ES2899227T3 - Anticuerpos anti sortilina y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti sortilina aislado que se une a sortilina humana, en donde el anticuerpo anti sortilina aumenta los niveles extracelulares de progranulina y disminuye los niveles de sortilina en la superficie celular, en donde el anticuerpo anti sortilina comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, y en donde: a) el dominio variable de cadena ligera comprende: una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 508, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y el dominio variable de cadena pesada comprende: una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 509, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 510, y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 511; o b) el dominio variable de cadena ligera comprende: una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 580, una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 581 y una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 100, y el dominio variable de cadena pesada comprende: una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 582, una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 583 y una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 233.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti sortilina y métodos de uso de los mismos
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a anticuerpos anti sortilina y a los usos terapéuticos de dichos anticuerpos.
Antecedentes de la invención
La sortilina es una proteína transmembrana de tipo I que actúa tanto como un receptor de varios ligandos como en la clasificación de cargas selectas desde la red del trans Golgi (TGN, del inglés trans-Golgi network) hasta lisosomas y endosomas tardíos para su degradación. La sortilina tiene un gran dominio extracelular que forma parte de la familia VPS10, homóloga a la VPS10P de levadura, y contiene una estructura de hélice beta de 10 hojas y un módulo 10CC rico en cisteína (Nykjaer, A et al., (2012) Trends Neurosci 35: 261-270 y Zheng, Y et al., (2011) PLoS One 6: e21023). La actividad de ADAM10 o gamma secretasa puede hacer que se desprenda una pequeña fracción de sortilina (<5 %) (Nykjaer, A et al., (2012) Trends Neurosci 35: 261-270 y Willnow, TE et al., (2011) Curr Opin Lipidol 22: 79-85).
La sortilina se une a la proteína progranulina (PGRN) secretada y la selecciona como diana para la degradación lisosomal, regulando así negativamente los niveles extracelulares de PGRN (Hu, F et al. (2010) Neuron 68, 654-667). De acuerdo con esto, la deficiencia de sortilina aumenta de forma significativa los niveles de PGRN en plasma tanto en modelos de ratón in vivo como en células humanas in vitro (Carrasquillo, M.M et al., (2010) Am J Hum Genet 87, 890-897; Lee, W.C et al., (2014) 23, 1467-1478). Además, se demostró que un polimorfismo en la sortilina está estrechamente relacionado con niveles de PGRN en suero en seres humanos (Carrasquillo MM et al., 2010), Am J Hum Genet. 10;87(6):890-7).
La progranulina (PGRN) es una proteína secretada, de tipo factor de crecimiento, trófica y antiinflamatoria, que también cumple una función como adipocina implicada en la obesidad inducida por la dieta y en la resistencia a la insulina (Nguyen DA et al., (2013). Trends in Endocrinology and Metabolism, 24, 597- 606). La deficiencia de progranulina representa aproximadamente el 25 % de todas las formas hereditarias de demencia frontotemporal (FTD, frontotemporal dementia), una enfermedad neurodegenerativa de inicio temprano. Los pacientes con mutaciones de pérdida de función heterocigotos en PGRN tienen niveles extracelulares de la proteína reducidos en ~50 % y desarrollarán invariablemente FTD, lo que convierte a la PGRN un gen causal de la enfermedad (Baker, M et al., (2006) Nature 442, 916-919; Carecchio M et al., (2011) J Alzheimers Dis 27, 781-790; Cruts, M et al., (2008) Trends Genet 24, 186-194; Galimberti, D et al., (2010) J Alzheimers Dis 19, 171-177). Además, se han identificado alelos con mutación de PGRN en pacientes con enfermedad de Alzheimer (Seelaar, H et al., (2011). Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry 82, 476-486). Cabe destacar, que la PGRN actúa de forma protectora en varios modelos de enfermedad ya que el aumento de los niveles de PGRN acelera la recuperación del comportamiento tras la isquemia (Tao, J et al., (2012) Brain Res 1436, 130-136; Egashira, Y. et al., (2013). J Neuroinflammation 10, 105), suprime los déficits locomotores en un modelo de enfermedad de Parkinson (Van Kampen, J.M et al. (2014). PLoS One 9, e97032), atenúa la patología en un modelo de esclerosis lateral amiotrófica (Laird, A.S et al., (2010). PLoS One 5, e13368.) y artritis (Tang, Wet al., (2011). Science 332, 478-484) y previene los déficits de memoria en un modelo de enfermedad de Alzheimer (Minami, S.S et al., 2014). Nat Med 20, 1157-1164).
La sortilina también se une directamente a proneurotrofinas, tales como el pro factor de crecimiento nervioso (pro-NGF), el pro-BDNF, la proneurotrofina 3, etc., que tienen un pro-dominio y normalmente son proapoptóticas. Tales precursores de proneurotrofinas se liberan durante el estrés, y la sortilina está involucrada en la regulación de su liberación, así como también en la unión en la célula receptora y la estimulación de la apoptosis junto con p75NTR (Willnow, TE et al., (2008) Nat Rev Neurosci 9: 899-909; Nykjaer, A et al., Trends Neurosci 35: 261-270 y Nykjaer, A et al., (2004) Nature 427: 843-848; Hiroko Yano et al., (2009) J Neurosci.; 29: 14790-14802. Teng H.K., et al., J. Neurosci. 25:5455-5463(2005)). La sortilina también se une directamente a p75NTR (Skeldal S et al., (2012) J Biol Chem.; 287:43798). La sortilina también se une a la neurotensina en una región que se superpone parcialmente a la unión de progranulina (Quistgaard, EM et al., (2009) Nat Struct Mol Biol 16: 96-98 y Zheng, Y et al., PLoS One 6: e21023). La sortilina también interactúa con los receptores de Trk, NTRK1, NTRK2 y NTRK3, y se puede regular su transporte y señalización axonal anterógrada (Vaegter, CB et al., (2011) Nat. Neurosci. 14:54-61). La sortilina también interactúa con la proteína precursora de amiloide y regula el procesamiento y el desplazamiento de esta y la producción resultante de péptidos beta amiloides patológicos (Gustafsen C et al., (2013). J Neurosci. 2;33(1):64-71.
También se ha demostrado que la sortilina se une a apolipoproteínas y a la lipoproteína lipasa y, por tanto, la deficiencia conduce a la reducción de la liberación de VLDl del hígado y a la reducción de colesterol (Willnow, TE et al., (2011) Curr Opin Lipidol 22: 79-85; Kjolby, M et al., (2010) Cell Metab 12: 213-223; Nilsson, SK et al., (2007) B/ochemistry 46: 3896-3904.; Nilsson, SK et al., (2008) J Biol Chem 283: 25920-25927 y Klinger, SC et al., (2011) J Cell Sci 124: 1095-1105). Recientemente, la sortilina también se ha implicado en la unión a APP de forma directa (Gustafsen, C et al., (2013) J.Neurosc. 33:64-71) y también a la enzima de procesamiento de APP, BACE1 (Gustafsen, C et al., (2013) J. Neurosc. 33:64-71 y Finan, g M et al., J Biol Chem 286: 12602-12616). La sortilina también se une a la apolipoproteína E (APOE), al péptido beta A (Cario, AS et al., (2013) J. Neurosc, 33: 358-370) y a PCSK9 (Gustafsen et al, (2014) Cell Metab, 19: 310-318). También se ha demostrado que la sortilina se une a PCSK9 y regula sus niveles extracelulares, lo que conduce al receptor de lipoproteína de baja densidad a la degradación en lisosomas, produciendo un aumento de los niveles de colesterol LDL (Gustafsen C et al., (2014). Cell Metab. 4 de febrero de 2014;19(2):310-8).
Cuando se encuentra en las vesículas intracelulares, tales como endosomas, el dominio extracelular del extremo amino de la sortilina se dirige hacia el interior, en donde se encuentra la carga de la vesícula. Sin embargo, el dominio intracelular o citoplasmático del extremo carboxilo de la sortilina se une a una serie de proteínas adaptadoras, que regulan su desplazamiento desde la superficie y en el interior de los compartimientos intracelulares. Entre estas se incluyen AP2 (un adaptador de clatrina que modula la endocitosis desde la superficie celular) y el complejo retrómero y AP1, que modula el movimiento desde endosomas tempranos al Golgi para su reciclaje, y la interacción con las proteínas de la familia GGA (siglas del inglés Golgi-localizing, gamma-ear containing, ADP-ribosylation factor binding, unión al factor de ADP ribosilación que contienen gamma-ear y se localizan en el Golgi) para el movimiento desde el Golgi directamente a los endosomas tempranos, normalmente para su degradación posterior a través de los lisosomas. Por lo tanto, la sortilina se puede unir a ligandos en su dominio interior, al tiempo que conecta los adaptadores citoplasmáticos que determinan su destino para determinar los destinos intracelulares, tal como la degradación para la progranulina y otros factores.
A través de sus diversas interacciones con proteínas, tales como progranulina, se ha demostrado que la sortilina y sus múltiples ligandos se encuentran implicados en varias enfermedades, trastornos y afecciones, tales como demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, fenotipos de demencia frontotemporal y esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, depresión, trastornos neuropsiquiátricos, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, lesión cerebral por traumatismo, envejecimiento, convulsiones, cicatrización, accidente cerebrovascular, artritis y enfermedades vasculares ateroscleróticas.
Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos que se unan específicamente a las proteínas sortilina y bloqueen la unión de la sortilina a sus ligandos, tal como progranulina, o que modulen de otro modo la concentración eficaz de los ligandos, para tratar una o más enfermedades, trastornos y afecciones asociados a la actividad de la sortilina.
Compendio de la invención
La presente divulgación se refiere, en líneas generales, a anticuerpos anti sortilina y a los usos terapéuticos de dichos anticuerpos.
Determinados aspectos de la presente divulgación se basan, al menos en parte, en la identificación de anticuerpos anti sortilina que son capaces de bloquear la interacción entre sortilina y progranulina (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4), los anticuerpos anti sortilina que son capaces de aumentar los niveles extracelulares de progranulina secretada por células en cultivo y de células en los cerebros de modelos de ratón de la enfermedad de Alzheimer (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5), anticuerpos anti sortilina que son capaces de reducir los niveles celulares de sortilina en monocitos primarios humanos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 25) y anticuerpos anti sortilina que son capaces de aumentar los niveles celulares de progranulina in vivo (véase, por ejemplo, el Ejemplo 26). De manera sorprendente, se demostró que una clase de anticuerpos es capaz de aumentar los niveles extracelulares de progranulina sin ser capaz de bloquear la interacción entre sortilina y progranulina (por ejemplo, anticuerpos S-2, S-15 y S-22) mientras que se demostró que una segunda clase de anticuerpos es capaz de bloquear tanto la interacción entre la sortilina y la progranulina como de aumentar los niveles extracelulares de progranulina (por ejemplo, anticuerpos S-8, S-49 y S-60). Además, se demostró que, sorpresivamente, los anticuerpos anti sortilina capaces de aumentar los niveles extracelulares de progranulina (por ejemplo, anticuerpos S-2, S-8, S-15, S-22, S-49 y S-60) también reducen los niveles celulares de sortilina, tal como niveles de superficie celular de sortilina (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5). Además, se demostró que los niveles celulares de sortilina se correlacionan estrecha e inversamente con aumentos en los niveles celulares de progranulina (véanse, por ejemplo, las Figuras 10B-10E y 23B y 23C). Los anticuerpos anti sortilina capaces de aumentar los niveles extracelulares de progranulina también son capaces de bloquear la unión pro-NGF a sortilina (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6). Otros aspectos de la presente divulgación se basan, al menos en parte, en la identificación de anticuerpos anti sortilina que bloquean la interacción entre sortilina y progranulina, y son capaces de aumentar los niveles extracelulares de progranulina sin reducir los niveles celulares de sortilina (por ejemplo, anticuerpo S-30 y Ejemplo 30). Otros aspectos de la presente divulgación se basan, al menos en parte, en la identificación de anticuerpos anti sortilina que bloquean la interacción entre sortilina y progranulina sin aumentar los niveles extracelulares de progranulina ni reducir los niveles celulares de sortilina (por ejemplo, anticuerpos S-5 y S-64 y Ejemplo 5). Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo anti sortilina aislado (por ejemplo, monoclonal) que se une a la sortilina humana, en el que el anticuerpo anti sortilina aumenta los niveles extracelulares de Progranulina y disminuye los niveles de Sortilina en la superficie celular, en donde el anticuerpo anti sortilina comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el anticuerpo anti sortilina comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende: (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RASQSX1X2SNLA (SEQ ID NO: 508), en donde X1 es V o I y X2 es S o G; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de GASTRAT (SEQ ID NO: 29) y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de QQARLGPWT (SEQ ID NO:55) y en donde el dominio variable de cadena pesada comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de YTX1X2X3X4X5X6S (SEQ ID NO:509), en donde X1 es F o L, X2 es T o A, X3 es S o K, X4 es Y, T, R, L, T, G, Q o H, X5 es Y, T o L, y X6 es M o I; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1INPx2GGX3X4SYAX5X6FX7G (SEQ ID NO:510), en donde X1 es I o V, X2 es S, W, Y, V, F, L o I, X3 es S o T, X4 es T o A, X5 es Q o R, X6 es K o R, y X7 es Q o R, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1RDPX2GX3X4X5X6X7PX8X9RX10X11X12GX13DV (SEQ ID NO:511), en donde X1 es A, V o T, X2 es S, F o G, X3 es I o A, X4 es A o G, X5 es A, Lo V, X6 es A, Lo P, X7 es G, F o Y, X8 es A, G o F, X9 es S, G o A, X10 es Y, G, P, H o S, X11 es Y o N, X12 es Y, L, Q o R, y X13 es M o L. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L1 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, 5 - 15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15yS-15-16; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L2 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6- 13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16; (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H1 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16; (v) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H2 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16, y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina comprende una región variable de cadena ligera de una cualquiera de las secuencias de anticuerpos de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16, y/o una región variable de cadena pesada de una cualquiera de las secuencias de anticuerpo de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15 y S-15-16. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo anti sortilina (por ejemplo, monoclonal) aislado que se une a la sortilina humana, en donde el anticuerpo anti sortilina aumenta los niveles extracelulares de Progranulina y disminuye los niveles de Sortilina en la superficie celular, en donde el anticuerpo anti sortilina comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende: (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de RSSQX1LLX2SNGYNYLD (SEQ ID NO: 580), en donde X1 es S o G y X2 es H o R; (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de LGSNRXS (SEQ ID NO: 581), en donde X es A o V y (c) una HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de MQQQETPLT (SEQ ID NO: 100) y en donde el dominio variable de cadena pesada comprende: (a) una HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de YSISSX1X2YWG (SEQ ID NO: 582), en donde X1 es G o V y X2 es Y o R; (b) una HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de X1 IYX2SGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO: 583), en donde X1 es T, S o A y X2 es H o P, y (c) una HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de ARQg S iKQGYYGMDV (SEQ ID NO: 233). En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina tiene al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L1 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L2 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H1 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (v) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H2 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9, y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina comprende una región variable de cadena ligera de una cualquiera de las secuencias de anticuerpo de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9, y/o una región variable de cadena pesada de una cualquiera de las secuencias de anticuerpo de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9.
En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, (a) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG1 humano o de ratón y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc en una posición de residuo seleccionado del grupo que consiste en: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, y cualquier combinación de estos, en donde la numeración de los residuos es conforme a la numeración de EU o Kabat; (b) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG2 y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc en una posición de residuo seleccionado del grupo que consiste en : P238S , V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E y cualquier combinación de estos, en donde la numeración de los residuos es conforme a la numeración de EU o Kabat, o (c) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG4 y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc en una posición de residuo seleccionado del grupo que consiste en : E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, y cualquier combinación de estos, en donde la numeración de los residuos es conforme a la numeración de EU o Kabat. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, (a) la región Fc comprende además una o más sustituciones de aminoácidos adicionales en una posición seleccionada del grupo que consiste en A330L, L234F; L235E, P331S, y cualquier combinación de estos, en donde la numeración de los residuos es conforme a la numeración de EU o Kabat; (b) la región Fc comprende además una o más sustituciones de aminoácidos adicionales en una posición seleccionada del grupo que consiste en M252Y, S254T, T256E, y cualquier combinación de estos, en donde la numeración de los residuos es conforme a la numeración de EU o Kabat o (c) la región Fc comprende además una sustitución del aminoácido S228P conforme a la numeración de EU o Kabat. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina reduce la expresión de uno o más mediadores proinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1p, TNF-a, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina tiene una constante de disociación (Kd) para la sortilina humana, la sortilina de ratón, o ambas, que varía de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,005 nM, o es menor de 0,005 nM. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina tiene una constante de disociación (Kd) para la sortilina humana que varía de aproximadamente 70,4 nM a aproximadamente 0,005 nM, o es menor de 0,005 nM. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina tiene una constante de disociación (Kd) para la sortilina de ratón que varía de aproximadamente 40,3 nM a aproximadamente 0,07 nM, o es menor de 0,07 nM.
Otros aspectos de la presente divulgación hacen referencia a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti sortilina de cualquiera de las realizaciones anteriores. Otros aspectos de la presente divulgación hacen referencia a un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las realizaciones anteriores. Otros aspectos de la presente divulgación hacen referencia a una célula hospedadora aislada que comprende el vector de cualquiera de las realizaciones anteriores. Otros aspectos de la presente divulgación hacen referencia a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti sortilina de una cualquiera de las realizaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otros aspectos de la presente divulgación hacen referencia a un método in vitro para aumentar los niveles extracelulares de progranulina, disminuir los niveles de sortilina en la superficie celular en una o más células y/o disminuir la expresión de uno o más mediadores proinflamatorios, que comprende poner una o más células en contacto con un anticuerpo anti sortilina de la invención.
En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, (a) el anticuerpo anti sortilina se une específicamente a la sortilina tanto humana como de ratón, (b) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo humano, (c) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo humanizado, (d) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo biespecífico, (e) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo biespecífico que reconoce un primer antígeno y un segundo antígeno, (f) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo biespecífico que reconoce un primer antígeno y un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es una proteína sortilina y el segundo antígeno es un antígeno que facilita el transporte a través de la barrera hematoencefálica y, opcionalmente, en donde el segundo antígeno se selecciona del grupo que consiste en sortilina, receptor de transferrina (TR), receptor de insulina (HIR), receptor de factor de crecimiento tipo insulina (IGFR), proteínas relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 1 y 2 (LPR-1 y 2), receptor de la toxina diftérica, CRM197, un anticuerpo de dominio simple de llama, TMEM 30(A), un domino de transducción de proteína, TAT, Syn-B, penetratina, un péptido poliarginina, un péptido angiopep, basigina, Glut1 y CD98hc, y ANG1005. (g) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo multivalente, (h) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo conjugado, (i) el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo quimérico; o (j) el anticuerpo anti sortilina es un fragmento de anticuerpo que se une a un epítopo que comprende residuos de aminoácidos en una sortilina humana y, opcionalmente, en donde el fragmento es un fragmento Fab, Fab’ , Fab’-SH, F(ab’ )2, Fv o scFv.
En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina se une a un epítopo conformacional de sortilina. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina se une a uno o más aminoácidos en los residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: i. los residuos de aminoácidos 314-338 de SEQ ID NO: 1, o los residuos de aminoácidos en una proteína sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 314-338 de SEQ ID NO: 1; ii. los residuos de aminoácidos 237-247 de SEQ ID NO: 1, o los residuos de aminoácidos en una proteína sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 237-247 de SEQ ID NO: 1; iii. los residuos de aminoácidos 237-247 y 314-338 de SEQ ID NO: 1, o los residuos de aminoácidos en una proteína sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 237-247 y 314-338 de SEQ ID NO: 1; y iv. los residuos de aminoácidos 207-231 de SEQ ID NO: 1, o los residuos de aminoácidos en una proteína sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 207-231 de SEQ ID NO: 1; En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina se une a uno o más residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en T218, Y222, S223, S227, S242, K243, S316, R325 y S595 de SEQ ID NO: 1, o uno o más restos de aminoácido en una proteína sortilina de mamífero correspondientes a los restos de aminoácido T218, Y222, S223, S227, S242, K243, S316, R325 y S595 de SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores el anticuerpo anti sortilina comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: S-15 y S-60. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina comprende: (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 o 10; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29 o 30; (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 o 100; (d) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129 o 142; (e) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 155 o 170; o (f) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 190 y 233. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende: (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 o 10, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9 o 10; (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29 o 30, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 29 o 30; y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 55 o 100, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 55 o 100; y en donde el dominio variable de cadena pesada comprende: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129 o 142, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129 o 142; (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 155 o 170, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 155 o 170; y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 190 y 233 o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 190 y 233.En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, (a) el anticuerpo anti sortilina compite con S-60 para unirse a la sortilina; o (b) el anticuerpo anti sortilina compite con S-15 para unirse a la sortilina o al anticuerpo anti sortilina que se une esencialmente al mismo epítopo de la sortilina como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: S-15 y S-60. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina comprende un dominio variable de cadena ligera y/o un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 342, 343, 430 y 431. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, (a) el anticuerpo anti sortilina es de la clase IgG de la clase IgM o de la clase IgA; o (b) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4; (c) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo de IgG1 de ser humano o ratón y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc en una posición de residuo seleccionada del grupo que consiste en: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, y cualquiera de sus combinaciones, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la numeración de EU o Kabat; (d) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo de IgG2 y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc en una posición de residuo seleccionada del grupo que consiste en: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E y cualquiera de sus combinaciones, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la numeración de Eu o Kabat; o (e) el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo de IgG4 y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en la región Fc en una posición de residuo seleccionada del grupo que consiste en: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, y cualquiera de sus combinaciones, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la numeración de EU o Kabat. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, la región Fc de uno o más de (c), (d) y (e) comprenden adicionalmente: (a) una o más sustituciones de aminoácidos adicionales en una posición seleccionada del grupo que consiste en A330L, L234F; L235E, P331S, y cualquiera de sus combinaciones, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la numeración de EU o Kabat; (b) una o más sustituciones de aminoácidos adicionales en una posición seleccionada del grupo que consiste en M252Y, S254T, T256E y cualquiera de sus combinaciones, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con la numeración de EU o Kabat; o (c) una sustitución de aminoácidos S228P de acuerdo con la numeración de EU o Kabat. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, (a) el anticuerpo anti sortilina tiene una constante de disociación (Kd) para la sortilina humana, sortilina de ratón o ambas, que varía de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,005 nM, o es menor de 0,005 nM; (b) el anticuerpo anti sortilina tiene una constante de disociación (Kd) para la sortilina humana que varía de aproximadamente 70,4 nM a aproximadamente 0,005 nM, o es menor de 0,005 nM; o (c) el anticuerpo anti sortilina tiene una constante de disociación (Kd) para la sortilina de ratón que varía de aproximadamente 40,3 nM a aproximadamente 0,07 nM, o es menor de 0,07 nM. En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina es el anticuerpo anti sortilina de cualquiera de las realizaciones anteriores.
Otros aspectos de la presente invención se refieren a un anticuerpo anti sortilina de cualquiera de las realizaciones anteriores, para su uso en la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad, un trastorno o una lesión, seleccionados del grupo que consiste en demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, esclerosis lateral amiotrófica, lesión cerebral por traumatismo, una lesión de la médula espinal, demencia, accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, encefalomielitis aguda diseminada, degeneración de la retina, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, esclerosis múltiple, choque séptico, infección bacteriana, artritis y artrosis. Otros aspectos de la presente invención se refieren a un anticuerpo anti sortilina de cualquiera de las realizaciones anteriores, para su uso en un método de tratamiento que comprende inhibir uno o más de neuroinflamación, caracterizada por crecimiento axonal corto y ramificación aberrante, activación de la microglía y respuesta inflamatoria. Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un anticuerpo anti sortilina de cualquiera de las realizaciones anteriores, para su uso en la promoción de la curación de heridas Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un anticuerpo anti sortilina de cualquiera de las realizaciones anteriores, para su uso en la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de un individuo que tiene artritis.
En determinadas realizaciones que se pueden combinar con cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo anti sortilina comprende dos o más anticuerpos anti sortilina.
Breve descripción de las figuras
El archivo de la patente o la solicitud contiene al menos un dibujo a color. Si se solicitara, y después de efectuado el pago de la tasa necesaria, la oficina entregará copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con la o las figuras en color.
La Figura 1 ilustra varias vistas de la proteína sortilina humana que muestra los sitios de unión a sortilina de los anticuerpos anti sortilina S-1, S-65, S-49, S-78, S-44 y S-8. La estructura principal de la sortilina se representa en un gris transparente. En color se resaltan las regiones de unión lineales identificadas para los anticuerpos S-1 (verde), S-65 (rojo), S-49 (azul), S-78 (amarillo), S-44 (rosa) y S-8 (violeta). Los sitios de unión se encuentran en regiones de bucle flexibles de sortilina,
Las Figuras 2A-2C ilustran la caracterización de las interacciones entre la sortilina y la progranulina usando resonancia de plasmón superficial (SPR, Surface Plasmon Resonance) y ELISA. La Figura 2A muestra el análisis cinético de la unión de progranulina (PGRN) a sortilina 1 (SORT1) capturada con His usando Biacore SPR. La Figura 2B muestra la unión de PGRN humana biotinilada a SORT1 humana inmovilizada en una placa de ELISA. La Figura 2C muestra la unión de PGRN de ratón biotinilada a SORT1 de ratón inmovilizada en una placa de ELISA.
La Figura 3A muestra la unión con avidez del anticuerpo a sortilina humana (b-H Sort) en un chip sensor y la competición con anticuerpos anti sortilina (IgG). La Figura 3B muestra la caracterización de las interacciones entre sortilina (SORT) y progranulina (PGRN) usando análisis Forte Bio y la competición con anticuerpos anti sortilina (IgG). Columna izquierda: se inmoviliza el péptido de progranulina biotinilada en el chip sensor y se añade SORT en solución, seguido de IgG. Columna central: se inmoviliza SORT humana recombinante biotinilada en el chip sensor y se añade PGRN recombinante en solución seguido de la IgG. Columna derecha: se inmoviliza PGRN recombinante biotinilada en un chip sensor y se añade SORT humana en solución, seguido de IgG. (SORT= sortilina, PGRN= progranulina, b = biotinilado, H= humano, mono= monomérico).
La Figura 4A muestra ejemplos de clases diferentes de anticuerpos anti sortilina que bloquean la unión de la progranulina en diferentes orientaciones de ForteBio (descrito en la Figura 3B). La columna izquierda ilustra la unión de competición con SORT humana que se une al péptido de PGRN inmovilizado en un chip sensor. La columna del medio ilustra la unión de competición con la proteína PGRN nativa que se une a SORT humana inmovilizada en un chip sensor. La columna derecha ilustra la unión de competición con la proteína SORT nativa que se une a la proteína PGRN nativa inmovilizada en un chip sensor. La Figura 4B ilustra la unión de anticuerpos anti sortilina a sortilina capturada con His (SORT1) usando Biacore SPR a un pH de 6,4 y de 7,4.
Las Figuras 5A-5D ilustran la caracterización de las interacciones entre la sortilina y la progranulina en células. La Figura 5A ilustra gráficas de FACS que muestran los niveles de unión de PGRN-Bio humana a linfocitos T HEK293 que expresan SORT humana. La Figura 5B ilustra gráficas de FACS que muestran los niveles de unión de PGRN-Bio humana para controlar las células de control. La Figura 5C ilustra la intensidad de fluorescencia media (MFI, siglas del inglés) representada gráficamente frente a la concentración de unión de PGRN humana a linfocitos T HEK293 que expresan SORT humana (círculos) o células de control (cuadrados). La Figura 5D ilustra la MFI representada gráficamente frente a la concentración de unión de PGRN de ratón a linfocitos T HEK293 que expresan SORT de ratón (círculos) o células de control (cuadrados).
Las Figuras 6A-6E ilustran la inhibición, en función de la dosis, de la unión de progranulina biotinilada a células que expresan sortilina mediante anticuerpos anti sortilina. Las Figuras 6A y 6B ilustran la inhibición del anticuerpo de la unión de progranulina humana a sortilina humana. Las Figuras 6C y 6D ilustran la inhibición del anticuerpo de la unión de progranulina de ratón a sortilina de ratón. La Figura 6E ilustra la inhibición de la unión de progranulina humana biotinilada a células que expresan sortilina humana mediante 67 nM de anticuerpos anti sortilina.
La Figura 7 ilustra la evaluación de efectos sinérgicos de combinaciones de anticuerpo en la unión de progranulina biotinilada a sortilina expresada en linfocitos T HEK293. S-49, S-64 (grupo 4) y S-16 (grupo 1) se combinaron con un anticuerpo de control de isotipo o entre sí.
La Figura 8A ilustra los resultados de un ensayo de obtención de imágenes para la unión en función del tiempo y endocitosis de progranulina (PGRN) marcada de forma fluorescente y su bloqueo con 10 pM de propéptido de sortilina que compite con PGRN. Las células transfectadas con sortilina humana (hSort) o lacZ se incubaron con progranulina (PGRN) durante 4, 15, 30 o 60 minutos y después se obtuvieron imágenes. El ensayo se diseña para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para prevenir la unión y endocitosis de progranulina (PGRN) mediante sortilina (Sort). La Figura 8B ilustra los resultados de una gráfica de FACS que representa la unión en función del tiempo y endocitosis de PGRN-DyLight650 mediante células que expresan sortilina humana. El ensayo se diseña para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para prevenir la unión y endocitosis de progranulina marcada de forma fluorescente mediante sortilina humana. La Figura 8C ilustra los resultados de una gráfica de FACS que representa la unión en función del tiempo y endocitosis de PGRN-DyLight650 mediante células que expresan sortilina de ratón. El ensayo se diseña para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para prevenir la unión y endocitosis de progranulina marcada de forma fluorescente mediante sortilina de ratón. Se añadió PGRN-DyLight650 humana a Sort humana (Figura 8B) o Sort de ratón (Figura 8C) o linfocitos T HEK293 y la cantidad de PGRN unida y sometida a endocitosis se cuantificó mediante FACS. La Figura 8D ilustra resultados de un ensayo de FACS que demuestra la capacidad del propéptido de Sort inhibidor de PGRN humana para prevenir la unión y endocitosis de PGRN marcada de forma fluorescente mediante sortilina humana. La Figura 8E ilustra resultados de un ensayo de FACS que demuestra la capacidad del propéptido de Sort inhibidor de PGRN de ratón para prevenir la unión y endocitosis de PGRN marcada de forma fluorescente mediante sortilina de ratón.
Las Figuras 9A-9D ilustran los resultados de ensayos que demuestran la capacidad de anticuerpos anti sortilina para aumentar los niveles secretados endógenos de progranulina en los medios de la línea celular de astrocitos humanos U-251, los que expresan la sortilina humana endógena. La Figura 9A ilustra los resultados de células U-251 incubadas con 50 nM de anticuerpos anti sortilina durante 72h. La Figura 9B ilustra los resultados de células U-251 incubadas con 5 nM de anticuerpos anti sortilina durante 72h. La Figura 9C ilustra los resultados de células U-251 incubadas con 50 nM de anticuerpos anti sortilina durante 72h. La Figura 9D ilustra los resultados de células U-251 incubadas con 5 nM de anticuerpos anti sortilina durante 72h. Los niveles de progranulina en los medios se cuantificaron mediante análisis ELISA. Se muestran promedios de dos experimentos independientes. Se llevaron a cabo estadísticas con ANOVA y los asteriscos muestran los anticuerpos que elevan de forma significativa los niveles de progranulina.
Las Figuras 10A-10F ilustran el efecto de los anticuerpos anti sortilina sobre los niveles de la superficie celular de sortilina en células U-251 humanas o células N2A murinas, y la capacidad correspondiente de los anticuerpos para aumentar los niveles secretados de progranulina (PGRN) endógena de una manera dependiente de la dosis. Las células se incubaron durante 72 horas con IgG de bloqueo 50 nM, se recogieron y se tiñeron con un anticuerpo anti sortilina que se une a una región diferente en sortilina que los anticuerpos de prueba. La Figura 10A ilustra la expresión de superficie celular de sortilina en células U-251 como porcentaje (%) de niveles de control que se trataron previamente con los anticuerpos de prueba enumerados en el eje X. Las barras grises indican anticuerpos que indicaron una reducción significativa de sortilina (ANOVA, p<0,05), mientras que las barras blancas indican anticuerpos que no mostraron una reducción de sortilina. Las barras negras indican IgG de control. La Figura 10B ilustra la expresión de superficie celular de sortilina en células N2A como porcentaje (%) de niveles de control que se trataron previamente con los anticuerpos de prueba enumerados en el eje X. Las barras grises indican anticuerpos que indicaron una reducción significativa de sortilina (ANOVA, p<0.05), mientras que las barras blancas indican anticuerpos que no mostraron una reducción de sortilina. Las barras negras indican IgG de control. Las Figuras 10C y 10D ilustran los niveles de sortilina de superficie celular en células U-251 que se incubaron con concentración diferente de los anticuerpos anti sortilina durante 72h. Los anticuerpos anti sortilina inducen una reducción dependiente de la dosis en la expresión de superficie celular de sortilina. La reducción de los niveles de sortilina se ilustra mediante la reducción de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de unión del anticuerpo S-20 a sortilina. La Figura 10E ilustra la cuantificación basada en ELISA de los niveles correspondientes de PGRN en los medios de las células U-251 en la Figura 10B que se incubaron con los anticuerpos anti sortilina enumerados durante 72h. Los anticuerpos anti sortilina que reducen los niveles de superficie celular de sortilina también provocan un aumento dependiente de la dosis en los niveles extracelulares de PGRn . La Figura 10F muestra la correlación entre la reducción en los niveles de superficie celular de sortilina inducidos por los anticuerpos anti sortilina y el aumento en los niveles extracelulares de progranulina (PGRN).
Las Figuras 11A-11F ilustran resultados que demuestran que la infusión de anticuerpo anti sortilina eleva los niveles endógenos de progranulina del cerebro en varias veces en el modelo de ratón Tg2576 de la enfermedad de Alzheimer. La Figura 11A ilustra niveles de progranulina en regiones del cerebro diferentes contralaterales respecto al sitio de infusión ICV. La Figura 11B ilustra niveles de progranulina en regiones del cerebro diferentes ipsilaterales respecto al sitio de infusión ICV. Las regiones del cerebro diferentes son el hipocampo (Hip), la corteza frontal (F Ctx), y la corteza occipital (R Ctx). Los ratones Tg2576 de 14 meses se sometieron a infusión ICV con tampón, IgG de cabra o anticuerpo policlonal anti sortilina de cabra (n=3/grupo). La Figura 11C ilustra niveles de anticuerpo anti sortilina en las tres regiones diferentes del cerebro. La Figura 11D ilustra la correlación positiva fuerte entre niveles de anticuerpo anti sortilina y progranulina (PGRN) endógena (r2=0,92). Los niveles más elevados de anticuerpo anti sortilina llevan a un aumento en PGRN del cerebro en una manera dependiente de la dosis. La Figura 11F ilustra niveles de péptido Abeta42 en la fracción de proteína soluble después de la infusión ICV con anticuerpo anti sortilina.
La Figura 12A ilustra un ensayo Biacore de resonancia de plasmón superficial (SPR) para controlar la competición entre pro-NGF y anticuerpos anti sortilina para la unión a sortilina. El ensayo muestra sortilina humana capturada en un chip Biacore seguido de la unión de pro-NGF a sortilina, seguido de la unión de un anticuerpo anti sortilina a sortilina. La Figura 12B ilustra un control no bloqueante. Si pro-NGF y un anticuerpo anti sortilina dado se unen a la misma región en la sortilina, la unión de pro-NGF inhibirá la unión posterior del anticuerpo anti sortilina. Por lo tanto, si un anticuerpo dado se une a sortilina en el mismo grado en presencia (líneas discontínua) o ausencia (líneas continuas) de pro-NGF, tal como se ilustra en Figura 12B, dicho anticuerpo no bloquea la unión de pro-NGF a sortilina.
La Figura 12C ilustra la unión de anticuerpos anti sortilina a sortilina en presencia (líneas discontinuas) o ausencia (líneas continuas) de pro-NGF. Los anticuerpos ilustrados están parcialmente bloqueados por la presencia de pro-NGF unido a sortilina. Los anticuerpos S-1 y S-65 se ven muy afectados. Las líneas continuas corresponden a la unión de anticuerpos a sortilina en ausencia de pro-NGF. Las líneas discontinuas corresponden a la unión de anticuerpos a sortilina en presencia de pro-NGF. Las líneas grises corresponden a la unión de pro-NGF a sortilina en presencia de pro-NGF (competencia máxima).
Las Figuras 13A-13G ilustran niveles de expresión de superficie celular de sortilina después de 72 horas de incubación con anticuerpos anti sortilina a concentraciones de 20 nM, 5 nM o 1,25 nM. Las Figuras 13A, 13B, 13C y 13D ilustran la expresión de superficie celular de sortilina en células U-251 humanas. Las Figuras 13E, 13F y 13G ilustran la expresión de superficie celular de sortilina en células N2A de ratón. Los resultados indican que los anticuerpos madurados por afinidad inducen un aumento de reducción de los niveles de superficie celular de sortilina, en especial cuando se utilizan a la concentración más baja de 1,25 nM.
La Figura 14 ilustra la inhibición de la unión de progranulina (en porcentaje de bloqueo de PGRN) a linfocitos T HEK293 que expresan sortilina a 150 nM de anticuerpos anti sortilina madurados por afinidad derivados del anticuerpo S-15. El anticuerpo madurado por afinidad S-15-6 demostró mejora en el bloqueo de PGRN.
Las Figuras 15A y 15B ilustran los perfiles de espectroscopía de masas de la unión del anticuerpo S-2-11 a sortilina en ausencia (Figura 15A) o en presencia (Figura 15B) de péptidos derivados de la digestión de sortilina. Los péptidos no compiten con la unión del anticuerpo a sortilina. Se observó una falta similar de competición de péptidos para otros anticuerpos anti sortilina.
La Figura 16A es una representación esquemática de la cobertura de péptidos después de la proteólisis enzimática de sortilina. Se cubrió el 94,78 % del dominio extracelular (ECD, siglas del inglés) de sortilina (SEQ ID NO: 714) mediante péptidos generados por proteólisis. La Figura 16B ilustra la unión reducida del anticuerpo S-30 a mutaciones de sortilina particulares, en donde los aminoácidos humanos se intercambiaron por aminoácidos de sortilina de ratón. Los resultados indican que la unión a S-30 requiere de los aminoácidos HVPLVIMT131 o un subconjunto de estos. La Figura 16C ilustra la unión reducida del anticuerpo S-60 a mutaciones de sortilina particulares, en donde los aminoácidos humanos se intercambiaron por aminoácidos de sortilina de ratón. Los resultados indicaron que la unión a S-60 requiere el aminoácido S595.
Las Figuras 17A-17E ilustran trazas de resonancia de plasmón superficial. La Figura 17A ilustra niveles de unión de progranulina (PGRN) a sortilina en presencia o ausencia de neurotensina (NTS). La Figura 17B ilustra niveles de unión de anticuerpo anti sortilina S-15 a sortilina en presencia o ausencia de NTS. La Figura 17C ilustra niveles de unión de anticuerpo anti sortilina S-22 a sortilina en presencia o ausencia de NTS. La Figura 17D ilustra niveles de unión de anticuerpo anti sortilina S-49 a sortilina en presencia o ausencia de NTS. La Figura 17E ilustra niveles de unión de anticuerpo anti sortilina S-60 a sortilina en presencia o ausencia de NTS. NTS no afecta la unión de los anticuerpos a sortilina, lo cual indica que los anticuerpos anti sortilina no se unen al sitio de unión de NTS.
La Figura 18 A ilustra la reducción de los niveles de proteína sortilina en macrófagos primarios humanos tanto con anticuerpos de longitud completa (IgG) como con el anticuerpo Fabs de los anticuerpos anti sortilina. La Figura 18B ilustra la reducción de los niveles de proteína sortilina en células dendríticas primarias humanas mediante anticuerpos de longitud completa (IgG). Se cargaron 15 pg de proteína en los geles, se transfirieron y se tiñeron con anticuerpos contra sortilina y beta-actina.
Las Figuras 19A y 19B ilustran las medidas de las semividas de anticuerpos anti sortilina in vivo después de la inyección intraperitoneal (IP) de 40 mg/kg el día 0. La Figura 19A ilustra la inyección de anticuerpos N297A IgG1 anti sortilina humana, n= 4-5 animales/grupo. La Figura 19B ilustra las inyecciones de anticuerpos N297A IgG1 anti sortilina de ratón. Los datos se ajustaron usando una función de declive de una fase (Graph Pad Prism). Los anticuerpos anti sortilina tienen una semivida más corta que la IgG de control.
Las Figuras 20A-20D ilustran medidas de niveles de proteína progranulina (PGRN) de ratón en muestras de plasma de ratón en varios momentos después de la inyección de 40 mg/kg de anticuerpos anti sortilina. Las Figuras 20A y 20B ilustran los resultados con anticuerpos N297A IgG1 anti sortilina de ratón. Las Figuras 20C y 20D ilustran los resultados con anticuerpos N297A IgG1 anti sortilina humanos. Las Figuras 20B y 20D resumen análisis estadísticos mediante Anova unidireccional con una prueba Tukey a posteriori. Los asteriscos indican nivel de significancia en comparación con el grupo de control de isotipo de IgG1 de ms o hu: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Los anticuerpos anti sortilina inducen un aumento de los niveles de proteína PGRN en plasma, con la duración del efecto correlacionado con la semivida del anticuerpo.
Las Figuras 21A-21F ilustran medidas de niveles de la proteína sortilina mediante análisis de transferencia Western de lisados de glóbulos blancos de ratón. Se utilizó anti beta actina como control de carga y para la normalización. La Figura 21A y la Figura 21B muestran los niveles de proteína en el día 5. Las Figuras 21C y 21D muestran los niveles de proteína el día 1 2. Los anticuerpos anti sortilina S-2 0 , S-15-6, y S-2 - 11 inducen una reducción significativa en los niveles de la proteína sortilina el día 5 (Anova unidireccional con prueba de Tukey a posteriori). Los asteriscos indican el nivel de significancia: **p<0,01, ***p<0,001). El anticuerpo S-15-6 indujo la reducción de los niveles de proteína sortilina el día 12 en 2 de cada 3 ratones. Las Figuras 21E y 21F muestran niveles de proteína en glóbulos blancos después de un ciclo prolongado de seis semanas de inyecciones IP semanales en ratones con 20, 40 u 80 mg/kg de anticuerpo anti sortilina S15-6. Las tres dosis dieron como resultado una regulación por reducción fuerte y estadísticamente significativa de sortilina en glóbulos blancos (****p<0,0001 en comparación con IgG de control, ANOVA unidireccional).
Las Figuras 22A-22D ilustran una correlación positiva entre los niveles de IgG de anticuerpos anti sortilina y los niveles de proteína progranulina (PGRN) en muestras del cerebro de ratones de tipo silvestre (WT, wild-type) después de una infusión ICV de 2 semanas. No hubo correlación significativa con el anticuerpo de control de isotipo. La Figura 22A ilustra el anticuerpo S-15. La Figura 22B ilustra el anticuerpo S-20. La Figura 22C ilustra el anticuerpo S-30. La Figura 22D ilustra el anticuerpo de control de isotipo.
La Figura 23A ilustra niveles de IgG medidos después de la inyección IV de 40 mg/kg de anticuerpo anti sortilina N297A huIgG1 S-15-6. La semivida de IgG aumenta con niveles reducidos de sortilina, lo que demuestra que la semivida relativamente corta de S-15-6 en ratones de tipo silvestre (WT) se debe a la degradación después de la unión de la diana, en lugar de a la inmunogenicidad u otra degradación inespecífica. La Figura 23B ilustra la referencia elevada de los niveles de la proteína progranulina (PGRN) en ratones con el gen de la sortilina inactivado (KO, knockout), en comparación con compañeros de camada heterocigotos (Het) y de tipo silvestre (WT) con respecto al gen de sortilina. Usando un ensayo ELISA se midió la PGRN en muestras de plasma. La Figura 23C ilustra los resultados que muestran que el anticuerpo S-15-6 indujo un aumento en los niveles de proteína progranulina (PGRN) durante hasta ocho días después de la inyección en ratones de tipo silvestre (WT) y heterocigotos (Het) con respecto al gen de sortilina, pero no en ratones con el gen de la sortilina inactivado (KO). La flecha negra indica la inyección del anticuerpo S-15-6 el día 7. ****p<0,0001, n.s.-no significativo por ANOVA unidireccional, KO contra Het y contra WT.
La Figura 24 ilustra resultados de un estudio de artritis inducida por colágeno en ratones. La inyección dos veces por semana de 40 mg/kg de anticuerpo anti sortilina S-15-6 redujo significativamente la puntuación de artritis clínica en comparación con la de los grupos de control (PBS y MOPC-21/msIgG1).
La Figura 25A ilustra los niveles en suero de progranulina después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 25B ilustra una cantidad de neutrófilos después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 25C ilustra una cantidad de macrófagos peritoneales grandes después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 25D ilustra una cantidad de macrófagos peritoneales grandes después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). Los resultados ilustran niveles elevados de progranulina. Sin embargo, la cantidad de neutrófilos peritoneales, macrófagos peritoneales grandes y macrófagos peritoneales pequeños no fueron significativamente diferentes. Los círculos blancos representan ratones de tipo silvestre y los cuadrados blancos representan ratones con el gen de la sortilina inactivado. n=8-10 ratones/grupo. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 y ****p<0,0001 mediante ANOVA unidireccional con prueba de múltiples comparaciones de Tukey.
La Figura 26A ilustra los niveles en suero de IL- 6 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 26B ilustra los niveles en suero de TNF-alfa después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 26C ilustra los niveles en suero de IFN-gamma después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) La Figura 26D ilustra los niveles en suero de IL-10 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) La Figura 26E ilustra los niveles en suero de IL-12p70 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 26F ilustra los niveles en suero de IL-12/IL-23p40 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 26G ilustra los niveles en suero de IL-1 alfa después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) La Figura 26H ilustra los niveles en suero de IL-1 beta después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). Los círculos blancos representan ratones de tipo silvestre y los cuadrados blancos representan ratones con el gen de la sortilina inactivado. n=8 - 1 0 ratones/grupo. *p<0 ,0 1 , **p<0 ,0 0 1 , ***p<0 , 001 y ****p<0,0001 mediante ANOVA unidireccional con prueba de múltiples comparaciones de Tukey.
La Figura 27A ilustra los niveles en suero de CXCL1 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) La Figura 27B ilustra los niveles en suero de CCL2 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre yde ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) La Figura 27C ilustra los niveles en suero de CCL3 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) La Figura 27D ilustra los niveles en suero de CCL4 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 27E ilustra los niveles en suero de CCL5 después de 1,5 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-) Los círculos blancos representan ratones de tipo silvestre y los cuadrados blancos representan ratones con el gen de la sortilina inactivado. n=8-10 ratones/grupo. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 y ****p<0,0001 mediante ANOVA unidireccional con prueba de múltiples comparaciones de Tukey.
La Figura 28A ilustra los niveles en suero de IL- 6 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado(sortilina -/-). La Figura 28B ilustra los niveles en suero de TNF-alfa después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 28C ilustra los niveles en suero de IFN-gamma después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 28D ilustra los niveles en suero de IL-10 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 28E ilustra los niveles en suero de IL-12p70 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 28F ilustra los niveles en suero de IL-12/IL-23p40 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 28G ilustra los niveles en suero de IL-1 alfa después de 6 horas de tratamiento con LPS en ratones de tipo silvestre y ratones con el gen de la sortilina inactivado(sortilina -/-). La Figura 28H ilustra los niveles en suero de IL-1 beta después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). Los círculos blancos representan ratones de tipo silvestre y los cuadrados blancos representan ratones con el gen de la sortilina inactivado. n=8-10 ratones/grupo. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 y ****p<0,0001 mediante ANOVA unidireccional con prueba de múltiples comparaciones de Tukey.
La Figura 29A ilustra los niveles en suero de CXCL1 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 29B ilustra los niveles en suero de CCL2 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 29C ilustra los niveles en suero de CCL3 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 29D ilustra los niveles en suero de CCL4 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). La Figura 29E ilustra los niveles en suero de CCL5 después de 6 horas de tratamiento con LPS de ratones de tipo silvestre y de ratones con el gen de la sortilina inactivado (sortilina -/-). Los círculos blancos representan ratones de tipo silvestre y los cuadrados blancos representan ratones con el gen de la sortilina inactivado. n=8-10 ratones/grupo. *p<0,01, **p<0,001, ***p<0,001 y ****p<0,0001 mediante ANOVA unidireccional con prueba de múltiples comparaciones de Tukey.
Descripción detallada de la invención
Técnicas generales
Las técnicas y los procedimientos descritos o indicados en el presente documento son entendidos y utilizados comúnmente en general por parte de los expertos en la técnica mediante el uso de metodología convencional, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente usadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3.a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual y Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (m .J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PcR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti yJ. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice ofOncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “que previene" incluye proveer profilaxis con respecto a la aparición o reaparición de una enfermedad, un trastorno o una afección particular en un individuo. Un individuo puede estar predispuesto, o ser susceptible, a padecer una enfermedad, un trastorno o una afección particular o puede estar en riesgo de desarrollar tal enfermedad, trastorno o afección, pero su enfermedad, trastorno o afección aún no se haya diagnosticado.
Tal como se utiliza en el presente documento, un individuo “en riesgo" de desarrollar una enfermedad, un trastorno o una afección particular puede tener una enfermedad o síntomas de la enfermedad detectables o no, y puede manifestar la enfermedad o síntomas de la enfermedad detectables o no previo a los métodos de tratamiento descritos en el presente documento. “En riesgo” indica que un individuo presenta uno o más factores de riesgo, los cuales son parámetros que se pueden medir y se correlacionan con el desarrollo de una enfermedad, un trastorno o una afección particular, tal como se conoce en la técnica. Un individuo con uno o más de estos factores de riesgo tiene una probabilidad más elevada de desarrollar una enfermedad, un trastorno o una afección particular que un individuo sin uno o más de estos factores de riesgo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “tratamiento” se refiere a la intervención clínica diseñada para alterar la evolución natural del individuo que se trata durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la reducción de la tasa de evolución, la mejora o mitigación de la patología y la remisión o el pronóstico mejorado de una enfermedad, un trastorno o una afección particular. Un individuo “se trata” de manera satisfactoria, por ejemplo, si se mitigan o eliminan uno o más síntomas asociados a una enfermedad, un trastorno o una afección particular.
Una “cantidad eficaz” se refiere a al menos una cantidad eficaz a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios para alcanzar los resultados profilácticos o terapéuticos deseados. Una cantidad eficaz se puede proporcionar en una o más administraciones.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es al menos la concentración mínima necesaria para producir una mejora de una enfermedad, un trastorno o una afección particular que se puede medir. En el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar en función de factores como la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del paciente, así como de la capacidad del antagonista de la proteína sortilina de producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del antagonista de la proteína sortilina se ve superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Tal como se utiliza en el presente documento, la administración “en combinación” con otro compuesto o composición incluye la administración simultánea y/o la administración en momentos diferentes. La administración en combinación también comprende la administración como una formulación conjunta o la administración como composiciones independientes, lo que incluye frecuencias o intervalos de dosificación diferentes, y el uso de la misma o diferente vía de administración.
Un “individuo”, a los efectos del tratamiento, prevención o reducción del riesgo, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, inclusive seres humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, utilizados en deportes o mascotas, tales como perros, caballos, conejos, ganado, cerdos, hámsteres, jerbos, ratones, hurones, ratas, gatos y similares. Preferentemente, el individuo es un ser humano.
En el presente documento, el término “inmunoglobulina” (Ig) se utiliza indistintamente con “anticuerpo”. El término “anticuerpo” se usa en el presente documento en el sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos y los fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.
La unidad básica de anticuerpos de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas ligeras (L, light) idénticas y dos cadenas pesadas (H, heavy) idénticas. El emparejamiento de una Vh con una Vl forma un sitio de unión al antígeno simple. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8.a edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.
La cadena L de cualquier especie de vertebrados puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (A), según las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Es posible asignar las inmunoglobulinas a clases o isotipos diferentes en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH, heavy chains). Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, con cadenas pesadas denominadas alfa (a), delta (8 ), épsilon (£), gamma (y) y mu (|j), respectivamente. Las clases y y a se dividen adicionalmente en subclases (isotipos) basándose en diferencias relativamente minoritarias en la función y secuencia de las CH, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 y IgA2. Las estructuras de subunidades y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son conocidas y se describen de forma general, por ejemplo, en Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4.a ed. (W.B. Saunders Co., 2 0 0 0 ).
Los “anticuerpos naturales” son generalmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente de 150 000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que la cantidad de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados en intervalos regulares. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo, el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
Un anticuerpo “aislado”, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, es uno que se ha identificado, separado y/o recuperado de un componente de su entorno de producción (por ejemplo, de forma natural o recombinante). Preferentemente, el polipéptido aislado se encuentra libre de asociación con todos los demás componentes contaminantes de su entorno de producción. Los componentes contaminantes de su entorno de producción, tal como aquellos que resultan de las células transfectadas recombinantes, son materiales que generalmente interferirían con los usos de investigación, diagnóstico o terapia para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará: (1) a más del 95% en peso del anticuerpo según se determina, por ejemplo, mediante el método de Lowry y, en algunas realizaciones, a más del 99 % en peso; (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos del extremo N o una secuencia de aminoácidos interna usando un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras con tinción con azul de Coomassie o, preferentemente, argéntica. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en linfocitos T recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, generalmente, un polipéptido o anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
La “región variable” o “dominio variable” de un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, se refiere a los dominios de extremo amino de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. Es posible referirse a los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera como “VH"y “Vl", respectivamente. Estos dominios son generalmente las partes más variables del anticuerpo (con respecto a los otros anticuerpos de la misma clase) y contienen los sitios de unión al antígeno.
El término “variable” se refiere a que determinados segmentos de los dominios variables difieren en gran medida en la secuencia entre anticuerpos, tal como los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. No obstante, la variabilidad no se distribuye de forma uniforme en toda la extensión de los dominios variables. En su lugar, se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVR, por su siglas en inglés) tanto en los dominios variables de cadena ligera como en los de cadena pesada. Las partes mejor conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada uno de los dominios variables de cadenas pesada y ligera naturales comprende cuatro regiones FR, adoptando en gran medida una configuración de lámina beta, conectada por tres HVR, que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina beta. Las regiones FR mantienen las HVR en cada cadena en su posición y próximas, y contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos junto con las HVR de la otra cadena (vea Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5.a edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tal como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por modificaciones postraduccionales y/o mutaciones de origen natural (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que se pueden encontrar presentes en cantidades pequeñas. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, y se dirigen hacia uno o más sitios antigénicos. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgación puede ser un anticuerpo biespecífico. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el uno o más sitios antigénicos. El modificador “monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo a través de ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar de acuerdo con la presente divulgación se pueden preparar mediante diversas técnicas, entre las que se incluyen, por ejemplo, tecnologías de expresión en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 101(34):12467-472 (2004) y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004), el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2.a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, patente estadounidense n.° 4816 567) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o similares a los humanos en animales que tienen una parte o la totalidad de los locus de inmunoglobulina humana o genes que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; Wo 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993), las patentes estadounidenses n.° 5545807, 55458 0 6 , 5569825, 5625126, 5633425 y 5661 016, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992), Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994), Morrison, Nature 368:812-813 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).
Las expresiones “anticuerpo de longitud completa", “anticuerpo intacto" o “anticuerpo completo" se utilizan indistintamente para referirse a un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, en su forma sustancialmente intacta, contrario a un fragmento de anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadena pesada y ligera que incluyen una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humanos) o variantes de secuencia de aminoácido de estas. En algunos casos, el anticuerpo intacto puede tener una o más funciones efectoras.
Un “fragmento de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente, la unión al antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab’ , F(ab’)2 y Fv, diacuerpos, anticuerpos lineales (véase la patente estadounidense 5641 870, Ejemplo 2, Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)), moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
La digestión con papaína de los anticuerpos, tales como los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación, produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, denominados fragmentos “Fab” y un fragmento “Fc” residual, cuya denominación refleja la capacidad de cristalizarse con facilidad. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (Vh) y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente respecto la unión al antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión al antígeno. El tratamiento de un anticuerpo con pepsina produce un único fragmento F(ab')2 grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab con enlaces disulfuro con diferente actividad de unión al antígeno y que mantiene la capacidad de entrecruzamiento de antígenos. Los fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab en que tienen algunos residuos adicionales en el extremo C del dominio Ch1 que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se utiliza en la presente para el Fab' en el cual los residuos de cisteína de los dominios constantes portan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
El fragmento Fc comprende las partes de extremo carboxilo de ambas cadenas H que se mantienen juntas mediante disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante las secuencias en la región Fc, la región que también es reconocida por los receptores de Fc (FcR) que se encuentran en determinados tipos de células.
“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión al antígeno y de reconocimiento de antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación fuerte, no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada una de las cadenas H y L) que contribuyen los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. No obstante, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor a todo el lugar de unión.
“Fv monocatenario”, abreviado también como “sFv” o “scFv”, son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo VH y VL conectados a una única cadena de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido sFv también comprende un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión con el antígeno. Véase una reseña sobre sFv de Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
Los “fragmentos funcionales” de los anticuerpos, tales como los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación, comprenden una parte de un anticuerpo intacto que generalmente incluye la región variable o la unión al antígeno del anticuerpo intacto o la región Fc de un anticuerpo que conserva la capacidad de unión a FcR o tiene una capacidad modificada. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente de 5-10 residuos) entre los dominios Vh y Vl, de forma que se logre el emparejamiento entre cadenas y no dentro de la cadena de los dominios V, lo produce un fragmento bivalente, es decir, un fragmento con dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv “de cruzamiento” en los que los dominios Vh y Vl de los dos anticuerpos se encuentran presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen de forma más detallada, por ejemplo, en los documentos EP 404 097, WO 93/11161, Hollinger et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993).
Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo (inmunoglobulina), tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homólogas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente estadounidense n.o4816567, Morrison et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos PRIMATIZED® cuya región de unión al antígeno del anticuerpo procede de un anticuerpo producido, por ejemplo, mediante la inmunización de monos macacos con un antígeno de interés. Tal como se utiliza en el presente documento, un “anticuerpo humanizado” se utiliza como un subconjunto de “anticuerpos quiméricos”.
Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos), tales como anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación, son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima procedente de inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual los residuos de una HVR del receptor se remplazan con residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, una rata, un conejo o un primate no humano, que tiene la especificidad, la afinidad y/o la capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de FR de inmunoglobulina humana se remplazan con los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones pueden realizarse para refinar adicionalmente el desempeño de los anticuerpos, tal como afinidad de unión. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos de los bucles hipervariables corresponden a los de una secuencia de inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones de FR pueden incluir una o más sustituciones de residuo de FR individuales que mejoren el rendimiento del anticuerpo, tal como afinidad de unión, isomerización, inmunogenicidad, y similares. La cantidad de estas sustituciones de aminoácidos en el FR no suele ser más de 6 en la cadena H, y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994) y las patentes estadounidenses n.° 6982321 y 7087409.
Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, producido por un ser humano y/o que se ha producido mediante cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos, tal como se describe en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante varias técnicas conocidas en la técnica, lo que incluye bibliotecas de expresión en fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También se encuentran disponibles métodos para preparar anticuerpos monoclonales humanos descritos en Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Véase también, van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001). Los anticuerpos humanos pueden prepararse al administrarle el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para que produzca tales anticuerpos, como respuesta a una exposición antigénica, pero cuyos locus endógenos fueron desactivados, por ejemplo, xenoratones inmunizados (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.° 6075 181 y 6 150584 respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) respecto a los anticuerpos humanos generados mediante una tecnología de hibridoma de linfocitos B humanos.
Cuando en el presente documento se utilizan las expresiones “región hipervariable”, “HVR” o “HV”, éstas se refieren a las regiones de un dominio variable de anticuerpo, tal como el de un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, las que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles definidos desde el punto de vista estructural. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). En anticuerpos naturales, H3 y L3 expresan la mayor diversidad de las seis HVR, y se cree que H3 en particular juega un papel extraordinario al conferir una buena especificidad a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methodsin Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélidos de origen natural que consisten únicamente en una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).
Se utilizan diversas descripciones de las HVR y se incluyen en el presente documento. Las HVR, que son regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementarity-determining regions) de EU o Kabat, se basan en la variabilidad de las secuencias y son las que más se utilizan habitualmente (Kabat et al., supra). Por el contrario, Chothia se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de los AbM (anticuerpos monoclonales) representan un compromiso entre las CDR de EU o Kabat y los bucles estructurales de Chothia y se utilizan en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVR “de contacto” se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. A continuación, se describen los residuos de cada una de estas HVR.
Bucle______ Kabat AbM Chothia Contacto
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeración de Kabat)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeración de Chothia)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
Las HVR pueden comprender “HVR extendidas”, como se indica a continuación: 24-36 o 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 o 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 o 49-65 (una realización preferida) (H2) y 93-102, 94-102 o 95­ 102 (H3) en el VH. Los residuos de dominio variable se enumeran de acuerdo con EU o Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones de HVR extendidas.
Los residuos “marco” o “FR” (del inglés framework), son los residuos de dominio variable diferentes de los residuos de HVR definidos en el presente documento.
Las frases “numeración de residuo de dominio variable según EU o Kabat” o “numeración de posición de aminoácido según EU o Kabat”, y variaciones de estas, hacen referencia al sistema de numeración utilizado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en EU o Kabat et al., supra. Al usar este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento o una inserción de una FR o una HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir la inserción de un único aminoácido (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. según Kabat) después del residuo FR de cadena pesada 82. Se puede determinar la numeración de residuos de EU o Kabat para un anticuerpo determinado mediante la alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia «estándar» numerada según Kabat.
El sistema de numeración de EU o Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente los residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Generalmente se utiliza el “sistema de numeración EU o Kabat” o “índice EU” cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU indicado en Kabat et al., supra). La expresión “índice EU de acuerdo con Kabat” se refiere a la enumeración de residuos del anticuerpo EU de IgG1 humana. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, las referencias a los números de residuos en el dominio variable de los anticuerpos significa la numeración del residuo según el sistema de numeración Kabat. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, las referencias a los números de residuos en el dominio constante de los anticuerpos significan la numeración de residuos según el sistema de numeración EU o Kabat (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2010-280227).
Un “marco humano aceptor”, tal como se usa en el presente documento, es un marco que comprende la secuencia de aminoácido de un marco VL o VH procedente de un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano. Un marco humano aceptor «procedente de» un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de este, o puede contener cambios en secuencias de aminoácidos preexistentes. En algunas realizaciones, la cantidad de cambios de aminoácidos preexistentes es 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. Cuando se encuentran cambios preexistentes de la secuencia de aminoácido en un VH, es preferible que esos cambios tengan lugar solo en tres, dos o una de las posiciones 71H, 73H y 78H, por ejemplo, los residuos de aminoácidos en esas posiciones pueden ser 71A, 73T y/o 78A. En una realización, la secuencia del marco humano aceptor de VL es idéntica a la secuencia VL de marco de inmunoglobulina humana o secuencia de marco de consenso humano.
Un “marco de consenso humano” es un marco que representa los residuos de aminoácidos más comunes en una selección de secuencias de marco VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza a partir de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias de dominio variable es un subgrupo según Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991). Los ejemplos para VL incluyen que el subgrupo puede ser un subgrupo kappa I, kappa II, kappa III o kappa IV según Kabat et al., supra. Adicionalmente, en el caso de VH, el subgrupo puede ser subgrupo I, subgrupo II o subgrupo III de acuerdo con Kabat et al., supra.
Una “modificación de aminoácido” en una posición específica, por ejemplo, de un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, se refiere a la sustitución o eliminación del residuo específico, o la inserción de al menos un residuo aminoácido adyacente al residuo especificado. La inserción «adyacente» a un residuo especificado significa inserción a uno a dos residuos de este. La inserción puede ser hacia el extremo N o el extremo C con respecto al residuo especificado. La modificación de aminoácido preferida en la presente divulgación es una sustitución.
Un anticuerpo “con maduración de afinidad”, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, es uno con una o más alteraciones en una o más de sus HVR que resulta en una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno en comparación con un anticuerpo original que carece de dichas alteraciones. En una realización, el anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describen la maduración por afinidad mediante transposiciones de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de los residuos de marco y/o HVR se describe, por ejemplo, en: Barbas et al. ProcNat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813(1994); Schieret al. Gene 169:147-155(1995); Yelton et al. J. Immunol.
155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 ( 1992).
Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones “reconoce específicamente a” o “se une específicamente a”, hacen referencia a interacciones que se pueden medir y reproducir, tales como la atracción o unión entre una diana y un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, lo que determina la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas que incluye moléculas biológicas.
Por ejemplo, un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, el que se une específica 0 preferencialmente con una diana o un epítopo, es un anticuerpo que se une a dicha diana o epítopo con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración respecto a su unión a otras dianas u otros epítopos de la diana. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o un resto) que se une específicamente o preferencialmente a una primera diana puede unirse específicamente o preferencialmente a una segunda diana o no. Por lo tanto, la unión específica o unión preferencial no requieren necesariamente una unión exclusiva (aunque la pueden incluir). Un anticuerpo que se une específicamente a una diana puede tener una constante de asociación de al menos aproximadamente 103M-1 o 104M-1, algunas veces de aproximadamente 105M-1 o 106 M-1, en otros casos, de aproximadamente 106 M-1 o 107 M-1, de aproximadamente 108 M-1 a aproximadamente 1010M-1 a 1011 M-1 o más. Se puede utilizar una variedad de formatos de inmunoensayos para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivo con una proteína particular. Por ejemplo, inmunoensayos de ELISA de fase sólida se usan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunoreactivos con una proteína. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción de formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.
Tal como se utiliza en el presente documento, una “interacción” entre una proteína sortilina y una segunda proteína comprende, de modo no taxativo, la interacción proteína-proteína, una interacción física, una interacción química, unión, unión covalente y unión iónica. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo “ inhibe la interacción” entre dos proteínas cuando el anticuerpo altera, reduce o elimina por completo una interacción entre las dos proteínas. Un anticuerpo de la presente divulgación o un fragmento de este, “ inhibe la interacción” entre dos proteínas cuando el anticuerpo o fragmento de este se une a una de las dos proteínas.
Un anticuerpo “bloqueador”, un anticuerpo “antagonista” o un anticuerpo “inhibidor” es un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, que inhibe o reduce una o más actividades biológicas del antígeno que une, tal como interacciones con una o más proteínas. En algunas realizaciones, los anticuerpos bloqueadores, anticuerpos antagonistas o anticuerpos inhibidores inhiben sustancial o completamente una o más actividades o interacciones biológicas del antígeno.
Las “funciones efectoras” del anticuerpo hacen referencia a las actividades biológicas que se pueden atribuir a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o una región Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían según el isotipo de anticuerpo.
En el presente documento, la expresión “región Fc” se utiliza para definir una región de extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. A pesar de que los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada IgG humana se define generalmente para extenderse desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de esta. Es posible eliminar la lisina del extremo C (residuo 447 conforme al sistema de numeración EU o Kabat) de la región Fc, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo o mediante la modificación recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 eliminados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Las regiones Fc de la secuencia natural adecuada a utilizar en los anticuerpos de la presente divulgación incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humana.
Una “región Fc de secuencia natural” comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza. Las regiones Fc humanas de secuencia natural incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia natural (alotipos no A y A), región Fc de IgG2 humana de secuencia natural, región Fc de IgG3 humana de secuencia natural y región Fc de IgG4 humana de secuencia natural, así como también variantes de origen natural de estas.
Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la región Fc de secuencia natural en virtud de al menos una modificación de aminoácido, preferentemente una o más sustituciones de aminoácidos.
Preferentemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia natural o con la región Fc de un polipéptido original, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia natural o en la región Fc del polipéptido original.
En el presente documento, la región Fc variante tendrá preferentemente al menos aproximadamente un 80 % de homología con una región Fc de secuencia natural y/o con una región Fc de polipéptido original y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 90 % de homología con estas y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 95 % de homología con estas.
Las expresiones “receptor de Fc” o “FcR” describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferido es uno que une un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyR i I, y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y formas empalmadas, de forma alternativa, de estos receptores, receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un receptor de activación) y FcyRIIB (un receptor de inhibición), que tiene secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de estos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación de inmunorreceptores basado en tirosina (ITAM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplasmático. El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en el inmunorreceptor de tirosina (ITIM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplásmico. (véase, por ejemplo, M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se analizan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994) y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcR, incluidos los que se identifiquen en el futuro, están dentro del término “FcR” en el presente documento. Los FcR también pueden aumentar la semivida en suero de los anticuerpos.
Es posible analizar la unión a FcRn in vivo y la semivida en suero de polipéptidos con unión de gran afinidad al FcRn humano, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas con expresión de FcRn humano o en primates a los que se les administran los polipéptidos que tienen una región de Fc variante. En el documento WO 2004/42072 (Presta) se describen variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a los FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” y el término “homología” con respecto a una secuencia de polipéptido, péptido o anticuerpo, hacen referencia al porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos o péptidos específica después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Es posible llevar a cabo una alineación para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos de varias formas al alcance de un experto en la técnica, por ejemplo, con un software informático disponible al público como BLAST, BLAST-2, ALIGN o MEGALIg N™ (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para medir la alineación, lo que incluye cualquier algoritmo conocido en la técnica necesario para lograr la alineación máxima en la longitud completa de las secuencias que se están comparando.
Una molécula de ácido nucleico “aislada” que codifica un anticuerpo, tal como un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación, es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia comúnmente en el entorno en el que se produjo. Preferentemente, el ácido nucleico aislado se encuentra libre de asociación con todos los componentes asociados al entorno de producción. Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos y anticuerpos del presente documento se encuentran en una forma diferente a la forma o configuración en las que se encuentran en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen del ácido nucleico que codifica los polipéptidos y anticuerpos del presente documento ya que existen de forma natural en las células.
El término “vector”, tal como se utiliza en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual se enlazó. Un tipo de vector es un «plásmido», lo que se refiere a un ADN de doble cadena circular al que se pueden ligar segmentos de ácidos nucleicos adicionales. Otro tipo de vector es un vector fágico. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma del virus. Determinados vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora después de la introducción en la célula hospedadora y, de esa forma, se replican junto con el genoma hospedador. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que se encuentran unidos de forma operativa. En el presente documento se hace referencia a dichos vectores como “vectores de expresión recombinante” o simplemente “vectores de expresión”. En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se suelen encontrar en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se pueden utilizar indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada.
“Polinucleótido” o “ácido nucleico”, tal como se utilizan indistintamente en el presente documento, hacen referencia a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar a un polímero mediante polimerasa de ADN o ARN o mediante una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. De estar presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede impartir antes o después del ensamble del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse mediante componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede comprender modificaciones realizadas después de la síntesis, tal como, conjugación con una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, “casquetes”, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones de entre nucleótidos como, por ejemplo, los que tienen enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos colgantes como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), los que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), los que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), los que contienen alquiladores, los que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del o de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes comúnmente en los azúcares se puede remplazar, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, se pueden proteger con grupos de protección estándar o activar para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar con soportes sólidos o semisólidos. Se puede fosforilar el OH de los extremos 5’ y 3’ o sustituirlos con aminas o restos de grupos casquete orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. También se pueden derivar otros hidroxilos en grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que generalmente se conocen en la técnica y que incluyen, por ejemplo, 2-O-metilo-, 2'-O-alilo, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos, tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósidos básicos, tal como, ribósido de metilo. Se pueden remplazar uno o más enlaces fosfodiéster con grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, de modo no taxativo, realizaciones en las que se remplaza el fosfato con P(O)S (tioato), P(S)S (ditioato), (O)NR2 (amidato), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 (formacetal), en los que R o R' es independientemente H o alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido que opcionalmente contiene un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No necesariamente todos los enlaces en un polinucleótido son idénticos. La anterior descripción se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluidos ARN y ADN.
Una “célula hospedadora” incluye una célula o cultivo celular del individuo que puede ser o ha sido un receptor para vectores para la incorporación de inserciones de polinucleótidos. Las células hospedadoras incluyen progenie de una única célula hospedadora y puede que esta no sea necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula progenitora original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Una célula hospedadora incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido de la presente divulgación.
Tal como se usa en el presente documento, “portadores” incluye portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a ellos en las dosis y las concentraciones empleadas. A menudo un portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con pH tamponado. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen soluciones tamponadoras tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; polipéptidos de peso molecular bajo (menor de aproximadamente de 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, entre los que se incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares alcohólicos tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio ;y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “apoptosis" se refiere a procesos dirigidos por genes de destrucción celular intracelular. La apoptosis se diferencia de la necrosis. Incluye alteración citoesquelética, encogimiento citoplasmático y condensación, expresión de fosfatidilserina en la superficie exterior de la membrana celular y formación de vesículas, lo que resulta en la formación de vesículas o cuerpos apoptóticos unidos a la membrana celular. También se refiere al proceso conocido como “muerte celular programada”. Durante la apoptosis, se observan fenómenos característicos, tales como superficies celulares curvadas, condensación de cromatina nuclear, fragmentación de ADN cromosómico y pérdida de función mitocondrial. Se pueden utilizar varias tecnologías conocidas para detectar la apoptosis, tales como tinción de células con anexina V, yoduro de propidio, ensayo de fragmentación de ADN y YO-PRO-1 (Invitrogen). En algunas realizaciones, se puede utilizar la tinción con anexina V y yoduro de propidio, y los porcentajes combinados de las poblaciones de anexina V+/PI+, anexina V+/PI- y anexina V-/PI+ se consideran células muertas.
La expresión “aproximadamente”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido por el experto en este campo técnico. La referencia a aproximadamente de un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parámetro en sí.
Tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “uno/a”, “el” y “ la”, incluyen sus referencias plurales, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a un “anticuerpo” es una referencia a uno o más anticuerpos, tal como cantidades molares, e incluye equivalentes de estos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
Se entiende que el aspecto y las realizaciones de la presente divulgación, descritos en el presente documento, incluyen “que comprende”, “que consiste en” y “que consiste básicamente en” aspectos y realizaciones.
Proteínas sortilina
En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos aislados (por ejemplo, monoclonales) que se unen a un epítopo en una proteína sortilina de la presente divulgación. Las proteínas sortilina de la presente divulgación incluyen, de modo no taxativo, una proteína sortilina de mamífero, proteína sortilina humana, proteína sortilina de ratón y proteína sortilina de rata.
La sortilina se conoce como sortilina 1, sort1, receptor de NT de 100 kDa, glicoproteína 95 (GP95), receptor de progranulina (PGRN-R) y receptor de neurotensina 3 (NT-3 o NTR-3). La sortilina es una proteína de 831 aminoácidos que codifica un receptor de membrana tipo I. Se conocen varios homólogos de sortilina, los que incluyen, de modo no taxativo, sortilina humana, sortilina de rata y sortilina de ratón. La secuencia de aminoácidos de sortilina humana se establece a continuación como la SEQ ID NO: 1 (con residuos de aminoácidos clave que se predice que participarán en la unión a progranulina ilustrada en negrita y la región de unión a pro-NGF prevista, con subrayado):
10 20 30 40 50
MERPWGAADG LSRWPHGLGL LLLLQLLPPS TLSQDRLDAP PPPAAPLPRW
60 70 80 90 100
SGPIGVSWGL RAAAAGGAFP RGGRWRRSAP GEDEECGRVR DFVAKLANNT
110 120 130 140 150
HQHVFDDLRG SVSLSWVGDS TGVILVLTTF HVPLVIMTFG QSKLYRSEDY
160 170 180 190 200
GKNFKDITDL INNTFIRTEF GMAIGPENSG KVVLTAEVSG GSRGGRIFRS
210 220 230 240 250
SDFAKNFVQT DLPFHPLTQM MYSPQNSDYL LALSTENGLW VSKNFGGKWE
260 270 280 290 300
EIHKAVCLAK WGSDNTIFFT TYANGSCKAD LGALELWRTS DLGKSFKTIG
310 320 330 340 350
VKIYSFGLGG RFLFASVMAD KDTTRRIHVS TDQGDTWSMA QLPSVGQEQF
360 370 380 390 400
YSILAANDDM VFMHVDEPGD TGFGTIFTSD DRGIVYSKSL DRHLYTTTGG
410 420 430 440 450
ETDFTNVTSL RGVYITSVLS EDNSIQTMIT FDQGGRWTHL RKPENSECDA
460 470 480 490 500
TAKNKNECSL HIHASYSISQ KLNVPMAPLS EPNAVGIVIA HGSVGDAISV
510 520 530 540 550
MVPDVYISDD GGYSWTKMLE GPHYYTILDS GGIIVAIEHS SRPINVIKFS
560 570 580 590 600
TDEGQCWQTY TFTRDPIYFT GLASEPGARS MNISIWGFTE SFLTSQWVSY
610 620 630 640 650
TIDFKDILER NCEEKDYTIW LAHSTDPEDY EDGCILGYKE QFLRLRKSSV
660 670 680 690 700
CQNGRDYVVT KQPSICLCSL EDFLCDFGYY RPENDSKCVE QPELKGHDLE
710 720 730 740 750
FCLYGREEHL TTNGYRKIPG DKCQGGVNPV REVKDLKKKC TSNFLSPEKQ
760 770 780 790 800
NSKSNSVPII LAIVGLMLVT VVAGVLIVKK YVCGGRFLVH RYSVLQQHAE
810 820 830
ANGVDGVDAL DTASHTNKSG YHDDSDEDLL E
De manera adicional, la secuencia de aminoácidos de la sortilina de ratón se expone en la SEQ ID NO: 2:
MERPRGAADG LLRWPLGLLL LLQLLPPAAV GQDRLDAPPP PAPPLLRWAG PVGVSWGLRA AAPGGPVPRA GRWRRGAPAE DQDCGRLPDF IAKLTNNTHQ HVFDDLSGSV SLSWVGDSTG VILVLTTFQV PLVIVSFGQS KLYRSEDYGK NFKDITNLIN NTFIRTEFGM AIGPENSGKV ILTAEVSGGS RGGRVFRSSD FAKNFVQTDL PFHPLTQMMY SPQNSDYLLA LSTENGLWVS KNFGEKWEEI HKAVCLAKWG PNNIIFFTTH VNGSCKADLG ALELWRTSDL GKTFKTIGVK IYSFGLGGRF LFASVMADKD TTRRIHVSTD QGDTWSMAQL PSVGQEQFYS ILAANEDMVF MHVDEPGDTG FGTIFTSDDR GIVYSKSLDR HLYTTTGGET DFTNVTSLRG VYITSTLSED NSIQSMITFD QGGRWEHLRK PENSKCDATA KNKNECSLHI HASYSISQKL NVPMAPLSEP NAVGIVIAHG SVGDAISVMV PDVYISDDGG YSWAKMLEGP HYYTILDSGG IIVAIEHSNR PINVIKFSTD EGQCWQSYVF TQEPIYFTGL ASEPGARSMN ISIWGFTESF ITRQWVSYTV DFKDILERNC EEDDYTTWLA HSTDPGDYKD GCILGYKEQF LRLRKSSVCQ NGRDYVVAKQ PSVCPCSLED FLCDFGYFRP ENASECVEQP ELKGHELEFC LYGKEEHLTT NGYRKIPGDK CQGGMNPARE VKDLKKKCTS NFLNPTKQNS KSNSVPIILA IVGLMLVTVV AGVLIVKKYV CGGRFLVHRY SVLQQHAEAD GVEALDSTSH AKSGYHDDSD EDLLE
De manera adicional, la secuencia de aminoácidos de la sortilina de rata se expone en la SEQ ID NO: 3.
MERPRGAADG LLRWPLGLLL LLQLLPPAAVGQDRLDAPPP PAPPLLRWAGPVGVSWGLRAAAPGGPVPRA GRWRRGAPAE DQDCGRLPDF IAKLTNNTHQHVFDDLSGSV SLSWVGDSTGVILVLTTFQVPLVIVSFGQS KLYRSEDYGK NFKDITNLIN NTFIRTEFGMAIGPENSGKV ILTAEVSGGSRGGRVFRSSDFAKNFVQTDL PFHPLTQMMY SPQNSDYLLA LSTENGLWVSKNFGEKWEEI HKAVCLAKWGPNNIIFFTTHVNGSCKADLG ALELWRTSDL GKTFKTIGVK IYSFGLGGRFLFASVMADKD TTRRIHVSTDQGDTWSMAQLPSVGQEQFYS ILAANDDMVF MHVDEPGDTG FGTIFTSDDRGIVYSKSLDR HLYTTTGGETDFTNVTSLRGVYITSTLSED NSIQSMITFD QGGRWEHLQK PENSKCDATAKNKNECSLHI HASYSISQKLNVPMAPLSEPNAVGIVIAHG SVGDAISVMV PDVYISDDGG YSWAKMLEGPHYYTILDSGG IIVAIEHSNRPINVIKFSTDEGQCWQSYVF SQEPVYFTGL ASEPGARSMN ISIWGFTESFLTRQWVSYTI DFKDILERNCEENDYTTWLAHSTDPGDYKD GCILGYKEQF LRLRKSSVCQ NGRDYVVAKQPSICPCSLED FLCDFGYFRPENASECVEQPELKGHELEFC LYGKEEHLTT NGYRKIPGDR CQGGMNPAREVKDLKKKCTS NFLNPKKQNSKSSSVPIILAIVGLMLVTVV AGVLIVKKYV CGGRFLVHRY SVLQQHAEADGVEALDTASH AKSGYHDDSDEDLLE
En algunas realizaciones, la sortilina es una preproteína que incluye una secuencia señal. En algunas realizaciones, la sortilina es una proteína madura. En algunas realizaciones, la proteína sortilina madura no incluye una secuencia señal. En algunas realizaciones, la proteína sortilina madura se expresa en una célula.
Las proteínas sortilina de la presente divulgación incluyen varios dominios, incluyendo, de modo no taxativo, una secuencia señal, un propéptido, un dominio interno, un dominio Vps10p, un dominio 10 CC, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. De manera adicional, las proteínas de la presente divulgación se expresan a niveles elevados en una cantidad de tejidos, lo que incluyen, de modo no taxativo, el cerebro, médula espinal, corazón y músculo esquelético, tiroides, placenta y testículos.
La sortilina es un miembro de la familia Vps10p de receptores de clasificación, lo que también incluye, de modo no taxativo, receptor relacionado con la proteína de clasificación con repeticiones tipo A (SorLA), receptor relacionado con sortilina expresado en CNS 1 (SorCS1), receptor relacionado con sortilina expresado en CNS 2 (SorCS2) y receptor relacionado con sortilina expresado en CNS 3 (SorCS3). La región interna de sortilina se alinea con cada uno de los dos dominios internos en la levadura Vps10p (dominios Vps10p). El rasgo distintivo del dominio Vps10p es un propéptido del extremo amino y un segmento del extremo carboxilo que contiene 10 residuos de cisteína conservados (10CC). Otros receptores de la familia Vps10p comparten un dominio Vps10p, el cual se ubica en los extremos amino y contiene ectodominios adicionales.
La familia Vps10p de los receptores de clasificación tiene diversas funciones tanto en el sistema nervioso como en otras partes. Se ha demostrado que los receptores son multifuncionales, unen varios ligandos diferentes, lo que incluye, de modo no taxativo, progranulina (PGRN), factor de crecimiento nervioso (Pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), PCSK9, proneurotrofinas, neurotrofinas, proneurotrofina 3 (pro-NT3), proneurotrofina 4/5, factor proneurotrófico derivado del cerebro (Pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3 (NT3), neurotrofina 4/5, neurotensina, p75NTR, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora de amiloide (APP), lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteínas, apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE 2, 3, 4), proteína asociada con el receptor (RAP) y elementos del sistema activador plasminógeno y participan en la clasificación intracelular, endocitosis y transducción de señal. Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación median en la endocitosis rápida de la lipoproteína lipasa, neurotensina y la proforma del factor de crecimiento nervioso y seleccionan como diana proteínas para el transporte de Golgi a endosomas tardíos. Además, se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación forman un complejo con p75 en la membrana celular y son esenciales para la muerte neuronal inducida por el factor de crecimiento nervioso (NGF). Recientemente también se ha demostrado que los miembros de la familia receptora de Vps10p interactúan con miembros de la familia neurotrofina, los que incluyen NGF, factor neutrófico derivado del cerebro, neurotrofina 3 y neurotrofina 4/5 o la forma prodominio de una neurotrofina (proneurotrofina). También se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación se unen a PCSK9 y regulan sus niveles extracelulares, lo que destina al receptor de lipoproteína de baja densidad a la degradación en lisosomas, lo que resulta en el aumento de los niveles de colesterol LDL.
Por consiguiente, tal como se utiliza en el presente documento, una proteína “sortilina” de la presente divulgación incluye, de modo no taxativo, una proteína sortilina de mamífero, una proteína sortilina humana, una proteína sortilina de primate, una proteína sortilina de ratón y una proteína sortilina de rata. De manera adicional, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación pueden unirse a un epítopo en una o más de una proteína sortilina de mamífero, una proteína sortilina humana, una proteína sortilina de primate, una proteína sortilina de ratón y una proteína sortilina de rata.
Dominios de la proteína sortilina
Las proteínas sortilina de la presente divulgación contienen varios dominios, tal como un dominio Vps10p que contiene un motivo Asp-box, una estructura de hélice beta con diez hojas y un bucle hidrófobo; y un dominio 10CC.
Tal como se desvela en el presente documento, el dominio Vps10p, que contiene una estructura de hélice beta con diez hojas y un motivo Asp-box, actúa como mediador en las interacciones entre las proteínas sortilina de la presente divulgación y las proneurotrofinas o neurotrofinas. En determinadas realizaciones, las proteínas sortilina de la presente divulgación contiene un dominio Vps10p que incluye una estructura de hélice beta con diez hojas y se ubica entre los residuos de aminoácidos 78-611 de la sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 78-611 de la SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones, los residuos de aminoácidos 190-220 de la sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 190-220 de la SEQ ID NO: 1 se ubican en el dominio Vps10p.
Los dominios Vps10p de la presente divulgación pueden incluir un motivo Asp-box. Tal como se utiliza en el presente documento, los motivos Asp-box tienen la siguiente secuencia: (S/T)-X-(D/N)-X-X-X-X-(W/F/Y) (SEQ ID NO: 4) o X-X-(S/T)-X-(D/N)-X-G-X-(T/S)-(W/F/Y)-X (SEQ ID NO: 5), en donde X representa cualquier aminoácido. En la sortilina humana, el motivo Asp-box se ubica en los residuos de aminoácidos 200-207 (SSDFAKNF (SEQ ID NO: 694)). Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se ubica un motivo Asp-box en los residuos de aminoácidos 200-207 de sortilina humana (SEQ ID NO :1) o residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 200-207 de la SEQ ID NO: 1.
Tal como se desvela en el presente documento, el dominio 10CC del bucle hidrófobo del dominio Vps10p actúa como mediador en las interacciones entre las proteínas sortilina de la presente divulgación y p75.
En determinadas realizaciones, las proteínas sortilina de la presente divulgación contiene un dominio 10CC que se ubica entre los residuos de aminoácidos 610-757 de la sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 610-757 de la SEQ ID NO: 1. En realizaciones preferidas, los residuos de aminoácidos 592-593, 610-660 y/o 667-749 de la sortilina humana (SEQ ID NO: 1), o residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 592­ 593, 610-660 y/o 667-749 de la SEQ ID NO: 1 se ubican en el dominio 10CC de sortilina.
En otras realizaciones, las proteínas sortilina de la presente divulgación contienen un bucle hidrófobo en el dominio Vps10p que se ubica entre los residuos de aminoácidos 130-141 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 130-141 de la SEQ ID NO: 1.
Tal como apreciará un experto en la técnica, los residuos al inicio y al final de los dominios de la presente divulgación, pueden variar según el programa de modelado informático que se utilice o según el método que se utilice para determinar el dominio.
Compañeros de unión a sortilina
Las proteínas sortilina de la presente divulgación pueden interactuar (por ejemplo, unirse) con una o más proteínas que incluyen, de modo no taxativo, proteína progranulina; neurotrofinas, tales como proneurotrofinas, proneurotrofina 3, neurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, factor de crecimiento nervioso (Pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (Pro-BDNF) y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); neurotensina, p75, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína Av (APOA5), apolipoproteína E (APOE), proteína precursora de amiloide, péptido beta A, PCSK9, p75NTR y proteína asociada al receptor (RAP).
Progranulina
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) directamente con progranulina y actúan como mediadoras en la degradación de progranulina (por ejemplo, Zheng, Y et al., (2011) PLoS ONE 6(6): e21023).
La progranulina se conoce como PGRN, proepitelina, precursor de granulina-epitelina, factor de crecimiento derivado de células (PCDGF) de PC (cáncer de próstata) y acrogranina. La progranulina es una proteína de 593 aminoácidos que codifica una glicoproteína secretada de 68,5 kD que tiene 7,5 repeticiones de motivos de granulina (epitelina) más pequeños que varían de 6-25 kDa, los que se pueden escindir proteolíticamente de la PGRN precursora. Ejemplos de productos de la escisión de progranulina incluyen, de modo no taxativo, granulina A/ epitelinas 1, granulina B epitelinas 2, granulina C, granulinas D, granulina E, granulina F, granulina G y cualquiera otros productos peptídicos conocidos derivados de progranulina.
La progranulina se expresa ampliamente, y, en células no neuronales, se ha asociado a una diversidad de eventos, tales como regulación del ciclo celular y motilidad celular, reparación de heridas, inflamación, inducción de factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y tumorigénesis. La progranulina también se expresa ampliamente en el desarrollo neuronal temprano, pero se restringe en el desarrollo posterior en poblaciones neuronales definidas, tales como neuronas corticales, neuronas piramidales del hipocampo y células Purkinje. Sin embargo, la función de progranulina en las células neuronales no fue clara hasta que se observó que los pacientes que padecen de demencia frontotemporal (FTD) tienen mutaciones en el gen de progranulina en el cromosoma 17. Posteriormente, se ha demostrado que progranulina promueve la supervivencia neuronal y mejora el crecimiento de neuritas en neuronas corticales y motoras. Por lo tanto, aunque la progranulina no es una neurotrofina, o un miembro de la familia de las neurotrofinas, se ha hecho referencia a ella como un factor neurotrófico debido a su capacidad para promover la supervivencia neuronal.
Además, se ha demostrado que la haploinsuficiencia de la progranulina (que incluye más de 70 mutaciones diferentes, tal como las mutaciones de pérdida de función) se asocia a la demencia frontotemporal (FTD) con patología de TDP-43. Asimismo, los niveles de progranulina en plasma se reducen con pacientes que tienen mutaciones de FTD. Las mutaciones de progranulina representan un 25 % de FTD familiar. De manera adicional, se observan niveles bajos de progranulina en algunos pacientes con FTD sin mutaciones de progranulina, y los niveles de progranulina se alteran en la enfermedad de Alzheimer y ALS. Por lo tanto, se cree que es posible que la progranulina esté involucrada en las enfermedades degenerativas.
También se ha demostrado que la pérdida total de progranulina lleva a un fenotipo de fuscinosis lipoide neuronal (NPL, siglas del inglés). Por consiguiente, se cree que los individuos con varios trastornos de depósito lisosomal pueden responder al aumento de niveles de progranulina. La progranulina se expresa ampliamente y las neuronas y microglía la producen en el sistema nervioso central. También se suele creer que la progranulina tiene una función antiinflamatoria en macrófagos y en la microglía, y una función que favorece la supervivencia en las neuronas.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación, que aumentan los niveles de progranulina, reducen los niveles de sortilina en la superficie celular y/o bloquean la interacción (por ejemplo, la unión) entre la sortilina y la progranulina, serían beneficiosos para prevenir, reducir el riesgo o tratar afecciones y/o enfermedades asociadas a la reducción de niveles de expresión y/o actividad de neurotrofina, muerte celular (por ejemplo, muerte celular neuronal), demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, lesión cerebral por traumatismo, lesión de la médula espinal, depresión prolongada, enfermedades vasculares ateroescleróticas, síntomas no deseados del envejecimiento normal, demencia, demencia mixta, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia normotensiva, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, tauopatía, accidente cerebrovascular, traumatismo grave, traumatismo crónico, lupus, colitis aguda y crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, malaria, temblor hereditario, lupus del sistema nervioso central, enfermedad de Behcet, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia de sistemas múltiples, degeneración de discos intervertebrales, síndrome de Shy-Drager, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar basal cortical, encefalomielitis diseminada aguda, trastornos granulomatosos, sarcoidosis, enfermedades vinculadas al envejecimiento, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración de la retina , infección de las vías respiratorias, sepsis, infección ocular, infección sistémica, trastornos inflamatorios, artritis, esclerosis múltiple, trastorno metabólico, obesidad, resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, daño vascular o tisular, una lesión y/o uno o más síntomas no deseados del envejecimiento normal. De manera adicional, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que aumentan los niveles de progranulina, reducen los niveles de sortilina en la superficie celular y/o bloquean la interacción (por ejemplo, la unión) entre la sortilina y la progranulina, pueden inhibir la interacción entre la sortilina y la progranulina, pueden inducir una o más actividades de progranulina, pueden reducir la internalización endosomal de progranulina o fragmentos de esta y/o pueden aumentar la concentración eficaz de progranulina.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que aumentan los niveles de progranulina, reducen los niveles de sortilina en la superficie celular y/o bloquean la interacción (por ejemplo, la unión) entre la sortilina y la progranulina, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175­ 181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237­ 247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391,429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233-243, 237­ 247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que aumentan los niveles de progranulina, reducen los niveles de sortilina en la superficie celular y/o bloquean la interacción (por ejemplo, la unión) entre la sortilina y la progranulina, se pueden unir a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Neurotrofinas
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) directamente con proneurotrofinas (por ejemplo, pro-NGF), que contienen un prodominio y suelen ser proapoptóticas (por ejemplo, Andersen, OS et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285, 12210-12222). Dichos precursores de pro-NGF se liberan durante el estrés y se ha demostrado que las proteínas sortilina se involucran regulando su liberación, así como también en la unión en la célula receptora. Esta unión se puede mediar a través de un epítopo lineal en la sortilina que corresponde a los residuos de aminoácidos 163-174 de la SEQ ID NO: 1.
Las neurotrofinas son una familia de proteínas de hormonas peptídicas diméricas que inducen supervivencia, desarrollo y función celular neuronal. Las neurotrofinas pertenecen a una clase de factores de crecimiento que son proteínas secretadas capaces de señalizar células particulares para supervivencia, diferenciación o crecimiento. Los factores de crecimiento, tal como las neurotrofinas que promueven la supervivencia de neuronas, se conocen como factores neurotróficos. Los factores neurotróficos se secretan por tejidos diana y actúan al prevenir que la neurona asociada inicie la muerte celular programada. Las neurotrofinas también pueden inducir la diferenciación de células progenitoras para formar neuronas. Las neurotrofinas de la presente divulgación se sintetizan de forma intracelular como proteínas precursoras de 30-35 kDa que contienen un péptido señal y sitios de glicosilación. Durante el procesamiento, también se escinden proteínas precursoras en un sitio de escisión dibásico con furina proteasa de serina dependiente de calcio y otros miembros de la familia prohormona convertasa, en el aparato de Golgi. La parte del extremo N de esta escisión es la neurotrofina madura de 118-120 aminoácidos y un producto del extremo C de 12­ 14 kDa biológicamente activo (Seidah et al, Biochem. J. (1996) 314:951-960). Tal como se utiliza en el presente documento, “neurotrofina” y “factor neurotrófico” se pueden utilizar indistintamente. Las neurotrofinas de la presente divulgación incluyen, de modo no taxativo, los factores relacionados estructuralmente, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina 3 (NT-3) y neurotrofina 4 (NT-4). Tal como se utiliza en el presente documento, “proneurotrofina” puede hacer referencia a cualquier propéptido de la familia de neurotrofinas, lo que incluye, de modo no taxativo, pro-NGF, pro-BDNF, proneurotrofina 3 y proneurotrofina 4/5.
Se ha demostrado que las proneurotrofinas cumplen una función patológica en el envejecimiento, convulsiones, distrofia de la retina, lesión cerebral por traumatismo, lesión de la médula espinal y depresión prolongada (por ejemplo, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766 ; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al. (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93 y Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491).
El factor de crecimiento nervioso (NGF, siglas del inglés) es una proteína pequeña secretada que se homodimeriza y se incorpora a un complejo más grande. El NGF presenta actividad estimuladora del crecimiento nervioso y el complejo se involucra en la regulación del crecimiento, mantenimiento, supervivencia y en la diferenciación de determinadas neuronas sensoriales y simpáticas. Las mutaciones producidas en el NGF se han asociado a neuropatía autonómica y sensorial hereditaria tipo 5 (HSAN5) y la desregulación de la expresión del NGF se asocia a la rinitis alérgica. Sin desear limitarse a la teoría, también se cree que el pro-NGF puede inducir a la apoptosis y a la depresión prolongada.
El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, siglas del inglés) es una proteína secretada inducida por neuronas corticales, y es necesario para la supervivencia de neuronas estriatales en el cerebro. La expresión de BDNF se reduce tanto en los pacientes con enfermedad de Alzheimer como en los que tienen la enfermedad de Huntington. El BDNF puede cumplir una función en la regulación de respuestas del estrés y en la biología de trastornos del humor. Se describen múltiples variantes de transcripción que codifican diferentes isoformas para este gen. Sin desear limitarse a la teoría, también se cree que pro-BDNF puede inducir la apoptosis y la depresión prolongada.
La neurotrofina 3 es una proteína secretada necesaria para la supervivencia y la función de múltiples neuronas del sistema nervioso central y periféricas. Una variante del gen de neurotrofina 3 se asocia a formas graves de esquizofrenia y la proneurotrofina 3 (pro-NT3) induce a la muerte celular simpática.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y las neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas). Dichos anticuerpos pueden ser beneficiosos para prevenir, reducir el riesgo o tratar afecciones y/o enfermedades asociadas a la reducción de niveles de expresión y/o actividad de neurotrofina, muerte celular (por ejemplo, muerte celular neuronal), demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, lesión cerebral por traumatismo, lesión de la médula espinal, depresión prolongada, enfermedades vasculares ateroescleróticas, síntomas no deseados del envejecimiento normal, demencia, demencia mixta, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia normotensiva, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, tauopatía, accidente cerebrovascular, traumatismo grave, traumatismo crónico, lupus, colitis aguda y crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, malaria, temblor hereditario, lupus del sistema nervioso central, enfermedad de Behcet, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia de sistemas múltiples, degeneración de discos intervertebrales, síndrome de Shy-Drager, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar basal cortical, encefalomielitis diseminada aguda, trastornos granulomatosos, sarcoidosis, enfermedades vinculadas al envejecimiento, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración de la retina , infección de las vías respiratorias, sepsis, infección ocular, infección sistémica, trastornos inflamatorios, artritis, esclerosis múltiple, trastorno metabólico, obesidad, resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, daño vascular o tisular, una lesión y/o uno o más síntomas no deseados del envejecimiento normal. Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre sortilina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas) también pueden prevenir la muerte celular (por ejemplo, apoptosis) inducida por proneurotrofinas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y una neurotrofina de la presente divulgación, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y una neurotrofina de la presente divulgación, se unen a uno o más aminoácidos de residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Neurotensina
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con neurotensina en la estructura de hélice beta de la sortilina, y se ha demostrado un contacto importante en el residuo de serina 283 de la sortilina humana (por ejemplo, Quistgaard, EM, et al. (2009) Nature Structural and Molecular Biology, 16 p96-98). También se ha demostrado que este residuo es importante para la unión a la progranulina. El sitio de unión a la neurotensina se encuentra en el túnel ubicado centralmente de la estructura de hélice beta de la sortilina, mientras que el dominio de la proneurotrofina se encuentra en la superficie de la estructura de hélice beta. La neurotensina inhibe parcialmente la unión de la proneurotrofina con la sortilina, ya que las regiones de unión no se encuentran muy separadas entre sí.
La neurotensina es un neuropéptido de 13 aminoácidos que está implicado en la regulación de la hormona luteinizante y la liberación de prolactina. Se ha demostrado que la neurotensina presenta interacción significativa con el sistema dopaminérgico. La neurotensina se sintetiza como parte de una proteína precursora de 169-170 aminoácidos que también contiene la neuromedina neuropeptídica N relacionada. Los dominios que codifican el péptido se encuentran en tándem cerca del extremo carboxilo del precursor y se unen y se separan por sitios de procesamiento de aminoácidos básicos en pares (lisina-arginina). La neurotensina comparte similitud de secuencia significativa en sus 6 residuos de aminoácidos en el extremo C con otros varios neuropéptidos, los que incluyen neuromedina N. Esta región del extremo C es responsable de la actividad biológica completa, al tiempo que la parte del extremo N cumple una función moduladora. En el sistema nervioso central, la neurotensina tiene cumple doble función de neuromodulador de transmisión de dopamina y secreción de hormona pituitaria anterior. También muestra efectos hipotérmicos y analgésicos potentes en el cerebro. La neurotensina también ha estado implicada en la patofisiología de la esquizofrenia, enfermedades de Huntington y Parkinson. También se ha demostrado que la neurotensina proporciona neuroprotección en modelos experimentales de isquemia cerebral.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y la neurotensina. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas a la reducción de niveles de expresión y/o actividad de neurotensina, muerte celular (por ejemplo, muerte celular neuronal), demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, una lesión cerebral por traumatismo, una lesión de médula espinal, depresión prolongada, enfermedades vasculares ateroscleróticas y/o síntomas no deseables del envejecimiento normal.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la neurotensina, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre sortilina y una neurotensina, se une a uno o más aminoácidos de residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (p75)
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con el receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGF) (p75) en el dominio 10CC de la sortilina o con el bucle hidrófobo del dominio Vps10p de la sortilina. Como se desvela en el presente documento, las proteínas sortilina de la presente divulgación pueden funcionar como un correceptor con p75 para las proneurotrofinas, lo que induce la señalización apoptótica.
El receptor del NGF de baja afinidad se conoce de diversas formas, tales como p75, receptor de neurotrofina p75, receptor de NGF p75, p75NTR, LNGFR, NGFR, CD271, Gp80-LNGFR y TNFRSF16 y p75NTR. P75 es uno de los dos tipos de receptor para neurotrofinas de la presente divulgación. Se ha demostrado que P75 se une a neurotrofinas y funciona como un “ inmersor” para las neurotrofinas. Sin embargo, también se ha demostrado que, en ausencia de un TrkA coexpresado (el otro tipo de receptor para las neurotrofinas), p75 puede inducir la muerte celular (por ejemplo, apoptosis) en las células. Como tal y sin desear limitarse a la teoría, se cree que el bloqueo de la interacción entre la sortilina y p75 reduce la producción de una señal de muerte celular dependiente de la muerte celular inmunogénica de p75.
Por tanto, la inhibición de la interacción (por ejemplo, unión) de la sortilina con p75, reduciría la concentración eficaz de proneurotrofinas y, por tanto, la muerte celular neuronal resultante.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y p75. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas a la reducción de niveles de expresión y/o actividad de p75, muerte celular (por ejemplo, muerte celular neuronal), demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, una lesión cerebral por traumatismo, una lesión de médula espinal, depresión prolongada, enfermedades vasculares ateroscleróticas y/o síntomas no deseables del envejecimiento normal. Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y p75 también reducirían las concentraciones eficaces de proneurotrofinas necesarias para la señalización apoptótica mediante p75, reducirían la internalización de p75, o fragmentos de estos, destinados a los endosomas, reducirían la producción de una señal de muerte celular dependiente de la muerte celular inmunogénica de p75 en las células y prevendría la muerte celular (por ejemplo, apoptosis) inducida por p75.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y p75, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233-243, 237­ 247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391,429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233-243, 237­ 247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y p75, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Proteína precursora de amiloide (APP)
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con proteínas precursoras de amiloide (APP, siglas del inglés). Como se desvela en el presente documento, las proteínas sortilina de la presente divulgación pueden funcionar para cambiar la localización subcelular de las APP y aumentar su procesamiento hasta los péptidos beta A y fragmentos intracelulares que se asocian a la enfermedad de Alzheimer.
La proteína precursora de amiloide (APP) es una proteína de membrana integral expresada en muchos tejidos y concentrada en la sinapsis de las neuronas. Se desconoce su función primaria, aunque se ha implicado como reguladora de formación de sinapsis, plasticidad neuronal y exportación de hierro. La APP se conoce mejor como la molécula precursora cuya proteólisis genera amiloide beta (Ap), un péptido de 37 a 49 aminoácidos cuya forma fibrilar amiloide es el componente primario de las placas amiloides que se encuentran en los cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer.
Por lo tanto, la inhibición de la interacción (por ejemplo, unión) de la sortilina con la APP aumentaría la concentración eficaz de las proneurotrofinas. Además, el bloqueo de la interacción entre la sortilina y la APP produciría la reducción de la internalización endosomal de APP y su procesamiento hasta el péptido beta A.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y la APP. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción del riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas a niveles anómalos o procesamiento de la expresión y/o la actividad de APP, muerte celular (por ejemplo, muerte celular neuronal), demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, una lesión cerebral por traumatismo, una lesión de médula espinal, depresión prolongada, enfermedades vasculares ateroscleróticas y/o síntomas no deseables del envejecimiento normal.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la a Pp , se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131­ 138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la APP, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Lipoproteína lipasa
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con la lipoproteína lipasa (LpL). Como se desvela en el presente documento, las proteínas sortilina de la presente divulgación se unen a LpL y modifican su degradación.
La lipoproteína lipasa es una enzima secretada que presenta actividad EC 3.1.1.34. La lipoproteína lipasa es un miembro de la familia del gen lipasa, que incluye la lipasa pancreática, lipasa hepática y lipasa endotelial. Una enzima soluble en agua hidroliza triglicéridos en lipoproteínas, como los que se encuentran en quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, siglas del inglés) en dos ácidos grasos libres y una molécula de monoacilglicerol. La lipoproteína lipasa también está involucrada en la promoción de la absorción celular de restos de quilomicrones, lipoproteínas ricas en colesterol y ácidos grasos libres. La lipoproteína lipasa está unida a la superficie interior de las células endoteliales de los capilares, y se distribuye más ampliamente en el tejido adiposo, cardíaco y del músculo esquelético. La lipoproteína lipasa se secreta de células parenquimáticas como un homodímero glicosilado, y después se trasloca a través de la matriz extracelular y las células endoteliales hasta el interior capilar.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y la lipoproteína lipasa. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción de riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas a la reducción de los niveles de expresión y/o actividad de la lipoproteína lipasa, demencia vascular y/o enfermedades vasculares ateroscleróticas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la lipoproteína lipasa, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221,233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391,429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre sortilina y lipoproteína lipasa, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Apolipoproteína AV
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con la apolipoproteína AV (APOA5). Como se desvela en el presente documento, las proteínas sortilina de la presente divulgación se unen a APOA5 y modifican su degradación.
La apolipoproteína AV se conoce como apolipoproteína A-V, APOA5, APOAV y RAP3. La apolipoproteína AV es un regulador importante de los niveles de triglicéridos en plasma, lo cual es un gran factor de riesgo para las enfermedades vasculares ateroscleróticas, tal como la arteriopatía coronaria. Es un componente de varias fracciones de lipoproteína que incluye VLDL, HDL y quilomicrones. La apolipoproteína AV puede influir sobre el metabolismo de las lipoproteínas al interactuar con los receptores de la familia del gen LDL-R.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y la apolipoproteína AV. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción de riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas a niveles anómalos de expresión y/o actividad de la apolipoproteína AV, demencia vascular y/o enfermedades vasculares ateroscleróticas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la apolipoproteína AV, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221,233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391,429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre sortilina y apolipoproteína AV, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Apolipoproteína E
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con la apolipoproteína E (APOE2, APOE3, APOE4). Como se desvela en el presente documento, las proteínas sortilina de la presente divulgación se unen y modifican la degradación y el transporte de APOE, así como también los agentes que traslada APOE, tal como el péptido beta A.
La apolipoproteína E (APOE) es una clase de apolipoproteína que se encuentra en quilomicrones y en lipoproteínas de densidad intermedia (IDL, siglas del inglés) y es esencial para el catabolismo normal de constituyentes de lipoproteína rica en triglicéridos. En tejidos periféricos, el hígado y los macrófagos producen principalmente APOE y esta actúa como un mediador en el metabolismo del colesterol de manera dependiente de la isoforma. En el sistema nervioso central, la APOE se produce principalmente en los astrocitos y transporta colesterol a las neuronas a través de los receptores de ApoE, los cuales son miembros de la familia del gen receptor de lipoproteína de baja densidad. Las variantes de APOE se asocian con un mayor riesgo de enfermedad de Alzheimer y con trastornos cardiovasculares, así como también con daños en la barrera hematoencefálica. También se demostró que APOE transporta el péptido beta A las neuronas a través del receptor de sortilina.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y la apolipoproteína E. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para prevenir, reducir el riesgo o tratar afecciones y/o enfermedades asociadas a niveles anómalos de expresión y/o actividad de la apolipoproteína E, demencia vascular y/o enfermedades vasculares ateroscleróticas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la apolipoproteína E, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221,233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391,429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la apolipoproteína E, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Proteína asociada al receptor
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se unen) con la proteína asociada al receptor (RAP, siglas del inglés).
La proteína asociada al receptor se conoce como RAP, proteína asociada a la proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad 1, LRPAP1, A2MRAP, A2RAP, HBP44 y MRAP. La proteína asociada al receptor es una proteína chaperona involucrada en el tránsito de ciertos miembros de la familia del receptor de LDL, los que incluyen, de modo no taxativo, LRP1 y LRP2. La proteína asociada al receptor es una glicoproteína que se une al receptor de alfa-2-macroglobulina, así como también a otros miembros de la familia del receptor de lipoproteína de baja densidad. Actúa inhibiendo la unión de todos los ligandos conocidos de dichos receptores, y puede impedir la agregación y degradación del receptor en el retículo endoplasmático, de forma que actúa como una chaperona molecular. La proteína asociada al receptor también puede estar bajo el control regulador de calmodulina.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción la entre sortilina y la RAP. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción de riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas a la reducción de los niveles de expresión y/o actividad de RAP, demencia vascular y/o enfermedades vasculares ateroscleróticas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la rAp , se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131­ 138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la RAP, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
PCSK9
Se ha demostrado que las proteínas sortilina de la presente divulgación interactúan (por ejemplo, se une) con la proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) y la secretan en la circulación.
PCSK9 es un miembro de la subfamilia de la proteinasa K de proteasas secretoras. PCSK9 cumple una función reguladora importante en la homeostasis del colesterol. Se une al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), de forma que induce la degradación del LDLR y una reducción de la capacidad del LDLR para eliminar colesterol, lo que puede llevar a hipercolesterolemia.
Por consiguiente, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación también pueden inhibir (por ejemplo, bloquear) la interacción entre la sortilina y la PCSK9 y la secreción de la PCSK9. Dichos anticuerpos serían beneficiosos para la prevención, reducción de riesgo o tratamiento de afecciones y/o enfermedades asociadas al aumento de los niveles de expresión y/o actividad de PCSK9, demencia vascular y/o enfermedades vasculares ateroscleróticas.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la PCSK9, se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131­ 138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, y/o 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o entre los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231,207-227, 212-221,233­ 243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632 y/o 740-749 de la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben (por ejemplo, bloquean) la interacción entre la sortilina y la PCSK9, se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos de una sortilina de mamífero que corresponde a uno o más de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1.
Anticuerpos anti sortilina
Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación pueden inhibir una o más actividades de una proteína sortilina, incluyendo, de modo no taxativo, aumentar los niveles de progranulina (por ejemplo, niveles extracelulares de progranulina y/o niveles celulares de progranulina), reducir los niveles celulares de sortilina (por ejemplo, niveles de superficie celular de sortilina, niveles intracelulares de sortilina y/o niveles totales de sortilina), inhibir la interacción (por ejemplo, la unión) con progranulina y/o inhibir la interacción (por ejemplo, la unión) con uno o más de proneurotrofinas de la presente divulgación (proneurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, pro-NGF, pro-BDNF, etc.), neurotrofinas de la presente divulgación (neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, NGF, BDNF, etc.), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora de amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE) y proteína asociada al receptor (RAP), reducir la secreción de PCSK9, reducir la producción de péptido amiloide beta.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación aumentan los niveles extracelulares de progranulina y/o los niveles celulares de progranulina in vitro o in vivo (por ejemplo, en el cerebro, la sangre y/u órganos periféricos de un individuo). Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti sortilina aumenta los niveles extracelulares de progranulina si induce un aumento de 20 % o más en los niveles extracelulares de progranulina tal como se mide mediante cualquiera de los ensayos basados en células o ensayos basados en tejidos (tal como basado en tejido cerebral) in vitro que se describen en la presente o se conocen en la técnica. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti sortilina aumenta los niveles celulares de progranulina si induce un aumento de 20 % o más en los niveles celulares de progranulina tal como se mide mediante cualquiera de los ensayos basados en células o ensayos basados en tejidos (tal como basado en tejido cerebral) in vitro que se describen en la presente o se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación reducen los niveles celulares de sortilina in vitro o in vivo (por ejemplo, en el cerebro y/o los órganos periféricos de un individuo). En algunas realizaciones, una reducción en los niveles celulares de sortilina comprende una reducción en los niveles de superficie celular de sortilina. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti sortilina reduce los niveles de superficie celular de sortilina si induce una reducción de 20 % o más en los niveles de superficie celular de sortilina tal como se midió mediante cualquiera de los ensayos basados en células in vitro o modelo in vivo adecuado descritos en la presente o conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una reducción en los niveles celulares de sortilina comprende una reducción en los niveles intracelulares de sortilina. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti sortilina reduce los niveles intracelulares de sortilina si induce una reducción de 20 % o más en los niveles intracelulares de sortilina tal como se midió mediante cualquiera de los ensayos basados en células in vitro o modelo in vivo adecuado descritos en la presente o conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, una reducción en los niveles celulares de sortilina comprende una reducción en los niveles totales de sortilina. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti sortilina reduce los niveles totales de sortilina si induce una reducción de 20 % o más en los niveles totales de sortilina tal como se midió mediante cualquiera de los ensayos basados en células in vitro o modelo in vivo adecuado descritos en la presente o conocidos en la técnica.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación aumentan los niveles de progranulina y/o reducen los niveles celulares de sortilina sin inhibir la interacción (por ejemplo, la unión) entre sortilina y progranulina. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación no inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre sortilina y progranulina. Tal como se utiliza en el presente documento, un anticuerpo anti sortilina no inhibe la interacción (por ejemplo, unión) entre sortilina y progranulina si reduce la unión de progranulina a sortilina en 20 % o menos a concentraciones de anticuerpo de saturación (por ejemplo, 67 nM) cualquier ensayo in vitro o ensayo de cultivo basado en células descritos en la presente o conocidos en la técnica.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación pueden reducir los niveles celulares de sortilina (por ejemplo, niveles de superficie celular de sortilina, niveles intracelulares de sortilina y/o niveles totales de sortilina) al inducir la degradación de sortilina. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación inducen la degradación de sortilina.
Tal como se utiliza en el presente documento, los niveles de progranulina pueden hacer referencia a los niveles de expresión de genes que codifican progranulina; niveles de expresión de una o más transcripciones que codifican progranulina; niveles de expresión de proteína progranulina y/o la cantidad de proteína progranulina secretada de células y/o presente en las células. Tal como se utiliza en el presente documento, los niveles de sortilina pueden hacer referencia a los niveles de expresión de genes que codifican la sortilina; niveles de expresión de una o más transcripciones que codifican la sortilina; niveles de expresión de proteína sortilina y/o la cantidad de proteína sortilina presente en células y/o en la superficie celular. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para medir los niveles de expresión génica, transcripción, traducción y/o abundancia o localización de proteínas para determinar los niveles de progranulina y sortilina.
De manera adicional, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se pueden utilizar para prevenir, reducir el riesgo o tratar la muerte celular (por ejemplo, la muerte celular neuronal), demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, lesión cerebral por traumatismo, lesión de la médula espinal, depresión prolongada, enfermedades vasculares ateroescleróticas, síntomas no deseados del envejecimiento normal, demencia, demencia mixta, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, hidrocefalia normotensiva, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, tauopatía, accidente cerebrovascular, traumatismo grave, traumatismo crónico, lupus, colitis aguda y crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, malaria, temblor hereditario, lupus del sistema nervioso central, enfermedad de Behcet, enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy, atrofia de sistemas múltiples, degeneración de discos intervertebrales, síndrome de Shy-Drager, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar basal cortical, encefalomielitis diseminada aguda, trastornos granulomatosos, sarcoidosis, enfermedades vinculadas al envejecimiento, degeneración macular relacionada con la edad, glaucoma, retinitis pigmentosa, degeneración de la retina , infección de las vías respiratorias, sepsis, infección ocular, infección sistémica, trastornos inflamatorios, artritis, esclerosis múltiple, trastorno metabólico, obesidad, resistencia a la insulina, diabetes tipo 2, daño vascular o tisular, una lesión y/o uno o más síntomas no deseados del envejecimiento normal. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación son anticuerpos monoclonales.
Determinados aspectos de la presente divulgación proporcionan anticuerpos anti sortilina que se unen a un epítopo de sortilina discontinuo. En algunas realizaciones, el epítopo de sortilina discontinuo comprende dos péptidos o más, tres péptidos o más, cuatro péptidos o más, cinco péptidos o más, seis péptidos o más, siete péptidos o más, ocho péptidos o más, nueve péptidos o más, o 10 péptidos o más. En algunas realizaciones, cada uno de los péptidos comprende cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más, 25 o más, 26 o más, 27 o más, 28 o más, 29 o más, o 30 o más residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; o cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o más, 20 o más, 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más, 25 o más, 26 o más, 27 o más, 28 o más, 29 o más, o 30 o más residuos de aminoácidos en una proteína sortilina de mamífero correspondientes a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan anticuerpos anti sortilina que se unen a un epítopo conformacional de sortilina.
Determinados aspectos de la presente divulgación proporcionan anticuerpos anti sortilina que se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 131-138 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 131-138 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 175-181 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1, o en residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 175-181 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 207-231 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1, o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 207-231 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 207-227 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 207-227 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 207-227 y 237­ 260 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 207-227 y 237-260 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 212-221 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 212-221 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 233-243 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 233-243 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 237-247 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 237-247 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 237-247 y 314-338 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 237-247 y 314-338 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 237­ 260 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 237-260 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 237-260 y 297-317 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 237-260 y 297-317 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 297-317 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 297-317 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 314-338 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 314-338 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 367-391 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 367-391 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 429-443 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 429-443 de la SEQ ID NO: 1; uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 623-632 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 623-632 de la SEQ ID NO: 1 y/o uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 740-749 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 740-749 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 190-220 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 190-220 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 199­ 220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207 y/o 203-207 de sortilina humana; o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponden a los residuos de aminoácidos 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200­ 207 y/o 203-207 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o de los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1. Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan anticuerpos anti sortilina que se unen a un epítopo que tiene residuos de aminoácidos (S/T)-X-(D/N)-X-X-X-X-(W/F/Y), en donde X representa cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 4).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación aumentan los niveles extracelulares de progranulina, aumentan los niveles celulares de progranulina y/o reducen los niveles de sortilina en la superficie celular. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina e inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina y aumentan los niveles celulares de progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles celulares de progranulina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción entre sortilina y progranulina, y aumentan los niveles celulares de progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles de progranulina in vivo. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles de progranulina in vivo sin reducir los niveles celulares de sortilina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles de progranulina en el cerebro. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles celulares de progranulina en la sangre. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles celulares de progranulina en uno o más órganos periféricos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina in vivo. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina en el cerebro. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina en uno o más órganos periféricos. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción entre sortilina y progranulina, y no reducen los niveles celulares de sortilina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles celulares de progranulina y no reducen los niveles celulares de sortilina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles extracelulares de progranulina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles extracelulares de progranulina e inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina e inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles celulares de progranulina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles celulares de progranulina e inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina, aumentan los niveles celulares de progranulina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina, inhiben la interacción entre sortilina y progranulina, y no aumentan los niveles celulares de progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles celulares de progranulina, inhiben la interacción entre sortilina y progranulina, y no aumentan los niveles extracelulares de progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan los niveles celulares de progranulina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina, inhiben la interacción entre sortilina y progranulina, y no reducen los niveles celulares de sortilina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina, no aumentan los niveles celulares de progranulina y no inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen los niveles celulares de sortilina, aumentan los niveles celulares de progranulina, aumentan los niveles extracelulares de progranulina e inhiben la interacción entre sortilina y progranulina. Se pueden medir niveles extracelulares de progranulina, niveles celulares de progranulina, niveles de superficie celular de sortilina o ambos, mediante cualquier ensayo basado en células conocido en la técnica y/o descrito en la presente. En determinadas realizaciones, se pueden medir los niveles extracelulares de progranulina, niveles de superficie celular de sortilina, o ambos, mediante el uso de un ensayo celular in vitro. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina también inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre sortilina y progranulina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina también inhiben el transporte y la secreción de PCSK9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina también inhiben la producción del péptido beta amiloide. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina también inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre sortilina y factor de crecimiento nervioso (pro-NGF). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina también inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre sortilina y una o más proteínas seleccionadas de una proneurotrofina, una neurotrofina, factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), proneurotrofina 3, neurotrofina 3, pro- neurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, neurotensina, neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora de amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE), PCSK9 y proteína asociada al receptor (RAP).
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan anticuerpos anti sortilina que se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 130-141 o 592-757 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o entre residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero correspondientes a los residuos de aminoácidos 130-141 o 592­ 757 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 610-666, 592-593 y/o 667-749 de sortilina humana o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponden a los residuos de aminoácidos 610-666, 592-593 y/o 667­ 749 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina se unen a uno o más aminoácidos entre los residuos de aminoácidos 130-141 de sortilina humana o entre los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponden a los residuos de aminoácidos 130-141 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina se unen a uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1) o de los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y una o más proteínas seleccionadas de progranulina, una proneurotrofina, una neurotrofina, proneurotrofina 3, neurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, factor de crecimiento nervioso (pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE), PCSK9 y proteína asociada al receptor (RAP) y/o variantes de origen natural. Preferentemente, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y p75.
Otros aspectos de la presente divulgación proporcionan anticuerpos anti sortilina que se unen a un epítopo con uno o más aminoácidos de los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de sortilina humana (SEQ ID NO: 1); o de los residuos de aminoácidos en una sortilina de mamífero que corresponde a los residuos de aminoácidos His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595 y/o Glu700 de la SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y una o más proteínas seleccionadas de progranulina, una proneurotrofina, una neurotrofina, proneurotrofina 3, neurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, factor de crecimiento nervioso (pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE), PCSK9 y proteína asociada al receptor (RAP). Preferentemente, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y progranulina. En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inducen una o más actividades de progranulina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina reducen la internalización endosomal de progranulina, o fragmentos de estos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina aumentan la concentración eficaz de progranulina.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y una neurotrofina de la presente divulgación, tal como una proneurotrofina, proneurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina 3, neurotrofina 4/5, NGF y BDNF. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y neurotensina. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y p75. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y un Sort-pro. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y APP. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la producción del péptido beta A. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben el transporte y la secreción de PCSK9. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y LpL. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y APOA5. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y APOE. En otras realizaciones, los anticuerpos anti sortilina inhiben la interacción (por ejemplo, la unión) entre una proteína sortilina de la presente divulgación y RAP.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a una proteína sortilina de la presente divulgación y/o a variantes de origen natural. En determinadas realizaciones preferidas, los anticuerpos anti sortilina se unen a sortilina humana.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a una proteína sortilina de la presente divulgación expresada en la superficie de la célula y los anticuerpos no conjugados inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre la proteína sortilina y progranulina, una proneurotrofina, una neurotrofina, proneurotrofina 3, neurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, factor de crecimiento nervioso (pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE), PCSK9 y proteína asociada al receptor (RAP).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que se unen a una proteína sortilina de la presente, inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre la proteína sortilina y progranulina, una proneurotrofina, una neurotrofina, proneurotrofina 3, neurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, factor de crecimiento nervioso (pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE), PCSK9 y proteína asociada al receptor (RAP) al reducir los niveles eficaces de sortilina disponible para interactuar con estas proteínas ya sea en la superficie celular o en el interior de la célula.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que se unen a una proteína sortilina de la presente, inhiben la interacción (por ejemplo, unión) entre la proteína sortilina y progranulina, una proneurotrofina, una neurotrofina, proneurotrofina 3, neurotrofina 3, proneurotrofina 4/5, neurotrofina 4/5, factor de crecimiento nervioso (pro-NGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor proneurotrófico derivado del cerebro (pro-BDNF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE), PCSK9 y proteína asociada al receptor (RAP) al inducir la degradación de sortilina.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación inhiben de forma competitiva la unión de al menos un anticuerpo seleccionado de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1-3 y 11-15. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación inhiben de forma competitiva la unión de al menos un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84yS-85. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación compite con uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos, para la unión a sortilina cuando el anticuerpo anti sortilina reduce la unión de uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, 5- 72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos para sortilina en una cantidad que varía de aproximadamente 50 % a 100 %, en comparación con la unión a sortilina en ausencia del anticuerpo anti sortilina. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación compite con uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6- 10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos, para la unión a sortilina cuando el anticuerpo anti sortilina reduce la unión de uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos para sortilina en al menos 50 %, al menos 55 %, en al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o 100 %, en comparación con la unión a sortilina en ausencia del anticuerpo anti sortilina. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación que reduce la unión de uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos para sortilina en 100% indica que el anticuerpo anti sortilina bloquea completamente la unión de uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, 5 - 15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6- 9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos para sortilina. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina y el uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, 5- 2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6- 12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos se encuentran presentes en una cantidad que corresponde a una relación 10:1, relación 9:1, relación 8:1, relación 7:1, relación 6:1, relación 5:1, relación 4:1, relación 3:1, relación 2:1, relación 1:1, relación 0.75:1, relación 0.5:1, relación 0.25:1, relación 0.1:1, relación 0.075:1, relación 0.050:1, relación 0.025:1, relación 0.01:1, relación 0.0075:1, relación 0.0050:1, relación 0.0025:1, relación 0.001:1, relación 0.00075:1, relación 0.00050:1, relación 0.00025:1, relación 0.0001:1, relación 1:10, relación 1:9, relación 1:8, relación 1:7, relación 1:6, relación 1:5, relación 1:4, relación 1:3, relación 1:2, relación 1:0.75, relación 1:0.5, relación 1:0.25, relación 1:0.1, relación 1:0.075, relación 1:0.050, relación 1:0.025, relación 1:0.01, relación 1:0.0075, relación 1:0.0050, relación 1:0.0025, relación 1:0.001, relación 1:0.00075, relación 1:0.00050, relación 1:0.00025 o relación 1:0.0001 de anticuerpo anti sortilina respecto a uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-228, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina se encuentra presente en exceso en una cantidad que varía de aproximadamente 1,5 veces a 100 veces, o más de 100 veces en comparación con la cantidad de los uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, 5- 68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina se encuentra presente en una cantidad que es un exceso de aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 35 veces, 40 veces, 45 veces, 50 veces, 55 veces, 60 veces, 65 veces, 70 veces, 75 veces, 80 veces, 85 veces, 90 veces, 95 veces o 100 veces en comparación con la cantidad de los uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-I, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6- 13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a un epítopo de sortilina humana que es igual o se superpone con el epítopo de sortilina al que se une al menos un anticuerpo seleccionado de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1-3 y 11-15. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a un epítopo de sortilina humana que es igual o se superpone con el epítopo de sortilina al que se une al menos un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-I I , S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen esencialmente al mismo epítopo de sortilina al que se une al menos un anticuerpo seleccionado de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1-3 y 11-15. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen al mismo epítopo de sortilina al que se une al menos un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, en Methods in Molecular Biology, vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), se proporcionan métodos ilustrativos detallados para mapear un epítopo al cual se une un anticuerpo.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-6, S-8, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-72, S-83 y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-5, S-45, S-64, S-65 y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-5, S-30, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9 y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-28, S-29, S-53, S-56, S-82 y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-3, S-4, S-6, S-7, S-9, S-10, S-11, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-23, S-26, S-27, S-31, S-32, S-38, S-46, S-48, S-51, S-52, S-54, S-55, S57, S-58, S-59, S-61, S-62, S-68, S-69, S-70, S-71, S-73, S-74, S-75, S-77, S-79, S-80, S-85 y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-5, S-12, S-24, S-25, S-30, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-47, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-72, S-76, S-78, S-81, S-83, S-84, y cualquier combinación de estos, por la unión a Sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-8, S-49, S-50 y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación compiten con uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, 5- 4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6- 12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina.
Cualquier ensayo de competición o ensayo de unión a sortilina adecuado y conocido en la técnica, tal como análisis BIAcore, ensayos ELISA o citometría de flujo, se puede utilizar para determinar si un anticuerpo anti sortilina compite con uno o más anticuerpos seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, S-85, y cualquier combinación de estos, por la unión a sortilina. En un ejemplo de ensayo de competición, se incuban sortilina inmovilizada o células que expresan sortilina en la superficie celular, en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a sortilina (por ejemplo, de primate no humano o de ser humano) y un segundo anticuerpo no marcado que se evalúa para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo por la unión a sortilina. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas. Como control, se incuban sortilina inmovilizada o células que expresan sortilina en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a sortilina, se elimina el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociada a la sortilina inmovilizada o a las células que expresan sortilina. Si la cantidad de marcador asociado a la sortilina inmovilizada o a células que expresan sortilina se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, ello indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por la unión a sortilina. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual c.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En algunas realizaciones, el ensayo de competición que se utiliza es uno o más de los ensayos de competición descritos en los Ejemplos 1, 3 o 4.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden (a) una región variable de cadena ligera que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1-3 y 11-15, o seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y/o (b) una región variable de cadena pesada que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-H1, HVR-H2, y HVR-H3 de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1- 3 y 11-15, o seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En algunas realizaciones, la HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 comprenden secuencias de CDR de EU o Kabat, CDR de Chothia o CDR de Contacttal como se muestra en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, 5- 2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6- 12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L1 mencionadas en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S-2- 1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L2 mencionadas en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L3 mencionadas en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85; (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H1 mencionadas en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, 5- 2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6- 1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85; (v) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H2 mencionadas en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H3 mencionadas en las Tablas 1-3 y 11-15, o de un anticuerpo seleccionado de S-1, S-2, 5- 2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6- 1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85.
En algunas realizaciones, anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende uno o más de: (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-16, 20-22, 24-25, 512, 584 y 585, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6-16, 20-22, 24-25, 512, 584 y 585, (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26-40 y 586 o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26-40 y 586, y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 y 121-125, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91,95, 97-101, 103-107, 109,111-116, 118 y 121-125, y/o en donde el dominio variable de cadena pesada comprende uno o más de: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145, 147-149, 482-492, 513-524, 567-570, 587 y 591-596, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126-127, 129­ 130, 133-140, 142, 144-145, 147-149, 482-492, 513-524, 567-570, 587 y 591-596, (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175, 177-178, 493-507, 525-539, 571-579, 588, and 597-603 o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175, 177-178, 493-507, 525-539, 571-579, 588 y 597-603, y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 179­ 186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249, 252-256 y 540-564, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249, 252-256 y 540-564.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden una región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1-3 y 11-15, o seleccionados de S-1, S-2, 5- 2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6- 1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85, y/o una región variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos mencionados en las Tablas 1-3 y 11-15, o seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprende una región variable de cadena ligera y/o un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 317-334, 337-338, 341-345, 348-357, 360-365, 368-372, 375-376, 379­ 380, 389-392, 395-402, 407-414, 421-422, 425-433, 436-444, 447-448, 451-461, 464-465, 470-479, 604-692.
Cualquiera de los anticuerpos de la presente divulgación se puede producir mediante una línea celular. En algunas realizaciones, la línea celular puede ser una línea celular de levadura. En otras realizaciones, la línea celular puede ser una línea celular de mamífero. En determinadas realizaciones, la línea celular puede ser una línea celular de hibridoma. Se puede utilizar cualquier línea celular conocida en la técnica adecuada para la producción de anticuerpos para producir un anticuerpo de la presente divulgación. En la presente divulgación se describen ejemplos de líneas celulares para la producción de anticuerpos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo monoclonal anti sortilina seleccionado de S-1, 5- 2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6- 12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En determinadas realizaciones, el anticuerpo de anti sortilina es un anticuerpo antagonista.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación inhiben de forma competitiva la unión de al menos un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a un epítopo de sortilina humana que es igual o se superpone al epítopo de sortilina unido por al menos un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen esencialmente al mismo epítopo de sortilina unido por al menos un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden (a) una región variable de cadena ligera que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 seleccionadas de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83, y/o (b) una región variable de cadena pesada que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 seleccionadas de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, las HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 comprenden las secuencias de CDR de EU o Kabat, CDR de Chothia o CDR de Contact de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L1 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L2 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L3 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83; (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H1 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83; (v) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H2 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83, y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H3 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden una región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos seleccionados de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83, y/o una región variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos seleccionados de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-83. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo monoclonal anti sortilina seleccionado de S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72 y S-835.
En algunas realizaciones, anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende uno o más de: (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 y 15, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 9-12, 14 y 15, (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 y 32, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 27, 29, 30 y 32, y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 y 123, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 y 123, y/o en donde el dominio variable de cadena pesada comprende uno o más de: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 y 148, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126, 127, 136, 140, 142, 145 y 148, (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 y 175, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 y 175, y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 182, 183, 1 8 5 , 219, 223, 233, 236, 237, 244 y 254, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 y 254.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación inhiben de forma competitiva la unión de al menos un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a un epítopo de sortilina humana que es igual o se superpone al epítopo de sortilina unido por al menos un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen esencialmente al mismo epítopo sortilina unido por al menos un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden (a) una región variable de cadena ligera que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 seleccionadas de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8; y/o (b) una región variable de cadena pesada que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 seleccionadas de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, 5- 20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, las HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 comprenden las secuencias de CDR de EU o Kabat, CDR de Chothia o CDR de Contact de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6- 13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L1 de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias HVR-L2 de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, 5- 2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6- 11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias HVR-L3 de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8; (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias HVR-H1 de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8; (v) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias HVR-H2 de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8, y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias HVR-H3 de un anticuerpo seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden una región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos seleccionadas de S-2, 5- 2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6- 7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8; y/o una región variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos seleccionados de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-1011, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, 5 - 15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo monoclonal anti sortilina seleccionado de S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6- 4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7 y S-82-8.
En algunas realizaciones, anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende uno o más de: (a) una HVR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-10, 13 y 14, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7-10, 13 y 14, (b) una HVR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 26-31 y 33-35, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26-31 y 33-35, y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61,62, 69, 91, 97, 101 y 122, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 y 122, y/o en donde el dominio variable de cadena pesada comprende uno o más de: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 y 147, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126, 129, 130, 135, 140, 142 y 147, (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 150, 155-158, 162, 166, 169 y 173, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 150, 155-158, 162, 166, 169 y 173, y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 y 253, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 y 253.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación inhiben de forma competitiva la unión de al menos un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen a un epítopo de sortilina humana que es igual o se superpone al epítopo de sortilina unido por al menos un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación se unen esencialmente al mismo epítopo de sortilina unido por al menos un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden (a) una región variable de cadena ligera que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3 seleccionadas de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9, y/o (b) una región variable de cadena pesada que comprende al menos una, dos o tres HVR seleccionadas de HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 seleccionadas de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En algunas realizaciones, las HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3 comprenden las secuencias de CDR de EU o Kabat, CDR de Chothia o CDR de Contact de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9.. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR seleccionadas de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L1 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L2 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-L3 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (iv) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H1 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9; (v) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H2 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9, y (vi) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de HVR-H3 de un anticuerpo seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden una región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos seleccionados de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9, y/o una región variable de cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos seleccionados de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina es un anticuerpo monoclonal anti sortilina seleccionado de S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 y S-60-9.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación comprenden un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en donde el dominio variable de cadena ligera comprende uno o más de: (a) una HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, (b) una HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 0, y (c) una HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45, 70 y 100, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 45, 70 y 100, y/o en donde el dominio variable de cadena pesada comprende uno o más de: (a) una HVR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126, 136 y 142, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 126, 136 y 142, (b) una HVR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151,163 y 170, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95% de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 151, 163 y 170, y (c) una HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 182, 204 y 233, o una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 95 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 182, 204 y 233.
Las constantes de disociación (Kd) de los anticuerpos anti sortilina de la sortilina humana, sortilina de ratón o ambas, pueden ser menores de 100 nM, menores de 90 nM, menores de 80 nM, menores de 70 nM, menores de 60 nM, menores de 50 nM, menores de 40 nM, menores de 30 nM, menores de 20 nM, menores de 10 nM, menores de 9 nM, menores de 8 nM, menores de 7 nM, menores de 6 nM, menores de 5 nM, menos de 4 nM, menos de 3 nM, menos de 2 nM, menos de 1 nM, menos de 0.5 nM, menos de 0,1 nM, menos de 0,09 nM, menores de 0,08 nM, menores de 0,07 nM, menores de 0,06 nM, menores de 0,05 nM, menores de 0,04 nM, menores de 0,03 nM, menores de 0,02 nM, menores de 0,01 nM, menores de 0,009 nM, menores de 0,008 nM, menores de 0,007 nM, menores de 0,006 nM, menores de 0,005 nM, menores de 0,004 nM, menores de 0,003 nM, menores de 0,002 nM, menores de 0,001 nM o menores de 0,001 nM. En algunas realizaciones, el anticuerpo tiene una constante de disociación (Kd) para sortilina humana, sortilina de ratón, o ambas, que varía de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 0,005 nM o menor de 0,005 nM. Preferentemente, la constante de disociación es menor de 50 nM. En algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) se mide a 4 °C o a temperatura ambiente, utilizando, por ejemplo, un ensayo de unión celular, un ensayo ForteBio o un ensayo MSD-SET, como se describe en el presente documento (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 1 y 23).
Las constantes de disociación (Kd) de los anticuerpos anti sortilina para la sortilina humana y la sortilina de ratón puede ser menores de 71 nM, menores de 70,9 nM, menores de 70,8 nM, menores de 70,7 nM, menores de 70,6 nM, menores de 70,5 nM, menores de 70,4 nM, menores de 70,3 nM, menores de 70,2 nM, menores de 70,1 nM, menores de 70 nM, menores de 60 nM, menores de 50 nM, menores de 40 nM, menores de 30,5 nM, menores de 30 nM, menores de 29,9 nM, menores de 29,8 nM, menores de 29,7 nM, menores de 29,6 nM, menores de 29,5 nM, menores de 29,4 nM, menores de 29,3 nM, menores de 29,2 nM, menores de 29,1 nM, menores de 29 nM, menores de 28,5 nM, menores de 28 nM, menores de 27,5 nM, menores de 27 nM, menores de 26,5 nM, menores de 26 nM, menores de 25.5 nM, menores de 25 nM, menores de 24,5 nM, menores de 24 nM, menores de 23,5 nM, menores de 23 nM, menores de 22,5 nM, menores de 22 nM, menores de 21,5 nM, menores de 21 nM, menores de 20,5 nM, menores de 20 nM, menores de 19,5 nM, menores de 19 nM, menores de 18,9 nM, menores de 18,8 nM, menores de 18,7 nM, menores de 18,6 nM, menores de 18,5 nM, menores de 18,4 nM, menores de 18,3 nM, menores de 18,2 nM, menores de 18,1 nM, menores de 18 nM, menores de 17,5 nM, menores de 17 nM, menores de 16,5 nM, menores de 16 nM, menores de 15,5 nM, menores de 15 nM, menores de 14,5 nM, menores de 14 nM, menores de 13,5 nM, menores de 13 nM, menores de 12,5 nM, menores de 12 nM, menores de 11,5 nM, menores de 11 nM, menores de 10,5 nM, menores de 10 nM, menores de 9,5 nM, menores de 9 nM, menores de 8,5 nM, menores de 8 nM, menores de 7,5 nM, menores de 7 nM, menores de 6,9 nM, menores de 6,8 nM, menores de 6,7 nM, menores de 6,6 nM, menores de 6.5 nM, menores de 6,4 nM, menores de 6,3 nM, menores de 6,2 nM, menores de 6,1 nM, menores de 6 nM, menores de 5,5 nM, menores de 5 nM, menores de 4,5 nM, menores de 4 nM, menores de 3,5 nM, menores de 3 nM, menores de 2,5 nM, menores de 2 nM, menores de 1,5 nM, menores de 1 nM, menores de 0,95 nM, menores de 0,9 nM, menores de 0,89 nM, menores de 0,88 nM, menores de 0,87 nM, menores de 0,86 nM, menores de 0,85 nM, menores de 0,84 nM, menores de 0,83 nM, menores de 0,82 nM, menores de 0,81 nM, menores de 0,8 nM, menores de 0,75 nM, menores de 0,7 nM, menores de 0,65 nM, menores de 0,64 nM, menores de 0,63 nM, menores de 0,62 nM, menores de 0,61 nM, menores de 0,6 nM, menores de 0,55 nM, menores de 0,5 nM, menores de 0,45 nM, menores de 0,4 nM, menores de 0,35 nM, menores de 0,3 nM, menores de 0,29 nM, menores de 0,28 nM, menores de 0,27 nM, menores de 0,26 nM, menores de 0,25 nM, menores de 0,24 nM, menores de 0,23 nM, menores de 0,22 nM, menores de 0,21 nM, menores de 0,2 nM, menores de 0,15 nM, menores de 0,1 nM, menores de 0,09 nM, menores de 0,08 nM, menores de 0,07 nM, menores de 0,06 nM, menores de 0,05 nM, menores de 0,04 nM, menores de 0,03 nM, menores de 0,02 nM, menores de 0,01 nM, menores de 0,009 nM, menores de 0,008 nM, menores de 0,007 nM, menores de 0,006 nM, menores de 0,005 nM, menores de 0,004 nM, menores de 0,003 nM, menores de 0,002 nM o menores de 0,001 nM. En algunas realizaciones, las constantes de disociación de los anticuerpos anti sortilina para las proteínas sortilina humanas varían de menos de aproximadamente 70,4 nM a menos de aproximadamente 0,29 nM o de menos de aproximadamente 18,7 nM a menos de aproximadamente 0,89 nM. En algunas realizaciones, las constantes de disociación de los anticuerpos anti sortilina para las proteínas sortilina humanas varían de aproximadamente 70,4 nM a aproximadamente 0,005 nM o menos de 0,005 nM. En algunas realizaciones, las constantes de disociación de los anticuerpos anti sortilina para las proteínas sortilina de ratón varían de menos de aproximadamente 40,3 nM a menos de aproximadamente 0,61 nM o de menos de aproximadamente 29,6 nM a menos de aproximadamente 0,61 nM. En algunas realizaciones, las constantes de disociación de los anticuerpos anti sortilina para las proteínas sortilina de ratón varían de aproximadamente 40,3 nM a aproximadamente 0,07 nM o menos de 0,07 nM. En algunas realizaciones, las constantes de disociación de los anticuerpos anti sortilina para las proteínas sortilina tanto humanas como de ratón varían de menos de aproximadamente 70,4 nM a menos de aproximadamente 0,29 nM o de menos de aproximadamente 29,6 nM a menos de aproximadamente 0,61 nM. Las constantes de disociación se pueden determinar mediante una técnica analítica, que incluye cualquier técnica bioquímica o biofísica, tal como ELISA, resonancia de plasmón superficial (SPR), interferometría de biocapa (véase, por ejemplo, Octet System de ForteBio), Meso Scale Discover (véase, por ejemplo, MSD-SET), calorimetría de titulación isotérmica (ITC), calorimetría de barrido diferencial (DSC), dicroísmo circular (CD), análisis de flujo detenido y análisis de fusión de proteínas fluorescentes o colorimétricas; o un ensayo de unión celular. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la constante de disociación (Kd) se mide a 4 °C o a temperatura ambiente, utilizando, por ejemplo, un ensayo de unión celular, un ensayo ForteBio o un ensayo MSD-SET, como se describe en el presente documento (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 1 y 23).
Se pueden identificar, analizar y/o caracterizar anticuerpos anti sortilina adicionales, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a una proteína sortilina de la presente divulgación, para determinar sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas mediante varios ensayos conocidos en la técnica.
Expresión reducida de mediadores proinflamatorios
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación pueden reducir la expresión de mediadores proinflamatorios después de la unión a una proteína sortilina expresada en una célula.
Tal como se utilizan en la presente, los mediadores proinflamatorios son proteínas involucradas ya sea forma directa o indirecta (por ejemplo, mediante vías de señalización proinflamatorias) en un mecanismo que induce, activa, promueve o reduce de otra forma una respuesta inflamatoria. Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para identificar y caracterizar mediadores proinflamatorios.
Ejemplos de mediadores proinflamatorios incluyen, de modo no taxativo, citocinas, tales como interferones tipo I y II, IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1p, TNF-a, IL-8, CRP, miembros de la familiar IL-20, IL-33, LIF, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18 y CRP. Ejemplos adicionales de mediadores proinflamatorios incluyen, de modo no taxativo, quimiocinas, tales como CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación pueden reducir la expresión funcional y/o la secreción de mediadores proinflamatorios, IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1p, TNF-a, CXCL1, CCl2, CCL3, CCL4 y CCL5. En determinadas realizaciones, la expresión reducida de mediadores proinflamatorios ocurre en macrófagos, células dendríticas, monocitos, osteoclastos, células de Langerhans de la piel, células de Kupffer, linfocitos T y/o células microgliales. La expresión reducida puede incluir, de modo no taxativo, una reducción en la expresión génica, una reducción en la expresión transcripcional o una reducción en la expresión proteica. Es posible utilizar cualquier método conocido en la técnica para determinar la expresión génica, transcripcional (por ejemplo, ARNm) y/o proteica. Por ejemplo, es posible emplear transferencia Northern para determinar niveles de expresión génica de mediadores proinflamatorios, emplear RT-PCR para determinar el nivel de transcripción de mediadores proinflamatorios y emplear transferencia Western para determinar los niveles proteicos de mediadores proinflamatorios.
Tal como se utiliza en el presente documento, se puede reducir la expresión de un mediador proinflamatorio si su expresión en una o más células de un sujeto tratado con un agente de sortilina, tal como un anticuerpo anti sortilina agonista de la presente divulgación, es mayor que la expresión del mismo mediador proinflamatorio expresado en una o más células de un sujeto correspondiente no tratado con el anticuerpo anti sortilina agonista. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación puede reducir la expresión de mediador proinflamatorio en una o más células de un sujeto, por ejemplo, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 100%, al menos 110%, al menos 115%, al menos 120%, al menos 125%, al menos 130%, al menos 135%, al menos 140%, al menos 145%, al menos 150%, al menos 160%, al menos 170%, al menos 180%, al menos 190% o al menos 200%, en comparación con la expresión de mediador proinflamatorio en una o más células de un sujeto correspondiente que no se trata con el anticuerpo anti sortilina. En otras realizaciones, el anticuerpo anti sortilina puede reducir la expresión de mediador proinflamatorio en una o más células de un sujeto, por ejemplo, al menos 1,5 veces, al menos 1,6 veces, al menos 1,7 veces, al menos 1,8 veces, al menos 1,9 veces, al menos 2,0 veces, al menos 2,1 veces, al menos 2,15 veces, al menos 2,2 veces, al menos 2,25 veces, al menos 2,3 veces, al menos 2,35 veces, al menos 2,4 veces, al menos 2,45 veces, al menos 2,5 veces, al menos 2,55 veces, al menos 3,0 veces, al menos 3,5 veces, al menos 4,0 veces, al menos 4,5 veces, al menos 5,0 veces, al menos 5,5 veces, al menos 6,0 veces, al menos 6,5 veces, al menos 7,0 veces, al menos 7,5 veces, al menos 8,0 veces, al menos 8,5 veces, al menos 9,0 veces, al menos 9,5 veces o al menos 10 veces, en comparación con la expresión de mediador proinflamatorio en una o más células de un sujeto correspondiente que no se trata con el anticuerpo anti sortilina.
Isotipos Fc de anticuerpo anti sortilina
En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgación incluyen anticuerpos antagonistas. En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen a la proteína sortilina pueden incluir anticuerpos antagonistas que se unen a sortilina e inhiben una o más actividades de sortilina, ya sea al impedir interacciones entre sortilina y uno o más de sus ligandos (por ejemplo, progranulina, proneurotrofinas, neurotrofinas, neurotensina, p75, propéptido de sortilina, APP, péptido beta A, LpL, APOA5, APOE y RAP). En algunas realizaciones, los anticuerpos antagonistas de la presente divulgación pueden tener un dominio Fc que no es capaz de unirse a receptores de Fc.
En la Tabla A indicada a continuación, se proporcionan ejemplos y modificaciones de isotipos Fc de anticuerpo antagonista y/o de bloqueo. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación tiene un isotipo Fc indicado en la Tabla A mostrada a continuación.
Tabla A: Ejemplos de isotipos Fc de anticuerpo anti sortilina
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En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina contiene una región constante de IgG1 de ratón. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina contiene una región constante de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la región constante de IgG1 humana incluye una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc contiene una o más modificaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc contiene una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, respecto a una región Fc de tipo silvestre del mismo isotipo). En algunas realizaciones, la o las sustituciones de aminoácidos se seleccionan de N297A, N297Q (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A, L234A, L235A (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), C226S, C229S (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238S (Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34:2204-2210), E233P, L234V (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238A, A327Q, A327G, P329A (Shields RL. et al., (2001) JBiolChem. 276(9):6591-604), K322A, L234F, L235E (Hezareh et al., (2001) J Virol 75, 12161-12168; Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallographica 64, 700-704), P331S (Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallographica 64, 700-704), T394D (Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406-417), A330L, M252Y, S254T y/o T256E, en cuyo caso la posición de aminoácido corresponde a la convención de numeración de Kabat o EU. En determinadas realizaciones, la región Fc también incluye una eliminación de aminoácido en una posición correspondiente a la glicina 236 de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG1 con una región constante de cadena pesada que contiene una sustitución de aminoácido C220S de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU.
En algunas realizaciones, la región Fc también contiene una o más sustituciones de aminoácidos adicionales seleccionadas de A330L, L234F, L235E y/o P331S de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG2. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina contiene una región constante de IgG2 humana. En algunas realizaciones, la región constante de IgG2 humana incluye una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc contiene una o más modificaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc contiene una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, respecto a una región Fc de tipo silvestre del mismo isotipo). En algunas realizaciones, la o las sustituciones de aminoácidos se seleccionan de P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, V309L, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T y/o T256E, en las que la posición de aminoácido es de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU (Vafa O. et al., (2014) Methods 65:114-126).
En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina tiene un isotipo IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti sortilina contiene una región constante de IgG4 humana. En algunas realizaciones, la región constante de IgG4 humana incluye una región Fc. En algunas realizaciones, la región Fc contiene una o más modificaciones. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc contiene una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, respecto a una región Fc de tipo silvestre del mismo isotipo). En algunas realizaciones, la o las sustituciones de aminoácidos se seleccionan de E233P, F234V, L235A, G237A, E318A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984), S228P, L234A/F234A, L236E, S241P, L248E (Reddy et al., (2000) J Immunol, 164:1925-1933; Angal et al., (1993) Mol Immunol. 30(1):105-8; US 8614299 B2; Vafa O. et al., (2014) Methods 65:114-126), T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A y/o N297Q, en las que la posición de aminoácido es de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU.
En algunas realizaciones, la región Fc también contiene una o más sustituciones de aminoácidos adicionales seleccionadas de M252Y, S254T y/o T256E, en las que la posición de aminoácido es de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU.
Mutaciones de IgG adicionales
En algunas realizaciones, una o más de las variantes de IgG1 descritas en el presente documento se pueden combinar con una mutación A330L (Lazar et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010) o una o más de mutaciones L234F, L235E y/o P331S (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167-20172), en las que la posición de aminoácido es de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU, para eliminar la activación de complemento. En algunas realizaciones, las variantes de IgG descritas en el presente documento se pueden combinar con una o más mutaciones para potenciar la semivida del anticuerpo anti sortilina en suero humano (por ejemplo, mutaciones M252Y, S254T, T256E de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU) (Dall’Acqua et al., (2006) J Biol Chem, 281:23514-23524; y Strohl et al., (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20:685-691).
En algunas realizaciones, una variante de IgG4 de la presente divulgación se puede combinar con una mutación de S228P de acuerdo con la convención de numeración de Kabat o EU (Angal et al., (1993) Mol Immunol, 30:105-108) y/o con una o más mutaciones descritas en Peters et al., (2012) J Biol Chem. 13; 287(29):24525-33) para potenciar la estabilización del anticuerpo.
Anticuerpos biespecíficos
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a anticuerpos biespecíficos que se unen a uno o más dominios en una proteína sortilina de la presente divulgación y un segundo antígeno. En la técnica se conocen métodos para generar anticuerpos biespecíficos y se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación se unen a uno o más residuos de aminoácidos de una proteína sortilina de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación reconocen un primer antígeno y un segundo antígeno. En algunas realizaciones, el primer antígeno es una proteína sortilina o una variante de origen natural de esta. En algunas realizaciones, el segundo antígeno también es una proteína sortilina o una variante de origen natural de esta. En algunas realizaciones, el segundo antígeno es un antígeno que facilita el transporte a través de la barrera hematoencenfálica (véase, por ejemplo, Gabathuler R., Neurobiol. Dis. 37 (2010) 48-57). Dicho segundo antígeno incluye, de modo no taxativo, un receptor de transferrina (TR), un receptor de insulina (HIR), un receptor del factor de crecimiento insulínico (IGFR), las proteínas 1 y 2 relacionadas con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LPR-1 y 2), un receptor de toxina diftérica, CRM197, un anticuerpo de dominio simple de llama, TMEM 30(A), un domino de transducción de proteína, TAT, Syn-B, penetratina, un péptido de poliarginina, un péptido angiopep tal como ANG1005 (véase, por ejemplo, Gabathuler, 2010), basigina, Glut1, CD98hc y otras proteínas de la superficie celular enriquecidas en células endoteliales de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, Daneman et al., PLoS One, 29 de octubre de 2010; 5(10):e13741).
Combinaciones de anticuerpos
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren al uso de dos o más anticuerpos anti sortilina que, cuando se utilizan en conjunto, presentan efectos aditivos o sinérgicos, en comparación con el uso de un anticuerpo anti sortilina simple correspondiente.
Fragmentos de anticuerpos
Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a fragmentos de anticuerpos que se unen a una proteína sortilina de la presente divulgación. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv o scFv. En algunas realizaciones, el fragmento de anticuerpo se utiliza en combinación con un segundo anticuerpo de sortilina y/o con uno o más anticuerpos que se unen de forma específica a una proteína que produce una enfermedad seleccionada de: beta amiloide o fragmentos de esta, Tau, IAPP, sinucleína alfa, TDP-43, proteína FUS, proteína de prion, PrPSc, huntingtina, calcitonina, superóxido dismutasa, ataxina, cuerpos de Lewy, factor natriurético auricular, polipéptido amiloide de islote, insulina, apolipoproteína AI, amiloide A en suero, medina, prolactina, transtirretina, lisozima, microglobulina beta 2, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadena ligera de inmunoglobulina AL, proteína S-IBM, productos de traducción no ATG asociados a la repetición (RAN), péptidos de repetición dipeptídica (DPR), péptidos de repetición de glicina-alanina (GA), péptidos de repetición de glicina-prolina (GP), péptidos de repetición de glicina-arginina (GR), péptidos de repetición de prolina-alanina (PA), péptidos de repetición de prolina-arginina (PR) y cualquier combinación de estos.
En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación pueden ser fragmentos funcionales que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo son versiones en miniatura de los anticuerpos anti sortilina o fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación que tienen el mismo epítopo del anticuerpo de longitud completa correspondiente, pero tienen peso molecular mucho menor. Dichos fragmentos de anticuerpo anti sortilina en miniatura pueden tener mejor capacidad de penetración cerebral y una semivida más corta, lo que resulta ventajoso para la obtención de imágenes y uso diagnóstico (véase, por ejemplo, Lütje S et al., Bioconjug Chem. 19 de febrero de 2014;25(2):335-41; Tavaré R et al., Proc Natl Acad Sci USA. 21 de enero de 2014;111(3):1108-13; y Wiehr S et al., Prostate. mayo de 2014; 74(7):743-55). Por consiguiente, en algunas realizaciones, los fragmentos de anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación tienen mejor penetración cerebral en comparación con sus anticuerpos de longitud completa correspondientes y/o tienen menor semivida en comparación con sus anticuerpos de longitud completa correspondientes.
Marcos de anticuerpos
Cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento incluye también un marco. En algunas realizaciones, el marco es un marco de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina) comprende las HVR como en cualquiera de las realizaciones anteriores y también comprende un marco humano aceptor, por ejemplo, un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. Los marcos de inmunoglobulina humana pueden ser parte del anticuerpo humano, o se puede humanizar un anticuerpo no humano reemplazando uno o más marcos endógenos con una o más regiones marco humanas. Las regiones marco humanas que se pueden usar para la humanización incluyen, de modo no taxativo, regiones marco que se seleccionan usando el método “de mejor ajuste” (véase, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)), regiones marco procedentes de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (véase, por ejemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)), regiones marco maduras humanas (con mutación somática) o regiones marco de línea germinal humana (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco procedentes del análisis de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem.
272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996)).
En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3 de la presente divulgación y una, dos, tres o cuatro de las regiones marco de cadena ligera tal como se ilustra en la Tabla 2 y las SEQ ID NO: 630, 667 y 641-684. En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3 de la presente divulgación y una, dos, tres o cuatro de las regiones marco de cadena pesada tal como se ilustra en la Tabla 3 y las SEQ ID NO: 604-618, 619-629, 631-666, 668, 669, 670-678-680 y 685-692. En algunas realizaciones, un anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende una HVR-L1, una HVR-L2 y una HVR-L3 de la presente divulgación y una, dos, tres o cuatro de las regiones marco de cadena ligera tal como se ilustran en la Tabla 2 y las SEQ ID NO: 630, 667 y 641-684, y también comprende una región variable de cadena pesada que comprende una HVR-H1, una HVR-H2 y una HVR-H3 de la presente divulgación y una, dos, tres o cuatro de las regiones marco de cadena pesada tal como se ilustran en la Tabla 3 y las SEQ ID NO: 604-618, 619-629, 631-666, 668, 669, 670-678-680 y 685-692.
Preparación de anticuerpos
Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación pueden abarcar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados y quiméricos, anticuerpos humanos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab’-SH, Fv, scFv y F(ab’)2), anticuerpos biespecíficos y poliespecíficos, anticuerpos multivalentes, anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos conjugados, anticuerpos derivados de bibliotecas, anticuerpos con funciones efectoras modificadas, proteínas de fusión que contienen una parte de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que incluye un sitio de reconocimiento de antígeno, tal como un epítopo con residuos de aminoácidos de una proteína sortilina de la presente divulgación, lo que incluye variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados de forma covalente. Los anticuerpos anti sortilina pueden ser humanos, murinos, de ratas o de cualquier otro origen (lo que incluye anticuerpos quiméricos o humanizados).
(1) Anticuerpos policlonales.
En general, los anticuerpos policlonales, tales como anticuerpos anti sortilina, se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante (por ejemplo, una proteína sortilina recombinante o purificada de la presente divulgación) con una proteína que sea inmunogénica en la especie a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja, con un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación mediante residuos cisteína), N-hidroxisuccinimida (mediante residuos lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCh o R1N=C=NR, en el que R y R1 son grupos alquilo inferiores independientes. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden utilizar incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético). Un experto en la técnica puede seleccionar el protocolo de inmunización sin experimentación indebida.
Los animales se inmunizan contra el antígeno deseado, conjugados inmunogénicos o derivados combinando, por ejemplo, 100 |jg (para conejos) o 5 |jg (para ratones) de la proteína o conjugado con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se aplica un refuerzo de 1/5 o 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund a los animales mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Entre 7 y 14 días después, se extrajeron muestras de sangre de los animales y se evaluó el suero para determinar los títulos de anticuerpo. Se administran refuerzos a los animales hasta alcanzar títulos constantes. También es posible producir los conjugados en cultivo de células recombinantes, tal como fusiones de proteínas. Asimismo, los agentes de agregación, tal como alumbre, se utilizan de forma adecuada para potenciar la respuesta inmunitaria.
(2) Anticuerpos monoclonales
Se obtienen anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos anti sortilina monoclonales, a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles modificaciones postraduccionales (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) y/o mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en menores cantidades. Por lo tanto, el modificador “monoclonal” indica que la naturaleza del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos distintos.
Por ejemplo, es posible producir los anticuerpos anti sortilina monoclonales con el método de hibridoma que se describió en primera instancia en Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) o mediante métodos de ADN recombinante (patente estadounidense de n.o4816567).
En el método de hibridoma, se inmuniza un ratón u otro animal hospedador adecuado, tal como un hámster, como se describió anteriormente en el presente documento para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán de forma específica a la proteína utilizada para la inmunización (por ejemplo, una proteína sortilina purificada o recombinante de la presente divulgación). De manera alternativa, es posible la inmunización in vitro de linfocitos. Después, los linfocitos se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Usualmente, el agente inmunizante incluirá la proteína antigénica (por ejemplo, una proteína sortilina purificada o recombinante de la presente divulgación) o una variante de fusión de esta. En general, se utilizan linfocitos de sangre periférica (PBL, por sus siglas en inglés) si se desean células de origen humano y células del bazo o de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamífero no humano. Después, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press (1986), págs. 59-103.
En general, las líneas celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas, particularmente, células de mieloma de origen roedor, bovino o humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma preparadas de esta manera se cultivan en un medio adecuado que preferentemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células madre de mieloma no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma madre carecen de enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá normalmente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), sustancias que previenen el crecimiento de células con deficiencia de HGPRT.
Las células de mieloma inmortalizadas preferidas son las que se fusionan de forma eficiente, soportan producción a nivel elevado estable de un anticuerpo de las células que producen el anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Entre ellas, se prefieren las líneas de mieloma murinas, tales como las procedentes de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 (disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EUA), así como células SP-2 y derivados de estas (por ejemplo, X63-Ag8-653) (disponible de American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EUA). También se han descrito líneas celulares de heteromieloma humano-ratón y mieloma humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).
Para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno (por ejemplo, una proteína sortilina de la presente divulgación), el medio de cultivo en el que se cultivan células de hibridoma se somete a ensayo. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).
Es posible someter a ensayo el medio de cultivo en el que se cultivan células de hibridoma para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado (por ejemplo, una proteína sortilina de la presente divulgación). Preferentemente, es posible determinar la afinidad y la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo ligado a enzimas (ELISA). Se conocen dichas técnicas y ensayos en la técnica. Por ejemplo, es posible determinar la afinidad de unión mediante el análisis de Scatchard de Munson et al.. Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Una vez que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de especificidad, afinidad y/o actividad deseada, es posible subclonar los clones mediante procedimientos de dilución limitante y se cultivan mediante métodos estándares (Goding, supra). El medio de cultivo adecuado a estos efectos incluye, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, es posible cultivar las células de hibridoma in vivo como tumores en un mamífero.
Se separan en forma adecuada los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía con proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía por afinidad y otros métodos anteriormente descritos.
Los anticuerpos monoclonales anti sortilina también se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente estadounidense n.° 4816 567 y como se describió anteriormente. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente con procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que se unen específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, se puede colocar el ADN en vectores de expresión que después se transfectan en células hospedadoras, tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen proteína inmunoglobulina de otra forma, para producir los anticuerpos monoclonales en dichas células hospedadoras. Los artículos de análisis sobre expresión recombinante en bacterias de ADN que codifican el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Immunol. Rev.
130:151-188(1992).
En determinadas realizaciones, es posible aislar anticuerpos anti sortilina de fagotecas de anticuerpos generadas con las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describieron el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, de fagotecas. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de afinidad elevada (intervalo nanomolar (nM)) mediante transposición de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir fagotecas muy grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Por lo tanto, dichas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales para aislar los anticuerpos monoclonales de especificidad deseada (por ejemplo, aquellos que se unen a la proteína sortilina de la presente divulgación).
También se pueden modificar los anticuerpos que codifican ADN o fragmentos de estos, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente estadounidense n.° 4 816 567; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) o mediante la unión covalente a la secuencia que codifica inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido diferente de inmunoglobulina. Habitualmente, tales polipéptidos diferentes de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.
Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación o fragmentos de estos) pueden ser monovalentes y su preparación se conoce en la técnica. Por ejemplo, un método implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de inmunoglobulina. Generalmente, la cadena pesada se trunca en cualquier punto en la región Fc para impedir el entrecruzamiento de la cadena pesada. De manera alternativa, los residuos de cisteína relevantes se pueden sustituir con otros residuos de aminoácidos o se eliminan para impedir el entrecruzamiento. También son adecuados métodos in vitro para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de ellos, particularmente, fragmentos Fab, se puede lograr mediante técnicas habituales conocidas en la materia.
También es posible preparar anticuerpos anti sortilina quiméricos o híbridos in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que implican agentes reticulantes. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados a estos efectos incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.
(3)Anticuerpos humanizados
Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación o fragmentos de anticuerpo de estos también pueden incluir anticuerpos humanizados o humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se reemplazan residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor con residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata o conejo, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos marco Fv de inmunoglobulina humana se remplazan con los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias marco o CDR importada. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todas o casi todas las regiones CDR corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humanas y todas o casi todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), por lo general la de una inmunoglobulina humana. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) y Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
En la técnica se conocen métodos para humanizar anticuerpos anti sortilina no humanos. En general, en un anticuerpo humanizado se introducen uno o más residuos de aminoácidos de una fuente no humana. Con frecuencia se hace referencia a estos residuos de aminoácidos no humanos como residuos "importados”, que normalmente se toman de un dominio variable “ importado”. La humanización se puede llevar a cabo esencialmente conforme al método de Winter y colaboradores, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) o mediante la sustitución de las CDR o de las secuencias de CDR de roedor para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense n.° 4816 567), en los que se sustituyó bastante menos que un dominio variable humano intacto con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizar para producir los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado método “de mejor ajuste”, se analiza la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor al compararla con la biblioteca completa de secuencias humanas de dominio variable conocidas. La secuencia humana que esté más próxima a la del roedor se acepta entonces como el marco (FR) humano para el anticuerpo humanizado. Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987). Otro método utiliza un marco particular procedente de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Es posible usar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes. Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993).
Asimismo, es importante que los anticuerpos se humanicen conservando una afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales con modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Usualmente, se encuentran disponibles modelos de inmunoglobulina tridimensionales y resultan familiares para los expertos en la técnica. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras de conformación tridimensional probables de secuencias de inmunoglobulina candidata seleccionadas. La inspección de dichas opciones presentadas hace posible el análisis del rol probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la unión de la inmunoglobulina candidata con su antígeno. De esa forma, es posible seleccionar y combinar residuos de FR del receptor e importar las secuencias de forma que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antígeno o antígenos diana (por ejemplo, proteínas sortilina de la presente divulgación). En general, los residuos de CDR están directamente y más sustancialmente implicados en la influencia sobre la unión al antígeno.
Se contemplan varias formas del anticuerpo humanizado anti sortilina. Por ejemplo, el anticuerpo anti sortilina humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que se conjuga opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos para generar un inmunoconjugado. De manera alternativa, el anticuerpo anti sortilina humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
(4)Anticuerpos humanos
De manera alternativa, se pueden generar anticuerpos anti sortilina humanos. Por ejemplo, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, después de inmunizarse, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. La eliminación homocigota del gen de región de unión de cadena pesada del anticuerpo (Jh) en ratones con mutaciones de línea germinal y quimérica produce la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de una matriz genética de inmunoglobulina de línea germinal humana a dichos ratones con mutaciones de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al exponerlos a antígenos. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nat' Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Yearin Immunol., 7:33 (1993); patente estadounidense n.° 5591 669 y WO 97/17852.
De manera alternativa, es posible utilizar tecnología de expresión en fagos para producir anticuerpos anti sortilina humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de gen de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes. McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991). De acuerdo con dicha técnica, se clonan genes de dominio V de anticuerpo enmarcados ya sea en un gen proteico de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se exhiben como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena simple del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe dichas propiedades. Por lo tanto, los fagos imitan algunas de las propiedades del linfocito B. La expresión de fago se puede llevar a cabo en una variedad de formatos reseñados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993). Se pueden utilizar varias fuentes de segmentos de gen V para expresión de fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), aislaron un conjunto diverso de anticuerpos antioxazolona de una biblioteca de combinación aleatoria pequeña de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Es posible crear un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y aislar anticuerpos con respecto a un conjunto diverso de antígenos (lo que incluye antígenos propios) esencialmente conforme a las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991), o Griffith et al., e Mb O J. 12:725-734 (1993). Véanse también las patentes estadounidenses n^ 5565332 y 5 573 905. De manera adicional, es posible emplear tecnología de expresión en levaduras para producir anticuerpos anti sortilina y fragmentos de anticuerpos in vitro (por ejemplo, documentos WO 2009/036379, WO 2010/105256, WO 2012/009568, US 2009/0181855, US 2010/0056386 y Feldhaus y Siegel (2004), J. Immunological Methods 290:69-80). En otras realizaciones, es posible emplear tecnología de expresión en ribosomas para producir anticuerpos anti sortilina humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro (por ejemplo, Roberts y Szostak (1997) Proc Natl Acad Sci 94:12297-12302; Schaffitzel et al. (1999) J. Immunological Methods 231:119-135; Lipovsek y Plückthun (2004) J. Immunological Methods 290:51-67).
Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al., también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales anti sortilina humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991). De manera similar, los anticuerpos anti sortilina humanos se pueden producir introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones, en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado total o parcialmente. Después de la exposición, se observa la producción de anticuerpos humanos que se asemeja en gran medida a lo que se observa en humanos en todo respecto, lo que incluye el reordenamiento de genes, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n^ 5545 807, 5545806, 5569825, 5625 126, 5 633425, 5661 016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Finalmente, también se pueden generar anticuerpos anti sortilina humanos in vitro mediante linfocitos B activados (véanse las patentes estadounidenses n.° 5567610 y 5229275).
(5) Fragmentos de anticuerpos
En determinadas realizaciones, el uso de fragmentos de anticuerpo anti sortilina implica ventajas respecto al uso de anticuerpos anti sortilina completos. El tamaño más reducido de los fragmentos hace que sea posible una eliminación rápida y una mejor penetración cerebral.
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, dichos fragmentos se obtuvieron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Method. 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, en la actualidad, dichos fragmentos se pueden producir directamente mediante células hospedadoras recombinantes, por ejemplo, con ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación. Todos los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv se pueden expresar y secretar en E. coli, de forma que sea posible la producción directa de grandes cantidades de dichos fragmentos. También se pueden aislar fragmentos de anticuerpo anti sortilina de bibliotecas de expresión en fagos, tal como se indicó anteriormente. De manera alternativa, es posible recuperar directamente fragmentos Fab'-SH de E. coli y acoplarlos químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Conforme con otro enfoque, es posible aislar fragmentos F(ab')2 directamente de cultivo de células hospedadoras recombinantes. En la patente estadounidense n^ 5869046 se describe la producción de fragmentos de anticuerpo Fab y F(ab’ )2 con mayores semividas in vivo. En otras realizaciones, el anticuerpo seleccionado es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185 y las patentes estadounidenses n^ 5 571 894 y n^ 5 587 458. El fragmento de anticuerpo anti sortilina también puede ser un anticuerpo lineal, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense 5641 870. Estos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.
(6) Anticuerpos biespecíficos y poliespecíficos
Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, incluyendo los que están en la misma proteína o en otra proteína (por ejemplo, una o más proteínas sortilina de la presente divulgación). De manera alternativa, es posible armar una parte de un BsAb para su unión al antígeno de sortilina diana y se puede combinar otra parte con un grupo que se une a una segunda proteína. Dichos anticuerpos pueden proceder de anticuerpos de longitud completa o de fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos de F(ab')2).
En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes. Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla posible de 10 moléculas de anticuerpos posibles de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la que usualmente se lleva a cabo mediante etapas de cromatografía por afinidad, es engorrosa y sus productos tienen bajo rendimiento. Se comentan procedimientos similares en el documento WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
Conforme a un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo y antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión se produce, preferentemente, con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, Ch2 y Ch3. Se prefiere que la primera región constante de cadena pesada (Ch1) contenga el sitio necesario para la unión con la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si así se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Esto hace posible una gran flexibilidad para el ajuste de proporciones de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones en las que relaciones no equivalentes de lastres cadenas polipeptídicas en la construcción producen los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o lastres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales produce rendimientos elevados o cuando las proporciones no son particularmente significativas.
En una realización preferida del presente enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (lo que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se observó que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseada de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, dado que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en únicamente la mitad de las moléculas biespecíficas implica una vía sencilla de separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690. Véanse detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, en Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
Conforme a otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011 o en la patente estadounidense n.° 5731 168, es posible diseñar la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo de células recombinantes. La interfaz preferida comprende al menos una parte de la región Ch3 de un domino constante de anticuerpo. En dicho método, se reemplazan una o más cadenas laterales de aminoácidos cortas de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo con cadenas laterales mayores (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes en la interfaz de una segunda molécula de anticuerpo mediante el reemplazo de cadenas laterales grandes con cadenas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
En la bibliografía se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, es posible preparar anticuerpos biespecíficos mediante enlaces químicos. Brennan et al., Science 229:81 (1985), describen un procedimiento en el que se escinden de forma proteolítica anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab’ )2. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio, agente formador de complejos de ditiol, para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab’ generados luego se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Después, se reconvierte uno de los derivados de Fab’-TNB en el derivado Fab’-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.
Es posible recuperar directamente fragmentos Fab’ de E. coli y acoplarlos químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992), describen la producción de moléculas F(ab’)2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizadas. Cada fragmento Fab’ se secretó por separado de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de dicha manera fue capaz de unirse a células con sobreexpresión del receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como también de activar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumores de mamas humanos.
También se han descrito varias técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpos bivalentes directamente a partir del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodímeros bivalentes con cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las partes Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y luego se oxidaron nuevamente para formar los heterodímeros de anticuerpo. La tecnología de diacuerpo descrita por Hollinger et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993), brinda un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos bivalentes/biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre ambos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, se fuerza el apareamiento de los dominios Vh y Vl de un fragmento con los dominios Vl y Vh complementarios de otro fragmento, de manera de formar dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico/bivalente mediante el uso de dímeros Fv de cadena sencilla (sFv). Vea Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
También se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).
Ejemplos de anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes en una molécula dada (por ejemplo, una proteína sortilina de la presente divulgación). De manera alternativa, un grupo que selecciona como diana un componente de señalización de sortilina se puede combinar con un grupo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula receptora de linfocito T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores de Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), para enfocar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa la proteína particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para localizar agentes citotóxicos de células que expresan una proteína particular. Dichos anticuerpos poseen un grupo de unión a proteína y un grupo que se une a un agente citotóxico o a un quelante radionucleido, tales como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une a la proteína de interés y también al factor tisular (TF).
(7)Anticuerpos multivalentes
Una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo puede internalizar (y/o catabolizar) más rápidamente un anticuerpo multivalente que un anticuerpo bivalente. Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación o fragmentos de anticuerpos de estos pueden ser anticuerpos multivalentes (que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), los que se pueden producir fácilmente mediante expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende una región de Fc o una región bisagra. En dicho caso, el anticuerpo comprenderá una región de Fc y tres o más sitios de unión al antígeno hacia el extremo amino respecto a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferido de la presente contiene de tres a aproximadamente ocho sitios de unión a antígeno, pero contiene preferentemente cuatro. El anticuerpo multivalente contiene al menos una cadena de polipéptidos (y, preferentemente, dos cadenas de polipéptidos), en la que la cadena o cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena polipeptídica de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. De manera similar, la cadena o cadenas polipeptídicas pueden comprender una cadena VH-CH1-enlazador flexible-VH-CH1-región Fc o una cadena VH-CH1-VH-CH1-región Fc. Preferentemente, el anticuerpo multivalente de la presente también comprende al menos dos (y preferentemente, cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente puede, por ejemplo, comprender de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera contemplados en el presente documento comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente, también comprenden un dominio CL. Los anticuerpos multivalentes pueden reconocer el antígeno de sortilina, así como, de modo no taxativo, antígenos adicionales, un antígeno de péptido beta A, antígeno de proteína sinucleína alfa, antígeno de proteína Tau, antígeno de proteína TDP-43, antígeno de proteína priónica, antígeno de proteína de huntingtina o RAN, antígeno de productos de traducción, lo que incluye las repeticiones dipepetídicas (péptidos DPR) compuestas de glicina-alanina (GA), glicina-prolina (GP), glicina-arginina (GR), prolina-alanina (PA) o prolina-arginina (PR), receptor de insulina, factor de crecimiento tipo insulina, receptor de transferrina o cualquier otro antígeno que simplifique la transferencia del anticuerpo a través de la barrera hematoencefálica.
(8) Anticuerpos heteroconjugados
El alcance de la presente divulgación también abarca anticuerpos heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados se componen de dos anticuerpos unidos de forma covalente (por ejemplo, anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación o fragmentos de anticuerpo de estos). Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a la avidina y el otro a la biotina. Se han propuesto tales anticuerpos, por ejemplo, para seleccionar células no deseadas como dianas de células del sistema inmunitario, patente estadounidense n.° 4 676980, y se han utilizado para el tratamiento de la infección por VIH. Publicaciones internacionales n.oWO 91/00360, WO 92/200373 y EP 0308936. Se ha contemplado la posibilidad de que los anticuerpos se preparen in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo los que impliquen agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir con una reacción de intercambio de disulfuros o mediante la formación de un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados con este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n^ 4 676 980. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden producir mediante cualquiera de los métodos de entrecruzamiento convenientes. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son ampliamente conocidos en la técnica y se describen en la patente estadounidense n^ 4676980 junto con múltiples técnicas de entrecruzamiento.
(9) Diseño de la función efectora
También se puede desear modificar un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación para modificar la función efectora y/o para aumentar la semivida en suero del anticuerpo. Por ejemplo, es posible modificar o mutar el sitio de unión al receptor de Fc en la región constante para eliminar o reducir la afinidad de unión a determinados receptores de Fc, tales como FcyRI, FcyRII y/o FcyRIII. En algunas realizaciones, la función efectora se impide eliminando la N-glicosilación de la región Fc (por ejemplo, en el dominio CH 2 de IgG) del anticuerpo. En algunas realizaciones, la función efectora se impide modificando regiones tales como 233-236, 297 y/o 327-331 de la IgG humana, tal como se describe en el documento PCT WO 99/58572 y en Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000).
Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítopo de unión al receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 5739277. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "epítopo de unión al receptor de rescate” se refiere a la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG-i, IgG2, IgG3 o IgG4) responsable del aumento de la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.
(10) Otras modificaciones de las secuencias de aminoácidos
También se contemplan modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación o fragmentos de estos. Por ejemplo, se puede desear mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico que codifica los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos y/o inserciones en estos y/o sustituciones de estos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se produce cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para lograr la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas (es d e c ir , la c a p a c id a d d e u n ió n o in te ra c c ió n f ís ic a c o n u n a p ro te ín a s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n ) . L o s c a m b io s d e a m in o á c id o s ta m b ié n p u e d e n a lte ra r p ro c e s o s p o s tra d u c c io n a le s d e l a n t ic u e rp o , ta le s c o m o e l c a m b io d e c a n t id a d o p o s ic ió n d e s it io s d e g lic o s ila c ió n .
U n m é to d o ú til p a ra id e n t if ic a r d e te rm in a d o s re s id u o s o re g io n e s d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a q u e re p re s e n ta n u b ic a c io n e s p re fe r id a s p a ra m u ta g é n e s is e s c o n o c id o c o m o “ m u ta g é n e s is d e b a rr id o d e a la n in a ” , ta l c o m o lo d e s c r ib ie ro n C u n n in g h a m y W e lls e n Science, 244 :1081 -1085 (1989 ). E n e s te c a s o , s e id e n t if ic a n un re s id u o o g ru p o d e re s id u o s d ia n a (p o r e je m p lo , re s id u o s c a rg a d o s ta le s c o m o a rg , a sp , h is, lys y g lu ) y s e re e m p la z a n co n un a m in o á c id o n e u tro o c a rg a d o n e g a t iv a m e n te (m á s p re fe re n te m e n te , a la n in a o p o lia la n in a ) p a ra a fe c ta r a la in te ra c c ió n d e lo s a m in o á c id o s co n e l a n tíg e n o d ia n a . D ic h a s u b ic a c io n e s d e a m in o á c id o s q u e d e m u e s tra n s e n s ib il id a d fu n c io n a l a la s s u s t itu c io n e s s e re f in a n d e s p u é s in tro d u c ie n d o o tra s v a r ia n te s o v a r ia n te s a d ic io n a le s en , o p a ra , lo s s it io s d e s u s t itu c ió n . P o r lo ta n to , a u n q u e e l s it io p a ra in tro d u c ir u n a v a r ia c ió n d e s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e s tá p re d e te rm in a d o , n o e s n e c e s a r io q u e s e p re d e te rm in e la n a tu ra le z a d e la m u ta c ió n per se. P o r e je m p lo , p a ra a n a liz a r e l re n d im ie n to d e u n a m u ta c ió n e n un s it io d a d o , se lle v ó a c a b o un b a rr id o d e a la n in a o u n a m u ta g é n e s is a le a to r ia en u n a re g ió n o c o d ó n d ia n a y s e a n a liz a ro n la s v a r ia n te s d e a n t ic u e rp o e x p re s a d a s p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d d e s e a d a .
L a s in s e rc io n e s d e s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s in c lu y e n fu s io n e s d e e x tre m o s a m in o (“ N ” ) y /o c a rb o x ilo (“ C ” ) q u e v a r ía n en c u a n to a lo n g itu d d e un re s id u o a p o lip é p tid o s q u e c o n t ie n e n c ie n re s id u o s o m á s , a s í c o m o ta m b ié n in s e rc io n e s in tra s e c u e n c ia d e un ú n ic o re s id u o o d e m ú lt ip le s re s id u o s d e a m in o á c id o s . E je m p lo s d e in s e rc io n e s te rm in a le s in c lu y e n un a n t ic u e rp o c o n un re s id u o m e t io n ilo d e e x tre m o N o e l a n t ic u e rp o fu s io n a d o a un p o lip é p tid o c ito tó x ic o . O tra s v a r ia n te s d e in s e rc ió n d e la m o lé c u la d e a n t ic u e rp o in c lu y e n la fu s ió n a l e x tre m o N o C d e l a n t ic u e rp o a u n a e n z im a o un p o lip é p tid o q u e a u m e n ta la s e m iv id a e n s u e ro d e l a n tic u e rp o .
O tro t ip o d e v a r ia n te e s u n a v a r ia n te d e s u s t itu c ió n d e a m in o á c id o . En e s ta s v a r ia n te s , s e re e m p la z a a l m e n o s un re s id u o d e a m in o á c id o e n la m o lé c u la d e l a n t ic u e rp o p o r un re s id u o d ife re n te . L o s s it io s d e m a y o r in te ré s p a ra la m u ta g é n e s is c o n s u s t itu c ió n in c lu y e n la s re g io n e s h ip e rv a r ia b le s , p e ro ta m b ié n s e c o n te m p la n a lte ra c io n e s d e FR . S e m u e s tra n s u s t itu c io n e s c o n s e rv a t iv a s e n la Tabla B q u e s e e n c u e n tra m á s a d e la n te c o n e l e n c a b e z a d o “ s u s t itu c io n e s p re fe r id a s ” . S i d ic h a s s u s t itu c io n e s p ro d u je ra n un c a m b io e n la a c t iv id a d b io ló g ic a , s e p o d ría n in tro d u c ir m á s c a m b io s s u s ta n c ia le s , d e n o m in a d o s “ e je m p lo s d e s u s t itu c io n e s ” e n la Tabla B o ta l c o m o s e d e s c r ib e n a d ic io n a lm e n te m á s a d e la n te c o n re fe re n c ia a las c la s e s d e a m in o á c id o s , y s e a n a liz a r ía n lo s p ro d u c to s .
TABLA B: Sustituciones de aminoácidos
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P u e d e n re a liz a rs e m o d if ic a c io n e s s u s ta n c ia le s e n la s p ro p ie d a d e s b io ló g ic a s d e l p o lip é p tid o s e le c c io n a n d o s u s t itu c io n e s q u e d if ie ra n s ig n if ic a t iv a m e n te en su e fe c to p a ra m a n te n e r (a ) la e s tru c tu ra d e la c a d e n a p r in c ip a l d e l p o lip é p tid o e n e l á re a d e s u s t itu c ió n , p o r e je m p lo , c o m o u n a c o n fo rm a c ió n d e lá m in a o h é lic e , (b ) la c a rg a o h id ro fo b ic id a d d e la m o lé c u la e n e l s it io d ia n a , o (c ) e l v o lu m e n d e la c a d e n a la te ra l. L o s re s id u o s d e o r ig e n n a tu ra l se d iv id e n e n g ru p o s b a s á n d o s e e n la s p ro p ie d a d e s c o m u n e s d e la s c a d e n a s la te ra le s :
(1 ) h id ró fo b o s : n o r le u c in a , m e t, a la , v a l, leu , ile;
(2 ) h id ró f ilo s n e u tro s : c ys , se r, th r;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservativas conllevan el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
También es posible sustituir cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo, generalmente, con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir un entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, es posible añadir uno o más enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente, en los casos en los que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).
Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo adicional tendrán mejores propiedades biológicas en comparación con el anticuerpo original a partir del cual se generan. Una forma conveniente para generar tales variantes de sustitución implica la maduración por afinidad con expresión en fagos. Brevemente, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) mutan para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas se expresan de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 dentro de cada partícula. Después, se analizan las variantes expresadas en fagos para detectar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión), tal como se describe en el presente documento. Con el fin de identificar los sitios candidatos de la región hipervariable para la modificación, se puede realizar mutagénesis de barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen de forma significativa con la unión al antígeno. De manera alternativa o adicional, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno y anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno (por ejemplo, una proteína anti sortilina de la presente divulgación). Dichos residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas desarrolladas en la presente. Una vez que se generan tales variantes, se somete el panel de variantes a análisis tal como se describe en la presente y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para desarrollo adicional.
Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Cuando se mencionan alteraciones, esto se refiere a la eliminación de uno o más restos de carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo y/o a la adición de uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran presentes en el anticuerpo.
La glicosilación de los anticuerpos es, por lo general, glicosilación ligada a N o glicosilación ligada a O. La expresión “ligada a N” se refiere a la unión del resto de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido menos prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La expresión glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente, serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal forma que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de N-glicosilación). La alteración también se puede realizar añadiendo o sustituyendo uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (en el caso de los sitios de glicosilación ligada a O).
Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti IgE se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, de modo no taxativo, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida), mutagénesis por PCR y mutagénesis de casete de una versión variante o no variante previamente preparada de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación) o fragmentos de anticuerpos.
(11) Otras modificaciones de anticuerpos
Los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación o fragmentos de anticuerpo de estos, se pueden modificar adicionalmente para que contengan restos no proteicos adicionales conocidos en la técnica y fácilmente disponibles. Preferentemente, los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no taxativos de polímeros solubles en agua incluyen, de modo no taxativo, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno y anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno y óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y mezclas de estos. La producción de propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas debido a su estabilidad en agua. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si hay más de un polímero unido, pueden ser las mismas moléculas o moléculas diferentes. En general, es posible determinar la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivatización basándose en cuestiones que incluyen, de modo no taxativo, las funciones o propiedades particulares del anticuerpo a mejorar, ya sea que se utilice el derivado del anticuerpo en un tratamiento en condiciones definidas, etc. Dichas técnicas y otras formulaciones adecuadas se desvelan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).
Ensayos de unión y otros ensayos
Es posible evaluar la actividad de unión al antígeno de los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación, por ejemplo, mediante métodos conocidos tales como ELISA, resonancia de plasmón superficial (SPR), transferencia Western, etc.
En algunas realizaciones, se pueden utilizar ensayos competitivos para identificar un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos indicados en las Tablas 1-3 y 11-15, o seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En determinadas realizaciones, dicho anticuerpo competitivo se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que se une con cualquiera de los anticuerpos indicados en las Tablas 1­ 3 y 11-15, o seleccionados de S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, 5 - 15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6- 9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84 y S-85. En Morris (1996), “Epitope Mapping Protocols” en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ), se indican ejemplos de métodos detallados para mapear un epítopo al cual se une un anticuerpo.
En un ejemplo de ensayo competitivo, se incuban sortilina inmovilizada o células que expresan sortilina en una superficie celular en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une a sortilina (por ejemplo, de primate no humano o humano) y un segundo anticuerpo no marcado que se evalúa para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo para unirse a sortilina. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas. Como control, se incuban sortilina inmovilizada o células que expresan sortilina en una solución que comprende el primer anticuerpo etiquetado, pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a sortilina, se elimina el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de marcador asociado a la sortilina inmovilizada o a células que expresan sortilina. Si la cantidad de marcador asociado a la sortilina inmovilizada o a células que expresan sortilina, se reduce sustancialmente en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, ello indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para unirse a sortilina. Véase Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, cap.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Ensayos de unión de ligandos
En el presente documento también se proporcionan métodos para determinar la presencia de anticuerpos anti sortilina que se unen a Lys260, Phe314, Ser316, Ile329, Arg325, Arg326, Tyr351, Ser352 y/o Ile353 de sortilina humana, y que bloquean las interacciones entre sortilina y un ligando de sortilina (por ejemplo, proNGF, proBDNF, proNT3, p75, a Pp , LpL, APOA5, APOE). En algunas realizaciones, es posible sintetizar una biblioteca de péptidos en la que una proteína sortilina se disecciona en péptidos consecutivos de 15 miembros y 25 miembros separados por un residuo aminoácido y posteriormente, se detectan en filtros. Después, es posible evaluar la unión de un ligando de sortilina para determinar su capacidad de interacción con el péptido receptor o con péptidos, por ejemplo, con mutaciones en Lys260, Phe314, Ser316, Ile329, Arg325, Arg326, Tyr351, Ser352 y/o Ile353 de bibliotecas de sortilina humana en presencia o ausencia de los anticuerpos anti sortilina mediante análisis de unión SPOT (por ejemplo, Frank, R y Overwin, H (1996) Methods. Mol. Biol. 66, 149-169; Reineke, U et al., (2002) J. Immunol. Methods 267, 13-26; y Andersen, OS et al., (2010) J, BIOLOGICAL CHEMISTRY 285, 12210-12222). En algunas realizaciones, se pueden construir bibliotecas de péptidos para miembros de la familia de genes de receptor de dominio VPS10p o variaciones peptídicas específicas en términos de sustitución o longitud de péptidos de unión a ligandos identificados en una membrana de celulosa. En algunas realizaciones, es posible emplear un total de 2181 péptidos para representar la familia de genes de sortilina, lo que incluye 273 péptidos para sortilina (n.° de acceso CAA66904), con una superposición de 13 aminoácidos entre péptidos de 16 miembros (Frank, R (1992) Tetrahedron 48, 9217-9232). En algunas realizaciones, se puede preparar un soporte de celulosa como una membrana de celulosa-éter aminohidroxilpropílico modificado en N y todas las rondas de síntesis se inician con una definición puntual mediante éster 9-fluorenilmetoxicabonilalaninapentafluorofenílico que crea un enlace de alanina entre péptido y membrana. Por ejemplo, una síntesis lineal automática de la adición en etapas de diferentes aminoácidos protegidos en su extremo N por 9-fluorofenilmetoxicarbonilo y protección de cadena lateral adecuada para la cadena peptídica creciente. En algunas realizaciones, se continúa el patrón de desprotección, activación y acoplamiento hasta que se producen péptidos de 16 miembros, lo que genera un arreglo distribuido de forma equitativa de péptidos anclados de forma covalente al soporte de celulosa en sus extremos C con extremos N libres (Scharn, D et al., (2000) J. Comb. Chem. 2, 361-369). En algunas realizaciones, la eliminación del grupo de protección lateral se puede llevar a cabo en dos etapas. En primer lugar, la membrana se puede tratar con ácido trifluoroacético al 90 % (en diclorometano, que contiene triisobutilsilano al 3 % y H2O al 2 %) y, en segundo lugar, por ejemplo, con ácido trifluoroacético al 60 % (en diclorometano, que contiene triisobutilsilano al 3 % y H2O al 2 %). La membrana se puede lavar varias veces con H 2 O, etanol, solución salina tamponada con Tris y etanol para eliminar sales de ácido trifluoroacético, y después se seca. Finalmente, se bloquea la membrana en tampón de bloqueo dilatado en solución salina tamponada con Tris (pH 8.0) y se complementa con sacarosa al 5 % durante 2 horas, antes de que la biblioteca peptídica predefinida esté lista para análisis de unión a ligando. En algunas realizaciones, para estudios de unión de péptidos unidos a celulosa, se pueden incubar bibliotecas unidas a membrana con ligandos marcados con polihistidina y péptido S combinado en presencia o ausencia de los anticuerpos anti sortilina, por ejemplo, en solución tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C, seguido de una segunda incubación con 1 mg/ml de proteína S conjugada con HRP también en tampón de bloqueo, pero durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se puede lavar la membrana, por ejemplo, tres veces durante 10 minutos con solución salina tamponada con Tris antes de llevar a cabo una caracterización cuantitativa de ligando unido con el sustrato de quimioluminiscencia UptiLight y un instrumento Lumilmager, con indicación de las intensidades de señales puntuales en unidades de iluminación de Boehringer. De manera alternativa, es posible llevar a cabo la detección de ligandos unidos mediante un ensayo inmunoquímico con un anticuerpo contra una etiqueta de histidina y un anticuerpo secundario anti ratón conjugado con HRP. Las incubaciones se pueden llevar a cabo con procedimientos convencionales de transferencia Western y detección puntual.
En el presente documento también se proporcionan métodos para detectar anticuerpos anti sortilina que bloquean las interacciones (por ejemplo, unión) entre sortilina y ligandos de sortilina (por ejemplo, progranulina, proneurotrofina, proNGF, proBDNF, proNT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE).
En algunas realizaciones, para la detección, se pueden preparar construcciones con formas etiquetadas de los ligandos de sortilina para cada proteína que permitan la adición de un péptido S en el extremo N y etiquetas de polihistidina. El molde de ADNc para el NGF y el BDNF humanos incluye los clones de ATCC utilizados para la generación de fragmentos que abarcan los residuos Glu1-Arg102 de NGF y Ala1-Arg110 de BDNF usando el par de cebadores 5'-GGTATTGAGGGTCGCGAACCACACTCAGAGAGCAATGTCCC-3' (SEQ ID NO: 695) y 3'-GGGGGAAGTTGTCCTGAGTGTCCTCGTTCGCCACTCCGAG ATTGAGAGGAGA-5' (SEQ ID NO: 696); y el par de cebadores 5'-GGTATTGAGGGTCGCGC CCCCATGAAAGAAGCAAACAT CCGAGG-3' (SEQ ID NO: 697) y 3'-CACGTTTGTAC AGGTACTCCCAGGCCGCGACTCCGAGATTGA GAGGAGA-5' (SEQ ID NO: 698). El ADNc puede incluir salientes compatibles para la clonación independiente del ligado en el vector LIC/Xa de pET-30 y amplificación con ADN polimerasa Phusion y conforme al protocolo poroporcionado por el fabricante. Las proteínas se pueden expresar en la cepa BL21/DE3 de Escherichia coli, extraerse de forma eficaz a partir de cuerpos de inclusión bacterianos usando reactivo Bugbuster con benzoato añadido y purificarse mediante cromatografía de afinidad con ácido nitriloacético y níquel estándar, por ejemplo, en NaCl 500 mM, imidazol 5 mM y Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. La elución de las proteínas se lleva a cabo en tampón complementado con EDTA 20 mM. Es posible llevar a cabo la verificación de versiones etiquetadas intactas de HisS-NGFpro y HisS-BDNFpro mediante análisis SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie o análisis de transferencia Western usando cualquier anticuerpo contra la etiqueta de histidina de Sigma (H-1029) y anticuerpo secundario anti ratón conjugado con HRP, o, de manera alternativa, mediante unión directa de la proteína S conjugada a HRP de Novagen (n^ de catálogo 69047-3) (por ejemplo, Andersen, OS et al., P (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). También se pueden utilizar métodos similares para generar ligandos de sortilina etiquetados con GST (por ejemplo, Quistgaard, EM et al., (2009) Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 96-98).
En algunas realizaciones, la interacción entre la sortilina y ligandos de sortilina (por ejemplo, progranulina, proneurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) se puede caracterizar mediante análisis de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287:43798; y Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). Es posible llevar a cabo la determinación de unión directa de ligando de sortilina a sortilina inmovilizada en presencia o ausencia de anticuerpos anti sortilina de bloqueo, por ejemplo, en un instrumento Biacore2000 (Biacore, Suecia) con CaHBS con tampón de ejecución estándar (h Ep Es 10 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM, CaCh 2 mM, EGTA 1 mM y Tween 20 al 0,005%). En algunas realizaciones, es posible activar un chip biosensor de Biacore (CM5) con el método NHS/EDC, seguido de revestimiento con sortilina hasta una densidad proteica de 79 fmol/mm2 y utilizarlo para medidas de afinidad de los prodominios recombinantes de NGF, BDNF y NT3. La preparación de una superficie de biosensor con prosortilina seguirá un procedimiento igual. La regeneración de la celda de flujo después de cada ciclo de experimento de unión de ligando se puede llevar a cabo mediante dos pulsos de 10 pl de tampón de regeneración (glicina-HCl 10 mM, pH 4,0, NaCl 500 mM, EDTA 20 mM y Tween 20 al 0,005 %) y una única inyección de SDS al 0,001 %. Es posible ajustar sensogramas para realizar estimaciones de afinidad, por ejemplo, usando BIAevaluation versión 3.1. De acuerdo con protocolos similares, también es posible inmovilizar HisS-NGFpro o HisS-BDNFpro en un chip biosensor CM5 con el kit de acoplamiento NHS/EDC, lo que produce densidades superficiales de proteína inmovilizada similares (~300 fmol/mm2). También es posible utilizar un chip biosensor con NGFpro o BDNFpro inmovilizada para evaluar la unión de sortilina en ausencia o en presencia de anticuerpos de sortilina competitivos. También se pueden aplicar versiones no procesadas de pro-NGF y pro-BDNF, así como otro ligando de sortilina (por ejemplo, proteína asociada a receptor (RAP), neurotensina, progranulina, p75, LpL, APOA5, APOE o APP), a sortilina inmovilizada y se puede medir la unión en ausencia o en presencia de anticuerpos competitivos.
En algunas realizaciones, la interacción entre la sortilina y ligandos de sortilina (por ejemplo, progranulina, proneurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) se puede caracterizar mediante un análisis de precipitación (pull-down) (por ejemplo, Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). Por ejemplo, los dominios extracelulares expresados de sortilina se pueden incubar con ligandos de sortilina etiquetados en ausencia o en presencia de anticuerpos de bloqueo de sortilina y se precipitan con 100 |jl de esferas de sefarosa y glutatión (GSH) (Amersham Biosciences, n.° de cat. 17-0756-01). Es posible determinar la cantidad de dominios de receptor aplicados mediante precipitación con esferas Talon como control. Las proteínas unidas se pueden separar mediante análisis de SDS-PAGE y visualizarse usando anticuerpos anti histidina mediante análisis convencional de transferencia Western.
En algunas realizaciones, la interacción entre la sortilina y ligandos de sortilina (por ejemplo, progranulina, proneurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) se puede caracterizar con proteínas unidas a celulosa (por ejemplo, Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). Por ejemplo, es posible incubar proteínas unidas a membrana con péptido S y pro-NGF, pro-BDNF, progranulina u otro ligando de sortilina etiquetado con polihistidina, tal como progranulina, proneurotrofina, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5 o APOE, en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C, seguido de una segunda incubación con 1 pg/ml de proteína S conjugada con HRP también en tampón de bloqueo, pero durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se puede lavar la membrana tres veces durante 10 minutos con solución salina tamponada con Tris antes de llevar a cabo una caracterización cuantitativa de ligando unido con el sustrato de quimioluminiscencia UptiLight y un instrumento Lumilmager, con indicación de las intensidades de señales puntuales en unidades de iluminación de Boehringer. De manera alternativa, es posible llevar a cabo la detección de ligandos unidos mediante un ensayo inmunoquímico con un anticuerpo contra la etiqueta de histidina y un anticuerpo secundario anti ratón conjugado con HRP. Después de las incubaciones, se pueden llevar a cabo análisis convencionales de transferencia Western blot y detección puntual.
En algunas realizaciones, la interacción entre la sortilina y ligandos de sortilina (por ejemplo, progranulina, proneurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) se puede caracterizar mediante un ensayo de ligamiento por proximidad (por ejemplo, Gustafsen, C et al., (2013) The Journal of Neuroscience, 33:64-71). Por ejemplo, es posible llevar a cabo un ensayo de ligamiento de proximidad (PLA, proximity ligation assay) (Duolinkll) en células que expresan o que están expuestas a sortilina y a su compañero de unión con los anticuerpos primarios anti sortilina/F11, anti SorLA/20C11 y anticuerpos contra el compañero de unión, tales como anticuerpos anti APP/AF1168, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados a oligonucleótidos, que se hibridan a oligonucleótidos que forman círculos añadidos posteriormente y actúan como cebadores de una amplificación de círculo rodante cuando los antígenos se ubican a una proximidad de 40 nm. Es posible visualizar el ADN amplificado añadiendo oligonucleótidos complementarios marcados con fluorescencia.
En algunas realizaciones, la interacción entre la sortilina y ligandos de sortilina (por ejemplo, progranulina, proneurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) se puede caracterizar usando ligandos etiquetados con fosfatasa alcalina en ensayos de unión celular (por ejemplo, Hu, F et al., (2005) J. Neurosci. 25, 5298­ 5304; Fournier, AE et al., (2001) Nature 409, 341-346; Lauren, J et al., (2009) Nature 457, 1128-1132; y Hu, F et al., (2010) Neuron 68, 654-667). Por ejemplo, es posible evaluar con ligandos etiquetados con fosfatasa alcalina (AP) la unión a sortilina en células transfectadas o neuronas primarias. Se pueden lavar los cultivos, por ejemplo, con solución salina equilibrada de Hanks que contiene HEPES sódico 20 mM, pH 7,05, y 1 mg ml-1 de albúmina de suero bovino (BSA) (HBH) para detectar la unión del ligando etiquetado con AP a células que expresan sortilina. Después, es posible incubar las placas con ligandos etiquetados con AP en presencia o en ausencia de anticuerpos de bloqueo de sortilina, por ejemplo, en HBH durante 2 horas a 23 °C. Se puede detectar y cuantificar un ligando unido a AP de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Ensayos basados en células
En el presente documento también se proporcionan métodos para detectar un antagonista de unión a sortilina, tal como un anticuerpo anti sortilina, que incluyen poner en contacto un agente (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina) con una célula que exprese una proteína sortilina en su superficie celular. En algunas realizaciones, el agente y la célula también se ponen en contacto con un ligando de sortilina de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la propia célula expresa un ligando de sortilina de la presente divulgación. Los métodos basados en células son particularmente adecuados para analizar y validar antagonistas de unión a sortilina (por ejemplo, anticuerpos anti sortilina) evaluando el efecto sobre la interacción entre la sortilina y un ligando de sortilina en el contexto de una célula.
Por consiguiente, determinados aspectos de la presente divulgación se refieren a una célula que expresa una proteína sortilina de la presente divulgación en su superficie celular. En algunas realizaciones, la célula expresa de forma endógena una proteína sortilina de la presente divulgación. En algunas realizaciones, la célula se modifica de forma recombinante para expresar una proteína sortilina de la presente divulgación. En cualquiera de dichas realizaciones, la proteína sortilina de la presente divulgación (ya sea endógena o recombinante) codificada por el polinucleótido incluirá, preferentemente, al menos los dominios proteicos necesarios para el procesamiento postraduccional, la translocación de membrana y la selección de dianas en la superficie celular, lo que incluye, de modo no taxativo, un péptido señal y un dominio transmembrana. En algunas realizaciones, el péptido señal y/o el dominio transmembrana pueden hacer referencia al péptido señal y/o al dominio transmembrana de la sortilina endógena. En otras realizaciones, el péptido señal y/o el dominio transmembrana pueden referirse a un péptido señal y/o a un dominio transmembrana exógeno que se sabe que promueven la expresión en la superficie celular en la célula hospedadora deseada. En realizaciones preferidas, la proteína sortilina también contendrá un dominio suficiente para la unión de un ligando de sortilina de la presente divulgación.
Se pueden utilizar técnicas de biología molecular convencionales conocidas en la técnica, tales como las que se describen y a las que se hace referencia en la presente divulgación, para modificar de forma recombinante una célula (por ejemplo, una célula hospedadora de la presente divulgación) para expresar una proteína sortilina de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los métodos incluyen el cultivo de una célula hospedadora de la presente divulgación que contiene un polinucleótido que codifica la proteína sortilina de la presente divulgación en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo.
Para la clonación y/o la expresión adicional en una célula hospedadora para la producción recombinante de una proteína sortilina de la presente divulgación, se aísla un ácido nucleico que codifica la proteína sortilina y se inserta en uno o más vectores. Dicho ácido nucleico se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo usando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a un gen que codifica la proteína sortilina).
Los vectores adecuados que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquiera de las proteínas sortilina de la presente divulgación descritas en el presente documento, o fragmentos expresados en la superficie celular de estas, incluyen vectores de clonación y vectores de expresión. Es posible construir vectores de clonación adecuados de acuerdo con técnicas convencionales o se puede seleccionar de una gran cantidad de vectores de clonación disponibles en la técnica. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula hospedadora que se desea utilizar, los vectores de clonación útiles generalmente son capaces de autorreplicarse, pueden poseer una única diana para una endonucleasa de restricción particular y/o pueden portar genes para un marcador que se pueden utilizar en la selección de clones que contienen el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+), y sus derivados, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, ADN de fagos y vectores transportadores, tales como pSA3 y pAT28. Estos y muchos otros vectores de clonación se encuentran disponibles en proveedores comerciales tales como BioRad, Strategene e Invitrogen.
En general, los vectores de expresión son construcciones de polinucleótidos replicables que contienen un ácido nucleico de la presente divulgación. El vector de expresión se puede replicar en las células hospedadoras, ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen, de modo no taxativo, plásmidos, vectores víricos, lo que incluye adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos y vectores de expresión divulgados en la publicación PCT n.oWO 87/04462. En general, los componentes de vectores pueden incluir, de modo no taxativo, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes de marcadores, elementos de control de transcripción adecuados (tales como promotores, potenciadores y elementos de terminación). Usualmente, también son necesarios elementos de control de la traducción, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de inicio de la traducción y codones de terminación, para la expresión (es decir, traducción).
Los vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés se pueden introducir en la célula hospedadora mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados, incluyendo electroporación, transfección con cloruro de calcio, lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . D ic h o s á c id o s n u c le ic o s p u e d e n c o d if ic a r u n a s e c u e n c ia de a m in o á c id o s q u e c o n te n g a la V L y /o u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e c o n te n g a la V H d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a (p o r e je m p lo , la s c a d e n a s lig e ra y /o p e s a d a d e l a n t ic u e rp o ). E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , s e p ro p o rc io n a n u n o o m á s v e c to re s (p o r e je m p lo , v e c to re s d e e x p re s ió n ) q u e c o n t ie n e n d ic h o s á c id o s n u c le ic o s . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , ta m b ié n s e p ro p o rc io n a u n a c é lu la h o s p e d a d o ra q u e c o n t ie n e d ic h o á c id o n u c le ic o . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la c é lu la h o s p e d a d o ra c o n t ie n e (p o r e je m p lo , s e tra n s d u c e c o n ): (1 ) un v e c to r q u e c o n t ie n e un á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e c o n t ie n e la V L d e l a n t ic u e rp o y u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e c o n t ie n e la V H d e l a n t ic u e rp o o (2 ) un p r im e r v e c to r q u e c o n t ie n e un á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e c o n t ie n e la V L d e l a n t ic u e rp o y un s e g u n d o v e c to r q u e c o n t ie n e un á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a u n a s e c u e n c ia de a m in o á c id o s q u e c o n t ie n e la V H d e l a n t ic u e rp o . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la c é lu la h o s p e d a d o ra e s e u c a r io ta , p o r e je m p lo , u n a c é lu la lin fo id e o c é lu la d e o v a r io d e h á m s te r c h in o (C H O ) (p o r e je m p lo , u n a c é lu la Y 0 , N S 0 , S p 20 ).
S e p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra p ro d u c ir un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l m é to d o in c lu y e e l c u lt iv o d e u n a c é lu la h o s p e d a d o ra d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n q u e c o n t ie n e un á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a e n c o n d ic io n e s a d e c u a d a s p a ra la e x p re s ió n d e l a n tic u e rp o . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a n t ic u e rp o s e re c u p e ra p o s te r io rm e n te d e la c é lu la h o s p e d a d o ra (o d e l m e d io d e c u lt iv o de la c é lu la h o s p e d a d o ra ) .
S e a ís la un á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a un a n t ic u e rp o a n ti s o r t il in a y s e in s e r ta e n u n o o m á s v e c to re s p a ra la c lo n a c ió n y /o la e x p re s ió n a d ic io n a l e n u n a c é lu la h o s p e d a d o ra p a ra la p ro d u c c ió n re c o m b in a n te d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . E s p o s ib le a is la r y s e c u e n c ia r fá c ilm e n te d ic h o á c id o n u c le ic o c o n p ro c e d im ie n to s c o n v e n c io n a le s (p o r e je m p lo , u s a n d o s o n d a s d e o l ig o n u c le ó t id o s c a p a c e s d e u n irs e e s p e c íf ic a m e n te a g e n e s q u e c o d if ic a n la s c a d e n a s p e s a d a y lig e ra d e l a n tic u e rp o ).
L o s v e c to re s a d e c u a d o s q u e c o n t ie n e n u n a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a c u a lq u ie ra d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n , o f ra g m e n to s d e e s to s , p o lip é p tid o s ( lo q u e in c lu y e a n t ic u e rp o s ) d e s c r ito s en la p re s e n te in c lu y e n , d e m o d o no ta x a t iv o , v e c to re s d e c lo n a c ió n y v e c to re s d e e x p re s ió n . E s p o s ib le c o n s tru ir v e c to re s d e c lo n a c ió n a d e c u a d o s d e a c u e rd o c o n té c n ic a s e s tá n d a re s o s e p u e d e n s e le c c io n a r d e u n a g ra n c a n t id a d d e v e c to re s d e c lo n a c ió n d is p o n ib le s e n la té c n ic a . A u n q u e e l v e c to r d e c lo n a c ió n s e le c c io n a d o p u e d e v a r ia r d e a c u e rd o c o n la c é lu la h o s p e d a d o ra q u e s e d e s e a u tiliz a r , lo s v e c to re s d e c lo n a c ió n ú tile s g e n e ra lm e n te s o n c a p a c e s d e a u to r re p lic a c ió n , p u e d e n p o s e e r u n a ú n ic a d ia n a p a ra u n a e n d o n u c le a s a d e re s tr ic c ió n p a r t ic u la r y /o p u e d e n p o rta r g e n e s p a ra un m a rc a d o r q u e s e p u e d e n u t il iz a r e n la s e le c c ió n d e c lo n e s q u e c o n t ie n e n e l v e c to r . E je m p lo s a d e c u a d o s in c lu y e n p lá s m id o s y v iru s b a c te r ia n o s , p o r e je m p lo , p U C 18 , p U C 19 , B lu e s c r ip t (p o r e je m p lo , p B S S K ), y s u s d e r iv a d o s , m p l8 , m p l9 , p B R 322 , p M B 9 , C o lE 1 , p C R 1 , R P 4 , A D N d e fa g o s y v e c to re s tra n s p o r ta d o re s , ta le s c o m o p S A 3 y p A T 28. E s to s y m u c h o s o tro s v e c to re s d e c lo n a c ió n s e e n c u e n tra n d is p o n ib le s d e p ro v e e d o re s c o m e rc ia le s ta le s c o m o B io R a d , S tra te g e n e e In v itro g e n .
E n g e n e ra l, lo s v e c to re s d e e x p re s ió n so n c o n s tru c c io n e s d e p o lin u c le ó t id o s re p lic a b le s q u e c o n t ie n e n un á c id o n u c le ic o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . E l v e c to r d e e x p re s ió n s e p u e d e re p lic a r e n la s c é lu la s h o s p e d a d o ra s , y a s e a c o m o e p is o m a s o c o m o u n a p a rte in te g ra l d e l A D N c ro m o s ó m ic o . L o s v e c to re s d e e x p re s ió n a d e c u a d o s in c lu y e n , d e m o d o n o ta x a t iv o , p lá s m id o s , v e c to re s v ír ic o s , in c lu y e n d o a d e n o v iru s , v iru s a d e n o a s o c ia d o s , re tro v iru s , c ó s m id o s y v e c to re s d e e x p re s ió n d iv u lg a d o s e n la p u b lic a c ió n P C T n .o W O 87 /04462. E n g e n e ra l, los c o m p o n e n te s d e v e c to re s p u e d e n in c lu ir , d e m o d o n o ta x a t iv o , u n o o m á s d e lo s s ig u ie n te s : u n a s e c u e n c ia s e ñ a l; un o r ig e n d e re p lic a c ió n ; u n o o m á s g e n e s m a rc a d o re s ; e le m e n to s d e c o n tro l d e la t ra n s c r ip c ió n a d e c u a d o s ( ta le s c o m o p ro m o to re s , p o te n c ia d o re s y e le m e n to s d e te rm in a c ió n ) . N o rm a lm e n te , p a ra la e x p re s ió n (e s d e c ir, t ra d u c c ió n ) , ta m b ié n so n n e c e s a r io s e le m e n to s d e c o n tro l d e la t ra d u c c ió n , ta le s c o m o s it io s d e u n ió n a l r ib o s o m a , s it io s d e in ic io d e la t ra d u c c ió n y c o d o n e s d e te rm in a c ió n .
L o s v e c to re s q u e c o n t ie n e n lo s á c id o s n u c le ic o s d e in te ré s se p u e d e n in tro d u c ir e n la c é lu la h o s p e d a d o ra m e d ia n te c u a lq u ie ra d e u n a v a r ie d a d d e m e d io s a d e c u a d o s , in c lu y e n d o e le c tro p o ra c ió n , t ra n s fe c c ió n c o n c lo ru ro d e c a lc io , c lo ru ro d e ru b id io , fo s fa to d e c a lc io , D E A E -d e x tra n o u o tra s s u s ta n c ia s , b o m b a rd e o co n m ic ro p ro y e c t ile s , l ip o fe c c ió n e in fe c c ió n (p o r e je m p lo , d o n d e e l v e c to r e s un a g e n te in fe c c io s o ta l c o m o e l v iru s d e la v a r io lo v a c u n a ) . La e le c c ió n d e in tro d u c ir v e c to re s o p o lin u c le ó t id o s d e p e n d e rá , a m e n u d o , d e ra s g o s d e la c é lu la h o s p e d a d o ra . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l v e c to r c o n t ie n e un á c id o n u c le ic o q u e c o n t ie n e u n a o m á s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s q u e c o d if ic a n un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n .
L a s c é lu la s h o s p e d a d o ra s a d e c u a d a s p a ra la c lo n a c ió n o e x p re s ió n d e v e c to re s q u e c o d if ic a n a n t ic u e rp o s in c lu y e n c é lu la s p ro c a r io ta s o e u c a r io ta s . P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n s e p u e d e n p ro d u c ir e n b a c te r ia s , e n p a r t ic u la r c u a n d o n o so n n e c e s a r ia s la g l ic o s ila c ió n y la fu n c ió n e fe c to ra d e Fc. E x p re s ió n d e fra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s y p o lip é p tid o s e n b a c te r ia s (p o r e je m p lo , p a te n te s e s ta d o u n id e n s e s n .° 5 648 237 , 5 789 199 y 5 840 523 , y C h a r lto n , Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B .K .C . Lo , e d ., H u m a n a P re s s , T o to w a , NJ, 2003 ) , p á g s . 245 -254 , q u e d e s c r ib e n la e x p re s ió n d e fra g m e n to s d e a n t ic u e rp o e n E. coli.). D e s p u é s d e la e x p re s ió n , e l a n t ic u e rp o s e p u e d e a is la r d e la p a s ta d e c é lu la s b a c te r ia n a s e n u n a fra c c ió n s o lu b le y s e p u e d e p u r if ic a r a d ic io n a lm e n te .
A d e m á s d e p ro c a r io ta s , lo s m ic ro o rg a n is m o s e u c a r io ta s , ta le s c o m o h o n g o s f i la m e n to s o s o le v a d u ra s , ta m b ié n so n hospedadores de expresión o clonación adecuados para vectores que codifican anticuerpos, lo que incluye cepas de hongos y levaduras cuyas vías de glicosilación se “humanizaron”, dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o completamente humano (por ejemplo, Gerngross, Nat. Biotech.
22:1409-1414 (2004); y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado también pueden proceder de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden utilizar junto con células de insectos, en particular, para latransfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar cultivos de células vegetales como hospedadores (por ejemplo, patentes estadounidenses n.° 5959 177, 6 040 498, 6420 548, 7125978 y 6417429, las que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden utilizar células de vertebrados como células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar líneas celulares de mamíferos que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas de células hospedadoras mamíferas son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), la línea de riñón embrionaria humana (células 293 o 293 tal como se describieron, por ejemplo, en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), células de riñón de hámster bebé (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4, tal como se describió, por ejemplo, en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Hep G2), tumor de mama de ratón (MMT 060562), células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), las que incluyen células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como Y0, NS0 y Sp2/0. Puede encontrar una reseña de determinadas líneas celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, por ejemplo, en Yazaki y Wu, Methodsin Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), págs. 255-268 (2003).
Composiciones farmacéuticas
Es posible incorporar anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación en una variedad de formulaciones para administración terapéutica mediante la combinación de los anticuerpos con diluyentes o vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables, y se pueden formular en preparaciones en forma sólida, semisólida, líquida o gaseosa. Ejemplos de dichas formulaciones incluyen, de modo no taxativo, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, de acuerdo con la formulación deseada, portadores de diluyentes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, que son vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para administración a animales o seres humanos. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Los ejemplos de dichos diluyentes incluyen, de modo no taxativo, agua destilada, agua con tampón, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, una formulación o composición farmacéutica de la presente divulgación puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizantes no tóxicos, no terapéuticos, no inmunógenos, excipientes y similares. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponadores y de ajuste de pH, agentes de ajuste de toxicidad, agentes humectantes y detergentes.
Una composición farmacéutica de la presente divulgación también puede incluir cualquiera de una variedad de agentes estabilizantes, por ejemplo, tales como un antioxidante. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, este puede formar complejos con varios compuestos conocidos que mejoran la estabilidad in vivo del polipéptido o que mejoran de otra forma sus propiedades farmacológicas (por ejemplo, aumentan la semivida del polipéptido, reducen su toxicidad y mejora su solubilidad o absorción). Ejemplos de dichas modificaciones o agentes de formación de complejos incluyen, de modo no taxativo, sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los polipéptidos de una composición también pueden formar complejos con moléculas que mejoran sus atributos in vivo. Dichas moléculas incluyen, de modo no taxativo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.
Es posible encontrar ejemplos adicionales de formulaciones adecuadas para varios tipos de administración en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, PA, 17.a ed. (1985). Vea una reseña breve de métodos de administración de fármacos en Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
En el caso de la administración oral, es posible administrar el principio activo en formas farmacéuticas sólidas, tales como cápsulas, comprimidos y polvos, o en formas farmacéuticas líquidas, tales como elíxires, jarabes y suspensiones. Los componentes activos se pueden encapsular en cápsulas de gelatina junto con principios inactivos y vehículos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato de magnesio. Son ejemplos de principios inactivos adicionales que se pueden añadir para proporcionar un color, un sabor, una estabilidad, una capacidad tamponadora, una dispersión u otros rasgos deseables conocidos, el óxido de hierro rojo, el lauril sulfato sódico, el d ió x id o d e t i ta n io y la t in ta b la n c a c o m e s t ib le . S e p u e d e n u t il iz a r d ilu y e n te s s im ila re s p a ra p ro d u c ir c o m p r im id o s s o m e t id o s a c o m p re s ió n . E s p o s ib le p ro d u c ir ta n to lo s c o m p r im id o s c o m o la s c á p s u la s c o m o p ro d u c to s d e lib e ra c ió n s o s te n id a p a ra p ro p o rc io n a r la lib e ra c ió n c o n t in u a d e l m e d ic a m e n to d u ra n te un p e río d o d e h o ra s . L o s c o m p r im id o s s o m e t id o s a c o m p re s ió n p u e d e n re v e s t irs e c o n a z ú c a r o c o n p e líc u la s p a ra e n m a s c a ra r c u a lq u ie r s a b o r d e s a g ra d a b le y p a ra p ro te g e r lo s d e la a tm ó s fe ra , o p u e d e n l le v a r un re v e s t im ie n to e n té r ic o p a ra su d is g re g a c ió n s e le c t iv a e n e l tu b o g a s tro in te s t in a l. L a s fo rm a s fa rm a c é u tic a s líq u id a s p a ra a d m in is t ra c ió n o ra l p u e d e n c o n te n e r c o lo ra n te s y s a b o r iz a n te s p a ra a u m e n ta r la a c e p ta c ió n p o r p a r te d e l p a c ie n te .
L a s fo rm u la c io n e s a d e c u a d a s p a ra la a d m in is tra c ió n p a re n te ra l in c lu y e n s o lu c io n e s in y e c ta b le s e s té r ile s is o tó n ic a s a c u o s a s y n o a c u o s a s q u e p u e d e n c o n te n e r a n t io x id a n te s , ta m p o n e s , b a c te r io s tá t ic o s y s o lu to s q u e h a c e n q u e la fo rm u la c ió n s e a is o tó n ic a c o n la s a n g re d e l re c e p to r d e s e a d o ; y s u s p e n s io n e s e s té r ile s a c u o s a s y n o a c u o s a s q u e p u e d e n in c lu ir a g e n te s d e s u s p e n s ió n , s o lu b il iz a n te s , a g e n te s e s p e s a n te s , e s ta b i l iz a n te s y c o n s e rv a n te s .
L o s c o m p o n e n te s u t iliz a d o s p a ra fo rm u la r las c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s t ie n e n , p re fe re n te m e n te , u n a p u re z a e le v a d a y c a re c e n s u s ta n c ia lm e n te d e c o n ta m in a n te s p o s ib le m e n te d a ñ in o s (p o r e je m p lo , a l m e n o s d e g ra d o a lim e n ta r io n a c io n a l, e n g e n e ra l a l m e n o s d e g ra d o a n a lít ic o , y m á s g e n e ra lm e n te a l m e n o s d e g ra d o fa rm a c é u tic o ) . A s im is m o , la s c o m p o s ic io n e s d e s e a d a s p a ra su u s o in vivo s u e le n s e r e s té r ile s . E n la m e d id a q u e un c o m p u e s to e s p e c íf ic o d e b e s in te t iz a rs e a n te s d e su u so , e l p ro d u c to re s u lta n te n o rm a lm e n te c a re c e s u s ta n c ia lm e n te d e c u a lq u ie r a g e n te p o s ib le m e n te tó x ic o , en p a rt ic u la r , c u a lq u ie r e n d o to x in a q u e p u e d a h a b e r d u ra n te e l p ro c e s o d e s ín te s is o p u r if ic a c ió n . L a s c o m p o s ic io n e s p a ra a d m in is tra c ió n p a re n te ra l ta m b ié n s o n e s té r ile s , s u s ta n c ia lm e n te is o tó n ic a s y se e la b o ra n e n c o n d ic io n e s d e G M P (goog manufacturing practice, p rá c t ic a s a d e c u a d a s d e fa b r ic a c ió n ) .
E s p o s ib le o p t im iz a r la s fo rm u la c io n e s p a ra su re te n c ió n y e s ta b il iz a c ió n e n e l c e re b ro o e n e l s is te m a n e rv io s o c e n tra l. C u a n d o s e a d m in is tra e l a g e n te a l c o m p a r t im e n to c ra n e a l, se p u e d e d e s e a r la re te n c ió n d e l a g e n te e n e l c o m p a r t im ie n to y q u e n o s e d ifu n d a o a t ra v ie s e la b a rre ra h e m a to e n c e fá lic a d e o tra fo rm a . L a s té c n ic a s d e e s ta b i l iz a c ió n in c lu y e n re t ic u la c ió n , m u lt im e r iz a c ió n o e n la c e a g ru p o s , ta le s c o m o p o lie t i le n g lic o l, p o lia c r i la m id a , v e h íc u lo s p ro te ic o s n e u tro s , e tc ., p a ra a u m e n ta r su p e s o m o le c u la r .
O tra s e s tra te g ia s p a ra a u m e n ta r la re te n c ió n in c lu y e n a t ra p a r e l a n tic u e rp o , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n , e n un im p la n te b io d e g ra d a b le o b io e ro s io n a b le . L a v e lo c id a d d e tra n s p o r te a t ra v é s d e la m a tr iz p o lim é r ic a y la b io d e g ra d a c ió n d e l im p la n te c o n tro la n la v e lo c id a d d e lib e ra c ió n d e l a g e n te te ra p é u t ic a m e n te a c tiv o . L a s o lu b il id a d d e l c o m p u e s to , h id ro f il ic id a d p o lim é r ic a , e x te n s ió n d e la re t ic u la c ió n p o lim é r ic a , e x p a n s ió n d e l p o lím e ro c o n la a b s o rc ió n d e a g u a p a ra h a c e r q u e la b a rre ra p o lim é r ic a s e a m á s p e rm e a b le a l fá rm a c o , la g e o m e tr ía d e l im p la n te y fa c to re s s im ila re s a fe c ta n a l t ra n s p o r te d e l fá rm a c o a t ra v é s d e la b a rre ra p o lim é r ic a . L o s im p la n te s t ie n e n d im e n s io n e s c o m p a ra b le s a l ta m a ñ o y a la fo rm a d e la re g ió n s e le c c io n a d a c o m o e l lu g a r d e l im p la n te . L o s im p la n te s p u e d e n s e r p a r tíc u la s , lá m in a s , p a rc h e s , p la c a s , f ib ra s , m ic ro c á p s u la s y s im ila re s , y p u e d e n te n e r c u a lq u ie r ta m a ñ o o fo rm a c o m p a t ib le co n e l lu g a r d e in s e rc ió n s e le c c io n a d o .
L o s im p la n te s p u e d e n s e r m o n o lí t ic o s , e s d e c ir , c o n e l a g e n te a c t iv o d is tr ib u id o d e fo rm a h o m o g é n e a e n la m a tr iz p o lim é r ic a , o p u e d e n e n c a p s u la rs e , e n c u y o c a s o , la m a tr iz p o lim é r ic a e n c a p s u la un d e p ó s ito d e a g e n te a c tiv o . La s e le c c ió n d e la c o m p o s ic ió n p o lim é r ic a a e m p le a r v a r ia rá co n e l lu g a r d e a d m in is tra c ió n , e l p e r ío d o d e tra ta m ie n to d e s e a d o , la to le ra n c ia d e l p a c ie n te , la n a tu ra le z a d e la e n fe rm e d a d a t r a ta r y fa c to re s s im ila re s . L a s c a ra c te r ís t ic a s d e lo s p o lím e ro s in c lu irá n c a p a c id a d d e b io d e g ra d a c ió n e n e l lu g a r d e l im p la n te , c o m p a t ib il id a d c o n e l a g e n te d e in te ré s , fa c il id a d d e e n c a p s u la c ió n y s e m iv id a en e l e n to rn o f is io ló g ic o .
L a s c o m p o s ic io n e s p o lim é r ic a s b io d e g ra d a b le s q u e s e p u e d e n e m p le a r p u e d e n s e r é te re s o é s te re s o rg á n ic o s qu e , c u a n d o se d e g ra d a n , g e n e ra n p ro d u c to s c o n d e g ra d a c ió n f is io ló g ic a m e n te a c e p ta b le , lo q u e in c lu y e lo s m o n ó m e ro s . T a m b ié n re s u lta n s e r ú tile s a n h íd r id o s , a m id a s , o r to é s te re s o s im ila re s , s o lo s o e n c o m b in a c ió n c o n o tro s m o n ó m e ro s . L o s p o lím e ro s s e rá n p o lím e ro s d e c o n d e n s a c ió n . L o s p o lím e ro s s e p u e d e n e n c o n tra r re t ic u la d o s o no re t ic u la d o s . L o s p o lím e ro s d e á c id o s c a rb o x í lic o s h id ro x ia lifá t ic o s , y a s e a h o m o o c o p o lím e ro s , a s í c o m o lo s p o lis a c á r id o s , s o n d e p a r t ic u la r in te ré s . L o s p o lié s te re s d e in te ré s in c lu y e n p o lím e ro s d e á c id o D - lá c t ic o , á c id o L - lá c t ic o , á c id o lá c t ic o ra c é m ic o , á c id o g lic ó lic o , p o lic a p ro la c to n a y c o m b in a c io n e s d e e s to s . A l e m p le a r L - la c ta to o D - la c ta to , s e o b t ie n e un p o lím e ro d e b io d e g ra d a c ió n le n ta y s e m e jo ra s u s ta n c ia lm e n te la d e g ra d a c ió n co n e l ra c e m a to . L o s c o p o lím e ro s d e á c id o g lic ó lic o y lá c t ic o s o n d e p a r t ic u la r in te ré s , d o n d e la v e lo c id a d d e b io d e g ra d a c ió n e s c o n tro la d a m e d ia n te la p ro p o rc ió n d e á c id o g lic ó lic o co n re s p e c to a lá c tic o . E l c o p o lím e ro d e g ra d a d o m á s rá p id a m e n te t ie n e a p ro x im a d a m e n te la s m is m a s c a n t id a d e s d e á c id o g lic ó lic o y á c id o lá c tic o , e n c u y o c a s o e l h o m o p o lím e ro e s m á s re s is te n te a la d e g ra d a c ió n . L a re la c ió n d e á c id o g lic ó lic o a á c id o lá c t ic o ta m b ié n a fe c ta rá a la f ra g il id a d d e l im p la n te y s e d e s e a un im p la n te m á s f le x ib le p a ra g e o m e tr ía s m a y o re s . L o s p o lis a c á r id o s d e in te ré s in c lu y e n a lg in a to d e c a lc io y c e lu lo s a s fu n c io n a liz a d a s , e n p a rt ic u la r , é s te re s d e c a rb o x im e t i lc e lu lo s a c a ra c te r iz a d o s p o r n o s e r s o lu b le s e n a g u a , p o r te n e r un p e s o m o le c u la r d e a p ro x im a d a m e n te 5 k D a 500 kD , e tc . T a m b ié n se p u e d e n e m p le a r h id ro g e le s b io d e g ra d a b le s e n los im p la n te s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . U s u a lm e n te , lo s h id ro g e le s s o n un m a te r ia l c o p o lim é r ic o c a ra c te r iz a d o p o r la c a p a c id a d d e a b s o rc ió n d e un líq u id o . E n H e lle r , Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A . P e p p e s e d ., to m o III, C R C P re s s , B o c a R a to n , F lo r id a , 1987 , p á g s . 137 -149 , se d e s c r ib e n e je m p lo s d e h id ro g e le s b io d e g ra d a b le s q u e se p u e d e n e m p le a r .
Dosis farmacéuticas
S e p u e d e n a d m in is t ra r c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n q u e c o n t ie n e n un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n a un in d iv id u o q u e re q u ie re tr a ta m ie n to co n e l a n t ic u e rp o a n ti s o rt il in a , p re fe re n te m e n te , un s e r h u m a n o , d e a c u e rd o co n m é to d o s c o n o c id o s , ta le s c o m o la a d m in is tra c ió n in tra v e n o s a en e m b o la d a o m e d ia n te in fu s ió n c o n t in u a d u ra n te un p e r ío d o d e t ie m p o , m e d ia n te v ía in tra m u s c u la r , in tra p e r ito n e a l, in t ra c e re b ro e s p in a l, in tra c ra n e a l, in tra e s p in a l, s u b c u tá n e a , in tra a r t ic u la r , in tra s in o v ia l, in tra te c a l, o ra l, tó p ic a o p o r in h a la c ió n .
L a s d o s is y la c o n c e n tra c ió n d e fá rm a c o d e s e a d a s d e la s c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u t ic a s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e n v a r ia r c o n fo rm e a l u s o p a r t ic u la r p re v is to . U n in d iv id u o c o n e x p e r ie n c ia e n la té c n ic a p o d rá d e te rm in a r la d o s is o la v ía d e a d m in is tra c ió n a d e c u a d a . L o s e x p e r im e n to s e n a n im a le s s irv e n c o m o o r ie n ta c ió n f ia b le p a ra d e te rm in a r d o s is e f ic a c e s p a ra e l t ra ta m ie n to d e s e re s h u m a n o s . E s p o s ib le g ra d u a r la s d o s is e f ic a c e s p a ra o tra s e s p e c ie s d e a c u e rd o c o n lo s p r in c ip io s d e s c r ito s e n M o rd e n ti, J. y C h a p p e ll, W . « T h e U s e o f In te rs p e c ie s S c a lin g in T o x ic o k in e t ic s » e n Toxicokinetics and New Drug Development, Y a c o b i e t a l., E d s , P e rg a m o n P re s s , N u e v a Y o rk , 1989 , p á g s . 42 -46.
E n e l c a s o d e a d m in is tra c ió n in vivo d e c u a lq u ie ra d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n , la s d o s is n o rm a le s p u e d e n v a r ia r d e a p ro x im a d a m e n te 10 n g /k g a a p ro x im a d a m e n te 100 m g /k g d e p e s o c o rp o ra l d e un in d iv id u o o m á s p o r d ía y, p re fe re n te m e n te , d e a p ro x im a d a m e n te 1 m g /k g /d ía a a p ro x im a d a m e n te 10 m g /k g /d ía c o n fo rm e a la v ía d e a d m in is tra c ió n . E n e l c a s o d e a d m in is t ra c io n e s re p e t id a s d u ra n te e l t ra n s c u rs o d e v a r io s d ía s o m á s , d e a c u e rd o c o n la g ra v e d a d d e la e n fe rm e d a d , t ra s to rn o o a fe c c ió n a tra ta r , e l t ra ta m ie n to s e m a n t ie n e h a s ta q u e s e lo g ra u n a re d u c c ió n d e s e a d a d e lo s s ín to m a s .
U n e je m p lo d e p a u ta d e d o s if ic a c ió n p u e d e in c lu ir la a d m in is tra c ió n d e u n a d o s is in ic ia l d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e a p ro x im a d a m e n te 2 m g /k g , s e g u id a d e u n a d o s is d e m a n te n im ie n to s e m a n a l d e a p ro x im a d a m e n te 1 m g /k g c a d a d o s s e m a n a s . P u e d e n s e r ú t ile s o tra s p a u ta s d e d o s if ic a c ió n , d e a c u e rd o co n e l p a tró n d e d e s in te g ra c ió n fa rm a c o c in é t ic o q u e d e s e e o b te n e r e l m é d ic o . P o r e je m p lo , e n e l p re s e n te d o c u m e n to se c o n te m p la la a d m in is tra c ió n d e d o s is a un in d iv id u o d e u n a a v e in t iu n a v e c e s a la s e m a n a . E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , e s p o s ib le u t i l iz a r u n a d o s if ic a c ió n q u e v a r íe d e a p ro x im a d a m e n te 3 jg / k g a a p ro x im a d a m e n te 2 m g /k g ( ta l c o m o d e a p ro x im a d a m e n te 3 | jg /k g , d e a p ro x im a d a m e n te 10 jg / k g , d e a p ro x im a d a m e n te 30 jg / k g , d e a p ro x im a d a m e n te 100 jg / k g , de a p ro x im a d a m e n te 300 jg / k g , d e a p ro x im a d a m e n te 1 m g /k g y d e a p ro x im a d a m e n te 2 /m g /k g ) . En d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , la f re c u e n c ia d e d o s if ic a c ió n e s d e t re s v e c e s p o r d ía , d o s v e c e s p o r d ía , u n a v e z p o r d ía , u n a v e z c a d a d o s d ía s , u n a v e z p o r s e m a n a , u n a v e z c a d a d o s s e m a n a s , u n a v e z c a d a c u a tro s e m a n a s , u n a v e z c a d a c in c o s e m a n a s , u n a v e z c a d a s e is s e m a n a s , u n a v e z c a d a s ie te s e m a n a s , u n a v e z c a d a o c h o s e m a n a s , u n a v e z c a d a n u e v e s e m a n a s , u n a v e z c a d a d ie z s e m a n a s o u n a v e z p o r m e s , u n a v e z c a d a d o s m e s e s , u n a v e z c a d a t re s m e s e s o m ás . E l p ro g re s o d e la te ra p ia s e c o n tro la fá c i lm e n te m e d ia n te té c n ic a s y e n s a y o s c o n v e n c io n a le s . L a p a u ta d e d o s if ic a c ió n , lo q u e in c lu y e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a a d m in is tra d o , p u e d e v a r ia r c o n e l t ra n s c u rs o d e l t ie m p o in d e p e n d ie n te m e n te d e la d o s is u tiliz a d a .
E s p o s ib le d e te rm in a r la s d o s is p a ra un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p a r t ic u la r d e fo rm a e m p ír ic a e n in d iv id u o s q u e re c ib ie ro n u n a o m á s a d m in is t ra c io n e s d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t il in a . L o s in d iv id u o s re c ib e n d o s is c re c ie n te s d e a n t ic u e rp o a n ti s o r t il in a . E s p o s ib le m o n ito r iz a r un s ín to m a c lín ic o d e c u a lq u ie ra d e las e n fe rm e d a d e s , t ra s to rn o s o a fe c c io n e s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n (p o r e je m p lo , d e m e n c ia f ro n to te m p o ra l, e n fe rm e d a d d e A lz h e im e r , d e m e n c ia v a s c u la r , c o n v u ls io n e s , d is tro f ia d e la re tin a , le s ió n c e re b ra l p o r t ra u m a t is m o , d a ñ o d e la m é d u la e s p in a l, d e p re s ió n p ro lo n g a d a , e n fe rm e d a d e s v a s c u la re s a te ro e s c le ró t ic a s y s ín to m a s n o d e s e a d o s d e e n v e je c im ie n to n o rm a l) p a ra e v a lu a r la e f ic a c ia d e un a n t ic u e rp o a n ti s o rt il in a .
L a a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e s e r c o n t in u a o in te rm ite n te , d e p e n d ie n d o , p o r e je m p lo , d e l e s ta d o f is io ló g ic o d e l re c e p to r , d e s i la f in a lid a d d e la a d m in is tra c ió n e s te ra p é u t ic a o p ro f ilá c t ic a , y d e o tro s fa c to re s c o n o c id o s p o r lo s p ro fe s io n a le s co n e x p e r ie n c ia . L a a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p u e d e s e r e s e n c ia lm e n te c o n t in u a d u ra n te un p e río d o d e t ie m p o p re s e le c c io n a d o o s e p u e d e p ro d u c ir en u n a s e r ie d e d o s is s e p a ra d a s .
S e p u e d e e n c o n tra r in fo rm a c ió n d e re fe re n c ia re s p e c to a d o s is p a r t ic u la re s y m é to d o s d e a d m in is tra c ió n e n la b ib lio g ra f ía , p o r e je m p lo , e n la s p a te n te s e s ta d o u n id e n s e s n .° 4 657 760 , 5 206 344 o 5 225 212. E l a lc a n c e d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n c o m p re n d e q u e fo rm u la c io n e s d ife re n te s s e rá n e f ic a c e s p a ra t ra ta m ie n to s d ife re n te s y t ra s to rn o s d ife re n te s , y q u e la a d m in is tra c ió n d e s e a d a p a ra t r a ta r un ó rg a n o o te j id o e s p e c íf ic o p u e d e re q u e r ir la a d m in is tra c ió n e n u n a fo rm a d ife re n te a a q u e lla p a ra o tro ó rg a n o o te jid o . A s im is m o , la s d o s is s e p u e d e n a d m in is t ra r m e d ia n te u n a o m á s a d m in is t ra c io n e s s e p a ra d a s , o m e d ia n te in fu s ió n c o n tin u a . E n e l c a s o d e a d m in is t ra c io n e s re p e t id a s d u ra n te v a r io s d ía s o m á s , d e a c u e rd o c o n la a fe c c ió n , e l t ra ta m ie n to se m a n t ie n e h a s ta q u e se p ro d u c e u n a s u p re s ió n d e s e a d a d e lo s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d . S in e m b a rg o , o tro s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n p u e d e n s e r ú tile s . E s p o s ib le c o n tro la r la e v o lu c ió n d e e s te t ra ta m ie n to m e d ia n te e n s a y o s y té c n ic a s c o n v e n c io n a le s .
Usos terapéuticos
A s p e c to s a d ic io n a le s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p ro p o rc io n a n m é to d o s p a ra a u m e n ta r lo s n iv e le s d e p ro g ra n u lin a en un in d iv id u o q u e lo re q u ie re , ta l c o m o e n e l c e re b ro , en la s a n g re y /o e n ó rg a n o s p e r ifé r ic o s d e l in d iv id u o , a d m in is tra n d o sortilina de la presente divulgación para: (i) inhibir la interacción entre sortilina y progranulina, una neurotrofina de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sort-pro), proteína precursora amiloide (APP), péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE) y/o proteína asociada a receptor (RAp ), y/o (ii) inhibir una o más actividades de sortilina, progranulina, una neurotrofina de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), neurotensina, p75, propéptido de sortilina (Sortpro), proteína precursora amiloide (APP), péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE) y/o proteína asociada a receptor (RAP). En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos para inducir la curación de una herida en un individuo que lo necesite, administrando al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación.
La presente divulgación también proporciona métodos para promover la supervivencia celular, tal como la supervivencia de células neuronales, administrando un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación para inhibir la interacción entre sortilina y progranulina, una neurotrofina de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), neurotensina, p75, proteína precursora amiloide (APP) y el péptido beta A. El anticuerpo anti sortilina se puede administrar a las células in vitro para promover la supervivencia celular. De manera alternativa, el anticuerpo anti sortilina se puede administrar in vivo (por ejemplo, administrando el anticuerpo a un individuo) para promover la supervivencia celular.
La presente divulgación también proporciona métodos para inhibir la neuroinflamación, la axonopatía caracterizada por un crecimiento axonal corto y una ramificación aberrante, la activación de la microglía y la respuesta inflamatoria y para promover la curación de heridas, la autofagia y la eliminación de proteínas agregadas, administrando un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación para inhibir la interacción entre sortilina y progranulina, una neurotrofina de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), neurotensina, p75, proteína precursora amiloide (APP) y el péptido beta A. El anticuerpo anti sortilina se puede administrar a las células in vitro. De manera alternativa, el anticuerpo anti sortilina se puede administrar in vivo (por ejemplo, administrando el anticuerpo a un individuo).
La presente divulgación también proporciona métodos para reducir la expresión de uno o más mediadores proinflamatorios administrando un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación a un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el uno o más mediadores proinflamatorios se seleccionan de IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1p, TNF-a, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 y CCL5.
Demencia
La demencia es un síndrome (es decir, un conjunto de señales y síntomas) inespecífico, que se presenta como una pérdida grave de capacidad cognitiva global en una persona previamente no afectada más allá de lo que se podría esperar debido al envejecimiento normal. La demencia puede permanecer estática como consecuencia de una única lesión cerebral global. De manera alternativa, la demencia puede ser progresiva, lo que genera un deterioro prolongado debido a daño o enfermedad en el cuerpo. Aunque la demencia es mucho más habitual en la población geriátrica, también se puede presentar antes de los 65 años. Las áreas cognitivas afectadas por la demencia incluyen, de modo no taxativo, memoria, capacidad de concentración, lenguaje y resolución de problemas. En general, los síntomas se deben presentar durante al menos seis meses antes de que se diagnostique que un individuo padece demencia.
Como ejemplos de formas de demencia se incluyen, de modo no taxativo, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia semántica y demencia con cuerpos de Lewy.
Sin limitarse a la teoría, se cree que la administración de un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación puede prevenir, reducir el riesgo y/o tratar la demencia. En algunas realizaciones, la administración de un anticuerpo anti sortilina puede inducir una o más actividades de progranulina en un individuo que padece demencia (por ejemplo, actividad neurotrófica y/o de supervivencia en neuronas y actividad antiinflamatoria).
Demencia frontotemporal
La demencia frontotemporal (FTD) es una afección generada por el deterioro progresivo del lóbulo frontal del cerebro. Con el transcurso del tiempo, la degeneración puede progresar al lóbulo temporal. En segundo lugar de prevalencia, después de la enfermedad de Alzheimer (AD), la FTD representa el 20 % de los casos de demencia presenil. Los rasgos clínicos de la FTD incluyen déficits de memoria, anomalías de comportamiento, cambios en la personalidad e impedimentos en el lenguaje (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C., Trends Genet.24:186-194 (2008); Neary, D., et al., Neurology 51:1546-1554 (1998); Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K. & Hodges, J. R., Neurology 58:1615-1621 (2002)).
Una parte importante de los casos de FTD se heredan de forma dominante autosómica, pero los síntomas pueden abarcar un espectro de FTD con perturbaciones de comportamiento a afasia progresiva primaria y degeneración ganglionar corticobasal incluso en una familia. Al igual que la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, la FTD se puede caracterizar por la presencia patológica de agregados proteicos específicos en el cerebro enfermo. Históricamente, las primeras descripciones de FTD reconocieron la presencia de acumulaciones intraneuronales de proteína Tau hiperfosforilada en ovillos neurofibrilares o cuerpos de Pick. La identificación de mutaciones en el gen que codifica la proteína Tau en varias familias confirma el rol causal de la proteína Tau asociada a microtúbulos (Hutton, M., et al., Nature 393:702-705 (1998). Sin embargo, la mayoría de los cerebros con FTD no presentan acumulación de Tau hiperfosforilada, pero muestran inmunorreactividad a la ubiquitina (Ub) y a la proteína de unión a ADN TAR (TDP43) (Neumann, M., et al., Arch. Neurol.64:1388-1394 (2007)). Se demostró que una mayoría de dichos casos de FTD con inclusiones de Ub (FTD-U) lleva mutaciones en el gen de la progranulina.
Las mutaciones de progranulina generan haploinsuficiencia y se sabe que se encuentran presentes en cerca del 50 % de los casos de FTD familiar, lo que hace que la progranulina sea un contribuyente genético importante a la FTD. Sin limitarse a la teoría, se cree que el carácter heterocigoto de pérdida de función de las mutaciones de progranulina indican que la expresión de progranulina en individuos sanos cumple una función esencial dependiente de la dosis en la protección de individuos sanos contra el desarrollo de FTD.
Por consiguiente, el aumento de los niveles de progranulina inhibiendo la interacción entre la sortilina y la progranulina puede prevenir, reducir el riesgo y/o tratar la FTD.
Enfermedad de Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia. No existe cura para la enfermedad y empeora a medida que evoluciona y, finalmente, conduce a la muerte. En la mayoría de los casos, se diagnostica Ea en individuos mayores de 65 años. Sin embargo, la enfermedad de Alzheimer de aparición temprana de menor prevalencia se puede presentar mucho antes.
Los síntomas comunes de la enfermedad de Alzheimer incluyen síntomas de comportamiento, tales como dificultad para recordar eventos recientes, síntomas cognitivos, confusión, irritabilidad y agresión, cambios de humor, problemas con el lenguaje y pérdida de memoria a largo plazo. A medida que la enfermedad evoluciona, se pierden funciones corporales, lo que conduce, en última instancia, a la muerte. La enfermedad de Alzheimer se desarrolla durante una extensión de tiempo desconocida y variable antes de ser completamente evidente y puede evolucionar sin diagnóstico durante años.
Se ha demostrado que la sortilina se une a la proteína precursora amiloide (APP) y a la enzima de procesamiento de APP BACE1. Sin limitarse a la teoría, se cree que dichas interacciones están involucradas en la enfermedad de Alzheimer. Por consiguiente, y sin limitarse a la teoría, se considera que es posible utilizar los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación para inhibir dichas interacciones y prevenir, reducir el riesgo o tratar la enfermedad de Alzheimer en individuos que lo necesitan.
También se ha demostrado en estudios recientes que los niveles de proneurotrofinas (por ejemplo, pro-NGF, pro-BDNF, etc.) aumentan en las etapas tempranas de la enfermedad de Alzheimer (por ejemplo, Fahnestock, M et al., (2001) Cell Neurosci. 18, 210-220; Michalski, B et al., (2003) Brain Res. Mol. Brain Res. 111, 148-154; Pedraza, CE et al., (2005) Am. J. Pathol. 166, 533-543; y Peng, S et al., (2005) J. Neurochem. 93, 1412-1421). Asimismo, las proneurotrofinas experimentan glucación y lipoxidación en el hipocampo y la corteza entorrinal de pacientes con enfermedad de Alzheimer (Counts, SE et al., (2004) Ann. Neurol. 5 6 , 520-531; y Counts, SE et al., (2005) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 263-272). Esto hace que las proneurotrofinas sean menos susceptibles al procesamiento en neurotrofinas maduras. Asimismo, se reduce la expresión de TrkA en pacientes con enfermedad de Alzheimer, al tiempo que la expresión de p75 y sortilina no varía. Por consiguiente, y sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), p75, proteína precursora amiloide (APP) y/o el péptido beta A, o que inhiben una o más actividades de sortilina, se pueden utilizar para prevenir, reducir el riesgo o tratar la enfermedad de Alzheimer en individuos que lo necesitan.
Demencia vascular
La demencia vascular (VaD) es un empeoramiento levemente progresivo de la memoria y de otras funciones cognitivas que se cree que se debe a una enfermedad cerebrovascular (enfermedad vascular cerebral). La enfermedad cerebrovascular es el cambio progresivo de los vasos sanguíneos (vasculatura) en el cerebro (encéfalo). El cambio vascular más común asociado con la edad es la acumulación de colesterol y de otras sustancias en las paredes de los vasos sanguíneos. Esto engrosa y endurece las paredes, y estrecha los vasos, lo que puede generar una reducción o incluso la interrupción total del flujo sanguíneo a regiones cerebrales a las que alimenta la arteria afectada. A menudo, los pacientes con demencia vascular presentan síntomas similares a los de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA). Sin embargo, los cambios relacionados en el cerebro no se deben a la patología de EA, sino al flujo sanguíneo reducido crónico en el cerebro, lo que, finalmente, lleva a la demencia. Se considera que la VaD es uno de los tipos más comunes de demencia en adultos mayores. Los síntomas de la VaD incluyen dificultades de memoria, dificultad para organizar y resolver problemas complejos, enlentecimiento del razonamiento, distracción o falta de atención, dificultad para recordar palabras, cambios de humor o comportamiento, tales como depresión, irritabilidad o apatía, y alucinaciones o delirio.
Sin limitarse a la teoría, se cree que una o más actividades de sortilina o una o más interacciones entre sortilina y progranulina, neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), neurotensina, lipoproteína lipasa, apolipoproteína AV y/o proteína asociada a receptor están involucradas en la demencia vascular. Por consiguiente, y sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, etc.), p75, proteína precursora amiloide (APP), el péptido beta A, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE) y/o proteína asociada a receptor (RAP), o que inhiben una o más actividades de sortilina se pueden utilizar para prevenir, reducir el riesgo o tratar la demencia vascular en individuos que lo necesitan.
Convulsiones, distrofia de la retina, lesión cerebral por traumatismo, lesión de la médula espinal y depresión prolongada
Tal como se utiliza en el presente documento, la distrofia de la retina se refiere a cualquier enfermedad o afección que implique la degeneración de la retina. Dichas enfermedades o afecciones pueden llevar a la pérdida de visión o a la ceguera total.
Tal como se utiliza en el presente documento, las convulsiones también incluyen convulsiones epilépticas y hacen referencia a un síntoma transitorio de actividad neuronal sincrónica o excesiva anómala en el cerebro. El efecto exterior puede ser tan grave como un movimiento de vapuleo descontrolado o tan leve como una pérdida de conocimiento breve. Las convulsiones se pueden manifestar como una alteración del estado mental, movimientos tónicos o clónicos, y otros síntomas físicos diversos.
También se puede hacer referencia a las lesiones cerebrales por traumatismo (TBI, traumatic brain injuries) como lesiones intracraneales. Las lesiones cerebrales por traumatismo se producen cuando una fuerza externa lesiona de forma traumática el cerebro. Es posible clasificar las lesiones cerebrales por traumatismo según su gravedad, mecanismo (lesión penetrante o cerrada en la cabeza) u otras características (por ejemplo, que se producen en una ubicación específica o en un área general).
Las lesiones de la médula espinal (SCI, spinal cord injuries) incluyen cualquier lesión de la médula espinal causada por traumatismo en lugar de una enfermedad. De acuerdo con la ubicación en la que se dañan la médula espinal y las raíces nerviosas, los síntomas pueden variar ampliamente desde dolor a parálisis e incontinencia. Las lesiones de médula espinal se describen en varios niveles «incompletas», lo que puede variar de no tener efecto en el paciente a una lesión «completa», lo que significa una pérdida total de función.
La depresión prolongada (LTD, long-term depression) es una reducción dependiente de la actividad de la eficacia de las sinapsis neuronales que se extiende durante horas o más después de un estímulo de patrón extendido. La depresión prolongada se puede producir en varias áreas del sistema nervioso central con mecanismos variables de acuerdo con la región cerebral y la evolución del desarrollo. La depresión prolongada se puede producir en el hipocampo, el cerebelo y en tipos diferentes de neuronas que liberan varios neurotransmisores. Sin limitarse a la teoría, se cree que la depresión prolongada se puede asociar a la neurodegeneración, la demencia y la enfermedad de Alzheimer.
Se ha demostrado que las proneurotrofinas (por ejemplo, proneurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, etc.) cumplen una función en las convulsiones, distrofina de la retina , lesión cerebral por traumatismo, lesión de la médula espinal y depresión prolongada (por ejemplo, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci.26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49 -57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al. (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; y Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491).
Por consiguiente, y sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, n Gf , BDNF, etc.), o que inhiben una o más actividades de sortilina, se pueden utilizar para prevenir, reducir el riesgo o tratar convulsiones, distrofia de la retina, lesiones cerebrales por traumatismo, lesiones de la médula espinal y/o depresión prolongada en individuos que lo necesitan.
Enfermedades vasculares ateroescleróticas
Tal como se utilizan en el presente documento, “enfermedad vascular ateroesclerótica”, “ASVD” y “ateroesclerosis”, se emplean indistintamente y hacen referencia a cualquier afección en la que se engrosa una pared arterial debido a la acumulación de materiales grasos, tales como colesterol, lípidos y triglicéridos. Las enfermedades vasculares ateroescleróticas incluyen, de modo no taxativo, cualquier afección, trastorno o enfermedad asociada a ASVD, lo que incluye, de modo no taxativo, tromboembolia, accidente cerebrovascular, isquemia, infarto, trombosis coronaria, infarto de miocardio (por ejemplo, ataque cardíaco) y claudicación.
La enfermedad vascular ateroesclerótica es un síndrome que afecta los vasos sanguíneos arteriales, una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, lo que es provocado principalmente por la acumulación de leucocitos de macrófagos y promovido por las lipoproteínas de baja densidad (LDL) sin remoción adecuada de grasas y colesterol de los macrófagos por las lipoproteínas de alta densidad (HDL) funcionales. Usualmente, se hace referencia a una enfermedad vascular ateroesclerótica como el endurecimiento u obstrucción de las arterias y la causa la formación de múltiples placas en las arterias.
Tal como se desvela en el presente documento, las proteínas sortilina de la presente divulgación están implicadas en la regulación lipídica mediante la unión de proteínas asociadas a lípidos, tales como proteínas asociadas a receptores, lipoproteína lipasa y apolipoproteínas APOA5 y APOE (por ejemplo, Nisson, SK et al., (2007) Biochemistry 46: 3896­ 3904; Nisson, SKet al., (2008) JBiolChem 283: 25920-25927; y Klinger, SC et al., JCelISci 124: 1095-1105). También se ha demostrado que los ratones con deficiencia de sortilina presentan carga reducida de placas en la aorta y niveles de colesterol reducidos en plasma en el contacto de deficiencia de receptor de LDL (por ejemplo, Kjolby, M et al., Cell Metab 12: 213-223). Deforma coherente con funciones similares de los receptores de sortilina en metabolismo lipídico, se ha demostrado que SorLA tiene un efecto similar a la sortilina sobre el metabolismo lipídico, dado que la pérdida de SorLA tiene función de protección (por ejemplo, Guo, Z et al., Mediators Inflamm 2012: 540794). Se regula SorLA por aumento en placas ateromatosas en conejos y ratones, y se protege a los ratones inactivados de lesiones obstructivas vasculares (por ejemplo, Guo, Z et al., Mediators Inflamm 2012: 540794).
Por consiguiente, y sin limitarse a la teoría, se cree que los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina y lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5), apolipoproteína E (APOE) y/o proteína asociada a receptor (RAP), o que inhiben una o más actividades de sortilina, se pueden utilizar para prevenir, reducir el riesgo o tratar una o más enfermedades vasculares ateroescleróticas en individuos que lo necesitan.
Síntomas no deseados del envejecimiento
Tal como se utilizan en el presente documento, los síntomas no deseados del envejecimiento incluyen, de modo no taxativo, pérdida de memoria, cambios de comportamiento, demencia, enfermedad de Alzheimer, degeneración de la retina , enfermedades vasculares ateroescleróticas, pérdida auditiva y ruptura celular.
Se ha demostrado que las proneurotrofinas (por ejemplo, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, etc.) cumplen una función en el envejecimiento y los síntomas vinculados al envejecimiento (por ejemplo, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49 -57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci.10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci.
28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, Ket al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) J. Neurosci.27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res.1183, 32­ 42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491; y Al-Shawi, R et al., Ann N YAcadSci. 2007;1119:208-15).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina, progranulina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, n Gf , Bd NF, etc.), p75, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5) y/o proteína asociada a receptor (RAP), o que inhiben una o más actividades de sortilina, se pueden utilizar para prevenir, reducir el riesgo o tratar uno o más síntomas no deseados del envejecimiento.
Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)
Tal como se utilizan en el presente documento, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o enfermedad de la neurona motora o enfermedad de Lou Gehrig, se emplean indistintamente y hacen referencia a una enfermedad debilitante con una etiología variada que se caracteriza por el debilitamiento progresivo rápido, atrofia muscular y fasciculaciones, espasmos musculares, dificultad para hablar (disartria), dificultad para tragar (disfagia) y dificultad para respirar (disnea).
Se ha demostrado que la progranulina desempeña una función en ELA (Schymick, JC et al., (2007) J Neurol Neurosurg Psychiaty 78:754-6) y protege contra el daño causado por proteínas que causan ELA, tales como TDP-43 (Laird, AS et al., (2010). PLoS ONE 5: e13368). También se demostró que pro-NGF induce la muerte de oligodendrocitos y neuronas corticoespinales mediada por p75 después de una lesión de médula espinal (Beatty et al., Neuron (2002),36, págs. 375-386; Giehl et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (2004), 101, págs. 6226-30).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina, progranulina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, n Gf , Bd NF, etc.), p75, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5) y/o proteína asociada a receptor (RAP), o que inhiben una o más actividades de sortilina, se pueden utilizar para prevenir o tratar uno o más síntomas no deseados de ELA.
Depresión
Tal como se utilizan en el presente documento, depresión, trastorno depresivo mayor (MDD, major depressive disorder), depresión clínica, depresión mayor, depresión unipolar, trastorno unipolar, depresión recurrente o distimia se usan indistintamente y hacen referencia a un trastorno mental caracterizado por episodios de desánimo generalizado acompañado por baja autoestima y pérdida de interés o placer en lo que respecta a actividades usualmente disfrutables. Dicho cúmulo de síntomas (síndrome) se bautizó, se describió y se clasificó como uno de los trastornos del humor en la edición de 1980 del manual de diagnóstico de la American Psychiatric Association. El término «depresión» es ambiguo. A menudo, se utiliza para hacer referencia a dicho síndrome, pero puede hacer referencia a otros trastornos del humor o para calmar estados del humor sin importancia clínica. Un trastorno depresivo mayor es una afección incapacitante que afecta de forma adversa a la familia de un individuo, su vida laboral o académica, sus hábitos alimenticios y de sueño, y su salud general. En los Estados Unidos, aproximadamente el 3,4 % de las personas con depresión mayor se suicida y hasta el 60 % de las personas que se suicidan tienen depresión u otro trastorno del humor.
Se ha demostrado que las neurotrofinas están implicadas en la depresión y la acción antidepresiva (Duman et al., Arch Gen Psychiatry (1997) 54:597-606). Por ejemplo, la infusión de BDNF en el hipocampo produce un efecto antidepresivo en dos modelos de comportamiento de depresión (Shirayama et al., (2002), J Neurosci 22: 3251-3261). Asimismo, se observó que un polimorfismo de nucleótido simple en el gen bdnf que lleva a la sustitución de valina (Val) por metionina (Met) en el codón 66 en el prodominio (BDNFMet) se asocia al aumento de susceptibilidad a enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, depresión y trastorno bipolar en humanos heterocigotos para el polimorfismo (Chen et al, J. Neuroscience (2005), 25:6156-6166; Kuipers y Bramham, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. (2006) 9(5):580-6; y Bath y Lee, Cogn. Affect. Behav. Neurosci (2006) 1:79-85). Además, se demostró que los humanos heterocigotos para BDNFMet tienen impedimentos de memoria (Egan et al., Cell (2003). 112, págs. 257-269).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti sortilina de la presente divulgación que inhiben la interacción entre sortilina, progranulina y neurotrofinas de la presente divulgación (por ejemplo, proneurotrofinas, proneurotrofina-3, proneurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, n Gf , BDNF, etc.), p75, lipoproteína lipasa (LpL), apolipoproteína AV (APOA5) y/o proteína asociada a receptor (RAP), o que inhiben una o más actividades de sortilina se pueden utilizar para prevenir o tratar uno o más síntomas no deseados de depresión.
Enfermedad de Parkinson
La enfermedad de Parkinson, a la que se puede hacer referencia como parkinsonismo primario o idiopático, síndrome de rigidez hipocinética (HRS, hypokinetic rigid syndrome) o parálisis agitante, es un trastorno cerebral neurodegenerativo que afecta al control del sistema motor. La muerte progresiva de las células que producen dopamina en el cerebro lleva a los síntomas principales de la enfermedad de Parkinson. En la mayoría de los casos, la enfermedad de Parkinson se diagnostica en individuos de más de 50 años. En la mayoría de las personas, la enfermedad de Parkinson es idiopática (no tiene causa conocida). Sin embargo, los factores genéticos también cumplen una función en la enfermedad.
Los síntomas de la enfermedad de Parkinson incluyen, de modo no taxativo, temblor de las manos, brazos, piernas, mandíbula y rostro, rigidez muscular de las extremidades y el torso, lentitud de movimiento (bradicinesia), inestabilidad postural, dificultad para caminar, problemas neuropsiquiátricos, cambios del habla o el comportamiento, depresión, ansiedad, dolor, psicosis, demencia, alucinaciones y problemas para dormir.
Sin limitarse a la teoría, se cree que la administración de un anticuerpo anti sortilina de la presente divulgación puede impedir, reducir el riesgo y/o tratar la enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, la administración de un anticuerpo anti sortilina puede inducir una o más actividades de progranulina en un individuo con enfermedad de Parkinson.
Enfermedad de Huntington
La enfermedad de Huntington (HD) es una enfermedad neurodegenerativa heredada provocada por una mutación dominante autosómica en el gen de Huntington (HTT). La expansión de una repetición del triplete citocina-adeninaguanina (CAG) en el gen de Huntington genera la producción de una forma mutante de la proteína de Huntington (Htt) c o d if ic a d a p o r e l g e n . D ic h a p ro te ín a d e H u n t in g to n c o n m u ta c ió n (m H tt) e s tó x ic a y c o n tr ib u y e a la m u e r te n e u ro n a l. L o s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d d e H u n t in g to n s u e le n a p a re c e r e n tre lo s 35 y lo s 44 a ñ o s , a u n q u e p u e d e n a p a re c e r a c u a lq u ie r e d a d .
L o s s ín to m a s d e la e n fe rm e d a d d e H u n t in g to n in c lu y e n , d e m o d o n o ta x a t iv o , p ro b le m a s d e c o n tro l m o to r , b ru s q u e d a d , m o v im ie n to s a le a to r io s (c o re a ), m o v im ie n to s o c u la re s a n ó m a lo s , im p e d im e n to s d e e q u ilib r io , c o n v u ls io n e s , d if ic u lta d p a ra m a s tic a r , p ro b le m a s c o g n it iv o s , a lte ra c io n e s d e l h a b la , d é f ic its d e m e m o r ia d if ic u lta d e s p a ra ra z o n a r, in s o m n io , fa t ig a , d e m e n c ia , c a m b io s d e la p e rs o n a lid a d , d e p re s ió n , a n s ie d a d y c o m p o r ta m ie n to c o m p u ls iv o .
S in lim ita rs e a la te o r ía , s e c re e q u e la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e im p e d ir , re d u c ir e l r ie s g o y /o t r a ta r la e n fe rm e d a d d e H u n tin g to n (H D ). En a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p u e d e in d u c ir u n a o m á s a c t iv id a d e s d e p ro g ra n u lin a e n un in d iv id u o c o n H D .
Tauopatía
L a s ta u o p a t ía s re p re s e n ta n u n a c la s e d e e n fe rm e d a d e s n e u ro d e g e n e ra t iv a s p ro v o c a d a s p o r a g re g a d o d e la p ro te ín a ta u a s o c ia d a a m ic ro tú b u lo s e n e l c e re b ro . L a e n fe rm e d a d d e A lz h e im e r (E A ) e s la ta u o p a t ía m á s c o n o c id a e im p lic a u n a a c u m u la c ió n d e p ro te ín a ta u en la s n e u ro n a s e n fo rm a d e o v il lo s n e u ro f ib r ila re s (N F T , neurofibrillary tangles) in s o lu b le s . O tra s ta u o p a t ía s in c lu y e n p a rá lis is s u p ra n u c le a r p ro g re s iv a , d e m e n c ia p u g ilís t ic a (e n c e fa lo p a t ía t ra u m á t ic a c ró n ic a ) , d e m e n c ia f ro n to te m p o ra l y p a rk in s o n is m o v in c u la d o a l c ro m o s o m a 17, e n fe rm e d a d d e L y t ic o -B o d ig ( c o m p le jo d e d e m e n c ia y P a rk in s o n d e G u a m ), d e m e n c ia p re d o m in a n te d e o v illo s , g a n g l io g lio m a y g a n g lio c ito m a , m e n in g io a n g io m a to s is , p a n e n c e fa lit is e s c le ro s a n te s u b a g u d a , e n c e fa lo p a tía p r in c ip a l, e s c le ro s is tu b e ro s a , e n fe rm e d a d d e H a lle rv o rd e n -S p a tz , lip o fu s c in o s is , e n fe rm e d a d d e P ick , d e g e n e ra c ió n c o r t ic o b a s a l, a rg iro f i l ia g ra n u lo s a (A G D ), e n fe rm e d a d d e H u n tin g to n , d e m e n c ia f ro n to te m p o ra l y d e g e n e ra c ió n lo b u la r f ro n to te m p o ra l.
S in lim ita rs e a la te o r ía , s e c re e q u e la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e im p e d ir , re d u c ir e l r ie s g o y /o t r a ta r la ta u o p a tía . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p u e d e in d u c ir u n a o m á s a c t iv id a d e s d e p ro g ra n u lin a e n un in d iv id u o c o n ta u o p a tía .
Esclerosis múltiple
T a m b ié n s e p u e d e h a c e r re fe re n c ia a la e s c le ro s is m ú lt ip le (E M ) c o m o e s c le ro s is d is e m in a d a o e n c e fa lo m ie lit is d is e m in a d a . L a E M e s u n a e n fe rm e d a d in f la m a to r ia e n la c u a l s e d a ñ a n la s v a in a s d e m ie lin a g ra s a a lre d e d o r d e los a x o n e s d e l c e re b ro y la m é d u la e s p in a l, lo q u e lle v a a la d e s m ie lin iz a c ió n y la c ic a tr iz a c ió n , a s í c o m o a un a m p lio e s p e c tro d e s e ñ a le s y s ín to m a s . L a E M a fe c ta a la c a p a c id a d d e la s c é lu la s n e rv io s a s e n e l c e re b ro y la m é d u la e s p in a l p a ra c o m u n ic a rs e e n tre s í d e fo rm a e fic a z . L a s c é lu la s n e rv io s a s s e c o m u n ic a n e n v ia n d o s e ñ a le s e lé c tr ic a s d e n o m in a d a s p o te n c ia le s d e a c c ió n , a t ra v é s d e f ib ra s la rg a s , c o n o c id a s c o m o a x o n e s , c o n te n id a s e n u n a s u s ta n c ia a is la n te d e n o m in a d a m ie lin a . E n la E M , e l s is te m a in m u n ita r io d e l c u e rp o a ta c a y d a ñ a la m ie lin a . C u a n d o s e p ie rd e la m ie lin a , lo s a x o n e s p ie rd e n la c a p a c id a d d e c o n d u c ir s e ñ a le s d e m a n e ra e f ic a z . H a b itu a lm e n te , la a p a r ic ió n d e la E M s e p ro d u c e e n a d u lto s jó v e n e s y e s m á s c o m ú n e n m u je re s .
L o s s ín to m a s d e la E M in c lu y e n , d e m o d o no ta x a t iv o , c a m b io s e n la p e rc e p c ió n , ta le s c o m o p é rd id a d e s e n s ib il id a d o c o s q u ille o ; p u n z a d a s o in s e n s ib il id a d , ta l c o m o h ip o e s te s ia y p a re s te s ia ; d e b ilid a d m u s c u la r ; c lo n o ; e s p a s m o s m u s c u la re s ; d if ic u lta d d e m o v im ie n to ; d if ic u lta d e s d e c o o rd in a c ió n y e q u ilib r io , ta le s c o m o a ta x ia ; p ro b le m a s p a ra h a b la r, ta le s c o m o d is a rtr ia , o p a ra t ra g a r , ta le s c o m o d is fa g ia ; p ro b le m a s v is u a le s , ta le s c o m o n is ta g m o , n e u r it is ó p tic a q u e in c lu y e fo s fe n o s y d ip lo s c o p ía ; c a n s a n c io ; d o lo r a g u d o o c ró n ic o ; p ro b le m a s d e v e jig a e in te s t in o ; im p e d im e n to c o g n it iv o d e v a r io s g ra d o s ; s ín to m a s e m o c io n a le s d e d e p re s ió n y h u m o r in e s ta b le ; fe n ó m e n o d e U h th o ff, e l q u e im p lic a e x a c e rb a r lo s s ín to m a s e x is te n te s d e b id o a u n a e x p o s ic ió n a te m p e ra tu ra s a m b ie n ta le s m a y o re s q u e la s u s u a le s y la s e ñ a l d e L h e rm itte , la q u e e s u n a s e n s a c ió n e lé c tr ic a a lo la rg o d e la e s p a ld a c u a n d o s e f le x io n a e l c u e llo .
S in lim ita rs e a la te o r ía , s e c re e q u e la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e im p e d ir , re d u c ir e l r ie s g o y /o t r a ta r la e s c le ro s is m ú ltip le . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p u e d e in d u c ir u n a o m á s a c t iv id a d e s d e p ro g ra n u lin a e n un in d iv id u o c o n e s c le ro s is m ú ltip le .
Glaucoma y degeneración macular
E l g la u c o m a d e s c r ib e , d e fo rm a n o ta x a t iv a , un g ru p o d e e n fe rm e d a d e s q u e se c a ra c te r iz a n p o r un n e rv io ó p tic o d a ñ a d o , lo q u e p ro d u c e p é rd id a d e v is ió n y c e g u e ra . U s u a lm e n te , e l g la u c o m a s e d e b e a l a u m e n to d e p re s ió n d e f lu id o (= p re s ió n in tra o c u la r ) e n la c á m a ra a n te r io r , d e b a jo d e la c ó rn e a . E l g la u c o m a g e n e ra u n a p é rd id a s u c e s iv a d e c é lu la s g a n g l io n a re s d e la re t in a q u e s o n im p o r ta n te s p a ra la v is ió n . L a d e g e n e ra c ió n m a c u la r v in c u la d a a la e d a d s u e le a fe c ta r a p e rs o n a s m a y o re s y, p r in c ip a lm e n te , p ro v o c a la p é rd id a d e v is ió n e n la m á c u la , e l c a m p o d e v is ió n c e n tra l. L a d e g e n e ra c ió n m a c u la r p ro v o c a , d e fo rm a n o ta x a t iv a , d ru s a , c a m b io s e n la p ig m e n ta c ió n , v is ió n d is to rs io n a d a , h e m o r ra g ia s o c u la re s , a tro fia , a g u d e z a v is u a l re d u c id a , v is ió n b o rro s a , e s c o to m a s c e n tra le s , v is ió n d e c o lo r re d u c id a y s e n s ib il id a d a l c o n tra s te re d u c id a .
S in lim ita rs e a la te o r ía , s e c re e q u e la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e im p e d ir , re d u c ir e l r ie s g o y /o t r a ta r g la u c o m a y d e g e n e ra c ió n m a c u la r . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la a d m in is tra c ió n d e un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p u e d e in d u c ir u n a o m á s a c t iv id a d e s d e p ro g ra n u lin a e n un in d iv id u o c o n g la u c o m a o d e g e n e ra c ió n m a c u la r .
Enfermedad degenerativa de disco (DDD)
L a e n fe rm e d a d d e g e n e ra t iv a d e d is c o (D D D ) d e s c r ib e , d e m o d o n o ta x a t iv o , un g ru p o d e e n fe rm e d a d e s e n la s c u a le s un d is c o in te rv e r te b ra l ( IV D ) e x p e r im e n ta g ra n d e s c a m b io s m o r fo ló g ic o s y b io m e c á n ic o s , y s e s u e le m a n ife s ta r d e fo rm a c lín ic a en p a c ie n te s c o n d o lo r d e la e s p a ld a b a ja . U s u a lm e n te , lo s d is c o s d e g e n e ra d o s e x h ib e n f ib ro c a r t í la g o d e g e n e ra d o y g ru p o s d e c o n d ro c ito s , lo q u e s u g ie re re p a ra c ió n . P u e d e h a b e r p re s e n te in f la m a c ió n o no. L a s o b s e rv a c io n e s p a to ló g ic a s en D D D in c lu y e n p ro tu b e ra n c ia s , e s p o n d iló lis is y /o s u b d is lo c a c ió n d e v é r te b ra s (e s p o n d ilo l is te s is ) y e s te n o s is e s p in a l.
Kits/artículos de fabricación
L a p re s e n te d iv u lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a k its q u e c o n t ie n e n un a n t ic u e rp o a is la d o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n (p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to ) o un f ra g m e n to fu n c io n a l d e e s to s . L o s k its d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n p u e d e n in c lu ir u n o o m á s re c ip ie n te s q u e c o m p re n d e un a n t ic u e rp o p u r if ic a d o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s k its ta m b ié n in c lu y e n in s tru c c io n e s a u t i l iz a r d e a c u e rd o c o n lo s m é to d o s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , d ic h a s in s tru c c io n e s c o m p re n d e n la a d m in is tra c ió n d e l a n t ic u e rp o a is la d o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n (p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e s c r ito e n e l p re s e n te d o c u m e n to ) p a ra im p e d ir , re d u c ir e l r ie s g o o t r a ta r a un in d iv id u o q u e p a d e c e u n a e n fe rm e d a d , un tra s to rn o o u n a le s ió n q u e se s e le c c io n a d e d e m e n c ia fro n to te m p o ra l, e n fe rm e d a d d e A lz h e im e r , d e m e n c ia v a s c u la r , c o n v u ls io n e s , d is tro f ia d e la re tin a , le s ió n c e re b ra l p o r t ra u m a t is m o , le s ió n d e la m é d u la e s p in a l, d e p re s ió n p ro lo n g a d a , e n fe rm e d a d e s v a s c u la re s a te ro e s c le ró t ic a s , s ín to m a s n o d e s e a d o s d e l e n v e je c im ie n to n o rm a l, d e m e n c ia , d e m e n c ia m ix ta , e n fe rm e d a d d e C re u tz fe ld t-J a k o b , h id ro c e fa lia n o rm o te n s iv a , e s c le ro s is la te ra l a m io tró f ic a , e n fe rm e d a d d e H u n tin g to n , ta u o p a tía , e n fe rm e d a d d e N a s u -H a k o la , a c c id e n te c e re b ro v a s c u la r , t ra u m a t is m o g ra v e , t ra u m a t is m o c ró n ic o , lu p u s , c o lit is a g u d a y c ró n ic a , c ic a tr iz a c ió n d e h e r id a s , e n fe rm e d a d d e C ro h n , e n fe rm e d a d in f la m a to r ia in te s t in a l, c o lit is u lc e ro s a , m a la r ia , te m b lo r h e re d ita r io , lu p u s d e l s is te m a n e rv io s o c e n tra l, e n fe rm e d a d d e B e h c e t, e n fe rm e d a d d e P a rk in s o n , d e m e n c ia c o n c u e rp o s d e L e w y , a tro f ia d e s is te m a s m ú ltip le s , s ín d ro m e d e S h y -D ra g e r , p a rá lis is s u p ra n u c le a r p ro g re s iv a , d e g e n e ra c ió n g a n g l io n a r b a s a l c o rt ic a l, e n c e fa lo m ie lit is d is e m in a d a a g u d a , t r a s to rn o s g ra n u lo m a to s o s , s a rc o id o s is , e n fe rm e d a d e s v in c u la d a s a l e n v e je c im ie n to , d e g e n e ra c ió n m a c u la r re la c io n a d a a la e d a d , g la u c o m a , re t in it is p ig m e n to s a , d e g e n e ra c ió n d e la re tin a , in fe c c ió n d e la s v ía s re s p ira to r ia s , s e p s is , in fe c c ió n o c u la r, in fe c c ió n s is té m ic a , lu p u s , a rtr it is , e s c le ro s is m ú lt ip le y c ic a tr iz a c ió n d e h e r id a s , d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra m é to d o s d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s in s tru c c io n e s c o m p re n d e n u n a d e s c r ip c ió n d e c ó m o d e te c ta r u n a p ro te ín a s o r t il in a , p o r e je m p lo , en un in d iv id u o , c o n u n a m u e s tra d e te j id o o e n u n a c é lu la . A d e m á s , e l k it p u e d e c o m p re n d e r u n a d e s c r ip c ió n d e la s e le c c ió n d e un in d iv id u o a d e c u a d o p a ra e l t ra ta m ie n to e n fu n c ió n d e la id e n t if ic a c ió n d e s i d ic h o in d iv id u o p a d e c e la e n fe rm e d a d y la e ta p a d e la e n fe rm e d a d .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s k its ta m b ié n p u e d e n in c lu ir o tro a n t ic u e rp o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n (p o r e je m p lo , a l m e n o s un a n t ic u e rp o q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a u n a m o lé c u la d e p u n to d e c o n tro l d e in h ib ic ió n , a l m e n o s un a n t ic u e rp o q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a u n a c ito c in a d e in h ib ic ió n y /o a l m e n o s un a n t ic u e rp o a g o n is ta q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a u n a p ro te ín a d e p u n to d e c o n tro l d e e s t ím u lo ) y /o a l m e n o s u n a c ito c in a d e e s tím u lo . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s k its ta m b ié n p u e d e n in c lu ir in s tru c c io n e s p a ra u t il iz a r e l a n t ic u e rp o y /o la c ito c in a e s t im u la n te en c o m b in a c ió n co n un a n t ic u e rp o a is la d o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n (p o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e s c r ito en la p re s e n te ) , in s tru c c io n e s p a ra u t il iz a r e l a n t ic u e rp o a is la d o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n e n c o m b in a c ió n c o n un a n t ic u e rp o y /o u n a c ito c in a e s t im u la n te , o in s tru c c io n e s p a ra u t il iz a r un a n t ic u e rp o a is la d o d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n y un a n t ic u e rp o y /o c ito c in a e s t im u la n te , d e a c u e rd o c o n c u a lq u ie ra d e lo s m é to d o s d e e s ta d iv u lg a c ió n .
L a s in s tru c c io n e s g e n e ra lm e n te in c lu y e n in fo rm a c ió n s o b re la d o s if ic a c ió n , e l c ro n o g ra m a d e d o s if ic a c ió n y la v ía d e a d m in is t ra c ió n p a ra e l t ra ta m ie n to p re v is to . L o s re c ip ie n te s p u e d e n s e r d o s is u n ita r ia s , p a q u e te s a g ra n e l (p o r e je m p lo , p a q u e te s d e m ú lt ip le s d o s is ) o d o s is s u b u n ita r ia s . L a s in s tru c c io n e s s u m in is tra d a s e n lo s k its d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n s u e le n s e r in s tru c c io n e s e s c r ita s e n u n a e t iq u e ta o p ro s p e c to (p o r e je m p lo , u n a h o ja d e p a p e l in c lu id a en e l k it), p e ro ta m b ié n s o n a c e p ta b le s la s in s tru c c io n e s le g ib le s p o r o rd e n a d o r (p o r e je m p lo , in s tru c c io n e s c a rg a d a s en un d is c o d e a lm a c e n a m ie n to ó p tic o o m a g n é tic o ) .
L a e t iq u e ta o p ro s p e c to in d ic a q u e la c o m p o s ic ió n s e u t iliz a p a ra e l t ra ta m ie n to , p o r e je m p lo , d e u n a e n fe rm e d a d d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n . S e p u e d e n p ro p o rc io n a r in s tru c c io n e s p a ra p o n e r e n p rá c t ic a c u a lq u ie ra d e lo s m é to d o s d e s c r ito s e n e l p re s e n te d o c u m e n to .
L o s k its d e la p re s e n te d iv u lg a c ió n s e e n c u e n tra n e n un e n v a s e a d e c u a d o . L o s e n v a s e s a d e c u a d o s in c lu y e n , d e m o d o n o ta x a t iv o , v ia le s , b o te lla s , f ra s c o s , e n v a s e s f le x ib le s (p o r e je m p lo , b o ls a s M y la r o d e p lá s t ic o s e lla d a s ) y s im ila re s . T a m b ié n se c o n te m p la n e n v a s e s a u t i l iz a r en c o m b in a c ió n co n un d is p o s it iv o e s p e c íf ic o , ta l c o m o un in h a la d o r , d is p o s it iv o d e a d m in is tra c ió n n a s a l (p o r e je m p lo , un a to m iz a d o r ) o un d is p o s it iv o d e in fu s ió n ta l c o m o u n a m in ib o m b a .
Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede tener una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede tener una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo aislado de la presente divulgación (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina descrito en la presente). Además, el recipiente puede comprender un segundo agente farmacéuticamente activo.
Opcionalmente, los kits pueden proveer componentes adicionales, tales como soluciones tamponadoras e información interpretativa. Usualmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en dicho recipiente o asociado a este.
Usos de diagnóstico
Los anticuerpos aislados de la presente divulgación (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina descrito en la presente) también son útiles para el diagnóstico. Por consiguiente, la presente divulgación provee métodos para utilizar los anticuerpos de esta divulgación, o fragmentos funcionales de estos, con fines de diagnóstico, tal como la detección de una proteína sortilina en un individuo o en muestras de tejido obtenidas de un individuo.
En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo es un paciente humano que padece, o se encuentra en riesgo de desarrollar, una enfermedad, trastorno o lesión de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los métodos de diagnóstico involucran la detección de una proteína sortilina en una muestra biológica, tal como un espécimen de biopsia, un tejido o una célula. Se pone un anticuerpo aislado de la presente divulgación (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina descrito en la presente) en contacto con la muestra biológica y se detecta un anticuerpo unido a antígeno. Por ejemplo, se puede teñir un espécimen de biopsia con un anticuerpo anti sortilina descrito en la presente para detectar y/o cuantificar células asociadas a la enfermedad. El método de detección puede involucrar la cuantificación del anticuerpo unido al antígeno. La detección de anticuerpos en muestras biológicas se puede producir con cualquier método conocido en la técnica, lo que incluye microscopía con inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, ELISA, análisis FACS, inmunoprecipitación o tomografía por emisión de micropositrones. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se radiomarca, por ejemplo, con 18F, y luego se detecta con análisis de tomografía por emisión de micropositrones. También es posible cuantificar la unión a anticuerpo en un paciente mediante técnicas no invasivas, tales como tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada con rayos X, tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT), tomografía computarizada (TC) y tomografía axial computarizada (TAC).
En otras realizaciones, se puede utilizar un anticuerpo aislado de la presente divulgación (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina descrito en el presente documento) para detectar y/o cuantificar, por ejemplo, microglía en un espécimen de cerebro obtenido en un modelo de enfermedad preclínico (por ejemplo, un modelo de enfermedad no humano). De esa forma, un anticuerpo aislado de la presente divulgación (por ejemplo, un anticuerpo anti sortilina descrito en el presente documento) puede ser útil para evaluar la respuesta terapéutica después del tratamiento en un modelo para una lesión o enfermedad del sistema nervioso, tal como demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, convulsiones, distrofia de la retina, enfermedades vasculares ateroescleróticas, enfermedad de Nasu-Hakola o esclerosis múltiple, en comparación con un control.
La presente descripción se comprenderá de forma más detallada con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no se debería considerar que limitan el alcance de la presente divulgación.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Producción, identificación y caracterización de anticuerpos anti sortilina
Introducción
Es posible identificar los anticuerpos anti sortilina usando bibliotecas de presentación de anticuerpos basadas en levaduras, por ejemplo, tal como se desvela en los documentos w O 2009/036379, WO 2010/105256, WO 2012/009568, US 2009/0181855 y US 2010/0056386. Es posible utilizar dichas bibliotecas para identificar anticuerpos anti sortilina que bloquean la interacción entre la sortilina y un ligando de la misma, tal como progranulina y/o pro-NGF, y/o anticuerpos anti sortilina con reactividad cruzada con otras proteínas sortilina de mamíferos, tales como sortilina de ratón, sortilina de rata y/o sortilina de primate.
De manera alternativa, se pueden utilizar protocolos de análisis de expresión de levadura estándares, tal como se describen en estándares presentan en Patrick Chames (ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, tomo 907, Springer Science+Business Media, LLC 2012, capítulo 15, “Selection of Antibody Fragments by Yeast Display” de Nathalie Scholler.
También es posible generar anticuerpos mediante cualquier otro método de producción de anticuerpos establecido, tal como se describe en Antibody Engineering: Methods and Protocols, segunda edición, Methods in Molecular Biology, to m o 907 , S p r in g e r S c ie n c e B u s in e s s M e d ia , L L C 2012.
E n to n c e s , s e p u e d e v a lid a r la c a p a c id a d d e lo s a n t ic u e rp o s p a ra in h ib ir in te ra c c io n e s e n tre s o r t i l in a y s u s lig a n d o s en m ú lt ip le s e n s a y o s c e lu la re s y /o b io q u ím ic o s e s ta b le c id o s , lo q u e in c lu y e , d e m o d o no ta x a t iv o , a n á lis is d e re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e rf ic ia l, c o in m u n o p re c ip ita c ió n , e n s a y o s d e p re c ip ita c ió n , e n s a y o s d e p ro te ín a u n id a a c e lu lo s a , e n s a y o s d e c o m p le m e n ta c ió n co n p -g a la c to s id a s a , e n s a y o s F R E T d e p o b la c ió n c e lu la r, e n s a y o s d e lig a m ie n to p o r p ro x im id a d y e n s a y o s d e u n ió n c e lu la r.
T a l c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te , s e id e n t if ic a ro n y s e c a ra c te r iz a ro n 85 a n t ic u e rp o s a n ti s o rt il in a .
Materiales y métodos
Producción de sortilina de ratón y humana conjugada con Fc y monomérica
L a e x p re s ió n e n m a m ífe ro s d e a n tíg e n o d e s o r t i l in a s e p ro d u jo m e d ia n te c lo n a c ió n d e g e n e s s in té t ic o s b a s á n d o s e en A D N c e n v e c to re s d e e x p re s ió n m a m ífe ro s , s e g u id o d e t ra n s fe c c ió n y e x p re s ió n e n c é lu la s H E K 293 T . L a s c o n s tru c c io n e s in c lu y e ro n un p é p tid o s e ñ a l h e te ró lo g o y F c d e IgG 1 h u m a n a p a ra c o n s tru c c io n e s d e fu s ió n d e F c. En re s u m e n , s e tra n s fe c ta ro n v e c to re s d e e x p re s ió n q u e c o n te n ía n e l a n tíg e n o d e in te ré s m e d ia n te la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s co n un re a c t iv o d e t ra n s fe c c ió n , s e g u id o d e e x p o s ic ió n a c é lu la s H E K 293 T d u ra n te 1 h o ra y d ilu c ió n de l m e d io d e c u lt iv o a u n a d e n s id a d f in a l d e 4 m illo n e s d e c é lu la s p o r m l. D e s p u é s , s e c u lt iv a ro n la s c é lu la s d u ra n te 7 d ía s c o n m e d io d e a lim e n ta c ió n re c ie n te c a d a 48 h o ra s . D e s p u é s d e 7 d ía s , se re c o g ió e l s o b re n a d a n te d e s p u é s d e c e n tr ifu g a d o y s e lle v ó a c a b o p u r if ic a c ió n c o n p ro te ín a N i-s e fa ro s a y, s i fu e ra n e c e s a r io , c o n p u r if ic a c ió n e n c o lu m n a d e S E C p a ra o b te n e r un c o n te n id o d e m o n ó m e ro n o a g re g a d o > 95 % . S e p re p a ra ro n a n tíg e n o s d e m o n ó m e ro d e s o r t i l in a m e d ia n te f ra g m e n ta c ió n d e un a n tíg e n o d e fu s ió n d e F c d e s o r t i l in a c o n re g ió n b is a g ra m o d if ic a d a (L y n a u g h e t a l., MAbs. o c tu b re d e 2013 ; 5 (5 ) :641 -45 ) c o n p ro te a s a F a b R IC A T O R ( Id e S ) (G e n o v is , n .° ca t. A 2 -F R 2 -1000 ) , s e g u id a d e p u r if ic a c ió n p o r a f in id a d a p ro te ín a A p a ra e lim in a r la p ro te ín a d e fu s ió n d e F c n o d ife r id a y S E C p a ra e lim in a r m o n ó m e ro a g re g a d o .
Progranulina y sortilina biotiniladas
S e lle v ó a c a b o la b io t in ila c ió n d e re a c t iv o p ro te ic o c o n e l k it d e s u lfo -N H S -b io t in ila c ió n E Z -L in k , T h e rm o S c ie n tif ic , n ^ ca t. 21425.
S e c o n c e n tra ro n la s o r t i l in a y la p ro g ra n u lin a a ~1 m g /m l y s e re a liz ó in te rc a m b io d e ta m p ó n e n P B S a n te s d e la a d ic ió n d e u n a re la c ió n m o la r d e 1 :7.5 d e re a c t iv o d e b io t in ila c ió n (k it d e s u lfo -N H S -b io t in ila c ió n E Z -L in k , T h e rm o S c ie n tif ic , n ^ ca t. 21425.) . S e m a n tu v o la m e z c la a 4 °C d u ra n te la n o c h e a n te s d e o tro ta m p ó n p a ra e lim in a r la b io t in a lib re en la s o lu c ió n . S e c o n f irm ó la b io t in ila c ió n m e d ia n te la u n ió n a l s e n s o r d e e s tre p ta v id in a d e la s p ro te ín a s e t iq u e ta d a s en F o r te B io .
Detección de anticuerpo de sortilina
S e d is e ñ a ro n , se g e n e ra ro n y s e p ro p a g a ro n o c h o b ib lio te c a s d e le v a d u ra s in té t ic a h u m a n a s in t ra ta m ie n to p re v io , c a d a u n a c o n u n a d iv e rs id a d d e ~ 109, ta l c o m o se d e s c r ib ió a n te r io rm e n te (v é a s e , p o r e je m p lo , X u e t a l, 2013 ; los d o c u m e n to s W O 2009036379 ; W O 2010105256 ; W O 2012009568 ; X u e t a l., Protein Eng Des Sel. o c tu b re d e 2013 ; 26 (10 ) :663 -70 ) . S e lle v a ro n a c a b o d ie z s e le c c io n e s p a ra le la s c o n la s o c h o b ib lio te c a s s in t ra ta m ie n to p re v io p a ra s e le c c io n a r a n tíg e n o s d e fu s ió n d e F c a s o r t i l in a h u m a n a y d o s c o n ju n to s d e o c h o b ib lio te c a s p a ra s e le c c io n a r m o n ó m e ro s d e s o r t i l in a h u m a n a . E n la s d o s p r im e ra s ro n d a s d e s e le c c ió n , s e lle v ó a c a b o u n a té c n ic a d e c la s if ic a c ió n d e e s fe ra s m a g n é t ic a s c o n e l s is te m a M ilte n y i M A C s , e s e n c ia lm e n te , c o m o s e d e s c r ib ió (S ie g e l e t a l., J Immunol Methods. m a rz o d e 2004 ; 286 (1 -2 ) :141 -53 ) . E n re s u m e n , se in c u b a ro n c é lu la s d e le v a d u ra ( ~ 1010 c é lu la s /b ib lio te c a ) c o n 3 m l d e a n tíg e n o d e fu s ió n d e F c a s o r t i l in a b io t in ila d a 10 nM o a n tíg e n o d e m o n ó m e ro d e s o r t i l in a b io t in ila d a 100 nM d u ra n te 15 m in u to s a te m p e ra tu ra a m b ie n te e n ta m p ó n P B S d e la v a d o d e F A C S c o n B S A a l 0 ,1 % . D e s p u é s d e un la v a d o co n 50 m l d e ta m p ó n d e la v a d o h e la d o , se re s u s p e n d ió e l s e d im e n to c e lu la r e n 40 m l d e ta m p ó n d e la v a d o y s e a ñ a d ie ro n 500 p l d e m ic ro e s fe ra s d e e s tre p ta v id in a (M ilte n y i B io te c , B e rg is c h G la d b a c h , A le m a n ia . n ^ c a t 130 -048 ­ 101 ) a la le v a d u ra y s e in c u b a ro n d u ra n te 15 m in u to s a 4 °C . A c o n t in u a c ió n , s e s e d im e n tó la le v a d u ra , se re s u s p e n d ió e n 5 m l d e ta m p ó n d e la v a d o y s e c a rg a ro n e n u n a c o lu m n a M A C S L S (M ilte n y i B io te c , B e rg is c h G la d b a c h , A le m a n ia . n ^ c a t 130 -042 -401 ) . D e s p u é s d e c a rg a r 5 m l, se la v ó la c o lu m n a 3 v e c e s co n 3 m l d e ta m p ó n d e la v a d o F A C S . D e s p u é s , se re t iró la c o lu m n a d e l c a m p o m a g n é t ic o y la s le v a d u ra s e lu y e ro n c o n 5 m l d e m e d io d e c re c im ie n to y se c u lt iv a ro n d u ra n te la n o c h e . S e lle v a ro n a c a b o la s s ig u ie n te s c u a tro ro n d a s d e c la s if ic a c ió n c o n c ito m e tr ía d e f lu jo . S e s e d im e n ta ro n a p ro x im a d a m e n te 1 * 108 le v a d u ra s , s e la v a ro n t re s v e c e s c o n ta m p ó n d e la v a d o y s e in c u b a ro n co n a n tíg e n o d e fu s ió n d e F c d e s o r t i l in a b io t in ila d a 10 nM o a n tíg e n o d e m o n ó m e ro d e s o r t i l in a b io t in ila d a 100 nM d u ra n te 10 m in u to s a te m p e ra tu ra a m b ie n te . D e s p u é s , s e la v a ro n las le v a d u ra s d o s v e c e s y s e t iñ e ro n c o n F (a b ’ )2 k a p p a a n t ih u m a n o d e c a b ra -F IT C e n d ilu c ió n 1 :100 (S o u th e rn B io te c h , B irm in g h a m , A la b a m a , n ^ ca t. 2062 -02 ) y e s tre p ta v id in a -A le x a F lu o r 633 (L ife T e c h n o lo g ie s , G ra n d Is la n d , N Y , n ^ ca t. S 21375 ) e n d ilu c ió n 1 :500 o e s tra v id in a -f ic o e r t ir in a (S ig m a -A ld r ic h , S t L o u is , n ^ ca t. E 4011 ) e n d ilu c ió n 1 :50 , re a c t iv o s s e c u n d a r io s d u ra n te 15 m in u to s a 4 °C . D e s p u é s d e d o s la v a d o s c o n ta m p ó n d e la v a d o h e la d o , s e re s u s p e n d ie ro n lo s s e d im e n to s c e lu la re s e n 0.4 m L d e ta m p ó n d e la v a d o y se t ra n s f ir ie ro n a tu b o s d e c la s if ic a c ió n c o n ta p ó n c o n f iltro . L a c la s if ic a c ió n s e lle v ó a c a b o co n un dispositivo de clasificación FACS ARIA (BD Biosciences) y se determinó que las compuertas de clasificación seleccionaran únicamente clones de unión a sortilina en una ronda y la segunda ronda fue una clasificación negativa para reducir los aglutinantes de reactivos, aglutinantes poliespecíficos (Xu et al., PEDS. octubre de 2013; 26(10):663-70) y aglutinantes para controlar el monómero etiquetado con HIS SorCS1 humano de proteína. La tercera ronda empleó etiquetado con antígenos de fusión de Fc de sortilina de ratón y humana 10 nM, antígeno de monómero de sortilina humana 100 nM y competencia con progranulina con antígenos de sortilina (10 nM) en complejos previamente formados con progranulina 500 nM. En el caso de levadura que compete con progranulina, se llevó a cabo una ronda final para enriquecimiento de aglutinantes de antígeno de fusión de Fc de sortilina. Después de la ronda final de clasificación, se colocaron levaduras en placas y se seleccionaron colonias individuales para su caracterización.
Para preparar bibliotecas de diversificación de cadena ligera utilizadas para selecciones adicionales, se utilizaron las cadenas pesadas de emisiones de la segunda y la cuarta rondas de selección de clasificación FACS. En dichas selecciones, la primera ronda de selección empleó esferas Miltenyi MACs y etiquetado con antígeno de fusión de Fc de sortilina humana 10 nM. Se continuó con cuatro rondas de clasificación FACS. La primera ronda empleó antígeno de monómero de sortilina humana 100 nM. La segunda ronda de FACS fue una clasificación negativa para reducir la unión a aglutinantes de reactivo, aglutinantes poliespecíficos y aglutinantes para controlar monómeros etiquetados con HIS SorCS1 humanos proteicos. Las dos rondas finales utilizaron titulación con monómero de sortilina humana (100 nM, 10 nM y 1 nM) para seleccionar los aglutinantes con afinidad más elevada, monómero de sortilina de ratón 100 nM y competición con anticuerpo 3E3 de control para evaluar la representación del competidor en la población enriquecida. Después de la ronda final de clasificación, se colocaron levaduras en placas y se seleccionaron colonias individuales para su caracterización.
Producción y purificación de anticuerpo IgG y Fab
Se cultivaron clones de levaduras hasta su saturación y, después, se indujeron durante 48 horas a 30 °C con agitación. Después de la inducción, se sedimentaron las células de levadura y se recogieron los sobrenadantes para su purificación. Se purificaron las IgG con una columna de proteína A y se eluyeron con ácido acético, pH 2,0. Los fragmentos Fab se generaron mediante digestión de papaína y se purificaron en una matriz de afinidad IgG-CH1 CaptureSelect (LifeTechnologies, n.° cat. 1943200250).
Experimentos de unión ForteBio
Se determinó la afinidad por los anticuerpos de sortilina al medir sus Kd mediante ForteBio. En general, las medidas de afinidad se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente (Estep et al., MAbs. marzo-abril de 2013; 5(2):270-8). En resumen, las medidas de afinidad ForteBio se llevaron a cabo mediante la carga de IgG en línea en sensores AHQ. Se equilibraron los sensores fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y, luego, se monitorearon en línea durante 60 segundos para establecer la referencia. En el caso de medidas de unión, se expusieron los sensores cargados con IgGa antígeno 100 nM (fusión de Fc de sortilina humana o de ratón) durante 3 minutos y después se transfirieron a tampón de ensayo durante 3 minutos para tomar medidas de constantes de disociación. Se determinó la unión adicional mediante la carga de monómero de sortilina biotinilada en sensores SA y exposición a IgG ~100 nM en solución. Las medidas de unión monovalente se obtuvieron mediante la carga de antígenos de fusión de Fc de sortilina humana o de ratón a un sensor AHQ y la posterior exposición a Fab de anticuerpo de sortilina ~100 nM. Se tomaron medidas monovalentes adicionales mediante la carga de monómero de sortilina humana o de ratón en un sensor SA, seguida de exposición a Fab ~100 nM en solución.
Se ajustaron los datos de cinética con un modelo de unión 1:1 en el software de análisis de datos provisto por ForteBio.
Clasificación de epítopos
La clasificación de epítopos de los anticuerpos anti sortilina se llevó a cabo en un sistema Octet Red384 de ForteBio (ForteBio, Menlo Park, CA) con un ensayo de clasificación de formato de sándwich estándar. Se cargó IgG anti diana de control en los sensores de AHQ y se bloquearon los sitios de unión a Fc no ocupados en el sensor con un anticuerpo IgG1 humana no relevante. Después, se expusieron los sensores a antígeno diana 100 nM, seguido de un segundo anticuerpo anti diana. Se procesaron los datos con el software de análisis de datos de ForteBio 7.0. La unión adicional del segundo anticuerpo después de la asociación del antígeno indica un epítopo no ocupado (no competidor) y la ausencia de unión indica el bloqueo del epítopo (competidor). Este proceso se repitió para los cuatro anticuerpos de control: (i) 3E3, que se une al dominio 1 de sortilina (grupo 1), (ii) S-29, que se une al dominio 2 de sortilina (grupo 2), (iii) S-3, que se une al dominio 3 de sortilina (grupo 3) y S-40, que se une al dominio 4 de sortilina (grupo 4). Los grupos de anticuerpos se enumeran en la TABLA 5 que se encuentra más adelante. Es posible utilizar métodos de clasificación similares para determinar la competición entre anticuerpo anti sortilina y progranulina humana o de ratón de longitud completa, así como entre anticuerpos anti sortilina y un péptido de progranulina de extremo C.
Ensayos competitivos de progranulina
Todos los experimentos se llevaron a cabo en un instrumento HTX de ForteBio. Todas las muestras se diluyeron en PBSF (BSA al 0.1% en PBS). Todas las etapas de inmersión y lectura de ForteBio involucraron agitación a 1000 rpm.
L a c o m p e te n c ia p o r p ro g ra n u lin a s e e v a lu ó u t il iz a n d o t re s e n s a y o s F o rte B io .
E n s a y o 1: E x p e r im e n to s c o m p e t it iv o s d e p ro g ra n u lin a c o n p é p tid o d e e x tre m o C d e p ro g ra n u lin a b io t in ila d a :
S e e m p a p a ro n lo s s e n s o re s d e S A co n P B S d u ra n te 10 m in u to s a n te s d e l a n á lis is . S e s u m e rg ie ro n lo s s e n s o re s b la n c o e n p é p tid o d e e x tre m o C d e p ro g ra n u lin a (P G R N ) b io t in ila d a (B io -T K C L R R E A P R W D A P L R D P A L R Q L L (S E Q ID N O : 693 )) 100 nM y d e s p u é s s e e m p a p a ro n co n P B S F d u ra n te a l m e n o s 10 m in u to s a n te s d e l a n á lis is . L a s p u n ta s c a rg a d a s c o n p é p tid o s e s u m e rg ie ro n d e fo rm a s e c u e n c ia l en P B S F (60 s e g u n d o s ) , m o n ó m e ro d e s o r t i l in a h u m a n a (100 n M ) d u ra n te 3 m in u to s y, f in a lm e n te , a n t ic u e rp o 100 nM . S e p re p a ra ro n lo s d a to s p a ra a n á lis is co n e l s o f tw a re d e a n á lis is d e d a to s d e F o r te B io v e rs ió n 8 .1.0.36 ta l c o m o s e in d ic a a c o n tin u a c ió n . S e a lin e a ro n lo s d a to s en e l e je y s e re a liz a ro n c o r re c c io n e s e n tre e ta p a s c o n fo rm e a l in ic io d e la e ta p a d e c a p tu ra d e s o r t i l in a y d e s p u é s s e re c o r ta ro n p a ra m o s tra r ú n ic a m e n te la s e ta p a s d e c a p tu ra d e s o r t i l in a y d e in te ra c c ió n c o n e l a n t ic u e rp o . L o s e n s a y o s e n lo s q u e n o se o b s e rv ó s e ñ a l d e u n ió n c o n la a d ic ió n d e u n a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o d a d o , in d ic a ro n q u e e l s it io d e u n ió n a a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o s e s u p e rp o n e c o n e l s it io d e u n ió n a l p é p tid o P R G N e n la s u p e r f ic ie d e la s o r t il in a . L o s e n s a y o s e n lo s q u e s e o b s e rv ó u n a s e ñ a l d e u n ió n c o n la a d ic ió n d e u n a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o de s o r t i l in a d e e n s a y o d a d o , in d ic a ro n q u e e l a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o n o b lo q u e a la u n ió n d e l p é p tid o P R G N a la s o rt il in a .
E n s a y o 2: E x p e r im e n to s c o m p e t it iv o s d e p ro g ra n u lin a c o n m o n ó m e ro d e s o r t i l in a h u m a n a b io t in ila d a :
S e e m p a p a ro n lo s s e n s o re s d e S A c o n P B S d u ra n te 10 m in u to s a n te s d e l a n á lis is . S e s u m e rg ie ro n lo s s e n s o re s de b la n c o e n m o n ó m e ro d e s o r t i l in a h u m a n a b io t in ila d a (100 n M ) y d e s p u é s s e e m p a p a ro n c o n P B S F d u ra n te 10 m in u to s a n te s d e l a n á lis is . L a s p u n ta s c a rg a d a s c o n s o r t i l in a s e s u m e rg ie ro n d e fo rm a s e c u e n c ia l e n P B S F (1 m in u to ) , p ro g ra n u lin a (1 ,0 u M ) d u ra n te 3 m in u to s y, f in a lm e n te , a n t ic u e rp o 100 nM . P a ra e l a n á lis is , lo s d a to s s e p re p a ra ro n c o n e l s o f tw a re d e a n á lis is d e d a to s d e F o r te B io v e rs ió n 8.1.0.36 , ta l c o m o s e in d ic a a c o n tin u a c ió n . S e a lin e a ro n los d a to s en e l e je y , s e re a liz a ro n c o r re c c io n e s e n tre e ta p a s c o n fo rm e a l in ic io d e la e ta p a d e c a p tu ra d e p ro g ra n u lin a y d e s p u é s s e re c o r ta ro n p a ra m o s tra r ú n ic a m e n te la s e ta p a s d e c a p tu ra d e p ro g ra n u lin a y d e in te ra c c ió n c o n e l a n t ic u e rp o . L o s e n s a y o s e n lo s q u e n o s e o b s e rv ó s e ñ a l d e u n ió n c o n la a d ic ió n d e u n a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o d a d o , in d ic a ro n q u e e l s it io d e u n ió n a l a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o se s u p e rp o n e c o n e l s it io d e u n ió n a p ro g ra n u lin a e n la s u p e r f ic ie d e la s o r t il in a . L o s e n s a y o s e n lo s q u e s e o b s e rv ó u n a s e ñ a l d e u n ió n c o n la a d ic ió n d e u n a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o d a d o , in d ic a ro n q u e e l a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a n o b lo q u e a la u n ió n d e p ro g ra n u lin a a s o rt il in a .
E n s a y o 3: E x p e r im e n to s c o m p e t it iv o s d e p ro g ra n u lin a c o n p ro g ra n u lin a b io t in ila d a :
S e e m p a p a ro n lo s s e n s o re s d e S A c o n P B S d u ra n te 10 m in u to s a n te s d e l a n á lis is . S e s u m e rg ie ro n lo s s e n s o re s de b la n c o e n p ro g ra n u lin a b io t in ila d a (100 n M ) y d e s p u é s s e e m p a p a ro n c o n P B S F d u ra n te 10 m in u to s a n te s d e l a n á lis is . L a s p u n ta s c a rg a d a s co n p ro g ra n u lin a s e s u m e rg ie ro n d e fo rm a s e c u e n c ia l e n P B S F (1 m in u to ) , m o n ó m e ro d e s o r t i l in a h u m a n a 100 nM (3 m in u to s ) y, f in a lm e n te , a n t ic u e rp o 100 nM . S e p re p a ra ro n lo s d a to s p a ra a n á lis is c o n e l s o f tw a re d e a n á lis is d e d a to s d e F o r te B io v e rs ió n 8 .1.0.36 ta l c o m o s e in d ic a a c o n tin u a c ió n . S e a lin e a ro n lo s d a to s en e l e je y s e re a liz a ro n c o r re c c io n e s e n tre e ta p a s c o n fo rm e a l in ic io d e la e ta p a d e c a p tu ra d e s o r t i l in a y lu e g o s e re c o r ta ro n p a ra m o s tra r ú n ic a m e n te la s e ta p a s d e c a p tu ra d e s o r t i l in a y d e in te ra c c ió n c o n e l a n t ic u e rp o . L o s e n s a y o s e n lo s q u e n o s e o b s e rv ó s e ñ a l d e u n ió n c o n la a d ic ió n d e u n a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o d a d o in d ic a ro n q u e e l s it io d e u n ió n a a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a se s u p e rp o n e c o n e l s it io d e u n ió n a p ro g ra n u lin a e n la s u p e r f ic ie d e la s o r t i l in a . L o s e n s a y o s e n lo s q u e s e o b s e rv ó u n a s e ñ a l d e u n ió n c o n la a d ic ió n d e u n a s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a d e e n s a y o d a d o in d ic a ro n q u e e l a n t ic u e rp o d e s o r t i l in a n o b lo q u e a la u n ió n d e p ro g ra n u lin a a s o rt il in a .
Resultados
Producción de anticuerpo anti sortilina
L o s a n t ic u e rp o s q u e se u n e n a s o r t il in a , e n p a rt ic u la r , e n e l d o m in io V p s 10 p u b ic a d o e n los re s id u o s d e a m in o á c id o s 78 -611 d e la s o r t i l in a h u m a n a (S E Q ID N O : 1), se id e n t if ic a ro n a p a r t ir d e o c h o b ib lio te c a s d e le v a d u ra s s in té t ic a s h u m a n a s s in t ra ta m ie n to p re v io , ta l c o m o se d e s c r ib ió a n te r io rm e n te . S e g e n e ró un to ta l d e 85 a n t ic u e rp o s (S -1 a S -85 ). D e s p u é s , se a n a liz a ro n lo s a n t ic u e rp o s p a ra d e te rm in a r la u n ió n a s o rt il in a .
Secuencias de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo
M e d ia n te té c n ic a s e s tá n d a re s se d e te rm in a ro n la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s q u e c o d if ic a n los d o m in io s v a r ia b le s d e c a d e n a p e s a d a y c a d e n a lig e ra d e lo s a n t ic u e rp o s g e n e ra d o s . L a s s e c u e n c ia s d e C D R d e E U o K a b a t d e los a n t ic u e rp o s s e e x p o n e n e n la Tabla 1. L a s s e c u e n c ia s m a rc o d e c a d e n a lig e ra d e E U o K a b a t d e lo s a n t ic u e rp o s se e x p o n e n e n la Tabla 2. L a s s e c u e n c ia s m a rc o d e c a d e n a p e s a d a d e K a b a t d e lo s a n t ic u e rp o s s e e x p o n e n e n la Tabla 3.
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Caracterización de la unión al anticuerpo de sortilina
L a c a ra c te r iz a c ió n in ic ia l d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a im p lic ó d e te rm in a r su c a p a c id a d d e u n ió n a la s o r t i l in a e x p re s a d a e n c é lu la s d e r iñ ó n d e e m b r io n e s h u m a n o s (293 ) q u e e x p re s a n s o r t i l in a h u m a n a (h S o r t) re c o m b in a n te o s o r t i l in a de ra tó n (m S o r t) re c o m b in a n te . S e re c o g ie ro n la s c é lu la s , s e c o lo c a ro n 105/m l e n u n a p la c a d e 96 p o c illo s , s e la v a ro n y s e in c u b a ro n e n 100 p l d e P B S q u e c o n te n ía 10 p g /m l d e M a b y F B S a l 2 % d u ra n te 1 h o ra e n h ie lo . D e s p u é s , las c é lu la s s e la v a ro n d o s v e c e s y s e in c u b a ro n e n 100 p l d e P B S F B S a l 2 % q u e c o n te n ía 5 p g /m l d e a n t ic u e rp o s e c u n d a r io a n t ih u m a n o c o n ju g a d o c o n P E d u ra n te 30 m in u to s e n h ie lo . S e la v a ro n d o s v e c e s la s c é lu la s e n P B S fr ío y s e o b tu v ie ro n d a to s e n un d is p o s it iv o B D F A C S C a n to . S e lle v ó a c a b o e l a n á lis is d e d a to s y e l c á lc u lo d e v a lo re s d e M F I c o n e l s o f tw a re F lo w J o (T re e S ta r ) v e rs ió n 10.0.7.
E n la Tabla 4 s e in d ic a n lo s v a lo re s d e in te n s id a d d e f lu o re s c e n c ia m e d ia (M F I, median fluorescent intensities) d e los t ip o s d e c é lu la s u n id a s a a n t ic u e rp o s d e s o r t i l in a S 1 -S 85. S e c o m p a ra la u n ió n a la lín e a c e lu la r o r ig in a l (293 ). L o s re s u lta d o s d e la Tabla 4 in d ic a n q u e S 1 -S 85 s e u n e n e s p e c íf ic a m e n te a lín e a s c e lu la re s q u e s o b re e x p re s a n s o r t i l in a h u m a n a y d e ra tó n e n la m e m b ra n a c e lu la r, p e ro n o c o n tro la n la s lín e a s c e lu la re s q u e n o e x p re s a n s o rt il in a .
Tabla 4: Unión de anticuerpos de sortilina a células humanas y de ratón
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continuación
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Se determinó la afinidad de unión de cada anticuerpo anti sortilina midiendo su Kd con ForteBio o MSD-SET a temperatura ambiente. Se tomaron mediciones de afinidad ForteBio tal como se describió anteriormente (Estep et al., (2013) MAbs 5(2):270-8). En resumen, las mediciones de afinidad ForteBio se llevaron a cabo cargando las IgG en línea en sensores AHQ. Se equilibraron los sensores fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y, después, se monitorizaron en línea durante 60 segundos para establecer la referencia. Se expusieron los sensores cargados con IgG a antígeno 100 nM durante 5 minutos y después se transfirieron a tampón de ensayo durante 5 minutos para tomar mediciones de las constantes de disociación. Se analizaron las propiedades cinéticas del modelo de unión 1:1.
Se tomaron mediciones de afinidad de equilibrio tal como se describió anteriormente (Estep et al., (2013) MAbs 5(2):270-8). Se realizaron titulaciones de equilibrio de soluciones (SET) en PBS BSA sin IgG al 0,1% (Pb Sf ) con antígeno constante a 50 pM y se incubaron con diluciones en serie de 3 a 5 veces de anticuerpos a partir de 10 nM. Se revistieron placas de Ms D-ECL de unión estándares con anticuerpos (20 nM en PBS) durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, se bloquearon las placas durante 30 minutos con agitación a 700 rpm, seguido de tres lavados con tampón de lavado (PBSf Tween 20 al 0,05%). Se aplicaron las muestras de SET y se incubaron en las placas durante 150 segundos con agitación a 700 rpm, seguido de un lavado. Se detectó antígeno captado en una placa con 250 ng/ml de estreptavidina etiquetada con Sulfotag en PBSF mediante incubación en la placa durante 3 minutos. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y, después, se leyeron con el instrumento MSD Sector Imager 2400 con tampón de lectura T con tensioactivo 1x. Se representó gráficamente el porcentaje libre de antígeno en función del anticuerpo titulado en Prism y se ajustó a una ecuación cuadrática para extraer la Kd. Se utilizaron robots de manipulación de líquidos en todos los experimentos de MSD-SET, incluyendo la preparación de muestras de SET, para mejorar el rendimiento.
La Tabla 5 enumera valores que representan la afinidad de unión (Kd) de los anticuerpos S1-S85 a una proteína de fusión de Fc de sortilina humana (hSort-Fc) y a una proteína de fusión de Fc de sortilina de ratón (mSort-Fc), así como el grupo al que pertenecen. Los anticuerpos que pertenecen al mismo grupo compiten entre sí por la unión a sortilina. En la Tabla 5, “N.B.” corresponde a ausencia de unión y “P.F.” corresponde a un ajuste de curva malo.
Tabla 5: Afinidad de unión de los anticuerpos de sortilina
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n in i n
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E je m p lo 2: M a p e o d e e p íto p o s d e a n t ic u e rp o s d e s o r t i l in a
L o s a n t ic u e rp o s d e s o r t i l in a se e v a lu a ro n p a ra d e te rm in a r su c a p a c id a d d e u n irs e a p é p tid o s d e 15 m ie m b ro s o 25 m ie m b ro s q u e a b a rc a n to d a la p ro te ín a s o r t i l in a h u m a n a .
S e s in te t iz a ro n p é p tid o s lin e a le s d e 15 m ie m b ro s b a s á n d o s e e n la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a h u m a n a (S E Q ID N O : 1) co n u n a s u p e rp o s ic ió n d e 14 re s id u o s . A d e m á s , se s in te t iz a ro n p é p tid o s lin e a le s d e 25 m ie m b ro s b a s á n d o s e e n la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a h u m a n a (S E Q ID N O : 1) c o n u n a s u p e rp o s ic ió n d e 24 re s id u o s . L o s p é p tid o s s e s in te t iz a ro n m e d ia n te q u ím ic a F m o c e s tá n d a r y s e d e s p ro te g ie ro n c o n á c id o t r i f lu o ro a c é t ic o c o n d e p u ra d o re s . S e e v a lu ó la u n ió n d e lo s a n t ic u e rp o s d e s o r t i l in a a c a d a u n o d e lo s p é p tid o s s in te t iz a d o s e n un m é to d o b a s á n d o s e en un e n s a y o E L IS A . E n d ic h o e n s a y o , s e in c u b a ro n la s m a tr ic e s p e p tíd ic a s c o n s o lu c ió n d e a n t ic u e rp o p r im a r io (d u ra n te la n o c h e a 4 °C ). D e s p u é s d e l la v a d o , s e in c u b a ro n la s m a tr ic e s p e p tíd ic a s co n u n a d ilu c ió n 1 /1000 d e un c o n ju g a d o d e p e ro x id a s a y a n t ic u e rp o (S B A , n .° ca t. 2010 -05 ) d u ra n te 1 h o ra a 25 °C . D e s p u é s d e l la v a d o , se a ñ a d ie ro n e l s u s tra to d e p e ro x id a s a , sulfonato de 2,2’-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 2 pl/ml de H2O2 al 3 %. Después de una hora, se midió el revelado de color que se cuantificó con una cámara de dispositivo de carga acoplado (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes.
Se determinó la región de unión a sortilina de seis anticuerpos anti sortilina: S-1, S-8, S-44, S-49, S-65 y S-78. Las regiones de unión se enumeran en la Tabla 6. La Figura 1 muestra una representación esquemática de sortilina humana que indica las regiones a las que se unen los seis anticuerpos anti sortilina.
Tabla 6: Re iones de unión al anticuer o de sortilina
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Tal como se indica en la Tabla 6, el péptido reconocido por el anticuerpo S-1 corresponde a los residuos de aminoácidos 623-632 de la SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: HSTDPEd Ye D (SEQ ID NO: 708). El péptido reconocido por el anticuerpo S-8 corresponde a los residuos de aminoácidos 429-443 de la SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: ITFDQGGRWTHLRKP (SEQ ID NO: 709). El péptido reconocido por el anticuerpo S-44 corresponde a los residuos de aminoácidos 740-749 de la SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: CTSNFLSPEK (SEQ ID NO: 710). El péptido reconocido por el anticuerpo S-49 corresponde a los residuos de aminoácidos 233-243 de la SEQ iD NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: LSTENGLWVSK (SEQ ID NO: 711). El péptido reconocido por el anticuerpo S-65 corresponde a los residuos de aminoácidos 175-181 de la SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: GPENSGK (SEQ ID NO: 712). El péptido reconocido por el anticuerpo S-78 corresponde a los residuos de aminoácidos 212-221 de la SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: LPFHPLTQMM (SEQ ID NO: 713). Los péptidos a los que se unen cada anticuerpo se ilustran en la Figura 1. Se ilustra el péptido reconocido por S-1 en verde, el péptido reconocido por S-65 en rojo, el péptido reconocido por S-49 en azul, el péptido reconocido por S-78 en amarillo, el péptido reconocido por S-44 en rosado y el péptido reconocido por S-8 en violeta.
Ejemplo 3: Caracterización de interacciones entre sortilina y progranulina
Introducción
Se caracterizó la interacción entre sortilina y progranulina con ForteBio y análisis de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287:43798; y Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222).
Materiales y métodos
Se caracterizó la interacción entre sortilina (SORT1) y progranulina (PGRN) con resonancia de plasmón superficial (SPR) (por ejemplo, Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287:43798; y Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222).
Es posible determinar la unión directa de progranulina humana o de ratón a sortilina inmovilizada, así como la unión de sortilina humana o de ratón a progranulina inmovilizada, en presencia o ausencia de anticuerpos anti sortilina de bloqueo en un instrumento Biacore2000 (Biacore, Suecia) con CaHBS como tampón de ejecución estándar (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 140 mM, CaCh 2 mM, EGTA 1 mM y Tween 20 al 0,005 %).
Se activó un chip biosensor de Biacore (CM5, n.° cat. BR-1000-14) con el método NHS/EDC, tal como lo describió el proveedor, seguido de revestimiento con sortilina a una densidad proteica de 79 fmol/mm2 y se utilizó para medidas de afinidad de proteína progranulina nativa. La regeneración de la celda de flujo después de cada ciclo de experimento de unión de ligando se llevó a cabo mediante dos pulsos de 10 pl de tampón de regeneración (glicina-HCl 10 mM, pH 4,0, NaCl 500 mM, EDTA 20 mM y Tween 20 al 0,005 %) y una única inyección de SDS al 0,001 %. Se ajustaron los sensogramas para realizar estimaciones de afinidad usando BIAevaluation versión 3.1. De acuerdo con protocolos similares, también es posible inmovilizar His-progranulina en un chip biosensor CM5 con el kit de acoplamiento NHS/EDC de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biacore, Suecia), lo que produce densidades superficiales de proteína inmovilizada similares (~300 fmol/mm2). También se utilizó un chip biosensor con progranulina inmovilizada para evaluar la unión de sortilina en ausencia o en presencia de anticuerpos de sortilina competitivos.
Se llevó a cabo una competencia entre anticuerpos anti sortilina y progranulina de forma similar a la clasificación de epítopos de anticuerpos de sortilina descritos en el ejemplo 1 anterior. En resumen, se llevó a cabo el ensayo competitivo en un sistema Octet Red384 de ForteBio (Pall Forte Bio Corporation, Menlo Park, CA) con un ensayo de clasificación de formato de sándwich estándar. Se cargó IgG anti diana de control en los sensores de AHQ y se bloquearon los sitios de unión a Fc no ocupados en el sensor con un anticuerpo IgG1 humana no relevante. Después, los sensores se expusieron a antígeno diana 100 nM, seguido de un segundo anticuerpo anti diana. Se procesaron los datos con el software de análisis de datos de ForteBio 7.0. La unión adicional del segundo anticuerpo después de la asociación del antígeno indica un epítopo no ocupado (no competidor) y la ausencia de unión indica el bloqueo del epítopo (competidor).
Resultados
Caracterización de la unión de progranulina con sortilina
En primer lugar, las interacciones entre sortilina y progranulina se caracterizaron usando SPR y ELISA. La Figura 2A muestra un análisis cinético de unión de PGRN a SORT1 captado con His realizado usando SPR de Biacore. En resumen, se captó sortilina en un chip sensor CM5 inmovilizado con un anticuerpo anti His (kit de GE). Se estableció flujo de progranulina en tampón de unión HBS a varias concentraciones. Se ajustaron los sensogramas para realizar estimaciones de afinidad usando BIAevaluation versión 3.1. Los resultados indican que la progranulina humana se une a la sortilina humana con una Kode 14,3 nM.
También se confirmó la unión entre sortilina y progranulina mediante ELISA. En resumen, se inmovilizó sortilina humana o de ratón (R&D Systems) durante la noche en una placa de ELISA (2 pg/ml en PBS). Se lavaron las placas en tampón de lavado (PBS TWEEN20 al 0,05 %) y se bloquearon durante una hora a 37 °C con tampón de unión (PBS BSA al 1%). Se biotiniló progranulina de ratón o humana recombinante (Adipogen) con un kit Micro NHS-PEG4 EZ-Link de ThermoScientific/Pierce. Se añadió progranulina biotinilada a varias concentraciones para inmovilizar sortilina y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las placas se lavaron tres veces en tampón de lavado y se incubaron con estreptavidina-HRP (1:200 en tampón de unión, R&D Systems) durante 20 minutos. Nuevamente, las placas se lavaron tres veces y se incubaron con solución de sustrato de TMB hasta que se desarrolló el color. Se detuvo la reacción mediante la adición de 50 ul de ácido sulfúrico 2 N y se cuantificó el color con un lector de placas Biotek Synergy H1. Se analizaron los datos y se ajustaron en Prism.
La Figura 2B muestra la unión de progranulina humana biotinilada a sortilina humana inmovilizada en una placa de ELISA (OD= densidad óptica) y la Figura 2C muestra la unión de progranulina de ratón biotinilada a sortilina de ratón inmovilizada en una placa de ELISA. Los resultados indican que la progranulina humana se une a sortilina humana con una Kode 14 nM y la progranulina de ratón se une a sortilina de ratón con una Kode 40 nM.
Ensayos competitivos de anticuerpos con péptidos de progranulina
La Figura 3A ilustra un esquema de análisis ForteBio para determinar la capacidad de unión de los anticuerpos anti sortilina a sortilina y para cuantificar la unión (es decir, Kd). En la figura, “RU” se refiere a unidades de respuesta. Se muestran ejemplos de resultados con el anticuerpo S-14 y se calculó que tenía una Kd de 0,8 nM.
Ensayos competitivos de anticuerpos con la proteína sortilina
La Figura 3B ilustra esquemas de análisis competitivos ForteBio diferentes. La columna izquierda ilustra un análisis competitivo ForteBio con péptidos de progranulina biotinilada en sensores de SA y anticuerpos IgG anti sortilina y sortilina humana recombinante (monomérica) (vea la columna izquierda, SORT= sortilina, p Gr N= progranulina, b = biotinilado, H= humano, mono= monomérico).
La columna central de la Figura 3B ilustra análisis competitivos ForteBio con proteína sortilina humana monomérica biotinilada unida a sensores de SA y anticuerpos anti sortilina y progranulina de longitud completa nativa.
La columna derecha de la Figura 3B ilustra análisis competitivos ForteBio con proteína progranulina humana biotinilada unida a sensores de SA y anticuerpos anti sortilina y monómeros de sortilina humana.
Resultados de ensayos competitivos de anticuerpo
La Figura 4A ilustra los resultados de tres análisis ForteBio diferentes en las Figuras 3A y 3B, y muestra varios ejemplos de anticuerpos anti sortilina que impiden la unión de progranulina (PGRN) a sortilina (SORT1).
La columna izquierda de la Figura 4A muestra la configuración de unión descrita en la columna izquierda de la Figura 3B, en la que se inmovilizó un péptido PGRN que se une a SORT1 en un SensorChip. Se unió SORT1 y luego se evaluó para determinar la capacidad de unión del anticuerpo anti sortilina de ensayo. Los anticuerpos con capacidad de unión a sortilina se consideraron no competidores. Los resultados indican que los anticuerpos S-20 y S-22 no son competidores, aunque el anticuerpo S-14 es un competidor.
La columna central de la Figura 4A muestra la configuración de unión descrita en la columna central de la Figura 3B, e n la q u e s e in m o v iliz ó e l m o n ó m e ro d e S O R T 1 b io t in ila d a en un S e n s o rC h ip . S e u n ió u n a p ro te ín a P G R N d e lo n g itu d c o m p le ta y lu e g o s e e v a lu ó p a ra d e te rm in a r la c a p a c id a d d e u n ió n d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e e n s a y o . L o s a n t ic u e rp o s c o n c a p a c id a d d e u n ió n a s o r t i l in a s e c o n s id e ra ro n n o c o m p e t id o re s . L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e e l a n t ic u e rp o S -20 n o e s c o m p e t id o r , a l t ie m p o q u e lo s a n t ic u e rp o s S -14 y S -22 s o n c o m p e t id o re s .
L a c o lu m n a d e re c h a d e la Figura 4A m u e s tra la c o n f ig u ra c ió n d e u n ió n d e s c r ita e n la c o lu m n a d e re c h a d e la Figura 3B , e n la q u e s e in m o v iliz ó la p ro te ín a P G R N b io t in ila d a e n un S e n s o rC h ip . S e u n ió S O R T 1 y lu e g o se e v a lu ó p a ra d e te rm in a r la c a p a c id a d d e u n ió n d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e e n s a y o . L o s a n t ic u e rp o s c o n c a p a c id a d d e u n ió n a s o r t i l in a s e c o n s id e ra ro n n o c o m p e t id o re s . L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e lo s a n t ic u e rp o s S -20 y S -22 n o so n c o m p e t id o re s , a u n q u e e l a n t ic u e rp o S -14 e s un c o m p e tid o r .
L o s re s u lta d o s d e la Figura 4A in d ic a n q u e n o to d o s lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a s o n c o m p e t id o re s y q u e a lg u n o s , ta le s c o m o e l a n t ic u e rp o S -22 , p u e d e n a c tu a r c o m o n o c o m p e t id o re s e n u n o o d o s fo rm a to s , a l m is m o t ie m p o q u e a c tú a n c o m o c o m p e t id o re s e n o tro (s ) fo rm a to (s ) .
L a Figura 4B m u e s tra la u n ió n d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a (S -5 , S -8 , S -49 , S -60 , S -63 , S -64 , S -72 y S -83 ) a s o r t i l in a c a p tu ra d a c o n H is (S O R T 1 ) u s a n d o S P R d e B ia c o re a un pH d e 6 ,4 y a un pH d e 7 ,4.
L a Tabla 7 m u e s tra lo s re s u lta d o s d e lo s e n s a y o s c o m p e t it iv o s d e S P R lle v a d o s a c a b o co n lo s a n t ic u e rp o s S 1 -S 85. L a c o lu m n a 2 d e la Tabla 7 c o rre s p o n d e a l e n s a y o d e s c r ito e n la c o lu m n a iz q u ie rd a d e la Figura 3B . L a c o lu m n a 3 d e la Tabla 7 c o rre s p o n d e a l e n s a y o d e s c r ito en la c o lu m n a c e n tra l d e la Figura 3B . La c o lu m n a 4 d e la Tabla 7 c o rre s p o n d e a l e n s a y o d e s c r ito e n la c o lu m n a d e re c h a d e la Figura 3B. E n la Tabla 7 , “ h P G R N ” h a c e re fe re n c ia a p ro g ra n u lin a h u m a n a , “ S í” in d ic a e l b lo q u e o d e l a n t ic u e rp o en e l fo rm a to d a d o y “ N o ” in d ic a la a u s e n c ia d e b lo q u e o d e l a n t ic u e rp o e n e l fo rm a to d a d o .
Tabla 7: Ensayos competitivos de anticuerpos ForteBio
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n in i n
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E je m p lo 4: C a ra c te r iz a c ió n d e in te ra c c io n e s e n tre s o r t i l in a y p ro g ra n u lin a u t il iz a n d o e n s a y o s b a s a d o s e n c é lu la s Materiales y métodos
Se biotiniló progranulina de ratón o humana recombinante (Adipogen) con un kit Micro NHS-PEG4 EZ-Link de ThermoScientific/Pierce, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se estableció una línea celular estable que expresa sortilina humana no etiquetada de longitud completa mediante infección vírica de células HEK293T y selección positiva con higromicina (proyecto adaptado Genscript). Se clonó sortilina de ratón de longitud completa en pCMV-AC-IRES-GFP (Origene) y se transfectaron células HEK293T de forma transitoria con dicho plásmido con Fugene HD (Promega). Se utilizaron células HEK293T originales o células HEK293T que expresan SORCS1 humana de longitud completa (clonadas en pCMV-AC-IRES-GFP) como células de control.
Se recogieron células que expresan sortilina o células de control y se lavaron en PBS. Se añadió progranulina humana o de ratón en PBS FBS al 2 % con anticuerpos anti sortilina (10 pg/ml) o anticuerpos de isotipo IgG1 humanos de control y se incubó en hielo durante 2 horas. Después de 3 lavados con PBS FBS al 2 %, las células se incubaron en estreptavidina-APC (BD Biosciences, 1:100) en hielo durante 30 minutos. Después, las células se lavaron de nuevo, se resuspendieron en PBS FBS al 2 % y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences, Mississauga, ON). Se midió la unión a PGRn como la intensidad media de fluorescencia de APC en la población de células que expresan sortilina.
Resultados
Unión de progranulina a sortilina
Se analizó la capacidad de la progranulina (PGRN) humana biotinilada o de la PGRN de ratón biotinilada, para unirse a sortilina (SORT1) humana o de ratón en la superficie de células HEK293T. Se añadió progranulina biotinilada en concentraciones crecientes (0 nM-100 nM) a las células HEK293T que expresan sortilina, o células de control, y se analizó la unión usando FACSCanto™.
La Figura 5A es una gráfica de FACS que demuestra la unión dependiente de la dosis de PGRN humana a SORT1 recombinante expresada en células HEK293T. Tal como se muestra en la Figura 5B, PGRN no muestra mucha unión a las células de control.
Las Figuras 5C y 5D muestran la intensidad media de fluorescencia (MFI) graficada en función de la unión de PGRN a sortilina humana recombinante (SORT) expresada en células HEK293T (Figura 5C) o unión de PGRN a sortilina de ratón (SORT1) expresada en células HEK293T (Figura 5D), en comparación con células de control sin expresión de sortilina recombinante. Los resultados demostraron que PGRN se une a sortilina de forma dependiente de la dosis.
Anticuerpos de sortilina capaces de bloquear la unión a progranulina
Para evaluar si los anticuerpos anti sortilina podían bloquear la unión de la progranulina a la sortilina, se incubaron células que expresaban sortilina humana o de ratón con progranulina humana o de ratón biotinilada 15 nM junto con anticuerpos anti sortilina 67 nM. En la Tabla 8 se ilustran los resultados del ensayo competitivo de progranulina celular. Los anticuerpos anti sortilina muestran una amplia capacidad para bloquear progranulina. Se identificaron los anticuerpos S-64, S-63, S-60, S-05, S-49, S-72, S-06, S-76, S-83 y S-65 como los anticuerpos con mayor capacidad de bloqueo de progranulina.
En la Tabla 8, “hPGRN” se refiere a progranulina humana, “mPGRN” se refiere a progranulina de ratón, “hSort” se refiere a sortilina humana y “mSort” se refiere a sortilina de ratón.
Tabla 8: Competición de anticuerpos basada en células
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n in i n
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n in i n
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S e in c u b a ro n c é lu la s H E K 293 T q u e e x p re s a b a n s o r t i l in a c o n p ro g ra n u lin a h u m a n a o d e ra tó n b io t in ila d a 15 m M ju n to c o n c o n c e n tra c io n e s c re c ie n te s d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a o d e c o n tro l p a ra e v a lu a r la c a p a c id a d d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a c o n m a y o r c a p a c id a d d e b lo q u e o d e p ro g ra n u lin a . S e m id ió la in te n s id a d m e d ia d e f lu o re s c e n c ia y se a ju s ta ro n c u rv a s e n P r is m ( re g re s ió n n o lin e a l: in h ib ic ió n lo g a r í tm ic a c o n tra re s p u e s ta a la d o s is c o n t re s p a rá m e tro s ) p a ra d e te rm in a r la s c o n s ta n te s d e b lo q u e o .
L a s Figuras 6A-6D d e m u e s tra n q u e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a in h ib e n la u n ió n d e p ro g ra n u lin a a s o r t i l in a h u m a n a y p ro g ra n u lin a d e ra tó n a s o r t i l in a d e ra tó n e x p re s a d a e n c é lu la s H E K 293 T d e fo rm a d e p e n d ie n te d e la d o s is . L a s Figuras 6A y 6B m u e s tra n q u e lo s a n t ic u e rp o s S -5 , S -60 , S -63 , S -64 , S -49 , S -8 , S -76 , S -83 , S -6 , S -65 y S -72 in h ib e n la u n ió n d e p ro g ra n u lin a h u m a n a a s o r t i l in a h u m a n a . L a s Figuras 6C y 6D m u e s tra n q u e lo s a n t ic u e rp o s S -1 , S -6 , S -26 , S -30 , S -39 , S -44 , S -24 , S -81 y S -85 in h ib e n la u n ió n d e p ro g ra n u lin a d e ra tó n a s o r t i l in a d e ra tó n , a l t ie m p o q u e e l a n t ic u e rp o S -49 n o fu e c a p a z d e in h ib ir la u n ió n d e p ro g ra n u lin a d e ra tó n a s o r t i l in a d e ra tó n , s in o q u e a u m e n tó la u n ió n d e p ro g ra n u lin a a s o r t il in a . L o s re s u lta d o s en la s Figuras 6A-6D in d ic a n q u e d e te rm in a d o s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a , ta le s c o m o e l a n t ic u e rp o S -6 , s o n c a p a c e s d e in h ib ir la u n ió n ta n to d e p ro g ra n u lin a h u m a n a c o m o d e ra tó n a la p ro te ín a s o r t i l in a re s p e c tiv a .
L a Figura 6E i lu s tra q u e h a y un in te rv a lo g ra d u a l en c u a n to a la c a p a c id a d d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a p a ra b lo q u e a r la u n ió n d e P G R N a s o r t il in a . L o s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a q u e re d u c e n la u n ió n d e p ro g ra n u lin a a s o r t i l in a e n 20 % o m e n o s a u n a c o n c e n tra c ió n d e a n t ic u e rp o d e s a tu ra c ió n (67 n M ) re c ib e n e l n o m b re d e a n t ic u e rp o s q u e no b lo q u e a n la p ro g ra n u lin a .
L a Tabla 9 c u a n tif ic a la c a p a c id a d d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a p a ra in h ib ir la u n ió n d e p ro g ra n u lin a (P G R N ) a s o r t i l in a b a s á n d o s e e n lo s d a to s i lu s tra d o s e n la Figura 6. L a Tabla 9 i lu s tra e l b lo q u e o a c o n c e n tra c ió n m e d ia m á x im a ( IC 50 ) y e l p o rc e n ta je m á x im o d e b lo q u e o d e u n ió n d e s o r t i l in a :p ro g ra n u lin a m e d ia n te lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a in d ic a d o s ( Ig G 150 n M ). “ N T ” s e re f ie re a a n t ic u e rp o s n o e v a lu a d o s .
Tabla 9: Anticuerpos de bloqueo que inhiben la interacción PGRN/SORT1
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n in i n
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Aumento del bloqueo de progranulina con combinaciones de anticuerpos de sortilina
L a Figura 7 m u e s tra lo s e fe c to s s in é rg ic o s d e la s c o m b in a c io n e s d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a q u e b lo q u e a n la u n ió n a p ro g ra n u lin a . E n re s u m e n , s e in c u b a ro n c é lu la s H E K 293 T c o n e x p re s ió n d e s o r t i l in a h u m a n a re c o m b in a n te co n p ro g ra n u lin a b io t in ila d a 15 nM co n lo s a n t ic u e rp o s S -49 , S -64 o S -16 67 nM , ju n to c o n a n t ic u e rp o d e c o n tro l o d ife re n te s c o m b in a c io n e s d e S -49 o S -64 67 nM e n tre s í o S -16 (c a d a a n t ic u e rp o a 67 n M ). S e d e te c tó p ro g ra n u lin a u n id a m e d ia n te e s tre p ta v id in a -A P C (1 :100 , B D B io s c ie n c e s ) y s e c u a n tif ic ó c o m o in te n s id a d m e d ia d e f lu o re s c e n c ia d e A P C . L o s re s u lta d o s e n la Figura 7 d e m u e s tra q u e la c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s S -49 y S -16 , la c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s S -64 y S -16 , y la c o m b in a c ió n d e a n t ic u e rp o s S -49 y S -64 a u m e n ta ro n e l b lo q u e o d e p ro g ra n u lin a h u m a n a , e n c o m p a ra c ió n co n la c a p a c id a d d e b lo q u e o d e p ro g ra n u lin a d e c u a lq u ie ra d e lo s a n t ic u e rp o s s o lo s . D ic h o s re s u lta d o s in d ic a n q u e la s c o m b in a c io n e s d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a p u e d e n s e r m á s e f ic ie n te s q u e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a s im p le s .
Unión y endocitosis de células que expresan sortilina y progranulina
C o n fo rm e a lo s re s u lta d o s ilu s tra d o s en la Figura 8, s e in c u b a ro n la s c é lu la s H E K 293 T q u e e x p re s a n s o r t i l in a o L a c Z (c o n tro l) c o n p ro g ra n u lin a (P G R N ) d u ra n te h a s ta 60 m in u to s a 37 °C . S e o b s e rv a ro n u n ió n y e n d o c ito s is P G R N d e p e n d ie n te s d e l t ie m p o m e d ia n te m ic ro s c o p ía c o n f lu o re s c e n c ia . S e e t iq u e tó la p ro g ra n u lin a h u m a n a re c o m b in a n te (A d ip o g e n ) c o n D y L ig h t 650 (L ife T e c h n o lo g ie s , C a r ls b a d , C A ). S e tra n s fe c ta ro n la s c é lu la s d e fo rm a tra n s ito r ia co n s o r t i l in a h u m a n a o la c Z (c o n tro l) y G F P c o n F u g e n e y s e re c o g ie ro n d e s p u é s d e 24 h o ra s . U n s e g u n d o v e c to r e x p re s ó G F P (T o p o 3.3 , In v it ro g e n ) o G F P se u b ic ó e n e l m is m o v e c to r , s e p a ra d o p o r IR E S (p C M V 6 -A C -IR E S -G F P , O r ig e n e ) . S e u t iliz ó s o r t i l in a d e lo n g itu d c o m p le ta y a s e a s in e t iq u e ta r (T o p o 3.3 ) o c o n u n a e t iq u e ta m y c d e e x tre m o C (p C M V 6 -A C - IR E S -G F P ) . D e s p u é s , la s c é lu la s s e c o lo c a ro n e n p o r ta o b je to s d e v id r io c o n c á m a ra s d e m ic ro s c o p ía re v e s t id a s c o n p o li- l- lis in a . D e s p u é s d e 4 -6 h o ra s , la s c é lu la s s e la v a ro n c o n m e d io s in s u e ro O p t iM e m y se a ñ a d ió p ro g ra n u lin a 650 40 nM co n p ro p é p t id o d e s o r t i l in a 10 uM c o m o b lo q u e a d o r o s in e s ta . L a s c é lu la s s e in c u b a ro n a 37 °C d u ra n te h a s ta 60 ’ . P o s te r io rm e n te , la s c é lu la s s e f i ja ro n en p a ra fo rm a ld e h íd o a l 4 % , s e la v a ro n c o n P B S y s e o b tu v ie ro n im á g e n e s e n un m ic ro s c o p io d e f lu o re s c e n c ia N iko n .
L a Figura 8A m u e s tra a u m e n to d e u n ió n y e n d o c ito s is d e p ro g ra n u lin a a c é lu la s c o n e x p re s ió n d e s o r t i l in a c o n m a y o r t ie m p o d e in c u b a c ió n , ta l c o m o s e d e te rm in ó e n e n s a y o s d e f lu o re s c e n c ia D y L ig h t-650. Ú n ic a m e n te s e o b s e rv ó u n ió n a p ro g ra n u lin a d e s p re c ia b le c u a n d o la s c é lu la s e x p re s a ro n p ro te ín a L a c Z d e c o n tro l o c u a n d o la s c é lu la s se c o in c u b a ro n c o n p ro p é p t id o d e s o r t i l in a d e b lo q u e o 10 pM .
L a s Figuras 8B-8E i lu s tra n un e n s a y o F A C S q u e c u a n tif ic a la e n d o c ito s is d e p ro g ra n u lin a y la c a p a c id a d d e l p ro p é p t id o d e s o r t i l in a d e b lo q u e o p a ra in h ib ir la e n d o c ito s is d e p ro g ra n u lin a . S e a ñ a d ió p ro g ra n u lin a h u m a n a co n e t iq u e ta s f lu o re s c e n te s (P G R N -D y L ig h t650 ) a s o r t i l in a h u m a n a (S o rt) ( Figura 8B), s o r t i l in a d e ra tó n (S o rt) ( Figura 8C) o c é lu la s H E K 293 T d e c o n tro l, y s e c u a n tif ic ó m e d ia n te F A C S la c a n t id a d d e p ro g ra n u lin a u n id a y q u e e x p e r im e n tó e n d o c ito s is a l m e d ir la in te n s id a d m e d ia d e f lu o re s c e n c ia d e la s c é lu la s q u e e x p re s a n s o rt il in a . L a s Figuras 8D y 8E d e m u e s tra n la c a p a c id a d d e l p ro p é p t id o d e s o r t i l in a p a ra in h ib ir la e n d o c ito s is d e p ro g ra n u lin a m e d ia n te s o r t i l in a h u m a n a ( Figura 8D) o s o r t i l in a d e ra tó n (Figura 8E).
E je m p lo 5: N iv e le s a u m e n ta d o s d e p ro g ra n u lin a s e c re ta d a en c é lu la s tra ta d a s c o n a n t ic u e rp o s d e s o r t i l in a
Niveles extracelulares aumentados de progranulina
C é lu la s U -251 d e a s tro c ito m a s h u m a n o s s e s e m b ra ro n e n p la c a s d e 96 p o c il lo s y s e in c u b a ro n d u ra n te la n o c h e . La m a ñ a n a s ig u ie n te , s e a ñ a d ie ro n a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a (S -1 a S -10 , S -12 , S -14 a S -16 , S -18 a S -22 , S -24 a S -26 , S -28 a S -30 , S -32 , S -34 , S -39 , S -40 , S -42 a S -45 , S -48 a S -51 , S -55 , S -57 a S -61 , S -63 , S -64 , S -65 , S -67 , S -69 , S -71 a S -76 , S -78 y S -81 a S -85 ), a s í c o m o un a n t ic u e rp o s d e b lo q u e o p o s it iv o (a n ti s o r t i l in a h u m a n a d e c a b ra (g tS o r p o r g o a t S o r t) ) d e R & D S y s te m s , A F 3154 ) y a n t ic u e rp o s d e c o n tro l d e is o t ip o ( Ig G d e c a b ra (g t), A D I-88 (Ig G 1 h u m a n a ) y A D I-89 ( Ig G 1 h u m a n a ) , a u n a d ilu c ió n f in a l 50 nM o 5 nM , y la s c é lu la s s e in c u b a ro n d e e s a fo rm a d u ra n te 72 h o ra s . D e s p u é s , s e re c o g ió e l m e d io y s e m id ió la c o n c e n tra c ió n d e p ro g ra n u lin a e n las m u e s tra s d e m e d io u s a n d o un k it d e e n s a y o E L IS A D u o s e t p a ra p ro g ra n u lin a h u m a n a d e R & D S y s te m s .
T a l c o m o s e m u e s tra e n la s Figuras 9A-9D, e l b lo q u e o d e la u n ió n d e p ro g ra n u lin a a s o r t i l in a c o n v a r io s a n t ic u e rp o s anti sortilina generó un aumento de hasta 3 veces del nivel de progranulina secretada en el medio de las células U-251. Las Figuras 9A y 9C muestran los resultados de los anticuerpos añadidos a 50 nM y las Figuras 9B y 9D muestran los resultados de los anticuerpos añadidos a 5 nM. Los resultados en las Figuras 9A y 9B demuestran que un subconjunto de una clase de anticuerpos anti sortilina que pertenecen a los grupos 3/4 y 4 (lo que incluye, por ejemplo, S-8, S-49 y S-60) no solo bloquea la unión de progranulina a sortilina, sino que aumenta el nivel de progranulina endógena en las células U-251, que expresan de manera natural tanto sortilina como progranulina. Asimismo, los resultados de las Figuras 9C y 9D demuestran adicionalmente que una segunda clase de anticuerpos anti sortilina que pertenecen a los grupos 1/2, 2 y 3 (incluyendo, por ejemplo, S-2, S-14, S-15, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-29, S-51, S-57, S-61 y S-82) que no bloquean la unión de progranulina a sortilina, o solo bloquean de forma débil la unión de progranulina a sortilina, también es capaz de inducir un aumento del nivel de progranulina endógena en las células U-251.
Reducción de niveles superficiales de sortilina
Después de la incubación de las células U-251 con anticuerpos anti sortilina 50 nM durante 72 horas tal como se indicó anteriormente, las células se recogieron las células, se lavaron en PBS y se etiquetaron con anticuerpo anti sortilina S-20 (cuya unión no compite de forma significativa por la unión a anticuerpos de bloqueo de progranulina). Después de la incubación de las células con 5 pg/ml de S-20 durante una hora en hielo, las células se lavaron tres veces en PBS FBS al 2% y después se incubaron con 5 pg/ml de anticuerpo secundario PE antihumano (Southern Biotech). Después, las células se lavaron nuevamente y la unión a S-20 se cuantificó usando FACSCanto™ como intensidad media de fluorescencia de PE.
La Figura 10A muestra que determinados anticuerpos anti sortilina reducen los niveles de sortilina en la superficie celular en células U-251 humanas y los anticuerpos que inducen el mayor aumento de progranulina secretada (por ejemplo, S-2, S-19 y S-22) también inducen la mayor reducción de niveles de sortilina en la superficie celular. Los anticuerpos, tales como S-64 y S-5, que no reducen los niveles de sortilina de la superficie celular no fueron capaces de aumentar los niveles extracelulares de progranulina, a pesar de que su capacidad para bloquear la unión de progranulina a sortilina es tan buena, o mejor, que la capacidad de bloqueo de progranulina de los anticuerpos S-49, S-60. La Figura 10B muestra que determinados anticuerpos anti sortilina reducen los niveles de sortilina en la superficie celular en células Neuro-2A (N2A) murinas. En general, los anticuerpos que reducen los niveles de sortilina en la superficie celular en células U-251 humanas también reducen los niveles de sortilina en la superficie celular en células N2A murinas. Dichos resultados indican que la reducción de los niveles de sortilina en la superficie celular es una actividad universal de dichos anticuerpos y, por lo tanto, los anticuerpos también pueden ser capaces de reducir los niveles de sortilina en la superficie celular en otros tipos de células tanto in vitro como in vivo.
Las Figuras 10C y 10D muestran los niveles de sortilina en la superficie celular en células U-251 que se incubaron con concentraciones diferentes de los anticuerpos anti sortilina durante 72 horas. Los anticuerpos anti sortilina inducen una reducción dependiente de la dosis de la expresión de sortilina en la superficie celular. La reducción de los niveles de sortilina se ilustra mediante una menor intensidad de fluorescencia media (MFI) de la unión de anticuerpo S-20 a sortilina. La Figura 10E muestra la cuantificación (mediante análisis ELISA) de los niveles correspondientes de PGRN en el medio de las células U-251 que se incubaron con los anticuerpos anti sortilina enumerados durante 72 horas. Los anticuerpos anti sortilina que reducen los niveles de sortilina en la superficie celulartambién provocan un aumento dependiente de la dosis de los niveles de PGRN extracelular.
La Figura 10F muestra que los niveles de sortilina (SORT) en la superficie celular se relacionan estrechamente y de forma inversa con el aumento en veces de los niveles extracelulares de progranulina (PGRN). Basándose en dichos resultados, los anticuerpos anti sortilina que reducen los niveles de sortilina en la superficie celulartambién aumentan los niveles extracelulares de progranulina. Asimismo, los anticuerpos anti sortilina que reducen los niveles de sortilina en la superficie celular y aumentan los niveles extracelulares de progranulina (por ejemplo, S-49, S-60 y S-8) pertenecen a los grupos 2, 3, 4 de anticuerpos o a grupos no categorizados (Tabla 5). Por lo tanto, los resultados indican que los anticuerpos anti sortilina adicionales que pertenecen a los mismos grupos que los anticuerpos S-49, S-60 y S-8 (los anticuerpos que pertenecen al mismo grupo compiten entre sí por la unión a sortilina) también serán capaces de reducir los niveles de sortilina en la superficie celular y aumentar los niveles extracelulares de progranulina.
La Tabla 10 indica anticuerpos que son capaces de reducir los niveles de sortilina en la superficie celular en células U-251 humanas y/o en células N2A murinas, y/o de aumentar los niveles extracelulares de progranulina. Los anticuerpos se enumeran de actividad más fuerte a más débil. “NT” se refiere a anticuerpos no evaluados.
Tabla 10: Actividades de los anticuerpos anti sortilina
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n in i n
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Aumento de niveles de prngranulina en cerebros de ratón
R a to n e s T g 2576 d e 14 m e s e s se re c ib ie ro n m e d ia n te in fu s ió n (c o n b o m b a s A lz e t 1002 im p la n ta d a s ) d u ra n te d o s s e m a n a s un to ta l d e 240 | jg d e s o r t i l in a a n ti ra tó n d e c a b ra (g t) (R & D S y s te m s , A F 2934 ) o a n t ic u e rp o p o lic lo n a l Ig G d e c a b ra (g t) o ta m p ó n a C S F s o lo (n = 3 /g ru p o ), D e s p u é s , lo s ra to n e s s e s a c r if ic a ro n y lo s c e re b ro s s e d is e c c io n a ro n e n h ip o c a m p o iz q u ie rd o y d e re c h o , c o r te z a f ro n ta l y c o r te z a o c c ip ita l c o n un to ta l d e 6 b lo q u e s p o r a n im a l. L o s b lo q u e s s e e x tra je ro n in m e d ia ta m e n te N -P e r (T h e rm o S c ie n t if ic P ie rc e ) o s e c o n g e la ro n d e fo rm a u lt ra r rá p id a y s e e x tra je ro n p o s te r io rm e n te . E l s e d im e n to d e la f ra c c ió n d e p ro te ín a in s o lu b le s e la v ó c o n T B S X , s e re s u s p e n d ió en á c id o fó rm ic o a l 70 % h a s ta 150 m g /m l b a s á n d o s e e n e l p e s o d e l s e d im e n to y s e m e z c ló m e d ia n te ro ta c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 2 h o ra s c o n c e n tr ifu g a c ió n e n v ó r t ic e o c a s io n a l p a ra a is la r e l p é p tid o A b e ta 42 a g re g a d o . S e c e n tr ifu g a ro n las m u e s tra s (100 000 x g, 1 h o ra a 4 °C ) y s e n e u tra liz ó la fra c c ió n s o lu b le e n á c id o fó rm ic o c o n 20 v o lú m e n e s d e b a s e T r is 1 M , s e d iv id ió e n a líc u o ta s y se c o n g e ló a 80 °C . S e m id ió e l c o n te n id o p ro te ic o d e to d o s los e x tra c to s co n e s p e c tro fo to m e tr ía A 280 y B C A (T h e rm o S c ie n t if ic P ie rc e ).
S e m id ie ro n lo s n iv e le s d e p ro g ra n u lin a d e ra tó n c o n un k it d e E L IS A D u o s e t d e R & D S y s te m s , S e m id ie ro n lo s n iv e le s d e A b e ta 42 s o lu b le e in s o lu b le c o n un k it d e E L IS A d e L ife T e c h n o lo g ie s . S e m id ie ro n lo s n iv e le s c e re b ra le s d e a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e c a b ra co n un e n s a y o E L IS A a d a p ta d o , En re s u m e n , s e c o lo c a ro n 2 jg / m l d e s o r t i l in a de ra tó n re c o m b in a n te (R & D S y s te m s ) e n P B S en p la c a s d u ra n te la n o c h e a 4 °C e n u n a p la c a d e E L IS A Im m u lo n . A l d ía s ig u ie n te , s e la v ó la p la c a e n P B S T W E E N 20 a l 0 ,05 % y s e b lo q u e ó e n P B S B S A a l 1 % d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . S e a ñ a d ie ro n 100 j l d e m u e s tra s d ilu id a s y s e in c u b a ro n d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . L a s p la c a s s e la v a ro n y d e s p u é s s e in c u b a ro n c o n 100 j l d e a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n H R P a n ti c a b ra (1 :20 000 , J a c k s o n Im m u n o ). L a s p la c a s s e la v a ro n n u e v a m e n te y s e in c u b a ro n c o n 100 j l d e s u s tra to d e T M B h a s ta q u e s e re v e ló e l c o lo r. L a re a c c ió n s e d e tu v o m e d ia n te la a d ic ió n d e 50 j l d e á c id o s u lfú r ic o 2 N y e l re v e la d o d e c o lo r se c u a n tif ic ó c o n un le c to r d e p la c a s B io te k .
E n c o m p a ra c ió n co n lo s g ru p o s d e c o n tro l ( Ig G g t y ta m p ó n a C S F s o lo ), la in fu s ió n d e un a n t ic u e rp o p o lic lo n a l a n ti s o r t i l in a d e c a b ra e n lo s c e re b ro s d e lo s ra to n e s p ro d u jo un a u m e n to fu e r te d e lo s n iv e le s d e p ro g ra n u lin a e n lo s t re s a n im a le s e n la s t re s re g io n e s c e re b ra le s e x a m in a d a s ( Figuras 11A y 11B). E l m a y o r a u m e n to d e lo s n iv e le s d e p ro g ra n u lin a s e p ro d u jo e n e l h e m is fe r io d e re c h o , ip s ila te ra l a l lu g a r d o n d e se p ro d u jo la in fu s ió n ( Figura 11B). D e fo rm a c o h e re n te c o n e s to s re s u lta d o s , lo s n iv e le s m á x im o s d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a s e p re s e n ta ro n e n la s re g io n e s c e re b ra le s ip s ila te ra le s (h ip o c a m p o > c o r te z a fro n ta l > c o r te z a o c c ip ita l) ( Figura 11C), C u a n d o la c o n c e n tra c ió n d e a n t ic u e rp o s e re p re s e n tó g rá f ic a m e n te f re n te a lo s n iv e le s d e p ro g ra n u lin a , s e o b s e rv ó u n a fu e r te c o r re la c ió n p o s it iv a c o n un v a lo r d e R a l c u a d ra d o d e 0 ,92 ( Figura 11D),
L a s Figuras 11E y 11F m u e s tra n lo s n iv e le s d e l p é p tid o A b e ta 42 m e d id o s e n e x tra c to s c e re b ra le s u s a n d o un E L IS A d e L ife T e c h n o lo g ie s . L a Figura 11E m u e s tra lo s n iv e le s d e l p é p tid o A b e ta 42 e n la f ra c c ió n p ro te ic a in s o lu b le e x tra íd a c o n á c id o fó rm ic o y la Figura 11F m u e s tra lo s n iv e le s d e l p é p tid o A b e ta 42 e n la fra c c ió n d e p ro te ín a s o lu b le . L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p a re c e te n e r e fe c to s o b re lo s n iv e le s d e l p é p tid o A b e ta 42 e n la f ra c c ió n p ro te ic a in s o lu b le e x tra íd a co n á c id o fó rm ic o .
E je m p lo 6: B lo q u e o d e la u n ió n d e p ro -N G F a s o r t i l in a
P a ra e x a m in a r e l b lo q u e o d e la u n ió n d e p ro -N G F a s o r t i l in a m e d ia n te a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -28 , S -5 , S -1 , S -6 , S -65 , S -83 , S -72 , S -8 , S -49 , S -60 , S -63 , S -64 y S -76 , s e u t iliz ó a n á lis is S P R B ia c o re T 200. S e re c o p ila ro n d a to s d e S P R a 25 °C e n un in s tru m e n to B ia C o re T 200 y s e a n a liz a ro n u s a n d o un s o ftw a re d e e v a lu a c ió n B ia C o re T 200 , v e rs ió n 2 ,0. S e u t iliz ó H B S -E P (H E P E S 100 m M , N a C l 1 ,5 M , E D T A 30 m M , te n s io a c t iv o P 20 a l 0 ,5 % v /v , pH 7 ,4 ) c o m o ta m p ó n d e e je c u c ió n y p a ra p re p a ra r re a c tiv o s ,
S e c a p tu ró s o r t i l in a e t iq u e ta d a co n H is (200 nM , R & D S y s te m s ) e n un c h ip s e n s o r C M 5 in m o v iliz a d o co n a n ti Ig G d e ra tó n m a rc a d o co n H is ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 j l /m in , t ie m p o d e d is o c ia c ió n 0 s e g u n d o s ) . S e e s ta b le c ió f lu jo d e p ro -N G F h u m a n o (400 n M ) o ta m p ó n H B S -E P a t ra v é s d e la s u p e r f ic ie d e l c h ip ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 j l /m in , t ie m p o d e d is o c ia c ió n 0 s e g u n d o s ) . S e e s ta b le c ió un f lu jo d e a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a (200 n M ) a t ra v é s d e la s u p e r f ic ie d e l c h ip ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 j l /m in , t ie m p o d e d is o c ia c ió n 30 s e g u n d o s ) . S e re g e n e ró la s u p e r f ic ie d e l c h ip e n tre c ic lo s c o n g lic in a -H C l 10 m M , pH 1 ,7 ( t ie m p o d e c o n ta c to 75 s e g u n d o s , c a u d a l 30 j l /m in , t ie m p o d e e s ta b il iz a c ió n 60 s e g u n d o s ) . L a s e ñ a l d e S P R re s u lta n te s e o b tu v o c o m o la d ife re n c ia d e re s p u e s ta d e la s m e d id a s to m a d a s e n u n a c e ld a d e f lu jo d e b la n c o .
L o s re s u lta d o s ilu s tra d o s e n las Figuras 12A-12C d e m o s tra ro n q u e p ro -N G F p u e d e b lo q u e a r p a rc ia lm e n te la u n ió n d e d e te rm in a d o s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a a s o rt il in a . L a Figura 12A m u e s tra la c o n f ig u ra c ió n e x p e r im e n ta l. L a Figura 12B m u e s tra la s t ra z a s d e re s p u e s ta d e un a n t ic u e rp o d e c o n tro l (S -28 ) q u e n o b lo q u e a la p ro g ra n u lin a . La p re in c u b a c ió n c o n p ro -N G F no b lo q u e a la u n ió n d e S -28 a s o rt il in a . L a Figura 12C m u e s tra q u e la u n ió n d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S-1 y S -65 a s o r t il in a , s e b lo q u e a e n m a y o r m e d id a m e d ia n te la u n ió n d e p ro -N G F a s o r t i l in a (R U = u n id a d e s d e re s p u e s ta ) .
E je m p lo 7: C a ra c te r iz a c ió n d e l u s o te ra p é u t ic o d e a n t ic u e rp o s d e b lo q u e o d e s o r t i l in a u s a n d o m o d e lo s a n im a le s e s ta b le c id o s d e le s ió n c e re b ra l p o r t ra u m a t is m o
E s p o s ib le e v a lu a r la u t ilid a d te ra p é u t ic a d e lo s a n t ic u e rp o s d e b lo q u e o d e s o r t i l in a e n m o d e lo s a n im a le s e s ta b le c id o s d e le s ió n c e re b ra l p o r t ra u m a t is m o (T a n a k a , Y e t a l., (2013 ) Neuroscience 231 49 -60 ),
P o r e je m p lo , s e p u e d e u t il iz a r un m o d e lo d e le s ió n c e re b ra l p o r t ra u m a t is m o q u e in d u c e la a c t iv a c ió n d e la m ic ro g lía y a s tro c ito s . S e p u e d e n u t il iz a r ra to n e s C 57 B L /6 J W T m a c h o o ra to n e s h e te ro c ig o to s p a ra p ro g ra n u lin a d e o c h o o n u e v e s e m a n a s . L o s ra to n e s s e a d q u ie re n en C h a r le s R iv e r L a b o ra to r ie s o J a c k s o n la b s . S e a d m in is tró p o r v ía in tra p e r ito n e a l c lo rh id ra to d e x i la z in a (8 m g /k g ) e h id ra to c lo ra l (300 m g /k g ) d is u e lto en s o lu c ió n s a lin a e s té r il p a ra a n e s te s ia r lo s y, p o s te r io rm e n te , s e c o lo c a ro n e n un a p a ra to e s te re o tá c t ic o (N a r is h ig e , T o k io , J a p ó n ) . S e h a c e u n a in c is ió n e n e l c u e ro c a b e llu d o y s e e x p o n e e l c rá n e o . S e re t ira e l p e r io s t io d e l c rá n e o , se ta la d ra un o r if ic io s o b re e l h e m is fe r io c e re b ra l d e re c h o c o n un ta la d ro d e n ta l y c o n la p u n ta d e u n a a g u ja s e re t ira la d u ra m a d re . S e u t iliz a u n a c á n u la d e a c e ro in o x id a b le c o n un d iá m e tro e x te rn o d e 0 ,5 m m p a ra h a c e r un c o r te lo n g itu d in a l en e l h e m is fe r io d e re c h o . L a c á n u la s e c o lo c a a 1 ,3 m m h a c ia un la d o d e la lín e a c e n tra l y 1 m m d e la n te d e l b re g m a , y s e in tro d u c e en e l c e re b ro h a s ta q u e la p u n ta a lc a n z a a u n a p ro fu n d id a d d e 2 m m . D e s p u é s , s e in c lin a la c á n u la 2 m m h a c ia a b a jo (b re g m a , 3 m m ) y se in c lin a 2 m m a n te r io rm e n te h a c ia su p o s ic ió n in ic ia l. F in a lm e n te , se e x tra e la c á n u la d e l c e re b ro y s e s u tu ra e l c u e ro c a b e llu d o . D e s p u é s , lo s ra to n e s s e tra ta n c o n a n t ic u e rp o s d e b lo q u e o d e s o r t i l in a d e a c u e rd o co n p ro c e d im ie n to s c o n v e n c io n a le s y p o s te r io rm e n te s e a n a liz a n m e d ia n te h is to lo g ía y t in c ió n in m u n o f lu o re s c e n te y m e d ia n te e n s a y o s d e c o m p o r ta m ie n to ,
Ejemplo 8: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos de bloqueo de sortilina usando un modelo de neuroinflamación de Parkinson y pérdida de neuronas después de una lesión inducida por toxinas o porsinucleína
También es posible evaluar la utilidad terapéutica de los anticuerpos de bloqueo de sortilina en un modelo de neuroinflamación y pérdida neuronal después de una lesión inducida por toxinas (Martens, LH et al., (2012) The Journal of Clinical Investigation, 122, 3955).
Ratones de tres meses de vida se trataron con 4 inyecciones i.p. de MPTP al día durante 2 días (4 pg/g peso corporal) (Sigma-Aldrich) o con PBS. La MPTP destruye las neuronas dopaminérgicas, lo que genera la enfermedad de Parkinson. Los ratones se trataron con anticuerpos de bloque de sortilina conforme a protocolos estándar y después se analizaron usando recuento estereológico para cuantificar las neuronas dopaminérgicas y la microglía en la SNpc. Tal como se describió. De manera alternativa, es posible utilizar modelos de Parkinson con expresión de mutaciones genéticas en el gen de la alfa sinucleína (A53T, A30P y E46K) o con sobreexpresión de alfa sinucleína (Maguire-Zeiss (2008) Pharmacol Res; 58(5-6): 271-280; Chesselet (2008) Exp Neurol 209: 22-27).
Ejemplo 9: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos que bloquean sortilina usando modelos animales de envejecimiento, convulsiones, lesiones de médula espinal, distrofia de la retina, demencia frontotemporal y enfermedad de Alzheimer
También es posible evaluar la utilidad terapéutica de los anticuerpos que bloquean sortilina en modelos animales de envejecimiento, convulsiones, lesión de médula espinal, distrofia de la retina, demencia frontotemporal y enfermedad de Alzheimer, tal como se describió anteriormente (por ejemplo, Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al., (2006) J, Neurosci, 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr, Opin, Neurobiol, 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat, Neurosci, 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J, Neurosci, 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol, Cell Neurosci, 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death, Differ, 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) Brain Res, 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci, Lett, 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Nykjaer, A et al., (2004) Nature 427, 843-848; Harrington, AW et al., (2004) Proc, Natl, Acad, Sci, U,S,A, 101, 6226-6230; Teng, HK et al., (2005) J, Neurosci, 25, 5455-5463; Jansen, P et al., (2007) Nat, Neurosci, 10, 1449­ 1457; Volosin, M et al., (2008) J, Neurosci, 28, 9870-9879; Fan, YJ et al., (2008) Eur, J, Neurosci, 27, 2380-2390; Al-Shawi, R et al., (2008) Eur, J, Neurosci, 27, 2103-2114; and Yano, H et al., (2009) J, Neurosci, 29, 14790-14802),
Ejemplo 10: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos que bloquean la unión a sortilina usando modelos de ateroesclerosis
También es posible evaluar la utilidad terapéutica de los anticuerpos que bloquean sortilina en modelos de ateroesclerosis, tal como se describió anteriormente (por ejemplo, Lance, A et al., (2011) Diabetes, 60, 2285; y Kjolby, M et al., (2012) Cell Metabolism 12, 213-223).
Ejemplo 11: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos que bloquean la unión a sortilina usando un modelo de infección
También es posible evaluar la utilidad terapéutica de anticuerpos que bloquean sortilina en un modelo de infección, Por ejemplo, se puede utilizar Listeria monocytogenes u otra bacteria infecciosa en ratones normales o heterocigotos para progranulina, tal como se describió anteriormente (por ejemplo, Yin, F et al., (2009) J, Exp, Med, 207, 117-128),
Ejemplo 12: Protección in vivo de EAE y cuprizona en un animal
Ratones hembra C57BL/6 de 7-9 semanas (obtenidos en Charles River Laboratories) recibieron bilateralmente en la base de la cola una inyección de 200 jl de un inóculo que contenía 100 |jg de péptido 35-55 de glicoproteína oligodendrocítica de mielina (aminoácidos MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ iD No : 707); Seqlab) y 1 mg de Mycobacteriun tuberculosis H37 Ra (Difco) en adyuvante incompleto de Freund (Difco). Se inyecta toxina diftérica (200 ng; List Biological Laboratories) el día 0 y el día 2 después de la inmunización. Los síntomas clínicos se puntúan de la siguiente manera: 0, sin síntomas; 1, cola totalmente flácida; 2, cola totalmente fláccida y marcha anómala; 3, paraparesia de una pata trasera; 4, paraparesia total de las patas traseras y 5, parálisis de patas delanteras y traseras o estado moribundo. En los experimentos solo se utilizan ratones con aparición de la enfermedad (puntuación clínica de 1 o más) el día 14. Se inyectan anticuerpos biespecíficos para sortilina y/o anti sortilina antagonista por vía intraperitoneal o intravenosa en los ratones que padecen EAE el día de los primeros síntomas clínicos o en cualquier otro momento deseado (PLoS Med (2007) 4(4): e124),
Ratones jóvenes o más mayores de tipo silvestre (WT, wild-type) reciben una dieta estándar (Harlan) que contiene bis(ciclohexilidenohidrazida) oxálica en polvo de cuprizona (CPZ) al 0,2 % (Sigma-Aldrich) durante 4, 6 o 12 semanas. Para realizar el análisis histológico e inmunohistoquímico se extraen los cerebros después de la perfusión de los ratones con paraformaldehído (PFA) al 4%, se fijan en PFA al 4% durante 24 horas, seguido de inmersión en sacarosa 30% durante 24-48 horas. Se tiñeron secciones de cerebro de ratón con anti MBP (1:100; Abcam, ab7349), anti dMBP (1:2000; Millipore, ab5864), anti p APP (1:100; Invitrogen, 51-2700), anti SMI-31 (1:1000;Covance, smi-31R), anti Iba1 (1:600; Wako, 019-19741), anti BrdU (1:250; Abcam, ab1893), anti GFAP (1:200; Invitrogen,13-0300), anti iNOS (l:100; BD Pharmingen, 610329), anti lPl (1:400, de Dr, G, Olivecrona)y anti Mh C II (1:100; BD Pharmingen, 553549) para evaluar la integridad y el daño de la mielina, así como la proliferación celular y la inflamación. Para determinar los efectos de los anticuerpos sobre el comportamiento, se analizó la actividad locomotriz de los ratones usando recintos de poliestireno transparente y un equipo de haz fotoeléctrico informatizado. Se analizan las variables de actividad general (recorridos totales, postura erecta en vertical) junto con índices emocionales que incluyen el tiempo, la distancia recorrida y las entradas. Se lleva a cabo una batería de análisis sensomotores para evaluar el equilibrio (saliente y plataforma), la resistencia (detección inversa), la coordinación (detección en polo e inclinada) e inicio del movimiento (comienzo de la marcha), La coordinación motriz y el equilibrio se estudiaron usando un protocolo de cilindro giratorio (rotarod) (Cantoni et al., Acta Neuropathol (2015)129(3):429-47),
Ejemplo 13: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos biespecíficos o antagonistas de sortilina en modelos animales establecidos de lesión cerebral por traumatismo
Es posible evaluar la utilidad terapéutica de la sortilina y/o de los anticuerpos biespecíficos de sortilina en modelos animales establecidos de lesión cerebral por traumatismo (Tanaka, Y et al., (2013) Neuroscience 231 49-60), Por ejemplo, se utiliza un modelo de lesión cerebral por traumatismo que induce la activación de la microglía y astrocitos. Se utilizan ratones macho C57BL/6J WT de ocho o nueve semanas o ratones heterocigotos para progranulina (adquiridos en Charles River Laboratories o Jackson Laboratories). Por vía intraperitoneal se administró clorhidrato de xilazina (8 mg/kg) e hidrato cloral (300 mg/kg) disuelto en solución salina estéril para anestesiar a los ratones y, posteriormente, se colocaron en un aparato estereotáctico (Narishige, Tokio, Japón). Se hace una incisión en el cuero cabelludo y se expone el cráneo. Se retira el periostio del cráneo, se taladra un orificio sobre el hemisferio cerebral derecho con un taladro dental y con la punta de una aguja se retira la duramadre. Se utiliza una cánula de acero inoxidable con un diámetro externo de 0,5 mm para hacer un corte longitudinal en el hemisferio derecho. La cánula se coloca 1,3 mm hacia un lado de la línea central y 1 mm delante del bregma, y se introduce en el cerebro hasta que la punta alcanza a una profundidad de 2 mm. Después, se inclina la cánula 2 mm hacia abajo (bregma, 3 mm) y se inclina 2 mm anteriormente hacia su posición inicial. Finalmente, se extrae la cánula del cerebro y se sutura el cuero cabelludo. Después, los ratones se tratan con anticuerpos anti sortilina agonistas y/o biespecíficos para sortilina de acuerdo con procedimientos convencionales y después se analizan mediante histología y tinción con inmunofluorescencia y mediante ensayos de comportamiento,
Ejemplo 14: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos de sortilina y/o anticuerpos biespecíficos de sortilina en un modelo de neuroinflamación y de pérdida neuronal después de una lesión inducida por toxinas
También es posible evaluar la utilidad terapéutica de los anticuerpos de sortilina y/o anticuerpos biespecíficos de sortilina en un modelo de neuroinflamación y pérdida neuronal después de una lesión inducida por toxinas (Martens, LH et al., (2012) The Journal ofClinical Investigation, 122, 3955). Ratones de tres meses se trataron con 4 inyecciones intraperitoneales de MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) al día durante 2 días (4 pg/g peso corporal) (Sigma-Aldrich) o de PBS. Los ratones se tratan con anticuerpos antagonistas anti-Sortilina y/o biespecíficos de sortilina según los protocolos estándar y después se analizan mediante recuento estereológico para cuantificar las neuronas dopaminérgicas y la microglía en la sustancia negra pars compacta (SNpc, substantia nigra pars compacta), como se describe.
Ejemplo 15: Análisis de la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para estimular la viabilidad de neuronas y/o células inmunitarias innatas
Se cultivan macrófagos procedentes de médula ósea de ratón de tipo silvestre (WT) en presencia de M-CSF o se exponen cultivos de células nerviosas en condiciones estándar a anticuerpo de sortilina, y se mide la viabilidad celular. Macrófagos aislados de la médula ósea de ratones WT y KO se siembran en placas de 96 pocillos tratadas en cultivo no tisular previamente revestidas con anticuerpo anti sortilina o anticuerpos de control. Se cultivan las células durante 48 horas en presencia de M-CSF 10 ng/ml. Se analiza la viabilidad usando un kit Cell Titer Glo (Promega). Se leen las placas con un lector de microplacas BioTek Synergy usando el software GEN52,04.
Ejemplo 16: Análisis del efecto contra accidentes cerebrovasculares de los anticuerpos de sortilina
Se utilizó obstrucción transitoria de la arteria cerebral media (MCAO, occlusion of the middle cerebral artery), un modelo que se parece mucho a un accidente cerebrovascular en un ser humano, para inducir un infarto cerebral en ratones. Se introdujo monofilamento (70SPRe, Doccol Corp, EUA) en la arteria carótida interna a través de una incisión en la arteria carótida común derecha. Se obstruyó la arteria cerebral media durante 30 minutos con un intervalo de tiempos de reperfusión (6 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 7 días y 28 días). Se controló el efecto de la cirugía con animales en simulación a 12 horas y 7 días. Los animales en simulación se sometieron al mismo procedimiento quirúrgico sin la obstrucción de la arteria cerebral media. Animales con MCAO se sometieron a tratamiento con anticuerpos anti sortilina antagonistas o anticuerpos de control y se evaluaron para determinar la volumetría de los infartos, la respuesta inflamatoria aguda (reperfusión de 12 horas), la transcripción de citocinas proinflamatorias TNFa, IL-1a e IL-1b, la actividad de la microglía (Cd 68, Iba1), la transcripción de quimiocinas CCL2 (MCP1), CCL3 (MIP1a) y del receptor de quimiocina CX3CR1 y la invasión de linfocitos T positivos para CD3 (Sieber et al, (2013) PLoS ONE 8(1): e52982),
Ejemplo 17: Análisis del efecto de los anticuerpos anti sortilina contra la enfermedad de Alzheimer
Se utilizaron ratones 5X FAD para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para retrasar, impedir o revertir el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer (EA). Los ratones 5X fAd presentan sobreexpresión de APP humana mutante (695) con las mutaciones sueca (K670N, M671L), de Florida (I716V) y de Londres (V717I) de la enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), junto con PS1 humano que presenta dos mutaciones de FAD, M146L y L286V, El promotor Thy1 de ratón regula ambos transgenes para dirigir la sobreexpresión en el cerebro y recapitular los rasgos principales de la EA. Se evalúan los ratones tratados con los anticuerpos anti sortilina antagonistas o con anticuerpos de control para determinar la carga de placa beta A con inmunohistoquímica y mediante ELISA de extractos de tejidos. Se analizan adicionalmente para determinar la cantidad de microglía en el cerebro y para determinar la reducción del déficit cognitivo con un laberinto acuático de Morris, tareas de memoria y aprendizaje espacial, laberinto acuático radial, laberinto en Y (cuantifica la alternancia espontánea como una medida de conocimiento espacial), preferencia por lo novedoso en un campo abierto, aprendizaje operante para evaluar aprendizaje y memoria, y condicionamiento de miedo (mousebiology,org; Wang et al.,(2015) Cell, pii: S0092-8674(15)00127-0).
Ejemplo 18: Análisis del efecto protector de los anticuerpos de sortilina en la cicatrización de heridas
Se utilizó un modelo de ratón de lesión por biopsia en el colon para evaluar la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para aumentar la reparación de heridas colónicas después de una lesión. En dicho modelo, se inserta el endoscopio con una envoltura operativa exterior en el colon descendente medio y se evalúa la mucosa de la unión anorrectal. Después, se retira una única área de espesor completo de la mucosa y la submucosa con fórceps para biopsia flexibles con un diámetro de 3 French, y se evita penetrar la capa muscular. Se hacen lesiones por biopsia en 3-5 sitios del lado dorsal del colon de cada ratón (por ejemplo, Seno H, 2008, Proc Natl Acad Sci U S A, 6 de enero 2009; 106(1): 256-261). Se trataron cohortes de ratones con anticuerpos de sortilina 2 o 3 días después de la lesión de biopsia. Se realiza el seguimiento de ratones cada día durante 15 días para controlar la reducción de peso y la cicatrización de heridas mediante medidas del área superficial de las lesiones.
Ejemplo 19: Análisis del efecto protector de los anticuerpos de sortilina en la degeneración de la retina
Los anticuerpos anti sortilina antagonistas reducen la acumulación y/o la función de los macrófagos inflamatorios y, como resultado, retrasan, impiden y/o tratan la degeneración macular relacionada a la edad (AMD). La AMD es una enfermedad degenerativa de la retina externa. Se cree que la inflamación, particularmente, de citocinas y macrófagos inflamatorios, contribuyen a la evolución de la enfermedad AMD. Se documenta la presencia de macrófagos cerca de las lesiones de la AMD, en drusas, membrana de Bruch, coroides y retina. Los macrófagos liberan factor tisular (TF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), lo que desencadena la expansión de formación de nuevos vasos sanguíneos en pacientes con neovascularización coroidal.
El tipo de macrófago presente en la coroides macular cambia conforme a la edad y presenta niveles elevados de macrófagos M2 en ojos de personas mayores en comparación con ojos de personas más jóvenes. Sin embargo, la mácula de la AMD avanzada presentó relaciones de M1 a M2 más elevadas en comparación con ojos de edad similar de autopsia normal (véase, por ejemplo, Cao X et al, (2011), Pathol Int 61(9): págs, 528-35). Esto sugiere un relación entre la activación de macrófagos M1 clásicos en el ojo en la aparición tardía de la evolución de AMD.
Las células de la microglía de la retina son macrófagos residentes en tejidos que también se encuentran usualmente presentes en la retina interna. En caso de daño, las microglías se pueden activar y actuar como mediadores de inflamación. Se detectaron microglías activadas en las muestras de tejido de AMD y se han planteado como uno de los posibles contribuyentes de los procesos inflamatorios que llevan a la patogénesis de AMD (Gupta et al., (2003) Exp Eye Res,, 76(4):463-71). Se evalúa la capacidad de los anticuerpos de sortilina antagonistas para impedir, retrasar o revertir AMD en uno o más modelos de AMD (véase, por ejemplo, Pennesi et al., (2012) Mol Aspects Med,; 33(4): 487-509),
Se documentaron los macrófagos inflamatorios generales (microglía M1 y/o activada) para establecer su relación con la evolución de la AMD y, por consiguiente, representan una diana terapéutica para anticuerpos de sortilina antagonistas. Es posible obtener un beneficio terapéutico similar en glaucoma o formas de degeneración de la retina, tales como la retinitis pigmentosa.
Se evalúa la capacidad de los anticuerpos anti sortilina para impedir, retrasar o revertir la degeneración de células ganglionares en glaucoma en un modelo de glaucoma (véase, por ejemplo, El-Danaf et al., (2015) J, Neurosci, 11;35(6):2329-43; Demetriades et al., (2013) Invest Ophthalmol Vis Sci 54: resumen 4940). Asimismo, se evalúa el beneficio terapéutico de los anticuerpos anti sortilina en la retinitis pigmentosa y la degeneración de la retina con inducción genética, tal como se describe en Chang et al., (2002) Vision Res,; 42(4):517-25, y en Gargin et al, (2007) J Comp Neurol, 500(2): 222-238; y en “Retinal Degeneration Rat Model Resource Availability of P23H and S334 the Mutant Rhodopsin Transgenic Rats and RCS Inbred and RCS Congenic Strains of Rats”, m M LaVail, 30 de junio de 2011, Asimismo, es posible evaluar el beneficio terapéutico de los anticuerpos anti sortilina en modelos de neovascularización de la retina y de la coroides inducida por toxina y virus, tal como se describe en Hans et al., (2010) Prog Retin Eye Res,; 29(6): 500-519. Los criterios de valoración de dichos estudios incluyen electrorretinografía, obtención de imágenes del fondo de ojo y tomografía de coherencia óptica, así como histopatología.
Ejemplo 20: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos de sortilina y/o anticuerpos biespecíficos para sortilina en un modelo de infección
Se evalúo la utilidad terapéutica de los anticuerpos anti sortilina agonistas y/o anticuerpos biespecíficos para sortilina en un modelo de infección. Por ejemplo, se puede utilizar infección con Listeria monocytogenes u otra infección en ratones normales o ratones heterocigotos para progranulina, tal como se describió anteriormente (por ejemplo, Yin, F et al., (2009) J, Exp, Med, 207, 117-128).
Ejemplo 21: Caracterización del uso terapéutico de anticuerpos de sortilina y/o anticuerpos biespecíficos para sortilina en un modelo de enfermedades inflamatorias y patología ósea
Se evalúo la utilidad terapéutica de los anticuerpos anti sortilina y/o anticuerpos biespecíficos para sortilina en un modelo de enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, artritis reumatoide o en un modelo establecido de otra enfermedad inflamatoria (Mizoguchi (2012) Prog Mol Biol Transí Sci., 105:263-320; y Asquith et al., (2009) Eur J Immunol, 39:2040-4), De manera alternativa, se evaluaron los anticuerpos anti sortilina y/o anticuerpos biespecíficos para sortilina en un modelo de degeneración de disco intervertebral (IVD, intervertebral disc) (Zhao, PY et al., (2015), SCIENTIFIC REPORTS, 5: 9102).
Ejemplo 22: Detección de anticuerpos anti sortilina y/o anticuerpos biespecíficos para sortilina que promueven la supervivencia de osteoclastos, microglía y/o neuronas
Se obtienen células precursoras de médula ósea murina mediante enjuague de células de médula tibial y femoral con PBS frío. Después de un lavado con PBS, se lisan los eritrocitos con tampón de lisado ACK (Lonza), se lavan con PBS y se suspenden a 0,5x106 células/ml en medio RPMI completo (FCS al 10%, Pen/Estrep, Gln, neAA) con las cantidades indicadas de 50 ng/ml de M-CSF para producir macrófagos o 10 ng/ml de g M-CSF. En el caso de macrófagos tipo M2, se añaden 10 ng/ml de IL-4 a las células en cultivo. En el caso de macrófagos tipo M1, se añaden 50 ng/ml de iFN-y. En algunos experimentos, se añade LPS o cimosano al cultivo celular el día 5 a una concentración de 1 pg/ml-0,01 ng/ml. Las citocinas recombinantes se adquirieron en Peprotech. Se prepararon células del genotipo indicado tal como se indicó anteriormente y se cultivaron en concentraciones graduadas de MCSF para analizar la viabilidad de macrófagos derivados de BM. Se colocan las células en placas a 105/200 pl en una placa de 96 pocillos (para análisis de viabilidad con un ensayo basado en luciferasa) o a 0,5x106/1 ml en una placa de 6 pocillos (para recuento de células de exclusión con azul de tripano) en placas tratadas para cultivo sin tejidos. Se añade medio que contiene M-CSF reciente el día 3. En los momentos indicados, se separan con cuidado las células de las placas con EDTA 3 mM y se hace un recuento con una cámara de Burker. En algunos experimentos, también se tiñen las células para análisis FACS con anticuerpo CD11b y DAPI. De manera alternativa, se incuban directamente las células con reactivo ToxGlo (Promega) y se determina la actividad de luciferasa. En algunos experimentos, se retira MCSF, o no, del medio de cultivo el día 5 y se analiza la viabilidad celular 36 horas después mediante FACS.
Se diferencian cultivos celulares de osteoclastos maduros en placas de 24 pocillos con RANKL y M-CSF. Después de 4 días, se sustituye el medio completo por medio asérico para inducir apoptosis. Se tratan las células con RANKL, PBS y un anticuerpo anti sortilina y/o biespecífico para sortilina, o un anticuerpo de control de isotipo correspondiente, durante el consumo de suero durante la noche. Se fijan las células en paraformaldehído al 1% y se tiñen con un kit TUNEL (Millipore Corporation) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se hace un recuento de los núcleos de apoptosis con un microscopio Nikon TE2000-E con amplificación 20*. Los resultados se expresan como porcentaje de células apoptóticas respecto a la cantidad total de células en seis campos seleccionados al azar de los dos pocillos, tal como se describió, por ejemplo, en Peng et al., (2010) Sci Signal,, 3(122): ra38. Se llevaron a cabo ensayos similares con células microgliales primarias.
Ejemplo 23: Producción, identificación y caracterización de anticuerpos anti sortilina madurados por afinidad
Materiales y métodos
Detección de anticuerpo de sortilina
Los anticuerpos anti sortilina S-2, S-15, S-22, S-60 y S-82 (denominados anticuerpos “originales”) se sometieron a maduración de afinidad. En resumen, se crearon bibliotecas de anticuerpos diversas en levadura para cada uno de los anticuerpos originales de partida. La diversidad se creó utilizando técnicas de clonación molecular convencionales para combinar la cadena pesada original CDR-H3 y la cadena ligera (LC) con diversidad genética preexistente en las regiones CDR-H1 y CDR-H2 de la cadena pesada (HC) (denominado “H1/H2”). Esto generó seis bibliotecas de un tamaño de apenas 108 listas para selección para enriquecerse en anticuerpos con afinidad mejorada. Las presiones de selección utilizadas para la determinación de bibliotecas incluyeron titulación de equilibrio de antígeno de sortilina humana y de ratón, cinética competitiva de Fab de anticuerpo original y el uso de deselección de reactivo con poliespecificidad (tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2014/179363; en Xu et al., Protein Eng Des Sel, Vol, 26(10), págs, 663-670). Después, se empleó citometría de flujo FACS para visualizar y seleccionar anticuerpos con técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Chao et al, Nature Protocols, 2006). Se pasó la población deseada a rondas de selección adicionales. Después de 6 rondas de enriquecimiento, se colocaron las levaduras en placas de forma desordenada para obtener aislados de anticuerpo simple, los que se produjeron y se caracterizaron tal como se describió en el Ejemplo 1. De esa forma, se obtuvieron cincuenta anticuerpos con afinidad mejorada de cada uno de los seis anticuerpos originales de partida.
Se seleccionaron tres clones de anticuerpos originales para una segunda ronda de maduración de afinidad: 1) S-60, dado que la primera ronda de maduración de afinidad no produjo clones con afinidad mejorada de forma significativa, 2) el clon de anticuerpo con maduración de afinidad S-15-6 y 3) el clon de anticuerpo con maduración de afinidad S-15-10. Se seleccionaron los clones con maduración de afinidad para una segunda ronda de maduración de afinidad, dado que las diferencias de afinidad y función de dichos clones no mejoraron mucho en la primera ronda de maduración. Se optimizaron las secuencias tanto de la región variable de cadena pesada (VH) como de la región variable de cadena ligera (VK), con foco particular en CDR-H3, para la segunda ronda de maduración de afinidad.
Producción y purificación de anticuerpo IgG y Fab
Se cultivaron clones de levaduras hasta su saturación y, después, se indujeron durante 48 horas a 30 °C con agitación. Después de la inducción, se sedimentaron las células de levadura y se recogieron los sobrenadantes para su purificación. Se purificaron las inmunoglobulinas con una columna de proteína A y se eluyeron con ácido acético, pH 2,0. Los fragmentos Fab se generaron mediante digestión con papaína y se purificaron en una matriz de afinidad IgG-CH1 CaptureSelect (LifeTechnologies).
Determinación de la afinidad
Se determinó la afinidad de los anticuerpos de sortilina al medir sus Kd mediante ForteBio y MSD. En general, las medidas de afinidad se llevaron a cabo a temperatura ambiente tal como se describió anteriormente (Estep et al., MAbs, marzo-abril de 2013; 5(2):270-8). En resumen, las medidas de afinidad ForteBio se llevaron a cabo mediante la carga de inmunoglobulinas (IgG) en línea en sensores AHQ. Se equilibraron los sensores fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y, después, se monitorizaron en línea durante 60 segundos para establecer la referencia. En el caso de medidas de unión, se expusieron los sensores cargados con IgGa antígeno 100 nM (fusión de Fc de sortilina humana o de ratón) durante 3 minutos y después se transfirieron a tampón de ensayo durante 3 minutos para tomar medidas de constantes de disociación. Se determinó la unión adicional mediante la carga de monómero de sortilina biotinilada en sensores SA y exposición a IgG ~100 nM en solución. Las medidas de unión monovalente se obtuvieron mediante la carga de antígenos de fusión de Fc de sortilina humana o de ratón a un sensor AHQ y la posterior exposición a Fab de anticuerpo de sortilina ~100 nM. Se tomaron medidas monovalentes adicionales mediante la carga de monómero de sortilina humana o de ratón en un sensor SA, seguida de exposición a Fab ~100 nM en solución. Se ajustaron los datos de cinética con un modelo de unión 1:1 en el software de análisis de datos provisto por ForteBio.
En el caso de las mediciones de Kd de MSD-SET, se llevaron a cabo titulaciones de equilibrio de soluciones (SET) en PBS BSA sin IgG (PBSF) al 0,1 % con sortilina humana o de ratón recombinante, se mantuvo constante a 100 pM y se incubó con diluciones en serie de 3 a 5 veces de anticuerpo a partir de aproximadamente 50 nM. Se revistieron placas convencionales de MSD-ECL de unión con anticuerpos (20 nM en PBS) durante la noche a 4 °C o a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después, se bloquearon las placas con BSA al 1% durante 30 minutos con agitación a 700 rpm, seguido de tres lavados con tampón de lavado (PBSF Tween 20 al 0,05%). Se aplicaron las muestras de SET y se incubaron en las placas durante 150 segundos con agitación a 700 rpm, seguido de un lavado. Se detectó antígeno captado en una placa con 250 ng/ml de estreptavidina etiquetada con Sulfotag en PBSF mediante incubación en la placa durante 3 minutos. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado y, después, se leyeron con el instrumento MSD Sector Imager 2400 con tampón de lectura T con tensioactivo 1x. Se representó gráficamente el porcentaje libre de antígeno en función del anticuerpo titulado en Prism y se ajustó a una ecuación cuadrática para extraer la Kd. Para mejorar el rendimiento, se utilizaron robots de manipulación de líquidos mediante experimentos de MSD-SET, lo que incluye la preparación de muestras de SET.
Se tomaron mediciones de afinidad de unión a células a 4 °C con células HEK293T transfectadas de forma transitoria con sortilina de ratón o que expresan sortilina humana de forma estable. En resumen, se recogieron las células, se lavaron en PBS y se incubaron con una cantidad de anticuerpo cercana a la Kd del anticuerpo (Kd original para unión a sortilina humana: S2= 1,1 nM, S15= 3,3 nM, S22= 2,4 nM, S60= 1,0 nM, S82= 1,4 nM; Kd para unión a sortilina de ratón: S2= 6,6 nM, S15= 6,4 nM, S22= 5,0 nM). Se diluyeron los anticuerpos en tampón Fa Cs (PBS FBS al 2% NaAzida al 0,01%). Después de la incubación en hielo durante 1 hora, las células se lavaron tres veces en tampón FACS y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con PE antihumano (BD Biosciences, dilución 1:100) durante 30 minutos en hielo. Después, las células se lavaron dos veces en 200 ul de tampón FACS y, posteriormente, se analizaron en un instrumento de detección FACS iQE o FACS Canto (Intellicyt Corp). Se seleccionaron los tres anticuerpos con mayor aumento tanto de sortilina humana como de ratón (medido como intensidad media de fluorescencia de PE) para análisis adicional.
Se añadieron anticuerpos a las células en una titulación de 0,16-40 nM para sortilina humana y 0,39-50 nM para sortilina de ratón, y se determinaron sus Kd de unión mediante ajustes de curvas no lineales (OneSiteTotal modificado, Graph Pad Prism) para determinar la afinidad aparente por la sortilina expresada en las células.
La regulación por reducción de sortilina en células U-251 u N2A, el bloqueo de progranulina (PGRN) en las células y la secreción de PGRN por parte de las células U-251 se llevaron a cabo tal como se describió en el Ejemplo 5.
Resultados
Selección de anticuerpos anti sortilina
Se caracterizaron adicionalmente clones de anticuerpo anti sortilina con maduración de afinidad que exhibieron mejor afinidad, en comparación con el anticuerpo original respectivo. Después de la determinación inicial de todos los clones de anticuerpo con maduración de afinidad, se seleccionaron clones para cada anticuerpo original para su análisis adicional.
Secuencias de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo
Usando técnicas convencionales, se determinaron las secuencias de aminoácidos que codifican los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de los clones de anticuerpos con maduración de afinidad seleccionados. Las secuencias de CDR de EU o Kabat de las variantes de anticuerpo S-2 se indican en la Tabla 11, las variantes de anticuerpo S-15 se indican en la Tabla 12, las variantes de anticuerpo S-22 se indican en la Tabla 13, las variantes de anticuerpo S-60 se indican en la Tabla 14 y las variantes de anticuerpo S-82 se indican en la Tabla 15.
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 Caracterización de la unión al anticuerpo anti sortilina con maduración de afinidad
L a s a f in id a d e s d e u n ió n c e lu la r d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a c o n m a d u ra c ió n d e a f in id a d s e le c c io n a d o s , se ilu s tra e n la s Tablas 16A y 16B. E n la ta b la , “ N .B .” in d ic a a u s e n c ia d e u n ió n , “ P .F .” in d ic a a ju s te m a lo , “ N .D .” in d ic a q u e no s e d e te rm in ó , “ B t- “ in d ic a b io t in ila c ió n , “ h S o r t” in d ic a s o r t i l in a h u m a n a , “ m s S o r t ” in d ic a s o r t i l in a d e ra tó n y “ ( M ) ” in d ic a m o n o v a le n c ia .
Tabla 16A: Afinidades de clones de anticuerpo con afinidad madura superior
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Tabla 16B: Afinidades de clones de anticuerpo con afinidad madura superior
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A c o n tin u a c ió n , s e c o m p a ra ro n lo s a n t ic u e rp o s c o n m a d u ra c ió n d e a f in id a d e n tre s í y c o n su a n t ic u e rp o o r ig in a l re s p e c t iv o e n c u a n to a su c a p a c id a d p a ra re d u c ir lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s u p e r f ic ie d e c é lu la s n a tu ra le s e n c é lu la s U -251 h u m a n a s y N 2 A d e ra tó n . S e a ñ a d ie ro n a n t ic u e rp o s a las c é lu la s d u ra n te 72 h o ra s a c o n c e n tra c io n e s v a r ia b le s y s e m id ie ro n lo s n iv e le s d e s o r t i l in a m e d ia n te F A C S c o n un a n t ic u e rp o c o n ju g a d o D y L ig h t d e un g ru p o d ife re n te a l g ru p o q u e e l re s to d e l a n t ic u e rp o (y a s e a S -29 -D y L ig h t650 o S -30 -D y L ig h t650 ) . E n g e n e ra l, lo s a n t ic u e rp o s co n m a d u ra c ió n d e a f in id a d p re s e n ta ro n c a p a c id a d p a ra re d u c ir los n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s u p e r f ic ie d e c é lu la s n a tu ra le s ta n to e n c é lu la s h u m a n a s c o m o d e ra tó n ( Figuras 13A-13G), e s p e c ia lm e n te a la c o n c e n tra c ió n m á s b a ja d e a n t ic u e rp o ( Ig G ) d e 1 ,25 nM ,
S e a n a liz a ro n e l a n t ic u e rp o o r ig in a l S -15 y lo s a n t ic u e rp o s c o n m a d u ra c ió n d e a f in id a d p ro c e d e n te s d e e s to s p a ra d e te rm in a r su c a p a c id a d d e b lo q u e a r la u n ió n d e P G R N 15 nM a s o r t i l in a e x p re s a d a e n c é lu la s H E K 293 T . T a l c o m o s e m u e s tra e n la Figura 14, lo s c lo n e s d e a n t ic u e rp o c o n m a d u ra c ió n d e a f in id a d d e S -15 (p o r e je m p lo , S -15 -1 a S -15 -7 y S -15 -12 s S -15 -14 ) in d u je ro n a u m e n to s p e q u e ñ o s d e la c a p a c id a d p a ra b lo q u e a r la u n ió n d e P G R N 15 nM a s o r t i l in a , e n c o m p a ra c ió n c o n e l a n t ic u e rp o S -15 o rig in a l.
E n re s u m e n , s e h a n id e n t if ic a d o h a s ta t re s c lo n e s c o n m a d u ra c ió n d e a f in id a d c o n m e jo r u n ió n ta n to a s o r t i l in a h u m a n a c o m o d e ra tó n , y c o n m e jo r fu n c io n a lid a d y a s e a p a ra la re g u la c ió n p o r re d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a s o r t i l in a y /o p a ra e l b lo q u e o d e la u n ió n a P G R N .
D ic h o s re s u lta d o s in d ic a ro n la id e n t if ic a c ió n d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a c o n m a d u ra c ió n d e a f in id a d c o n m e jo r u n ió n ta n to a s o r t i l in a h u m a n a c o m o s o r t i l in a d e ra tó n , y co n m e jo r fu n c io n a lid a d p a ra re d u c ir lo s n iv e le s d e la s u p e r f ic ie c e lu la r n a tu ra le s d e s o r t i l in a y /o b lo q u e o d e la u n ió n d e P G R N a s o r t il in a , e n c o m p a ra c ió n c o n e l a n t ic u e rp o o r ig in a l re s p e c tiv o .
E je m p lo 24 : M a p e o d e e p íto p o s d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a
Materiales y métodos
Unión a epítopos lineales
S e m a p e a ro n lo s e p íto p o s d e a n t ic u e rp o s ta l c o m o s e d e s c r ib e a c o n tin u a c ió n . S e to m a ro n m e d id a s c o n un d is p o s it iv o U lt ra f le x III M A L D I T o F (B ru k e r ) e q u ip a d o c o n un m ó d u lo d e in te ra c c ió n H M 4 p a ra c a ra c te r iz a r e l a n tíg e n o . D ic h o m ó d u lo c o n t ie n e un s is te m a d e d e te c c ió n e s p e c ia l d is e ñ a d o p a ra o p t im iz a r la d e te c c ió n d e h a s ta 2 M D a co n s e n s ib il id a d n a n o m o la r .
S e m e z c la ro n m u e s tra s d e a n tíg e n o y a n t ic u e rp o h a s ta u n a c o n c e n tra c ió n f in a l d e 1 j M a 0 ,5 jM , re s p e c t iv a m e n te . S e m e z c ló 1 j l d e la m e z c la o b te n id a c o n 1 j l d e u n a m a tr iz c o m p u e s ta p o r u n a m a tr iz d e á c id o s in a p ín ic o re c r is ta liz a d o (10 m g /m l) e n a c e to n it r i lo /a g u a (1 :1 , v /v ) , T F A a l 0,1 % (k it K 200 M A L D I). D e s p u é s d e la m e z c la , se c o lo c a ro n m u e s tra s d e 1 j l d e c a d a m u e s tra e n la p la c a M A L D I (S C O U T 384 ). D e s p u é s d e la c r is ta l iz a c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te , s e in tro d u jo la p la c a e n e l e s p e c tró m e tro d e m a s a y s e a n a liz ó in m e d ia ta m e n te , y e l a n á lis is s e re p it ió p o r t r ip l ic a d o .
L a m e z c la p re p a ra d a p a ra e l e x p e r im e n to d e c o n tro l s e re t ic u ló c o n un k it d e a n á lis is K 200 M A L D I M S . S e m e z c la ro n 9 m ic ro lit ro s d e la m e z c la c o n 1 j l d e re a c t iv o d e e s ta b il iz a c ió n K 200 (2 m g /m l) y s e in c u b ó a te m p e ra tu ra a m b ie n te . D e s p u é s d e l p e r ío d o d e in c u b a c ió n (180 m in u to s ) , s e p re p a ra ro n la s m u e s tra s p a ra a n á lis is M A L D I p a ra e x p e r im e n to s d e c o n tro l. S e a n a liz a ro n la s m u e s tra s m e d ia n te H ig h -M a s s M A L D I in m e d ia ta m e n te d e s p u é s d e la c r is ta l iz a c ió n .
S e lle v ó a c a b o la p ro te ó lis is d e l a n tíg e n o d e s o r t i l in a h u m a n a re c o m b in a n te c o n p e p s in a in m o v iliz a d a p a ra e v a lu a r si la u n ió n d e l e p íto p o e s d e n a tu ra le z a lin e a l. S e m e z c la ro n 50 j l d e l a n tíg e n o a u n a c o n c e n tra c ió n d e 4 j M c o n p e p s in a in m o v i liz a d a a 2 ,5 j M y s e in c u b a ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 30 m in u to s . D e s p u é s d e l p e r ío d o d e in c u b a c ió n , s e c e n tr ifu g ó la m u e s tra y s e p ip e te ó e l s o b re n a d a n te . S e c o n tro ló q u e s e c o m p le ta ra la p ro te ó lis is m e d ia n te e s p e c tro m e tr ía d e m a s a s H ig h -M a s s M A L D I e n m o d o lin e a l y m o d o re fle jo . S e o p t im iz ó la p ro te ó lis is d e p e p s in a p a ra o b te n e r u n a g ra n c a n t id a d d e p é p tid o e n e l in te rv a lo d e 1000 -3500 D a . S e m e z c la ro n 5 j l d e lo s p é p tid o s d e a n tíg e n o g e n e ra d o m e d ia n te p ro te ó lis is c o n 5 j l d e a n t ic u e rp o S -2 -11 , S -15 -6 , S -60 , S -22 -9 o S -82 -8 a 2 j M y s e in c u b a ro n a 37 °C d u ra n te 2 h o ra s . D e s p u é s , s e m e z c ló la m e z c la c o n 5 j l d e a n tíg e n o in ta c to 2 jM . S e lle v ó a c a b o la in te ra c c ió n e n tre e l a n t ic u e rp o y e l a n tíg e n o ta l c o m o s e d e s c r ib ió a n te r io rm e n te .
Huella de masa peptídica del antígeno de sortilina y caracterización de las interfaces de unión
S e m e z c la ro n 10 j l d e s o r t i l in a (5 j M) c o n 10 j l d e a n t ic u e rp o (2 ,5 j M) p a ra o b te n e r la h u e lla d e l p é p tid o . S e a ñ a d ie ro n 2 j l d e D S S d 0 /d 12 (2 m g /m l; d Mf ) y s e c o n t in u ó c o n 3 h o ra s d e in c u b a c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te . S e d e tu v o la re a c c ió n m e d ia n te la a d ic ió n d e 2 j l d e b ic a rb o n a to d e a m o n io 400 m M ( f in a l = 20 m M ), s e g u id a d e 1 h o ra d e in c u b a c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te . S e s e c ó la s o lu c ió n c o n un S p e e d V a c , a n te s d e s u s p e n d e r la c o n 20 j l d e H 2 O y u re a 8 M , D e s p u é s d e la m e z c la , se a ñ a d ie ro n 2 j l d e D T T (500 m M ) a la s o lu c ió n , D e s p u é s , s e in c u b ó la m e z c la d u ra n te 1 h o ra a 37 °C , D e s p u é s d e la in c u b a c ió n , s e a ñ a d ie ro n 2 j l d e y o d o a c e ta m id a (1 M ) a n te s d e 1 h o ra d e in c u b a c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te e n u n a h a b ita c ió n o s c u ra . D e s p u é s d e la in c u b a c ió n , s e a ñ a d ie ro n 80 j l d e l ta m p ó n p ro te o lí t ic o . P o s te r io rm e n te , s e m e z c la ro n 100 j l d e l a n tíg e n o re d u c id o /a lq u ila d o c o n e n z im a s d e d ig e s tió n d e R o c h e D ia g n o s t ic s (1 ,66 j l d e tr ip s in a , 0 ,83 j l d e q u im io tr ip s in a , 0 ,83 j l d e A S P -N , 1 ,66 j l e la s ta s a o 3 ,32 j l d e te rm o lis in a ) y se in c u b a ro n d u ra n te la n o c h e a 37 °C ( tr ip s in a , A S P -N , e la s ta s a ) , a 25 °C (q u im io tr ip s in a ) o a 70 °C ( te rm o lis in a ) . D e s p u é s d e la d ig e s tió n , a la s o lu c ió n s e a ñ a d ió á c id o fó rm ic o a l 1 % fin a l. D e s p u é s , la s m u e s tra s se s o m e tie ro n a la v a d o S P E e n u n a c o lu m n a d e 2 ,1 *30 m m A t la n t is d C 18 3 jM .
D e s p u é s d e la p ro te ó lis is , s e c a rg a ro n lo s 10 j l d e p é p tid o s g e n e ra d o s e n un s is te m a d e n a n o -c ro m a to g ra f ía líq u id a (U lt im a te 3000 , D io n e x ) y s e lle v ó a c a b o e s p e c tro m e tr ía d e m a s a s L T Q o rb itra p .
S e in c u b a ro n lo s c o m p le jo s d e a n t ic u e rp o y a n t íg e n o co n a g e n te s re t ic u la n te s d e u te ra d o s y s e s o m e tie ro n a e s c is ió n m u lt ie n z im á t ic a p a ra d e te rm in a r e l e p íto p o d e lo s a n t ic u e rp o s S -2 -11 , S -15 -6 , S -22 -9 , S -60 y S -82 -8 e n e l a n tíg e n o d e s o r t i l in a c o n a lta re s o lu c ió n . D e s p u é s d e l e n r iq u e c im ie n to d e lo s p é p tid o s re t ic u la d o s , s e a n a liz a ro n la s m u e s tra s m e d ia n te e s p e c tro m e tr ía d e a lta re s o lu c ió n (n L C -O rb itra p M S ) y lo s d a to s s e a n a liz a ro n c o n e l s o f tw a re X Q u e s t y S ta v ro x . S e u tiliz ó n L C e n c o m b in a c ió n c o n e s p e c tro m e tr ía d e m a s a s O rb itra p . S e m e z c la ro n 5 p l d e la m u e s tra d e a n tíg e n o (c o n c e n tra c ió n : 4 p M ) co n 5 p l d e la m u e s tra d e a n t ic u e rp o (c o n c e n tra c ió n : 2 p M ) p a ra o b te n e r u n a m e z c la d e a n t ic u e rp o y a n tíg e n o a u n a c o n c e n tra c ió n f in a l d e 2 p M /1 p M . L a m e z c la s e in c u b ó a 37 °C d u ra n te 180 m in u to s . E n u n a p r im e ra e ta p a , s e m e z c ló 1 m g d e a g e n te re t ic u la n te d 0 co n 1 m g d e a g e n te re t ic u la n te d 12. L o s 2 m g p re p a ra d o s s e m e z c la ro n co n 1 m l d e D M F p a ra o b te n e r u n a s o lu c ió n d e 2 m g /m l d e D S S d o /d 12. S e m e z c la ro n 10 p l d e la m e z c la d e a n t ic u e rp o y a n tíg e n o p re v ia m e n te p re p a ra d a c o n 1 p l d e la s o lu c ió n d e a g e n te re t ic u la n te d 0 /d 12 (2 m g /m l) . S e in c u b ó la s o lu c ió n d u ra n te 180 m in u to s a te m p e ra tu ra a m b ie n te p a ra c o m p le ta r la re a c c ió n de re t ic u la c ió n . S e m e z c la ro n 10 p l d e la s o lu c ió n re t ic u la d a c o n 4 o p l d e b ic a rb o n a to d e a m o n io (25 m M , pH 8 ,3 ). D e s p u é s d e la m e z c la , s e a ñ a d ie ro n 2 p l d e D T T (500 m M ) a la s o lu c ió n . S e in c u b ó la m e z c la d u ra n te 1 h o ra a 55 °C . D e s p u é s d e la in c u b a c ió n , s e a ñ a d ie ro n 2 p l d e y o d o a c e ta m id a (1 M ) y d e s p u é s s e in c u b ó d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te e n u n a h a b ita c ió n o s c u ra . D e s p u é s d e la in c u b a c ió n , la s o lu c ió n se d ilu y ó a 1 /5 m e d ia n te la a d ic ió n d e 120 p l d e l ta m p ó n u t iliz a d o p a ra la p ro te ó lis is . S e m e z c la ro n 145 p l d e l a n tíg e n o re d u c id o /a lq u ila d o y a s e a c o n 0 ,7 p l d e tr ip s in a , 0 ,35 p l d e q u im io tr ip s in a , 0 ,35 p l d e A S P -N , 0 ,7 p l d e e la s ta s a o 1 ,4 p l d e te rm o lis in a . S e in c u b a ro n la s m e z c la s p ro te o lí t ic a s d u ra n te la n o c h e a 37 °C ( t r ip s in a , A S P -N , e la s ta s a ) , a 25 °C (q u im io tr ip s in a ) o a 70 °C ( te rm o lis in a ) . D e s p u é s , s e a n a liz a ro n lo s p é p tid o s re t ic u la d o s co n e l s o f tw a re X q u e s t v e rs ió n 2 ,0 y S ta v ro x 2 ,1.
Resultados
Unión a epítopos lineales
C a d a u n o d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -2 -11 , S -15 -6 y S -60 s e u n ió a s o r t i l in a e n un c o m p le jo d e e s te q u io m e tr ía 1 :1. L a p re s e n c ia d e p é p tid o s n o in h ib ió d ic h a u n ió n ( Figura 15). C a d a u n o d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a co n m a d u ra c ió n d e a f in id a d S -22 -9 y S -82 -8 fo rm a c o m p le jo s 1:1 y 1 :2 (a n t ic u e rp o :a n t íg e n o ) c o n s o r t il in a . L a p re s e n c ia d e p é p tid o s ta m p o c o in h ib ió d ic h o s c o m p le jo s . L a Figura 15 ta m b ié n in d ic a q u e lo s p é p tid o s d e s o r t i l in a n o c o m p ite n c o n e l a n t ic u e rp o S -2 -11 p o r la u n ió n a s o rt il in a . T a m b ié n se o b s e rv ó u n a a u s e n c ia d e c o m p e t ic ió n d e p é p tid o d e s o r t i l in a s im ila r p a ra lo s a n t ic u e rp o s S -15 -6 , S -22 -9 , S -82 -8 y S -60. L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e los e p íto p o s d e u n ió n p a ra lo s a n t ic u e rp o s S -2 -11 , S -15 -6 , S -22 -9 , S -82 -8 y S -60 , so n c o n fo rm a c io n a le s y /o n o c o n tin u o s . E s to e s c o h e re n te c o n la in c a p a c id a d d e m a p e a r lo s a n t ic u e rp o s S -2 -11 , S -15 -6 , S -22 -9 , S -82 -8 y S -60 e n s o r t i l in a u s a n d o un p ro c e d im ie n to d e b ib lio te c a p e p tíd ic a .
Huella de masa peptídica del antígeno de sortilina y caracterización de las interfaces de unión
D e s p u é s d e la p ro te ó lis is d e tr ip s in a , s e id e n t if ic a ro n 52 p é p tid o s e n la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a q u e a b a rc a b a un 57 ,72 % d e la s e c u e n c ia . D e s p u é s d e la p ro te ó lis is d e la q u im io tr ip s in a , s e id e n t if ic a ro n 73 p é p tid o s en la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a q u e a b a rc a b a un 81 ,12 % d e la s e c u e n c ia . D e s p u é s d e la p ro te ó lis is d e A S P -N , s e id e n t if ic a ro n 12 p é p tid o s e n la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a q u e a b a rc a b a un 24 ,22 % d e la s e c u e n c ia . N o s e id e n t if ic a ro n p é p tid o s e n la s e c u e n c ia de s o r t i l in a d e s p u é s d e la p ro te ó lis is d e e la s ta s a . D e s p u é s d e la p ro te ó lis is d e te rm o lis in a , s e id e n t if ic a ro n 2 p é p tid o s en la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a q u e a b a rc a b a un 1 ,47 % d e la s e c u e n c ia . L a c o m b in a c ió n d e lo s p é p tid o s d e to d a s las p ro te ó lis is a b a rc a b a un 94 ,78 % d e la s e c u e n c ia d e s o r t i l in a ( Figura 16A). D a d o q u e lo s p é p tid o s g e n e ra d o s p o r p ro te ó lis is a b a rc a ro n un 94 ,78 % d e l d o m in io e x tra c e lu la r d e s o r t il in a , s e c re e q u e n o s e o m it ie ro n e p íto p o s u s a n d o e s te m é to d o .
L a Tabla 17 re s u m e lo s re s u lta d o s d e los e x p e r im e n to s d e e n tre c ru z a m ie n to p a ra d e te rm in a r e p íto p o s . L a d ig e s tió n d e te rm o lis in a n o p ro d u jo n in g ú n p é p tid o d e te c ta b le e n n in g ú n d e a n t ic u e rp o ., S e id e n t if ic a ro n d o s e p íto p o s d ife re n te s p a ra lo s a n t ic u e rp o s S -2 -11 , S -15 -6 y S -22 -9. S e id e n t if ic ó un s o lo e p íto p o p a ra lo s a n t ic u e rp o s S -60 y S -82 -8. E n la ta b la , s e in d ic a n lo s a m in o á c id o s e n tre c ru z a d o s en n e g rita .
Tabla 17A: Cantidad de péptidos
Figure imgf000129_0001
Tabla 17B: Regiones de unión a anticuerpos de sortilina
Figure imgf000130_0001
Tal como se indica en la Tabla 17, los péptidos reconocidos por el anticuerpo S-2-11 corresponden a los residuos de aminoácidos 237-260 y 297-317 de SEQ ID NO: 1 y tienen las secuencias de aminoácidos de: NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK (SEQ ID NO: 703) y KTIGVKIYSFGLGGRFLFA SV (SEQ ID NO: 699). Además, los residuos entrecruzados en los péptidos corresponden a los residuos K 243 y K 248 entre los residuos de aminoácidos 237-260 de SEQ ID NO: 1 y los residuos S 305 , R 311 y S 316 entre los residuos de aminoácidos 297-317 de SEQ ID NO: 1. Los péptidos reconocidos por el anticuerpo S-15-6 corresponden a los residuos de aminoácidos 237-247 y 314-338 de SeQ ID NO: 1 y tienen las secuencias de aminoácidos de: NGLWVSKNFGG (SEQ ID NO: 700) y FASVMAD KDTTRRIHVSTDq Gd TWS (SEQ ID NO: 701). Además, los residuos entrecruzados en los péptidos corresponden a los residuos S 242 y K 243 entre los residuos de aminoácidos 237-247 de SEQ ID NO: 1 y los residuos S 316 y R 325 entre los residuos de aminoácidos 314-338 de SEQ ID NO: 1. Los péptidos reconocidos por el anticuerpo S-22-9 corresponden a los residuos de aminoácidos 207-227 y 237-260 de SEQ ID NO: 1 y tienen las secuencias de aminoácidos de: FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNS (SEQ ID NO: 702) y NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK (SEQ ID NO: 703). Además, los residuos de aminoácidos entre los péptidos corresponden a los residuos T 210 , T 218 y S 223 entre los residuos de aminoácidos 207-227 de SEQ ID NO: 1 y los residuos K 243 , K 248 y K 254 entre los residuos de aminoácidos 237-260 de SEQ ID NO: 1. El péptido reconocido por el anticuerpo S-60 corresponde a los residuos de aminoácidos 207-231 de la SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: FVQTDLPFh PlTQMMYSPQNSDYLL (SEQ ID NO: 704). Además, los residuos entrecruzados en el péptido corresponden a los residuos T 218 , Y 222 , S 223 y S 227 entre los residuos de aminoácidos 207-231 de SEQ ID NO: 1. El péptido reconocido por el anticuerpo S-82-8 corresponde a los residuos de aminoácidos 367-391 de SEQ ID NO: 1 y tiene la secuencia de aminoácidos: EPGDTGFGTIFT SDDRGIVYSKSLD (SEQ ID NO: 705). Además, los residuos de aminoácidos en el péptido corresponden a los residuos S 379 , R 382 e Y 386 entre los residuos de aminoácidos 367-391 de SEQ ID NO: 1.
Mapeo funcional
Se generaron variantes mutantes de sortilina HVPLVIMT131QVPLVIVS (SEQ ID NO: 706) (en la que los residuos subrayados H, M y T de la secuencia de aminoácidos de sortilina de tipo silvestre se han sustituido por Q, V y S, respectivamente) y S595R, usando cebadores mutantes y se clonaron en un vector plasmídico pCMV-AC-IRES-GFP (de Origene). Los anticuerpos anti sortilina S-30 y S-60 se conjugaron con el kit de marcaje de anticuerpos DyLight 650 (Thermo Scientific Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se transfectaron células HEK293T de manera transitoria con los plásmidos usando Fugene HD (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células HEK293T transfectadas se recogieron después de 24 horas, se lavaron con PBS y se incubaron con 5 pg/ml de anticuerpo durante una hora en tampón de FACS en hielo (PBS FBS al 2%). Posteriormente, las células se lavaron dos veces con 200 pl de tampón FACS y se analizaron en un software FlowJo y FACS Canto. Se seleccionaron las células positivas para GFP y se midió la expresión de sortilina como intensidad media de fluorescencia en el canal de APC.
El mutante de sortilina HVPLVIMT131QVPLVIVS redujo en gran medida la unión de anticuerpo S-30 (Figura 16B), al tiempo que no se redujo la unión del anticuerpo S-60. En cambio, la unión del anticuerpo S - 6 0 al mutante de sortilina S595R se redujo en gran medida (Figura 16C), al tiempo que no se redujo la unión del anticuerpo S-30. Dichos resultados indican que los aminoácidos en el péptido 131HVPLVIMT138 de sortilina son necesarios para la unión de S-30 y que el residuo S595 es esencial para la unión de S-60 a sortilina.
Ejemplo 25: Caracterización de interacciones entre sortilina y neurotensina
Materiales y métodos
Se recopilaron datos de resonancia de plasmón superficial (SPR) a una tasa de 1 Hz a 25 °C en un instrumento BiaCore T200. Se llevó a cabo análisis de datos con software de evaluación BiaCore T200, versión 2,0. Se utilizó HBS-EP+ (HEPES 100 mM, NaCl 1,5 M, EDTA 30 mM, tensioactivo P20 al 0,5 % v/v, pH 7,4) como tampón de ejecución y para preparar reactivos.
S e c a p tu ró s o r t i l in a h u m a n a e t iq u e ta d a co n h is t id in a (25 nM ; R & D B io s y s te m s ) ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 p l/m in , t ie m p o d e e s ta b il iz a c ió n 0 s e g u n d o s ) e n un c h ip s e n s o r C M 5 (G E H e a lth c a re ) in m o v iliz a d o c o n Ig G a n ti h is t id in a . L a p ro g ra n u lin a h u m a n a (P G R N ; 50 nM ; A d ip o G e n ) q u e c o n t ie n e n e u ro te n s in a (N T S ; S ig m a ) 0 nM , 100 nM o 500 nM f lu y ó h a c ia la s u p e r f ic ie d e la s o r t i l in a c a p tu ra d a ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 p l/m in , t ie m p o d e d is o c ia c ió n 30 s e g u n d o s ) . S e re g e n e ró la s u p e r f ic ie d e l c h ip e n tre c ic lo s co n g l ic in a -H C l 10 m M , pH 1 ,7 ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 p l/m in , t ie m p o d e e s ta b i l iz a c ió n 60 s e g u n d o s ) . L a s e ñ a l d e S P R re s u lta n te s e o b tu v o c o m o la d ife re n c ia d e re s p u e s ta d e la s m e d id a s to m a d a s e n u n a c e ld a d e f lu jo d e b la n c o .
S e c a p tu ra ro n a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -15 (25 n M ), S -22 (25 n M ), S -49 (25 n M ) y S -60 (25 n M ) ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 p l/m in , t ie m p o d e d is o c ia c ió n 0 s e g u n d o s ) e n un c h ip s e n s o r C M 5 (G E H e a lth c a re ) in m o v i liz a d o c o n Ig G a n ti h u m a n a (J a c k s o n L a b s ). S e p re in c u b ó s o r t i l in a h u m a n a (100 nM ; R & D B io s y s te m s ) co n n e u ro te n s in a (N T S , S ig m a ) 0 nM , 100 nM , 500 nM o 10 000 nM , y d e s p u é s f lu y ó h a c ia la s u p e r f ic ie d e a n ti s o r t i l in a c a p tu ra d a ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 p l/m in , t ie m p o d e d is o c ia c ió n 30 s e g u n d o s ) . S e re g e n e ró la s u p e r f ic ie d e l c h ip e n tre c ic lo s c o n g lic in a -H C l 10 m M , pH 1 ,7 ( t ie m p o d e c o n ta c to 60 s e g u n d o s , c a u d a l 30 p l/m in , t ie m p o d e e s ta b i l iz a c ió n 60 s e g u n d o s ) . L a s e ñ a l d e S P R re s u lta n te s e o b tu v o c o m o la d ife re n c ia d e re s p u e s ta d e las m e d id a s to m a d a s e n u n a c e ld a d e f lu jo d e b la n c o .
Resultados
T a l c o m o s e m u e s tra e n la Figura 17A, la c o in y e c c ió n d e n e u ro te n s in a b lo q u e ó la u n ió n d e p ro g ra n u lin a (P G R N ) h u m a n a re c o m b in a n te a s o r t i l in a h u m a n a , lo q u e c o n f irm a q u e la P G R N y la n e u ro te n s in a s e u n e n a l m is m o s it io en la s o r t il in a . S e c a p tu ra ro n lo s a n t ic u e rp o s e n e l c h ip y s e c o in y e c ta ro n co n s o r t i l in a p re in c u b a d a c o n d o s is d ife re n te s d e n e u ro te n s in a p a ra e v a lu a r s i lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a (S -15 , S -22 , S -49 y S -60 ) se u n ía n a l m is m o s it io e n la s o r t i l in a q u e la n e u ro te n s in a . S e o b s e rv ó ú n ic a m e n te u n a re d u c c ió n m e n o r d e la u n ió n d e a n t ic u e rp o a l a n tíg e n o de s o r t i l in a p a ra lo s a n t ic u e rp o s S -15 , S -22 y S -49 ( Figuras 17B, 17C y 17D). S in e m b a rg o , n o s e o b s e rv ó re d u c c ió n d e la u n ió n d e S -60 a s o r t i l in a ( Figura 17E). T a l c o m o s e ilu s tra e n e l E je m p lo 4 , e l a n t ic u e rp o S -60 e s un a n t ic u e rp o b lo q u e a n te d e P G R N q u e b lo q u e a la u n ió n d e P G R N a s o r t il in a . L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e lo s a n t ic u e rp o s S -15 , S -22 , S -49 y S -60 n o s e u n e n a s o r t i l in a e n e l s it io d e u n ió n a n e u ro te n s in a . D a d o q u e la n e u ro te n s in a p u e d e b lo q u e a r la u n ió n d e P G R N a s o r t il in a , p e ro n o d e l a n t ic u e rp o S -60 , s e c re e q u e la c a p a c id a d d e l a n t ic u e rp o S -60 p a ra b lo q u e a r la u n ió n d e P G R N a s o r t i l in a s e lo g ra m e d ia n te la u n ió n d e S -60 c e rc a d e l s it io d e u n ió n a P G R N e n s o r t i l in a y p u e d e o c lu ir e l s it io d e u n ió n d e P G R N p o r im p e d im e n to e s té r ic o , en lu g a r d e p o r c o m p e t ic ió n d ire c ta p o r e l s it io d e u n ió n a P G R N e n s o r t il in a . A s im is m o , lo s a n t ic u e rp o s S -15 , S -22 , S -49 y S -60 re p re s e n ta n lo s g ru p o s 2, 3, 4 y 5 (n .d .) , lo q u e s u g ie re q u e los a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a e n u m e ra d o s e n lo s E je m p lo s 1 y 23 q u e p e r te n e c e n a lo s g ru p o s 2, 3 y 4 ta m p o c o s e u n e n a s o r t i l in a e n e l s it io d e u n ió n a n e u ro te n s in a .
E je m p lo 26 : R e d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n c é lu la s
Materiales y métodos
S e a is la ro n m o n o c ito s p r im a r io s h u m a n o s d e s a n g re h u m a n a h e p a r in iz a d a (B lo o d C e n te rs o f th e P a c if ic ) u s a n d o un c ó c te l d e e n r iq u e c im ie n to d e m o n o c ito s h u m a n o s R o s e tte S e p (S T E M C E L L T e c h n o lo g ie s ) , d e a c u e rd o c o n e l p ro to c o lo d e l fa b r ic a n te . S e re c o g ie ro n m o n o c ito s e n R P M I ( In v it ro g e n ) c o n s u e ro fe ta l b o v in o a l 10 % (H y c lo n e ) y y a se a 50 p g /m l d e M -C S F (P e p ro te c h ) p a ra in d u c ir la d ife re n c ia c ió n e n m a c ró fa g o s o 100 p g /m l d e IL -4 100 p g /m l d e G M -C S F (P e p ro te c h ) p a ra in d u c ir la d ife re n c ia c ió n e n c é lu la s d e n d r í t ic a s . D e s p u é s d e 5 d ía s , s e re c o g ie ro n la s c é lu la s . E n e l c a s o d e m a c ró fa g o s , ú n ic a m e n te s e re c o g ie ro n c é lu la s u n id a s a la p la c a c o n un d e p u ra d o r c e lu la r. En e l c a s o d e c é lu la s d e n d r í t ic a s , s e re c o g ie ro n c é lu la s e n s u s p e n s ió n . D e s p u é s d e la v a d o s e n P B S , s e c o lo c a ro n la s c é lu la s en p la c a s a 0 ,4 M i/p o c il lo e n p la c a s d e 12 p o c illo s ,
S e a ñ a d ió F a b d e a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a o a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e lo n g itu d c o m p le ta ( Ig G ) 50 nM a c a d a p o c illo y s e in c u b ó d u ra n te 48 h o ra s , D e s p u é s , la s c é lu la s s e s o m e tie ro n a lis is en h ie lo co n ta m p ó n R IP A (T h e rm o F is h e r S c ie n t if ic ) c o n in h ib id o re s d e p ro te a s a (L ife T e c h n o lo g ie s ) . L o s lis a d o s s e re c o g ie ro n y se c e n tr ifu g a ro n a 10 000 x g d u ra n te 10 m in u to s a 4 °C . S e re c o g ie ro n s o b re n a d a n te s y s e m id ió la c o n c e n tra c ió n p ro te ic a c o n un k it B C A d e a c u e rd o co n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te (T h e rm o F is h e r P ie rc e ). S e u t il iz a ro n lo s s ig u ie n te s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a : S -2 -11 , S -5 , S -15 -6 , S -22 -9 , S -60 y S -82 -8.
S e c a rg a ro n 15 m ic ro g ra m o s d e p ro te ín a p o r c a rr il e n c a d a u n o d e lo s g e le s p ro te ic o s B o lt B is -T r is a l 4 -12 % (L ife T e c h n o lo g ie s ) y s e p ro c e s a ro n a 150 V d u ra n te 45 m in u to s . S e tra n s f ir ió la p ro te ín a a u n a m e m b ra n a d e P V D F u s a n d o iB lo t d e a c u e rd o co n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te (L ife T e c h n o lo g ie s ) . D e s p u é s , s e la v ó la m e m b ra n a e n T B S T r ito n a l 0 ,05 % (T B S T ) y s e b lo q u e ó a l m e n o s d u ra n te 1 h o ra a T A e n T B S T B S A a l 5 % . S e e t iq u e tó la s o r t i l in a c o n a n ti n e u ro te n s in a (B D B io s c ie n c e s , 1 :200 ) y a c t in a c o n a n ti b e ta a c t in a (S a n ta C ru z , 1 :500 ) e n d ilu c ió n e n T B S T c o n in c u b a c ió n d u ra n te la n o c h e a 4 °C . D e s p u é s , la s m e m b ra n a s s e la v a ro n t re s v e c e s c o n T B S T y s e in c u b a ro n d u ra n te u n a h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te e n a n t ic u e rp o s e c u n d a r io a n ti ra tó n c o n ju g a d o c o n H R P (J a c k s o n L a b o ra to r ie s ) . N u e v a m e n te , se la v a ro n la s m e m b ra n a s t r e s v e c e s e n T B S T , s e in c u b a ro n d u ra n te 1 m in u to en re a c tiv o d e d e te c c ió n W e s te rn E C L (G E L ife S c ie n c e s ) y se o b tu v ie ro n im á g e n e s e n A m e rs h a m Im a g e r 600 (G E L ife S c ie n c e s ) .
Resultados
E n c o m p a ra c ió n c o n lo s c o n tro le s (c o n tro l, IgG 1 h u m a n a d e c o n tro l y F a b d e IgG 1 h u m a n a ) , e l t ra ta m ie n to co n a n t ic u e rp o s d e lo n g itu d c o m p le ta 50 nM o fra g m e n to s F a b d e a n ti s o r t i l in a S -2 -11 , S -15 -6 , S -22 -9 y S -82 -8 g e n e ró u n a re d u c c ió n im p o r ta n te d e e x p re s ió n d e p ro te ín a s o r t i l in a en m a c ró fa g o s p r im a r io s h u m a n o s ( Figura 18A) y c é lu la s d e n d r í t ic a s p r im a r ia s h u m a n a s ( Figura 18B) e n un p e río d o d e 48 h o ra s . E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a S -60 in d u jo ú n ic a m e n te u n a re d u c c ió n le v e d e la e x p re s ió n d e p ro te ín a s o r t i l in a en m o n o c ito s p r im a r io s h u m a n o s , a p e s a r d e su c a p a c id a d p a ra e lim in a r c a s i to ta lm e n te lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s u p e r f ic ie c e lu la r (Figuras 18A y 18B). E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a S -5 n o in d u jo u n a re d u c c ió n d e e x p re s ió n d e p ro te ín a s o r t i l in a e n m o n o c ito s p r im a r io s h u m a n o s ( Figuras 18A y 18B). L o s re s u lta d o s c o n e l a n t ic u e rp o S -5 s o n c o h e re n te s c o n la in c a p a c id a d d e l a n t ic u e rp o S -5 p a ra re d u c ir lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s u p e r f ic ie c e lu la r e n c é lu la s U -251 (E je m p lo 5 y Figura 10). E s to s re s u lta d o s in d ic a n q u e e l a n t ic u e rp o S -5 a n ti s o r t i l in a e s un b lo q u e a d o r p u ro d e la u n ió n a P G R N .
L o s re s u lta d o s i lu s tra d o s d e la Figura 18 in d ic a n q u e e s p o s ib le u t i l iz a r c é lu la s m ie lo id e s p r im a r ia s h u m a n a s o b te n id a s d e m u e s tra s d e s a n g re d e p a c ie n te s p a ra m e d ir la a c t iv id a d in vivo d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a q u e re d u c e los n iv e le s d e p ro te ín a s o r t il in a . T a m b ié n s e h a n d e m o s tra d o re s u lta d o s s im ila re s in vivo c o n ra to n e s ,
E je m p lo 27 : C a ra c te r iz a c ió n d e in te ra c c io n e s e n tre s o r t i l in a y p ro g ra n u lin a in vivo
Materiales y métodos
S e c lo n a ro n lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a re c o m b in a n te s e n p lá s m id o s d e e x p re s ió n y s e p ro d u je ro n c é lu la s H E K 293 T m e d ia n te un p ro c e d im ie n to e s tá n d a r , ta l c o m o s e d e s c r ib ió e n W il l ia m J, H a rr is & J o h n R, A d a ir , E d s , (Antibody Therapeutics, 1997 ). L o s p lá s m id o s d e e x p re s ió n , e n lo s q u e s e c lo n a ro n lo s a n t ic u e rp o s , c o n t ie n e n re g io n e s d e c a d e n a lig e ra y c a d e n a p e s a d a c o n s ta n te d e IgG 1 h u m a n a o m u r in a d e c o n s e n s o , lo q u e in c lu y e la m u ta c ió n N 297 A e n la F c d e c a d e n a p e s a d a q u e im p id e la g l ic o s ila c ió n d e l a n tic u e rp o .
S e a d m in is tra ro n in y e c c io n e s a ra to n e s C 57 B L 6 (T a c o n ic ) , ra to n e s c o n e l g e n d e s o r t i l in a in a c t iv a d o o ra to n e s h e te ro c ig o to s p a ra s o r t i l in a p o r v ía in t ra p e r ito n e a l d e 40 m g /k g d e Ig G e l d ía 0. S e u t il iz a ro n lo s s ig u ie n te s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t il in a : S -2 -11 , S -15 -6 , S -20 y S -30 ,
S e to m a ro n m u e s tra s d e s a n g re d e s p u é s d e 4 h o ra s y los d ía s 2, 5, 8 y 12 p a ra a is la r p la s m a y le u c o c ito s . E n e l c a s o d e a is la m ie n to d e p la s m a , s e re c o g ió s a n g re e n tu b o s h e p a r in iz a d o s y s e c e n tr ifu g a ro n a 10 000 x g d u ra n te 10 m in u to s a 4 °C . S e re c o g ió e l s o b re n a d a n te d e p la s m a y s e c o n s e rv ó a -80 °C . S e a ñ a d ió 1 x v o lu m e n d e P B S E D T A 1 m M y s e re s u s p e n d ie ro n la s c é lu la s m e d ia n te a g ita c ió n e n v ó r t ic e p a ra p o s te r io r a is la m ie n to d e le u c o c ito s . S e a ñ a d ió un v o lu m e n 10 x d e ta m p ó n d e lis is A C K 1 x (L o n z a ) , s e in c u b a ro n la s c é lu la s en h ie lo d u ra n te 10 m in u to s y se c e n tr ifu g a ro n p o s te r io rm e n te a 500 x g d u ra n te 10 m in u to s a 4 °C . S e d e s c a r tó e l s o b re n a d a n te , s e re s u s p e n d ie ro n la s c é lu la s e n 10 x v o lu m e n d e ta m p ó n d e lis is A C K , s e in c u b a ro n n u e v a m e n te e n h ie lo d u ra n te 5 m in u to s y, p o s te r io rm e n te , s e c e n tr ifu g a ro n a 500 x g d u ra n te 10 m in u to s a 4 °C . L a s c é lu la s s e la v a ro n e n 1 m l d e P B S E D T A 1 m M , s e v o lv ie ro n a c e n tr ifu g a r, s e d e s c a r tó e l s o b re n a d a n te y e l s e d im e n to c e lu la r s e c o n s e rv ó a -80 °C .
S e re s u s p e n d ie ro n lo s s e d im e n to s c e lu la re s e n 50 p l d e N -P e r (T h e rm o S c ie n t if ic P ie rc e ) q u e c o n te n ía un c ó c te l in h ib id o r d e p ro te a s a p a ra a is la r la p ro te ín a d e lo s le u c o c ito s . S e in c u b ó la s o lu c ió n e n h ie lo d u ra n te 20 m in u to s y se c e n tr ifu g ó a 10 000 x g d u ra n te 10 m in u to s a 4 °C . S e re c o g ió e l s o b re n a d a n te , s e m id ió m e d ia n te B C A y se c a rg ó en un g e l p ro te ic o , ta l c o m o s e d e s c r ib ió e n la s e c c ió n a n te r io r . S e d e te rm in a ro n lo s n iv e le s d e IgG 1 h u m a n a e n e l p la s m a m e d ia n te un e n s a y o E L IS A u su a l. E n re s u m e n , s e re v is tie ro n la s p la c a s d e 96 p o c il lo s d u ra n te la n o c h e a 4 °C co n 0,1 p g /p o c il lo d e f ra g m e n to F a b a n t ih u m a n o e s p e c íf ic o p a ra Ig G (J a c k s o n Im m u n o ). L a s p la c a s s e la v a ro n t re s v e c e s e n 200 p l d e ta m p ó n d e la v a d o (P B S T w e e n a l 0 ,05 % ) y s e b lo q u e a ro n e n ta m p ó n d e u n ió n (P B S B S A a l 1 % ) d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . S e d ilu y ó p la s m a e n ta m p ó n d e u n ió n , s e a ñ a d ió a la s p la c a s b lo q u e a d a s y s e in c u b ó d u ra n te 1 h o ra a 37 °C . P o s te r io rm e n te , la s p la c a s s e la v a ro n t re s v e c e s en 200 p l d e ta m p ó n d e la v a d o y s e in c u b a ro n c o n a n t ic u e rp o s e c u n d a r io c o n ju g a d o c o n H R P e s p e c íf ic o p a ra F c a n ti h u m a n o (J a c k s o n Im m u n o R e s e a rc h ) e n d ilu c ió n 1 :10 000 e n ta m p ó n d e u n ió n d u ra n te 1 h o ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te . S e la v a ro n la s p la c a s t r e s v e c e s e n ta m p ó n d e la v a d o y, d e s p u é s , s e a ñ a d ie ro n 100 p l d e s u s tra to d e T M B y s e in c u b ó h a s ta q u e se re v e ló c o lo r s u f ic ie n te . S e d e tu v o la re a c c ió n m e d ia n te la a d ic ió n d e 50 p l d e á c id o s u lfú r ic o 2 N y s e le y ó la p la c a e n un le c to r d e p la c a s S y n e rg y H1 (B io te k ) . S e u t iliz ó e l a n t ic u e rp o IgG 1 d e c o n tro l a u n a c o n c e n tra c ió n e s tá n d a r d e 16 ­ 1000 pM . S e e v a lu a ro n lo s n iv e le s d e a n t ic u e rp o s IgG 1 d e ra tó n c o n u n a c o n f ig u ra c ió n d e E L IS A s im ila r, S e re v is tie ro n la s p la c a s c o n 0,1 p g /p o c il lo d e p ro te ín a s o r t i l in a d e ra tó n re c o m b in a n te (R & D S y s te m s ) y s e u t iliz ó F c a n ti ra tó n e s p e c íf ic o p a ra Ig G d e c a b ra ( J a c k s o n Im m u n o R e s e a rc h ) c o m o un a n t ic u e rp o d e d e te c c ió n e n d ilu c ió n 1 :10 000 en ta m p ó n d e u n ió n (P B S B S A a l 3 % ). S e u t iliz ó e l a n t ic u e rp o in y e c ta d o c o m o e s tá n d a r d e 37 -3000 pM .
S e m id ie ro n lo s n iv e le s d e p ro g ra n u lin a (P G R N ) d e ra tó n u s a n d o un k it d e E L IS A D u o s e t d e R & D S y s te m s , d e a c u e rd o c o n e l p ro to c o lo d e l fa b r ic a n te . L o s n iv e le s d e p ro te ín a s o r t i l in a s e m id ie ro n e n lo s lis a d o s d e le u c o c ito s u s a n d o tra n s fe re n c ia W e s te rn y c u a n tif ic a c ió n d e lo s m is m o s , ta l c o m o s e d e s c r ib ió e n e l E je m p lo 25.
S e im p la n ta ro n m in ib o m b a s o s m ó tic a s A lz e t s u b c u tá n e a s (m o d e lo 1002 , c a u d a l= 0 ,25 p l/h ) e n lo s ra to n e s , q u e se re v is t ie ro n y s e re l le n a ro n p re v ia m e n te c o n e l a n t ic u e rp o (2 m g /m l) y s e c o n e c ta ro n a u n a c á n u la A lz e t (k it d e in fu s ió n c e re b ra l 3 ) p a ra a d m in is tra c ió n IC V u n ila te ra l p a ra la in fu s ió n IC V d e a n t ic u e rp o s e n e l c e re b ro d e lo s ra to n e s . A n te s d e la c iru g ía , s e c e b a ro n las m in ib o m b a s c o n fo rm e a las in d ic a c io n e s d e A lz e t. E n re s u m e n , to d o s lo s e n v a s e s , f ra s c o s , je r in g a s y g u a n te s , se p u lv e r iz a ro n c o n e ta n o l a l 70 % , S e re l le n ó la m in ib o m b a c o n e l a r t íc u lo d e e n s a y o d e s e a d o c o n u n a a g u ja l im p ia y u n a je r in g a . D e s p u é s , se lim p ió c o n un p a ñ u e lo d e p a p e l e m p a p a d o c o n is o p ro p a n o l y s e c o lo c ó e n un re c ip ie n te c o n s o lu c ió n s a lin a e s té r il a l 0 ,9 % d u ra n te la n o c h e a 37 C p a ra c e b a r la s b o m b a s ,
S e u t iliz ó is o f lu o ra n o o x íg e n o u s a n d o un v a p o r iz a d o r e q u ip a d o c o n u n a m a s c a r il la p a ra a n e s te s ia r a los ra to n e s . D e s p u é s , c a d a ra tó n s e c o lo c ó e n un m a rc o e s te re o tá c t ic o en u n a a lm o h a d illa c a le fa c to ra a ju s ta b le . M ie n tra s e s ta b a n e n e l m a rc o e s te re o tá c t ic o , s e c o n t in u ó a d m in is tra n d o a n e s te s ia c o n is o f lu o ra n o a lo s ra to n e s a t ra v é s d e un c o n o n a s a l. D e s p u é s , lo s ra to n e s re c ib ie ro n u n a a p lic a c ió n lo c a l d e m a rc a ín a (b u p iv a c a ín a e p in e fr in a ) e n e l lu g a r d e la in c is ió n e n e l c rá n e o . S e re t iró la p ie l q u e c u b r ía e l c rá n e o co n u n a g a s a q u irú rg ic a y la v a d o co n b e ta d in a , y d e s p u é s s e lim p ió co n e ta n o l a l 75 % e n u n a g a s a q u irú rg ic a . S e u t iliz ó un e s c a lp e lo p a ra re a liz a r u n a in c is ió n s a g ita l m e d ia d e 1 c m a t ra v é s d e la p ie l q u e c u b ría e l c rá n e o , p a ra e x p o n e r e l h u e s o . S e u t il iz a ro n c o to n e te s e s té r ile s c o n s o lu c ió n s a lin a n o rm a l a l 0 ,9 % o H 2O 2 a l 3 % p a ra lim p ia r la s a n g re en e l c a m p o q u irú rg ic o . S e u t il iz a ro n h e m ó s ta to s p a ra a s ir lo s c o lg a jo s d e p ie l y re tra e r lo s la te ra lm e n te . U n a v e z q u e s e re t ira ro n la fa s c ia y e l p e r io s t io co n un b is tu rí, fu e p o s ib le v is u a liz a r e l b re g m a . E n p r im e r lu g a r, s e im p la n tó la m in ib o m b a p o r v ía s u b c u tá n e a a lo la rg o d e la e s c á p u la /e s p a ld a y a s e a a la iz q u ie rd a o a la d e re c h a d e la c o lu m n a . D e s p u é s , s e m a rc ó la u b ic a c ió n d e lo s o r if ic io s a t r e p a n a r c o n la p u n ta d e l e s c a lp e lo o co n un m a rc a d o r d e p u n ta f in a , y s e ta la d ró un o r if ic io e n e l c rá n e o co n un ta la d ro m a n u a l co n c u id a d o d e n o d a ñ a r e l te j id o c e re b ra l o la d u ra m a d re s u b y a c e n te . S e in s e rtó en e l h ip o c a m p o o e l v e n tr íc u lo la te ra l la c á n u la A lz e t (k it 3 ) u n id a a la m in ib o m b a . L a s c o o rd e n a d a s p a ra la s p u n ta s d e la c á n u la p a ra e l v e n tr íc u lo la te ra l so n : a n te r io r -p o s te r io r (A P ) = -0 ,3 m m re s p e c to a l b re g m a , m e d ia - la te ra l (M L ) = -1 ,0 m m re s p e c to a la lín e a m e d ia y v e n tra l (V ) = -1 ,7 m m re s p e c to a la d u ra m a d re , c o n la b a rra d e n ta d a c o n f ig u ra d a a 0 m m . D e s p u é s d e la c iru g ía , los ra to n e s s e in s ta la ro n in d iv id u a lm e n te e n ja u la s y re c ib ie ro n a lim e n to y a g u a a d e m a n d a . D e s p u é s d e la c iru g ía , se re a liz ó un s e g u im ie n to d ia r io d e l e s ta d o d e lo s ra to n e s . En e l m o m e n to f in a l, to d o s lo s ra to n e s s e s a c r if ic a ro n . D e s p u é s d e l s a c r if ic io o d e la m u e r te e s p o n tá n e a , s e a b r ió e l s it io d e im p la n te d e la m in ib o m b a y s e re g is tra ro n las o b s e rv a c io n e s , lo q u e in c lu y e c u a lq u ie r in d ic io d e n e c ro s is o d e a c u m u la c ió n d e líq u id o .
E n e l c a s o d e in y e c c io n e s p e r ifé r ic a s a lo s ra to n e s , s e a d m in is tra ro n a n t ic u e rp o s e n P B S e s té r il y a s e a p o r v ía in tra p e r ito n e a l ( IP ) c o m o in tra v e n o s a ( IV ) d e a c u e rd o c o n lo s p ro c e d im ie n to s c o n v e n c io n a le s . S e e x tra je ro n m u e s tra s d e s a n g re d e 50 -200 p l y s e re c o g ie ro n e n tu b o s h e p a r in iz a d o s . P o s te r io rm e n te , s e c e n tr ifu g a ro n la s m u e s tra s d e s a n g re d u ra n te 10 m in u to s a 2000 x g a 4 °C y s e re c o g ió p la s m a .
E l c e re b ro s e d is e c c io n ó e n h ip o c a m p o iz q u ie rd o y d e re c h o , c o r te z a f ro n ta l y c o r te z a o c c ip ita l. S e a ñ a d ie ro n 20 p l d e N -P e r /m g d e te j id o ju n to c o n in h ib id o re s d e fo s fa ta s a y p ro te a s a p a ra p re p a ra r l is a d o s c e re b ra le s . S e s e p a ra ro n los te j id o s y la s c é lu la s m e d ia n te u ltra s o n id o . D e s p u é s d e la s e p a ra c ió n , la m e z c la d e te j id o y N -p e r s e in c u b ó e n h ie lo d u ra n te 30 m in u to s y, d e s p u é s , s e c e n tr ifu g ó c o n 20 000 x g d u ra n te 30 m in u to s . S e re c o g ió e l s o b re n a d a n te y se c o n s e rv ó a -80 °C h a s ta su a n á lis is . U s a n d o e n s a y o s E L IS A , s e m id ie ro n lo s n iv e le s d e a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a y P G R N d e ra tó n e n la s m u e s tra s d e lis a d o c e re b ra l.
Resultados
P o r v ía in t ra p e r ito n e a l, e l d ía 0 lo s ra to n e s re c ib ie ro n u n a in y e c c ió n d e 40 m g /k g d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -2 -11 , S -15 -6 , S -20 y S -30. S e m id ie ro n lo s n iv e le s d e a n t ic u e rp o los d ía s 0 (4 h o ra s d e s p u é s d e la in y e c c ió n ) , 2, 5, 8 y 12 u s a n d o un e n s a y o E L IS A a d a p ta d o . S e m id ió la s e m iv id a e n s u e ro c o n u n a e x p a n s ió n d e E x c e l e s p e c ia l. T a l c o m o se ilu s tra e n la Figura 19A, e l a n t ic u e rp o S -20 c o m o N 297 A h u Ig G 1 t ie n e u n a s e m iv id a d e 0 ,9 d ía s , m ie n tra s q u e e l a n t ic u e rp o d e c o n tro l d e is o t ip o (h u Ig G 1 N 297 A ) t ie n e u n a s e m iv id a d e 4 ,2 d ía s . E n e s to s e x p e r im e n to s , s e u t i l iz a ro n lo s a n t ic u e rp o s N 297 A IgG 1 h u m a n o s o m u r in o s , q u e t ie n e n u n a m u ta c ió n N 297 A e n su re g ió n F c q u e im p id e la g lic o s ila c ió n y, p o r ta n to , la u n ió n a re c e p to re s d e Fc.
T a l c o m o se m u e s tra e n la Figura 19B, la s v e rs io n e s N 297 A d e IgG 1 m u r in a d e a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -2 -11 , S -15 -6 , S -20 y S -30 t ie n e n s e m iv id a s q u e v a r ía n d e 0 ,5 d ía s a 2 ,0 d ía s .
L o s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a t ie n e n u n a s e m iv id a m á s c o r ta q u e la d e la Ig G d e c o n tro l, lo q u e s e c re e q u e s e d e b e a la in te ra c c ió n c o n la d ia n a . T a l c o m o s e m u e s tra e n la Figura 19, lo s a n t ic u e rp o s S -15 -6 y S -20 t ie n e n la s s e m iv id a s m á s e x te n s a s d e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o rt il in a .
D e s p u é s , se e v a lu a ro n lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a p a ra d e te rm in a r s i p o d ía n in d u c ir c a m b io s e n lo s n iv e le s p ro te ic o s d e P G R N e n e l p la s m a s a n g u ín e o d e ra to n e s u s a n d o un k it d e E L IS A D u o s e t d e P G R N d e ra tó n (R & D S y s te m s ). L o s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -2 -11 , S -15 -6 y S -20 , q u e in d u c e n u n a re d u c c ió n e n lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s c é lu la s ( Figuras 10 y 18), ta m b ié n fu e ro n c a p a c e s d e in d u c ir un a u m e n to d e a p ro x im a d a m e n te 4 v e c e s e n lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N en e l p la s m a s a n g u ín e o d e ra to n e s ( Figuras 20A a 20D). A u n q u e e l a u m e n to d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N in d u c id o p o r e l a n t ic u e rp o S -2 -11 p a re c e s e r in te rm ite n te , lo s a n t ic u e rp o s S -20 y S -15 -6 in d u c e n un a u m e n to c o n s id e ra b le d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N d u ra n te h a s ta 8 d ía s ( Figuras 20A a 20D). E l a n t ic u e rp o b lo q u e a n te d e la u n ió n a P G R N p u ro , S -30 , ta m b ié n p o d ía a u m e n ta r d e fo rm a s ig n if ic a t iv a lo s n iv e le s d e P G R N d e s p u é s d e 4 h o ra s ( Figuras 20A y 20B). L o s re s u lta d o s s u g ie re n q u e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a b lo q u e a n te s d e P G R N , q u e no in d u c e n n in g u n a re d u c c ió n d e los n iv e le s c e lu la re s d e s o r t il in a , ta m b ié n p u e d e n a u m e n ta r lo s n iv e le s p ro te ic o s d e P G R N . S in e m b a rg o , se c re e q u e lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t il in a , q u e in d u c e n u n a re d u c c ió n e n lo s n iv e le s c e lu la re s d e s o r t i l in a , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s S -15 -6 y S -20 , y q u e ta m b ié n s o n c a p a c e s d e in d u c ir un e fe c to p ro lo n g a d o e n los n iv e le s d e p ro te ín a P G R N , e n c o m p a ra c ió n c o n lo s a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a q u e s o la m e n te b lo q u e a n la in te ra c c ió n e n tre s o r t i l in a y P G R N , s o n m á s a d e c u a d o s p a ra e s tu d io s d e e f ic a c ia in vivo.
S e p ro c e s a ro n lis a d o s d e m u e s tra s d e le u c o c ito s o b te n id a s d e ra to n e s tra ta d o s e n un g e l p ro te ic o y s e e v a lu a ro n m e d ia n te tra n s fe re n c ia W e s te rn p a ra c o n f irm a r q u e e l a u m e n to d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N in d u c id o p o r los a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -2 -11 , S -15 -6 y S -20 s e d e b ió a la in d u c c ió n d e u n a re d u c c ió n d e lo s n iv e le s c e lu la re s d e s o r t i l in a . C in c o d ía s d e s p u é s d e la in y e c c ió n , lo s a n t ic u e rp o s S -2 -11 , S -15 -6 y S -20 in d u je ro n u n a re d u c c ió n fu e r te d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a s o r t i l in a e n lo s le u c o c ito s ( Figuras 21A y 21B). D o c e d ía s d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to co n a n t ic u e rp o s S -2 -11 , S -20 y S -30 , la s m u e s tra s d e le u c o c ito s d e ra to n e s m o s tra ro n n iv e le s d e p ro te ín a s o r t i l in a q u e v o lv ie ro n a lo s n iv e le s d e c o n tro l ( Figuras 21C y 21D). S in e m b a rg o , la s m u e s tra s d e le u c o c ito s d e ra to n e s d o c e d ía s d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to co n e l a n t ic u e rp o S -15 -6 to d a v ía p re s e n ta ro n n iv e le s re d u c id o s d e p ro te ín a s o r t i l in a ( Figuras 21C y 21D). E l a n t ic u e rp o S -30 n o p a re c e in d u c ir u n a re d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a s o r t i l in a ( Figuras 21A a 21D ), lo q u e e s c o h e re n te c o n lo s re s u lta d o s in vitro ( Tabla 10 ). E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a S -30 e s un b lo q u e a d o r e s p e c íf ic o d e P G R N .
L o s ra to n e s re c ib ie ro n in y e c c io n e s d e 20 , 40 u 80 m g /k g d e a n t ic u e rp o S -15 -6 o d e un a n t ic u e rp o d e c o n tro l m s Ig G 1 u n a v e z a la s e m a n a d u ra n te s e is s e m a n a s p a ra m e d ir la in te ra c c ió n c o n la d ia n a d e s p u é s d e in y e c c io n e s p ro lo n g a d a s . D e s p u é s d e 35 d ía s , s e a is la ro n le u c o c ito s d e m u e s tra s d e s a n g re c o m p le ta . S e o b s e rv ó u n a re d u c c ió n im p o r ta n te d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a s o r t i l in a e n m u e s tra s o b te n id a s d e ra to n e s e n to d a s las d o s is in y e c ta d a s (Figuras 2 lE y 21F). D ic h o s re s u lta d o s in d ic a n q u e e s p o s ib le lo g ra r u n a in te ra c c ió n d u ra d e ra c o n la d ia n a .
S e in y e c ta ro n v e rs io n e s N 297 A d e IgG 1 h u m a n a d e los a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a S -15 , S -20 , S -30 , a s í c o m o un a n t ic u e rp o d e c o n tro l d e is o t ip o h u m a n o , e n e l v e n tr íc u lo la te ra l d e re c h o d e l c e re b ro e n ra to n e s c o n u n a m in ib o m b a o s m ó tic a d e A lz e t p a ra m e d ir la in te ra c c ió n c o n la d ia n a d e lo s a n t ic u e rp o s d e s o r t i l in a e n e l c e re b ro . D e s p u é s d e d o s s e m a n a s d e in fu s ió n , lo s c e re b ro s se d is e c c io n a ro n e n h ip o c a m p o iz q u ie rd o y d e re c h o , c o r te z a fro n ta l y c o r te z a o c c ip ita l. S e g e n e ra ro n lis a d o s a p a r t ir d e d ic h a s á re a s y se m id ie ro n lo s n iv e le s d e Ig G h u m a n a u s a n d o e n s a y o s E L IS A . T a l c o m o s e m u e s tra en la s Figuras 22A a 22c , c u a n d o s e re p re s e n ta ro n g rá f ic a m e n te lo s n iv e le s d e a n t ic u e rp o ( Ig G ) c o n tra lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N , s e o b s e rv ó u n a c o r re la c ió n p o s it iv a fu e r te e n tre la s d o s v a r ia b le s , lo q u e in d ic a q u e e l a u m e n to d e la d o s is d e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a p u e d e a u m e n ta r lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N e n e l c e re b ro . N o s e o b s e rv ó d ic h a c o r re la c ió n e n tre lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N e Ig G d e c o n tro l ( Figura 22D).
S e e v a lu ó u n a v e rs ió n N 297 A d e IgG 1 h u m a n a d e a n t ic u e rp o S -15 -6 (h u Ig G ) e n ra to n e s co n e l g e n d e s o r t i l in a in a c t iv a d o (K O ) y e n in d iv id u o s d e la m is m a c a m a d a d e t ip o s i lv e s tre (W T ) y h e te ro c ig o to s (H e t) p a ra s o r t il in a , p a ra d e te rm in a r s i lo s e fe c to s d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N in d u c id o s p o r a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a s e d e b ía n a u n a re d u c c ió n d e lo s n iv e le s d e s o r t i l in a y n o a e fe c to s in e s p e c íf ic o s . S e m id ie ro n lo s n iv e le s d e a n t ic u e rp o S -15 -6 e n e l p la s m a y s e o b s e rv ó q u e la s e m iv id a d e l a n t ic u e rp o a u m e n ta b a d rá s t ic a m e n te a m e d id a q u e s e re d u c ía n lo s v a lo re s d e s o r t i l in a e x p re s a d a ( Figura 23A). L o s re s u lta d o s in d ic a n q u e e l a n t ic u e rp o S -15 -6 re c o n o c e e s p e c íf ic a m e n te la s o r t i l in a y, p ro b a b le m e n te , s e re c ic le y s e d e g ra d e d e s p u é s d e su in te ra c c ió n c o n e l re c e p to r (e s d e c ir, d e u n irs e a la s o r t il in a ) .
T a m b ié n s e d e te rm in a ro n lo s n iv e le s d e P G R N e n ra to n e s c o n e l g e n d e s o r t i l in a in a c tiv a d o . L o s n iv e le s d e re fe re n c ia d e p ro te ín a P G R N fu e ro n 4 v e c e s m a y o re s en ra to n e s c o n e l g e n d e s o r t i l in a in a c t iv a d o (K O ), en c o m p a ra c ió n co n in d iv id u o s d e la m is m a c a m a d a d e t ip o s ilv e s tre (W T ) ( Figura 23B). D e m a n e ra a d ic io n a l, se in y e c ta ro n 40 m g /k g d e a n t ic u e rp o S -15 -6 e n u n a d o s is ú n ic a a lo s ra to n e s c o n e l g e n d e s o r t i l in a in a c tiv a d o , a s í c o m o a ra to n e s d e la m is m a c a m a d a h e te ro c ig o to s (H e t) y d e t ip o s i lv e s tre (W T ), y s e m id ie ro n los n iv e le s d e p ro te ín a P G R N u s a n d o e n s a y o s E L IS A . L o s re s u lta d o s d e la Figura 23C m u e s tra n q u e , a u n q u e la in y e c c ió n d e a n t ic u e rp o S -15 -6 e n ra to n e s d e t ip o s ilv e s tre o h e te ro c ig o to s p a ra s o r t il in a , a u m e n tó en g ra n m e d id a lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N , n o s e o b s e rv ó un a u m e n to a d ic io n a l d e lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N e n ra to n e s c o n e l g e n d e s o r t i l in a in a c tiv a d o , lo q u e in d ic a q u e e l a n t ic u e rp o S -15 -6 a u m e n ta lo s n iv e le s d e p ro te ín a P G R N e s p e c íf ic a m e n te m e d ia n te la re d u c c ió n d e lo s n iv e le s de p ro te ín a s o rt il in a .
E je m p lo 28 : M e jo ra d e los s ín to m a s d e a r tr it is in d u c id a p o r c o lá g e n o e n ra to n e s d e b id o a a n t ic u e rp o s a n ti s o r t i l in a
Materiales y métodos
L o s d ía s 0 y 21 d e l e s tu d io , s e a n e s te s ió a lo s ra to n e s c o n is o f lu o ra n o y re c ib ie ro n in y e c c io n e s in tra d é rm ic a s d e un to ta l d e 100 p l d e c o lá g e n o t ip o II e n a d y u v a n te c o m p le to d e F re u n d e n la b a s e d e la co la . S e p re p a ró c o lá g e n o p ro d u c ie n d o u n a s o lu c ió n d e 4 m g /m l e n á c id o a c é t ic o 0 ,01 N. M e z c la n d o m a n u a lm e n te , s e e m u ls io n a ro n lo s m is m o s v o lú m e n e s d e c o lá g e n o y a d y u v a n te d e F re u n d 5 m g /m l. E l d ía 0 d e l e s tu d io , lo s ra to n e s s e a s ig n a ro n a l a z a r a los g ru p o s d e tra ta m ie n to e n fu n c ió n d e su p e s o c o rp o ra l. D e s p u é s su in c o rp o ra c ió n a l e s tu d io , se in ic ió e l t ra ta m ie n to . S e in y e c tó c o lá g e n o lo s d ía s 0 y 21. P o r v ía in tra p e r ito n e a l, lo s d ía s 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 , 24 y 28 d e l e s tu d io , se in y e c ta ro n 40 m g /k g d e a n t ic u e rp o S -15 -6 c o m o N 297 A IgG 1 d e ra tó n o a n t ic u e rp o d e c o n tro l M O P C -21. S e a d m in is tra ro n d o s is d ia r ia s d e d e x a m e ta s o n a ,
D e s p u é s d e la in c lu s ió n d e lo s ra to n e s , se re g is tra ro n s u s p e s o s c o rp o ra le s y la s p u n tu a c io n e s c lín ic a s d e la s c u a tro patas. Después, se determinaron diariamente las puntuaciones de las patas desde el día 18 al día 35 del estudio. La eficacia general de los artículos ensayados se basó en las puntuaciones diarias de las patas y en un cálculo del área bajo la curva (AUC, area under curve) de la puntuación de las patas con respecto al tiempo.
Las puntuaciones clínicas de las patas se determinaron de la siguiente manera:
0 = Normal
1 = 1 articulación de la pata delantera o trasera afectada o hinchazón y eritema difuso mínimo
2 = 2 articulaciones de las patas delanteras o traseras afectadas o hinchazón y eritema difuso leve
3 = 3 articulaciones de las patas delanteras o traseras afectadas o hinchazón y eritema difuso moderado 4 = eritema difuso notorio e hinchazón o 4 articulaciones de los dedos afectadas
5 = toda la pata presenta eritema difuso grave e hinchazón grave y no es posible doblar los dedos
Resultados
La administración de dosis de 40 mg/kg de anticuerpo anti sortilina S-15-6 a los animales, produjo una reducción moderada, pero estadísticamente significativa, de las puntuaciones clínicas de las patas, así como un retraso de un día en la aparición de la enfermedad (Figura 24). Las Tablas 18A y 18B muestran los valores de p calculados usando una prueba de la t y un análisis de varianza (ANOVA) bidireccional, indicándose la significación estadística de los resultados ilustrados en la Figura 24,
Tabla 18A: Prueba de la t
Figure imgf000135_0002
Tabla 18B: ANOVA bidireccional
Figure imgf000135_0001
Estos resultados indican que el aumento de los niveles de progranulina, inducido por el anticuerpo anti sortilina, puede reducir los síntomas clínicos de la artritis.
Ejemplo 29: Caracterización de la actividad de sortilina in vivo
Materiales y métodos
Por vía intraperitoneal, se inyectaron 0 mg/kg, 0,4 mg/kg y 4 mg/kg de lipopolisacárido (LPS) de E, coli 0111:B4 a ratones C57Bl6 de tipo silvestre y a ratones (con el gen de sortilina inactivado) sortilina -/- de 9-10 semanas de vida. Se recogieron muestras de suero de los ratones 1,5 y 6 horas después de la administración de LPS. Después, usando un kit de inflamación de ratón BD Cytometric Bead Array, se evaluaron los niveles de citocinas y quimiocinas, incluyendo IL-6, TNFalfa (TNF-a), IFNgamma (IFN-y), IL-10, IL12p70 y CCL2, y el conjunto flex que comprende IL12/IL-23p40, IL-1beta(IL-1p), IL-1alfa (IL-1a), CXCL1, CCL3, CCL4 y CCL5. Para evaluar la infiltración y la migración celular se realizó un lavado de la cavidad peritoneal 6 horas después de la administración de LPS. El análisis se llevó a cabo usando un sistema BD FACSCanto II.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. U n a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a a is la d o q u e s e u n e a s o r t i l in a h u m a n a , e n d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a a u m e n ta los n iv e le s e x tra c e lu la re s d e p ro g ra n u lin a y d is m in u y e lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s u p e r f ic ie c e lu la r , en d o n d e el a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a c o m p re n d e un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra y un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a , y e n d o n d e :
a ) e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e : u n a H V R -L 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s de S E Q ID N O : 508 , u n a H V R -L 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 29 y u n a H V R -L 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 55 , y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e : u n a H V R -H 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 509 , u n a H V R -H 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 510 , y u n a H V R -H 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 511 ; o
b ) e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e : u n a H V R -L 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s de S E Q ID N O : 580 , u n a H V R -L 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 581 y u n a H V R -L 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 100 , y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e : u n a H V R -H 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 582 , u n a H V R -H 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 583 y u n a H V R -H 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 233.
2. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la re iv in d ic a c ió n 1, e n d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a se u n e c o n u n a c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n (Kd) d e la s o r t i l in a h u m a n a q u e v a r ía d e 100 nM a 0 ,005 nM , o e s m e n o r d e 0 ,005 nM y /o e n d o n d e el a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a se u n e co n u n a c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n (Kd) d e la s o r t i l in a d e ra tó n q u e v a r ía d e 100 nM a 0 ,005 nM , o e s m e n o r d e 0 ,005 nM .
3. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e n d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a e s un a n t ic u e rp o h u m a n o , un a n t ic u e rp o h u m a n iz a d o , un a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o , un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l, un a n t ic u e rp o m u ltiv a le n te , un a n t ic u e rp o c o n ju g a d o o un a n t ic u e rp o q u im é r ic o , o en d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a e s un fra g m e n to d e a n tic u e rp o , y o p c io n a lm e n te , e n d o n d e e l f ra g m e n to e s un f ra g m e n to F a b , F a b ', F a b '-S H , F (a b ')2 , F v o s c F v .
4. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -3 , e n d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a e s un a n t ic u e rp o b ie s p e c íf ic o q u e re c o n o c e un s e g u n d o a n tíg e n o , o p c io n a lm e n te , e n d o n d e e l s e g u n d o a n tíg e n o e s un a n tíg e n o q u e fa c il ita e l t ra n s p o r te a t ra v é s d e la b a rre ra h e m a to e n c e fá lic a , o p c io n a lm e n te , en d o n d e e l s e g u n d o a n tíg e n o s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n un re c e p to r d e t r a n s fe r r in a (T R ), un re c e p to r d e in s u lin a (H IR ), un re c e p to r d e l fa c to r d e c re c im ie n to in s u lín ic o ( IG F R ), la s p ro te ín a s 1 y 2 re la c io n a d a s c o n e l re c e p to r d e lip o p ro te ín a d e b a ja d e n s id a d (L P R -1 y 2 ), un re c e p to r d e la to x in a d if té r ic a , C R M 197 , T M E M 30 (A ), un d o m in io d e tra n s d u c c ió n d e p ro te ín a s , T A T , S y n -B , p e n e tra t in a , un p é p tid o d e p o lia rg in in a , un p é p tid o a n g io p e p y A N G 1005.
5. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -4 , e n d o n d e :
(a ) e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e : u n a H V R -L 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e SEq ID N O : 10, u n a H V R -L 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 30 y u n a H V R -L 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 100 , y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e : u n a H V R -H 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 142 , u n a H V R -H 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 170 y u n a H V R -H 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s de S E Q ID N O : 233 ; o
(b ) e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 430 y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 431.
6. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -4 , e n d o n d e :
(a ) e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e : u n a H V R -L 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 9, u n a H V R -L 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 29 y u n a H V R -L 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 55 , y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e : u n a H V R -H 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 129 , u n a H V R -H 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 155 y u n a H V R -H 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s de S E Q ID N O : 190 ; o
(b ) e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 343 y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 342.
7. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -4 , en d o n d e e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e : u n a H V R -L 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 9, u n a H V R -L 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 29 y u n a H V R -L 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 55 , y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e : u n a H V R -H 1 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 520 , u n a H V R -H 2 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 533 y u n a H V R -H 3 q u e c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 553.
8. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e las re iv in d ic a c io n e s 1 -4 o 7, en d o n d e el d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 343 y e l d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a c o m p re n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e S E Q ID N O : 648.
9. E l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -8 , en d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a t ie n e un is o t ip o d e IgG 1 o Ig G 4 , o p c io n a lm e n te e n d o n d e :
(a ) e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a t ie n e un is o t ip o d e IgG 1 h u m a n a y c o m p re n d e u n a o m á s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s e n la re g ió n F c e n u n a p o s ic ió n d e re s id u o s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en : N 297 A , N 297 Q , D 265 A , L 234 A , L 235 A , C 226 S , C 229 S , P 238 S , E 233 P , L 234 V , P 238 A , A 327 Q , A 327 G , P 329 A , K 322 A , L 234 F , L 235 E , P 331 S , T 394 D , A 330 L , M 252 Y , S 254 T , T 256 E , y c u a lq u ie ra d e s u s c o m b in a c io n e s , en d o n d e la n u m e ra c ió n d e lo s re s id u o s e s d e a c u e rd o c o n la n u m e ra c ió n d e E U ; o
(b ) e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a t ie n e un is o t ip o d e Ig G 4 h u m a n a y c o m p re n d e u n a o m á s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s e n la re g ió n F c e n u n a p o s ic ió n d e re s id u o s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en : E 233 P , F 234 V , L 234 A /F 234 A , L 235 A , G 237 A , E 318 A , S 228 P , L 236 E , S 241 P , L 248 E , T 394 D , M 252 Y , S 254 T , T 256 E , N 297 A , N 297 Q , y c u a lq u ie ra d e s u s c o m b in a c io n e s , en d o n d e la n u m e ra c ió n d e lo s re s id u o s e s d e a c u e rd o co n la n u m e ra c ió n d e E U , o p c io n a lm e n te e n d o n d e :
( i) la re g ió n F c d e la IgG 1 c o m p re n d e a d ic io n a lm e n te u n a o m á s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s a d ic io n a le s en u n a p o s ic ió n s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en A 330 L , L 234 F , L 235 E , P 331 S , y c u a lq u ie ra d e s u s c o m b in a c io n e s , e n d o n d e la n u m e ra c ió n d e lo s re s id u o s e s d e a c u e rd o c o n la n u m e ra c ió n d e E U ;
( ii) la re g ió n F c d e la IgG 1 o Ig G 4 c o m p re n d e a d ic io n a lm e n te u n a o m á s s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s a d ic io n a le s e n u n a p o s ic ió n s e le c c io n a d a d e l g ru p o q u e c o n s is te en M 252 Y , S 254 T , T 256 E , y c u a lq u ie ra d e s u s c o m b in a c io n e s , e n d o n d e la n u m e ra c ió n d e lo s re s id u o s e s d e a c u e rd o c o n la n u m e ra c ió n d e E U ; o ( iii) la re g ió n F c d e la Ig G 4 c o m p re n d e a d ic io n a lm e n te u n a s u s t itu c ió n d e a m in o á c id o S 228 P d e a c u e rd o co n la n u m e ra c ió n d e E U .
10. El a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e la re iv in d ic a c ió n 9, e n d o n d e e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a t ie n e un is o t ip o d e Ig G 4 h u m a n a y c o m p re n d e u n a s u s t itu c ió n d e a m in o á c id o en la s p o s ic io n e s d e lo s re s id u o s S 228 P , F 234 A y L 235 A , en d o n d e la n u m e ra c ió n d e la p o s ic ió n d e l re s id u o e s d e a c u e rd o co n la n u m e ra c ió n d e E U .
11. U n á c id o n u c le ic o a is la d o q u e c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -10.
12. U n v e c to r q u e c o m p re n d e e l á c id o n u c le ic o d e la re iv in d ic a c ió n 11.
13. U n a c é lu la h o s p e d a d o ra a is la d a q u e c o m p re n d e e l v e c to r d e la re iv in d ic a c ió n 12.
14. U n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a q u e c o m p re n d e el a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -10 , y un v e h íc u lo fa rm a c é u t ic a m e n te a c e p ta b le .
15. U n m é to d o in vitro p a ra a u m e n ta r lo s n iv e le s e x tra c e lu la re s d e p ro g ra n u lin a , d is m in u ir lo s n iv e le s d e s o r t i l in a e n la s u p e r f ic ie c e lu la r e n u n a o m á s c é lu la s , y /o d is m in u ir la e x p re s ió n en u n o o m á s m e d ia d o re s p ro in f la m a to r io s , o p c io n a lm e n te , en d o n d e e l u n o o m á s m e d ia d o re s p ro in f la m a to r io s s e s e le c c io n a n d e l g ru p o q u e c o n s is te en IL -6 , M 2 p 70 , IL 12 p 40 , IL -1 p , T N F -a , C X C L 1 , C C L 2 , C C L 3 , C C L 4 y C C L 5 , q u e c o m p re n d e p o n e r e n c o n ta c to u n a o m á s c é lu la s c o n e l a n t ic u e rp o a n ti s o r t i l in a d e u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -10.
16. U n a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 10, p a ra su u so en un m é to d o de p re v e n c ió n , re d u c c ió n d e l r ie s g o o tra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d , un t ra s to rn o o u n a le s ió n en un in d iv id u o q u e lo n e c e s ite , en d o n d e la e n fe rm e d a d , e l t ra s to rn o o la le s ió n s e s e le c c io n a n d e l g ru p o q u e c o n s is te en d e m e n c ia fro n to te m p o ra l, p a rá lis is s u p ra n u c le a r p ro g re s iv a , e n fe rm e d a d d e A lz h e im e r , d e m e n c ia v a s c u la r , c o n v u ls io n e s , d is tro f ia d e la re tin a , e s c le ro s is la te ra l a m io tró f ic a , le s ió n c e re b ra l p o r t ra u m a t is m o , u n a le s ió n d e la m é d u la e s p in a l, d e m e n c ia , a c c id e n te c e re b ro v a s c u la r , e n fe rm e d a d d e P a rk in s o n , e n c e fa lo m ie lit is a g u d a d is e m in a d a , d e g e n e ra c ió n de la re tin a , d e g e n e ra c ió n m a c u la r re la c io n a d a c o n la e d a d , g la u c o m a , e s c le ro s is m ú ltip le , c h o q u e s é p tic o , in fe c c ió n b a c te r ia n a , a r tr it is y a rtro s is .
17. U n a n t ic u e rp o d e a c u e rd o co n u n a c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 a 10, p a ra su u so en un m é to d o de tra ta m ie n to q u e c o m p re n d e in h ib ir u n a o m á s d e n e u ro in f la m a c ió n , a x o n o p a t ía c a ra c te r iz a d a p o r c re c im ie n to a x o n a l c o r to y ra m if ic a c ió n a b e rra n te , a c t iv a c ió n d e la m ic ro g lia y u n a re s p u e s ta in f la m a to r ia y /o p ro m o c ió n d e la c u ra c ió n d e h e r id a s .
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