KR20180030047A - 과인산화된 타우에 특이적인 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents
과인산화된 타우에 특이적인 항체 및 이의 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 병리학적인 과인산화된(PHF) 타우(tau) 상의 인산화된 세린 396 잔기(pS396)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 신규한 부류뿐만 아니라 알츠하이머병 및 타우병증의 치료에서 상기 분자 및 이의 타우 결합 단편을 이용하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 병리학적인 과인산화된(PHF) 타우(tau) 상의 인산화된 세린 396 잔기(pS396)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 신규한 부류뿐만 아니라 알츠하이머병 및 타우병증의 치료에서 상기 분자 및 이의 타우 결합 단편을 이용하는 방법에 관한 것이다.
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연령-관련 신경변성 질환, 예를 들어, 알츠하이머병(AD) 및 치매는 오늘날 가장 큰 사회적 난제 중 하나이다. 세계보건기구는 노인 돌봄 비용이 지속적으로 증가할 것이며, 진단 치매 사례의 수는 2050년까지 3배가 될 것으로 예측한다(World Health Organization and Alzheimer's Disease International - Status Report (2012) DEMENTIA: A public health priority, WHO). AD에 대한 첫번째 치료는 아세틸콜린 에스테라제 억제제 및 NMDA 조절제와 같은 신경전달물질 조절제였다. 이들 요법은 밀레니엄 전환기에 이용 가능해졌고, 여전히 치매 및 AD와 관련된 기억력 결핍의 증상 경감을 위한 초석을 이룬다. 그러나, 이들 약물은 AD의 근본 원인인 아밀로이드-β(Aβ) 펩티드 및 타우 단백질 응집체의 축적 및 신경 시냅스 및 결국에는 뉴런의 관련 손실을 표적으로 하지 않는다.
노인의 종단의 지역사회 차원의 연구(Weiner, M.W. et al. (2014) ADNI online: http://www.adni-info.org/; Breteler, M.M. et al. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 23-28; Launer, L.J. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 2-13)와 함께 대규모의 유전체 차원의 연관 연구(Lambert, J.C. et al. (2013) Nat. Genet. 45, 1452-1458)는 AD가 진행성 AD 환자의 10 퍼센트 이하가 아밀로이드 병리가 결여된 치매의 이종 혼합인 것을 밝혀냈다(Crary, J.F. et al. (2014) Acta Neuropathol. 128, 755-766). 또한, 브라악 및 브라악(Braak & Braak)에 의한 정액 병리학적 연구(Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12)는 부검 전에 신경섬유 매듭(neurofibrillary tangle) 병리의 정도와 인지 상태 사이에 명확한 상관 관계를 입증하였다. 이들 관찰은 여러 연구자(Nelson, P.T. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381), 및 타우 및 포스포-타우의 뇌척수액(CSF) 수준이 질병의 초기 및 후기 단계 전체에 걸쳐 증가하는 것을 나타내는 최근의 종단 바이오마커 연구(Jack, C.R., Jr. et al. (2013) Lancet Neurol. 12, 207-216)에 의해 강화되었다.
상기 기재된 바와 같이, 미세소관-관련 단백질인 타우 및 이의 과인산화된 형태는 AD의 주요 특징 중 하나인 세포내 신경섬유 매듭의 주성분을 이룬다. 또한, 타우의 특이적인 유전적 변형은 전두-측두엽 치매(FTD)의 가족형과 관련되어 있다. AD에서 타우 병리의 출현은 내후각 피질에서 시작하여 해마 및 피질 영역에서 후속되는 별개의 공간적 패턴으로 발생한다(Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12). 타우 병리의 특정 단계는 또한 인지 능력과도 잘 연관되어 있다(Nelson, P.T. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol. 71, 362-381; Braak, E. et al. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249 Suppl 3, 14-22). 종합하면, 이러한 증거는 AD에 대한 타우-기반 가설의 기초를 형성한다. 타우의 세포내 축적은 미세소관 변성 및 척수 붕괴로 이어지게 만든다. 결과적으로, 뉴런 사이의 소통이 오작동하고, 세포 사멸이 후속된다. 최근에, 타우 자체가 하나의 세포에서 다음 세포로 신경변성을 전달할 수 있는 엔도-병원성 종을 형성할 수 있음이 또한 밝혀졌다(Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913).
I. 엔도-병원체(
endo
-pathogen)로서의
타우
클라바게라(Clavaguera) 및 동료들은 타우 자체가 엔도-병원체로 작용할 수 있음을 입증하였다(Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol. 11, 909-913). 저회전 뇌 추출물이 P301S 타우 트랜스제닉 마우스로부터 분리되고(Allen, B. et al. (2002) J. Neurosci. 22, 9340-9351), 희석되고, 어린 ALZ17 마우스의 해마 및 피질 영역으로 주사되었다. ALZ17 마우스는 후기 병리만을 발달시키는 타우 트랜스제닉 마우스 계통이다(Probst, A. et al. (2000) Acta Neuropathol. 99, 469-481). 주사된 ALZ17 마우스는 신속하게 견고한 섬유모양 병리를 발달시켰고, P301S 마우스로부터의 면역-고갈된(immuno-depleted) 뇌 추출물 또는 야생형 마우스로부터의 추출물의 투여는 타우 병리를 유도하지 않았다. 가용성 타우(S1) 및 사르코실-불용성 타우(P3)에서의 뇌 추출물의 분획화(Sahara, N. et al. (2013) J. Alzheimer's. Dis. 33, 249-263) 및 ALZ17 마우스로의 이들의 주사는 P3 분획이 병리를 유도하는데 있어서 가장 적격인 것을 입증하였다. 이는 세포내 과인산화된 섬유모양 타우의 대부분을 함유한다. 병리의 대부분은 또한 야생형 마우스의 뇌로 P301S 추출물을 주사하는 경우에 유도될 수 있었으나, NFT는 형성되지 않았다. 후속 연구에서, 클라바게라 등(Clavaguera et al.)은 다른 타우병증(은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 및 피질기저핵 변성(CBD))의 사후 뇌 조직으로부터 추출된 인간 타우가 또한 ALZ17 모델에서 타우 병리를 유도할 수 있음을 밝혀냈다(Clavaguera, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 9535-9540). 이들 데이터의 발표 이후, 여러 다른 타우 시딩(seeding) 및 확산(spreading) 모델이 보고되었다(Ahmed, Z. et al. (2014) Acta Neuropathol. 127, 667-683; Walker, L.C. et al. (2013) JAMA Neurol. 70, 304-310). 이들 연구로부터의 주요 결론은 세포내 봉입체 내의 병원성 타우가 세포로부터 원형질막 주위 공간으로 분비되는 메커니즘을 제시한다. 병리학적 타우 물질은 이후 선행 및 역행 방향 둘 모두로 소포 집(vesicular sheath)을 따라 운반되고, 이어서 대량 세포내이입에 의해 이웃하는 세포에 의해 흡수된다. 이러한 메커니즘은 인간 질병에서 관찰되는 병리의 확산이 명백한 해부학적 패턴을 후속시키는 이유를 설명한다. 흥미롭게도, 병리학적 타우의 말초 투여는 ALZ17 마우스에서 타우 병리의 형성을 촉진시킬 수 있다(Clavaguera, F. et al. (2014) Acta Neuropathol. 127, 299-301). 이러한 확산 메커니즘은 다른 단백질병증에서의 질병 전파를 설명할 수 있다(Goedert, M. et al. (2010) Trends Neurosci. 33, 317-325; Sigurdsson, E.M. et al. (2002) Trends Mol. Med. 8, 411-413).
II.
타우
종
타우 단백질이 엔도-병원체로 작용할 수 있다는 발견은 잠재적 중재 요법에서 표적화될 수 있는 "병원성 종"에 대한 연구를 발생시켰다.
미세소관-관련 단백질 타우 유전자(MAPT)는 인간 유전체의 염색체 17에 위치하고 있으며, 성인 인간 뇌에서 타우 단백질의 6종의 아이소형(isoform)을 발현한다. 이들 아이소형은 MAPT 유전자 내의 16개의 엑손 중 엑손 2, 3 및 10의 선택적 스플라이싱으로부터 발생한다. 엑손 2 및 3은 29개의 아미노산 반복부를 발현하고, 엑손 10은 추가의 미세소관 결합 도메인을 발현한다. 결과로서, 타우 아이소형은 0, 1 또는 2개의 N-말단 반복부 및 3 또는 4개의 C-말단 미세소관 결합 도메인(3R 또는 4R 타우)을 함유할 것이다. 일반적으로, 타우의 6종의 아이소형이 발현된다. 가장 긴 아이소형(2N4R) 및 가장 짧은 아이소형(0N3R)은 각각 441 및 352개의 아미노산으로 구성된다(Kolarova, M. et al. (2012) Int. J. Alzheimers. Dis. 2012, 731526). 타우 (2N4R)의 N-말단 돌출 도메인은 44개 아미노산의 글리신-풍부 꼬리로 구성되며, 잔기 45 내지 102는 2개의 매우 산성인 영역(N1, N2-도메인)을 포함한다. 2개의 프롤린-풍부 영역이 잔기 151 내지 243에서 발견된다(P1, P2 도메인). 단백질의 나머지는 4개의 미세소관 결합 도메인(R1 내지 R4)에 이어서 짧은 C-말단 영역에 의해 구성된다.
타우는 매우 가용성이고, 매우 인산화되기 쉬운 단백질이다. 타우의 가장 긴 아이소형의 아미노산 잔기의 약 20% 또는 85개는 잠재적(Ser, Thr 또는 Tyr) 인산화 부위이다. 이들 중 대략 절반이 실험적으로 관찰되었고(Hanger, D.P. et al. (2009) Trends Mol. Med. 15, 112-119; Hasegawa, M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 17047-17054), 미세소관 결합 도메인의 말단 잔기 주위에 모여 있다. 타우는 세포 주기 동안 동적으로 인산화되고, 탈인산화된다. 이는 감수분열이 발생할 수 있도록 미세소관으로부터 분리되어야 한다. 유사분열 후 세포(분화된 뉴런)에서의 이의 주요 역할은 최적의 축삭 운반을 가능하게 하는 미세소관 안정화제로 작용하는 것이다. 이는 단지 대부분이 탈인산화된 형태의 미세소관과만 결합될 수 있으며, 따라서 인산화는 뉴런 내에서 직접적인 미세소관 결합/해리 스위치로 작용한다. 정상 조건하에서, 세포질 타우는 평균 2개의 인산화 부위를 함유한다. 쌍을 이룬 나선형 섬유모양 물질에서, 적어도 7 내지 8개의 부위가 인산화된다(Hanger, D.P. et al. (2009) Trends Mol. Med. 15, 112-119; Hasegawa, M. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 17047-17054). 과인산화된 쌍을 이룬 나선형 섬유모양 타우는 알츠하이머병의 주요 특징이며(Kosik et. al. (1986) PNAS, 86, 4044-4048), 인간 AD 뇌 물질의 면역-세포화학 분석에서 과인산화된 타우의 명백한 이동성 변화가 관찰된다.
타우 단백질의 준안정적 특성을 반영하는 x-선 결정학 또는 NMR 분광학과 같은 전통적인 구조 기술로는 타우 단백질을 연구하기가 어려웠다. 상기 연구는 주로 인산화되지 않은 단백질의 도메인 단편에 대해 수행되었다. NMR 분광학을 이용한 전장 타우(2N4R)에 대한 현재까지의 유일한 구조 연구는 상기 단백질이 안정한 이차 구조의 드문 스트레치(stretch)만을 함유하는 것을 나타낸다(Mukrasch, M.D. et al. (2009) PLoS. Biol. 7, e34). 이러한 분석은 펩티드 백본의 이차 구조가 β-시트 구조를 적응시키는 것에 대한 큰 경향성을 갖는 것을 나타낸다. 백본의 처음 200개의 잔기는 미세소관 결합 도메인을 포함하는 C-말단보다 상당히 더 정렬되어 있다. 용액 내에서 단백질 내의 많은 특정한 긴 범위의 상호작용의 존재는 상기 단백질이 크게 불규칙한 용융 구상 상태로 존재하는 것을 나타낸다(Ohgushi, M. and Wada, A. (1983) FEBS Lett. 164, 21-24).
특히 카스파제 및 칼파인에 의해 생성된 타우의 프로테아제 생성물(Asp13, Glu391 및 Asp421)이 매듭 물질에서 확인되었다(Gamblin, T.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10032-10037). 특히, Asp421에서의 트렁케이션은 자유 Asp421 말단에 결합하는 타우 C3 항체를 이용하여 상세히 연구되었다. 이러한 트렁케이션은 아폽토시스의 유도와 관련된 AD 발병기전에서 초기 사건으로 가정되었다(deCalignon A. et al. (2010) Nature 464, 1201-1204). Asp13에서의 N-말단 절단 및 Glu391에서의 C-말단 절단은 발병기전에서 후기 사건으로 간주된다(deCalignon A. et al. (2010) Nature 464, 1201-1204; Delobel, P. et al. (2008) Am. J. Pathol. 172, 123-131). 최근에, 추가 N-말단 단편(잔기 1 내지 224)이 AD 및 PSP 환자로부터의 CSF에서 확인되었고, 질병의 초기 마커이고 특히 병원성인 것으로 가정되었다(US14/092539; Bright, J. et al. (2014) Neurobiol. Ageing, 1-17). 유사한 칼파인 절단된 단편이 다른 그룹에 의해 보고되었다(Ferreira, A. and Bigio, E.H. (2011) Mol. Med. 17, 676-685; Reinecke, J.B. et al. (2011) PLoS. One. 6, e23865).
과인산화 및 타우 단편화와 별개로, 번역 후 아세틸화(Cohen, T.J. et al. (2011) Nat. Commun. 2, 252; Min, S.W. et al. (2010) Neuron 67, 953-966) 및 O-GlcNAcylation(Zhu, Y. et al. (2014) J. Biol. Chem.)가 AD와 관련된 매듭 병리의 형성에서 병리 규정 과정인 것으로 제안되었다.
III.
타우
면역요법
면역요법은 전통적으로 수동 및 능동 백신 접근법으로 구분된다. 능동 백신 접근법에서, 병원성 제제가 환자에게 주사되고, 선천 면역계가 면역 반응을 유도한다. 이는 투여된 항원에 대한 높은 친화성의 항체를 발생시키는 B-세포의 성숙을 촉발시킨다. 수동 백신 접근법에서, 선천 면역계의 촉발은 항원에 대한 특정 항체를 주입함으로써 회피된다. 이후, 고유한 청소 시스템이 항체 결합된 리간드를 제거한다.
AC 면역은 타우의 포스포-세린 409에 대한 마우스 모노클로날 항체를 추구한다. 항체는 인간 AD 및 대조군 뇌 조직에 대하여 윤곽이 잡히고, 매듭 병리를 인지하는 이들의 능력을 기초로 하여 선택되었다. 2개 항체의 인간화 형태 hACI-36-2B6-Ab1 및 hACI-36-3A8-Ab1 둘 모두는 아미노산 401 내지 418 내의 타우 에피토프에 결합한다(WO 2013/151762).
로저 니쉬(Roger Nitsch)의 그룹은 변성 타우병증의 징후가 없는 건강한 노인 개체로부터 타우 자가-항체를 분리하였다. 타우 특이적 항체를 찾기 위해 전장 재조합 인간 타우(2N4R)를 이용하여 다수의 항체가 분리되었다. 이후, 이들은 질병이 있는 개체 및 건강한 개체로부터의 타우 분리물을 구별하는 이들의 능력에 대해 스크리닝되었다. 3종의 선도 항체 4E4, 4A3 및 24B2가 특허 문헌(WO2012049570호; US2012087861호)에 기재되었다. 이들의 에피토프 맵핑은 모두 위치 V339 내지 K369의 미세소관 결합 영역 내의 아미노산 및 미세소관 결합 영역에 대한 C-말단의 아미노산을 인지하는 것을 나타낸다. 이들 항체는 어떠한 포스포-특이성도 나타내지 않는다.
C2N 진단학은 주로 신경변성 질병의 초기 검출을 위한 진단 도구 개발에 초점을 둔다. 항체가 전장 인간 및 마우스 타우 단백질에 대해 생성되었다. 인간 및 마우스 타우를 각각 인지하는 8종 및 5종의 항체가 확인되었다(Yanamandra, K. et al. (2013) Neuron 80, 402-414). 상이한 결합 동역학을 갖는 3종의 항체가 생체내 평가를 위해 선택되었다. 즉, HJ9.3, HJ9.4 및 HJ8.5는 타우 잔기 306 내지 320, 7 내지 13 및 25 내지 30을 각각 인지하며, HJ8.5는 인간 타우에 대해 특이적이다. 상기 항체는 또한 타우의 세포간 전파의 독창적인 기계적 리포터 검정에서 병리의 전달을 방지하는 이들의 능력을 기초로 하여 선택되었다(Sanders, D.W. et al. (2014) Neuron 82, 1271-1288; Kfoury, N. et al. (2012) J. Biol. Chem. 287, 19440-19451). P301S 트랜스제닉 마우스에서 만성 i.c.v. 주사 연구에서의 이들의 평가는 처리된 마우스의 면역-조직화학 분석에서 AT8 염색에 의해 결정된 바와 같이 과인산화된 타우 단백질의 수준을 감소시키는 이들의 능력을 입증하였다.
피터 데이비스(Peter Davies)의 항체는 원래 AD 및 대조군 뇌 물질에서 병리학적 타우와 정상 타우를 구별할 수 있는 진단 도구로서 개발되었다(Greenberg, S.G. and Davies, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 5827-5831). PHF1 및 MC1 항체의 치료적 유용성의 평가는 P301S 및 JPNL3(P301L)에서 입증되었다(Boutajangout, A. et al. (2011) J. Neurochem. 118, 658-667; Chai, X. et al. (2011) J. Biol. Chem. 286, 34457-34467; D'Abramo, C. et al. (2013) PLoS. One. 8, e62402 mice). PHF1은 선형 포스포-타우 에피토프(pS396, pS404)를 인지하는 반면, MC1은 선형 서열의 2개의 별개의 부분인 잔기 46 내지 202 내의 에피토프 및 잔기 312 내지 342 사이의 C-말단 에피토프를 필요로 하는 구조적 타우 에피토프를 인지하는 입체형태-의존적 항체이다(Jicha, G.A. et al. (1997) J. Neurosci. Res. 48, 128-132). 만성 12 내지 13주 면역화 연구에서 이들 2개 항체의 주사는 다른 뇌 영역 중에서 척수 및 뇌간 병리의 실질적 감소를 발생시켰고, 이는 이들 마우스에서 관찰된 운동 결손의 감쇠로 해석된다(D'Abramo, C. et al. (2013) PLoS. One. 8, e62402).
아이페리안 / 브리스톨 마이어스 스퀴브(iPerian / Bristol Meyers Squibb)는 유도된 다능성 줄기 세포 기반 신경세포 배양에서 과다활성을 촉진하는 타우의 N-말단 단편(etau: 잔기 1 내지 224)으로 구성된 가정된 병리학적 타우 종에 대한 타우 항체를 개발하였다. 항체의 포트폴리오가 개발되었으나, 특성규명은 잔기 9 내지 18 내의 N-말단 에피토프를 인지하는 항체 IPN001 및 IPN002에 집중되었다. 따라서, 이들 항체는 질병의 초기 징후일 수 있는 단계적 AD 및 PSP 환자로부터의 CSF에서의 상승된 타우 수준을 검출한다. JPNL3(P301L) 마우스에서의 항체의 생체내 주사는 진행성 운동 결손의 부분적 역전을 유발시켰다(US14/092539호).
에이나 시구르드손(Einar Sigurdsson)은 타우 기반 면역요법의 효능을 입증하기 위한 최초의 프로그램이었다. JPNL3(P301L) 마우스를 면역화시키기 위해 타우 펩티드 379 내지 408[pS396, pS404]로 구성된 활성 백신과 함께 Adju-Phos 애쥬번트가 사용되었다. 이러한 연구에서, 대조군 동물과 비교하는 경우 백신 처리된 마우스에서 타우 병리의 현저한 감소가 관찰되었다. 타우병증-관련 운동 표현형의 감쇠가 또한 검출되었다. 이의 효능은 돌연변이체 타우에 의해 유도되지 않은 다양한 마우스 모델(htau/PS1)에서 확인되었다(Boutajangout, A. et al. (2011) AAIC 2011 (7, issue 4, Supplement edn) p. s480-s431; Congdon, E.E. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288, 35452-35465; Gu, J. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288, 33081-33095).
프로테나(Prothena)는 K369I(K3) 트랜스제닉 타우 마우스 및 P301L 마우스 모델에서 3종의 타우 항체를 평가하였다. 다양한 특성을 갖는 항체가 생체내 평가를 위해 선택되었다. 상이한 아이소타입(isotype)을 갖는 2종의 pS404 항체(IgG1/k 및 IgG2a/k) 또는 전체(범) 항-타우 항체(IgG1/k)가 만성 패러다임으로 주사되었다. K369I 마우스는 3주령에서 시작하여 21주 동안 매주의 주사로 처리되었고, P301L 마우스는 4개월령에서 시작하여 매주의 주사로 7개월 동안 처리되었다. IgG2a/k pS404 항체를 이용하여 K3 마우스에서 타우 양성 신경섬유 봉입체의 감소가 관찰되었다. pS404 항체 모두는 pS422 양성 타우의 수준을 감소시킬 수 있었던 반면, 범-항-타우 항체 처리된 마우스에서 감소가 관찰되지 않았다. 이들 연구는 1) 타우 청소가 아이소타입-의존적일 수 있고, 2) 전체-항-타우 항체가 과인산화된 타우를 감소시킬 수 없으므로 질병과 관련된 타우 종을 표적화하는 것이 중요할 수 있음을 암시한다(PCT/US2014/025044호).
본 발명의 발명자는 놀랍게도 인산화된 타우 세린 잔기 396(pS396)에 특이적인 항체를 발견하였고, 이는 타우 상의 396 및 404 잔기 둘 모두에서 인산화되거나, 404 잔기에서만 인산화되거나, 다른 잔기에서 인산화된 타우 단백질을 주로 인지하는 종래 항체와 대조적이다.
본 발명자는 또한 인간 병리학적 타우에 대한 현저한 특이성 및 선택성을 갖는 항체를 개발하였다. 병원성 타우 단백질에 대해 매우 선택적이고 특이적인 항체가 필요하다. 본 발명의 항체는 WO2013/050567호의 항체(WO2013/050567호의 도 1 참조)와 비교하여 비-병리학적 타우에 비해 인간 병리학적 타우에 대한 훨씬 더 높은 정도의 특이성 및 선택성을 나타낸다. 특이적 결합을 갖는 것으로 보고된 WO2012/045882호의 항체는 타우 아미노산 393 내지 401, 396 내지 401, 394 내지 400 및 393 내지 400의 6 내지 9개 잔기의 아미노산 서열로부터 유도되었다. 이는 본원에 기재된 바와 같이 더 긴 아미노산 서열을 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 대해 유도된 본 발명의 항체와 대조적이다.
실시예에 제시된 바와 같이, hACI-2B6(WO2013151762호에 기재됨); IPN002(WO 2014028777호에 기재됨); HJ8.5(WO 2014008404호에 기재됨); 항-타우 pS422 모노클로날 항체 2.10.3(US8609097호에 기재됨); PHF13(마우스, 래트 및 인간 기원의 Ser 396에서 인산화된 타우의 검출에 권장되고, 문헌[Sankaranarayanan (PLOSONE, DOI:10.1371/journal.pone.0125614 May 1, 2015 및 Otvos (Biochemistry 1997, 36, 8114-8124)]에 논의된 상업적으로 이용 가능한 항체(예를 들어, SigmaAldrich)); 및 4E4 항체(US8940272에서 V339, E342, D387, E391 및 K395에 결합하는 것으로 기재됨)의 5종의 공개된 타우 항체와의 비교는 본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편이 비교기 항체 중 어느 것보다 인간 병리학적 타우에 대한 높은 정도의 특이성 및 선택성을 나타내는 것을 제시하였다.
또한, 본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 많은 이로운 특징, 예를 들어, 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력, 및 특히 알츠하이머(AD) 병리와 관련된 타우에 결합하는 능력을 나타낸다. 전기생리학적 연구에서, 본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 감소된 쌍을 이룬 펄스 촉진 및 자발적인 소형 흥분성 시냅스 전류(mEPSC)를 추가로 역전시킬 수 있었다.
본 발명은 인간(2N4R 아이소형) 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 세린 396에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 및 이의 에피토프-결합 단편, 및 상기 특이적 분리 및 회수를 가능하게 하는 새로운 방법을 이용하여 생성된 상기 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 인산화된 잔기 396과 404 사이를 구별하여, 이들이 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합하지 않는 이들의 능력을 추가 특징으로 한다.
특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자로부터의 증거는 잔기 404에서 인산화되었으나, 396에서는 인산화되지 않은 타우 단백질의 존재하에서의 잔기 396에서 인산화된 인간 타우 단백질에 대한 본 발명의 항체의 구별성 및 선택성은 병리적 및 치료적 관점에서 유의한 것임을 입증한다. 본 발명의 항체는 비-병원성이나, 인산화된 타우의 존재하에서 병리학적 타우에 대해 선택적이다. 본 발명의 항체는 정상 타우의 존재하에서 병리학적 타우의 타우 매듭을 고갈시킬 수 있다. 특정 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 타우 위치 396에서 인산화된 타우 단백질을 포함하는 타우의 매듭을 고갈시키는 것은 병리학적 타우의 타우 매듭으로의 시딩을 방지하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 상기 분자가 타우 위치 404에서 인산화된 타우 단백질의 존재하에 있는 경우에도 396-인산화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 관련 양태는 상기 분자가 비-병리학적 타우의 존재하에 있는 경우에도 396-인산화된 타우에 선택적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다. 추가로 정의하면, 본 발명은 병리학적 타우에 대해 선택적인 항체에 관한 것으로, 상기 병리학적 타우는 타우의 인간 2N4R 아이소형을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 64 kDa 밴드(웨스턴 블롯 분석에 의함)로 나타나는 과인산화된 타우이다.
본 발명의 일 양태는 i) 항체가 인산화되지 않은 타우에 결합하지 않고; ii) 항체가 404에서 인산화되고, 396에서 인산화되지 않은 타우에 결합하지 않고; iii) 항체가 396에서 인산화된 타우에 결합하고; iv) 항체가 396 및 404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합한다는 시험 기준을 충족시키는 항-타우 항체에 관한 것이다. 본 발명자는 시험 기준 iii) 및 iv) 하에서의 결합이 동일한 정도의 크기인 것을 발견하였고, 위치 404에서의 인산화가 결합 과정을 간섭하거나 향상시키지 않는 것을 가정한다. 본 발명자는 시험 기준 ii)와 반대로 396에서 인산화되지 않았지만 404에서 인산화된 타우 단백질에 대한 결합이 시험 모델에서 매듭을 고갈시키지 않거나 병리학적 타우를 제거하지 않는 것을 추가로 발견하였다.
본 발명의 일 양태는 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 이하만큼 감소시키는 항-타우 항체에 관한 것이다. 본 발명의 추가 양태는 과인산화된 타우 64 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 이하만큼 감소시키거나; 본원에 기재된 바와 같이 인간 AD 사후 뇌로부터의 추출물과 함께 사용되는 경우 인산화된 S396 과인산화 타우 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 과인산화되지 않은 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력을 갖는 항-타우 항체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 매듭을 고갈시키거나 상기 매듭의 진행을 감쇠시키는 단계를 포함하는 타우병증, 예를 들어, 알츠하이머병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 매듭은 과인산화된 타우를 포함하며, 상기 방법은 과인산화된 타우와 본 발명의 항체를 접촉시켜 매듭이 고갈되거나, 매듭에서의 과인산화된 타우의 함량이 감소되거나, 매듭 형성의 진행이 감쇠되도록 하는 단계를 포함한다.
대안적으로 정의하면, 본 발명은 타우병증, 예를 들어, 알츠하이머병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 매듭과 인산화된 잔기 396을 갖는 타우에 선택적인 항체를 접촉시켜, 과인산화된 타우의 매듭을 고갈시키는 단계를 포함한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 4종의 모노클로날 항체 중 어느 하나에 관한 것이다:
항체 C5.2
여기서, 항체 C5.2는 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
항체 C8.3
여기서, 항체 C8.3는 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
항체 C10-2
여기서, 항체 C10-2는 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3;
및
항체 D1.2
여기서, 항체 D1.2는 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
예시적 항체 C5.2의 완전한 경쇄 및 중쇄(그 안에 불변 도메인을 포함함)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:24(실시예에서 사용되는 바와 같음)에 제시된다.
예시적 항체 C8.3의 완전한 경쇄 및 중쇄(그 안에 불변 도메인을 포함함)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32(실시예에서 사용되는 바와 같음)에 제시된다.
관심 항체 C10-2의 완전한 경쇄 및 중쇄(그 안에 불변 도메인을 포함함)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16(실시예에서 사용되는 바와 같음)에 제시된다. 인간화 C10-2 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:35에 제시된다. 인간화 C10-2 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36에 제시된다. 본 발명의 일 양태는 SEQ ID NO:35 또는 SEQ ID NO:36, 또는 둘 모두를 포함하는 본 발명의 항체에 관한 것이다.
예시적 항체 D1.2의 완전한 경쇄 및 중쇄(그 안에 불변 도메인을 포함함)의 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8(실시예에서 사용되는 바와 같음)에 제시된다.
대안적 구현예에서, 항체 D1.2는 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 포함하며, 여기서 위치 3의 아미노산은 발린(반면에 SEQ ID NO:7의 예시적 경쇄에서, 상기 아미노산은 메티오닌임)이다. 이러한 경쇄는 상기 기재된 바와 같은 중쇄, 즉, SEQ ID NO:4 , 5 및 6의 CDR을 갖는 중쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 예를 들어, 항체는 SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 경쇄와 함께 SEQ ID NO:8의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함할 수 있다(항체 "D1.2*").
본 발명의 일 양태는 하기를 포함하는 항체에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
본 발명의 추가 양태는 하기를 포함하거나, 하기를 추가로 포함하는 항체에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 타우병증, 예를 들어, 알츠하이머병(AD), 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저핵 변성(CBD), TBI(외상성 뇌 손상, 경증, 급성 또는 만성) 및 만성 외상성 뇌병증(CTE)을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 또한 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
도 1: 병리학적 물질 도트 - 블롯에 대한 결합
도 1(패널 A 및 패널 B)은 병리학적 타우의 검출을 평가하기 위해 1 ㎍/㎖의 D1.2 또는 C10-2로 탐지된 AD 환자(AD) 및 나이든 건강한 개체(con)의 뇌 또는 32주령의 rTg4510 및 비-트랜스제닉(wt) 한배새끼(littermate)로부터 유래된 500 ng의 S1 및 P3 분획(S1 및 P3 분획의 생성은 실시예 3에 개시됨)을 제시하는 도트 블롯 분석의 결과를 제공한다(실시예 3). 도트 블롯은 D1.2(패널 A) 또는 C10-2(패널 B)가 트랜스제닉 마우스(Tg4510)에서 발현된 바와 같은 AD 환자 또는 인간(P301L) 타우로부터의 질병 물질에 대해 특이적으로 반응하는 것을 제시한다.
도 2: D1.2 및 C10-2 항체의 웨스턴 블롯 분석
도 2(패널 A 및 패널 B)는 1 ㎍/㎖의 D1.2(패널 A) 또는 C10-2(패널 B)로 탐지된 32주령의 rTg4510 및 비-트랜스제닉(wt) 한배새끼의 뇌로부터 유래된 2 ㎍의 S1 및 P3 분획 또는 AD 환자(AD) 및 나이든 건강한 개체(con)로부터의 뇌로부터 유래된 20 ㎍의 S1 및 P3 분획을 제시하는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 제공한다. S1 및 P3 분획은 1:50(조직 중량을 기준으로 함)의 비율로 로딩되었고, 이는 0.01 ㎎의 조직으로부터 유래되었다. 웨스턴 블롯에서, 정상 P301L 돌연변이체 인간 4R0N 타우는 55 kDa에 제시되는 반면, 과인산화된 P301L 돌연변이체 인간 4R0N 타우 종은 64 및 70 kDa에 제시된다. AD로부터의 P3 분획에서, 과인산화된 타우는 54, 64, 69 및 74 kDa에서 제시된다(실시예 3). 상기 도면은 항체가 과인산화된 이동성 변화된 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 예시한다.
도 3: MSD에서의 병리학적 P3 물질에 대한 결합
도 3(패널 A 내지 패널 D)은 인간 AD 및 병에 걸리지 않은 대조군 뇌로부터 분리된 타우에 대한 D1.2(패널 A), C5-2(패널 B), C10-2(패널 C) 및 C8-3(패널 D)의 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD) ELISA 결합의 결과를 제공한다(실시예 4). 도 1에서 입증된 바와 유사하게, 본 발명의 항체가 병리학적 타우 종에 특이적으로 결합하는 것을 입증하기 위해 질병(AD) 및 건강한 대조군 뇌로부터 분리된 뇌의 ELISA 플레이트 상의 고정이 이용될 수 있다. 항체 농도 증가는 포화 결합을 유발시킨다. 결합된 항체의 양은 이차 항-마우스 항체로 검출된다.
도 4: 펩티드 친화성 및 pS396 선택성(펩티드 결합)
도 4(패널 A 내지 패널 D)는 위치 S396 및 S404에서의 인산화의 모든 조합을 갖는 타우(386 내지 409) 펩티드에 대한 C10-2(패널 A) 및 D1.2(패널 B)의 특이적 결합의 분석 결과를 제공한다(실시예 5). 인간의 병리학적 물질에 대한 특이적 친화성은 평가하기 어려우며, 이러한 이유로, 본 발명자는 특정 인산화 펩티드 및 비-인산화 펩티드를 이용하여 정확한 에피토프 친화성을 결정하기 위해 특정 펩티드 결합을 이용한다. 잔기 Ser396 및 Ser404에서 인산화된 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)(pS396/pS404)에 대한 항체 C10-2(패널 C) 및 D1.2(패널 D)의 결합에 대한 특이적인 용량 반응 곡선이 제시된다. 비-인산화 펩티드(NP) 및 일-인산화 펩티드(pS396 및 pS404)를 이용하여 경쟁 결합이 수행되었다. 또한, 인산화된 세린 262에 상응하는 대조군 펩티드가 포함되었다. 경쟁 결합은 모든 결합이 인산화된 396 세린 잔기를 통해 획득되는 것을 입증한다. 추가로, 데이터는 잔기 404에서의 인산화가 인-세린 396에서의 항체의 결합을 간섭하지 않음을 입증한다.
도 5: 병리 특이적 항체의 조직학적 특성규명
도 5, 패널 A는 C10-2(좌측 컬럼) 및 D1.2(우측 컬럼) 항체가 Tg4510(상단 열) 세포체 및 신경그물 내의 p-타우 종에 결합하는 것을 제시한다. 면역반응성은 비-Tg 뇌 섹션(하단 열)에서 검출되지 않는다. 도 5, 패널 B는 C10-2(좌측 컬럼) 및 D1.2(우측 컬럼) 항체가 AD 공여자(AD)(상단 열)의 세포체 및 신경그물실 내의 p-타우 종에 결합하는 것을 제시한다. 대조군 공여자 뇌는 면역반응성이 결여되어 있다(하단 열)(실시예 6).
도 6: C10-2 및 참조 항체에 대한 병리학적 및 비-병리학적 P3에 대한 결합
도 6(패널 A 내지 패널 E)은 종래 항체 2-10-3(패널 A), HACI-2B6(패널 B), IPN 002(패널 D), 및 HJ8.5(패널 E)에 비해 병리학적 물질을 인지하는데 있어서 본 발명의 항체 C10-2(패널 C)의 우수성을 입증하는 결과를 제공한다. 상기 도면은 P301L 돌연변이체 인간 타우를 발현하는 10개월령의 Tg4510 마우스로부터의 타우에 대한 결합과 함께 건강한(대조군) 인간 및 질병이 있는(AD) 인간 뇌로부터의 타우에 대한 C10-2의 특이적 결합을 제시한다. 증가하는 농도의 항체가 ELISA 플레이트 상에 고정된 P3 타우 물질에 첨가된다. 병리학적 타우에 대한 선택성의 비율은 활성 종을 이용한 완전한 포화 상태에서 결정된다. 종래 항체 각각에 대한 선택성 배수가 도면에 제시된다(실시예 7).
도 7: HEK293 세포 및 시험관내에서의 시딩의 방지
도 7(패널 A 내지 패널 C)은 Cisbio 검정에 의한 타우 응집의 정량화를 제공한다. 시딩된 pcDNA HEK293 세포는 신호를 나타내지 않았고, 이는 투입 시딩 물질에 대한 검출의 부재를 확증한다. Wt(야생형) 시딩 물질(WW)은 시딩을 나타내지 않았으나, 대조적으로 rTg4510 균질액(CC)은 비시딩에 비해 효율적으로 시딩되었다. 이러한 시딩 효과는 HEL을 이용한 처리에 영향을 받지 않았지만, 타우 항체(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)를 이용한 처리에 의해 부분적으로 역전되었다. 그래프(패널 A 내지 패널 C)는 3개의 독립적 세트의 샘플을 제공하며, 상대 타우 응집(전체 단백질로 표준화된 백그라운드에 비한 신호 배수)으로 작도된다(실시예 8).
도 8: 전기생리학적 결손의 역전
도 8은 대조군으로서의 tTa 마우스와 함께 Tg4510 마우스에서의 C10-2를 이용한 CA1 아만성 처리에서 유발된 장 전위를 예시하는 CA1 유발된 장 전위(field potential)(C10-2, 패널 A; D1.2, 패널 B)에서의 쌍을 이룬 펄스 촉진(패널 B 및 패널 D) 및 기초 시냅스 전달(패널 A 및 패널 C) 결손의 항체 역전을 제시한다. 동물은 2주 동안 15 ㎎/㎏ 용량의 항체로 매주 2회 처리되었다(실시예 9 참조). 패널 A(C10-2에 대한 것임) 및 패널 C(D1.2에 대한 것임)에서, 장 전위(fEPSP) 기울기가 자극 강도에 대해 작도된다. 패널 A 및 패널 C는 4.5 내지 5.5개월령의 rTg4510(아래 2 곡선) 및 tTA(위 2 곡선) 대조군 마우스에서 해마의 CA1 영역에서의 시냅스 전달 및 가소성의 생체내 전기생리학적 평가에서, i) 기본 시냅스 전달이 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 손상되며, ii) 쌍을 이룬 펄스 촉진이 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 감소되는 것을 예시한다.
시냅스전 메커니즘에 의존하는 것으로 생각되는 단기 시냅스 가소성인 쌍을 이룬 펄스 촉진이 rTg4510 및 tTA 마우스(C10-2에 대해 패널 B 및 D1.2에 대해 패널 D)에서 추가로 측정되었다. 간단히 말하자면, 25 내지 1000 ms의 다양한 자극간 간격(ISI)을 가진 한 쌍의 자극이 샤퍼 곁가지(Schaffer collateral)에 적용되었고, 두번째 fEPSP의 기울기가 첫번째 fEPSP의 기울기와 비교되었다. 모든 ISI에서 촉진이 관찰되었고, 50 및 75 ms의 ISI에서 최대 촉진이 있었다. 흥미롭게도, tTA 마우스(처음 2 막대)와 비교하는 경우 rTg4510 마우스(두번째 2 막대)에서 유의하게 낮은 PPF가 관찰되었다.
도 9: 도 1 내지 도 8에 설명된 스크리닝의 개관
2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 이-인산화 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)에 대해 항체가 생성되었다. 포스포-에피토프 S396 및/또는 S404 중 어느 하나에 대해 매우 특이적이고, 동시에 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우를 특이적으로 인지하는 클론을 분리하기 위해 도트-블롯 및 고정된 인간 병리학적 및 비-병리학적 타우를 이용한 MSD ELISA(실시예 4)를 이용하여 하이브리도마가 스크리닝된다. 도트-블롯 및 웨스턴 블롯에서 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력이 하이브리도마의 선택을 위해 이용된다. 16종의 클론이 선택되었고, 이중 4종의 클론(D1.2, C10-2, C5.2 및 C8.3)이 인간 병리학적 물질로의 결합에 대해 탁월한 능력을 나타낸다. 특정 면역화 및 스크리닝 프로토콜의 이용은 매우 포스포-세린-396(pS396) 특이적인 항체를 생성시킨다.
도 10: 잔기 pSer396은 mAb C5.2의 항원 결합 부위의 중심에 결합된다 .
1.9Å 해상도의 포스포-펩티드 386 내지 410과의 복합체 내 mAb C5.2의 결정 구조. 이러한 구조에서, 잔기 392 내지 398의 전자 밀도가 결정된다. 잔기 {p}Ser396은 mAb C5.2의 항원 결합 부위의 중심에 결합된다. 항-타우 mAb의 이러한 구조 연구에서, 에피토프는 중쇄(하단 우측) 및 경쇄(하단 좌측) 전체에 걸쳐 결합된다.
도 11: 포스포세린 타우 (292 내지 298) 펩티드와의 항체 C5.2 상호작용
도 11은 항체 C5.2와 포스포세린 타우(292 내지 298) 펩티드 사이의 상호작용을 제공한다. Ile(392)-VAL(393)-Tyr(394)-Lys(395)-P-Ser(396)-Pro(397)-Val(398)의 구조가 제시된다. 주요 상호작용은 타우 펩티드의 L3:H3, L3:F8*, H1:H13, H2:Y1, H2:Y3 및 Y(394)에 의해 형성된 소수성 포켓을 포함한다. 용매화된 {p}S(396)과 L3:T4, H1:R10, H1:T11, H3:R1, H3:T3 사이에서 형성된 광범위한 수소 결합 네트워크가 존재한다. 사용된 명명법에서, 첫번째 문자(예를 들어, L3:H3의 "L")는 관련된 CDR 잔기가 경쇄 CDR인지 또는 중쇄 CDR인지의 여부를 나타내고, 첫번째 숫자는 상기 사슬의 어떠한 CDR이 관련된 것인지 나타내고(예를 들어, "L3"는 경쇄의 CDR3를 나타냄), 나머지 용어(예를 들어, L3:H3의 "H3")는 관련된 아미노산의 이름 및 위치를 나타내고(예를 들어, "H3"는 CDR의 세번째 잔기 위치의 히스티딘을 나타냄); 따라서 "L3:H3"는 경쇄 CDR3의 세번째 위치의 히스티딘 잔기를 나타낸다. Y(394) 측쇄와 백본 사이에는 강한 수소 결합 및 전하/극성 상호작용이 존재하며, {p}S396 형태의 포스포네이트는 펩티드 백본 안쪽에 구부려져 있다. (*) L3:F8은 CDR L3의 C-말단 측접 프레임워크 잔기이다.
C5.2의 CDR 서열은 하기와 같다:
도 12: 시딩 검정을 위한 타우의 고갈( HEK293 )
도 12(패널 A 및 패널 B)는 뮤린 C10-2(mC10-2) 및 인간화 C10-2(hC10-2)를 이용한 rTg4510 뇌 균질액의 면역-고갈을 제시한다. 고갈된 균질액의 웨스턴 블롯이 E1(전체 타우; 패널 A; 아래)) 및 C10-2(pS396 타우; 패널 A; 위)로 검출되었고, mC10-2 및 hC10-2 둘 모두가 과인산화된 타우를 효율적으로 고갈시켰다(E1 블롯에 대해 윗 밴드 및 C10-2 블롯에 대해 모든 밴드). 고갈된 균질액이 또한 Cisbio 검정을 이용하여 응집된 타우의 고갈에 대해 분석되었다. 패널 B는 샘플 내에서의 응집된 타우의 변화를 제시한다. mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈 연구는 타우 응집체를 각각 99 및 99.5%만큼 제거하였다(패널 B).
도 13: 고갈된 물질을 이용한 시딩 검정( HEK293 )
패널 A 내지 패널 C는 HEK293 세포에서 P301L-hTau를 시딩하기 위해 사용된 고갈된 균질액을 제시한다. 전체 세포 용해질에 대한 Cisbio 응집 검정 또는 1% 트리톤-X에서의 HEK293 세포의 분획화(불용성의 과인산화된 D1.2 및 타우의 정량화(패널 A, 위 및 아래))에 의해 측정시 대조군 동물로부터의 균질액(WW)은 시딩되지 않은 반면, rTg4510 균질액(CC)은 효율적으로 시딩되었다. HEL 및 hHEL 항체를 이용한 고갈은 시딩에 영항을 미치지 않은 반면, mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈은 타우 응집을 88% 및 96%(패널 C) 및 불용성 타우를 97% 및 100%(패널 B)로 각각 방지하였다.
도 14: 면역 고갈 rTg4510 물질(생체내 시딩 연구에 사용됨)
패널 A 내지 패널 C는 면역-고갈된 rTg4510 뇌 추출물의 웨스턴 블롯(패널 A; 위, 아래) 분석을 나타낸다. C10-2 및 D1.2는 인간 과인산화 64 kDa 밴드를 90%만큼 특이적으로 감소시키고, 55 kDa 타우 Tau5에 대해서는 영향을 미치지 않으며, 대조적으로 상업적인 전체 타우 항체는 정상 55 kDa 타우를 74%만큼 감소시키고, 인간 64 kDa 타우에 대해서는 영향을 미치지 않는다(패널 B 및 패널 C).
도 15: 면역 고갈 AD 물질(생체내 시딩 연구에 사용됨)
도 15(패널 A 내지 패널 C)는 면역-고갈된 알츠하이머 뇌 추출물의 웨스턴 블롯(패널 A) 분석을 도시한다. C10-2 및 D1.2를 이용한 면역-고갈은 전체 타우 수준을 10% 초과로 감소시키지 않지만, 과인산화된 타우를 특이적으로 낮춘다(90% 감소)(패널 B 및 패널 C).
도 16(패널 A): 면역 고갈된 rTg4510 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 타우 병리
도 16(패널 A)은 rTg4510 또는 AD 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화를 예시한다. 시딩 전, 과인산화된 타우는 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
도 16(패널 B): 면역 고갈된 AD 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리
도 16(패널 B)은 rTg4510 (A) 또는 AD (B) 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화를 예시한다. 시딩 전, 과인산화된 타우는 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
도 17: D1.2로 처리된 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리
도 17은 시딩된 rTg4510 마우스의 해마에서의 매듭 함유 뉴런의 정량화를 도시한다. 병리는 시간에 따라 증가한다(Ig G, 1개월; IgG 2개월; IgG 3개월). 그러나, D1.2로 마우스를 처리하면, 병리는 시딩 후 1, 2 및 3개월에 유의하게 낮아진다. (D1.2 1개월; D1.2 2개월; D1.2 3개월).
도 18: 시딩 검정을 위한 타우의 고갈( HEK293 )
패널 A는 뮤린 C10-2(mC10-2) 및 인간화 C10-2(hC10-2)를 이용한 rTg4510 뇌 균질액의 면역-고갈을 제시한다. 고갈된 균질액의 웨스턴 블롯이 E1(전체 타우) 및 C10-2(pS396 타우)로 검출되었고, mC10-2 및 hC10-2 둘 모두가 과인산화된 타우를 효율적으로 고갈시켰다(E1 블롯에 대해 윗 밴드 및 C10-2 블롯에 대해 모든 밴드). 고갈된 균질액이 Cisbio 검정을 이용하여 응집된 타우의 고갈에 대해 분석되었다. 패널 B는 mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈이 타우 응집체를 각각 99 및 99.5% 제거한 것을 제시한다.
도 19: 고갈된 물질을 이용한 시딩 검정( HEK293 )
패널 A는 불용성 분획에 대한 타우 분획화(웨스턴)를 제시한다. 패널 B는 웨스턴 블롯 정량화를 제시한다. 패널 C는 세포 용해질에서의 응집된 타우를 제시한다. 고갈된 균질액은 HEK293 세포에서 P301L-hTau를 시딩하기 위해 사용되었다. 전체 세포 용해질에 대한 Cisbio 응집 검정 또는 1% 트리톤-X에서의 HEK293 세포의 분획화(불용성의 과인산화된 D1.2 + 타우의 정량화)에 의해 측정시 대조군 동물로부터의 균질액(WW)은 시딩되지 않은 반면, rTg4510 균질액(CC)은 효율적으로 시딩되었다. HEL 및 hHEL 항체를 이용한 고갈은 시딩에 영항을 미치지 않은 반면, mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈(패널 C)은 타우 응집을 88% 및 96% 및 불용성 타우를 97% 및 100%(패널 B)만큼 각각 방지하였다.
도 20: 정상 타우에 비한 과인산화된 타우에 대한 C10-2 및 D1.2의 면역선택성.
생체내 시딩 연구를 위해 사용된 면역 고갈 rTg4510 물질: 패널 A는 면역-고갈된 rTg4510 뇌 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 제시한다. 패널 B는 C10-2 및 D1.2가 유의한 양의 p396을 포함하지 않는 타우 55 kDa 밴드에 비해 세린 396에서 인산화된 과인산화된 64 kDa 밴드를 특이적으로 감소시키는 것을 제시한다. 대조적으로, 상업적 전체 타우 항체인 Tau5는 정상 55 kDa 타우를 감소시키며, 64 kDa 타우에 결합하는데 비효율적이다.
도 21: 정상 타우에 비한 과인산화된 타우에 대한 C10-2 및 D1.2의 면역선택성.
생체내 시딩 연구를 위해 사용된 면역 고갈 AD 물질: 패널 A는 면역-고갈된 알츠하이머 뇌 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 제시한다. mC10-2 및 D1.2를 이용한 면역-고갈은 전체 타우 수준을 10% 초과로 감소시키지 않지만(패널 B), 과인산화된 타우를 특이적으로 낮춘다(90% 감소)(패널 C).
도 22: rTg4510 마우스에서의 해마 타우 병리
패널 A는 면역 고갈된 rTg4510 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 타우 병리를 제시한다. 패널 B는 면역 고갈된 AD 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리를 제시한다. rTg4510 (A) 또는 AD (B) 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화. 시딩 전, 과인산화된 타우는 항체 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
도 23: D1.2로 처리된 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리
시딩된 rTg4510 마우스의 해마에서의 매듭 함유 뉴런의 정량화. 상기 도면은 병리가 시간에 따라 증가하고, 마우스를 D1.2로 처리함으로써, 병리가 시딩 후 2 및 3개월에 유의하게 낮아지는 것을 제시한다.
도 24: 면역-고갈된 인간 AD 추출물의 웨스턴 블롯 분석
상기 도면은 C10-2의 인간화 형태(hC10-2)뿐만 아니라 mC10-2가 2.10.3(P-S422) 항체와 상이하며, 나머지 전체 타우는 2.10.3과 극적으로 상이하지 않지만(좌측 패널), C10-2(hC10-2)뿐만 아니라 mC10-2는 면역 고갈 방법에 의해 알츠하이머 뇌 추출물에 존재하는 과인산화된 타우 단백질을 더 많이 제거하는 것을 예시한다. 이는 정량화에 의해 도 25에서 확인된다.
도 25: 면역 고갈 후의 응집된 타우의 정량화
hC10-2 및 mC10-2 항체는 면역 고갈 방법에 의해 알츠하이머 뇌 추출물에 존재하는 응집된 타우 단백질을 더 많이 제거하는 이의 능력에 있어서 2.10.3 항체와 상이하다.
도 26: 면역 고갈 후에 남아있는 전체 타우
상이한 양의 인간화된 C10-2(▲) 및 2.10.3 항체(◆)를 이용한 알츠하이머 추출물을 면역 고갈시킨 후의 웨스턴 블롯 신호의 정량화. 도 26에서, Tau5를 이용한 전체 타우 신호의 정량화(모든 타우 아이소형이 분석에 포함됨)가 제시된다. 둘 모두의 항체는 알츠하이머 뇌 제조물로부터 적은 분획의 타우를 제거한다. P-S422 타우에 대한 특이성을 갖도록 설계된 2.10.3은 전체 타우량의 24%까지 제거하는 반면, C10-2는 전체 타우의 15%까지 제거한다(도 26 참조).
도 27: 과인산화된 타우의 면역고갈 후에 남아있는 전체 타우
도 27은 세린 422에서 인산화되는 과인산화된 타우의 정량화를 예시한다(모든 밴드 및 고분자량의 도말표본이 분석에 포함됨). 2.10.3(▲) 및 C10-2(◆) 둘 모두는 세린 422에서 인산화된 타우의 90% 초과를 제거한다. 그러나, 타우의 50%를 제거하는데 필요한 항체의 양은 상이하며, 항체 2.10.3에 대해서는 0.42 ㎍의 항체가 필요한 반면, C10-2에 대해서는 동일 효과를 위해 0.27 ㎍이 필요하다.
도 28: 과인산화된 타우의 면역고갈 후에 남아있는 전체 타우
세린 396에서 인산화되는 과인산화된 타우의 정량화(모든 밴드 및 고분자량의 도말표본이 분석에 포함됨). C10-2(◆)는 세린 396에서 인산화되는 타우를 효율적으로 제거한다(최대 효과: 88%, 0.30 ㎍ 항체를 사용하여 효과의 절반에 도달함). 2.10.3(▲)은 세린 396에서 인산화되는 타우의 적은 분획을 제거한다(최대 효과: 60%, 0.63 ㎍ 항체를 사용하여 효과의 절반에 도달함). 이는 세린 422에서 인산화되는 모든 타우가 또한 세린 396에서 인산화되나, 위치 422에서 인산화된 세린이 존재하지 않는 세린 396에서 인산화되는 과인산화된 타우의 일부가 존재하는 것을 나타낸다.
도 29: 과인산화된 타우의 면역고갈 후에 남아있는 전체 타우
세린 199/202에서 인산화되는 과인산화된 타우의 정량화(모든 밴드 및 고분자량의 도말표본이 분석에 포함됨). C10-2(◆)에 의해 제거되는 타우의 대부분은 또한 세린 199/202에서 인산화되는데, 이는 상기 인산화를 갖는 타우의 69%가 면역고갈에 의해 영향을 받기 때문이다(0.34 ㎍ 항체를 이용하는 경우 효과의 절반). 2.10.3(▲) 면역고갈은 P-S199/202 타우에 대해 S자형 용량 반응을 발생시키지 않지만, 증가하는 양의 항체로 신호에서의 저하가 관찰된다(최대량의 항체(5 ㎍)를 이용하는 경우 최대 52% 감소). 이러한 데이터는 인산화된 세린 396을 표적으로 하는 C10-2 항체가 422 위치에서 인산화된 세린을 표적으로 하는 2.10.3 항체보다 더 큰 풀(pool)의 과인산화된 타우에 결합하는 것을 나타낸다.
도 30: mC10 -2 코팅된 플레이트에서의 타우 항원 포획의 mD1 .2 및 mC10 - 2 억 제
유체상 ELISA에서, rTg4510 P3 제조물 및 다양한 양의 C10-2 또는 D1.2 항체의 혼합물이 C10-2 코팅된 플레이트에 첨가된다. 용액에서 P3 타우에 결합하는 항체가 많을수록, 플레이트에 결합할 수 있는 타우 에피토프가 덜 이용 가능하다. 플레이트에 결합하는 타우의 양은 설포-태깅된 인간 타우 항체에 의해 결정된다. C10-2(▲) 및 D1.2(□)는 용액 중의 타우에 대한 상이한 결합을 가지며, C10-2는 플레이트에 대한 모든 결합과 경쟁할 수 있다(IC50 20 nM). 다른 한편으로, D1.2는 용액 중의 타우에 대한 매우 낮은 수준의 결합을 나타낸다.
도 31: mC10 -2 코팅된 플레이트에서의 타우 항원 포획의 PHF13 및 mC10 -2 억제
유체상 ELISA에서, AD P3 제조물 및 다양한 양의 C10-2 및 PHF13 항체의 혼합물이 C10-2 코팅된 플레이트에 첨가되었다. 용액에서 P3 타우에 결합하는 항체가 많을수록, 플레이트에 결합할 수 있는 타우 에피토프가 덜 이용 가능하다. 플레이트에 결합하는 타우의 양은 설포-태깅된 인간 타우 항체에 의해 결정된다. C10-2 및 PHF13은 용액 중의 타우에 상이한 결합을 가지며, C10-2는 플레이트에 대한 모든 결합과 경쟁할 수 있는 반면(IC50 = 3 nM), PHF13은 그렇지 않다.
도 32: mC10 -2 및 PFH -13 둘 모두는 Ptau 386 내지 408( pS396 / pS404 )에 용량 의존적으로 결합한다.
도 32는 100 ng/㎖의 p-타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅된 MSD 플레이트 내의 웰에 mC10-2 및 PHF-13이 동등하게 결합하는 것을 제시한다. 증가하는 농도의 항체(x-축에 표시됨)가 2시간 동안 웰에서 인큐베이션된 후, 세척되고, 설포 태깅된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 결합된 항체가 검출되었다. 이는 이후 실시예에서 사용되는 제조된 PHF-13이 활성임을 나타낸다.
도 33: AD-P3에 결합하는 mD1 .2 및 mC10 -2 비교
도 33은 1 ㎍/㎖의 AD-P3로 코팅된 MSD 플레이트 내의 웰에 mD1.2 및 mC10-2가 동등하게 결합하는 것을 제시한다. 증가하는 농도의 항체(x-축에 표시됨)가 실온에서 1시간 동안 10 uM의 p-타우 386 내지 408(pS396/pS404) 펩티드의 존재 및 부재하에서 인큐베이션된 후, 2시간 동안 웰에서 인큐베이션된 후, 설포 태깅된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 결합된 항체가 검출되었다. IC50 값은 AD-P3 및 AD-S1(p)의 포획에 대해 320 nM 및 11 nM이었다. 대조적으로, mD1.2는 589 및 503 nM의 IC50 값으로 타우 항원 포획의 유의적으로 약한 억제를 나타내었고, 이는 가용성 항원에 대한 훨씬 낮은 친화성 결합을 암시한다.
검정은 2단계로 수행되었다. A: 1 ㎍/㎖의 AD-P3 및 20 ng/㎖의 AD s1(p) 각각이 증가하는 농도의 mD1.2 및 mC10-2와 함께 인큐베이션되고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되어, 항체-항원 결합(점유)을 증가시켰다. B: 샘플이 2시간 동안 AD-P3(1 ㎍/㎖)로 코팅된 MSD 플레이트에서 인큐베이션된 후, 세척되고, 설포 태깅된 항-전체 타우G 항체를 이용하여 포획된 타우 항원이 검출되었다.
도 34: mC10 -2는 고체상 제시된 AD-P3 항원에 효율적으로 결합하나, PHF - 13는 그렇지 않다.
PHF-13는 아닌, mC10-2의 매우 특이적인 결합: 도 34는 mC10-2가 AD-P3 항원 코팅된 MSD 플레이트(1 ㎍/㎖)에 효율적으로 결합하는 것을 제시한다. 비교시, PHF-13의 낮은 결합 활성은 생리학적 p-타우 항원에 대한 낮은 친화성을 나타낸다. 또한, PHF-13은 mC10-2와 비교하여 상당히 높은 정도의 비특이적 결합을 나타내었다(표 6 참조). 증가하는 농도의 항체(x-축에 표시됨)가 2시간 동안 인큐베이션된 후, 설포 태깅된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 결합된 항체가 검출되었다. 결합 신호가 비특이적 결합 활성(10 uM p-타우 386 내지 408(pS396/pS404) 펩티드의 존재하에서 측정된 신호로 정의됨)에 대해 보정되었다. IC50 값은 AD-P3의 mC10-2 포획에 대해 3 nM이었다. 대조적으로, PHF-13은 사실상 억제를 나타내지 않았다.
검정은 2단계로 수행되었다. A: 1 ㎍/㎖의 AD-P3가 증가하는 농도의 mC10-2 및 PHF-13과 함께 인큐베이션되고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되어, 항체-항원 결합(점유)을 증가시켰다. B: 샘플이 2시간 동안 AD-P3(1 ㎍/㎖)로 코팅된 MSD 플레이트에서 인큐베이션된 후, 세척되고, 설포 태깅된 항-전체 타우 항체를 이용하여 포획된 타우 항원이 검출되었다.
참조로서 포함되는 서열
SEQ ID NO:1 D1.2 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:2 D1.2 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:3 D1.2 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:4 D1.2 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:5 D1.2 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:6 D1.2 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:7 D1.2 경쇄
SEQ ID NO:8 D1.2 중쇄
SEQ ID NO:9 C10-2 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:10 C10-2 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:11 C10-2 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:12 C10-2 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:13 C10-2 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:14 C10-2 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:15 C10-2 경쇄
SEQ ID NO:16 C10-2 중쇄
SEQ ID NO:17 C5.2 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:18 C5.2 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:19 C5.2 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:20 C5.2 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:21 C5.2 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:22 C5.2 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:23 C5.2 경쇄
SEQ ID NO:24 C5.2 중쇄
SEQ ID NO:25 C8.3 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:26 C8.3 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:27 C8.3 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:28 C8.3 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:29 C8.3 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:30 C8.3 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:31 C8.3 경쇄
SEQ ID NO:32 C8.3 중쇄
SEQ ID NO:33 인간 타우
SEQ ID NO:34 D1.2* 경쇄
SEQ ID NO:35 인간화된 C10-2 중쇄
SEQ ID NO:36 인간화된 C10-2 경쇄
SEQ ID NO:37 타우 잔기 386 내지 408 (pS396, pS404)
도 1(패널 A 및 패널 B)은 병리학적 타우의 검출을 평가하기 위해 1 ㎍/㎖의 D1.2 또는 C10-2로 탐지된 AD 환자(AD) 및 나이든 건강한 개체(con)의 뇌 또는 32주령의 rTg4510 및 비-트랜스제닉(wt) 한배새끼(littermate)로부터 유래된 500 ng의 S1 및 P3 분획(S1 및 P3 분획의 생성은 실시예 3에 개시됨)을 제시하는 도트 블롯 분석의 결과를 제공한다(실시예 3). 도트 블롯은 D1.2(패널 A) 또는 C10-2(패널 B)가 트랜스제닉 마우스(Tg4510)에서 발현된 바와 같은 AD 환자 또는 인간(P301L) 타우로부터의 질병 물질에 대해 특이적으로 반응하는 것을 제시한다.
도 2: D1.2 및 C10-2 항체의 웨스턴 블롯 분석
도 2(패널 A 및 패널 B)는 1 ㎍/㎖의 D1.2(패널 A) 또는 C10-2(패널 B)로 탐지된 32주령의 rTg4510 및 비-트랜스제닉(wt) 한배새끼의 뇌로부터 유래된 2 ㎍의 S1 및 P3 분획 또는 AD 환자(AD) 및 나이든 건강한 개체(con)로부터의 뇌로부터 유래된 20 ㎍의 S1 및 P3 분획을 제시하는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 제공한다. S1 및 P3 분획은 1:50(조직 중량을 기준으로 함)의 비율로 로딩되었고, 이는 0.01 ㎎의 조직으로부터 유래되었다. 웨스턴 블롯에서, 정상 P301L 돌연변이체 인간 4R0N 타우는 55 kDa에 제시되는 반면, 과인산화된 P301L 돌연변이체 인간 4R0N 타우 종은 64 및 70 kDa에 제시된다. AD로부터의 P3 분획에서, 과인산화된 타우는 54, 64, 69 및 74 kDa에서 제시된다(실시예 3). 상기 도면은 항체가 과인산화된 이동성 변화된 타우 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 예시한다.
도 3: MSD에서의 병리학적 P3 물질에 대한 결합
도 3(패널 A 내지 패널 D)은 인간 AD 및 병에 걸리지 않은 대조군 뇌로부터 분리된 타우에 대한 D1.2(패널 A), C5-2(패널 B), C10-2(패널 C) 및 C8-3(패널 D)의 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery; MSD) ELISA 결합의 결과를 제공한다(실시예 4). 도 1에서 입증된 바와 유사하게, 본 발명의 항체가 병리학적 타우 종에 특이적으로 결합하는 것을 입증하기 위해 질병(AD) 및 건강한 대조군 뇌로부터 분리된 뇌의 ELISA 플레이트 상의 고정이 이용될 수 있다. 항체 농도 증가는 포화 결합을 유발시킨다. 결합된 항체의 양은 이차 항-마우스 항체로 검출된다.
도 4: 펩티드 친화성 및 pS396 선택성(펩티드 결합)
도 4(패널 A 내지 패널 D)는 위치 S396 및 S404에서의 인산화의 모든 조합을 갖는 타우(386 내지 409) 펩티드에 대한 C10-2(패널 A) 및 D1.2(패널 B)의 특이적 결합의 분석 결과를 제공한다(실시예 5). 인간의 병리학적 물질에 대한 특이적 친화성은 평가하기 어려우며, 이러한 이유로, 본 발명자는 특정 인산화 펩티드 및 비-인산화 펩티드를 이용하여 정확한 에피토프 친화성을 결정하기 위해 특정 펩티드 결합을 이용한다. 잔기 Ser396 및 Ser404에서 인산화된 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)(pS396/pS404)에 대한 항체 C10-2(패널 C) 및 D1.2(패널 D)의 결합에 대한 특이적인 용량 반응 곡선이 제시된다. 비-인산화 펩티드(NP) 및 일-인산화 펩티드(pS396 및 pS404)를 이용하여 경쟁 결합이 수행되었다. 또한, 인산화된 세린 262에 상응하는 대조군 펩티드가 포함되었다. 경쟁 결합은 모든 결합이 인산화된 396 세린 잔기를 통해 획득되는 것을 입증한다. 추가로, 데이터는 잔기 404에서의 인산화가 인-세린 396에서의 항체의 결합을 간섭하지 않음을 입증한다.
도 5: 병리 특이적 항체의 조직학적 특성규명
도 5, 패널 A는 C10-2(좌측 컬럼) 및 D1.2(우측 컬럼) 항체가 Tg4510(상단 열) 세포체 및 신경그물 내의 p-타우 종에 결합하는 것을 제시한다. 면역반응성은 비-Tg 뇌 섹션(하단 열)에서 검출되지 않는다. 도 5, 패널 B는 C10-2(좌측 컬럼) 및 D1.2(우측 컬럼) 항체가 AD 공여자(AD)(상단 열)의 세포체 및 신경그물실 내의 p-타우 종에 결합하는 것을 제시한다. 대조군 공여자 뇌는 면역반응성이 결여되어 있다(하단 열)(실시예 6).
도 6: C10-2 및 참조 항체에 대한 병리학적 및 비-병리학적 P3에 대한 결합
도 6(패널 A 내지 패널 E)은 종래 항체 2-10-3(패널 A), HACI-2B6(패널 B), IPN 002(패널 D), 및 HJ8.5(패널 E)에 비해 병리학적 물질을 인지하는데 있어서 본 발명의 항체 C10-2(패널 C)의 우수성을 입증하는 결과를 제공한다. 상기 도면은 P301L 돌연변이체 인간 타우를 발현하는 10개월령의 Tg4510 마우스로부터의 타우에 대한 결합과 함께 건강한(대조군) 인간 및 질병이 있는(AD) 인간 뇌로부터의 타우에 대한 C10-2의 특이적 결합을 제시한다. 증가하는 농도의 항체가 ELISA 플레이트 상에 고정된 P3 타우 물질에 첨가된다. 병리학적 타우에 대한 선택성의 비율은 활성 종을 이용한 완전한 포화 상태에서 결정된다. 종래 항체 각각에 대한 선택성 배수가 도면에 제시된다(실시예 7).
도 7: HEK293 세포 및 시험관내에서의 시딩의 방지
도 7(패널 A 내지 패널 C)은 Cisbio 검정에 의한 타우 응집의 정량화를 제공한다. 시딩된 pcDNA HEK293 세포는 신호를 나타내지 않았고, 이는 투입 시딩 물질에 대한 검출의 부재를 확증한다. Wt(야생형) 시딩 물질(WW)은 시딩을 나타내지 않았으나, 대조적으로 rTg4510 균질액(CC)은 비시딩에 비해 효율적으로 시딩되었다. 이러한 시딩 효과는 HEL을 이용한 처리에 영향을 받지 않았지만, 타우 항체(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)를 이용한 처리에 의해 부분적으로 역전되었다. 그래프(패널 A 내지 패널 C)는 3개의 독립적 세트의 샘플을 제공하며, 상대 타우 응집(전체 단백질로 표준화된 백그라운드에 비한 신호 배수)으로 작도된다(실시예 8).
도 8: 전기생리학적 결손의 역전
도 8은 대조군으로서의 tTa 마우스와 함께 Tg4510 마우스에서의 C10-2를 이용한 CA1 아만성 처리에서 유발된 장 전위를 예시하는 CA1 유발된 장 전위(field potential)(C10-2, 패널 A; D1.2, 패널 B)에서의 쌍을 이룬 펄스 촉진(패널 B 및 패널 D) 및 기초 시냅스 전달(패널 A 및 패널 C) 결손의 항체 역전을 제시한다. 동물은 2주 동안 15 ㎎/㎏ 용량의 항체로 매주 2회 처리되었다(실시예 9 참조). 패널 A(C10-2에 대한 것임) 및 패널 C(D1.2에 대한 것임)에서, 장 전위(fEPSP) 기울기가 자극 강도에 대해 작도된다. 패널 A 및 패널 C는 4.5 내지 5.5개월령의 rTg4510(아래 2 곡선) 및 tTA(위 2 곡선) 대조군 마우스에서 해마의 CA1 영역에서의 시냅스 전달 및 가소성의 생체내 전기생리학적 평가에서, i) 기본 시냅스 전달이 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 손상되며, ii) 쌍을 이룬 펄스 촉진이 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 감소되는 것을 예시한다.
시냅스전 메커니즘에 의존하는 것으로 생각되는 단기 시냅스 가소성인 쌍을 이룬 펄스 촉진이 rTg4510 및 tTA 마우스(C10-2에 대해 패널 B 및 D1.2에 대해 패널 D)에서 추가로 측정되었다. 간단히 말하자면, 25 내지 1000 ms의 다양한 자극간 간격(ISI)을 가진 한 쌍의 자극이 샤퍼 곁가지(Schaffer collateral)에 적용되었고, 두번째 fEPSP의 기울기가 첫번째 fEPSP의 기울기와 비교되었다. 모든 ISI에서 촉진이 관찰되었고, 50 및 75 ms의 ISI에서 최대 촉진이 있었다. 흥미롭게도, tTA 마우스(처음 2 막대)와 비교하는 경우 rTg4510 마우스(두번째 2 막대)에서 유의하게 낮은 PPF가 관찰되었다.
도 9: 도 1 내지 도 8에 설명된 스크리닝의 개관
2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 이-인산화 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)에 대해 항체가 생성되었다. 포스포-에피토프 S396 및/또는 S404 중 어느 하나에 대해 매우 특이적이고, 동시에 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우를 특이적으로 인지하는 클론을 분리하기 위해 도트-블롯 및 고정된 인간 병리학적 및 비-병리학적 타우를 이용한 MSD ELISA(실시예 4)를 이용하여 하이브리도마가 스크리닝된다. 도트-블롯 및 웨스턴 블롯에서 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력이 하이브리도마의 선택을 위해 이용된다. 16종의 클론이 선택되었고, 이중 4종의 클론(D1.2, C10-2, C5.2 및 C8.3)이 인간 병리학적 물질로의 결합에 대해 탁월한 능력을 나타낸다. 특정 면역화 및 스크리닝 프로토콜의 이용은 매우 포스포-세린-396(pS396) 특이적인 항체를 생성시킨다.
도 10: 잔기 pSer396은 mAb C5.2의 항원 결합 부위의 중심에 결합된다 .
1.9Å 해상도의 포스포-펩티드 386 내지 410과의 복합체 내 mAb C5.2의 결정 구조. 이러한 구조에서, 잔기 392 내지 398의 전자 밀도가 결정된다. 잔기 {p}Ser396은 mAb C5.2의 항원 결합 부위의 중심에 결합된다. 항-타우 mAb의 이러한 구조 연구에서, 에피토프는 중쇄(하단 우측) 및 경쇄(하단 좌측) 전체에 걸쳐 결합된다.
도 11: 포스포세린 타우 (292 내지 298) 펩티드와의 항체 C5.2 상호작용
도 11은 항체 C5.2와 포스포세린 타우(292 내지 298) 펩티드 사이의 상호작용을 제공한다. Ile(392)-VAL(393)-Tyr(394)-Lys(395)-P-Ser(396)-Pro(397)-Val(398)의 구조가 제시된다. 주요 상호작용은 타우 펩티드의 L3:H3, L3:F8*, H1:H13, H2:Y1, H2:Y3 및 Y(394)에 의해 형성된 소수성 포켓을 포함한다. 용매화된 {p}S(396)과 L3:T4, H1:R10, H1:T11, H3:R1, H3:T3 사이에서 형성된 광범위한 수소 결합 네트워크가 존재한다. 사용된 명명법에서, 첫번째 문자(예를 들어, L3:H3의 "L")는 관련된 CDR 잔기가 경쇄 CDR인지 또는 중쇄 CDR인지의 여부를 나타내고, 첫번째 숫자는 상기 사슬의 어떠한 CDR이 관련된 것인지 나타내고(예를 들어, "L3"는 경쇄의 CDR3를 나타냄), 나머지 용어(예를 들어, L3:H3의 "H3")는 관련된 아미노산의 이름 및 위치를 나타내고(예를 들어, "H3"는 CDR의 세번째 잔기 위치의 히스티딘을 나타냄); 따라서 "L3:H3"는 경쇄 CDR3의 세번째 위치의 히스티딘 잔기를 나타낸다. Y(394) 측쇄와 백본 사이에는 강한 수소 결합 및 전하/극성 상호작용이 존재하며, {p}S396 형태의 포스포네이트는 펩티드 백본 안쪽에 구부려져 있다. (*) L3:F8은 CDR L3의 C-말단 측접 프레임워크 잔기이다.
C5.2의 CDR 서열은 하기와 같다:
도 12: 시딩 검정을 위한 타우의 고갈( HEK293 )
도 12(패널 A 및 패널 B)는 뮤린 C10-2(mC10-2) 및 인간화 C10-2(hC10-2)를 이용한 rTg4510 뇌 균질액의 면역-고갈을 제시한다. 고갈된 균질액의 웨스턴 블롯이 E1(전체 타우; 패널 A; 아래)) 및 C10-2(pS396 타우; 패널 A; 위)로 검출되었고, mC10-2 및 hC10-2 둘 모두가 과인산화된 타우를 효율적으로 고갈시켰다(E1 블롯에 대해 윗 밴드 및 C10-2 블롯에 대해 모든 밴드). 고갈된 균질액이 또한 Cisbio 검정을 이용하여 응집된 타우의 고갈에 대해 분석되었다. 패널 B는 샘플 내에서의 응집된 타우의 변화를 제시한다. mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈 연구는 타우 응집체를 각각 99 및 99.5%만큼 제거하였다(패널 B).
도 13: 고갈된 물질을 이용한 시딩 검정( HEK293 )
패널 A 내지 패널 C는 HEK293 세포에서 P301L-hTau를 시딩하기 위해 사용된 고갈된 균질액을 제시한다. 전체 세포 용해질에 대한 Cisbio 응집 검정 또는 1% 트리톤-X에서의 HEK293 세포의 분획화(불용성의 과인산화된 D1.2 및 타우의 정량화(패널 A, 위 및 아래))에 의해 측정시 대조군 동물로부터의 균질액(WW)은 시딩되지 않은 반면, rTg4510 균질액(CC)은 효율적으로 시딩되었다. HEL 및 hHEL 항체를 이용한 고갈은 시딩에 영항을 미치지 않은 반면, mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈은 타우 응집을 88% 및 96%(패널 C) 및 불용성 타우를 97% 및 100%(패널 B)로 각각 방지하였다.
도 14: 면역 고갈 rTg4510 물질(생체내 시딩 연구에 사용됨)
패널 A 내지 패널 C는 면역-고갈된 rTg4510 뇌 추출물의 웨스턴 블롯(패널 A; 위, 아래) 분석을 나타낸다. C10-2 및 D1.2는 인간 과인산화 64 kDa 밴드를 90%만큼 특이적으로 감소시키고, 55 kDa 타우 Tau5에 대해서는 영향을 미치지 않으며, 대조적으로 상업적인 전체 타우 항체는 정상 55 kDa 타우를 74%만큼 감소시키고, 인간 64 kDa 타우에 대해서는 영향을 미치지 않는다(패널 B 및 패널 C).
도 15: 면역 고갈 AD 물질(생체내 시딩 연구에 사용됨)
도 15(패널 A 내지 패널 C)는 면역-고갈된 알츠하이머 뇌 추출물의 웨스턴 블롯(패널 A) 분석을 도시한다. C10-2 및 D1.2를 이용한 면역-고갈은 전체 타우 수준을 10% 초과로 감소시키지 않지만, 과인산화된 타우를 특이적으로 낮춘다(90% 감소)(패널 B 및 패널 C).
도 16(패널 A): 면역 고갈된 rTg4510 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 타우 병리
도 16(패널 A)은 rTg4510 또는 AD 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화를 예시한다. 시딩 전, 과인산화된 타우는 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
도 16(패널 B): 면역 고갈된 AD 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리
도 16(패널 B)은 rTg4510 (A) 또는 AD (B) 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화를 예시한다. 시딩 전, 과인산화된 타우는 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
도 17: D1.2로 처리된 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리
도 17은 시딩된 rTg4510 마우스의 해마에서의 매듭 함유 뉴런의 정량화를 도시한다. 병리는 시간에 따라 증가한다(Ig G, 1개월; IgG 2개월; IgG 3개월). 그러나, D1.2로 마우스를 처리하면, 병리는 시딩 후 1, 2 및 3개월에 유의하게 낮아진다. (D1.2 1개월; D1.2 2개월; D1.2 3개월).
도 18: 시딩 검정을 위한 타우의 고갈( HEK293 )
패널 A는 뮤린 C10-2(mC10-2) 및 인간화 C10-2(hC10-2)를 이용한 rTg4510 뇌 균질액의 면역-고갈을 제시한다. 고갈된 균질액의 웨스턴 블롯이 E1(전체 타우) 및 C10-2(pS396 타우)로 검출되었고, mC10-2 및 hC10-2 둘 모두가 과인산화된 타우를 효율적으로 고갈시켰다(E1 블롯에 대해 윗 밴드 및 C10-2 블롯에 대해 모든 밴드). 고갈된 균질액이 Cisbio 검정을 이용하여 응집된 타우의 고갈에 대해 분석되었다. 패널 B는 mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈이 타우 응집체를 각각 99 및 99.5% 제거한 것을 제시한다.
도 19: 고갈된 물질을 이용한 시딩 검정( HEK293 )
패널 A는 불용성 분획에 대한 타우 분획화(웨스턴)를 제시한다. 패널 B는 웨스턴 블롯 정량화를 제시한다. 패널 C는 세포 용해질에서의 응집된 타우를 제시한다. 고갈된 균질액은 HEK293 세포에서 P301L-hTau를 시딩하기 위해 사용되었다. 전체 세포 용해질에 대한 Cisbio 응집 검정 또는 1% 트리톤-X에서의 HEK293 세포의 분획화(불용성의 과인산화된 D1.2 + 타우의 정량화)에 의해 측정시 대조군 동물로부터의 균질액(WW)은 시딩되지 않은 반면, rTg4510 균질액(CC)은 효율적으로 시딩되었다. HEL 및 hHEL 항체를 이용한 고갈은 시딩에 영항을 미치지 않은 반면, mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈(패널 C)은 타우 응집을 88% 및 96% 및 불용성 타우를 97% 및 100%(패널 B)만큼 각각 방지하였다.
도 20: 정상 타우에 비한 과인산화된 타우에 대한 C10-2 및 D1.2의 면역선택성.
생체내 시딩 연구를 위해 사용된 면역 고갈 rTg4510 물질: 패널 A는 면역-고갈된 rTg4510 뇌 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 제시한다. 패널 B는 C10-2 및 D1.2가 유의한 양의 p396을 포함하지 않는 타우 55 kDa 밴드에 비해 세린 396에서 인산화된 과인산화된 64 kDa 밴드를 특이적으로 감소시키는 것을 제시한다. 대조적으로, 상업적 전체 타우 항체인 Tau5는 정상 55 kDa 타우를 감소시키며, 64 kDa 타우에 결합하는데 비효율적이다.
도 21: 정상 타우에 비한 과인산화된 타우에 대한 C10-2 및 D1.2의 면역선택성.
생체내 시딩 연구를 위해 사용된 면역 고갈 AD 물질: 패널 A는 면역-고갈된 알츠하이머 뇌 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 제시한다. mC10-2 및 D1.2를 이용한 면역-고갈은 전체 타우 수준을 10% 초과로 감소시키지 않지만(패널 B), 과인산화된 타우를 특이적으로 낮춘다(90% 감소)(패널 C).
도 22: rTg4510 마우스에서의 해마 타우 병리
패널 A는 면역 고갈된 rTg4510 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 타우 병리를 제시한다. 패널 B는 면역 고갈된 AD 물질로 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리를 제시한다. rTg4510 (A) 또는 AD (B) 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화. 시딩 전, 과인산화된 타우는 항체 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
도 23: D1.2로 처리된 시딩된 rTg4510 마우스에서의 해마 매듭 병리
시딩된 rTg4510 마우스의 해마에서의 매듭 함유 뉴런의 정량화. 상기 도면은 병리가 시간에 따라 증가하고, 마우스를 D1.2로 처리함으로써, 병리가 시딩 후 2 및 3개월에 유의하게 낮아지는 것을 제시한다.
도 24: 면역-고갈된 인간 AD 추출물의 웨스턴 블롯 분석
상기 도면은 C10-2의 인간화 형태(hC10-2)뿐만 아니라 mC10-2가 2.10.3(P-S422) 항체와 상이하며, 나머지 전체 타우는 2.10.3과 극적으로 상이하지 않지만(좌측 패널), C10-2(hC10-2)뿐만 아니라 mC10-2는 면역 고갈 방법에 의해 알츠하이머 뇌 추출물에 존재하는 과인산화된 타우 단백질을 더 많이 제거하는 것을 예시한다. 이는 정량화에 의해 도 25에서 확인된다.
도 25: 면역 고갈 후의 응집된 타우의 정량화
hC10-2 및 mC10-2 항체는 면역 고갈 방법에 의해 알츠하이머 뇌 추출물에 존재하는 응집된 타우 단백질을 더 많이 제거하는 이의 능력에 있어서 2.10.3 항체와 상이하다.
도 26: 면역 고갈 후에 남아있는 전체 타우
상이한 양의 인간화된 C10-2(▲) 및 2.10.3 항체(◆)를 이용한 알츠하이머 추출물을 면역 고갈시킨 후의 웨스턴 블롯 신호의 정량화. 도 26에서, Tau5를 이용한 전체 타우 신호의 정량화(모든 타우 아이소형이 분석에 포함됨)가 제시된다. 둘 모두의 항체는 알츠하이머 뇌 제조물로부터 적은 분획의 타우를 제거한다. P-S422 타우에 대한 특이성을 갖도록 설계된 2.10.3은 전체 타우량의 24%까지 제거하는 반면, C10-2는 전체 타우의 15%까지 제거한다(도 26 참조).
도 27: 과인산화된 타우의 면역고갈 후에 남아있는 전체 타우
도 27은 세린 422에서 인산화되는 과인산화된 타우의 정량화를 예시한다(모든 밴드 및 고분자량의 도말표본이 분석에 포함됨). 2.10.3(▲) 및 C10-2(◆) 둘 모두는 세린 422에서 인산화된 타우의 90% 초과를 제거한다. 그러나, 타우의 50%를 제거하는데 필요한 항체의 양은 상이하며, 항체 2.10.3에 대해서는 0.42 ㎍의 항체가 필요한 반면, C10-2에 대해서는 동일 효과를 위해 0.27 ㎍이 필요하다.
도 28: 과인산화된 타우의 면역고갈 후에 남아있는 전체 타우
세린 396에서 인산화되는 과인산화된 타우의 정량화(모든 밴드 및 고분자량의 도말표본이 분석에 포함됨). C10-2(◆)는 세린 396에서 인산화되는 타우를 효율적으로 제거한다(최대 효과: 88%, 0.30 ㎍ 항체를 사용하여 효과의 절반에 도달함). 2.10.3(▲)은 세린 396에서 인산화되는 타우의 적은 분획을 제거한다(최대 효과: 60%, 0.63 ㎍ 항체를 사용하여 효과의 절반에 도달함). 이는 세린 422에서 인산화되는 모든 타우가 또한 세린 396에서 인산화되나, 위치 422에서 인산화된 세린이 존재하지 않는 세린 396에서 인산화되는 과인산화된 타우의 일부가 존재하는 것을 나타낸다.
도 29: 과인산화된 타우의 면역고갈 후에 남아있는 전체 타우
세린 199/202에서 인산화되는 과인산화된 타우의 정량화(모든 밴드 및 고분자량의 도말표본이 분석에 포함됨). C10-2(◆)에 의해 제거되는 타우의 대부분은 또한 세린 199/202에서 인산화되는데, 이는 상기 인산화를 갖는 타우의 69%가 면역고갈에 의해 영향을 받기 때문이다(0.34 ㎍ 항체를 이용하는 경우 효과의 절반). 2.10.3(▲) 면역고갈은 P-S199/202 타우에 대해 S자형 용량 반응을 발생시키지 않지만, 증가하는 양의 항체로 신호에서의 저하가 관찰된다(최대량의 항체(5 ㎍)를 이용하는 경우 최대 52% 감소). 이러한 데이터는 인산화된 세린 396을 표적으로 하는 C10-2 항체가 422 위치에서 인산화된 세린을 표적으로 하는 2.10.3 항체보다 더 큰 풀(pool)의 과인산화된 타우에 결합하는 것을 나타낸다.
도 30: mC10 -2 코팅된 플레이트에서의 타우 항원 포획의 mD1 .2 및 mC10 - 2 억 제
유체상 ELISA에서, rTg4510 P3 제조물 및 다양한 양의 C10-2 또는 D1.2 항체의 혼합물이 C10-2 코팅된 플레이트에 첨가된다. 용액에서 P3 타우에 결합하는 항체가 많을수록, 플레이트에 결합할 수 있는 타우 에피토프가 덜 이용 가능하다. 플레이트에 결합하는 타우의 양은 설포-태깅된 인간 타우 항체에 의해 결정된다. C10-2(▲) 및 D1.2(□)는 용액 중의 타우에 대한 상이한 결합을 가지며, C10-2는 플레이트에 대한 모든 결합과 경쟁할 수 있다(IC50 20 nM). 다른 한편으로, D1.2는 용액 중의 타우에 대한 매우 낮은 수준의 결합을 나타낸다.
도 31: mC10 -2 코팅된 플레이트에서의 타우 항원 포획의 PHF13 및 mC10 -2 억제
유체상 ELISA에서, AD P3 제조물 및 다양한 양의 C10-2 및 PHF13 항체의 혼합물이 C10-2 코팅된 플레이트에 첨가되었다. 용액에서 P3 타우에 결합하는 항체가 많을수록, 플레이트에 결합할 수 있는 타우 에피토프가 덜 이용 가능하다. 플레이트에 결합하는 타우의 양은 설포-태깅된 인간 타우 항체에 의해 결정된다. C10-2 및 PHF13은 용액 중의 타우에 상이한 결합을 가지며, C10-2는 플레이트에 대한 모든 결합과 경쟁할 수 있는 반면(IC50 = 3 nM), PHF13은 그렇지 않다.
도 32: mC10 -2 및 PFH -13 둘 모두는 Ptau 386 내지 408( pS396 / pS404 )에 용량 의존적으로 결합한다.
도 32는 100 ng/㎖의 p-타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅된 MSD 플레이트 내의 웰에 mC10-2 및 PHF-13이 동등하게 결합하는 것을 제시한다. 증가하는 농도의 항체(x-축에 표시됨)가 2시간 동안 웰에서 인큐베이션된 후, 세척되고, 설포 태깅된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 결합된 항체가 검출되었다. 이는 이후 실시예에서 사용되는 제조된 PHF-13이 활성임을 나타낸다.
도 33: AD-P3에 결합하는 mD1 .2 및 mC10 -2 비교
도 33은 1 ㎍/㎖의 AD-P3로 코팅된 MSD 플레이트 내의 웰에 mD1.2 및 mC10-2가 동등하게 결합하는 것을 제시한다. 증가하는 농도의 항체(x-축에 표시됨)가 실온에서 1시간 동안 10 uM의 p-타우 386 내지 408(pS396/pS404) 펩티드의 존재 및 부재하에서 인큐베이션된 후, 2시간 동안 웰에서 인큐베이션된 후, 설포 태깅된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 결합된 항체가 검출되었다. IC50 값은 AD-P3 및 AD-S1(p)의 포획에 대해 320 nM 및 11 nM이었다. 대조적으로, mD1.2는 589 및 503 nM의 IC50 값으로 타우 항원 포획의 유의적으로 약한 억제를 나타내었고, 이는 가용성 항원에 대한 훨씬 낮은 친화성 결합을 암시한다.
검정은 2단계로 수행되었다. A: 1 ㎍/㎖의 AD-P3 및 20 ng/㎖의 AD s1(p) 각각이 증가하는 농도의 mD1.2 및 mC10-2와 함께 인큐베이션되고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되어, 항체-항원 결합(점유)을 증가시켰다. B: 샘플이 2시간 동안 AD-P3(1 ㎍/㎖)로 코팅된 MSD 플레이트에서 인큐베이션된 후, 세척되고, 설포 태깅된 항-전체 타우G 항체를 이용하여 포획된 타우 항원이 검출되었다.
도 34: mC10 -2는 고체상 제시된 AD-P3 항원에 효율적으로 결합하나, PHF - 13는 그렇지 않다.
PHF-13는 아닌, mC10-2의 매우 특이적인 결합: 도 34는 mC10-2가 AD-P3 항원 코팅된 MSD 플레이트(1 ㎍/㎖)에 효율적으로 결합하는 것을 제시한다. 비교시, PHF-13의 낮은 결합 활성은 생리학적 p-타우 항원에 대한 낮은 친화성을 나타낸다. 또한, PHF-13은 mC10-2와 비교하여 상당히 높은 정도의 비특이적 결합을 나타내었다(표 6 참조). 증가하는 농도의 항체(x-축에 표시됨)가 2시간 동안 인큐베이션된 후, 설포 태깅된 항-인간 IgG 항체를 이용하여 결합된 항체가 검출되었다. 결합 신호가 비특이적 결합 활성(10 uM p-타우 386 내지 408(pS396/pS404) 펩티드의 존재하에서 측정된 신호로 정의됨)에 대해 보정되었다. IC50 값은 AD-P3의 mC10-2 포획에 대해 3 nM이었다. 대조적으로, PHF-13은 사실상 억제를 나타내지 않았다.
검정은 2단계로 수행되었다. A: 1 ㎍/㎖의 AD-P3가 증가하는 농도의 mC10-2 및 PHF-13과 함께 인큐베이션되고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션되어, 항체-항원 결합(점유)을 증가시켰다. B: 샘플이 2시간 동안 AD-P3(1 ㎍/㎖)로 코팅된 MSD 플레이트에서 인큐베이션된 후, 세척되고, 설포 태깅된 항-전체 타우 항체를 이용하여 포획된 타우 항원이 검출되었다.
참조로서 포함되는 서열
SEQ ID NO:1 D1.2 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:2 D1.2 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:3 D1.2 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:4 D1.2 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:5 D1.2 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:6 D1.2 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:7 D1.2 경쇄
SEQ ID NO:8 D1.2 중쇄
SEQ ID NO:9 C10-2 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:10 C10-2 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:11 C10-2 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:12 C10-2 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:13 C10-2 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:14 C10-2 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:15 C10-2 경쇄
SEQ ID NO:16 C10-2 중쇄
SEQ ID NO:17 C5.2 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:18 C5.2 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:19 C5.2 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:20 C5.2 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:21 C5.2 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:22 C5.2 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:23 C5.2 경쇄
SEQ ID NO:24 C5.2 중쇄
SEQ ID NO:25 C8.3 경쇄 CDR1
SEQ ID NO:26 C8.3 경쇄 CDR2
SEQ ID NO:27 C8.3 경쇄 CDR3
SEQ ID NO:28 C8.3 중쇄 CDR1
SEQ ID NO:29 C8.3 중쇄 CDR2
SEQ ID NO:30 C8.3 중쇄 CDR3
SEQ ID NO:31 C8.3 경쇄
SEQ ID NO:32 C8.3 중쇄
SEQ ID NO:33 인간 타우
SEQ ID NO:34 D1.2* 경쇄
SEQ ID NO:35 인간화된 C10-2 중쇄
SEQ ID NO:36 인간화된 C10-2 경쇄
SEQ ID NO:37 타우 잔기 386 내지 408 (pS396, pS404)
본원에서 사용되는 용어 "타우"는 "타우 단백질"과 동의어이며, 타우 단백질 아이소형(예를 들어, UniProt에서 P10636, 1-9에서 확인됨) 중 임의의 아이소형을 나타낸다. 본원에서 사용되는 타우의 아미노산 넘버링은 하기 제시된 바와 같은 아이소형 2(SEQ ID NO:33)와 관련하여 제공되며, 메티오닌(M)이 아미노산 잔기 1이다:
SEQ ID NO:33:
본 발명은 타우, 특히 인간 타우에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 및 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것으로, 일 구현예에서, 이는 인간 타우의 인산화된 S396 잔기(pS396)에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낸다. 본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은, 예를 들어, 항원 제한 또는 비-포화 조건하에서 인간 타우 상의 인산화된 404(pS404) 잔기에 특이적으로 결합할 수 없거나, 실질적으로 특이적으로 결합할 수 없음을 추가 특징으로 한다. 또한, pS404에서의 인산화는 pS396에 대한 특이적 결합을 간섭하지 않는다. 본원에서 사용되는 기호법 "pS" 및 "{p}S"는 아미노산 잔기 포스포세린을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같은 항체는 또 다른 에피토프와 비교하는 경우 한 에피토프에 "실질적으로" 결합할 수 없으며, 상기 결합은 상기 다른 에피토프로 관찰된 결합의 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만이다.
본 발명의 상황에서의 용어 "항체"(Ab)는 면역글로불린 분자, 또는 본 발명의 일부 구현예에 따르면, 분자("항원")의 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자의 단편을 나타낸다. 천연 발생 항체는 통상적으로 적어도 2개의 중쇄(H) 및 적어도 2개의 경쇄(L)로 일반적으로 구성되는 테트라머를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 도메인(본원에서 VH로 약칭됨) 및 일반적으로 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성되는 중쇄 불변 도메인으로 구성된다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 아형)를 포함하는 임의의 아이소타입일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인은 통상적으로 항원 인지를 담당하는 한편, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전 보체 시스템의 첫번째 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 도메인은 "프레임워크 영역"(FR)으로 언급되는 더욱 보존된 서열의 도메인이 산재된 "상보성 결정 영역"으로 언급되는 과가변성의 도메인으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음과 같은 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 도메인 및 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 특히 관련성이 있는 것은 천연 발생할 수 있는 환경과 다른 물리적 환경에 존재하도록 "분리되거나", 아미노산 서열에 있어서 천연 발생 항체와 상이하도록 변형된 항체 및 이의 에피토프-결합 단편이다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 항원성 결정기를 의미한다. 에피토프는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 표면 그룹으로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 에피토프에 대한 결합은 변성 용매의 존재하에서 항상 상실되나, 선형 에피토프는 그렇지 않다는 점에서 입체형태적 에피토프 및 선형 에피토프는 구별된다. 에피토프는 결합에 직접 관련된 아미노산 잔기 및 결합에 직접 관련되지 않는 아미노산 잔기, 예를 들어, 특이적 에피토프-결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기(즉, 아미노산 잔기가 특이적 에피토프-결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있음)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체의 에피토프-결합 단편"은 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편, 일부, 영역 또는 도메인(생성되는 방법(예를 들어, 절단을 통하거나, 재조합적으로 생성되거나, 합성적으로 생성되거나 등등)과 상관 없음)을 의미한다. 에피토프-결합 단편은 상기 항체의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 CDR 도메인을 함유할 수 있으며, 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으나 상기 항체의 것과 상이한 상기 에피토프에 대해 특이성, 친화성 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 에피토프-결합 단편은 상기 항체의 6개 모두의 CDR 도메인을 함유할 것이다. 항체의 에피토프-결합 단편은 단일 폴리펩티드 사슬(예를 들어, scFv)의 일부일 수 있거나 이를 포함할 수 있거나, 각각이 아미노-말단 및 카르복실 말단을 갖는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬(예를 들어, 디아바디(diabody), Fab 단편, Fab2 단편 등)의 일부일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 에피토프-결합 능력을 나타내는 항체의 단편은, 예를 들어, 온전한 항체의 프로테아제 절단에 의해 획득될 수 있다. 더욱 바람직하게는, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 자연적으로 인코딩되지만, 상기 유전자 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 이들의 인코딩 cDNA)는 VL 및 VH 영역이 결합되어 1가 에피토프-결합 분자(단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조되는 것을 가능하게 하는 가요성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 대안적으로, 단일 폴리펩티드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 함께 결합되는 것을 가능하게 하기에 너무 짧은(예를 들어, 약 9개 잔기 미만) 가요성 링커를 이용함으로써, 이특이적 항체, 디아바디, 또는 유사한 분자(2개의 상기 폴리펩티드 사슬이 함께 결합되어 2가 에피토프-결합 분자를 형성함)를 형성시킬 수 있다(예를 들어, 디아바디의 설명에 대해 문헌[PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993)] 참조). 본 발명에 포함되는 에피토프-결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab' 또는 Fab 단편, 또는 WO2007059782호에 기재된 바와 같은 1가 항체; (ii) 힌지 도메인에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인을 필수적으로 포함하는 Fd 단편; (iv) VL 및 VH 도메인을 필수적으로 포함하는 Fv 단편; (v) VH 도메인을 필수적으로 포함하고, 도메인 항체(Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov;2i(ll) :484-90)로도 언급되는 dAb 단편(Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (vi) 카멜리드(camelid) 또는 나노바디(nanobody)(Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5_(l): l ll-24) 및 (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되나, 이들은 VL 및 VH 도메인이 쌍을 이루어 1가 분자(단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) 및 Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)] 참조)를 형성하는 단일 단백질 사슬로 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 본 발명의 상황에서의 이들 및 기타 유용한 항체 단편이 본원에 추가로 논의되어 있다. 달리 특정되지 않는 한 용어 항체는 또한 항체-유사 폴리펩티드, 예를 들어, 키메라 항체 및 인간화된 항체, 및 임의의 공지된 기술, 예를 들어, 효소적 절단, 펩티드 합성 및 재조합 기술에 의해 제공되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편(에피토프-결합 단편)을 포함하는 것이 또한 이해되어야 한다. 생성된 항체는 임의의 아이소타입을 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 "아이소타입"은 중쇄 불변 도메인 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)를 나타낸다. 상기 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 획득되며, 원하는 에피토프에 결합할 수 있는 적합한 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 용이하게 스크리닝될 수 있다.
용어 "이특이적 항체"는 각각이 독립적 표적을 표적으로 하는 2개의 독립적 에피토프-결합 단편을 함유하는 항체를 나타낸다. 이들 표적은 상이한 단백질 상에 존재하는 에피토프 또는 동일한 표적 상에 존재하는 상이한 에피토프일 수 있다. 이특이적 항체 분자는 모(parent) 일특이적 2가 항체 분자의 HC의 불변 도메인에서의 보충적 아미노산 변화를 이용하여 제조될 수 있다. 결과로서 발생된 이종이합체 항체는 2개의 상이한 모 일특이적 항체로부터 유래된 하나의 Fab를 함유한다. Fc 도메인에서의 아미노산 변화는 시간이 지남에 따라 안정한 이특이성을 갖는 이종이합체 항체의 안정성을 증가시킨다. (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6 546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10 571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145 -5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5 646-654 (2013)). 이특이적 항체는 또한 ScFv 융합을 이용하여 생성된 분자를 포함할 수 있다. 이후, 2개의 일특이적 scfv는 안정한 이종이합체를 형성할 수 있는 Fc 도메인에 독립적으로 연결되어 단일한 이특이적 분자를 생성시킬 수 있다(Mabry et al., PEDS 23:3 115-127 (2010). 이특이적 분자는 이중 결합 능력을 갖는다.
용어 "항체 D1.2"는,
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3를 갖는 항체 경쇄 가변 도메인, 및
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3를 갖는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하거나 이들로 구성되는, 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 나타내기 위한 것이다.
일 구현예에서, 항체 D1.2 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:8의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:7의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
관련 구현예에서, 항체 D1.2* 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:8의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:34의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
용어 "항체 C10-2"는,
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3를 갖는 항체 경쇄 가변 도메인, 및
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3를 갖는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하거나 이들로 구성되는, 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 나타내기 위한 것이다.
일 구현예에서, 항체 C10-2 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:16의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:15의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
추가 구현예에서, 인간화된 항체 C10-2 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:35의 중쇄, SEQ ID NO:36의 경쇄, 또는 둘 모두를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 구현예는 SEQ ID NO:35의 중쇄, SEQ ID NO:36의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다.
용어 "항체 C5.2"는,
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3를 갖는 항체 경쇄 가변 도메인, 및
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3를 갖는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하거나 이들로 구성되는, 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 나타내기 위한 것이다.
일 구현예에서, 항체 C5.2 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:24의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
용어 "항체 C8.3"은,
(a) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3를 갖는 항체 경쇄 가변 도메인, 및
(d) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3를 갖는 항체 중쇄 가변 도메인을 포함하거나 이들로 구성되는, 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 나타내기 위한 것이다.
일 구현예에서, 항체 C8.3 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:32의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
"항-타우 항체"는 타우 또는 타우 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조물을 나타낸다. 통상적인 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 모노클로날 항체는 하나 초과의 Fab 도메인으로 구성됨으로써 하나 초과의 표적에 대한 특이성을 증가시킬 수 있다. 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 임의의 특정 생성 방법(예를 들어, 재조합, 트랜스제닉, 하이브리도마 등)에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 바람직하게는, 특히 치료 목적을 위해 사용되는 경우 "인간화"될 것이다. 용어 "인간화"는 일반적으로 재조합 기술을 이용하여 제조되고, 비-인간 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유래된 에피토프-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열을 기초로 하는 나머지 면역글로불린 구조를 갖는 분자를 나타낸다. 에피토프-결합 부위는 인간 불변 도메인에 융합된 완전한 비-인간 항체 가변 도메인, 또는 단지 인간 가변 도메인의 적절한 인간 프레임워크 영역에 이식된 상기 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다. 상기 인간화 분자의 프레임워크 잔기는 야생형(예를 들어, 완전히 인간)일 수 있거나, 이들은 서열이 인간화를 위한 기초로 작용하는 인간 항체에서 발견되지 않는 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하도록 변형될 수 있다. 인간화는 분자의 불변 도메인이 인간 개체에서 면역원으로 작용할 가능성을 감소시키거나 제거하지만, 외래 가변 도메인에 대한 면역 반응의 가능성은 남아 있다(LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). 또 다른 접근법은 인간 유래 불변 도메인을 제공하는 것뿐만 아니라 가변 도메인을 인간 형태와 가능한 가깝게 재성형시키기 위해 가변 도메인을 또한 변형시키는 것에 초점을 둔다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 도메인은 제공된 종에서 비교적 보존되고 CDR에 대한 스캐폴딩을 추정적으로 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)이 측접된, 당해 항원에 반응하여 변하고 결합 능력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 비인간 항체가 특정 항원과 관련하여 제조되는 경우, 가변 도메인은 변형되는 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비인간 항체로부터 유래된 CDR을 이식시킴으로써 "재성형" 또는 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이러한 접근법의 적용은 문헌[Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR -Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti- p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154]에 보고되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항체는 모든 CDR 서열을 보존한다(예를 들어, 마우스 항체로부터의 6개 모두의 CDR을 함유하는 인간화 마우스 항체). 다른 구현예에서, 인간화 항체는 본래의 항체로부터의 하나 이상의 CDR로부터 "유래된" 하나 이상의 CDR로 또한 언급되는 본래 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개)을 갖는다. 항체를 인간화시키는 능력은 널리 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 5,225,539호; 5,530,101호; 5,585,089호; 5,859,205호; 6,407,213호; 6,881,557호 참조).
용어 "항체 XX"는 각각의 SEQ ID NO에 의해 정의되는 경쇄, 경쇄 가변 도메인, 또는 경쇄 가변 도메인 CDR1 내지 3, 및 각각의 SEQ ID NO에 의해 정의되는 중쇄, 중쇄 가변 도메인, 또는 중쇄 가변 도메인 CDR1 내지 3을 포함하거나 이들로 구성되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편(예를 들어, 항체 "C10-2")을 나타내기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 이의 SEQ ID NO에 의해 정의되는 이의 전체 중쇄 가변 도메인 및 이의 SEQ ID NO에 의해 정의되는 이의 경쇄 가변 도메인에 의해 정의된다.
본원에서 달리 명시하지 않는 한, 항체의 Fc 영역 또는 불변 도메인에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 지표로도 언급되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
본원에서 사용되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 대안적 에피토프에 비해 또 다른 분자의 영역(즉, 에피토프)과 더 긴 기간 및/또는 더 큰 친화성 또는 결합성으로 더욱 빈번하고 더욱 신속하게 반응하거나 결합하는 경우에 상기 또 다른 분자의 영역(즉, 에피토프)에 "특이적으로" 결합하는 것으로 언급된다. 예를 들어, 첫번째 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 두번째 표적에 특이적 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없음이 상기 정의를 읽음으로써 또한 이해된다. 소정의 항원에 대한 항체의 결합의 상황에서 본원에서 사용되는 용어 "결합"은 통상적으로, 예를 들어, 리간드로서 항원 및 분석물로서 항체를 이용하여 BIAcore® 3000 기계에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정시 약 10-7 M 이하, 예를 들어, 약 10-8 M 이하, 예를 들어, 약 10-9 M 이하의 KD에 상응하는 친화성으로 결합하는 것을 나타내며, 이는 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원이 아닌 비특이적 항원(예를 들어, BSA, 카세인)에 결합하는 이의 친화성보다 적어도 10배, 예를 들어, 적어도 100배, 예를 들어, 적어도 1,000배, 예를 들어, 적어도 10,000배, 예를 들어, 적어도 100,000배 낮은 KD에 상응하는 친화성으로 소정의 항원에 결합한다. 친화성이 더 낮은 양은 항체의 KD에 의존하므로, 항체의 KD가 매우 낮은 경우(즉, 항체가 매우 특이적임), 항원에 대한 친화성이 비특이적 항원에 대한 친화성보다 낮은 양은 적어도 10,000배일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "kd"(sec -1 또는 1/s)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 나타낸다. 상기 값은 koff 값으로도 언급된다.
본원에서 사용되는 용어 "ka"(M-1 x sec-1 또는 1/Msec)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "KD"(M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 나타내며, kd를 ka로 나눔으로써 획득된다.
본원에서 사용되는 용어 "KA"(M-1 또는 1/M)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수를 나타내며, ka를 kd로 나눔으로써 획득된다.
일 구현예에서, 본 발명은 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기(pS404)에 실질적으로 결합할 수 없는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 본원에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력; 또는 본원에 기재된 바와 같이 인간 AD 사후 뇌로부터의 추출물과 함께 사용되는 경우 S396 인산화된 과인산화 타우 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 과인산화되지 않은 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력.
본 발명의 추가 구현예는 인산화된 S396 잔기를 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 면역특이적인 고 특이성의 고 친화성 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 생성된 항체에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(A) 포유동물에 면역원을 주사함으로써 상기 포유동물을 면역화시키는 단계로서, 상기 면역원이 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)을 포함하는 18 내지 40개, 예를 들어, 18 내지 30개, 예를 들어, 20 내지 30개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화된 펩티드를 포함하는, 단계;
(B) 상기 포유동물의 상기 면역화를 2회 이상 반복하는 단계;
(C) 상기 반복적으로 면역화된 포유동물로부터의 혈청 샘플을 인산화된 S396 잔기를 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 결합할 수 있으나, 비-병원성의 타우에 실질적으로 덜 결합할 수 있는 고 특이성의 고 친화성 항체의 존재에 대해 스크리닝하는 단계; 및
(D) 상기 고 특이성의 고 친화성 항체를 회수하는 단계.
본원에서 사용되는 타우 분자에 "실질적으로 결합할 수 없음"은 참조 항체에 의해 매개되는 검출 가능한 결합에 비해 기능성에 있어서의 20% 초과의 차이, 40% 초과의 차이, 60% 초과의 차이, 80% 초과의 차이, 100% 초과의 차이, 150% 초과의 차이, 2배 초과의 차이, 4배 초과의 차이, 5배 초과의 차이, 또는 10배 초과의 차이를 나타낸다.
2개의 에피토프와 관련하여 항-타우 항체의 결합 능력을 언급하는 경우의 용어 "선택적" 및 "면역선택적"은 포화 조건하에서 관찰된 결합이 적어도 80%의 차이, 적어도 95%의 차이, 가장 바람직하게는 100%의 차이(즉, 하나의 에피토프에 대해 검출 가능한 결합이 없음)를 나타내는 것을 표시하기 위한 것이다. 타우 항체를 언급하는 경우의 용어 "선택적" 및 "면역선택적"은 추가로 항체가 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하고, 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별할 수 있음을 의미하기 위한 것이다.
용어 TBS-추출 가능한(S1), 고 염/사르코실-추출 가능한(S3), 및 사르코실-불용성(P3) 분획은 본원에 기재된 타우 생화학적 분획화에 의해 획득된 분획이다.
일부 항체에서, CDR의 단지 일부, 즉, SDR로 언급되는 결합에 필요한 CDR 잔기의 부분집합이 인간화 항체에서 결합을 유지하는데 필요하다. 관련 에피토프와 접촉하지 않고, SDR에 존재하지 않는 CDR 잔기는 초티아(Chothia) 과가변 루프 외부에 있는 케이뱃(Kabat) CDR의 영역으로부터의 이전 연구(예를 들어, CDR H2의 잔기 H60 내지 H65는 종종 요구되지 않음)를 기초로 하거나(예를 들어, 문헌[Kabat et al. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins ," J. Mol. Biol. 196:901-917] 참조), 분자 모델링 및/또는 경험에 의하거나, 문헌[Gonzales, N.R. et al. (2004) "SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity ," Mol. Immunol. 41:863-872]에 기재된 바와 같이 확인될 수 있다. 상기 인간화 항체에서, 하나 이상의 공여자 CDR 잔기가 부재하거나, 전체 공여자 CDR이 생략된 위치에서, 상기 위치를 점유하는 아미노산은 수용자 항체 서열의 상응하는 위치(케이뱃 넘버링에 의함)를 점유하는 아미노산일 수 있다. 포함될 CDR 내의 공여자 아미노산에 대한 수용자의 상기 치환의 수는 경쟁적 고려사항의 균형을 반영한다. 상기 치환은 인간화 항체에서 마우스 아미노산의 수를 감소시키고, 결과로서 잠재적 면역원성을 감소시키는데 있어서 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화성의 변화를 야기시킬 수 있고, 친화성의 유의한 감소는 회피되는 것이 바람직하다. CDR 내의 치환을 위한 위치 및 치환시킬 아미노산은 또한 경험적으로 선택될 수 있다.
CDR 잔기의 단일 아미노산 변경이 기능적 결합의 상실을 발생시킬 수 있다는 사실(Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983)은 대안적 기능성 CDR 서열을 체계적으로 확인하기 위한 수단을 제공한다. 상기 변형 CDR을 획득하기 위한 한 바람직한 방법에서, CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이화되어(예를 들어, 무작위 돌연변이유발을 통하거나, 부위-특이적 방법(예를 들어, 돌연변이된 유전자좌를 인코딩하는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄-매개 증폭)에 의함), 치환된 아미노산 잔기를 갖는 CDR을 생성시킨다. 본래의(기능성) CDR 서열에서의 관련 잔기의 정체를 치환된(비-기능성) 변형 CDR 서열의 정체와 비교함으로써, 상기 치환에 대한 BLOSUM62.iij 치환 스코어가 확인될 수 있다. BLOSUM 시스템은 신뢰성 있는 정렬에 대해 서열 데이터베이스를 분석함으로써 생성된 아미노산 치환의 매트릭스를 제공한다(Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol. 219, 555-565). 현재, 가장 진보된 BLOSUM 데이터베이스는 BLOSUM62 데이터베이스(BLOSUM62.iij)이다. 표 1은 BLOSUM62.iij 치환 스코어(스코어가 높을수록, 치환이 더 보존적이고, 따라서 치환이 기능에 영향을 미치지 않을 가능성이 더 높음)를 나타낸다. 예를 들어, 결과로서 발생된 CDR을 포함하는 에피토프-결합 단편이 타우에 결합하는데 실패하면, BLOSUM62.iij 치환 스코어는 불충분하게 보존성인 것으로 간주되고, 더 높은 치환 스코어를 갖는 새로운 후보 치환이 선택되고 생성된다. 따라서, 예를 들어, 본래의 잔기가 글루타메이트(E)이고, 비-기능성 치환 잔기가 히스티딘(H)인 경우, BLOSUM62.iij 치환 스코어는 0이 될 것이고, 보다 보존적 변화(예를 들어, 아스파테이트, 아스파라긴, 글루타민 또는 리신으로의 변화)가 바람직하다.
따라서, 본 발명은 개선된 CDR을 확인하기 위한 무작위 돌연변이유발의 이용을 고려한다. 본 발명의 상황에서, 보존성 치환은 표 2, 3 또는 4 중 하나 이상에 반영된 아미노산의 부류 내에서의 치환에 의해 정의될 수 있다:
보존성 치환에 대한 아미노산
잔기
부류:
대안적인 보존성 아미노산
잔기
치환 부류:
아미노산
잔기의
대안적인 물리적 및 기능적 분류:
더욱 보존성인 치환 그룹은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민을 포함한다.
추가의 아미노산 그룹은 또한, 예를 들어, 문헌[Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed. 1993), W. H. Freeman and Company]에 기재된 원리를 이용하여 제형화될 수 있다.
CDR 친화성을 증가(또는 감소)시키기 위해 파지 디스플레이 기술이 대안적으로 사용될 수 있다. 친화성 성숙으로 언급되는 이러한 기술은 돌연변이유발 또는 "CDR 워킹(CDR walking)"을 이용하며, 재선택은 최초 또는 모 항체와 비교하는 경우 항원에 대한 더 높은(또는 더 낮은) 친화성으로 결합하는 CDR을 갖는 항체를 확인하기 위해 표적 항원 또는 이의 항원성 에피토프-결합 단편을 이용한다(예를 들어, 문헌[Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903] 참조). 단일 뉴클레오티드가 아닌 전체 코돈을 돌연변이시키는 것은 반-무작위화 레퍼토리의 아미노산 돌연변이를 발생시킨다. 각각이 단일 CDR 내에서의 단일 아미노산 변경에 의해 상이하고, 각각의 CDR 잔기에 대한 각각의 가능한 아미노산 치환을 나타내는 변형을 함유하는 변형 클론의 풀로 구성된 라이브러리가 작제될 수 있다. 항원에 대한 증가된(또는 감소된) 결합 친화성을 갖는 돌연변이체는 고정된 돌연변이체와 표지된 항원을 접촉시킴으로써 스크리닝될 수 있다. 항원에 대한 증가되거나 감소된 친화성을 갖는 돌연변이체 항원을 확인하기 위해 당 분야에 공지된 임의의 스크리닝 방법(예를 들어, ELISA)이 사용될 수 있다(문헌[Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994] 참조). 경쇄를 무작위화시키는 CDR 워킹이 사용 가능할 수 있다(예를 들어, 문헌[Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551] 참조).
상기 친화성 성숙을 달성하기 위한 방법은, 예를 들어, 문헌[Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41 ," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR -H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic 
Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM- CSF Antibodies By Targeted CDR -Diversification," Mol. Immunol. 46(1):135-144; 및 Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034]에 기재되어 있다.
따라서, 포함된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 CDR 변형의 서열은 치환, 예를 들어, 치환된 4개의 아미노산 잔기, 3개의 아미노산 잔기, 2개의 아미노산 잔기 또는 1개의 아미노산 잔기를 통해 모 항체인 D1.2, C10-2, C5.2 또는 C8.3의 CDR의 서열과 상이할 수 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, CDR 영역 내의 아미노산이 상기 표 3에 정의된 바와 같은 보존성 치환으로 치환될 수 있음이 또한 예견된다. 예를 들어, 산성 잔기 Asp는 항체의 결합 특징에 실질적으로 영향을 주지 않고 Glu로 치환될 수 있다.
용어 "정상 타우"는 단백질 1 몰 당 2 내지 3 몰의 포스페이트를 함유하는 정상 뇌 타우를 나타낸다.
용어 "과인산화된 타우"는 웨스턴 블롯에서 다중-음이온 종 유도 이동성 변화와 일치하는 타우의 다중-인산화 종, 또는 5개, 6개 또는 7개 초과의 인산화된 세린, 트레오닌 또는 티로신 부위를 갖는 타우 종을 나타낸다.
용어 "인산화된 잔기 396을 갖는 타우"는 잔기 396이 인산화되고, 잔기 404가 인산화되거나 인산화되지 않은 과인산화된 타우에 관한 것이다.
용어 "트랜스제닉 비-인간 동물"은 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 트랜스진(transgene) 또는 트랜스-염색체(동물의 천연 유전체 DNA에 통합되거나 통합되지 않음)를 포함하고, 완전히 인간화된 항체를 발현할 수 있는 유전체를 갖는 비-인간 동물을 나타낸다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간화된 경쇄 트랜스진 및 인간화된 중쇄 트랜스진 또는 인간화된 중쇄 트랜스-염색체를 가질 수 있어, 마우스는 타우 항원 및/또는 타우를 발현하는 세포로 면역화되는 경우 인간화된 항-타우 항체를 생성한다. 인간화된 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 마우스, 예를 들어, HuMAb 마우스, 예를 들어, HCo7 또는 HCol2 마우스의 경우와 같이 마우스의 염색체 DNA로 통합될 수 있거나, 인간화된 중쇄 트랜스진은 WO02/43478호에 기재된 바와 같은 트랜스-염색체 KM 마우스의 경우와 같이 염색체외적으로 유지될 수 있다. 상기 트랜스제닉 및 트랜스-염색체 마우스(집합적으로 본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 언급됨)는 V-D-J 재조합 및 아이소타입 스위칭(isotype switching)을 겪음으로써 제공된 항원에 대한 다수의 아이소타입의 인간화된 모노클로날 항체(예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgD 및/또는 IgE)를 생성할 수 있다.
트랜스제닉의 비인간 동물은 또한, 예를 들어, 유전자를 동물의 밀크에서 발현되는 유전자와 작동 가능하게 연결시켜 상기 특정 항체를 인코딩하는 유전자를 도입시킴으로써 특정 항원에 대한 항체의 생성에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질병 또는 장애의 진행 또는 중증도를 개선하거나, 늦추거나, 감쇠시키거나, 역전시키거나, 상기 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 부작용을 개선하거나, 늦추거나, 감쇠시키거나, 역전시키는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, "치료" 또는 "치료하는"은 이롭거나 원하는 임상 결과를 획득하기 위한 접근법을 추가로 의미하며, "이롭거나 원하는 임상 결과"는 부분적이거나 전체적이거나, 검출 가능하거나 검출 가능하지 않은 것과 무관하게 증상의 개선, 장애 또는 질병의 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질병 또는 장애 상태, 질병 또는 장애 상태의 지연 또는 늦춤, 질병 또는 장애 상태의 개선 또는 완화, 및 질병 또는 장애의 진정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 적용되는 경우 "유효량"은 필요한 투여량 및 기간 동안 임상 결과를 포함하나 이에 제한되지는 않는 의도된 생리학적 효과 또는 원하는 치료 결과를 달성하기에 충분한 양을 나타낸다. 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 적용되는 경우 어구 "치료적 유효량"은 장애 또는 질병 상태, 또는 장애 또는 질병의 증상의 진행을 개선하거나, 완화시키거나, 안정시키거나, 역전시키거나, 늦추거나, 감쇠시키거나, 지연시키기에 충분한 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 양을 나타내기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 다른 화합물과 조합된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 투여를 제공한다. 이러한 경우, "유효량"은 의도된 생물학적 효과를 야기하기 충분한 조합의 양이다.
본 발명의 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 치료적 유효량은 질병 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 능력과 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료적으로 이로운 효과가 더 가치가 있는 양이다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 특히 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 및 상기 분자(및 이에 따른 이의 에피토프-결합 단편)를 생성하기 위한 완전히 새로운 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 도 9에 개설되어 있다. 모노클로날 항체를 분리하는 상기 새로운 방법의 능력은 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 세린 396({p}S396)에 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체를 분리하기 위한 이의 용도에 의해 본원에 예시된다. 이들 항체는 인산화된 잔기 세린 396과 세린 404(pS404) 사이를 구별하여, 이들이 타우가 또한 잔기 396에서 인산화되지 않는 한 인산화된 세린 404를 갖는 타우 단백질에 결합하지 않는 이들의 능력을 추가 특징으로 한다.
본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 {p}S396 특이적 항체의 선택을 선호하는 신규한 방법(도 9)의 사용에 의해 생성되고 분리되었다(도 9). 또한, 이러한 매우 엄격한 항체 클론 선택 절차를 적용시킴으로써, S396에 대해 매우 특이적일뿐만 아니라 인산화된 {p}S396 에피토프에 대해 매우 선택적인 항체가 획득되었다. 이들 항체는 알츠하이머병 뇌로부터의 타우를 독특하게 인지한다. 본 발명자는 또한 도 9에 개설된 스크리닝 절차가 기능적 및 치료적 유용성을 갖는 항체의 확인을 보장하는 것을 입증한다.
2N4R 타우의 잔기 386 내지 408을 포함하는 이-인산화 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)에 대해 항체가 생성되었다(실시예 1). 마우스는 포스포-펩티드로 면역화되었다. 일단 충분한 항체 역가가 획득된 후, 마우스가 희생되고, 하이브리도마가 생성되었다(실시예 2). 하이브리도마는 도트-블롯(실시예 3) 및 고정된 인간 병리학적 및 비-병리학적 타우를 갖는 MSD ELISA(실시예 4)를 이용하여 스크리닝되었다. 도트-블롯 및 웨스턴 블롯에서 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력이 하이브리도마의 선택을 위해 이용되었다. 16개의 클론이 선택되었고, 이 중 인간 병리학적 타우 물질에 대한 결합에 대해 탁월한 능력을 나타낸 항체를 생성한 4개의 하이브리도마 클론이 회수되었다.
병리학적 및 비-병리학적 타우에 대한 특이적 결합이 또한 병에 걸린 인간 AD 뇌 및 병에 걸리지 않은 인간 AD 뇌로부터의 타우의 분리 및 MSD ELISA 플레이스 상의 상기 물질의 고정에 의해 결정되었다(실시예 4).
본 발명의 추가 양태는 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37) 내의 적어도 18개, 예를 들어, 적어도 20개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화된 펩티드에 대해 유도된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태에서, 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 통상적으로 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)을 포함하는 18 내지 40개, 예를 들어, 18 내지 30개, 예를 들어, 20 내지 30개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화 펩티드에 대해 유도된다.
본 발명의 추가 양태는 연령-매치된 건강한 대조군에 비해 AD-병에 걸린 환자로부터의 포스포타우(pTau)에 대한 특이성을 갖는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것으로, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 본원에 기재된 바와 같은 포스포-특이적 및 멀티머-특이적 셋업(Setup) 1 ELISA를 이용하여 AD 및 건강한 대조군 대상체로부터의 뇌 균질액에서 포스포타우(pTau)를 검출하기 위한 ELISA 기반 검정에서 건강한 대조군 물질에 비해 AD 질병 물질에 대한 특이성에 있어서 50배 초과, 예를 들어, 100배 초과로 증가한 연령-매치된 건강한 대조군으로부터의 타우에 비한 AD-병에 걸린 환자로부터의 포스포타우(pTau)에 대한 특이성 차이를 갖는다.
본 발명의 관련 양태는 AD-질병 타우에 대한 특이성을 갖는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것으로, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 포스포-특이적 및 멀티머-특이적 셋업 1 ELISA를 이용하여 AD 및 건강한 대조군 대상체로부터의 뇌 균질액에서 포스포타우(pTau)를 검출하기 위한 ELISA 기반 검정에서 건강한 대조군 물질에 비해 AD 질병 물질에 대한 특이성에 있어서 50배 초과, 예를 들어, 100배 초과로 증가한 연령-매치된 건강한 대조군에 비한 AD에 대한 특이성 차이를 갖는다.
셋업 1 ELISA 방법은 A) C10-2 코팅된 플레이트를 이용한 AD 뇌로부터의 병리학적 인간 타우 항원의 포획 단계; B) 타우 항원과 증가하는 농도의 pS396 특이적 항체의 인큐베이션 단계; 및 C) MSD로부터의 설포-태깅된 항 인간(전체) 타우 항체를 이용한 타우 항원 포획 및 항체 매개 억제의 검출 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 인산화된 S396 잔기를 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 면역특이적인 고 특이성의 고 친화성 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 생성된 항체에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(A) 포유동물에 면역원을 주사함으로써 상기 포유동물을 면역화시키는 단계로서, 상기 면역원이 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)을 포함하는 18 내지 40개, 예를 들어, 18 내지 30개, 예를 들어, 20 내지 30개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화된 펩티드를 포함하는, 단계;
(B) 상기 포유동물의 상기 면역화를 2회 이상 반복하는 단계;
(C) 상기 반복적으로 면역화된 포유동물로부터의 혈청 샘플을 인산화된 S396 잔기를 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 결합할 수 있으나, 비-병원성의 타우에 실질적으로 덜 결합할 수 있는 고 특이성의 고 친화성 항체의 존재에 대해 스크리닝하는 단계; 및
(D) 상기 고 특이성의 고 친화성 항체를 회수하는 단계.
더욱 구체적으로, 단계 A는 MSD 플레이트를 코팅 완충액 중 통상적으로 0.5 ㎍/㎖의 C10-2 항체(포획 항체)로 코팅(통상적으로, 4℃에서 밤새)하고, 차단(통상적으로, 실온에서 1시간)시키고, 통상적으로 3회 세척하는 단계를 포함한다. 단계 B는 AD(3명의 환자로부터 풀링됨)로부터의 P3 용해질(통상적으로, 1:1000 = 2 내지 4 ㎍/㎖ 전체 단백질) 및/또는 S1(p)(통상적으로, 1:300=20 내지 40 ng/㎖ 전체 단백질)의 샘플과 등급화된 농도의 pS396 펩티드 에피토프 특이적 항체를 혼합하고, 인큐베이션(통상적으로, 실온에서 1시간)하는 단계를 포함한다. 반응물은 이후 단계 A에서 제조된 플레이트 상에서 2시간 동안 인큐베이션된다. 단계 C는 설포-태깅된 인간 타우를 이용하여 C10-2 포획된 타우를 검출하는 단계를 포함한다. 제조업체의 설명서에 따른 MSD로부터의 타우 항체(통상적으로, 1:50). 플레이트는 MSD SECTOR® S600에서 분석된다. AD P3 및 AD S1(p)는 유사한 설정으로 시험된다.
추가 구현예는 세포주, 예를 들어, 인간 세포주, 포유동물 비-인간 세포주, 곤충, 효모 또는 박테리아 세포주에서 생성되거나 제조된 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CHO 세포주, HEK 세포주, BHK-21 세포주, 뮤린 세포주(예를 들어, 골수종 세포주), 섬유육종 세포주, PER.C6 세포주, HKB-11 세포주, CAP 세포주 및 HuH-7 인간 세포주에서 생성된 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있다.
D1.2 및 C10-2의 특정 친화성 및 결합 특성은 위치 396 또는 404(SEQ ID NO:29 내지 32)에서 인산화되거나 인산화되지 않은 타우 386 내지 410(2R4N) 펩티드를 이용하여 특성규명되었다. 본 출원에 개설된 특정 면역화 및 스크리닝 프로토콜(도 9)을 이용하는 것은 도 4에서 입증된 바와 같이 매우 포스포-세린-396(pS396) 특이적 항체를 생성할 것이다.
항체가 병리학적 타우에 특이적인 것을 입증하기 위해, D1.2 및 C10-2 항체가 또한 면역-조직화학 분석에 의해 특성규명되었다(실시예 6). 항체는 알츠하이머병 뇌 및 인간(P301L) 돌연변이체 타우를 발현하는 Tg4510 타우 트랜스제닉 마우스로부터의 섹션에서 신경섬유 매듭에 대한 매우 특이적인 결합을 나타낸다(도 5). 인간 대조군 뇌 및 비-트랜스제닉 마우스 뇌로부터의 조직에 대해 결합이 관찰되지 않으며, 이는 항체가 인간 타우, 특히 알츠하이머 병리와 관련된 타우에 특이적으로 결합하는 것을 입증한다.
질병 병리와 관련된 타우를 인지하는 이들 항체의 독특한 능력은 본원의 실시예 7에서 입증된다. 본 발명자는 실시예 3에 기재된 검정에서 병리학적 타우 대 비-병리학적 타우의 결합을 비교한다. 상기 비교는 hACI-2B6, IPN002, HJ8.5, 2.10.3 및 4E4의 5개의 공개된 타우 항체에 대한 것이다. 도 6은 건강한 뇌 및 병에 걸린 뇌로부터의 타우에 대한 참조 항체 각각의 결합, 및 10개월령 Tg4510 타우 트랜스제닉 마우스로부터 분리된 P301L 인간 돌연변이체 타우에 대한 결합을 예시한다. 이는 분리된 항체가 인간 병리학적 타우에 대한 특별히 높은 정도의 특이성 및 선택성을 나타내는 것을 입증한다. 이러한 선택성은 표 5에 제시된 바와 같은 비교측정기 항체 중 임의의 것보다 우수하다.
포화 상태에서, 결합 항체 D1.2 및 C10-2는 인간 AD 뇌로부터 분리된 P3 타우에 대한 100배 초과의 선택성을 나타낸다.
선택된 항체가 기능적 및 치료적 유용성을 갖는 것을 입증하기 위해, 항체가 시험관내 및 세포 내 타우 응집 검정에서 시험되었다(실시예 8). 이들 검정은 항체가 타우의 병리적 응집 과정에 간섭할 수 있는 것을 입증하는 기능적 검정이다. HEK293 세포는 인간 타우-P301L-FLAG(4R0N)로 일시적으로 형질감염된다. 이후, 세포는 인간 AD 뇌 또는 트랜스제닉 Tg4510 뇌로부터의 타우 추출물에 노출된다. 병리학적 타우에 대한 이러한 노출은 세포로의 타우 흡수 및 세포내 응집을 촉진시킨다. 항체 D1.2 및 C10-2를 이용한 타우-제조물의 면역-고갈, 및 이들 항체를 이용한 세포의 직접 처리 둘 모두는 타우 응집체의 형성을 극적으로 감소시킬 수 있다(도 7).
항체 D1.2 및 C10-2의 치료적 유용성이 또한 인간 타우/PS1 마우스에서 평가되었다(실시예 9). 이러한 마우스 모델은 생애 후기(12 내지 18개월령)에 AD 병리만 발생시키는 더욱 AD 질병 관련된 동물 모델이다. 그러나, 마우스는 고형 매듭 병리의 발생 전에 타우 과인산화를 나타낸다. 마우스는 13주 동안 만성으로 매주 2회 15 ㎎/㎏ 용량으로 주사되었다. 항체 처리된 마우스는 도 9에서 입증된 바와 같이 인산화된 타우에서 극적인 감소를 나타내며, 이는 항체 D1.2 및 C10-2를 이용한 만성 처리가 매듭 병리 및 이에 따른 이후의 생체내에서의 신경변성을 감소시킬 것을 나타낸다.
본 발명의 항체는 면역고갈 방법에 의해 rTg4510 마우스 뇌 추출물로부터의 과인산화된 타우를 특이적으로 제거한다. 또한, 본 발명의 항체는 균질액으로부터 정상 타우를 제거하지 않는 반면, 상업적으로 이용 가능한 tau5 항체는 정상 타우를 제거한다. 잔기 404 또는 잔기 404 및 396 둘 모두에 인산화가 있는 타우 단백질에 결합하는 상업적 항체와 대조적으로, 본 발명의 항체는 세린 396에서 인산화되는 과인산화된 타우를 95%만큼 특이적으로 제거한다. 실험(실시예 12)은 본 발명의 항체가 뇌 균질액에서의 전체 타우의 단지 매우 적은 분획(8%)을 제거함에도 불구하고 과인산화된 타우를 특이적으로 제거(90% 만큼)하는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 병원성의 과인산화된 타우에 면역특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다. 또한, 과인산화된 타우가 본 발명의 항체를 이용하여 제거되는 실험에서, 시딩 활성이 폐기된다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다. 시딩의 감소가 매듭 형성의 발달 및 알츠하이머병을 포함하는 타우병증의 진행을 감소시키는 것으로 제안되었다. 따라서, 본 발명의 추가 양태는 AD의 진행 또는 AD의 증상의 감소에 사용하기 위한 본 발명의 항체에 관한 것이다.
더욱 구체적으로, 상기 상술된 바와 같이, 본 발명은 하기를 포함하는 군으로부터 선택되는 4종의 모노클로날 항체 중 어느 하나에 관한 것이다:
항체 D1.2
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:8의 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
관련 구현예에서, 항체 D1.2 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:8의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:34의 경쇄를 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
항체 C10-2
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:15의 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:16의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
인간화된 C10-2 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:35에 제시된다. 인간화된 C10-2 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36에 제시된다.
전체적으로, 실시예는 C10-2를 포함하는 본 발명의 항체가 AD-P3 항원 코팅된 MSD 플레이트에 효율적으로 결합하는 것을 제시한다. 비교시, PHF-13과 같은 상업적 항체는 낮은 결합 활성을 갖는다. 또한, PHF-13은 본 발명의 항체와 비교하여 상당히 높은 정도의 비특이적 결합을 나타내었다(표 6A 내지 표 6D 참조). 표 6은 C10-2 코팅된 플레이트에서의 Ptau 항원 포획의 mC10-2 유체상 억제가 효과적(IC50= 10 내지 20 nM)인 반면, mD1.2는 비효과적(IC50 = 500 내지 1000 nM)인 것을 제시한다. mC10-2 코팅된 플레이트에서의 p-타우 항원 포획의 mC10-2 유체상 억제는 효과적인 반면 (IC50= 10 내지 20 nM임), PHF-13은 비효과적이다(IC50 = 500 내지 1000 nM).
본 발명의 일 양태는 하기를 포함하는 항체에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
본 발명의 추가 양태는 하기를 포함하는 항체에 관한 것이다:
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
본 발명의 추가 양태는,
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3,
및 하기 중 1개, 2개 또는 3개를 포함하는 항체에 관한 것이다:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3.
항체 C5.2
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:23의 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:24의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
도 10의 결정 구조로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 에피토프는 C5.2의 중쇄 및 경쇄 전체에 걸쳐 결합된다. 따라서, 관련 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 또는
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 또는
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3; 및
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 또는
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 또는
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
항체 C8.3
(a) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 SEQ ID NO:31의 중쇄 가변 도메인 및/또는 SEQ ID NO:32의 경쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이들로 구성될 수 있다.
항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다.
일 구현예에 따른 상기 언급된 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 변형(4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 가짐)을 추가로 포함할 수 있다.
도 11로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 적어도 일 구현예에서, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3 및 LC CDR3는 타우의 392 내지 398 영역에 대한 결합에 중요하다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 하기를 포함한다:
a) SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:28로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
b) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:29로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
c) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:30으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
d) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:27로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 하기를 포함할 수 있다:
a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
d) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 타우 펩티드의 Y394와 함께 L3:H3, L3:F8*, H1:H13, H2:Y1, H2:Y3에 의해 형성되는 소수성 포켓을 형성하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 용매화된 {p}S396과 L3:T4, H1:R10, H1:T11, H3:R1, H3:T3 사이에 수소 결합 네트워크를 형성하는데 대해 본원에 추가로 기재된 항체와 경쟁하는 항체에 관한 것으로, (*) L3:F8은 CDR L3의 C-말단 측접 프레임워크 잔기이다(도 11 참조).
x-선 결정 구조로부터 관찰될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 항체는 2개 수준의 선택성으로 결합한다. 첫번째 수준의 선택성은 과인산화된 병리학적 타우에 대한 선택성이고, 두번째 수준의 선택성은 과인산화된 세린 잔기에 대한 선택성이며, 상기 인산화된 세린의 포스페이트는 상기 인산화된 세린으로부터 제거된 2개 잔기의 티로신 잔기의 측쇄에 수소 결합된다. 따라서, 본 발명의 흥미로운 양태는 티로신 잔기로부터 2개의 잔기가 제거된 인산화된 세린을 포함하는 과인산화된 타우의 아미노산 모티프에 대해 선택적인 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다. 통상적으로, 아미노산 모티프는 하기 서열을 갖는다:
Y - X - S(인산화됨) - P -
여기서, Y는 티로신이고, X는 천연 발생 아미노산이고, P는 프롤린이고, S(인산화됨)은 인산화된 하이드록실 측쇄를 갖는 세린이다.
유사하게, 본 발명의 흥미로운 양태는 인산화된 타우, 바람직하게는 과인산화된 타우에 결합하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 하기 아미노산 잔기 모티프 IA에 대해 선택적이며, 여기서 R은 천연 발생 아미노산의 측쇄이다.
특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 아미노산 모티프 IA가 병리학적 타우에 의해 채택된 입체형태로 존재하는 경우에 본 발명의 항체가 상기 모티프에 대해 선택적인 것으로 생각된다. 따라서, 아미노산 모티프 IA는 통상적으로 본 발명의 항채에 의해 선택적으로 인지되는 서열이다. 따라서, 본 발명의 흥미로운 양태는 인산화된 타우, 바람직하게는 과인산화된 타우에 결합하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 하기 아미노산 잔기 모티프 IB에 대해 선택적이며, 여기서 R은 천연 발생 아미노산의 측쇄이다.
본 발명의 상기 양태의 통상적인 구현예에서, 본 발명은 인산화된 타우, 바람직하게는 과인산화된 타우에 결합하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것으로, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 하기 아미노산 잔기 모티프 IB에 대해 선택적이며, 여기서 R은 천연 발생 아미노산의 측쇄, 비제한적인 예로, 하기 화학식 IC 또는 ID이다.
본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 타우 매듭 형성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 이용하여 타우병증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 통상적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI(외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 신경섬유 매듭-우세 노인 치매, 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병과 관련된 신경변성, 염색체와 연관된 파킨슨증, 리티코-보디그 병(Lytico-Bodig disease)(괌의 파킨슨-치매 복합증(Parkinson-dementia complex of Guam)), 신경절교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화 범뇌염, 헌팅턴병, 납중독뇌병증, 결절경화증, 할러포르텐-스파츠병 및 지방갈색소증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 통상적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI(외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상으로부터 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 양태는 타우병증의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다. 통상적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI(외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 신경섬유 매듭-우세 노인 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병과 관련된 신경변성, 염색체와 연관된 파킨슨증, 리티코-보디그 병(괌의 파킨슨-치매 복합증), 신경절교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화 범뇌염, 헌팅턴병, 납중독뇌병증, 결절경화증, 할러포르텐-스파츠병 및 지방갈색소증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 통상적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI (외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 애쥬번트 및/또는 안정화제와 함께 조성물로 존재하는 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 타우병증의 치료를 위한 요법에 사용될 수 있다. 통상적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI(외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 신경섬유 매듭-우세 노인 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병과 관련된 신경변성, 염색체와 연관된 파킨슨증, 리티코-보디그 병(괌의 파킨슨-치매 복합증), 신경절교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화 범뇌염, 헌팅턴병, 납중독뇌병증, 결절경화증, 할러포르텐-스파츠병 및 지방갈색소증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 통상적으로, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI (외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD) 및 픽병으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특히, 타우병증은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 의해 계획되는 치료는 만성 치료일 수 있고, 환자는 적어도 2주, 예를 들어, 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 동안 치료될 수 있다.
본 발명의 항체는, 예를 들어, 문헌[Kohler et al., Nature 256, 495 (1975)]에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 생성된 모노클로날 항체일 수 있거나, 재조합 DNA 또는 다른 방법에 의해 생성된 모노클로날 항체일 수 있거나, 더욱 바람직하게는 본원에 개시된 신규한 방법(도 9)에 의해 생성될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들어, 문헌[Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 모노클로날 항체는 임의의 적합한 공급원으로부터 획득될 수 있다. 따라서, 모노클로날 항체는, 예를 들어, 표면 상에서 항원을 발현하는 세포, 또는 관심 항원을 인코딩하는 핵산 형태의 관심 항원으로 면역화된 마우스로부터 획득된 뮤린 비장 B 림프구 세포로부터 제조된 하이브리도마로부터 획득될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 면역화된 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어, 래트, 토끼, 개, 양, 염소, 영장류 등의 항체-발현 세포로부터 유래된 하이브리도마로부터 획득될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다. 타우에 대해 유도된 인간화된 모노클로날 항체는 마우스 면역계가 아닌 인간 면역계의 일부를 갖는 트랜스제닉 또는 트랜스-염색체 마우스를 이용하여 생성될 수 있다. 상기 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 본원에서 HuMAb(인간화된 모노클로날 항체) 마우스 및 KM 마우스로 각각 언급되는 마우스를 포함하며, 본원에서 "트랜스제닉 마우스"로 집합적으로 언급된다.
HuMAb 마우스는 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 및 불변(μ 및 Y) 및 경쇄 가변 및 불변(κ) 사슬 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니-유전자좌와 함께 내인성 μ 및 K 사슬 유전자좌를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이를 함유한다(Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진은 부류 전환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪어 고 친화성 인간 IgG, κ 모노클로날 항체를 생성한다(문헌[Lonberg, N. et al. (1994), 상기]; 문헌[Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) 및 Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)]에 개관됨). HuMAb 마우스의 제조는 문헌[Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 상세히 기재되어 있다. 또한, US 5,545,806호, US 5,569,825호, US 5,625,126호, US 5,633,425호, US 5,789,650호, US 5,877,397호, US 5,661,016호, US 5,814,318호, US 5,874,299호, US 5,770,429호, US 5,545,807호, WO 98/24884호, WO 94/25585호, WO 93/1227호, WO 92/22645호, WO 92/03918호 및 WO 01/09187호를 참조한다.
HCo7, HCo12, HCo17 및 HCo20 마우스는 이들의 내인성 경쇄(카파) 유전자에서 JKD 붕괴(문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재됨), 이들의 내인성 중쇄 유전자에서 CMD 붕괴(WO 01/14424호의 실시예 1에 기재됨), 및 KCo5 인간 카파 경쇄 트랜스진(문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재됨)을 갖는다. 또한, HCo7 마우스는 HCo7 인간 중쇄 트랜스진을 갖고(US 5,770,429호에 기재됨), HCo12 마우스는 HCo12 인간 중쇄 트랜스진을 갖고(WO 01/14424호의 실시예 2에 기재됨), HCo17 마우스는 HCo17 인간 중쇄 트랜스진을 갖고(WO 01/09187호의 실시예 2에 기재됨), HCo20 마우스는 HCo20 인간 중쇄 트랜스진을 갖는다. 결과로서 발생된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 유전자좌의 붕괴를 위해 배경 동형접합체(background homozygous)에서 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄를 발현한다.
KM 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 붕괴되었고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187호의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 붕괴되었다. 이러한 마우스 계통은 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같이 인간 카파 경쇄 트랜스진 KCo5를 갖는다. 이러한 마우스 계통은 또한 WO 02/43478호에 기재된 바와 같이 염색체 14 단편 hCF(SC20)로 구성된 인간 중쇄 트랜스염색체를 갖는다. HCo12-Balb/c, HCo17-Balb/c 및 HCo20-Balb/c 마우스는 WO 09/097006호에 기재된 바와 같이 HCo12, HCo17 및 HCo20을 KCo5[J/K](Balb)와 교배시킴으로써 생성될 수 있다.
rTg4510 마우스는 돌연변이체 타우 트랜스진 발현에 대한 시간적 및 공간적 제어를 제공하는 공지된 타우병증 모델이다. KM 마우스 계통에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자는 문헌[Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993)]에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 붕괴되었고, 내인성 마우스 중쇄 유전자는 WO 01/09187호의 실시예 1에 기재된 바와 같이 동형접합적으로 붕괴되었다. 이러한 마우스 계통은 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)]에 기재된 바와 같이 인간 카파 경쇄 트랜스진 KCo5를 갖는다. 이러한 마우스 계통은 또한 WO 02/43478호에 기재된 바와 같이 염색체 14 에피토프-결합 단편 hCF(SC20)로 구성된 인간 중쇄 트랜스-염색체를 갖는다.
이들 트랜스제닉 마우스로부터의 비장세포가 널리 공지된 기술에 따라 인간화된 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 인간화된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 다른 종으로부터 유래되는 본 발명의 항체는 또한 관심 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 대해 트랜스제닉인 다른 비-인간 포유동물 또는 식물의 생성 및 이로부터의 회수 가능한 형태의 항체의 생성을 통해 트랜스제닉적으로 생성될 수 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 생성과 관련하여, 항체는 염소, 소, 또는 다른 포유동물의 밀크로부터 생성되고 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, US 5,827,690호; US 5,756,687호; US 5,750,172호 및 US 5,741,957호를 참조한다.
본 발명의 항체는 임의의 아이소타입의 항체일 수 있다. 아이소타입의 선택은 통상적으로 ADCC 유도와 같은 원하는 효과기 기능에 의해 안내될 것이다. 예시적 아이소타입은 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4이다. 인간 경쇄 불변 도메인 카파 또는 람다 중 하나가 사용될 수 있다. 원하는 경우, 본 발명의 항-타우 항체의 부류는 공지된 방법에 의해 전환될 수 있다. 예를 들어, 원래 IgM이었던 본 발명의 항체는 본 발명의 IgG 항체로 부류 전환될 수 있다. 또한, 부류 전환 기술은 하나의 IgG 하위부류를 또 다른 하위부류로, 예를 들어, IgG1로부터 IgG2로 전환시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 효과기 기능은 다양한 치료 용도를 위해, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체로의 아이소타입 전환에 의해 변경될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG1 항체, 예를 들어, IgG1, κ이다. 항체는 이의 아미노산 서열이 다른 아이소타입에 비해 특정 아이소타입과 가장 유사한 경우 상기 아이소타입인 것으로 언급된다.
일 구현예에서, 본 발명의 항체는 전장 항체, 바람직하게는 IgG 항체, 특히 IgG1, κ 항체이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 항체 에피토프-결합 단편 또는 단일쇄 항체이다.
항체 및 이의 에피토프-결합 단편은, 예를 들어, 통상적인 기술을 이용한 에피토프-결합 단편화에 의해 획득될 수 있고, 에피토프-결합 단편은 전체 항체에 대해 본원에 기재된 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 에피토프-결합 단편은 항체를 펩신으로 처리함으로써 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 에피토프-결합 단편은 이황화 브릿지를 감소시키기 위해 처리되어 Fab' 에피토프-결합 단편을 생성시킬 수 있다. Fab 에피토프-결합 단편은 IgG 항체를 파파인으로 처리함으로써 획득될 수 있고, Fab' 에피토프-결합 단편은 IgG 항체의 펩신 분해로 획득될 수 있다. F(ab') 에피토프-결합 단편은 또한 티오에테르 결합 또는 이황화 결합을 통해 하기 기재된 Fab'를 결합시킴으로써 생성될 수 있다. Fab' 에피토프-결합 단편은 F(ab')2의 힌지 도메인의 이황화 결합을 절단함으로써 획득된 항체 에피토프-결합 단편이다. Fab'-에피토프-결합 단편은 F(ab')2 에피토프-결합 단편을 환원제, 예를 들어, 디티오트레이톨로 처리함으로써 획득될 수 있다. 항체 에피토프-결합 단편은 또한 재조합 세포에서의 상기 에피토프-결합 단편을 인코딩하는 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)] 참조). 예를 들어, F(ab')2 에피토프-결합 단편의 일부를 인코딩하는 키메라 유전자는 상기 트렁케이션된 항체 에피토프-결합 단편 분자를 생성하기 위해 H 사슬의 CH1 도메인 및 힌지 도메인을 인코딩하는 DNA 서열, 및 이어서 번역 정지 코돈을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 항-타우 항체는 1가 항체, 바람직하게는 힌지 영역의 결실을 갖는 WO2007059782호(전체내용이 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같은 1가 항체이다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 1가 항체이며, 상기 항-타우 항체는 i) 상기 1가 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산 작제물을 제공하는 단계로서, 상기 작제물이 선택된 항원 특이적 항-타우 항체의 VL 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 Ig의 불변 CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 선택된 항원 특이적 항체의 VL 영역을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 및 Ig의 CL 영역을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 함께 작동 가능하게 연결되고, IgG1 서브타입의 경우, CL 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 CL 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재하에서 또는 동물 또는 인간에 투여되는 경우 CL 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩티드와 이황화 결합 또는 공유 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산을 함유하지 않도록 변형된, 단계; ii) 상기 1가 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산 작제물을 제공하는 단계로서, 상기 작제물이 선택된 항원 특이적 항체의 VH 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 인간 Ig의 불변 CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, CH 영역을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 힌지 영역에 해당하는 영역 및 Ig 서브타입에 의해 필요시 CH 영역의 다른 영역, 예를 들어, CH3 영역이 폴리클로날 인간 IgG의 존재하에서 또는 동물 또는 인간에 투여되는 경우 인간 Ig의 CH 영역의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 다른 펩티드와의 이황화 결합 또는 공유 결합 또는 안정한 비-공유성의 중쇄간 결합의 형성에 참여하는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않도록 변형되고, 선택된 항원 특이적 항체의 VH 영역을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열 및 상기 Ig의 CH 영역을 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열이 함께 작동 가능하게 연결된, 단계; iii) 상기 1가 항체를 생성하기 위한 세포 발현 시스템을 제공하는 단계; iv) (iii)의 세포 발현 시스템의 세포에서 (i) 및 (ii)의 핵산 작제물을 공동 발현시킴으로써 상기 1가 항체를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 작제된다.
유사하게, 일 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체는 하기를 포함하는 1가 항체이다:
(i) 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 항체의 가변 도메인 또는 상기 도메인의 에피토프-결합 부분, 및
(ii) 면역글로불린의 CH 도메인 또는 CH2 및 CH3를 포함하는 이의 도메인으로서, 상기 CH 도메인 또는 이의 도메인이 힌지 도메인 및, 면역글로불린이 IgG4 서브타입이 아닌 경우, CH 도메인의 다른 도메인, 예를 들어, CH3 도메인에 해당하는 도메인이 폴리클로날 인간 IgG의 존재하에서 동일한 CH 도메인과 이황화 결합 또는 동일한 CH 도메인과 다른 공유 또는 안정한 비-공유의 중쇄간 결합을 형성할 수 있는 임의의 아미노산 잔기를 포함하지 않도록 변형된, 면역글로불린의 CH 도메인 또는 CH2 및 CH3를 포함하는 이의 도메인.
추가 구현예에서, 본 발명의 1가 항체의 중쇄는 전체 힌지 영역이 결실되도록 변형되었다.
또 다른 추가 구현예에서, 1가 항체의 서열은 N-결합된 당화를 위한 임의의 수용자 부위를 포함하지 않도록 변형되었다.
본 발명은 또한 항-타우 결합 영역(예를 들어, 항-타우 모노클로날 항체의 타우-결합 영역)이 하나 초과의 에피토프를 표적으로 하는 2가 또는 다가 이특이적 스캐폴드의 일부인 "이특이적 항체"를 포함한다(예를 들어, 두번째 에피토프는 활성 운반 수용체의 에피토프를 포함할 수 있어, 이특이적 항체는 생물학적 장벽, 예를 들어, 혈액뇌장벽을 가로지르는 개선된 트랜스사이토시스(transcytosis)를 나타낼 수 있다). 따라서, 또 다른 추가 구현예에서, 항-타우 항체의 1가 Fab는 상이한 단백질을 표적으로 하는 추가 Fab 또는 scfv에 연결되어 이특이적 항체를 생성시킬 수 있다. 이특이적 항체는 이중 기능, 예를 들어, 항-타우 결합 도메인에 의해 부여되는 치료 기능 및 생물학적 장벽, 예를 들어, 혈액뇌장벽을 가로지르는 전달을 향상시키는 수용체 분자에 결합할 수 있는 운반 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 또한 단일쇄 항체를 포함한다. 단일쇄 항체는 중쇄 및 경쇄 Fv 도메인이 연결된 펩티드이다. 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-타우 항체의 Fv 내의 중쇄 및 경쇄가 단일 펩티드 사슬에서 가요성 펩티드 링커(통상적으로, 약 10개, 12개, 15개 이상의 아미노산 잔기의 가요성 펩티드 링커)와 연결된 단일쇄 Fv(scFv)를 제공한다. 상기 항체를 생성하는 방법은, 예를 들어, US 4,946,778호, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) 및 McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990)]에 기재되어 있다. 단일쇄 항체는 단지 하나의 VH 및 VL이 사용되는 경우 1가, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우 2가, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우 다가일 수 있다.
본원에 기재된 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 임의의 적합한 수의 변형된 아미노산 및/또는 상기 컨쥬게이션된 치환기와의 결합의 포함에 의해 변형될 수 있다. 이러한 상황에서의 적합성은 일반적으로 유도체화되지 않은 모 항-타우 항체와 관련된 타우 선택성 및/또는 타우 특이성을 적어도 실질적으로 보유하는 능력에 의해 결정된다. 하나 이상의 변형된 아미노산의 포함은, 예를 들어, 폴리펩티드 혈청 반감기를 증가시키거나, 폴리펩티드 항원성을 감소시키거나, 폴리펩티드 보관 안정성을 증가시키는데 이로울 수 있다. 아미노산(들)은, 예를 들어, 재조합 생성 동안(예를 들어, 포유동물 세포에서의 발현 동안 N-X-S/T 모티프에서의 N-연결 당화) 번역과 동시에 또는 번역 후에 변형되거나, 합성 수단에 의해 변형된다. 변형된 아미노산의 비제한적인 예는 당화된 아미노산, 황산화된 아미노산, 프레닐화된(예를 들어, 파네실화, 게라닐-게라닐화)된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 아실화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 비오티닐화된 아미노산, 카르복실화된 아미노산, 인산화된 아미노산 등을 포함한다. 아미노산의 변형 기술 중 하나를 안내하기에 적절한 참고문헌은 본 문헌 전체에 걸쳐 충분하다. 예시적 프로토콜은 문헌[Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ]에서 발견된다. 변형된 아미노산은, 예를 들어, 당화된 아미노산, PEG화된 아미노산, 파네실화된 아미노산, 아세틸화된 아미노산, 비오티닐화된 아미노산, 지질 모이어티에 컨쥬게이션된 아미노산, 또는 유기 유도체화 제제에 컨쥬게이션된 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 또한, 예를 들어, 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 컨쥬게이션에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 예시적 중합체, 및 이를 펩티드에 부착시키는 방법은, 예를 들어, US 4,766,106호; US 4,179,337호; US 4,495,285호 및 US 4,609,546호에 예시되어 있다. 추가의 예시적 중합체는 폴리옥시에틸화 폴리올 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 약 1,000 내지 약 40,000, 예를 들어, 약 2,000 내지 약 20,000, 예를 들어, 약 3,000 내지 12,000 g/mol의 분자량을 갖는 PEG)을 포함한다.
본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편은 진단 방법에서 또는 진단 영상화 리간드로 추가로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 방사성 표지된 아미노산을 포함하는 본 발명의 항체 및 이의 에피토프-결합 단편이 제공된다. 방사성 표지된 항-타우 항체는 진단 및 치료 목적(방사성 표지된 분자에 대한 컨쥬게이션이 또 다른 가능한 특징임) 둘 모두에 사용될 수 있다. 상기 표지의 비제한적인 예는 비스무트(213Bi), 탄소(11C, 13C, 14C), 크롬(51Cr), 코발트(57Co, 60Co), 구리(64Cu), 디스프로슘(165Dy), 에르븀(169Er), 플루오르(18F), 가돌리늄(153Gd, 159Gd), 갈륨(68Ga, 67Ga), 게르마늄(68Ge), 금(198Au), 홀뮴(166Ho), 수소(3H), 인듐(111In, 112In, 113In, 115In), 요오드(121I, 123I, 125I, 131I), 이리듐(192Ir), 철(59Fe), 크립톤(81mKr), 란타늄(140La), 루테튬(177Lu), 망간(54Mn), 몰리브덴(99Mo), 질소(13N, 15N), 산소(15O), 팔라듐(103Pd), 인(32P), 포타슘(42K), 프라세오디뮴(142Pr), 프로메튬(149Pm), 레늄(186Re, 188Re), 로듐(105Rh), 루비듐(81Rb, 82Rb), 루테늄(82Ru, 97Ru), 사마륨(153Sm), 스칸듐(47Sc), 셀레늄(75Se), 소듐(24Na), 스트론튬(85Sr, 89Sr, 92Sr), 황(35S), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Tl), 주석(113Sn, 117Sn), 크세논(133Xe), 이테르븀(169Yb, 175Yb, 177Yb), 이트륨(90Y), 아연(65Zn) 및 지르코늄(89Zr)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 지르코늄(89Zr)이 특히 흥미롭다. 방사성 표지된 아미노산 및 관련 펩티드 유도체를 제조하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))] 및 US 4,681,581호; US 4,735,210호; US 5,101,827호; US 5,102,990호(US RE35,500호), US 5,648,471호 및 US 5,697,902호 참조). 예를 들어, 방사성 동위원소는 클로라민 T 방법에 의해 컨쥬게이션될 수 있다(Lindegren, S. et al. (1998) " Chloramine -T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N- Succinimidyl -3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate," Nucl. Med. Biol. 25(7):659-665; Kurth, M. et al. (1993) "Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor," J. Med. Chem. 36(9):1255-1261; Rea, D.W. et al. (1990) "Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors," Cancer Res. 50(3 Suppl):857s-861s).
본 발명은 또한 모두가 광학 검출에 적합한 형광 표지(예를 들어, 희토류 킬레이트(예를 들어, 유로퓸 킬레이트)), 플루오레세인-타입 표지(예를 들어, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 5-카르복시플루오레세인, 6-카르복시 플루오레세인, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인), 로다민-타입 표지(예를 들어, ALEXA FLUOR® 568(Invitrogen), TAMRA® 또는 단실 클로라이드), VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROME™(Perkin Elmer), 피코에리트린; 움벨리페론, 리사민(Lissamine); 시아닌; 피코에리트린, Texas Red, BODIPY FL-SE®(Invitrogen) 또는 이들의 유사체를 이용하여 검출 가능하게 표지되는 항-타우 항체 및 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다. 화학발광 표지(예를 들어, 루미놀, 루시페라제, 루시페린, 및 애큐오린)가 사용될 수 있다. 상기 진단 및 검출은 또한 다양한 효소, 호스라디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소, 또는 보조군 복합체, 비제한적인 예로, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출 가능한 물질에 본 발명의 진단 분자를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다.
화학발광 표지(예를 들어, 루미놀, 루시페라제, 루시페린, 및 애큐오린)가 사용될 수 있다. 상기 진단 및 검출은 또한 다양한 효소, 호스라디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소, 또는 보조군 복합체, 비제한적인 예로, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출 가능한 물질에 본 발명의 진단 분자를 커플링시킴으로써 달성될 수 있다. 상자성 표지가 또한 사용될 수 있으며, 바람직하게는 양전자 방출 단층촬영술(PET) 또는 단일-광자 방출 전산화 단층촬영술(SPECT)을 이용하여 검출된다. 상기 상자성 표지는 알루미늄(Al), 바륨(Ba), 칼슘(Ca), 세륨(Ce), 디스프로슘(Dy), 에르븀(Er), 유로퓸(Eu), 가돌리늄(Gd), 홀뮴(Ho), 이리듐(Ir), 리튬(Li), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 몰리브덴(M), 네오디뮴(Nd), 오스뮴(Os), 산소(O), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 로듐(Rh), 루테늄(Ru), 사마륨(Sm), 소듐(Na), 스트론튬(Sr), 테르븀(Tb), 툴륨(Tm), 주석(Sn), 티타늄(Ti), 텅스텐(W) 및 지르코늄(Zi)의 상자성 이온, 특히 Co+2, CR+2, Cr+3, Cu+2, Fe+2, Fe+3, Ga+3, Mn+3, Ni+2, Ti+3, V+3 및 V+4, 다양한 양전자 방출 단층촬영술을 이용하는 양전자 방출 금속, 및 비-방사성 상자성 금속 이온을 함유하는 화합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편은 형광 표지, 화학발광 표지, 상자성 표지, 방사성 동위원소 표지 또는 효소 표지로 표지될 수 있다. 단편의 표지된 항체는 대상체의 뇌에서 상기 타우의 존재 또는 양을 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 상기 타우에 결합된 항-타우 항체 또는 타우-결합 단편의 생체내 영상화의 검출 또는 측정을 포함할 수 있으며, 상기 타우에 결합된 상기 항-타우 항체 또는 타우-결합 단편의 생체 외 영상화를 포함할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 타우-결합 단편의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 재조합 생성에 사용될 수 있다.
본 발명의 상황에서의 발현 벡터는 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터(적합한 세트의 발현 조절 요소를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는 임의의 적합한 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 상기 벡터의 예는 SV40의 유도체, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA, 배큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 항-타우 항체-인코딩 핵산은, 예를 들어, 선형 발현 효소를 포함하는 네이키드 DNA 또는 RNA 벡터(예를 들어, 문헌[Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)]에 기재됨), 압축 핵산 벡터(예를 들어, US 6,077,835호 및/또는 WO 00/70087호에 기재됨), 플라스미드 벡터, 예를 들어, pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119, "미지(midge)" 최소-크기 핵산 벡터(예를 들어, 문헌[Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)]에 기재됨), 또는 침전된 핵산 벡터 작제물, 예를 들어, CaPO4-침전된 작제물(예를 들어, WO 00/46147호, 문헌[Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), 및 Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981)]에 기재됨)에 포함된다. 상기 핵산 벡터 및 이의 용도는 당 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, US 5,589,466호 및 US 5,973,972호 참조).
일 구현예에서, 벡터는 박테리아 세포에서의 본 발명의 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 발현에 적합하다. 상기 벡터의 예는 발현 벡터, 예를 들어, BlueScript(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509 (1989), pET 벡터(Novagen, Madison, WI) 등을 포함한다.
발현 벡터는 또한 또는 대안적으로 효모 시스템에서의 발현에 적합한 벡터일 수 있다. 효모 시스템에서의 발현에 적합한 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 항시성 또는 유도성 프로모터, 예를 들어, 알파 인자, 알콜 옥시다제 및 PGH를 포함하는 벡터를 포함한다(문헌[F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987), Mattanovich, D. et al. Methods Mol. Biol. 824, 329-358 (2012), Celik, E. et al. Biotechnol. Adv. 30(5), 1108-1118 (2012), Li, P. et al. Appl. Biochem. Biotechnol. 142(2), 105-124 (2007), 
, E. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77(3), 513-523 (2007), van der Vaart, J.M. Methods Mol. Biol. 178, 359-366 (2002), 및 Holliger, P. Methods Mol. Biol. 178, 349-357 (2002)]에 개관됨).
본 발명의 발현 벡터에서, 항-타우 항체-인코딩 핵산은 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 및 다른 발현-촉진 요소를 포함하거나, 이와 결합될 수 있다. 상기 요소의 예는 강한 발현 프로모터(예를 들어, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서뿐만 아니라 RSV, SV40, SL3-3, MMTV, 및 HIV LTR 프로모터), 효과적인 폴리(A) 종결 서열, E. 콜리에서의 플라스미드 생성을 위한 복제 기점, 선택성 마커로서의 항생제 내성 유전자, 및/또는 편리한 클로닝 부위(예를 들어, 폴리링커)를 포함한다. 핵산은 또한 항시성 프로모터와 반대되는 유도성 프로모터, 예를 들어, CMV IE를 포함할 수 있다(당업자는 상기 용어가 실제로 특정 조건하에서의 유전자 발현의 정도의 기술어(descriptor)임을 인지할 것이다).
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편 또는 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 이특이적 분자를 생성하는 재조합 진핵생물 또는 원핵생물 숙주 세포, 예를 들어, 트랜스펙토마(transfectoma)에 관한 것이다. 숙주 세포의 예는 효모, 박테리아, 및 포유동물 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK 세포를 포함한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 세포 유전체에 안정적으로 통합된 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 발현을 코딩하는 서열을 포함하는 통합되지 않은 핵산, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 선형 발현 요소를 포함하는 세포를 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 a) 상기 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 하이브리도마 또는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 배양 배지로부터 본 발명의 항체를 정제하는 단계를 포함하는 본 발명의 항-타우 항체를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 상기 용어가 본원에서 사용되는 바와 같이 본원에 정의된 바와 같은 항-타우 항체를 포함하고, 타우에 결합할 수 없거나, 제제의 항-타우 기능성을 크게 변경시키지 않는 천연-발생 항체가 실질적으로 없는 제제에 관한 것이다. 따라서, 항-타우 항체 및 제제의 항-타우 항체의 기능성을 변경시키지 않는 또 다른 항체의 혼합물을 포함하는 상기 제제는 천연 발생 혈청 또는 상기 혈청의 정제된 유도체를 포함하지 않으며, 상기 기능성은 하기와 같다:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 본원에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력, 또는 본원에 기재된 바와 같이 인간 AD 사후 뇌로부터의 추출물과 함께 사용되는 경우 S396 인산화된 과인산화 타우 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 과인산화되지 않은 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력.
본 발명은 특히 천연-발생 항-타우 항체의 구조에 비해 이의 아미노산 서열에서의 구조적 변화(이의 CDR, 가변 도메인, 프레임워크 잔기 및/또는 불변 도메인 내의 구조적 변화)를 갖는 상기 항-타우 항체의 제제에 관한 것으로, 상기 구조적 변화는 항-타우 항체가 상기 천연 발생 항-타우 항체에 의해 나타난 기능성에 비해 현저하게 변경된 기능성(즉, 기능성에 있어서 20% 초과의 차이, 40% 초과의 차이, 60% 초과의 차이, 80% 초과의 차이, 100% 초과의 차이, 150% 초과의 차이, 2배 초과의 차이, 4배 초과의 차이, 5배 초과의 차이, 또는 10배 초과의 차이)을 나타내도록 하며, 상기 기능성은 다음과 같다:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 본원에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력; 또는 본원에 기재된 바와 같이 인간 AD 사후 뇌로부터의 추출물과 함께 사용되는 경우 S396 인산화된 과인산화 타우 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 과인산화되지 않은 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력.
용어 천연 발생 항체가 "실질적으로 없는"은 상기 제제에서의 상기 천연 발생 항체의 완전한 부재, 또는 제제의 타우-결합 특성에 크게 영향을 미치지 않는 상기 제제에서의 상기 천연 발생 항체의 농도의 포함을 나타낸다. 항체는 천연 발생 대응물을 갖지 않거나, 자연적으로 동반되는 성분으로부터 분리되거나 정제된 경우에 "분리된" 것으로 언급된다.
상기 제제와 관련된 바와 같은 용어 "천연 발생 항체"는 면역계의 기능성에 대한 자연 결과로서 살아 있는 인간 또는 다른 동물 내에서 유도된 항체(천연 발생 자가항체를 포함함)를 나타낸다.
따라서, 본 발명의 제제는 항-타우 항체 및 타우가 갖지 않은 에피토프에 결합할 수 있는 의도적으로 첨가된 추가 항체를 함유하는 제제를 배제하지 않으며, 실제로 명백히 포함한다. 상기 제제는 특히 제제가 알츠하이머병(AD), 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 및 피질기저핵 변성(CBD)을 치료하는데 있어서 향상된 효능을 나타내는 상기 제제의 구현예를 포함한다. 또한, 본 발명은 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상의 치료에 사용하기 위한 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 함유하는 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 제제는 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병과 관련된 신경변성의 치료에 사용될 수 있는 항-타우 항체 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 함유한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다:
(i) 본원에 정의된 바와 같은 타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 상기 항-타우 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 제제(이러한 용어는 본원에 정의됨); 및
(ii) 약학적으로 허용되는 담체.
약학적 조성물은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013]에 개시된 기술과 같은 통상적인 기술에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 애쥬번트 및 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제뿐만 아니라 임의의 다른 공지된 애쥬번트 및 부형제는 본 발명의 선택된 화합물 및 선택된 투여 방식에 적합해야 한다. 약학적 조성물의 담체 및 다른 성분의 적합성은 에피토프 결합에 대한 본 발명의 선택된 화합물 또는 약학적 조성물의 원하는 생물학적 특성에 대한 유의한 부정적 영향의 결핍(예를 들어, 실질적인 영향 미만(10% 이하의 상대 억제, 5% 이하의 상대 억제 등)을 기초로 하여 결정된다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 희석제, 충전제, 염, 완충제, 세제(예를 들어, 비이온성 세제, 예를 들어, Tween-20 또는 Tween-80), 안정화제(예를 들어, 당 또는 단백질 비함유 아미노산), 보존제, 조직 고정제, 가용화제, 및/또는 약학적 조성물에 포함시키기에 적합한 다른 물질을 포함할 수 있다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 상기 희석제의 예는 증류수, 생리학적 인산염-완충 염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 또한, 약학적 조성물 또는 제형은 또한 다른 담체, 또는 비독성, 비치료적, 비-면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 거대한 느리게 대사되는 거대분자, 예를 들어, 단백질, 키토산과 같은 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어, 라텍스 작용화된 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체(예를 들어, 오일 비말 또는 리포솜)를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 획득하기 위해 변할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물 또는 이의 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합하여 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 널리 공지된 유사 요인을 포함하는 다양한 약동학적 요인에 좌우될 것이다.
약학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위한 비경구, 국소, 경구 또는 비내 수단을 포함하는 임의의 적합한 경로 및 방식에 의해 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여된다. 본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은 일반적으로 주사에 의한 장용 및 국소 투여가 아닌 투여 방식을 의미하며, 표피, 정맥내, 근내, 동맥내, 수막강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 힘줄내, 경기관, 피하, 표피밑, 관절내, 피막하, 거미막밑, 척수내, 두개내, 흉곽내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
생체내 및 시험관내에서 본 발명의 화합물을 투여하는 추가의 적합한 경로는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 당업자에 의해 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 약학적 조성물은 정맥내 또는 피하 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
약학적으로 허용되는 담체는 본 발명의 화합물과 생리학적으로 상용성인 임의의 및 모든 적합한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제, 항산화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 에탄올, 덱스트로스, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유, 및 참기름, 카르복시메틸 셀룰로스 콜로이드성 용액, 트래거캔쓰 검(tragacanth gum) 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트, 및/또는 다양한 완충제를 포함한다. 다른 담체는 약학 분야에 널리 공지되어 있다.
약학적으로 허용되는 담체는 멸균된 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 사용은 당 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용될 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다.
적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 물질, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용되는 항산화제, 예를 들어, (1) 수용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유용성 항산화제, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트제, 예를 들어, 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 조성물에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 또는 소듐 클로라이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 약학적 조성물의 저장 수명 또는 유효성을 향상시킬 수 있는 선택된 투여 경로에 적절한 하나 이상의 애쥬번트, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, 보존제 또는 완충제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 임플란트, 경피 패치 및 미세캡슐화 전달 시스템을 포함하는 조절 방출 제형과 같은 신속한 방출에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 상기 담체는 젤라틴, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 디스테아레이트, 생물분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산을 단독으로 또는 왁스 또는 당 분야에 널리 공지된 다른 물질과 함께 포함할 수 있다. 상기 제형의 제조를 위한 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 생체내에서 적절한 분포를 보장하도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 멸균된 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 사용은 당 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용될 수 없는 경우를 제외하고, 본 발명의 약학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
주사용 약학적 조성물은 통상적으로 제조 및 보관 조건하에서 멸균되고 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어, 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트를 함유하는 수성 또는 비-수성 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 내에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예를 들어, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 항체 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생될 수 있다. 멸균 주사용 용액은, 예를 들어, 상기 열거된 바와 같은 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을 혼입시키고, 필요에 따라 이후 멸균 미세여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및, 예를 들어, 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에서, 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 제조 방법의 예는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
멸균 주사용 용액은 상기 열거된 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적절한 용매 중에 필요량의 활성 화합물을 혼입시키고, 필요에 따라 이후 멸균 미세여과에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에서, 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성하는 제조 방법의 예는 진공 건조 및 냉동-건조(동결건조)이다.
본원에 기재된 치료 및 사용의 상기 방법에서의 투여 요법은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 나누어진 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료되는 대상체에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 필요한 약학적 담체와 결합된 원하는 치료 효과를 발생시키도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 달성되는 특정 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위한 상기 활성 화합물 배합의 당 분야에 내재된 제한에 의해 직접 지정되며, 이들에 직접적으로 의존한다.
본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 대한 효과적인 투여량 및 투여 요법은 치료되는 질병 또는 질환에 의존하며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량이 제공되는 임의의 제공일에, 투여량은 숙주 체중 1 ㎏ 당 약 0.0001 내지 약 100 ㎎, 더욱 일반적으로 숙주 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 내지 약 5 ㎎ 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 1 ㎎ 또는 체중 1 ㎏ 당 10 ㎎, 또는 체중 1 ㎏ 당 1 내지 10 ㎎의 범위 내일 수 있다. 따라서, 예시적 투여량은 약 0.1 내지 약 10 ㎎/㎏/체중, 약 0.1 내지 약 5 ㎎/㎏/체중, 약 0.1 내지 약 2 ㎎/㎏/체중, 약 0.1 내지 약 1 ㎎/㎏/체중, 예를 들어, 약 0.15 ㎎/㎏/체중, 약 0.2 ㎎/㎏/체중, 약 0.5 ㎎/㎏/체중, 약 1 ㎎/㎏/체중, 약 1.5 ㎎/㎏/체중, 약 2 ㎎/㎏/체중, 약 5 ㎎/㎏/체중, 또는 약 10 ㎎/㎏/체중을 포함한다.
당 분야의 숙련된 기술을 갖는 의사는 필요한 약학적 조성물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사는 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 것보다 낮은 수준으로 약학적 조성물에 사용되는 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 용량으로 시작할 수 있고, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 가장 낮은 용량인 화합물의 양일 것이다. 상기 유효 용량은 일반적으로 상기 기재된 요인에 좌우될 것이다. 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근내, 복막내, 또는 피하 투여일 수 있다. 원하는 경우, 약학적 조성물의 효과적인 일일 용량은, 임의로 단위 투여 형태로 하루 전체에 걸쳐 적절한 간격으로 별도로 투여되는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 하위용량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 상기 기재된 바와 같은 약학적 조성물로 화합물을 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 표지된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 질병 또는 장애를 검출하거나, 진단하거나, 모니터하기 위한 진단 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 (a) 타우에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체를 이용하여 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 피로글루타메이트화 Aβ 단편의 존재를 검정하고, (b) 항원의 수준과 대조군 수준, 예를 들어, 정상 조직 샘플에서의 수준을 비교함으로써 항원의 대조군 수준에 비한 항원의 검정된 수준에서의 증가가 질병 또는 장애를 나타내거나, 질병 또는 장애의 중증도를 나타내는 것을 포함하는, 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 및 기저피질핵 변성(CBD)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경변성 또는 인지 질병 또는 장애의 검출 또는 진단을 제공한다.
본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편은 당 분야에 널리 공지된 면역조직화학 방법을 이용하여 생물학적 샘플에서 타우 또는 타우의 단편을 검정하기 위해 사용될 수 있다. 단백질을 검출하는데 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역검정, 예를 들어, 효소 결합 면역검정(ELISA) 및 방사면역검정법(RIA) 및 메소스케일 디스커버리 플랫폼 기반 검정(mesoscale discovery platform based assays; MSD)을 포함한다. 적합한 항체 표지가 상기 키트 및 방법에 사용될 수 있으며, 당 분야에 공지된 표지는 효소 표지, 예를 들어, 알칼리성 포스파타제 및 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소 표지, 예를 들어, 요오드(125I, 131I), 탄소(14C), 황(35S), 트리튬(3H), 인듐(121In), 및 테크네튬(99mTc); 및 발광 표지, 예를 들어, 루미놀 및 루시페라제; 및 형광 표지, 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민을 포함한다.
표지된 항-타우 항체 또는 이의 타우-결합 단편의 존재는 진단 목적을 위해 생체내에서 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 진단은 a) 유효량의 상기 표지된 분자를 대상체에 투여하는 단계; b) 투여 후 시간 간격 동안 기다려서 표지된 분자가 Aβ 침착 부위(존재시)에서 농축되도록 하고, 결합되지 않은 표지된 분자가 백그라운드 수준까지 청소되도록 하는 단계; c) 백그라운드 수준을 결정하는 단계; 및 d) 대상체에서 표지된 분자를 검출하여, 백그라운드 수준을 초과하는 표지된 분자의 검출이 대상체가 질병 또는 장애를 갖는 것을 나타내거나, 질병 또는 장애의 중증도를 나타내는 단계를 포함한다. 상기 구현예에 따르면, 분자는 당업자에게 공지된 특정 영상화 시스템을 이용한 검출에 적합한 영상화 모이어티로 표지된다. 백그라운드 수준은 검출되는 표지된 항체의 양을 특정 영상화 시스템에 대해 이전에 결정된 표준 값과 비교하는 것을 포함하는 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 진단 방법에 사용될 수 있는 방법 및 시스템은 전산화 단층촬영술(CT), 전신 스캔, 예를 들어, 양전자 방출 단층촬영술(PET), 자기 공명 영상화(MRI), 및 초음파촬영술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
추가 양태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 타우병증의 치료, 진단 또는 영상화에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 및 피질기저핵 변성(CBD)의 치료에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 타우병증을 치료하거나, 진단하거나, 영상화하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다.
바람직하게는, 약제는 알츠하이머병(AD), 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 및 피질기저핵 변성(CBD), 가장 바람직하게는 알츠하이머병(AD)을 치료하기 위한 것이다. 약제는 또한 바람직하게는 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상의 치료를 위한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 약제 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 유효량으로 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 대상체에서 알츠하이머병 또는 다른 타우병증을 치료하거나, 진단하거나, 영상화하는 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 치료는 만성 치료, 바람직하게는 적어도 2주, 예를 들어, 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 동안의 치료이다.
추가 양태에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
구현예
1. 인간 타우의 인산화된 잔기 396, 예를 들어, SEQ ID NO:33의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
2. 구현예 1에 있어서, 온전한 항체로 구성되는 항체.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, Fv 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv); Fab-유사 단편(예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편); 미니바디(mini-body)(Fv)2-CH3 도메인 및 도메인 항체(예를 들어, 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인)으로 구성된 군으로부터 선택되는 에피토프-결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
4. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입의 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
5. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 인간 또는 인간화된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편인 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
6. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체 또는 에피토프-결합 단편이 하기 특성 중 하나 이상을 나타내는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) 인간 병리학적 타우에 대한 선택성 및 특이성;
(b) 0.5 내지 10 nM, 예를 들어, 1 내지 5 nM 또는 1 내지 2 nM의 p-타우 386 내지 408(pS396/pS404)(SEQ ID NO:33)에 대한 결합 친화성(KD).
7. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항체가 타우(SEQ ID NO:33) 상의 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합하지 않는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
8. 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
9. 구현예 8에 있어서, SEQ ID NO:8 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인, 및/또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 SEQ ID NO:7의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 항체.
10. 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
11. 구현예 10에 있어서, SEQ ID NO:16 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인, 및/또는 SEQ ID NO:15 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 항체.
12. 에피토프-결합 단편이 하기를 포함하는 모노클로날 항체:
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
13. 구현예 12에 있어서, SEQ ID NO:24 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인, 및/또는 SEQ ID NO:23 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 항체.
14. 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2;
(f) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3.
15. 구현예 14에 있어서, SEQ ID NO:32 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 중쇄 가변 도메인, 및/또는 SEQ ID NO:31 또는 4개 이하의 아미노산 차이, 또는 3개 이하의 아미노산 차이, 또는 2개 이하의 아미노산 차이, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 갖는 아미노산 서열의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 모노클로날 항체.
16. 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편이 인간 타우에 대한 결합에 대해 구현예 8 내지 구현예 15 중 어느 한 구현예에 정의된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편과 경쟁하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
17. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
18. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 추가로 포함하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
19. 구현예 18에 있어서, 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인간 혈청 알부민, 당화 기, 지방산 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
20. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 있어서, 항체가 검출 가능한 모이어티를 추가로 포함하는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
21. 구현예 20에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 형광 표지; 화학발광 표지; 상자성 표지; 방사성-동위원소 표지; 또는 효소 표지로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
22. 구현예 20 또는 구현예 21에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 방사성 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
23. 구현예 22에 있어서, 방사성 동위원소가 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 123I 및 201Tl로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
24. 구현예 21에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 상자성 동위원소를 포함하거나 이로 구성되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
25. 구현예 24에 있어서, 상자성 동위원소가 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr 및 56Fe로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
26. 구현예 20 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 영상화 기술, 예를 들어, SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 영상화에 의해 검출 가능한 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
27. 구현예 20 내지 구현예 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 연결 모이어티를 통해 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편에 간접적으로 연결되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
28. 구현예 27에 있어서, 연결 모이어티가 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10,테트라아세트산(DOTA)의 유도체, 데페록사민(DFO), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)의 유도체, S-2-(4-이소티오시아네이토벤질)-1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산(NOTA)의 유도체 및 1,4,8,11-테트라아자사이클로도데칸-1,4,8,11-테트라아세트산(TETA)의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
29. 중쇄가 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:35로 구성된 군으로부터 선택되고, 경쇄가 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:36으로 구성된 군으로부터 선택되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
30. 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:28로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:29로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:30으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
(d) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:27로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
31. 하기를 포함하는 구현예 1 내지 구현예 7 중 어느 한 구현예에 따른 본 발명의 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
(d) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.
32. 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 어느 한 구현예에 정의된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 인코딩하는 분리된 핵산 분자.
33. 구현예 32에 있어서, 분자가 cDNA 분자인 핵산 분자.
34. 구현예 32 또는 구현예 33에 정의된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
35. 구현예 32 내지 구현예 34 중 어느 한 구현예에 정의된 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
36. 인코딩된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에서 구현예 35에 정의된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에 정의된 항체 또는 에피토프-결합 단편을 생성하기 위한 방법.
37. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 제제로서, 상기 제제가 타우에 결합할 수 없거나, 제제의 항-타우 기능성을 크게 변경시키지 않는 천연-발생 항체를 실질적으로 함유하지 않고, 상기 기능성이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 제제:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 본원에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력; 또는 본원에 기재된 바와 같이 인간 AD 사후 뇌로부터의 추출물과 함께 사용되는 경우 S396 인산화된 과인산화 타우 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 과인산화되지 않은 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력.
38. 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 따른 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 제제로서, 상기 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 천연-발생 항-타우 항체의 구조에 비해 이의 아미노산 서열에 있어서 구조적 변화를 갖고, 상기 구조적 변화가 상기 항체 또는 상기 단편이 상기 천연-발생 항-타우 항체에 의해 나타나는 기능성에 비해 변경된 기능성을 나타내도록 하고, 상기 기능성이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 제제:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 본원에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력; 또는 본원에 기재된 바와 같이 인간 AD 사후 뇌로부터의 추출물과 함께 사용되는 경우 S396 인산화된 과인산화 타우 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 과인산화되지 않은 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력.
39. 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에 정의된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 구현예 37 또는 구현예 38에 정의된 제제; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
40. 의약에 사용하기 위한 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예의 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 구현예 37 또는 구현예 38의 제제, 또는 구현예 39의 약학적 조성물.
41. 타우병증을 치료하는데 사용하기 위한 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예의 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 구현예 37 또는 구현예 38의 제제, 또는 구현예 39의 약학적 조성물.
42. 구현예 41에 있어서, 타우병증이 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저핵 변성(CBD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상으로 구성된 군으로부터 선택되는 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 제제, 또는 약학적 조성물.
43. 타우병증을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예의 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 구현예 37 또는 구현예 38의 제제, 또는 구현예 39의 약학적 조성물의 용도.
44. 구현예 43에 있어서, 타우병증이 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저핵 변성(CBD), AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상으로 구성된 군으로부터 선택되는 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 제제, 또는 약학적 조성물의 용도.
45. 유효량의 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예의 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 구현예 37 또는 구현예 38의 제제, 또는 구현예 39의 약학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 알츠하이머병 또는 기타 타우병증을 치료하는 방법.
46. 구현예 45에 있어서, 치료가 만성 치료인 방법.
47. 구현예 46에 있어서, 만성 치료가 적어도 2주, 예를 들어, 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 동안의 치료인 방법.
48. 구현예 45 내지 구현예 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
49. 의약에 사용하기 위한 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예의 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 구현예 37 또는 구현예 38의 제제, 또는 구현예 39의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
50. 대상체의 뇌에서 타우의 존재 또는 양을 검출하거나 측정하는데 사용하기 위한 구현예 1 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예의 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 구현예 37 또는 구현예 38의 제제, 또는 구현예 39의 약학적 조성물.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 검출 또는 측정이 상기 타우에 결합된 상기 항-타우 항체의 생체내 영상화를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 제제, 또는 약학적 조성물.
52. 구현예 50에 있어서, 상기 검출 또는 측정이 상기 타우에 결합된 상기 항-타우 항체 또는 이의 단편의 생체 외 영상화를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편, 제제, 또는 약학적 조성물.
53. 잔기 404에서 인산화되었으나, 잔기 396에서는 인산화되지 않은 인간 타우의 존재하에서 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
54. i) 항체가 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합하지 않고; ii) 396이 인산화되지 않은 경우 항체가 404에서 인산화된 타우에 실질적으로 결합하지 않고; iii) 항체가 396에서 인산화된 타우에 결합하고; iv) 396 및 404 둘 모두가 인산화된 경우 항체가 타우에 결합하는 시험 기준에 따라, 인산화된 잔기 396을 포함하는 인간 타우에 대한 면역특이적 결합을 나타내는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
55. 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 이-인산화된 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)에 대해 발생된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
56. 구현예 55에 있어서, 하이브리도마를 인간 병리학적 및 비-병리학적 타우로 스크리닝하여, i) 포스포-에피토프 S396 중 어느 하나에 대해 면역 특이적이고, ii) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우를 특이적으로 인지하는 클론을 분리하고, 상기 항체가 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별할 수 있는 모노클로날 항체.
57. 과인산화된 타우와 항체를 접촉시켜 매듭에서 과인산화된 타우의 90%가 고갈되도록 하는 단계를 포함하는 과인산화된 타우를 포함하는 매듭으로부터 과인산화된 타우를 제거하는 방법으로서, 상기 항체가 인산화된 잔기 396을 갖는 타우에 대해 선택적인, 방법.
58. 인산화된 396 잔기를 갖는 타우 단백질을 제거하는 항체를 투여하는 단계를 포함하여 환자에서 병리학적 타우 단백질의 축적을 감소시키거나 감쇠시키는 단계를 포함하는, 환자에서의 알츠하이머병의 진행을 지연시키는 방법.
59. 병리학적 타우 단백질을 시딩하는 타우 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 환자에서 알츠하이머병의 진행을 지연시키는 방법으로서, 인산화된 잔기 396을 갖는 타우 단백질이 제거되는, 방법.
60. 과인산화된 타우와 인산화된 잔기 396을 갖는 타우에 선택적인 항체를 접촉시킴으로써 과인산화된 타우 및 정상 타우를 포함하는 매듭으로부터 과인산화된 타우를 제거하는 단계를 포함하는 알츠하이머병을 갖는 환자를 치료하는 방법.
61. 구현예 57 내지 구현예 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 구현예 1 내지 구현예 31, 구현예 40 내지 구현예 42 또는 구현예 50 내지 구현예 56 중 어느 한 구현예에 정의된 항체의 사용을 포함하는 방법.
62. 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 분리된 에피토프-결합 단편.
63. 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 재조합 인간 또는 재조합 인간화 모노클로날 항체 또는 이들의 분리된 에피토프-결합 단편.
64. 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 이-인산화된 펩티드 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)에 대해 발생된 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편으로서, 상기 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는, 재조합 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
65. 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 분리된 에피토프-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 분리된 에피토프-결합 단편이 상기 구현예 중 어느 한 구현예에 정의된 바와 같은, 약학적 조성물.
66. 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 키메라 모노클로날 항체 또는 이의 분리된 에피토프-결합 단편.
67. 세포주, 예를 들어, 인간 세포주, 포유동물 비-인간 세포주, 곤충, 효모 또는 박테리아 세포주에서 생성되거나 제조된 구현예 1 내지 구현예 31 및 구현예 51 내지 구현예 56 중 어느 한 구현예에 정의된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
68. 구현예 67에 있어서, CHO 세포주, HEK 세포주, BHK-21 세포주, 뮤린 세포주(예를 들어, 골수종 세포주), 섬유육종 세포주, PER.C6 세포주, HKB-11 세포주, CAP 세포주 및 HuH-7 인간 세포주에서 생성된 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
실시예
실시예
1:
포스포
-펩티드 396/404를 이용한 마우스의 면역화
C56/BL6 및 FVB 마우스를 TiterMax 애쥬번트에 제형화된 10 ㎍의 P30 컨쥬게이션된 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)(SEQ ID NO:37)로 면역화시켰다.
마우스(C56/BL6 및 FVB 계통, 암컷 및 수컷). 2 내지 3개월령 마우스를 펩티드 에피토프 P30 컨쥬게이션된 인산화된 타우 386 내지 408로 면역화시켰다.
Immunogenic P30 컨쥬게이션된 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404) 펩티드를 TiterMax/vendor 프로토콜에 따라 TiterMax에서 제형화(1:1 vol:vol로 혼합된 400 ㎍/㎖ 펩티드)시키고, 마우스에 20 ㎍의 펩티드(100 ㎕) 항원을 피하 주사하였다. 대조군 마우스에는 애쥬번트만 주사하였다. 모든 펩티드-면역화된 마우스를 매월 간격으로 0.5 ㎍의 펩티드/Titermax(상기 기재된 바와 같이 제형화되고 주사되는 10 ㎍/㎖ 펩티드)로 부스팅(boosting)시켰다. 마우스를 비장세포와 SP-2 세포의 융합 3일 전에 Titermax 3 없이 P30 컨쥬게이션된 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 최종적으로 부스팅시켰다. 1 ㎍/㎖의 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅된 ELISA 플레이트에 대한 양성 결합을 나타내고, AD 및 TG4510 뇌 용해질로부터의 S1 및 P3 항원에 대한 우선적 결합 활성을 나타낸 후에 하이브리도마를 재-클로닝 주기를 위해 선택하였다(하기 실시예 3에 기재됨). 상기 결합을 도트 블롯 및 뇌 용해질 코팅된 ELISA 또는 MSD 플레이트를 이용하여 대조군으로부터의 뇌 용해질에 대한 상기 항체의 결합 활성과 비교하였다.
실시예
2:
하이브리도마
생성
마우스를 비장세포와 SP-2 세포의 융합 3일 전에 Titermax 3 없이 P30 컨쥬게이션된 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 부스팅시켰다. 도트 블롯 및 뇌 용해질 코팅된 ELISA 또는 MSD 플레이트를 이용하여 1 ㎍/㎖의 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅된 ELISA 플레이트에서의 양성 결합, 및 대조군으로부터의 뇌 용해질에 비한 AD 및 TG4510 뇌 용해질로부터의 S1 및 P3 항원에 대한 우선적 결합 활성 후에 하이브리도마를 재-클로닝 주기를 위해 선택하였다.
실시예
3: 특정 항체의
웨스턴
블롯
및
도트
-
블롯
분석
타우
생화학
분획화
인간 타우 돌연변이 P301L을 과발현하는 인간 또는 rTg4510 마우스로부터의 뇌 조직을 다음과 같은 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 함유하는 10 부피의 Tris-완충된 염수에서 균질화시켰다: 50 mM Tris/HCl(pH 7.4); 274 mM NaCl; 5 mM KCl; 1% 프로테아제 억제제 혼합물(Roche); 1% 포스파타제 억제제 칵테일 I & II(Sigma); 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF; Sigma). 균질액을 4℃에서 20분 동안 27,000 x g에서 원심분리시켜, 상층액(S1) 및 펠렛 분획을 획득하였다. 펠렛을 5 부피의 고 염/수크로스 완충액(0.8 M NaCl, 10% 수크로스, 10 mM Tris/HCl, [pH 7.4], 1 mM EGTA, 1 mM PMSF)에서 재균질화시키고, 상기와 같이 원심분리하였다. 상층액을 수거하고, 37℃에서 1시간 동안 사르코실(1% 최종 농도; Sigma)과 함께 인큐베이션시킨 후, 4℃에서 1시간 동안 150,000 x g에서 원심분리하여, P3 분획으로 언급되는 사르코실-불용성 펠렛을 획득하였다. P3 펠렛을 뇌 균질액에 대해 사용되는 본래 부피의 절반과 동등한 부피로 TE 완충액(10 mM Tris/HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA)에 재현탁시켰다.
웨스턴
및
도트
블롯
분획화된 조직 추출물 S1 및 P3을 0.1 M DTT를 함유하는 SDS-샘플 완충액에 용해시켰다. 열-처리된 샘플(10분 동안 95℃)을 4 내지 12% Bis-Tris SDS-PAGE 젤(Invitrogen) 상에서의 젤 전기영동에 의해 분리하고, PVDF 막(BioRad Laboratories, Hercules, CA)으로 옮겼다. 도트 블롯 샘플을 샘플 전체에 걸쳐 공지된 농도로 니트로셀룰로스 막(Amersham, Pittsburgh, PA)으로 직접 스포팅하였다. 웨스턴 및 도트 블롯 막 둘 모두를 TBS-Tween(0.5%)(pH 7.4) 중 5% 탈지 분유로 차단한 후, 4℃에서 밤새 1 ㎍/㎖의 D1.2 또는 C10-2에서 인큐베이션시켰다. 막을 세척하고, 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 항-마우스 IgG(1:5000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 향상된 화학발광 시스템(ECL PLUS 키트; PerkinElmer)를 이용하여 검출하였다. 웨스턴 및 도트 블롯 면역반응성의 정량 및 시각적 분석을 컴퓨터-연결 LAS-4000 바이오이미징 어낼라이저 시스템(BioImaging Analyzer System)(Fujifilm, Tokyo, Japan) 및 멀티 게이지(Multi Gauge) v3.1 소프트웨어(Fujifilm)로 수행하였다. 단백질 로딩을 본래 분획의 부피에 의해 조정하였고, 이는 본래 조직의 습윤 중량으로 전환될 수 있다. 결과는 도 1 및 도 2에 제시된다.
실시예
4: 고정된 인간 병리학적 물질을 이용한 396/404 항체의 스크리닝 및 선택
하이브리도마 상층액을 0.1M 카르보네이트 완충액(pH 9)을 이용하여 1 ㎍/㎖의 펩티드 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅된 눈크(nunc) 플레이트에서 항체 결합에 대해 스크리닝하였다.
양성 상층액을 이후 AD 및 건강한 대조군(HC)으로부터의 뇌(P3 펠렛, 실시예 3 참조) 용해질 항원 각각으로 코팅된 ELISA 또는 MSD 플레이트에서의 결합을 위해 PBS, 0.1% BSA 및 0.1 NP40에서 1:50 내지 1:800으로 희석시켰다. 뇌 용해질 항원을 ELISA 또는 MSD 플레이트의 인큐베이션/코팅 전에 0.1 M 카르보네이트 완충액(pH 9)에서 1500배 희석시켰다. 웰을 이후 실온에서 2시간 동안 차단(PBS, 3 ㎎/㎖ BSA, 0.1% NP-40)하고, 항원 결합 활성을 판매업체의 프로토콜에 따라 HRP(DAKO) 및 설포태그(sulfotag)(MSD, product #) 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG로 검출하였다. 0.1% BSA를 갖는 PBS에서 희석된 항체(D1-2, C5-2, C8-3 및 C10-2)의 선택을 용량 반응에 의해 특성규명하였고, 이는 AD-P3 항원 코팅된 플레이트에 대해 나노몰이하(sub-nanomolar) 내지 나노몰의 결합 활성을 나타내었으며, 이를 특정 및 대조군 펩티드의 선택을 위한 결합-활성에 대해 추가로 특성규명하였다. 결과는 도 3에 제시된다.
실시예
5: 펩티드 특이성 및 결합 친화성
병리학적 타우에 대한 결합에 대해 양성인 항체를 일정 범위의 포스포-펩티드(p) 에피토프에 대한 겉보기 친화성(IC50) 및 선택성/특이성에 대해 추가로 특성규명하였다. MSD 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 100 ng/㎖의 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅하였다. 인산화된 타우에 대한 항체를 용량 반응 검정에서 분석하여 ELISA에서 450 nm에서 1.0 내지 1.5의 OD 신호 또는 0.5 내지 2%의 최대 기계 신호에 해당하는 MSD에서의 적절한 분석 신호 수준(통상적으로, 5,000 내지 20,000 RU)을 제공하는 항체 농도를 확인하였다. 선택 항체를 2시간 동안 실온에서 등급화된 농도(0 내지 1000 nM)의 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/404)와 인큐베이션하였다. 반응물을 이후 상기 기재된 바와 같이 100 ng/㎖의 펩티드 인산화된 타우 386 내지 408(pS396/pS404)로 코팅된 펩티드 코팅된 MSD 플레이트에 적용하고, 결합 활성을 측정하였다. 억제 검정으로부터의 IC50 값은 10 내지 100 nM의 겉보기 친화성(KD)에 해당한다.
특이성 및 포스포-선택성: 적절한 농도의 모노클로날 항체를 100 nM의 이중 인산화되거나(pS396/pS404), 인산화되지 않거나, 일-인산화된(pS396 또는 pS404) 인산화 타우 386 내지 408과 함께 인큐베이션하고, 결합 활성에 대해 분석(억제 검정)하였다. 대조군 인산화 타우 펩티드(인산화 타우 260 내지 270(pS262) 또는 인산화 타우 240 내지 270(pS262)) 및 재조합의 인산화되지 않은 타우 단백질을 비교를 위해 분석하였다. 모든 AD-P3 항원 양성 항체는 인산화 펩티드 타우 386 내지 408(pS396/pS404) 및 일-인산화 펩티드 인산화 타우 386 내지 408(pS396)에 대한 강한 선호도를 나타내었고, 일-인산화 펩티드 인산화 타우 386 내지 408(pS404) 및 인산화되지 않은 펩티드 타우 386 내지 408에 대해서는 결합 활성을 나타내지 않았다. 대조군 포스포-펩티드 타우 240 내지 270 및 인산화 타우. 결과는 도 4 및 도 32에 제시된다.
실시예
6: 면역조직화학에 의한 항체의 조직학적 특성규명
마우스 뇌 조직을 8개월령 rTg4510 마우스(CamKII 프로모터 하에서 인간 P301L-타우를 과발현함) 및 비-트랜스제닉 한배새끼(비-Tg)로부터 수거하고, 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 파라핀에 포매시켰다. 전두 피질의 파라핀-포매된 인간 뇌 샘플을 티슈 솔루션즈(Tissue Solutions)(Glasgow, UK)로부터 획득하였다. 최종 단계 알츠하이머병으로 진단된 공여자의 뇌를 연령-매치된 비-치매 대조군 공여자와 비교하였다. 4개의 ㎛ 두께의 절편을 파라핀 제거하고, 10분 동안 10 mM 시트레이트 완충액(pH 6)에서 절편을 마이크로파 처리함으로써 항원 복원에 적용시켰다. 내인성 퍼옥시다제를 1% 하이드로겐 퍼옥시다제 및 이후 PBS/1%BSA/0.3%Triton X-100(PBS-BT) 중 5% 정상 돼지 혈청으로 차단시켰다. 절편을 다양한 농도로 PBS-BT에 희석된 D1.2 및 C10-2 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 절편을 PBS, 0.25% BSA, 0.1% Triton X-100으로 세척한 후, 1시간 동안 1:500으로 비오티닐화된 이차 돼지 항-마우스 항체(E0464; DAKO, Glostrup, Denmark)와 함께 인큐베이션하였다. 추가 세척 후, 스트렙트아비딘-비오틴 컴플렉스(StreptAvidin-Biotin Complex) 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA)를 적용하고, 면역반응성을 디아미노벤지딘으로 시각화시켰다. 절편을 헤마톡실린으로 대조염색시켰다. 결과는 도 5에 제시된다.
실시예
7: 병리학적
타우에
대한 항체의 선택성
MSD 플레이트를 AD 뇌(1:1500 희석됨) 또는 TG4510 뇌(1:3000 희석됨)로부터의 가용화된 P3 항원으로 코팅하였다. 결과는 도 6에 제시된다.
검출은 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행한다.
실시예
8:
HEK
세포 시딩 검정
HEK293 세포를 플레이팅 24시간 후에 6-웰 플레이트에서 인간 타우-P301L-FLAG로 일시적으로 형질감염시키고, 24시간 후 24시간 동안 뇌 균질액과 함께 인큐베이션시킨 후, 세포를 분할하고 재플레이팅시키고, 추가 24시간 후에 수거하였다. 세포를 용해시키고, 1% triton X, Phos-stop 및 완전한 포스파타제 및 프로테아제 억제제(Roche) 완충액으로 보충된 PBS 중에서 음파처리하고, 30분 동안 100,000 x g에서 초원심분리하였다. 펠렛을 SDS에 재현탁시키고, 음파처리하고, 100,000 x g에서 30분 동안 초원심분리하였다. 상층액을 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 인간 타우-P301L을 발현하는 세포는 rTg4510 타우 트랜스제닉 마우스로부터의 전체 뇌 균질액으로 시딩시 불용성(SDS 분획, E1/FLAG 검출)의 과인산화된(D1.2}pS396 검출) 타우를 나타내었다. 마우스로부터의 대조군 뇌 균질액으로 처리된 세포는 응집된 과인산화된 인간 타우의 부재를 나타내었다. 또한, HEK293 세포의 전체 세포 용해질을 Cisbio로부터의 타우 응집 검정을 이용하여 분석하였다. 이러한 검정은 FRET에서 공여자(Tb3+ 컨쥬게이션됨) 및 수용자(d2 컨쥬게이션됨) 항체 둘 모두에 대해 동일한 항체를 이용한 시간-분해 형광을 기초로 한다. 10 ㎕ 샘플을 10 ㎕ 항체 믹스와 혼합하고, 20시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 페라스타(Pherastar) 플레이트 판독기에서 판독하여 시간 분해 형광(FRET 신호 측정/여기 광의 스위칭 후 적분)을 평가하였다. 상기 검정은 높은 특이성 및 민감성으로 인간 부검 물질, rTg4510 마우스 및 시딩된 HEK 세포 모두에서 응집된 타우를 측정한다. 결과는 도 7에 제시되며, 시딩 효과가 HEL을 이용한 처리에 영향을 받지 않았지만, 타우 항체(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)를 이용한 처리에 의해 부분적으로 역전된 것을 나타낸다.
실시예
9: D1.2 및 C10-2에 대한 생체내에서의 기능적(전기생리학적(elphys)) 반응의 역전
4.5 내지 5.5개월령의 rTg4510 및 tTA 대조군 마우스에서 해마의 CA1 영역에서의 시냅스 전달 및 가소성의 생체내 전기생리학적 평가는, i) 기본 시냅스 전달이 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 손상되며, ii) 쌍을 이룬 펄스 촉진이 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 감소되는 것을 나타내었다.
모든 실험을 실험실 동물의 관리 및 이용에 대한 유럽 공동체 위원회 지침(86/609/EEC) 및 동물 시험을 규제하는 덴마크 법령에 따라 수행하였다.
기록 당시에 5 내지 5.5개월령의 rTg4510 및 tTA 수컷 마우스(Taconic Europe A/S)를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 통제된 온도(22 ± 1.5℃) 및 습도 조건(55 내지 65%)에서 그룹화하여 사육하였고, 12:12시간 명/암 주기(06:00h에 점등)로 유지시켰다. 음식 및 물은 자유롭게 이용 가능하였다.
동물을 우레탄(1.2 g/㎏)의 복막내(i.p.) 주사로 마취시켰다. 이후, 마우스를 정위 프레임에 올리고, 체온을 가열 패드를 통해 37.5℃로 조정하고, 두개골을 노출시켰다. 백금선을 참조로서 작용하도록 전두골에 두고, 팍시노스 및 프랭클린의 도감(Paxinos and Franklin, 2001)에 따라 다음과 같은 좌표에서 해마 내에서의 기록 및 자극 전극을 삽입하기 위해 추가 구멍을 뚫었다: 기록, 브레그마 후방 1.5 내지 1.7 ㎜, 중간선 측면 1.0 내지 1.2 ㎜, 뇌 표면 아래 1.4 내지 1.7 ㎜; 자극, 브레그마 후방 1.8 내지 2.0 ㎜, 중간선 측면 1.5 내지 1.7 ㎜, 뇌 표면 아래 1.3 내지 1.7 ㎜. 동물은 기록의 전체 기간 동안 정위 프레임에 놓여 있었고, 이들의 마취 수준을 정기적으로 확인하였다.
장 전위(fEPSP)는 30초마다 샤퍼 곁가지의 전기적 자극에 의해 CA1에서 유발되었고, 음성 fEPSP가 단극 정사각형 펄스에 응답하여 기록될 때까지 기록 전극의 깊이가 조정되었다. 유발된 fEPSP의 기울기는 통상적으로 fEPSP의 최대 진폭의 30 내지 70% 사이에서 측정되었다.
최적 fEPSP가 유도된 후, 자극 강도와 유발된 fEPSP의 기울기 사이의 관계(입력-출력 관계)에 의해 기초 시냅스 전달이 평가되었다. 자극의 상이한 강도는 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 및 500 μA였고, 각 강도에서 2 내지 3회 반복하여 증가하는 순서로 연속적으로 적용되었다. 기초 시냅스 전달은 tTA 마우스에 비해 rTg4510에서 유의하게 손상된 것으로 밝혀졌다.
시냅스전 메커니즘에 의존하는 것으로 생각되는 단기 시냅스 가소성인 쌍을 이룬 펄스 촉진이 rTg4510 및 tTA 마우스에서 추가로 측정되었다. 간단히 말하자면, 25 내지 1000 ms의 다양한 자극간 간격(ISI)을 가진 한 쌍의 자극이 샤퍼 곁가지에 적용되었고, 두번째 fEPSP의 기울기가 첫번째 fEPSP의 기울기와 비교되었다. 모든 ISI에서 촉진이 관찰되었고, 50 및 75 ms의 ISI에서 최대 촉진이 있었다. 흥미롭게도, tTA 마우스와 비교하는 경우 rTg4510 마우스에서 유의하게 낮은 PPF가 관찰되었다.
rTg4510 마우스의 기초 시냅스 전달 및 쌍을 이룬 펄스 촉진에서 확인된 손상을 항체 효능을 시험하기 위한 판독값으로 추가로 사용하였다.
기록을 모든 실험에서 2주 동안 주 당 2회 4 용량의 항체의 투여(i.p.) 2 내지 4일 후에 수행하였다. 기초 시냅스 전달 및 쌍을 이룬 펄스 촉진을 가능한 경우 각각의 동물에서 둘 모두의 해마에서 기록하고, 개별적 실험으로 추가로 사용하였다. 결과는 도 8에 제시되며, CA1 유발된 장 전위에서의 쌍을 이룬 펄스 촉진 및 기초 시냅스 전달 결손의 항체 역전을 제시한다.
실시예
10:
rTg4510
뇌 추출물로부터의
타우의
면역고갈
60 ㎍의 마우스 및 인간화 C10-2 항체를 300 ㎕의 자성 다이나비드(Magnetic dynabead) 현탁액(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex, Cat no 10007D)에 고정시켰다. 충분한 세척 후, 비드를 60 ㎕의 rTg4510 뇌 추출물과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 자성 비드를 추출물로부터 분리하고, 추출물을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. mC10-2 및 hC10-2에 의한 고갈은 타우 응집체를 각각 99 및 99.5% 제거하였다. 결과는 도 12에 제시된다.
실시예
11:
면역고갈된
추출물을 이용한
HEK
세포 시딩 검정
HEK293 세포를 6-웰 플레이트에서 인간 타우-P301L-FLAG로 일시적으로 형질감염시켰다. 24시간 후, 세포를 인간화 또는 마우스 C10-2를 이용하여 면역고갈된 뇌 균질액과 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 재플레이팅하고, 추가 24시간 후에 수거하였다. 세포를 용해시키고, 1% triton X, 포스파타제 및 프로테아제 억제제(Roche)로 보충된 TBS 중에서 음파처리하고, 30분 동안 100,000 x g에서 초원심분리하였다. 펠렛을 1% SDS에 재현탁시키고, 음파처리하고, 100,000 x g에서 30분 동안 초원심분리하였다. 상층액을 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. 인간 타우-P301L을 발현하는 세포는 rTg4510 타우 트랜스제닉 마우스로부터의 전체 뇌 균질액으로 시딩시 불용성(SDS 분획, E1/FLAG 검출)의 과인산화된 타우(D1.2/pS396 타우, 높은 분자량에서 이동함)를 나타내었다. tTA 마우스로부터의 대조군 뇌 균질액으로 처리된 세포는 응집된 과인산화된 인간 타우의 부재를 나타내었다. 또한, HEK293 세포의 전체 세포 용해질을 Cisbio로부터의 타우 응집 검정을 이용하여 분석하였다. HEL 및 hHEL 항체를 이용한 고갈은 시딩에 영항을 미치지 않은 반면, mC10-2 및 hC10-2를 이용한 고갈은 타우 응집을 88% 및 96% 및 불용성 타우를 97% 및 100%로 각각 방지하였다. 결과는 도 13에 제시된다.
실시예
11:
rTg4510
뇌 추출물로부터의
타우의
면역고갈
100 ㎍의 마우스 C10-2, D1.2 및 Tau5(Invitrogen) 항체를 500 ㎕의 자성 다이나비드 현탁액(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex, Cat no 10007D)에 고정시켰다. 충분한 세척 후, 비드를 100 ㎕의 rTg4510 뇌 추출물과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 자성 비드를 추출물로부터 분리하고, 추출물을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. C10-2 및 D1.2는 상업적으로 이용 가능한 Tau5 항체가 그러한 것처럼 균질액으로부터 정상 타우를 제거하지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 2개의 항체는 과인산화된 타우(64 kDa), 즉 세린 396에서 인산화된 타우를 95%만큼 특이적으로 제거한다. 결과는 도 14에 제시된다.
실시예
12: 알츠하이머 뇌 추출물로부터의
타우의
면역고갈
100 ㎍의 마우스 C10-2 및 D1 항체를 500 ㎕의 자성 다이나비드 현탁액(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex, Cat no 10007D)에 고정시켰다. 충분한 세척 후, 비드를 100 ㎕의 알츠하이머 뇌 추출물과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 자성 비드를 추출물로부터 분리하고, 추출물을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. D1.2 및 C10-2는 뇌 균질액에서 전체 타우 중 매우 적은 분획(8%)만 제거한다. 그러나, 상기 항체는 AD 환자에 특이적인 과인산화된 타우를 특이적으로 제거(90%)한다. 결과는 도 15에 제시된다.
실시예
13:
면역고갈된
추출물을 이용한
rTg4510
마우스에서의 시딩
CamK2 양성 뉴런(rTg4510)에서 tet-off 반응 요소 하에서 인간 돌연변이된 타우(P301L 0N4R)를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하였다. 상기 모델은 일반적으로 3개월령에서 타우 병리가 발달하기 시작하나, 임신 중에 독시사이클릭을 어미에게 먹이고, 새끼의 생후 3주 동안 독시사이클린을 먹임으로써, 병리는 이후 단계(6개월령 후에 시작)에서 발달한다. 연구에 사용된 독시사이클린 전처리 마우스는 주사 시점에 2.5개월령이었다. 마우스를 정위 프레임에 고정된 이소플루란 흡입에 의해 마취시켰다. 두개골을 노출시키고, 브레그마 및 람다가 수평이 될때까지 조정하였다. 두개골에서 브레그마의 측면 2 ㎜(우측) 및 후방 2.4 ㎜에 구멍을 뚫었다. 상기 언급된 좌표에서 뇌 표면에 대해 1.4 ㎜ 내면에 시딩 물질을 주사하기 위해 10 ㎕ 주사기 베벨드 팁(syringe beveled tip; SGE)을 사용하였다. 실시예 11 및 12에 기재된 2 ㎕의 면역고갈된 추출물을 상기 부위에서 천천히 주입(1 ㎕/분)하고, 주사기를 5분 동안 방치한 후 이를 제거하였다. 상처를 바늘로 막고, 마우스를 깨어날 때까지 가온시켰다. 마우스를 3개월 동안 사육한 후, 희생시키고, 4% PFA로 관류 고정시켰다.
면역조직화학: 고정된 뇌를 NSA에서 35 ㎛의 관상면 절편으로 절단하고, 6번째 절편을 타우 매듭(갈리야스(Gallyas) 은 염색) 및 과인산화된 타우(AT8)에 대해 염색하였다. 양성으로 염색된 뉴런(soma)을 모든 뇌의 해마의 동측 및 대측에서 계수하였다. 해마의 모든 하위영역을 포함시켰다. 뇌 당 8개의 절편을 계수하였다. 결과는 8개의 절편으로부터의 양성 뉴런의 합계를 반영한다. 배경 신호를 2마리의 주사되지 않은 마우스에서 결정하였다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다. 결과는 도 16에 제시된다. rTg4510 (A) 또는 AD (B) 뇌 균질액으로 시딩된 rTg4510 뇌에서의 타우 병리의 정량화. 시딩 전, 과인산화된 타우는 C10-2 또는 D1.2를 이용하여 균질액에서 90 내지 95%만큼 감소되었으나, 정상 타우는 그렇지 않았다. 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 균질액은 더 이상 타우 병리의 시딩을 유도하지 않는다.
내인성 타우 병리가 발달하지 않은 단계의 rTg4510 마우스에서 rTg4510 또는 알츠하이머 뇌로부터의 균질액이 타우 병리를 시딩시킬 수 있다. 실시예 11 및 12에 기재된 바와 같이 D1.2 또는 C10-2를 이용함으로써 균질액으로부터 과인산화된 타우를 제거함으로써, 시딩 활성이 폐기된다.
실시예
14:
시딩된
rTg4510
마우스에서의 항체 처리
독시사이클린 처리된 rTg4510 마우스(실시예 13에 기재된 바와 같음)를 2개월령에서 시작하여 마우스 D1.2 또는 대조군 항체를 15 ㎎/㎏/주로 만성적으로 처리하였다. 2.5개월에서, rTg4510 뇌 추출물을 해마에 주입하였다(실시예 13에 기재된 바와 같음). 마우스를 뇌 주입 및 면역조직화학 1, 2 및 3개월 후에 희생시키고, 이후 분석을 실시예 13에 기재된 바와 같이 수행하였다. D1.2 처리는 시딩이 개시된 지 2 및 3개월 후에 타우 병리를 유의하게 감소시켰다. 결과는 도 17에 제시된다.
시딩된 rTg4510 마우스의 해마에서의 매듭 함유 뉴런의 정량화. 병리는 시간에 따라 증가하고, 마우스를 D1.2로 처리함으로써, 병리가 시딩 2 및 3개월 후에 유의하게 낮아진다. 시딩된 rTg4510 마우스의 해마에서의 매듭 함유 뉴런의 정량화. 병리는 시간에 따라 증가하고, 마우스를 D1.2로 처리함으로써, 병리가 시딩 2 및 3개월 후에 유의하게 낮아진다.
내인성 타우 병리가 발달하지 않은 단계에서 rTg4510 마우스에서 rTg4510 또는 알츠하이머 뇌로부터의 균질액이 타우 병리를 시딩시킬 수 있다. 마우스를 D1.2로 전신 처리함으로써, 타우 병리의 발달이 유의하게 감소될 수 있다.
실시예
15: 인간화된
타우
항체를 이용한 알츠하이머 뇌 추출물로부터의
타우의
면역고갈
100 ㎍의 마우스 및 인간화 C10-2뿐만 아니라 종래 항체 2.10.3 및 HJ8.5 항체(source)를 500 ㎕의 자성 다이나비드 현탁액(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex, Cat no 10007D)에 고정시켰다. 충분한 세척 후, 비드를 100 ㎕의 알츠하이머 뇌 추출물과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 자성 비드를 추출물로부터 분리하고, 추출물을 웨스턴 블롯 및 CisBio 검정에 의해 분석하였다. 마우스 및 인간화 C10-2는 pS396 인산화 타우의 93 및 97%를 효율적으로 제거하였으나, hHel 대조군 항체에 비해 전체 타우의 22 및 17%만 제거하였다. 2.10.3 항체는 세린 396 인산화 타우의 91% 및 전체 타우의 10%를 제거하였다. 2.10.3은 C10-2 항체(중간 64 kDa 밴드)와 비교하여 과인산화된 밴드 중 하나를 제거하는데 있어서 덜 효율적인 것으로 보인다. HJ8.5 항체는 대부분의 타우, 전체 타우의 89% 및 pS396 타우의 88%를 제거함으로써 C10-2 및 2.10.3 항체 둘 모두와 완전히 상이한 프로파일을 갖는다. 결과는 도 23 및 도 24에 제시된다.
실시예
16: 인간화된
타우
항체를 이용한 알츠하이머 뇌 추출물로부터의 응집된
타우의
면역고갈
실시예 13에 기재된 면역고갈된 AD 추출물을 또한 실시예 10에 기재된 타우 응집 검정을 이용하여 분석하였다. C10-2 및 HJ8.5 항체는 2.10.3 항체보다 AD 물질로부터 응집된 타우를 더욱 효율적으로 제거한다. 효율 순서: 모두 hHel 항체와 비교하여 HJ8.5(99%), hC10-2(98%), mC10-2(96%) 및 2.10.3(90%). 결과는 도 25에 제시된다.
실시예
17:
타우의
면역고갈
25 ㎍의 항체(인간화 C10-2 또는 2.10.3)를 125 ㎕의 자성 다이나비드 현탁액(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex, Cat no 10007D)에 고정시켰다. 충분한 세척 후, 코팅된 비드를 다양한 양의 코팅되지 않은 세척된 비드와 혼합하였다. 5 ㎍ 항체에 해당하는 100%의 Ab 코팅된 비드로부터 시작하여 100%의 코팅되지 않은 비드까지 내렸다. 비드의 전체량은 모든 샘플에서 동일하였다. 비드를 20 ㎕의 AD 추출물과 혼합하고, 10분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 자성 비드를 추출물로부터 분리하고, 추출물을 분취시키고, 급속 동결시키고, 사용 때까지 -80℃에서 유지시켰다.
웨스턴
블롯을
이용한 고갈의 분석
샘플을 1x LDS 로딩 완충액 및 100 mM DTT에서 비등시켰다. 3 ㎕의 추출물에 해당하는 부피를 4 내지 12% Bis-Tris NuPAGE 젤(LifeTech Novex)에 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질을 Immobilon-FL PVDF 막(0.45 ㎛, IPFL10100, Millipore) 상에서 블로팅시켰다. 막을 SEA 차단 완충액(Prod#37527, Thermo)으로 차단시켰다. 타우 및 P-타우 수준을 Tau5(Abcam ab80579, 1:2000) 마우스 C10-2(1 ㎍/㎖), P-S199/202(Invitrogen 44768 G, 1:1000), P-S422(Abcam ab79415, 1:750), 인간 IPN (1 ㎍/㎖)을 이용하여 샘플에서 평가하였다. Gapdh 및 액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다(Abcam ab9484, 1:2000, Sigma A5441, 1:20000). 이차 플루오로포어 컨쥬게이션된 IgG 항체(IRDye 800CW 염소 항-인간, IRDye 800CW, 염소 항-토끼, IRDye 680 염소 항-마우스, LI-COR biosciences)를 사용하였고, 신호를 오디세이(Odyssey) CLx 및 이미지 스튜디오(Image studio) 소프트웨어(LI-COR biosciences)를 이용하여 정량하였다.
개별적 밴드뿐만 아니라 전체 레인에서의 신호의 정량화를 수행하였고, 이로부터 S자형 용량-반응 곡선을 작도하였고, 가능한 경우 최대 효과 및 EC50 값을 평가하였다.
결과
둘 모두의 항체는 알츠하이머 뇌 제조물로부터 적은 분획의 타우를 제거한다. P-S422 타우에 대한 특이성을 갖도록 설계된 2.10.3은 전체 타우량의 24%까지 제거하는 반면, C10-2는 전체 타우의 15%까지 제거한다(도 26 참조).
2.10.3 및 C10-2 둘 모두는 P-S422 타우의 50%를 제거하는데 필요한 항체의 양이 상이하더라도 세린 422에서 인산화된 타우의 90% 초과를 제거하였고, 동일 효과를 위해 2.10.3의 경우 0.42 ㎍의 항체가 필요하고, C10-2의 경우 0.27 ㎍이 필요하다(도 27 참조).
C10-2는 세린 396에서 인산화되는 타우를 효율적으로 제거한다(최대 효과: 88%, 0.30 ㎍ 항체를 사용하여 효과의 절반에 도달함). 2.10.3는 세린 396에서 인산화되는 타우의 적은 분획을 제거한다(최대 효과: 60%, 0.63 ㎍ 항체를 사용하는 경우 효과의 절반에 도달함)(도 28 참조). 이는 세린 422에서 인산화되는 모든 타우가 또한 세린 396에서 인산화되나, 위치 422에서 인산화된 세린이 존재하지 않는 세린 396에서 인산화되는 과인산화된 타우의 일부가 존재하는 것을 나타낸다.
C10-2에 의해 제거되는 타우의 대부분은 또한 세린 199/202에서 인산화되는데, 이는 상기 인산화를 갖는 타우의 69%가 면역고갈에 의해 영향을 받기 때문이다(0.34 ㎍ 항체를 이용하는 경우 효과의 절반)(도 29 참조). 2.10.3 면역고갈은 P-S199/202 타우에 대해 S자형 용량 반응을 발생시키지 않지만, 증가하는 양의 항체로 신호에서의 저하가 관찰된다(최대량의 항체(5 ㎍)를 이용하는 경우 최대 52% 감소) (도 29 참조).
이러한 데이터는 인산화된 세린 396을 표적으로 하는 C10-2 항체가 422 위치에서 인산화된 세린을 표적으로 하는 2.10.3 항체보다 더 큰 풀(pool)의 과인산화된 타우에 결합하는 것을 나타낸다.
실시예
18: AD 뇌 용해질에서의 병리학적
타우
항원의
mC10
-2 특이적 포획의 항체 매개 억제
재료 및 방법
재료
코팅 완충액: 카르보네이트 완충액 pH 8.5, 150 mM NaCL. 차단 완충액: PBS(pH7.4) 중 3% BSA(분획 V), 0.1% NP40. 세척 완충액: PBS(pH 7.4) 중 0.1% BSA(분획 V), 0.1% NP40. 설포태그 염소 전체 인간화 타우 항체(MSD D221LA-1, 50 ㎍/㎖).
본 방법은 타우 항원과 증가하는 농도의 pS396 특이적 항체의 인큐베이션(단계 B) 후에 C10-2 코팅된 플레이트를 이용한 AD 뇌로부터의 병리학적 인간 타우 항원의 포획(단계 A)을 측정하는 것을 목표로 한다. 타우 항원 포획 및 항체 매개 억제를 MSD로부터의 설포-태깅된 항 인간(전체) 타우 항체를 이용하여 검출하였다.
A: MSD 플레이트를 코팅 완충액 중 0.5 ㎍/㎖의 mC10-2(포획 항체)로 코팅(4℃에서 o/n)시키고, 이후 (실온에서 1시간 동안) 차단시키고, 3회 세척하였다. (도 30)
B: AD(3명의 환자로부터 풀링됨)로부터의 샘플 P3 용해질(1:1000 = 2 내지 4 ㎍/㎖ 전체 단백질) 및/또는 S1(p)(1:300=20 내지 40 ng/㎖ 전체 단백질)를 등급화된 농도의 pS396 펩티드 에피토프 특이적 항체와 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 이후 단계 A에서 제조된 플레이트 상에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. (도 31)
C: C10-2 포획된 타우를 설포-태깅된 인간 타우를 이용하여 검출하였다. 제조업체의 설명서에 따른 MSD로부터의 타우 항체(1:50). 플레이트를 MSD SECTOR® S 600에서 분석하였다. AD P3 및 AD S1(p)를 유사한 설정으로 시험하였다. (도 33/34)
표 6A
표 6B
표 6C
표 6D
표 6A 내지 표 6D:
타우
항원 포획 억제
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> H. Lundbeck A/S
<120> Tau 396 antibodies
<130> 0995-WO-PCT
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 CDR 1 Light Chain
<400> 1
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 CDR 2 Light Chain
<400> 2
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 CDR 3 Light Chain
<400> 3
Ser Gln Ser Thr His Val Pro
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 CDR 1 Heavy Chaiin
<400> 4
Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Ile His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 CDR 2 Heavy Chain
<400> 5
Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 CDR 3 Heavy Chain
<400> 6
Ser Arg Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 Light Chain
<400> 7
Asp Val Met Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2 Heavy Chain
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val
195 200 205
Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu
370 375 380
Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp Ile
405 410 415
Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg
420 425 430
His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 CDR 1 Light Chain
<400> 9
Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 CDR 2 Light Chain
<400> 10
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 CDR 3 Light Chain
<400> 11
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 CDR 1 Heavy Chain
<400> 12
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 CDR 2 Heavy Chain
<400> 13
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 CDR 3 Heary Chain
<400> 14
Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 Light Chain
<400> 15
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 16
<211> 439
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C10.2 Heavy Chain
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 CDR 1 Light Chain
<400> 17
Gln Ala Ser Gln Asp Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 CDR 2 Light Chain
<400> 18
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 CDR 3 Light Chain
<400> 19
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro
1 5
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 CDR 1 Heavy Chain
<400> 20
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 CDR 2 Heavy Chain
<400> 21
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 CDR 3 Heavy Chain
<400> 22
Arg Gly Thr Met Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 Light Chain
<400> 23
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 24
<211> 439
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C5.2 Heavy Chain
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Asn Asp Met Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 CDR 1 Light Chain
<400> 25
Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 CDR 2 Light Chain
<400> 26
Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 CDR 3 Light Chain
<400> 27
Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 CDR 1 Heavy Chain
<400> 28
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 CDR 2 Heavy Chain
<400> 29
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 CDR 3 Heavy Chain
<400> 30
Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 Light Chain
<400> 31
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 32
<211> 439
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> C8.3 Heavy Chain
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 33
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> No 33 Human Tau
<400> 33
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 34
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> D1.2* Light Chain
<400> 34
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 444
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hC10.2 Heavy Chain
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> hC10.2 LC
<400> 36
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 386-408 Tau with Phosphorylated S396 and S404
<400> 37
Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
20
Claims (53)
- 인간 타우(tau)(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 온전한 항체로 구성되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, Fv 단편(예를 들어, 단일쇄 Fv 및 이황화-결합된 Fv); Fab-유사 단편, 예를 들어, Fab 단편, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편; 및 도메인 항체, 예를 들어, 단일 VH 가변 도메인 또는 VL 가변 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 에피토프-결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입의 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간의 또는 인간화된 것인 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 타우(SEQ ID NO:33) 상의 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3. - 제7항에 있어서, SEQ ID NO:8의 중쇄 또는 SEQ ID NO:7의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제7항에 있어서, SEQ ID NO:8의 중쇄 및 SEQ ID NO:34의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:13의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:14의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3. - 제10항에 있어서, SEQ ID NO:16의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:15의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3. - 제12항에 있어서, SEQ ID NO:24의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:23의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3;
(d) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1;
(e) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 및
(f) SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3. - 제14항에 있어서, SEQ ID NO:32의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:31의 경쇄를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:32 및 SEQ ID NO:35로 구성된 군으로부터 선택되고, 경쇄가 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:36으로 구성된 군으로부터 선택되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:28로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:29로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
(c) SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:30으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
(d) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:19 및 SEQ ID NO:27로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
(a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
(b) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2;
(c) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3; 및
(d) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3. - 티로신 잔기로부터 2개의 잔기가 제거된 인산화된 세린을 포함하는 과인산화된 타우의 아미노산 모티프에 대해 선택성인 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제19항에 있어서, 아미노산 모티프가 하기 서열을 갖는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편:
-Y - X - S(인산화됨) - P -
(여기서, Y는 티로신이고, X는 천연 발생 아미노산이고, P는 프롤린이고, S(인산화됨)는 인산화된 하이드록실 측쇄를 갖는 세린임). - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역을 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 모이어티를 추가로 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, i) 항체가, 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합하지 않고; ii) 396이 인산화되지 않은 경우, 항체가, 404에서 인산화된 타우에 실질적으로 결합하지 않고; iii) 항체가, 396에서 인산화된 타우에 결합하고; iv) 396 및 404 둘 모두가 인산화된 경우 항체가 타우에 결합하는 시험 기준에 따라, 인산화된 잔기 396을 포함하는 인간 타우에 대한 면역특이적 결합을 나타내는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37) 내에서 적어도 18개의 연속적 아미노산 잔기, 예를 들어, 적어도 20개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화 펩티드에 대해 유도되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제24항에 있어서, 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)을 포함하는 18 내지 40개, 예를 들어, 18 내지 30개, 예를 들어, 20 내지 30개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화 펩티드에 대해 유도되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 연령-매치된 건강한 대조군에 비해 AD-병에 걸린 환자로부터의 포스포타우(pTau)에 대한 특이성을 갖는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편으로서, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 포스포-특이적 및 멀티머-특이적 셋업(Setup) 1 ELISA를 이용하여 AD 및 건강한 대조군 대상체로부터의 뇌 균질액에서 포스포타우(pTau)(SEQ ID NO:33)를 검출하는 ELISA 기반 검정에서 건강한 대조군 물질에 비해 AD 질병 물질에 대한 특이성에 있어서 50배 초과, 예를 들어, 100배 초과로 증가한 연령-매치된 건강한 대조군으로부터의 타우에 비한 AD-병에 걸린 환자로부터의 포스포타우(pTau)에 대한 특이성 차이를 갖는, 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, AD-병에 걸린 타우에 대한 특이성을 갖는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편으로서, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 포스포-특이적 및 멀티머-특이적 셋업 1 ELISA를 이용하여 AD 및 건강한 대조군 대상체로부터의 뇌 균질액에서 포스포타우(pTau)(SEQ ID NO:33)를 검출하는 ELISA 기반 검정에서 건강한 대조군 물질에 비해 AD 질병 물질에 대한 특이성에 있어서 50배 초과, 예를 들어, 100배 초과로 증가한 연령-매치된 건강한 대조군에 비한 AD에 대한 특이성 차이를 갖는, 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 인간 타우(SEQ ID NO:33)의 인산화된 잔기 396에 면역특이적으로 결합할 수 있는 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)의 이-인산화된 펩티드에 대해 유도된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편으로서, 세포주, 예를 들어, 인간 세포주, 포유동물 비-인간 세포주, 곤충, 효모 또는 박테리아 세포주에서 생성되거나 제조된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제29항에 있어서, CHO 세포주, HEK 세포주, BHK-21 세포주, 뮤린 세포주(예를 들어, 골수종 세포주), 섬유육종 세포주, PER.C6 세포주, HKB-11 세포주, CAP 세포주 및 HuH-7 인간 세포주에서 생성된 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가, i) 포스포-에피토프 S396에 대해 면역 특이적이고, ii) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우를 특이적으로 인지하는 클론을 분리하기 위해 인간 병리학적 및 비-병리학적 타우로 하이브리도마를 스크리닝함으로써 분리된 하이브리도마에 의해 발현되는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편으로서, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프 결합 단편이 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별할 수 있는, 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 검출 가능한 모이어티를 추가로 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제32항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 형광 표지, 화학발광 표지, 상자성(paramagnetic) 표지, 방사성 동위원소 표지 또는 효소 표지인 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 제제로서, 상기 제제가 타우에 결합할 수 없거나, 제제의 항-타우 기능성을 크게 변경시키지 않는 천연-발생 항체를 실질적으로 함유하지 않고, 상기 기능성이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 제제:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없거나, S396에 우선적으로 결합하는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 실시예에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력. - 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 제제로서, 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편이 천연-발생 항-타우 항체의 구조에 비해 이의 아미노산 서열에 있어서 구조적 변화를 갖고, 상기 구조적 변화가 상기 모노클로날 항체 또는 상기 단편이 상기 천연-발생 항-타우 항체에 의해 나타나는 기능성에 비해 변경된 기능성을 나타내도록 하고, 상기 기능성이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 제제:
(i) 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(ii) S404에서 인산화되고, S396에서 인산화되지 않은 타우에 실질적으로 결합할 수 없음;
(iii) S396에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(iv) S396 및 S404 둘 모두에서 인산화된 타우에 결합하는 능력;
(v) 인산화된 타우 잔기 S396과 인산화된 타우 잔기 S404 사이를 선택적으로 구별하여, 인산화된 404 잔기에 실질적으로 결합할 수 없거나, S396에 우선적으로 결합하는 능력;
(vi) 인간 알츠하이머병 뇌로부터의 과인산화된 타우에 결합하는 능력;
(vii) 병리학적 인간 타우 단백질과 비-병리학적 인간 타우 단백질을 구별하는 능력; 및/또는
(viii) 본원에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 마우스로부터의 면역-고갈된 rTg4510 추출물과 함께 사용되는 경우 과인산화된 타우 64 kDa 및 70 kDa 밴드를 적어도 90%만큼 특이적으로 감소시키는 반면 55 kDa 타우 밴드는 10% 초과로 감소시키지 않는 능력. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제34항 또는 제35항에 따른 제제, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 인코딩하거나, 이들의 구성 사슬을 인코딩하는 핵산.
- 요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 제34항 또는 제35항에 따른 제제, 또는 제36항의 약학적 조성물.
- 타우병증의 치료, 진단 또는 영상화에 사용하기 위한 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 제34항 또는 제35항에 따른 제제, 또는 제36항의 약학적 조성물.
- 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 정신병, 특히 AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 루이 소체(Lewy body) 치매를 갖는 환자의 정신병 증상, 진행성 핵상 마비(PSP), 전두측두엽 치매(FTD 또는 이의 변형), TBI(외상성 뇌 손상, 급성 또는 만성), 피질기저핵 변성(CBD), 픽병, 원발성 연령-관련 타우병증(PART), 신경섬유 매듭-우세 노인 치매, 권투선수 치매(Dementia pugilistica), 만성 외상성 뇌병증, 뇌졸중, 뇌졸중 회복, 파킨슨병과 관련된 신경변성, 염색체와 연관된 파킨슨증, 리티코-보디그 병(Lytico-Bodig disease)(괌의 파킨슨-치매 복합증(Parkinson-dementia complex of Guam)), 신경절교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 뇌염후 파킨슨증, 아급성 경화 범뇌염, 헌팅턴병, 납중독뇌병증, 결절경화증, 할러포르텐-스파츠병 및 지방갈색소증으로 구성된 군으로부터 선택되는 타우병증을 치료하는 데 사용하기 위한 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제34항 또는 제35항에 따른 제제 또는 약학적 조성물, 또는 제36항에 따른 조성물.
- 타우병증을 치료하거나, 진단하거나, 영상화하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제34항 또는 제35항에 따른 제제, 또는 제36항에 따른 약학적 조성물.
- 제41항에 있어서, 약제가 알츠하이머병, 은친화 입자병(AGD), 진행성 핵상 마비(PSP), 피질기저핵 변성(CBD), AD로 인한 정신병 또는 AD를 갖는 환자의 정신병, 및 루이 소체 치매를 갖는 환자의 정신병 증상을 치료하기 위한 것인 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 제제 또는 약학적 조성물, 또는 조성물.
- 대상체에서 알츠하이머병 또는 기타 타우병증을 치료하거나, 진단하거나, 영상화하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 대상체로 유효량의 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 제34항 또는 제35항에 따른 제제, 또는 제36항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제43항에 있어서, 치료가 만성 치료인 방법.
- 제44항에 있어서, 만성 치료가 적어도 2주, 예를 들어, 적어도 1개월, 6개월, 1년 이상 동안의 치료인 방법.
- 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 요법에 사용하기 위한 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 제34항 또는 제35항에 따른 제제, 또는 제36항의 약학적 조성물을 포함하는 키트.
- 대상체의 뇌에서 상기 타우의 존재 또는 양을 검출하거나 측정하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 또는 상기 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는 제제 또는 약학적 조성물.
- 제48항에 있어서, 상기 검출 또는 측정이 상기 타우에 결합된 상기 항-타우 항체의 생체내 영상화를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 제제, 또는 약학적 조성물.
- 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 검출 또는 측정이 상기 타우에 결합된 상기 항-타우 항체 또는 이의 단편의 생체외 영상화를 포함하는 모노클로날 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편, 제제, 또는 약학적 조성물.
- 과인산화된 타우와 항체를 접촉시켜 매듭(tangle)에서 과인산화된 타우의 90%가 고갈되도록 하는 단계를 포함하는 과인산화된 타우를 포함하는 매듭으로부터 과인산화된 타우를 제거하는 방법으로서, 상기 항체가 인산화된 잔기 396을 갖는 타우에 대해 선택적이거나, 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 인산화된 잔기 396을 갖는 타우에 대해 선택적인 항체를 투여함으로써 환자에서 병리학적 타우 단백질의 축적을 감소시키거나 감쇠시키는 단계를 포함하는, 환자에서 알츠하이머병의 진행을 지연시키는 방법.
- 하기 단계를 포함하는 인산화된 S396 잔기를 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 면역특이적인 고 특이성의 고 친화성 항체를 생성하기 위한 방법에 의해 생성된 항체:
(A) 포유동물에 면역원을 주사함으로써 상기 포유동물을 면역화시키는 단계로서, 상기 면역원이 2N4R 타우의 잔기 386 내지 410을 포함하는 TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)을 포함하는 18 내지 40개, 예를 들어, 18 내지 30개, 예를 들어, 20 내지 30개의 연속적 아미노산 잔기를 포함하는 이-인산화된 펩티드를 포함하는, 단계;
(B) 상기 포유동물의 상기 면역화를 2회 이상 반복하는 단계;
(C) 상기 반복적으로 면역화된 포유동물로부터의 혈청 샘플을 인산화된 S396 잔기를 포함하는 병원성의 과인산화된 타우에 결합할 수 있으나, 비-병원성의 타우에 실질적으로 덜 결합할 수 있는 고 특이성의 고 친화성 항체의 존재에 대해 스크리닝하는 단계; 및
(D) 상기 고 특이성의 고 친화성 항체를 회수하는 단계.
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