CN107847595A - 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法 - Google Patents

特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107847595A
CN107847595A CN201680040472.7A CN201680040472A CN107847595A CN 107847595 A CN107847595 A CN 107847595A CN 201680040472 A CN201680040472 A CN 201680040472A CN 107847595 A CN107847595 A CN 107847595A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tau protein
seq
antibody
amino acid
binding fragments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201680040472.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107847595B (zh
Inventor
J·T·彼得森
L·*·彼得森
L·Ø·彼得森
J·C·A·达奇塞尔
A·阿卜杜勒-拉希德阿苏尼
N·罗森奎斯特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
H Lundbeck AS
Original Assignee
H Lundbeck AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1512211.2A external-priority patent/GB201512211D0/en
Priority claimed from GBGB1518375.9A external-priority patent/GB201518375D0/en
Application filed by H Lundbeck AS filed Critical H Lundbeck AS
Publication of CN107847595A publication Critical patent/CN107847595A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107847595B publication Critical patent/CN107847595B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新颖种类的单克隆抗体，其特异性地结合病理性过度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化丝氨酸396残基(pS396)，并且涉及在阿尔茨海默病和τ蛋白病变的治疗中使用这些分子以及它们的τ蛋白结合片段的方法。

Description

特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法
发明领域
本发明涉及一种新颖种类的单克隆抗体，其特异性地结合病理性过度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化丝氨酸396残基(pS396)，并且涉及在阿尔茨海默病和τ蛋白病变的治疗中使用这些分子以及它们的τ蛋白结合片段的方法。
序列表的引用
本申请包括根据37C.F.R.1.821等的一个或多个序列表，所述序列表以计算机可读介质披露(文件名称：0995.txt，创建于2016年6月23日，并且具有40kB的大小)，将该文件通过引用以其全文结合在此。
发明背景
年龄相关性神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(AD)和痴呆，是现今的最大社会性挑战之一。世界卫生组织估计，护理老年人的成本将持续增加并且诊断为痴呆的病例的数目到2050年增至三倍(世界卫生组织和阿尔茨海默病国际状态报告(2012)痴呆：公共卫生优先事项(World Health Organization and Alzheimer's Disease International-Status Report(2012)DEMENTIA:A public health priority)，WHO)。对于AD的首要治疗是神经递质调节剂，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA调节剂。这些疗法在世纪之交变得可用，并且仍然形成用于痴呆和AD相关的记忆缺陷的症状减轻的基础。然而，这些药物不靶向AD的潜在病因，即淀粉样蛋白β(Aβ)肽和τ蛋白聚集体的积累以及神经元突触和最终神经元的相关损失。
对老年人的纵向的社区范围的研究(韦纳(Weiner)，M.W.等人(2014)ADNI在线：http://www.adni-info.org/；布勒泰尔(Breteler)，M.M.等人(1992)神经流行病学(Neuroepidemiology)11增刊1，23-28；劳纳(Launer)，L.J.(1992)神经流行病学(Neuroepidemiology)11增刊1，2-13)以及大基因组范围相关研究(兰伯特(Lambert)，J.C.等人(2013)自然基因组学(Nat.Genet.)45，1452-1458)已经显示，AD是痴呆的多相混合物，其中高达10％的晚期AD患者缺乏淀粉样蛋白病变(克拉里(Crary)，J.F.等人(2014)神经病理学学报(Acta Neuropathol.)128，755-766)。此外，由布拉克(Braak)&布拉克(Braak)进行的开创性病理学研究(布拉克(Braak)，H.和布拉克(Braak)，E.(1996)斯堪的纳维亚神经学学报(Acta Neurol.Scand.)增刊165，3-12)证明神经原纤维缠结病变程度与尸体解剖前的认知状态之间的明显相关。这些观察已经通过一些研究者(内尔松(Nelson)，P.T.等人(2012)神经病理学与实验神经学杂志(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)71，362-381)以及在最近的纵向生物标记研究中得以验证，所述研究指示，贯穿该疾病的早期和后期，τ蛋白和磷酸化τ蛋白的脑脊液(CSF)水平增加(杰克(Jack)，C.R.，Jr.等人(2013)柳叶刀神经学(Lancet Neurol.)12，207-216)。
如以上指出的，微管相关蛋白、τ蛋白、及其过度磷酸化形式形成作为AD的一类主要标志的细胞内神经原纤维缠结的主要成分。此外，τ蛋白的具体基因变体与额颞痴呆(FTD)的家族形式相关联。在AD中τ蛋白病变的表现以不同的空间模式出现，起始于内嗅皮层中，随后为海马区以及皮层区(布拉克(Braak)，H.和布拉克(Braak)，E.(1996)斯堪的纳维亚神经学学报(Acta Neurol.Scand.)增刊165，3-12)。τ蛋白病变的具体阶段还良好地与认知能力相关(内尔松(Nelson)，P.T.等人(2012)神经病理学与实验神经学杂志(J.Neuropathol.Exp.Neurol.)71，362-381；布拉克(Braak)，E.等人(1999)欧洲精神病学与临床神经科学档案(Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.)249增刊3，14-22)。综上，此证据形成对于AD的基于τ蛋白的假设的基础。需要的是τ蛋白的细胞内积累导致微管变性和脊髓坍塌。结果是神经元之间的通信故障和细胞死亡随之发生。最近，还已经显示τ蛋白本身可以形成内-病原性种类，这些种类可以将神经变性从一个细胞传递到下一个细胞(克拉维古(Clavaguera)，F.等人(2009)自然细胞生物学(Nat.Cell Biol.)11，909-913)。
I.作为内-病原体的τ蛋白
克拉维古(Clavaguera)和同事们已经证明τ蛋白本身可以充当内-病原体(克拉维古，F.等人(2009)自然细胞生物学(Nat.Cell Biol.)11，909-913)。低自旋脑提取物分离自P301Sτ蛋白转基因小鼠(艾伦(Allen)，B.等人(2002)神经科学杂志(J.Neurosci.)22，9340-9351)，稀释并且注入幼小ALZ17小鼠的海马体和皮层区中。该ALZ17小鼠是τ蛋白转基因小鼠品系，该品系仅发展晚期病变(普罗布斯特(Probst)，A.等人(2000)神经病理学学报(Acta Neuropathol.)99，469-481)。经注射的ALZ17小鼠快速发展实体丝状病变，并且给予来自P301S小鼠的经免疫耗减的脑提取物或来自野生型小鼠的提取物并不诱导τ蛋白病变。将脑提取物在可溶(S1)和十二烷基肌氨酸钠-不溶的τ蛋白(P3)(撒哈拉(Sahara)，N.等人(2013)阿尔茨海默病杂志(J.Alzheimer’s.Dis.)33，249-263)方面分级并且将这些注入ALZ17小鼠证明了P3部分是诱导病变中最有力的。它包含多数的细胞内过度磷酸化丝状τ蛋白。大部分的病变还可以在将P301S提取物注入野生型小鼠的脑中时诱导，但无NFT形成。在后续的研究中，克拉维古等人已经显示，从其他τ蛋白病变(嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD))的尸体解剖后的脑组织提取的人类τ蛋白也可以在ALZ17模型中诱导τ蛋白病变(克拉维古，F.等人(2013)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)110，9535-9540)。自从呈现了这些数据，若干其他τ蛋白接种和扩展模型已经被报道(艾哈迈德(Ahmed)，Z.等人(2014)神经病理学学报(ActaNeuropathol.)127，667-683；沃克(Walker)，L.C.等人(2013)美国医学会杂志:神经学分册(JAMA Neurol.)70，304-310)。从这些研究得出的主要结论指示一种机制，通过该机制在细胞内内含物中的病原性τ蛋白从该细胞分泌进入周质空间。然后病理τ蛋白材料沿着囊泡鞘以顺行方向和逆行方向被运输，并且随后通过批量内吞作用被邻近细胞吸收。这个机制解释了为什么在人类疾病中观察到的病变的扩展遵循不同的解剖学模式。有趣的是，病理性τ蛋白的外周给予可以加速ALZ17小鼠中τ蛋白病变的形成(克拉维古，F.等人(2014)神经病理学学报(Acta Neuropathol.)127，299-301)。该扩展机制可以解释其他蛋白病变中的疾病传播(格代尔(Goedert)，M.等人(2010)神经科学趋势(Trends Neurosci.)33，317-325；西古德松(Sigurdsson)，E.M.等人(2002)分子医学趋势(Trends Mol.Med.)8，411-413)。
II.τ蛋白种类
τ蛋白可以充当内-病原体的发现已经引发出关于“病原性种类”的研究，可以在潜在的介入疗法中靶向这些种类。
该微管相关蛋白τ基因(MAPT)位于人类基因组17号染色体上并且在成人脑中表达τ蛋白的六种亚型。这些亚型产生自MAPT基因内的16个外显子的外显子2、3以及10的可变剪接。外显子2和3表达29个氨基酸重复，并且外显子10表达另外的微管结合结构域。结果是τ蛋白亚型将包含0、1或2个N-末端重复以及3个或4个C-末端微管结合结构域(3R或4Rτ蛋白)。通常τ蛋白的六种亚型被表达。最长的(2N4R)和最短的(0N3R)亚型分别由441和352个氨基酸组成(科拉罗夫(Kolarova)，M.等人(2012)阿尔茨海默病国际杂志(Int.J.Alzheimers.Dis.)2012，731526)。τ蛋白(2N4R)的N-末端突出结构域由富含甘氨酸尾的44个氨基酸组成，并且残基45-102包括两个高度酸性区域(N1、N2-结构域)。两个富含脯氨酸的区域发现于残基151-243处(P1、P2构域)。该蛋白的剩余部分是由四个微管结合结构域(R1-R4)、随后为短C-末端区域构成。
τ蛋白是极易溶的并且是高度磷酸化不稳定蛋白。在τ蛋白的最长亚型中大约20％或85％的氨基酸残基是潜在的(Ser、Thr或Tyr)磷酸化位点。这些中大约有一半已经在实验中观察到(汉格(Hanger)，D.P.等人(2009)分子医学趋势(Trends Mol.Med.)15，112-119；长谷川(Hasegawa)，M.等人(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267，17047-17054)，并且在微管结合结构域的末端残基周围聚簇。τ蛋白在细胞周期期间是动态地磷酸化和去磷酸化。它必须从微管解离以允许减数分裂发生。它在有丝分裂后细胞(分化神经元)中的主要作用是充当微管稳定剂，从而允许最佳轴突运输。它可以按其主要的去磷酸化形式仅与微管关联，由此磷酸化充当神经元内的直接微管关联/解离开关。在正常条件下，胞质τ蛋白平均包含两个磷酸化位点。在配对螺旋丝状材料中，至少7-8个位点被磷酸化(汉格(Hanger)，D.P.等人(2009)分子医学趋势(Trends Mol.Med.)15，112-119；长谷川(Hasegawa)，M.等人(1992)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267，17047-17054)。过度磷酸化配对螺旋丝状τ蛋白是阿尔茨海默病的关键标志(科希克(Kosik)等人(1986)PNAS，86，4044-4048)，在对人类AD脑材料的免疫细胞化学分析中观察到过度磷酸化τ蛋白的不同的迁移性变动。
已经难于用反映其元稳定性质的传统结构技术(像x射线晶体学或NMR光谱法)来研究τ蛋白。已经主要对非磷酸化蛋白的结构域片段进行了此类研究。迄今为止，使用NMR光谱学对全长τ蛋白(2N4R)的仅结构研究揭示了该蛋白质仅包含稳定的二级结构的稀少延展(莫克拉施(Mukrasch)，M.D.等人(2009)科学公共库生物学(PLoS.Biol.)7，e34)。此分析指示肽骨架的二级结构具有适于β-片层结构的大的倾向。与包括微管结合结构域的C-末端相比，该骨架的前200个残基是显著更有序的。在溶液中在该蛋白内许多特异性的长程相互作用的存在指示它存在于非常无序的熔融球状状态中(小岸(Ohgushi)，M.和瓦达(Wada)，A.(1983)FEBS快报(FEBS Lett.)164，21-24)。
具体地由半胱天冬酶和钙蛋白酶产生的τ蛋白的蛋白酶产物(Asp13、Glu391和Asp421)已经在缠结材料中得以鉴定(冈布兰(Gamblin)，T.C.等人(2003)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)100，10032-10037)。特别地，已经使用τ蛋白C3抗体(其结合至游离Asp421末端)详细研究了在Asp421处的截短。该截短已经被推测为AD发病机理中的与细胞凋亡诱导相关联的早期事件(德卡利尼翁(deCalignon)A.等人(2010)自然(Nature)464，1201-1204)。在Asp13处的N-末端切割和在Glu391处的C-末端切割被认为是该发病机理中的晚期事件(德卡利尼翁(deCalignon)A.等人(2010)自然(Nature)464，1201-1204；德贝尔(Delobel)，P.等人(2008)美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)172，123-131)。最近，在来自AD和PSP患者的CSF中鉴定出另外的N-末端片段(残基1-224)，并且已经被假设为疾病的早期标记并且具体是病原性的(US 14/092539；布赖特(Bright)，J.等人(2014)老化神经生物学(Neurobiol.Ageing)，1-17)。类似的钙蛋白酶切割片段由其他团队进行了报道(费雷拉(Ferreira)，A.和比焦(Bigio)，E.H.(2011)分子医学(Mol.Med.)17，676-685；赖内克(Reinecke)，J.B.等人(2011)PLoS.One.6，e23865)。
除过度磷酸化和τ蛋白片段化之外，已经提出翻译后乙酰化(科恩(Cohen)，T.J.等人(2011)自然通讯(Nat.Commun.)2，252；民(Min)，S.W.等人(2010)神经元(Neuron)67，953-966)和O-GlcN酰化是限定了与AD相关联的缠结病变形成过程中的病变。
III.τ蛋白免疫疗法
免疫疗法传统上分为被动和主动疫苗方法。在主动疫苗方法中，将病原性药剂注入患者，并且先天免疫系统引发免疫应答。这触发了B细胞的成熟，产生针对给予抗原的高亲和力抗体。在被动疫苗方法中，通过输注针对抗原的特异性抗体来避免触发先天免疫系统。固有清除系统然后去除结合抗体的配体。
AC免疫正在追寻针对τ蛋白的磷酸化丝氨酸409的小鼠单克隆抗体。将抗体针对人类AD和对照脑组织进行特征概括，并且基于它们识别缠结病变的能力来选择这些抗体。人源化形式的两种抗体，hACI-36-2B6-Ab1和hACI-36-3A8-Ab1，均结合至氨基酸401-418内的τ蛋白表位(WO 2013/151762)。
罗杰尼奇(Roger Nitsch)团队已经从不具有退行性τ蛋白病变的体征的老年健康个体中分离了τ蛋白自身抗体。已经使用全长重组人类τ蛋白(2N4R)以发现τ蛋白特异性抗体而分离出多种抗体。然后，将这些针对其区分来自患病和健康个体的τ蛋白分离物的能力来进行筛选。三种领先抗体，4E4、4A3和24B2，已经描述于专利文献(WO 2012049570；US2012087861)中。它们的表位作图指示所有均识别微管结合区内的以及C-末端到微管结合区的氨基酸(从位置V339到K369)。这些抗体未展现出任何磷酸化-特异性。
C2N诊断主要聚焦在用于早期检测神经退行性疾病的发育诊断工具上。产生针对全长人类和小鼠τ蛋白的抗体。分别鉴定了识别人类和小鼠τ蛋白的八种和五种抗体(亚那曼德拉(Yanamandra)，K.等人(2013)神经元(Neuron)80，402-414)。选择三种具有不同结合动力学的抗体用于体内评价。即，分别识别τ蛋白残基306-320、7-13和25-30的HJ9.3、HJ9.4和HJ8.5，其中最后一个是特异性针对人类τ蛋白的。在τ蛋白跨细胞传播的独创性机理报道测定中，还基于这些抗体防止病变转移的能力来对这些抗体进行选择(桑德斯(Sanders)，D.W.等人(2014)神经元(Neuron)82，1271-1288；克福里(Kfoury)，N.等人(2012)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)287，19440-19451)。在P301S转基因小鼠中的慢性i.c.v.注射研究中，对它们的评价证明了它们能够降低过度磷酸化τ蛋白的水平，如通过在对经处理小鼠的免疫组织化学分析中AT8染色所确定。
起初将彼得·戴维斯(Peter Davies)的抗体开发作为诊断工具，该诊断工具可以在AD和对照脑材料中的病理性和正常τ蛋白之间区分(格林伯格(Greenberg)，S.G.和戴维斯(Davies)，P.(1990)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87，5827-5831)。在P301S和JPNL3(P301L)中证明了PHF1和MC1抗体的治疗效用的评价(布塔将奥(Boutajangout)，A.等人(2011)神经化学杂志(J.Neurochem.)118，658-667；翟(Chai)，X.等人(2011)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)286，34457-34467；达布拉莫(D'Abramo)，C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402小鼠)。PHF1识别线性磷酸化τ蛋白表位(pS396、pS404)，而MC1是构象-依赖性抗体，其需要线性序列的两个不同部分(即在残基46-202内的表位和在残基312-342之间的C末端表位)来识别结构性τ蛋白表位(伊哈(Jicha)，G.A.等人(1997)神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)48，128-132)。在慢性12-13周免疫研究中，这两种抗体的注射导致脊髓病变的和在其他脑区域中的脑干病变的实质性减少，这些转化为这些小鼠中观察到的运动缺陷的衰减(达布拉莫(D'Abramo)，C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402)。
伊伯利亚(iPerian)/百时美施贵宝(Bristol Meyers Squibb)已经开发了针对推测的病理性τ蛋白种类(由τ蛋白的N-末端片段(eτ蛋白：残基1-224)构成)的τ蛋白抗体，该病理性τ蛋白种类促进了在基于诱导性多能干细胞的神经元培养物中的过度活性。已经开发了一系列抗体，但表征已经聚焦于识别残基9-18内的N末端表位的抗体IPN001和IPN002上。相应地，这些抗体检测到来自分期AD和PSP患者的CSF中升高的τ蛋白水平，这可以是疾病的早期体征。在JPNL3小鼠(P301L)中体内注射抗体导致渐进性运动缺陷的部分逆转(US14/092539)。
艾纳西古德松(Einar Sigurdsson)是证明基于τ蛋白的免疫疗法的功效的第一个程序。将由τ蛋白的肽379-408[pS396、pS404]组成的主动疫苗连同Adju-Phos佐剂一起用于免疫JPNL3(P301L)小鼠。在该研究中，当与对照动物相比时，在经疫苗处理的小鼠中观察到τ蛋白病变的显著降低。也检测到τ蛋白相关的运动表型的衰减。其功效在不同的不是由突变体τ蛋白驱动的小鼠模型(hτ/PS1)中得以确认(布塔将奥(Boutajangout)，A.等人(2011)AAIC2011(7，发行4，增补版)p.s480-s431；康登(Congdon)，E.E.等人(2013)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)288，35452-35465；古(Gu)，J.等人(2013)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)288，33081-33095)。
普西纳(Prothena)已经评价了在K369I(K3)转基因τ蛋白小鼠和P301L小鼠模型中的三种τ蛋白抗体。选择具有不同特性的抗体用于体内评价。将具有不同同种型的两种pS404抗体(IgG1/k和IgG2a/k)或总(全)抗-τ蛋白抗体(IgG1/k)以慢性模式注射。将K369I小鼠每周采用注射处理，持续21周，在3周龄时开始；并且将P301L小鼠每周采用注射处理，持续7个月，在4月龄时开始。在采用IgG2a/k pS404抗体的K3小鼠中观察到τ蛋白阳性神经原纤维内含物的减少。两种pS404抗体均能降低pS422阳性τ蛋白的水平，然而在经全-抗-τ蛋白抗体处理的小鼠中没有观察到减少。这些研究表明：1)τ蛋白清除可以是同种型-依赖性的，并且；2)重要的是其靶向与疾病相关的τ蛋白种类，因为总-抗τ蛋白抗体不能减少过度磷酸化的τ蛋白(PCT/US 2014/025044)。
本发明的诸位发明人已经出人意料地发现特异性针对磷酸化τ蛋白丝氨酸残基396(pS396)的抗体；所述抗体与现有技术抗体相比之下，其主要识别在τ蛋白上的396和404残基两者处磷酸化、仅在404残基处或在其他残基处磷酸化的τ蛋白。
诸位发明人已经开发了另外对人类病理性τ蛋白具有显著特异性和选择性的抗体。存在对于对病原性τ蛋白具有高度选择性和特异性的抗体的需要。与WO 2013/050567的抗体(参见WO 2013/050567的图1)相比较，本发明的这些抗体显示出超过非病理性τ蛋白的对人类病理性τ蛋白非常高程度的特异性和选择性。被报道为具有特异性结合的、WO 2012/045882的抗体是从τ蛋白氨基酸393-401、396-401、394-400和393-400的6至9残基氨基酸序列引发的。这与本发明的抗体形成对比，本发明的抗体是针对包含如在此所述的更长氨基酸序列的病原性过度磷酸化τ蛋白引发的。
如在实例中所示，相比于五种公开的τ蛋白抗体：hACI-2B6(描述于WO2013151762)；IPN002(描述于WO 2014028777中)；HJ8.5(描述于WO 2014008404中)；抗τ蛋白pS422单克隆抗体2.10.3(描述于US 8609097中)；PHF13(可商购抗体，例如西格玛奥德里奇)，推荐用于检测在小鼠、大鼠和人类来源的、在Ser 396处磷酸化的τ蛋白，并且由三卡拉那雷南(Sankaranarayanan)(PLOSONE，DOI:10.1371/journal.pone.0125614五月1，2015)和奥特沃斯(Otvos)(生物化学(Biochemistry)1997，36，8114-8124)讨论；以及4E4抗体(在US 8940272中描述为结合至V339、E342、D387、E391和K395)，显示本发明的抗体及其表位结合片段展现出相比于对比抗体的任一个而言对于人类病理性τ蛋白更高程度的特异性和选择性。
此外，本发明的抗体及其表位结合片段示出许多有利特征，例如能够在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分，并且特别是能够结合与阿尔茨海默(AD)病理学相关联的τ蛋白。在电生理研究中，本发明的抗体及其表位结合片段另外还能够逆转降低的配对脉冲易化以及自发微小兴奋性突触电流(mEPSC)。
发明概述
本发明涉及单克隆抗体及其表位结合片段，它们能够特异性地结合至人类(2N4R亚型)τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基丝氨酸396，并且涉及已经使用允许这种特异性分离和回收的新方法产生的此类抗体。这些抗体被进一步表征为它们在磷酸化残基396和404之间区分的能力，使得它们基本上不结合磷酸化404残基。
不受具体理论的束缚，来自诸位发明人的证据证明，在残基404处而不是在396处磷酸化的τ蛋白的存在下，本发明的抗体针对在残基396处磷酸化的人类τ蛋白的区分和选择性从病理和治疗角度上是显著的。本发明的这些抗体在非病理性但磷酸化的τ蛋白的存在下对于病理性τ蛋白具有选择性。在正常τ蛋白存在下，本发明的这些抗体能够耗减病理性τ蛋白的τ蛋白缠结。不受具体理论的束缚，认为τ蛋白(包含在τ蛋白位置396处已经磷酸化的τ蛋白)的缠结耗减会防止将病理性τ蛋白接种到τ蛋白缠结中。因此，本发明的一个方面涉及一种抗体，该抗体能够选择性地结合至396-磷酸化τ蛋白，甚至当此类分子是在τ蛋白位置404处已经磷酸化的τ蛋白的存在下时。本发明的相关方面涉及一种抗体，该抗体能够选择性地结合至396-磷酸化τ蛋白，甚至当此类分子是在非病原性τ蛋白的存在下时。另外定义，本发明涉及一种针对病理性τ蛋白具有选择性的抗体，所述病理性τ蛋白是过度磷酸化τ蛋白，其在过表达τ蛋白的人类2N4R亚型的转基因小鼠中作为64kDa条带出现(通过蛋白质印迹分析)。
本发明的一个方面是针对一种抗τ蛋白抗体，其满足以下测试标准：i)该抗体并不结合至非磷酸化τ蛋白；ii)该抗体并不结合至在404处磷酸化且在396处非磷酸化的τ蛋白；iii)该抗体结合至在396处磷酸化的τ蛋白；以及iv)该抗体结合至在396和404两者处均磷酸化的τ蛋白。诸位发明人已经发现，在测试标准iii)和iv)下的结合是在同一数量级上，并且假定在位置404处的磷酸化不干扰也不增强该结合过程。诸位发明人已经进一步发现，与测试标准ii)相反，结合至一种在396处非磷酸化但在404处磷酸化的τ蛋白并不耗减在测试模型中的缠结或明显的病理性τ蛋白。
本发明的一个方面是针对抗τ蛋白抗体，该抗体与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，其特异性地以至少90％减少过度磷酸化τ蛋白64和70kDa条带，同时以不多于10％减少55kDaτ蛋白条带。本发明的另外一方面是针对抗τ蛋白抗体，该抗体特异性地以至少90％减少过度磷酸化τ蛋白64和70kDa条带，同时以不多于10％减少55kDaτ蛋白条带；或者当如在此所描述的与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，其特异性地以至少90％减少磷酸化S396过度磷酸化τ蛋白条带、同时以不多于10％减少非过度磷酸化τ蛋白条带的能力。
本发明的另一个方面是针对一种治疗患有τ蛋白病变(例如阿尔茨海默病)的患者的方法，该方法包括耗减缠结或衰减所述缠结的进展，所述缠结包括过度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使过度磷酸化τ蛋白与本发明的抗体接触，以使得该缠结被耗减，其过度磷酸化τ蛋白的含量得以减少，或者缠结形成的进展得以衰减。
可替代地定义的，本发明涉及一种治疗患有τ蛋白病变(例如阿尔茨海默病)的患者的方法，所述方法包括使缠结与对具有磷酸化残基396的τ蛋白具有选择性的抗体接触，这样使得缠结耗减过度磷酸化τ蛋白。
更确切地说，本发明涉及选自下组的四种单克隆抗体中的任一种，该组包括：
抗体C5.2
其中抗体C5.2包括：
(a)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3；
抗体C8.3
其中抗体C18.3包括：
(a)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链CDR3；
抗体C10-2
其中抗体C10-2包括：
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3；
以及
抗体D1.2
其中抗体D1.2包括：
(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3。
示例性抗体C5.2的全轻链和全重链(包括在此的恒定结构域)的氨基酸序列分别示出于SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中(如在实例中使用的)。
示例性抗体C8.3的全轻链和全重链(包括在此的恒定结构域)的氨基酸序列分别示出于SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32中(如在实例中使用的)。
感兴趣抗体C10-2的全轻链和全重链(包括在此的恒定结构域)的氨基酸序列分别示出于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中(如在实例中使用的)。人源化C10-2抗体的重链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:35中。人源化C10-2抗体的轻链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:36中。本发明的一个方面涉及一种本发明的抗体，其包含SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36或二者。
示例性抗体D1.2的全轻链和全重链(包括在此的恒定结构域)的氨基酸序列分别示出于SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中(如在实例中使用的)。
在一个替代实施例中，抗体D1.2包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链，其中在位置3处的氨基酸是缬氨酸(然而在SEQ ID NO:7的示例性轻链中，该氨基酸是甲硫氨酸)。该轻链可以与如上所述的重链配对，即具有SEQ ID NO:4、5和6的CDR。例如，该抗体可以包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链，连同具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的重链(抗体“D1.2*”)。
本发明的一个方面是针对一种抗体，该抗体包含：
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；和/或
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3。
本发明的另一个方面是针对一种抗体，该抗体包含或另外包含：
(a)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；和/或
(c)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3。
本发明的抗体及其表位结合片段，可以用于治疗τ病变，例如阿尔茨海默病(AD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、TBI(轻度、急性或慢性创伤性脑损伤)、以及慢性创伤性脑病(CTE)。
本发明的抗体及其表位结合片段另外预期用于治疗精神病，特别是由于AD引起的精神病或患有AD的患者中的精神病。
附图简要说明
图1：结合至病理性材料斑点印迹
图1(图A-B)呈现了斑点印迹分析的结果，显示用1μg/ml D1.2或C10-2探测，来自AD患者(AD)和老年健康个体(con)的脑的或者来自32周龄rTg4510和非转基因(wt)同窝仔的500ng S1和P3部分(S1和P3部分的产生披露于实例3中)，以评估病理性τ蛋白的检测(实例3)。斑点图示出D1.2(图A)或C10-2(图B)特异性地对来自AD患者的疾病材料或如在转基因小鼠(Tg4510)中表达的人类(P301L)τ蛋白发生反应。
图2：D1.2和C10-2抗体的蛋白质印迹分析
图2(图A-B)呈现出蛋白质印迹分析的结果，显示用1μg/ml D1.2(图A)或C10-2(图B)探测，来自32周龄rTg4510和非转基因(wt)同窝仔的脑的2μg S1和P3部分或者来自AD患者(AD)和老年健康个体(con)的脑的20μg S1和P3部分。S1和P3部分以1:50的比例(基于组织重量)加载，该比例衍生自0.01mg组织。在蛋白质印迹中，人类4R0Nτ蛋白正常P301L突变体显示为55kDa，而人类4R0Nτ蛋白种类过度磷酸化P301L突变体显示为64和70kDa。在来自AD过度磷酸化τ蛋白的P3部分中，显示为54、64、69和74kDa(实例3)。该图展示了这些抗体特异性地结合至过度磷酸化的迁移性变动的τ蛋白。
图3：在MSD中结合至病理性P3材料
图3(图A-D)呈现了中尺度发现(Meso Scale Discovery，MSD)公司ELISA中D1.2(图A)、C5-2(图B)、C10-2(图C)和C8-3(图D)结合至从人类AD和非患病对照脑中分离的τ蛋白的结果(实例4)。类似于在图1中证实的，将分离自疾病(AD)和健康对照脑中的τ蛋白固定在ELISA板上可以用于证明本发明中的抗体特异性地结合病理性τ蛋白种类。增加抗体的浓度导致饱和结合。结合的抗体的量是用二级抗-小鼠抗体检测。
图4：肽亲和力和pS396选择性(肽结合)
图4(图A-D)呈现了C10-2(图A)和D1.2(图B)特异性结合至τ(386-409)肽的分析结果，这些τ肽在位置S396和S404处具有磷酸化的全部组合(实例5)。对于人类病理性材料的特异性亲和力是难于评估的，为此我们使用特异性肽结合以使用特定的磷酸化和非磷酸化肽确定准确的表位亲和力。针对抗体C10-2(图C)和D1.2(图D)与在残基Ser396和Ser404处磷酸化的肽TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)(pS396/pS404)的结合，示出特定的剂量反应曲线。竞争结合是采用非磷酸化肽(NP)和单磷酸化肽(pS396和pS404)进行的。此外，包括对应于磷酸化丝氨酸262的对照肽。该竞争结合证明了所有结合是通过磷酸化396丝氨酸残基获得的。此外，该数据证明在残基404处的磷酸化不干扰抗体在磷酸化丝氨酸396处的结合。
图5：病理学特异性抗体的组织学表征
图5的图A示出C10-2(左栏)和D1.2(右栏)抗体结合至Tg4510(顶行)细胞体和神经毡中的p-τ蛋白种类。在非Tg脑部分(底行)中未检测到免疫反应性。图5的图B示出C10-2(左栏)和D1.2(右栏)抗体结合至AD供体(顶行)中的细胞体和神经毡线中的p-τ蛋白种类。对照供体脑缺乏免疫反应性(底行)(实例6)。
图6：C10-2和参考抗体结合至病理性和非病理性P3
图6(图A-E)呈现了与现有技术抗体2-10-3(图A)、HACI-2B6(图B)、IPN 002(图D)、和HJ8.5(图E)相比，本发明的抗体C10-2(图C)在识别病理性材料中的优越性的结果。该图示出C10-2特异性结合至来自健康(作为对照)和患病(AD)人类脑的τ蛋白，并且结合至来自表达人类τ蛋白P301L突变体的10月龄Tg4510小鼠的τ蛋白。将递增浓度的抗体添加到固定在ELISA板上的P3τ蛋白材料。针对病理性τ蛋白的选择性的比率是以被活性种类全饱和来确定的。针对现有技术抗体的每一个的选择性倍数示于图中(实例7)。
图7：防止在HEK293细胞中和在体外接种
图7(图A-C)呈现通过西斯比(Cisbio)测定对τ蛋白聚集的定量。接种的pcDNAHEK293细胞没有显示信号，确认了不存在用于输入接种材料的检测。Wt(野生型)接种材料(WW)没有示出接种，但相比之下与未接种的相比，rTg4510匀浆(CC)有效地接种。这种接种效应不受用HEL处理的影响，但部分地通过用τ蛋白抗体(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)处理而逆转。图示(图A-C)代表三个独立的样品组，并且被绘制为相对的τ蛋白聚集(超出背景的信号倍数，针对总蛋白归一化)(实例8)。
图8：电生理缺陷的逆转
图8示出在CA1诱发的场电位中配对脉冲易化(图B和D)以及基础突触传递(图A和C)缺陷的抗体逆转(C10-2，图A；D1.2，图B)，展示了在用C10-2在Tg4510小鼠中进行的CA1亚慢性处理中的诱发场电位，采用tTa小鼠作为对照。将动物每周两次用15mg/kg剂量的抗体处理持续两周(参见实例9)。在图A(对于C10-2)和图C(对于D1.2)中，场电位(fEPSP)斜率针对刺激强度绘制。图A和C展示了在4.5到5.5月龄rTg4510(下部2个曲线)和tTA(上部2个曲线)对照小鼠中对海马体CA1区中突触传递和可塑性的体内电生理评估：i)相比于tTA小鼠，在rTg4510中基础突触传递显著受损，并且ii)相比于tTA小鼠，在rTg4510中配对脉冲易化显著降低。
进一步在rTg4510和tTA小鼠中测量配对脉冲易化，这是一种被认为依赖于突触前机制的短期突触可塑性(图B针对C10-2，且图D针对D1.2)。简言之，将具有从25到1000ms变化的刺激间时间间隔(ISI)的一对刺激施加至谢弗侧枝，并且将第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率进行比较。在所有ISI处观察到易化，其最大易化在50和75ms的ISI处。令人感兴趣的是，在rTg4510小鼠(第二2个条)中观察到当与tTA小鼠(第一2个条)比较时显著更低的PPF。
图9：如概括于图1-8中的筛选概述
针对覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的双磷酸化肽：TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)产生抗体。杂交瘤是使用斑点印迹和MSD ELISA、采用固定的人类病理性和非病理性τ蛋白进行筛选(实例4)，以分离克隆，这些克隆对于磷酸化表位S396和/或S404的任一个具有高度特异性并且同时特异性地识别来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白。在斑点印迹和蛋白质印迹中，在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分的能力用于选择杂交瘤。选择16个克隆，其中的四个克隆(D1.2、C10-2、C5.2和C8.3)展现出结合至人类病理性材料的非凡能力。使用特异性免疫和筛选方案产生高度磷酸化丝氨酸-396(pS396)特异性抗体。
图10：残基pSer396结合在mAb C5.2的抗原结合位点的中心
在与磷酸化肽386-410的复合物中，mAb C5.2的晶体结构，分辨率为在该结构中，确定了残基392-398的电子密度。残基{p}Ser396结合在mAb C5.2的抗原结合位点的中心。在抗τ蛋白mAb的该结构研究中，表位跨重链(底右)和轻链(底左)结合。
图11：抗体C5.2与磷酸化丝氨酸τ(292-298)肽的相互作用
图11表示抗体C5.2与磷酸化丝氨酸τ(292-298)肽之间的相互作用。示出Ile(392)-VAL(393)-Tyr(394)-Lys(395)-P-Ser(396)-Pro(397)-Val(398)的结构。主要相互作用涉及由τ肽的L3:H3、L3:F8*、H1:H13、H2:Y1、H2:Y3和Y(394)形成的疏水口袋。存在在溶剂化的{p}S(396)和L3:T4、H1:R10、H1:T11、H3:R1、H3:T3之间形成的广泛氢键键合网络。在所使用的命名中，第一个字母(例如，L3:H3的“L”)表示涉及的CDR残基是否是轻链CDR或重链CDR，第一个数目表示涉及此链的哪个CDR(例如，“L3”表示轻链的CDR3)，其余术语(例如，L3:H3的“H3”)表示所涉及的氨基酸的名称和位置(例如，“H3”表示在该CDR的第三个残基位置处的组氨酸)；因此“L3:H3”表示轻链CDR3的第三个位置处的组氨酸残基。在Y(394)侧链和骨架之间存在强氢键键合和电荷/极性相互作用，并且具有{p}S396的膦酸酯的骨架在肽骨架中形成转弯。(*)L3:F8是CDR L3的C末端侧翼框架残基。
C5.2的CDR序列是：
CDR L1：QASQDTSINLN(SEQ ID NO:17)
CDR L2：GASNLED(SEQ ID NO:18)
CDR L3：LQHTYLP(SEQ ID NO:19)
CDR H1：KASGYTFTDRTIH(SEQ ID NO:20)
CDR H2：YIYPGDDSTKYNDNFKG(SEQ ID NO:21)
CDR H3：RGTMDY(SEQ ID NO:22)
图12：τ蛋白的耗减用于接种测定(HEK293)
图12(图A-B)示出了使用鼠类C10-2(mC10-2)和人源化C10-2(hC10-2)的rTg4510脑匀浆的免疫耗减。经耗减的匀浆的蛋白质印迹被用E1检测(总τ蛋白；图A；下部))和C10-2(pS396τ蛋白；图A；上部)，并且mC10-2和hC10-2两者有效地耗减过度磷酸化τ蛋白(在E1印迹上的上部条带，以及在C10-2印迹上的所有条带)。还针对聚集的τ蛋白的耗减使用西斯比(Cisbio)测定来分析经耗减的匀浆。图B示出在样品中聚集的τ蛋白的变化。用mC10-2和hC10-2的耗减研究分别以99％和99.5％去除了τ蛋白聚集物(图B)。
图13：用耗减材料的接种测定(HEK293)
图A-C示出用于在HEK293细胞中接种P301L-hτ的经耗减的匀浆。来自对照动物(WW)的匀浆并不接种，而rTg4510匀浆(CC)有效地接种，如通过西斯比聚集测定对总细胞裂解物所测量或者通过在1％triton-X中对HEK293细胞的分级所测量(不溶性过度磷酸化D1.2和τ蛋白的定量(图A，上部和下部))。用HEL和hHEL抗体的耗减不影响接种，然而用mC10-2和hC10-2的耗减分别以88％和96％(图C)防止τ蛋白聚集并且以97％和100％(图B)防止不溶性τ蛋白。
图14：免疫耗减rTg4510材料(用于体内接种研究)
图A-C证明了经免疫耗减的rTg4510脑提取物的蛋白质印迹(图A；上部，下部)分析。C10-2和D1.2特异性地以90％减少人类过度磷酸化64kDa条带，并且对55kDaτ蛋白τ5(商业总τ蛋白抗体)没有影响，相比之下将正常55kDaτ蛋白降低了74％并且对人类64kDaτ蛋白没有影响(图B-C)。
图15：免疫耗减AD材料(用于体内接种研究)
图15(图A-C)描绘了经免疫耗减的阿尔茨海默脑提取物的蛋白质印迹(图A)分析。使用C10-2和D1.2的免疫耗减并未将总τ蛋白水平降低多于10％，但特异性地降低了过度磷酸化τ蛋白(90％降低)(图B-C)。
图16(图A)：在接种了经免疫耗减的rTg4510材料的rTg4510小鼠中的海马体τ蛋白病理学
图16(图A)展示在接种有rTg4510或AD脑匀浆的rTg4510脑中的τ蛋白病理学的定量。在接种之前，通过使用C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已经在匀浆中降低了90％-95％。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。
图16(图B)在接种了经免疫耗减的AD材料的rTg4510小鼠中的海马体缠结病理学
图16(图B)展示在接种有rTg4510(A)或AD(B)脑匀浆的rTg4510脑中的τ蛋白病理学的定量。在接种之前，通过使用C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已经在匀浆中降低了90％-95％。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。
图17：在用D1.2处理的接种的rTg4510小鼠中海马体缠结病理学
图17描绘了在接种的rTg4510小鼠的海马体中具有神经元的缠结的定量。病变随着时间增加(Ig G，1个月；IgG 2个月；IgG 3个月)。然而通过用D1.2处理小鼠，在接种后1个月、2个月和3个月时病变显著降低。(D1.2 1个月；D1.2 2个月；D1.2 3个月)。
图18τ蛋白的耗减用于接种测定(HEK293)
图A示出了使用鼠类C10-2(mC10-2)和人源化C10-2(hC10-2)的rTg4510脑匀浆的免疫耗减。经耗减的匀浆的蛋白质印迹是用E1(总τ蛋白)和C10-2(pS396τ蛋白)进行检测，并且mC10-2和hC10-2两者有效地耗减了过度磷酸化τ蛋白(在E1印迹上的上部条带和在C10-2印迹上的所有条带)。针对聚集的τ蛋白的耗减使用西斯比(Cisbio)测定来分析经耗减的匀浆。图B示出用mC10-2和hC10-2的耗减分别将τ蛋白聚集物去除99％和99.5％。
图19用耗减材料的接种测定(HEK293)
图A示出τ蛋白分级(对不溶性部分的蛋白质印迹。图B示出蛋白质印迹定量。图C示出在细胞裂解物中的聚集的τ蛋白。使用经耗减的匀浆以在HEK293细胞中接种P301L-hτ。来自对照动物(WW)的匀浆并不接种，而rTg4510匀浆(CC)有效地接种，如通过西斯比聚集测定对总细胞裂解物所测量或者通过在1％triton-X中对HEK293细胞的分级所测量(不溶性过度磷酸化D1.2+τ蛋白的定量)。用HEL和hHEL抗体的耗减不影响接种，然而用mC10-2和hC10-2(图C)的耗减分别以88％和96％防止τ蛋白聚集并且以97％和100％防止不溶性τ蛋白(图B)。
图20 C10-2和D1.2针对过度磷酸化τ蛋白超过正常τ蛋白的免疫选择性
用于体内接种研究的免疫耗减rTg4510材料：图A示出经免疫耗减的rTg4510脑提取物的蛋白质印迹分析。图B示出C10-2和D1.2特异性地降低在丝氨酸396处磷酸化的过度磷酸化64kDa条带(与不包含显著量的p396的τ蛋白55kDa条带相比)。相比之下，τ5，一种商业总τ蛋白抗体，减少了正常55kDaτ蛋白，并且低效地结合至64kDaτ蛋白。
图21 C10-2和D1.2针对过度磷酸化τ蛋白超过正常τ蛋白的免疫选择性
用于体内接种研究的免疫耗减AD材料：图A示出经免疫耗减的阿尔茨海默脑提取物的蛋白质印迹分析。使用mC10-2和D1.2的免疫耗减并未将总τ蛋白水平降低多于10％(图B)，但特异性地降低了过度磷酸化τ蛋白(90％降低)(图C)。
图22在rTg4510小鼠中的海马体τ蛋白病理学
图A示出在接种了经免疫耗减的rTg4510材料的rTg4510小鼠中的海马体τ蛋白病理学。图B示出在接种了经免疫耗减的AD材料的rTg4510小鼠中的海马体缠结病理学。接种有rTg4510(A)或AD(B)脑匀浆的rTg4510脑中的τ蛋白病理学的定量。在接种之前，通过使用抗体C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已经在匀浆中降低了90％-95％。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。
图23在用D1.2处理的接种的rTg4510小鼠中海马体缠结病理学
接种的rTg4510小鼠的海马体中的具有神经元的缠结的定量。该图示出病变随时间增加，并且通过用D1.2处理小鼠，在接种后2个月和3个月时病变显著更少。
图24经免疫耗减的人类AD提取物的蛋白质印迹分析
该图示出人源化形式的C10-2(hC10-2)以及mC10-2与2.10.3(P-S422)抗体的不同之处在于，虽然剩余的总τ蛋白并非显著不同(左图)于2.10.3，但C10-2(hC10-2)以及mC10-2通过免疫耗减方法去除存在于阿尔茨海默脑提取物中的更多过度磷酸化τ蛋白。这在图25中通过定量得以确认。
图25在免疫耗减之后聚集的τ蛋白的定量
hC10-2和mC10-2抗体与2.10.3抗体的不同之处在于其能够通过免疫耗减方法将存在于阿尔茨海默脑提取物中的更多的聚集的τ蛋白去除。
图26在免疫耗减之后剩余的总τ蛋白
在使用不同量的人源化C10-2(▲)和2.10.3抗体(◆)来对阿尔茨萃取物进行免疫耗减之后，对蛋白质印迹信号的定量。在图26中，示出使用τ5对总τ蛋白信号的定量(所有τ蛋白亚型都包括在分析中)。两种抗体去除来自阿尔茨海默脑制品的小部分τ蛋白。被设计为对P-S422τ蛋白具有特异性的2.10.3去除了高达24％的总τ蛋白量，而C10-2去除了高达15％的总τ蛋白(参见图26)。
图27在过度磷酸化τ蛋白的免疫耗减之后，剩余的总τ蛋白
图27展示了对过度磷酸化τ蛋白(在丝氨酸422处磷酸化)的定量(所有条带和高分子量涂片都包括在分析中)。2.10.3(▲)和C10-2(◆)两者均去除多于90％的在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白。然而，去除50％的τ蛋白所需的抗体的量不同：针对相同效果，对于抗体2.10.3，需要0.42μg抗体，而对于C10-2，需要0.27μg。
图28在过度磷酸化τ蛋白的免疫耗减之后，剩余的总τ蛋白
对过度磷酸化τ蛋白(在丝氨酸396处磷酸化)的定量(所有条带和高分子量涂片都包括在分析中)。C10-2(◆)有效地去除了在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白(最大效应：88％，并且通过使用0.30μg抗体达到该效应的一半)。2.10.3(▲)去除了更少部分的在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白(最大效应：60％，并且当使用0.63μg抗体时达到该效应的一半)。这指示所有的在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白在丝氨酸396处也被磷酸化，但在位置422处的磷酸化丝氨酸不存在时，存在在丝氨酸396处磷酸化的一部分过度磷酸化τ蛋白。
图29在过度磷酸化τ蛋白的免疫耗减之后，剩余的总τ蛋白
对过度磷酸化τ蛋白(在丝氨酸199/202处磷酸化)的定量(所有条带和高分子量涂片都包括在分析中)。通过C10-2(◆)去除的大部分τ蛋白在丝氨酸199/202处也被磷酸化，因为69％的具有该磷酸化的τ蛋白受到免疫耗减的影响(当使用0.34μg抗体时该效应的50％)。2.10.3(▲)免疫耗减并不对P-S199/202τ蛋白给出S形剂量反应，但可看到信号随递增量的抗体而降低，当使用抗体的最大量(5μg)时(最大值52％降低。该数据指示，与靶向在422位置处的磷酸化丝氨酸的2.10.3抗体相比，靶向磷酸化丝氨酸396的C10-2抗体结合更大量的过度磷酸化τ蛋白。
图30在mC10-2包被的板中，mD1.2和mC10-2抑制τ抗原捕获
在液相ELISA中，其中将rTg4510P3制品和可变量的C10-2或D1.2抗体的混合物添加至C10-2包被的板上。结合至溶液中的P3τ蛋白的抗体越多，能够结合至板的可用τ蛋白表位越少。结合至板的τ蛋白的量是通过硫标记的人类τ蛋白抗体来确定。C10-2(▲)和D1.2(□)与溶液中的τ蛋白具有不同的结合，其中C10-2可以从结合至板的所有中竞争而出(IC50 20nM)。在另一方面D1.2示出与溶液中的τ蛋白的非常低水平的结合。
图31在mC10-2包被的板中，PHF13和mC10-2抑制τ抗原捕获
在液相ELISA中，其中将AD P3制品与可变量的C10-2和PHF13抗体的混合物添加至C10-2包被的板上。结合至溶液中的P3τ蛋白的抗体越多，能够结合至板的可用τ蛋白表位越少。结合至板的τ蛋白的量是通过硫标记的人类τ蛋白抗体来确定。C10-2和PHF13与溶液中的τ蛋白具有不同的结合，其中C10-2可以从结合至板的所有中竞争而出(IC50＝3nM)，然而PHF13并非如此。
图32mC10-2和PFH-13两者剂量依赖性地结合至Pτ386-408(pS396/pS404)
图32示出mC10-2和PHF-13同样地结合MSD板中的孔，所述MSD板用100ng/ml p-τ386-408(pS396/pS404包被。将渐增浓度的抗体(x轴上指示)在孔中孵育2小时，随后使用硫标记的抗人类IgG抗体洗涤并检测结合的抗体。这指示用于后续实例中的制备的PHF-13是有活性的。
图33比较mD1.2和mC10-2与AD-P3的结合
图33示出mD1.2和mC10-2同样地结合MSD板中的孔，所述MSD板用1μg/ml AD-P3包被。在存在和不存在10uM p-τ386-408(pS396/pS404)肽的情况下，在室温下孵育渐增浓度的抗体(x轴上指示)1小时，随后在孔中孵育2小时，之后使用硫标记的抗人类IgG抗体检测结合的抗体。对于AD-P3和AD-S1(p)的捕获而言，IC50值是320nM和11nM。相比之下，mD1.2示出τ蛋白抗原捕获的显著更弱的抑制，其IC50值为589和503nM-表明对可溶性抗原的更低的亲和力
以两个步骤进行测定：A：将1μg/ml AD-P3和20ng/ml AD s1(p)分别用渐增浓度的mD1.2和mC10-2孵育，并且在室温下孵育1小时，以允许渐增的抗体-抗原结合(占有率)。B：将样品在MSD板上孵育2小时，所述MSD板用AD-P3(1μg/ml)包被，随后使用硫标记的抗总τG抗体洗涤并检测捕获的τ抗原
图34mC10-2(而不是PHF-13)有效地结合至展示AD-P3抗原的固相上
mC10-2而不是PHF-13的高度特异性结合：图34示出mC10-2有效地结合至AD-P3抗原包被的MSD板(1μg/ml)。相比之下，PHF-13的低结合活性指示对生理学p-τ抗原的更低亲和力。此外PHF-13证实了相比于mC10-2而言实质性更高程度的非特异性结合(参见表6)。将渐增浓度的抗体(x轴上指示)孵育2小时，之后使用硫标记的抗人类IgG抗体检测结合的抗体。针对非特异性结合活性校正结合信号(定义为在10uM p-τ386-408(pS396/pS404)肽的存在下测量的信号)。对于AD-P3的mC10-2捕获，IC50值是3nM。相比之下，PHF-13实质上没有示出抑制。
以两个步骤进行测定。A：将1μg/ml AD-P3用渐增浓度的mC10-2和PHF-13孵育，并且在室温下孵育1小时，以允许增加抗体-抗原结合(占有率)。B：将样品在MSD板上孵育2小时，所述MSD板用AD-P3(1μg/ml)包被，随后使用硫标记的抗总τ蛋白抗体洗涤并检测捕获的τ抗原。
通过引用结合的序列
SEQ ID NO:1 D1.2轻链CDR1
SEQ ID NO:2 D1.2轻链CDR2
SEQ ID NO:3 D1.2轻链CDR3
SEQ ID NO:4 D1.2重链CDR1
SEQ ID NO:5 D1.2重链CDR2
SEQ ID NO:6 D1.2重链CDR3
SEQ ID NO:7 D1.2轻链
SEQ ID NO:8 D1.2重链
SEQ ID NO:9 C10-2轻链CDR1
SEQ ID NO:10 C10-2轻链CDR2
SEQ ID NO:11 C10-2轻链CDR3
SEQ ID NO:12 C10-2重链CDR1
SEQ ID NO:13 C10-2重链CDR2
SEQ ID NO:14 C10-2重链CDR3
SEQ ID NO:15 C10-2轻链
SEQ ID NO:16 C10-2重链
SEQ ID NO:17 C5.2轻链CDR1
SEQ ID NO:18 C5.2轻链CDR2
SEQ ID NO:19 C5.2轻链CDR3
SEQ ID NO:20 C5.2重链CDR1
SEQ ID NO:21 C5.2重链CDR2
SEQ ID NO:22 C5.2重链CDR3
SEQ ID NO:23 C5.2轻链
SEQ ID NO:24 C5.2重链
SEQ ID NO:25 C8.3轻链CDR1
SEQ ID NO:26 C8.3轻链CDR2
SEQ ID NO:27 C8.3轻链CDR3
SEQ ID NO:28 C8.3重链CDR1
SEQ ID NO:29 C8.3重链CDR2
SEQ ID NO:30 C8.3重链CDR3
SEQ ID NO:31 C8.3轻链
SEQ ID NO:32 C8.3重链
SEQ ID NO:33人类τ蛋白
SEQ ID NO:34 D1.2*轻链
SEQ ID NO:35人源化C10-2重链
SEQ ID NO:36人源化C10-2轻链
SEQ ID NO:37τ蛋白残基386-408(pS396，pS404)
发明的详细说明
如在此使用的，术语“τ”与“τ蛋白”是同义的，并且是指τ蛋白亚型的任一种(例如在UniProt中鉴定为P10636，1-9)。在此使用的τ蛋白的氨基酸编号是相对于如以下所示的亚型2(SEQ ID NO:33)给出的，其中甲硫氨酸(M)是氨基酸残基1：
SEQ ID NO:33：
本发明涉及抗体及其表位结合片段，它们能够特异性地结合至τ蛋白，并且特别是人类τ蛋白，并且在一个实施例中展现出能够特异性地结合至人类τ蛋白的磷酸化S396残基(pS396)。本发明的抗体及其表位结合片段进一步表征为不能或基本上不能特异性地结合至人类τ蛋白上的磷酸化404(pS404)残基，例如在抗体限制或非饱和条件下。此外，在pS404处的磷酸化并不干扰特异性结合至pS396。如在此所使用的，符号“pS”和“{p}S”表示氨基酸残基磷酸化丝氨酸。如在此所使用的，如果相对于另一个表位，抗体与表位的结合是用这样的其他表位观察到的结合的小于20％、小于10％、小于5％、小于2％并且更优选小于1％，那么该抗体“基本上”不能结合至该表位。
在本发明的背景中术语“抗体”(Ab)是指免疫球蛋白分子，或者根据本发明的一些实施例为具有特异性地结合至分子(“抗原”)表位的能力的免疫球蛋白分子片段。天然存在的抗体典型地包括四聚体，它通常由至少两个重(H)链和至少两个轻(L)链构成。每个重链由重链可变结构域(在此缩写为VH)以及重链恒定结构域构成，该重链恒定结构域通常由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。重链可以具有任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)。每个轻链是由轻链可变结构域(在此缩写为VL)和轻链恒定结构域(CL)构成。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变结构域典型地促成抗原识别，而该重链和轻链恒定结构域可以介导将该免疫球蛋白结合到宿主组织或因子，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。该VH和VL结构域可以进一步细分为高变性结构域，称为“互补决定区”，其穿插有更保守序列的结构域(称为“框架区”(FR))。每个VH和VL是由三个CDR结构域和四个FR结构域组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链的可变结构域包含与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是抗体与其表位结合片段，它们已经被“分离”以在一种照物理环境存在，该物理环境不同于它们在自然界中存在的环境，或者它们已经被修饰以在氨基酸序列方面不同于天然存在的抗体。
术语“表位”意指能够特异性地结合至抗体的抗原决定簇。表位通常由分子的表面组群(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和线性表位的区别在于与前者而非后者的结合在变性溶剂的存在下常常缺失。表位可以包含直接涉及于结合中的氨基酸残基和其他未直接涉及于结合中的氨基酸残基，例如被特异性表位结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基是在特异性表位结合肽的足迹内)。
如在此所使用的，术语“抗体的表位结合片段”意指抗体的片段、部分、区域或结构域(无论它如何产生(例如，经由切割、重组、合成，等))，其能够特异性地结合至表位。表位结合片段可以包含这种抗体的CDR结构域的1、2、3、4、5或所有6个，并且虽然能够特异性地结合至这种表位，但可以展现对这种表位的不同于这种抗体的特异性、亲和力或选择性。然而，优选地，表位结合片段将包含这种抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单一多肽链的部分或者包括单一多肽链(例如scFv)，或者可以是两个或更多个多肽链的部分或者包括两个或更多个多肽链，各自具有氨基末端和羧基末端(例如，抗体、Fab片段、Fab2片段等)。可以获得展现表位结合活性的抗体的片段，例如通过完整抗体的蛋白酶切割。更优选地，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH天然地由单独基因编码，编码此类基因序列的多核苷酸(例如它们的编码cDNA)可以使用重组方法通过能将所述VL和VH产生为单一蛋白链的柔性接头进行连接，在该单一蛋白链中VL和VH区关联以形成单价表位结合分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，博尔德(Bird)等人，(1988)科学(Science)242：423-426；和休斯顿(Huston)等人(1988)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))85：5879-5883)。可替代地，通过采用太短(例如，小于约9个残基)以使得单一多肽链的VL和VH结构域不能够关联在一起的柔性接头，可以形成双特异性抗体、双体、或类似分子(其中两个这样的多肽链关联在一起以形成二价表位结合分子)(关于双体的说明参见例如PNAS USA 90(14)，6444-8(1993))。包含在本发明中的表位结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，即一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如描述于WO 2007059782中的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，即包括由在铰链结构域处的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，实质上由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，实质上由VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(沃德(Ward)等人，自然(Nature)341，544-546(1989))，实质上由VH结构域组成，并且还称为域抗体(霍尔特(Holt)等人；生物技术趋势(Trends Biotechnol.)2003年11月；2i(ll)：484-90)；(vi)骆驼抗体或纳米抗体(瑞维特(Revets)等人；生物理论专家观点(Expert Opin Biol Ther.)2005年1月；5_(l)：l ll-24)以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然该Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码，它们可以使用重组方法通过能将所述VL和VH产生为单一蛋白链的合成接头来进行连接，在所述单一蛋白链中VL和VH结构域配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如博尔德(Bird)等人，科学(Science)242，423-426(1988)和休斯顿(Huston)等人，美国国家科学院院刊(PNAS USA)85，5879-5883(1988))。在此进一步讨论在本发明的背景下的这些和其他有用的抗体片段。还应理解的是，术语抗体，除非另外指明，否则还包括抗体样多肽(例如嵌合抗体和人源化抗体)、以及保留特异性地结合至抗原的能力的抗体片段(表位结合片段)，它们是通过任何已知的技术提供的，例如酶切割、肽合成、以及重组技术。如产生的抗体可以具有任何同种型。如在此使用的，“同种型”是指由重链恒定结构域基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。此类抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得；可以易于针对效用以与完整抗体相同的方式来筛选能够结合至所希望的表位的适合片段。
术语“双特异性抗体”是指包含两个独立表位结合片段的抗体，每个表位结合片段靶向独立的靶标。这些靶标可以是存在于不同蛋白上的表位或者存在于相同靶标上的不同表位。双特异性抗体分子可以通过在亲本单特异性双价抗体分子的HC的恒定结构域中使用补偿性氨基酸变化来产生。所得异源二聚体抗体包含从两个不同的亲本单特异性抗体贡献的一个Fab。在Fc结构域中的氨基酸变化导致异源二聚体抗体的增加的稳定性，该异源二聚体抗体具有随时间稳定的双特异性。(里奇韦(Ridgway)等人，蛋白质工程化(ProteinEngineering)9，617-621(1996)，贾娜萨卡(Gunasekaran)等人，JBC 285，19637-1(2010)，摩尔(Moore)等人，MAbs 3：6 546-557(2011)，施特罗普(Strop)等人，JMB 420，204-219(2012)，梅茨(Metz)等人，蛋白质工程化(Protein Engineering)25：10 571-580(2012)，拉布林(Labrijn)等人，PNAS110：113，5145-5150(2013)，施普雷特尔范弗里登施泰因(Spreter Von Kreudenstein)等人，MAbs 5：5 646-654(2013))。双特异性抗体还可以包括使用ScFv融合物产生的分子。然后将两个单特异性scfv独立地连接至能够形成稳定异二聚体的Fc结构域，以产生单一双特异性分子(马布里(Mabry)等人，PEDS 23：3 115-127(2010)。双特异性分子具有双重结合能力。
术语“抗体D1.2”旨在表示抗体或其表位结合片段，包含抗体轻链可变结构域或由抗体轻链可变结构域组成，该抗体轻链可变结构域具有：
(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR2；以及
(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链CDR3；
以及抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域具有：
(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施例中，抗体D1.2或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:8的重链和/或SEQ ID NO:7的轻链或由SEQ ID NO:8的重链和/或SEQ ID NO:7的轻链组成。
在一个相关实施例中，抗体D1.2*或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:8的重链和/或SEQ ID NO:34的轻链或由SEQ ID NO:8的重链和/或SEQ ID NO:34的轻链组成。
术语“抗体C10-2”旨在表示抗体或其表位结合片段，包含抗体轻链可变结构域或由抗体轻链可变结构域组成，该抗体轻链可变结构域具有：
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；以及
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3；
以及抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域具有：
(d)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施例中，抗体C10-2或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:16的重链和/或SEQ ID NO:15的轻链或由SEQ ID NO:16的重链和/或SEQ ID NO:15的轻链组成。
在一个另外的实施例中，人源化抗体C10-2或其表位结合片段可以包含SEQ IDNO:35的重链、SEQ ID NO:36的轻链、或两者或由SEQ ID NO:35的重链、SEQ ID NO:36的轻链、或两者组成。本发明的一个实施例针对抗体或其表位结合片段，该抗体或其表位结合片段包含SEQ ID NO:35的重链、SEQ ID NO:36的轻链或由SEQ ID NO:35的重链、SEQ ID NO:36的轻链组成。
术语“抗体C5.2”旨在表示抗体或其表位结合片段，包含抗体轻链可变结构域或由抗体轻链可变结构域组成，该抗体轻链可变结构域具有：
(a)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2；以及
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
以及抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域具有：
(d)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施例中，抗体C5.2或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO 24的重链和/或SEQ ID NO:23的轻链或由SEQ ID NO 24的重链和/或SEQ ID NO:23的轻链组成。
术语“抗体C8.3”旨在表示抗体或其表位结合片段其片段，包含抗体轻链可变结构域或由抗体轻链可变结构域组成，该抗体轻链可变结构域具有：
(a)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2；以及
(c)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链CDR3；
以及抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域具有：
(d)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链CDR3。
在一个实施例中，抗体C8.3或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO 32的重链和/或SEQ ID NO:31的轻链或由SEQ ID NO 32的重链和/或SEQ ID NO:31的轻链组成。
“抗τ蛋白抗体”是一种抗体或其表位结合片段，其特异性地结合至τ蛋白或τ蛋白片段。
如在此使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子的制品。常规的单克隆抗体组合物显示对于具体表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实施例中，单克隆抗体可以由多于一种Fab结构域构成，由此增加针对多于一种靶标的特异性。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”不是旨在由任何具体产生方法(例如，重组的、转基因、杂交瘤、等)限制。
本发明的这些抗体及其表位结合片段将优选是“人源化”的，特别是当被采用以用于治疗目的时。术语“人源化”是指一种通常使用重组技术制备的分子，具有从来自非人类物种的免疫球蛋白衍生的表位结合位点，以及基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。该表位结合位点可包括与人类恒定结构域融合的完整非人类抗体可变结构域，或者包括此类可变结构域的接枝到人类可变结构域的适当人类框架区上的仅互补决定区(CDR)。此类人源化分子的框架残基可以是野生型(例如，全人的)或者它们可以被修饰为包含未在人类抗体中发现的一种或多种氨基酸取代，其序列可以充当人源化的基础。人源化减轻或消除了分子的恒定结构域将在人类个体中充当免疫原的可能性，但外源可变结构域的免疫应答的可能性仍保留(洛布利(LoBuglio)，A.F.等人(1989)“在人类中的小鼠/人类嵌合单克隆抗体：动力学和免疫应答”(“Mouse/Human Chimeric MonoclonalAntibody In Man:Kinetics And Immune Response，”)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))86：4220-4224)。另一种方法不仅聚焦于提供人类-衍生的恒定结构域，而且还聚焦于修饰可变结构域以便尽可能改造它们接近人类形式。已知的是重链和轻链两者的可变结构域包含三个互补决定区(CDR)，这些互补决定区响应于讨论的抗原而不同，并且决定结合能力，侧翼为四个框架区(FR)，这些框架区在给定物种中是相对保守的并且推测为CDR提供支架。当非人类抗体相对于具体抗原制备时，可变结构域可以通过将衍生自非人类抗体的CDR接枝到有待修饰的人类抗体中存在的FR上来“改造”或“人源化”。这种方法应用至不同抗体已经由以下报道：萨托(Sato)，K.等人(1993)癌症研究(Cancer Res)53：851-856；莱兴曼(Riechmann)，L.等人(1988)“改造人抗体用于治疗(Reshaping Human Antibodies for Therapy)”，自然(Nature)332：323-327；维霍演(Verhoeyen)，M.等人(1988)“改造人类抗体：接枝溶菌酶抗体活性”(“Reshaping HumanAntibodies:Grafting An Antilysozyme Activity”)，科学(Science)239：1534-1536；凯特伯拉夫(Kettleborough)，C.A.等人(1991)“通过CDR接枝小鼠单克隆抗体的人源化：框架残基对环构象的重要性”(“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation”)，蛋白质工程化(Protein Engineering)4：773-3783；梅达(Maeda)，H.等人.(1991)“具有HIV中和活性的改造人类抗体的构建”(“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity”)，人类抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)2：124-134；戈尔曼(Gorman)，S.D.等人.(1991)“改造治疗性CD4抗体”(“Reshaping A TherapeuticCD4Antibody”)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))88：4181-4185；坦皮斯特(Tempest)，P.R.等人.(1991)“改造人类单克隆抗体以抑制人类呼吸道合胞病毒的体内感染”(“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human RespiratorySyncytial Virus Infection in vivo”)，生物/技术(Bio/Technology)9：266-271；可(Co)，M.S.等人.(1991)“用于抗病毒疗法的人源化抗体”(“Humanized Antibodies ForAntiviral Therapy”)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))88：2869-2873；卡特(Carter)，P.等人.(1992)“抗p185her2抗体的人源化用于人类癌症疗法”(“Humanization Of An Anti-p185her2Antibody For Human Cancer Therapy，”)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))89：4285-4289；以及可(Co)，M.S.等人.(1992)“具有针对CD33抗原的特异性的嵌合和人源化抗体”(“Chimeric And HumanizedAntibodies With Specificity For The CD33Antigen”)，免疫学杂志(J.Immunol.)148：1149-1154。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，它包含来自小鼠抗体的所有六种CDR)。在其他实施例中，人源化抗体具有相对于该原始抗体被改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，这些CDR还称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗原的能力是熟知的(参见例如美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
术语抗体“XX”旨在表示一种抗体或其表位结合片段(例如抗体“C10-2”)，包含或其组成为轻链、轻链可变结构域、或轻链可变结构域CDR1-3(如通过其对应的SEQ ID NO定义)以及重链、重链可变结构域、或重链可变结构域CDR1-3(如通过其对应的SEQ ID NO定义)。在某些实施例中，该抗体或其表位结合片段是通过它们的如通过其SEQ ID NO定义的整个重链可变结构域以及它们的如通过其SEQ ID NO定义的轻链可变结构域来定义。
除非在此另外指定，在抗体的Fc区或恒定结构域中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也成为EU索引，如在以下中描述的：卡巴特(Kabat)等人)，具有免疫学意义的蛋白的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生服务(Public Health Service)，国立卫生研究院，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(MD)，1991。
如在此所使用的，如果一种抗体或其表位结合片段更频繁地、更快速地以更大持续时间和/或更大亲和力或亲合力(相对于可替代表位而言)与该表位发生反应或缔合，该抗体或其表位结合片段即被认为“特异性地”结合另一个分子的区域(即表位)。通过阅读本定义还应理解，例如，特异性地结合至第一靶标的抗体或其表位结合片段可以是或可以不是特异性地或优先地结合至第二靶标。如在此所使用的，在抗体结合至预定抗原的背景中，术语“结合”典型地是指当通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在3000仪器中使用抗原作为配体并且使用抗体作为分析物来确定时，以相应于约10-7M或更小(例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小)的KD的亲和力的结合，并且与结合至不是预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)的亲和力相比，以相应于低至少十倍例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的亲和力结合至该预定抗原。使亲和力更低的量依赖于抗体的KD，从而当抗体的KD非常低时(即抗体是高度特异性的)，则使针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。
如在此使用的，术语“kd”(sec-1或1/s)是指具体抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。
如在此使用的，术语“ka”(M-1 x sec-1或1/Msec)是指具体抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。
如在此使用的，术语“KD”(M)是指具体抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，并且是通过将kd除以ka来获得。
如在此使用的，术语“KA”(M-1或1/M)是指具体抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数，并且是通过将ka除以kd来获得。
在一个实施例中，本发明涉及一种抗τ蛋白抗体或其表位结合片段，其展现出以下特性中的一种或多种：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基(pS404)；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％；或者当如在此所描述的与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，其特异性地以至少90％减少S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带、同时以不多于10％减少非过度磷酸化τ蛋白条带的能力。
本发明的一个另外的实施例涉及一种通过用于产生高特异性、高亲和力抗体的方法而产生的抗体，这些高特异性、高亲和力抗体对于包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白具有免疫特异性，其中所述方法包括以下步骤：
(A)将免疫原注入哺乳动物中，由此免疫所述哺乳动物，所述免疫原包含双磷酸化肽，该双磷酸化肽包含含有覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)的18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基；
(B)将对所述哺乳动物的所述免疫重复进行两次或更多次；
(C)针对高特异性、高亲和力抗体的存在对来自所述经重复免疫的哺乳动物的血清样品进行筛选，这些高特异性、高亲和力抗体能够结合包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白、但是基本上很少能够结合非病原性τ蛋白；并且
(D)回收所述高特异性、高亲和力抗体。
如在此使用的，“基本上不能”结合τ分子表示，相对于由参考抗体介导的可检测结合而言，在功能方面的多于20％差异、多于40％差异、多于60％差异、多于80％差异、多于100％差异、多于150％差异、多于2-倍差异、多于4-倍差异、多于5-倍差异、或多于10-倍差异。
术语“选择性”和“免疫选择性”当指代抗τ蛋白抗体相对于两种表位的结合能力时，是旨在表示在饱和条件下观察到的结合展现至少80％差异、至少95％差异、以及最优选100％差异(即没有与一种表位的可检测结合)。术语“选择性”和“免疫选择性”当指代τ蛋白抗体时，进一步旨在意指该抗体结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白，并且能够在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分。
术语TBS-可提取的(S1)、高盐/肌氨酰-可提取的(S3)、以及肌氨酰-不溶性(P3)部分是如通过在此描述的τ蛋白生物化学分级获得的部分。
在一些抗体中，需要仅CDR的部分，即结合所需要的CDR残基子集(称为SDR)，以保持在人源化抗体中的结合。不接触相关表位且不在SDR中的CDR残基可以基于先前研究(例如在CDR H2中的残基H60-H65常常不是需要的)，从位于乔西亚(Chothia)高变环外部的卡巴特CDR的区域(参见卡巴特(Kabat)等人(1992)具有免疫学意义的蛋白的序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)，国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)，出版号91-3242；乔西亚(Chothia)，C.等人(1987)“对于免疫球蛋白的高变区的典范结构”(“Canonical Structures For The Hypervariable Regions OfImmunoglobulins”)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917)，通过分子建模和/或根据经验来鉴定，或者如在以下文献中描述的来鉴定：冈萨雷斯(Gonzales)，N.R.等人(2004)“使用多种人类种系模板进行鼠类抗体的SDR接枝以最小化其免疫原性”(“SDR GraftingOf A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize ItsImmunogenicity”)，分子免疫学(Mol.Immunol.)41：863-872。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在的位置处或者在整个供体CDR被省略的位置处，占据该位置的氨基酸可以是受体抗体序列中占据相应位置(通过卡巴特编号)的氨基酸。在所包含的CDR中受体对于供体氨基酸的此类取代的数目反映竞争考虑的平衡。此类取代在降低人源化抗体中的小鼠氨基酸的数目方面是潜在有利的，并且因此降低潜在的免疫原性。然而，取代还可以引起亲和力的变化，并且优选避免亲和力的显著降低。还可以根据经验选择在CDR内用于取代的位置和用以取代的氨基酸。
CDR残基的单一氨基酸改变可以导致功能性结合的损失的事实(鲁迪科夫(Rudikoff)，S.等(1982)“改变抗原结合特异性的单一氨基酸取代”(“Single Amino AcidSubstitution Altering Antigen-Binding Specificity”)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))79(6)：1979-1983)提供了用于系统地鉴定可替代功能CDR序列的手段。在用于获得此类变体CDR的一个优选方法中，诱变编码CDR的多核苷酸(例如经由随机诱变或通过定点方法(例如聚合酶链介导的采用编码突变座位的引物进行的扩增))以产生具有经取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能性)CDR序列中的相关残基的身份与经取代的(非功能性)变体CDR序列的身份，可以针对该取代鉴定BLOSUM62.iij取代分数。BLOSUM系统提供了通过分析受信任的比对的序列的数据库而创建的氨基酸取代的矩阵(埃迪(Eddy)，S.R.(2004)“BLOSUM62比对分数矩阵来自哪里？”(“Where Did TheBLOSUM62Alignment Score Matrix Come From？”)，自然生物技术(Nature Biotech.)22(8)：1035-1036；赫尼科夫(Henikoff)，J.G.(1992)“来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵”(“Amino acid substitution matrices from protein blocks”)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))89：10915-10919；卡林(Karlin)，S.等人(1990)“用于通过使用一般评分方案评估分子序列特征的统计学显著性的方法”(“Methods For AssessingThe Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using GeneralScoring Schemes”)，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))87：2264-2268；阿尔丘尔(Altschul)，S.F.(1991)“从信息理论角度的氨基酸取代矩阵”(“Amino AcidSubstitution Matrices From An Information Theoretic Perspective”)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)219，555-565。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表1呈现了BLOSUM62.iij取代分数(得分越高取代越保守，并且因此更加可能地，该取代将不会影响功能)。如果包含所得CDR的表位结合片段未能结合至τ蛋白，例如，则BLOSUM62.iij取代分数被认为是不足够保守的，并且选择并产生具有更高取代分数的新候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)，并且非功能性取代残基是组氨酸(H)，则BLOSUM62.iij取代分数将是0，并且更保守的变化(例如变为天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、或赖氨酸)是优选的。
因此，本发明考虑了使用随机诱变来鉴定改进的CDR。在本发明的背景下，保守取代可以由表2、3、或4中的一个或多个中反映的氨基酸类别之内的取代来限定：
用于保守取代的氨基酸残基类别：
可替代的保守氨基酸残基取代类别：
氨基酸残基的可替代的物理性和功能性分类：
更保守取代组群包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。
另外组的氨基酸还可以使用描述于例如克赖顿(Creighton)(1984)蛋白质：结构和分子特性(Proteins:Structure and Molecular Properties)(第2版，1993)，W.H.弗里曼(Freeman)和公司中的原则来配制。
噬菌体展示技术可以可替代地用于增加(或降低)CDR亲和力。被称为亲和力成熟的这种技术采用诱变或者“CDR步移”和重选择，使用靶标抗原或其抗原表位结合片段来鉴别具有如下CDR的抗体，这些CDR当与初始抗体或亲本抗体比较时以更高(或更低)亲和力结合到该抗原(参见例如格拉泽(Glaser)等人(1992)免疫学杂志(J.Immunology)149：3903)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸产生了氨基酸突变的半随机谱。可构建由一组变体克隆所组成的库，每一克隆都在单个CDR中相差单个氨基酸改变，并且这些克隆包含代表了每个CDR残基的每个可能氨基酸取代的变体。可通过使固定化突变体与标记的抗原相接触来筛选对抗原的结合亲和力增加(或减少)的突变体。本领域中已知的任何筛选方法(例如ELISA)可以用于鉴定对抗原具有增加或降低的亲和力的突变体抗体(参见吴(Wu)等人，1998，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.))95：6037；耶尔顿(Yelton)等人，1995，免疫学杂志(J.Immunology)155：1994)。可以可能地使用使轻链随机化的CDR步移(参见例如希尔(Schier)等人，1996，分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)263：551)。
用于完成此类亲和力成熟的方法描述于以下中，例如：克劳斯(Krause)，J.C.等人(2011)“扭曲抗体结合位点构造的插入突变增强了人类抗体的功能(An InsertionMutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances FunctionOf A Human Antibody)”，MBio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10；宽(Kuan)，C.T.等人(2010)“靶向恶性胶质瘤和黑色素瘤的亲和力成熟的抗糖蛋白NMB重组免疫毒素(Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant ImmunotoxinsTargeting Malignant Gliomas And Melanomas)”，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)10.1002/ijc.25645；哈克尔(Hackel)，B.J.等人(2010)“稳定性和CDR组成偏移丰富了结合物功能景观(Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder FunctionalityLandscapes)”，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)401(1)：84-96；蒙哥马利(Montgomery)，D.L.等人(2009)“针对HIV-1gp41的人类单克隆抗体的亲和力成熟和表征(AffinityMaturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1gp41)”，MAbs 1(5)：462-474；古斯查那(Gustchina)，E.等人(2009)“通过源自合成原初人类抗体文库并且针对Gp41的内部三聚卷曲螺旋的单克隆Fab的CDR-H2环的靶向多样化的亲和力成熟产生了一组具有改进的HIV-1中和效力和幅度的Fab(Affinity Maturation ByTargeted Diversification Of The CDR-H2Loop Of A Monoclonal Fab Derived From ASyntheticHuman Antibody Library And Directed Against The InternalTrimeric Coiled-Coil Of Gp41Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1Neutralization Potency And Breadth)”，病毒学(Virology)393(1)：112-119；芬利(Finlay)，W.J.等人(2009)“用于抗RAGE治疗的人源化大鼠抗体的亲和力成熟：全面诱变揭示在互补决定区内外同时存在的高水平的突变可塑性((Affinity Maturation Of AHumanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy:Comprehensive MutagenesisReveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside TheComplementarity-Determining Regions)”，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)388(3)：541-558；博斯特伦(Bostrom)，J.等人(2009)“改进抗体结合亲和力和特异性用于治疗开发(Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For TherapeuticDevelopment)”，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)，525：353-376；施泰德尔(Steidl)，S.等人(2008)“通过靶向的CDR多样化的人类GM-CSF抗体的体外亲和力成熟(In VitroAffinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification)”，分子免疫学(Mol.Immunol.)46(1)：135-144；和班德拉斯(Barderas)，R.等人(2008)“通过计算机建模辅助的抗体的亲和力成熟(Affinity Maturation OfAntibodies Assisted By In Silico Modeling)”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))105(26)：9029-9034。
因此，包括的抗体或其表位结合片段的CDR变体序列可以通过取代而不同于亲本抗体D1.2、C10-2、C5.2或C8.3的CDR序列；例如经取代的4个氨基酸残基、3个氨基酸残基、2个氨基酸残基或1个氨基酸残基。根据本发明的实施例，进一步设想的是在CDR区中的氨基酸可以用如在上表3中定义的保守取代来取代。例如，酸性残基Asp可以被Glu取代而不会实质性地影响该抗体的结合特征。
术语“正常τ蛋白”是指每摩尔蛋白中包含2-3摩尔磷酸的正常脑τ蛋白。
术语“过度磷酸化τ蛋白”是指与多阴离子种类诱导的在蛋白质印迹中的迁移性变动相一致的τ蛋白的多磷酸化种类，或者是指具有多于五个、六个或七个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位点的τ蛋白种类。
术语“具有磷酸化残基396的τ蛋白”涉及过度磷酸化τ蛋白，其中残基396被磷酸化并且残基404磷酸化或不被磷酸化。
术语“转基因非人类动物”是指具有含一种或多种人类重和/或轻链转基因或转染色体(整合或未整合到动物的天然基因组DNA中)的基因组的非人类动物，并且其不能表达全人源化抗体。例如，转基因小鼠可以具有人源化轻链转基因以及人源化重链转基因或人源化重链转染色体，使得该小鼠当用τ抗原和/或表达τ蛋白的细胞免疫时产生人源化抗τ蛋白抗体。人源化重链转基因可以整合到小鼠的染色体DNA中，转基因小鼠的例子例如HuMAb小鼠，如HCo7或Hcol2小鼠，或者人源化重链转基因可以保持在染色体外，转染色体KM小鼠的例子如在WO 02/43478中所述。此类转基因和转染色体小鼠(在此统称为“转基因小鼠”)能够通过经历V-D-J重组和同种型转换而产生针对给定抗原的人源化单克隆抗体的多种同种型(例如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。
转基因的非人类动物还可以用于通过引入编码这种特异性抗体的基因(例如通过可操作地将基因连接至在动物乳中表达的基因)针对特定抗原产生抗体。
如在此所使用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指改善、减慢、衰减、或逆转疾病或障碍的进展或严重性、或者改善、减慢、衰减、或逆转这种疾病或障碍的一种或多种症状或副作用。对于本发明的目的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”另外指的是一种用于获得有益的或希望的临床结果的方法，其中“有益的或希望的临床结果”包括但不限于症状的缓解、障碍或疾病程度的减小、稳定化的(即没有恶化的)疾病或障碍状态、疾病或障碍状态进展的延缓或减慢、疾病或障碍状态的改善或减轻、以及疾病或障碍的缓解，不论是部分地或全部地、可检出的或不可检出的。
“有效量”，当应用于本发明的抗体或其表位结合片段时，是指一个在所需剂量和持续时期下足以实现预期生物效应或希望的治疗结果(包括而不限于临床结果)的量。短语“治疗有效量”当应用于本发明的抗体或其表位结合片段时，旨在表示该抗体或其表位结合片段足以改善、减轻、稳定、逆转、减慢、衰减或延缓障碍或疾病状态的进展或该障碍或疾病的症状的量。在实施例中，本发明的方法提供用于与其他化合物相组合来给予该抗体或其表位结合片段。在此类情况下，“有效量”是足以引起预期的生物效应的该组合的量。
本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的治疗有效量可以根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别、和体重以及抗τ蛋白抗体或其表位结合片段在该个体中引发希望的应答的能力来改变。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。
如以上指出的，本发明特别涉及单克隆抗体或表位结合片段，并且涉及一种全新的用于产生此类分子(以及由此此类其表位结合片段)的方法。这种方法概述于图9中。新方法用以分离单克隆抗体的这种能力在此通过将该方法用于分离能够特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基丝氨酸396({p}S396)的单克隆抗体得以例证。这些抗体被进一步表征为它们在磷酸化残基丝氨酸396和丝氨酸404(pS404)之间区分的能力，使得它们不结合至具有磷酸化丝氨酸404的τ蛋白，除非τ蛋白在残基396处也被磷酸化。
已经通过使用新颖方法产生并分离本发明的抗体、或其表位结合片段(图9)，该方法有利于选择{p}S396特异性抗体(图9)。此外，通过应用这种非常严格的抗体克隆选择程序，已经获得不仅对S396具有高度特异性而且对磷酸化{p}S396表位具有高度选择性的抗体。这些抗体唯一性地识别来自阿尔茨海默病脑的τ蛋白。我们还证实，概述于图9中的筛选程序确保对具有功能性和治疗性效用的抗体的鉴定。
针对覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-408的双磷酸化肽：TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)产生抗体(实例1)。用该磷酸化肽免疫小鼠。一旦已经获得足够的抗体滴度，则处死这些小鼠并产生杂交瘤(实例2)。使用斑点印迹(实例3)以及MSD ELISA筛选这些杂交瘤，该ELISA中使用固定的人类病理性和非病理性τ蛋白(实例4)。在斑点印迹和蛋白质印迹中，在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分的能力用于选择杂交瘤。选择16个克隆，回收其中的四个杂交瘤克隆，这四个杂交瘤克隆产生展现出结合至人类病理性τ蛋白材料的非凡能力的抗体。
还通过从患病和未患病人类AD脑中分离τ蛋白，并且将此材料固定在MSD ELISA板上来确定与病理性和非病理性τ蛋白的特异性结合(实例4)。
本发明的另外一方面涉及针对双磷酸化肽引发的单克隆抗体或其表位结合片段，该双磷酸化肽包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQID NO:37)内的至少18个例如至少20个连续氨基酸残基。在本发明的这个方面，该单克隆抗体或其表位结合片段典型地是针对双磷酸化肽引发，该双磷酸化肽包含含有覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)的18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基。
本发明的另外一方面是针对本发明的单克隆抗体或其表位结合片段，具有超过年龄匹配健康对照的、对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有超过来自年龄匹配健康对照的τ蛋白的、对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用如在此所述的磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆中检测磷酸化τ蛋白(pτ)。
本发明的一个相关方面是针对本发明的单克隆抗体或其表位结合片段，具有对于AD患病τ蛋白的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有超过年龄匹配健康对照的、对于AD的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆中检测磷酸化τ蛋白(pτ)。
设置1ELISA方法包括步骤：A)使用C10-2包被的板，捕获来自AD脑的病理性人类τ抗原；B)孵育τ抗原与渐增浓度的pS396特异性抗体；以及C)使用来自MSD的硫标记的抗人类(总)τ蛋白抗体，检测该τ抗原捕获和抗体介导的抑制。
本发明进一步涉及一种通过用于产生高特异性、高亲和力抗体的方法而产生的抗体，这些高特异性、高亲和力抗体对于包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白具有免疫特异性，其中所述方法包括以下步骤：
(A)将免疫原注入哺乳动物中，由此免疫所述哺乳动物，所述免疫原包含双磷酸化肽，该双磷酸化肽包含含有覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)的18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基；
(B)将对所述哺乳动物的所述免疫重复进行两次或更多次；
(C)针对高特异性、高亲和力抗体的存在对来自所述经重复免疫的哺乳动物的血清样品进行筛选，这些高特异性、高亲和力抗体能够结合包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白、但是基本上很少能够结合非病原性τ蛋白；并且
(D)回收所述高特异性、高亲和力抗体。
更确切地说，步骤A包括：用典型地为在包被缓冲液中0.5μg/ml(捕获抗体)的C10-2抗体包被MSD板(典型地在4C过夜)，封闭(典型地在室温1小时)，并且洗涤(典型地3次)。步骤B包括：将来自AD(从3名患者聚集)的P3裂解物的样品(典型地1:1000＝2-4μg/ml总蛋白)和/或S1(p)(典型地1:300＝20-40ng/ml总蛋白)与成梯度浓度的pS396肽表位特异性抗体进行混合，并且孵育(典型在室温下1小时)。随后将这些反应物在步骤A中制备的板上孵育2小时。步骤C包括使用硫标记的人类τ蛋白检测C10-2捕获的τ蛋白。来自MSD的τ蛋白抗体(典型地1:50)遵循厂商说明书。将板在MSDS600上进行分析。以类似设置测试AD P3和AD S1(p)。
另外一个实施例涉及抗体或其抗原结合片段，其能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396，已经在一种细胞系中产生或制造，该细胞系例如是人类细胞系、哺乳动物非人类细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系。
该抗体或其抗原结合片段能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396，产生于CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11的细胞系、CAP细胞系和HuH-7人类细胞系中。
D1.2和C10-2特异性亲和力和结合特性已经使用在位置396或404处磷酸化或非磷酸化的τ386-410(2R4N)肽进行表征(SEQ ID NO:29-32)。使用本申请中概述的特定免疫和筛选方案(图9)将产生高度磷酸化丝氨酸-396(pS396)特异性抗体，如图4中证明的。
为了证明这些抗体对于病理性τ蛋白具有特异性，已经通过免疫组织化学分析对D1.2和C10-2抗体进行表征(实例6)。这些抗体展现出与阿尔茨海默病脑中的以及来自表达人类(P301L)突变体τ蛋白的Tg4510τ蛋白转基因小鼠的部分中的神经原纤维缠结的高度特异性结合(图5)。没有观察到与来自人类对照脑和来自非转基因小鼠脑的组织的结合，证明了这些抗体特异性地结合人类τ蛋白并且特别是与阿尔茨病理学相关联的τ蛋白。
这些抗体识别与疾病病理性相关联的τ蛋白的独特能力是在此处的实例7中得以证实。我们在实例3中描述的测定中比较了病理性对比非病理性τ蛋白的结合。比较是与五种公开的τ蛋白抗体：hACI-2B6、IPN002、HJ8.5、2.10.3、和4E4的比较。图6展示了参考抗体的每一个对于来自健康和患病脑的τ蛋白的结合，以及与分离自10月龄Tg4510τ蛋白转基因小鼠的P301L人类突变体τ蛋白的结合。这证明了分离的抗体展现出对于人类病理性τ蛋白的格外高程度的特异性和选择性。该选择性优于如表5中所示的对比抗体中的任一个。
饱和时，结合抗体D1.2和C10-2展现出对于分离自人类AD脑的P3τ蛋白大于100倍的选择性。
为了证明所选择的抗体具有功能性和治疗性效用，在体外和细胞内τ-聚集测定中测试了抗体(实例8)。这些测定是功能测定，证实这些抗体能够干扰τ蛋白的病理性聚集过程。将HEK293细胞瞬时转染人类τ-P301L-FLAG(4R0N)。随后将细胞暴露于来自人AD脑或来自转基因Tg4510脑的τ蛋白提取物。到病理性τ蛋白的这种暴露促进τ蛋白摄取入细胞和细胞内聚集。使用抗体D1.2和C10-2两者对τ蛋白-制品的免疫耗减以及用这些抗体直接处理细胞能够显著减少τ蛋白聚集体的形成(图7)。
抗体D1.2和C10-2的治疗效用也已经在人类τ/PS1小鼠中被评价(实例9)。这种小鼠模型是更加与AD疾病相关的动物模型，其仅在生命后期(12-18月龄)产生AD病理学。然而，这些小鼠在实体缠结病理学的出现之前展现出τ蛋白过度磷酸化。慢性注射小鼠持续13周，每周两次，剂量为15mg/kg。抗体处理的小鼠展现出磷酸化τ蛋白的显著减少，如图9中证明的，指示用抗体D1.2和C10-2慢性处理将降低缠结病理学，并且由此降低随后的体内神经变性。
本发明的抗体通过免疫耗减方法特异性地去除来自rTg4510小鼠脑提取物的过度磷酸化τ蛋白。此外，本发明的抗体并不去除来自匀浆的正常τ蛋白，而可商购的τ5抗体去除来自匀浆的正常τ蛋白。与结合至τ蛋白(其中磷酸化在残基404处或在残基404和396两者处)的商业抗体相比，本发明的抗体特异性地去除95％的在丝氨酸396上磷酸化的过度磷酸化τ蛋白。实验(实例12)证明本发明的抗体，尽管仅去除脑匀浆中的总τ蛋白的非常少的部分(8％)，但这些抗体特异性地去除过度磷酸化τ蛋白(以90％)。因此，本发明的一个方面是针对单克隆抗体或其表位结合片段，能够免疫特异性地结合至病原性过度磷酸化τ蛋白。其此外，在其中使用本发明的抗体去除过度磷酸化τ蛋白的实验中，接种活性被消除。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。已经提出接种的减少降低了缠结形成的发展以及τ蛋白病变(包括阿尔茨海默病)的进展。因此，本发明的另一个方面是针对本发明的抗体，用于在AD进展或AD症状的降低中使用。
更确切地说，如上详述，本发明涉及选自下组的四种单克隆抗体中的任一种，该组包括：
抗体D1.2
(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3。
该抗体或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域和/或SEQ IDNO:7的轻链可变结构域或由SEQ ID NO:8的重链可变结构域和/或SEQ ID NO:7的轻链可变结构域组成。
在一个相关实施例中，抗体D1.2或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:8的重链和/或SEQ ID NO:34的轻链或由SEQ ID NO:8的重链和/或SEQ ID NO:34的轻链组成。
抗体C10-2
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3。
该抗体或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:15的重链可变结构域和/或SEQ IDNO:16的轻链可变结构域或由SEQ ID NO:15的重链可变结构域和/或SEQ ID NO:16的轻链可变结构域组成。
人源化C10-2抗体的重链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:35中。人源化C10-2抗体的轻链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:36中。
总之，这些实例示出包括C10-2的本发明的抗体有效地结合至AD-P3抗原包被的MSD板上。相比之下，商业抗体如PHF-13，具有低的结合活性。此外PHF-13证实了相比于本发明的抗体而言实质上更高程度的非特异性结合(参见表6A-表6D)。表6示出在C10-2包被的板中，Pτ抗原捕获的mC10-2液相抑制是有效的(IC50＝10-20nM)，而mD1.2是无效的(IC50＝500-1000nM)。在mC10-2包被的板中，p-τ抗原捕获的mC10-2液相抑制是有效的(其IC50＝10-20nM)，而PHF-13是无效的(IC50＝500-1000nM)。
本发明的一个方面是针对一种抗体，该抗体包含
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3。
本发明的另一个方面是针对一种抗体，该抗体包含
(d)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3。
本发明的另一个方面是针对一种抗体，该抗体包含
(d)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3以及
以下项中的一个、两个或三个
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；以及
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3。
抗体C5.2
(a)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3。
该抗体或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:23的重链可变结构域和/或SEQ IDNO:24的轻链可变结构域或由SEQ ID NO:23的重链可变结构域和/或SEQ ID NO:24的轻链可变结构域组成。
如可以从图10的晶体结构看出，表位跨C5.2的重链和轻链结合。因此，在相关实施例中，本发明的该抗体或其表位结合片段包含
(a)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR1；或
(b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2；或
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；以及
(d)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；或
(e)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；或
(f)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3。
抗体C8.3
(a)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2
(c)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链CDR3。
该抗体或其表位结合片段可以包含SEQ ID NO:31的重链可变结构域和/或SEQ IDNO:32的轻链可变结构域或由SEQ ID NO:31的重链可变结构域和/或SEQ ID NO:32的轻链可变结构域组成。
该抗体或其表位结合片段优选是一种人类抗体或人源化抗体。
根据一个实施例，以上所述的抗体及其表位结合片段可以进一步包括这种轻链和/或重链CDR1、CDR2或CDR3的变体(具有不多于4个氨基酸差异，或不多于3个氨基酸差异，或不多于2个氨基酸差异，或不多于1个氨基酸差异。
如可以从图11中所见，在至少一个实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3和LCCDR3对于结合至τ蛋白的392-398区域是重要的。在本发明的一个实施例中，本发明的抗体或其表位结合片段包括：
a)重链CDR1，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20、和SEQ ID NO:28；
b)重链CDR2，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:29；以及
c)重链CDR3，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:30；以及
d)轻链CDR3，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:19、和SEQ ID NO:27。
如本发明所述的抗体，或其表位结合片段可以包含
a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；
c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3；以及
d)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3。
在本发明的一个方面中，本发明是针对一种抗体或其表位结合片段，它们形成疏水口袋，该疏水口袋是由L3:H3、L3:F8*、H1:H13、H2:Y1、H2:Y3与τ肽的Y394形成。在一个实施例中，本发明是针对一种抗体，该抗体与在此进一步描述的抗体相竞争以在溶剂化的{p}S396与L3:T4、H1:R10、H1:T11、H3:R1、H3:T3之间形成氢键键合网络；(*)L3:F8是CDR L3的C末端侧翼框架残基(参见图11)。
如可以从x-射线晶体结构所见，本发明的抗体以两个水平的选择性结合。第一水平的选择性是针对过度磷酸化病理性τ蛋白的选择性，并且第二水平的选择性是针对磷酸化丝氨酸残基的选择性，其中所述磷酸化丝氨酸的磷酸盐通过氢键键合到酪氨酸残基的侧链上，该酪氨酸残基距离所述磷酸化丝氨酸两个残基。因此，本发明的令人感兴趣的方面是针对一种对过度磷酸化τ蛋白的包含磷酸化丝氨酸的氨基酸基序具有选择性的抗体或其表位结合片段，该磷酸化丝氨酸距离酪氨酸残基两个残基。典型地，该氨基酸基序具有以下序列：
Y-X–S(磷酸化)-P-
其中Y是酪氨酸，X是天然存在的氨基酸，P是脯氨酸，并且S(磷酸化)是具有磷酸化羟基侧链的丝氨酸。
类似地，本发明的令人感兴趣的一个方面是针对一种抗体或其表位结合片段，其结合至磷酸化τ蛋白、优选地至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IA具有选择性，其中R是天然存在的氨基酸的侧链。
不受具体理论的束缚，认为当氨基酸基序IA处于病理性τ蛋白采用的构象中时，本发明的抗体对于所述基序具有选择性。因此，氨基酸基序IA典型地是由本发明的抗体选择性地识别。因此，本发明的令人感兴趣的一个方面是针对一种抗体或其表位结合片段，其结合至磷酸化τ蛋白、优选地至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IB具有选择性，其中R是天然存在的氨基酸的侧链。
在本发明的此方面的一个典型实施例中，本发明是针对一种抗体或其表位结合片段，其结合至磷酸化τ蛋白、优选地至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IB具有选择性，其中R是天然存在的氨基酸的侧链，但不限于IC或ID。
本发明还提供了一种降低患者中τ蛋白缠结形成的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者给予治疗有效量的本发明的抗体或其表位结合片段。
本发明的一个方面是针对一种使用本发明的抗体或其表位结合片段治疗τ蛋白病变的方法。典型地该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆(Neurofibrillary tangle-predominant seniledementia)；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。具体地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
因此，本发明的另一个方面是针对本发明的抗体或其表位结合片段，用于在治疗τ蛋白病变中使用。典型地该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease)(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。具体地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
本发明的另一个方面是针对在一种组合物中的本发明的抗体或其表位结合片段，连同药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或稳定剂。本发明的抗体或其表位结合片段可以在用于治疗τ蛋白病变的疗法中使用。典型地该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。具体地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
设想的通过本发明的治疗可以是慢性的，并且可以对该患者治疗至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。
本发明的这些抗体可以例如是通过杂交瘤方法产生的单克隆抗体，该杂交瘤方法首次描述于科勒(Kohler)等人，自然(Nature)256，495(1975)，或可以是通过重组DNA或其他方法产生的单克隆抗体，或更优选可以通过在此披露的新颖方法产生(图9)。还可以使用例如，在克拉克森(Clackson)等人(自然(Nature)352：624-628，1991)和马克思(Marks)等人分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597,(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。单克隆抗体可以获得自任何适合的来源。因此，例如，单克隆抗体可以获得自从鼠类脾脏B淋巴细胞(获得自用感兴趣抗原免疫的小鼠)制备的杂交瘤，该感兴趣抗原例如处于以下形式：在表面上表达抗原的细胞、或者编码感兴趣抗原的核酸。单克隆抗体还可以获得自杂交瘤，该杂交瘤衍生自经免疫的人类的抗体表达细胞，或者来自非人类哺乳动物例如大鼠、兔、狗、绵羊、山羊、灵长类动物等。
在一个实施例中，本发明的抗体是人源化抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠免疫系统的转基因或转染色体小鼠产生针对τ蛋白的人源化单克隆抗体。此类转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb(人源化单克隆抗体)小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。
HuMAb小鼠包含人类免疫球蛋白基因迷你座位(mini-locus)，该迷你座位编码未重排的人类重链可变和恒定(μ和Y)以及轻链可变和恒定(κ)链免疫球蛋白序列，连同靶向的突变，所述突变使内源性μ和K链座位失活(兰博尔格(Lonberg)，N.等人，自然(Nature)368，856-859(1994))。因此，这些小鼠展示出小鼠IgM或κ的表达减少，并且响应于免疫，所引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人类IgG、κ单克隆抗体(兰博尔格(Lonberg)，N等人(1994)，同上；评论于兰博尔格，N.，实验药物学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)113：49-101(1994)中；兰博尔格,·N.和胡萨尔(Huszar)，D.)，国际免疫学评论(Intern.Rev.Immunol.)13：65-93(1995)，以及哈丁(Harding)，F.和兰博尔格，N.，纽约科学院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)764：536-546(1995))。HuMAb小鼠的制备详细描述于泰勒(Taylor)，L.等人，核酸研究(Nucleic AcidsResearch)20，6287-6295(1992)，陈(Chen)，J.等人，国际免疫学(InternationalImmunology)5，647-656(1993)，蒂阿永(Tuaillon)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)152，2912-2920(1994)，泰勒(Taylor)，L.等人，国际免疫学(International Immunology)6，579-591(1994)，费雪维尔德(Fishwild)，D.等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)。还参见US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918和WO 01/09187。
HCo7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在它们的内源性轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如在陈(Chen)等人，EMBO J.12，811-820(1993)中所述)、在它们的内源性重链基因中的CMD破坏(如在WO 01/14424的实例1中所述)、以及KCo5人类κ轻链转基因(如在费雪维尔德(Fishwild)等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)14，845-851(1996)中所述)。此外，这些HCo7小鼠具有HCo7人类重链转基因(如US 5,770,429中所述)，该HCo12小鼠具有HCo12人类重链转基因(如WO 01/14424的实例2中所述)，该HCo17小鼠具有HCo17人类重链转基因(如WO 01/09187的实例2中所述)，并且HCo20小鼠具有HCo20人类重链转基因。所得小鼠在内源性小鼠重链和κ轻链座位破坏的纯合背景中表达人类免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。
在KM小鼠品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经纯合地破坏，如在陈(Chen)等人EMBOJ.12：811-820(1993)中所述，并且内源性小鼠重链基因已经纯合地破坏，如在WO 01/09187的实例1中所述。该小鼠品系携带如在费雪维尔德(Fishwild)等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)14，845-851(1996)中所述的人类κ轻链转基因KCo5。该小鼠品系还携带由染色体14片段hCF(SC20)构成的人类重链转染色体，如在WO 02/43478中所述。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以通过将HCo12、HCo17和HCo20与KCo5[J/K](Balb)杂交来产生，如在WO 09/097006中所述。
rTg4510小鼠是已知的τ蛋白病变模型，提供了突变体τ蛋白转基因表达上的时空控制。在KM小鼠品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经纯合地破坏，如在陈(Chen)等人EMBOJ.12，811-820(1993)中所述，并且内源性小鼠重链基因已经纯合地破坏，如在WO 01/09187的实例1中所述。该小鼠品系携带如在费雪维尔德(Fishwild)等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)14，845-851(1996)中所述的人类κ轻链转基因KCo5。该小鼠品系还携带由染色体14表位结合片段hCF(SC20)构成的人类重链转染色体，如在WO 02/43478中所述。
来自这些转基因小鼠的脾细胞可以用于根据熟知技术产生分泌人源化单克隆抗体的杂交瘤。本发明的人源化单克隆或多克隆抗体、源自其他物种的本发明的抗体还可以通过以下方式转基因地产生：产生对于感兴趣的免疫球蛋白重链和轻链序列而言是转基因的另一种非人类哺乳动物或植物，并且以从中可回收的形式产生抗体。结合哺乳动物中转基因生产，抗体可以从山羊、母牛或其他哺乳动物的乳中产生并且从其回收。参见例如US5,827,690；US 5,756,687；US 5,750,172和US 5,741,957。
本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择典型地将由所希望的效应子功能(如ADCC诱导)引导。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4。可以使用人类轻链恒定结构域的任一个，κ或λ。如果希望的话，本发明的抗τ蛋白抗体的类别可以通过已知的方法转换。例如，最初是IgM的本发明的抗体可以经类别转换变为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可以用于将一种IgG亚类转变为另一种，例如从IgGl变为IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型转换改变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE、或IgM抗体，以用于各种治疗用途。在一个实施例中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1、κ。如果相对于其他同种型而言，一种抗体的氨基酸序列与一种同种型最具有同源性，则认为该抗体具有这种特定同种型。
在一个实施例中，本发明的抗体是全长抗体，优选IgG抗体，特别是IgG1、κ抗体。在另一个实施例中，本发明的抗体是抗体表位结合片段或单链抗体。
抗体及其表位结合片段可以例如通过使用常规技术的表位结合片段化获得，并且以与在此对完整抗体所述的相同方式针对效用筛选表位结合片段。例如，F(ab')2表位结合片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体产生。可以处理所得F(ab')2表位结合片段以减少二硫键，以产生Fab'表位结合片段。Fab表位结合片段可以通过用木瓜蛋白酶处理IgG抗体获得；Fab'表位结合片段可以用胃蛋白酶消化IgG抗体获得。F(ab')表位结合片段还可以通过经由硫醚键或二硫键结合以下描述的Fab'来产生。Fab'表位结合片段是通过切割F(ab')2的铰链结构域的二硫键获得的抗体表位结合片段。Fab'-表位结合片段可以通过用还原剂如二硫苏糖醇处理F(ab')2表位结合片段获得。抗体表位结合片段还可以通过在重组细胞中表达编码此类表位结合片段的核酸产生(参见例如埃文斯(Evans)等人，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)184，123-38(1995))。例如，编码F(ab')2表位结合片段一部分的嵌合基因可以包括编码CH1结构域和H链的铰链结构域的DNA序列，随后为翻译终止密码子，以产生这样一种截短的抗体表位结合片段分子。
在一个实施例中，抗τ蛋白抗体是单价抗体，优选如在WO 2007059782中所述的具有铰链区缺失的单价抗体(将其通过引用以其全文结合在此)。因此，在一个实施例中，该抗体是单价抗体，其中所述抗τ蛋白抗体是通过一种方法构建，该方法包括：i)提供一种核酸构建体，该核酸构建体编码所述单价抗体的轻链，所述构建体包括对所选抗原特异性抗τ蛋白抗体的VL区进行编码的核苷酸序列以及对Ig的恒定CL区进行编码的核苷酸序列，其中所述对所选抗原特异性抗体的VL区进行编码的核苷酸序列以及所述对Ig的CL区进行编码的核苷酸序列可操作地连接在一起，并且其中，在IgG1亚型的情况下，编码CL区的核苷酸序列已经被修饰为使得该CL区不包含任何能够在多克隆人类IgG的存在下或当给予至动物或人类时与其他肽(包含CL区的相同氨基酸序列)形成二硫键或共价键的氨基酸；ii)提供一种核酸构建体，该核酸构建体编码所述单价抗体的重链，所述构建体包括对所选抗原特异性抗体的VH区进行编码的核苷酸序列以及对人类Ig的恒定CH区进行编码的核苷酸序列，其中这种对CH区进行编码的核苷酸序列已经被修饰为使得对应于铰链区的区域以及CH区的如Ig亚型所需要的其他区(例如CH3区)不包含任何参与在多克隆人类IgG的存在下或当给予至动物人类时与其他肽(包含人类Ig的CH区的相同氨基酸序列)形成二硫键或共价键或稳定非共价重链间键的氨基酸残基，其中所述对所选抗原特异性抗体的VH区进行编码的核苷酸序列以及所述对所述Ig的CH区进行编码的核苷酸序列可操作地连接在一起；iii)提供一种用于产生所述单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达具有(i)和(ii)的核酸构建体产生所述单价抗体。
类似地，在一个实施例中，本发明的抗τ蛋白抗体是单价抗体，其包含：
(i)如在此所述的本发明的抗体的可变结构域，或者所述结构域的表位结合部分，以及
(ii)免疫球蛋白的CH结构域或其包含CH2和CH3结构域的结构域，其中该CH结构域或其结构域已经被修饰为使得对应于铰链结构域的结构域以及CH结构域的其他结构域(如果免疫球蛋白不是IgG4亚型)(例如CH3结构域)不包含任何能够在多克隆人类IgG的存在下与相同CH结构域或者具有相同CH结构域的其他共价键或稳定非共价重链间键形成二硫键的氨基酸残基。
在另外的实施例中，本发明的单价抗体的重链已经被修饰为使得整个铰链区已缺失。
在另一个另外的实施例中，单价抗体的序列已经被修饰为使得它不包含任何用于N-连接的糖基化的受体位点。
本发明还包括“双特异性抗体”，其中抗τ蛋白结合区(例如抗τ蛋白单克隆抗体的τ蛋白-结合区)是靶向多于一个表位(例如第二表位可以包括主动转运受体的表位，使得双特异性抗体可以展现出改进的跨生物屏障例如血脑屏障的转胞吞作用)的二价或多价双特异性支架的部分。因此，在另一个另外的实施例中，抗τ蛋白抗体的单价Fab可以连接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv上，以产生双特异性抗体。双特异性抗体可以具有双重功能，例如由抗τ蛋白结合结构域赋予的治疗功能，以及可以结合至受体分子以增强跨生物屏障如血脑屏障的转移的运输功能。
本发明的抗体及其表位结合片段还包括单链抗体。单链抗体是其中重链和轻链Fv结构域连接的肽。在一个实施例中，本发明提供了单链Fv(scFv)，其中在本发明的抗τ蛋白抗体的Fv中的重链和轻链与柔性肽接头(典型地具有约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接在单一肽链中。产生此类抗体的方法描述于例如US 4,946,778中，普吕克通(Pluckthun)单克隆抗体药理学，第113卷，罗森堡(Rosenburg)和摩尔(Moore)编辑，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，纽约(New York)，第269-315页(1994)，博尔德(Bird)等人，科学(Science)242，423-426(1988)，休斯顿(Huston)等人，美国国家科学院院刊(PNAS USA)85，5879-5883(1988)以及麦卡菲蒂(McCafferty)等人，自然(Nature)348，552-554(1990)。如果仅使用单一VH和VL，该单链抗体可以是单价的，如果使用两个VH和VL则是双价的，或者如果使用多于两个VH和VL则是多价的。
在此描述的抗体及其表位结合片段可以通过包含任何适合数目的修饰氨基酸和/或与此类缀合取代基的关联来修饰。在该背景中的适合性通常是通过至少基本上保留与未衍生化的亲本抗τ蛋白抗体关联的τ蛋白选择性和/或τ蛋白特异性的能力来确定。该一个或多个修饰氨基酸的包含在以下方面可以是有利的，例如，增加多肽血清半衰期，降低多肽抗原性，或增加多肽贮存稳定性。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组产生的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞中表达过程中在N-X-S/T基序上的N-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性实例包括：糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化(geranyl-geranylated))的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸、以及类似氨基酸。足够指导本领域中的普通技术人员进行氨基酸修饰的参考在文献中相当充分。实例方案可见于沃克(Walker)(1998)关于CD-ROM的蛋白质方案(Protein Protocols on CD-ROM)胡玛纳出版社(Humana Press)，托托华(Totowa)，NJ。该经修饰的氨基酸可例如选自：糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、偶联到脂类部分上的氨基酸、或偶联到有机衍化剂上的氨基酸。
本发明的抗体及其表位结合片段还可以通过共价缀合到聚合物上进行化学修饰，以例如增加它们的循环半衰期。示例性聚合物和将其附接至肽的方法展示于例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546。另外的说明性聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，具有在约1,000与约40,000之间，例如在约2,000与约20,000之间，例如约3,000-12,000g/mol的分子量的PEG)。
本发明的抗体及其表位结合片段可以进一步用于诊断方法中或用作诊断成像配体。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种放射性标记的氨基酸的本发明的抗体及其表位结合片段。经放射性标记的抗τ蛋白抗体可以用于诊断和治疗目的两者(缀合至经放射性标记的分子是另一种可能的特征)。此类标记的非限制性实例包括但不限于：铋(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、铬(51Cr)、钴(57Co、60Co)、铜(64Cu)、镝(165Dy)、铒(169Er)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、金(198Au)、钬(166Ho)、氢(3H)、铟(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、125I、131I)、铱(192Ir)、铁(59Fe)、氪(81mKr)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、钯(103Pd)、磷(32P)、钾(42K)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、铷(81Rb、82Rb)、钌(82Ru、97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、钠(24Na)、锶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Tl)、锡(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb、177Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)以及锆(89Zr)。锆(89Zr)是特别感兴趣的。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法在本领域中是已知的(参见例如荣汉斯(Junghans)等人，癌症化学疗法和生物疗法(Cancer Chemotherapy and Biotherapy)655-686(第2版，查范纳和隆哥编(Chafner and Longo，eds.)，Lippincott Raven(1996))，以及US 4,681,581；US 4,735,210；US 5,101,827；US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471以及US 5,697,902。例如，放射性同位素可以通过氯胺T方法缀合(林德格伦(Lindegren)，S.等人(1998)“在使用N-琥珀酰亚胺-3-(三甲基甲锡烷基)苯甲酸酯作为中间体对抗体进行高特异活性放射性碘化中的氯胺-T”(“Chloramine-T In High-Specific-ActivityRadioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate”)，核酸医学生物学(Nucl.Med.Biol.)25(7)：659-665；库尔特(Kurth)，M.等人(1993)“放射性碘化的苯乙胺衍生物与单克隆抗体的位点特异性缀合导致肿瘤中增加的放射活性定位”(“Site-Specific Conjugation Of A RadioiodinatedPhenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In IncreasedRadioactivity Localization In Tumor”)，医学化学杂志(J.Med.Chem.)36(9)：1255-1261；雷亚(Rea)，D.W.等人(1990)“用于靶向肿瘤的位点特异性放射性碘化的抗体”(“Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors”)，癌症研究(Cancer Res.)50(3增刊)：857s-861s)。
本发明还提供了抗τ蛋白抗体及其表位结合片段，使用以下项将它们可检测地进行标记：荧光标记(例如稀土螯合物(例如铕螯合物))、荧光素型标记(例如荧光素、异硫氰酸荧光素、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素)、罗丹明型标记(例如亚历克萨568(英杰公司)、或丹磺酰氯)、VIVOTAG 680Xl荧光色素TM(珀金埃尔默)、藻红蛋白；伞形酮、丽丝胺(Lissamine)；花菁；藻红蛋白、德克萨斯红、BODIPY(英杰公司(Invitrogen))或其类似物，所有这些都适合用于光学检测。可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、萤光素、以及水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶联至可检测物质或辅基复合物来完成，这些可检测物质包括但不限于：各种酶、包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶的酶，这些辅基复合物例如但不限于链霉亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。
可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、萤光素、以及水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶联至可检测物质或辅基复合物来完成，这些可检测物质包括但不限于：各种酶、包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶的酶，这些辅基复合物例如但不限于链霉亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。还可以采用顺磁性标记，并且优选使用正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射型计算机断层摄影(SPECT)来检测。此类顺磁性标记包括但不限于包含以下项的顺磁离子的化合物：铝(Al)、钡(Ba)、钙(Ca)、铈(Ce)、镝(Dy)、铒(Er)、铕(Eu)、钆(Gd)、钬(Ho)、铱(Ir)、锂(Li)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(M)、钕(Nd)、锇(Os)、氧(O)、钯(Pd)、铂(Pt)、铑(Rh)、钌(Ru)、钐(Sm)、钠(Na)、锶(Sr)、铽(Tb)、铥(Tm)、锡(Sn)、钛(Ti)、钨(W)、以及锆(Zi)，并且特别是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+3、和V+4，正电子发射金属(使用各种正电子发射断层摄影)，以及非放射性顺磁金属离子。
因此，在一个实施例中，本发明的抗τ蛋白抗体或其τ蛋白-结合片段可以用荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记来标记。标记的抗体或片段可以用于检测或测量所述τ蛋白在受试者脑中的存在。这种方法可以包括检测或测量结合到所述τ蛋白上的抗τ蛋白抗体或τ蛋白结合片段的体内成像，并且可以包括对结合到这种τ蛋白上的所述抗τ蛋白抗体或τ蛋白结合片段的离体成像。
在一个另外的方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其τ蛋白结合片段的一种或多种多肽链的表达载体。此类表达载体可以用于重组产生本发明的抗体或其表位结合片段。
在本发明的背景中的表达载体可以是任何适合的DNA或RNA载体，包括染色体、非染色体、以及合成的核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施例中，编码抗τ蛋白抗体的核酸被包含在包含例如线性表达元件的裸DNA或RNA载体(如例如赛克斯(Sykes)和约翰斯顿(Johnston)，自然生物技术(Nat Biotech)12，355-59(1997)中所述)，紧凑型核酸载体(如例如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述)，质粒载体如pBR322、pUC 19/18、或pUC 118/119，“侏儒(midge)”最小大小的核酸载体(如例如沙科夫斯基(Schakowski)等人，分子治疗学(MoI Ther)3，793-800(2001)中所述)中，或作为沉淀核酸载体构建体，如CaPO4-沉淀构建体(如例如WO 00/46147，本维尼斯特(Benvenisty)和雷瑟夫(Reshef)，PNAS USA 83，9551-55(1986)，魏格勒(Wigler)等人，细胞(Cell)14，725(1978)，以及科拉罗(Coraro)和皮尔森(Pearson)，体细胞遗传学(Somatic Cell Genetics)2，603(1981)中所述)。这种核酸载体及其使用在本领域中是熟知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施例中，该载体适合用于在细菌细胞中表达本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段。此类载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(范黑克(Van Heeke)&舒斯特(Schuster)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)264，5503-5509(1989)，pET载体(诺沃根(Novagen)，麦迪逊(Madison)，WI)。
表达载体还可以是或可替代地是适合用于在酵母系统中表达的载体。可使用任何适用于在酵母系统中进行表达的载体。适合的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体(综述于：F.奥苏贝尔(Ausubel)等人编，分子生物学中的当前工具(Current Protocols in Molecular Biology)，格林出版和威利跨学科(Greene Publishing and Wiley InterScience)纽约(New York)(1987)，格朗(Grant)等人，酶学方法(Methods in Enzymol)153，516-544(1987)，马塔诺维赫(Mattanovich)，D.等人，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)824，329-358(2012)，切利克(Celik)，E.等人，生物技术进展(Biotechnol.Adv.)30(5)，1108-1118(2012)，李(Li)，P.等人，应用生物化学与生物技术(Appl.Biochem.Biotechnol.)142(2)，105-124(2007)，布尔E.等人，应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)77(3)，513-523(2007)，范德法特(van der Vaart)，J.M.分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)178，359-366(2002)，以及霍利格(Holliger)，P.分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)178，349-357(2002))。
在本发明的表达载体中，编码抗τ蛋白抗体的核酸可以包括任何适合的启动子、增强子、以及其他表达辅助元件或与其相关联。此类元件的实例包括强表达启动子(例如，人类CMV IE启动子/增强子连同RSV、SV40、SL3-3、MMTV、以及HIV LTR启动子)，有效聚(A)终止序列，用于大肠杆菌中的质粒产物的复制起点，作为选择性标记的抗生素抗性基因，和/或便利的克隆位点(例如，多聚接头)。核酸还可以包括与组成型启动子如CMV IE相反的诱导型启动子(本领域的技术人员将认识到此类术语实际上是在某些条件下基因表达程度的描述语)。
在一个甚至另外的方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞，如转染瘤，其产生如在此定义的本发明的抗体或其表位结合片段或者如在此定义的本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌、和哺乳动物细胞，例如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施例中，本发明提供了一种细胞，该细胞包含稳定地整合到细胞基因组中的核酸，该核酸包含编码用于表达本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种细胞，该细胞包含一种非整合的核酸，如质粒、粘粒、噬菌粒、或线性表达元件，该非整合的核酸包含编码用于表达本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的序列。
在一个另外的方面，本发明涉及一种用于产生抗τ蛋白抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)培养杂交瘤或如以上定义的本发明的宿主细胞，并且b)从培养基纯化本发明的抗体。
在一个实施例中，本发明涉及一种制品，在这种术语在此使用时，该制品包含如在此定义的抗τ蛋白抗体，并且基本上不含天然产生的不能结合至τ蛋白或者不实质性地改变该制品的抗τ蛋白功能的抗体。因此，这种制品不包含天然产生的血清、或这种血清的纯化衍生物，该血清或其纯化衍生物包含抗τ蛋白抗体与另一种不改变该制品的抗τ蛋白抗体的功能的抗体的混合物，其中这种功能是：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述与经免疫耗减的来自转基因小鼠的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％，或者当如在此所述与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，特异性地将S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带减少至少90％，同时没有将非过度磷酸化τ蛋白条带减少多于10％。
本发明具体涉及这样一种抗τ蛋白抗体的制品，该抗体在氨基酸序列方面(在其CDR、可变结构域、框架残基和/或恒定结构域中的任一个中)相对于天然存在的抗τ蛋白抗体的结构而言具有结构变化，其中相对于由所述天然存在的抗τ蛋白抗体展现出的功能而言，所述结构变化引起抗τ蛋白抗体展现出显著改变的功能(即在功能方面多于20％的差异，多于40％的差异，多于60％的差异，多于80％的差异，多于100％的差异，多于150％的差异，多于2-倍的差异，多于4-倍的差异，多于5-倍的差异，或多于10-倍的差异)；其中这种功能是：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％；或者当如在此所描述的与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，其特异性地以至少90％减少S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带、同时以不多于10％减少非过度磷酸化τ蛋白条带的能力。
术语“基本不含”天然产生的抗体是指在此类制品中完全不存在此类天然产生的抗体，或者在此类制品中包含不会实质性影响这些制品的τ蛋白结合特性的一个浓度的此类天然产生的抗体。如果抗体不具有天然产生的对应物或已经从天然伴随该抗体的组分中分离或纯化，则认为该抗体是“分离的”。
术语“天然产生的抗体”，在它涉及此类制品时，是指在活人或其他动物内引发的抗体(包括天然产生的自身抗体)，作为对活人或其他动物的免疫系统发挥作用的自然结果。
因此，本发明的制品不排除并且事实上明确涵盖此类包含抗τ蛋白抗体和有意添加的能够结合至未由τ蛋白拥有的表位上的另外抗体的制品。此类制品特别包括其实施例，其中该制品在治疗阿尔茨海默病(AD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、和皮质基底节变性(CBD)中展现出增强的功效。此外，本发明是针对包含抗τ蛋白抗体抗体、或其表位结合片段的制品，旨在用于治疗精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。此外，本发明的制品包含抗τ蛋白抗体或其表位结合片段，其可以用于治疗中风、中风恢复、与帕金森病相关的神经变性。
在一个甚至另外的方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包括：
(i)均在此定义的τ蛋白抗体、或其表位结合片段，或包含这种抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的制品(在这种术语在此定义时)；以及
(ii)药学上可接受的载体。
这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的技术：雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第22版，Gennaro(热纳罗)编，Mack Publishing Co.(马克出版公司)，伊斯顿，宾夕法尼亚，2013。
药学上可接受的载体或稀释剂连同任何其他已知的佐剂和赋形剂应该适合用于本发明的所选化合物和所选给药模式。对于载体和药物组合物的其他组分的适合性是基于对本发明的所选化合物或药物组合物的关于表位结合的期望生物学特性缺乏显著负面影响(例如少于实质性影响(10％或更低的相对抑制，5％或更低的相对抑制，等))而确定的。
本发明的药物组合物还可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂(如吐温-20或吐温-80)、稳定剂(例如，无糖或无蛋白氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或其他适合用于包含于药物组合物中的材料。以不影响组合物的生物活性为目的来选择稀释剂。此类稀释剂的实例为蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液(Hank’s solution)。此外，该药物组合物或制剂还可以包括其他载体，或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。这些组合物还可以包括大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖(例如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸以及共聚物(例如，乳胶官能化琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、以及类似物))、聚氨基酸、氨基酸共聚物、以及脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于具体的患者、组合物和给药模式而言能有效实现期望治疗反应的活性成分量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明具体组合物或其酰胺的活性，给药路径，给药时间，所采用具体化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与所采用的具体组合物组合应用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史，以及医学领域公知的类似因素。
该药物组合物可以通过任何适合途径和模式给予，包括：用于预防性和/或治疗性治疗的肠胃外、局部、口服或鼻内手段。在一个实施例中，本发明的药物组合物是肠胃外给予。如在此使用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外给予”意指除了肠道和局部给药之外的给药模式，通常通过注射进行，并且包括：表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊髓内、颅内、胸内、硬膜外和胸骨内(intrasternal)注射和输注。
在体内和体外给予本发明的化合物的另外的适合途径是本领域中熟知的，并且可以由本领域普通技术人员选择。
在一个实施例中，该药物组合物是通过静脉内或皮下注射或输注来给予。
药学上可接受的载体包括任何和全部适合的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂以及吸收延迟剂等与本发明的化合物生理上相容的载体。
可以用于本发明的药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及类似物)、以及其适合的混合物、植物油(如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、以及芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)和/或各种缓冲剂。在药物领域中其他载体是熟知的。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉剂，其用于临时制备无菌注射液或分散体。使用此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域中已知的。除了与活性化合物不相容的任一常规介质或试剂之外，预期其用于本发明的药物组合物。
可例如通过使用包衣材料如卵磷脂，通过维持所需的颗粒大小(在分散剂的情况下)和通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可以包括药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可以包括在这些组合物中的等渗性试剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以包含适合用于所选给药途径的一种或多种佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可以增强该药物组合物的保质期或有效性。本发明的化合物可用保护该化合物免于快速释放的载体制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊化递送系统。此类载体可以包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，可生物降解的生物相容性聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸(单独地或与蜡一起)，或者本领域中熟知的其他材料。制备此类制剂的方法是本领域技术人员通常已知的。参见例如缓释和控释药物递送系统(Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems)，(罗宾逊(J.R.Robinson)编，马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，纽约(New York)，1978)。
在一个实施例中，本发明的这些化合物可以配制为确保适当的体内分布。用于肠胃外给药的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉剂，其用于临时制备无菌注射液或分散体。使用此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域中已知的。除了与活性化合物不相容的任一常规介质或试剂之外，预期其用于本发明的药物组合物。补充性活性化合物也可以掺入这些组合物中。
用于注射的药物组合物通常必须是在生产和保存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他规则结构。该载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及类似物)、以及其适合的混合物、植物油(如橄榄油)、以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。恰当的流动性可例如通过使用包衣如卵磷脂来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟抗体吸收的试剂，如单硬脂酸盐和明胶来实现。无菌可注射溶液可通过按需要将处于适当溶剂中的所需量的活性化合物与例如如上文列举的成分中的一种或组合掺在一起、随后微滤除菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌运载体中来制备分散体，该无菌运载体包含基础分散介质以及例如来自以上列举的那些的所需的其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些方法由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加任何另外所希望的成分的粉末。
通过将活性化合物以所需的量在合适的溶剂中与上面列举的成分之一或者组合掺和，如果需要，随后进行无菌微量过滤来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌运载体中来制备分散体，该无菌运载体包含基础分散介质以及来自以上列举的那些的所需的其他成分。在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这些方法由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加任何另外所希望的成分的粉末。
在此处所述的治疗和使用的上述方法中的剂量方案被调整为提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单一推注剂，可以随时间给予若干个分剂量或可以由治疗情况的紧迫性指示来按比例的减少或增加剂量。肠胃外组合物可以被配制成单位剂型，以易于给药和剂量的均一性。如在此使用的单位剂型是指适合作为针对待治疗受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生与所需药用载体相关的所需治疗效应的活性化合物的预先确定的量。针对本发明的单位剂型的说明受指示于并直接依赖于：(a)活性化合物的独特特性和将要达到的特定疗效，和(b)在复合这样的活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的领域中固有的限制。
针对本发明的抗体或其表位结合片段的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可以由本领域的普通技术人员确定。在给予一个剂量的任何给定日，该剂量的范围可以是从约0.0001至约100mg/kg、并且更通常是从约0.01至约5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg体重范围内。因此示例性剂量包括：从约0.1至约10mg/kg/体重、从约0.1至约5mg/kg/体重、从约0.1至约2mg/kg/体重、从约0.1至约1mg/kg/体重，例如约0.15mg/kg/体重、约0.2mg/kg/体重、约0.5mg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约1.5mg/kg/体重、约2mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、或约10mg/kg/体重。
具有本领域普通技术的医师可以容易地决定且开出所需药物组合物的有效量。例如，该医师可以按低于用以实现所希望的治疗效果所需的水平，起始用于药物组合物中的本发明的抗体或其表位结合片段的剂量，并且逐渐增加剂量直到实现所希望的效果。一般而言，本发明组合物的适合的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。给予可以是例如静脉内、肌内、腹膜内、或皮下。如果期望，药物组合物的有效日剂量可以在一整天以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量来给药，任选以单位剂型来给予。虽然可以单独给予本发明的化合物，但优选的是以如上所述的药物组合物的形式给予本发明化合物。
标记的本发明的抗体或其表位结合片段可以用于诊断目的以检测、诊断、或监测疾病或障碍。本发明提供用于对神经退行性或认知疾病或障碍的检测或诊断，所述疾病或障碍包括但不限于阿尔茨海默病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD)，该检测或诊断包括：(a)使用特异性地结合至τ蛋白的一种或多种抗体，测定焦谷氨酸化的Aβ片段在受试者细胞或组织样品中的存在；并且(b)将该抗原的水平与对照水平(例如，在正常组织样品中的水平)进行比较，借此相比于抗原的对照水平而言该抗原的测定水平的增加指示该疾病或障碍或者指示该疾病或障碍的严重性。
本发明的抗体或其表位结合片段可以用于使用在本领域中熟知的免疫组织化学方法测定生物样品中的τ蛋白或τ蛋白片段。可用于检测蛋白的基于其他抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)，以及基于中尺度发现平台(mesoscale discovery platform)的测定(MSD)。适合的抗体标记可以用于此类试剂盒和方法中，并且本领域中已知的标记包括酶标记，如碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素标记，例如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)、以及锝(99mTc)；和发光标记，例如鲁米诺和荧光素酶；和荧光标记，例如荧光素和罗丹明。
可以在体内检测经标记的抗τ蛋白抗体或其τ蛋白结合片段的存在，以用于诊断目的。在一个实施例中，诊断包括：a)向受试者给予有效量的这种经标记分子；b)在给予之后等待一个时间间隔，以允许经标记的分子在Aβ沉积位点(如果有的话)浓缩，并且以允许未结合的经标记的分子被清除至背景水平；c)确定背景水平；并且d)检测受试者中经标记的分子，使得对超过背景水平的经标记的分子的检测指示受试者患有该疾病或障碍，或者指示该疾病或障碍的严重性。根据这样的实施例，该分子用成像部分标记，以用于使用本领域的普通技术人员已知的具体成像系统检测。背景水平可以通过本领域中已知的不同方法来确定，包括将检测到的标记抗体的量与先前确定的针对具体成像系统的标准值进行比较。可用于本发明的诊断方法中的方法以及系统包括但不限于计算机断层摄影(CT)、全身扫描诸如正电子发射体层摄影(PET)、磁共振成像(MRI)、以及超声检查。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在治疗中使用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在τ蛋白病变的治疗、诊断或成像中使用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在治疗阿尔茨海默病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD)中使用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在制造一种用于对τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的药剂中使用。
优选地，该药剂是用于治疗阿尔茨海默病(AD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD)，最优选阿尔茨海默病(AD)。该药物还优选用于治疗精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
在一个另外的方面，本发明提供了一种在受试者中对阿尔茨海默病或其他τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的如在此定义的药剂单克隆抗体或其表位结合片段。
在一个优选实施例中，该治疗是慢性的，优选持续至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。
在一个另外的方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括如在此定义的用于在治疗中使用的抗体或其片段。
实施例
1.一种单克隆抗体或其表位结合片段，能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白的磷酸化残基396，例如SEQ ID NO:33的磷酸化残基396。
2.根据实施例1所述的抗体，由完整抗体组成。
3.根据实施例1或2所述的抗体或其表位结合片段，包括选自下组的表位结合片段或由其组成，该组由以下各项组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫键键合的Fv)；Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段)；迷你体(mini-body)(Fv)2-CH3结构域，以及结构域抗体(例如，单一VH可变结构域或VL可变结构域)。
4.根据任何前述实施例所述的抗体或其表位结合片段，其中该抗体选自下组，该组由以下抗体组成：亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其是人类的或人源化的。
6.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该抗体或其表位结合片段展现以下特性中的一种或多种
(a)针对人类病理性τ蛋白的选择性和特异性；
(b)对于p-τ386-408(pS396/pS404)(SEQ ID NO:33)的结合亲和力(KD)在0.5-10nM之间，例如1-5nM或1-2nM
7.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中所述抗体基本上不结合τ蛋白(SEQ ID NO:33)上的磷酸化404残基。
8.一种单克隆抗体或其表位结合片段，包含：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
9.根据实施例8所述的单克隆抗体，包含SEQ ID NO:8的重链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；和/或SEQ ID NO:7的轻链可变结构域，具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异。
10.一种单克隆抗体或其表位结合片段，包含：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
11.根据实施例10所述的单克隆抗体，包含SEQ ID NO:16的重链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；和或SEQ ID NO:15的轻链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
12.一种单克隆抗体，其中该表位结合片段包含：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
13.根据实施例12所述的单克隆抗体，包含SEQ ID NO:24的重链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；和或SEQ ID NO:23的轻链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
14.一种单克隆抗体或其表位结合片段，包含：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列或有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
15.根据实施例14所述的单克隆抗体，包含SEQ ID NO:32的重链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列；和或SEQ ID NO:31的轻链可变结构域或者具有不多于4个氨基酸差异、或不多于3个氨基酸差异、或不多于2个氨基酸差异、或不多于1个氨基酸差异的氨基酸序列。
16.根据实施例1至7中的一项所述的抗体或其表位结合片段，其中所述抗体或其片段与在实施例8-15中定义的抗体或其表位结合片段相竞争以结合至人类τ蛋白。
17.根据任何前述实施例所述的抗体或其表位结合片段，包含Fc结构域。
18.根据任何前述实施例所述的抗体或其表位结合片段，进一步包括增加体内半衰期的部分。
19.根据实施例18所述的抗体或其表位结合片段，其中用于增加体内半衰期的该部分选自下组，该组由以下各项组成：聚乙二醇(PEG)、人类血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。
20.根据任何前述实施例所述的抗体或其表位结合片段，其中该抗体进一步包含可检测部分。
21.根据实施例20所述的抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分选自下组，该组由以下各项组成：荧光标记；化学发光标记；顺磁性标记；放射性同位素标记；或酶标记。
22.根据实施例20或21所述的抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分包括放射性同位素或由其组成。
23.根据实施例22所述的抗体或其表位结合片段，其中该放射性同位素选自下组，该组由以下各项组成：99mTc、111In、67Ga、68Ga、72As、89Zr、123I和201Tl。
24.根据实施例21所述的抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分包括顺磁性同位素或由其组成。
25.根据实施例24所述的抗体或其表位结合片段，其中该顺磁性同位素选自下组，该组由以下各项组成：157Gd、55Mn、162Dy、52Cr和56Fe。
26.根据实施例20至25中任一项所述的抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分是通过成像技术可检测的，该成像技术是例如SPECT、PET、MRI、光学或超声成像。
27.根据实施例20至26中任一项所述的抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分经由连接部分间接地连接到该抗体或其表位结合片段上。
28.根据实施例27所述的抗体或其表位结合片段，其中该连接部分选自下组，该组由以下各项组成：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10,四乙酸(DOTA)的衍生物，去铁胺(DFO)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物，S-2-(4-异硫氰基苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)的衍生物，以及1,4,8,11-四氮杂环十二烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)的衍生物。
29.单克隆抗体或其表位结合片段，其中该重链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、和SEQ ID NO:35，并且该轻链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、和SEQ IDNO:36。
30.一种单克隆抗体或其表位结合片段，包含
(a)重链CDR1，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:20、和SEQ ID NO:28；
(b)重链CDR2，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:29；以及
(c)重链CDR3，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:30；以及
(d)轻链CDR3，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:19、和SEQ ID NO:27。
31.根据实施例1至7中任一项所述的本发明的抗体、或其表位结合片段，包含
a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3；以及
(d)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3。
32.一种分离的核酸分子，该核酸分子编码如在实施例1至31中任一项所定义的抗体或其表位结合片段。
33.根据实施例32所述的核酸分子，其中该分子是cDNA分子。
34.一种载体，包含如在实施例32或33中所定义的核酸分子。
35.一种重组宿主细胞，包含如在实施例32至34中任一项所定义的核酸分子。
36.一种用于产生如在实施例1至31中任一项所定义的抗体或表位结合片段的方法，该方法包括在允许表达该编码的抗体或其表位结合片段的条件下培养如在实施例35中所定义的宿主细胞。
37.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其表位结合片段的制品，其中所述制品基本上不含天然产生的抗体，这些天然产生的抗体不能结合至τ蛋白或不实质性地改变该制品的抗-τ蛋白功能，其中所述功能选自下组，该组由以下各项组成：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％％；或者当如在此所描述的与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，其特异性地以至少90％减少S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带、同时以不多于10％减少非过度磷酸化τ蛋白条带的能力。
38.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其表位结合片段的制品，其中相对于天然存在的抗τ蛋白抗体的结构，所述抗体或所述其表位结合片段在其氨基酸序列方面具有结构改变，其中所述结构改变导致所述抗体或所述片段展现出相对于由所述天然存在的抗τ蛋白抗体展现出的功能而言改变的功能，其中所述功能选自下组，该组由以下各项组成：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％；或者当如在此所描述的与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，其特异性地以至少90％减少S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带、同时以不多于10％减少非过度磷酸化τ蛋白条带的能力。
39.一种药物组合物，包含如在实施例1至31中任一项所定义的单克隆抗体或其表位结合片段，或者如在实施例37-38中任一项所定义的制品；以及药学上可接受的载体。
40.如在实施例1-31中任一项所述的单克隆抗体或其片段，如在实施例37-38中任一项所述的制品，或者如实施例39所述的药物组合物，用于在医学中使用。41.如在实施例1-31中任一项所述的单克隆抗体或其片段，如在实施例37-38中任一项所述的制品，或者如实施例39所述的药物组合物，用于在治疗τ蛋白病变中使用。
42.根据实施例41所述的单克隆抗体或其片段、制品或药物组合物，其中该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；进行性核上性麻痹(PSP)；皮质基底节变性(CBD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有路易体痴呆的患者的精神病症状。
43.如在实施例1-31中任一项所述的单克隆抗体或其片段、如在实施例37-38中任一项所述的制品、或者如实施例39所述的药物组合物的在制造用于治疗τ蛋白病变的药剂中的用途。
44.根据实施例43所述的单克隆抗体或其片段、制品或药物组合物的用途，其中该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD、因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病、以及患有路易体痴呆的患者的精神病症状。
45.一种在受试者中对阿尔茨海默病或其他τ蛋白病变进行治疗的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的根据实施例1-31中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、根据实施例37-38中任一项所述的制品、或如实施例39所述的药物组合物。
46.根据实施例45所述的方法，其中该治疗是慢性的。
47.根据实施例46所述的方法，其中该慢性治疗是持续至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。
48.根据实施例45至47中任一项所述的方法，其中该受试者是人类。
49.一种试剂盒，该试剂盒包括用于在医学中使用的如在实施例1-31中任一项所述的单克隆抗体或其片段、如在实施例37-38中任一项所述的制品、或者如实施例39所述的药物组合物。
50.如在实施例1-31中任一项所述的单克隆抗体或其片段，如在实施例37-38中任一项所述的制品，或者如实施例39所述的药物组合物，用于在检测或测量所述τ蛋白在受试者脑中的存在或量中使用。
51.如实施例50所述的单克隆抗体或其片段、制品或药物组合物，其中所述检测或测量包括对结合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体进行体内成像。
52.如实施例50所述的单克隆抗体或其片段、制品或药物组合物，其中所述检测或测量包括对结合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体或所述其片段进行离体成像。
53.一种单克隆抗体或其表位结合片段，其在残基404处磷酸化而在残基396处非磷酸化的人类τ蛋白的存在下能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396。
54.一种单克隆抗体或其表位结合片段，根据以下测试准则该单克隆抗体或其表位结合片段展现出免疫特异性地结合至包含磷酸化残基396的人类τ蛋白：i)该抗体基本上不结合至非磷酸化τ蛋白；ii)该抗体基本上不结合至当396非磷酸化时在404处磷酸化的τ蛋白；iii)该抗体结合至在396处磷酸化的τ蛋白；以及iv)该抗体结合至当396和404两者均磷酸化时的τ蛋白。
55.一种针对双磷酸化肽产生的单克隆抗体或其表位结合片段，该双磷酸化肽为覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)，该单克隆抗体或其表位结合片段能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396。
56.根据实施例55所述的单克隆抗体，其中将杂交瘤用人类病理性τ蛋白和非病理性τ蛋白来进行筛选以分离以下克隆，这些克隆i)免疫特异性地针对磷酸化表位S396的任一个并且ii)特异性地识别来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分。
57.一种将过度磷酸化τ蛋白从缠结中去除的方法，所述缠结包含过度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使过度磷酸化τ蛋白与抗体接触从而导致该缠结耗减90％的过度磷酸化τ蛋白，所述抗体对于具有磷酸化残基396的τ蛋白具有选择性。
58.一种延迟患者中的阿尔茨海默病的进展的方法，所述方法包括减少或衰减所述患者中的病理性τ蛋白的积累，所述方法包括给予去除具有磷酸化396残基的τ蛋白的抗体。
59.一种延迟患者中的阿尔茨海默病的进展的方法，所述方法包括去除这些接种用于病理性τ蛋白的τ蛋白，其中具有磷酸化396残基的τ蛋白被去除。
60.一种治疗患有阿尔茨海默病的患者的方法，该方法包括通过使过度磷酸化τ蛋白与一种对具有磷酸化残基396的τ蛋白具有选择性的抗体进行接触而从缠结去除过度磷酸化τ蛋白，所述缠结包括过度磷酸化τ蛋白和正常τ蛋白。
61.根据实施例57至59中任一项所述的方法，该方法包括使用如在实施例1至31、40至42或50至56中任一项所定义的抗体。
62.一种分离的单克隆抗体或其分离的表位结合片段，能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396。
63.一种重组人类或重组人源化单克隆抗体或其分离的表位结合片段，能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396。
64.一种重组单克隆抗体或其表位结合片段，是针对双磷酸化肽产生的，该双磷酸化肽为覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)，其中所述重组单克隆抗体或其表位结合片段能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQID NO:33)的磷酸化残基396。
65.一种药物组合物，该药物组合物包括分离的单克隆抗体或其分离的表位结合片段，其中所述分离的单克隆抗体或其分离的表位结合片段是如在以上实施例中的任一项中定义的。
66.一种嵌合单克隆抗体或其分离的表位结合片段，能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396。
67.如实施例1-31和51-56中任一项定义的抗体或其抗原结合片段，其已经在细胞系中产生或制造，该细胞系例如是人类细胞系、哺乳动物非人类细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系。
68.根据实施例67所述的抗体或其抗原结合片段，产生于CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11的细胞系、CAP细胞系和HuH-7人类细胞系中。
实例
实例1：用磷酸化肽396/404免疫小鼠
将C56/BL6和FVB小鼠用在TiterMax佐剂中配制的10μg缀合P30的磷酸化τ386-408(pS396/pS404)(SEQ ID NO:37)免疫。
小鼠(C56/BL6和FVB品系，雌性和雄性。将2-3月龄小鼠用缀合肽表位P30的磷酸化τ386-408进行免疫。
遵循TiterMax/供应商方案，将缀合免疫原性P30的磷酸化τ386-408(pS396/pS404)肽配制于TiterMax(400μg/ml肽，以1:1vol:vol混合)中，并且将小鼠皮下注射20μg抗原肽(100μl)。对于对照小鼠仅注射佐剂。将所有用肽免疫的小鼠用0.5μg肽/Titermax(10μg/ml肽，如上所述配制并且注射)以月间隔进行强化。最后在将脾细胞与SP-2细胞融合前3天，在不用Titermax的情况下，将小鼠用缀合P30的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)进行强化。在展现与ELISA板的阳性结合后(所述ELISA板已经用1μg/ml磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被)，并且展现出与来自AD和TG4510脑裂解物的S1和P3抗原的优先结合活性之后，选择杂交瘤用于再克隆循环(下文描述于实例3中)。使用斑点印迹和脑裂解物包被的ELISA或MSD板，将这种结合与此类抗体结合到来自对照的脑裂解物的活性进行比较。
实例2：杂交瘤产生
在将脾细胞与SP-2细胞融合前3天，在不用Titermax的情况下，将小鼠用缀合P30的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)进行强化。在用1μg/ml磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被的ELISA板中阳性结合、并且使用斑点印迹和脑裂解物包被的ELISA或MSD板相比于来自对照的脑裂解物与来自AD和TG4510脑裂解物的S1和P3抗原的优先结合活性之后，选择杂交瘤用于再克隆循环。
实例3特异性抗体的蛋白质印迹和斑点印迹分析
τ蛋白生物化学分级
将来自过表达人类τ蛋白突变P301L的人类或rTg4510小鼠的脑组织匀浆化于10个体积的如下包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的Tris-缓冲盐水中：50mM Tris/HCl(pH7.4)；274mM NaCl；5mM KCl；1％蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche))；1％磷酸酶抑制剂混合物I&III(西格玛公司)；和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF；西格玛公司)。将匀浆物在27,000x g下4℃离心20min，以获得上清液(S1)和沉淀部分。将沉淀重新匀浆化于5个体积的高盐/蔗糖缓冲液(0.8M NaCl、10％蔗糖、10mM Tris/HCl[pH 7.4]、1mM EGTA、1mM PMSF)中，并且如上离心。将上清液收集并且与肌氨酰(1％最终浓度；西格玛)在37℃一起孵育一小时，随后在150,000x g下4℃离心一小时，以获得肌氨酰不可溶的沉淀，称为P3部分。将P3沉淀重悬浮于TE缓冲液(10mM Tris/HCl[pH 8.0]、1mM EDTA)中到一个体积，该体积相当于对于脑匀浆所使用的原始体积的一半。
蛋白质印迹和斑点印迹
将分级的组织提取物S1和P3溶解于含有0.1M DTT的SDS-样品缓冲液中。将经热处理的样品(95℃持续10min)通过在4％-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司)上的凝胶电泳进行分离，并且转移到PVDF膜(伯乐实验室(BioRad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)上。将斑点印迹样品以跨样品已知的浓度直接点样到硝酸纤维素膜(阿默舍姆(Amersham)，匹兹堡，宾夕法尼亚州)上。将蛋白质印迹和斑点印迹膜在TBS-吐温(0.5％)pH 7.4中的5％脱脂奶粉中封闭，随后在1μg/ml D1.2或C10-2中于4℃孵育过夜。将膜进行洗涤，并且与缀合过氧化物酶的抗小鼠IgG一起孵育(1:5000；杰克逊免疫研究(Jackson ImmunoResearch)，西格罗夫(West Grove)，宾夕法尼亚州)中。使用增强的化学发光系统(ECL PLUS试剂盒；珀金埃尔默(PerkinElmer))检测结合的抗体。使用连接计算机的LAS-4000生物成像分析仪系统(富士胶片(Fujifilm)，东京，日本)和Multi Gauge v3.1软件(富士胶片)进行蛋白质印迹和斑点印迹免疫反应性的定量和视觉分析。将蛋白加载通过原始部分的体积进行调节，并且可以转化为原始的组织湿重。结果示于图1和图2中。
实例4使用固定的人类病理性材料筛选和选择396/404抗体
针对在能肯(nunc)板中的抗体结合来筛选杂交瘤上清液，使用0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9)将所述板用1μg/ml肽磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)进行了包被。
随后将阳性上清液以1:50-1:800稀释于PBS、0.1％BSA和0.1NP40中，以便在分别用来自AD和健康对照(HC)的脑(P3沉淀，参见实例3)裂解物抗原包被的ELISA或MSD板中结合。将脑裂解物抗原在0.1M碳酸盐缓冲液(pH 9)中稀释1500倍，之后进行ELISA或MSD板的孵育/包被。将孔随后在室温下封闭2小时(PBS、3mg/ml BSA、0.1％NP-40)，并且遵循供应商方案，用HRP(DAKO)和缀合硫标记(MSD，产品#)的抗小鼠IgG检测抗体结合活性。稀释于具有0.1％BSA的PBS中的抗体的选择(D1-2、C5-2、C8-3和C10-2)表征为剂量反应，并且示出的与AD-P3抗原包被的板的亚纳摩尔-纳摩尔结合活性被另外针对特异性肽和对照肽的选择的结合活性来表征。结果在图3中示出。
实例5：肽特异性以及结合亲和力
对于与病理性τ蛋白的结合呈阳性的抗体被进一步针对对于一系列磷酸化肽(p)表位的表观亲和力(IC50)和选择性/特异性来表征。将MSD板用100ng/ml磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被，如上所述。在剂量反应测定中分析针对磷酸化τ蛋白的抗体，以鉴定提供适当分析信号水平(典型地在MSD中为5,000-20,000RU，相应于最大仪器信号的0.5％-2％，或在ELISA中450nm下1.0-1.5的OD信号)的抗体浓度。将抗体的选择与梯度浓度(0-1000nM)的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/404)一起在室温孵育2小时。将反应物随后施加至肽包被的MSD板上，如上所述的将该MSD板用100ng/ml肽磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)包被，并且测量结合活性。来自抑制测定的IC50值对应于10-100nM之间的表观亲和力(KD)。
特异性和磷酸化选择性：将适当浓度的单克隆抗体与100nM双磷酸化的(pS396/pS404)、非磷酸化或单磷酸化(pS396或pS404)的磷酸化τ蛋白386-408一起孵育，并且分析结合活性(抑制测定)。将对照磷酸化τ肽(磷酸化τ蛋白260-270(pS262)或磷酸化τ蛋白240-270(pS262))和重组非磷酸化τ蛋白进行分析以用于比较。所有AD-P3抗原阳性抗体示出对于磷酸化肽τ蛋白386-408(pS396/pS404)和单磷酸化肽磷酸化τ蛋白386-408(pS396)的强优先性，以及对于单磷酸化肽磷酸化τ蛋白386-408(pS404)和非磷酸化肽τ蛋白386-408没有结合活性。对照磷酸化肽τ蛋白240-270和磷酸化τ蛋白。结果示于图4和图32中。
实例6：通过免疫组织化学对抗体的组织学表征
从8月龄rTg4510小鼠(在CamKII启动子下过表达人类P301L-τ)和非转基因同窝仔(非-Tg)收集小鼠脑组织，固定于4％低聚甲醛中，并且包埋于石蜡中。从组织方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英国)获取石蜡包埋的人类额皮质的脑样品。将来自患有诊断的末期阿尔茨海默病的供体的组织与年龄匹配的非痴呆对照供体进行比较。将四微米厚的切片去石蜡，并且通过在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中微波处理切片10分钟，使其经受抗原修复。将内源性过氧化物酶用PBS/1％BSA/0.3％Triton X-100(PBS-BT)中的1％过氧化氢酶、随后用5％正常猪血清进行封闭。将切片与稀释于PBS-BT中的处于一系列浓度的D1.2和C10-2抗体在4℃孵育过夜。将切片在PBS、0.25％BSA、0.1％Triton X-100中洗涤，之后与生物素酰化的二级猪抗小鼠抗体(E0464；DAKO，格洛斯楚普(Glostrup)，丹麦(Denmark))以1:500一起孵育1小时。在另外的洗涤后，应用链霉亲和素-生物素复合物试剂盒(载体实验室(Vector Laboratories)，伯林盖姆(Burlingame)，加利福尼亚州)，并且用二氨基联苯胺使免疫反应性可见。将切片用苏木精复染。结果在图5中示出。
实例7：抗体对于病理性τ蛋白的选择性
将MSD板用来自AD脑(1:1500稀释)或TG4510脑(1:3000稀释)的溶解的P3抗原包被。结果在图6中示出。
如在上述实例4中所述进行检测
实例8：HEK细胞接种测定
在6孔板中在铺板后24h，将HEK293细胞用人类τ-P301L-FLAG瞬时转染，24h后接着与脑匀浆一起孵育24h，随后分离并重铺板细胞，并且在再一个24h之后收获。在补充有1％triton X、Phos-stop和完全的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(罗氏)缓冲液的PBS中，将细胞裂解并进行超声处理，并且在100,000x g下超速离心30min。将沉淀重悬浮于SDS中，进行超声处理，在100,000x g下超速离心30min。通过蛋白质印迹分析上清液。表达人类τ-P301L的细胞在用来自rTg4510τ蛋白转基因小鼠的总脑匀浆接种后，显示不溶性(SDS级分，E1/FLAG检测)过度磷酸化的(D1.2}pS396检测)τ蛋白。用来自小鼠的对照脑匀浆处理的细胞示出不存在聚集的过度磷酸化人类τ蛋白。此外，使用来自西斯比的τ蛋白聚集测定来分析HEK293细胞的总细胞裂解物。这种测定是基于在FRET中的时间分辨荧光，对于供体(Tb3+缀合的)和受体(d2缀合的)抗体而言使用的是相同抗体。将10μl样品与10μl抗体混合物进行混合，并且孵育20h。在Pherastar酶标仪上读取板以评估时间分辨荧光(在切换激发光之后，测量的/积分的FRET信号)。该测定以高特异性和灵敏性测量在人类尸体解剖材料、rTg4510小鼠以及接种的HEK细胞两者中聚集的τ蛋白。结果在图7中显示，并且示出接种效应不受用HEL处理的影响，但部分地通过用τ蛋白抗体(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)处理而逆转。
实例9：对于D1.2和C10-2的体内功能(电生理学(elphys))响应的逆转
在4.5到5.5月龄rTg4510和tTA对照小鼠中对海马体CA1区中突触传递和可塑性的体内电生理评估示出i)相比于tTA小鼠，在rTg4510中基础突触传递显著受损，并且ii)相比于tTA小鼠，在rTg4510中配对脉冲易化显著降低。
根据关于照料和使用实验室动物的欧共体委员会指令(European CommunitiesCouncil Directive)(86/609/EEC)以及管理动物实验的丹麦立法进行所有实验。
将5到5.5个月大的rTg4510和tTA雄性小鼠(欧洲泰康利公司(Taconic Europe A/S))在记录的时间用于本研究中。将小鼠分组笼养于受控温度(22℃±1.5℃)和湿度条件(55％-65％)，并且保持在12:12小时光/暗周期中(在06:00h光亮)。可随意获得食物和水。
将动物用腹膜内(i.p.)注射尿烷(1.2g/kg)进行麻醉。然后将小鼠安装在立体定位架中，经由热板将它们的温度调节至37.5℃，并且暴露颅骨。将铂丝放置于额骨中以充当参考，并且打额外的孔以用于按照根据帕西尼奥斯和富兰克林图集(atlas of Paxinosand Franklin)(帕西尼奥斯(Paxinos)和富兰克林(Franklin)，2001)的以下坐标将记录和刺激电极插入海马体中：记录，前囱后部1.5-1.7mm，中线侧部1.0-1.2mm，在脑表面1.4-1.7mm之下；刺激，前囱后部1.8-2.0mm，中线侧部1.5-1.7mm，脑表面之下1.3-1.7mm。在记录的整个过程中，将动物保留在立体定位架中，并且规律地检查它们的麻醉水平。
每30s通过谢弗侧枝(Schaffer collateral)的电刺激在CA1诱发场电位(fEPSP)，并且调节记录电极的深度，直至检测到响应于单极方形脉冲的负fEPSP。典型地在30％和70％之间的fEPSP最大幅值之间测量诱发fEPSP的斜率。
一旦诱导最优的fEPSP，则通过刺激强度和诱发fEPSP的斜率之间的关系(输入-输出关系)评估基础突触传递。不同的刺激强度是0、25、50、75、100、150、200、300、400、和500μA，并且以递增顺序相继施加，每个强度重复2至3次。发现与tTA小鼠相比，在rTg4510中基础突触传递显著受损。
进一步在rTg4510和tTA小鼠中测量配对脉冲易化，这是一种被认为依赖于突触前机制的短期突触可塑性。简言之，将具有从25到1000ms变化的刺激间时间间隔(ISI)的一对刺激施加至谢弗侧枝，并且将第二fEPSP的斜率与第一fEPSP的斜率进行比较。在所有ISI处观察到易化，其最大易化在50和75ms的ISI处。令人感兴趣的是，在rTg4510小鼠中观察到当与tTA小鼠比较时显著更低的PPF。
将鉴定的在基础突触传递中的受损以及在rTg4510小鼠中的配对脉冲易化进一步用作用以测试抗体效价的读数。
在每周两次给予(i.p.)4个剂量的抗体持续2周之后2至4天，在所有实验中进行记录。当可能时，将在每个动物的两个海马体中的基础突触传递和配对脉冲易化进行记录，并且进一步用作单独的实验。结果在图8中显示，并且示出在CA1诱发场电位中配对脉冲易化和基础突触传递缺陷的抗体逆转。实例10：来自rTg4510脑提取物的τ蛋白的耗减
将60μg小鼠和人源化C10-2抗体固定到300μl的磁珠(Magnetic dynabead)悬浮物(免疫沉淀试剂盒磁珠蛋白G(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G)Novex，货号10007D)上。在彻底洗涤之后，将珠粒与60μl rTg4510脑提取物混合，并且在室温孵育10分钟。将磁珠与提取物分离，并且将提取物通过蛋白质印迹进行分析。用mC10-2和hC10-2的耗减分别将τ蛋白聚集物去除99％和99.5％。结果在图12中示出。
实例11：使用经免疫耗减的提取物进行HEK细胞接种测定
在6孔板中将HEK293细胞用人类τ-P301L-FLAG瞬时转染。24h后，将细胞与已经使用人源化或小鼠C10-2进行了免疫耗减的脑匀浆一起孵育。在24h之后，将细胞重新铺板，并且在再一个24h之后收获。在补充有1％triton X、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂(罗氏)的TBS中，将细胞裂解并进行声处理，并且在100,000x g下超速离心30min。将沉淀重悬浮于1％SDS中，进行超声处理，在100,000x g下超速离心30min。通过蛋白质印迹分析上清液。在用来自rTg4510τ蛋白转基因小鼠的总脑匀浆接种后，表达人类τ-P301L的细胞示出不可溶的(SDS部分，E1/FLAG检测)过度磷酸化τ蛋白(D1.2/pS396τ，以更高的分子量运行)。用来自tTA小鼠对照脑匀浆处理的细胞示出不存在聚集的过度磷酸化人类τ蛋白。此外，使用来自西斯比的τ蛋白聚集测定来分析HEK293细胞的总细胞裂解物。用HEL和hHEL抗体的耗减不影响接种，然而用mC10-2和hC10-2的耗减分别以88％和96％防止τ蛋白聚集并且以97％和100％防止不溶性τ蛋白。结果在图13中示出。
实例11：来自rTg4510脑提取物的τ蛋白的耗减
将100μg小鼠C10-2、D1.2和τ5(英杰公司)抗体固定到500μl的磁珠(Magneticdynabead)悬浮物(免疫沉淀试剂盒磁珠蛋白G(Immunoprecipitation Kit DynabeadsProtein G)Novex，货号10007D)上。在彻底洗涤之后，将珠粒与100μl rTg4510脑提取物混合，并且在室温孵育10分钟。将磁珠与提取物分离，并且将提取物通过蛋白质印迹进行分析。C10-2和D1.2未去除来自匀浆的正常τ蛋白，而可商购的τ5抗体去除了来自匀浆的正常τ蛋白。相比之下，本发明的两种抗体特异性地将过度磷酸化τ蛋白(64kDa)(其是在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白)去除95％。结果在图14中示出。
实例12：来自阿尔茨海默脑提取物的τ蛋白的免疫耗减
将100μg小鼠C10-2和D1抗体固定到500μl的磁珠(Magnetic dynabead)悬浮物(免疫沉淀试剂盒磁珠蛋白G(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G)Novex，货号10007D)上。在彻底洗涤之后，将珠粒与100μl阿尔茨海默脑提取物混合，并且在室温孵育10分钟。将磁珠与提取物分离，并且将提取物通过蛋白质印迹进行分析。D1.2和C10-2仅去除脑匀浆中非常少部分的总τ蛋白(8％)。然而这些抗体特异性地将对于AD患者具有特异性的过度磷酸化τ蛋白去除(90％)。结果在图15中示出。
实例13：使用经免疫耗减的提取物在rTg4510小鼠中接种
使用在CamK2阳性神经元(rTg4510)中在tet-关(tet-off)响应元件下表达人类突变τ蛋白(P301L 0N4R)的转基因小鼠。该模型正常地在3月龄开始发展τ蛋白病理学，但通过在妊娠期间用多西环素饲养母鼠并且持续到小鼠生命的第一个3周，病理学在后期(在六月龄之后开始)发展。用于研究中的经多西环素预处理的小鼠在注射时间点是2.5月大。将小鼠通过固定于立体定位架中的异氟烷吸入进行麻醉。将颅骨暴露并且调节直至前囱和人字点在水平向上。在颅骨中在前囱侧向2mm(右)和后部2.4mm处钻孔。使用10μl的注射器斜尖(SGE)在脑表面侧部1.4mm以上文所述的坐标注射接种材料。将实例11和12中描述的2μl的经免疫耗减的提取物缓慢输注在位点处(1μl/分钟)，并且将注射器保留5分钟之后将其移除。通过缝线将伤口闭合并且在小鼠醒来时加热。将小鼠笼养3个月，并且然后处死，并且用4％PFA进行灌注固定。
免疫组织化学：在NSA上将固定的脑切成35μm冠状切片，并且将每6个切片针对τ蛋白缠结(加莱斯(Gallyas)银染)和针对过度磷酸化τ蛋白(AT8)进行染色。将阳性染色的神经元(胞体)在所有脑的海马体的同侧和对侧中进行计数。包括海马体的所有亚区。每个脑计数八个切片。结果反映来自这8个切片的阳性神经元的总和。在2个未注射的小鼠中确定背景信号。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。结果在图16中示出。接种有rTg4510(A)或AD(B)脑匀浆的rTg4510脑中的τ蛋白病理学的定量。在接种之前，通过使用C10-2或D1.2，高度磷酸化τ蛋白(而不是正常τ蛋白)已经在匀浆中降低了90％-95％。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。
来自rTg4510或阿尔茨海默脑的匀浆可以在rTg4510小鼠中在内源性τ蛋白病变还未发展的时期处接种τ蛋白病变。通过经使用D1.2或C10-2而从匀浆去除过度磷酸化τ蛋白(如实例11和12所述)，接种活性消除。
实例14：在接种的rTg4510小鼠中的抗体处理
将多西环素处理的rTg4510小鼠(如实例13中所述)慢性地用小鼠D1.2或对照抗体处理，15mg/kg/周，在2月龄时开始。在2.5月大时，将rTg4510脑提取物输注到海马体中(如实例13中所述)。在脑输注之后1、2和3个月，将小鼠处死，并且如实例13中所述的进行免疫组织化学法和以下分析。在接种已经起始之后2和3个月，D1.2处理显著降低了τ蛋白病变。结果在图17中示出。
接种的rTg4510小鼠的海马体中的具有神经元的缠结的定量。病变随时间增加，并且通过用D1.2处理小鼠，在接种后2个月和3个月时病变显著更少。接种的rTg4510小鼠的海马体中的具有神经元的缠结的定量。病变随时间增加，并且通过用D1.2处理小鼠，在接种后2个月和3个月时病变显著更少。
来自rTg4510或阿尔茨海默脑的匀浆可以在rTg4510小鼠中在内源性τ蛋白病变还未发展的时期处接种τ蛋白病变。通过系统地用D1.2处理小鼠，τ蛋白病变的发展可以显著降低。
实例15：使用人源化τ蛋白抗体对来自阿尔茨海默脑提取物的τ蛋白进行免疫耗减
将100μg小鼠和人源化C10-2以及现有技术抗体2.10.3和HJ8.5抗体(来源)固定到500μl的磁珠(Magnetic dynabead)悬浮物(免疫沉淀试剂盒磁珠蛋白G Novex，货号10007D)上。在彻底洗涤之后，将珠粒与100μl阿尔茨海默脑提取物混合，并且在室温孵育10分钟。将磁珠与提取物分离，并且将提取物通过蛋白质印迹和西斯比测定进行分析。与hHel对照抗体相比，小鼠和人源化C10-2有效地将93％和97％的pS396磷酸化τ蛋白去除，但仅去除22％和17％的总τ蛋白。2.10.3抗体去除91％的丝氨酸396磷酸化τ蛋白和10％的总τ蛋白。看起来与C10-2抗体(中间64kDa条带)相比，2.10.3在去除过度磷酸化条带方面不是很有效。HJ8.5抗体具有完全不同于C10-2和2.10抗体二者的特征，其去除大部分τ蛋白，89％的总τ蛋白和88％的pS396τ蛋白。结果在图23-24中示出。
实例16：使用人源化τ蛋白抗体对来自阿尔茨海默脑提取物的聚集的τ蛋白进行免疫耗减
还通过使用实例10中所述的τ蛋白聚集测定分析了实例13中所述的经免疫耗减的AD提取物。与2.10.3抗体相比，C10-2和HJ8.5抗体更有效地去除来自AD材料的聚集的τ蛋白。按照效率的顺序为：HJ8.5(99％)、hC10-2(98％)、mC10-2(96％)和2.10.3(90％)，所有均与hHel抗体相比。结果在图25中示出。
实例17：τ蛋白的免疫耗减
将25μg抗体(人源化C10-2或2.10.3)固定到125μl的磁珠(Magnetic dynabead)悬浮物(免疫沉淀试剂盒磁珠蛋白G Novex，货号10007D)上。在彻底洗涤之后，将包被的珠粒与可变量的非包被洗涤珠粒进行混合。从100％Ab包被的珠粒(对应于5μg抗体)开始，直到100％未包被的珠粒。珠粒的总量在所有样品中是相同的。将珠粒与20μl AD提取物混合，并且在室温下孵育10分钟。将磁珠与提取物分离，并且将提取物等分，迅速冷冻，并且保持在-80C直到使用。
使用蛋白质印迹对耗减的分析
将样品在1x LDS加载缓冲液和100mM DTT中煮沸。将对应于3μl提取物的体积加载在4％-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(LifeTech Novex)上。在电泳后，将蛋白质印迹在Immobilon-FL PVDF膜(0.45μm，IPFL10100，密理博(Millipore))上。将膜用SEA封闭缓冲液(Prod#37527，赛默(Thermo))封闭。使用τ5(艾碧康(Abcam)ab80579，1:2000)、小鼠C10-2(1μg/ml)、P-S199/202(英杰公司，44768G，1:1000)、P-S422(艾碧康(Abcam)ab79415，1:750)、人类IPN(1μg/ml)，对样品中的τ蛋白和P-τ蛋白水平进行评估将磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)和肌动蛋白用作加载对照(艾碧康(Abcam)ab9484，1:2000，西格玛A5441，1:20000)。使用二级荧光团缀合的IgG抗体(IRDye 800CW山羊抗-人，IRDye 800CW，山羊抗-兔，IRDye 680山羊抗-小鼠，LI-COR生物科学)，并且使用Odyssey CLx和Image studio软件(LI-COR生物科学)对信号定量。进行对整个泳道中单独条带以及信号的定量，并且据此绘制S形剂量反应曲线，并且可能时，评价最大效应和EC50值。
结果
两种抗体去除来自阿尔茨海默脑制品的小部分τ蛋白。被设计为对P-S422τ蛋白具有特异性的2.10.3去除了高达24％的总τ蛋白量，而C10-2去除了高达15％的总τ蛋白(参见图26)。
2.10.3和C10-2两者去除多于90％的在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白，但去除50％的P-S422τ蛋白所需的抗体的量不同，对相同效果而言，对于2.10.3需要0.42μg抗体，并且对于C10-2需要0.27μg(参见图27)。
C10-2有效地去除了在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白(最大效应：88％，并且通过使用0.30μg抗体达到该效应的一半)。2.10.3去除了更少部分的在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白(最大效应：60％，并且当使用0.63μg抗体时达到该效应的一半)(参见图28)。这指示所有的在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白在丝氨酸396处也被磷酸化，但在位置422处的磷酸化丝氨酸不存在时，存在在丝氨酸396处磷酸化的一部分过度磷酸化τ蛋白。
通过C10-2去除的大部分τ蛋白在丝氨酸199/202处也被磷酸化，因为69％的具有该磷酸化的τ蛋白受到免疫耗减的影响(当使用0.34μg抗体时该效应的50％)(参见图29)。2.10.3免疫耗减并不对P-S199/202τ蛋白给出S形剂量反应，但可看到信号随递增量的抗体而降低，当使用抗体的最大量(5μg)时(最大值52％降低(参见图29)。
该数据指示，与靶向在422位置处的磷酸化丝氨酸的2.10.3抗体相比，靶向磷酸化丝氨酸396的C10-2抗体结合更大量的过度磷酸化τ蛋白。
实例18：对AD脑裂解物中病理性τ抗原的mC10-2特异性捕获的抗体介导的抑制
材料与方法
材料
包被缓冲液：碳酸盐缓冲液pH 8.5，150mM NaCL。封闭缓冲液：3％BSA(部分V(fraction V))，0.1％NP40于PBS中，pH 7.4。洗涤缓冲液：0.1％BSA(部分V)，0.1％NP40于PBS中，pH 7.4。硫标记山羊总人源化τ蛋白抗体(MSD D221LA-1，50μg/ml)
方法旨在将τ抗原与递增浓度的pS396特异性抗体一起孵育(步骤B)之后，使用C10-2包被的板(步骤A)测量来自AD脑的病理性人类τ抗原的捕获。使用来自MSD的硫标记抗人类(总)τ蛋白抗体检测τ抗原捕获和抗体介导的抑制。
A：将MSD板用在包被缓冲液中的0.5μg/ml mC10-2(捕获抗体)包被(4℃过夜)，并且随后在室温下)封闭1小时，并且洗涤3次。(图30)
B：将来自AD(从3名患者聚池)的样品P3裂解物(1:1000＝2-4μg/ml总蛋白)和/或S1(p)(1:300＝20-40ng/ml总蛋白)与梯度浓度的pS396肽表位特异性抗体混合，并且在室温孵育1小时。随后将反应在步骤A中制备的板上孵育2小时。(图31)
C：使用硫标记的人类τ蛋白检测C10-2捕获的τ蛋白。来自MSD的τ蛋白抗体(典型地1:50)遵循厂商说明书。在MSDS 600上分析板。以类似设置测试AD P3和AD S1(p)。(图33/34)
表6A
表6B
表6C
表6D
表6A-6D：τ抗原捕获抑制
序列表
<110> H．隆德贝克有限公司（H. Lundbeck A/S）
<120> τ 396抗体
<130> 0995-WO-PCT
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2 CDR 1轻链
<400> 1
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2 CDR 2轻链
<400> 2
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2 CDR 3轻链
<400> 3
Ser Gln Ser Thr His Val Pro
1 5
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2 CDR 1重链
<400> 4
Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Ile His
1 5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2 CDR 2重链
<400> 5
Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2 CDR 3重链
<400> 6
Ser Arg Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 7
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2轻链
<400> 7
Asp Val Met Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2重链
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Ile His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Asn Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Arg Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val
195 200 205
Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Arg Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu
370 375 380
Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asp Ile
405 410 415
Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg
420 425 430
His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2 CDR 1轻链
<400> 9
Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2 CDR 2轻链
<400> 10
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2 CDR 3轻链
<400> 11
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro
1 5
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2 CDR 1重链
<400> 12
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2 CDR 2重链
<400> 13
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2 CDR 3重链
<400> 14
Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 15
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2轻链
<400> 15
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 16
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C10.2重链
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2 CDR 1轻链
<400> 17
Gln Ala Ser Gln Asp Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2 CDR 2轻链
<400> 18
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2 CDR 3轻链
<400> 19
Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro
1 5
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2 CDR 1重链
<400> 20
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2 CDR 2重链
<400> 21
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Asn Asp Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2 CDR 3重链
<400> 22
Arg Gly Thr Met Asp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2轻链
<400> 23
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 24
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C5.2重链
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Asn Asp Met Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3 CDR 1轻链
<400> 25
Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn Leu Asn
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3 CDR 2轻链
<400> 26
Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3 CDR 3轻链
<400> 27
Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro
1 5
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3 CDR 1重链
<400> 28
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg Thr Ile His
1 5 10
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3 CDR 2重链
<400> 29
Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3 CDR 3重链
<400> 30
Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3轻链
<400> 31
Asp Val Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Ile Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Gly Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Asp
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gln His Ser Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 32
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> C8.3重链
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 33
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 33号人类τ蛋白
<400> 33
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
1 5 10 15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
20 25 30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
35 40 45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
50 55 60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65 70 75 80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
85 90 95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
100 105 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
115 120 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
130 135 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
165 170 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
180 185 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
195 200 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
210 215 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225 230 235 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
245 250 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
260 265 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
275 280 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305 310 315 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
325 330 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
340 345 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
355 360 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
370 375 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385 390 395 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
405 410 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
420 425 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
435 440
<210> 34
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> D1.2*轻链
<400> 34
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115 120 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145 150 155 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> hC10.2重链
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Arg
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> hC10.2 LC
<400> 36
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Thr Ser Ile Asn
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Met Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Thr Tyr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工(Artificial)
<220>
<223> 具有磷酸化S396和S404的386-408 τ蛋白
<400> 37
Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ser Pro Arg His Leu
20

Claims (53)

1.一种单克隆抗体或其表位结合片段，能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ IDNO:33)的磷酸化残基396。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，由完整抗体组成。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括选自下组的表位结合片段或由其组成：Fv片段(例如单链Fv和二硫键键合的Fv)；Fab样片段，例如Fab片段、Fab’片段和F(ab)2片段；以及结构域抗体，例如单一VH可变结构域或VL可变结构域。
4.根据任何前述权利要求所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该抗体选自下组，该组由以下抗体组成：亚型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，它们是人类的或人源化的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中所述抗体基本上不能结合至τ蛋白(SEQ ID NO:33)上的磷酸化404残基。
7.一种单克隆抗体或其表位结合片段，包括：
(a)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链CDR3。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括SEQ ID NO:8的重链或SEQ ID NO:7的轻链。
9.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括SEQ ID NO:8的重链和SEQ ID NO:34的轻链。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括：
(a)具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链CDR3。
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体，包括SEQ ID NO:16的重链和/或SEQ ID NO:15的轻链。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括：
(a)具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3。
13.根据权利要求12所述的单克隆抗体，包括SEQ ID NO:24的重链和/或SEQ ID NO:23的轻链。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括：
(a)具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链CDR1；
(b)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链CDR2；
(c)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链CDR3；
(d)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的重链CDR1；
(e)具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链CDR2；以及
(f)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链CDR3。
15.根据权利要求14所述的单克隆抗体，包括SEQ ID NO:32的重链和/或SEQ ID NO:31的轻链。
16.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该重链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:32、和SEQ ID NO:35，并且该轻链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:23、和SEQ ID NO:36。
17.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括
(a)重链CDR1，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:4、SEQID NO:12、SEQ ID NO:20、和SEQ ID NO:28；
(b)重链CDR2，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:5、SEQID NO:13、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:29；以及
(c)重链CDR3，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:6、SEQID NO:14、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:30；以及
(d)轻链CDR3，其包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3、SEQID NO:11、SEQ ID NO:19、和SEQ ID NO:27。
18.根据权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括：
(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链CDR1；
(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链CDR2；
(c)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链CDR3；以及
(d)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链CDR3。
19.一种单克隆抗体或其表位结合片段，对于过度磷酸化τ蛋白的、包含磷酸化丝氨酸的氨基酸基序具有选择性，该磷酸化丝氨酸距离酪氨酸残基两个残基。
20.根据权利要求19所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该氨基酸基序具有以下序列：
-Y-X-S(磷酸化)-P-
其中Y是酪氨酸，X是天然存在的氨基酸，P是脯氨酸，并且S(磷酸化)是具有磷酸化羟基侧链的丝氨酸。
21.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括Fc区。
22.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，进一步包括用于增加试剂体内半衰期的部分。
23.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，根据以下测试准则它们展现出免疫特异性地结合至包含磷酸化残基396的人类τ蛋白：i)该抗体基本上不结合至非磷酸化τ蛋白；ii)该抗体基本上不结合至当396非磷酸化时在404处磷酸化的τ蛋白；iii)该抗体结合至在396处磷酸化的τ蛋白；以及iv)该抗体结合至当396和404两者均磷酸化时的τ蛋白。
24.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，针对双磷酸化肽而被引发，该双磷酸化肽包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQID NO:37)之内的至少18个连续氨基酸残基，例如至少20个连续氨基酸残基。
25.根据权利要求24所述的单克隆抗体或其表位结合片段，针对双磷酸化肽而被引发，该双磷酸化肽包含18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基，这些连续氨基酸残基包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)。
26.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，具有超过年龄匹配健康对照的、对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)超过对于来自年龄匹配健康对照的τ蛋白的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆中检测磷酸化τ蛋白(pτ)(SEQ ID NO:33)。
27.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，具有对于AD患病τ蛋白的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有对于AD超过对于年龄匹配健康对照的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆中检测磷酸化τ蛋白(pτ)(SEQ ID NO:33)。
28.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，针对以下双磷酸化肽而被引发：
覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)，能够免疫特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:33)的磷酸化残基396。
29.如权利要求1-28中任一项定义的抗体或其表位结合片段，其已经在细胞系中被产生或制造，该细胞系例如是人类细胞系、哺乳动物非人类细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系。
30.根据权利要求29所述的抗体或其表位结合片段，产生于CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11细胞系、CAP细胞系和HuH-7人类细胞系中。
31.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤表达，该杂交瘤是通过用人类病理性τ蛋白和非病理性τ蛋白筛选杂交瘤以分离以下克隆来分离的，这些克隆i)免疫特异性地针对磷酸化表位S396并且ii)特异性地识别来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分。
32.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该抗体或其表位结合片段进一步包括可检测部分。
33.根据权利要求32所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记。
34.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其表位结合片段的制品，其中所述制品基本上不含天然产生的抗体，这些天然产生的抗体不能结合至τ蛋白或不实质性地改变该制品的抗-τ蛋白功能，其中所述功能选自下组，该组由以下各项组成：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使得该制品基本上不能结合该磷酸化404残基或使得该制品优先结合至S396；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在实例中描述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％。
35.一种包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其表位结合片段的制品，其中相对于天然存在的抗τ蛋白抗体的结构，所述抗体或所述其表位结合片段在其氨基酸序列方面具有结构改变，其中所述结构改变导致所述抗体或所述片段展现出相对于由所述天然存在的抗τ蛋白抗体展现出的功能而言改变的功能，其中所述功能选自下组，该组由以下各项组成：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使得所述抗体或所述片段基本上不能结合该磷酸化404残基或使得所述抗体或所述片段优先结合至S396；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％。
36.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1至31中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或者根据权利要求34至35中任一项所述的制品，以及药学上可接受的载体。
37.一种对根据权利要求1至31中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段进行编码的或者对其组成链进行编码的核酸。
38.根据权利要求1至31中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、根据权利要求34至35中任一项所述的制品、或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于治疗。
39.根据权利要求1至33中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、根据权利要求34至35中任一项所述的制品、或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于对τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像。
40.根据权利要求1至31中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据权利要求34至35中任一项所述的制品或药物组合物、或根据权利要求36所述的组合物，其用于治疗选自下组的τ蛋白病变，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。
41.根据权利要求1至31中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据权利要求34至35中任一项所述的制品、或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于制造用于对τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的药剂。
42.根据权利要求41所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或制品或药物组合物、或组合物，其中该药剂是用于治疗阿尔茨海默病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病、以及患有路易体痴呆的患者的精神病症状。
43.一种在受试者中对阿尔茨海默病或其他τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的根据权利要求1-37中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、根据权利要求34至35中任一项所述的制品、或根据权利要求36所述的药物组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中该治疗是慢性的。
45.根据权利要求44所述的方法，其中该慢性治疗是持续至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的方法，其中该受试者是人类。
47.一种试剂盒，该试剂盒包含根据权利要求1-31中任一项所述的抗体或其片段、根据权利要求34至35中任一项所述的制品、或根据权利要求36所述的药物组合物，其用于治疗。
48.如权利要求1至33所述的单克隆抗体或其表位结合片段，或包含所述抗体或片段的制品或药物组合物，其用于检测或测量所述τ蛋白在受试者的脑中的存在或量。
49.如权利要求48所述的单克隆抗体或其表位结合片段、制品或药物组合物，其中所述检测或测量包括对结合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体进行体内成像。
50.如权利要求48或49所述的单克隆抗体或其表位结合片段、制品或药物组合物，其中所述检测或测量包括对结合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体或所述其片段进行离体成像。
51.一种将过度磷酸化τ蛋白从缠结中去除的方法，所述缠结包含过度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使过度磷酸化τ蛋白与抗体接触从而导致该缠结耗减90％的过度磷酸化τ蛋白，所述抗体对于具有磷酸化残基396的或如权利要求1至31中任一项定义的τ蛋白具有选择性。
52.一种延迟患者中的阿尔茨海默病的进展的方法，所述方法包括通过给予对于如权利要求1至31中任一项定义的、具有磷酸化残基396的τ蛋白有选择性的抗体从而减少或衰减所述患者中的病理性τ蛋白的积累。
53.一种通过用于产生高特异性、高亲和力抗体的方法而产生的抗体，这些高特异性、高亲和力抗体对于包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白具有免疫特异性，其中所述方法包括以下步骤：
(A)将免疫原注入哺乳动物中，由此免疫所述哺乳动物，所述免疫原包含双磷酸化肽，该双磷酸化肽包含18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基，这些连续氨基酸残基包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:37)；
(B)将对所述哺乳动物的所述免疫重复进行两次或更多次；
(C)针对高特异性、高亲和力抗体的存在对来自所述经重复免疫的哺乳动物的血清样品进行筛选，这些高特异性、高亲和力抗体能够结合包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白、但是基本上很少能够结合非病原性τ蛋白；并且
(D)回收所述高特异性、高亲和力抗体。
CN201680040472.7A 2015-07-13 2016-07-12 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法 Active CN107847595B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1512211.2A GB201512211D0 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Agents, uses and methods
GB1512211.2 2015-07-13
GBGB1518375.9A GB201518375D0 (en) 2015-10-16 2015-10-16 Agents,uses and methods
GB1518375.9 2015-10-16
PCT/EP2016/066470 WO2017009308A2 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107847595A true CN107847595A (zh) 2018-03-27
CN107847595B CN107847595B (zh) 2021-09-24

Family

ID=56557664

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680040472.7A Active CN107847595B (zh) 2015-07-13 2016-07-12 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法

Country Status (32)

Country Link
US (4) US10196439B2 (zh)
EP (1) EP3322442A2 (zh)
JP (1) JP6878395B2 (zh)
KR (1) KR20180030047A (zh)
CN (1) CN107847595B (zh)
AU (1) AU2016292892B2 (zh)
BR (1) BR112018000769A2 (zh)
CA (1) CA2990555A1 (zh)
CL (1) CL2018000096A1 (zh)
CO (1) CO2017013318A2 (zh)
CR (1) CR20180026A (zh)
DO (1) DOP2018000012A (zh)
EA (1) EA038703B1 (zh)
EC (1) ECSP18002644A (zh)
GE (1) GEP20227369B (zh)
HK (1) HK1254357A1 (zh)
IL (1) IL256791B (zh)
JO (1) JO3711B1 (zh)
MA (1) MA42446A (zh)
MX (1) MX2018000505A (zh)
NI (1) NI201800005A (zh)
NZ (1) NZ738595A (zh)
PE (1) PE20180607A1 (zh)
PH (1) PH12018500062A1 (zh)
RU (1) RU2727911C2 (zh)
SG (1) SG10202101343RA (zh)
SV (1) SV2018005611A (zh)
TN (1) TN2017000541A1 (zh)
TW (1) TWI741987B (zh)
UA (1) UA123862C2 (zh)
WO (1) WO2017009308A2 (zh)
ZA (1) ZA201800070B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110267985A (zh) * 2017-01-04 2019-09-20 H.隆德贝克有限公司 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
CN111655723A (zh) * 2018-02-01 2020-09-11 扬森疫苗与预防公司 与tau特异性结合的结合分子
WO2024067401A1 (zh) * 2022-09-26 2024-04-04 中美华世通生物医药科技(武汉)股份有限公司 包含Fc-高级脂肪酸链的超长效平台

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2902026C (en) 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
JO3627B1 (ar) 2015-04-30 2020-08-27 H Lundbeck As إيميدازو بيرازينونات على هيئة مثبطات pde1
IL300670A (en) 2015-06-05 2023-04-01 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
PE20180499A1 (es) 2015-07-06 2018-03-09 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos de union a tau
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
PE20190261A1 (es) 2016-05-02 2019-02-25 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
HUE060258T2 (hu) 2016-05-02 2023-02-28 Prothena Biosciences Ltd Tau immunterápia
US10034861B2 (en) 2016-07-04 2018-07-31 H. Lundbeck A/S 1H-pyrazolo[4,3-b]pyridines as PDE1 inhibitors
LT3484916T (lt) * 2016-07-12 2021-04-26 H. Lundbeck A/S Antikūnai, būdingi hiperfosforilintam tau, ir jų naudojimo būdai
US11590304B2 (en) 2016-08-15 2023-02-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Volume control device for manually operated resuscitator and ventilation apparatus and method of use
CN109803653A (zh) 2016-10-28 2019-05-24 H.隆德贝克有限公司 包括给予咪唑并吡嗪酮的组合治疗
CA3041607A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 H. Lundbeck A/S Combination treatments comprising imidazopyrazinones for the treatment of psychiatric and/or cognitive disorders
WO2018106776A2 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
PE20191135A1 (es) 2016-12-07 2019-09-02 Genentech Inc Anticuerpos antitau y metodos de uso
CN110520440A (zh) 2017-02-17 2019-11-29 戴纳立制药公司 抗τ抗体及其使用方法
JOP20180014A1 (ar) 2017-02-27 2019-01-30 Teijin Pharma Ltd جسم مضاد متوافق مع البشر لعلاج أو الوقاية من الاضطرابات الإدراكية، وعملية لإنتاجه، وعامل لعلاج أو الوقاية من الاضطرابات الإدراكية باستخدامه
EA039569B1 (ru) * 2017-03-14 2022-02-11 Х. Лундбекк А/С Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения
MX2019013045A (es) 2017-05-02 2020-02-12 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau.
CN111630064B (zh) 2017-10-16 2023-06-27 卫材R&D管理有限公司 抗Tau抗体及其用途
AR113926A1 (es) 2017-12-14 2020-07-01 H Lundbeck As Derivados de 1h-pirazolo[4,3-b]piridinas
SG11202005361RA (en) 2017-12-14 2020-07-29 H Lundbeck As Combination treatments comprising administration of 1h-pyrazolo[4,3-b]pyridines
WO2019121840A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 H. Lundbeck A/S Pyrazolo[3,4-b]pyridines and imidazo[1,5-b]pyridazines as pde1 inhibitors
WO2020180819A1 (en) 2019-03-03 2020-09-10 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
WO2020193500A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 H. Lundbeck A/S Use of a ps396 assay to diagnose tauophaties
AU2021257848A1 (en) 2020-04-15 2022-12-01 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
CN116723856A (zh) 2020-06-25 2023-09-08 默沙东有限责任公司 靶向丝氨酸413处磷酸化的tau的高亲和力抗体
JP2023540796A (ja) 2020-09-11 2023-09-26 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ベータ鎖媒介性免疫を調節するための方法及び組成物
JP2023540799A (ja) * 2020-09-11 2023-09-26 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多重特異性免疫標的化分子及びその使用
WO2022104136A2 (en) * 2020-11-12 2022-05-19 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for tauopathy diagnosis and treatment
MX2023007181A (es) 2020-12-16 2023-08-30 Voyager Therapeutics Inc Compuestos de union a tau.
CN113702647B (zh) * 2021-08-31 2024-03-15 普十生物科技(北京)有限公司 人生长分化因子15即时检测试剂盒、其制备方法及其应用
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023250388A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2298814A2 (en) * 2000-09-27 2011-03-23 Life Technologies Corporation Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
WO2012045882A2 (en) * 2010-10-07 2012-04-12 Ac Immune S.A. Pharmaceutical composition
CN104080806A (zh) * 2011-10-07 2014-10-01 Ac免疫有限公司 识别Tau的磷酸化特异抗体

Family Cites Families (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4861581A (en) 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DE69032742T2 (de) 1989-08-09 1999-06-17 Rhomed Inc Direkte radioetikettierung von antikörpern und sonstigen proteinen mittels technetium oder rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
ATE398176T1 (de) 1991-12-06 2008-07-15 Max Planck Gesellschaft Phosphorylierungsepitope aus dem tau-protein zur diagnose und behandlung der alzheimer-krankheit
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
MXPA02000962A (es) 1999-07-29 2002-07-02 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para her2/neu.
NZ517202A (en) 1999-08-24 2004-05-28 Medarex Inc Human CTLA-4 antibodies and their uses
ATE378403T1 (de) 2000-11-30 2007-11-15 Medarex Inc Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humänen antikörpern
EP1539233B1 (en) 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2007019273A2 (en) 2005-08-04 2007-02-15 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Phosphorylation of tau by abl
BRPI0619056A2 (pt) 2005-11-28 2011-09-20 Genmab As anticorpo monovalente, método para preparar e produzir um antcorpo monovalente, construção de ácido nucleico, célula hospedeira, imunoconjugado, uso de um anticorpo monovalente, e, composição farmacêutica
EP3255144A1 (en) 2007-08-10 2017-12-13 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Recombineering construct for preparing transgenic mice capable of producing human immunoglobulin
EP2185592B1 (en) 2007-09-13 2013-01-23 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
US8609097B2 (en) * 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
WO2010144711A2 (en) 2009-06-10 2010-12-16 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins
KR20120092139A (ko) 2009-10-26 2012-08-20 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 벤즈아제핀 화합물
NZ609984A (en) * 2010-10-11 2015-05-29 Biogen Idec Internat Neuroscience Gmbh Human anti-tau antibodies
MY183989A (en) * 2011-09-19 2021-03-17 Axon Neuroscience Se Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in alzheimer's disease
WO2013151762A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Ac Immune S.A. Humanized tau antibody
SG11201408626YA (en) 2012-07-03 2015-03-30 Univ Washington Antibodies to tau
MX359817B (es) 2012-08-16 2018-10-11 Ipierian Inc Anticuerpos que se enlazan a tau.
CA2902026C (en) 2013-03-13 2023-08-29 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
WO2014170549A1 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Glykos Finland Oy A method for generating induced pluripotent stem cells
CN107073297B (zh) 2014-07-08 2021-09-14 纽约大学 Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
LT3484916T (lt) 2016-07-12 2021-04-26 H. Lundbeck A/S Antikūnai, būdingi hiperfosforilintam tau, ir jų naudojimo būdai
US10364286B2 (en) * 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
JP7217710B2 (ja) 2017-01-04 2023-02-03 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット 眼疾患の治療のための過リン酸化タウに特異的な抗体
US10934438B2 (en) 2017-04-27 2021-03-02 Axalta Coating Systems Ip Co., Llc Coatings and methods for using and producing the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2298814A2 (en) * 2000-09-27 2011-03-23 Life Technologies Corporation Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
WO2012045882A2 (en) * 2010-10-07 2012-04-12 Ac Immune S.A. Pharmaceutical composition
CN104080806A (zh) * 2011-10-07 2014-10-01 Ac免疫有限公司 识别Tau的磷酸化特异抗体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INVITROGEN: "Mouse anti-Phospho-Tau 396，Catalog No. 35-5300", 《INVITROGEN》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110267985A (zh) * 2017-01-04 2019-09-20 H.隆德贝克有限公司 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
CN110267985B (zh) * 2017-01-04 2023-05-23 H.隆德贝克有限公司 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
CN111655723A (zh) * 2018-02-01 2020-09-11 扬森疫苗与预防公司 与tau特异性结合的结合分子
WO2024067401A1 (zh) * 2022-09-26 2024-04-04 中美华世通生物医药科技(武汉)股份有限公司 包含Fc-高级脂肪酸链的超长效平台

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017009308A3 (en) 2017-04-06
NI201800005A (es) 2018-10-19
CO2017013318A2 (es) 2018-05-21
SV2018005611A (es) 2018-02-23
ECSP18002644A (es) 2018-03-31
US10934348B2 (en) 2021-03-02
CL2018000096A1 (es) 2018-07-06
UA123862C2 (uk) 2021-06-16
US11739140B2 (en) 2023-08-29
KR20180030047A (ko) 2018-03-21
TN2017000541A1 (en) 2019-04-12
CA2990555A1 (en) 2017-01-19
MA42446A (fr) 2018-05-23
US20210206843A1 (en) 2021-07-08
TW201716436A (zh) 2017-05-16
RU2018100822A3 (zh) 2019-12-26
PE20180607A1 (es) 2018-04-09
EP3322442A2 (en) 2018-05-23
SG10202101343RA (en) 2021-03-30
US20190177401A1 (en) 2019-06-13
CN107847595B (zh) 2021-09-24
IL256791A (en) 2018-03-29
BR112018000769A2 (pt) 2018-09-25
MX2018000505A (es) 2018-04-30
IL256791B (en) 2022-09-01
AU2016292892B2 (en) 2021-11-18
EA201890039A1 (ru) 2018-08-31
DOP2018000012A (es) 2018-02-28
GEP20227369B (en) 2022-04-11
PH12018500062A1 (en) 2018-07-09
US20170015738A1 (en) 2017-01-19
WO2017009308A2 (en) 2017-01-19
HK1254357A1 (zh) 2019-07-19
US10196439B2 (en) 2019-02-05
EA038703B1 (ru) 2021-10-07
TWI741987B (zh) 2021-10-11
JP2018531580A (ja) 2018-11-01
US10562962B2 (en) 2020-02-18
JO3711B1 (ar) 2021-01-31
ZA201800070B (en) 2019-04-24
JP6878395B2 (ja) 2021-05-26
NZ738595A (en) 2022-07-01
CR20180026A (es) 2018-03-08
AU2016292892A1 (en) 2018-01-18
RU2727911C2 (ru) 2020-07-24
RU2018100822A (ru) 2019-08-13
US20200190178A1 (en) 2020-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107847595A (zh) 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法
KR102551971B1 (ko) 과인산화된 타우에 특이적인 항체 및 이의 사용 방법
CN110114088A (zh) 用于预防τ蛋白聚集的单克隆抗α-突触核蛋白抗体
TWI729992B (zh) 用於治療共核蛋白病的藥劑、用途及方法
CN105283196B (zh) 用于产生和使用构象-特异性抗体的方法和组合物
CN109937210A (zh) 用于治疗共核蛋白病的药剂、用途和方法
CN110267985B (zh) 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
CN106573979A (zh) 抗axl抗体
CN107073297A (zh) Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途
CN109562167A (zh) 联合治疗
CN107849135A (zh) 与分拣蛋白结合并抑制颗粒蛋白前体的结合的抗体
CN110072888A (zh) 药剂、用途和方法
CN108135986A (zh) 对于Tau的截短的Asp421表位特异性的基于抗体的分子和它们在诊断和治疗Tau疾病中的用途
OA18779A (en) Antibodies Specific for Hyperphosphorylated Tau and Methods of Use Thereof.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant