA27-XA28-XA29-XA30-XA31-XA32-XA33-XA34，
其中XA2＝Val或Ile；XA3＝Val或Ala；XA4＝Glu、γ羧基谷氨酸或Cys；XA5＝Gln、Glu、γ羧基谷氨酸、His或Val；CysA6、CysA7、和CysA11独立地是Cys或硒代半胱氨酸；XA8＝Thr、His、Asp、Gln、Tyr、Lys或Val；XA9＝Ser、Arg、Asn、His或Lys；XA10＝Ile、Pro、Tyr、Ala、Ser、Phe、His或Thr；XA12＝Ser或Thr；XA13＝Leu、Asn、Val或Asp；XA14＝Tyr、Ala、Gln、Asp或Glu；XA15＝Gln、Glu或Thr；或Ala；XA17＝Glu、Lys、Arg、Ile、Met、Thr或Ser；XA18＝Lys、Thr、Asn、Gln或Glu；XA19＝Tyr或Phe；CysA20＝Cys、硒代半胱氨酸、酰胺化的Cys、或酰胺化的硒代半胱氨酸；XA21＝Asn、Pro、His、Ser、Gly、Ala或不存在；XA22＝Pro、Asn、Thr、Leu、Ser或不存在；XA23＝Thr、Leu、Val、Ser或不存在；XA24＝Arg、Thr、Met、Gln、Leu或不存在；XA25＝Glu、Gly或不存在；从XA26＝Ser、Leu或不存在；XA27至XA31独立地是Ser或不存在；XA32＝Ala、Ser或不存在；XA33＝Ala、Val或不存在；并且XA34＝Ala或不存在(SEQ ID NO：9)。
16.根据权利要求1至6中任一项所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物包含：
A链肽，该A链肽包含序列Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-XA16-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA16是Phe或Leu；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：10)；和
B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-XB22-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；XB22＝Gly或Tyr；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：11)。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物包含：
A链肽，该A链肽包含序列
Gly-XA2-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA2是Val或Ile；XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：12)；和
B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-XB8-CysB9-Gly-Ser-XB12-XB13-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-XB20-CysB21-Tyr-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB8＝Arg或Leu；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB13＝Ile或Leu；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；XB20＝Leu或Val；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：13)。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物包含：
A链肽，该A链肽包含序列
Gly-Val-Val-XA4-XA5-CysA6-CysA7-XA8-XA9-XA10-CysA11-Ser-XA13-XA14-XA15-Phe-XA17-XA18-Tyr-CysA20-XA21，其中XA4是Glu或γ羧基谷氨酸；XA5是His或Gln；XA8是His或Thr；XA9是Arg或Ser；XA10是Pro或Ile；XA13是Asn或Leu；XA14是Ala或Tyr；XA15是Glu或Gln；XA17是Lys或Glu；XA18是Lys或Asn；并且XA21是Asn或不存在(SEQ ID NO：14)；和
B链肽，该B链肽包含序列XB1-XB2-XB3-XB4-XB5-XB6-His-Arg-CysB9-Gly-Ser-XB12-Ile-XB14-XB15-XB16-XB17-XB18-XB19-Leu-CysB21-Tyr-XB23，其中XB1＝Thr或不存在；XB2＝Phe或不存在；XB3＝Phe或Asp；XB4＝Thr或Val；XB5＝Pro、Asn或羟脯氨酸；XB6＝Lys或Gln；XB12＝His、Glu或γ羧基谷氨酸；XB14＝Thr或Val；XB15＝Glu或Asn；XB16＝Ser或Ala；XB17＝Tyr或Leu；XB18＝Tyr或Met；XB19＝Leu或Asp；并且XB23＝Glu或Arg(SEQ ID NO：15)。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的胰岛素类似物，其中应用以下的一种或多种或全部；
i)XA4是γ羧基谷氨酸；
ii)XB5是羟脯氨酸；并且
iii)XB12是γ羧基谷氨酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物包含：
A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：16)；和
B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Xaa-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ IDNO：17)。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物包含：
A链肽，该A链肽包含序列Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：18)；和
B链肽，该B链肽包含序列Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Xaa-Glu，其中Xaa是芳香族残基或大的脂肪族残基(SEQ IDNO：19)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的胰岛素类似物，其中该B链肽的CysB9与该A链肽的CysA6结合。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的胰岛素类似物，其中该B链肽的CysB21与该A链肽的CysA20结合。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的胰岛素类似物，其中CysA7与CysA11结合。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的胰岛素类似物，其中该A链肽和该B链肽在一对它们各自末端处连接在一起。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的胰岛素类似物，其中该A链肽和该B链肽在两个末端处连接在一起。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物具有针对人IR-B受体的小于10-6M的IC50。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的胰岛素类似物，其中在溶液中，至少75％的类似物在溶液中是单体的。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的胰岛素类似物，当给予人时，当与人胰岛素相比时，该胰岛素类似物具有增加的生物利用度。
30.根据权利要求29所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物具有在给予至人的0.5至3小时内的峰生物利用度。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的胰岛素类似物，该胰岛素类似物具有在给予的10分钟内的活性起效。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的胰岛素类似物，其中该类似物不结合人IGF-IR或弱结合人IGF-IR。
33.根据权利要求32所述的胰岛素类似物，其中该类似物对人IGF-IR具有弱于100nM的亲和力(Kd)。
34.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1至31中任一项所述的胰岛素类似物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。
35.一种用于治疗和/或预防胰岛素相关病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求1至32中任一项所述的胰岛素类似物。
36.根据权利要求33所述的方法，其中该胰岛素相关病症是高血糖症、胰岛素抵抗、1型糖尿病、妊娠糖尿病或2型糖尿病。
37.一种用于降低血糖水平的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求1至32中任一项所述的胰岛素类似物。
38.根据权利要求1至32中任一项所述的胰岛素类似物在制备用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素相关病症的药物中的用途。
39.根据权利要求1至32中任一项所述的胰岛素类似物在制备用于在受试者中降低血糖水平的药物中的用途。
40.根据权利要求1至32中任一项所述的胰岛素类似物，用于在受试者中治疗和/或预防胰岛素相关病症。
41.根据权利要求1至32中任一项所述的胰岛素类似物，用于在受试者中降低血糖水平。
42.一种重新设计或修饰已知与胰岛素受体(IR)结合的多肽的方法，该方法包括对由附录I的原子坐标或其子集定义的结构进行基于结构的评估，并且依照评估的结果，重新设计或化学修饰多肽。
43.根据权利要求40所述的方法，其中基于结构的评估包括将由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素的原子坐标或其子集定义的结构进行比较。
44.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中基于结构的评估进一步包括在由附录I的原子坐标或其子集与胰岛素受体的原子坐标或其子集定义的结构之间形成的复合物的分子建模。
45.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测试该多肽结合IR的能力。
46.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测定经重新设计或化学修饰的多肽调节IR激活的能力。
47.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，该方法进一步包括合成或获得该经重新设计或化学修饰的多肽并且测定该经重新设计或化学修饰的多肽降低血糖水平的能力。
48.根据权利要求40至45中任一项所述的方法，其中已知与IR结合的该多肽是胰岛素。
49.根据权利要求46所述的方法，其中该胰岛素是人胰岛素。
50.一种多肽，该多肽已经通过根据权利要求40至47中任一项所述的方法被重新设计或修饰。
51.根据权利要求48所述的多肽，该多肽是单体的。
52.一种作为IR激动剂的分离的分子，其中该分子基于由附录I的原子坐标或其子集定义的Con-Ins G1的3D结构被鉴定和/或设计。
53.根据权利要求50所述的分子，其中该分子是肽、多肽或肽模拟物。
54.根据权利要求50或权利要求51所述的分子，该分子是单体的。
55.根据权利要求50至52中任一项所述的分子，该分子具有针对人IR-B受体的小于10- 6M的IC50。
56.一种鉴定结合IR的化合物的方法，该方法包括：
i)产生多肽的三维结构模型，该多肽具有：
a)由附录I的原子坐标或其子集定义的结构、或
b)当叠加在相应的a)中的主链原子上时具有小于约的均方根偏差的结构，和
ii)设计或筛选潜在结合该IR的化合物。
57.根据权利要求54所述的方法，其中产生三维结构模型包括产生与IR或其区域结合的多肽的模型。
58.根据权利要求54或权利要求55所述的方法，该方法进一步包括合成潜在结合该IR的化合物。
59.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中该化合物调节IR的至少一种生物活性。
60.根据权利要求54至57中任一项所述的方法，其中该化合物是单体的。
61.根据权利要求54至58中任一项所述的方法，该方法进一步包括测试在ii)中设计或筛选的化合物其调节血糖水平的能力。
62.根据权利要求54至59中任一项所述的方法，其中i)和ii)是计算机模拟进行的。
63.一种鉴定模拟胰岛素活性的化合物的基于计算机的方法，该方法包括：
i)产生多肽的三维结构模型，该多肽具有：
a)由附录I的原子坐标或其子集定义的结构、或
b)当叠加在相应的a)中的主链原子上时具有小于约的均方根偏差的结构，和
ii)设计或筛选模拟胰岛素活性的化合物。
64.根据权利要求61所述的方法，其中产生三维结构模型包括产生与IR或其区域结合的多肽的模型。
65.根据权利要求61或权利要求62所述的方法，该方法进一步包括合成潜在结合该IR的化合物。
66.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中该化合物调节IR的至少一种生物活性。
67.根据权利要求61至64中任一项所述的方法，其中该化合物是单体的。
68.根据权利要求61至65中任一项所述的方法，该方法进一步包括测试在ii)中设计或筛选的化合物其调节血糖水平的能力。
69.根据权利要求61至66中任一项所述的方法，其中i)和ii)是计算机模拟进行的。
70.一种使用根据权利要求54至67中任一项所述的方法所鉴定的化合物。
71.一种具有空间群P432的Con-Ins G1多肽的晶体，其中晶胞大小为 其中任何晶胞大小中存在高达约2％变异。
72.如由附录I的原子坐标定义的Con-Ins G1多肽的结构。
73.根据权利要求70所述的结构作为结构模型的用途。
74.根据权利要求71所述的结构模型用于鉴定胰岛素类似物的用途。
75.一种胰岛素类似物，该胰岛素类似物由根据权利要求72所述的用途鉴定。
76.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求48或权利要求49所述的多肽、根据权利要求50至53中任一项所述的分子、根据权利要求68所述的化合物或根据权利要求72所述的胰岛素类似物。
77.一种包含胰岛素A链肽和胰岛素B链肽的肽，其中该B链肽包含在氨基酸10和氨基酸20处的取代。
78.根据权利要求75所述的肽，其中在氨基酸20处的该取代是G20Y、G20F或G20P。
79.根据权利要求76所述的肽，其中在氨基酸20处的该取代是G20P，并且该肽进一步包含在氨基酸21处的取代，其中在氨基酸21处的该取代是G21H。
80.根据权利要求75至77中任一项所述的肽，其中在氨基酸10处的该取代是H10E、H10D或H10Q。
81.根据权利要求75至78中任一项所述的肽，该肽进一步包含该A链肽中的至少一个取代。
82.根据权利要求79所述的肽，其中该A链肽中的该至少一个取代是T8H、T8Y、T8K或S9R。
83.根据权利要求80所述的肽，该肽进一步包含该A链肽中的至少两个取代。
84.根据权利要求79所述的肽，其中该A链肽中的该至少两个取代是选自T8H、T8Y、T8K和S9R的取代中的两个。
85.根据权利要求75至82中任一项所述的肽，其中该肽是去八肽胰岛素。
86.根据权利要求75至83中任一项所述的肽，其中该B链肽包含FVNQHLCGSELVEALYLVCYER的序列(SEQ ID NO：30)。
87.根据权利要求75至84中任一项所述的肽，其中该A链包含GIVEQCCHRICSLYQLENYCN的序列(SEQ ID NO：39)。
88.根据权利要求75至85中任一项所述的肽，其中该A链肽和B链肽经至少一个二硫键结合。
89.根据权利要求75至86中任一项所述的肽，其中该肽是单体。
90.根据权利要求75至87中任一项所述的肽，其中该胰岛素A链肽与野生型人胰岛素A链肽具有至少70％同一性。
91.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求75至88中任一项所述的肽，以及药学上可接受的载体。
92.一种在受试者中增加胰岛素受体激活的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求75至88中任一项所述的肽的任一者。
93.一种在受试者中降低血糖的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求75至88中任一项所述的肽的任一者。
94.一种在受试者中治疗1型糖尿病的方法，该方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的根据权利要求75至88中任一项所述的肽的任一者。
95.根据权利要求92所述的方法，其中在给予该肽之前，该受试者已经被诊断为患有1型糖尿病。
96.一种具有经至少一个二硫键与B链肽结合的A链肽的治疗性蛋白质，其中该A链包含GIVEQCCHRICSLYQLENYCN的序列(SEQ ID NO：39)，并且其中该B链肽包含FVNQHLCGSELVEALYLVCYER的序列(SEQ ID NO：30)。
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