UA123862C2 - Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування - Google Patents

Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування Download PDF

Info

Publication number
UA123862C2
UA123862C2 UAA201800762A UAA201800762A UA123862C2 UA 123862 C2 UA123862 C2 UA 123862C2 UA A201800762 A UAA201800762 A UA A201800762A UA A201800762 A UAA201800762 A UA A201800762A UA 123862 C2 UA123862 C2 UA 123862C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
tau protein
antibody
amino acid
epitope
antibodies
Prior art date
Application number
UAA201800762A
Other languages
English (en)
Inventor
Ян Торлєіф Педерсен
Ян Торлеиф Педерсен
Ларс Естергор Педерсен
Ларс Эстергор Педерсен
Юстус Клаус Альфред Дехзель
Асуні Айодеджі Абдур-Рашид
Асуни Айодеджи Абдур-Рашид
Ніна Росєнквіст
Нина Росенквист
Original Assignee
Х. Луннбек А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1512211.2A external-priority patent/GB201512211D0/en
Priority claimed from GBGB1518375.9A external-priority patent/GB201518375D0/en
Application filed by Х. Луннбек А/С filed Critical Х. Луннбек А/С
Publication of UA123862C2 publication Critical patent/UA123862C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується моноклонального антитіла, яке специфічно зв'язується з фосфорилованим сериновим залишком 396 в патологічному гіперфосфорилованому (РНЕ) тау-білку (р5396), а також до застосування цієї молекули і її тау-зв'язувального фрагменту в лікуванні хвороби
Альцгеймера і таупатій.
Даний винахід відноситься до нового класу моноклональних антитіл, які специфічно зв'язуються з фосфорилованим сериновим залишком 396 в патологічно гіперфосфорилованому (РНЕ) тау-білку (р5396), а також до способів застосування цих молекул і їх тау-зв'язувальних фрагментів в лікуванні хвороби Альцгеймера і таупатій.
Посилання на перелік послідовностей
Ця заявка містить один або декілька переліків послідовностей згідно з параграфами 1.821 і наступними розділу 37 СЕК, які розкриті на машинопрочитуваних носіях (назва файлу: 09954Х, створений 23 червня 2016 року і має розмір 40 КБ), при цьому даний файл включений в даний опис шляхом посилання у його повному обсязі.
Рівень техніки
Вікові нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба Альцгеймера (АБ) і деменція, в даний час є однією з найбільших суспільних проблем. За оцінками Всесвітньої організації охорони здоров'я вартість лікування осіб старшого віку продовжуватиме підвищуватися, і кількість діагностованих випадків деменції потроїться до 2050 року (/Могій Неакп Огодапігайоп апа АІ2пеїтегв5 Оівеазе Іпівегпайопа!-сіав Вероп (2012) ОЕМЕМТІА: А рибіїс пеайй ргіогу,
МІНО). Першими засобами лікування АО були модулятори вивільнення нейромедіаторів, такі як інгібітори ацетилхолінестерази, і модулятори ММОА-рецепторів. Ці терапевтичні засоби стали доступними на рубежі тисячоліть і як і раніше утворюють основу полегшення симптомів дефіцитів пам'яті, пов'язаних з деменцією і АЮ. Проте, ці лікарські засоби не впливають цілеспрямовано на першопричини АО - накопичення агрегатів В-амілоїдного (АВ) пептиду і тау- білка і асоційовану з ним втрату нейронних синапсів і нарешті нейронів.
Довгострокові широкомасштабні дослідження осіб старшого віку (М/еїпег, М.УМ. еї аї. (2014)
АРМІ опіїпе: пір/Лимли.адпі-іпто.ого/; Вгеївіег, М.М. еї а!. (1992) Мештоерідетіоіоду 11 Биррі 1, 23- 28; Іайпег, Г.). (1992) Мешйгоерідетіоіоду 11 Зиррі 1, 2-13) разом з крупними повногеномними дослідженнями асоціацій (І атрегї, ).С. еї аІ. (2013) Маї. Сепеї. 45, 1452-1458) показали, що АЮ є неоднорідною комбінацією форм деменції, де до 10 відсотків пацієнтів із запущеною формою
АО не мають патології амілоїдного пептиду (Стгагу, у.Р. еї аї. (2014) Асіа Меигораїйої. 128, 755- 766). Додатково, фундаментальні патологоанатомічні дослідження, проведені Вгаак 5 Вгаак (Вгаак, Н. апа Вгаак, Е. (1996) Асіа Мешйгої. 5сапа. 5иррі 165, 3-12), продемонстрували чітку
Зо кореляцію між ступенем патології нейрофібрилярних клубків і когнітивним статусом перед розтином. Ці спостереження підкріплювалися декількома дослідниками (Меїзоп, Р.Т. еї а. (2012)
У. Мешигораїної. Ехр. Меийгої. 71, 362-381) і в недавніх довгострокових дослідженнях біомаркерів, які указують на те, що рівні тау-білка і фосфорилованого тау-білка в цереброспінальній рідині (С5Е) підвищуються впродовж ранніх і пізніх стадій захворювання (аск, С.К., г. еї аї. (2013)
І апсеї Меишгої. 12, 207-216).
Як вказано вище, тау-білок, асоційований з мікротрубочками, і його гіперфосфорилований варіант утворюють основну складову внутріклітинних нейрофібрилярних клубків, які є однією з головних характерних особливостей АЮ. Додатково, певні варіанти гена тау-білка асоційовані з сімейними формами лобно-скроневої деменції (ЕТО). Поява патології тау-білю»а при А відбувається відповідно до чітко вираженого просторового патерну, починаючи з енторинальної кори з подальшим переходом в гіпокампальні зони і зони кори (Вгаак, Н. апа Вгаак, Е. (1996)
Асіа Мешгої. 5сапа. Зиррі 165, 3-12). Конкретна стадія патології тау-білка також добре корелює з когнітивними здібностями (Меї5оп, Р.Т. еї аїЇ. (2012) У. Мешигораїої. Ехр. Меигої. 71, 362-381;
Вгаак, Е. єї а. (1999) Єиг. Агосн. Рзуспіату Сіїп. Мешйговсі. 249 Зиррі 3, 14-22). Узяті разом, ці дані складають основу гіпотези, що спирається на те, що тау-білок грає певну роль в АЮ. Вона має на увазі, що внутріклітинне накопичення тау-білка приводить до руйнування мікротрубочок і колапсу дендритних шипиків. В результаті цього порушується комунікація між нейронами і наступає загибель клітин. Недавно також було показано, що тау-білок сам по собі може утворювати ендопатогенні молекули, які можуть сприяти розповсюдженню нейродегенерації від однієї клітини до наступної (Сіамадиега, РК. еї аї. (2009) Маї. Сеї! Віої. 11, 909-913).
Ї. Тау-білок як ендопатоген
СІамадцега і співавтори продемонстрували, що тау-білок сам по собі може діяти як ендопатоген (Сіамаднега, Р. еї а. (2009) Маї. СеїІ Віої. 11, 909-913). Екстракти головного мозку, отримувані при низькій швидкості центрифугування, виділяли з трансгенних по тау-білюу мишей
РЗО15 (Айеп, В. еї аї. (2002) 9. Мешгозсі. 22, 9340-9351), розбавляли і ін'єктували в гіпокамп і зони кори молодих мишей АЇ 217. Миші АЇІ 717 є трансгенною по тау-білку лінією мишей, у яких розвивається тільки пізня патологія (Ргоброї, А. еї аї. (2000) Асіа Меигораїйої. 99, 469-481). У підданих ін'єкції мишей АЇ217 швидко розвивалася патологія щільних філаментів, і введення імуновиснажених екстрактів головного мозку від мишей РЗО15 або екстрактів від мишей дикого бо типу не індукувало патологію тау-білка. Фракціонування екстрактів головного мозку на розчинний (51) і нерозчинний в саркозилі (РЗ3) тау-білок (Запага, М. еї аї. (2013) 9. АІ7/пеїтегв. рів. 33, 249-263) і їх ін'єкція мишам АЇ 217 продемонстрували, що фракція РЗ найбільшою мірою здатна індукувати патологію. Вона містить велику частину внутріклітинного гіперфосфорилованого філаментозного тау-білка. Патологію в більшості випадків також можна було індукувати при ін'єкції екстрактів РЗО15 в головний мозок мишей дикого типу, але МЕТ не утворювалися. У подальших дослідженнях Сіамадиега і співавтори показали, що людський тау- білок, екстрагований посмертно з тканини головного мозку з іншими таупатіями (хворобою аргірофільних зерен (АС), прогресуючим над'ядерним паралічем (РБ5Р) і кортикобазальною дегенерацією (СВО)), також може індукувати патологію тау-білка в моделі АЇ 2717 (Сіамадчега, Р. еї а). (2013) Ргос. Май). Асад. сі. О.5.А. 110, 9535-9540). З моменту представлення цих даних повідомлялося про деякі інші моделі затравлювальної дії і рознесення тау-білка (Аптей, 7. еї аї. (2014) Аста Мецгораїнпої. 127, 667-683; УМаїКег, І.С. єї аі. (2013) ЧАМА Меишгої. 70, 304-310).
Основний висновок цих досліджень вказує на механізм, за допомогою якого патогенний тау- білок у внутріклітинних включеннях секретується з клітини в периплазматичний простір.
Матеріал патологічного тау-білка потім транспортується по оболонці синаптичних пухирців як в антероградному, так і в ретроградному напрямі і згодом поглинається сусідніми клітинами шляхом об'ємного ендоцитозу. Цей механізм пояснює, чому рознесення патології, спостережуване при захворюванні у людини, слідує чітко вираженому анатомічному патерну.
Вельми цікаво, що периферичне введення патологічного тау-білка може прискорювати формування патології тау-білка у мишей АГ 717 (СіІамадчцега, Р. еї а. (2014) Асіа Меигораїної. 127, 299-301). Цей механізм рознесення може пояснювати розповсюдження захворювання при інших протеїнопатіях (Соеєаегі, М. еї а. (2010) Ттепав Мешцгозсі. 33, 317-325; Зідигаввоп, Е.М. єї а!. (2002) Ттепаз Мої. Мед. 8, 411-413).
ІЇ. Молекули тау-білка
Виявлення того, що тау-білок може діяти як ендопатоген, спонукало до пошуку "патогенних молекул", на які можна було б цілеспрямовано впливати в рамках потенційних методів інтервенційної терапії.
Ген тау-білка, що асоціюється з мікротрубочками (МАРТ), розташований в хромосомі 17 людського генома і експресує шість ізоформ тау-білка в головному мозку дорослої людини. Ці
Зо ізоформи утворюються в результаті альтернативного сплайсингу екзонів 2, З і 10 з 16 екзонів в гені МАРТ. Екзони 2 і З експресують повтор з 29 амінокислот, а екзон 10 експресує додатковий домен, що зв'язується з мікротрубочками. В результаті цього ізоформи тау-білка міститимуть 0, 1 або 2 М-кінцеві повтори і З або 4 С-кінцеві домени, що зв'язуються з мікротрубочками (тау- білок ЗЕ або 4К). Зазвичай експресуються шість ізоформ тау-білка. Найбільш довга (2М4К) і найбільш коротка (ОМЗК) ізоформи складаються з 441 і 352 амінокислот, відповідно (Коїагома,
М. еї аї. (2012) Іпі. У. АІ2Неітегв. Оів. 2012, 731526). М-кінцевий виступаючий домен тау-білка (2М4К) складається з багатого гліцином "хвоста" з 44 амінокислот і залишків 45-102, що охоплюють дві висококислі ділянки (М1, М2-домени). У залишках 151-243 виявлено дві ділянки, багаті проліном (Р1, Р2-домени). Решту білка складають чотири домени, що зв'язуються з мікротрубочками (К1-К4), за якими розташована коротка С-кінцева ділянка.
Тау-білок є вельми розчинним і високолабільним стосовно фосфорилування білком.
Приблизно 20 відсотків, або 85, амінокислотних залишків в найбільш довгій ізоформі тау-білка є потенційними (Зег, ТИйг або Ту) сайтами фосфорилування. Близько половини 3 них спостерігались експериментально (Наподег, О.Р. еї а). (2009) Ттепаб5 Мої. Мей. 15, 112-119;
Назедамжа, М. еї аї. (1992) 9. Віої. Снпет. 267, 17047-17054) і групуються навколо кінцевих залишків доменів, що зв'язуються з мікротрубочками. Тау-білок піддається динамічному фосфорилуванню і дефосфорилуванню в ході клітинного циклу. Він повинен дисоціювати від мікротрубочок, щоб забезпечити проходження мейозу. Його головною роллю в постмітотичних клітинах (диференційованих нейронах) є дія як стабілізатора мікротрубочок, що забезпечує оптимальний аксональний транспорт. Він може асоціюватися з мікротрубочками тільки в своїй головним чином дефосфорилованій формі, тому фосфорилування виступає як безпосередній перемикач асоціації з мікротрубочками/дисоціації від мікротрубочок в нейроні. За нормальних умов цитозольний тау-білок в середньому містить два фосфориловані сайти. У матеріалі парних спіральних філаментів щонайменше 7-8 сайтів є фосфорилованими (Напоег, О.Р. еї аї. (2009) Ттепав5 Мої. Меа. 15, 112-119; Назедама, М. еї аї. (1992) 9. Вісі. Спет. 267, 17047-17054).
Парні спіральні філаменти гіперфосфорилованого тау-більюа є ключовою характерною особливістю хвороби Альцгеймера (Кобік ей оаКі (1986) РМАБ, 86, 4044-4048), в імуноцитохімічному аналізі матеріалу головного мозку людини з АЮ спостерігається чітко виражена зміна рухливості гіперфосфорилованого тау-білка. бо Дослідження тау-білка за допомогою традиційних структурних методик, таких як рентгенівська кристалографія або ЯМР-спектроскопія, було важким, що відображає його метастабільну природу. Такі дослідження проводилися головним чином стосовно фрагментів доменів нефосфорилованого білка. Єдине до теперішнього часу структурне дослідження повнорозмірного тау-білка (2М4К) за допомогою ЯМР-спектроскопії виявило, що білок містить тільки рідкісні фрагменти стабільної вторинної структури (МикКгазсі, М.О. еї а. (2009) Рі о5. Віої. 7, е34). Цей аналіз указує на те, що вторинна структура пептидного остову має високу схильність приймати структуру В-аркуша. Перші 200 залишків остову є значно більш впорядкованими, ніж С-кінець, що охоплює домени, що зв'язуються з мікротрубочками.
Наявність великої кількості специфічних взаємодій дальнього порядку в білку в розчині указує на те, що він існує в сильно невпорядкованому стані розплавленої глобули (Опдизпі, М. апа
М/ада, А. (1983) РЕВЗ5З І ей. 164, 21-24).
У матеріалі клубків були ідентифіковані продукти розщеплювання тау-білка протеазами, що утворюються, зокрема, під дією каспази і кальпаїну (Азр13, СІи391 і Азр421) (сСатріїйп, Т.С. еї аї. (2003) Ргос. Май). Асад. сі. О.5.А. 100, 10032-10037). Зокрема, усікання по Азр421 детально вивчалося із застосуванням антитіла СЗ до тау-білка, яке зв'язується з вільним кінцем Азр421.
Було висунуто припущення, що це усікання є ранньою подією в патогенезі АО, що асоціюється з індукцією апоптозу (аеСаїїднпоп А. еї аї. (2010) Маїшге 464, 1201-1204). М-кінцеве розщеплювання по Ав5р1!3 і С-кіндеве розщеплюванню по (0391 вважаються за пізні події в патогенезі (деСаїїдпоп А. єї аї. (2010) Майте 464, 1201-1204; Оейобеї, Р. еї а. (2008) Ат. У). Раїної. 172, 123- 131). Недавно в С5Е від пацієнтів з АЮ і РО5Р був ідентифікований додатковий М-кінцевий фрагмент (залишки 1-224), і була висунута гіпотеза, що він є раннім маркером захворювання і особливо патогенним (5 14/092539; Вгідні, 9. еї аїЇ. (2014) Меишгобріої. Адеїпд, 1-17). Про аналогічний фрагмент, що утворюється в результаті розщеплювання кальпаїном, повідомляли інші групи (Реїтеїга, А. апа Відіо, Е.Н. (2011) Мої. Меа. 17, 676-685; Неїіпеске, .В. єї аї. (2011)
РІ о5. Опе. 6, е23865).
Було висунуто припущення, що, окрім гіперфосфорилування і фрагментації тау-білка, посттрансляційне ацетилування (Сопеп, Т..). еї аї. (2011) Маї. Соттип. 2, 252; Міп, 5.МУ. еї аї. (2010) Мешгоп 67, 953-966) і О-СІсСМАцилування (Пи, У. еї аї. (2014) 9. ВіоІ. Спет.) є процесами, що визначають патологію, при формуванні патології клубків, що асоціюється з АЮ.
Зо І. Види імунотерапії із застосуванням тау-білка
Види імунотерапії традиційно розділяються на пасивні і активні підходи до вакцинації. При активному підході до вакцинації патогенний засіб вводять пацієнтові шляхом ін'єкції, і система природженого імунітету викликає імунну відповідь. Це запускає дозрівання В-клітин, що виробляють високоафінні антитіла до введеного антигену. При пасивному підході до вакцинації запуску системи природженої імунної відповіді уникають шляхом інфузії антитіла, специфічного до антигену. Власна система очищення організму потім видаляє зв'язаний з антитілом ліганд.
АС Іттипе надає моноклональне мишаче антитіло до фосфосерину-409 тау-білка.
Визначали профіль антитіл до антигенів тканини головного мозку людини з АО і контрольної тканини головного мозку, і їх відбирали на підставі їх здатності до розпізнавання патології клубків. Обидва гуманізовані варіанти двох антитіл ПАСІ-36-286-АБІ і пПАСІ-36-ЗА8-АБІ1 зв'язуються з епітопом тау-білка в межах амінокислот 401-418 (МО 2013/151762).
Група Кодег Мії5сп виділила аутоантитіла до тау-білка від немолодих здорових індивідуумів без ознак дегенеративної таупатії. Було виділено ряд антитіл із застосуванням повнорозмірного рекомбінантного людського тау-білка (2М4К) для виявлення антитіл, специфічних до тау-білка.
Їх потім піддавали скринінгу стосовно їх здатності до розрізнення ізолятів тау-білка від хворих і здорових індивідуумів. Три провідні антитіла 4Е4, 4АЗ і 2482 були описані в патентній літературі (МО 2012049570; 005 2012087861). Картування їх епітопів указує на те, що всі вони розпізнають амінокислоти в межах ділянки зв'язування з мікротрубочками і в С-кінцевому напрямку від нього в положеннях від У339 до КЗ369. Ці антитіла не проявляють будь-яку фосфоспецифічність.
С2М Оіадповіїс5 фокусується головним чином на розробці засобів діагностики для раннього виявлення нейродегенеративного захворювання. Отримували антитіла до повнорозмірного людського і мишачого тау-білка. Ідентифікували вісім і п'ять антитіл, що розпізнають, відповідно, людський і мишачий тау-білок (Уапатапага, К. еї аї. (2013) Мешгоп 80, 402-414). Три антитіла з різними показниками кінетики зв'язування відбирали для оцінювання іп мімо. А саме це були
Н.9.3, Н.ОЗУ.4 і НОв.5, які розпізнають, відповідно, залишки 306-320, 7-13 і 25-30 тау-білка, при цьому останнє є специфічним до людського тау-білка. Антитіла також відбирали на підставі їх здатності до попередження перенесення патології в оригінальному репортерному аналізі механізму дії трансцелюлярного розповсюдження патології тау-білка (Запаегв, Ю.М. еї аї. (2014)
Мешгоп 82, 1271-1288; Кіошгу, М. еї аї. (2012) 9. Віо!. Спет. 287, 19440-19451). Їх оцінювання в бо дослідженнях з тривалою і.с.м. ін'єкцією у трансгенних мишей РЗО15 продемонструвало їх здатність до зменшення рівнів гіперфосфорилованого тау-білка, визначену за забарвлюванням
АТ8В в імуногістохімічному аналізі оброблених мишей.
Антитіла Реїег Юаміез спочатку розробляли як засоби діагностики, які можуть забезпечувати встановлення відмінностей між патологічним і нормальним тау-білком в матеріалі головного мозку з АО ї контрольним матеріалом головного мозку (Ссгеепрегу, 5.0. апа Оаміев, Р. (1990)
Ргос. Маї!. Асад. бсі. О.5.А. 87, 5827-5831). Оцінювання терапевтичної корисності антитіл РНЕЧ1 і
МС1 було продемонстровано у мишей РЗО15 і УРМІ-З (РЗО1І) (Воша|апдоиї, А. еї аї. (2011) 9.
Мешйгоспет. 118, 658-667; Спаї, Х. еї аї. (2011) 9. Віої. Снет. 286, 34457-34467; Б'Абгато, б. єї аІ. (2013) РІ о5. Опе. 8, еб2402). РНЕ1 розпізнає лінійний епітоп фосфорилованого тау-білка (р5396, рбе404), тоді як МС1 є конформаційно-залежним антитілом, яке розпізнає структурний епітоп тау-білка, для якого потрібно дві окремі частини лінійної послідовності, епітоп в межах залишків 46-202 і С-кінцевий епітоп між залишками 312-342 (дісна, С.А. евї аї. (1997) 9. Мешговсі.
Вез. 48, 128-132). Ін'єкція цих двох антитіл в дослідженнях з тривалою 12-13-тижневою імунізацією приводила до істотного зменшення патології спинного мозку і стовбура головного мозку серед інших ділянок головного мозку, що перетворювалося на ослаблення рухового дефіциту, спостережуваного у цих мишей. (С'Абгато, С. еї аї. (2013) РІ о5. Опе. 8, еб2402). іРегіап/Вгівїо! Меуег5 Зацібь розробили антитіла до тау-білка, направлені на передбачувані патологічні молекули тау-білка, що складаються з М-кінцевого фрагмента тау-білка (еТаи: залишки 1-224), які сприяли гіперактивності в культурах нейронів з індукованих плюрипотентних стволових клітин. Був розроблений портфель антитіл, але отримання характеристик було сфокусовано на антитілах ІРМОО1 їі ІРМОО2, які розпізнають М-кінцевий епітоп в межах залишків 9-18. Відповідно, ці антитіла виявляють підвищені рівні тау-білка в С5Е від пацієнтів зі встановленою стадією АЮ і РОР, які можуть бути ранньою ознакою захворювання. Ін'єкції антитіл мишам УРМІ-З (РЗО11)) іп мімо приводили до часткового усунення прогресуючих рухових дефіцитів (05 14/092539).
Еіпаг бідигаб55оп розробив першу програму, що демонструє ефективність імунотерапії на основі застосування тау-білка. Для імунізації мишей УРМІЗ (РЗО1Ї) застосовували активну вакцину, що складається з пептиду тау-білка 379-408 Іре396, ре404| разом з ад'ювантом Адіи-
Рпо5. У цьому дослідженні спостерігали виражене зменшення патології тау-білюка у мишей,
Зо оброблених вакциною, в порівнянні з контрольними тваринами. Також виявляли ослаблення рухового фенотипу, пов'язаного з таупатією. Його ефективність підтверджували в іншій мишачій моделі (піаш/РБІ1), що функціонує без дії мутантного тау-білка (Воша|апдоці, А. еї аї. (2011) ААІС 2011 (7, ізвзце 4, Бирріетепі едп) р. 5480-5431; Сопоадоп, Е.Е. еї аї. (2013) 9. Віої. Снет. 288, 35452-35465; СИ, у. єї а. (2013) 9. Віої. Спет. 288, 33081-33095).
У Ргоїпепа оцінили три антитіла до тау-білка у трансгенних по тау-білку мишей КЗ691 (КЗ) і в мишачій моделі РЗО11Ї.. Антитіла з різними властивостями відбирали для оцінювання іп мімо. Два антитіла до рб404 з різними ізотипами (ІдС1/К і |Ід2а/К) або загальне (панспецифічне) антитіло до тау-білка (дс1/К) ін'єктгували в рамках парадигми тривалого дослідження. Мишей КЗ691І обробляли шляхом щотижневих ін'єкцій протягом 21 тижня, починаючи з віку З тижнів, а мишей
РЗО1Ї. обробляли протягом 7 місяців шляхом щотижневих ін'єкцій, починаючи з віку 4 місяців. У мишей КЗ, оброблених антитілом ІдбсСга/к до рза404, спостерігали зменшення кількості позитивних по тау-білюу нейрофібрилярних включень. Обидва антитіла до рб404 були здатні зменшувати рівні ре422-позитивного тау-білка, тоді як у мишей, оброблених панспецифічним антитілом до тау-білка, зменшення не спостерігалося. Ці дослідження дозволяють припустити, що: 1) очищення від тау-білюка може залежати від ізотипу, і 2) може бути важливою цілеспрямована дія на молекули тау-білка, що мають відношення до захворювання, оскільки загальне антитіло до тау-білка було не здатне зменшувати рівні гіперфосфорилованого тау- білка (РСТ/О52014/025044).
Автори цього винаходу несподівано виявили антитіла, специфічні до фосфорилованого серинового залишку 396 тау-білка (р5396); це контрастує з антитілами з попереднього рівня техніки, які розпізнають головним чином тау-білки, фосфориловані як по залишку 396, так і по залишку 404, фосфориловані тільки по залишку 404 або по іншим залишкам тау-білка.
Автори цього винаходу розробили антитіла, які додатково характеризуються значною специфічністю і селективністю стосовно патологічного людського тау-білка. Існує необхідність в антитілах, що характеризуються високим ступенем селективності і специфічності стосовно патогенного тау-білка. Антитіла за цим винаходом демонструють набагато вищий ступінь специфічності і селективності стосовно патологічного людського тау-білка в порівнянні з непатологічним тау-білком, ніж антитіла з М/О 2013/050567 (див. фігуру 1 з УМО 2013/050567).
Утворення антитіл з МО 2012/045882, які, як повідомлялося, характеризуються специфічним 60 зв'язуванням, викликалося у відповідь на амінокислотні послідовності з 6-9 залишками з амінокислот 393-401, 396-401, 394-400 і 393-400 тау-білка. Це контрастує з антитілами за цим винаходом, утворення яких відбувається у відповідь на патогенний гіперфосфорилований тау- білок, що містить довшу амінокислотну послідовність, описану в даному описі.
Як показано в прикладах, порівняння з п'ятьма опублікованими антитілами до тау-білка:
НАСІ-286 (описаним в УУО 2013151762); ІРМО02 (описаним в УМО 2014028777); НУв8в.5 (описаним в МО 2014008404); моноклональним антитілом 2.10.3 до тау-білка рб5422 (описаним в 58609097); РНЕ1З3 (комерційно доступним антитілом (наприклад, Зідта-Аіагісн), рекомендованим для виявлення тау-білка, фосфорилованого по 5ег 396, мишачого, щурячого і людського походження і обговорюваним запкКкагапагауапап (РГОБОМЕ, 0О1:10.1371ЛоигпаІ.ропе.0125614 Мау 1, 2015 ї Оїмоз (Віоспетівзігу 1997, 36, 8114-8124); а також антитілом 4Е4 (описаним в 58940272, як таке, що зв'язується з М339, Е342, 0387, ЕЗ391 і К395) показало, що антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом проявляють вищий ступінь специфічності і селективності стосовно патологічного людського тау-білка, ніж будь-які з порівнюваних антитіл.
Додатково, антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом демонструють багато переважних ознак, таких як здатність розрізняти патологічний і непатологічний людський тау-білки і, зокрема, до зв'язування з тау-білюом, що асоціюється з альцгеймеровською (АБ) патологією. У електрофізіологічних дослідженнях антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом були додатково здатні усувати зменшені парне полегшення і мимовільний мініатюрний збуджувальний синаптичний струм (птЕРЗС).
Суть винаходу
Цей винахід відноситься до моноклональних антитіл і їх епітопзв'язувальних фрагментів, здатних специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком серином-396 людського тау- білка (ізоформи 2М4К) (З5ЕО ІО МО: 33), і до тих антитіл, які були отримані за допомогою нового способу, що забезпечує таке специфічне виділення і добування. Антитіла додатково характеризуються своєю здатністю розрізняти фосфориловані залишки 396 і 404, так що вони практично не зв'язуються з фосфорилованим залишком 404.
Без обмеження будь-якою конкретною теорією дані авторів цього винаходу демонструють, що розрізняльна здатність і селективність антитіл за цим винаходом стосовно людського тау-
Зо білка, фосфорилованого по залишку 396, у присутності тау-білка, фосфорилованого по залишку 404, але не по 396, є значущими з погляду патологічної і терапевтичної перспективи. Антитіла за цим винаходом є селективними стосовно патологічного тау-білюа у присутності непатологічного, але при цьому фосфорилованого, тау-білка. Антитіла за цим винаходом здатні викликати виснаження клубків тау-білка з патологічного тау-білка у присутності нормального тау-білка. Без обмеження будь-якою конкретною теорією вважають, що виснаження клубків тау- білка, що містять тау-білок, який був фосфорилований в положенні 396 тау-білка, попереджає затравлювальну дію патологічного тау-білка з утворенням клубків тау-білка. Відповідно, один аспект цього винаходу відноситься до антитіла, здатного селективно зв'язуватися з фосфорилованим в положенні 396 тау-білюком навіть в тих випадках, коли такі молекули знаходяться у присутності тау-білка, який був фосфорилований в положенні 404 тау-білка.
Пов'язаний аспект цього винаходу відноситься до антитіла, здатного селективно зв'язуватися з фосфорилованим в положенні 396 тау-білюком навіть в тих випадках, коли такі молекули знаходяться у присутності непатогенного тау-білюка. Як визначено додатково, цей винахід відноситься до антитіла, селективного стосовно патологічного тау-білка, при цьому вказаний патологічний тау-білок є гіперфосфорилованим тау-білюом, що виявляється у вигляді смуги, відповідної 64 кДа (у вестерн-блот-аналізі), у трансгенних мишей, що надмірно експресують ізоформу 2М4К людського тау-білка.
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло до тау-білка, що задовольняє наступним критеріям тестування: Її) антитіло не зв'язується з нефосфорилованим тау-білком; ії) антитіло не зв'язується з тау-білююом, фосфорилованим в 404 і не фосфорилованим в 396; іїї) антитіло зв'язується з тау-білком, фосфорилованим в 396; і ім) антитіло зв'язується з тау-білком, фосфорилованим як в 396, так і в 404. Автори цього винаходу виявили, що зв'язування відповідно до критеріїв тестування ії) і ім) має один і той же порядок величини, і припустили, що фосфорилування в положенні 404 не перешкоджає процесу зв'язування, так само як і не підсилює його. Автори цього винаходу додатково виявили, що, в протилежність критерію тестування ії), зв'язування з тау-білююм, який не є фосфорилованим в 396, але є фосфорилованим в 404, не викликає виснаження клубків або очищення від патологічного тау- білка в тестових моделях.
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло до тау-білка, яке при застосуванні з бо імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей г/Т94510 специфічно зменшує смуги гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 і 70 кДа щонайменше на 90 95, зменшуючи при цьому смугу тау-білка розміром 55 кДа не більше, ніж на 10 95. Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло до тау-білка, яке специфічно зменшує смуги гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 і 70 кДа щонайменше на 90 95, зменшуючи при цьому смугу тау-білка розміром 55 кДа не більше, ніж на 10 95; або яке при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами головного мозку людей з АЮ має здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білка щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау- білка більше, ніж на 10 95.
Інший аспект цього винаходу направлений на спосіб лікування пацієнта з таупатією, такою як хвороба Альцгеймера, який включає виснаження клубків або ослаблення прогресу утворення вказаних клубків, при цьому вказані клубки містять гіперфосфорилований тау-білок, при цьому вказаний спосіб включає приведення гіперфосфорилованого тау-білка в контакт з антитілом за цим винаходом таким чином, що клубки виснажуються, вміст в них гіперфосфорилованого тау- білка зменшується або прогрес утворення клубків ослабляється.
Як визначено в якості альтернативи, цей винахід відноситься до способу лікування пацієнта з таупатією, такою як хвороба Альцгеймера, при цьому вказаний спосіб включає приведення клубків в контакт з антитілом, селективним стосовно тау-білка, що має фосфорилований залишок 396, таким чином, що в клубках відбувається виснаження по гіперфосфорилованому тау-білку.
Конкретніше, цей винахід відноситься до будь-якого з чотирьох моноклональних антитіл, вибраних з групи, що включає: антитіло С5.2, де антитіло С5.2 містить: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 17; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮ МО: 18; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5ХЕО ІЮ МО: 19; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 20; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 21; і
Зо () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 22; антитіло С8.3, де антитіло С8.3 містить: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 25; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 26; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зХЕО ІЮ МО: 27; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 28; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 29; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 30; антитіло С10-2, де антитіло С10-2 містить: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 9; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 10; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність хЕО ІЮ МО: 11; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 13; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 14; і антитіло 01.2 де антитіло 01.2 містить: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 1; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 2; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 3; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 4; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність зЗЕО ІЮО МО: 5; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність 5БЕО ІЮ МО: 6.
Амінокислотні послідовності повних легкого і важкого ланцюгів антитіла С5.2, що наводиться як приклад, включаючи їх константні домени, показані, відповідно, в ХЕО ІЮ МО: 23 і ЗЕО ІЮ МО: 24 (як використовується в прикладах).
Амінокислотні послідовності повних легкого і важкого ланцюгів антитіла С8.3, що наводиться 60 як приклад, включаючи їх константні домени, показані, відповідно, в ХЕО ІЮ МО: 31 і ЗЕО ІЮ МО:
32 (як використовується в прикладах).
Амінокислотні послідовності повних легкого і важкого ланцюгів антитіла С10-2, що представляє інтерес, включаючи їх константні домени, показані, відповідно, в зХЕО ІЮ МО: 15 і
ЗБО ІЮ МО: 16 (як використовується в прикладах). Амінокислотна послідовність важкого ланцюга гуманізованого антитіла С10-2 показана в 5ЕО ІЮО МО: 35. Амінокислотна послідовність легкого ланцюга гуманізованого антитіла С10-2 показана в ЗЕО ІО МО: 36. Один аспект цього винаходу відноситься до антитіла за цим винаходом, що містить ЗЕО ІЮ МО: 35 або 5ЕО ІЮ МО: 36 або їх обидві.
Амінокислотні послідовності повних легкого і важкого ланцюгів антитіла 01.2, що наводиться як приклад, включаючи їх константні домени, показані, відповідно, в ЗЕО ІЮ МО: 7 і ЗЕО І МО: 8 (як використовується в прикладах).
У альтернативному варіанті здійснення антитіло 01.2 містить легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ МО: 34, де амінокислота в положенні З є валіном (тоді як в легкому ланцюзі, що наводиться як приклад, в ЗЕО ІЮ МО: 7 ця амінокислота є метіоніном). Цей легкий ланцюг може знаходитися в парі з важким ланцюгом, описаним вище, тобто таким, що має СОК за 5ЕО ІЮО МО: 4, 5 і 6. Наприклад, антитіло може містити легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність за 5ЕБО ІО МО: 34, разом з важким ланцюгом, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО: 8 (антитіло "01.27.
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 9; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО: 10; і/або (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 11.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить або додатково містить: (а) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 12; (б) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 13; і/або (с) СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 14.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати в лікуванні таупатій, таких як хвороба Альцгеймера (АБ), хвороба аргірофільних зерен (АСВ),
Зо прогресуючий над'ядерний параліч (РЗР), кортикобазальна дегенерація (СВО), ТВІ (травматичне пошкодження головного мозку, легке, гостре або хронічне) і хронічна травматична енцефалопатія (СТЕ).
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом додатково призначені для застосування в лікуванні психозу, зокрема, психозу, обумовленого АО, або психозу у пацієнтів з
Ар.
Стислий опис ілюстративних матеріалів
Фігура 1. Дот-блот-аналіз зв'язування з патологічним матеріалом
На фігурі 1 (панелі А-В) представлені результати дот-блот-аналізу, що відображають 500 нг фракцій 51 і РЗ (утворення фракцій 51 і РЗ розкрито в прикладі 3), отриманих з головного мозку пацієнтів з АЮ (АБ) і немолодих здорових індивідуумів (соп) або з 32-тижневих тварин одного приплоду гТ94510 і нетрансгенних тварин (м/), які зондували 1 мкг/мл 01.2 або С10-2 для оцінки виявлення патологічного тау-білка (приклад 3). На точковій діаграмі показано, що 01.2 (панель
А) або С10-2 (панель В) специфічно реагують з ураженим захворюванням матеріалом від пацієнтів з АЮ або людським тау-білюом (РЗО1Ї), що експресувався у трансгенних мишей (Т94510).
Фігура 2. Вестерн-блот-аналіз антитіл 01.2 і С10-2
На фігурі 2 (панелі А-В) представлені результати вестерн-блот-аналізу, що відображають 2 мкг фракцій 51 і РЗ, отриманих з головного мозку 32-тижневих тварин одного приплоду гТ94510 і нетрансгенних тварин (м/)), або 20 мкг фракцій 51 і РЗ, отриманих з головного мозку пацієнтів з
Ар (АБ) і немолодих здорових індивідуумів (соп), які зондували 1 мкг/мл 01.2 (панель А) або
С10-2 (панель В). Фракції 51 і РЗ, які отримували з 0,01 мг тканини, завантажували в співвідношенні 1:50 (за масою тканини). У вестерн-блот-аналізі нормальний людський тау-білок
АКОМ з мутацією РЗО1Ї. відображається при 55 кДа, а гіперфосфорилована молекула людського тау-білка 4КОМ з мутацією РЗО1Ї. відображається при 64 і 70 кДа. У фракціях РЗ з матеріалу з
Ар гіперфосфорилований тау-білок відображається при 54, 64, 69 і 74 кДа (приклад 3). На фігурі проілюстровано, що антитіла специфічно зв'язуються з гіперфосфорилованим тау-білком із зміною рухливості.
Фігура 3. Зв'язування з патологічним матеріалом РЗ на М5О
На фігурі З (панелі А-ОЮ) представлені результати зв'язування 01.2 (панель А), С5-2 (панель бо В), С10-2 (панель С) і С8-3 (панель 0) в ході ЕГІЗА на платформі Мезо Зсаїе ріхсомегу (МО) з тау-білюом, виділеним з головного мозку людей з АЮ і не ураженим захворюванням контрольним головним мозком (приклад 4). Аналогічно продемонстрованому на фігурі 1, іммобілізацію тау-білка, виділеного з ураженого захворюванням (АВ) і здорового контрольного головного мозку, на планшетах для ЕГІЗА можна застосовувати для демонстрації того, що антитіла в цьому винаході специфічно зв'язуються з патологічними молекулами тау-білка.
Підвищення концентрацій антитіла приводить до насичувального зв'язування. Кількість зв'язаного антитіла виявляють за допомогою вторинного антитіла до мишачих імуноглобулінів.
Фігура 4. Афінність до пептидів і селективність стосовно ре396 (зв'язування з пептидами)
На фігурі 4 (панелі А-ОЮ) представлені результати аналізу специфічного зв'язування С10-2 (панель А) і 01.2 (панель В) з пептидами тау-білка (386-409) зі всіма комбінаціями фосфорилування в положеннях 5396 і 5404 (приклад 5). Специфічну афінність до патологічного матеріалу людини важко оцінити, і з цієї причини автори цього винаходу використовували специфічне зв'язування з пептидами для визначення точної афінності до епітопу із застосуванням специфічних фосфорилованих і нефосфорилованих пептидів. Специфічні криві залежності доза-відповідь показані для зв'язування антитіл С10-2 (панель С) і 01.2 (панель 0) з пептидом ТОНСАБЕІМУКРОРМУУБООТРОРАНІ (5ЕБО 10 МО: 37) (реЗ396/ре404), фосфорилованим по залишках Бег396б і Бег404. Конкурентне зв'язування проводили з нефосфорилованим пептидом (МР) їі монофосфорилованими пептидами (рз396 і ре5іа404).
Додатково був включений контрольний пептид, відповідний фосфорилованому серину-262.
Конкурентне зв'язування демонструє, що у всіх випадках зв'язування досягається за допомогою фосфорилованого серинового залишку 396. Додатково, дані демонструють, що фосфорилування по залишку 404 не перешкоджає зв'язуванню антитіл з фосфосерином-396.
Фігура 5. Отримання гістологічними методами характеристик специфічних до патології антитіл
На фігурі 5, панелі А показано, що антитіла С10-2 (лівий стовпець) і 01.2 (правий стовпець) зв'язуються з молекулами ртТаий в клітинних тілах і нейропілях Т94510 (верхній ряд). У зрізах головного мозку тварин, відмінних від То, імунореактивність не виявлена (нижній ряд). На фігурі 5, панелі В показано, що антитіла С10-2 (лівий стовпець) і 01.2 (правий стовпець) зв'язуються з молекулами ртТаи в клітинних тілах і нитках нейропілю в донорному матеріалі з АО (АБ) (верхній
Зо ряд). У контрольному донорному головному мозку відсутня імунореактивність (нижній ряд) (приклад 6).
Фігура 6. Зв'язування з патологічним і непатологічним РЗ для С10-2 і еталонних антитіл
На фігурі 6 (панелі А-Е) представлені результати, що демонструють перевагу антитіла С10-2 (панель С) за цим винаходом в розпізнаванні патологічного матеріалу в порівнянні з антитілами 2-10-3 (панель А), НАСІ-286 (панель В), ІРМ 002 (панель 0) і Ну8.5 (панель Е) з попереднього рівня техніки. На фігурі показано специфічне зв'язування С10-2 з тау-білком із здорового (як контроль) і ураженого захворюванням (АБ) головного мозку людей поряд зі зв'язуванням з тау- білком від мишей Т94510 у віці 10 місяців, експресуючих людський тау-білок з мутацією РЗО1Ї.
До матеріалу тау-білка РЗ, іммобілізованого на планшетах для ЕГІ5А, додають антитіло в концентраціях, що підвищуються. Ступінь селективності щодо патологічного тау-білка визначають при повному насиченні активними молекулами. Кратність селективності для кожного з антитіл з попереднього рівня техніки показана на фігурі (приклад 7).
Фігура 7. Попередження затравлювальної дії в клітинах НЕК29З і іп міго
На фігурі 7 (панелі А-С) представлена кількісна оцінка агрегації тау-білка за допомогою аналізу СізБріо. Клітини НЕК293, трансфектовані рсОМА для введення затравки, не продемонстрували сигнал, що підтверджувало відсутність виявлення вхідного затравлювального матеріалу. Затравлювальний матеріал ММ (дикого типу) (ММ) не продемонстрував затравлювальної дії, проте, на відміну від цього, гомогенати гТ494510 (СС) характеризувалися ефективною затравлювальною дією в порівнянні з позбавленими затравки.
На цей затравлювальний ефект не впливала обробка за допомогою НЕЇ, але він частково усувався шляхом обробки антитілами до тау-білка (С10-2 з» 01.2 » ПАСІЗ6-286-АБІ1).. На графічних зображеннях (панелі А-С) представлено три незалежні набори зразків, і вони виконані у вигляді діаграми відносної агрегації тау-білка (кратності сигналу щодо фонового рівня, нормалізованого до загального білка) (приклад 8).
Фігура 8. Усунення електрофізіологічного дефіциту
На фігурі 8 показано усунення антитілами дефіцитів парного полегшення (панелі Вів) і базальної синаптичної передачі (панелі А і С) у викликаних польових потенціалах в СА1 (С10-2, панель А; 01.2, панель В), де проілюстровані викликані польові потенціали при обробці СА1 середньої тривалості за допомогою С10-2 у мишей Т94510 з і мишами ІТА як контроль. Тварин 60 обробляли двічі на тиждень дозою 15 мг/кг антитіла протягом двох тижнів (див. приклад 9). На панелі А (для С10-2) і панелі С (для 01.2) градієнт польових потенціалів (ТЕРБР) представлений на діаграмі залежно від інтенсивності стимуляції. На панелях А і С проілюстровано, що електрофізіологічна оцінка синаптичної передачі і пластичності в СА1-зоні гіпокампу у мишей "94510 (нижні 2 криві) і контрольних мишей ІТА (верхні 2 криві) у віці 4,5-5,5 місяців іп мімо показала: ї) значне погіршення базальної синаптичної передачі у мишей гТ94510 в порівнянні з
ЇТА і ії) значне зменшення парного полегшення у мишей гТ94510 в порівнянні з ІТА.
Парне полегшення - короткострокову синаптичну пластичність, в основі якої, як вважають, знаходяться пресинаптичні механізми - додатково вимірювали у мишей гТ94510 і 1їТА (панель В для С10-2 і панель Ю для 01.2). Стисло, стосовно колатералі Шеффера прикладали пару стимулів з інтервалом між стимулами (І5І), що варіюється від 25 до 1000 мс, і градієнт другого
ТЕРБР порівнювали з градієнтом першого ТЕРОР. Полегшення спостерігали при всіх ІБІ з максимальним полегшенням при І5І, що становить 50 і 75 мс. Цікаво, що у мишей гГ94510 спостерігали значно нижчі РРЕ (другі 2 стовпці) в порівнянні з мишами ІТА (перші 2 стовпці).
Фігура 9. Стислий огляд скринінгу, у загальних рисах представленого на фігурах 1-8
Індукували вироблення антитіл до дифосфорилованого пептиду
ТОНОАЕІМУКРІЗРУУБООЮТРОРЕНІ (5ЕО І МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2М4К. Гібридоми піддавали скринінгу за допомогою дот-блот-аналізу і М5О-ЕЇ І5А з іммобілізованим патологічним і непатологічним людським тау-білком (приклад 4) для виділення клонів, які були високоспецифічними до будь-якого з фосфорилованих епітопів 5396 і/або 5404 і в той же час специфічно розпізнавали гіперфосфорилований тау-білок з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера. Здатність розрізняти патологічний і непатологічний людські тау-білки в ході дот-блот-аналізу і вестерн-блот-аналізу застосовували для відбору гібридом. Відбирали 16 клонів, з яких чотири клони (01.2, С10-2, С5.2 і С8.3) проявляли надзвичайно високі здатності до зв'язування з патологічним матеріалом людини. У разі застосування специфічного протоколу імунізації і скринінгу виробляються високоспецифічні антитіла до фосфосерину-396 (ре396).
Фігура 10. Залишок рЗег396 зв'язується в центрі антигензв'язувальної ділянки тАр С5.2
Представлена кристалічна структура тАб С5.2 в комплексі з фосфорилованим пептидом 386-410 при роздільності 1,9 А. У цій структурі дозволена електронна щільність для залишків 392-398. Залишок (РіЗег396 зв'язується в центрі антигензв'язувальної ділянки тАб С5.2. У цьому
Зо структурному дослідженні тАб до тау-білка епітоп зв'язується між важким ланцюгом (справа внизу) і легкими (зліва внизу) ланцюгами.
Фігура 11. Взаємодія антитіла С5.2 з пептидом тау-білка (292-298) з фосфосерином
На фігурі 11 представлена взаємодія між антитілом С5.2 і пептидом тау-білка (292-298) з фосфосерином. Показана структура Пе(392)-МаІ(393)- Туг(394)-І уг(395)-Р-5ец(396)-Рго(397)-
МаІ(398). У основній взаємодії бере участь гідрофобна кишеня, утворювана 1 3:НЗ, І 3:87",
НІ:НІ3, Н2ОМ1, Н2г:УЗ ї у(394) пептиду тау-білка. Існує розгалужена мережа водневих зв'язків, що утворюється між сольватованим (РІЗ(396) і 13:74, НІ:К10, НІ:Т11, НЗ:Р1, НЗ:Т3. У використовуваній номенклатурі перша буква (наприклад, "І" в І 3:Н3З) означає, чи відноситься залишок СОК, що бере участь, до СОМ легкого ланцюга або СОК важкого ланцюга, перша цифра означає, яка СОК такого ланцюга бере участь (наприклад, "13" означає СОКЗ легкого ланцюга), решта позначень (наприклад, "НЗ" в І13:НЗ3) означають назву і положення амінокислоти, що бере участь (наприклад, "НЗ" означає гістидин в третьому положенні залишку
СОК); таким чином, "І 3:НУЗ" означає гістидиновий залишок в третьому положенні СОКЗ легкого ланцюга. Існують утворення сильних водневих зв'язків і взаємодії зарядів/полярні взаємодії між
У(394) бічного ланцюга і остовом, при цьому фосфонат РІЗ396 утворює вигин в пептидному остові. (У 3:28 являє собою С-кінцевий залишок каркасної ділянки, фланкуючий СОК І 3.
Послідовності СО С5.2 являють собою:
СОВ1І: ОАБООТБІМІ М (ЗЕО ІО МО: 17)
СОВІ2: САБЗМІ ЕО (ЗЕОІО МО: 18)
СОРІЗ:ТОНТМІ Р (ЗЕО ІО МО: 19)
СОВ НІ: КАЗаМТЕТОВТІН (ЗЕО ІЮ МО: 20)
Сов нг: МІУИРОВОЗТКУМОМЕКИ (ЗЕО ІЮ МО: 21) сов нЗ: ВатмМмру (ЗЕО ІО МО: 22)
Фігура 12. Виснаження по тау-білку для аналізу затравлювальної дії (НЕК293)
На фігурі 12 (панелі А-В) показано імуновиснаження гомогенатів головного мозку гТ94510 за допомогою мишачого С10-2 (тС10-2) і гуманізованого С10-2 (НС10-2). Виявлення у виснажених гомогенатах в ході вестерн-блотингу проводили за допомогою Е1 (загальний тау-білок; панель
А; нижня частина) і С10-2 (тау-білок р5396; панель А; верхня частина), і як тС10-2, так і пС10-2 здійснювали ефективне виснаження по гіперфосфорилованому тау-білку (верхні смуги на картині блотингу для Ен і всі смуги на картині блотингу для С10-2). Виснажені гомогенати також аналізували щодо виснаження по агрегованому тау-білюу за допомогою аналізу Сівбіо. На панелі В показана зміна кількості агрегованого тау-білка в зразках. У дослідженнях виснаження з використанням тс10-2 і пС10-2 агрегати тау-білка були видалені, відповідно, на 99 і 99,5 95 (панель В).
Фігура 13. Аналіз затравлювальної дії (НЕК293) з виснаженим матеріалом
На панелях А-С показані виснажені гомогенати, вживані для здійснення затравлювальної дії
РЗО1І-пТаим в клітинах НЕК293. Гомогенати від контрольних тварин (МЛМ) не демонстрували затравлювальної дії, тоді як гомогенати г/94510 (СС) характеризувалися ефективною затравлювальною дією, згідно з вимірюванням в ході аналізу агрегації Сіб5Біо в загальних клітинних лізатах або в ході фракціонування клітин НЕК293 в 1 95 Тиійоп-Х (за кількісною оцінкою нерозчинного гіперфосфорилованого 01.2 і тау-білка (панель А, верхня і нижня частини)).
Виснаження за допомогою антитіл НЕЇ і НЕЇ не впливало на затравлювальну дію, тоді як виснаження за допомогою тС10-2 і пС10-2 попереджало агрегацію тау-білка на 88 95 ї 96 95 (панель С), а нерозчинного тау-білка на 97 9б5 і 100 95 (панель В), відповідно.
Фігура 14. Імуновиснажений матеріал гГд4510 (вживаний для досліджень затравлювальної дії іп мімо)
На панелях А-С продемонстрований вестерн-блот-аналіз (панель А; верхня, нижня частини) імуновиснажених екстрактів головного мозку гТ94510. С10-2 і 01.2 специфічно зменшують смугу гіперфосфорилованого людського білка розміром 64 кДа на 9095 і не діють на тау-білок розміром 55 кДа. Таи5, комерційне антитіло до загального тау-білка, на відміну від цього, зменшує смугу нормального тау-білка розміром 55 кДа на 74 95 і не діє на людський тау-білок розміром 64 кДа (панелі В-О).
Фігура 15. Імуновиснажений матеріал з АО (вживаний для досліджень затравлювальної дії іп мімо)
На фігурі 15 (панелі А-С) зображений вестерн-блот-аналіз (панель А) імуновиснажених екстрактів головного мозку з хворобою Альцгеймера. Імуновиснаження за допомогою С10-2 і 01.2 не приводить до зменшення рівнів загального тау-білка більше, ніж на 10 95, але обумовлює специфічне зниження рівня гіперфосфорилованого тау-білка (90 95 зменшення) (панелі В-С).
Зо Фігура 16 (панель А). Патологія тау-білка в гіпокампах у мишей гТ94510 з затравкою імуновиснаженим матеріалом гГ94510
На фігурі 16 (панель А) проілюстрована кількісна оцінка патології тау-білка в головному мозку гТ94510 з затравкою гомогенатами головного мозку гТ94510 або з АО. Перед введенням затравки рівень гіперфосфорилованого тау-білка, але не нормального тау-білка, був зменшений в гомогенатах на 90-9595 шляхом застосування С10-2 або 01.2. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка.
Фігура 16 (панель В). Патологія клубків в гіпокампах мишей гТ94510 з затравкою імуновиснаженим матеріалом з АЮ
На фігурі 16 (панель В) проілюстрована кількісна оцінка патології тау-білка в головному мозку гТ94510 з затравкою гомогенатами головного мозку гТ94510 (А) або з АЮ (В). Перед введенням затравки рівень гіперфосфорилованого тау-білка, але не нормального тау-білка, був зменшений в гомогенатах на 90-95 95 шляхом застосування С10-2 або 01.2. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка.
Фігура 17. Патологія клубків в гіпокампах мишей гТ94510 з затравкою, оброблених 01.2
На фігурі 17 зображена кількісна оцінка нейронів, що містять клубки, в гіпокампах мишей гтд4510 з затравкою. Дана патологія збільшується за часом (Ід2-1 місяць; ІдДа-2 місяці; Іда-З місяці). Проте після обробки мишей за допомогою 01.2 патологія значно зменшувалася через 1, 2 і З місяці після введення затравки. (01.2-1 місяць; 01.2-2 місяці; 01.2-3 місяці).
Фігура 18. Виснаження по тау-білку для аналізу затравлювальної дії (НЕК293)
На панелі А показано імуновиснаження гомогенатів головного мозку гТ94510 за допомогою мишачого С10-2 (тС10-2) і гуманізованого С10-2 (йС10-2). Виявлення у виснажених гомогенатах в ході вестерн-блотингу проводили за допомогою Еї1 (загальний тау-білок) і С10-2 (тау-білок рБ396), і як тС10-2, так і йС10-2 здійснювали ефективне виснаження по гіперфосфорилованому тау-білку (верхні смуги на картині блотингу для ЕЇ і всі смуги на картині блотингу для С10-2). Виснажені гомогенати аналізували стосовно виснаження по агрегованому тау-білюу за допомогою аналізу Сібріо. На панелі В показано виснаження з використанням тС10-2 і пС10-2, в ході якого агрегати тау-білка були видалені, відповідно, на 99 і 99,5 9. (510)
Фігура 19. Аналіз затравлювальної дії (НЕК293) з виснаженим матеріалом
На панелі А показано фракціонування тау-білка (вестерн-блотинг нерозчинної фракції). На панелі В показана кількісна оцінка вестерн-блотингу. На панелі С показаний агрегований тау- білок в клітинних лізатах. Виснажені гомогенати застосовували для здійснення затравлювальної дії РЗО1І -яТаи в клітинах НЕК293. Гомогенати від контрольних тварин (М//Л/) не демонстрували затравлювальної дії, тоді як гомогенати г/94510 (СС) характеризувалися ефективною затравлювальною дією, згідно з вимірюванням в ході аналізу агрегації Сібріо в загальних клітинних лізатах або в ході фракціонування клітин НЕК293 в 1 95 Тиійоп-Х (за кількісною оцінкою нерозчинного гіперфосфорилованого 01.2. тау-білка). Виснаження за допомогою антитіл НЕЇ і
АНЕГ. не впливало на затравлювальну дію, тоді як виснаження за допомогою тсС10-2 і пС10-2 (панель С) попереджало агрегацію тау-білка на 88 95 і 96 95, а нерозчинного тау-білка на 97 95 і 100 95, відповідно (панель В).
Фігура 20. Імуноселективність С10-2 і 01.2 щодо гіперфосфорилованого тау-білка в порівнянні з нормальним тау-білком
Імуновиснажений матеріал гТд4510 застосовували для досліджень затравлювальної дії іп мімо. На панелі А показаний вестерн-блот-аналіз імуновиснажених екстрактів головного мозку гТ94510. На панелі В показано, що С10-2 і 01.2 специфічно зменшують смугу гіперфосфорилованого білка розміром 64 кДа, фосфорилованого по серину-396, в порівнянні із смугою тау-білка розміром 55 кДа, який не містить значну кількість р396. На відміну від цього,
Таи5, комерційне антитіло до загального тау-білюка, зменшує смугу нормального тау-білка розміром 55 кДа і є неефективним в зв'язуванні з тау-білком розміром 64 кДа.
Фігура 21. Імуноселективність С10-2 і 01.2 щодо гіперфосфорилованого тау-білка в порівнянні з нормальним тау-білком
Імуновиснажений матеріал з АО застосовували для досліджень затравлювальної дії іп мімо.
На панелі А показаний вестерн-блот-аналіз імуновиснажених екстрактів головного мозку з хворобою Альцгеймера. Імуновиснаження за допомогою тС10-2 і 01.2 не приводить до зменшення рівнів загального тау-білка більше, ніж на 1095 (панель В), але обумовлює специфічне зниження рівня гіперфосфорилованого тау-білка (90 95 зменшення) (панель С).
Фігура 22. Патологія тау-білка в гіпокампах мишей гТ94510
Зо На панелі А показана патологія тау-білка в гіпокампах у мишей гТ94510 з затравкою імуновиснаженим матеріалом гТ94510. На панелі В показана патологія клубків в гіпокампах у мишей г/94510 з затравкою імуновиснаженим матеріалом з АЮ. Показана кількісна оцінка патології тау-білка в головному мозку гТ94510 з затравкою гомогенатами головного мозку гТ94510 (А) або з АО (В). Перед введенням затравки рівень гіперфосфорилованого тау-білка, але не нормального тау-білка, був зменшений в гомогенатах на 90-95 95 шляхом застосування антитіл С10-2 або 01.2. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка.
Фігура 23. Патологія клубків в гіпокампах мишей гТ94510 з затравкою, оброблених 01.2
Показана кількісна оцінка нейронів, що містять клубки, в гіпокампах мишей гТ94510 з затравкою. На фігурі показано, що патологія збільшується за часом, і при обробці мишей за допомогою 01.2 патологія значно понижена через 2 і З місяці після введення затравки.
Фігура 24. Вестерн-блот-аналіз імуновиснажених екстрактів від людей з АЮ
На фігурі проілюстровано, що гуманізований варіант С10-2 (пС10-2), а також тС10-2 відрізняються від антитіла 2.10.3 (Р-5422) тим, що, хоча рівень загального тау-білка, що залишається, неїстотно відрізняється (ліва панель) від рівня у випадку з 2.10.3, С10-2 (нС10-2), а також тС10-2 видаляють більшу кількість гіперфосфорилованого тау-білка, присутнього в екстрактах головного мозку з хворобою Альцгеймера, за допомогою способів імуновиснаження.
Це підтверджується на фігурі 25 шляхом кількісної оцінки.
Фігура 25. Кількісна оцінка агрегованого тау-білка після імуновиснаження
Антитіла ПС10-2 ї тС10-2 відрізняються від антитіла 2.10.3 своєю здатністю до видалення більшої кількості агрегованого тау-білка, присутнього в екстрактах головного мозку з хворобою
Альцгеймера, за допомогою способів імуновиснаження.
Фігура 26. Загальний тау-білок, що залишається після імуновиснаження
Показана кількісна оцінка сигналів вестерн-блотингу після імуновиснаження екстрактів матеріалу з хворобою Альцгеймера за допомогою різних кількостей гуманізованого С10-2 (А) і антитіла 2.10.3 (Ф). На фігурі 26 показана кількісна оцінка сигналу загального тау-білка із застосуванням Таих (всі ізоформи тау-білка були включені в аналіз). Обидва антитіла видаляли невелику частку тау-білка з препарату головного мозку суб'єкта з хворобою Альцгеймера. 2.10.3, сконструйоване таким чином, що воно має специфічність до тау-білка Р-5422, видаляє 60 до 24 95 від загальної кількості тау-білка, а С10-2 видаляє до 15 95 загального тау-білка (див.
фігуру 26).
Фігура 27. Загальний тау-білок, що залишається після імуновиснаження по гіперфосфорилованому тау-білку
На фігурі 27 проілюстрована кількісна оцінка гіперфосфорилованого тау-білка, фосфорилованого по серину-422 (всі смуги і високомолекулярний шмер були включені в аналіз). Як 2.10.3 (А), так ії С10-2 (Ф) видаляють більше 90 95 тау-білка, фосфорилованого по серину-422. Проте кількість антитіла, необхідна для видалення 50 95 тау-білка, розрізняється: у випадку з антитілом 2.10.3 необхідно 0,42 мкг антитіла, тоді як у випадку з С10-2 для того ж ефекту необхідно 0,27 мкг.
Фігура 28. Загальний тау-білок що залишається після імуновиснаження по гіперфосфорилованому тау-білку
Показана кількісна оцінка гіперфосфорилованого тау-білка, фосфорилованого по серину- 396 (всі смуги і високомолекулярний шмер були включені в аналіз). С10-2 (Ф) ефективно видаляє тау-білок,; фосфорилований по серину-396 (максимальний ефект: 88 95, і половина цього ефекту досягається при застосуванні 0,30 мкг антитіла). 2.10.3 (А) видаляє меншу частину тау-білка, фосфорилованого по серину-396 (максимальний ефект: 60 95, і половина цього ефекту досягається при застосуванні 0,63 мкг антитіла). Це указує на те, що весь тау- білок, фосфорилований по серину-422, також є фосфорилованим по серину-396, але існує частина гіперфосфорилованого тау-білка, фосфорилованого по серину-396, в якому відсутній фосфорилований серин в положенні 422.
Фігура 29. Загальний тау-білок, що залишається після імуновиснаження по гіперфосфорилованому тау-білку
Показана кількісна оцінка гіперфосфорилованого тау-білка, фосфорилованого по серину- 199/202 (всі смуги і високомолекулярний шмер були включені в аналіз). Значна частина тау- білка, що видаляється С10-2 (Ф), також є фосфорилованою по серину-199/202, оскільки 69 95 тау-білка, що має таке фосфорилування, підпадає під вплив імуновиснаження (50 95 ефект при застосуванні 0,34 мкг антитіла). Імуновиснаження за допомогою 2.10.3 (А) не давало сигмоїдальну криву залежності доза-відповідь для тау-білка Р-5199/202, хоча при підвищенні кількості антитіла спостерігається зниження інтенсивності сигналу (максимальне зменшення
Зо 52 965 при застосуванні максимальної кількості антитіла (5 мкг). Ці дані указують на те, що антитіло С10-2, що націлюється на фосфорилований серин-396, зв'язується з більшим пулом гіперфосфорилованих тау-білків, ніж антитіло 2.10.3, що націлюється на фосфорилований серин в положенні 422.
Фігура 30. Інгібування ітО1.2 і тС10-2 захоплення антигенного тау-білюка в планшетах, покритих тС10-2
Це відбувалося в рамках рідиннофазного ЕГІЗА, де суміш препарату РЗ гТ94510 їі різних кількостей антитіл С10-2 або 01.2 додавали на планшети, покриті С10-2. Чим більше антитіл зв'язувалися з тау-білююм РЗ в розчині, тим менше доступних епітопів тау-білка могли зв'язуватися з планшетами. Величину зв'язування тау-білка з планшетами визначають за допомогою антитіла до людського тау-білка, міченого ЗЙОГРО-ТАС С10-2 (п) ї 01.2 (0) характеризуються різним зв'язуванням з тау-білюом в розчині, при цьому зв'язування з С10-2 може повністю перевершувати зв'язування з планшетами (1050-20 нМ). В той же час 01.2 демонструє дуже низький рівень зв'язування з тау-білком в розчині.
Фігура 31. Інгібування РНЕ1З3 і тС10-2 захоплення антигенного тау-білка в планшетах, покритих тС10-2
В рамках рідиннофазного ЕГІЗА суміш препарату РЗ з матеріалу з АО і різних кількостей антитіл С10-2 і РНЕ13 додавали на планшети, покриті С10-2. Чим більше антитіл зв'язувалися з тау-білююом РЗ в розчині, тим менше доступних епітопів тау-білка могли зв'язуватися з планшетами. Величину зв'язування тау-білка з планшетами визначають за допомогою антитіла до людського тау-білка, міченого ЗІ РО-ТАС С10-2 і РНЕ1З3 характеризуються різним зв'язуванням з тау-білююм в розчині, при цьому зв'язування з С10-2 може повністю перевершувати зв'язування з планшетами (ІС50-3 нМ), тоді як у випадку з РНЕ1ТЗ це не відбувається.
Фігура 32. Як тС10-2, так і РНЕ-13 зв'язуються з рТГаи 386-408 (ре396/різ404) дозозалежним чином
На фігурі 32 показано, що тС10-2 і РНЕ-13 в рівній мірі добре зв'язуються в планшетах
М5О, покритих 100 нг/мл рТаи 386-408 (рез396/р5404). Антитіла в концентраціях, що підвищуються (вказаних по осі х), інкубували в лунках протягом 2 годин з подальшим промиванням і виявленням зв'язаних антитіл за допомогою антитіл до людського Ід, мічених бо ЗМ РО-ТАС. Це указує на те, що отримане РНЕ-13, вживане в подальших прикладах, є активним.
Фігура 33. Порівняння зв'язування тО1.2 ії тС10-2 з АО-РЗ
На фігурі 33 показано, що тО1.2 і тС10-2 в рівній мірі добре зв'язуються в планшетах М5О, покритих 1 мкг/мл АЮ-РЗ. Антитіла в концентраціях, що підвищуються (вказаних по осі х), інкубували в присутності і у відсутності 10 мкМ пептиду рТаим 386-408 (рз396/рз404) протягом 1 години при кімнатній температурі з подальшою інкубацією в лунках протягом 2 годин перед виявленням зв'язаних антитіл за допомогою антитіл до людського ЇдДО, мічених 5БЙЇ РО-ТАа.
Значення ІС50 складали 320 нМ і 11 нМ для захоплення АЮБ-РЗ і АО-51/(р). На відміну від цього, тО1.2 продемонструвало значно слабкіше інгібування захоплення антигенного тау-білка при значеннях ІС50О, що становлять 589 і 503 нМ, що дозволяє припустити значно нижчу афінність зв'язування з розчинними антигенами.
Аналіз виконували в дві стадії. А: 1 мкг/мл АО-РЗ і 20 нг/мл АЮ-51(р), відповідно, інкубували з тО1.2 ії тС10-2 в концентраціях, що підвищуються, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі для забезпечення підвищення зв'язування антитіла і антигену (зайнятості). В: зразки інкубували на планшетах М5О, покритих АО-РЗ (1 мкг/мл), протягом 2 годин з подальшим промиванням і виявленням захоплених антигенних тау-білків за допомогою антитіл до загального тау-білка, мічених БОЇ РО-ТАО.
Фігура 34. тС10-2, але не РНЕ-13, ефективно зв'язується з антигенами АЮО-РЗ, представленими на твердій фазі
Високоспецифічне зв'язування тС10-2, але не РНЕ-13: на фігурі 34 показано, що тС10-2 ефективно зв'язується з планшетами М5О, покритими антигенами АО-РЗ (1 мкг/мл). Для порівняння, низька активність зв'язування РНЕ-13 указує на нижчу афінність до фізіологічних антигенів рТай. Додатково, РНЕ-13 демонструвало значно вищий ступінь неспецифічного зв'язування в порівнянні з тС10-2 (див. таблицю 6). Антитіла в концентраціях, що підвищуються (вказаних по осі х), інкубували протягом 2 годин перед виявленням зв'язаних антитіл за допомогою антитіл до людського дО, мічених ЗІ РО-ТАС. У сигнал зв'язування вносили поправку на активність неспецифічного зв'язування (визначену як сигнали, виміряні у присутності 10 мкМ пептиду рТаи 386-408 (рз396/рз404). Значення ІС50О складало З нМ для захоплення тС10-2 АО-РЗ. На відміну від цього, РНЕ-13 практично не продемонструвало
Зо інгібування.
Аналіз виконували в дві стадії. А: 1 мкг/мл АО-РЗ інкубували з тС10-2 і РНЕ-13 в концентраціях, що підвищуються, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі для забезпечення підвищення зв'язування антитіла і антигену (зайнятості). В: зразки інкубували на планшетах М50О, покритих АО-РЗ (1 мкг/мл), протягом 2 годин з подальшим промиванням і виявленням захоплених антигенних тау-білків за допомогою антитіл до загального тау-білка, мічених ЗОЇ РО-ТАО.
Послідовності, включені шляхом посилання
ЗЕОІЮО МО: 1 СОН легкого ланцюга 01.2
ЗЕОІЮ МО: 2 СОг2 легкого ланцюга 01.2
ЗЕОІЮ МО: З СОЗ легкого ланцюга 01.2
ЗЕО ІЮ МО: 4 СОМ важкого ланцюга 01.2
ЗЕОІЮО МО: 5 СОР2 важкого ланцюга 01.2
ЗЕОІЮ МО: 6 СОЕЗ важкого ланцюга 01.2
ЗЕО ІЮ МО: 7 легкий ланцюг 01.2
ЗЕО ІЮ МО: 8 важкий ланцюг 01.2
ЗЕОІЮО МО: 9 СОН легкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 10 СОг2 легкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮО МО: 11 СОгЗ легкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 12 СОМ важкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 13 СОР2 важкого ланцюга С10-2
ЗЕО І МО: 14 СОЕЗ важкого ланцюга С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 15 легкий ланцюг С10-2
ЗЕОІЮ МО: 16 важкий ланцюг С10-2
ЗЕО ІЮО МО: 17 СОМ легкого ланцюга С5.2
ЗЕО І МО: 18 СОг2 легкого ланцюга С5.2
ЗЕО ІЮ МО: 19 СОЗ легкого ланцюга С5.2
ЗЕО ІЮ МО: 20 СОМ важкого ланцюга С5.2
ЗЕО І МО: 21 СОР2 важкого ланцюга С5.2
ЗЕО ІЮ МО: 22 СОЕЗ важкого ланцюга С5.2
ЗЕО ІЮ МО: 23 легкий ланцюг С5.2
ЗЕО ІЮ МО: 24 важкий ланцюг С5.2
ЗЕО ІЮ МО: 25 СОН легкого ланцюга С8.3
ЗЕО ІЮ МО: 26 СОг2 легкого ланцюга С8.3
ЗЕО І МО: 27 СОЗ легкого ланцюга С8.3
ЗЕО ІЮ МО: 28 СОМ важкого ланцюга С8.3
ЗЕО ІЮ МО: 29 СОР2 важкого ланцюга С8.3
ЗЕО І МО: 30 СОЕЗ важкого ланцюга С8.3
ЗЕО І МО: 31 легкий ланцюг С8.3
ЗЕО ІЮ МО: 32 важкий ланцюг С8.3
ЗЕО ІЮО МО: 33 людський тау-білок
ЗЕО І МО: 34 легкий ланцюг 01.27
ЗЕО ІЮ МО: 35 важкий ланцюг гуманізованого С10-2
ЗЕО ІЮ МО: 36 легкий ланцюг гуманізованого С10-2
ЗЕО І МО: 37 залишки 386-408 тау-білка (ре396, ре404)
Докладний опис винаходу
Використовуваний в даному описі термін "тау" є синонімом "тау-білка" і відноситься до будь- якої з ізоформ тау-білка (ідентифікованих, наприклад, в ОпіРгої як Р10О636б, 1-9). Нумерація амінокислот тау-білка, використовувана в даному описі, приведена стосовно ізоформи 2 (ЗЕО
ІО МО: 33), показаної нижче, при цьому метіонін (М) є амінокислотним залишком 1.
ЗЕО І МО: 33:
МАЕРВОЕРЕМ МЕОНАСТМОаї совКроаамМтТ МНОрОБаОТО Асі КЕРІ ОТ
РТЕРОБЕЕРО 5ЗЕТ5БАКЗТР ТАЕОМТАРІ М ВЕСАРИЕИКОАА АОРНТЕЇІРЕС
ТТАЕЕАСІСО ТРОЕСЕАДОа НУТОАВНМУ5К 5КОСТавБООК КАКаСАраТктк
ІАТРАБААРР ФОКОИОАМАТЕА ІРАКТРРАРК ТРРУОЗОЕРРК 5008555 Р а5РатТРОаБНА5 ВТРОЇ РТРРТ ВЕРККМАМУВ ТРРКОРОЗАК ЗВГ ОТАРУРМ
РОЇ КМУКЗКІ СЗТЕМІ КНОР саезакмМоОпМК КІ рі зММОо5К сСавзкоОомМІКНМУ рРасавмої!мМ КРУВІ 5КУТ5 КСОаБІ СМІНН КРОССОМЕМК ЗЕКІ ОРКОВМУ
ОБКІСОІ ОМІ ТНУРАСИМКК ІЕТНКІСТЕВЕ МАКАКТОНОА ЕІМУКОРУМУЗ
СОТ5РАНІ БМ М55ТО510ММ О5РОЇ АТІ АО ЕМБАБІ АКОСІІ.
Цей винахід відноситься до антитіл і їх епітопзв'язувальних фрагментів, які здатні специфічно зв'язуватися з тау-білком, і зокрема, з людським тау-білком, і в одному варіанті здійснення проявляють здатність до специфічного зв'язування з фосфорилованим залишком 5396 (ре396) людського тау-білка. Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом додатково характеризуються тим, що вони не здатні або практично не здатні специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404 (ре404) в людському тау-білку, наприклад, в умовах обмеженої кількості антитіл або ненасичувальних умовах. Додатково, фосфорилування в рбе404 не перешкоджає специфічному зв'язуванню з ре396. Використовувані в даному описі позначення "р" і "РІЗ" означають фосфосериновий амінокислотний залишок. Як використовується в даному описі, антитіло "практично" не здатне зв'язуватися з епітопом, якщо стосовно іншого епітопу таке зв'язування складає менше 20 95, менше 10 95, менше 5 95, менше 2 У і переважніше менше 1 95 від зв'язування, спостережуваного для такого іншого епітопу.
Термін "антитіло" (АБ) в контексті цього винаходу відноситься до молекули імуноглобуліну або, згідно з деякими варіантам здійснення цього винаходу, до фрагмента молекули
Зо імуноглобуліну, які мають здатність до специфічного зв'язування з епітопом молекули
Сантигену"). Антитіла, що зустрічаються в природі, в типовому випадку є тетрамерами, які зазвичай складаються щонайменше з двох важких (Н) ланцюгів і щонайменше двох легких (І) ланцюгів. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельного домену важкого ланцюга (скорочено званого в даному описі МН) і константного домену важкого ланцюга, що зазвичай складається з трьох доменів (СНІ, СН2 і СНЗ). Важкі ланцюги можуть відноситися до будь-якого ізотипу, включаючи Ідс (підтипи ІДдс1, Ідс2, доз і 454). Кожен легкий ланцюг складається з варіабельного домену легкого ланцюга (скорочено званого в даному описі МІ) ї константного домену легкого ланцюга (СІ). Легкі ланцюги включають каппа-ланцюги і лямбда-ланцюги.
Варіабельний домен важкого і легкого ланцюгів в типовому випадку відповідає за розпізнавання антигену, а константний домен важкого і легкого ланцюгів може опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами реципієнта, в тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (С1д) класичного шляху активації системи комплементу. МН- і Мі-домени можуть додатково підрозділятися на гіперваріабельні домени, звані "ділянками, що визначають комплементарність", які чергуються з доменами з консервативнішою послідовністю та які називаються "каркасними ділянками" (ЕК).
Кожен МН і МІ. складається з трьох СОК-доменів і чотирьох ЕК-доменів, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в наступному порядку: ЕК1-СО81-ЕН2-СОВ2-ЕНЗ-СОВЗ-ЕНА.
Варіабельні домени важкого і легкого ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Особливо відповідними є антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти, які були "виділені" таким чином, щоб вони існували у фізичному середовищі, що відрізняється від середовища, в якому вони можуть зустрічатися в природі, або які були модифіковані так, щоб вони відрізнялися за амінокислотною послідовністю від антитіла, що зустрічається в природі.
Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, здатну специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи зазвичай складаються з поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або цукрові бічні ланцюги, і зазвичай мають специфічні характеристики тривимірної структури, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні і лінійні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першими, але не з останніми, завжди втрачається у присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може містити амінокислотні залишки, що безпосередньо беруть участь у зв'язуванні, і інші амінокислотні залишки, які безпосередньо не беруть участь у зв'язуванні, такі як амінокислотні залишки, що ефективно блокуються пептидом, що специфічно зв'язується з епітопом (іншими словами, амінокислотний залишок знаходиться в межах ділянки розпізнавання для пептиду, що специфічно зв'язується з епітопом).
Використовуваний в даному описі термін "епітопзв'язувальний фрагмент антитіла" означає фрагмент, частину, ділянку або домен антитіла (незалежно від того, як вони отримані (наприклад, шляхом розщеплювання, рекомбінантним шляхом, синтетичним шляхом і т. п.)), які здатні специфічно зв'язуватися з епітопом. Епітопзв'язувальний фрагмент може містити 1, 2, З, 4,5 або усі 6 СОК-доменів такого антитіла і, не дивлячись на те, що здатний специфічно зв'язуватися з таким епітопом, може проявляти специфічність, афінність або селективність стосовно того епітопу, який відрізняється від епітопу для такого антитіла. Переважно, проте, щоб епітопзв'язувальний фрагмент містив усі б СОБК-доменів такого антитіла.
Епітопзв'язувальний фрагмент антитіла може являти собою або містити частину одного поліпептидного ланцюга (наприклад, в 5сЕм) або може являти собою або містити частину двох або більше поліпептидних ланцюгів, кожна з яких має аміно-кінець і карбоксильний кінець (наприклад, в діатілі, Рар-фрагменті, Рар»-фрагменті і т.п.). Фрагменти антитіл, які проявляють здатність до зв'язування з епітопом, можна отримати, наприклад, шляхом розщеплювання інтактних антитіл протеазами. Переважніше, щоб, не дивлячись на те, що два домени Ем- фрагмента, МІ ї МН, в природних умовах кодуються окремими генами, полінуклеотиди, які кодують такі послідовності генів (наприклад, їх кодуючу КДНК), можна було за допомогою рекомбінантних способів з'єднати гнучким лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому МІ/- і МН-ділянки асоційовані одна з одною з утворенням одновалентних епітопзв'язувальних молекул (відомих як одноланцюгові Ем (зсЕм); див., наприклад, Віга еї а!., (1988) Зсіепсе 242:423-426; і Ниєоп еї аї. (1988) Ргос. Маї). Асай. сі. (0О.5.А.) 85:5879-5883). Як альтернатива, шляхом використання гнучкого лінкера, який є дуже коротким (наприклад, має довжину менш ніж приблизно 9 залишків) для того, щоб забезпечити можливість асоціації МІ- ії МН-доменів одного поліпептидного ланцюга один з одним, можна утворити біспецифічне антитіло, діатіло або аналогічну молекулу (у якій два такі поліпептидні ланцюги асоціюють один з одним з утворенням двовалентної епітопзв'язувальної молекули) (див., наприклад, РМАБ ИОБА 90(14), 6444-8 (1993) відносно опису діатіл). Приклади епітопзв'язувальних фрагментів, що охоплюються цим винаходом, включають (ї) Габр'- або Рар- фрагмент - одновалентний фрагмент, що складається з МІ-, МН-, СІ- ії СНІ1-доменів, або одновалентне антитіло, описане в УМО 2007059782; (ії) К(авБ)2-фрагменти - двовалентні фрагменти, що містять два Рар-фрагменти, з'єднані дисульфідним містком в шарнірному домені; (ії) Ба-фрагмент, що по суті складається з МН- і СНІ1-доменів; (їм) Ем-фрагмент, що по суті складається з МІ- і МН-доменів, (м) ЧАБ-фрагмент (Умага еї а!., Маїиге 341, 544-546 (1989)), який по суті складається з МН-домену і також називається доменним антитілом (Ноїє еї аї;
Тгєепаз Віотесппої. 2003 Мом;2(П): 484-90); (м) антитіла верблюжих або нанотіла (Кемеїв еї аї;
Ехреп Оріп Віої Трег 2005 ап; (І: 1 11-24) і (мі) виділену ділянку, що визначає комплементарність (гіперваріабельну ділянку) (СОК). Додатково, не дивлячись на те, що два домени Еу-фрагмента, МІ. ї МН, кодуються окремими генами, їх за допомогою рекомбінантних способів можна з'єднати синтетичним лінкером, який забезпечує можливість їх отримання у вигляді одного білкового ланцюга, в якому Мі- і МН-домени знаходяться в парі, з утворенням одновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюгові Ем (5СЕм), див., наприклад, Віга еї аїЇ., 5сіепсе 242, 423-426 (1988), і Низіоп еї аіІ., РМА5 ОБА 85, 5879-5883 (1988)). Ці ї інші фрагменти антитіл, застосовні в контексті цього винаходу, додатково обговорюються в даному описі. Також слід розуміти, що термін "антитіло", якщо не вказане 60 інше, також включає антитілоподібні поліпептиди, такі як химерні антитіла і гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, що зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (епітопзв'язувальні фрагменти), отримувані за допомогою будь-якої відомої методики, такої як ферментативне розщеплювання, синтез пептидів і рекомбінантні методики. Отримане антитіло може мати будь-який ізотип. Як використовується в даному описі, "ізотип" відноситься до класу імуноглобуліну (наприклад, Ідс1, ІдС2, ДСЗ або Ід054), що кодується генами константних доменів важких ланцюгів. Такі фрагменти антитіл отримують за допомогою традиційних методик, відомих фахівцям в даній галузі; відповідні фрагменти, здатні зв'язуватися з бажаним епітопом, можна без зусиль піддати скринінгу відносно корисності таким же чином, як і інтактне антитіло.
Термін "біспецифічне антитіло" відноситься до антитіла, що містить два незалежні епітопзв'язувальні фрагменти, кожен з яких націлюється на незалежні мішені. Ці мішені можуть бути епітопами, присутніми в різних білках, або різними епітопами, присутніми в одній і тій же мішені. Молекули біспецифічних антитіл можна отримувати за допомогою компенсаторних змін амінокислот в константних доменах НС початкових молекул моноспецифічних двовалентних антитіл. Отримане в результаті гетеродимерне антитіло містить один Раб, внесок в утворення якого вносять два різні початкові моноспецифічні антитіла. Зміни амінокислот в Ес-домені приводять до підвищення стабільності гетеродимерного антитіла з біспецифічністю, стабільною за часом. (Кіддуау еї аї., Ргоївіп Епдіпеегіпуд 9, 617-621 (1996), СипазекКагап еї аї., УВС 285, 19637-1 (2010), Мооге єї аі!., МАБзв 3:6 546-557 (2011), 5ігор вї аї!., "МВ 420, 204-219 (2012), Меї? еї аї., Ргоївіп Епдіпеегіпа 25:10 571-580 (2012), Іарі|п еї аіІ., РМАБ 110:113, 5145-5150 (2013),
Зргеїег Моп Кгецаепвівїп єї аіІ., МАБ5 5:5 646-654 (2013)). Біспецифічні антитіла також можуть включати молекули, що отримуються за допомогою злиття 5сЕм. Два моноспецифічні 5сЕм потім незалежно з'єднують з Есо-доменами, здатними утворювати стабільні гетеродимери, з отриманням однієї біспецифічної молекули (Мабгу еї аі., РЕОБ5 23:3 115-127 (2010).
Біспецифічні молекули мають здатності до подвійного зв'язування.
Термін "антитіло 01.2" призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що має: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 1; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 2; і
Зо (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 3; і варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що має: (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 4; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮО МО: 5; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 6, або які складаються з них.
У одному варіанті здійснення антитіло 01.2 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за 5ЕО ІЮ МО: 8 і/або легкий ланцюг за 5ЕО ІЮ МО: 7 або складатися з них.
У пов'язаному варіанті здійснення антитіло О1.27 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за ЗЕО ІО МО: 8 і/або легкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 34 або складатися з них.
Термін "антитіло С10-2" призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що має: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 9; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮО МО: 10; і (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 11; і варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що має: (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 13; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 14, або які складаються з них.
У одному варіанті здійснення антитіло С10-2 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 16 і/або легкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 15 або складатися з них.
У додатковому варіанті здійснення гуманізоване антитіло С10-2 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за 5ЕО ІЮ МО: 35, легкий ланцюг за 5ЕО ІЮ МО: 36 або їх обидва або складатися з них. Один варіант здійснення цього винаходу направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять важкий ланцюг за
ЗЕО ІЮ МО: 35, легкий ланцюг за 5ЕО ІЮ МО: 36 або що складаються з них. бо Термін "антитіло С5.2" призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що має: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5Е0 ІЮ МО: 17; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 18; і (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 19; і варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що має: (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 20; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 21; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО: 22, або що складаються з них.
У одному варіанті здійснення антитіло С5.2 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 24 і/або легкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 23 або складатися з них.
Термін "антитіло С8.3" призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент його фрагмент, що містять варіабельний домен легкого ланцюга антитіла, що має: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 25; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 26; і (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 27; і варіабельний домен важкого ланцюга антитіла, що має: (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 28; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮО МО: 29; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІО МО: 30, або що складаються з них.
У одному варіанті здійснення антитіло С8.3 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 32 і/або легкий ланцюг за ЗЕО ІЮ МО: 31 або складатися з них. "Антитіло до тау-білка" є антитілом або його епітопзв'язувальним фрагментом, що специфічно зв'язуються з тау-білюом або фрагментом тау-білка.
Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл", використовувані в даному описі, відносяться до препарату з молекул антитіл єдиного
Зо молекулярного складу. Традиційна композиція на основі моноклональних антитіл демонструє єдину специфічність зв'язування і афінність до конкретного епітопу. У певних варіантах здійснення моноклональне антитіло може складатися із понад одного Рар-домену з підвищенням таким чином специфічності більш ніж до однієї мішені. Терміни "моноклональне антитіло" або "композиція на основі моноклональних антитіл" не призначені обмежувати будь- яким конкретним способом отримання (наприклад, рекомбінантним, трансгенним, гібридомним і т.п.).
Антитіла за цим винаходом і їх епітопзв'язувальні фрагменти переважно є "туманізованими", зокрема, якщо вони використовуються для терапевтичних цілей. Термін "гуманізований" відноситься до молекули, що зазвичай отримується за допомогою рекомбінантних методик, яка має епітопзв'язувальну ділянку, отриману з імуноглобуліну від виду, відмінного від людини, і решту структури імуноглобуліну, в основі якої лежить структура і/або послідовність людського імуноглобуліну. Епітопзв'язувальна ділянка може містити або повні варіабельні домени антитіла, відмінного від людського, злиті з людськими константними доменами, або тільки ділянки, що визначають комплементарність (СОК), таких варіабельних доменів, прищеплені до відповідних людських каркасних ділянок людських варіабельних доменів. Залишки каркасних ділянок таких гуманізованих молекул можуть бути дикого типу (наприклад, повністю людськими), або вони можуть бути модифіковані так, щоб містити одну або декілька амінокислотних замін, що не виявляються в людському антитілі, послідовність якого служила як основа для гуманізації. Гуманізація зменшує або усуває вірогідність того, що константний домен молекули діятиме як імуноген у індивідуумів-людей, проте можливість вироблення імунної відповіді на чужорідний варіабельний домен зберігається (ГоВидію, А.Р. еї аї. (1989) "Моизе/Нитап Спітетгіс Мопосіопа! Апіїроду Іп Мап: Кіпеїїсв Апа Іттипе Незропзе", Ргос. Маї).
Асай. 5сі. (0.5.А.) 86:4220-4224). Інший підхід фокусується не тільки на отриманні константних доменів людського походження, але також і на модифікації варіабельних доменів так, щоб реконструювати їх якомога ближче до людської форми. Відомо, що варіабельні домени як важкого, так і легкого ланцюгів містять три ділянки, що визначають комплементарність (СОК), які розрізняються за відповіддю на антигени, що розглядаються, і визначають здатність до зв'язування, фланковані чотирма каркасними ділянками (ЕК), які є відносно консервативними у даного виду і які імовірно забезпечують остов для СОК. У тих випадках, коли антитіла, відмінні 60 від людських, отримують у відношенні конкретного антигену, варіабельні домени можна
"реконструювати" або "гуманізувати" шляхом трансплантації СОК, що походять від антитіла, відмінного від людського, на ЕК, що присутні в людському антитілі, яке підлягає модифікації.
Про застосування даного підходу до різних антитіл повідомлялося в За, К. єї а!. (1993) Сапсег
Вев5 53:851-856. Віесптапп, Г. еї аї. (1988) "Незпаріпд Нитап Апіїродієз тог Тпегару", Машге 332:323-327; Метоеуеєп, М. еї аї. (1988) "ВезПпаріпд Нитап Апііродієв: Станіпд Ап Апійузогуте
Асіїмпу", Зсієпсе 239:1534-1536; КешШерогоцай, б. А. єї аї. (1991) "Нитапігайоп ОГ А Моизе
Мопосіопа! Апіроду Ву СОВ-Стайіпд: Те Ітропапсе ОЇ Ргатемжо!к Вевзідиез Оп Іоор
Сопіоптаїййоп", Ргоївїп Епадіпеегіпу 4:773-3783; Маєда, Н. еї а!. (1991) "Сопвігисіюп ОЇ Везпарейд
Нитап Апіїродієз Мп НІМ-Мешкнаїїгіпу Асіїмпу", Нитап Апііїродієз Нубгідота 2:124-134; Согптап,
З. р. еї а. (1991) "Везпаріпу А ТНегарешіс СА Апіїроду", Ргос. Маї!. Асад. бсі. (0О.5.А.) 88:4181- 4185; Тетрезі, Р.В. еї аї. (1991) "Незпаріпуд А Мопосіопа! Апіїроду То Іппірїї Нитап Незрігаюгу зЗупсуйа! Мігив ІпТесіоп іп мімо", Віо/Гесппоіоду 9:266-271; Со, М. 5. еї аї. (1991) "Нитапігеа
Апіїродієв Рог Апіїмігаї Тнегару", Ргос. Маї!. Асай. сі. (0О.5.А.) 88:2869-2873; Сапег, Р. еї аї. (1992) "Нитапігайоп ОЇ Ап Апіїі-рі85Ппег2 Апіїбоду Рог Нитап Сапсег ТПаегару", Ргос. Маї!. Асад.
Зсі. (0О.5.А.) 89:4285-4289; і Со, М.5. еї аїІ. (1992) "Спітегіс Апі Нитапілей Апіїродіез УМИЙ
Зресіїйсйу Бог Те СО33 Апіідеп", у). Іттипої. 148:1149-1154. У деяких варіантах здійснення в гуманізованих антитілах зберігаються всі послідовності СОК (наприклад, в гуманізованому мишачому антитілі, яке містить усі шість СОК мишачих антитіл). У інших варіантах здійснення гуманізовані антитіла мають одну або декілька СОМ (одну, дві, три, чотири, п'ять, шість), змінених в порівнянні з початковим антитілом, які також називають однією або декількома СОК, "отриманими з" однієї або декількох СОЄ. початкового антитіла. Можливість гуманізації антигену добре відома (див., наприклад, патенти США МоМо 5225539; 5530101; 5585089; 5859205; 6407213; 6881557).
Термін "антитіло "ХХ" призначений позначати антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент (наприклад, антитіло "С10-2"), що містять легкий ланцюг, варіабельний домен легкого ланцюга або СОК1-3 варіабельного домену легкого ланцюга, визначені за їх відповідними ЗЕО
ІЮО МО, і важкий ланцюг, варіабельний домен важкого ланцюга або СОК1-3 варіабельного домену важкого ланцюга, визначені за їх відповідними 5ЕО ІЮО МО, або що складаються з них. У певних варіантах здійснення антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент визначені повним варіабельним доменом важкого ланцюга, що міститься в них, визначеним за його 5ЕО ІЮО МО, і варіабельним доменом легкого ланцюга, визначеним за його ЗЕО ІЮ МО.
Якщо в даному описі не вказане інше, нумерація амінокислотних залишків в Ес-ділянці або константному домені антитіла відповідає системі нумерації ЄЮ, яка також називається ЕО- індексом, яка описана в КаБбаї єї аІ., Зедоепсев5 ої Ргоїеїп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегев5і, Бій Еа.
Рибіїс Неанцй 5егуісе, Маїйопаї! Іпвзійшез ої Неапй, Веїйезаа, МО, 1991.
Як використовується в даному описі, говорять, що антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент "специфічно" зв'язуються з ділянкою іншої молекули (тобто епітопом), якщо вони реагують або асоціюються з цим епітопом частіше, швидше, з більшою тривалістю і/або з більшою афінністю або авідністю в порівнянні з альтернативними епітопами. Також при прочитанні цього визначення слід розуміти, що, наприклад, антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язуються з першою мішенню, можуть специфічно або переважно зв'язуватися з другою мішенню або можуть не робити цього.
Використовуваний в даному описі термін "зв'язування", що застосовується до зв'язування антитіла із попередньо визначеним антигеном, в типовому випадку відноситься до зв'язування з афінністью, відповідною КО, що становить приблизно 107 М або менше, як, наприклад, приблизно 108 М або менше, як, наприклад, приблизно 109 М або менше, при визначенні за допомогою, наприклад, технології поверхневого плазмонного резонансу (ЗРК) на приладі
ВІАсогетФ 3000 із застосуванням антигену як ліганду і антитіла як аналізованої речовини, і до зв'язування із попередньо визначеним антигеном з афінністю, відповідною КО, щонайменше вдесятеро нижчою, як, наприклад, щонайменше в 100 разів нижчою, наприклад, щонайменше в 1000 разів нижчою, як, наприклад, щонайменше в 10000 разів нижчою, наприклад, щонайменше в 100000 разів нижчою, ніж для його афінності зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, В5БА, казеїном), відмінним від попередньо визначеного антигену, або близькоспорідненим антигеном. Величина, на яку афінність є нижчою, залежить від КО антитіла, так що якщо КО антитіла є дуже низькою (тобто антитіло є високоспецифічним), то величина, на яку афінність до антигену є нижчою, ніж афінність до неспецифічного антигену, може бути щонайменше 10000-кратною.
Термін "Ка" (с-1 або 1/с), використовуваний в даному описі, відноситься до константи швидкості дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену. Вказане значення також бо називають значенням Кої.
Термін "Ка" (М-1 х с-1 або 1/М.с), використовуваний в даному описі, відноситься до константи швидкості асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену.
Термін "КО" (М), використовуваний в даному описі, відноситься до рівноважної константи дисоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, отримуваної шляхом ділення Ка на Ка.
Термін "КА" (М-1 або 1/М), використовуваний в даному описі, відноситься до рівноважної константи асоціації для конкретної взаємодії антитіла і антигену, отримуваної шляхом ділення
Ка на ка.
У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента, які проявляють одну або декілька наступних властивостей: () практично відсутню здатність до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (і) практично відсутню здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатність до селективного розрізнення фосфорилованих залишків 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404 (рз404); (м) здатність до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатність до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків і/або (мії) здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей гТ94510 або здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білюа щонайменше на 9095 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами головного мозку людей з АЮ.
Додатковий варіант здійснення цього винаходу відноситься до антитіла, що отримується за допомогою способу отримання високоспецифічних високоафінних антитіл, які є
Зо імуноспецифічними до патогенного гіперфосфорилованого тау-білка, що містить фосфорилований залишок 5396, де вказаний спосіб включає стадії: (А) проведення ін'єкції імуногена ссавцеві при цьому вказаний імуноген містить дифосфорилований пептид, що містить 18-40, як, наприклад, 18-30, як, наприклад, 20-30, послідовних амінокислотних залишків, що містять ТОНСАЕІМУКРЗРУУБОЮТІРВАНІ. (5ЕО 10
МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2М4ЕК, з імунізацією таким чином вказаного ссавця; (В) повторення вказаної імунізації вказаного ссавця два або більше разів; (С) проведення скринінгу зразка сироватки крові від вказаного багато разів імунізованого ссавця щодо наявності високоспецифічних високоафінних антитіл, здатних зв'язуватися з патогенним гіперфосфорилованим тау-білком, що містить фосфорилований залишок 5396, але в значно меншому ступені здатних зв'язуватися з непатогенним тау-білком; і (СЮ) добування вказаних високоспецифічних високоафінних антитіл.
Як використовується в даному описі, "практично відсутня здатність" до зв'язування з молекулою тау-білка означає більш ніж 20 95 різницю, більш ніж 40 95 різницю, більш ніж 60 95 різницю, більш ніж 80 95 різницю, більш ніж 100 95 різницю, більш ніж 150 95 різницю, більш ніж 2-кратну різницю, більш ніж 4-кратну різницю, більш ніж 5-кратну різницю або більш ніж 10- кратну різницю у функціональних характеристиках в порівнянні з детектовним зв'язуванням, опосередкованим еталонним антитілом.
Терміни "селективний" і "імуноселективний", коли мова йде про здатності до зв'язування, які має антитіло до тау-білка у відношенні двох епітопів, призначені позначати те, що для спостережуваного зв'язування в насичувальних умовах виявляється щонайменше 80 95 різниця, щонайменше 95 95 різниця і найпереважніше 100 95 різниця (тобто відсутність детектовного зв'язування з одним епітопом). Терміни "селективний" і ""імуноселективний", коли мова йде про антитіло до тау-білка, додатково призначені позначати те, що антитіло зв'язується з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера і здатне розрізняти патологічний і непатологічний людський тау-білок.
Терміни фракція "що екстрагується в ТВ5" (51), фракція "що екстрагується. "у високосольовому розчині/саркозилі" (53) і "нерозчинна в саркозилі" фракція (РЗ) означають фракції, що отримуються за допомогою біохімічного фракціонування тау-білка, описаного в 60 даному описі.
У деяких антитілах тільки частина СОК, а саме підмножина залишків СОМ, потрібних для зв'язування, що називається 5ЗОК, необхідна для збереження зв'язування в гуманізованому антитілі. Залишки СОК, що не контактують з відповідним епітопом і не містяться в ЗОК, можна ідентифікувати на підставі попередніх досліджень (наприклад, залишки НбО-Нб5 в Н2 СОК часто не потрібні), з ділялнок СОМ за Кабраї, що знаходяться за межами гіперваріабельних петель за Споїпіа (див. Кабаї еї а. (1992) Зедиепсев5 ої Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іптегеві,
Маїйопаї! Інвійшевз ої Неайй Рибіїсайоп Мо. 91-3242; Споїніа, С. єї а. (1987) "Сапопіса! Бігисіигев
Еог Тне Нурегчмагіаріє Ведіопе. ОЇ Іттиподіобиїїпе", У. Мої. Віо!ї. 196:901-917), за допомогою молекулярного моделювання і/або емпіричним шляхом або згідно з описаним в Соплаїе5, М.М. еї а). (2004) "БО Стайіпуд ОЇ А Мигіпе Апіїбоду Овіпд Мийіріє Нитап Септіїпе Тетріаїев5 То
Міпітіге Н5 Іттиподепісйу", Мої. Іттипої. 41:863-872. У таких гуманізованих антитілах в положеннях, в яких відсутні один або декілька залишків донорного СОР. або в яких пропущений весь донорний СОК, амінокислота, що займає певне положення, може бути амінокислотою, що займає відповідне положення (згідно з нумерацією за Кара) в акцепторній послідовності антитіла. Кількість таких замін акцепторних амінокислот на донорні в СО, які потрібно включити, відображає баланс альтернативних думок. Такі заміни є потенційно переважними для зниження кількості мишачих амінокислот в гуманізованому антитілі і зниження внаслідок цього потенційної імуногенності. Проте, заміни також можуть обумовлювати зміни афінності, і переважно уникають значного зменшення значень афінності. Положення для заміни в межах
СОК і амінокислоти, необхідні для заміни, також можна вибрати емпіричним шляхом.
Той факт, що зміна однієї амінокислоти в залишку СОК може приводити до втрати функціонального зв'язування (Киаїкоїй, 5. еїс... (1982) "Біпдіе Атіпо Асі ЗиБзійшіоп АКегіпод
Апіідеп-Віпаіпу Зресіїісйу", Ргос. Маї). Асад. сі. (О5А) 79(6):1979-1983), забезпечує можливість систематичної ідентифікації альтернативних функціональних послідовностей СОК. У одному переважному способі отримання таких варіантів СОК полінуклеотид, що кодує СОК, піддають мутагенезу (наприклад, за допомогою випадкового мутагенезу або за допомогою сайт- спрямованого способу (наприклад, ампліфікації, опосередкованої полімеразною ланцюговою реакцією, з праймерами, що кодують мутантний локус)) з отриманням СОК, що має замінений амінокислотний залишок. Шляхом порівняння за відповідним залишком ідентичності початкової
Зо (функціональної) послідовності СОК з ідентичністю варіанта послідовності СОК із заміною (нефункціональної) для цієї заміни можна визначити вагу заміни згідно з ВГОБОМБ2.ЇЇ). У системі ВГОБИМ представлена матриця амінокислотних замін, що створюється шляхом аналізу бази даних послідовностей відносно достовірних вирівнювань (Едау, 5.К. (2004) "УМпеге бій Тпе
ВГОБИМб2 Аїїдптепі бсоге Маїйїх Соте Егот?", Майте Віоїесн. 22(8):1035-1036; Непікоїй, 9.а. (1992) "Атіпо асіа зирзійшіоп таїгісев їїот ргоївіп Біоск5", Ргос. Маї). Асад. 5сі. (ОА) 89:10915- 10919; Капіп, 5. еї а). (1990) "Меїйод5 Еог Авзевззіпд Те 5іаїівіїса! бідпітісапсе ОЇ Моїіесшаг
Зедиєпсе ЕРеаштев Ву Овіпуд Сепега! бсогіпд Зспетев" Ргос. Маї!. Асай. бсі. (О5А) 87:2264-2268;
Аїйївспиї, 5.Р. (1991) "Атіпо Асій ЗиБ5ійшіоп Майсез Егот Ап Іпіогтайоп ТНеогеїїс Регзресіїме",
У. Мої. Віої. 219, 555-565. В даний час найбільш досконалою базою даних ВГОБИМ є база даних в'юозИмМб2 (В ОЗИМБ2.ЇЇ). У таблиці 1 представлені значення ваги замін згідно з ВГОЗОМБб2. Її) (чим більша вага, тим більш консервативною є заміна і, таким чином, тим більш ймовірно, що заміна не впливатиме на функцію). Якщо епітопзв'язувальний фрагмент, що містить отриману в результаті СОК, не може зв'язуватися з тау-білюом, наприклад, то вважають, що вага заміни згідно з В ОБИМБ2.Їїї|Ї свідчить про її недостатню консервативність, і вибирають і проводять нову заміну-кандидата, що має більшу вагу заміни. Таким чином, наприклад, якщо початковим залишком був глутамат (Е), а нефункціональним замінюючим залишком був гістидин (Н), то вага заміни згідно з ВІОБИМБА2.їїЇ дорівнювала 0, і консервативніші зміни (як, наприклад, на аспартат, аспарагін, глутамін або лізин) є переважними.
Таблиця 1 ГТА|ВнІМ Іо |сСІО | Е сСІНІ! су укІМІєРІЗ|т|мМ ММ
А|змі ил 2| 210 лі л1 01211 12 ніо| зго віллі о 2г|з но го 3221132 1-7 з | 2 з міг210 ч6|Їніз 010 0-33 01 21|3| 2 10 4 | 2| з 0212 -|6| 310 2 11314 131 3|11 01-71 4 | з з со 1-31 3|-3Щ|9 314 313-311 2|3 171 2 | 2 о |лініої|о| 3 52 2103 2 ям 0|3|1 0171 2 | 2
Ел 101 0|2| 4 21452103 3 я 2| 3101-71 з | 2 2 ао0/210|ч1|3/ 2246/1244 21 3|3| 2 021 г | З| з ніІгіо ніл| 31010 214833 1 21|1| 21-12 2 || з 11313133 43 4-2 3 н|0|3 2171 з | 71 | 3
ЕЕ 213|4|1 213 43 2144 21210| 3 217 2 | лі я кіл ол з німе 2 51713101 3 | 2 2 міліліе|з|1012 32 на 15102177 лі
ЕЕ 21-31 3|3| 233 3111010 3101-6Ї 4 2/1 21 ян
РІЛЛІ 2|ч| 31121213 3 121457 17 4 || 2
Інілініо|л1010 01121210 2|1 41 | 2 2 то лотерея тілі се || о
Міо з3| || 21213 з|із| ні гніт 2 2/0 з | 1 | 4
Цей винахід, таким чином, припускає застосування випадкового мутагенезу для ідентифікації покращених СОМ. У контексті цього винаходу консервативні заміни можуть бути 5 визначені як заміни в межах класів амінокислот, відображених в одній або декількох з таблиць 2, З або 4.
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця 2
Азр (0) і Сім (Е)
І.уз (К), Аго (В) і Ні (Н)
Зег (5), Тиг (Т), Авп (М) і Сіп (С) сту (С), Ліа (А), Ма! (М), Сем (3 ї Пе ()
Суз (С), Ме! (М) і Рго (Р)
Рпе (Є). Туг (9 і Тгр (ММ)
Альтернативні класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Таблиця З а 11116111 11111111 1 811111 214111в1 11111 к1 6 Гм 7261 ГГ мМ1мМ
Альтернативні фізичні і функціональні класифікації амінокислотних залишків
Таблиця 4
Групи консервативніших замін включають валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін і аспарагін-глутамін.
Додаткові групи амінокислот також можуть бути складені з використанням принципів, описаних, наприклад, в Стгеідпіоп (1984) Ргоїеіп5: 5ігисішге апа Моїесціаг Ргорегіевз (24 Еа. 1993), МУ. Н. Егеетап апа Сотрапу.
Як альтернативу можна застосовувати технологію фагового дисплея для підвищення (або зниження) афінності СОМ. У цій технології, званій дозріванням афінності, використовується мутагенез або "прогулянка по СОК" і повторний відбір із застосуванням антигену-мішені або його антигенного епітопзв'язувального фрагмента для ідентифікації антитіл, що мають СОК, які зв'язуються з вищою (або нижчою) афінністю з антигеном в порівнянні з первинним або початковим антитілом (див., наприклад, Сіазег еї аї. (1992) 9. ІттипоЇоду 149:3903). Мутагенез цілих кодонів, а не окремих нуклеотидів, приводить до отримання напіввипадкового набору амінокислотних мутацій. Можна конструювати бібліотеки, що складаються з пулу варіантів клонів, кожен з яких відрізняється однією зміною амінокислоти в одній СОК, який також містить варіанти, що представляють кожну можливу амінокислотну заміну для кожного залишку СОК.
Мутантні форми з підвищеною (або зниженою) афінністю зв'язування з антигеном можна піддати скринінгу шляхом приведення іммобілізованих мутантних форм в контакт з міченим антигеном. Можна застосовувати будь-який спосіб скринінгу, відомий з рівня техніки, для ідентифікації мутантних антитіл з підвищеною або зниженою афінністю до антигену (наприклад,
ЕГІЗА) (див. УМи еї аЇ. 1998, Ргос. Май). Асай. осі. (0.5.А.) 95:6037; Меп еї аї., 1995, 9.
Іптітипоїоду 155:1994). Можливо також застосовувати прогулянку по СОК, в ході якої легкий ланцюг піддається випадковому мутагенезу (див. Зспіег еї аї!., 1996, 9. Мої. Віо. 263:551).
Способи виконання такого дозрівання афінності описані, наприклад, в Кгаизе, 9.С. еї аї. (2011) "Ап Іпзепйіоп Миїайоп ТНаї Оівютів Апіїбоду Віпаїпд 5йе Агспійесіиге Еппапсев5 Рипсійоп ОЇ
А Нитап Апііїроду", МВіо. 2(1) рії: е00345-10. дої: 10.1128/тВіо.00345-10; Киап, С.Т. еї аї. (2010) "Аніпнку-Маїйигейд Апіі-Сіусоргоївїіп ММВ РесотрБбіпапі Іттипоїохіп5 Тагдеїйпу Маїїдпапі Спіотав
Ап Меїапотав", Іпі. У. Сапсег 10.1002/|с.25645; НаскКеї, В.). еї ах. (2010) "Ззарійу Апа СОВ
Сотровійоп Віазев Епгісп Віпдег Рипсііопаїйу І апазсарев", у. Мої. Віої. 401(1):84-96; Мопідотегу,
О.К. еї аї. (2009) "Аніппу Маїигайоп Апа Спагасієгігайоп ОЇ А Нитап Мопосіопа! Апіїбоду Адаїпві
НІМ-1 др41", МАБб5 1(5):462-474; Саяивісніпа, Е. єї аі. (2009) "АНіпйу Майшгайоп Ву Таговївй
Оімегвіїїсайоп ОЇ Те СОВ-НЕ2 Іоор ОЇ А Мопосіопа! Раб Оеєгімед Рот А Зупіпеїїс Маїме Нитап
Апіїрбоду І Інгагу Апа бігесієйд Адаїп5і Тпеє Іпіегпаї! Тгітегіс Соїйед-Сої! ОЇ Сір41 Мівідв А 5еї ОЇ Рарз
ММ Ітргомей НІМ-1 Мешгаїїгайоп Роїепсу Апа Вгєайін", Мігоїоду 393(1):112-119; Ріпіау, МУ... еї а. (2009) "АНіпйу Маїйгайоп ОЇ А Нитапігей АНаї Апіроду Бог АМТІ-ВАСЕ Тнегару:
СотргеНепвзіме Миїадепевзіз Немеаї5 А Нідп І еме! ОЇ Миїайопаї! Ріавіїсйу Воїй Іпвіде Апа Оцівіде
Тне Сотріетепіату-Оеєїеттіпіпу Недіопв", ). Мої. Віо!. 388(3):541-558; Вовігот, «у. еї аї. (2009) "Ітпргоміпуд Апіїбоду Віпаіїпд Айіпйу Апа Зресіїїсйу Рог Тнегарецшіїс ОемеІортепі", Меїйосдв5 Мо).
Віо!. 525:353-376; еїеїаї, 5. еї аї. (2008) "п Міго Айіпйу Майшгайоп ОЇ Нитап СМ-С5Е Апіїродієв
Ву Тагдеїва СОВ-Оімегвіїісайоп", Мої. Іттипої. 46(1):135-144; і Вагаегав, Е. еї аї. (2008) "Айіпйу
Маїсгаїйоп ОГї Апіібодієв Аввзівієй Ву Іп 5біїїсо Моавеїїпд", Ргос. Маї!. Асад. 5сі. (ОА) 105(26):9029- 9034.
Таким чином, послідовність варіантів СОК охоплюваних антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів може відрізнятися від послідовності СОК початкового антитіла 01.2, С10-2, С5.2 або
С8.3 завдяки замінам; наприклад, заміненим 4 амінокислотним залишкам, З амінокислотним залишкам, 2 амінокислотним залишкам або 1 амінокислотному залишку. Згідно з варіантом здійснення цього винаходу додатково передбачається, що амінокислоти в СОМ -ділянках можна замінювати за допомогою консервативних замін, визначених в З таблицях вище. Наприклад, кислий залишок Азр можна замінити на Сім без значного впливу на характеристики зв'язування антитіла.
Термін "нормальний тау-білок" відноситься до нормального тау-білка головного мозку, що містить 2-3 моля фосфату на моль білка.
Термін "гіперфосфорилований тау-білок" відноситься до поліфосфорилованих молекул тау- білка, відповідних індукованому поліаніонними молекулами зсуву рухливості у вестерн- блотингу, або до молекул тау-білка, що мають більше п'яти, шести або семи фосфорилованих серинових, треонінових або тирозинових сайтів.
Термін "тау-білок, що має фосфорилований залишок 396" відноситься до гіперфосфорилованого тау-білка, в якому залишок 396 є фосфорилованим, а залишок 404 є фосфорилованим або не є фосфорилованим.
Термін "трансгенна тварина, відмінна від людини" відноситься до тварини, відмінної від людини, що має геном, що містить один або декілька людських трансгенів або трансхромосом, що кодують важкий і/або легкий ланцюг (інтегрованих або не інтегрованих в природну геномну
ДНК тварини), яка здатна експресувати повністю гуманізовані антитіла. Наприклад, трансгенна миша може мати трансген, що кодує гуманізований легкий ланцюг, і або трансген, що кодує гуманізований важкий ланцюг, або трансхромосому, що кодує гуманізований важкий ланцюг, так що у миші виробляється гуманізоване антитіло до тау-білка при імунізації антигенним тау- білком і/або клітинами, що експресують тау-білок. Трансген, що кодує гуманізований важкий ланцюг, може бути інтегрований в хромосомну ДНК миші, як у випадку з трансгенними мишами, наприклад, мишами НиМАбБ, такими як миші НСо7 або НСо12, або трансген, що кодує гуманізований важкий ланцюг, може зберігатися опозахромосомно, як у випадку з трансхромосомними мишами КМ, описаними в УУО 02/43478. Такі трансгенні і трансхромосомні миші (в сукупності називаються в даному описі "трансгенними мишами") здатні виробляти декілька ізотипів гуманізованих моноклональних антитіл до даного антигену (таких як да, ІдА,
ІаМ, дО і/або ІДЕ), що піддаються У-0-)-рекомбінації і перемиканню ізотипу.
Зо Трансгенну тварину, відмінну від людини, також можна використовувати для отримання антитіл до специфічного антигену шляхом введення генів, що кодують таке специфічне антитіло, наприклад, шляхом формування функціонального зв'язку генів з геном, що експресується в молоці тварини.
Термін "лікування" або "здійснення лікування", використовуваний в даному описі, означає полегшення, уповільнення, ослаблення або усунення прогресу або тяжкості захворювання або порушення або полегшення, уповільнення, ослаблення або усунення одного або декількох симптомів або побічних ефектів такого захворювання або порушення. Для цілей цього винаходу "лікування" або "здійснення лікування" додатково означає підхід для отримання сприятливих або бажаних клінічних результатів, де "сприятливі або бажані клінічні результати" включають, без обмеження, часткові або повні, що виявляються або не виявляються, зменшення інтенсивності прояву симптому, зниження ступеня тяжкості порушення або захворювання, стабілізацію (тобто відсутність погіршення) стану захворювання або порушення, затримку або уповільнення прогресу стану захворювання або порушення, полегшення або пом'якшення стану захворювання або порушення і ремісію захворювання або порушення. "Ефективна кількість", вживана стосовно антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом, відноситься до кількості, яка при введенні в необхідних дозах і протягом необхідних періодів часу є достатньою для досягнення наміченого біологічного ефекту або бажаного терапевтичного результату, в тому числі, без обмеження, клінічних результатів. Фраза "герапевтично ефективна кількість", вживана стосовно антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом, призначена позначати кількість антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, яка є достатньою для полегшення, пом'якшення, стабілізації, усунення, уповільнення, ослаблення або затримки прогресу стану порушення або захворювання або симптому порушення або захворювання. У варіанті здійснення спосіб за цим винаходом передбачає введення антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента в комбінаціях з іншими сполуками. У таких випадках "ефективною кількістю" є кількість комбінації, достатня для того, щоб викликати намічений біологічний ефект.
Терапевтично ефективна кількість антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом може варіюватися залежно від таких чинників, як стан захворювання, вік, стать і маса індивідуума, а також від здатності антитіла до тау-білка або його бо епітопзв'язувального фрагмента викликати бажану відповідь у індивідуума. Терапевтично ефективною також є така кількість, при якій будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіла або частини антитіла переважуються терапевтично сприятливими ефектами.
Як вказано вище, цей винахід, зокрема, відноситься до моноклональних антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів і до абсолютно нового способу отримання таких молекул (і, отже, таких їх епітопзв'язувальних фрагментів). Цей спосіб у загальних рисах представлений на фігурі 9. Ця можливість виділяти моноклональні антитіла за допомогою нового способу представлена в даному описі на прикладі його застосування для виділення моноклональних антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком серином-396 (Р'БЗО6) людського тау-білка (ЗЕО ІЮ МО: 33). Ці антитіла додатково характеризуються своєю здатністю розрізняти фосфориловані залишки серин-396 і серин-404 (рбе404), так що вони не зв'язуються з тау-білююом з фосфорилованим серином 404, за винятком випадків, коли тау-білок також фосфорилований по залишку 396.
Антитіла за цим винаходом або їх епітопзв'язувальний фрагмент були отримані і виділені шляхом застосування нового способу (фігура 9), який сприяє відбору (РІЗЗО96б-специфічних антитіл (фігура 9). Додатково, за допомогою застосування цієї вельми строгої процедури відбору клонів антитіл були отримані антитіла, які є не тільки високоспецифічними відносно 5396, але також і високоселективними відносно фосфорилованого епітопу (Р/5396. Ці антитіла унікальним чином розпізнають тау-білки з головного мозку з хворобою Альцгеймера. Автори цього винаходу також демонструють, що процедура скринінгу, представлена у загальних рисах на фігурі 9, забезпечує ідентифікацію антитіл, що мають функціональну і терапевтичну корисність.
Індукували вироблення антитіл до дифосфорилованого пептиду
ТОНОАЕІМУКРІЗРМУМУБООЮТРІОРЕКНІ (ЗЕО ІЮ МО: 37), що охоплює залишки 386-408 тау-білка 2М4К (приклад 1). Мишей імунізували цим фосфорилованим пептидом. Після отримання достатніх титрів антитіл мишей убивали і отримували гібридоми (приклад 2). Гібридоми піддавали скринінгу за допомогою дот-блот-аналізу (приклад 3) ії М5О-ЕГ І5А з іммобілізованим патологічним і непатологічним людським тау-білком (приклад 4). Здатність до розрізнення патологічного і непатологічного людських тау-білків застосовували в ході дот-блот-аналізу і вестерн-блот-аналізу для відбору гібридом. Відбирали шістнадцять клонів, з яких добували
Зо чотири гібридомні клони, які виробляли антитіла, що характеризуються надзвичайно високими здатностями до зв'язування з патологічним матеріалом людського тау-білка.
Специфічне зв'язування з патологічним і непатологічним тау-білком також визначали шляхом виділення тау-білка з ураженого захворюванням головного мозку людей з АЮ і не ураженого захворюванням головного мозку і іммобілізації цього матеріалу на планшетах для
М50-ЕГІ5А (приклад 4).
Додатковий аспект цього винаходу відноситься до моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, утворення яких відбувається у відповідь на дифосфорилований пептид, що містить щонайменше 18, як, наприклад, щонайменше 20, послідовних амінокислотних залишків в межах ТОНСАЕЇМУКРОРМУУЗООТІРАНІ. (5ЕО ІО МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2М4Е. У цьому аспекті цього винаходу утворення моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента в типовому випадку викликається у відповідь на дифосфорилований пептид, що містить 18-40, як, наприклад, 18-30, як, наприклад, 20-30, послідовних амінокислотних залишків, що містять
ТОНОАЕІМУКРІЗРМУМУБООЮТРІЗРЕНІ (ЗЕ ІЮ МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2МаВ.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом, що мають специфічність у відношенні фосфорилованого тау-білка (рТаим) від пацієнтів, уражених АЮ, в порівнянні із здоровими контрольними суб'єктами у відповідній віковій групі, так що вказані моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються різницею в специфічності стосовно фосфорилованого тау-білка (рТаиц) від пацієнтів, уражених АО, в порівнянні з тау-білком від контрольних суб'єктів у відповідній віковій групі здорових людей, що являє собою більш ніж 50- кратне, як, наприклад, більш ніж 100-кратне підвищення специфічності стосовно матеріалу, ураженого АБ, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів в заснованому на аналізі ЕГІЗА для виявлення фосфорилованого тау-білка (рТацй) в гомогенатах головного мозку від уражених АЮ і від здорових контрольних суб'єктів із застосуванням специфічної схеми 1
ЕГІЗА для фосфорилованих і мультимерних молекул, як описано в даному описі.
Пов'язаний аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом, що мають специфічність до тау-білка з бо матеріалу, ураженого АО, так що вказані моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент характеризуються різницею в специфічності у відношенні матеріалу, ураженого Аб, в порівнянні з матеріалом від контрольних суб'єктів у відповідній віковій групі здорових людей, що являє собою більш ніж 50-кратне, як, наприклад, більш ніж 100-кратне підвищення специфічності у відношенні матеріалу, ураженого АБ, в порівнянні з матеріалом від здорових контрольних суб'єктів в заснованому на аналізі ЕГІЗА для виявлення фосфорилованого тау- білка (рТаш) в гомогенатах головного мозку від уражених АЮ і від здорових контрольних суб'єктів із застосуванням специфічної схеми 1 ЕГІЗБА для фосфорилованих і мультимерних молекул.
Спосіб виконання схеми 1 ЕГІ5А включає стадії: А) захоплення патологічних антигенних людських тау-білків з головного мозку з АЮ за допомогою планшетів, покритих С10-2; В) інкубування антигенних тау-білків з рЗ396-специфічними антитілами в концентраціях, що підвищуються, і с) виявлення захоплення антигенних // тау-білків і його антитілоопосередкованого інгібування за допомогою антитіл до людського (загального) тау- білка від МБО, мічених БОЇ ЕО-ТАа.
Цей винахід додатково відноситься до антитіла, що отримується за допомогою способу отримання високоспецифічних високоафінних антитіл, які є імуноспецифічними до патогенного гіперфосфорилованого тау-білка, що містить фосфорилований залишок 5396, де вказаний спосіб включає стадії: (А) проведення ін'єкції імуногена ссавцеві при цьому вказаний імуноген містить дифосфорилований пептид, що містить 18-40, як, наприклад, 18-30, як, наприклад, 20-30, послідовних амінокислотних залишків, що містять ТОНСАЕІМУКРЗРУУБОЮТІРВАНІ. (5ЕО 10
МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2М4К, з імунізацією таким чином вказаного ссавця; (В) повторення вказаної імунізації вказаного ссавця два або більше разів; (С) проведення скринінгу зразка сироватки крові від вказаного імунізованого багато разів ссавця у відношенні наявності високоспецифічних високоафінних антитіл, здатних зв'язуватися з патогенним гіперфосфорилованим тау-білком, що містить фосфорилований залишок 5396, але в значно меншому ступені здатних зв'язуватися з непатогенним тау-білком; і (СЮ) добування вказаних високоспецифічних високоафінних антитіл.
Зо Конкретніше, стадія А включає: покриття планшетів М5О (у типовому випадку протягом ночі при 4 С) антитілом С10-2, в типовому випадку при 0,5 мкг/мл (захоплюючим антитілом) в покриваючому буфері, блокування (у типовому випадку протягом 1 години при кімнатній температурі) і промивання, в типовому випадку З рази. Стадія В включає: змішування зразків лізату РЗ (у типовому випадку при 1:1000-2-4 мкг/мл загального білка) і/або 51(р) (у типовому випадку при 1:300-20-40 нг/мл загального білка) з матеріалу від суб'єктів з АЮ (об'єднаного від З пацієнтів) з антитілом, специфічним до пептидного епітопу ре396, в концентраціях, що ступінчасто змінюються, і інкубування (у типовому випадку протягом 1 години при кімнатній температурі). Реакційні суміші потім інкубують протягом 2 годин на планшетах, підготовлених на стадії А. Стадія С включає виявлення тау-білка, захопленого С10-2, за допомогою антитіла до людського тау-білка, міченого ЗОЇ ЄО-ТАб. Антитіло до тау-білка (у типовому випадку 1:50) від
М50О, відповідне інструкціям виробника. Планшети аналізують на БЗЕСТОМКФ 5600 від М5О. РЗ з матеріалу з АЮ і 51(р) з матеріалу з АО тестують згідно з аналогічною схемою.
Додатковий варіант здійснення направлений на антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (БЕО ІЮ МО: 33), які були отримані або вироблені в клітинній лінії, такій як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, клітинна лінія комахи, дріжджів або бактерії.
Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІЮ МО: 33), отримують в клітинній лінії СНО, клітинній лінії НЕК, клітинній лінії ВНК-21, клітинній лінії миші (такій як клітинна лінія мієломи), клітинній лінії фібросаркоми, клітинній лінії РЕК.Сб, клітинній лінії НКВ-11, клітинній лінії САР і клітинній лінії людини НиН-7.
Характеристики специфічної афінності і властивостей зв'язування 01.2 і С10-2 отримували із застосуванням пептидів 386-410 тау-білка (2К4М), фосфорилованих або не фосфорилованих в положенні 396 або 404 (5ЕО ІЮ МО: 29-32). Шляхом застосування специфічного протоколу імунізації і скринінгу (фігура 9), у загальних рисах представленого в цій заявці, отримують високоспецифічні антитіла до фосфосерину-396 (ре396), як продемонстровано на фігурі 4.
Щоб продемонструвати, що антитіла є специфічними відносно патологічного тау-білка, також отримували характеристики антитіл 01.2 і С10-2 за допомогою імуногістохімічного аналізу бо (приклад б). Антитіла проявляють високоспецифічне зв'язування з нейрофібрилярними клубками в головному мозку і в зрізах з хворобою Альцгеймера від трансгенних по тау-білку мишей Т94510, що експресують людський (РЗО11І) мутантний тау-білок (фігура 5). Зв'язування з тканиною з контрольного головного мозку людей і з головного мозку нетрансгенних мишей не спостерігається, що демонструє, що антитіла специфічно зв'язуються з людським тау-білком і, зокрема, з тау-білком, що асоціюється з альцгеймеровською патологією.
Унікальна здатність цих антитіл до розпізнавання тау-білка, що асоціюється з хворобливою патологією, продемонстрована в даному описі в прикладі 7. Автори цього винаходу порівнюють зв'язування патологічного і непатологічного тау-білка в аналізі описаному в прикладі 3.
Порівняння проводять стосовно п'яти опублікованих антитіл до тау-білка: ПАСІ-286, ІРМОО2,
Нув.5, 2.10.3 і 4Е4. На фігурі 6 проілюстровано зв'язування кожного з еталонних антитіл з тау- білком із здорового і ураженого захворюванням головного мозку і зв'язування з людським тау- білком з мутацією РЗО1Ї, виділеним з мишей Т94510 у віці 10 місяців, трансгенних по тау-білку.
Це демонструє, що виділені антитіла демонструють виключно високий ступінь специфічності і селективності стосовно людського патологічного тау-білка. Ця селективність перевершує селективність будь-якого з порівнюваних антитіл, як показано в таблиці 5.
Таблиця 5
При насичувальному зв'язуванні антитіла 01.2 і С10-2 проявляють більш ніж 100-кратну селективність у відношенні тау-білка РЗ, виділеного з головного мозку людей з АЮ.
Щоб продемонструвати, що відібрані антитіла мають функціональну і терапевтичну корисність, антитіла тестували в аналізах агрегації тау-білка іп міїго і в клітині (приклад 8). Цими аналізами є функціональні аналізи, в яких демонструється, що антитіла здатні перешкоджати процесу патологічної агрегації тау-білка. Клітини НЕК293 транзієнтно трансфікують людським тау-білюом РЗО1ТІ-РГ Ас (4КОМ). Потім клітини піддають дії екстрактів тау-білка з головного мозку людей з АЮ або з головного мозку трансгенних Т94510. Ця дія патологічного тау-білка сприяє поглинанню тау-білка клітинами і його внутріклітинній агрегації. Як імуновиснаження препаратів тау-білка за допомогою антитіл 01.2 і С10-2, так і безпосередня обробка клітин цими антитілами здатні забезпечувати істотне зменшення утворення агрегатів тау-білка (фігура 7).
Терапевтичну корисність антитіл 01.2 і С10-2 також оцінювали у мишей, що експресують
Зо людський тау-білок/Р51 (приклад 9). Ця мишача модель є більш відповідною тваринною моделлю захворювання Аб, в якій патологія АО утворюється лише в пізньому віці (у віці 12-18 місяців). Проте, у мишей виявляється гіперфосфорилування тау-білка до появи патології щільних клубків. Мишам ін'єктували дозу 15 мг/кг двічі на тиждень протягом тривалого періоду 13 тижнів. У мишей, оброблених антитілом, виявляється істотне зменшення рівня фосфорилованого тау-білка, продемонстроване на фігурі 9, що указує на те, що при тривалій обробці антитілами 01.2 і С10-2 зменшуватиметься клубкова патологія і, таким чином, подальша нейродегенерація іп мімо.
Антитіла за цим винаходом специфічно видаляють гіперфосфорилований тау-білок з екстрактів головного мозку мишей гТ94510 за допомогою способів імуновиснаження. Крім того, антитіла за цим винаходом не видаляють нормальний тау-білок з гомогенатів, тоді як комерційно доступне антитіло Тай5 робить це. На відміну від комерційних антитіл, що зв'язуються з тау-білками, в яких має місце фосфорилування по залишку 404 або як по залишку 404, так і по залишку 396, антитіла за цим винаходом специфічно видаляють на 9595 гіперфосфорилований тау-білок, який фосфорилований по серину-396. Експерименти (приклад 12) демонструють, що не дивлячись на те, що антитіло за цим винаходом видаляє лише дуже невелику частку загального тау-білка в гомогенаті головного мозку (8 95), антитіла, проте, специфічно видаляють гіперфосфорилований тау-білок (на 90 95). Відповідно, один аспект цього винаходу направлений на моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з патогенним гіперфосфорилованим тау-білком.
Додатково, в експериментах, в яких гіперфосфорилований тау-білок видаляли за допомогою антитіла за цим винаходом, усувається активність затравлювальної дії. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка. Було висунуто припущення, що при зменшенні затравлювальної дії зменшується розвиток утворення клубків і прогрес таупатій, включаючи хворобу Альцгеймера. Відповідно, додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло за цим винаходом для застосування в зменшенні прогресу АО або інтенсивності симптомів АЮ.
Конкретніше, як детально описано вище, цей винахід відноситься до будь-якого з чотирьох моноклональних антитіл, вибраних з групи, що включає:
Антитіло 01.2 (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 1; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 2; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 3; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 4; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮО МО: 5; і (у СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 6.
Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 8 і/або варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІЮО МО: 7 або складатися з них.
У пов'язаному варіанті здійснення антитіло 01.2 або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити важкий ланцюг за ЗЕО ІЮО МО: 8 і/або легкий ланцюг за ЗЕО ІО МО: 34 або складатися з них.
Антитіло С10-2 (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 9; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 10; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 11; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО: 12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 13; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 14.
Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІО МО: 15 і/або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 16
Ко) або складатися з них.
Амінокислотна послідовність важкого ланцюга гуманізованого антитіла С10-2 показана під
ЗБЕО ІЮ МО: 35. Амінокислотна послідовність легкого ланцюга гуманізованого антитіла С10-2 показана під БЕО ІЮ МО: 36.
В сукупності приклади показують, що антитіла за цим винаходом, зокрема С10-2, ефективно зв'язуються з планшетами М5О, покритими антигенами АЮ-РЗ. Для порівняння, комерційні антитіла, такі як РНЕ-13, мають низьку активність зв'язування. Додатково, РНЕ-13 демонструвало значно вищий ступінь неспецифічного зв'язування в порівнянні з антитілами за цим винаходом (див. таблиці бА-60). У таблиці 6 показано, що рідиннофазне інгібування тс10- 2 захоплення антигену рТашй в планшеті, покритому С10-2, є ефективним ІС50-10-20 нМ), тоді як у випадку з тО1.2 воно є неефективним (І250-500-1000 нМ). Рідиннофазне інгібування тС10-2 захоплення антигену рТацй в планшеті, покритому тсС10-2, є ефективним при ІС50-10-20 нм, тоді як у випадку з РНЕ-13 воно є неефективним (ІС50-500-1000 нм).
Один аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 9; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 10; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 11.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить: (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО: 12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 13; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 14.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло, що містить: (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 13; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 14, а також одну, дві або три з (а) СОК!І легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 9; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮО МО: 10; і (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 11.
Антитіло С5.2 60 (а) СОВІ1 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО: 17;
(в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 18; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 19; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 20; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 21; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 22.
Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІО МО: 23 і/або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 24 або складатися з них.
Як можна бачити з кристалічної структури на фігурі 10, епітоп зв'язується між важким ланцюгом і легкими ланцюгами С5.2. Відповідно, в пов'язаному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальний фрагмент містять: (а) СОКІ1 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО: 17; або (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮ МО: 18; або (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 19; і (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 20; або (4) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 21; або () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 22.
Антитіло С8.3 (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 25; (в) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 26; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 27; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 28; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 29; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 30.
Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІО МО: 31 і/або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІО МО: 32 або складатися з них.
Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент переважно є людським або гуманізованим антитілом.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти, згадані вище, згідно з одним варіантом здійснення, можуть додатково містити варіант такої СОКІ, СОК2 або СОКЗ легкого і/або важкого ланцюга (не більше ніж з 4 відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж з З відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж з 2 відмінностями в амінокислотах, або не більше ніж з 1 відмінністю в амінокислотах).
Як можна бачити з фігури 11, СОМКІ НС, СОК2 НС, СОКЗ НС і СОКЗ І С щонайменше в одному варіанті здійснення важливі для зв'язування з ділянкою 392-398 тау-білка. У одному варіанті здійснення цього винаходу антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальний фрагмент містять: а) СОМКІ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 4, 5БЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІО МО: 20 ї БЕО ІЮ МО: 28; р) СОК2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 21 ї БЕО ІО МО: 29; і с) СОКЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІО МО: 22 ії БЕО ІЮО МО: 30; і а) СОКЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІО МО: 19 ї БЕО ІЮО МО: 27.
Антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальний фрагмент можуть містити: а) СОКІ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 20; р) СОКО2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 21; с) СОКЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 22; і а) СОКЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 19.
У одному аспекті цього винаходу цей винахід направлений на антитіло або його епітопзв'язувальні фрагменти, що утворюють гідрофобну кишеню, утворювану І13:НЗ, І З:Е87У,
НІ:НІ3, Н2ОМ1, Н2:УЗ з 394 пептиду тау-білка. У варіанті здійснення цей винахід направлений на антитіло, яке конкурує з антитілом, додатково описаним в даному описі, за утворення мережі водневих зв'язків між сольватованим (РІЗ396 і І 3:74, НІ:РБ10, НІ1:Т11, НЗ:Е1, НЗІ:Т3; (3 І 3:Е8 являє собою С-кінцевий залишок каркасної ділянки, фланкуючий СОК ІЗ (див. фігуру 11).
Як можна бачити з кристалічної структури, визначеної за допомогою рентгенографічного аналізу, антитіло за цим винаходом зв'язується на двох рівнях селективності. Першим рівнем бо селективності є селективність стосовно гіперфосфорилованого патологічного тау-білка, а другим рівнем селективності є селективність стосовно фосфорилованого серинового залишку, де фосфат вказаного фосфорилованого серину зв'язаний водневим зв'язком з бічним ланцюгом тирозинового залишку, віддаленого на два залишки від вказаного фосфорилованого серину.
Відповідно, аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, селективні стосовно амінокислотного мотиву гіперфосфорилованого тау-білка, що містить фосфорилований серин, віддалений на два залишки від тирозинового залишку. У типовому випадку цей амінокислотний мотив має наступну послідовність:
У-Х - В(фосфорилований) - Р - де М являє собою тирозин, Х являє собою амінокислоту, що зустрічається в природі, Р являє собою опролін, а З(фосфорилований) являє собою серин з фосфорилованою гідроксильною групою бічного ланцюга.
Так само, аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білком, переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІА з амінокислотних залишків, де К є бічним ланцюгом амінокислоти, що зустрічається в природі. (в) Кк і)
Н оя М М
Н Н
(в)
Ге) (в) до М о. се
Н
ІА
Без обмеження будь-якою конкретною теорією вважають, що антитіло за цим винаходом є селективним стосовно амінокислотного мотиву ІА, де вказаний мотив має конформацію, яку приймає патологічний тау-білок. Відповідно, амінокислотний мотив ІА в типовому випадку є послідовністю, селективно розпізнаваною антитілом за цим винаходом. Відповідно, аспект цього винаходу, що представляє інтерес, направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білюом, переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІВ з амінокислотних залишків, де К є бічним ланцюгом
Зо амінокислоти, що зустрічається в природі.
У типовому варіанті здійснення даного аспекту цього винаходу цей винахід направлений на антитіло або його епітопзв'язувальний Фрагмент, які зв'язуються з фосфорилованим тау-білком, переважно з гіперфосфорилованим тау-білком, де вказані антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент є селективними стосовно мотиву ІВ з амінокислотних залишків, такого як, без обмеження, ІС або І, де К є бічним ланцюгом амінокислоти, що зустрічається в природі.
о в о
Н пу
Нм М п к М
Н о о о 2
Ж зле те
Н
ІВ
Ма о о
Н
Нм М й ї ; і
Н о о о а
Ж чає н
Те; он о о
Н
Нм М з М М А,
Н о о о 2
Ж оо те
Н
Тв
Цей винахід також передбачає спосіб зменшення утворення клубків тау-білка у пацієнта, який включає введення пацієнтові, що потребує такого лікування, терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом або його епітопзв'язувальних фрагментів.
Один аспект цього винаходу направлений на спосіб лікування таупатії за допомогою антитіла за цим винаходом або його епітопзв'язувальних фрагментів. У типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АЮ, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАКТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, зчепленого з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогломи і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітичного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. У більш типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО) і хвороби Піка. Зокрема, таупатії можуть бути вибрані з хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АСОЮ)), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО і психіатричними симптомами у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
Відповідно, додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальні фрагменти для застосування в лікуванні таупатії. У типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у
Зо пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАКТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою
Паркінсона, паркінсонізму, зчепленого з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітичного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби
Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. У більш типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АР, або психозу у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями
Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО) і хвороби Піка. Зокрема, таупатії можуть бути вибрані з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО і психіатричними симптомами у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
Додатковий аспект цього винаходу направлений на антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальні фрагменти в композиції разом з фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем, допоміжним засобом і/або стабілізатором. Антитіла за цим винаходом або їх епітопзв'язувальні фрагменти можна застосовувати в терапії для лікування таупатії. У типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАКТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою бо Паркінсона, паркінсонізму, зчепленого з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітичного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби
Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу. У більш типовому випадку таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АР, або психозу у пацієнтів з АО, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями
Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РОР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО) і хвороби Піка. Зокрема, таупатії можуть бути вибрані з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АО і психіатричними симптомами у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві.
Лікування, що передбачається цим винаходом, може бути тривалим, і пацієнт може отримувати лікування щонайменше протягом 2 тижнів, як, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
Антитіла за цим винаходом можуть, наприклад, бути моноклональними антитілами, що отримуються за допомогою гібридомного способу, вперше описаного в КопПіег еї а!., Маїиге 256, 495 (1975), або можуть бути моноклональними антитілами, що отримуються за допомогою рекомбінантних ДНК або інших способів, або переважніше можуть бути отримані за допомогою нового способу, розкритого в даному описі (фігура 9). Моноклональні антитіла також можна виділяти з фагових бібліотек антитіл за допомогою методик, описаних, наприклад, в Сіаскзоп еї аї.,, Маїшге 352, 624-628 (1991), і МаїКкз еї аї., У. МОЇ. Віої. 222, 581-597 (1991). Моноклональні антитіла можна отримувати з будь-якого відповідного джерела. Таким чином, наприклад, моноклональні антитіла можна отримувати з гібридом, отриманих з мишачих В-лімфоцитів селезінки, отриманих від мишей, імунізованих антигеном, що представляє інтерес, наприклад, у вигляді клітин, що експресують антиген на поверхні, або нуклеїнової кислоти, що кодує антиген, що представляє інтерес. Моноклональні антитіла також можна отримувати з гібридом, що походять від клітин, що експресують антитіла, імунізованих людей або ссавців, відмінних від людини, таких як щури, кролі, собаки, вівці, кози, примати і т. п.
У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є гуманізованим антитілом.
Зо Гуманізовані моноклональні антитіла, направлені проти тау-білька можна отримувати з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, що несуть частини людської імунної системи, а не мишачої системи. Такі трансгенні і трансхромосомні миші включають мишей, які називаються в даному описі відповідно мишами НиМАБ (від слів "гуманізоване моноклональне антитіло") і мишами КМ, і в сукупності називаються в даному описі ""трансгенними мишами".
Миша НиМмМАБ містить мінілокус гена людського імуноглобуліну, який кодує нереаранжировані послідовності варіабельних і константних доменів важких ланцюгів (ні у) і варіабельних і константних доменів легких ланцюгів (к) людського імуноглобуліну, разом з цільовими мутаціями, які інактивують ендогенні локуси, що кодують |ц- і к-ланцюги (І опрего, М. еї аЇ., Маїште 368, 856-859 (1994)). Відповідно, у мишей виявляється зменшена експресія мишачого ДМ або Ід9К, ї у відповідь на імунізацію введені трансгени, що кодують людський важкий і легкий ланцюг, піддаються перемиканню класу і соматичній мутації з утворенням високоафінних людських моноклональних антитіл до к-ізотипу (Гопрего, М. еї аї. (1994), вище, огляд яких приведений в І опрего, М., Напароок ої Ехрегітепіа! Рпаптасоїіоду 113, 49-101 (1994),
Г опрего, М. апа Низлаг, 0., Іпіет. Нем. Іттипої. Мої. 13 65-93 (1995) і Нагаїіпо, Р. апа Гопрего, М.,
Апп. М. У. Асай. 5сі 764 536-546 (1995)). Отримання мишей НиМАБ детально описано в Тауїог, . еї аі., Мисівїс Асідє Везвагсі 20, 6287-6295 (1992), Спеп, 5. єї аї., Іпіегпайопаї! Іттипоіоду 5, 647-656 (1993), Тиаїйоп еї аї., У. Іттипої. 152, 2912-2920 (1994), Тауог, Ї.. еї аї., Іпіегпайопаї
Іттипоїоду 6, 579-591 (1994), РівПпмліІа, 0. еї аї., Маїште Віоїесппоіоду 14, 845-851 (1996). Див. також 05 5545806, 005 5569825, 05 5625126, 05 5633425, 5 5789650, 05 5877397, 05 5661016, 05 5814318, 005 5874299, 05 5770429, 005 5545807, МО 98/24884, МО 94/25585, МО 93/1227, УМО 92/22645, МО 92/03918 і УМО 01/09187.
Миші НСо7, НСо12, НСо17 і НСо20 мають порушення КО в своїх ендогенних генах легких ланцюгів (каппа) (як описано в Спеп еї аї., ЕМВО .). 12, 811-820 (1993)), порушення СМО в своїх ендогенних генах важких ланцюгів (як описано в прикладі 1 УМО 01/14424) і трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг (як описано в Різпм/йа еї аї., Масиге ВіоїесппоЇоду 14, 845- 851 (1996)). Крім того, миші НСо7 мають трансген НСо7, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в 5 5770429), миші НСо12 мають трансген НСо12, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в прикладі 2 УМО 01/14424), миші НСо17 мають трансген НСо17, що кодує людський важкий ланцюг (як описано в прикладі 2 МО 01/09187), а миші НСо20 мають трансген НСо20, бо що кодує людський важкий ланцюг. Отримані в результаті миші експресують трансгени, що кодують важкі ланцюги і легкі каппа-ланцюги людських імуноглобулінів, в генетичному оточенні, гомозиготному по руйнуванню ендогенних локусів, що кодують мишачі важкі ланцюги і легкі каппа-ланцюги.
У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в Спеп еї аі.,, ЕМВО .. 12, 811-820 (1993), і ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в прикладі 1 УМО 01/09187. Дана лінія мишей несе трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг, який описаний в Різпм/йа еї аї., Маїшге ВіоїесппоІоду 14, 845-851 (1996).
Дана лінія мишей також несе трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, що складається з НСЕ-фрагмента хромосоми 14 (5020), описаного в УМО 02/43478. Мишей НСо12-
Ва!Б/с, НСо17-ВаїБр/с і НСо20-ВаІрБ/с можна отримувати шляхом схрещування НСо12, НСої17 і
НСог20 з КСо5ЮЖКІ(Ваїб) згідно з описаним в УМО 09/097006.
Миші гТд4510 є відомою моделлю таупатії, що забезпечує часовий і просторовий контроль над експресією трансгену, що кодує мутантний тау-білок. У мишей лінії КМ ендогенний ген мишачого легкого каппа-ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в
Спеп єї аІ., ЕМВО 4). 12, 811-820 (1993), і ендогенний ген мишачого важкого ланцюга був підданий гомозиготному руйнуванню згідно з описаним в прикладі 1 УМО 01/09187. Дана лінія мишей несе трансген КСо5, що кодує людський легкий каппа-ланцюг, який описаний в Рі5пм/йа еї аї., Майте ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996). Дана лінія мишей також несе трансхромосому, що кодує людський важкий ланцюг, що складається з ПСЕ-фрагмента хромосоми 14 (5020), що відповідає за зв'язування з епітопом, як описано в УМО 02/43478.
Спленоцити від цих трансгенних мишей можна використовувати для утворення гібридом, що секретують гуманізовані моноклональні антитіла, згідно з добре відомими методиками.
Гуманізовані моноклональні або поліклональні антитіла за цим винаходом, або антитіла за цим винаходом, що походять від інших видів, також можна отримувати трансгенним шляхом за допомогою отримання іншого ссавця, відмінного від людини, або рослини, що є трансгенними стосовно послідовностей важких і легких ланцюгів імуноглобулінів, що представляють інтерес, і отримання з них антитіла у добувній формі. Що стосується отримання антитіл у ссавців трансгенним шляхом, антитіла можна отримувати в молоці кіз, корів або інших ссавців і добувати з нього. Див., наприклад, О5 5827690; 005 5756687; 05 5750172 і 05 5741957.
Антитіло за цим винаходом може відноситися до будь-якого ізотипу. При виборі ізотипу в типовому випадку виходитимуть з бажаних ефекторних функцій, таких як індукція АЮСС.
Ізотипами, що наводяться як приклад, є Ідс1, Ідс2, ІдсеЗ і Ідб4. Можна використовувати константні домени будь-якого з людських легких ланцюгів каппа- або лямбда-типу. За бажанням, клас антитіла до тау-білка за цим винаходом можна перемкнути за допомогою відомих способів. Наприклад, антитіло за цим винаходом, яке спочатку було ІДМ, можна піддати перемиканню класу на антитіло до за цим винаходом. Додатково, методики перемикання класу можна застосовувати для перетворення одного підкласу ІдО на іншій, наприклад, з ДО на Ідса2.
Таким чином, ефекторну функцію антитіл за цим винаходом можна змінити шляхом перемикання ізотипу, наприклад, на антитіло Ідс1, Ідс2, ІдсеЗ, Ідс4, дО, ІдДА, ЗЕ або ІМ для різних терапевтичних шляхів застосування. У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є антитілом Ідс1, наприклад, Ідс1 к-ізотипу. Вважають, що антитіло відноситься до конкретного ізотипу, якщо його амінокислотна послідовність найбільшою мірою гомологічна цьому ізотипу в порівнянні з іншими ізотипами.
У одному варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є повнорозмірним антитілом, переважно антитілом дО, зокрема, антитілом дос! к-ізотипу. У іншому варіанті здійснення антитіло за цим винаходом є епітопзв'язувальним фрагментом антитіла або одноланцюговим антитілом.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти можна, наприклад, отримувати шляхом розділення на епітопзв'язувальні фрагменти за допомогою традиційних методик, а епітопзв'язувальні фрагменти піддавати скринінгу стосовно корисності таким же чином, як описано в даному описі для повних антитіл. Наприклад, епітопзв'язувальні Е(аб)2-фрагменти можна отримувати шляхом обробки антитіла пепсином. Отриманий в результаті епітопзв'язувальний Е(ар')2:-фрагмент можна обробити для відновлення дисульфідних містків з отриманням епітопзв'язувальних Рар'-фрагментів. Епітопзв'язувальні Бар-фрагменти можна отримувати шляхом обробки антитіла дос папаїном; епітопзв'язувальні Раб'-фрагменти можна отримувати шляхом розщеплювання антитіла дб пепсином. Епітопзв'язувальний Е(аб')- фрагмент також можна отримати за допомогою зв'язування Рар', описаних нижче, за допомогою тіоетерного зв'язку або дисульфідного зв'язку. Епітопзв'язувальний Рар'-ррагмент являє собою бо епітопзв'язувальний фрагмент антитіла, отриманий шляхом розрізання дисульфідного зв'язку в шарнірному домені Е(аб')». Епітопзв'язувальний Рар'ррагмент можна отримати шляхом обробки епітопзв'язувального Е(ар)»:-фрагмента відновником, таким як дитіотреїтол.
Епітопзв'язувальний фрагмент антитіла також можна отримати шляхом експресії нуклеїнових кислот, що кодують такі епітопзв'язувальні фрагменти, в рекомбінантних клітинах (див., наприклад, Емапз еї аї.,.). Іттипої. Мей. 184, 123-38 (1995)). Наприклад, химерний ген, що кодує частину епітопзв'язувального Е(аб)»:-фрагмента, може містити послідовності ДНК, що кодують СНІ-домен і шарнірний домен Н-ланцюга, за якими розташований стоп-кодон для зупинки трансляції, для отримання такої усіченої молекули епітопзв'язувального фрагмента антитіла.
У одному варіанті здійснення антитіло до тау-білка являє собою одновалентне антитіло, переважно одновалентне антитіло, описане в УМО 2007059782 (включена шляхом посилання в даний опис у її повному обсязі), що має делецію в шарнірній ділянці. Відповідно, в одному варіанті здійснення антитіло являє собою одновалентне антитіло, де вказане антитіло до тау- білка сконструйоване за допомогою способу, що включає: ї) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує Мі -ділянку вибраного антиген- специфічного антитіла до тау-білка, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну Сі - ділянку ІД, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Мі -ділянку вибраного антиген- специфічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку Ід, функціонально зв'язані разом, і де у випадку з підтипом Ідс1 нуклеотидна послідовність, що кодує Сі -ділянку, була модифікована так, щоб Сі -ділянка не містила будь-яких амінокислот, здатних утворювати дисульфідні зв'язки або ковалентні зв'язки з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність Сі -ділянки, у присутності поліклонального людського
Іо або при введенні тварині або людині; ії) забезпечення конструктом нуклеїнової кислоти, що кодує важкий ланцюг вказаного одновалентного антитіла, при цьому вказаний конструкт містить нуклеотидну послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антиген-специфічного антитіла, і нуклеотидну послідовність, що кодує константну СН-ділянку людського Ід, де нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку, була модифікована так, щоб ділянка, відповідна шарнірній ділянці і, як того вимагає підтип Ід, іншим ділянкам СН-ділянки, таким як СНЗ-ділянка, не
Зо містила будь-яких амінокислотних залишків, що беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків або ковалентних або стабільних нековалентних зв'язків між важкими ланцюгами з іншими пептидами, що містять ідентичну амінокислотну послідовність СН-ділянки людського Ід, у присутності поліклонального людського ДС або при введенні тварині, людині, де вказана нуклеотидна послідовність, що кодує МН-ділянку вибраного антиген-специфічного антитіла, і вказана нуклеотидна послідовність, що кодує СН-ділянку вказаного Ід, функціонально зв'язані разом; ії) забезпечення клітинної системи експресії для отримання вказаного одновалентного антитіла; ім) отримання вказаного одновалентного антитіла шляхом сумісної експресії конструктів нуклеїнових кислот з (Її) і (ії) в клітинах клітинної системи експресії з (її).
Так само, в одному варіанті здійснення антитіло до тау-білка за цим винаходом являє собою одновалентне антитіло, яке містить: () варіабельний домен антитіла за цим винаходом, описаний в даному описі, або епітопзв'язувальну частину вказаного домену, і (ї) СН-домен імуноглобуліну або його домен, що містить СН2- і СНЗ-домени, де СН-домен або його домен був модифікований таким чином, щоб домен, відповідний шарнірному домену і, якщо імуноглобулін не відноситься до підтипу ІдДо4, іншим доменам СН-домену, таким як СНЗ- домен, не містив будь-яких амінокислотних залишків, здатних утворювати дисульфідні зв'язки з ідентичним СН-доменом або інші ковалентні або стабільні нековалентні зв'язки між важкими ланцюгами з ідентичним СН-доменом у присутності поліклонального людського Ідо.
У додатковому варіанті здійснення важкий ланцюг одновалентного антитіла за цим винаходом був модифікований так, щоб вся шарнірна ділянка була піддана делеції.
У іншому додатковому варіанті здійснення послідовність одновалентного антитіла була модифікована так, щоб вона не містила будь-яких акцепторних сайтів М-зв'язаного глікозилування.
Цей винахід також включає "біспецифічні антитіла", де ділянка зв'язування антитіла з тау- білком (наприклад, ділянка зв'язування з тау-білюом моноклонального антитіла до тау-білка) є частиною двовалентного або полівалентного біспецифічного остову, який націлюється більш ніж на один епітоп (наприклад, другий епітоп може включати епітоп рецептора, що бере участь в активному транспорті, так що біспецифічне антитіло проявлятиме покращений трансцитоз через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр). Таким чином, в іншому 60 додатковому варіанті здійснення одновалентний Раб антитіла до тау-білка може бути з'єднаний з додатковим Бар або 5сЕм, які націлюються на інший білок, з отриманням біспецифічного антитіла. Біспецифічне антитіло може мати подвійну функцію, наприклад, терапевтичну функцію, що надається доменом антитіла, що зв'язується з тау-білком, і транспортну функцію, завдяки якій воно може зв'язуватися з молекулою рецептора для посилення перенесення через біологічний бар'єр, такий як гематоенцефалічний бар'єр.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом також включають одноланцюгові антитіла. Одноланцюгові антитіла представляють собою пептиди, в яких Ем- домени важкого і легкого ланцюгів з'єднані один з одним. У одному варіанті здійснення цей винахід передбачає одноланцюговий Ем (5сЕУ), де важкий і легкий ланцюги в Ем антитіла до тау- білка за цим винаходом з'єднані за допомогою гнучкого пептидного лінкера (у типовому випадку завдовжки приблизно 10, 12, 15 або більше амінокислотних залишків) в один пептидний ланцюг.
Способи отримання таких антитіл описані, наприклад, в 5 4946778, РінскШип в Те
Рпагтасоїоду ої Мопосіопаї! Апііродіев, мої. 113, Козепригуд апа Мооге єдвз. Зргіпдег-Мепад, Мем
Мої, рр. 269-315 (1994), Віга еї а!ї., Зсієпсе 242, 423-426 (1988), Низюп єї аІ., РМАБ ОБА 85, 5879-5883 (1988) і МсСапепу еї аї!., Маїшге 348, 552-554 (1990). Одноланцюгове антитіло може бути одновалентним, якщо використовується тільки один МН і Мі, двовалентним, якщо використовуються два МН і МІ, або полівалентним, якщо використовується більше двох УН і МІ...
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти, описані в даному описі, можна модифікувати шляхом включення, можна модифікувати шляхом включення будь-якої придатної кількості модифікованих амінокислот і/або зв'язків з такими кон'югованими замісниками. Придатність в даному контексті зазвичай визначається здатністю щонайменше в значній мірі зберігати селективність стосовно тау-білка і/або специфічність стосовно тау-білка, притаманну недериватизованому початковому антитілу до тау-білка. Включення однієї або декількох модифікованих амінокислот може бути переважним, наприклад, для збільшення періоду напівжиття поліпептиду в сироватці крові, зменшення антигенності поліпептиду або збільшення стабільності поліпептиду при зберіганні Амінокислоту(и) модифікують, наприклад, котрансляційно або посттрансляційно в ході отримання рекомбінантним шляхом (наприклад, шляхом М-зв'язаного глікозилування в мотивах М-Х-5/І в ході експресії в клітинах ссавців) або модифікують за допомогою синтетичних засобів. Необмежувальні приклади модифікованої
Зо амінокислоти включають глікозиловану амінокислоту, сульфатовану амінокислоту, преніловану (наприклад, фарнезиловану, геранілгераніловану) амінокислоту, ацетиловану амінокислоту, ациловану амінокислоту, ПЕПловану амінокислоту, біотиніловану амінокислоту, карбоксиловану амінокислоту, фосфориловану амінокислоту і т. п. У літературі представлено безліч джерел, які можуть бути керівництвом для фахівця з модифікації амінокислот.
Протоколи, що наводяться як приклад, знаходяться в УмаїЇКег (1998) Ргоївіп Ргоїосої5 Оп СО-
Кот, Нитапа Ргев55, Тоїоула, МУ. Модифіковану амінокислоту можна вибрати, наприклад, з глікозилованої амінокислоти, ПЕГілованої амінокислоти, фарнезилованої амінокислоти, ацетилованої амінокислоти, біотинілованої амінокислоти, амінокислоти, кон'югованої з ліпідним фрагментом, або амінокислоти, кон'югованої з органічним дериватизуючим засобом.
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом також можна модифікувати хімічним шляхом за допомогою ковалентного кон'югування з полімером, наприклад, для збільшення періоду напівжиття в кровотоку. Полімери, що наводяться як приклад, і способи приєднання їх до пептидів проілюстровані, наприклад, в 05 4766106; 05 4179337; 05 4495285 і
ОБ 4609546. Додаткові ілюстративні полімери включають поліоксіетиловані поліоли і поліетиленгліколь (РЕС) (наприклад, РЕС з молекулярною масою від приблизно 1000 до приблизно 40000, наприклад, від приблизно 2000 до приблизно 20000, наприклад, приблизно 3000-12000 г/моль).
Антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна додатково застосовувати в способі діагностики або як діагностичний візуалізуючий ліганд.
У одному варіанті здійснення передбачені антитіла і їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом, що містять одну або декілька мічених радіоактивними ізотопами амінокислот.
Мічене радіоактивним ізотопом антитіло до тау-білка можна застосовувати як в діагностичних, так і в терапевтичних цілях (ще однією можливою ознакою є кон'югування з міченими радіоактивним ізотопом молекулами). Необмежувальні приклади таких міток включають, без обмеження, вісмут (2З3Ві), вуглець (С, 190, 1723, хром ("'Сг), кобальт (7"Со, 90Со), мідь (СИ), диспрозій (55бу), ербій (99Ег), фтор (ЗЕ), гадоліній (1590250, 159054), галій (88(3а, 6/За), германій (68(зе), золото (з8Ди), гольмій (66Но), водень (ЗН), індій (Ти, 712Іп, 119), 115Іп), йод (211, 129|, 125І, 1911), іридій (192Іг), залізо ("Ее), криптон ('"Кг), лантан (779| а), лютецій (77 0), марганець (Мп), молібден (Мо), азот (М, 75М), кисень (20), паладій (093Ра), фосфор (З2Р), калій (К), 60 празеодим (Рг), прометій (79Ріт), реній (85Ве, 88Ке), родій (5), рубідій (ЗВ, 92), рутеній
(82Ви, Ки), самарій (535), скандій (75с), селен ("»5е), натрій (Ма), стронцій (855, 8951, 9251), сірку (55), технецій (Тс), талій (2ИТІ), олово (35п, 11751), ксенон (93Хе), ітербій (99Ур, 175Ур, 1774в), ітрій (у), цинк (952п) і цирконій (9927). Цирконій (9972г) представляє особливий інтерес.
Способи отримання амінокислот, мічених радіоактивними ізотопами, і відповідних похідних пептидів відомі з рівня техніки (див., наприклад, Чипопапз5 еї аіІ., у Сапсег Спетоїпегару апа
Віоштегару 655-686 (2-е видання, під редакцією Спаїпег апа Гоподо, Гірріпсоїї Камеп (1996)) ії 05 4681581; 005 4735210; 005 5101827; 05 5102990 (05 КЕЗ35500), 005 5648471 і 05 5697902.
Наприклад, радіоактивний ізотоп можна кон'югувати за допомогою способу з використанням хлораміну Т (Ііпдедгеп, 5. еї аї. (1998) "Спіогатіпе-Т Іп Нідн-5ресіїіс-Асіїмну Вадіоіодіпайоп ОЇ
Апіїродієз Овіпд М-Биссіпітіду!-3-(ТиітеїНу!івіаппуї!) Вепгоаїе Ав Ап Іпіептеадіаїе", Мисі. Мед. Віо1. 25(7):659-665; Кипи, М. еї аї. (1993) "Зйе-5ресіїс Сопіндайоп Ої А Вадіоіодіпаїєд Рпепеїйпуіатіпе
Оегімайме То А Мопосіопа! Апібоду Незиїйв5 Іп Іпстеазейд Надіоасіїмпу І осаїі2айоп п Титог"", 9.
Мей. Спет. 36(9):1255-1261; Веа, ОМУ. єї аі. (1990) "Зпе-зресіїїсаПу гадіоіодіпаїейд апіїбоду ог
Тагдеїіпу Шштогв", Сапсег Нев. 50(3 Зиррі):8575-8615).
Цей винахід також передбачає антитіла до тау-білка і їх епітопзв'язувальні фрагменти, мічені за допомогою детектовної флуоресцентної мітки (такої як хелат рідкоземельного елементу (наприклад, хелат європію)), мітки флуоресцеїнового типу (наприклад, флуоресцеїн, флуоресцеїнізотіоціанат, 5-карбоксифлуоресцеїн, б-карбоксифлуоресцеїн, дихлортриазиніламінфлуоресцеїн), мітки родамінового типу (наприклад, АГЕХА Р ШООКФО 568 (Іпийгодеп), ТАМКАФ або данзилхлорид), МІМОТАС 680 ХІІ РІ ШОКОСНЕОМЕ" (Регкіп ЕЇІптег), фікоеритрину; умбеліферону, лісаміну; ціаніну; фікоеритрину, техаського червоного, ВОБІРУ
ЕІ -5ЕФ (Іпмігодеп) або його аналога, всі з яких підходять для оптичного виявлення. Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу, люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна виконувати шляхом приєднання діагностичної молекули за цим винаходом до придатних до виявлення речовин, включаючи, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або до комплексів з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин.
Можна використовувати хемілюмінесцентні мітки (наприклад, люмінол, люциферазу,
Зо люциферин і екворин). Таку діагностику і виявлення також можна виконувати шляхом приєднання діагностичної молекули за цим винаходом до детектовних речовин, що включають, без обмеження, різні ферменти, при цьому ферменти включають, без обмеження, пероксидазу хріну, лужну фосфатазу, бета-галактозидазу або ацетилхолінестеразу, або до комплексів з простетичними групами, такими як, без обмеження, стрептавідин/біотин і авідин/біотин. Також можна використовувати парамагнітні мітки, і їх переважно виявляють за допомогою позитронно- емісійної томографії (РЕТ) або однофотонної емісійної комп'ютерної томографії (5РЕСТ). Такі парамагнітні мітки включають, без обмеження, сполуки, що містять парамагнітні іони алюмінію (АЇ), барію (Ва), кальцію (Са), церію (Се), диспрозію (бу), ербію (Ег), європію (Би), гадолінію (са), гольмію (Но), іридію (Іг), літію (Гі), магнію (Мо), марганцю (Мп), молібдену (М), неодиму (Ма), осмію (05), кисню (СО), паладію (Ра), платини (РО, родію (КП), рутенію (Ки), самарію (5т), натрію (Ма), стронцію (5г), тербію (ТБ), тулію (Тт), олова (Зп), титану (Ті), вольфраму (М) і цирконію (7), і, зокрема, Со, СА, Сі, би, Ееє, Рез, (баз, Мп, Мі, Ті, Ме її М, позитрон-випромінювальні ізотопи металів при використанні різних видів позитронно-емісійної томографії і нерадіоактивні парамагнітні іони металів.
Таким чином, в одному варіанті здійснення антитіло до тау-білка або його фрагмент, що зв'язується з тау-білюоюм, за цим винаходом можуть бути міченими флуоресцентною міткою, хемілюмінесцентною міткою, парамагнітною міткою, радіоїзотопною міткою або ферментною міткою. Мічене антитіло або його фрагмент можна застосовувати для виявлення наявності або вимірювання кількості вказаного тау-білка в головному мозку суб'єкта. Цей спосіб може включати виявлення або вимірювання кількості антитіла до тау-білка або фрагмента, що зв'язується з тау-білком, зв'язаного з вказаним тау-білком, шляхом візуалізації іп мімо і може включати візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до тау-білка або фрагмента, що зв'язується з тау-білком, зв'язаного з таким тау-білком.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до вектора експресії, що кодує один або декілька поліпептидних ланцюгів антитіла за цим винаходом або його фрагмента, що зв'язується з тау-білком. Такі вектори експресії можна застосовувати для отримання антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів за цим винаходом рекомбінантним шляхом.
Вектор експресії в контексті цього винаходу може являти собою будь-який відповідний ДНК- або РНК-вектор, включаючи хромосомні, нехромосомні і синтетичні вектори на основі бо нуклеїнових кислот (послідовність нуклеїнової кислоти, що містить відповідний набір елементів
Зб контролю експресії). Приклади таких векторів включають похідні 5М40, бактеріальні плазміди, фагову ДНК, бакуловірус, дріжджові плазміди, вектори, отримані в результаті об'єднання плазмід і фагової ДНК, і вектори на основі вірусної нуклеїнової кислоти (РНК або ДНК). У одному варіанті здійснення нуклеїнова кислота, що кодує антитіло до тау-білка, міститься у векторі на основі "голої" ДНК або РНК, включаючи, наприклад, лінійний експресійний елемент (описаний, наприклад, в ЗуКе5 апа допп5іоп, Маї Віоїтесп 12, 355-59 (1997)), векторі на основі щільно укладеної нуклеїнової кислоти (як описано, наприклад, в 5 6077835 і/або УМО 00/70087), плазмідному векторі, такому як рВК322, рОС 19/18 або рус 118/119, векторі мінімального розміру "тідде" на основі нуклеїнової кислоти (як описано, наприклад, в
Зспнакомв»кі єї аї!., Мої Тнег 3, 793-800 (2001)) або представлена у вигляді векторного конструкта нуклеїнової кислоти, що осаджується, такого як конструкт, що осаджується СаРох (як описано, наприклад, в УМО 00/46147, Вепмепізіу апа Кезпеї, РМАБ ОА 83, 9551-55 (1986), М/ідіег єї аї.,
СеїІ 14, 725 (1978), і Согаго апа Реагзоп, Зотаїййс Сеї! Сепеїйс5 2, 603 (1981)). Такі вектори на основі нуклеїнових кислот і їх застосування добре відомі з рівня техніки (див., наприклад, О5 5589466 і 05 5973972).
У одному варіанті здійснення вектор підходить для експресії антитіл до тау-білка або їх епітопзв'язувальних фрагментів за цим винаходом в бактеріальній клітині. Приклади таких векторів включають вектори експресії, такі як Вісезсгірі (5ігаїадепе), вектори ріМ (Мап Нееке 5
Зеспизвіег, У. Віої. Спет. 264, 5503-5509 (1989), вектори рЕТ (Момадеп, Мадісон, Вісконсін) і т. п.
Вектор експресії може також, або альтернативно, бути вектором, відповідним для експресії в дріжджовій системі. Можна використовувати будь-який вектор, відповідний для експресії в дріжджовій системі. Відповідні вектори включають, наприклад, вектори, що містять конститутивні або індуковані промотори, такі як опромотори генів фактора альфа, алкогольоксидази і РОН (огляд яких наведений в: ЕР. А!йзибреї еї аї., ей. Ситепі Ргоїосої5 іп МоіІесшіаг Віоіоду, Стеєпе Рибріїзпіпд апа УМіІеу Іпіегосівєпсе Мем Моїк (1987), Стгапі єї аї., Меїйодв іп Епгутої! 153, 516-544 (1987), Майцапомісн, 0. єї аІ. Мейоз Мо!. Віо!. 824, 329-358 (2012), Сеїїк,
Е. еї а. Віотесппої. Адм. 30(5), 1108-1118 (2012), Ії, Р. еї а. Аррі. Віоспет. Віоїеснпої. 142(2), 105-124 (2007), Воег, Е. еї а). Аррі. Містобіої!. Віотесппої. 77(3), 513-523 (2007), мап дег Маай, У.М.
Меїпоаз Мої. Віо!. 178, 359-366 (2002), і Ноїдег, Р. Меїтоаз Мої. Віої. 178, 349-357 (2002)).
Зо У векторі експресії за цим винаходом нуклеїнові кислоти, що кодують антитіло до тау-білка, можуть містити будь-який відповідний промотор, енхансер і інші елементи, сприяючі експресії, або бути пов'язаними з ними. Приклади таких елементів включають сильні промотори експресії (наприклад, ІЕ промотор/енхансер СММ людини, а також промотори К5М, 5М40, 51 3-3, ММТІМ і
Ї ТА НІМ), ефективні полі-(А)-послідовності термінації, точку початку реплікації для продукту плазміди в Е. соїї, ген стійкості до антибіотиків як селективний маркер і/або відповідний сайт клонування (наприклад, полілінкер). Нуклеїнові кислоти також можуть містити індукований промотор, а не конститутивний промотор, такий як ІЕ СММ (фахівець в даній галузі техніки зрозуміє, що такі терміни фактично описують ступінь експресії гена в певних умовах).
У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, такої як трансфектома, яка виробляє антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за цим винаходом, визначені в даному описі, або біспецифічну молекулу за цим винаходом, визначену в даному описі. Приклади клітин-хазяїнів включають клітини дріжджів, бактерій і ссавців, такі як клітини СНО або НЕК. Наприклад, в одному варіанті здійснення цей винахід передбачає клітину, що містить нуклеїнову кислоту, стабільно інтегровану в клітинний геном, яка містить послідовність, що кодує продукт експресії у вигляді антитіла до тау-білка за цим винаходом або його епітопзв'язувального фрагмента. У іншому варіанті здійснення цей винахід передбачає клітину, що містить неінтегровану нуклеїнову кислоту, таку як плазміда, косміда, фагміда або лінійний експресійний елемент, яка містить послідовність, що кодує продукт експресії у вигляді антитіла до тау-білка або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом.
У додатковому аспекті цей винахід відноситься до способу отримання антитіла до тау-білка за цим винаходом, при цьому вказаний спосіб включає стадії: а) культивування гібридоми або клітини-хазяїна за цим винаходом, як описано в даному описі вище, і БЮ) очищення антитіла за цим винаходом від культурального середовища.
У одному варіанті здійснення цей винахід відноситься до препарату в тому сенсі, в якому цей термін використовується в даному описі, який містить антитіло до тау-білка, визначене в даному описі, і який практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися 3 тау-білююом, або істотним чином не змінюють функціональні характеристики препарату, спрямовані проти тау-білка. Таким чином, такий препарат не бо охоплює сироватку крові, що утворюється в природних умовах, або очищений похідний продукт такої сироватки крові, який містить суміш антитіла до тау-білка і іншого антитіла, яке не змінює функціональні характеристики антитіла до тау-білка в препараті, де такі функціональні характеристики являють собою: (ї) практично відсутню здатність до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (її) практично відсутню здатність до зв'язування з тау-білююом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатність селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404; (м) здатність до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатність розрізняти патологічний і непатологічний людські тау-білки і/або (мії) здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей гТ94510 або здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білюа щонайменше на 9095 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами з головного мозку людей з АЮ.
Цей винахід, зокрема, відноситься до препаратів такого антитіла до тау-білка, що має структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності (у будь-яких своїх СОК, варіабельних доменах, залишках каркасної ділянки і/або константних доменах) в порівнянні із структурою антитіла до тау-білка, що зустрічається в природі, де вказана структурна зміна обумовлює прояв антитілом до тау-білка значно змінених функціональних характеристик (тобто більш ніж з 2095 різницею, більш ніж з 40 95 різницею, більш ніж з 60 95 різницею, більш ніж з 80 95 різницею, більш ніж з 100 95 різницею, більш ніж з 150 95 різницею, більш ніж з 2-кратною різницею, більш ніж з 4-кратною різницею, більш ніж з 5-кратною різницею або більш ніж з 10-
Зо кратною різницею у функціональних характеристиках) в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним антитілом до тау-білка, що зустрічається в природі; де вказані функціональні характеристики являють собою: (ї) практично відсутню здатність до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (і) практично відсутню здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатність до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатність селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404; (м) здатність до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатність розрізняти патологічний і непатологічний людські тау-білки і/або (мії) здатність до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей гТ94510 або здатність до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білюа щонайменше на 9095 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами головного мозку людей з АЮ.
Термін "практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах" відноситься до повної відсутності таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в таких препаратах або до включення таких антитіл, що утворюються в природних умовах, в такі препарати в концентрації, в якій вони істотним чином не впливають на властивості зв'язування з тау-білком даних препаратів. Говорять, що антитіло є "виділеним", якщо воно не має еквівалента, що утворюється в природних умовах, або було відокремлене або очищене від компонентів, які в природних умовах супроводжують його.
Термін "антитіла, що утворюються в природних умовах", використовуваний стосовно таких препаратів, відноситься до антитіл (включаючи аутоантитіла, що утворюються в природних бо умовах), утворення яких відбувається в організмі живих людей або інших тварин як природний наслідок функціонування їх імунних систем.
Таким чином, препарати за цим винаходом не виключають, а насправді явним чином охоплюють препарати, які містять антитіло до тау-білка і спеціально додане додаткове антитіло, здатне зв'язуватися з епітопом, який не міститься в тау-білку. Такі препарати, зокрема, включають їх варіанти здійснення, в яких препарат проявляє підвищену ефективність в лікуванні хвороби Альцгеймера (А), хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РБР) і кортикобазальної дегенерації (СВО). Додатково, цей винахід направлений на препарати, які містять антитіло, антитіла до тау-білка або їх епітопзв'язувальні фрагменти, призначені для застосування в лікуванні психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АЮ, або психозу у пацієнтів з АС, і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями
Леві. Додатково, препарати за цим винаходом містять антитіло, антитіла до тау-білка або їх епітопзв'язувальні фрагменти, які можна застосовувати в лікуванні інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона.
У ще одному додатковому аспекті цей винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить: (ї) антитіло до тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент, обидва з яких визначені в даному описі, або препарат в тому сенсі, в якому цей термін визначений в даному описі, який містить таке антитіло до тау-білка або його епітопзв'язувальний фрагмент; і (ї) фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтичні композиції можна складати з фармацевтично прийнятними носіями або розріджувачами, а також з будь-якими іншими відомими допоміжними засобами і наповнювачами згідно з традиційними методиками, такими як розкриті в Кетіпдіоп: Те Зсіепсе апа Ргасіїсе ої Рпагтасу, 22па Едіоп, Сеппаго, Ед., Маск Рибіїєпіпа Со., Еавіоп, РА, 2013.
Фармацевтично прийнятні носії або розріджувачі, а також будь-які інші відомі допоміжні засоби і наповнювачі мають бути придатними для вибраної сполуки цього винаходу і вибраного способу введення. Придатність носіїв і інших компонентів фармацевтичних композицій визначають на підставі відсутності значного негативного впливу на бажані біологічні властивості вибраної сполуки або фармацевтичної композиції цього винаходу (наприклад, на підставі меншого, ніж істотний вплив (на підставі 10 95 або меншого відносного інгібування, 5 95 або
Зо меншого відносного інгібування і т. д.)) стосовно зв'язування з епітопом.
Фармацевтична композиція цього винаходу також може містити розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонний детергент, такий як Тмееп-20 або Тмееп-80), стабілізатори (наприклад, цукри або вільні протеїногенні амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізатори і/або інші матеріали, відповідні для включення у фармацевтичну композицію. Розріджувач вибирають так, щоб він не впливав на біологічну активність комбінації.
Прикладами таких розріджувачів є дистильована вода, фізіологічний фосфатно-сольовий буферний розчин, розчини Рінгера, розчин декстрози і розчин Хенка. Крім того, фармацевтична композиція або склад також можуть містити інші носії або нетоксичні нетерапевтичні неімуногенні стабілізатори і т. п. Композиції також можуть містити великі макромолекули, що поволі метаболізуються, такі як білки, полісахариди, такі як хітозан, полімолочні кислоти, полігліколеві кислоти і сополімери (наприклад, функціоналізована латексом сефароза, агароза, целюлоза і т. п.), полімери амінокислот, сополімери амінокислот і агрегати ліпідів (наприклад, масляні краплі або ліпосоми).
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях цього винаходу можна змінювати для того, щоб отримати кількість активного інгредієнта, яка є ефективною для досягнення бажаної терапевтичної відповіді для конкретного пацієнта, композиції і способу введення. Вибраний рівень дози залежатиме від ряду фармакокінетичних чинників, зокрема активності конкретних використовуваних композицій цього винаходу або їх аміду, шляху введення, часу введення, швидкості виведення конкретної використовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук і/або матеріалів, вживаних в комбінації з конкретними використовуваними композиціями, віку, статі, ваги, стану, загального стану здоров'я і анамнезу пацієнта, що піддається лікуванню, а також аналогічних чинників, добре відомих в галузі медицини.
Фармацевтичну композицію можна вводити будь-яким відповідним шляхом і способом, зокрема парентеральним, місцевим, пероральним або інтраназальним способом, для профілактичного і/або терапевтичного лікування. Згідно з одним варіантом здійснення фармацевтичну композицію цього винаходу вводять парентерально. Використовувані в даному описі винаходу фрази "парентеральне введення" і "що вводиться парентерально" означають способи введення, відмінні від ентерального і місцевого введення, зазвичай шляхом ін'єкції, і бо включають епідермальну, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну,
інтратекальну, внутрішньокапсулярну, внутрішньоочноямкову, внутрішньосерцеву, внутрішньошкірну, внутрішньочеревну, внутрішньосухожильну, транстрахеальну, підшкірну, субкутикулярну, внутрішньосуставну, підкапсулярну, субарахноїдальну, інтраспінальну, внутрічерепну, інтраторакальну, епідуральну і внутрішньогрудинну ін'єкцію і інфузію.
Додаткові відповідні шляхи введення сполуки за цим винаходом іп мімо і іп міго добре відомі з рівня техніки і можуть бути вибрані звичайними фахівцями в даній галузі техніки.
У одному варіанті здійснення цю фармацевтичну композицію вводять за допомогою внутрішньовенної або підшкірної ін'єкції або інфузії.
Фармацевтично прийнятні носії включають будь-які можливі відповідні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, засоби, що надають ізотонічність, антиоксиданти і засоби, що уповільнюють абсорбцію, і т. п., які є фізіологічно сумісними із сполуками цього винаходу.
Приклади відповідних водних і неводних носіїв, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях цього винаходу, включають воду, сольовий розчин, фосфатно- сольовий буферний розчин, етанол, декстрозу, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.), а також їх придатні суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, кукурудзяна олія, арахісова олія, бавовняна олія і кунжутна олія, колоїдні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат, і/або різні буфери. В галузі фармацевтики добре відомі інші носії.
Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального отримання стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій.
Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли будь-яке традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях цього винаходу.
Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування матеріалів для покриття, таких як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і шляхом застосування поверхнево-активних речовин.
Фармацевтичні композиції цього винаходу також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад, (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію і т. п.; (2) жиророзчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутилований гідроксіанізол (ВНА), бутилований гідрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол і т. п.; і (3) металохелатори, такі як лимонна кислота, етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕОТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота і т. п.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити засоби, що забезпечують ізотонічність, такі як цукри, багатоатомні спирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин, або хлорид натрію, в композиціях.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом також можуть містити одну або декілька допоміжних речовин, відповідних для вибраного шляху введення, такі як консерванти, зволожувальні речовини, емульгатори, диспергуючі речовини, консерванти або буфери, які можуть збільшити термін зберігання або ефективність фармацевтичної композиції. Сполуки цього винаходу можна отримувати з носіями, які захищатимуть сполуки від швидкого вивільнення, наприклад, у вигляді складу з контрольованим вивільненням, в тому числі у вигляді імплантатів, трансдермальних пластирів і мікроінкапсульованих систем доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, полімери, які руйнуються біологічно, біосумісні полімери, такі як сополімер етилену і вінілацетату, поліангідриди, полігліколеву кислоту, колаген, поліортоестери і полімолочну кислоту, окремо або разом з воском, або інші матеріали, добре відомі з рівня техніки. Способи отримання таких складів в цілому відомі фахівцям в даній галузі техніки. Див., наприклад, Зивіаіїпей апа
Сопігоїїєй ВеІєазе Ога Овєїїмегу Зувієтв, .). В. Вобіпзоп, єд., Магсеї! Оеккег, Іпс., Мем МоїКк, 1978.
У одному варіанті здійснення сполуки за цим винаходом можна складати для забезпечення належного розподілу іп мімо. Фармацевтично прийнятні носії для парентерального введення включають стерильні водні розчини або дисперсії і стерильні порошки для індивідуального приготування стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ і засобів для фармацевтично активних речовин відоме з рівня техніки. За винятком випадків, коли які-небудь традиційне середовище або засіб є несумісними з активною сполукою, передбачається їх застосування у фармацевтичних композиціях за цим винаходом. Додаткові активні сполуки також можна включати до складу композицій. бо Фармацевтичні композиції для ін'єкцій як правило мають бути стерильними і стабільними в умовах виготовлення і зберігання. Композиція може бути складена у вигляді розчину, мікроемульсії, ліпосоми або іншої впорядкованої структури, відповідної для високої концентрації лікарського засобу. Носій може бути водним або неводним розчинником або дисперсійним середовищем, що містить, наприклад, воду, етанол, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.) і відповідні їх суміші, рослинні олії, такі як оливкова олія, і придатні для ін'єкцій органічні естери, такі як етилолеат. Належну плинність можна підтримувати, наприклад, шляхом застосування покриття, такого як лецитин, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсії і шляхом застосування поверхнево-активних речовин. В багатьох випадках буде переважним включення засобів, що забезпечують ізотонічність, наприклад цукрів, багатоатомних спиртів, таких як гліцерин, маніт, сорбіт, або хлориду натрію в композицію. Тривалого всмоктування ін'єкційних композицій можна досягти шляхом включення в композицію засобу, що уповільнює всмоктування антитіла, наприклад моностеаратних солей і желатину. Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, наприклад, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією.
Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти, наприклад, з перелічених вище. У разі стерильних порошків для приготування стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів отримання порошків є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті якої отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Стерильні ін'єкційні розчини можна отримати шляхом поміщення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним інгредієнтом або комбінацією інгредієнтів, перелічених вище, при необхідності з подальшою стерилізуючою мікрофільтрацією. Зазвичай дисперсії отримують шляхом поміщення активної сполуки в стерильний наповнювач, який містить основне дисперсійне середовище і інші необхідні інгредієнти з перелічених вище. У разі стерильних порошків для отримання стерильних ін'єкційних розчинів прикладами способів приготування є вакуумна сушка і сублімаційна сушка (ліофілізація), в результаті якої отримують порошкоподібний активний інгредієнт плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт з їх
Зо розчину, заздалегідь підданого стерилізуючій фільтрації.
Схеми прийому у вищезгаданих способах лікування і шляхах застосування, описаних в даному описі винаходу, коректують для отримання оптимальної бажаної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді). Наприклад, можна вводити одноразову болюсну дозу, можна вводити декілька розділених доз протягом деякого часу, або дозу можна пропорційно зменшувати або збільшувати, як визначається потребами терапевтичної ситуації. Композиції для парентерального введення можна складати у вигляді одиничної лікарської форми для простоти введення і рівномірності дозування. Одинична лікарська форма, використовувана в даному описі винаходу, відноситься до фізично дискретних одиниць, зручних в якості одиничних доз для суб'єктів, що підлягають лікуванню; при цьому кожна одиниця містить попередньо визначену кількість активної сполуки, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту, спільно з необхідним фармацевтичним носієм. Технічні вимоги до одиничних лікарських форм цього винаходу продиктовані (а) унікальними характеристиками активної сполуки і конкретним терапевтичним ефектом, якого необхідно досягти, і (Б) обмеженнями, притаманними галузі складання такої активної сполуки для лікування чутливості у індивідуумів, і безпосередньо залежать від них.
Ефективні дози і схеми прийому антитіл або їх епітопзв'язувальних фрагментів за цим винаходом залежать від захворювання або стану, що підлягають лікуванню, і можуть бути визначені фахівцями в даній галузі техніки. У будь-який заданий день, коли дають дозу, доза може знаходитися в діапазоні від приблизно 0,0001 до приблизно 100 мг/кг ії частіше від приблизно 0,01 до приблизно 5 мг/кг ваги тіла реципієнта. Наприклад, дози можуть складати 1 мг/кг ваги тіла або 10 мг/кг ваги тіла або знаходитися в діапазоні 1-10 мг/кг ваги тіла. Таким чином, ілюстративні дози включають від приблизно 0,1 до приблизно 10 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 5 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 2 мг/кг/ваги тіла, від приблизно 0,1 до приблизно 1 мг/кг/ваги тіла, наприклад, приблизно 0,15 мг/кг/ваги тіла, приблизно 0,2 мг/кг/ваги тіла, приблизно 0,5 мг/кг/ваги тіла, приблизно 1 мг/кг/ваги тіла, приблизно 1,5 мг/кг/ваги тіла, приблизно 2 мг/кг/ваги тіла, приблизно 5 мг/кг/ваги тіла або приблизно 10 мг/кг/ваги тіла.
Лікар із стандартною кваліфікацією в даній галузі легсо може визначити і призначити ефективну кількість необхідної фармацевтичної композиції. Наприклад, лікар може почати з доз бо антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента за цим винаходом, використовуваних у фармацевтичній композиції нижчих рівнів, ніж потрібно для досягнення бажаного терапевтичного ефекту, і поступово підвищувати дозу до досягнення бажаного ефекту. В цілому, відповідною добовою дозою композиції цього винаходу буде така кількість сполуки, яка є найнижчою дозою, ефективною для отримання терапевтичного ефекту. Така ефективна доза зазвичай залежатиме від описаних вище чинників. Введення може бути, наприклад, внутрішньовенним, внутрішньом'язовим, внутрішньочеревним або підшкірним. За бажанням, ефективну добову дозу фармацевтичної композиції можна вводити у вигляді двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести або більше частин дози, що вводяться окремо з відповідними інтервалами протягом доби, необов'язково у вигляді одиничних лікарських форм. Хоча сполуки цього винаходу можна вводити окремо, переважно вводити сполуки у вигляді фармацевтичної композиції, описаної вище.
Мічені антитіла або їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати в діагностичних цілях для виявлення, діагностики або моніторингу захворювань або порушень.
Цей винахід передбачає виявлення або діагностику нейродегенеративного або когнітивного захворювання або порушення, зокрема, без обмеження, хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РР) і кортикобазальної дегенерації (СВО), що включають: (а) проведення аналізу наявності піроглутамілованих Ар- фрагментів у клітинах або зразках тканин суб'єкта за допомогою одного або декількох антитіл, що специфічно зв'язуються з тау-білком; і (Б) проведення порівняння рівня антигену з контрольним рівнем, наприклад, з рівнями в зразках нормальних тканин, при якому підвищення аналізованого рівня антигену в порівнянні з контрольним рівнем антигену свідчить про захворювання або порушення або свідчить про тяжкість захворювання або порушення.
Антитіла або їх епітопзв'язувальні фрагменти за цим винаходом можна застосовувати для аналізу тау-білка або фрагментів тау-білка в біологічному зразку за допомогою імуногістохімічних способів, добре відомих з рівня техніки. Інші способи з використанням антитіл, застосовні для виявлення білка, включають імунологічні аналізи, такі як імуноферментний аналіз (ЕГІ5БА) і радіоіїмунологічний аналіз (КІА), а також аналізи з використанням платформи Мезо бсаІе Різсомегу (М5О). У таких наборах і способах можна застосовувати відповідні мітки для антитіл, і мітки, відомі з рівня техніки, включають ферментні
Ко) мітки, такі як лужна фосфатаза і глюкозооксидаза; радіоізотопні мітки, такі як йод (7251, 71911), вуглець (77С), сірка (355), тритій (ЗН), індій (п) і технецій ("Тс); а також люмінесцентні мітки, такі як люмінол і люцифераза; і флуоресцентні мітки, такі як флуоресцеїн і родамін.
Наявність мічених антитіл до тау-білка або їх фрагментів, що зв'язуються з тау-білком, можна виявляти іп мімо в діагностичних цілях. У одному варіанті здійснення діагностика включає: а) введення суб'єктові ефективної кількості такої міченої молекули; Б) очікування протягом деякого проміжку часу після введення для забезпечення концентрації міченої молекули в місцях відкладення АВ (за наявності таких) і для забезпечення очищення від незв'язаної міченої молекули до фонового рівня; с) визначення фонового рівня і а) виявлення міченої молекули у суб'єкта таким чином, що виявлення міченої молекули на рівні, що перевищує фоновий, свідчить про те, що суб'єкт має захворювання або порушення, або свідчить про тяжкість захворювання або порушення. Відповідно до такого варіанта здійснення молекулу мітять візуалізуючим компонентом, відповідним для виявлення, за допомогою конкретної системи візуалізації, відомої фахівцям в даній галузі. Фонові рівні можна визначити за допомогою різних способів, відомих з рівня техніки, зокрема шляхом порівняння кількості виявленого міченого антитіла із стандартним значенням, заздалегідь визначеним для конкретної системи візуалізації. Способи і системи, які можна застосовувати в способах діагностики за цим винаходом, включають, без обмеження, комп'ютерну томографію (СТ), сканування всього тіла, таке як позитронно-емісійна томографія (РЕТ), магнітно-резонансна візуалізація (МК) і ультразвукове дослідження.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в терапії.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в лікуванні, діагностиці або візуалізації таупатій.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в лікуванні хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РР) і кортикобазальної дегенерації (СВО).
У додатковому аспекті цей винахід передбачає моноклональне антитіло або його бо епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в даному описі, для застосування у виробництві лікарського препарату для лікування, діагностики або візуалізації таупатій.
Лікарський препарат переважно призначений для лікування хвороби Альцгеймера (АБ), хвороби аргірофільних зерен (АСОЮ), прогресуючого над'ядерного паралічу (Р5Р) і кортикобазальної дегенерації (СВО), найпереважніше хвороби Альцгеймера (АБ). Лікарський препарат також переважно призначений для лікування психозу, зокрема, психозу, обумовленого
АР, або психозу у пацієнтів з АБО, і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями
Леві.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає спосіб лікування, діагностики або візуалізації хвороби Альцгеймера або інших таупатій у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб включає введення лікарського препарату на основі моноклонального антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента, визначених в даному описі, вказаному суб'єктові в ефективній кількості.
У переважному варіанті здійснення лікування є тривалим і переважно продовжується щонайменше протягом 2 тижнів, як, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше.
У додатковому аспекті цей винахід передбачає набір, що містить антитіло або його фрагмент, визначені в даному описі, для застосування в терапії.
Варіанти здійснення 1. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка, таким як фосфорилований залишок 396 ЗЕО ІО МО: 33. 2. Антитіло відповідно до варіанта здійснення 1, що складається з інтактного антитіла. 3. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіантів здійснення 1 або 2, що містять епітопзв'язувальний фрагмент, вибраний з групи, що складається з Еу-фрагмента (наприклад, одноланцюгового Ем і Гм, стабілізованого дисульфідними зв'язками); Гар-подібного фрагмента (наприклад, Рар-фрагмента, Бар'-фрагмента і Е(ар)2-фрагмента); (Ем)2-СНЗ-домену мініантитіла і доменного антитіла (наприклад, окремого варіабельного МН-домену або варіабельного Мі -домену), або що складаються з нього. 4. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло вибране з групи, що складається з антитіл підтипу ДС, Ідс2,
ІЧОЗ або Ідсаі. 5. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, які є людськими або гуманізованими. 6. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло або епітопзв'язувальний фрагмент проявляють одне або декілька з наступних властивостей: (а) селективність і специфічність стосовно людського патологічного тау-білка; (р) афінність зв'язування (КО) з рТаи 386-408 (р5396/р5З404) (ЗЕО ІО МО: 33), що становить 0,5-10 нМ, як, наприклад, 1-5 нМ або 1-2 НМ. 7. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де вказане антитіло практично не зв'язується з фосфорилованим залишком 404 тау-білка (ЗЕО ІЮ МО: 33). 8. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (ах СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 1 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 2 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З
БО відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: З або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (4) СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 4 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; 60 (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 5 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; і (0 СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 6 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 9. Моноклональне антитіло відповідно до варіанта здійснення 8, що містить варіабельний домен важкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 8 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах, і/або варіабельний домен легкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 7, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше 3 відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 10. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (ах СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 9 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 10 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 11 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (4) СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 12 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З
Ко) відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 13 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; і (9 СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІО МО: 14 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 11. Моноклональне антитіло відповідно до варіанта здійснення 10, що містить варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 16 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше 3 відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах, і або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 15 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 12. Моноклональне антитіло, де епітопзв'язувальний фрагмент містить: (ах СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 17 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З
БО відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 18 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 19 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; 60 (4) СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 20 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 21 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; і (5 СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 22 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 13. Моноклональне антитіло відповідно до варіанта здійснення 12, що містить варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІЮ МО: 24 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах, і/або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 23 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 14. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (ах СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 25 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 26 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮ МО: 27 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З
Ко) відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (4) СОКІ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 28 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за ЗЕО ІЮО МО: 29 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах; і (5 СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 30 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 15. Моноклональне антитіло відповідно до варіанта здійснення 14, що містить варіабельний домен важкого ланцюга за ЗЕО ІО МО: 32 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах, і/або варіабельний домен легкого ланцюга за 5ЕО ІЮ МО: 31 або амінокислотну послідовність, що має не більше 4 відмінностей в амінокислотах, або не більше З відмінностей в амінокислотах, або не більше 2 відмінностей в амінокислотах, або не більше 1 відмінності в амінокислотах. 16. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 1-7, де вказані антитіло або його фрагмент конкурують з антитілом або його епітопзв'язувальним фрагментом, визначеними у варіантах здійснення 8-15, за зв'язування з людським тау-білком. 17. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, що містять Ес-домен. 18. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, що додатково містять компонент для збільшення періоду напівжиття іп мімо. 60 19. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 18,
де компонент для збільшення періоду напівжиття іп мімо вибраний з групи, що складається з поліетиленгліколю (РЕС), людського сироваткового альбуміну, глікозилуючих груп, жирних кислот і декстрану. 20. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх варіантів здійснення, де антитіло додатково містить детектовний компонент. 21. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 20, де детектовний компонент вибраний з групи, що складається з флуоресцентної мітки, хемілюмінесцентної мітки, парамагнітної мітки, радіоізотопної мітки або ферментної мітки. 22. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіантів здійснення 20 або 21, де детектовний компонент містить радіоактивний ізотоп або складається з нього. 23. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 22, де радіоактивний ізотоп вибраний з групи, що складається з 99п"Тес, 1, 67(За, 88(За, 72Ав, 892, 123) і 2011. 24. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 21, де детектовний компонент містить парамагнітний ізотоп або складається з нього. 25. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 24, де парамагнітний ізотоп вибраний з групи, що складається з 157434, Мп, 792Пу, 52Стк і 56Ее, 26. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 20-25, де детектовний компонент виявляється за допомогою методики візуалізації, такої як ЗРЕСТ, РЕТ, МК, оптична або ультразвукова візуалізація. 27. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 20-26, де детектовний компонент опосередковано з'єднаний з антитілом або його епітопзв'язувальним фрагментом за допомогою лінкерного компоненту. 28. Антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 27, де лінкерний компонент вибраний з групи, що складається 3 похідних 1,4,7,10- тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраоцтової кислоти (ОТА), дефероксаміну (ОБО), похідних діетилентриамінпентаоцтової кислоти (ОТРА), похідних 5-2-(4-ізотіоціанатобензил)-1,4,7- триазациклононан-1,4,7-триоцтової кислоти (МОТА) і похідних 1,4,8,11-тетраазациклододекан- 1,4,8,11-тетраоцтової кислоти (ТЕТА).
Зо 29. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, де важкий ланцюг вибраний з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 24, 5ЕО ІЮО МО: 32 і 5ЕО ІЮО МО: 35, а легкий ланцюг вибраний з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 7, ЗЕО ІО
МО: 15, БЕО ІЮО МО: 23 і ЗЕО ІЮ МО: 36. 30. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що містять: (а) СОКІ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 4, 5БЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІО МО: 20 ї БЕО ІЮ МО: 28; (Б) СОК2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 21 ї БЕО ІО МО: 29; і (с) СОКЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 22 ії БЕО ІЮО МО: 30; і (4) СОКЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з БЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІО МО: 19 ї БЕО ІЮО МО: 27. 31. Антитіло за цим винаходом або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь- якого з варіантів здійснення 1-7, що містять: а) СОКІ1 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 20; (в) СОК2 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за зЕО ІЮ МО: 21; (с) СОКЗ важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 22; і (4) СОКЗ легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 19. 32. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-31. 33. Молекула нуклеїнової кислоти відповідно до варіанта здійснення 32, де молекула є молекулою кДНК. 34. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, визначену у варіантах здійснення 32 або 33. 35. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, визначену в будь-якому з варіантів здійснення 32-34. 36. Спосіб отримання антитіла або епітопзв'язувального фрагмента, визначених в будь- якому з варіантів здійснення 1-31, при цьому спосіб включає культивування клітини-хазяїна, визначеної у варіанті здійснення 35, в умовах, що забезпечують можливість експресії бо кодованого антитіла або його епітопзв'язувального фрагмента.
37. Препарат, що містить антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх пунктів, де вказаний препарат практично не містить антитіл, що утворюються в природних умовах, які або не здатні зв'язуватися з тау-білком, або істотним чином не змінюють функціональні характеристики препарату, спрямовані проти тау-білка, де вказані функціональні характеристики вибрані з групи, що складається з: (ї) практично відсутньої здатності до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (і) практично відсутньої здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатності до зв'язування з тау-білюком, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатності селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404; (м) здатності до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатності розрізняти патологічний і непатологічний людські тау-білки і/або (мії) здатності до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей гТ94510 або здатності до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-більл«а щонайменше на 9095 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 1095, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами з головного мозку людей з АЮ. 38. Препарат, що містить антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент відповідно до будь-якого з попередніх пунктів, де вказане антитіло або його вказаний епітопзв'язувальний фрагмент мають структурну зміну в своїй амінокислотній послідовності в порівнянні із структурою антитіла, що зустрічається в природі, до тау-білка, де вказана структурна зміна обумовлює прояв вказаним антитілом або вказаним фрагментом змінених функціональних характеристик в порівнянні з функціональними характеристиками, що проявляються вказаним
Зо антитілом до тау-білка, що зустрічається в природі, де вказані функціональні характеристики вибрані з групи, що складається з: (І) практично відсутньої здатності до зв'язування з нефосфорилованим тау-білком; (і) практично відсутньої здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5404 і не фосфорилованим в 5396; (ії) здатності до зв'язування з тау-білюом, фосфорилованим в 5396; (ім) здатності до зв'язування з тау-білком, фосфорилованим як в 5396, так і в 5404; (м) здатності селективно розрізняти фосфориловані залишки 5396 і 5404 тау-білка, так що вони практично не здатні зв'язуватися з фосфорилованим залишком 404; (м) здатності до зв'язування з гіперфосфорилованим тау-білком з головного мозку людей з хворобою Альцгеймера; (мії) здатності розрізняти патологічний і непатологічний людські тау-білки і/або (мії) здатності до специфічного зменшення смуг гіперфосфорилованого тау-білка розміром 64 кДа і 70 кДа щонайменше на 90 95 без зменшення при цьому смуги тау-білка розміром 55 кДа більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з імуновиснаженими екстрактами від трансгенних мишей гТ94510 або здатності до специфічного зменшення смуг фосфорилованого в 5396 гіперфосфорилованого тау-білюа щонайменше на 9095 без зменшення при цьому смуг негіперфосфорилованого тау-білка більше, ніж на 10 95, при застосуванні, згідно з описаним в даному описі, з посмертними екстрактами з головного мозку людей з АЮ. 39. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-31, або препарат, визначений в будь-якому з варіантів здійснення 37-38; і фармацевтично прийнятний носій. 40. Моноклональне антитіло або його фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1- 31, препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 37-38 або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 39 для застосування в медицині. 41. Моноклональне антитіло або його фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1- 31, препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 37-38 або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 39 для застосування в лікуванні таупатії. бо 42. Моноклональне антитіло або його фрагмент, препарат або фармацевтична композиція відповідно до варіанта здійснення 41, де таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби
Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), кортикобазальної дегенерації (СВО), психозу, зокрема, психозу, обумовленого А0, або психозу у пацієнтів з АОС, і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві. 43. Застосування моноклонального антитіла або його фрагмента згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-31, препарату згідно з будь-яким з варіантів здійснення 37-38 або фармацевтичної композиції згідно з варіантом здійснення 39 у виробництві лікарського препарату для лікування таупатії. 44. Застосування моноклонального антитіла або його фрагмента, препарату або фармацевтичної композиції відповідно до варіанта здійснення 43, де таупатія вибрана з групи, що складається з хвороби Альцгеймера, хвороби аргірофільних зерен (АС), прогресуючого над'ядерного паралічу (Р5Р), кортикобазальної дегенерації (СВО), психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АС, і психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві. 45. Спосіб лікування хвороби Альцгеймера або інших таупатій у суб'єкта, при цьому вказаний спосіб включає введення моноклонального антитіла або його фрагмента згідно з будь- яким з варіантів здійснення 1-31, препарату згідно з будь-яким з варіантів здійснення 37-38 або фармацевтичної композиції згідно з варіантом здійснення 39 вказаному суб'єктові в ефективній кількості. 46. Спосіб відповідно до варіанта здійснення 45, де лікування є тривалим. 47. Спосіб відповідно до варіанта здійснення 46, де тривале лікування продовжують щонайменше протягом 2 тижнів, як, наприклад, щонайменше протягом 1 місяця, 6 місяців, 1 року або довше. 48. Спосіб відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 45-47, де суб'єктом є людина. 49. Набір, що містить моноклональне антитіло або його фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1-31, препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 37-38 або фармацевтичну композицію згідно з варіантом здійснення 39, для застосування в медицині. 50. Моноклональне антитіло або його фрагмент згідно з будь-яким з варіантів здійснення 1- 31, препарат згідно з будь-яким з варіантів здійснення 37-38 або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 39 для застосування у виявленні наявності або вимірюванні
Зо кількості вказаного тау-білка в головному мозку суб'єкта. 51. Моноклональне антитіло або його фрагмент, препарат або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 50, де вказане виявлення або вимірювання включає візуалізацію іп мімо вказаного антитіла до тау-білка, зв'язаного з вказаним тау-білком. 52. Моноклональне антитіло або його фрагмент, препарат або фармацевтична композиція згідно з варіантом здійснення 50, де вказане виявлення або вимірювання включає візуалізацію ех мімо вказаного антитіла до тау-білка або його вказаного фрагмента, зв'язаних з вказаним тау- білком. 53. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІЮ
МО: 33) у присутності людського тау-білка, фосфорилованого по залишку 404, але не фосфорилованого по залишку 396. 54. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, що характеризуються імуноспецифічним зв'язуванням з людським тау-білюом, що містить фосфорилований залишок 396, відповідно до наступних критеріїв тестування: ї) антитіло практично не зв'язується з нефосфорилованим тау-білком; ії) антитіло практично не зв'язується 3 тау-білком, фосфорилованим в 404, якщо він при цьому не фосфорилований в 396; ії) антитіло зв'язується з тау-білюом, фосфорилованим в 396; і ім) антитіло зв'язується з тау-білком, якщо як 396, так і 404 є фосфорилованими. 55. Моноклональне антитіло, вироблення якого індукується у відповідь на дифосфорилований пептид ТОНСАЕІМУКРОРУУБООЮТРІЗРЕНІ. (5ЕО ІО МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2М4Е, або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІЮ
МО: 33). 56. Моноклональне антитіло відповідно до варіанта здійснення 55, де гібридоми піддаються скринінгу з використанням людського патологічного і непатологічного тау-білка для виділення клонів, які як ї) є імуноспецифічними стосовно будь-якого з фосфорилованих епітопів 5396, такі ії) специфічно розпізнають гіперфосфорилований тау-білок з головного мозку людей з хворобою
Альцгеймера, де вказані антитіла здатні розрізняти патологічний і непатологічний людський тау- білок. 60 57. Спосіб видалення гіперфосфорилованого тау-білка з клубка, при цьому вказаний клубок містить гіперфосфорилований тау-білок при цьому вказаний спосіб включає приведення гіперфосфорилованого тау-білка в контакт з антитілом, при цьому вказане антитіло є селективним стосовно тау-білка, що має фосфорилований залишок 396, так, щоб в результаті отримати 90 95 виснаження клубка по гіперфосфорилованому тау-білку. 58. Спосіб затримки прогресу хвороби Альцгеймера у пацієнта, при цьому вказаний спосіб включає зменшення або ослаблення накопичення патологічного тау-білка у вказаного пацієнта, при цьому вказаний спосіб включає введення антитіла, яке видаляє тау-білки з фосфорилованим залишком 396. 59. Спосіб затримки прогресу хвороби Альцгеймера у пацієнта, при цьому вказаний спосіб включає видалення тау-білків, з яких шляхом затравлювальної дії утворюються патологічні тау- білки, при якому видаляють тау-білки, що мають фосфорилований залишок 396. 60. Спосіб лікування пацієнта з хворобою Альцгеймера, який включає видалення гіперфосфорилованого тау-білка з клубка, при цьому вказаний клубок містить гіперфосфорилований тау-білок і нормальний тау-білок, шляхом приведення гіперфосфорилованого тау-білка в контакт з антитілом, селективним відносно тау-білка, що має фосфорилований залишок 396. 61. Спосіб відповідно до будь-якого з варіантів здійснення 57-59, який включає застосування антитіла, визначеного в будь-якому з варіантів здійснення 1-31, 40-42 або 50-56. 62. Виділене моноклональне антитіло або його виділений епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІО МО: 33). 63. Рекомбінантне людське або рекомбінантне гуманізоване моноклональне антитіло або його виділений епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІЮ МО: 33). 64. Рекомбінантне моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, вироблення яких індукується у відповідь на дифосфорилований пептид
ТОНОАЕІМУКРІЗРУУБООЮТРОРЕНІ (5ЕО І МО: 37), що охоплює залишки 386-410 тау-білка 2МАК, де вказане рекомбінантне моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІО МО: 33). 65. Фармацевтична композиція, яка містить виділене моноклональне антитіло або його виділений епітопзв'язувальний фрагмент, де вказане виділене моноклональне антитіло або його виділений епітопзв'язувальний фрагмент визначені в будь-якому з наведених вище варіантів здійснення. 66. Химерне моноклональне антитіло або його виділений епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІО МО: 33). 67. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, визначені в будь-якому з варіантів здійснення 1-31 і 51-56, які були отримані або вироблені в клітинній лінії, такій як клітинна лінія людини, клітинна лінія ссавця, відмінного від людини, клітинна лінія комахи, дріжджів або бактерії. 68. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент відповідно до варіанта здійснення 67, отримані в клітинній лінії СНО, клітинній лінії НЕК, клітинній лінії ВНК-21, клітинній лінії миші (такій як клітинна лінія мієломи), клітинній лінії фібросаркоми, клітинній лінії РЕК.Сб, клітинній лінії НКВ-11, клітинній лінії САР і клітинній лінії людини НинН-7.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Імунізація мишей фосфорилованими пептидами 396/404
Мишей (С56/ВІб і ЕМВ імунізували 10 мкг фосфорилованого тау-білка 386-408 (ре396/рі404) (ЗЕО ІО МО: 37), кон'югованого з РЗО, в складі з ад'ювантом ПіегмМах.
Миші були самками і самцями з ліній С56/ВІ 6 і ЕМВ. Мишей у віці 2-3 місяців імунізували фосфорилованим тау-білком 386-408, кон'югованим з пептидним епітопом РЗО.
Імуногенний фосфорилований пептид тау-білка 386-408 (рЗ396/різ404), кон'югований з РЗО, змішували з ТйегМах (400 мкг/мл пептиду в суміші 1:1 о0об.:06б.) згідно з протоколом постачальника ТіегМах і мишам підшкірно ін'єктували 20 мкг антигенного пептиду (100 мкл).
Контрольним мишам ін'єктували тільки ад'ювант. Всіх мишей, імунізованих пептидом, піддавали повторній імунізації 0,5 мкг пептиду/ПйегМах (10 мкг/мл пептиду, змішаного, як описано вище, і ін'єктованого) з місячними інтервалами. На закінчення мишей піддавали повторній імунізації фосфорилованим тау-білком 386-408 (р5396/рз404), кон'югованим з РЗО, без ТіегМах за З дні до злиття спленоцитів з клітинами 5Р-2. Гібридоми відбирали для циклів повторного 60 клонування після того, як вони проявляли позитивне зв'язування з планшетами для ЕЇ І5А, які були покриті 1 мкг/мл фосфорилованого тау-білка 386-408 (р5396/р5404), і проявляли активність переважного зв'язування з антигенами 51 і РЗ з лізату головного мозку суб'єктів з АЮ і 7094510 (як описано нижче в прикладі 3). Таке зв'язування порівнювали з активністю зв'язування таких антитіл з лізатом головного мозку від контрольних суб'єктів за допомогою дот- блот-аналізів і планшетів для ЕГІ5А або М50, покритих лізатом головного мозку.
Приклад 2. Утворення гібридом
Мишей піддавали повторній імунізації фосфорилованим тау-білком 386-408 (ре396/р404), кон'югованим з РЗО, без ТіегМах за З дні до злиття спленоцитів з клітинами 5Р-2. Гібридоми відбирали для циклів повторного клонування після позитивного зв'язування в планшетах для
ЕІЗА, покритих 1 мкг/мл фосфорилованого тау-білюка 386-408 (ре396/рз404), і прояву активності переважного зв'язування з антигенами 51 і РЗ з лізату головного мозку суб'єктів з АЮ і т04510 в порівнянні з лізатом головного мозку від контрольних суб'єктів за допомогою дот- блот-аналізів і планшетів для ЕГІ5А або М50, покритих лізатом головного мозку.
Приклад 3. Вестерн-блот-аналіз і дот-блот-аналіз специфічних антитіл
Біохімічне фракціонування тау-білка
Тканини головного мозку людей або мишей гТ94510, що надмірно експресують людський тау-білок з мутацією РЗО1Ї,, гомогенізували в 10 об'ємах Тгіз-сольового буферного розчину, що містить інгібітори протеаз і фосфатаз, як вказано далі: 50 мМ Ттгів/НеїІ (рН 7,4); 274 мМ Масі; 5
ММ КС; 1 95 суміш інгібіторів протеаз (Коспе); 1 95 коктейль інгібіторів фосфатаз | і ІІ (Зідта) і 1
ММ фенілметилсульфонілфторид (РМ5Е; Зідта). Гомогенати центрифугували при 27000 х д протягом 20 хв. при 4 "С з отриманням фракцій надосадової рідини (51) і осаду. Зразки осаду повторно гомогенізували в 5 об'ємах буфера з високою концентрацією солі/сахарози (0,8 М
Масі, 10 95 сахароза, 10 мМ Тгтгіз/НСІ, ІрН 7,4), 1 мМ ЕСТА, 1 мМ РМ5БЕ) і центрифугували, як описано вище. Зразки надосадової рідини збирали і інкубували з саркозилом (кінцева концентрація 1 90; Бідта) протягом години при 37 "С з подальшим центрифугуванням при 150000 х 9 протягом години при 4 "С з отриманням зразків осаду, нерозчинних в саркозилі, що називаються фракцією РІЗ. Осад РЗ ресуспендували в буфері ТЕ (10 мМ Ттгіз/НСЇІ ГІрн 8,01, 1 мМ
ЕОТА) до об'єму, рівного половині початкового об'єму, використовуваного для гомогенатів головного мозку.
Ко) Вестерн-блот- і дот-блот-аналізи
Фракціоновані екстракти тканин 51 і РЗ розчиняли в 505-буфері для зразка, що містить 0,1
М ОТТ. Піддані тепловій обробці зразки (95 "С протягом 10 хв.) розділяли за допомогою гель- електрофорезу в 4-12 95 Вібз-Тгіз-гелях для ЗО5-РАСЕ (Іпмийгодеп) і переносили на мембрани з
РМОБЕ (ВіоКай І арогасогіє5, Геркулес, Каліфорнія). Зразки для дот-блотингу наносили плямами безпосередньо на нітроцелюлозні мембрани (АтегзПпат, Пітсбург, Пенсільванія) у відомих концентраціях для всіх зразків. Мембрани як для вестерн-блотингу, так і для дот-блотингу блокували в 595 знежиреному сухому молоці в ТВ5-Глеєп (0,595) з рН 7,4 з подальшою інкубацією в 1 мкг/мл 01.2 або С10-2 протягом ночі при 4 "С. Мембрани промивали і інкубували з антитілом до мишачого Ідс, кон'югованим з пероксидазою (1:5000; даскбзоп ІттипокКезеагосі,
Вест Гроув, Пенсільванія). Зв'язані антитіла виявляли за допомогою системи посиленої хемілюмінесценції (набір ЕСІЇ РІГОБ; РегКіпЕІтег). Кількісну оцінку і візуальний аналіз імунореактивності в рамках вестерн-блотингу і дот-блотингу виконували за допомогою підключеної до комп'ютера аналітичної системи біовізуалізації І А5-4000 (Еціййт, Токіо, Японія) і програмного забезпечення Мийі Сзацде м3.1 (Рціййт). Білкове навантаження коректували за об'ємом початкових фракцій, і його можна перетворити на початкову сиру масу тканини.
Результати показані на фігурі 1 і фігурі 2.
Приклад 4. Скринінг і відбір антитіл до 396/404 із застосуванням іммобілізованого людського патологічного матеріалу
Зразки надосадової рідини культур гібридом піддавали скринінгу відносно зв'язування антитіл в планшетах Мипс, покритих 1 мкг/мл фосфорилованого пептиду тау-білка 386-408 (рз396/рі5404), із застосуванням 0,1 М карбонатного буфера з рН 9.
Позитивні зразки надосадової рідини потім розбавляли 1:50-1:800 в РВ5, 0,1 95 ВБА і 0,1 95
МРАО для зв'язування в планшетах для ЕГІЗА або М50, покритих антигенами лізату головного мозку (осадом РЗ, див. приклад 3) від уражених АЮ і здорових контрольних суб'єктів (НС), відповідно. Антигени лізату головного мозку розбавляли в 1500 разів в 0,1 М карбонатному буфері з рН 9 перед інкубацією/покриттям планшетів для ЕГІ5БА або М50О. Лунки потім блокували протягом 2 годин при кімнатній температурі (РВ5, З мг/мл ВЗА, 0,1 95 МР-40), і активність зв'язування антитіл виявляли за допомогою антитіла до мишачого дос, кон'югованого з НКР (САКО) і БО РО-ТАС (М5О Мо продукту), згідно з протоколом постачальника. Вибрані 60 антитіла (01-2, 05-2, С8-3 і С10-2), розбавлені в РВЗ з 0,195 ВЗА, характеризувалися 5О0 дозозалежним ефектом і демонстрували активність зв'язування з планшетами, покритими антигеном АО-РЗ, від субнаномолярної до наномолярної, і додатково характеризувалися активністю зв'язування з вибраними специфічними і контрольними пептидами. Результати показані на фігурі 3.
Приклад 5. Специфічність стосовно пептидів і афінність зв'язування з ними
Антитіла, що характеризуються позитивним зв'язуванням 3 патологічним тау-білком, додатково характеризували стосовно уявної афінності (ІС50) і селективності/специфічності стосовно ряду фосфорилованих пептидних епітопів (р). Планшети для М5О покривали 100 нг/мл фосфорилованого тау-білка 386-408 (реЗ396/ре404), як описано вище. Антитіла до фосфорилованого тау-білка аналізували в аналізах залежності доза-відповідь для визначення концентрацій антитіл, що забезпечують належний рівень аналітичного сигналу (у типовому випадку 5000-20000 КО в М50, що відповідає 0,5-2 95 від максимального апаратного сигналу, або сигнали оптичної щільності (00) 1,0-1,5 при 450 нм в ЕГІ5А). Вибрані антитіла інкубували з фосфорилованим тау-білком 386-408 (рЗ396/404) в концентраціях (0-1000 нМ), що ступінчасто змінюються, протягом 2 годин при кімнатній температурі. Реакційні суміші потім наносили на покриті пептидом планшети для М5О, покриті 100 нг/мл фосфорилованого пептиду тау-білка 386-408 (ре5396/рз404), як описано вище, і вимірювали активність зв'язування. Значення ІС50 з аналізів інгібування відповідають значенням уявної афінності (КО), що становлять 10-100 нМ.
Специфічність і фосфоселективність. Моноклональне антитіло в належній концентрації інкубували з 100 НМ дифосфорилованого (ре396/р5404), нефосфорилованого або монофосфорилованого (рз396 або р5404) фосфорилованого тау-білка 386-408 і аналізували стосовно активності зв'язування (у аналізах інгібування). Контрольні фосфориловані пептиди тау-білка (фосфорилований тау-білок 260-270 (ре5262) або фосфорилований тау-білок 240-270 (р5262)) і рекомбінантний нефосфорилований тау-білок аналізували для порівняння. Всі антитіла, що позитивно реагують з антигеном АО-РЗ, демонстрували сильну перевагу до фосфорилованого пептиду тау-білка 386-408 (ре396/різ404) і монофосфорилованого пептиду фосфорилованого тау-білка 386-408 (рБ396б) і відсутність активності зв'язування з монофосфорилованим пептидом фосфорилованого тау-білка 386-408 (рб5404) (і нефосфорилованим пептидом тау-білка 386-408. Фосфориловані пептиди тау-білка 240-270 і
Зо фосфорилований тау-білок були контрольними. Результати показані на фігурі 4 і фігурі 32.
Приклад 6. Отримання характеристик антитіл гістологічними методами за допомогою імуногістохімічного дослідження
Тканини головного мозку мишей брали від мишей гТ94510 у віці 8 місяців (надмірно експресуючих людський тау-білок РЗОТІЇ під контролем промотору Саткі!) і нетрансгенних тварин одного приплоду (відмінних від То), фіксували в 4 956 параформальдегіді і заливали в парафін. Залиті в парафін зразки лобної долі кори головного мозку людини придбали у Тізвиє
БоЇшіоп5 (Глазго, Великобританія). Тканину від донорів з діагностованою кінцевою стадією хвороби Альцгеймера порівнювали з тканиною від не уражених деменцією контрольних донорів у відповідній віковій групі. Зрізи товщиною 4 мкм депарафінували і піддавали демаскуванню антигену шляхом мікрохвильової обробки зрізів в 10 мМ цитратному буфері, рН 6, протягом 10 хвилин. Ендогенні пероксидази блокували за допомогою 1 95 гідропероксидази, а потім 5 95 нормальної свинячої сироватки крові в РВБЗ/1 95 ВБА/0,395 Тийоп Х-100 (РВ5-ВТ). Зрізи інкубували протягом ночі при 4 "С з антитілами 01.2 і С10-2, розбавленими РВ5-ВТ в діапазоні концентрацій. Зрізи промивали в РВ5, 0,25 95 ВБА, 0,195 Тійоп Х-100 перед інкубацією з біотиніллованим вторинним свинячим антитілом до мишачих імуноглобулінів (Е0О464; БАКО,
Глоструп, Данія) при 1:500 протягом 1 години. Після додаткового промивання застосовували набір для утворення комплексу стрептавідин-біотин (Месіог І аброгаїйогіеєх, Бурлінгейм,
Каліфорнія) і візуалізували імунореактивність за допомогою діамінобензидину. Зрізи піддавали контрастному забарвленню гематоксиліном. Результати показані на фігурі 5.
Приклад 7. Селективність антитіл стосовно патологічного тау-білка
Планшети для М5О покривали солюбілізованими антигенами РЗ з головного мозку суб'єкта з АО (розбавленими 1:1500) або головного мозку 754510 (розбавленими 1:3000). Результати показані на фігурі 6.
Виявлення виконують згідно з описаним в прикладі 4 вище.
Приклад 8. Аналіз затравлювальної дії в клітинах НЕК
Клітини НЕК293 піддавали транзієнтній трансфекції людським тау-білюом РЗО1І-РГ АС в 6- лункових планшетах через 24 години після посіву з наступною через 24 години інкубацією з гомогенатом головного мозку протягом 24 годин з подальшим розділенням і пересіванням клітин і збором через додаткові 24 години. Клітини лізували і піддавали ультразвуковій обробці 60 в РВ5, доповненому буфером з 1 95 Тиійоп-Х, інгібітором фосфатаз РИо55ТОР і інгібітором протеаз сотрієїе (Коспе), і ультрацентрифугували при 100000 х д протягом 30 хвилин. Осад ресуспендували в 505, піддавали ультразвуковій обробці і ультрацентрифугували протягом 30 хвилин при 100000 х 9. Зразки надосадової рідини аналізували за допомогою вестерн-блотингу.
Клітини, що експресують людський тау-білок РЗО1Ї, продемонстрували наявність нерозчинного (фракція 505, виявлення за допомогою Е1/РГАС) гіперфосфорилованого (виявлення за допомогою 01.2)рз396) тау-білка при затравлюванні загальними гомогенатами головного мозку від мишей гТ94510, трансгенних по тау-білку. Клітини, оброблені гомогенатом контрольного головного мозку мишей, продемонстрували відсутність агрегованого гіперфосфорилованого людського тау-білка. Додатково, загальні клітинні лізати клітин НЕК293 аналізували за допомогою аналізу агрегації тау-білків від Сіб5ріо. У основі цього аналізу лежить флуоресценція з розрізненням за часом із застосуванням одного і того ж антитіла як донорного (кон'югованого з
ТЬЗ3ж), так і акцепторного (кон'югованого з 42) антитіла в ЕКЕТ. Зразок об'ємом 10 мкл змішували з сумішшю антитіл об'ємом 10 мкл і інкубували протягом 20 годин. Планшет прочитували на планшет-рідері РПегазіаг для оцінки флуоресценції з розрізненням за часом (виміряної/нтегрованої після включення збуджуючого світла сигналу ЕКЕТ). У аналізі вимірюють рівень агрегованого тау-білка як в людському секційному матеріалі, так і у мишей гТ94510 ії в клітинах НЕК із затравкою з високою специфічністю і чутливістю. Результати показані на фігурі 7 і демонструють, що на затравлювальний ефект не впливала обробка за допомогою НЕЇ, але він частково усувався шляхом обробки антитілами до тау-білка (С10-2 » 01.2 » пАСІЗ6-286-АБІ1).
Приклад 9. Усунення функціональної (електрофізіологічної (ел.-фіз.)) відповіді іп мімо для р1.2ісС10-2
Електрофізіологічна оцінка синаптичної передачі і пластичності в САї1-зоні гіпокампу у мишей гГ94510 і контрольних мишей ІТА у віці 4,5-5,5 місяців іп мімо показала: ї) значне погіршення базальної синаптичної передачі у мишей гТд4510 в порівнянні з ІТА та її) значне зменшення парного полегшення у мишей гТ94510 в порівнянні з ТА.
Всі експерименти проводили відповідно до Директиви Ради Європейського Союзу (86/609/ЕЕС) про догляд за лабораторними тваринами і їх використання і законодавства Данії, регулюючого проведення експериментів на тваринах.
Зо У цьому дослідженні використовували самців мишей гГд4510 і їТА (Тасопіс Еигоре А/5) у віці 5-5,5 місяців на момент реєстрації даних. Мишей утримували групами в умовах регульованої температури (221,5 С) ї вологості (55-65 90) і витримували при циклі чергування світла і темряви 12:12 годин (світло включали о 06:00 годині). Їжа і вода були доступні без обмежень.
Тварин анестезували шляхом внутрішньочеревної (і.р.) ін'єкції уретану (1,2 г/кг"). Мишей потім фіксували в стереотаксичній рамці, їх температуру доводили до 37,5 "С за допомогою електричної грілки і оголяли череп. На лобну кістку поміщали платиновий дріт, виступаючий як еталонний електрод, і просвердлювали додатковий отвір для введення реєструючого і стимулюючого електродів в гіпокамп за наступними координатами згідно з атласом Рахіпоз: і
ЕгапкКіїп (Рахіпо5 апа Егапкіїп, 2001): реєструючий - на 1,5-1,7 мм назад від брегми, на 1,0-1,2 мм латерально від серединної лінії, на 1,4-14,/7 мм нижче за поверхню головного мозку; стимулюючий - на 1,8-2,0 мм назад від брегми, на 1,5-1,7 мм латерально від серединної лінії, на 1,39-1,7 мм нижче за поверхню головного мозку. Тварин залишали в стереотаксичній рамці протягом всього періоду реєстрації даних, а їх рівень анестезії регулярно перевіряли.
Польові збуджуючі постсинаптичні потенціали (ТЕРОР) викликали в САї шляхом електростимуляції колатералі Шеффера кожні 30 с, а глибину розташування реєструючого електроду коректували до тих пір, поки у відповідь на монополярний прямокутний імпульс не був зареєстрований негативний ТЕРОР. Виміряний градієнт викликаного ТЕРЗР в типовому випадку складав від ЗО до 70 95 максимальної амплітуди ТЕРБ5Р.
Після індукції оптимального ТЕРЗР оцінювали базальну синаптичну передачу за залежністю між інтенсивністю стимуляції і градієнтом викликаного ТЕР5Р (залежність "вхід-вихід"). Різні значення інтенсивності стимуляції становили 0, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 ї 500 мкА, і їх послідовно прикладали в порядку зростання з 2-3 повторами для кожного значення інтенсивності. Було виявлено, що базальна синаптична передача значно погіршувалася у мишей гТ94510 в порівнянні з ЇТА.
Парне полегшення - короткострокову синаптичну пластичність, в основі якої, як вважають, знаходяться пресинаптичні механізми - додатково вимірювали у мишей гТ94510 і їТА. Стисло, до колатералі Шеффера прикладали пару стимулів з інтервалом між стимулами (ІІ), що варіюються від 25 до 1000 мс, і градієнт другого ТЕРБР порівнювали з градієнтом першого
ТЕРБР. Полегшення спостерігали при всіх ІІ з максимальним полегшенням при ІбіІ, що бо становить 50 і 75 мс. Цікаво, що у мишей гТ94510 спостерігали значно нижче РРЕ в порівнянні з мишами ІТА.
Ідентифіковані погіршення базальної синаптичної передачі і парного полегшення у мишей гТ94510 додатково використовували як показники, які можна реєструвати для тестування ефективності антитіл.
Реєстрацію даних виконували в усіх експериментах через 2-4 дні після введення 4 доз антитіла двічі на тиждень протягом 2 тижнів і.р. У кожної тварини, за наявності можливості, в гіпокампі реєстрували як базальну синаптичну передачу, так і парне полегшення, які додатково використовували в окремих експериментах. Результати показані на фігурі 8 і демонструють усунення антитілами дефіцитів парного полегшення і базальної синаптичної передачі при викликаних польових потенціалах в СА1.
Приклад 10. Імуновиснаження екстрактів з головного мозку гТ94510 по тау-білку 60 мкг мишачого і гуманізованого антитіла С10-2 іммобілізували на магнітних гранулах
Рупабреаад» в 300 мкл суспензії (набір для імунопреципітації Супабеайд» з білком С Момех Мо за кат. 100070). Після ретельного промивання гранули змішували з 60 мкл екстракту з головного мозку гТ94510 і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Магнітні гранули відокремлювали від екстракту і екстракти аналізували за допомогою вестерн-блотингу. При виснаженні за допомогою тсС10-2 і пС10-2 було видалено, відповідно, 99 95 і 99,5 95 агрегатів тау-білка. Результати показані на фігурі 12.
Приклад 11. Аналіз затравлювальної дії в клітинах НЕК із застосуванням імуновиснажених екстрактів
Клітини НЕК293 транзієнтно трансфектували людським тау-білююм РЗО1ТІ-РГАС в 6- лункових планшетах. Через 24 години клітини інкубували з гомогенатом головного мозку, який був підданий імуновиснаженню за допомогою гуманізованого або мишачого С10-2. Через 24 години клітини пересівали і збирали через додаткові 24 години. Клітини лізували і піддавали ультразвуковій обробці в ТВ5, доповненому 1 95 Тийоп-Х, інгібіторами фосфатаз і протеаз (Коспе), і ультрацентрифугували при 100000 х д протягом 30 хвилин. Осад ресуспендували в 195 505, піддавали ультразвуковій обробці і ультрацентрифугували протягом 30 хвилин при 100000 х д. Зразки надосадової рідини аналізували за допомогою вестерн-блотингу. Клітини, що експресують людський тау-білок РЗОТІ, продемонстрували наявність нерозчинного (фракція
Зо ЗО5, виявлення за допомогою Е1/РГАсС) гіперфосфорилованого тау-білка (01.2/тау-білок роез396, прогін при вищій молекулярній масі) при затравці загальними гомогенатами головного мозку від мишей гТ94510, трансгенних по тау-білку. Клітини, оброблені гомогенатом контрольного головного мозку мишей ІЇТА, продемонстрували відсутність агрегованого гіперфосфорилованого людського тау-білка. Додатково, загальні клітинні лізати клітин НЕК293 аналізували за допомогою аналізу агрегації тау-білків від Сізбіо. Виснаження за допомогою антитіл НЕЇ ї НЕЇ не впливало на затравлювальну дію, тоді як виснаження за допомогою тС10-2 ії пС10-2 попереджало агрегацію тау-білка на 88 95 і 96 95, а нерозчинного тау-білка на 97 9бв і 100 95, відповідно. Результати показані на фігурі 13.
Приклад 11. Імуновиснаження екстрактів з головного мозку гТ94510 по тау-білку 100 мкг мишачих антитіл С10-2, 01.2 і Тац5 (Іпмігодеп) іммобілізували на магнітних гранулах
Рупабреаадз» в 500 мкл суспензії (набір для імунопреципітації Супабеайд» з білком С Момех Мо за кат. 100070). Після ретельного промивання гранули змішували з 100 мкл екстракту з головних мозків гТ94510 і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Магнітні гранули відокремлювали від екстракту і екстракти аналізували за допомогою вестерн-блотингу. С10-2 і 01.2 не видаляють нормальний тау-білок з гомогенатів, як це робить комерційно доступне антитіло Тац5. На відміну від цього, два антитіла за цим винаходом специфічно видаляють гіперфосфорилований тау-білок (64 кДа), тобто тау-білокю,; фосфорилований по серину-396, на 95 95. Результати показані на фігурі 14.
Приклад 12. Імуновиснаження екстрактів з головного мозку суб'єктів з хворобою
Альцгеймера по тау-білку 100 мкг мишачих антитіл С10-2 і 01 іммобілізували на магнітних гранулах ЮСупабеадз» в 500 мкл суспензії (набір для імунопреципітації бупабеад» з білком з Момех Мо за кат. 100070). Після ретельного промивання гранули змішували з 100 мкл екстракту з головного мозку суб'єктів з хворобою Альцгеймера і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Магнітні гранули відокремлювали від екстракту і екстракти аналізували за допомогою вестерн-блотингу. 01.2 ії С10-2 видаляють лише дуже невелику частину загального тау-білка в гомогенаті головного мозку (8 95). Ці антитіла, проте, специфічно видаляють гіперфосфорилований тау- білок (90 95), специфічний для пацієнтів з АЮ. Результати показані на фігурі 15.
Приклад 13. Затравлювальна дія у мишей гТ9д4510 із застосуванням імуновиснажених бо екстрактів
Використовували трансгенних мишей, що експресують людський мутантний тау-білок (РЗОТІЇ ОМ4К) під контролем елементу відповіді Тег-ОйЙ в СаткК2-позитивних нейронах (гТ94510). У цій моделі патологія тау-білка зазвичай починає розвиватися у віці З місяців, але при згодовуванні матерям доксицикліну під час вагітності і протягом перших З тижнів життя мишеня патологія розвивається на пізнішій стадії (починаючи з віку 6 місяців). Використовувані в даних дослідженнях миші, заздалегідь оброблені доксицикліном, мали вік 2,5 місяця у момент часу, що відповідає ін'єкції Миші отримували анестезію, будучи зафіксованими в стереотаксичній рамці, шляхом вдихання ізофлурану. Череп оголяли і його положення вирівнювали, поки брегма і лямбда не розташувалися на одному рівні. У черепі просвердлювали отвір на 2 мм латерально (справа) і на 2,4 мм назад від брегми. Шприц на 10 мкл зі скошеним наконечником (5ОЕ) застосовували для ін'єкції матеріалу затравки на 1,4 мм вентрально поверхні головного мозку за вищезгаданими координатами. 2 мкл імуновиснажених екстрактів, описаних в прикладах 11 і 12, поволі подавали в необхідне місце (1 мкл/хвилину) і шприц залишали на 5 хвилин перед його видаленням. Рану закривали швами, і мишей зігрівали, поки вони прокидалися. Мишей доглядали протягом З місяців, а потім убивали і піддавали перфузійній фіксації за допомогою 4 95 РЕА.
Імуногістохімічне дослідження. Фіксовані головні мізки розрізали на коронарні зрізи товщиною 35 мкм в М5А і кожен 6-й зріз забарвлювали для виявлення клубків тау-білка (срібний барвник за Сзайуає) і для виявлення гіперфосфорилованого тау-білка (АТ8). Позитивно забарвлені нейрони (соми) підраховували на іпси- і контралатеральній сторонах гіпокампу в усіх головних мозках. Були включені всі підділянки гіпокампу. Підрахунок проводили у восьми зрізах на головний мозок. Результати відображають сумарну кількість позитивних нейронів з 8 зрізів. У 2 мишей, не підданих ін'єкції, визначали фоновий сигнал. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка. Результати показані на фігурі 16. Показана кількісна оцінка патології тау- білка в головному мозку гТ94510 із затравкою з гомогенатів головного мозку гТ94510 (А) або з
АР (В). Перед введенням затравки рівень гіперфосфорилованого тау-білка, але не нормального тау-білка, був зменшений в гомогенатах на 90-95 95 шляхом застосування С10-2 або 01.2. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів гомогенати більше не індукують
Зо затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка.
Гомогенати з головного мозку гТ94510 або суб'єктів з хворобою Альцгеймера здатні індукувати затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка у мишей гТ94510 на стадії, на якій ендогенна патологія тау-білка не розвивалася. При видаленні гіперфосфорилованого тау-білка з гомогенатів шляхом застосування 01.2 або С10-2, як описано в прикладах 11 і 12, активність затравлювальної дії усувається.
Приклад 14. Обробка антитілами мишей гТ94510 із затравкою
Мишей гТ94510, оброблених доксицикліном (як описано в прикладі 13), піддавали тривалій обробці мишачим антитілом 01.2 або контрольним антитілом при 15 мг/кг/ тиждень, починаючи з віку 2 місяців. У віці 2,5 місяців екстракт з головного мозку гТ94510 інфузували в гіпокамп (як описано в прикладі 13). Мишей убивали через 1, 2 і З місяці після інфузії в головний мозок, а імуногістохімічне дослідження і подальший аналіз виконували згідно з описаним в прикладі 13.
При обробці за допомогою 01.2 патологія тау-білка була значно меншою через 2 і З місяці після початку затравлювальної дії. Результати показані на фігурі 17.
Показана кількісна оцінка нейронів, що містять клубки, в гіпокампах мишей гТ94510 із затравкою. Патологія збільшується з часом, але при обробці мишей за допомогою 01.2 патологія є значно меншою через 2 і З місяці після введення затравки. Показана кількісна оцінка нейронів, що містять клубки, в гіпокампах мишей гТ94510 із затравкою. Патологія збільшується з часом, але при обробці мишей за допомогою 01.2 патологія є значно меншою через 2 і З місяці після введення затравки.
Гомогенати з головного мозку г/Т94510 або суб'єктів з хворобою Альцгеймера здатні індукувати затравлювальну дію з формуванням патології тау-білка у мишей гТ94510 на стадії, на якій ендогенна патологія тау-білка не розвивалася. Шляхом системної обробки мишей за допомогою 01.2 можна значно зменшити розвиток патології тау-білка.
Приклад 15. Імуновиснаження екстрактів з головного мозку суб'єктів з хворобою
Альцгеймера по тау-білку за допомогою гуманізованих антитіл до тау-білка 100 мкг мишачого і гуманізованого С10-2, а також антитіл 2.10.3 і Ну8.5 з попереднього рівня техніки (джерел) іммобілізували на магнітних гранулах Юбупабеад3 в 500 мкл суспензії (набір для імунопреципітації бупабеадз» з білком С Момех Мо за кат. 100070). Після ретельного промивання гранули змішували з 100 мкл екстракту з головного мозку суб'єктів з хворобою Альцгеймера і бо інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Магнітні гранули відокремлювали від екстракту і екстракти аналізували за допомогою вестерн-блотингу і аналізу Сіб5ріо. Мишаче і гуманізоване С10-2 ефективно видаляли 93 95 і 97 96 фосфорилованого тау-білка р5396, але тільки 22 95 і 17 95 загального тау-білка в порівнянні з контрольним антитілом ПНЕГ. Антитіло 2.10.3 видаляло 91 95 тау-білка, фосфорилованого по серину-396, і 10 95 загального тау-білка.
Здається, що 2.10.3 є менш ефективним у видаленні однієї із смуг гіперфосфорилованого білка в порівнянні з антитілами С10-2 (середня смуга, відповідна 64 кДа). Антитіло НуО8Ф.5 має абсолютно інший профіль в порівнянні з антитілами як С10-2, так і 2.10.3, видаляючи велику частину тау-білка, 89 95 загального тау-білка і 88 95 тау-білка р5396. Результати показані на фігурах 23-24.
Приклад 16. Імуновиснаження екстрактів з головного мозку суб'єктів з хворобою
Альцгеймера по агрегованому тау-білку за допомогою гуманізованих антитіл до тау-білка
Імуновиснажені екстракти від суб'єктів з АЮ, описані в прикладі 13, також аналізували шляхом застосування аналізу агрегації тау-білків, описаного в прикладі 10. Антитіла С10-2 і
Ноувгв.5 ефективніше видаляють агрегований тау-білок з матеріалу від суб'єктів з АО, ніж антитіло 2.10.3. В порядку зменшення ефективності: НУ8.5 (99 95), НС10-2 (98 95), тС10-2 (96 95) і 2.10.3 (90 Фо), в усіх випадках в порівнянні з антитілом ПНЕ/Г.. Результати показані на фігурі 25.
Приклад 17. Імуновиснаження по тау-білку 25 мкг антитіла (гуманізованого С10-2 або 2.10.3) іммобілізували на магнітних гранулах
Рупабреадз» в 125 мкл суспензії (набір для імунопреципітації Супабеайд» з білком С Момех Мо за кат. 100070). Після ретельного промивання покриті гранули змішували з різними кількостями непокритих промитих гранул. Починали з 100 95 гранул, покритих АБ, що відповідало 5 мкг антитіла, із зниженням до 100 95 непокритих гранул. Загальна кількість гранул була однаковою в усіх зразках. Гранули змішували з 20 мкл екстракту від суб'єктів з АО і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Магнітні гранули відокремлювали від екстракту і екстракти розділяли на аліквоти, піддавали миттєвому заморожуванню і витримували при -80 С до застосування.
Аналіз виснаження за допомогою вестерн-блотингу
Зразки кип'ятили в їх завантажувальному І О5-буфері і 100 мМ ОТТ. Об'єм, відповідний З мкл екстрактів, завантажували в 4-12 95 Віб-Тіз-гель МИРАСЕ (Пе Тесп, Момех). Після
Зо електрофорезу білки блотували на мембрану Іттобріоп-РІ з РМОЕ (0,45 мкм, ІРЕЇ10100,
МіПіроге)о. Мембрану блокували за допомогою блокуючого буфера 5ЕА (Мо продукту 37527,
Тпепто). Рівні тау-білка і рТацш оцінювали в зразках за допомогою Таи5 (ар80579, Абсат, 1:2000), мишачого С10-2 (1 мкг/мл), Р-5199/202 (447682, Іпийтодеп, 1:1000), Р-5422 (ар79415,
Арсат, 1:750), людського ІРМ (1 мкг/мл) (СЗАРОН і актин застосовували як контролі навантаження (ар9484, Арсат, 1:2000, А5441, БЗідта, 1:20000). Застосовували вторинні антитіла ІДС, кон'юговані з флуорофором (козяче антитіло до людських імуноглобулінів, кон'юговане з ІЕОуе 800СМУ, козяче антитіло до кролячих імуноглобулінів, кон'юговане з ІКОуе 8ООСУМ, козяче антитіло до мишачих імуноглобулінів, кон'юговане з ІКОуе 680, ГІ-СОВ
Віозсіепсе5), і сигнал оцінювали кількісно за допомогою Ойдуззеу Сіх і програмного забезпечення Ітаде Зішцаїйо (ГІ-СОВ Віозсієпсев).
Проводили кількісну оцінку окремих смуг, а також сигналу в цілих доріжках, і на її підставі будували сигмоїдальні криві залежності доза-відповідь, і, за наявності можливості, оцінювали максимальний ефект і значення ЕС50О.
Результати
Обидва антитіла видаляли невелику частину тау-білка з препарату головного мозку суб'єкта з хворобою Альцгеймера. 2.10.3, сконструйоване таким чином, що воно має специфічність до тау-білка Р-5422, видаляє до 24 95 від загальної кількості тау-білка, а С10-2 видаляє до 15 95 загального тау-білка (див. фігуру 26).
Як 2.10.3, так і С10-2 видаляють більше 90 95 тау-білка, фосфорилованого по серину-422, хоча кількість антитіла, необхідна для видалення 5095 тау-білка Р-5422, відрізняється: у випадку з 2.10.3 необхідно 0,42 мкг антитіла, а у випадку з С10-2 для досягнення того ж самого ефекту необхідно 0,27 мкг (див. фігуру 27).
С10-2 ефективно видаляє тау-білок, фосфорилований по серину-396 (максимальний ефект: 88 96, і половина цього ефекту досягається при застосуванні 0,30 мкг антитіла). 2.10.3 видаляє меншу частину тау-білка, фосфорилованого по серину-396 (максимальний ефект: 60 95, і половина цього ефекту досягається при застосуванні 0,63 мкг антитіла) (див. фігуру 28). Це указує на те, що весь тау-білок, фосфорилований по серину-422, також є фосфорилованим по серину-396, але існує частина гіперфосфорилованого тау-білка, фосфорилованого по серину- 396, в якій відсутній фосфорилований серин в положенні 422. бо Значна частина тау-білка, що видаляється С10-2, також є фосфорилованою по серину-
199/202, оскільки 6995 тау-білка, що має таке фосфорилування, підпадає під вплив імуновиснаження (5095 ефект при застосуванні 0,34 мкг антитіла) (див. фігуру 29).
Імуновиснаження за допомогою 2.10.3 не дає сигмоїдальну криву залежності доза-відповідь для тау-білка Р-5199/202, хоча при підвищенні кількості антитіла спостерігається зниження інтенсивності сигналу (максимальне зменшення 52 905 при застосуванні максимальної кількості антитіла (5 мкг)) (див. фігуру 29).
Ці дані указують на те, що антитіло С10-2, що націлюється на фосфорилований серин-396, зв'язується з більшим пулом гіперфосфорилованих тау-білків, ніж антитіло 2.10.3, що націлюється на фосфорилований серин в положенні 422.
Приклад 18. Опосередковане антитілом інгібування специфічного захоплення тс10-2 патологічних антигенних тау-білків в лізатах головного мозку від суб'єктів з АЮ
Матеріали і способи
Матеріал
Покриваючий буфер: карбонатний буфер, рН 8,5, 150 мМ Масі. Блокуючий буфер: З 95 ВБА (фракція М), 0,1 95 МРА0О в РВ5, рН 7,4. Промивальний буфер: 0,1 95 ВЗА (фракція М), 0,1 95
МРАО в РВ5, рН 7,4. Гуманізоване загальне козяче антитіло до тау-білка, мічене ЗОЇ РГО-ТАС (02211 А-1 М50, 50 мкг/мл).
Спосіб направлений на вимірювання захоплення патологічних людських антигенних тау- білків з головного мозку суб'єктів з АО із застосуванням планшетів, покритих С10-2 (стадія А), після інкубації антигенних тау-білків з ре396-специфічними антитілами в концентраціях, що підвищуються (стадія В). Захоплення антигенного тау-білка і опосередковане антитілом інгібування виявляли за допомогою мічених ЗІ РО-ТАС антитіл до людського (загального) тау- білка від М5О.
А: планшети для М50О покривали (протягом ночі при 4"С) 0,5 мкг/мл тст10-2 (захоплювального антитіла) в покриваючому буфері і потім блокували протягом 1 години при кімнатній температурі) і промивали З рази (фігура 30).
В: зразки лізату РЗ (1:1000-2-4 мкг/мл загального білка) і/або 51(р) (1:300-20-40 нг/мл загального білка) з матеріалу від суб'єктів з АЮ (об'єднаного від З пацієнтів) змішували з антитілом, специфічним до пептидного епітопу ре396, в концентраціях, що ступінчасто
Зо змінюються, і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі. Реакційні суміші потім інкубували протягом 2 годин в планшетах, підготовлених на стадії А (фігура 31).
С: тау-білок, захоплений С10-2, виявляли за допомогою антитіла до людського тау-білка, міченого БОЇ РО-ТАО. Антитіло до тау-білка (1:50) від М50О, що відповідає інструкції виробника.
Планшети аналізують на ЗЕСТОКФ 5 600 від М50О. РЗ з матеріалу від суб'єктів з АЮ і 51(р) з матеріалу від суб'єктів з АО тестують згідно з аналогічною схемою (фігура 33/34).
Таблиці бА-60: інгібування захоплення антигенного тау-білка
Таблиця бА середнє значення сигнал сигнал сигналу
Таблиця 6В середнє значення сигнал сигнал р нн нн
Таблиця 6С р нн нн значення сигнал сигнал сигналу
Таблиця 60 ж нн нн значення сигнал сигнал сигнал
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«110» Х. ЛУННБЕК А/С (Н. І ипабеск А/5) «120» Антитіла до тау-білка (396) «130» 0995-М/О-РСТ
«160» 37 «170» РагепіНп мегзіоп 3.5 «21051 «211» 16 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» СОВ 1 легкого ланцюга 01.2 «4005 1
Аге бег бег СІп бег Геи Маї Ні бег Ахп Су Азп ТАг Туг Геи Ні 1 5 10 15 «2105» 2 «2115 7 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 легкого ланцюга 01.2 «400» 2
Зо Гуз Маї бег Азп Аге Ре 5ег 1 5 «210» З «2115 7 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» СОК З легкого ланцюга 01.2 «400» З бег СіІп 5ег ТНг Ні Ма! Рго 1 5 «210» 4 «211» 13 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» СОК 1 важкого ланцюга 01.2
«400» 4
Гуз АІа бег СІу Азп ТНг РНе ТНпг Ар Туг Си Ме Ні 1 5 10 «210» 5 «211» 17 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 важкого ланцюга 01.2 «400» 5
Аа Ме Ар Рго Сім ТНг СІу Азп ТНг Аа Туг Азп Сп Гу Ре Гу 1 5 10 15 су «2105» 6 «2115 6 «212» РВТ «213» Штучна
Зо «220» «223» СОК З важкого ланцюга 01.2 «400» 6 5ег Аге Су Ре Ар Туг 1 5 2105 7 «211» 219 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Легкий ланцюг 01.2 «400» 7
Азр Ма! Меї Меї ТНпг Сп Тпг Рго Геи 5ег Теми Рго Маї бег Теми су 1 5 10 15
Ар Сп Аа 5ег Пе бег Сух Аге бег 5ег СІп бег Геи Маї Ні бег
20 25 з0
Азп Су Азп ТАг Туг Ге Нів Тгр Ніх Гей Сп ух Рго Су Сп 5ег 35 до д5
Рго ух Ре Геи Іе Туг Гух Ма! бег Азп Аге РНе 5ег Су Ма! Рго 50 55 60
Ар Аге Ре 5ег СІу бег Су бег СОІУ Тиг Азр РНе ТНг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 5ег Аге Маї СІм Аа СІм Азр Геиц Су Маї! Туг Ре Сух бег СІп бег 85 90 95
ТНг Ні Ма! Рго Рпе Тиг Ре Су 5ег Су ТНг Гуз Геи Си Пе Гу 100 105 110
Аге Аа Ар Аа Аа Рго ТНг Маї бек Пе Ре Рго Рго 5ег 5ег Си 115 120 125
СіІп Ге ТНг 5ег Су Су Аа бег Маї Ма! Су Рне Гей Азп Азп Ре 130 135 140
Коо)
Тук Рго Гуз Ар Іе Азп Маї Гуз Тгр Гуз Пе Ар Су бег СЇм Аге 145 150 155 160
СіІп Азп Су Маї Геи Азп бег Тгр ТАиг Ар Сп Ар бег Гуз Ар бег 165 170 175
ТНг Туг бег Меї 5ег 5ег ТНиг Геи ТАг Геи ТАг Гуз Ар См Туг СЇи 180 185 190
Аге Ні Азп 5ег Туг Тиг Су Сім Аа ТНк Ні ух Тиг бег ТАиг бег 195 200 205
Рго Пе Маї уз бег Рне Азп Аге Азп Сім Су 210 215 «210» 8 «211» 451 «212» РЕТ бо
«213» Штучна «223» Важкий ланцюг 01.2 «400» 8
Сп Ма! СІп Гей Сп Сп бег СІу Аа Сім Геи Маї Аге Рго СІу Аа 1 5 10 15 б5ег Ма! Тиг Геи бег Сух Гуз Аа бег СІуУ Азп Тиг Рпе ТНг Ар Туг 20 25 з0
Си Пе Ніх Тгр Маї Гух СІп Тиг Рго Маї Ніх СІу Геи Си Тгр Пе 35 40 45
Су Аа Пе Ар Рго Сім ТАг Су Азп ТАг Аа Туг Азп Сп Гу Рпе 50 55 60
Гуз СІу ух Аа Аге Геи ТНг Аа Азр Гуз 5ег 5ег бег ТНиг Аа Туг 65 70 75 80
Меї сім Гей Аг 5ег Геи ТНг 5ег Сім Азр 5ег Аа Ма! Тук Туг Суб 85 90 95
Зо
ТНк Аге бег Аге Су Ре Азр Туг Тгр СІу СІп СІу Так Тег Геи Тв 100 105 110
Маї бег бег АІа ух ТАиг ТНг Рго Рго 5ег Маї Тук Рго Геиц Аа Рго 115 120 125
СІу Сух СсІу Ар Тпг ТАг Су 5ег 5ег Ма! Тиг Геи Су Су Геи Маї 130 135 140
Гуз СІу Туг РНе Рго Сім 5ег Маї ТНнг Ма! ТНг Тгр Азп 5ег Су бег 145 150 155 160
І е!ц бег 5ег бег Ма! Ні ТНг Ре Рго Аа Геи Ге Сп бег СІу Гец 165 170 175
Туг Тнг Меї 5ег 5ег 5ег Ма! Тиг Маї Рго бег бег ТНк Тгр Рго 5ег 180 185 190
Сп Тнг Ма! Тиг Сух бег Маї Аа Ні Рго Аа бег бег Тиг Тиг Маї 195 200 205
Ар Гуз Гуз Гей Сім Рго бег СІу Рго Пе 5ег Тиг Пе Азп Рго Су 210 215 220
Рго Рго Сух Гух См Сух Ні Гу Сух Рго Аа Рго Азп Геи См су 225 230 235 240
Су Рго 5ег Ма! РНе Пе РНе Рго Рго Азп Пе Гуз Азр Ма! Ге Меї 245 250 255
Пе бег Теи ТА Рго Гуз Маї Тиг Сух Маї Маї Маї Ар Маї! бег Сім 260 265 270
Ар Азр Рго Азр Маї Аге Іе 5ег Тгр Ріе Маї Азп Азп Маї См Маї 275 280 285
Ні Тиг Аа Сп ТНг Сп ТА Ні Аге См Азр Туг Азп бег ТАг Пе 290 295 300
Зо Аге Маї Ма! 5ег Аа Гей Рго Ме Сіп Ні СІп Ар Тгр Меї 5ег СІу 305 310 315 320
Гуз СІмш Рпе Гух Сух Гуз Маї Азп Азп Гуз Азр Гей Рго 5ег Рго Пе 325 330 335
Си Аге ТАг Пе бег Гуз Ме Гух Су Геи Маї Аге Аа Рго Сіп Маї 340 345 350
Тук Ме Геим Рго Рго Рго Аа Сім Сіп Геи бег Аге Гух Азр Маї бег 355 360 365
Іеи Тиг Суз Геи Маї Маї СІу Рпе Азп Рго Су Ар Іе 5ег Ма! Си 370 375 380
Тер Тпиг 5ег Азп Су Ні ТАг Си Сім Азп Туг Гуз Азр ТАг Аа Рго 385 390 395 до
Ма! Геи Азр 5ег Ар СІу бег Туг РНе Пе Туг 5ег Гуз Геи Ар Пе
405 410 415
Гуз ТНг бег ух Тгр Сім Гуз ТНг Азр 5ег РНе 5ег Су Азп Ма! Аге 420 425 430
Ніх СЇми Су Гей Гуз Азп Туг ТугГеци Гуз Гу ТАиг Пе бег Аге бег 435 440 445
Рго Су Гу 450 «2105» 9 «211» 11 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» СОВ 1 легкого ланцюга С10.2 «400» 9
Сп Аа бег СІп СІу ТНкг 5ег Пе Ап Геци Ап 1 5 10
Зо «210» 10 «211» 7 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 легкого ланцюга С10.2 «400» 10
Су Аа 5ег Азп Геи См Азр 1 5 «210» 11 2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК З легкого ланцюга С10.2 «400» 11
І ей сп Ні Тк Туг Геи Рго
1 5 «210» 12 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК 1 важкого ланцюга С10.2 «400» 12
Гуз Аа бег СІу Туг ТАг РНе ТНг Ар Аг Тк Ме Ні 1 5 10 «210» 13 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОВ 2 важкого ланцюга С10.2 «400» 13
Тук Ме Тук Рго СІу Азр Су бег ТАиг Гу Туг Азп Сім Азп Рве Гу 1 5 10 15 0) су «210» 14 «2115 6 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК З важкого ланцюга С10.2 «400» 14
Аге Су АІа Меї Азр Туг 1 5 «210» 15 «211» 214 «212» РВЕТ «213» Штучна
«223» Легкий ланцюг С10.2 «400» 15
Азр Ма! СІп Мей Пе Сіп 5ег Рго 5ег 5ег Геи бег Аа 5ег ей Су 1 5 10 15
Азр Пе Маї Тиг Ме Тпг Сух Сп Аа 5ег СІп Су ТНнг 5ег Пе Ап 20 25 з0
Гей Азп Тгр Рве СіІп Сіп Гух Рго Су Гуз Аа Рго Гуз Ге Геи Ме 35 40 45
Туг Су АДіІа 5ег Азп Геи Сім Ар Су Маї Рго 5ег Аге Рпе 5ег Су 50 55 60 б5ег Аге Туг СІуУ Тиг Азр Ре ТНг Геи Тнг Пе бег бег Геци Сім Азр 65 70 75 80
СІ Азр Меї Аа Тиг Туг РНе Суз Гей Сп Ніх Тиг Туг Геми Рго Ре 85 90 95
Зо ТНг Ре Су 5ег СІу Тиг Гуз Тем Си Ме Гух Аге АїЇа Азр Аа Аа 100 105 110
Рго ТНг Маї бег Пе РНе Рго Рго 5ег бег СЇи СІп Ге ТАг бег Су 115 120 125
СІу Аа 5ег Маї Маї Су Рпе Геи Азп Азп Ре Туг Рго Гуз Ар Пе 130 135 140
Азп Маї Гу Тгр Гуз Пе Азр Су бег Сім Аге СІп Азп су Ма! Гец 145 150 155 160
Азп 5ег Тгр Тиг Ар Сп Азр бег Гуз Ар 5ег ТАг Туг бег Меї 5ег 165 170 175 б5ег ТигГеи Тиг ем ТНг Гуз Ар Си Туг См Аге Ні Азп 5ег Туг 180 185 190
ТНк Сух СІм Аа Тнк Ні ух ТНг бег ТНг 5ег Рго Пе Маї Гуз бег
195 200 205
Рпе Азп Аге Азп Сім Су 210 «210» 16 «211» 439 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Важкий ланцюг С10.2 «400» 16
Сп Маї СІп Гей Сп Сп бег Азр Аа Сім Геи Маї Гух Рго СІу Аа 1 5 10 15 б5ег Маї Гуз Пе бег Су Гуз Аа 5ег Су Туг Тиг Рпе Тиг Ар Аге 20 25 з0
Тк Не Ні Тгр Маї Гух СІп Аг Рго Сім СІп СУ Геми Си Тгр Пе
Зо Су Туг Ме Туг Рго СсІу Ар су 5ег ТАг Гух Туг Азп См Азп Ре 60
Гуз СІу ух Аіа ТАг Геи ТНг Аа Ар Гуз 5ег 5ег 5ег ТНг Аа Туг 35 65 70 75 80
Меї сбіІп Геи Азп 5ег Геи ТНпг 5ег См Ар бег Аа Маї Тук Ре Су 85 90 95 40
Аа Аге Аге Су АіІа Меї Ар Туг Тгр Су СІп Су ТАг 5ег Ма! Тиг 100 105 110 45
Маї 5ег бег АІа Гух Тиг ТНг Рго Рго 5ег Маї Туг Рго Гей Аа Рго 115 120 125 50 Су бег Аа Аа Сп ТНг Азп 5ег Меї Ма! Тиг Геи Су Су ем Маї 130 135 140
Гуз СсІу Туг Рпе Рго Сіи Рго Ма! ТНг Ма! ТАк Тер Азп 5ег Су бег
145 150 155 160
І е!и бег 5ег Су Ма! Ні Тик Ре Рго Аа Маї ем Сп бег Азр Гец 165 170 175
Туг Тнг Ге 5ег 5ег бег Ма! ТНг Ма! Рго бег 5ег ТНг Тгр Рго бег 180 185 190
Си ТНг Ма! Тикг Сух Азп Маї Аа Ні Рго Аа 5ег бег Тиг Гух Маї 195 200 205
Ар Гуз Гуз Пе Маї Рго Аге Ар Сух СОІУ Су ух Рго Су Пе Су 210 215 220
ТНг Маї Рго Сім Маї! 5ег бег Ма! Ре Іе Ре Рго Рго Гуз Рго Гу 225 230 235 240
Ар Ма! Геи ТНг Ме ТНг Гец Тк Рго Гух Маї Тиг Сух Маї Маї Маї 245 250 255
Азр Ме бег ух Азр Азр Рго Си Маї СіІп Ре 5ег Тгр Ріе Маї Азр 260 265 270
Коо)
Азр Маї Сім Маї Ні Тнг Аа СіІп Тк Сп Рго Аге Сім См СІп Ре 275 280 285
Азп 5ег Тиг Ре Аг 5ег Маї бег Сім Геи Рго Ме Меї Ні СІп Азр 290 295 300
Тгреи Азп Су Гух СІ Рпе Гух Сух Аге Маї Азп 5ег Аа АІа Рпе 305 310 315 320
Рго АїЇа Рго Ме Сім Гух ТАг Ме бег Гух ТНиг Гу СІу Аге Рго Гу 325 330 335
Аа Рго Сіп Маї Туг ТНиг ІПе Рго Рго Рго Гух См СІп Меї Аа Гу 340 345 350
Азр Гуз Маї 5ег Гец Тиг Су5 Меї Ме Тиг Ар РНе Ре Рго Си Азр 355 360 365
Пе Тниг Маї сІм Тгр Сп Тгр Азп су Сп Рго Аа Си Азп Туг Гу 370 375 380
Азп ТАг Сп Рго Пе Меї Ар Тиг Азр Су 5ег Туг Ре Маї Туг бег 385 390 395 400
Гуз Геи Азп Маї СіІп Гух 5ег Азп Тгр См Аа Су Азп ТАг Ре ТНг 405 410 415
Сух бег Ма! Геи Ні СІми СІу Геи Ні Азп Ні Ні ТНиг Сім Гуз бег 420 425 430
І е!и бег Ні бег Рго Су Гу 435 «210» 17 «211» 11 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОВ 1 легкого ланцюга С5.2
Зо «400» 17
Сп Аа бег СІп Ар ТНг 5ег Пе Ап Геци Ап 1 5 10 «210» 18 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 легкого ланцюга С5.2 «400» 18
Су Аа 5ег Азп Гей Сім А5р 1 5 «210» 19 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна
«223» СОК З легкого ланцюга С5.2 «400» 19
І ей сп Ні Тк Туг Геи Рго 1 5 «210» 20 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОВ 1 важкого ланцюга С5.2 «400» 20
Гуз АІа 5ег Су Туг Тиг Ріе ТНг Азр Аг» Тк Іе Ні 1 5 10 «210» 21 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 важкого ланцюга С5.2 «400» 21
Тук Ме Тук Рго СІу Азр Азр бег ТАг Гуз Туг Азп Ар Азп Рве Гуз 1 5 10 15 су «210» 22 «2115 6 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК З важкого ланцюга С5.2 «400» 22
Аге су Тиг Меї Ар Туг 1 5
«210» 23 «211» 214 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Легкий ланцюг С5.2 «400» 23
Азр Ма! СІп Мей Пе Сіп 5ег Рго 5ег 5ег Геи бег Аа 5ег ей Су 1 5 10 15
Азр Ме Ма! Тиг Меї Тпг Сух Сп Аа бег СіІп Ар ТНг бег Ме Азп з0 20 Іем Ап Тгр Ре Сп Сп Гух Рго Су Гух Аа Рго Гуз Геиц Геиц Пе
Туг Су АДіІа 5ег Азп Геи Сім Ар Су Маї Рго 5ег Аге Рпе 5ег Су 25 50 55 60 б5ег Аге Туг СІуУ Тиг Азр Ре ТНг Геи Тнг Пе бег бег Геци Сім Азр 65 70 75 80
Зо
СІ Азр Меї Аа Тиг Туг РНе Суз Гей Сп Ніх Тиг Туг Геми Рго Ре 85 90 95 35
ТНк Ре су 5ег Су ТАиг Гуз Геми См Пе Гуз Аге Аа Азр АїЇа Аа 100 105 110 40 Рго ТНг Маї 5ег Іе Ре Рго Рго 5ег 5ег Сім СІп Геи ТАг бег Су 115 120 125
СІу Аа 5ег Маї Маї Су Рпе Геи Азп Азп Ре Туг Рго Гуз Ар Пе 45 130 135 140
Азп Маї Гу Тгр Гуз Пе Азр Су бег Сім Аге СІп Азп су Ма! Гец 145 150 155 160
Азп 5ег Тгр Тиг Ар Сп Азр бег Гуз Ар 5ег ТАг Туг бег Меї 5ег 165 170 175 б5ег ТигГеи ТАиг Гец ТНг Гуз Азр Си Туг См Аге Ні Азп бег Туг 180 185 190
ТНк Сух СІм Аа Тнк Ні ух ТНг бег ТАг 5ег Рго Пе Маї Гуз бег 195 200 205
Ре Авзп Аге Азп См Су 210 «210» 24 «211» 439 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Важкий ланцюг 05.2 «400» 24
Сп Ма! СІп Гей Сп Сп бег Ар Аа Сім Геи Маї Гух Рго Су Аа 1 5 10 15 б5ег Маї Гуз Пе бег Су Гуз Аа 5ег Су Туг Тиг Рпе Тиг Ар Аге 20 25 з0
Зо
ТВ Не Ні Тгр Маї Гух СіІп Аге Рго Сім СіІп Су Геи Сім Тер Пе 35
Су Туг Пе Тук Рго Су Ар Азр 5ег ТАг Гуз Туг Азп Азр Меї Ре 60 40 Гуз АІа Гух Аа Тиг Геи ТНг АїЇа Ар Гуз 5ег 5ег Азп ТНг Аа Туг 65 70 75 80
Меї сбіІп Геи Азп бег Гец ТАг бег Ар Ар 5бег Аа Маї Тук Ре Су 45 85 90 95
Аа Аге Аге СІу Тиг Меї Ар Туг Тгр СОІУ СІп Су ТАг бег Ма! Тиг 100 105 110 50
Маї 5ег бег АІа Гух Тиг ТНг Рго Рго 5ег Маї Туг Рго Гей Аа Рго 115 120 125
Су бег АІа Аа СіІп Тиг Азп бег Меї Маї ТНг Геи Су Су Геи Маї 130 135 140
Гуз СсІу Туг Рпе Рго Сіи Рго Ма! ТНг Ма! ТАк Тер Азп 5ег Су бег 145 150 155 160
Іем 5ег 5ег Су Маї Ні ТАг Рпе Рго Аа Маї! Геиц Сп бег Ар Гей 165 170 175
Туг Тнг Ге 5ег 5ег бег Ма! ТНг Ма! Рго бег 5ег ТНг Тгр Рго бег 180 185 190
Си ТНг Ма! Тикг Сух Азп Маї Аа Ні Рго Аа 5ег бег ТАиг Гуз Маї 195 200 205
Ар Гуз Гуз Пе Маї Рго Аге Ар Сух СОІУ Су ух Рго Су Пе Су 210 215 220
ТНк Маї Рго Сім Маї бег бег Ма! РНе Іе Ре Рго Рго Гуз Рго Гу 225 230 235 240
Зо Азр Маї Геи Тпг Пе ТАг ем ТНг Рго Гух Ма! ТНг Сух Ма! Ма! Ма! 245 250 255
Азр Ме бег ух Азр Азр Рго Си Маї СіІп Ре 5ег Тгр Ріе Маї Азр 260 265 270
Азр Маї Сім Маї Ні Тнг Аа СіІп Тк Сп Рго Аге Сім См СІп Ре 275 280 285
Азп 5ег Тиг Ре Аг 5ег Маї бег Сім Геи Рго Ме Меї Ні СІп Азр 290 295 300
Тгреи Азп Су Гух Сім Ре Гух Сух Аге Маї Азп 5ег Аа АІа Ре 305 310 315 320
Рго Аа Рго Іе Сім Гух Тиг Пе 5ег Гу ТАг ух СОІУ Аге Рго Гу 325 330 335
Аа Рго Сіп Маї Туг ТНиг ІПе Рго Рго Рго Гух См СІп Меї Аа Гу
340 345 350
Азр Гуз Маї 5ег Гец Тиг Суз Мей Ме Тиг Ар РНе Ре Рго Сім Ар 355 360 365
Пе Тниг Маї сІм Тгр Сп Тгр Азп су Сп Рго Аа Си Азп Туг Гу 370 375 380
Азп ТАг Сп Рго Пе Меї Ар Тиг Азр Су 5ег Туг Ре Маї Туг бег 385 390 395 400
Гуз Гец Азп Маї Сп Гуз 5ег Азп Тгр Си Аа Су Азп ТАг Ре Тпг 405 410 415
Сух 5ег МаїЇ Теми Ніх См Су Геи Ні Азп Ні Ні Тиг См Гу 5ег 420 425 430
І е!и бег Ні бег Рго Су Гу 435 «210» 25 «211» 11
Зо «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОВК 1 легкого ланцюга С8.3 «400» 25
Сп Аа бег СІп СІу ТНкг 5ег Пе Ап Геци Ап 1 5 10 «210» 26 «2115 7 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 легкого ланцюга С8.3 «400» 26
Су бег бег Азп Геи Си А5р 1 5
«2105» 27 «2115 7 «212» РВЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК З легкого ланцюга С8.3 «400» 27
І ей Сп Ні бег Туг Геи Рго 1 5 «210» 28 «211» 13 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОВ 1 важкого ланцюга С8.3 «400» 28
Гуз Аа бег СІу Туг ТАг РНе ТНг Ар Аг Тк Ме Ні 1 5 10 0) «210» 29 «211» 17 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК 2 важкого ланцюга С8.3 «400» 29
Тук Це Туг Рго Су Ар су 5ег ТАг Гух Туг Азп См Азп Рве Гух 1 5 10 15 су «210» 30 «2115 6 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» СОК З важкого ланцюга С8.3
«400» 30
Аге Су АІа Меї Азр Туг 1 5 «210» 31 «211» 214 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Легкий ланцюг С8.3 «400» 31
Азр Ма! СІп Мей Пе Сіп 5ег Рго 5ег 5ег Геи бег Аа 5ег ей Су 1 5 10 15
Азр Іе Ма! Тиг Меї Тнг Сух СіІп Аа 5ег СІп СІу ТАг бег Ме Азп 20 25 з0
Гей Азп Тгр Рве СіІп Сіп Гух Рго Су Гуз Аа Рго Гуз Ге Геи Ме
Зо Туг су 5ег 5ег Азп Геи Сім Азр Су Маї Рго 5ег Аге Рпе 5ег Су 60 б5ег Аге Туг СІуУ Тиг Азр Ре ТНг Геи Тнг Пе бег бег Геци Сім Азр 35 65 70 75 80
СІ Азр Меї Аа Тиг Туг РНе Суз Геи Сп Ні 5ег Туг Геи Рго Ре 85 90 95 40
ТНк Ре су 5ег Су ТАиг Гуз Геми См Пе Гуз Аге Аа Азр АїЇа Аа 100 105 110 45
Рго ТНг Маї бег Пе РНе Рго Рго 5ег бег СЇи СІп Ге ТАг бег Су 115 120 125 50 СІу Аа 5ег Ма! Маї Сух Ріє Геи Азп Азп Ре Туг Рго Гуз Азр Пе 130 135 140
Азп Маї Гу Тгр Гуз Пе Азр Су бег Сім Аге СІп Азп су Ма! Гец
145 150 155 160
Азп 5ег Тгр Тиг Ар Сп Азр бег Гуз Ар 5ег ТАг Туг бег Меї 5ег 165 170 175 б5ег ТигГеи ТАиг Гец ТНг Гуз Азр Си Туг См Аге Ні Азп бег Туг 180 185 190
ТНк Сух СІм Аа Тнк Ні ух ТНг бег ТНг 5ег Рго Іе Маї Гуз бег 195 200 205
Рпе Азп Аге Азп Сім Су 210 210» 32 «211» 439 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Важкий ланцюг С8.3 «400» 32
Зо СіІп Маї сп Геиц Сп Сп 5ег Ар Аїа Сім Гей Маї Азп Рго су Аа 1 5 10 15 б5ег Маї Гуз Пе бег Су Гуз Аа 5ег Су Туг Тиг Рпе Тиг Ар Аге 20 25 з0
Тк Не Ні Тгр Маї Цух СІп Аге Рго Сім СІп Су Геи Сім Тер Пе 35 40 45
Су Туг Пе Тук Рго Су Ар Су бег ТНг Гуз Туг Азп Си Азп Ре 50 55 60
Гуз СІу Гух Аа ТАг Геи ТНг Аа Ар Гуз 5ег 5ег бег ТАиг Аа Туг 65 70 75 80
Меї біІп Геи Азп 5ег Гей Аа 5ег Сім Азр 5ег Аа Маї Туг Рпе Су 85 90 95
Аа Аге Аге СІу АіІа Меї Ар Туг Тгр Су СІп Су ТНг бег Ма! Тиг
100 105 110
Маї 5ег бег АІа Гух Тиг ТНг Рго Рго 5ег Маї Туг Рго Гей Аа Рго 115 120 125
Су бег АІа Аа СіІп Тиг Азп бег Меї Маї ТНг Геи Су Су Геи Маї 130 135 140
Гуз СсІу Туг Рпе Рго Сіи Рго Ма! ТНг Ма! ТАк Тер Азп 5ег Су бег 145 150 155 160
І е!и бег 5ег Су Ма! Ні Тиг Ре Рго Аа Маї ем СіІп бег Ар Гец 165 170 175
Туг ТигІеи 5ег 5ег 5ег Ма! ТАг Маї Рго 5ег 5ег ТНг Тгр Рго 5ег 180 185 190
Си ТНг Ма! Тикг Сух Азп Маї Аа Ні Рго Аа 5ег бег ТАиг Гуз Маї 195 200 205
Ар Гуз Гуз Пе Маї Рго Аге Ар Сух СОІУ Су ух Рго Су Пе Су 210 215 220
Коо)
ТНк Маї Рго Сім Маї бег бег Ма! РНе Іе Ре Рго Рго Гуз Рго Гу 225 230 235 240
Ар Ма! Геи ТНг Ме ТНг Гец Тк Рго Гух Маї Тиг Сух Маї Маї Маї 245 250 255
Азр Пе 5ег ух Ар Азр Рго Сім Маї СІп РНе 5ег Тгр Ре Маї Азр 260 265 270
Азр Маї Сім Маї Ні Тнг Аа СіІп Тк Сп Рго Аге Сім См СІп Ре 215 280 285
Азп 5ег Тиг Ре Аг 5ег Маї бег Сім Геи Рго Ме Меї Ні СІп Азр 290 295 300
Тгреи Азп Су Гух Сім Ре Гух Сух Аге Маї Азп 5ег Аа АІа Ре 305 310 315 320
Рго АїЇа Рго Ме Сім Гух ТАг Ме бег Гух ТНиг Гу СІу Аге Рго Гу 325 330 335
Аа Рго Сіп Маї Туг ТНиг ІПе Рго Рго Рго Гух См СІп Меї Аа Гу 340 345 350
Азр Гуз Маї бег ем Тиг Сух Меї Пе Тиг Азр РНе Ре Рго Сім Ар 355 360 365
Пе Тниг Маї СсІм Тгр Сіп Тгр Азп су Сп Рго Аа Си Азп Туг Гу 370 375 380
Азп ТАг Сп Рго Пе Меї Ар Тиг Азр Су 5ег Туг Ре Маї Туг бег 385 390 395 400
Гуз Геи Азп Маї Сп Гуз 5ег Азп Тгр Си Аа Су Азп ТНг Ре ТАг 405 410 415
Сух бег Ма! Геи Ні СІми СІу Геи Ні Азп Ні Ні ТНиг Сім Гуз бег 420 425 430
Зо Іем 5ег Ні 5ег Рго Су Гу 435 «210» 33 «211» 441 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Людський тау-білок, Мо 33 «400» 33
Меї Аа Сім Рго Аге СІп См Ре Си Ма! Меї См Ар Ні АІа Су 1 5 10 15
Те Тук Су Геи Су Азр Аге Гух Ар Сп Су Су Туг Так Меї Ні 20 25 з0
СіІп Ар СіІп См Су Ар Твг Ар Аа Су Ге Гух Си бег Рго Геи 35 40 45
Сп ТНг Рго ТНиг Сім Ар Су бег Си Си Рго Су бег См ТНк бег 50 55 60
Ар Аа Гуз 5ег ТНг Рго ТНг Аа Сім Азр Маї ТНк Аа Рго Геи Маї 65 70 75 80
Азр Сім Су Аа Рго су Гух Сп Аа АїЇа Аа сСіп Рго Ні Тиг Си 85 90 95
Пе Рго Сім СІу Тнг ТАг Аа Сім Сім Аа СІуУ Пе СІу Ар ТА Рго 100 105 110 5егІеи Сім Ар Сім Аа Аа Су Ніх Ма! Тиг СІп Аа Аге Ме Маї 115 120 125 б5ег ух бег Гу Азр Су ТНг Су бег Азр Азр Гух Гух Аа Гух Су 130 135 140
Аа Азр Су Гу ТАг Гуз Пе Аа ТНг Рго Аге СІу Аа Аа Рго Рго 145 150 155 160
Зо Су СІп Гух Су Сп Аа Азп Аа ТНг Аге Пе Рго АїЇа Гу ТНиг Рго 165 170 175
Рго АїЇа Рго Гух ТНг Рго Рго 5бег бег Су Сім Рго Рго Гуз бег СЇу 180 185 190
Ар Аге бег Су Туг бег бег Рго Су бег Рго СІу Тиг Рго Су 5ег 195 200 205
Аге бег Аге ТАг Рго 5ег Геи Рго ТНг Рго Рго ТАг Аге Сім Рго Гу 210 215 220
Гуз Ма! Аа Маї Маї Аге ТНк Рго Рго Гуз бег Рго бег бег Аа Гу 225 230 235 240 бег Аге Геи Сп ТНг Аа Рго Маї Рго Меї Рго Ар Геи Гуз Азп Маї 245 250 255
Гуз бег Гуз Пе Су бег Тиг Сім Ахп Геиц Гуз Ні СІп Рго Су су
260 265 270
Су Гух Маї СіІп Пе Пе Азп Гуз Гуз Геци Ар Геи 5ег Азп Ма! Сп 215 280 285 б5ег ух Су СІу бег Гу Азр Ап Іе Гуз Ніх Ма! Рго СіІу СіІу су 290 295 300 5ег Ма! СІп Пе Маї Туг Гух Рго Маї Азр Геиц 5бег Гуз Ма! ТНк бег 305 310 315 320
Гуз Сух Оу бег Геи Су Азп Ше Ніх Ні Гух Рго СІу су су сп 325 330 335 ма! сім Маї ух бег ОЇ Гуз Геи Ар Ре Гух Азр Аге Маї СіІп бег 340 345 350
Гуз Пе Су бег Гей Ар Азп Іе Тк Ніх Маї Рго СІу СІу СІу Ап 355 360 365
Гуз Гуз Пе Сім Тк Ні Гуз Геи ТАг РНе Аге Си Азп Аа Гуз Аа 370 375 380
Коо)
Гуз ТНг Ар Ні Су Аа Си Пе Маї Тук Гуз 5ег Рго Маї Маї бег 385 390 395 до
Су Аор ТНг 5ег Рго Аге Ні Геи 5ег Азп Маї бег 5ег ТНиг Су бег до5 410 д15
Ше Азр Меї Маї Азр 5ег Рго Сп Геи Аа ТНг Геи Аа Ар См Маї 420 425 430 5ег Аа 5ег Гей Аа Гуз СІп Су Гей 435 дао «210» 34 «211» 219 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Легкий ланцюг 01.25
«400» 34
Азр Маї Ма! Меї ТНг Сп Тк Рго Геи 5ег Геи Рго Маї бег Геци Су 1 5 10 15
Ар Сп Аа 5ег Пе бег Сух Аге бег 5ег СІп бег Геи Маї Ні бег 20 25 з0
Азп Су Азп ТАг Туг Ге Нів Тгр Ні Гей Сп Гух Рго Су Сп 5ег 35 до 45
Рго ух Ре Геи Іе Туг Гух Ма! бег Азп Аге РНе 5ег Су Ма! Рго 50 55 60
Азр Аге Ре 5ег Оу 5ег Су бег Су Тпг Азр Рпєе ТАг Геи Гуз Пе 65 70 75 80 5ег Аге Маї СІм Аа СІм Азр Геиц Су Маї! Туг Ре Сух бег СІп бег 85 90 95
ТНк Ні Маї Рго РНе ТНг Ре Су бег СІу ТАг Гуз Геци Си Пе Гу 100 105 110
Коо)
Аге Аа Ар Аа Аа Рго ТНг Маї бек Пе Ре Рго Рго 5ег 5ег Си 115 120 125
СіІп Ге ТНг 5ег СІу Су Аа бег Маї Ма! Су Рпе Гей Азп Азп Ре 130 135 140
Тук Рго Гух Ар Іе Азп Маї Кух Тгр Гуз Пе Ар Су 5ег Сім Аге 145 150 155 160
СіІп Азп Су Маї Геи Азп бег Тгр ТАиг Ар Сп Ар бег Гуз Ар бег 165 170 175
ТНк Туг бег Меї 5ег 5ег ТНг Геи ТНг Геи ТА Гу Ар См Туг СЇи 180 185 190
Аге Ні Азп 5ег Туг Тиг Су Сім Аа ТНк Ні ух Тиг бег ТАиг бег 195 200 205
Рго Пе Маї уз бег Рне Азп Аге Азп Сім Су 210 215 «210» 35 «211» 444 «212» РЕТ «213» Штучна «220» «223» Важкий ланцюг пС10.2 «400» 35
Сп Ма! СІп Гей Маї Сп 5ег СІу Аа Сім Маї Маї ух Рго СІу Аа 1 5 10 15 бег Маї Гуз Ме 5ег Сух Цух Аа 5ег Су Туг Тк Ре ТНг Ар Аге 20 25 з0
Тк Не Ні Тгр Маї Аг» СіІп Аа Рго СІу СІп СІу Геи Си Тер Пе
Су Тук Пе Тук Рго Су Ар Су бег Тиг Гуз Туг бег СІп Гу Ре 60
Зо
СіІп Су Аге Аа Тиг Геи ТНг Аа Азр ТНг 5ег Аа 5ег ТНг Аа Туг 65 70 75 80 35
Меї сім Геи 5ег 5ег Геи Аге 5ег См Азр ТНАг Аа Ма! Туг Тук Су 85 90 95 40 Аа Аге Аге Су АІа Меї Ар Туг Тгр Су СІп су ТНг 5ег Ма! Тиг 100 105 110
Маї 5ег бег Аа бег ТНг Гуз Су Рго 5ег Ма! Рне Рго Геиц Аа Рго 45 115 120 125 бег бег Туз бег ТАиг 5ег СІу СІу ТНг Аа Аа Геи СІу Сух Гей Маї 130 135 140 50
Гуз Ар Туг Ре Рго Сім Рго Маї ТНк Ма! бег Тгр Азп 5ег Су Аа 145 150 155 160
Іеи ТНиг бег Су Маї Ні Тиг Ре Рго Аа Маї Гец Сп бег 5ег СІу 165 170 175
Іеи Туг бег Те 5ег бег Ма! Ма! ТНг Маї Рго 5ег 5ег бег Геи Су 180 185 190
ТНг біІп Тпг Тук Ме Сух Азп Маї Азп Ніх ух Рго бег Азп ТНг Гуз 195 200 205
Ммаї Ар Гух Аге Маї Сім Рго Гух бег Су Ар Гуз ТНг Ні Тиг Су 210 215 220
Рго Рго Сух Рго Аа Рго Сім Ге Гей Су Су Рго бег Ма! Рпе Гец 225 230 235 240
Ре Рго Рго Гух Рго Гуз Ар ТАиг Геи Меї Іе бег Аге ТНг Рго Си 245 250 255
Ма! ТНк Сух Маї Маї Ма! Азр Маї 5ег Ні СІм Ар Рго Си Маї Гу 260 265 270
Зо Ре Азп Тгр Туг Ма! Азр Оу Маї СОЇми Маї Ні Азп Аа Гуз ТАг Гу 275 280 285
Рго Аге Сім См СІп Туг Азп бег ТАг Туг Аге Маї Ма! бег Ма! Гец 290 295 300
ТНк Ма! Геи Ні СІп Ар Тгр Гец Азп су Гуз Си Тук Гуз Су Гу 305 310 315 320
Маї бек Азп Гуз Аа Геи Рго Аа Рго Іе Си ух ТА Пе бег Гу 325 330 335
Аа Цух Су СІп Рго Аге Сім Рго СіІп Маї Тук Тиг Геи Рго Рго бег 340 345 350
Аге СІм СЇм Меї ТНг ух Азп Сп Маї бег Геи Тнг Сух Геми Маї Гу 355 360 365
Су Ре Туг Рго 5ег Ар Іе АїЇа Маї Сім Тгр Сім бег Азп Су Сп
370 375 380
Рго См Азп Азп Туг Гух ТАг Тв Рго Рго Маї Геи Ар 5ег Азр СІу 385 390 395 до б5ег Ре Ре Геи Туг 5ег Гуз Геи Тиг Маї Ар Гуз 5ег Аге Тгр СІп 405 410 415
СІп СсІу Азп Маї Рпе 5ег Сух бег Ма! Меї Ніх Сім Аа Геи Ні Азп 420 425 430
Ні Тугк ТАг Сп Гуз 5ег Геи 5ег Геиц бег Рго Су 435 440 210» 36 «211» 214 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» ІС пС10.2 «400» 36
Зо Азр Ма! СІп Ме Тпг Сп 5ег Рго 5ег 5ег Геи 5ег Аа 5ег Ма! СІу 1 5 10 15
Ар Аге Маї Тиг Меї ТНг Сух Сп Аа бег СіІп Ар ТНпг 5ег Ме Азп 20 25 з0
Гей Азп Тгр Рве СіІп Сіп Гух Рго Су Гуз Аа Рго Гуз Ге Геи Ме 35 40 45
Туг Су АіІа 5ег Азп Геи Сім ТАиг Су Маї Рго 5ег Аге РНе бег СІу 50 55 60 б5ег Аге бег СІу Тиг Ар Рпе ТНг Геи Тпг Пе бег бег Геци Сп Рго 65 70 75 80
СІми Азр Меї АїЇа ТНпг Туг Туг Су Гем Сп Ні Тиг Туг Геи Рго Ре 85 90 95
ТНк Ре су 5ег Су Тиг Гуз Гем См Пе Гуз Аге ТНг Маї Аа Аа
100 105 110
Рго бег Ма! Ре ІМе РНе Рго Рго 5ег Ар Сім СІп Гей Гуз бег Су 115 120 125
Тк Аа 5ег Маї Ма! Су Геи Гей Азп Азп Ре Туг Рго Аге Сім Аа 130 135 140
Гуз Ма! Сп Тер Гух Маї Азр Азп Айа Геи Сп бег СІу Азп бег СІп 145 150 155 160
Си 5ег Ма! Тиг См Сп Азр 5ег Гуз Азр бег ТНг Туг бегеиц бег 165 170 175 5ег ТигГеи Тиг ем 5ег Цух Аа Азр Туг Сім Гух Ні Гух Ма! Туг 180 185 190
Аа Сух СІм Маї Тик Ні СІп Су Геи бег бег Рго Ма! Тиг Гуз бег 195 200 205
Рпе Азп Аге Су Си Су 210
Зо «210» 37 «211» 23 «212» РВТ «213» Штучна «220» «223» Тау-білок 386-408 з фосфорилованими 5396 і 5404 «400» 37
Тк Ар Ні СІу Аа Сім Пе Маї Туг ух 5ег Рго Маї Маї бег СІу 1 5 10 15
Ар ТНпг 5ег Рго Аге Ні Гец

Claims (10)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент, здатні імуноспецифічно зв'язуватися тільки з фосфорилованим залишком 396 людського тау-білка (ЗЕО ІЮО МО: 33), що містять: (а) СОКІ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮО МО: 9; (Б) СОК2 легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО: 10;
(с) СОКЗ легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІО МО: 11; (4) СОКІ1 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 12; (є) СОК2 важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за 5ЕО ІЮ МО: 13; і () СОКЗ важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність за БЕО ІЮО МО: 14.
2. Моноклональне антитіло за п. 1, що містить важкий ланцюг за 5ЕО ІО МО: 16 і легкий ланцюг за 5ЕО ІО МО: 15.
З. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2 для застосування в терапії.
4. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2 для застосування в лікуванні, діагностиці або візуалізації таупатії.
5. Моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2 для застосування в лікуванні таупатії, вибраної з групи, що складається з хвороби Альцгеймера (Ар), хвороби аргірофільних зерен (АСО), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АЮ, або психозу у пацієнтів з АЮ, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (РР), лобно-скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАКТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко-Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліогліоми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітичного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу.
б. Фармацевтична композиція, яка містить моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2 та фармацевтично прийнятний носій.
7. Фармацевтична композиція за п. 6 для застосування в терапії.
8. Фармацевтична композиція за п. 6 для застосування в лікуванні, діагностиці або візуалізації Зо таупатії.
9. Фармацевтична композиція за п. 6 для застосування в лікуванні таупатії, вибраної з групи, що складається з хвороби Альцгеймера (АФ), хвороби аргірофільних зерен (АСО), психозу, зокрема, психозу, обумовленого АО, або психозу у пацієнтів з АЮ, психіатричних симптомів у пацієнтів з деменцією з тільцями Леві, прогресуючого над'ядерного паралічу (Р5Р), лобно- скроневої деменції (ЕТО або її варіантів), ТВІ (травматичного пошкодження головного мозку, гострого або хронічного), кортикобазальної дегенерації (СВО), хвороби Піка, первинної вікової таупатії (РАКТ), сенільної деменції з домінантою нейрофібрилярних клубків, деменції боксерів, хронічної травматичної енцефалопатії, інсульту, відновлення після інсульту, нейродегенерації, пов'язаної з хворобою Паркінсона, паркінсонізму, пов'язаного з хромосомою, хвороби Літіко- Бодіга (гуамського комплексу паркінсонізм-деменція), гангліоглюми і гангліоцитоми, менінгоангіоматозу, постенцефалітичного паркінсонізму, підгострого склерозуючого паненцефаліту, хвороби Хантінгтона, свинцевої енцефалопатії, туберозного склерозу, хвороби Галлервордена-Шпатца і ліпофусцинозу.
10. Нуклеїнова кислота, яка кодує моноклональне антитіло або його епітопзв'язувальний фрагмент за п. 1 або 2.
ВЗ Я УН ІБЗ лю во ОО в Ми п М ММ ЦІ с й й ДоЦБ
0. ви мн о гак А шо І Ра Ех РІ пра т птващІо о в й м о и ГУ ав 8 ХЕ у т
Фіг.
Се х х ж ге п З Кз Го СУ 5 в щ т їж; ся я З : е НУ ; що їх і. Е З хв що щи : у З х ІК я во Е Ж з й - во Ж до; ї ех що щ й -к т М ВЗ В ; ее яку. Ех як У ЕК х В и а В 5 п в М В І с с ; їй Кос кВ ОВ ! З КО ОО пу ПЕК со НВ Он нн КК ОКО ОО ї о І с Х В Кнох ПИ Зв ще о пив ОО Ов ин ЕК КОХ ОО КК ПЕК ОО ОБО ЕВ а КОХ ОО М КВ З ВО ов СО о в Зй е З о ПОМ ЖЕО: ВВ Пе п х Тон НИ БЕК ПО ех ВН Ох. пе ОХ КОХ ОК т: ЗМЕН КО о ООН Кн За с о о пит, КК ОХ МИС МИ КК но ОМ ОЛЯ В а М з М УВО ен о с ПВ шо о я ОК ПО КК В МОН ОКХ ОО я о п о: ОХ ПОКИ НО НК А КО я оо с с ОО ОККО МО ОХ АК КЕ СЕ оЕНЕШ в ОКО он ОК КК Ко Ох ОККО ОО МО ЗЕ В а п о хе п ОО а ЗО КН ПО Б ОО ПЕН М . ОО ОВК п ще Я НК ОК НК ОН ОВ КО о о МО М с КИНИШИНи ОХ ЕХ ОО КК ВОК пох ОО ОО с жя ПЕКИ ОХ ве ОО 5 ОК в 0. о ОО я МКУ о ОО ОВ КЕ З ОО ООН ноя КК КК ОК нн ЗШ ОО х ОХ ДНКК НК КТ ПЕН ОО же ща нь Зі Ех о в о. Ох ПЕК в КК х. НК о ОВ ЩЕ КК ОО еВ ОО МО - КН В ОК ПО: -х о В ан: А В МО о ОО я п ОБ ОО ї ке В КК ВХ ОО я пн хх ін ОХ ОО УМХ ОХ ОК о. У МО і. ЛВ ЗИМИ НК ОО ПК СК ще о У ж ОО в . о ПК ПК с ПКЕЕ с о о ВИМОВА ОХ Кф ин НН В ОК: ПИППИПИННИ НЕННЯ ПШШПКІЦИИШК ОО НВ Мо З ЕЕ ЕК ДУХ я о щ КЕ ПНЯ ооо о. По МКК ОО ОО і Кв З в В ОО З ШК НВ У ОО : ОМ ОК ИПИПИНИ ЛИШ ПЕ З
Тих. ПО я ОЙ ПЕВНЕ ЕК : ЕВ а в М в ОО Я ПИХЕМЛИХИИНИЖИ ИН
Фіг.2А до НхЯ - да с: : З я вом - З й я зу г ; : 5 в й 5 КЗ щі : За ї : 5 г В ї КЕ ї ї й Ж ОО. ши ЕЗ хх Ж ек і Са 5 Б В - я : зе я З г дО М х 5 ї Її. Її о й Я В Є Г2зу щу й ї що х їх і і х і ж я ем ОО о Я о А вве КОН ОО НК. с з КК З о ОК КК В ЕЕ я. КО КО СОКИ МНН КЕ ОО Ох ПЕ КИ КО Ве М ПЕК В ПМК ВН хй М С с НН ЗОВ КО ОО УКХ ОО У ООН АК КВ По ДОК ООН КИ ОХ ОК: МО МКК ОО У І ВК КК с п о. я ДО хо ГО 5 УК В ПК ВН о НОВ Я КК М НЕ ОХ ЗОВ ж пи М УВК "Ж о о НВ З БЕ що ОО Є ОМ Ж с ОО. о З М У ЕН в В ОК: с В: КОКО ПЕ я ХМ МАН В ПЛИТ К п п УОЗ РЗК: ФК ОО У ОН М М: Ко ПК Ки МПК ЗО що ОО ПО Є ЗО о Як ОО МН ПИШНИХ КК си ще ПОН ОХ с о ЗО З У КО Я ОН ОК зу М ОО В Ох ЗО Ох с ВОК о ЗО о о У КО ОВ ХО шо о о ЗНМ Бо ПО Ко Ох ОО ПО МКС Я Кв Ся ща ОО ї КОКО В КК НЯ ОКО Як ОО 00000 5 и Б г о В ВО КК З У ЕН ОМ ОХ КК я Ве ши ВВ с ща. с о. ОЗ ЕХО СМП ОО ОХ ОХ КК КОЖ сени ; СЯ ОКО НЯ З КК А ХХ у п ОО З МКК ПН ВК ХК М ОХ КОКО Х ОХ КК ОО
М. о ХК ОО КК МАХ Шо ПК В МО ЗМО пи ХХ о 5 п сс. с о ОО не МЕМ Ох КОН ПЕ ХХ ОХ СКУ з 5 ХХ ОО о ОО НК ХО ПОМОХЕВЕ ООКН ЕК А ВО КОКО п ОО В о Ен ПАК КК ПК о МКК 5 У пе я ЕК ОО НН о. М НК ХО КЕ ї
ССС. о ОХ М о я КН ОН ПИКККНЯ Я у ЕХ ЗК В ще ЕМ МО ТЕКИ ПМК ЕМВ ПМК КК НК
Фіг.28
А о ж Ар ек З кл ке М «век іо З ЦИ не і о В З Я Х г Кв петвя І В яке ж АВ Бон йо коугрань І хом | ; й іх нет ОН
Фіг. ЗА і ЗВ б і з а а й жо ховеуроль ще ит дного пон я «Х Ж і у ЕЗ ЕЗ Каскнулма СЯ
ОК. Шо: а ад же. ; і фо вонтреде оо . Мод света СЕН
Фіг.ЗС і 30
А а Ве х ї яд і «й КЗ З Її З З Том іх павук ек - В ВЕ м КМ погляду; Фігді4В
С Кох 7 ох ЕКО і БАК жо КО - М ВЕК яке КО ТО ФК Ж я ів і.
ж і. . | У . і. ши ІТ, ння крана ТЯМ 7 і: Бе х Е Х ї ЕНН З ЩЕ Я « й х Я ву се Ж Фіг АСі140 АВС Км З жк Я кра довтратняя парою СКК ще ї КОКО ОО с і. о. о: ше . ще о. о. . . . . о. с о
Фіг.ЗА
ЗМК МЕ шана о п о шен НН Ффіг.5 А ЕК | / : і: они ж Ав а ж тоні Тех Ким ЗеАЬЗ | ж
Фіг.бд ші з Ку | / 2 во / вок ЩЕ нини нак АВ НАС ІНЯХ ж то що
Фіг.
Зх Я . З 7 АЮ ШИЯ ! юн уроте ше є пев З ЩО і. . ї З З їв ВА Ко хокох І | ж КЕ вжи г я вк зх нн що кевтроз» Е жа яко ве / в ек д | ще ще ких ху їхх : ун З Же нн ни з Я із ВЧЕНІ ФігосСіво ше х ж АВ свова : до ЖК ковкуреть ші Кок ж ВВ ; дж щі з ВО я Б Я ізкп Я НІВ.
Фіг. оЕ ж ж Я ск Ж рооусЯ. -е Е Я ш ; Е ї - ЗОМ т г ше: я з КЕНЕ к ! а | : Унши чи ши ИКеНН У сх С не а М я ИЙ ож с вх Ге - Мк ІК, же ие я ж ; ке в я ж Й жо я Вк» | Ї В вовк ; іш т У як аа ШЕ: Е МР: ! вищ ШЕ : а 5 За г Я їі х Б «дв | и Ж що г: | з ш НХ ех ! Е: яв 1 ча дн й І 3 дров од вв работу пряну . ши х ке ки З ой я я ши ся КИ оди 13 Я ев й ря я з Кт чи як - С жжж ж ник БІ, «ке з т Ж ще Е й ЕІ ни во ЗЕ ми ший ., . хх я Є є ЖЕ З ШК У во» Е є ШЕ Ж ЩЕ з Я Ж Е: Ж З зд З щ і Ж Я Ежен - м щі І І І шк и У ДАЧ же си ми сни ав и и о «й у й вис В а ем Фо шко; ке шко ж ще
ОБ. і сккрж У «ж роса зей з : - Ми щит т КЕ Н КЗ м щ ї ри ве зи ти "ох ВК тісту ротою іпуекеванть сккюючаю жк а в вк СОН ШЕ хвманмукн Зх В БУХ ко Й Ж ко йо Ме її Зв їх АВ .Ж, ОБО ВЕ Бе ВК Вч В ВЕК "ВЕ . і . їі . ВХ ВК В Ж ХО Я Закеврняхе забоєгтзкукали ГМК Ффігзд і в і ШО СО банан 5 г З АВ Во Б В ЩЕ Є СЯ У Ка со І -коще М НН нн . о Ккумне Вик умах КА, ВАУККО ВВ до пня Ко си м ЗВ Ох хе ке о, ЗМК ХК її ВЖК Ж жо ще пк Е ПЕК КІ КЕ ВК кн щи р ВК В В В В В ВК Са п и Ка ПК: В о ве Ко ж ОКО С, я ВЕ З зв 8 х З В 0 МН ЗЕ НК ЗОН ВОНИ о НН Я ВОК ВЕК В КК ВК ерчука Вк ніяк «УВУ ЕНаН ЕМ Фіг осі во
Може ОТО УНН УудалИ ТЦ Я паунення ВЗН ВО В Нове КЕ. ! СЕН і в. ідентиніікикцани 1 яке, ма За зуються з ОВТ З сх сук чия щі ау, сії З оку знані З ана на вино МИ ТНК |! - ВІВ | ви оуй ктів З АК. В повна: з контрепьникм ; і ат ерВем і ! і я іденти жеовамо 15 лов ї : св (у - г. д А й попруанц у ІЗ З АЕН» дн ЛЕН РВЬЕЕЕ, Фу кВт. ; й Банжування | Ж. СМ ЕАМання характе г жк ан» ї ХВКННКЧУ ДЕС НЕНОКЧЯ, Іване мая. : їні денною З клон З а уник атняна КЕ ж ик ! Пк свахи її Бболередження втроєані і Упав кваньної Ж ефекнвніть НУ. ве и и п Ж шл я ї 3 Павезеднення запалення ДИ та ; х Ш х. к г й З ВІКНО АЕН Я ЯРУ. я КНХКЕНІЕ Залгутавно й Я х вальні на ПМ Е Б функцівнамьна я пе о но ОД ДН Ще фун ще ой ща | М КОЖ Ка ВООЗ нКічних ДЕЧНМИТ вояк ВНТ НУ в зва Ти і
1 Я. Змечвжння рівня РЕ тесрлюв ж зим, і ско номнчих ВТаНе ши Оачеичен кахнекен нь зма Ффіго Ж : х ее ше нев з Б. КО ЕТ ОХ а В У Си С ве и ню й. з а і й киш ше ПО а й. сов що ОЙ й У ЕЕ іш а В КЗ ох хх я о о В ї Янв сш 8 - : С ЩЕ У. й Шота В У ще ХЕ ХМК с, З Ж Ж ше НВ й ТЕ ХЕ ЖОВ Я
Фіг.1о
Визна ан ян С т ні ДЕ юю в ВВЕ Ев КОФЕ інзацхюх ЗШ щ х ЗМО ММК З КОЕ НА її. ОД НЯ у ОО ох Ах їх Жорж ще Жак "те ОКА КВ, орви ОВ КОЖЕН й й ОО а В Ю не, схх шо Ж Ходи джує х с ЗА НЕ дк НК бо» ни з Б Ли Шк й Кк х п ен що КУ ЕЕ ож Ко х 7 р док пе ї ВЕ Ж зи, Х У ге я х. сити. ни А А У жо о ЗМЕН КЕ НЯ я ше т 5 ак їх ій ше щи в я я п Ка ІЗ й: НУ з щи Фіг - х З КЗ Жож КЗ щ що Я ща ж що ж В, Ка й Ж СУД 5 Ко юю. ЗА КТ св В ов сн кН А А Я Ж ОО ЗК и Не НН пит. ще ПИИИИИ ех. п вн не вос ВЙ М нн шШН о а ша, с ПВ ВЕ ВЕ в НН ОК ня плн Не ВВ В Ффіг12д дек ОК ЗУБ фа ЗОЖн | М нку Ж В Я ! Х З Х ж ЕК Е Х З о ї ! ; З М о Ж Е З Е о я. | ! ме Я: х -
ва. | ! с Зх су ох з
Я. я В що а ож ЩО и що йКУй С як Ж «т и НУ к. г . чНя Е ща Й ї- Фіг 126 зх ; - З о ех ОД Ж , ШЕ и Ше ше: шо ж Ко КК ноу ОО КК ТЕТ Ух рос ЕК о НУ Он и НО дя я САН В НН о о в М шк шк є ЕН ОКО НМ ЕЕ й х с Б 5 Ви В ОХ Фіг 13д т ТВ і я 10 ЗУ ж г й ЗТ: т : В Н ю Ж дет х Щі Е: вве ! : і - 5 К Е ї і їх У ! Ж ! М: й Ж » Се А ННЯ Ей КМ І М Я « СНИ В Кі сю ом с ха о и и й в т дощ Б ОК «Й з Аа ке: в ж ШЕ У Фіг13Б ї7 се В ЖЖ ) жжж - де їх сх ж Я в я «З а с а є а Б й Со се ІА я ах й Є й вв з СО де аа ек бе С м й как й Кк й а Ку КЗ я Ко З и Он и ши Фіг 15С фіг14А
ЗЕ з кіз ТАКО ; тик ка кох я І: Я Е Ех : : Е | К Е мк : же Е ІЩЕ: : Е я хх З й з Іще: їх й З Е я | Я Е Е я Е Е Я Я З Е І х Я ї й К Я . Е М: ї г: К шк ЩЕ жо: СЕН ОК ВВНЗ Гоше сення ж оо ан с я ВаСхУкерімя ЖОМІЬНИЙ, МОКІЯ КК КАС «ЗХ ЕВЯЖНК 0 мнономухмі в За як УМ: ЯК ІИКеИ й песика (а са ЕІ НЕ ВЕ Бе: ї : : се Щ а З З : ІЗ : У : ІЗ : З : в ІЗ Я Я Я Щ ; : З яв ї : З у : : З : де ВК Ба ОО НУК жноні куауернах КСМКрНЄТЬНЯМ.
Врхоюнно ча Кене Жике ММЕЖОЯМІВ КБЕаЯжЕНяКЗИ оханхиеь: ХУ НИК диву нни ах.
ГКІ ТЕХ. в й в м ФіглЯвії3с сн НН. ва В зі зе МОЯ еще Кон КО ДЕ Сни: А С В НК Ж Б Б с п Я М М В НТ т М 5 Фіг 15А
В ЕКО а Е ЩО : В : В Е хво Н БУ і шин З Ме Е аа м й й з І: й та і Я ОО ЗУ, пит я З В а ванн ЗЕ ПОП цих хв. ИН ЧЕ ВИНИ о Е З пк Га в. сечечнчяичнь» скккхжркюьня пхютржжннй Ї ппжнлдюллнно ВНКНННННК, ння Конитрояех Вхідний Виснавенн» Виснаження Висивження зай овхійний меторіни За деревне За чне. Зх допом заатерійи звід зак що ТОНУ КЕ га ЯН Кубки М ОО о» 125 1 Ш джу М ЖЕ І жо я ес : о В А ЗЕ ЧИ: ВЕБ ШЕУ Ї кв : 1 Вже А і ом Я ех З ! с ЗЕ БО Ж З ! Жоніднзиь- Вхідний Виснаження Мнснаження Бідснаження кий ехідний маторійн за девомо- ЗВ ДЮПОМ- ЗВ ДІВМЕ- маторіаи від тою МКХ сх ЕНО.Я гою УМ судів з АВ
Фіг.158 і 155
- ЕЕ вх : мож й Жов Е Ж ОК о сдяо й х доле вож шою т в з щоб щі Щі я ЕС кот рда яж ох Ко оу АК КА М й Я я В ко з ж ВВО- ж що мВ ля ЩЕ В В . Й Я Е я 4 -к ШЕ Ве Е Ох ко Е хх х що як. ; ! ! : Я ЕЕ що: я їх да їх ТвояФ бе й ще Я с ке те чи й т щої Фіг 1бді 10 то З ох Е Е ово» | щ- Бе Е г Е З за шк | -" ШЕ ! я Пенн щ -к ж -Е ще в та -Е ий . Кк і к | щі в -Е я ко шу бок ж пи ще ее і Без що в я І
Фіг.17 же Ж У в їх ЙДЕ Ж ох м ни У: Я ВО с о бо а ДЕ Ж 0-2 ВИ ші КК Х А «Фо ую аю в ав х 8 І и еВ ШО КЕ АК ВЕК КУ х ШИК О СПИМЦИИЕ ї як при зитющо ОПНИШИКИЙ ООПИЙИШИЙИ: ОСПИЦИЩИТ;
І. дк Зиие АЖ: ШИ: скиди: КК - с з й с - пон ЗОБОВ М я ШИН ОМ х 0 шо ж ПИЙ ПИЙИИИИИ ПИПИИПИИП ПИШНИМИ З СИ ПИПИИИИТ. ПДДЦИПИНИ ППП ПИ БУ во ПОЕТ в ВК п Я
Фіг.18А дов СО ук 150 : Я : х коненя ; | - З Тк г н : а ЗО Ех ш щи т в Г. Ж Ко ство, | ! Е и | шк г НЯ | | ! ! я ! ! «6 Же ях (я - ме я й ще де я я хт я ГА єї ке ке їх і Гм Ффіг.188 їі Ще ж х ще Ж що 7 шов де яке жа М ас я с її а ОЙ сш МОЖ Я Жду ДЖ КО що я шк шо а ВН НЯ ше ше ши и Ше Ве . Ж ї вк и и О е А БИК ння - ОК.
ЗК С її як о Е БЕ ! х ЩЕ Б ше Ж З шин нн а М ОВ х Я ово ПДК ЕЕ МУК пт ДОЖВОКНЯ Ффігтод ту чо за дак МОЖ я 1985 ее нен Би ХЕ ОК З є 3584 - Я Ко з т ов у а В | З шк САНИ ! ко В ї У яв Ї х х Кк х і ! З жк ТР і Ку Ї Шк Ж Ї Ко й и и НН Ка щ й 3 я Кк; КУ з-ій в В ЗА я Х де « З в У со) Ки я, У и кв я и вай кА У й и Коб ня и НВ З
ВО : аж і х ї хе шк КЕ КЕШ н "ще щї З | І в З Я - ОМ я я Шк А я я відб в а пу и 4 бе Кі ой и Фіг19с х ей - ХЕ Еш ки ш ке ін т ще А й г с .
о. . с о
Фіг. 2Од ш 5 їв. тв Ба да мож К; к Е Стара ля хх Кок во - М Та ков я 225 -
Пов. | ще с х З Бк щ х ЖЕ Е ї Гі ях І їі Ех ! | і ЕН Е ї Я о В що: ЗХ ! І в 2- сере Хлячи плату дого нтуюй ллледосюту вкедний Контрольний, Миснжження Биснаження Та затеріай виоважений ЗЯ дено За децама» від зи данамогон п 18 пою 23.2 єтааво «З
Фіг.208 З їх Ж. Ех - Же О пежх ЗОН ОКО И я БеНеЯ Б НВК а я пЕШНИНИМННИЦННИ ХО ХОМ с БО З о ше НЕННННННННННИНЯ КО о ШЕ с 53 о о З МО оче ОКО КК Я Б ОО КК КН ЕЕ с с о МН КК КК Ех фіг 21д
Ха я МЕ ож вї і це ее ще видввснвю заряванй ЗЕ | в їх Б ї Н ; ой щі Фе МН ; ПО хз і ! З «и Ж тая З знан ВЕ а і ПА ШЕУ Н ДЕН Ж Н і дя Ко) Х Домен ско ВВВЩЩИИК, для ша, пек Єоюннтх Кснтропь Вуїдний бУуснаження Веснаження Виснаження ний яхідний маузрівй Зв допомо за доалимо З допомо матерів хід гою що пою тою ППУ губка сх Ап в 83 сич д щоку зд Я МЕ 1 Її. кеКСВим Н во м З ок 1 ше і пок Н гЗ ФО ЕХ СВа Гея щі Н ТОМ о» ї КЕ Е за 1 ки ї 85 ті МО Н Контроль Вхідний йиенаження Шмеззження Виснаження мих ахідний миатвріжн За допомо За допомо за донамо матаріви а ге ща ТЯ оогою 00, субукиа з АВ " "о,
Фіг.218 і 210
Є з же А тм З В БОЯХ ШЕ СМ сш м МИС а е 24 8 х й 8 й ЕТ ши
5 . ! х и коту ще и В о виш е каш я Ффіг.22А і 228 но що В» щі БЕЕІе я Я їх ОлЕЕ щі ПЕ ст ! ! м й Що. заши шши шк ше ше Б ще с що си гчЗ чу -е а в ах хо ще 2 З а те - пе М: - М . с гук се пр ке я І ми нн С НН ШИ
Фіг.23
КУ їх я Кй я Ки КЯ КУ й Ж Кк я Я с що КІ Кі з с х щ Кй Я 0 - с
5. г 0: с у.» с г - г ооо ..ОСс ши о ооОоО'ГГ,ГпГгк" В ЗАГАЛЬНИЙ ТАУ-ІЛОК ЕТ ТАУЧЖИВОК Р-БІВВ (010.
Фіг.24 ій о З й ї ! З й ОО : : я ек Об вНЕО Ве сю воював нава фіг.25
UAA201800762A 2015-07-13 2016-07-12 Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування UA123862C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1512211.2A GB201512211D0 (en) 2015-07-13 2015-07-13 Agents, uses and methods
GBGB1518375.9A GB201518375D0 (en) 2015-10-16 2015-10-16 Agents,uses and methods
PCT/EP2016/066470 WO2017009308A2 (en) 2015-07-13 2016-07-12 Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA123862C2 true UA123862C2 (uk) 2021-06-16

Family

ID=56557664

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201800762A UA123862C2 (uk) 2015-07-13 2016-07-12 Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування

Country Status (32)

Country Link
US (4) US10196439B2 (uk)
EP (1) EP3322442A2 (uk)
JP (1) JP6878395B2 (uk)
KR (1) KR20180030047A (uk)
CN (1) CN107847595B (uk)
AU (1) AU2016292892B2 (uk)
BR (1) BR112018000769A2 (uk)
CA (1) CA2990555A1 (uk)
CL (1) CL2018000096A1 (uk)
CO (1) CO2017013318A2 (uk)
CR (1) CR20180026A (uk)
DO (1) DOP2018000012A (uk)
EA (1) EA038703B1 (uk)
EC (1) ECSP18002644A (uk)
GE (1) GEP20227369B (uk)
HK (1) HK1254357A1 (uk)
IL (1) IL256791B (uk)
JO (1) JO3711B1 (uk)
MA (1) MA42446A (uk)
MX (1) MX2018000505A (uk)
NI (1) NI201800005A (uk)
NZ (1) NZ738595A (uk)
PE (1) PE20180607A1 (uk)
PH (1) PH12018500062A1 (uk)
RU (1) RU2727911C2 (uk)
SG (1) SG10202101343RA (uk)
SV (1) SV2018005611A (uk)
TN (1) TN2017000541A1 (uk)
TW (1) TWI741987B (uk)
UA (1) UA123862C2 (uk)
WO (1) WO2017009308A2 (uk)
ZA (1) ZA201800070B (uk)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6674888B2 (ja) 2013-03-13 2020-04-01 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ免疫療法
JO3627B1 (ar) 2015-04-30 2020-08-27 H Lundbeck As إيميدازو بيرازينونات على هيئة مثبطات pde1
JP6793134B2 (ja) 2015-06-05 2020-12-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
MX2017015908A (es) 2015-07-06 2018-03-15 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos de union a tau.
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
FI3452507T3 (fi) 2016-05-02 2022-12-15 Tau-immuunihoito
EA201892417A1 (ru) 2016-05-02 2019-05-31 Протена Биосайенсис Лимитед Антитела, распознающие тау
US10034861B2 (en) 2016-07-04 2018-07-31 H. Lundbeck A/S 1H-pyrazolo[4,3-b]pyridines as PDE1 inhibitors
GEP20217222B (en) 2016-07-12 2021-02-10 Lundbeck A/S H Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
WO2018035137A1 (en) * 2016-08-15 2018-02-22 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Volume control device for manually operated resuscitator and ventilation apparatus and method of use
CA3041595A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 H. Lundbeck A/S Combination treatments comprising administration of imidazopyrazinones
EP3532064B1 (en) 2016-10-28 2020-07-29 H. Lundbeck A/S Combination treatments comprising imidazopyrazinones for the treatment of psychiatric and/or cognitive disorders
AR110321A1 (es) 2016-12-07 2019-03-20 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso
JP2020511937A (ja) 2016-12-07 2020-04-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
MA47205A (fr) * 2017-01-04 2019-11-13 H Lundbeck As Anticorps spécifiques de la protéine tau hyperphosphorylée pour traiter des maladies oculaires
WO2018152359A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Anti-tau antibodies and methods of use thereof
JP2018139530A (ja) 2017-02-27 2018-09-13 帝人ファーマ株式会社 認知症治療又は予防のためのヒト化抗体及びその製造方法、並びにそれを用いた認知症治療剤又は予防剤
EA039569B1 (ru) * 2017-03-14 2022-02-11 Х. Лундбекк А/С Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения
CN110881274A (zh) 2017-05-02 2020-03-13 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
JP6851549B2 (ja) 2017-10-16 2021-03-31 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 抗タウ抗体及びその使用
AR113926A1 (es) 2017-12-14 2020-07-01 H Lundbeck As Derivados de 1h-pirazolo[4,3-b]piridinas
SG11202005361RA (en) 2017-12-14 2020-07-29 H Lundbeck As Combination treatments comprising administration of 1h-pyrazolo[4,3-b]pyridines
US11535611B2 (en) 2017-12-20 2022-12-27 H. Lundbeck A/S Pyrazolo[3,4-B]pyridines and imidazo[1,5-B]pyridazines as PDE1 inhibitors
US11274147B2 (en) 2018-02-01 2022-03-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
BR112021016947A2 (pt) 2019-03-03 2021-11-03 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos que reconhecem tau
EP3948295A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 H. Lundbeck A/S Use of a ps396 assay to diagnose tauophaties
EP4135841A1 (en) 2020-04-15 2023-02-22 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
US20230265175A1 (en) 2020-06-25 2023-08-24 Merck Sharp & Dohme Llc High affinity antibodies targeting tau phosphorylated at serine 413
IL301242A (en) * 2020-09-11 2023-05-01 Janssen Biotech Inc Multispecific vaccine targeting molecules and their uses
KR20230084508A (ko) 2020-09-11 2023-06-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 베타 사슬 매개 면역을 조절하기 위한 방법 및 조성물
WO2022104136A2 (en) * 2020-11-12 2022-05-19 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions for tauopathy diagnosis and treatment
MX2023007181A (es) 2020-12-16 2023-08-30 Voyager Therapeutics Inc Compuestos de union a tau.
CN113702647B (zh) * 2021-08-31 2024-03-15 普十生物科技(北京)有限公司 人生长分化因子15即时检测试剂盒、其制备方法及其应用
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023250388A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024059739A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
WO2024067401A1 (zh) * 2022-09-26 2024-04-04 中美华世通生物医药科技(武汉)股份有限公司 包含Fc-高级脂肪酸链的超长效平台

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4861581A (en) 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
JP3070763B2 (ja) 1989-08-09 2000-07-31 ロメッド インコーポレイティド テクネチウムまたはレニウムでの抗体または他のタンパク質の直接放射能標識
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
EP0911390B1 (en) 1991-12-06 2009-08-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Protein kinases as tools for the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
DK0804070T3 (da) 1993-03-09 2000-08-07 Genzyme Corp Fremgangsmåde til isolering af proteiner fra mælk
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
JP2003516718A (ja) 1999-07-29 2003-05-20 メダレックス インク ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するヒトモノクローナル抗体
MXPA02001911A (es) 1999-08-24 2003-07-21 Medarex Inc Anticuerpos ctla-4 humanos y sus usos.
US20030162230A1 (en) * 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
EP1539233B1 (en) 2001-07-12 2011-04-27 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US20070134724A1 (en) 2005-08-04 2007-06-14 Peter Davies Phosphorylation of tau by abl
EP1973576B1 (en) 2005-11-28 2019-05-15 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
EP2185692A4 (en) 2007-08-10 2012-05-02 Medarex Inc HCO32 AND HCO27 AND RELATED EXAMPLES
EP2185592B1 (en) 2007-09-13 2013-01-23 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
CN106390107B (zh) 2009-06-10 2019-12-31 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
EP2495236A4 (en) 2009-10-26 2013-03-27 Otsuka Pharma Co Ltd BENZAZEPINE COMPOUND
MY164376A (en) * 2010-10-07 2017-12-15 Univ Leuven Kath Phosphospecific antibodies recognizing tau
EA031698B1 (ru) 2010-10-11 2019-02-28 Байоджен Интернэшнл Нейросайенз Гмбх Человеческие анти-тау антитела
MY183989A (en) * 2011-09-19 2021-03-17 Axon Neuroscience Se Protein-based therapy and diagnosis of tau-mediated pathology in alzheimer's disease
AR092779A1 (es) * 2011-10-07 2015-05-06 Ac Immune Sa Composicon farmaceutica que comprende anticuerpos que se unen a conformeros de proteinas tau
CA2869438C (en) 2012-04-05 2021-08-17 Ac Immune S.A. Humanized tau antibody
RU2668159C2 (ru) 2012-07-03 2018-09-26 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
JP6674888B2 (ja) 2013-03-13 2020-04-01 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ免疫療法
US20160068818A1 (en) * 2013-04-16 2016-03-10 Glykos Finland Oy A method for generating induced pluripotent stem cells
WO2016007414A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 New York University Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
GEP20217222B (en) 2016-07-12 2021-02-10 Lundbeck A/S H Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
US10364286B2 (en) * 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
MA47205A (fr) 2017-01-04 2019-11-13 H Lundbeck As Anticorps spécifiques de la protéine tau hyperphosphorylée pour traiter des maladies oculaires
US10934438B2 (en) 2017-04-27 2021-03-02 Axalta Coating Systems Ip Co., Llc Coatings and methods for using and producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
PH12018500062A1 (en) 2018-07-09
US10934348B2 (en) 2021-03-02
SG10202101343RA (en) 2021-03-30
JP6878395B2 (ja) 2021-05-26
IL256791B (en) 2022-09-01
ECSP18002644A (es) 2018-03-31
US20210206843A1 (en) 2021-07-08
EA201890039A1 (ru) 2018-08-31
WO2017009308A3 (en) 2017-04-06
KR20180030047A (ko) 2018-03-21
CR20180026A (es) 2018-03-08
RU2018100822A3 (uk) 2019-12-26
HK1254357A1 (zh) 2019-07-19
IL256791A (en) 2018-03-29
BR112018000769A2 (pt) 2018-09-25
CO2017013318A2 (es) 2018-05-21
NZ738595A (en) 2022-07-01
EA038703B1 (ru) 2021-10-07
TW201716436A (zh) 2017-05-16
AU2016292892A1 (en) 2018-01-18
TWI741987B (zh) 2021-10-11
US10562962B2 (en) 2020-02-18
TN2017000541A1 (en) 2019-04-12
US10196439B2 (en) 2019-02-05
PE20180607A1 (es) 2018-04-09
US20200190178A1 (en) 2020-06-18
RU2727911C2 (ru) 2020-07-24
GEP20227369B (en) 2022-04-11
US20170015738A1 (en) 2017-01-19
SV2018005611A (es) 2018-02-23
MA42446A (fr) 2018-05-23
US20190177401A1 (en) 2019-06-13
US11739140B2 (en) 2023-08-29
CA2990555A1 (en) 2017-01-19
EP3322442A2 (en) 2018-05-23
DOP2018000012A (es) 2018-02-28
JO3711B1 (ar) 2021-01-31
CN107847595B (zh) 2021-09-24
JP2018531580A (ja) 2018-11-01
CN107847595A (zh) 2018-03-27
WO2017009308A2 (en) 2017-01-19
MX2018000505A (es) 2018-04-30
NI201800005A (es) 2018-10-19
AU2016292892B2 (en) 2021-11-18
ZA201800070B (en) 2019-04-24
CL2018000096A1 (es) 2018-07-06
RU2018100822A (ru) 2019-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA123862C2 (uk) Моноклональне антитіло, специфічне до гіперфосфорилованого тау-білка, і спосіб його застосування
RU2760875C1 (ru) Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения
US11519920B2 (en) Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
UA125501C2 (uk) Моноклональне антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке здатне специфічно зв'язуватися з альфа-синуклеїном людини, його застосування та спосіб лікування синуклеопатії
CN110267985B (zh) 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
CN110072888B (zh) 药剂、用途和方法
UA125136C2 (uk) Антитіла, які зв'язуються з сортиліном і пригнічують зв'язування програнуліну
JP2022527790A (ja) 抗ｆｇｆ２３抗体分子
EA039569B1 (ru) Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения
OA18779A (en) Antibodies Specific for Hyperphosphorylated Tau and Methods of Use Thereof.