RS62546B1 - Antitela protiv sortilina i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Antitela protiv sortilina i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS62546B1
RS62546B1 RS20211389A RSP20211389A RS62546B1 RS 62546 B1 RS62546 B1 RS 62546B1 RS 20211389 A RS20211389 A RS 20211389A RS P20211389 A RSP20211389 A RS P20211389A RS 62546 B1 RS62546 B1 RS 62546B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sortilin
amino acid
seq
antibody
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20211389A
Other languages
English (en)
Inventor
Arnon Rosenthal
Tina Schwabe
Michael Kurnellas
Anthony B Cooper
Robert Pejchat
Original Assignee
Alector Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alector Llc filed Critical Alector Llc
Publication of RS62546B1 publication Critical patent/RS62546B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovo otkriće se odnosi na antitela protiv sortilina i terapijsku upotrebu takvih antitela.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] Sortilin je transmembranski protein tipa I koji deluje i kao receptor za nekoliko liganda, i u sortiranju odabranog tereta od trans-Goldžijeve mreže (TGN) do kasnih endosoma i lizosoma za razgradnju. Sortilin ima veliki vanćelijski domen koji je deo familije VPS10, homolog sa VPS10P kvasca, i sastoji se od strukture beta-propelera sa 10 lopatica i modula 10CC bogatog cisteinom (Nykjaer, A et al., (2012) Trends Neurosci 35: 261-270; and Zheng, Y et al., (2011) PLoS One 6: e21023). Mali deo sortilina može se izlučiti aktivnošću ADAM10 ili gama-sekretaze (<5%) (Nykjaer, A et al., (2012) Trends Neurosci 35: 261-270; and Willnow, TE et al., (2011) Curr Opin Lipidol 22: 79-85).
[0003]•Sortilin vezuje izlučeni protein progranulin (PGRN) i ciljano deluje na razgradnju lizosoma, čime se negativno regulišu vanćelijski nivoi PGRN (Hu, F er al. (2010) Neuron 68, 654-667. U skladu s tim, nedostatak sortilina značajno povećava nivoe PGRN u plazmi i u modelima miševa in vivo i u humanim ćelijama in vitro (Carrasquillo, M.M et al., (2010) Am J Hum Genet 87, 890-897; Lee, W.C et al., (2014) 23, 1467-1478). Šaviše, pokazalo se da je polimorfizam u sortilinu snažno povezan sa nivoima PGRN seruma kod ljudi (Carrasquillo MM e al., 2010), Am J Hum Genet.10;87(6):890-7).
[0004]•Progranulin (PGRN) je izlučeni, trofični i antiinflamatorni protein sličan faktoru rasta, koji takođe ima ulogu adipokina uključenog u gojaznost izazvanu ishranom i rezistenciju na insulin (Nguyen DA et al., (2013). Trends in Endocrinology and Metabolism, 24, 597- 606). Nedostatak progranulina čini otprilike 25% svih naslednih oblika frontotemporalne demencije (FTD), neurodegenerativne bolesti sa ranim pojavljivanjem. Pacijenti sa heterozigotnim mutacijama gubitka funkcije u PGRN imaju ~ 50% smanjene vanćelijske nivoe proteina i oni će uvek razviti FTD, čineći PGRN uzročnim genom za bolest (Baker, M et al., (2006) Nature 442, 916-919; Carecchio M et al., (2011) J Alzheim0 ers Dis 27, 781-790; Cruts, M et al., (2008) Trends Genet 24, 186-194; Galimberti, D et al., (2010) J Alzheimers Dis 19, 171-177). Osim toga, mutirani aleli PGRN su identifikovani kod pacijenata sa Alzheimer-ovom bolešću (Seelaar, H et al., (2011). Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry 82, 476-486). Važno je da PGRN deluje zaštitno u nekoliko modela bolesti sa povećanim nivoima PGRN ubrzavajući oporavak u ponašanju od ishemije (Tao, J et al., (2012) Brain Res 1436, 130-136; Egashira, Y. et al., (2013). J Neuroinflammation 10, 105), potiskujući lokomotorne deficite u modelu Parkinson-ove bolesti (Van Kampen, J.M et al. (2014). PLoS One 9, e97032), umanjujući patologiju u modelu amiotrofične lateralne skleroze (Laird, A.S et al., (2010). PLoS One 5, e13368.) i artritisu (Tang, Wet al., (2011). Science 332, 478-484) i sprečavanje deficita memorije u modelu Alzheimer-ove bolesti (Minami, S.S et al., 2014). Nat Med 20, 1157-1164).
[0005]•Sortilin se takođe direktno veže za pro-neurotrofine, kao što je pro-nervni faktor rasta (pro-NGF), pro-BDNF, pro-neurotrofin-3, itd., koji sadrže pro-domen i tipično su proapoptotični. Takvi prekursori pro-neurotrofina se oslobađaju tokom stresa, a sortilin je uključen u regulisanje njihovog oslobađanja, kao i vezivanje za ćeliju primaoca i stimulaciju apoptoze zajedno sa p75NTR (Willnow, TE et al., (2008) Nat Rev Neurosci 9: 899-909; Nykjaer, A et al., Trends Neurosci 35: 261-270; and Nykjaer, A et al., (2004) Nature 427: 843-848; Hiroko Yano et al., (2009) J Neurosci.; 29: 14790–14802.Teng H.K., et al., J. Neurosci. 25:5455-5463(2005)). Sortilin se takođe direktno vezuje za p75NTR (Skeldal S et al., (2012) J Biol Chem.; 287:43798). Sortilin se takođe vezuje za neurotenzin u regionu koji se delimično preklapa sa vezivanjem za progranulin (Quistgaard, EM et al., (2009) Nat Struct Mol Biol 16: 96-98; and Zheng, Y et al., PLoS One 6: e21023). Sortilin takođe stupa u interakciju sa Trk receptorima NTRK1, NTRK2 i NTRK3; i mogu regulisati njihov anterogradni aksonski transport i signalizaciju (Vaegter, CB et al., (2011) Nat. Neurosci.
14:54-61). Sortilin takođe stupa u interakciju i reguliše preradu i promet amiloidnog prekursorskog proteina i rezultujuću proizvodnju patoloških beta amiloidnih peptida (Gustafsen C et al., (2013). J Neurosci.2;33(1):64-71.
[0006]•Takođe se pokazalo da se sortilin vezuje za apolipoproteine i lipoprotein lipazu, pa prema tome nedostatak dovodi do smanjenja oslobađanja VLDL iz jetre i smanjenja holesterola (Willnow, TE et al., (2011) Curr Opin Lipidol 22: 79-85; Kjolby, M et al., (2010) Cell Metab 12: 213-223; Nilsson, SK et al., (2007) Biochemistry 46: 3896-3904.; Nilsson, SK et al., (2008) J Biol Chem 283: 25920-25927; and Klinger, SC et al., (2011) J Cell Sci 124: 1095-1105). Nedavno je sortilin takođe umešan u direktno vezivanje za APP (Gustafsen, C et al., (2013) J.Neurosc. 33:64-71), a takođe i za enzim za obradu APP BACE1 (Gustafsen, C et al., (2013) J.Neurosc. 33:64-71; and Finan, GM et al., J Biol Chem 286: 12602-12616). Sortilin se takođe vezuje za apolipoprotein E (APOE), za A beta peptid (Carlo, AS et al., (2013) J, Neurosc, 33: 358-370), i za PCSK9 (Gustafsen et al, (2014) Cell Metab, 19: 310-318). Takođe se pokazalo da se sortilin vezuje i reguliše vanćelijske nivoe PCSK9, koji usmerava receptore lipoproteina niske gustine za razgradnju u lizosomima, što rezultuje povećanjem nivoa LDL holesterola (Gustafsen C et al., (2014). Cell Metab. 2014 Feb 4;19(2):310-8).
[0007]•Kada je prisutan u unutarćelijskim vezikulama, kao što su endosomi, amino-terminalni vanćelijski domen sortilina je usmeren ka lumenu, gde je prisutan teret vezikula. Karboksiterminalni unutarćelijski/citoplazmatični domen sortilina, međutim, vezuje se za niz adapterskih proteina, koji regulišu njegovo razmenjivanje sa površine i unutar unutarćelijskih odeljaka. Ovo uključuje AP2 (adapter klatrina za moduliranje endocitoze sa ćelijske površine) i retromerni kompleks/AP1, koji modulira kretanje od ranih endosoma do Goldžija zbog recikliranja; i interakcija sa GGA (lokalizovanim po Goldžiju, koji obuhvata gama-uho, vezivanje faktora ADP-ribozilacije) familije proteina za kretanje iz Goldžija direktno u rane endosome, obično za naknadnu degradaciju kroz lizosome. Tako se sortilin može vezati za ligande u svom luminalnom domenu, istovremeno angažujući citoplazmatične adaptere koji određuju njegovo odredište za određivanje unutarćelijske sudbine, kao što je razgradnja za progranulin i druge faktore.
[0008]•Svojim različitim interakcijama sa proteinima, kao što su progranulin, sortilin i njegovi višestruki ligandi pokazalo se da su uključeni u različite bolesti, poremećaje i stanja, kao što je frontotemporalna demencija, amiotrofična lateralna skleroza, amiotrofična lateralna skleroza-fenotipova frontotemporalne demencije, Alzheimer -ova bolest, Parkinson-ova bolest, depresija, neuropsihijatrijski poremećaji, vaskularna demencija, napadi, distrofija mrežnjače, starosna makularna degeneracija, glaukom, traumatska povreda mozga, starenje, napadi, zarastanje rana, moždani udar, artritis i aterosklerotične vaskularne bolesti.
[0009]•Shodno tome, postoji potreba za terapijskim antitelima koja specifično vezuju proteine sortilina i blokiraju vezivanje sortilina za njegove ligande, kao što je progranulin, ili na drugi način moduliraju efektivnu koncentraciju liganada da bi se lečila jedne ili više bolesti, poremećaja, i stanja povezanih sa aktivnošću sortilina.
SAŽETAK PRONALASKA
[0010]•Ovo otkriće je generalno usmereno na antitela protiv sortilina i terapeutsku upotrebu takvih antitela..
[0011]•Određeni aspekti ovog otkrića zasnovani su, najmanje delimično, na identifikaciji antitela protiv sortilina koja su u stanju da blokiraju interakciju između sortilina i progranulina (videti, na primer, Primer 4), antitela protiv sortilina koja su sposobna da povećaju vanćelijske nivoe progranulina koji luče ćelije u kulturi i iz ćelija u mozgu mišjih modela Alzheimer -ove bolesti (videti, na primer, Primer 5), antitela protiv sortilina koja su sposobna da smanje ćelijske nivoe sortilina u humanim primarnim monocitima ( videti, na primer, Primer 25), i antitela protiv sortilina koja su sposobna da povećaju ćelijske nivoe progranulina in vivo (videti, na primer, Primer 26). Iznenađujuće, pokazalo se da je jedna klasa antitela sposobna da poveća vanćelijske nivoe progranulina, a da ne može da blokira interakciju između sortilina i progranulina (npr. antitela S-2, S-15 i S-22), dok se pokazalo da druga klasa antitela može da blokira interakciju između sortilina i progranulina i da poveća vanćelijske nivoe progranulina (npr. antitela S-8, S-49 i S-60). • Štaviše, antitela protiv sortilina sposobna da povećaju vanćelijske nivoe progranulina (npr. antitela S-2, S-8, S-15, S-22, S-49 i S-60) su iznenađujuće pokazala da takođe smanjuju ćelijske nivoe sortilina, kao što su nivoi sortilina na ćelijskim površinama (videti, na primer, Primer 5). Štaviše, pokazalo se da su ćelijski nivoi sortilina snažno i obrnuto povezani sa povećanjem ćelijskog nivoa progranulina (videti, na primer, slike 10B-10E i slike 23B i 23C). Antitela protiv sortilina sposobna da povećaju vanćelijske nivoe progranulina takođe su sposobna da blokiraju vezivanje pro-NGF za sortilin (videti, na primer, Primer 6). Drugi aspekti ovog otkrića zasnivaju se, najmanje delimično, na identifikaciji antitela protiv sortilina koja blokiraju interakciju između sortilina i progranulina i sposobna su da povećaju vanćelijske nivoe progranulina bez smanjenja ćelijskog nivoa sortilina (npr. antitelo S-30 i Primer 30). Drugi aspekti ovog otkrića zasnivaju se, najmanje delimično, na identifikaciji antitela protiv sortilina koja blokiraju interakciju između sortilina i progranulina bez povećanja vanćeljskih nivoa progranulina ili smanjenja ćelijskog nivoa sortilina (npr. antitela S-5 i S-64 i Primer 5). Prvi aspekt ovog pronalaska se odnosi na izolovano (npr. monoklonsko) antitelo protiv sortilina koje se vezuje za humani sortilin, pri čemu antitelo protiv sortilina povećava vanćelijske nivoe progranulina i smanjuje nivoe sortilina na ćelijskim površinama, pri čemu antitelo protiv sortilina sadrži varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina RASQSX1X2SNLA (SEQ ID BR:508), pri čemu je X1V ili I i X2je S ili G; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina GASTRAT (SEQ ID BR:29); i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina QQARLGPWT (SEQ ID BR:55); i pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina YTX1X2X3X4X5X6S (SEQ ID BR:509), pri čemu je X1F ili L, X2je T ili A, X3je S ili K, X4je Y, T, R, L, T, G, Q, ili H, X5je Y, T ili L, a X6je M ili I; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1INPx2GGX3X4SYAX5X6FX7G (SEQ ID BR:510), pri čemu X1je I ili V, X2je S, W, Y, V, F, L ili I, X3je S ili T, X4je T ili A, X5je Q ili R, X6je K ili R, i X7je Q ili R; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1RDPX2GX3X4X5X6X7PX8X9RX10X11X12GX13DV (SEQ ID BR:511), pri čemu X1je A, V, ili T, X2je S, F, ili G, X3je I ili A, X4je A ili G, X5je A, L, ili V, X6je A, L, ili P, X7je G, F, ili Y, X8je A, G, ili F, X9je S, G, ili A, X10je Y, G, P, H, ili S, X11je Y ili N, X12je Y, L, Q, ili R, i X13je M ili L. U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina ima najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs odabranih iz (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-L1 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16; (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-L2 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16; (iii) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-L3 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16; (iv) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-H1 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16; (v) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-H2 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16; i (vi) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-H3 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16. U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži varijabilni region lakog lanca bilo koje od sekvenci antitela iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16; i/ili varijabilni region teškog lanca bilo koje od sekvenci antitela iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, i S-15-16. Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na izolovano (npr. monoklonsko) antitelo protiv sortilina koje se vezuje za humani sortilin, pri čemu antitelo protiv sortilina povećava vanćelijske nivoe progranulina i smanjuje nivoe sortilina na površini ćelije, pri čemu antitelo protiv sortilina obuhvata varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina RSSQX1LLX2SNGYNYLD (SEQ ID BR:580), pri čemu X1je S ili G i X2je H ili R; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina LGSNRXS (SEQ ID BR:581), pri čemu X je A ili V; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina MQQQETPLT (SEQ ID BR:100); i pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina YSISSX1X2YWG (SEQ ID BR:582), pri čemu X1je G ili V i X2je Y ili R; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina X1IYX2SGSTYYNPSLKS (SEQ ID BR:583), pri čemu X1je T, S ili A i X2je H ili P; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina ARQGSIKQGYYGMDV (SEQ ID BR:233). U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina ima najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs odabranih od (i) HVR-L1 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L1 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; (ii) HVR-L2 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L2 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; (iii) HVR-L3 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L3 sekvence iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; (iv) HVR-H1 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H1 sekvenci iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; (v) HVR-H2 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H2 sekvenci iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; i (vi) HVR-H3 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H3 sekvenci iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9. U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži varijabilni region lakog lanca bilo koje sekvence antitela iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; i/ili varijabilni region teškog lanca bilo koje sekvence antitela iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9.
[0012]•U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina ima izotip IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, (a) antitelo protiv sortilina ima izotip humanog ili mišjeg IgG1 i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranoj iz grupe koja se sastoji od: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; (b) antitelo protiv sortilina ima izotip IgG2 i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od: P238S , V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; ili (c) antitelo protiv sortilina ima izotip IgG4 i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, (a) Fc region dalje sadrži jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od A330L, L234F; L235E, P331S, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; (b) Fc region dalje sadrži jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od M252Y, S254T,T256E, , i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; ili (c) Fc region dalje sadrži S228P supstituciju aminokiseline prema EU ili Kabat numeraciji. • U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina smanjuje ekspresiju jednog ili više proinflamatornih posrednika odabranih iz grupe koja se sastoji od IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1β, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4, i CCL5. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina ima konstantu disocijacije (KD) za humani sortilin, mišji sortilin ili oboje, koja je u opsegu od oko 100 nM do oko 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina ima konstantu disocijacije (KD) za humani sortilin koja je u opsegu od oko 70.4 nM do oko 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina ima konstantu disocijacije (KD) za mišji sortilin koja je u opsegu od oko 40.3 nM do oko 0.07 nM, ili manje od 0.07 nM.
[0013]•Drugi aspekti ovog otkrića se odnose na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo protiv sortilina iz bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja. Drugi aspekti ovog otkrića odnose se na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja. Drugi aspekti ovog otkrića odnose se na izolovanu ćeliju domaćina koja sadrži vektor bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja. Ostali aspekti ovog otkrića odnose se na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo protiv sortilina bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0014]•Ostali aspekti ovog otkrića odnose se na in vitro postupak povećanja vanćelijskih nivoa progranulina, smanjenja nivoa sortilina na površini ćelije na jednoj ili više ćelija i/ili smanjene ekspresije jednog ili više pro-inflamatornih posrednika, koji sadrže kontaktiranje jedne ili više ćelija sa antitelom protiv sortilina prema pronalasku. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, (a) antitelo protiv sortilina se specifično vezuje za humani i mišji sortilin; (b) antitelo protiv sortilina je humano antitelo; (c) antitelo protiv sortilina je humanizovano antitelo; (d) antitelo protiv sortilina je bispecifično antitelo; (e) antitelo protiv sortilina je bispecifično antitelo koje prepoznaje prvi antigen i drugi antigen; (f) antitelo protiv sortilina je bispecifično antitelo koje prepoznaje prvi antigen i drugi antigen, pri čemu je prvi antigen protein sortilin, a drugi antigen je antigen koji olakšava transport preko krvno-moždane barijere, i, izborno, pri čemu
1
je drugi antigen odabran iz grupe koja se sastoji od sortilina, receptora transferina (TR), receptora insulina (HIR), receptora faktora rasta sličnog insulinu (IGFR), proteina 1 i 2 povezanih sa lipoproteinskim receptorima niske gustine (LPR-1 i 2), receptor za toksin difterije, CRM197, antitelo lame sa jednim domenom, TMEM 30 (A), domen transdukcije proteina, TAT, Syn-B, penetratin, poli-arginin peptid, angiopep peptid, basigin, Glut1, CD98hc, i ANG1005; (g) antitelo protiv sortilina je multivalentno antitelo; (h) antitelo protiv sortilina je konjugovano antitelo; (i) antitelo protiv sortilina je himerno antitelo; ili (j) antitelo protiv sortilina je fragment antitela koje se vezuje za epitop koji sadrži aminokiselinske ostatke na humanom sortilinu, i izborno, pri čemu je fragment Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab') 2 , Fv ili scFv fragment.
[0015]•U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina se vezuje za konformacioni epitop sortilina. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina se vezuje za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka odabranih iz grupe koja se sastoji od: i. . aminokiselinskih ostataka 314-338 SEQ ID BR: 1, ili aminokiselinskih ostataka na proteinu sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 314-338 SEQ ID BR: 1; ii. aminokiselinskih ostataka 237-247 SEQ ID BR: 1, ili aminokiselinskih ostataka na proteinu sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-247 SEQ ID BR: 1; iii. aminokiselinskih ostataka 237-247 i 314-338 SEQ ID BR: 1, ili aminokiselinskih ostataka na proteinu sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-247 i 314-338 SEQ ID BR: 1; i iv. aminokiselinskih ostataka 207-231 SEQ ID BR: 1, ili aminokiselinskih ostataka na proteinu sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 207-231 SEQ ID BR: 1. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina se vezuje za jedan ili više aminokiselinskih ostataka odabranih iz grupe koja se sastoji od T218, Y222, S223, S227, S242, K243, S316, R325, i S595 SEQ ID BR: 1, ili jedan ili više aminokiselinskih ostataka na proteinu sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima T218, Y222, S223, S227, S242, K243, S316, R325, i S595 SEQ ID BR: 1. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs antitela odabranih iz grupe koja se sastoji od: S-15 i S-60. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 9 ili 10; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 29 ili 30; (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 55 ili 100; (d) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 129 ili 142; (e) HVR-H2 koj koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 155 ili 170; ili (f) HVR-H3 koj koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 190 i 233. U određenim primerima izvođenja koje se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži: • (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 9 ili 10, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 9 ili 10; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 29 ili 30, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 29 ili 30; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 55 ili 100, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 55 ili 100; i pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 129 ili 142, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 129 ili 142; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 155 ili 170, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 155 ili 170; i • (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 190 i 233 ili sekvencu aminokiseline sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 190 i 233. U određenim primerima izvođenja koje se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, (a) antitelo protiv sortilina je u kompeticiji sa S-60 za vezivanje za sortilin; ili (b) antitelo protiv sortilina je u kompeticiji sa S-15 za vezivanje za sortilin ili antitelo protiv sortilina koje se u suštini vezuje za isti epitop sortilina kao antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od: S-15 i S-60. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži varijabilni domen lakog lanca i/ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 342, 343, 430 i 431. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, (a) antitelo protiv sortilina je klase IgG, klase IgM ili klase IgA; ili (b) antitelo protiv sortilina ima izotip IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4; (c) antitelo protiv sortilina ima izotip humanog ili mišjeg IgG1 i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; (d) antitelo protiv sortilina ima izotip IgG2 i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od: P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q H268E, V309L, N297A, N297Q, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, T256E, , i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; ili (e) antitelo protiv sortilina ima izotip IgG4 i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranog iz grupe koja se sastoji od: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, Fc region jednog ili više od (c), (d) i (e) dalje sadrži: (a) jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od A330L, L234F; L235E, P331S, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; (b) jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od M252Y, S254T,T256E, i bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU ili Kabat numeraciji; ili (c) S228P supstitucija aminokiseline prema EU ili Kabat numeraciji. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, (a) antitelo protiv sortilina ima konstantu disocijacije (KD) za humani sortilin, mišji sortilin, ili oba, koja je u opsegu od
1
oko 100 nM do oko 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM; (b) antitelo protiv sortilina ima konstantu disocijacije (KD) za humani sortilin koja je u opsegu od oko 70.4 nM do oko 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM; ili (c) antitelo protiv sortilina ima konstantu disocijacije (KD) za mišji sortilin koja je u opsegu od oko 40.3 nM do oko 0.07 nM, ili manje od 0.07 nM. U određenim primerima izvođenja koja se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina je antitelo protiv sortilina bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja.
[0016]•Ostali aspekti ovog pronalaska se odnose na antitelo protiv sortilina bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja za upotrebu u sprečavanju, smanjenju rizika ili lečenju pojedinca koji ima bolest, poremećaj ili povredu odabranu iz grupe koja se sastoji od frontotemporalne demencije, progresivne supranuklearne paralize, Alzheimer -ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, amiotrofične lateralne skleroze, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, demencija, moždanog udara, Parkinson-ove bolesti, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, degeneracije mrežnjače, starosne makularne degeneracije, glaukoma, multiple skleroze, septičkog šoka , bakterijske infekcije, artritisa i osteoartritisa. Drugi aspekti ovog pronalaska se odnose na antitelo protiv sortilina bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja za upotrebu u postupku lečenja koji sadrži inhibiranje jednog ili više od neuroinflamacije, aksonopatije koju karakteriše izrastanje kratkog aksona i aberantno grananje, mikroglijalne aktivacije i inflamatornog odgovora. Ostali aspekti ovog otkrića odnose se na antitelo protiv sortilina bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja za upotrebu u podsticanju zarastanja rana. Ostali aspekti ovog otkrića odnose se na antitelo protiv sortilina bilo kojeg od prethodnih primera izvođenja za upotrebu u sprečavanju, smanjenju rizika ili lečenju pojedinca koji boluje od artritisa.
[0017]•U određenim primerima izvođenja koje se mogu kombinovati sa bilo kojim od prethodnih primera izvođenja, antitelo protiv sortilina sadrži dva ili više antitela protiv sortilina.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0018] Patent ili datoteka prijave obuhvata najmanje jedan crtež urađen u boji. Kopije ovog patenta ili publikacija patentne prijave sa crtežima u boji će biti obezbeđene od strane Zavoda na zahtev i plaćanjem potrebne takse.
SLIKA 1 prikazuje nekoliko prikaza humanog proteina sortilina koji prikazuju mesta vezivanja antitela protiv sortilina na sorlitinu S-1, S-65, S-49, S-78, S-44, i S-8.
Okosnica sortilina prikazana je u providnom sivom prikazu. Istaknuto su obojeni linearni regioni vezivanja identifikovani za antitela S-1 (zeleno), S-65 (crveno), S-49 (plavo), S-78 (žuto), S-44 (roze), i S-8 (ljubičasto). Mesta za vezivanje se nalaze unutar regiona fleksibilnih petlji sortilina.
SLIKA 2A-2C prikazuju karakterizaciju interakcija između sortilina i progranulina koristeći površinsku plazmonsku rezonancu (SPR) i ELISA. SLIKA 2A prikazuje kinetičku analizu vezivanja progranulina (PGRN) za His-vezanim sortilinom 1 (SORT1) koristeći Biacore SPR.
SLIKA 2B prikazuje vezivanje biotinilizovanog humanog PGRN za imobilizovani humani SORT1 na ELISA ploči.SLIKA 2C prikazuje vezivanje biotinilizovanog mišjeg PGRN za imobilizovani mišji SORT1 na ELISA ploči.
SLIKA 3A prikazuje avidnost antitela koja se vezuju za humani sortilin (b-H Sort) na senzorskom čipu i kompeticiju sa antitelima protiv sortilina (IgG). SLIKA 3B prikazuje karakterizaciju interakcija između sortilina (SORT) i progranulina (PGRN) koristeći Forte Bio analizu i kompeticiju sa antitelima protiv sortilina (IgG). Leva kolona: biotinilizovani progranulinski peptid je imobilizovan na senzorskom čipu i SORT je dodat u rastvor, a zatim i IgG. Centralna kolona: biotinilizovani rekombinantni humani SORT je imobilizovan na senzorskom čipu i u rastvor je dodat rekombinantni PGRN, a zatim i IgG. Desna kolona: biotinilizovani rekombinantni PGRN je imobilizovan na senzorskom čipu i u rastvor je dodat humani SORT, a zatim i IgG. (SORT = sortilin, PGRN = progranulin, b = biotinilizovani, H = humani, mono = monomerni).
SLIKA. 4A prikazuje primere različitih klasa antitela protiv sortilina koja blokiraju vezivanje progranulina u različitim ForteBio orijentacijama (opisano na slici 3B). Leva kolona prikazuje kompetitivno vezivanje pomoću humanog SORT koji vezuje PGRN peptid imobilizovan na senzorskom čipu. Srednja kolona prikazuje kompetitivno vezivanje koristeći nativni PGRN protein koji vezuje humani SORT imobilizovan na senzorskom čipu. Desna kolona prikazuje kompetitivno vezivanje koristeći nativni protein SORT koji vezuje nativni protein PGRN imobilizovan na senzorskom čipu. SLIKA 4B prikazuje vezivanje antitela protiv sortilina na His-vezanim sortilinom (SORT1) koristeći Biacore SPR na pH 6.4 i pH 7.4.
SLIKE 5A-5D prikazuju karakterizaciju interakcija između sortilina i progranulina na ćelijama. SLIKA 5A prikazuje dijagrame FACS koji pokazuju nivoe vezivanja humanog
1
PGRN-Bio za ćelije HEK293T koje eksprimiraju humani SORT. SLIKA 5B prikazuje dijagrame FACS koji pokazuju nivoe vezivanja humanog PGRN-Bio za kontrolne ćelije.
SLIKA 5C prikazuje srednji fluorescentni intenzitet (MFI) iscrtan prema koncentraciji vezanja humanog PGRN za ćelije HEK293T koje eksprimiraju humani SORT (krugovi) ili kontrolne ćelije (kvadrati). SLIKA 5D prikazuje MFI iscrtan u odnosu na koncentraciju mišjeg PGRN koji se vezuje za HEK293T ćelije koje eksprimiraju mišji SORT (krugovi) ili kontrolne ćelije (kvadrati).
SLIKE 6A-6E prikazuju zavisnu od doze inhibiciju vezivanja biotinilizovanog progranulina za ćelije koje eksprimiraju antitelima sortilina protiv sortilina. SLIKA 6A i SLIKA 6B prikazuju inhibiciju antitela vezivanja humanog progranulina za humani sortilin. SLIKA 6C i SLIKA 6D prikazuje inhibiciju antitela vezivanja mišjeg progranulina za mišji sortilin.
SLIKA. 6E prikazuje inhibiciju vezivanja biotinilizovanog humanog progranulina za ćelije koje eksprimiraju humani sortilin pomoću 67 nM antitela protiv sortilina.
SLIKA 7 prikazuje ispitivanje sinergističkih efekata kombinacija antitela na vezivanje biotinilizovanog progranulina za sortilin eksprimiran na HEK293T ćelijama. S-49, S-64 (pakovanje 4) i S-16 (pakovanje 1) su ili kombinovane sa izotipskim kontrolnim antitelom ili se međusobno kombinuju.
SLIKA 8A prikazuje rezultate analize snimanja za vremenski zavisno vezivanje i endocitozu fluorescentno obeleženog progranulina (PGRN) i njegovu blokadu od 10 µM pro-peptida sortilina koji je u kompeticiji sa PGRN. Ćelije transficirane ili humanim sortilinom (hSort) ili lacZ inkubirane su sa progranulinom (PGRN) tokom 4, 15, 30 ili 60 minuta i snimljene nakon toga. Analiza je dizajnirana da testira sposobnost antitela protiv sortilina da spreče vezivanje i endocitozu progranulina (PGRN) pomoću sortilina (Sort). SLIKA 8B prikazuje rezultate grafikona FACS koji prikazuje vremenski zavisno vezivanje i endocitozu PGRN-DyLight650 ćelijama koje eksprimiraju humani sortilin. Analiza je dizajnirana da testira sposobnost antitela protiv sortilina da spreče vezivanje i endocitozu fluorescentno obeleženog progranulina pomoću humanog sortilina. SLIKA 8C prikazuje rezultate grafikona FACS koji prikazuje vremenski zavisno vezivanje i endocitozu PGRN-DyLight650 ćelijama koje eksprimiraju mišji sortilin. Analiza je namenjena da testira sposobnost antitela protiv sortilina da spreče vezivanje i endocitozu fluorescentno obeleženog progranulina pomoću mišjeg sortilina. Humani PGRN-DyLight650 je dodat humanom Sort (SLIKA 8B) ili mišjem Sort (SLIKA 8C), ili kontrolnim HEK293T ćelijama, a količina vezanog i endocitoziranog PGRN
1
kvantifikuje se pomoću FACS. SLIKA 8D prikazuje rezultate FACS analize koja pokazuje sposobnost pro-peptida humanog sortilina inhibitora PGRN da spreči vezivanje i endocitozu fluorescentno obeleženog PGRN humanim sortilinom. SLIKA 8E prikazuje rezultate FACS analize koja pokazuje sposobnost pro-peptida mišjeg sortilina inhibitora PGRN da spreči vezivanje i endocitozu fluorescentno obeleženog PGRN mišjim sortilinom.
SLIKE 9A-9D prikazuju rezultate analiza koji pokazuju sposobnost antitela protiv sortilina da povećaju endogeno izlučeni nivo progranulina u medijumu ćelijske linije U-251 humanih astrocita, koji eksprimira endogeni humani sortilin. SLIKA 9A prikazuje rezultate U-251 ćelija inkubiranih sa 50 nM antitela protiv sortilina tokom 72 sata. SLIKA 9B prikazuje rezultate U-251 ćelija inkubiranih sa 5 nM antitela protiv sortilina tokom 72 sata. SLIKA 9C prikazuje rezultate U-251 ćelija inkubiranih sa 50 nM antitela protiv sortilina tokom 72 sata.
SLIKA 9D prikazuje rezultate U-251 ćelija inkubiranih sa 5 nM antitela protiv sortilina tokom 72 sata. Nivoi progranulina u medijumima su kvantifikovani ELISA analizom. Prikazane su prosečne vrednosti dva nezavisna eksperimenta. Statistika je izvedena korišćenjem ANOVA i zvezdice pokazuju antitela koja značajno podižu nivo progranulina. SLIKE 10A-10F pokazuju efekat antitela protiv sortilina na nivo sortilina na površine ćelije na humanim U-251 ćelijama ili mišjim N2A ćelijama, i odgovarajuću sposobnost antitela da povećavaju nivo izlučenog endogenog progranulina (PGRN) na način koji zavisi od doze. Ćelije su inkubirane 72 sata sa 50 nM blokirajućim IgG, sakupljene i obojene sa antitelom protiv sortilina koje vezuje drugačiji region na sortilinu od test antitela. SLIKA 10A prikazuje ekspresiju sortilina na ćelijskoj površini na U-251 ćelijama kao procenat (%) kontrolnih nivoa koji su prethodno tretirani sa test antitelima navedenim na X osi. Sivi stubići ukazuju na antitela koja su pokazala značajno smanjenje sortilina (ANOVA, p <0.05), dok beli stubići ukazuju na antitela koja nisu pokazala smanjenje sortilina. Crni stubići označavaju kontrolni IgG. SLIKA 10B prikazuje ekspresiju sortilina na površini ćelije na N2A ćelijama kao procenat (%) kontrolnih nivoa koji su prethodno tretirani sa test antitelima navedenim na X osi. Sivi stubići ukazuju na antitela koja su pokazala značajno smanjenje sortilina (ANOVA, p <0.05), dok beli stubići ukazuju na antitela koja nisu pokazala smanjenje sortilina. Crni stubići označavaju kontrolni IgG. SLIKA 10C i SLIKA 10D prikazuju nivoe sortilina na površine ćelije u U-251 ćelijama koje su inkubirane sa različitim koncentracijama antitela protiv sortilina tokom 72 sata. Antitela protiv sortilina indukuju dozno zavisno smanjenje ekspresije sortilina na površini ćelije. Smanjenje nivoa sortilina prikazano je smanjenjem fluorescentnog
1
intenziteta (MFI) antitela S-20 koji se vezuje za sortilin. SLIKA 10E prikazuje kvantifikaciju odgovarajućih nivoa PGRN zasnovanih na ELISA u medijumu U-251 ćelija na SLIKA 10B koji su inkubirani sa navedenim antitelima protiv sortilina tokom 72 sata. Antitela protiv sortilina koja smanjuju nivoe sortilina na površini ćelija takođe uzrokuju dozno zavisno povećanje nivoa vanćelijskog PGRN. SLIKA 10F prikazuje korelaciju između smanjenja nivoa sortilina na površini ćelije izazvanog antitelima protiv sortilina i povećanja vanćelijskih nivoa progranulina (PGRN).
SLIKE 11A-11F pokazuju rezultate koji pokazuju da infuzija antitela protiv sortilina povećava endogene nivoe moždanog progranulina nekoliko puta u Tg2576 mišjem modelu za Alzheimer -ovu bolest. SLIKA 11A prikazuje nivo progranulina u različitim regionima mozga, kontralateralno u odnosu na mesto ICV infuzije. SLIKA 11B prikazuje nivo progranulina u različitim regionima mozga ipsilateralno u odnosu na mesto ICV infuzije. Različiti regioni mozga su hipokampus (Hip), frontalni korteks (F Ctx) i potiljačni korteks (R Ctx). 14-mesečni Tg2576 miševi su ICV infuzirani sa puferom, kozjim IgG ili kozjim poliklonskim antitelom protiv sortilina (n = 3/grupa). SLIKA 11C prikazuje nivo antitela protiv sortilina u tri različita regiona mozga. SLIKA 11D prikazuje snažnu pozitivnu korelaciju između nivoa antitela protiv sortilina i nivoa endogenog progranulina (PGRN) (r<2>= 0.92). Veći nivo antitela protiv sortilina dovodi do povećanja PGRN u mozgu na način zavisan od doze. SLIKA 11F prikazuje nivoe peptida Abeta42 u rastvorljivoj proteinskoj frakciji nakon ICV infuzije sa antitelom protiv sortilina.
SLIKA 12A prikazuje biacore analizu površinske plazmonske rezonance (SPR) za praćenje kompeticije između pro-NGF i antitela protiv sortilina za vezivanje za sortilin. Analiza prikazuje humani sortilin vezan na Biacore čipu, nakon čega sledi vezivanje pro-NGF za sortilin, nakon čega sledi vezivanje antitela protiv sortilina za sortilin. SLIKA 12B prikazuje kontrolu koja ne blokira. Ako se pro-NGF i dato antitelo protiv sortilina vezuju za isti region na sortilinu, vezivanje pro-NGF će inhibirati naknadno vezivanje antitela protiv sortilina. Dakle, ako dato antitelo vezuje sortilin u istom stepenu u prisustvu (isprekidane linije) ili odsustvu (pune linije) pro-NGF, kao što je prikazano na SLIKA 12B, takvo antitelo ne blokira vezivanje pro-NGF za sortilin. SLIKA 12C prikazuje vezivanje antitela protiv sortilina za sortilin u prisustvu (isprekidane linije) ili odsustvu (pune linije) pro-NGF. Prikazana antitela su delimično blokirana prisustvom pro-NGF vezanog za sortilin. Antitela S-1 i S-65 su snažno pogođena. Pune linije odgovaraju vezivanju antitela za sortilin u odsustvu
1
pro-NGF. Isprekidane linije odgovaraju vezivanju antitela za sortilin u prisustvu pro-NGF. Sive linije odgovaraju vezivanju pro-NGF za sortilin u prisustvu pro-NGF (maksimalna kompeticija).
SLIKE 13A-13G prikazuje nivoe ekspresije sortilina na površini ćelija nakon 72 sata inkubacije sa antitelima protiv sortilina na koncentracijama od 20 nM, 5 nM ili 1.25 nM.
SLIKA 13A, SLIKA 13B, SLIKA 13C i SLIKA 13D prikazuju ekspresiju sortilina na površini ćelija na humanim U-251ćelijama. SLIKA 13E, SLIKA 13F i SLIKA 13G prikazuje ekspresiju sortilina na površini ćelija na mišjim N2A ćelijama. Rezultati ukazuju da su afinitetno sazrela antitela indukovala povećano smanjenje nivoa sortilina na površini ćelije, posebno kada se koriste pri najnižoj koncentraciji od 1.25 nM.
SLIKA 14 prikazuje inhibiciju vezivanja progranulina (u procentima blokiranja PGRN) za HEK293T ćelije koje eksprimiraju sortilin pomoću 150 nM afinitetno sazrelih antitela protiv sortilina izvedenih iz antitela S-15. Afinitetno sazrelo antitelo S-15-6 pokazalo je poboljšanje u blokiranju PGRN.
SLIKA 15A i SLIKA 15B prikazuju profile masene spektroskopije antitela S-2-11 koje se vezuje za sortilin u odsustvu (SLIKA 15A) ili prisustvu (SLIKA 15B) peptida dobijenih digestijom sortilina. Peptidi nisu u kompeticiji sa antitelima koja se vezuju za sortilin. Sličan nedostatak peptidne kompeticije primećen je i za druga antitela protiv sortilina.
SLIKA 16A je šematski prikaz pokrivenosti peptida nakon enzimske proteolize sortilina.
94.78% vanćelijskog domena sortilina (ECD) (SEQ ID BR: 714) bilo je pokriveno peptidima nastalim proteolizom. SLIKA 16B prikazuje smanjeno vezivanje antitela S-30 za određene mutante sortilina, gde su humane aminokiseline zamenjene za mišje aminokiseline sortilina. Rezultati ukazuju da su za vezivanje S-30 potrebne aminokiseline HVPLVIMT131 ili njegov podskup. Slika 16C prikazuje smanjeno vezivanje antitela S-60 za određene mutante sortilina, gde su humane aminokiseline zamenjene za mišje aminokiseline sortilina. Rezultati su pokazali da je za vezivanje S-60 potrebna amino kiselina S595.
SLIKE 17A-17E prikazuju tragove površinske plazmonske rezonancije. SLIKA 17A prikazuje nivo vezivanja progranulina (PGRN) za sortilin u prisustvu ili odsustvu neurotenzina (NTS). SLIKA 17B prikazuje nivo vezivanja antitela protiv sortilina S-15 za sortilin u prisustvu ili odsustvu NTS. SLIKA 17C prikazuje nivo vezivanja antitela protiv sortilina S-22 za sortilin u prisustvu ili odsustvu NTS. SLIKA 17D prikazuje nivo vezivanja antitela protiv sortilina S-49 za sortilin u prisustvu ili odsustvu NTS. SLIKA 17E prikazuje
1
nivoe vezivanja antitela protiv sortilina S-60 za sortilin u prisustvu ili odsustvu NTS. NTS nije uticao na vezivanje antitela za sortilin, što ukazuje da se antitela protiv sortilina ne vezuju za mesto vezivanja NTS.
SLIKA 18 A prikazuje smanjenje nivoa proteina sortilina u humanim primarnim makrofagima pomoću antitela pune dužine (IgG) i Fabs antitela, antitela protiv sortilina.
SLIKA 18B prikazuje smanjenje nivoa proteina sortilina u humanim primarnim dendritičkim ćelijama pomoću antitela pune dužine (IgG). 15 µg proteina je stavljeno na gelove, upijeno i obojeno antitelima protiv sortilina i beta-aktina.
SLIKA 19A i 19B prikazuju merenja poluživota antitela protiv sortilina in vivo nakon intraperitonealne (IP) injekcije od 40 mg/kg na dan 0. SLIKA 19A prikazuje ubrizgavanje humanih IgG1 N297A antitela protiv sortilina, n = 4-5 životinja/grupa. SLIKA 19B prikazuje ubrizgavanje mišjeg antitela IgG1 N297A protiv sortilina. Podaci su usklađeni korišćenjem jednofazne funkcije raspadanja (Graph Pad Prism). Antitela protiv sortilina imaju kraći poluživot od kontrolnih IgG.
SLIKE 20A-20D prikazuju merenje nivoa proteina mišjeg progranulina (PGRN) u uzorcima plazme miševa u različito vreme nakon ubrizgavanja 40 mg/kg antitela protiv sortilina.
SLIKA 20A i SLIKA 20B prikazuju rezultate sa mišjim IgG1 N297A antitelima protiv sortilina. SLIKA 20C i SLIKA 20D prikazuju rezultate sa humanim IgG1 N297A antitelom protiv sortilina. SLIKA 20B i SLIKA 20D rezimira statističku analizu koristeći jednofaktorsku Anova sa Tukey-jevim posthoc testom. Zvezde ukazuju na nivo značajnosti u poređenju sa kontrolnom grupom izotipa ms ili hu IgG1:*p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, **** p <0.0001. Antitela protiv sortilina indukuju povećanje nivoa proteina PGRN proteina u plazmi, pri čemu je trajanje efekta u korelaciji sa poluživotom antitela.
SLIKE 21A-21F prikazuju merenje nivoa proteina sortilina koristeći Western blot analizu lizata belih krvnih zrnaca miševa. Anti-beta aktin je korišćen kao kontrola opterećenja i za normalizaciju. SLIKA 21A i SLIKA 21B pokazuju nivo proteina na 5 dan. SLIKA 21C i SLIKA 21D pokazuju nivo proteina na 12 dan. Antitela protiv sortilina S-20, S-15-6 i S-2-11 indukuju značajno smanjenje nivoa proteina sortilina na 5 dan (jednofaktorska Anova sa Tukey-jevim posthoc testom. Zvezde ukazuju nivo značajnosti: ** p <0.01, *** p <0.001). Antitelo S-15-6 je indukovalo smanjeni nivo proteina sortilina na 12 dan u 2 od 3 miša.
SLIKE 21E i 21F pokazuju nivo proteina u belim krvnim zrncima nakon hroničnog šestonedeljnog ciklusa nedeljnih IP ubrizgavanja kod miševa sa 20, 40 ili 80 mg/kg antitela
2
protiv sortilina S15-6. Sve tri doze rezultuju snažnom i statistički značajnom sniženom regulacijom sortilina u belim krvnim zrncima (**** p <0.0001 u poređenju sa kontrolnim IgG, jednofaktorska ANOVA).
SLIKE 22A-22D prikazuju pozitivnu korelaciju između nivoa IgG antitela protiv sortilina i nivoa proteina progranulina (PGRN) u uzorcima mozga miševa divljeg tipa (WT) posle dvonedeljne ICV infuzije. Nije bilo značajne korelacije sa izotipom kontrolnog antitela.
SLIKA 22A prikazuje antitelo S-15. SLIKA 22B prikazuje antitelo S-20. SLIKA 22C prikazuje antitelo S-30. SLIKA 22D prikazuje izotip kontrolog antitela.
SLIKA 23A prikazuje nivo IgG izmeren nakon IV ubrizgavanja 40 mg/kg antitela protiv sortilina S-15-6 huIgG1 N297A. Poluživot IgG se povećava sa smanjenim nivoom sortilina, pokazujući da je relativno kratak poluživot S-15-6 kod miševa divljeg tipa (WT) posledica degradacije nakon ciljane angažovanosti, a ne imunogenosti ili drugih nespecifičnih degradacija. SLIKA 23B prikazuje povišene osnovne nivoe proteina progranulina (PGRN) kod sortilin knock-out (KO) miševa, u poređenju sa sortilin heterozigotnim (Het) i divljim tipom (WT) koji su zajedno odgajani. PGRN je meren u uzorcima plazme korišćenjem ELISA analize. SLIKA 23C prikazuje rezultate koji pokazuju da je antitelo S-15-6 izazvalo povećanje nivoa proteina progranulina (PGRN) do osam dana nakon ubrizgavanja u miševima divljeg tipa (WT) i miševa sa heterozigotnim sortilinom (Het), ali ne i u sortilin knock-out (KO) miševima. Crna strelica označava ubrizgavanje antitela S-15-6 na 7 dan. **** p <0.0001, n.s.-nije značajno koristeći jednofaktorsku ANOVA, KO nasuprot Het i nasuprot WT.
SLIKA 24 prikazuje rezultate istraživanja artritisa izazvanog kolagenom na miševima. Dvonedeljno ubrizgavanje 40 mg/kg antitela protiv sortilin S-15-6 značajno je smanjila ocenu kliničkog artritisa u poređenju sa kontrolnim grupama (PBS i MOPC-21/ msIgG1).
SLIKA 25A prikazuje nivo progranulina u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 25B prikazuje broj peritonealnih neutrofila nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 25C prikazuje broj velikih peritonealnih makrofaga nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 25D prikazuje broj malih peritonealnih makrofaga nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. Rezultati prikazuju povećane nivoe progranulina; međutim, broj peritonealnih neutrofila, velikih peritonealnih makrofaga i malih peritonealnih makrofaga nije se značajno razlikovao. Otvoreni krugovi predstavljaju miševe divljeg tipa, a otvoreni kvadratići predstavljaju sortilin knock-out miševe. n = 8-10 miševa/grupa. *p <0.01, ** p <0.001, *** p <0.001 i **** p <0.0001 jednofaktorskom ANOVA sa Tukey-jevim testom višestrukih poređenja.
SLIKA 26A prikazuje nivoe IL-6 u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 26B prikazuje nivoe TNFalfa u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 26C prikazuje nivoe IFNgama u serumu posle 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa.SLIKA 26D prikazuje nivoe IL-10 u serumu posle 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 26E prikazuje nivoe IL-12p70 u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 26F prikazuje nivoe IL-12/IL-23p40 u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 26G prikazuje nivoe IL-1alfa u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 26H prikazuje nivoe IL-1beta u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. Otvoreni krugovi predstavljaju miševe divljeg tipa, a otvoreni kvadratići predstavljaju sortilin knockout miševe. n = 8-10 miševa/grupa. *p <0.01, ** p <0.001, *** p <0.001 i **** p <0.0001 jednofaktorskom ANOVA sa Tukey-jevim testom višestrukih poređenja.
SLIKA 27A prikazuje nivoe CXCL1u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 27B prikazuje nivoe CCL2 u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa.
SLIKA 27C prikazuje nivoe CCL3 u serumu posle 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa.SLIKA 27D prikazuje nivoe CCL4 u serumu posle 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 27E prikazuje nivoe CCL5 u serumu nakon 1.5 sata LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. Otvoreni krugovi predstavljaju miševe divljeg tipa, a otvoreni kvadratići predstavljaju sortilin knock-out miševe. n = 8-10 miševa/grupa. *p <0.01, ** p <0.001, *** p <0.001 i **** p <0.0001 jednofaktorskom ANOVA sa Tukey-jevim testom višestrukih poređenja.
SLIKA 28A prikazuje nivoe IL-6 u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 28B prikazuje nivoe TNFalfa u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 28C prikazuje nivoe IFNgama u serumu posle 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa.SLIKA 28D prikazuje nivoe IL-10 u serumu posle 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 28E prikazuje nivoe IL-12p70 u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 28F prikazuje nivoe IL-12/IL-23p40 u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 28G prikazuje nivoe IL-1alfa u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 28H prikazuje nivoe IL-1beta u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. Otvoreni krugovi predstavljaju miševe divljeg tipa, a otvoreni kvadratići predstavljaju sortilin knock-out miševe. n = 8-10 miševa/grupa. *p <0.01, ** p <0.001, *** p <0.001 i **** p <0.0001 jednofaktorskom ANOVA sa Tukey-jevim testom višestrukih poređenja.
SLIKA 29A prikazuje nivoe CXCL1u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 29B prikazuje nivoe CCL2 u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 29C prikazuje nivoe CCL3 u serumu posle 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knockout (Sortilin-/-) miševa.SLIKA 29D prikazuje nivoe CCL4 u serumu posle 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. SLIKA 29E prikazuje nivoe CCL5 u serumu nakon 6 sati LPS tretmana miševa divljeg tipa i sortilin knock-out (Sortilin-/-) miševa. Otvoreni krugovi predstavljaju miševe divljeg tipa, a otvoreni kvadratići predstavljaju sortilin knock-out miševe. n = 8-10 miševa/grupa. *p <0.01, ** p <0.001, *** p <0.001 i **** p <0.0001 jednofaktorskom ANOVA sa Tukey-jevim testom višestrukih poređenja.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Opšte tehnike
[0019] Tehnike i postupci opisani ili navedeni ovde su generalno dobro razumljivi i obično se koriste konvencionalnim postupcima od strane stručnjaka u tehnici, kao što su, na primer, široko korišteni postupci opisani u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
2
3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
Definicije
[0020] Kako je upotrebljen ovde, termin "sprečavanje" uključuje obezbeđivanje profilakse u pogledu pojave ili recidiva određene bolesti, poremećaja ili stanja kod pojedinca. Pojedinac može biti predisponiran, podložan određenoj bolesti, poremećaju ili stanju, ili u riziku od razvoja takve bolesti, poremećaja ili stanja, ali mu još nije dijagnostikovana bolest, poremećaj ili stanje..
[0021] Kako je upotrebljen ovde, pojedinac „u riziku“ od razvoja određene bolesti, poremećaja ili stanja može, ali i ne mora imati otkrivenu bolest ili simptome bolesti, a može, a možda i nije pokazao uočljivu bolest ili simptome bolesti pre lečenja ovde opisanim postupcima. „U riziku“ označava da pojedinac ima jedan ili više faktora rizika, koji su merljivi parametri koji su u korelaciji sa razvojem određene bolesti, poremećaja ili stanja, kako je poznato u tehnici. Pojedinac koji ima jedan ili više ovih faktora rizika ima veću verovatnoću da razvije određenu bolest, poremećaj ili stanje od pojedinca bez jednog ili više ovih faktora rizika.
[0022] Kako je upotrebljen ovde, izraz "lečenje" odnosi se na kliničku intervenciju osmišljenu da promeni prirodni tok pojedinca koji se leči tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju smanjenje stope progresije, poboljšanje ili ublažavanje patološkog stanja i remisiju ili poboljšanje prognoze određene bolesti, poremećaja ili stanja. Pojedinac se uspešno „leči“, na primer, ako se jedan ili više simptoma povezanih sa određenom bolešću, poremećajem ili stanjem ublaži ili eliminiše.
[0023] "Efikasna količina" odnosi se na najmanju količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnih vremenskih perioda, da bi se postistigao željeni terapijski ili profilaktički rezultat. Efikasana količina može se obezbediti u jednoj ili više primena.
[0024] „Terapeutski efikasna količina“ je najmanje minimalna koncentracija potrebna da bi se postiglo merljivo poboljšanja određene bolesti, poremećaja ili stanja. Ovde navedena terapeutski efikasna količina može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, i sposobnost antagonista proteina sortilina da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj terapeutski korisni efekti nadmašuju bilo koje toksične ili štetne efekte antagonista proteina sortilina.
[0025] Kako je upotrebljen ovde, primena "zajedno" sa drugim jedinjenjem ili kompozicijom uključuje istovremenu primenu i/ili primenu u različito vreme. Primena zajedno uključuje i primenu kao ko-formulaciju ili primenu kao zasebne kompozicije, uključujući pri različitim učestanostima doziranja ili intervalima, i koristeći isti način primene ili različite načine primene.
[0026] „Pojedinac” u svrhe lečenja, sprečavanja ili smanjenja rizika odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisar, uključujući ljude, domaće životinje i životinje sa farme i iz zoološkog vrta, životinje koje se koriste u sportu ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, zečevi, govedi, svinji, hrčci, gerbili, miševi, feretke, pacovi, mačke i slično. Poželjno je da je pojedinac čovek.
[0027] Termin „imunoglobulin“ (Ig) je naizmenično upotrebljen ovde sa terminom „antitelo“. Termin „antitelo“ je ovde upotrebljen u najširem smislu i posebno obuhvata monoklonska
2
antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) nastala od najmanje dva intaktna antitela i fragmente antitela sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost.
[0028] Osnovna jedinica antitela sa 4 lanca je heterotetramerni glikoprotein sastavljen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Sparivanje VHi VLzajedno čini jedno mesto za vezivanje antigena. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela videti, npr., Basic and Clinical Immunology, 8th Ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6.
[0029] L lanac bilo koje vrste kičmenjaka može se pripisati jednom od dva jasno različita tipa, koji se nazivaju kappa (“κ”) i lambda (“λ”), na osnovu sekvenci aminokiselina njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od sekvence aminokiselina konstantnog domena njihovih teških lanaca (CH), imunoglobulini se mogu svrstati u različite klase ili izotipove. Postoji pet klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, koji imaju teške lance označene kao alfa („α“), delta („δ“), epsilon („ε“), gama („γ“) i mi („μ“), respektivno. Klase γ i α su dalje podeljene u podklase (izotipove) na osnovu relativno malih razlika u CH sekvenci i funkciji, na primer, ljudi eksprimiraju sledeće podklase: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate i generalno su opisane u, na primer, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 4<th>ed. (W.B. Saunders Co., 2000).
[0030] „Nativna antitela“ su obično heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira među teškim lancima različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima regularno razmaknute intralančane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) iza kojeg sledi niz konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantan domen na svom drugom kraju; konstantan domen lakog lanca je poravnjan sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnjan sa varijabilnim domenom teškog lanca. Veruje se da posebni aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog lanca i teškog lanca.
[0031] "Izolovano" antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, je ono koje je identifikovano, odvojeno i/ili oporavljeno od komponente njegovog okruženja
2
proizvodnje (npr. prirodno ili rekombinantno). Poželjno je da izolovani polipeptid nije povezan sa svim ostalim kontaminiranim komponentama iz svog okruženja proizvodnje. Kontaminirane komponente iz njegovog okruženja proizvodnje, kao što su one koje su rezultat rekombinantnih transficiranih ćelija, su materijali koji bi obično ometali istraživanje, dijagnostičku ili terapijsku upotrebu antitela i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili ne-proteinske rastvore. U poželjnim primerima izvođenja, polipeptid će biti prečišćen: (1) do više od 95% po masi antitela kako je određeno, na primer, Lowry –jevim postupkom, i u nekim primerima izvođenja, do više od 99% po težini; (2) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje sekvence aminokiselina upotrebom “spinning cup” sekvenatora”, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod uslovima koji ne redukuju ili redukuju korišćenjem Coomassie plave boje ili, poželjno, boje srebra. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih T-ćelija jer najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Uobičajeno, međutim, izolovani polipeptid ili antitelo će se pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.
[0032] „Varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ antitela, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, odnosi se na amino-terminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca mogu se nazvati „VH“ i „VL“, respektivno. Ovi domeni su generalno najvarijabilniji delovi antitela (u odnosu na druga antitela iste klase) i obuhvataju mesta vezivanja antigena.
[0033] Termin „varijabilni“ odnosi se na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih domena dosta razlikuju u sekvenci među antitelima, kao što su antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. V domen posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost određenog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena po celom rasponu varijabilnih domena. Umesto toga, koncentrisan je u tri segmenta koji se nazivaju hipervarijabilni regioni (HVRs) u varijabilnim domenima i lakog lanca i teškog lanca. Visoko očuvani delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR). Varijabilni domeni nativnih teških i lakih lanaca svaki sadrži četiri FR regiona, koji u velikoj meri prihvataju konfiguraciju beta-ploče, povezanu sa tri HVRs, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima čine i deo strukture beta-ploče. HVRs u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini regiona FR i, sa HVRs iz drugog lanca, doprinose stvaranju mesta na antitelu za vezivanje antigena . (videti Kabat et al., Sequences of
2
Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u toksičnosti ćelije zavisnoj od antitela.
[0034] Termin "monoklonsko antitelo", kako je upotrebljeno ovde, odnosi se na antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, dobijeno iz populacije znatno homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična, osim mogućih prirodnih pojava mutacije i/ili post-translacionih modifikacija (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jednog ili više antigenih mesta. U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom otkriću može biti bispecifično antitelo. Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na jednom ili više antigenih mesta. Modifikator „monoklonski“ označava karakter antitela dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa ovim otkrićem mogu se proizvesti različitim tehnikama, uključujući, na primer, tehnologije prikaza faga (videti, npr., Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 101(34):12467-472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004), postupak hibridoma (npr., Kohler and Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2d ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), postupci rekombinantne DNK (videti, npr., U.S. Patent No. 4,816,567), i tehnologije za proizvodnju humanih antitela ili antitela sličnih humanim kod životinja koje imaju delove ili sve lokuse humanog imunoglobulina ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (videti, npr., WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994);
2
Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol.14:826 (1996); i Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13:65-93 (1995).
[0035] Termini „antitelo pune dužine“, „intaktno antitelo“ ili „celo antitelo“ koriste se naizmenično za ukazivanje na antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, u njegovom suštinski intaktnom obliku, za razliku od fragment antitela. Konkretno, cela antitela uključuju ona sa teškim i lakim lancima, uključujući Fc region. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni nativne sekvence (npr., konstantni domeni humane nativne sekvence) ili njihove varijante sekvence aminokiselina. U nekim slučajevima, intaktno antitelo može imati jednu ili više efektorskih funkcija.
[0036] "Fragment antitela" sadrži deo intaktnog antitela, poželjno onaj za vezivanje antigena i/ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab ', F (ab') 2 i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (videti U.S. Patent 5,641,870, Example 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)); molekule jednolančanih antitela i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
[0037] Digestija papaina antitelima, kao što su antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, proizvodi dva identična fragmenta koji vezuju antigen, nazvanih „Fab“ fragmenti, i zaostali „Fc“ fragment, oznaka koja odražava sposobnost da se lako kristališe. Fab fragment se sastoji od celog L lanca zajedno sa varijabilnim regionom domena H lanca (VH) i prvim konstantnim domenom jednog teškog lanca (CH1). Svaki Fab fragment je monovalentan u odnosu na vezivanje antigena, tj. ima jedno mesto za vezivanje antigena. Tretman antitela pepsinom daje jedan veliki F (ab')2fragment koji otprilike odgovara dva disulfidom povezana Fab fragmenta koji imaju različitu aktivnost vezivanja za antigen i još uvek je sposoban da unakrsno povezuje antigen. Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po tome što imaju nekoliko dodatnih ostataka na karboksi kraju CH1 domena uključujući jedan ili više cisteina iz regiona povezivanja antitela. Fab'-SH je ovde oznaka za Fab 'u kojoj cisteinski ostatak (ostaci) konstantnih domena nose slobodnu tiolnu grupu. F (ab')2fragmenti antitela su prvobitno proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji imaju cisteine između njih koji ih povezuju. Poznata su i druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela.
[0038] Fc fragment sadrži karboksi-terminalne delove oba H lanca koja se zajedno drže disulfidima. Efektorske funkcije antitela su određene sekvencama u Fc regionu, regionu koji takođe prepoznaju Fc receptori (FcR) koji se nalaze na određenim vrstama ćelija..
2
[0039] „Fv“ je minimalni fragment antitela koji obuhvata kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera jednog varijabilnog regiona domena teškog i jednog varijabilnog regiona domena lakog lanca u uskoj, nekovalentnoj asocijaciji. Iz preklapanja ova dva domena proizilazi šest hipervarijabilnih petlji (po 3 petlje iz H i L lanca) koje doprinose aminokiselinskim ostacima za vezivanje antigena i daju antitelu specifičnost vezivanja antigena. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri HVRs specifične za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, iako sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.
[0040]•„Jednolančani Fv“ takođe skraćeno „sFv“ ili „scFv“ su fragmenti antitela koji sadrže domene VH i VL antitela povezanih u jedan polipeptidni lanac. Poželjno, sFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni povezivač između domena VHi VLkoji omogućava sFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled sFv videti Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
[0041] „Funkcionalni fragmenti“ antitela, kao što su antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, sadrže deo intaktnog antitela, generalno uključujući za koji se vezuje antigen ili varijabilni region intaktnog antitela ili F region antitela koje zadržava ili ima modifikovanu sposobnost vezivanja FcR. Primeri fragmenata antitela uključuju linearna antitela, molekule jednolančanih antitela i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
[0042] Termin„dijatela“ odnosi se na male fragmente antitela pripremljene konstrukcijom sFv fragmenata (vidi prethodni pasus) sa kratkim povezivačima (oko 5-10) ostataka) između domena VHi VL, tako da se međulančano, ali ne i unutarlančano sparivanje postiže sa V domenima, što rezultuje bivalentnim fragmentom, tj. fragmentom koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična dijatela su heterodimeri dva „ukrštena“ sFv fragmenta u kojima su domeni VHi VLdva antitela prisutni na različitim polipeptidnim lancima. Dijatelitela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993).
[0043] Kako je upotrebljeno ovde, "himerno antitelo" se odnosi na antitelo (imunoglobulin), kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, u kome je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je (su) ostatak lanca (lanaca) identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili koji pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 81:6851-55 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju PRIMATIZED<®>antitela pri čemu je region antitela koji se vezuje za antigen izveden iz antitela proizvodenih, na primer, imunizacijom makaki majmuna sa antigenom od interesa. Kako je upotrebljeno ovde, „humanizovano antitelo“ se koristi kao podskup „himernih antitela“.
[0044] „Humanizovani“ oblici ne-humanih (na primer, mišjih) antitela, kao što su antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, su himerna antitela koja obuhvataju minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (antitelo primalac) u kome su ostaci iz HVR primaoca zamenjeni ostacima iz HVR nehumane vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili ne -humani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili sposobnost. U nekim slučajevima, FR ostaci humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Štaviše, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu ili u donorskom antitelu. Ove modifikacije se mogu izvršiti da bi se dalje poboljšale performanse antitela, kao što je afinitet vezivanja. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u osnovi sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili u suštini sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima od ne-humane imunoglobulinske sekvence, i svi ili suštinski svi FR regioni su oni od sekvence humanog imunoglobulina, iako FR regioni mogu uključivati jednu ili više pojedinačnih supstitucija FR ostataka koje poboljšavaju performanse antitela, kao što je afinitet vezivanja, izomerizacija, imunogenost i slično. Broj ovih supstitucija aminokiselina u FR obično nije veći od 6 u H lancu, a u L lancu nije veći od 3. Humanizovano antitelo će izborno takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc ), obično humanog imunoglobulina. Za više detalja videti, npr, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Videti takođe, na primer, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); i U.S. Patent Nos.6,982,321 i 7,087,409.
[0045] „Humano antitelo“ je ono koje poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara sekvenci antitela, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, koje je proizveo
1
čovek i/ili je napravljeno korišćenjem bilo koje od tehnika za stvaranje humanih antitela kao što je ovde otkriveno. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane ostatke za vezivanje antigena. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici, uključujući i biblioteke za prikaz faga. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Za pripremu humanih monoklonskih antitela takođe su dostupni postupci opisani u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Videti, takođe van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001). Humana antitela se mogu pripremiti davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvede takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, na primer, imunizovani miševi “xenomice” (videti, npr. U.S. Patent Nos. 6,075,181 i 6,150,584 što se tiče XENOMOUSE<TM>tehnologije). Vidi takođe, na primer, Li et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) što se tiče humanih antitela nastalih pomoću tehnologije hibridoma humanih B-ćelija.
[0046] Termin „hipervarijabilni region“, „HVR“ ili „HV“, kada se upotrebljava ovde, odnosi se na regione varijabilnog domena antitela, kao što su ona antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, koji su hipervarijabilni u nizu i/ili formiraju strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sadrže šest HVRs; tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U nativnim antitelima, H3 i L3 pokazuju najveću raznolikost od šest HVRs, a posebno se veruje da H3 ima jedinstvenu ulogu u davanju fine specifičnosti antitela. Videti, na primer, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Zaista, prirodna antitela koja se pojavljuju kod kamila i koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca. Videti, na primer, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) and Sheriff et al., Nature Struct. Biol.3:733-736 (1996).
[0047] U upotrebi su brojna HVR ograničenja koja su ovde obuhvaćena. HVRs koji su regioni za određivanje EU ili Kabat komplementarnosti (CDRs) zasnovani su na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al., prethodno pomenuto). Chothia se umesto toga odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVRs predstavljaju kompromis između EU ili Kabat CDRs i Chothia strukturnih petlji, a koriste ih softveri za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. „Kontaktni“
2
HVRs zasnovani su na analizi raspoloživih složenih kristalnih struktura. Ostaci svakog od ovih HVRs su navedeni u nastavku.
[0048] HVRs mogu sadržati „proširene HVRs“ na sledeći način: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2), i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL, i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (poželjni primer izvođenja) (H2), i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena su numerisani prema EU ili Kabat et al., prethodno navedeno, za svaku od ovih proširenih HVR definicija.
[0049] "Okvirni" ili "FR" ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu ostaci HVR kako je ovde definisano.
[0050] Fraza „numerisanje ostataka u varijabilnom domenu kao u EU ili Kabatu“ ili „numerisanje pozicije aminokiselina kao u EU ili Kabatu“, i njihove varijacije, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili var ijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u EU ili Kabat et al., prethodno navedeno. Koristeći ovaj sistem numerisanja, stvarna linearna sekvenca aminokiselina može obuhvatati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili umetanju unutar FR ili HVR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati jedan umetak aminokiseline (ostatak 52a prema Kabat-u) posle ostatka 52 H2 i umetnute ostatke (npr. ostatke 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabat-u) nakon teškog lanca FR ostatak 82. EU ili Kabat numeracija ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnavanjem u homologim regionima sekvence antitela sa „standardnom“ Kabat numerisanom sekvencom.
[0051] EU ili Kabat sistem numerisanja se generalno koristi kada se odnosi na ostatak u varijabilnom domenu (približno ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). „EU ili Kabt sistem numerisanja“ ili „EU indeks“ se generalno koristi kada se odnosi na ostatak u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr. EU indeks naveden u Kabat et al., prethodno navedeno). "EU indeks kao u Kabatu" odnosi se na numerisanje ostataka humanog IgG1 EU antitela. Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, pozivanje na brojeve ostataka u varijabilnom domenu antitela označava numerisanje ostataka prema Kabat sistemu numeracije. Osim ako ovde nije drugačije naznačeno, pozivanje na brojeve ostataka u konstantnom domenu antitela označava numerisanje ostataka prema EU ili Kabat sistemu numerisanja (npr. videti United States Patent Publication No.2010-280227).
[0052] "Akceptorski humani okvir" kako je upotrebljen ovde je okvir koji sadrži sekvencu aminokiselina VL ili VH okvira izvedenog iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa. Akceptorski humani okvir „izveden iz“ okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može sadržati istu njegovu sekvencu aminokiselina ili može obuhvatati već postojeće promene sekvence aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, broj već postojećih promena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje . Tamo gde su prisutne već postojeće promene aminokiselina u VH, poželjno je da se te promene dešavaju samo na tri, dva ili jednom od pozicija 71H, 73H i 78H; na primer, ostaci aminokiselina na tim položajima mogu biti 71A, 73T i/ili 78A. U jednom primeru izvođenja, VL akceptorski humani okvir je identičan u sekvenci sa VL sekvencom okvira humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa.
[0053]•„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja ostatke aminokiselina koji se najčešće javljaju u odabiru sekvenci okvira VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Primeri uključuju za VL, podgrupa može biti podgrupa kapa I, kapa II, kapa III ili kapa IV, kao u Kabat et al., prethodno navedeno. Dodatno, za VH, podgrupa može biti podgrupa I, podgrupa II ili podgrupa III kao u Kabat et al., prethodno navedeno.
[0054] „Modifikacija aminokiselina“ na određenoj poziciji, na primer, antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, odnosi se na supstituciju ili deleciju navedenog ostatka, ili na inserciju najmanje jednog aminokiselinskog ostatka pored navedenog ostatka. Insercija
4
„pored“određenog ostatka znači inserciju unutar jednog do dva njegova ostatka. Insercija može biti N-terminalna ili C-terminalna prema navedenom ostatku. Poželjna modifikacija aminokiselina ovde je supstitucija.
[0055] „Afinitetno sazrelo“ antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, je ono sa jednom ili više promena u jednoj ili više njihovih HVRs koje rezultuju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa parentalnim antitelom koje nema te promene. U jednom primeru izvođenja, afinitetno sazrelo antitelo ima nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljani antigen. Afinitetno sazrela antitela se proizvode postupcima poznatim u tehnici. Na primer, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje afinitetno sazrevanje mešanjem VH i VL domena. Slučajna mutageneza HVR i/ili ostataka okvira opisana je, na primer: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
[0056] Kako je upotrebljen ovde, termin "specifično prepoznaje" ili "specifično se vezuje" odnosi se na merljive i ponovljive interakcije, kao što je privlačenje ili vezivanje između cilja i antitela, kao što su antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije molekula uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, koje se specifično ili preferencijalno vezuje za cilj ili je antitelo epitop koji se vezuje za ovaj cilj ili je epitop sa većim afinitetom, avidnošću, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge ciljeve ili druge epitope cilja. Takođe se podrazumeva čitanjem ove definicije da se, na primer, antitelo (ili deo) koje se specifično ili preferencijalno vezuje za prvi cilj može, ali ne mora specifično ili preferencijalno vezivati za drugi cilj. Kao takvo, „specifično vezivanje“ ili „preferencijalno vezivanje“ ne zahteva nužno (iako može uključivati) isključivo vezivanje. Antitelo koje se specifično vezuje za cilj može imati konstantu asocijacije od najmanje oko 10<3>M<-1>ili 10<4>M<-1>, ponekad oko 10<5>M<-1>ili 10<6>M<-1>, u drugim slučajevima oko 10<6>M<-1>ili 10<7>M<-1>, oko 10<8>M<-1>do 10<9>M<-1>, ili oko 10<10>M<-1>do 10<11>M<-1>ili više. Za odabir antitela specifično imunoreaktivnih sa određenim proteinom mogu se koristiti različiti formati imunoloških analiza. Na primer, ELISA imunološke analize u čvrstoj fazi se rutinski koriste za odabir monoklonskih antitela specifično imunoreaktivnih sa proteinom. Videti, na primer, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, za opis formata i stanja imunoanaliza koje se mogu koristiti za određivanje specifične imunoreaktivnosti.
[0057] Kako je upotrebljen ovde, "interakcija" između proteina sortilina i drugog proteina obuhvata, bez ograničenja, interakciju protein-protein, fizičku interakciju, hemijsku interakciju, vezivanje, kovalentno vezivanje i jonsko vezivanje. Kako je upotrebljeno ovde, antitelo „inhibira interakciju“ između dva proteina kada antitelo poremeti, smanji ili potpuno eliminiše interakciju između dva proteina. Antitelo prema ovom otkriću, ili njegov fragment, „inhibira interakciju“ između dva proteina kada se antitelo ili njegov fragment veže za jedan od dva proteina.
[0058] „Blokirajuće“ antitelo, „antagonističko“ antitelo ili „inhibitorno“ antitelo je antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, koje inhibira ili smanjuje jednu ili više bioloških aktivnosti antigena za koje se veže, kao što su interakcije sa jednim ili više proteina. U nekim primerima izvođenja, blokirajuća antitela, antagonistička antitela ili inhibitorna antitela u suštini ili potpuno inhibiraju jednu ili više bioloških aktivnosti ili interakcije antigena.
[0059] "Efektorske funkcije" antitela se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (nativna sekvenca Fc regiona ili varijanta sekvenca aminokiselina Fc regiona) antitela i variraju u zavisnosti od izotipa antitela.
[0060] Termin „Fc region“ ovde je upotrebljen za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc regione nativne sekvence i varijantne Fc regione. Iako se granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu razlikovati, Fc region teškog lanca humanog IgG obično se definiše tako da se proteže od aminokiselinskog ostatka na poziciji Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksilnog kraja. C-terminalni lizin (ostatak 447 prema EU ili Kabat sistemu numerisanja) Fc regiona može se ukloniti, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela . Shodno tome, kompozicija intaktnih antitela može da sadrži populacije antitela sa uklonjenim svim K447ostacima, populacije antitela bez uklonjenih K447 ostataka i populacije antitela koja imaju mešavinu antitela sa i bez K447ostatka. Pogodni Fc regioni nativne sekvence za upotrebu u antitelima prema ovom otkriću uključuju humane IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.
[0061] „Fc region nativne sekvence“ sadrži sekvencu aminokiselina identičnu sekvenci aminokiselina Fc regiona pronađenoj u prirodi. Humani Fc regioni nativne sekvence uključuju Fc region nativne sekvence humanog IgG1 (ne-A i A alotipovi); Fc region nativne sekvence humanog IgG2; Fc region nativne sekvence humanog IgG3; i Fc region nativne sekvence humanog IgG4, kao i njegove varijante u prirodi.
[0062] „Varijantni Fc region“ sadrži sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od Fc regiona nativne sekvence zbog najmanje jedne modifikacije aminokiselina, poželjno jedne ili više supstitucija aminokiselina. Poželjno, varijantni Fc region ima najmanje jednu supstituciju aminokiselina u poređenju sa Fc regionom nativne sekvence ili sa Fc regionom parentalnog polipeptida, npr. od oko jedne do oko deset supstitucija aminokiselina, a poželjno od oko jedne do oko pet supstitucija aminokiselina u Fc regionu nativne sekvence ili u Fc regionu parentalnog polipeptida. Varijantni Fc region ovde će poželjno imati najmanje oko 80% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom parentalnog polipeptida, a najpoželjnije najmanje oko 90% homologije sa njim(a), poželjnije najmanje oko 95% homologija sa njim(a).
[0063] "Fc receptor" ili "FcR" opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je humani FcR nativne sekvence. Štaviše, poželjan FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore podklasa FcγRI, FcγRII, i FcγRIII, uključujući varijante alela i alternativno spojene oblike ovih receptora, FcγRII receptori uključuju FcγRIIA („aktivirajući receptor”) i FcγRIIB („inhibitorni receptor”), koji imaju slične sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktivirajući receptor FcγRIIA obuhvata imunoreceptorski motiv aktivacije na bazi tirozina („ITAM“) u svom citoplazmatskom domenu. Inhibitorni receptor FcγRIIB obuhvata imunoreceptorski motiv inhibicije na bazi tirozina („ITIM“) u svom citoplazmatskom domenu. (videti, na primer, M. Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs su pregledani u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Ostali FcRs, uključujući one koji će biti identifikovani u budućnosti, obuhvaćeni su terminom „FcR“ u ovom dokumentu. FcRs takođe mogu povećati poluživot seruma antitela.
[0064] Vezivanje za FcRn in vivo i poluživot seruma humanih FcRn visokog afiniteta koji se vezuju za polipeptide može se analizirati, na primer, kod transgenih miševa ili transficiranih humanih ćelijskih linija koje eksprimiraju humani FcRn, ili kod primata kojima su dati polipeptidi sa varijantnim Fc regionom. WO 2004/42072 (Presta) opisuje varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRs. Videti takođe, na primer, Shields et al., J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001).
[0065] Kako je upotrebljen ovde, „procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ i „homologija“ u odnosu na peptid, polipeptid ili sekvencu antitela odnosi se na procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnoj sekvenci peptida ili polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhe određivanja procenta identičnosti sekvence aminokiselina može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili MEGALIGN<TM>(DNASTAR) softver. Stručnjaci u tehnici mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koje algoritme poznate u tehnici potrebne da bi se postiglo maksimalno poravnanje po celoj dužini sekvenci koje se upoređuju.
[0066] "Izolovani" molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo, kao što je antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminiranog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u okruženju u kome je proizveden. Poželjno je da izolovana nukleinska kiselina ne bude povezana sa svim komponentama povezanim sa okruženjem proizvodnje. Izolovani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju ovde navedene polipeptide i antitela su u drugom obliku, a ne u obliku ili okruženju u kojem se nalaze u prirodi. Izolovani molekuli nukleinske kiseline se stoga razlikuju od nukleinske kiseline koja kodira ovde navedene polipeptide i antitela koja prirodno postoje u ćelijama.
[0067] Termin „vektor“, kako je upotrebljen ovde, ima za cilj da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Jedna vrsta vektora je „plazmid“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu DNK u koju se mogu vezati dodatni segmenti DNK. Druga vrsta vektora je fag vektor. Druga vrsta vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni segmenti DNK mogu vezati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćina u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. ne-epizomalni vektori sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i na taj način se replikuju zajedno sa genom domaćina.
Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmere ekspresiju gena sa kojima su operativno vezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori“ ili jednostavno „ekspresioni vektori“. U suštini, korisni ekspresioni vektori u tehnikama rekombinantne DNK često su u obliku plazmida. U ovoj specifikaciji, „plazmid“ i „vektor“ se mogu koristiti naizmenično jer je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora.
[0068] „Polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“, kako su ovde naizmenično upotrebljeni, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine i uključuju DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji se može ugraditi u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze ili sintetičkom reakcijom. Polinukleotid može sadržati modifikovane nukleotide, kao što su metilirani nukleotidi i njihovi analozi. Ako je prisutna, modifikacija nukleotidne strukture može se preneti pre ili nakon sastavljanja polimera. Sekvenca nukleotida može biti prekinuta ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid može sadržati modifikacije napravljene nakon sinteze, kao što je konjugacija sa oznakom. Druge vrste modifikacija uključuju, na primer, „zaštite“, supstituciju jednog ili više nukleotida u prirodi sa analognim, internukleotidnim modifikacijama, kao što su, na primer, one sa ne-naelektrisanim vezama (npr. metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa naelektrisanim vezama (npr. fosforotioati, fosforoditioati, itd.), oni koji obuhvataju prikačene ostatke, kao što su, na primer, proteini (npr. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, sloj L-lizina itd.), oni sa interkalatorima (npr. akridin, psoralen itd.), oni koji obuhvataju helate (npr. metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali itd.), oni koji obuhvataju alkilatore, oni sa izmenjenim vezama (npr. alfa anomerne nukleinske kiseline itd.), kao i nemodifikovane oblike polinukleotida. Dalje, bilo koja od hidroksilnih grupa koje su obično prisutne u šećerima može biti zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićenim standardnim zaštitnim grupama, ili aktivirana za pripremu dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima, ili može biti konjugovana sa čvrstim ili polu -čvrstim nosačima. 5 ’i 3’ terminalni OH može biti fosforilisan ili supstituisan sa aminima ili ostacima organskih zaštitnih grupa od 1 do 20 atoma ugljenika. Drugi hidroksili se takođe mogu derivatizovati u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi takođe mogu obuhvatati analogne oblike šećera riboze ili deoksiriboze koji su opšte poznati u tehnici, uključujući, na primer, 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- ili 2'-azido -ribozu, analoge karbocikličnog šećera, α -anomerne šećere, epimerne šećere kao što su arabinoza, ksiloze ili liksoze, šećere piranoze, šećere furanoze, sedoheptuloze, aciklične analoge i osnovne analoge nukleozida kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiesterskih veza mogu biti zamenjene alternativnim grupama za povezivanje. Ove alternativne grupe za povezivanje uključuju, ali se ne ograničavaju na, primere izvođenja pri čemu je fosfat zamenjen sa P(O)S ("tioat"), P(S)S ("ditioat"), (O)NR2 ("amidat"), P(O)R, P(O)OR ', CO ili CH2 ("formacetal"), gde svaki R ili R' je nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C) izborno koji obuhvata etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu biti identične. Prethodni opis se odnosi na sve ovde navedene polinukleotide, uključujući RNK i DNK.
[0069] „Ćelija domaćin“ uključuje pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primalac vektora za ugradnju polinukleotidnih umetaka. Ćelije domaćini uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina, a potomci ne moraju nužno biti potpuno identični (u morfologiji ili u genomskom komplementu DNK) originalnoj parentalnoj ćeliji usled prirodne, slučajne ili namerne mutacije. Ćelija domaćin uključuje ćelije transficirane in vivo polinukleotidom(ima) prema ovom otkriću.
[0070] "Nosači" kako su upotrebljeni ovde uključuju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijente ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisare koji su im izloženi u dozama i koncentracijama koje se koriste. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni pH puferisani rastvor. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid niske molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su albumini u serumu, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećerni alkoholi, kao što je manitol ili sorbitol; kontrajoni koji stvaraju so, kao što je natrijum; i/ili nejonski surfaktanti kao što su TWEEN™, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS™.
[0071] Kako je upotrebljen ovde, termin "apoptoza" odnosi se na genom-usmereni postupak unutarćelijskog uništavanja ćelija. Apoptoza se razlikuje od nekroze; uključuje remećenje citoskeleta, citoplazmatsko skupljanje i kondenzaciju, ekspresiju fosfatidilserina na spoljnoj površini ćelijske membrane i bubrenja, što rezultuje stvaranjem vezikula vezanih za ćelijsku membranu ili apoptotičnih tela. Postupak se takođe naziva „programirana ćelijska smrt“. Tokom apoptoze primećuju se karakteristični fenomeni kao što su zakrivljene ćelijske površine, kondenzacija hromatina jedra, fragmentacija hromozomske DNK i gubitak funkcije
4
mitohondrija. Za otkrivanje apoptoze mogu se koristiti različite poznate tehnologije, kao što su bojenje ćelija aneksinom V, propidijum jodidom, analiza fragmentacije DNK i YO-PRO-1 (Invitrogen). . U nekim primerima izvođenja, može se koristiti bojenje sa aneksinom V i propidijum jodidom, a kombinovani procenti aneksin V+/PI+, aneksin V+/PI- i aneksin V-/PI+ populacija smatraju se mrtvim ćelijama.
[0072] Termin „oko“ kako je upotrebljen ovde odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost koja je lako poznata stručnjaku u ovoj tehničkoj oblasti. Pozivanje na „oko“ vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) primere izvođenja koja su usmerene na tu vrednost ili parametar sam po sebi.
[0073] Kako su upotrebljeni ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini „a“, „an“ i „the“ uključuju poyivanje na množinu, osim ako kontekst jasno ukazuje na drugačije. Na primer, pozivanje na „antitelo“ je upućivanje na jedno do mnogo antitela, kao što su molarne količine, i uključuje njihove ekvivalente poznate stručnjacima u ovoj tehnici, itd.
[0074] Podrazumeva se da aspekt i primeri izvođenja ovog otkrića koji su ovde opisani uključuju „koji sadrže“, „koji se sastoje“ i „koji se u suštini sastoje od“ aspekata i primera izvođenja.
Proteini sortilina
[0075] U jednom aspektu, ovo otkriće obezbeđuje izolovana (na primer, monoklonska) antitela koja se vezuju za epitop unutar proteina sortilina prema ovom otkriću. Proteini sortilina prema ovom otkriću uključuju, bez ograničenja, protein sortilina sisara, humani protein sortilina, protein sortilina miša i protein sortilina pacova.
[0076] Sortilin se različito naziva kao sortilin 1, sort1, 100 kDa NT receptor, glikoprotein 95 (GP95), receptor progranulina (PGRN-R) i receptor neurotenzin 3 (NT-3 ili NTR-3). Sortilin je protein od 831 aminokiseline koji kodira membranski receptor tipa I. Poznati su različiti homolozi sortilina, uključujući, bez ograničenja, humani sortilin, sortilin pacova i sortilin miša. Sekvenca aminokiselina humanog sortilina je prikazana u nastavku kao SEQ ID BR: 1 (sa ključnim ostacima aminokiselina za koje je predviđeno da učestvuju u vezivanju progranulina prikazano podebljano, a predviđena regija vezivanja pro-NGF podvučena):
[0077] Dodatno, sekvenca aminokiselina sortilina miša je navedena u SEQ ID BR: 2:
[0078] Dodatno, sekvenca aminokiselina sortilina pacova je navedena u SEQ ID BR: 3:
[0079] U nekim primerima izvođenja, sortilin je preprotein koji uključuje signalnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, sortilin je zreo protein. U nekim primerima izvođenja, zreli protein sortilin ne uključuje signalnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, zreli protein sortilin se eksprimira na ćeliji.
[0080] Proteini sortilina prema ovom otkriću uključuju nekoliko domena, uključujući bez ograničenja, signalnu sekvencu, propeptid, luminalni domen, Vps10p domen, 10 CC domen, transmembranski domen i citoplazmatski domen. Dodatno, proteini prema ovom otkrića su eksprimirani u visokim nivoima u brojnim tkivima, uključujući bez ograničenja, mozak, kičmenu moždinu, srce i skeletne mišiće, štitnu žlezdu, placentu i testise.
[0081]•Sortilin je član Vps10p familije receptora sortiranja, koji takođe uključuje, bez ograničenja, receptore povezane sa proteinima za sortiranje sa ponovcima tipa A (SorLA), CNS eksprimiranog 1 receptora povezanog sa sortilinom (SorCS1), CNS eksprimiranog 2 receptora povezanog sa sortilinom (SorCS2), i CNS eksprimiranog 3 receptora povezanog sa
4
sortilinom (SorCS3). Luminalni region sortilina poravnjava se sa svakim od dva luminalna domena kod Vps10p kvasca (domeni Vps10p). Obeležje domena Vps10p je amino-terminalni propeptid i karboksi-terminalni segment koji obuhvata 10 konzerviranih ostataka cisteina (10CC). Ostali receptori familije Vps10p dele domen Vps10p, koji se nalazi na aminoterminalnom kraju i obuhvata dodatne ektodomene.
[0082] Familija receptora za sortiranje Vps10p ima različite funkcije kako u nervnom sistemu, tako i u drugim sistemima. Pokazalo se da su receptori multifunkcionalni i da vezuju nekoliko različitih liganda, uključujući, bez ograničenja, progranulin (PGRN), pro-nervni faktor rasta (Pro-NGF), nervni faktor rasta (NGF), PCSK9, pro-neurotrofine, neurotrofine, pro -neurotrofin-3 (pro-NT3), pro-neurotrofin-4/5, pro neurotrofni faktor izveden iz mozga (Pro-BDNF), neurotrofni faktor izveden iz mozga (BDNF), neurotrofin-3 (NT3), neurotrofin-4/5, neurotenzin, p75NTR, propeptid sortilina (Sort-pro), protein prekursora amiloida (APP), lipoprotein lipazu (LpL), apolipoproteine, apolipoprotein AV (APOA5), apolipoprotein E (APOE 2, 3, 4), protein povezan sa receptorom (RAP) i elemente sistema aktivatora plazminogena; i uključivanje u unutarćelijsko sortiranje, endocitozu i transdukciju signala. Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću posreduju u brzoj endocitozi lipoprotein lipaze, neurotenzina i pro-oblika nervnog faktora rasta; i da ciljaju proteine za transport od Goldžija do kasnih endosoma. Nadalje, pokazalo se da proteini sortilina prema ovom otkriću formiraju kompleks sa p75 na ćelijskoj membrani i da su bitni za smrt neurona izazvanu pronervnim faktorom rasta (NGF). Nedavno je takođe pokazano da članovi familije receptora Vps10p stupaju u interakciju sa članovima familije neurotrofina, koja uključuje NGF, neurotrofni faktor izveden iz mozga, neurotrofin-3 i neurotrofin-4/5, ili oblik pro-domena neurotrofina. (pro-neurotrofin). Takođe se pokazalo da se proteini sortilina prema ovom otkriću vezuju i regulišu vanćelijske nivoe PCSK9, što određuje lipoproteinske receptore niske gustine za razgradnju u lizozomima, što rezultuje povećanjem nivoa LDL holesterola.
[0083] Shodno tome, kako je upotrebljen ovde, protein „sortilin“ prema ovom otkriću uključuje, bez ograničenja, protein sortilina sisara, protein humanog sortilina, protein sortilina primata, protein sortilina miša i protein sortilina pacova. Dodatno, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu vezati epitop unutar jednog ili više proteina sortilina sisara, humanog proteina sortilina, sortilina primata, proteina sortilina miša i proteina sortilina pacova.
Domeni proteina sortilina
[0084] Proteini sortilina prema ovom otkriću obuhvataju nekoliko domena, kao što je Vps10p domen koji obuhvata Asp-boks motiv, strukturu beta-propelera sa deset lopatica i hidrofobnu petlju; i 10 CC domen.
[0085] Kao što je ovde otkriveno, interakcije između proteina sortilina prema ovom otkriću i pro-neurotrofina ili neurotrofina posredovane su domenom Vps10p koji obuhvata strukturu beta-propelera sa deset lopatica i Asp-boks motiv. U određenim primerima izvođenja, proteini sortilina prema ovom otkriću obuhvataju Vps10p domen koji uključuje strukturu betapropelera sa deset lopatica i nalazi se unutar aminokiselinskih ostataka 78-611 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1) ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovara aminokiselinskim ostacima 78-611 SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinski ostaci 190-220 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1) ili aminokiselinski ostaci sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 190-220 SEQ ID BR: 1 nalaze se unutar Vps10p domena.
[0086] Vps10p domeni prema ovom otkriću mogu uključivati Asp-boks motiv. Kako su upotrebljeni ovde, Asp-boks motivi imaju sledeću sekvencu: (S/T)-X-(D/N)-X-X-X-X-(W/F/Y) (SEQ ID BR: 4), ili X-X-(S/T)-X-(D/N)-X-G-X-(T/S)-(W/F/Y)-X (SEQ ID BR: 5), gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu. U humanom sortilinu, Asp-boks motiv se nalazi na aminokiselinskim ostacima 200-207 (SSDFAKNF (SEQ ID BR:694)). Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, Asp-boks motiv se nalazi na aminokiselinskim ostacima 200-207 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1) ili aminokiselinskim ostacima sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 200-207 SEQ ID BR: 1.
[0087] Kao što je ovde otkriveno, interakcije između proteina sortilina prema ovom otkriću i p75 posredovane su domenom 10CC hidrofobne petlje domena Vps10p.
[0088] U određenim primerima izvođenja, proteini sortilina prema ovom otkriću obuhvataju domen 10CC koji se nalazi unutar aminokiselinskih ostataka 610-757 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1) ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 610 -757 SEQ ID BR: 1. U poželjnim primerima izvođenja, aminokiselinski ostaci 592-593, 610-660 i/ili 667-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1) ili aminokiselinski ostaci sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 592-593, 610-660 i/ili 667-749 SEQ ID BR: 1 nalaze se unutar 10CC domena sortilina.
4
[0089] U drugim primerima izvođenja, proteini sortilina prema ovom otkriću obuhvataju hidrofobnu petlju unutar domena Vps10p koja se nalazi unutar aminokiselinskih ostataka 130-141 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1) ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 130-141 SEQ ID BR: 1.
[0090] Kao što će stručnjak u ovoj oblasti smatrati, početni i krajnji ostaci domena prema ovom otkriću mogu varirati u zavisnosti od korišćenog programa za kompjutersko modelovanje ili postupka koji se koristi za određivanje domena.
Partneri za vezivanje sortilina
[0091] Proteini sortilina prema ovom otkriću mogu stupiti u interakciju sa (na primer, vezati se za) jednim ili više proteina uključujući, bez ograničenja, protein progranulin; neurotrofine, kao što su pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, neurotrofin-4/5, pro nervni faktor rasta (Pro-NGF), nervni faktor rasta (NGF), pro neurotrofni faktor izveden iz mozga (Pro-BDNF) i neurotrofni faktor izveden iz mozga (BDNF); neurotenzin, p75, lipoprotein lipaza (LpL), apolipoprotein AV (APOA5), apolipoprotein E (APOE), protein prekurzor amiloida, A beta peptid, PCSK9, p75NTR i protein povezan sa receptorom (RAP).
Progranulin
[0092] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) direktno sa progranulinom i posreduju u razgradnji progranulina (npr., Zheng, Y et al., (2011) PLoS ONE 6(6): e21023).
[0093] Progranulin se različito naziva kao PGRN, proepitelin, prekursor granulin-epitelin, faktor rasta isporučen iz ćelije PC (karcinoma prostate) (PCDGF) i akrogranin. Progranulin je protein od 593 aminokiseline koji kodira 68.5 kD izlučeni glikoprotein koji ima 7.5 ponovaka manjih motiva granulina (epitelina), u rasponu od 6-25 kDa, koji se mogu proteolitički odvojiti od prekursora PGRN. Primeri proizvoda cepanja progranulina uključuju, bez ograničenja, granulin A/Epitelin 1, granulin B/Epitelin 2, granulin C, granulin D, granulin E, granulin F, granulin G i bilo koje druge poznate proizvode peptida izvedenih iz progranulina.
4
[0094] Progranulin je široko eksprimiran, a u ne-neuronskim ćelijama povezan je sa raznim događajima, kao što su regulacija ćelijskog ciklusa i pokretljivost ćelija, saniranje rana, upala, indukcija faktora rasta, kao što je vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), i tumorigeneza. Progranulin je takođe široko eksprimiran u ranom razvoju neurona, ali u kasnijem razvoju postaje ograničen na definisane populacije neurona, kao što su kortikalni neuroni, piramidalni neurona hipokampusa i Purkinje-ove ćelije. Međutim, uloga progranulina u ćelijama neurona nije bila jasna sve dok se nije pokazalo da pacijenti koji pate od frontotemporalne demencije (FTD) nose mutacije u genu progranulina na hromozomu 17. Nakon toga se pokazalo da progranulin promoviše preživljavanje neurona i pojačava rast neurita u kortikalnim i motornim neuronima. Dakle, iako progranulin nije neurotrofin ili član familije neurotrofina, on se naziva neurotrofičnim faktorom zbog svoje sposobnosti da promoviše preživljavanje neurona.
[0095] Dalje, pokazano je da je haploinsuficijencija progranulina (koja uključuje preko 70 različitih mutacija, kao što je mutacija gubitka funkcije) povezana sa frontotemporalnom demencijom (FTD) sa patologijom TDP-43. Nadalje, nivo progranulina u plazmi se smanjuje kod pacijenata sa mutacijama FTD. Mutacije progranulina čine 25% familijarne FTD. Pored toga, niski nivoi progranulina se primećuju kod nekih pacijenata sa FTD bez mutacija progranulina, a nivoi progranulina se menjaju kod Alzheimer -ove bolesti i ALS. Prema tome, veruje se da progranulin može generalno biti uključen u degenerativne bolesti.
[0096] Takođe je pokazano da potpuni gubitak progranulina dovodi do fenotipa neuronske lipoidne fuscinoze (NPL). Shodno tome, veruje se da pojedinci sa različitim poremećajima skladištenja lizozoma mogu reagovati na povećane nivoe progranulina. Progranulin je široko eksprimiran, a u centralnom nervnom sistemu ga proizvode neuroni i mikroglija. Generalno se smatra da progranulin ima anti-inflamatornu ulogu u makrofagima i mikroglijama, i ulogu preživljavanja u neuronima.
[0097] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja povećavaju nivo progranulina, smanjuju nivo sortilina na površini ćelije i/ili blokiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina bila bi korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa smanjenim nivoom ekspresije i/ili aktivnosti progranulina, ćelijske smrti (npr. smrti neuronskih ćelija), frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotične vaskularne
4
bolesti, nepoželjnih simptoma normalnog starenja, demencije, mešovite demencije, Creutzfeldt-Jakob-sove bolesti, normalnog pritiska hidrocefalusa, amiotrofične lateralne skleroze, Huntington-ove bolesti, taupatijske bolesti, moždanog udara, akutne traume, hronične traume, lupusa, akutnog i hroničnog kolitisa, Crohn-ove bolesti, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, malarije, esencijalnog tremora, lupusa centralnog nervnog sistema, Behcet-ove bolesti, Parkinson-ove bolesti, demencije sa Lewy-jevim telima, višestruke sistemske atrofije, degeneracije intervertebralnog diska, Shy-Drager-ovog sindroma, progresivne supranuklearne paralize, kortikalne bazalne ganglionske degeneracije, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, granulomatoznog poremećaja, sarkoidozoma, bolesti starenja, makularne degeneracije povezane sa starenjem, glaukoma, pigmentoze retinitisa, degeneracije mrežnjače, infekcije respiratornog trakta, sepse, infekcije oka, sistemske infekcije, inflamatornih poremećajima, artritisa, multiple skleroze, metaboličkih poremećaja, gojaznosti, insulinske rezistencije, dijabetesa tipa 2, oštećenja tkiva ili krvnih sudova, povreda i/ili jednog ili više neželjenih simptoma normalnog starenja. Dodatno, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja povećavaju nivo progranulina, smanjuju nivo sortilina na površini ćelije i/ili blokiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina mogu inhibirati interakciju između sortilina i progranulina, mogu izazvati jedno ili više aktivnosti progranulina, mogu smanjiti endozomalnu internalizaciju progranulina ili njegovih fragmenata i/ili mogu povećati efektivnu koncentraciju progranulina.
[0098] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja povećavaju nivo progranulina, smanjuju nivo sortilina na površini ćelije i/ili blokiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina da se vežu za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja povećavaju nivo progranulina, smanjuju nivo sortilina na površini ćelije i/ili blokiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina da se vežu za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka
4
His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Neurotrofini
[0099] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) direktno sa pro-neurotrofinima (npr. pro-NGF), koji sadrže pro-domen i tipično su proapoptotični (npr. Andersen, OS et al. (2010) The Journal of Biological Chemistry, 285, 12210-12222). Takvi prekursori pro-NGF se oslobađaju tokom stresa, a pokazalo se da su proteini sortilina uključeni u regulisanje njihovog oslobađanja, kao i vezivanje za ćeliju primaoca. Ovo vezivanje može biti posredovano sa linearnim epitopom na sortilinu koji odgovara aminokiselinskim ostacima 163-174 SEQ ID BR: 1.
[0100] Neurotrofini su familija dimernih peptidnih hormonskih proteina koji indukuju preživljavanje, razvoj i funkciju neuronskih ćelija. Neurotrofini pripadaju klasi faktora rasta, koji su izlučeni proteini koji su sposobni da signaliziraju određenim ćelijama da prežive, diferenciraju se ili rastu. Faktori rasta kao što su neurotrofini koji promovišu preživljavanje neurona poznati su kao neurotrofni faktori. Neurotrofni faktori se izlučuju pomoću ciljnih tkiva i deluju sprečavajući povezani neuron da pokrene programiranu smrt ćelije. Neurotrofini takođe mogu indukovati diferencijaciju ćelija progenitora da bi se formirali neuroni. Neurotrofini prema ovom otkriću se sintetišu unutar ćelije kao proteini prekursori 30-35 kDa, koji obuhvataju signalni peptid i mesta glikozilacije. Tokom obrade proteini prekursori se takođe cepaju na dvobaznom mestu cepanja pomoću kalcijum-zavisnog serin proteaznog furina i drugih članova familije prohormonske konvertaze, unutar Goldžijevog aparata. N-terminalni deo ovog cepanja je zreli neurotrofin sa 118-120 aminokiselina i biološki aktivan
4
C-terminalni produkt od 12-14 kDa (Seidah et al, Biochem. J. (1996) 314:951-960). Kako je upotrebljen ovde, "neurotrofin" i "neurotrofni faktor" mogu se koristiti naizmenično. Neurotrofini prema ovom otkriću uključuju, bez ograničenja, strukturno povezane faktore nervnog faktor rasta (NGF), neurotrofni faktor izveden iz mozga (BDNF), neurotrofin-3 (NT-3) i neurotrofin-4 (NT-4). Kako je upotrebljen ovde, "pro-neurotrofin" se može odnositi na bilo koji pro-peptid iz familije neurotrofina, uključujući, bez ograničenja, pro-NGF, pro-BDNF, pro-neurotrofin-3 i pro-neurotrofin-4/5.
[0101] Pokazano je da pro-neurotrofini imaju patološku ulogu u starenju, napadima, distrofiji mrežnjače, traumatskim povredama mozga, povredama kičmene moždine i dugotrajnoj depresiji (npr., Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375–386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756 –7766 ; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49 –57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci.
28, 9870 –9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al. (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett.
429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; i Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491).
[0102] Nervni faktor rasta (NGF) je mali, izlučeni protein koji homodimerizuje i ugrađen je u veći kompleks. NGF ima aktivnost koja stimuliše rast nerva, a kompleks je uključen u regulaciju rasta, održavanje, preživljavanje i diferencijaciju simpatičkih i određenih senzornih neurona. Mutacije u NGF su povezane sa naslednom senzornom i autonomnom neuropatijom, tipa 5 (HSAN5), a disregulacija ekspresije NGF je povezana sa alergijskim rinitisom. Bez želje za vezivanjem za teoriju, takođe se veruje da pro-NGF može izazvati apoptozu i dugotrajnu depresiju.
[0103] Neurotrofni faktor izveden iz mozga (BDNF) je izlučeni protein indukovan kortikalnim neuronima i neophodan je za preživljavanje strijatnih neurona u mozgu. Ekspresija BDNF je smanjena i kod pacijenata sa Alzheimer-ovom i Huntington-ovom bolešću. BDNF može imati ulogu u regulaciji odgovora na stres i u biologiji poremećaja raspoloženja. Za ovaj gen je opisano više varijanti transkripta koje kodiraju različite izoforme. Bez želje za vezivanjem za teoriju, takođe se veruje da pro-BDNF može izazvati apoptozu i dugoročnu depresiju.
[0104] Neurotrofin-3 je izlučeni protein neophodan za preživljavanje i funkciju više neurona perifernog i centralnog nervnog sistema. Varijanta gena neurotrofin-3 povezana je sa teškim oblicima šizofrenije, a pro-neurotrofin-3 (pro-NT3) izaziva smrt simpatičkog neurona.
[0105] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu takođe da inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotrofina prema ovom pronalasku (npr., proneurotrofini). Takva antitela mogu biti korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa smanjenim nivoom ekspresije i/ili aktivnosti neurotrofina, ćelijske smrti (npr. smrti neuronskih ćelija), frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti, nepoželjnih simptoma normalnog starenja, demencije, mešovite demencije, Creutzfeldt-Jakob-sove bolesti, normalnog pritiska hidrocefalusa, amiotrofične lateralne skleroze, Huntington-ove bolesti, taupatijske bolesti, moždanog udara, akutne traume, hronične traume, lupusa, akutnog i hroničnog kolitisa, Crohn-ove bolesti, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, malarije, esencijalnog tremora, lupusa centralnog nervnog sistema, Behcet-ove bolesti, Parkinson-ove bolesti, demencije sa Lewy-jevim telima, višestruke sistemske atrofije, degeneracije intervertebralnog diska, Shy-Drager-ovog sindroma, progresivne supranuklearne paralize, kortikalne bazalne ganglionske degeneracije, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, granulomatoznih poremećaja, sarkoidoza, bolesti starenja, makularne degeneracije povezane sa starenjem, glaukoma, pigmentoze retinitisa, degeneracije mrežnjače, infekcije respiratornog trakta, sepse, infekcije oka, sistemske infekcije, inflamatornih poremećaja, artritisa, multiple skleroze, metaboličkog poremećaja, gojaznosti, insulinske rezistencije, dijabetesa tipa 2, oštećenja tkiva ili krvnih sudova, povreda i/ili jednog ili više neželjenih simptoma normalnog starenja. Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini) takođe mogu sprečiti ćelijsku smrt (npr. apoptozu) izazvanu proneurotrofinima.
[0106] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotrofina prema ovom otkriću vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749
1
humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotrofina prema ovom otkriću vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Neurotenzin
[0107] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću stupaju u interakciju (npr. vezuju se) sa neurotenzinom unutar strukture beta-propelera sortilina, a važan kontakt je prikazan na serinu 283 humanog sortilina (npr., Quistgaard, EM, et al. (2009) Nature Structural and Molecular Biology, 16 p96-98). Takođe se pokazalo da je ovaj ostatak važan za vezivanje progranulina. Mesto vezivanja neurotenzina nalazi se unutar centralno lociranog tunela strukture beta-propelera sortilina, dok je domen pro-neurotrofina na površini strukture betapropelera. Vezivanje pro-neurotrofina za sortilin delimično je inhibirano neurotenzinom, jer regioni za vezivanje nisu dosta udaljeni.
[0108] Neurotenzin je neuropeptid od 13 aminokiselina koji je uključen u regulaciju luteinizirajućeg hormona i oslobađanja prolaktina. Pokazalo se da neurotenzin ima značajnu interakciju sa dopaminergičkim sistemom. Neurotenzin se sintetiše kao deo prekursora proteina od 169-170 aminokiselina koji takođe obuhvata i srodni neuropeptid neuromedin N.
2
Domeni koji kodiraju peptide nalaze se u tandemu blizu karboksilnog terminalnog kraja prekursora i ograničeni su i odvojeni uparenim osnovnim aminokiselinama (lizin-arginin) mesta za obradu. Neurotenzin ima značajnu sličnost u sekvenci u svojim 6 C-terminalnim aminokiselinskim ostacima sa nekoliko drugih neuropeptida, uključujući neuromedin N. Ovaj C-terminalni region je odgovoran za potpunu biološku aktivnost, dok N-terminalni deo ima modularnu ulogu. U centralnom nervnom sistemu, neurotenzin ima dvostruku funkciju neuromodulatora prenosa dopamina i lučenja hormona prednje hipofize. Takođe pokazuje snažne hipotermičke i analgetske efekte na mozak. Neurotenzin je takođe uključen u patofiziologiju šizofrenije, Huntington-ove i Parkinson-ove bolesti. Takođe je pokazano da neurotenzin obezbeđuje neuroprotekciju u eksperimentalnim modelima cerebralne ishemije.
[0109] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu takođe da inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotenzina. Takva antitela mogu biti korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa smanjenim nivoom ekspresije i/ili aktivnosti neurotenzina, ćelijske smrti (npr. smrti neuronskih ćelija), frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti i/ili nepoželjenih simptoma normalnog starenja.
[0110] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotenzina vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i neurotenzina vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Receptor nervnog faktora rasta sa niskim afinitetom (p75)
[0111] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa receptorom nervnog faktora rasta (NGF) sa niskim afinitetom (p75) unutar 10CC domena sortilina ili hidrofobne petlje Vps10p domena sortilina. Kao što je ovde otkriveno, proteini sortilina prema ovom otkriću mogu da funkcionišu kao ko-receptor sa p75 za proneurotrofine, koji indukuju apoptotičku signalizaciju.
[0112] NGF receptor sa niskim afinitetom se različito naziva p75, p75 neurotrofinski receptor, p75 NGF receptor, p75<NTR>, LNGFR, NGFR, CD271, Gp80-LNGFR i TNFRSF16 i p75<NTR>. P75 je jedan od dva tipa receptora za neurotrofine prema ovom otkriću. Pokazano je da se P75 vezuje i služi kao „mesto potapanja“ za neurotrofine. Takođe je pokazano, međutim, da u odsustvu ko-eksprimiranog TrkA (drugog tipa receptora za neurotrofine), p75 može izazvati ćelijsku smrt (npr. apoptozu) u ćelijama. Kao takvi i bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da blokiranje interakcije između sortilina i p75 smanjuje proizvodnju signala ćelijske smrti zavisnog od p75 imunogene ćelijske smrti.
[0113] Tako bi inhibiranje interakcije (npr. vezivanje) sortilina za p75 smanjilo efektivnu koncentraciju pro-neurotrofina, a time i rezultujuću smrt neuronskih ćelija.
[0114] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu takođe da inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i p75. Takva antitela mogu biti korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa smanjenim nivoom ekspresije i/ili aktivnosti p75, ćelijske smrti (npr. smrti neuronskih ćelija), frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti i/ili nepoželjenih simptoma normalnog starenja. Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i p75 takođe
4
bi smanjila efektivne koncentracije pro-neurotrofina potrebne za apoptotičku signalizaciju pomoću p75, smanjila internalizaciju p75 ili njegovih fragmenata, namenjenih za endozome, smanjila proizvodnju signala ćelijske smrti zavisne od p75 imunogene ćelijske smrti u ćelijama, i sprečila ćelijsku smrt (npr. apoptozu) izazvanu pomoću p75.
[0115] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i p75 vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i p75 vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Prekursor proteina amiloida (APP)
[0116] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa prekursorom proteina amiloida (APP). Kao što je ovde otkriveno, proteini sortilina prema ovom otkriću mogu da funkcionišu tako da promene subćelijsku lokalizaciju APP i povećaju njegovu preradu u A-beta peptide i unutarćelijske fragmente koji su povezani sa Alzheimerovom bolešću.
[0117] Prekursorski protein amiloida (APP) je integralni membranski protein koji se eksprimira u mnogim tkivima i koncentriše u sinapsama neurona. Njegova primarna funkcija nije poznata, iako je uključen kao regulator stvaranja sinapsi, neuronske plastičnosti i izvoza gvožđa. APP je najpoznatiji kao prekursorski molekul čija proteoliza stvara beta amiloid (Aβ), peptid od 37 do 49 aminokiselina čiji je oblik amiloidne fibrile primarna komponenta amiloidnih plakova koji se nalaze u mozgu pacijenata sa Alzheimer-ovom bolešću.
[0118] Tako bi inhibiranje interakcije (npr. vezivanja) sortilina za APP povećalo efektivnu koncentraciju pro-neurotrofina. Štaviše, blokiranje interakcije između sortilina i APP dovelo bi do smanjene endozomske internalizacije APP i njegove obrade u A beta peptid.
[0119] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću takođe mogu inhibirati (npr. blokirati) interakciju između sortilina i APP. Takva antitela bi bila korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa abnormalnim nivoima ili obradom ekspresije i/ili aktivnosti APP, ćelijske smrti (na primer, smrt neuronskih ćelija), frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti i/ili nepoželjenih simptoma normalnog starenja.
[0120] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i APP vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i APP vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Lipoprotein lipaza
[0121] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa lipoproteinom lipazom (LpL). Kao što je ovde otkriveno, proteini sortilina prema ovom otkriću vezuju se i modifikuju razgradnju LpL.
[0122] Lipoprotein lipaza je enzim koji se luči i ima EC 3.1.1.34 aktivnost. Lipoprotein lipaza je član familije gena lipaze, koja uključuje lipazu pankreasa, lipazu jetre i lipazu endotela. To je enzim rastvorljiv u vodi koji hidrolizuje trigliceride u lipoproteinima, kao što su oni koji se nalaze u hilomikronima i lipoproteinima veoma niske gustine (VLDL), u dve slobodne masne kiseline i jedanom molekulu monoacilglicerola. Lipoprotein lipaza je takođe uključen u podsticanje ćelijskog preuzimanja ostataka hilomikrona, lipoproteina bogatih holesterolom i slobodnih masnih kiselina. Lipoprotein lipaza je vezana za luminalnu površinu endotelnih ćelija u kapilarama, a najrasprostranjenija je u masnom tkivu, srcu i skeletnom mišićnom tkivu. Lipoprotein lipaza se izlučuje iz parenhimskih ćelija kao glikozilirani homodimer, a zatim se translocira kroz vanćelijski matriks i preko endotelnih ćelija u kapilarni lumen.
[0123] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu takođe inhibirati (npr. blokirati) interakciju između sortilina i lipoprotein lipaze. Takva antitela bi bila korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa smanjenjem nivoa ekspresije i/ili aktivnosti lipoprotein lipaze, vaskularne demencije i/ili aterosklerotičnih vaskularnih bolesti.
[0124] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i lipoprotein lipase vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i lipoprotein lipase vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Apolipoprotein AV
[0125] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa apolipoproteinom AV (APOA5). Kao što je ovde otkriveno, proteini sortilina prema ovom otkriću vezuju se i modifikuju razgradnju APOA5.
[0126] Apolipoprotein AV se različito naziva apolipoprotein A-V, APOA5, APOAV i RAP3. Apolipoprotein AV je važan regulator nivoa triglicerida u plazmi, što je glavni faktor rizika za aterosklerotične vaskularne bolesti, kao što su bolesti koronarnih arterija. On je komponenta nekoliko lipoproteinskih frakcija uključujući VLDL, HDL i hilomikrone. Apolipoprotein AV može uticati na metabolizam lipoproteina interakcijom sa receptorima familije LDL-R gena.
[0127] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću takođe mogu inhibirati (npr. blokirati) interakciju između sortilina i apolipoproteina AV. Takva antitela bi bila korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa abnormalnim nivoima ekspresije i/ili aktivnosti apolipoproteina AV, vaskularne demencije i/ili aterosklerotičnih vaskularnih bolesti.
[0128] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i apolipoproteina AV vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i apolipoproteina AV vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Apolipoprotein E
[0129] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa apolipoproteinom E (APOE2, APOE3, APOE4). Kao što je ovde otkriveno, proteini sortilina prema ovom otkriću vezuju se i modifikuju razgradnju i transport APOE, kao i sredstva koja APOE nosi, kao što je A beta peptid.
[0130] Apolipoprotein E (APOE) je klasa apolipoproteina koji se nalazi u hilomikronu i lipoproteinu srednje gustine (IDLs) koji je neophodan za normalan katabolizam sastojaka lipoproteina bogatih trigliceridima. U perifernim tkivima, APOE prvenstveno proizvodi jetra i makrofagi i posreduje metabolizam holesterola na način koji zavisi od izoforme. U centralnom nervnom sistemu APOE uglavnom proizvode astrociti i transportuju holesterol do neurona preko ApoE receptora, koji su članovi familije gena za lipoproteinske receptore niske gustine. Varijante APOE povezane su sa povećanim rizikom od Alzheimer-ove bolesti i kardiovaskularnih poremećaja, kao i sa oštećenjem krvno -moždanske barijere. Takođe je pokazano da APOE transportuje A beta peptid u neurone preko receptora sortilina.
[0131] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću takođe mogu inhibirati (npr. blokirati) interakciju između sortilina i apolipoproteina E. Takva antitela bi bila korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa abnormalnim nivoima ekspresije i/ili aktivnosti apolipoproteina E, vaskularne demencije i/ili aterosklerotičnih vaskularnih bolesti.
[0132] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i apolipoproteina E vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i apolipoprotein E vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Protein povezan sa receptorom
[0133] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa proteinom povezanim sa receptorom (RAP).
[0134] Protein povezan sa receptorom se različito naziva RAP, protein 1 povezan sa proteinima povezanim sa lipoproteinskim receptorima niske gustine, LRPAP1, A2MRAP, A2RAP, HBP44 i MRAP. Protein povezan sa receptorom je protein šaperon uključen u promet određenih članova familije LDL receptora, uključujući, bez ograničenja, LRP1 i LRP2. Protein povezan sa receptorom je glikoprotein koji se vezuje za receptor alfa-2-makroglobulina, kao i za druge članove familije receptora lipoproteina niske gustine. On deluje tako što inhibira vezivanje svih poznatih liganda za takve receptore i može sprečiti agregaciju i razgradnju receptora u endoplazmatskom retikulumu, delujući tako kao molekularni šaperon. Protein povezan sa receptorom takođe može biti pod regulatornom kontrolom kalmodulina.
[0135] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću takođe mogu inhibirati (npr. blokirati) interakciju između sortilina i RAP. Takva antitela bi bila korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa smanjenim nivoima ekspresije i/ili aktivnosti RAP, vaskularne demencije i/ili aterosklerotičnih vaskularnih bolesti.
[0136] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i RAP vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i RAP vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203,
1
Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
PCSK9
[0137] Pokazano je da proteini sortilina prema ovom otkriću interaguju (npr. vezuju se) sa proprotein konvertazom subtilisin/keksin tipa 9 (PCSK9) i izlučuju ga u cirkulaciju.
[0138] PCSK9 je član subfamilije proteinaze K sekretornih proteaza. PCSK9 ima važnu regulatornu ulogu u homeostazi holesterola. Vezuje se za lipoproteinske receptore niske gustine (LDLR), izazivajući razgradnju LDLR i smanjenje sposobnosti LDLR da uklanja holesterol, što može dovesti do hiperholesterolemije.
[0139] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću takođe mogu inhibirati (npr. blokirati) interakciju između sortilina i PCSK9 i sekreciju PCSK9. Takva antitela bi bila korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje stanja i/ili bolesti povezanih sa povećanjem nivoa ekspresije i/ili aktivnosti PCSK9, vaskularne demencije i/ili aterosklerotičnih vaskularnih bolesti.
[0140] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i PCSK9 vezuju jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138, 175-181, 190-220, 199-220, 190-211, 196-207, 196-199,
2
200-207, 203-207, 207-231, 207-227, 212-221, 233-243, 237-247, 237-260, 297-317, 314-338, 367-391, 429-443, 623-632, i/ili 740-749 SEQ ID BR: 1. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju (npr. blokiraju) interakciju između sortilina i PCSK9 vezuju jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka sortilina sisara koji odgovaraju jednom ili većem broju aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1.
Antitela protiv sortilina
[0141] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu inhibirati jednu ili više aktivnosti proteina sortilina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, povećanje nivoa progranulina (npr. vanćelijski nivoi progranulina i/ili ćelijski nivoi progranulina), smanjenje ćelijskog nivoa sortilina (npr. nivoi sortilina na površini ćelije, unutarćelijski nivoi sortilina i/ili ukupni nivoi sortilina), koji inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) sa progranulinom i/ili inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) sa jednim ili više pro-neurotrofina prema ovom otkriću (proneurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, itd.), neurotrofini prema ovom otkriću (neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzin, p75, propeptid sortilina (sort-pro), prekursor proteina amiloida (APP), A beta peptid, lipoprotein lipaza (LpL), apolipoprotein AV (APOA5), apolipoprotein E (APOE), i protein povezan sa receptorom (RAP), smanjuje lučenje PCSK9, smanjuje produkciju beta amiloid peptida.
[0142] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću povećavaju vanćelijske nivoe progranulina i/ili ćelijske nivoe progranulina in vitro ili in vivo (npr. u mozgu, krvi i/ili perifernim organima pojedinca). Kako je upotrebljeno ovde, antitelo protiv sortilina povećava vanćelijske nivoe progranulina ako indukuje povećanje od 20% ili više u vanćelijskim nivoima progranulina, mereno bilo kojim in vitro analizama zasnovanim na ćelijama ili zasnovanih na tkivu (kao što je zasnovana na moždanom tkivu) opisanih ovde ili poznatih u tehnici. Kako je upotrebljeno ovde, antitelo protiv sortilina povećava ćelijske nivoe progranulina ako indukuje povećanje od 20% ili više u ćelijskim nivoima progranulina, mereno bilo kojim in vitro analizama zasnovanim na ćelijama ili tkivu (kao što zasnovana na moždanom tkivu) opisanih ovde ili poznatih u tehnici.
[0143] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću smanjuju ćelijske nivoe sortilina in vitro ili in vivo (npr. u mozgu i/ili perifernim organima pojedinca). U nekim primerima izvođenja, smanjenje ćelijskog nivoa sortilina sadrži smanjenje nivoa sortilina na površini ćelije. Kako je upotrebljeno ovde, antitelo protiv sortilina smanjuje nivo sortilina na površini ćelije ako izazove smanjenje nivoa sortilina na površini ćelije za 20% ili više, mereno bilo kojom in vitro analizom zasnovanom na ćeliji ili odgovarajućim in vivo modelom koji je ovde opisan ili je poznat u tehnici. U nekim primerima izvođenja, smanjenje ćelijskog nivoa sortilina sardrži smanjenje unutarćelijskog nivoa sortilina. Kako je upotrebljeno ovde, antitelo protiv sortilina smanjuje unutarćelijske nivoe sortilina ako indukuje smanjenje od 20% ili više u unutarćelijskim nivoima sortilina, mereno bilo kojom in vitro analizom zasnovanom na ćelijama ili pogodnim in vivo modelom opisanim ovde ili poznatim u tehnici. U nekim primerima izvođenja, smanjenje ćelijskog nivoa sortilina sadrži smanjenje ukupnih nivoa sortilina. Kako je upotrebljeno ovde, antitelo protiv sortilina smanjuje ukupne nivoe sortilina ako izazove smanjenje ukupnih nivoa sortilina za 20% ili više, mereno bilo kojom in vitro analizom zasnovanom na ćeliji ili pogodnim in vivo modelom koji je ovde opisan ili je poznat u tehnici.
[0144] U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću povećavaju nivoe progranulina i/ili smanjuju ćelijske nivoe sortilina bez inhibiranja interakcije (npr. vezivanja) između sortilina i progranulina. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću ne inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina. Kako je upotrebljeno ovde, antitelo protiv sortilina ne inhibira interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina ako smanji vezivanje progranulina za sortilin za 20% ili manje pri koncentracijama zasićenih antitela (npr.67 nM)
4
bilo kojom in vitro analizom ili analizom kulture zasnovane na ćelijama ovde opisanih ili poznatih u tehnici.
[0145] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu smanjiti ćelijske nivoe sortilina (npr. nivoe sortilina na površini ćelije, unutarćelijske nivoe sortilina i/ili ukupne nivoe sortilina) indukovanjem razgradnje sortilina. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću indukuju razgradnju sortilina.
[0146] Kako su upotrebljeni ovde, nivoi progranulina mogu se odnositi na nivoe ekspresije gena koji kodira progranulin; na nivoe ekspresije jednog ili više transkripata koji kodiraju progranulin; na nivoe ekspresije proteina progranulina; i/ili na količinu proteina progranulina izlučenog iz ćelija i/ili prisutnog u ćelijama. Kako su upotrebljeni ovde, nivoi sortilina mogu se odnositi na nivoe ekspresije gena koji kodira sortilin; na nivoe ekspresije jednog ili više transkripata koji kodiraju sortilin; na nivoe ekspresije proteina sortilina; i/ili na količinu proteina sortilina prisutnog u ćelijama i/ili na površini ćelije. Za utvrđivanje nivoa progranulina i sortilina mogu se koristiti bilo koji postupci poznati u tehnici za merenje nivoa ekspresije gena, transkripcije, translacije i/ili zastupljenosti ili lokalizovanosti proteina.
[0147] Shodno tome, antitela protiv sortilina prema ovom pronalasku mogu biti korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje ćelijske smrti (npr. smrti neuronskih ćelija), frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti, nepoželjnih simptoma normalnog starenja, demencije, mešovite demencije, Creutzfeldt-Jakob-sove bolesti, normalnog pritiska hidrocefalusa, amiotrofične lateralne skleroze, Huntington-ove bolesti, taupatijske bolesti, moždanog udara, akutne traume, hronične traume, lupusa, akutnog i hroničnog kolitisa, Crohn-ove bolesti, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, malarije, esencijalnog tremora, lupusa centralnog nervnog sistema, Behcet-ove bolesti, Parkinson-ove bolesti, demencije sa Lewyjevim telima, višestruke sistemske atrofije, degeneracije intervertebralnog diska, Shy-Dragerovog sindroma, progresivne supranuklearne paralize, kortikalne bazalne ganglionske degeneracije, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, granulomatoznih poremećaja, sarkoidoze, bolesti starenja, makularne degeneracije povezane sa starenjem, glaukoma, pigmentoze retinitisa, degeneracije mrežnjače, infekcije respiratornog trakta, sepse, infekcije oka, sistemske infekcije, inflamatornih poremećaja, artritisa, multiple skleroze, metaboličkih poremećaja, gojaznosti, insulinske rezistencije, dijabetesa tipa 2, oštećenja tkiva ili krvnih sudova, povrede i/ili jednog ili više neželjenih simptoma normalnog starenja. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom pronalasku su monoklonska antitela.
[0148] Određeni aspekti ovog otkrića obezbeđuju antitela protiv sortilina koja vezuju prekinuti epitop sortilina. U nekim primerima izvođenja, prekinuti epitop sortilina sadrži dva ili više peptida, tri ili više peptida, četiri ili više peptida, pet ili više peptida, šest ili više peptida, sedam ili više peptida, osam ili više peptida, devet ili više peptida, ili 10 ili više peptida. U nekim primerima izvođenja, svaki od peptida sadrži pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, 10 ili više, 11 ili više, 12 ili više, 13 ili više 14 ili više, 15 ili više, 16 ili više, 17 ili više, 18 ili više, 19 ili više, 20 ili više, 21 ili više, 22 ili više, 23 ili više, 24 ili više, 25 ili više, 26 ili više, 27 ili više, 28 ili više, 29 ili više, ili 30 ili više aminokiselinskih ostataka sekvence aminokiselina SEQ ID BR: 1; ili pet ili više, šest ili više, sedam ili više, osam ili više, devet ili više, 10 ili više, 11 ili više, 12 ili više, 13 ili više 14 ili više, 15 ili više, 16 ili više, 17 ili više, 18 ili više, 19 ili više, 20 ili više, 21 ili više, 22 ili više, 23 ili više, 24 ili više, 25 ili više, 26 ili više, 27 ili više, 28 ili više, 29 ili više, ili 30 ili više aminokiselinskih ostataka na proteinu sortilina sisara koji odgovara sekvenci aminokiselina SEQ ID BR: 1. Drugi aspekti ovog otkrića obezbeđuju antitela protiv sortilina koja se vezuju za konformacioni epitop sortilina.
[0149] Određeni aspekti ovog otkrića obezbeđuju antitela protiv sortilina koja se vezuju za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 131-138 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 131-138 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 175-181 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 175-181 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 207-231 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 207-231 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 207-227 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 207-227 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 207-227 i 237-260 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 207-227 i 237-260 iz SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 212-221 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 212-221 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 233-243 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 233-243 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 237-247 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-247 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 237-247 i 314-338 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-247 i 314-338 iz SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 237-260 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-260 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 237-260 i 297-317 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-260 i 297-317 iz SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 297-317 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 297-317 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 314-338 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 314-338 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 367-391 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 367-391 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 429-443 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 429-443 SEQ ID BR: 1; jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 623-632 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 623-632 SEQ ID BR: 1; i/ili jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 740-749 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 740-749 SEQ ID BR: 1.
[0150] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 190-220 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 190-220 SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina vezuju se za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 199-220, 190- 211, 196-207, 196-199, 200-207 i/ili 203-207 humanog sortilina; ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 199-220, 190-211, 196-207, 196-199, 200-207 i/ili 203-207 SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina se vezuju za jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili ostataka aminokiselina na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1. Drugi aspekti ovog otkrića obezbeđuju antitela protiv sortilina koja se vezuju za epitop koji ima aminokiselinske ostatke (S/T)-X-(D/N)-X-X-X-X-(W/F/Y), gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu (SEQ ID BR: 4).
[0151] U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću povećavaju vanćelijske nivoe progranulina, povećavaju ćelijske nivoe progranulina i/ili smanjuju nivoe sortilina na površine ćelije. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina i inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina i povećavaju ćelijske nivoe progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju ćelijske nivoe progranulina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina i povećavaju ćelijske nivoe progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju nivoe progranulina in vivo. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju nivoe progranulina in vivo bez smanjenja ćelijskih nivoa sortilina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju nivoe progranulina u mozgu. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju ćelijske nivoe progranulina u krvi. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju ćelijske nivoe progranulina u jednom ili više perifernih organa. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina in vivo. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina u mozgu. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina u jednom ili više perifernih organa. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina i ne smanjuju ćelijske nivoe sortilina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju ćelijske nivoe progranulina i ne smanjuju ćelijske nivoe sortilina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju vanćelijske nivoe progranulina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju vanćelijske nivoe progranulina i inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina i inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju ćelijske nivoe progranulina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju ćelijske nivoe progranulina i inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina, povećavaju ćelijske nivoe progranulina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina, inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina i ne povećavaju ćelijske nivoe progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju ćelijske nivoe progranulina, inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina i ne povećavaju vanćelijske nivoe progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju ćelijske nivoe progranulina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina, inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina i ne smanjuju ćelijske nivoe sortilina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina, ne povećavaju ćelijske nivoe progranulina i ne inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju ćelijske nivoe sortilina, povećavaju ćelijske nivoe progranulina, povećavaju vanćelijske nivoe progranulina i inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina. Vanćelijski nivoi progranulina, ćelijski nivoi progranulina, nivoi sortilina na površini ćelije ili oba mogu se meriti bilo kojom analizom baziranom na ćelijama poznatiom u tehnici i/ili ovde otkrivenom. U određenim primerima izvođenja, vanćelijski nivoi progranulina, nivoi sortilina na površini ćelije ili oba mogu se meriti korišćenjem analize ćelija in vitro. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina takođe inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i progranulina. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina takođe inhibiraju transport i sekreciju PCSK9. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina takođe inhibiraju proizvodnju beta amiloidnog peptida. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina takođe inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i pro-nervnog faktora rasta (pro-NGF). U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina takođe inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između sortilina i jednog ili više proteina odabranih od pro-neurotrofina, neurotrofina, nervnog faktora rasta (NGF), pro neurotrofičnog faktora izvedenog iz mozga (pro -BDNF), neurotrofičnog faktor izvedenog iz mozga (BDNF), proneurotrofina-3, neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, neurotenzina, neurotenzina, , p75, propeptida sortilina (Sort-pro) , prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9 i proteina povezanog sa receptorima (RAP).
[0152] Drugi aspekti ovog otkrića obezbeđuju antitela protiv sortilina koja se vezuju za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 130-141 ili 592-757 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 130-141 ili 592-757 SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina vezuju se za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 610- 666, 592-593 i/ili 667-749 humanog sortilina; ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 610-666, 592-593 i/ili 667-749 SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina vezuju se za jednu ili više aminokiselina unutar aminokiselinskih ostataka 130-141 humanog sortilina; ili unutar aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima 130-141 SEQ ID BR: 1. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina vezuju se za jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i jednog ili više proteina odabranih od progranulina, proneurotrofina, neurotrofina, pro-neurotrofina-3, neurotrofina-3 , pro-neurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, pro nervnog faktor rasta (pro-NGF), nervnog faktora rasta (NGF), pro neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (pro-BDNF), neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoprotein E (APOE), PCSK9 i proteina povezanog sa receptorima (RAP), i/ili varijanti koje se javljaju u prirodi. Poželjno je da antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i p75.
[0153] Drugi aspekti ovog otkrića obezbeđuju antitela protiv sortilina koja se vezuju za epitop koji ima jednu ili više aminokiselina aminokiselinskih ostataka His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260,
1
Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1); ili aminokiselinskih ostataka na sortilinu sisara koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima His131, Val132, Pro133, Leu134, Val135, Ile136, Met137, Thr138, Arg196, Phe198, Arg199, Phe203, Lys205, Phe207, Thr210, Thr218, Tyr222, Ser223, Ser227, Ser242, Lys243, Lys248, Lys254, Lys260, Ser305, Phe306, Gly307, Arg311, Phe314, Ser316, Arg325, Arg326, Ile327, Phe350,Tyr351, Ser352, Ile353, Asn373, Ser379, Arg382, Tyr386, Ser595, i/ili Glu700 SEQ ID BR: 1. U određenim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i jednog ili više proteina odabranih od progranulina, pro-neurotrofina, neurotrofina, pro-neurotrofina-3, neurotrofina- 3, pro-neurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, pro nervnog faktora rasta (pro-NGF), nervnog faktor rasta (NGF), pro neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (pro-BDNF), neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9, i proteina povezanog sa receptorima (RAP). Poželjno je da antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i progranulina. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina indukuju jednu ili više aktivnosti progranulina. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina smanjuju endozomalnu internalizaciju progranulina ili njegovih fragmenata. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina povećavaju efektivnu koncentraciju progranulina.
[0154] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i neurotrofina prema ovom otkriću, kao što su pro-neurotrofin, pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin- 4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF i BDNF. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i neurotenzina. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i p75. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i Sort-pro. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i APP. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju proizvodnju A beta
2
peptida. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju transport i sekreciju PCSK9. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i LpL. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i APOA5. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i APOE. U drugim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina prema ovom otkriću i RAP.
[0155] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za protein sortilina prema ovom otkriću i/ili prirodnim varijantama. U određenim poželjnim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina vezuju se za humani sortilin.
[0156] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za protein sortilina prema ovom otkriću eksprimiranog na površini ćelije, a gola antitela inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina i progranulina, proneurotrofina, neurotrofina, pro-neurotrofina-3, neurotrofina- 3, pro-neurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, pro nervnog faktora rasta (pro-NGF), nervnog faktor rasta (NGF), pro neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (pro-BDNF), neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9, i proteina povezanog sa receptorima (RAP).
[0157] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za protein sortilina prema ovom otkriću inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina i progranulina, pro-neurotrofina, neurotrofina, pro-neurotrofina-3, neurotrofina- 3, pro-neurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, pro nervnog faktora rasta (pro-NGF), nervnog faktor rasta (NGF), pro neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (pro-BDNF), neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9, i proteina povezanog sa receptorima (RAP) smanjenjem efikasnih nivoa sortilina koji su dostupni za interakciju sa ovim proteinima bilo na površini ćelije ili unutar ćelije.
[0158] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za protein sortilina prema ovom otkriću inhibiraju interakciju (npr. vezivanje) između proteina sortilina i progranulina, pro-neurotrofina, neurotrofina, pro-neurotrofina-3, neurotrofina- 3, pro-neurotrofina-4/5, neurotrofina-4/5, pro nervnog faktora rasta (pro-NGF), nervnog faktor rasta (NGF), pro neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (pro-BDNF), neurotrofičkog faktora izvedenog iz mozga (BDNF), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9, i proteina povezanog sa receptorima (RAP) indukovanjem razgradnje sortilina.
[0159] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću kompetitivno inhibiraju vezivanje najmanje jednog antitela odabranog od bilo kog od antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću kompetitivno inhibiraju vezivanje najmanje jednog antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću su u kompeticiji sa jednim ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6,
4
S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koje njihove kombinacije, za vezivanje za sortilin kada antitelo protiv sortilina smanjuje vezivanje jednog ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koja njihova kombinacija sa sortilinom u količini koja je u opsegu od oko 50% do 100%, u poređenju sa vezivanjem za sortilin u odsustvu antitela protiv sortilina. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću je u kompeticiji sa jednim ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin kada antitelo protiv sortilina smanjuje vezivanje jednog ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koju njihovu kombinaciju sa sortilinom za najmanje 50%, najmanje 55%, za najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, pri najmanje 90%, najmanje 95%ili 100%, u poređenju sa vezivanjem za sortilin u odsustvu antitela protiv sortilina. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću koje smanjuje vezivanje jednog ili više antitela odabrano je od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koja njihova kombinacija sa sortilinom za 100% ukazuje da esencijalno antitelo protiv sortilina potpuno blokira vezivanje jednog ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koju njihovu kombinaciju sa sortilinom. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina i jedno ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koja njihova kombinacija prisutna je u količini koja odgovara odnosu 10:1, odnosu 9:1, odnosu 8:1, odnosu 7:1, odnosu 6:1, odnosu 5:1, odnosu 4:1, odnosu 3:1, odnosu 2:1, odnosu 1:1, odnosu 0.75:1, odnosu 0.5:1, odnosu 0.25:1, odnosu 0.1:1, odnosu 0.075:1, odnosu 0.050:1, odnosu 0.025:1, odnosu 0.01:1, odnosu 0.0075: , odnosu 0.0050:1, odnosu 0.0025:1, odnosu 0.001:, odnosu 0.00075:1, odnosu 0.00050:1, odnosu 0.00025:1, odnosu 0.0001:, odnosu 1:10, odnosu 1:9, odnosu 1:8, odnosu 1:7, odnosu 1:6, odnosu 1:5, odnosu 1:4, odnosu 1:3, odnosu 1:2, odnosu 1:0.75, odnosu 1:0.5, odnosu 1:0.25, odnosu 1:0.1, odnosu 1:0.075, odnosu 1:0.050, odnosu 1:0.025, odnosu 1:0.01, odnosu 1:0.0075, odnosu 1:0.0050, odnosu 1:0.0025, odnosu 1:0.001, odnosu 1:0.00075, odnosu 1:0.00050, odnosu 1:0.00025, ili odnosu 1:0.0001 antitela protiv sortilina na jedno ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je prisutno u višku u količini koja je u opsegu od oko 1.5 puta do 100 puta, ili više od 100 puta u poređenju sa količinom jednog ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je prisutno u količini koja je oko 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 25 puta, 30 puta, 35 puta, 40 puta, 45 puta, 50 puta, 55 puta, 60 puta, 65 puta, 70 puta, 75 puta, 80 puta, 85 puta, 90 puta, 95 puta ili 100 puta u višku u odnosu na količinu jednog ili više antitela odabranih iz S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koju njihovu kombinaciju.
[0160] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za epitop humanog sortilina koji je isti ili se preklapa sa epitopom sortilina vezanog za najmanje jedno antitelo odabrano od bilo kog antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za epitop humanog sortilina koji je isti ili se preklapa sa epitopom sortilina vezanog za najmanje jedno antitelo odabrano od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću vezuju se u suštini za isti epitop sortilina povezan za najmanje jedno antitelo izabrano od bilo kog antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću vezuju se u suštini za isti epitop sortilina povezan za najmanje jedno antitelo odabrano od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. Detaljni ogledni primeri postupaka za mapiranje epitopa na koji se vezuje antitelo su obezbeđeni u Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0161] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-6, S-8, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-72, S-83, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-5, S-45, S-64, S-65, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-5, S-30, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1,
1
S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-28, S-29, S-53, S-56, S-82, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-1, S-3, S-4, S-6, S-7, S-9, S-10, S-11, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-23, S-26, S-27, S-31, S-32, S-38, S-46, S-48, S-51, S-52, S-54, S-55, S57, S-58, S-59, S-61, S-62, S-68, S-69, S-70, S-71, S-73, S-74, S-75, S-77, S-79, S-80, S-85, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-5, S-12, S-24, S-25, S-30, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-47, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-72, S-76, S-78, S-81, S-83, S-84, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-8, S-49, S-50 i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću u kompeticiji su sa jednim ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5,
2
S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin.
[0162] Bilo koja odgovarajuća analiza kompeticije ili analiza vezivanja sortilina poznata u tehnici, kao što su BIAcore analiza, ELISA analize ili protočna citometrija, mogu se koristiti za utvrđivanje da li je antitelo protiv sortilina u kompeticiji sa jednim ili više antitela odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, S-85, i bilo koje njihove kombinacije za vezivanje za sortilin. U oglednoj analizi kompeticije, imobilizovani sortilin ili ćelije koje eksprimiraju sortilin na površini ćelije se inkubiraju u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za sortilin (npr., ljudi ili ne-humanih primata) i drugo neobeleženo antitelo na koje se ispituje njegova sposobnost da bude u kompeticiji sa prvim antitelom za vezivanje za sortilin. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilizovani sortilin ili ćelije koje eksprimiraju sortilin inkubiraju se u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije u uslovima dozvoljenim za vezivanje prvog antitela za sortilin, uklanja se višak nevezanog antitela i meri se količina oznake povezane sa imobilizovanim sortilinom ili ćelijama koje eksprimiraju sortilin. Ako se količina oznake povezane sa imobilizovanim sortilinom ili ćelijama koje eksprimiraju sortilin značajno smanji u testiranom uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, to znači da je drugo antitelo u kompeticiji sa prvim antitelom za vezivanje za sortilin. Videti, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). U nekim primerima izvođenja, analiza kompeticije koji se koristi je jedna ili više analiza kompeticije opisanih u Primerima 1, 3 ili 4.
[0163] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže (a) varijabilni region lakog lanca koja sadrži najmanje jednu, dve ili tri HVRs odabrane između HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 bilo kog od antitela nabrojanih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili odabrani od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; i/ili (b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan, dva ili tri HVRs odabranih od HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3 bilo kojih antitela nabrojanih u Tablelama 1-3 i 11-15, ili odabrani od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12,
4
S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. U nekim primerima izvođenja, HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sadrže EU ili Kabat CDR, Chothia CDR ili Kontakt CDR sekvence kako je prikazano u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85.
[0164] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs odabranih od (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L1 sekvence navedene u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-611, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L2 sekvence navedene u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela izabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; (iii) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L3 sekvence navedene u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; (iv) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H1 sekvenci navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; (v) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H2 sekvenci navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; i (vi) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H3 sekvenci navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili iz antitela odabranog od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85.
[0165] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 6-16, 20-22, 24-25, 512, 584 i 585, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koji se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 6-16, 20-22, 24-25, 512, 584 i 585; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 26-40 i 586, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 26-40 i 586; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79 -80, 82-85, 88-91, 95, 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 i 121-125, ili sekvencu aminokiselinska sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 41-50, 52, 54-56, 58-62, 64-66, 68-70, 72, 74, 79-80, 82-85, 88-91, 95 , 97-101, 103-107, 109, 111-116, 118 i 121-125; i/ili pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se satoji od SEQ ID BR-jevi: 126-127, 129-130, 133-140, 142 , 144-145, 147-149, 482-492, 513-524, 567-570, 587 i 591-596, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126-127, 129-130, 133-140, 142, 144-145, 147-149, 482-492, 513-524, 567-570, 587 i 591-596; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175, 177-178, 493-507, 525-539, 571-579, 588 i 597-603, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 150-153, 155-158, 160-166, 169-175, 177-178, 493-507, 525-539, 571-579, 588 i 597-603; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249, 252-256, i 540-564, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 179-186, 188, 190-191, 193-197, 199-201, 203-204, 206, 208, 213-214, 216-219, 222-225, 229, 231-234, 236-239, 241, 243-247, 249, 252-256, i 540-564.
[0166] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni region lakog lanca bilo kog od antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili odabrana od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85; i/ili varijabilni region teškog lanca bilo kog od antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili odabranih od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni domen teškog lanca koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu od bilo koje od SEQ ID BR-jevi:317-334, 337-338, 341-345, 348-357, 360-365, 368-372, 375-376, 379-380, 389-392, 395-402, 407-414, 421-422, 425-433, 436-444, 447-448, 451-461, 464-465, 470-479, 604-692.
[0167] Bilo koje od antitela prema ovom otkriću može biti proizvedeno ćelijskom linijom. U nekim primerima izvođenja, ćelijska linija može biti ćelijska linija kvasca. U drugim primerima izvođenja, ćelijska linija može biti ćelijska linija sisara. U određenim primerima izvođenja, ćelijska linija može biti ćelijska linija hibridoma. Bilo koja ćelijska linija poznata u tehnici pogodna za proizvodnju antitela može se koristiti za proizvodnju antitela prema ovom otkriću. Ogledne ćelijske linije za proizvodnju antitela su opisane kroz celo ovo otkriće.
[0168] U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je monoklonsko antitelo protiv sortilina odabrano od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je antagonističko antitelo.
[0169] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću kompetitivno inhibiraju vezivanje najmanje jednog antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za epitop humanog sortilina koji je isti ili se preklapa sa epitopom sortilina vezanim za najmanje jedno antitelo odabrano od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću vezuju se u suštini za isti epitop sortilina povezan za najmanje jedno antitelo odabrano od S-5, S-6, S-8, S-45, S-
1
49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže (a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedan, dva ili tri HVRs odabrana od HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 odabrana od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83 i/ili (b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan, dva ili tri HVRs odabrana od HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 odabranih od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sadrže EU ili Kabat CDR, Chothia CDR ili Kontakt CDR sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs odabranih od (i) HVR-L1 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L1 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83; (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L2 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83; (iii) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L3 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83; (iv) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H1 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83; (v) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H2 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83 i (vi) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H3 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni region lakog lanca bilo kog od antitela odabranih od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83; i/ili varijabilni region teškog lanca bilo
2
kog od antitela odabranih iz S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-83. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je monoklonsko antitelo protiv sortilina odabrano od S-5, S-6, S-8, S-45, S-49, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-63, S-64, S-65, S-72, i S-835.
[0170] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 6, 9-12, 14 i 15, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 6, 9-12, 14 i 15; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 26, 27, 29, 30 i 32, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 26, 27, 29, 30 i 32; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 i 123, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 45, 46, 48, 85, 89, 100, 103-105, 112 i 123; i/ili pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126, 127, 136, 140, 142, 145 i 148, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126, 127, 136, 140, 142, 145 i 148; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 i 175, ili sekvenca aminokiselina sa najmanje oko 95% homologija sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 151, 152, 163, 166, 169, 170, 173 i 175; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 i 254 ili sekvenca aminokiselinska sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 182, 183, 185, 219, 223, 233, 236, 237, 244 i 254.
[0171] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću kompetitivno inhibiraju vezivanje najmanje jednog antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, antitela potiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za epitop humanog sortilina koji je isti ili se preklapa sa epitopom sortilina povezanim sa najmanje jednim antitelom odabranim od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, antitela potiv sortilina prema ovom otkriću vezuju se u suštini za isti epitop sortilina povezan sa najmanje jednim antitelom odabranim od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, antitela potiv sortilina prema ovom otkriću sadrže (a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje
4
jedan, dva ili tri HVRs odabrana od HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 odabrana od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8; i/ili (b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan, dva ili tri HVRs odabrana od HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 odabrana od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3 sadrže EU ili Kabat CDR, Chothia CDR, ili Contact CDR sekvence iz antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs odabranih od (i) HVR-L1 koji sadrže sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L1 sekvence iz antitela odabranog iz S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8; (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-L2 sekvence iz antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8; (iii) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-L3 sekvence iz antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S82-8; (iv) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-H1 sekvence iz antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8; (v) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-H2 sekvence iz antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8; i (vi) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje HVR-H3 sekvence iz antitela odabranog od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni region lakog lanca bilo kog od antitela odabranih od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8; i/ili varijabilni region teškog lanca bilo kog od antitela odabranih od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je monoklonsko antitelo protiv sortilina odabrano od S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-29, S-51, S57, S-61, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, i S-82-8.
[0172] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 7-10, 13 i 14, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 7-10, 13 i 14; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 26-31 i 33-35, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupa koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 26-31 i 33-35; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 i 122, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 42, 54, 55, 58, 59, 60, 61, 62, 69, 91, 97, 101 , i 122; i/ili pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126, 129, 130, 135, 140, 142 i 147, ili sekvencu aminokiselinska sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126, 129, 130, 135, 140, 142 i 147; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 150, 155-158, 162, 166, 169 i 173, ili sekvencu aminokiselinska sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselinska odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 150, 155-158, 162, 166, 169 i 173; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 i 253 ili sekvencu aminokiselinska sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 180, 190, 193-197, 203, 225, 231, 234 i 253.
[0173] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću kompetitivno inhibiraju vezivanje najmanje jednog antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću se vezuju za epitop humanog sortilina koji je isti ili se preklapa sa epitopom sortilina povezanim sa najmanje jednim antitelom odabranim od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9 . U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću vezuju se u suštini za isti epitop sortilina povezan sa najmanje jednim antitelom odabranim od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže (a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedan, dva ili tri HVRs odabrana od HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 odabrana od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; i/ili (b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan, dva ili tri HVRs odabrana između HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 odabranih od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9. U nekim primerima izvođenja, HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 sadrže EU ili Kabat CDR, Chothia CDR ili Kontakt CDR sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVRs odabranih od (i) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L1 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; (ii) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L2 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, i S-60-9; (iii) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-L3 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9; (iv) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H1 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9; (v) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H2 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9; i (vi) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina bilo koje od HVR-H3 sekvence iz antitela odabranog od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3 , S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9. U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni region lakog lanca bilo kog od antitela odabranih od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60- 3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9; i/ili varijabilni region teškog lanca bilo kog od antitela odabranih od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S- 60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina je monoklonsko antitelo protiv sortilina, odabrano od S-5, S-30, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8 i S-60-9.
[0174] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću sadrže varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, pri čemu varijabilni domen lakog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 10, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom
1
aminokiselina SEQ ID BR: 10; (b) HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 30, ili ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina SEQ ID BR: 30; i (c) HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 45, 70 i 100, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 45, 70 i 100; i/ili gde varijabilni domen teškog lanca sadrži jedan ili više od: (a) HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126, 136 i 142, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 126, 136 i 142; (b) HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 151, 163 i 170, ili sekvencu aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 151, 163 i 170; i (c) HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 182, 204 i 233, ili sekvence aminokiselina sa najmanje oko 95% homologije sa sekvencom aminokiselina odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID BR-jevi: 182, 204 i 233.
[0175] Konstante disocijacije (KD) antitela protiv sortilina za humani sortilin, mišji sortilin ili oba, mogu biti manje od 100 nM, manje od 90 nM, manje od 80 nM, manje od 70 nM, manje od 60 nM, manje od 50 nM, manje od 40 nM, manje od 30 nM, manje od 20 nM, manje od 10 nM, manje od 9 nM, manje od 8 nM, manje od 7 nM, manje od 6 nM, manje od 5 nM, manje od 4 nM, manje od 3 nM, manje od 2 nM, manje od 1 nM, manje od 0.5 nM, manje od 0.1 nM, manje od 0.09 nM, manje od 0.08 nM, manje od 0.07 nM, manje od 0.06 nM, manje od 0.05 nM, manje od 0.04 nM, manje od 0.03 nM, manje od 0.02 nM, manje od 0.01 nM, manje od 0.009 nM, manje od 0.008 nM, manje od 0.007 nM, manje od 0.006 nM, manje od 0.005 nM, manje od 0.004 nM, manje od 0.003 nM, manje od 0.002 nM, manje od 0.001 nM ili manje od 0.001 nM. U nekim primerima izvođenja, antitelo ima konstantu disocijacije (KD) za humani sortilin, mišji sortilin ili oba, u opsegu od oko 100 nM do oko 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM. Poželjno, konstanta disocijacije je manja od 50 nM. U nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (KD) se meri na 4 °C ili sobnoj temperaturi koristeći, na primer, analizu vezivanja ćelija, ForteBio analizu ili MSD-SET analizu kao što je ovde opisano (videti, na primer, Primere 1 i 23).
1 1
[0176] Konstante disocijacije (KD) antitela protiv sortilina za humani sortilin i mišji sortilin mogu biti manje od 71 nM, manje od 70.9 nM, manje od 70.8 nM, manje od 70.7 nM, manje od 70.6 nM, manje od 70.5 nM, manje od 70.4 nM, manje od 70.3 nM, manje od 70.2 nM, manje od 70.1 nM, manje od 70 nM, manje od 60 nM, manje od 50 nM, manje od 40 nM, manje od 30.5 nM, manje od 30 nM, manje od 29.9 nM, manje od 29.8 nM, manje od 29.7 nM, manje od 29.6 nM, manje od 29.5 nM, manje od 29.4 nM, manje od 29.3 nM, manje od 29.2 nM, manje od 29.1 nM, manje od 29 nM, manje od 28.5 nM, manje od 28 nM, manje od 27.5 nM, manje od 27 nM, manje od 26.5 nM, manje od 26 nM, manje od 25.5 nM, manje od 25 nM, manje od 24.5 nM, manje od 24 nM, manje od 23.5 nM, manje od 23 nM, manje od 22.5 nM, manje od 22 nM, manje od 21.5 nM, manje od 21 nM, manje od 20.5 nM, manje od 20 nM, manje od 19.5 nM, manje od 19 nM, manje od 18.9 nM, manje od 18.8 nM, manje od 18.7 nM, manje od 18.6 nM, manje od 18.5 nM, manje od 18.4 nM, manje od 18.3 nM, manje od 18.2 nM, manje od 18.1 nM, manje od 18 nM, manje od 17.5 nM, manje od 17 nM, manje od 16.5 nM, manje od 16 nM, manje od 15.5 nM, manje od 15 nM, manje od 14.5 nM, manje od 14 nM, manje od 13.5 nM, manje od 13 nM, manje od 12.5 nM, manje od 12 nM, manje od 11.5 nM, manje od 11 nM, manje od 10.5 nM, manje od 10 nM, manje od 9.5 nM, manje od 9 nM, manje od 8.5 nM, manje od 8 nM, manje od 7.5 nM, manje od 7 nM, manje od 6.9 nM, manje od 6.8 nM, manje od 6.7 nM, manje od 6.6 nM, manje od 6.5 nM, manje od 6.4 nM, manje od 6.3 nM, manje od 6.2 nM, manje od 6.1 nM, manje od 6 nM, manje od 5.5 nM, manje od 5 nM, manje od 4.5 nM, manje od 4 nM, manje od 3.5 nM, manje od 3 nM, manje od 2.5 nM, manje od 2 nM, manje od 1.5 nM, manje od 1 nM, manje od 0.95 nM, manje od 0.9 nM, manje od 0.89 nM, manje od 0.88 nM, manje od 0.87 nM, manje od 0.86 nM, manje od 0.85 nM, manje od 0.84 nM, manje od 0.83 nM, manje od 0.82 nM, manje od 0.81 nM, manje od 0.8 nM, manje od 0.75 nM, manje od 0.7 nM, manje od 0.65 nM, manje od 0.64 nM, manje od 0.63 nM, manje od 0.62 nM, manje od 0.61 nM, manje od 0.6 nM, manje od 0.55 nM, manje od 0.5 nM, manje od 0.45 nM, manje od 0.4 nM, manje od 0.35 nM, manje od 0.3 nM, manje od 0.29 nM, manje od 0.28 nM, manje od 0.27 nM, manje od 0.26 nM, manje od 0.25 nM, manje od 0.24 nM, manje od 0.23 nM, manje od 0.22 nM, manje od 0.21 nM, manje od 0.2 nM, manje od 0.15 nM, manje od 0.1 nM, manje od 0.09 nM, manje od 0.08 nM, manje od 0.07 nM, manje od 0.06 nM, manje od 0.05 nM, manje od 0.04 nM, manje od 0.03 nM, manje od 0.02 nM, manje od 0.01 nM, manje od 0.009 nM, manje od 0.008 nM, manje od 0.007 nM, manje od 0.006 nM, manje od 0.005 nM, manje od 0.004 nM, manje od
1 2
0.003 nM, manje od 0.002 nM, ili manje od 0.001 nM. U nekim primerima izvođenja, konstante disocijacije antitela protiv sortilina za humane sortilin proteine su u opsegu od manje od oko 70.4 nM do manje od oko 0.29 nM, ili od manje od oko 18.7 nM do manje od oko 0.89 nM. U nekim primerima izvođenja, konstante disocijacije antitela protiv sortilina za humane proteine sortilina su u opsegu od oko 70.4 nM do oko 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM. U nekim primerima izvođenja, konstante disocijacije antitela protiv sortilina za mišje sortilin proteine su u opsegu od manje od oko 40.3 nM do manje od oko 0.61 nM, ili od manje od oko 29.6 nM do manje od oko 0.61 nM. U nekim primerima izvođenja, konstante disocijacije antitela protiv sortilina za mišje sortilinske proteine su u opsegu od oko 40.3 nM do oko 0.07 nM, ili manje od 0.07 nM. U nekim primerima izvođenja, konstante disocijacije antitela protiv sortilina za humane i mišje proteine sortilina su u opsegu od manje od oko 70.4 nM do manje od oko 0.29 nM, ili od manje od oko 29.6 nM do manje od oko 0.61 nM. Konstante disocijacije se mogu odrediti pomoću bilo koje analitičke tehnike, uključujući bilo koju biohemijsku ili biofizičku tehniku, kao što je ELISA, površinska plazmonska rezonanca (SPR), interferometrija bio-sloja (videti, npr., Octet System by ForteBio), otkrivanje mezo skale (videti, npr. MSD-SET), izotermička titraciona kalorimetrija (ITC), diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC), kružni dihroizam (CD), analiza zaustavljenog protoka i kolorimetrijske ili fluorescentne analize topljenja proteina; ili analiza vezivanja ćelija. Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (KD) se meri na 4ºC ili na sobnoj temperaturi koristeći, na primer, analizu vezivanja ćelija, ForteBio analizu ili MSD-SET analizu kao što je ovde opisano (videti, na primer, Primere 1 i 23).
[0177] Dodatna antitela protiv sortilina, na primer, antitela koja se specifično vezuju za protein sortilina prema ovom otkriću, mogu se identifikovati, pregledati i/ili okarakterisati zbog njihovih fizičkih/hemijskih svojstava i/ili bioloških aktivnosti različitim analizama poznatim u tehnici.
Smanjena ekspresija pro-inflamatornih posrednika
[0178] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu smanjiti ekspresiju pro-inflamatornih posrednika nakon vezivanja za protein sortilin eksprimiran u ćeliji.
1
[0179] Kako su upotrebljeni ovde, pro-inflamatorni posrednici su proteini uključeni direktno ili indirektno (npr. putem pro-inflamatornih signalnih puteva) u mehanizam koji indukuje, aktivira, promoviše ili na drugi način smanjuje inflamatorni odgovor. Može se koristiti bilo koji postupak poznat u tehnici za identifikaciju i karakterizaciju pro-inflamatornih posrednika.
[0180] Primeri pro-inflamatornih posrednika uključuju, bez ograničenja, citokine, kao što su interferoni tipa I i II, IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1 β, TNF- α, IL-8, CRP, članovi familije IL-20, IL-33, LIF, OSM, CNTF, GM-CSF, IL-11, IL-12, IL-17, IL-18 i CRP. Dalji primeri proinflamatornih posrednika uključuju, bez ograničenja, hemokine, kao što su CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 i CCL5.
[0181] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu smanjiti funkcionalnu ekspresiju i/ili sekreciju pro-inflamatornih posrednika, IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1 β, TNF- α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 i CCL5. U određenim primerima izvođenja, smanjena ekspresija pro-inflamatornih posrednika javlja se u makrofagima, dendritičkim ćelijama, monocitima, osteoklastima, Langerhans-ovim ćelijama kože, Kupfferovim ćelijama, T ćelijama i/ili mikroglijalnim ćelijama. Smanjena ekspresija može uključivati, bez ograničenja, smanjenje ekspresije gena, smanjenje transkripcione ekspresije ili smanjenje ekspresije proteina. Može se koristiti bilo koji postupak poznat u tehnici za određivanje ekspresije gena, transkripta (npr. mRNK) i/ili proteina. Na primer, Northern blot analiza može se koristiti za određivanje nivoa ekspresije gena za pro-inflamatorni posrednik, RT-PCR se može koristiti za određivanje nivoa transkripcije pro-inflamatornog posrednika, a Western blot analiza se može koristiti za određivanje nivoa proteina pro-inflamatornog posrednika.
[0182] Kako je upotrebljen ovde, pro-inflamatorni posrednik može imati smanjenu ekspresiju ako je njegova ekspresija u jednoj ili više ćelija subjekta tretiranog sortilin sredstvom, kao što je agonističko antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću, veća od ekspresije istog proinflamatornog posrednika eksprimiranog u jednoj ili više ćelija odgovarajućeg subjekta koji nije tretiran agonističkim antitelom protiv sortilina. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću može smanjiti ekspresiju pro-inflamatornog posrednika u jednoj ili više ćelija subjekta za najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, pri najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 100%, najmanje 110%, najmanje 115%, najmanje 120%, najmanje 125%, najmanje 130%, najmanje 135%, najmanje 140%, najmanje
1 4
145%, najmanje 150%, najmanje 160%, najmanje 170%, najmanje 180%, najmanje 190%ili najmanje 200% na primer, u poređenju sa ekspresijom pro-inflamatornog posrednika u jednoj ili više ćelija odgovarajućeg subjekta koji nije tretiran antitelom protiv sortilina. U drugim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina može smanjiti ekspresiju pro-inflamatornog posrednika u jednoj ili više ćelija subjekta za najmanje 1.5 puta, najmanje 1.6 puta, najmanje 1.7 puta, najmanje 1.8 puta, najmanje 1.9 puta, najmanje 2.0 puta, najmanje 2.1 puta, najmanje 2.15 puta, najmanje 2.2 puta, najmanje 2.25 puta, najmanje 2.3 puta, najmanje 2.35 puta, najmanje 2.4 puta, najmanje 2.45 puta, najmanje 2.5 puta, najmanje 2.55 puta, najmanje 3.0 puta, najmanje 3.5 puta, najmanje 4.0 puta, najmanje 4.5 puta, najmanje 5.0 puta, najmanje 5.5 puta, najmanje 6.0 puta, najmanje 6.5 puta, najmanje 7.0 puta, najmanje 7.5 puta, najmanje 8.0 puta, najmanje 8.5 puta, najmanje 9.0 puta, najmanje 9.5 puta, ili najmanje 10 puta, na primer, u poređenju sa ekspresijom pro-inflamatornog posrednika u jednoj ili više ćelija odgovarajućeg subjekta koji nije tretiran antitelom protiv sortilina.
Fc izotipovi antitela protiv sortilina
[0183] U nekim primerima izvođenja, antitela prema ovom otkriću uključuju antagonistička antitela. U nekim primerima izvođenja, antitela koja vezuju protein sortilin mogu uključivati antagonistička antitela koja vezuju sortilin i inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina, bilo sprečavanjem interakcije između sortilina i jednog ili više njegovih liganda (npr. progranulin, pro-neurotrofini, neurotrofini, neurotenzin , p75, propeptid sortilina, APP, A beta peptid, LpL, APOA5, APOE i RAP). U nekim primerima izvođenja, antagonistička antitela prema ovom otkriću mogu imati Fc domen koji nije sposoban da poveže Fcg receptore.
[0184] Ogledni Fc izotipovi i modifikacije blokirajućih i/ili antagonističkih antitela obezbeđeni su u Tabeli A u nastavku. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću ima Fc izotip naveden u Tabeli A u nastavku.
Tabela A: Ogledni Fc izotipovi antitela protiv sortilina
1
[0185] U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina ima IgG1 izotip. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina obuhvata konstantni region mišjeg IgG1. U
1
nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina obuhvata konstantni region humanog IgG1. U nekim primerima izvođenja, konstantan region humanog IgG1 uključuje Fc region. U nekim primerima izvođenja, Fc region obuhvata jednu ili više modifikacija. Na primer, u nekim primerima izvođenja, Fc region obuhvata jednu ili više supstitucija aminokiselina (npr. u odnosu na Fc region divljeg tipa istog izotipa). U nekim primerima izvođenja, jedna ili više supstitucija aminokiselina su odabrane od N297A, N297Q (Bolt S et al. (1993) Eur J Immunol 23:403-411), D265A, L234A, L235A (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), C226S, C229S (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238S (Davis et al., (2007) J Rheumatol, 34:2204-2210), E233P, L234V (McEarchern et al., (2007) Blood, 109:1185-1192), P238A, A327Q, A327G, P329A (Shields RL. et al., (2001) J Biol Chem. 276(9):6591-604), K322A, L234F, L235E (Hezareh,et al., (2001) J Virol 75, 12161–12168; Oganesyan et al., (2008). Acta Crystallographica 64, 700–704), P331S (Oganesyan et al., (2008) Acta Crystallographica 64, 700–704), T394D (Wilkinson et al. (2013) MAbs 5(3): 406–417), A330L, M252Y, S254T i/ili T256E, gde je položaj aminokiselina prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja. U nekim primerima izvođenja, Fc region dalje uključuje brisanje aminokiselina na poziciji koja odgovara glicinu 236 prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja.
[0186] U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina ima IgG1 izotip sa konstantnim regionom teškog lanca koji obuhvata supstituciju aminokiseline C220S prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja.
[0187] U nekim primerima izvođenja, Fc region dalje obuhvata jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina odabranih od t A330L, L234F; L235E i/ili P331S prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja.
[0188] U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina ima izotip IgG2. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina obuhvata konstantni region humanog IgG2. U nekim primerima izvođenja, konstantni region humanog IgG2 uključuje Fc region. U nekim primerima izvođenja, Fc region obuhvata jednu ili više modifikacija. Na primer, u nekim primerima izvođenja, Fc region obuhvata jednu ili više supstitucija aminokiselina (npr. u odnosu na Fc region divljeg tipa istog izotipa). U nekim primerima izvođenja, jedna ili više supstitucija aminokiselina su odabrane od P238S, V234A, G237A, H268A, H268Q, H268E, V309L, N297A, N297Q, V309L, A330S, P331S, C232S, C233S, M252Y, S254T, i/ili T256E,
1
gde je položaj aminokiselina prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja (Vafa O. et al., (2014) Methods 65:114–126).
[0189] U određenim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina ima izotip IgG4. U nekim primerima izvođenja, antitelo protiv sortilina obuhvata konstantni region humanog IgG4. U nekim primerima izvođenja, konstantan region humanog IgG4 uključuje Fc region. U nekim primerima izvođenja, Fc region obuhvata jednu ili više modifikacija. Na primer, u nekim primerima izvođenja, Fc region obuhvata jednu ili više supstitucija aminokiselina (npr. u odnosu na Fc region divljeg tipa istog izotipa). U nekim primerima izvođenja, jedna ili više supstitucija aminokiselina su odabrane od E233P, F234V, L235A, G237A, E318A (Hutchins et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92:11980-11984), S228P, L234A/F234A, L236E, S241P, L248E (Reddy et al., (2000) J Immunol,164:1925-1933; Angal et al., (1993) Mol Immunol. 30(1):105-8; US 8614299 B2; Vafa O. et al., (2014) Methods 65:114–126), T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, i/ili N297Q, gde je položaj aminokiselina prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja.
[0190] U nekim primerima izvođenja, Fc region dalje obuhvata jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina odabranih od M252Y, S254T, i/ili T256E, gde je položaj aminokiselina prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja.
Dalje mutacije IgG
[0191] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više ovde opisanih varijanti IgG1 mogu se kombinovati sa mutacijom A330L (Lazar et al., (2006) Proc Natl Acad Sci USA, 103:4005-4010), ili jednom ili više L234F, L235E, i/ili P331S mutacija (Sazinsky et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105:20167-20172), gde je položaj aminokiselina prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja, da bi se eliminisala aktivacija komplementa. U nekim primerima izvođenja, ovde opisane varijante IgG mogu se kombinovati sa jednom ili više mutacija da bi se povećao poluživot antitela protiv sortilina u humanom serumu (npr. mutacije M252Y, S254T,T256E prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja) (Dall’Acqua et al., (2006) J Biol Chem, 281:23514-23524; i Strohl e al., (2009) Current Opinion in Biotechnology, 20:685– 691).
[0192] U nekim primerima izvođenja, varijanta IgG4 ovog otkrića može se kombinovati sa mutacijom S228P prema EU ili Kabat konvenciji numerisanja (Angal et al., (1993) Mol
1
Immunol, 30:105-108) i/ili sa jednom ili više mutacija opisanih u Peters et al., (2012) J Biol Chem. 13;287(29):24525-33) za poboljšanje stabilizacije antitela.
Bispecifična antitela
[0193] Određeni aspekti ovog otkrića odnose se na bispecifična antitela koja se vezuju za jedan ili više domena na proteinu sortilina prema ovom otkriću i drugom antigenu. Postupci stvaranja bispecifičnih antitela su dobro poznati u tehnici i ovde su opisani. U nekim primerima izvođenja, bispecifična antitela prema ovom otkriću se vezuju za jedan ili više aminokiselinskih ostataka proteina sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, bispecifična antitela prema ovom otkriću prepoznaju prvi antigen i drugi antigen. U nekim primerima izvođenja, prvi antigen je protein sortilin ili njegova prirodna varijanta. U nekim primerima izvođenja, drugi antigen je takođe protein sortilin, ili njegova prirodna varijanta. U nekim primerima izvođenja, drugi antigen je antigen koji olakšava transport preko krvno-moždane barijere (videti, na primer, Gabathuler R., Neurobiol. Dis. 37 (2010) 48-57). Takvi drugi antigeni uključuju, bez ograničenja, receptor transferina (TR), receptor insulina (HIR), receptor faktora rasta sličnog insulinu (IGFR), proteine 1 i 2 povezane sa lipoproteinskim receptorima niske gustine (LPR-1 i 2), receptor za toksin difterije, CRM197, antitelo lame sa jednim domenom, TMEM 30 (A), domen transdukcije proteina, TAT, Syn-B, penetratin, poli-arginin peptid, peptidi angiopepa kao što je ANG1005 (vidi, npr., Gabathuler, 2010), basigin, Glut1, CD98hc i drugi proteini na površini ćelije koji su obogaćeni na endotelnim ćelijama krvno-moždane barijere (videti, na primer, Daneman et al., PLoS One.
2010 Oct 29;5(10):e13741).
Kombinacije antitela
[0194] Određeni aspekti ovog otkrića odnose se na upotrebu dva ili više antitela protiv sortilina koja, kada se koriste zajedno, pokazuju aditivne ili sinergističke efekte, u poređenju sa upotrebom odgovarajućeg pojedinačnog antitela protiv sortilina.
1
Fragmenti antitela
[0195] Određeni aspekti ovog otkrića odnose se na fragmente antitela koji se vezuju za protein sortilin prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, fragment antitela je Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv ili scFv fragment. U nekim primerima izvođenja, fragment antitela se koristi u kombinaciji sa drugim antitelom sortilina i/ili sa jednim ili više antitela koja specifično vezuju protein koji izaziva bolest, odabran od: amiloid beta ili njegovih fragmenata, Tau, IAPP, alfa-sinuklein, TDP -43, FUS protein, protein prion, PrPSc, huntingtin, kalcitonin, superoksid dismutaza, ataksin, Lewy-jevo telo, atrijalni natriuretički faktor, amiloidni polipeptid ostravca, insulin, apolipoprotein AI, amiloid A u serumu, medin, prolaktin, transtiretin, lizozim, beta 2 mikroglobulin, gelsolin, keratoepitelin, cistatin, imunoglobulinski laki lanac AL, S-IBM protein, produkti translacije kroz ponovke nezavisne od kodona ATG (RAN), peptidi sa ponovljenim dipeptidima (DPR), peptidi sa ponovcima glicin-alanin (GA), peptidi sa ponovcima glicin-prolin (GP), peptidi sa ponovcima glicinarginin (GR), peptidi sa ponovcima prolin-alanin (PA), peptidi sa ponovcima prolin-arginin (PR) i bilo koja njihova kombinacija.
[0196] U nekim primerima izvođenja, fragmenti antitela prema ovom otkriću mogu biti funkcionalni fragmenti koji vezuju isti epitop kao i bilo koje od antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, fragmenti antitela su minijaturne verzije antitela protiv sortilina ili fragmenti antitela prema ovom otkriću koji imaju isti epitop odgovarajućeg antitela pune dužine, ali imaju mnogo manju težinu molekula. Takvi minijaturni fragmenti antitela protiv sortilina mogu imati bolju sposobnost prodiranja u mozak i kraći poluživot, što je povoljno u snimanju i dijagnostici (videti,npr., Lütje S et al., Bioconjug Chem. 2014 Feb 19;25(2):335-41; Tavaré R et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2014 Jan 21;111(3):1108-13; and Wiehr S et al., Prostate. 2014 May;74(7):743-55). Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, fragmenti antitela protiv sortilina prema ovom pronalasku imaju bolje prodiranje u mozak u poređenju sa njihovim odgovarajućim antitelima pune dužine i/ili imaju kraći poluživot u poređenju sa njihovim odgovarajućim antitelima pune dužine.
Okviri antitela
[0197] Bilo koje od ovde opisanih antitela dalje uključuje okvir. U nekim primerima izvođenja, okvir je okvir humanog imunoglobulina. Na primer, u nekim primerima izvođenja, antitelo (na primer, antitelo protiv sortilina) sadrži HVRs kao u bilo kojoj od prethodnih
11
primera izvođenja i dalje sadrži akceptorski humani okvir, na primer, okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa. Okviri humanog imunoglobulina mogu biti deo humanog antitela, ili ne-humano antitelo može biti humanizovano zamenom jednog ili više endogenih okvira sa humanim okvirnim regionom (regionima). Humani okvirni regioni koji se mogu koristiti za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: okvirne regione odabrane postupkom "najboljeg uklapanja" (videti, na primer, Sims et al. J. Immunol.
151:2296 (1993)); okvirne regione izvedene iz konsenzusne sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti, npr., Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humani zreli (somatski mutirani) okvirni regioni ili okvirni regioni humanih germinativnih linija (videti, na primer, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione izvedene iz skrininga FR biblioteka (videti, na primer, Baca et al., J. Biol. Chem.
272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).
[0198] U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koja sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 prema ovom otkriću i jedno, dva, tri ili četiri okvirna regiona lakog lanca kao što je prikazano u Tabeli 2 i SEQ ID BR-jevi: 630, 667 i 641-684. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 prema ovom otkriću i jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona teškog lanca kao što je prikazano u Tabeli 3 i SEQ ID BR-jevi: 604-618, 619-629, 631-666, 668, 669, 670-678-680 i 685-692. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži HVR-L1, HVR-L2 i HVR-L3 prema ovom otkriću i jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona lakog lanca kao što je prikazano u Tabeli 2 i SEQ ID BR-jevi: 630, 667 i 641-684 i dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koja sadrži HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3 prema ovom otkriću i jedan, dva, tri ili četiri okvirna regiona teškog lanca prikazanih u Tabeli 3 i SEQ ID BR-jevi: 604-618, 619-629, 631-666, 668, 669, 670-678-680 i 685-692.
Priprema antitela
[0199] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu obuhvatati poliklonska antitela, monoklonska antitela, humanizovana i himerna antitela, humana antitela, fragmente antitela (npr. Fab, Fab'-SH, Fv, scFv i F (ab')2), bispecifična i polispecifična antitela, multivalentna antitela, heterokonjugovana antitela, konjugovana antitela, antitela izvedena iz biblioteke, antitela koja imaju modifikovane efektorske funkcije, fuzioni proteini koji obuhvataju deo antitela i bilo koja druga modifikovana konfiguracija molekula imunoglobulina koja uključuje mesto prepoznavanja antigena, kao što je epitop koji ima aminokiselinske ostatke proteina sortilina prema ovom otkriću, uključujući varijante glikozilacije antitela, varijante sekvenci aminokiselina antitela i kovalentno modifikovana antitela. Antitela protiv sortilina mogu biti humana, mišja, pacovska ili bilo kog drugog porekla (uključujući himerna ili humanizovana antitela).
(1) Poliklonska antitela
[0200] Poliklonska antitela, kao što su poliklonska antitela protiv sortilina, generalno se podižu kod životinja višestrukim potkožnim (sc) ili intraperitonealnim (ip) ubrizgavanjima relevantnog antigena i ađuvanta. Može biti korisno konjugovati relevantan antigen (npr. prečišćeni ili rekombinantni protein sortilin prema ovom otkriću) sa proteinom koji je imunogen u vrstama koje treba imunizovati, npr. keyhole limpet hemocijanin (KLH), albumin u serumu, goveđi tiroglobulin ili inhibitor tripsina soje, koristeći bifunkcionalno ili derivatizirajuće sredstvo, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimid estar (konjugacija kroz ostatke cisteina), N-hidroksisukcinimid (kroz ostatke lizina), glutaraldehid, sukcidni anhidrid, SOCl2, ili R<1>N=C=NR, gde su R i R<1>nezavisno niže alkilne grupe. Primeri ađuvanata koji se mogu koristiti uključuju Freund-ov potpuni ađuvant i MPL-TDM ađuvant (monofosforil lipid A, sintetička trehaloza dikorinomikolata). Stručnjak u tehnici može odabrati protokol imunizacije bez nepotrebnih eksperimenata.
[0201] Životinje su imunizovane protiv željenog antigena, imunogenih konjugata ili derivata kombinovanjem, na primer, 100 μg (za zečeve) ili 5 μg (za miševe) proteina ili konjugata sa 3 zapremine Freund-ovog kompletnog ađuvanta i ubrizgavanjem rastvora intradermalno na više mesta. Mesec dana kasnije, životinje su pojačane sa 1/5 do 1/10 originalne količine peptida ili konjugata u Freund-ovom potpunom ađuvantu potkožnim ubrizgavanjem na više mesta. Sedam do četrnaest dana kasnije, životinjama se uzima krv i serum se analizira na titar antitela. Životinje se pojačavaju do titarskog platoa. Konjugati se takođe mogu napraviti u kulturi rekombinantnih ćelija kao fuzije proteina. Takođe, sredstva za agregaciju kao što je alaun su pogodni za pojačavanje imunološkog odgovora.
(2) Monoklonska antitela
[0202] Monoklonska antitela, kao što su monoklonska antitela protiv sortilina, dobijaju se iz populacije znatno homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili post-translacionih modifikacija (npr. izomerizacije, amidacije) koji mogu biti prisutni u manjim količinama. Prema tome, „monoklonski“ modifikator ukazuje na karakter antitela kao da nije mešavina odvojenih antitela.
[0203] Na primer, monoklonska antitela protiv sortilina mogu se napraviti postupkom hibridoma koju je prvi opisao Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili se mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK (U.S. Patent Br.4,816,567).
[0204] U postupku hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin, kao što je hrčak, imunizuje se kao što je prethodno opisano da izazove limfocite koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju (npr. prečišćeni ili rekombinantni protein sortilin prema ovom otkriću). Alternativno, limfociti se mogu imunizirati in vitro. Limfociti su zatim spojeni sa ćelijama mijeloma pomoću odgovarajućeg sredstva za fuziju, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala ćelija hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
[0205] Sredstvo za imunizaciju tipično će uključivati antigenski protein (npr. prečišćeni ili rekombinantni protein sortilin prema ovom otkriću) ili njegovu fuzionu varijantu. Generalno, limfociti periferne krvi („PBLs“) se koriste ako se žele ćelije humanog porekla, dok se ćelije slezine ili limfnih čvorova koriste ako se žele izvori ne-humanih sisara. Limfociti se zatim fuzionišu sa besmrtnom ćelijskom linijom koristeći odgovarajuće sredstvo za fuziju, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala ćelija hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp.59-103.
[0206] Besmrtne ćelijske linije obično su transformisane ćelije sisara, naročito ćelije mijeloma glodara, goveda ili su humanog porekla. Obično se koriste ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Tako pripremljene ćelije hibridoma su zasejane i uzgajane u pogodnom medijumu za kulturu koji poželjno obuhvata jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili opstanak nefuzionisanih, parentalnih ćelija mijeloma. Na primer, ako parentalnim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum
11
kulture za hibridome obično će uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), koji su supstance koje sprečavaju rast ćelija deficijentnih za HGPRT.
[0207] Preferirane besmrtne ćelije mijeloma su one koje se efikasno fuzionišu, podržavaju stabilnu proizvodnju antitela na visokom nivou od strane odabranih ćelija koje proizvode antitela i osetljive su na medijum kao što je medijum HAT. Među ovim, poželjne su linije mijeloma miševa, kao što su one izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miša (dostupno iz the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornija, SAD), kao i ćelije SP-2 i njihovi derivati (npr. X63-Ag8-653) (dostupno iz American Type Culture Collection, Manasas, Virdžinija, SAD). Ćelijske linije humanog mijeloma i miševa-humanog heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).
[0208] Medijum za kulturu u kome rastu ćelije hibridoma se analizira za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena (npr. protein sortilin prema ovom otkriću). Poželjno, specifičnost vezivanja monoklonskih antitela koja proizvode ćelije hibridoma određena je imunoprecipitacijom ili in vitro analizom vezivanja, kao što je radioimunska analiza (RIA) ili enzimski povezana imunosorbentna analiza (ELISA).
[0209] Medijum za kulturu u kome se ćelije hibridoma kultivišu može se analizirati na prisustvo monoklonskih antitela usmerenih protiv željenog antigena (na primer, protein sortilin prema ovom otkriću). Poželjno, afinitet vezivanja i specifičnost monoklonskog antitela mogu se odrediti imunoprecipitacijom ili in vitro analizom vezivanja, kao što je radioimunska analiza (RIA) ili enzimski povezana analiza (ELISA). Takve tehnike i analize su poznati u tehnici. Na primer, afinitet vezivanja može se odrediti Scatchard-ovom analizom Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
[0210] Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi se mogu subklonirati ograničavanjem procedura razblaživanja i uzgajati standardnim postupcima (Goding, prethodno pomenuto). Pogodni medijumi za kulturu u tu svrhu uključuju, na primer, medijum D-MEM ili RPMI-1640. Osim toga, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao tumori kod sisara.
[0211] Monoklonska antitela koja izlučuju subklonovi prikladno se odvajaju od medijuma za kulturu, tečnosti ascitesa ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja imunoglobulina, kao što je, na primer, hromatografija proteina A-sefaroze, hromatografija sa hidroksilapatitom, gel elektroforeza, dijaliza, afinitetna hromatografija i drugi postupci kao što je prethodno opisano.
[0212] Monoklonska antitela protiv sortilina mogu se takođe proizvesti postupcima rekombinantne DNK, kao što su oni otkriveni u US patentu br.4,816,567, i kako je prethodno opisano. DNK koja kodira monoklonska antitela se lako izoluje i sekvencira primenom konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela miševa). Ćelije hibridoma služe kao preferirani izvor takve DNK. Kada se izoluje, DNK se može staviti u ekspresione vektore, koji se zatim transfektuju u ćelije domaćine, kao što su ćelije E. coli, COS ćelije majmuna, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se sintetisala monoklonska antitela u takvim rekombinantnim ćelijama domaćinima. Pregledni članci o rekombinantnoj ekspresiji u bakterijskim DNK koje kodiraju antitela uključuju Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol. Rev.130:151-188 (1992).
[0213] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina se mogu izolovati iz biblioteke antitela u fagu generisanih tehnikama opisanim u McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) opisali su izolaciju mišjih i humanih antitela, respektivno, iz biblioteka faga. Naknadne publikacije opisuju proizvodnju humanih antitela visokog afiniteta (opseg nanomolarnih („nM“)) mešanjem lanaca (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), kao i kombinatornu infekciju i in vivo rekombinaciju kao strategiju za izgradnju veoma velikih biblioteka faga (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Dakle, ove tehnike su održive alternative tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonskih antitela za izolaciju monoklonskih antitela željene specifičnosti (na primer, onih koje vezuju protein sortilin prema ovom otkriću).
[0214] DNK koja kodira antitela ili njihove fragmente takođe se može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za humane i teške i lake lance konstantnih domena umesto homolognih mišjih sekvenci (U.S. Patent No. 4,816,567; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ili kovalentnim spajanjem kodirajuće sekvence imunoglobulina cele ili dela kodirajuće sekvence za ne-imunoglobulinski polipeptid. Obično su takvi ne-imunoglobulinski polipeptidi supstituisani za konstantne domene antitela, ili su zamenjeni za varijabilne domene antitela jednog mesta za kombinovanje antigena da bi se
11
formiralo himerno dvovalentno antitelo koje sadrži jedno mesto za kombinovanje antigena koje ima specifičnost za antigen i drugo mesto za kombinovanje antigena koje ima specifičnost za različit antigen.
[0215] Ovde opisana monoklonska antitela (na primer, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću ili njihovi fragmenti) mogu biti monovalentna, čija je priprema dobro poznata u tehnici. Na primer, jedan postupak uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac se generalno skraćuje u bilo kojoj tački Fc regiona da bi se sprečilo unakrsno povezivanje teškog lanca. Alternativno, relevantni ostaci cisteina mogu biti supsituisani drugim aminokiselinskim ostatkom ili izbrisani da bi se sprečilo unakrsno povezivanje. In vitro postupci su takođe pogodni za dobijanje monovalentnih antitela. Digestija antitela za proizvodnju njihovih fragmenata, posebno Fab fragmenata, može se izvršiti korišćenjem rutinskih tehnika poznatih u tehnici.
[0216] Himerna ili hibridna antitela protiv sortilina takođe se mogu pripremiti in vitro koristeći poznate postupke u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koje uključuju sredstva za unakrsno povezivanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati pomoću reakcije razmene disulfida ili formiranjem tioetarske veze. Primeri odgovarajućih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
(3) Humanizovano antitelo
[0217] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću ili njihovi fragmenti antitela mogu dalje uključivati humanizovana ili humana antitela. Humanizovani oblici ne-humanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2ili druge sekvence antitela za vezivanje antigena) koji obuhvataju minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (antitela primaoca) u kojima su ostaci iz regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz CDR ne-humane vrste (antitelo donora) kao što su miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv humanog imunoglobulina zamenjeni su odgovarajućim ne-humanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe sadržati ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu ni u ubačenim CDR ili sekvencama okvirna. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u osnovi sve od najmanje jednog, a tipično dva,
11
varijabilna domena, u kojima svi ili uglavnom svi CDR regioni odgovaraju onim ne-humanim imunoglobulinima i svi ili u suštini svi FR regioni su one konsenzusne sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će optimalno takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično one humanog imunoglobulina. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) i Presta, Curr. Opin. Struct. Biol.2: 593-596 (1992).
[0218] Postupci za humanizaciju ne-humanih antitela protiv sortilina su dobro poznati u tehnici. Generalno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka unetih u njega iz izvora koji nije čovek. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci se često nazivaju "ubačeni" ostaci, koji se obično uzimaju iz "ubačenog" varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvesti primenom postupka Winter-a i saradnika, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988), ili supstitucijom CDRs ili CDR sekvenci glodara odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Shodno tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (U.S. Patent No. 4,816,567), pri čemu je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom iz ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci i verovatno neki FR ostaci supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.
[0219] Izbor humanih varijabilnih domena, lakih i teških, koji će se koristiti u stvaranju humanizovanih antitela veoma je važan za smanjenje antigenosti. Prema takozvanom postupku „najboljeg uklapanja“, sekvenca varijabilnog domena antitela glodara se pregleda protiv čitave biblioteke poznatih humanih sekvenci varijabilnog domena. Humana sekvenca koja je najbliža sekvenci glodara se tada prihvata kao humani okvir (FR) za humanizovano antitelo. Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987).. Drugi postupak koristi poseban okvir izveden iz konsenzusne sekvence svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela. Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993).
[0220] Štaviše, važno je da se antitela humanizuju uz zadržavanje visokog afiniteta za antigen i druga povoljna biološka svojstva. Da bi se postigao ovaj cilj, prema preferiranom postupku, humanizovana antitela se pripremaju postupkom analize parentalnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele parentalnih i
11
humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su opšte dostupni i poznati su stručnjacima u tehnici. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata sekvenci imunoglobulina. Pregled ovih ekrana dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata sekvence imunoglobulina, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci se mogu odabrati i kombinovati iz sekvence primaoca i ubačene sekvence tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen ili antigene (npr. proteine sortilina prema ovom otkriću). Generalno, ostaci CDR su direktno i najznačajnije uključeni u uticaj na vezivanje antigena.
[0221] Razmatraju se različiti oblici humanizovanog antitela protiv sortilina. Na primer, humanizovano antitelo protiv sortilina može biti fragment antitela, kao što je Fab, koje je izborno konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih sredstava da bi se stvorio imunokonjugat. Alternativno, humanizovano antitelo protiv sortilina može biti intaktno antitelo, kao što je intaktno IgG1 antitelo.
(4) Humana antitela
[0222] Alternativno, mogu se stvoriti humana antitela protiv sortilina. Na primer, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr. miševe) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvedu pun repertoar humanih antitela u odsustvu proizvodnje endogenog imunoglobulina. Homozigotna delecija gena regiona za spajanje teškog lanca antitela (JH) kod himernih miševa i germinativne linije mutantnih miševa rezultuje potpunom inhibicijom proizvodnje endogenih antitela. Prenos niza gena imunoglobulina humane germinativne linije u takve germinativne linije mutiranih miševa rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja antigena. Videti, na primer, Jakobovits et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); U.S. Patent Nos.5,591,669 i WO 97/17852.
[0223] Alternativno, tehnologija prikaza faga može se koristiti za proizvodnju humanih antitela protiv sortilina i fragmenata antitela in vitro, iz repertoara gena varijabilnog (V) domena imunoglobulina od neimunizovanih donora. McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991). Prema ovoj tehnici, geni V
11
domena antitela se kloniraju u okviru ili u glavnom ili manjem genu proteinskog omotača filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili fd, i prikazuju se kao funkcionalni fragmenti antitela na površini čestice faga. S obzirom da filamentozna čestica obuhvata jednolančanu DNK kopiju genoma faga, odabiri zasnovani na funkcionalnim svojstvima antitela takođe rezultuju odabirom gena koji kodira antitelo koje pokazuje ta svojstva. Dakle, fag oponaša neka svojstva B-ćelije. Prikaz faga može se izvesti u različitim formatima, pregledano u, na primer, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol.3:564-571 (1993). Nekoliko izvora segmenata V-gena može se koristiti za prikaz faga. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) su izolovali raznoliki niz antitela protiv oksazolona iz male nasumične kombinatorne biblioteke V gena izvedenih iz slezine imunizovanih miševa. Repertoar V gena od neimunizovanih humanih donora može se konstruisati, a antitela na različit niz antigena (uključujući self-antigene) mogu se izdvojiti u suštini prateći tehnike koje su opisali Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ili Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Videti takođe U.S. Patent. Nos. 5,565,332 i 5,573,905. Osim toga, tehnologija prikaza kvasca može se koristiti za proizvodnju humanih antitela protiv sortilina i fragmenata antitela in vitro (npr., WO 2009/036379; WO 2010/105256; WO 2012/009568; US 2009/0181855; US 2010/0056386; i Feldhaus and Siegel (2004) J. Immunological Methods 290:69-80). U drugim primerima izvođenja, tehnologija prikaza ribozoma može se koristiti za proizvodnju humanih antitela protiv sortilina i fragmenata antitela in vitro (npr., Roberts and Szostak (1997) Proc Natl Acad Sci 94:12297-12302; Schaffitzel et al. (1999) J. Immunolical Methods 231:119-135; Lipovsek and Plückthun (2004) J. Immunological Methods 290:51-67).
[0224] Tehnike Cole et al., i Boerner et al., takođe su dostupne za pripremu humanih monoklonskih antitela protiv sortilina (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) i Boerner et al., J. Immunol.147(1): 86-95 (1991). Slično, humana antitela protiv sortilina mogu se napraviti uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina u transgene životinje, npr. miševe u kojima su geni endogenih imunoglobulina delimično ili potpuno inaktivirani. Nakon izazivanja, primećuje se proizvodnja humanih antitela, koja po svemu veoma podseća na onu koja se vidi kod ljudi, uključujući rearanžmane gena, sastavljanje i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, u U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016 i u sledećim naučnim publikacijama: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild
11
et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) i Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).
[0225] Konačno, humana anitela protiv sortilina mogu se takođe proizvesti in vitro aktivacijom B-ćelija (videti U.S. Patent Nos 5,567,610 i 5,229,275).
(5) Fragmenti antitela
[0226] U određenim primerima izvođenja, postoje prednosti u korišćenju fragmenata antitela protiv sortilina , a ne celih antitela protiv sortilina. Fragmenati manje veličine omogućavaju brzo čišćenje i bolju penetraciju u mozak.
[0227] Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni proteolitičkom digestijom intaktnih antitela (videti, na primer, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Method. 24:107-117 (1992); i Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Međutim, ovi fragmenti se sada mogu direktno proizvesti rekombinantnim ćelijama-domaćinima, na primer, upotrebom nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. Svi fragmenti antitela Fab, Fv i scFv mogu da se eksprimiraju i izluče iz E. coli, omogućavajući tako direktnu proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela protiv sortilina takođe se mogu izolovati iz biblioteka antitela u fagu kao što je prethodno razmatrano. Alternativno, Fab’-SH fragmenti se mogu direktno oporaviti iz E. coli i hemijski kuplovati da bi se formirali F (ab’)2fragmenti (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, fragmenti F (ab’)2se mogu izolovati direktno iz kulture rekombinantnih ćelija domaćina. Proizvodnja fragmenata antitela Fab i F (ab’)2sa povećanim in vivo poluživotom opisana je u američkom patentu br. U.S. Patent No.
5,869,046. U drugim primerima izvođenja, antitelo po izboru je jednolančani Fv fragment (scFv). Videti WO 93/16185; U.S. Patent No. 5,571,894 i U.S. Patent No. 5,587,458. Fragment antitela protiv sortilina takođe mogu biti „linearno antitelo“, na primer, kao što je opisano u U.S. Patent 5,641,870. Takvi linearni fragmenti antitela mogu biti monospecifični ili bispecifični.
12
(6) Bispecifična i polispecifična antitela
[0228] Bispecifična antitela (BsAbs) su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa, uključujući ona na istom ili drugom proteinu (npr. jedan ili više proteina sortilina prema ovom otkriću). Alternativno, jedan deo BsAb može biti opremljen da se vezuje za ciljni antigen sortilina, a drugi se može kombinovati sa granom koji se vezuje za drugi protein. Takva antitela mogu biti izvedena iz antitela pune dužine ili fragmenata antitela (npr. F(ab’)2bispecifična antitela).
[0229] Postupci za stvaranje bispecifičnih antitela poznati su u tehnici. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine zasniva se na koekspresiji dva para imunoglobulinskog teškog lanca/lakog lanca, gde dva lanca imaju različite specifičnosti. Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983). Zbog nasumičnog sortiranja teških i lakih lanaca imunoglobulina, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima ispravnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje ispravnog molekula, koje se obično vrši koracima afinitetne hromatografije, prilično je glomazno, a prinosi proizvoda su niski. Slični postupci su otkriveni u WO 93/08829 i u Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
[0230] Prema drugačijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta kombinovanja antitela i antigena) su fuzionisani sa sekvencama konstantnih domena imunoglobulina. Fuzija je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži najmanje deo povezujućih CH2 i CH3 regiona. Poželjno je da prvi konstantni region teškog lanca (CH1) obuhvati mesto potrebno za vezivanje lakog lanca, prisutno u najmanje jednoj od fuzija. DNKs koje kodiraju fuzije teških lanaca imunoglobulina i, po želji, laki lanac imunoglobulina, ubacuju se u odvojene ekspresione vektore i kotransfektuju u odgovarajući organizam domaćina. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost u podešavanju međusobnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u primerima izvođenja kada nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca koji se koriste u konstrukciji obezbeđuju optimalne prinose. Moguće je, međutim, umetnuti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultuje visokim prinosima ili kada odnosi nemaju poseban značaj.
[0231] U poželjnom primeru izvođenja ovog pristupa, bispecifična antitela su sastavljena od hibridnog teškog lanca imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja u jednoj grani, i hibridnog para teškog lanca i lakog lanca imunoglobulina (koji obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja) u drugoj grani. Utvrđeno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanaca imunoglobulina, jer prisustvo lakog lanca imunoglobulina samo u polovini bispecifičnih molekula obezbeđuje lak način razdvajanja. Ovaj pristup je otkriven u WO 94/04690. Za više detalja o stvaranju bispecifičnih antitela, videti, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology 121: 210 (1986).
[0232] Prema drugom pristupu opisanom u WO 96/27011 ili U.S. Patent No. 5,731,168, interfejs između para molekula antitela može biti projektovan tako da maksimizira procenat heterodimera koji se oporavljaju iz kulture rekombinantnih ćelija. Poželjni interfejs sadrži najmanje deo CH3 regiona konstantnog domena antitela. U ovoj postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina sa interfejsa prvog molekula antitela zamenjeni su većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzatorne „šupljine“ iste ili slične veličine za velike bočne lance stvaraju se na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina sa manjima (na primer, alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera nad drugim neželjenim krajnjim proizvodima, kao što su homodimeri.
[0233] U literaturi su opisane tehnike stvaranja bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela. Na primer, bispecifična antitela se mogu pripremiti korišćenjem hemijskog povezivanja. Brennan et al., Science 229:81 (1985) opisuju postupak pri čemu se intaktna antitela proteolitički cepaju da bi nastali F(ab’)2fragmenti. Ovi fragmenti se smanjuju u prisustvu ditiol kompleksnog sredstva natrijum arsenita da bi se stabilizovali vicinalni ditioli i sprečilo međumolekulsko stvaranje disulfida. Generisani Fab’ fragmenti se zatim pretvaraju u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od derivata Fab'-TNB se zatim ponovo pretvara u derivat Fab'-TNB da bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao sredstva za selektivnu imobilizaciju enzima.
[0234] Fab’ fragmenti se mogu direktno oporaviti od E. coli i hemijski kuplovati da bi se formirala bispecifična antitela. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) opisuje proizvodnju potpuno humanizovanih molekula bispecifičnog antitela F(ab’)2. Svaki Fab' fragment je odvojeno izlučen iz E. coli i podvrgnut usmerenom hemijskom kuplovanju in vitro da bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo je moglo da se veže za ćelije koje prekomerno eksprimiraju ErbB2 receptor i normalne humane T-ćelije, kao i da pokrene litičku aktivnost humanih citotoksičnih limfocita protiv ciljanih humanih tumora dojke.
[0235] Opisane su i različite tehnike za pravljenje i izolovanje fragmenata bivalentnih antitela direktno iz kulture rekombinantnih ćelija. Na primer, bivalentni heterodimeri proizvedeni su pomoću leucinskih patentnih zatvarača. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Peptidi leucinskih patentnih zatvarača iz Fos i Jun proteina povezani su sa Fab’ delovima dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su smanjeni u regionima povezivanja da bi se formirali monomeri, a zatim su ponovo oksidovani da bi se formirali heterodimeri antitela. Tehnologija „dijatela“ koju su opisali Hollinger et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) obezbedila je alternativni mehanizam za stvaranje fragmenata bispecifičnih/bivalentnih antitela. Fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) pomoću linkera koji je prekratak da bi se omogućilo sparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VHi VLdomeni jednog fragmenta su prisiljeni da se spare sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, formirajući tako dva mesta za vezivanje antigena. Takođe je prijavljena druga strategija za stvaranje fragmenata bispecifičnih/bivalentnih antitela upotrebom jednolančanih Fv (sFv) dimera. Videti Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).
[0236] Takođe se razmatraju antitela sa više od dve valencije. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt et al., J. Immunol.147:60 (1991).
[0237] Ogledna bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa na datom molekulu (npr., proteinu sortilina prema ovom otkriću). Alternativno, grana koja ciljano deluje na signalnu komponentu sortilina može se kombinovati sa granom koja se vezuje za molekul okidača na leukocitu kao što je molekul receptora T-ćelije (npr. CD2, CD3, CD28 ili B7) ili Fc receptori za IgG (FcγR), kao što su FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD16) tako da se fokusiraju ćelijski odbrambeni mehanizmi na ćeliju koja eksprimira određeni protein. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih sredstava u ćelijama koje eksprimiraju određeni protein. Takva antitela poseduju granu za vezivanje proteina i granu koja vezuje citotoksično sredstvo ili radionuklidni helator, kao što su EOTUBE, DPTA, DOTA ili TETA. Drugo bispecifično antitelo od interesa vezuje proteine od interesa i dalje vezuje tkivni faktor (TF).
12
(7) Multivalentna antitela
[0238] Multivalentno antitelo može biti internalizovano (i/ili katabolizovano) brže od dvovalentnog antitela pomoću ćelije koja eksprimira antigen za koji se vezuju antitela. Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću ili njihovi fragmenti antitela mogu biti multivalentna antitela (koja su drugačija od klase IgM) sa tri ili više mesta za vezivanje antigena (npr. tetravalentna antitela), koja se lako mogu proizvesti rekombinantnom ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela. Multivalentno antitelo može sadržati domen dimerizacije i tri ili više mesta za vezivanje antigena. Poželjni domen dimerizacije sadrži Fc region ili region povezivanja. U ovom scenariju, antitelo će sadržati Fc region i tri ili više mesta za vezivanje antigena, amino-terminal za Fc region. Poželjno multivalentno antitelo ovde obuhvata tri do oko osam, ali poželjno četiri mesta za vezivanje antigena. Multivalentno antitelo obuhvata najmanje jedan polipeptidni lanac (i poželjno dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanac ili lanci sadrže dva ili više varijabilnih domena. Na primer, polipeptidni lanac ili lanci mogu sadržati VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen, VD2 je drugi varijabilni domen, Fc je jedan polipeptidni lanac Fc regiona , X1 i X2 predstavljaju aminokiselinu ili polipeptid, a n je 0 ili 1. Slično, polipeptidni lanac ili lanci mogu sadržati lanac VH-CH1-fleksibilni povezivač-VH-CH1-Fc regiona lanca; ili VH-CH1-VH-CH1-Fc regiona lanca. Ovde multivalentno antitelo poželjno dalje sadrži najmanje dva (a poželjno četiri) polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Ovde multivalentno antitelo može, na primer, sadržati od oko dva do oko osam polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Polipeptidi varijabilnog domena lakog lanca koji se ovde razmatraju sadrže varijabilni domen lakog lanca i, izborno, dalje sadrže CL domen. Multivalentna antitela mogu prepoznati antigen sortilina, kao i, bez ograničenja, dodatne antigene A beta peptida, antigen ili alfa sinuklain proteinski antigen ili, Tau proteinski antigen ili, TDP-43 proteinski antigen ili, antigen proteina priona ili, antigen proteina huntingtin , ili RAN, antigen produkta translacije, uključujući dipeptidne ponovke (DPRs peptide) sastavljene od glicin-alanina (GA), glicin-prolina (GP), glicin-arginina (GR), prolin-alanina (PA) ili prolin- arginina (PR), receptora insulina, receptora faktora rasta sličanog insulinu, receptora transferina ili bilo koji drugi antigen koji olakšava prenos antitela kroz krvno -moždanu barijeru.
(8) Heterokonjugovana antitela
[0239] Heterokonjugovana antitela su takođe u obimu ovog otkrića. Heterokonjugovana antitela se sastoje od dva kovalentno spojena antitela (npr. antitela protiv sortilina prema ovom otkriću ili njihovih fragmenata antitela). Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može biti kuplovano za avidin, drugo za biotin. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljano deluju na ćelije imunog sistema na neželjene ćelije, U.S. Patent No. 4,676,980, i korišćena su za lečenje HIV infekcije. Međunarodne publikacije Br-jevi WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 0308936. Smatra se da se antitela mogu pripremiti in vitro koristeći poznate postupke u hemiji sintetičkih proteina, uključujući i one koje uključuju sredstva za unakrsno povezivanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati primenom reakcije razmene disulfida ili formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat i one koji su otkriveni, na primer, u U.S. Patent No.
4,676,980. Heterokonjugovana antitela mogu se napraviti bilo kojim prikladnim postupkom unakrsnog povezivanja. Pogodna sredstva za unakrsno povezivanje su dobro poznati u tehnici i otkrivena su u U.S. Patent No. 4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama unakrsnog povezivanja.
(9) Stvaranje efektorske funkcije
[0240] Takođe može biti poželjno modifikovati antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću da bi se izmenila efektorska funkcija i/ili povećao poluživot antitela u serumu. Na primer, mesto vezivanja Fc receptora u konstantnom regionu može biti modifikovano ili mutirano da bi se uklonio ili smanjio afinitet vezivanja za određene Fc receptore, kao što su FcγRI, FcγRII i/ili FcγRIII. U nekim primerima izvođenja, efektorska funkcija je izmenjena uklanjanjem N-glikozilacije Fc regiona (npr. u CH2 domenu IgG) antitela. U nekim primerima izvođenja, efektorska funkcija je izmenjena modifikovanjem regiona kao što su 233-236, 297, i/ili 327-331 humanog IgG, kako je opisano u PCT WO 99/58572 i Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000).
[0241] Da bi se povećao poluživot antitela u serumu, može se uključiti epitop koji se vezuje za spasonosne receptore u antitelu (posebno fragment antitela) kao što je opisano u U.S. Patent 5,739,277, na primer. Kako je upotrebljen ovde, termin "epitop koji se vezuje za spasonosne receptore" odnosi se na epitop Fc regiona molekula IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3ili IgG4) koji je odgovoran za in vivo povećanje poluživota molekula IgG u serumu.
12
(10) Ostale modifikacije sekvence aminokiselina
[0242] Takođe se razmatraju modifikacije sekvence aminokiselina antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, ili njihovi fragmenti antitela. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela ili fragmenata antitela. Varijante sekvence aminokiselina antitela ili fragmenata antitela se pripremaju uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u nukleinsku kiselinu koja kodira antitela ili fragmente antitela, ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, delecije iz, i/ili umetanje u i/ili supstitucije ostataka unutar sekvenci aminokiselina antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije se postiže da bi se došlo do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt poseduje željene karakteristike (tj. sposobnost vezivanja ili fizičke interakcije sa proteinom sortilina prema ovom otkriću). Promene aminokiselina takođe mogu promeniti post-translacione postupke antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.
[0243] Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona antitela protiv sortilina koja su poželjna mesta za mutagenezu naziva se „mutageneza skeniranja alanina“ kako je opisano od strane Cunningham and Wells in Science, 244:1081-1085 (1989). Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) da bi uticali na interakciju aminokiselina sa ciljanim antigenom. Ona mesta aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim poboljšavaju uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Dakle, iako je mesto za uvođenje varijacije sekvence aminokiselina unapred određeno, priroda mutacije sama po sebi ne mora biti unapred određena. Na primer, da bi se analizirale performanse mutacije na datom mestu, vrši se skeniranje alanina ili nasumična mutageneza na ciljanom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante antitela se pregledaju na željenu aktivnost.
[0244] Insercija sekvence aminokiselina uključuje amino- („N”) i/ili karboksi- („C”) terminalne fuzije koje su u opsegu u dužini od jednog ostatka do polipeptida koji obuhvataju stotinu ili više ostataka, kao i umetanja insercije unutar sekvence pojedinačnih ili više ostataka aminokiselina. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom ili antitelo fuzionisano sa citotoksičnim polipeptidom. Druge varijante insercija
12
molekula antitela uključuju fuziju na N- ili C-terminalnom kraju antitela za enzim ili polipeptid koji povećava poluživot antitela u serumu.
[0245] Druga vrsta varijante je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu antitela zamenjen drugim ostatkom. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali se takođe razmatraju FR promene. Konzervativne zamene su prikazane u Tabeli B u nastavku pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ako takve supstitucije dovedu do promene biološke aktivnosti, tada se značajnije promene, označene kao „ogledne supstitucije“ u Tabeli B, ili kako je dalje opisano u nastavku u odnosu na klase aminokiselina, mogu uvesti a produkti se mogu pregledati.
TABELA B: Supstitucije aminokiselina
12
[0246] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima antitela postižu se odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom efektu na održavanje (a) strukture polipeptidne okosnice u oblasti supstitucije, na primer, u obliku ploče ili heliks konformacije, ( b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) najvećeg dela bočnog lanca. Prirodni ostaci su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:
(1) hudrofobni: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutralno hidrofilni: cys, ser, thr;
(3) kiseli: asp, glu;
(4) bazni: asn, gln, his, lys, arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i
(6) aromatični: trp, tyr, phe.
[0247] Ne-konzervativne supstitucije podrazumevaju zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.
[0248] Bilo koji ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije antitela takođe može biti supstituisan, generalno serinom, da bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo aberantno unakrsno povezivanje. Nasuprot tome, cisteinska veza(e) mogu se dodati antitelu da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito tamo gde je antitelo fragment antitela, kao što je Fv fragment).
[0249] Posebno poželjan tip varijante supstitucije uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona parenteralnog antitela (npr. humanizovano ili humano antitelo protiv sortilina). Generalno, nastala varijanta (varijante) odabrane za dalji razvoj imaće poboljšana biološka svojstva u odnosu na parentalno antitelo iz kojeg se stvaraju. Pogodan način za stvaranje takvih varijanti supstitucija uključuje afinitetno sazrevanje pomoću prikaza faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr. 6-7 mesta) su mutirana da bi se stvorile sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Tako stvorene varijante antitela prikazane su na monovalentan način iz filamentoznih čestica faga kao fuzije sa produktom gena III M13 upakovanog unutar svake čestice. Varijante prikazane fagom se
12
zatim pregledaju na njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet za vezivanje) kao što je ovde otkriveno. Da bi se identifikovala potencijalna mesta hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvršiti mutageneza skeniranja alanina da bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena (npr. protein sortilin prema ovom otkriću). Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde razrađene. Kada se takve varijante stvore, panel varijanti se podvrgava skriningu kao što je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih analiza mogu biti odabrana za dalji razvoj.
[0250] Druga vrsta varijante aminokiselina antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Pod promenom se podrazumeva brisanje jednog ili više ugljenohidratnih delova koji se nalaze u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koje nisu prisutne u antitelu.
[0251] Glikozilacija antitela je tipično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezano se odnosi na vezivanje ugljenohidratnog dela na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenohidratnog dela na bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktosamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
[0252] Dodavanje mesta glikozilacije u antitelo pogodno se postiže promenom sekvence aminokiselina tako da ona obuhvata jednu ili više prethodno opisanih sekvenci tripeptida (za N-vezana mesta glikozilacije). Do promene može doći i dodavanjem ili supstitucijom jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka u sekvenci originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).
[0253] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante sekvence aminokiselina anti-IgE antitela se pripremaju različitim postupcima poznatim u tehnici. Ovi postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti sekvenci aminokiselina) ili pripremu mutagenezom posredovanom oligonukleotidom (ili usmerenom na mesto), PCR mutagenezom i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene varijante ili ne-
12
varijantne verzije antitela (npr. antitela protiv sortilina prema ovom otkriću) ili fragmenata antitela.
(11) Druge modifikacije antitela
[0254] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, ili njihovi fragmenti antitela, mogu se dalje modifikovati tako da obuhvataju dodatne ne-proteinske ostatke koji su poznati u tehnici i lako su dostupni. Poželjno, grupe pogodne za derivatizaciju antitela su polimeri rastvorljivi u vodi. Neograničavajući primeri polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali se ne ograničavaju na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli -1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/malein anhidrid, poliaminokiseline (bilo homopolimeri ili nasumični kopolimeri), i dekstran ili poli (n-vinil pirolidon) polietilen glikol, homopolimeri polipropilen glikola, ko-polimeri polipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilirani polioli (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, a može biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera vezanih za antitelo može varirati, a ako je vezano više polimera, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja uključujući, ali ne ograničavajući se na, posebna svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li će se derivat antitela koristiti u terapiji pod definisanim uslovima, itd. Takve tehnike i druge pogodne formulacije su otkrivene u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).
Analize vezivanja i druge analize
[0255] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu se testirati na aktivnost vezivanja antigena, na primer, poznatim postupcima kao što su ELISA, površinska plazmonska rezonanca (SPR), Western blot itd.
[0256] U nekim primerima izvođenja, analize kompeticije se mogu koristiti za identifikaciju antitela koje je u kompeticiji sa bilo kojim od antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili odabrano od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-
1
2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. U određenim primerima izvođenja, takvo kompetitivno antitelo se vezuje za isti epitop (npr., linearni ili konformacioni epitop) koji je vezan za bilo koje od antitela navedenih u Tabelama 1-3 i 11-15, ili odabrano od S-1, S-2, S-2-1, S-2-2, S-2-3, S-2-4, S-2-5, S-2-6, S-2-7, S-2-8, S-2-9, S-2-10, S-2-11, S-2-12, S-2-13, S-2-14, S-2-15, S-3, S-4, S-5, S-6, S-7, S-8, S-9, S-10, S-11, S-12, S-13, S-14, S-15, S-15-1, S-15-2, S-15-3, S-15-4, S-15-5, S-15-6, S-15-6-1, S-15-6-2, S-15-6-3, S-15-6-4, S-15-6-5, S-15-6-6, S-15-6-7, S-15-6-8, S-15-6-9, S-15-6-10, S-15-6-11, S-15-6-12, S-15-6-13, S-15-7, S-15-8, S-15-9, S-15-10, S-15-10-1, S-15-10-2, S-15-10-3, S-15-10-4, S-15-10-5, S-15-10-6, S-15-10-7, S-15-10-8, S-15-10-9, S-15-10-10, S-15-10-11, S-15-10-12, S-15-10-13, S-15-10-14, S-15-10-15, S-15-10-16, S-15-10-17, S-15-10-18, S-15-10-19, S-15-10-20, S-15-10-21, S-15-11, S-15-12, S-15-13, S-15-14, S-15-15, S-15-16, S-16, S-17, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-22-1, S-22-2, S-22-3, S-22-4, S-22-5, S-22-6, S-22-7, S-22-8, S-22-9, S-23, S-24, S-25, S-26, S-27, S-28, S-29, S-30, S-31, S-32, S-33, S-34, S-35, S-36, S-37, S-38, S-39, S-40, S-41, S-42, S-43, S-44, S-45, S-46, S-47, S-48, S-49, S-50, S-51, S-52, S-53, S-54, S-55, S-56, S-57, S-58, S-59, S-60, S-60-1, S-60-2, S-60-3, S-60-4, S-60-5, S-60-6, S-60-7, S-60-8, S-60-9, S-61, S-62, S-63, S-64, S-65, S-66, S-67, S-68, S-69, S-70, S-71, S-72, S-73, S-74, S-75, S-76, S-77, S-78, S-79, S-80, S-81, S-82, S-82-1, S-82-2, S-82-3, S-82-4, S-82-5, S-82-6, S-82-7, S-82-8, S-83, S-84, i S-85. Detaljni ogledni postupci za mapiranje epitopa na koji se vezuje
1 1
antitelo su obezbeđeni u Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
[0257] U oglednoj analizi kompeticije, imobilizovani sortilin ili ćelije koje eksprimiraju sortilin na površini ćelije inkubiraju se u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za sortilin (npr. humani ili ne-humani primati) i drugo neobeleženo antitelo koje se testira zbog njegove sposobnosti da bude u kompeticiji sa prvim antitelom za vezivanje za sortilin. Drugo antitelo može biti prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilizovani sortilin ili ćelije koje eksprimiraju sortilin inkubiraju se u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije u uslovima dozvoljenim za vezivanje prvog antitela za sortilin, uklanja se višak nevezanog antitela i meri se količina oznake povezane sa imobilizovanim sortilinom ili ćelijama koje eksprimiraju sortilin. Ako je količina oznake povezane sa imobilizovanim sortilinom ili ćelijama koje eksprimiraju sortilin značajno smanjena u testiranom uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, to znači da je drugo antitelo u kompeticiji sa prvim antitelom za vezivanje za sortilin. Videti, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Analize vezivanja liganda
[0258] Ovde su dalje obezbeđeni postupci skrininga za antitela protiv sortilina koja vezuju Lys260, Phe314, Ser316, Ile329, Arg325, Arg326, Tyr351, Ser352, i/ili Ile353 humanog sortilina, i koje blokiraju interakcije između sortilina i liganda sortilina (npr. progranulin, proneurotrofin, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE). U nekim primerima izvođenja, može se sintetisati biblioteka peptida u kojoj se protein sortilin seče na uzastopne 15-merne i 25-merne peptide odvojene jednim aminokiselinskim ostatkom i zatim uočene na filterima. Vezivanje liganda sortilina se tada može testirati na njegovu sposobnost interakcije sa peptidom receptora ili sa peptidima koji su, na primer, mutirali na Lys260, Phe314, Ser316, Ile329, Arg325, Arg326, Tyr351, Ser352, i/ili Ile353 biblioteka humanih sortilina u prisustvu ili odsustvu antitela protiv sortilina pomoću SPOT analize vezivanja (npr. Frank, R and Overwin, H (1996) Methods. Mol. Biol.66, 149-169; Reineke, U et al., (2002) J. Immunol. Methods 267, 13-26; i Andersen, OS et al., (2010) J, BIOLOGICAL CHEMISTRY 285, 12210-12222). U nekim primerima izvođenja, biblioteke peptida za članove familije
1 2
gena receptora VPS10p domena ili specifične varijacije peptida u smislu supstitucije ili analiza dužine identifikovanih peptida koji vezuju ligande mogu se konstruisati na celuloznoj membrane. U nekim primerima izvođenja, ukupno 2181 peptida se može koristiti za predstavljanje familije gena sortilina, uključujući 273 peptida za sortilin (pristupni broj CAA66904), sa preklapanjem od 13 aminokiselina između 16-mernih peptida (Frank, R (1992) Tetrahedron 48, 9217-9232). U nekim primerima izvođenja, celulozna potpora može biti pripremljena kao N-modifikovana celulozo -aminohidroksilpropil etar membrana, a svi krugovi sinteze započinju sa tačkastom definicijom pomoću 9-fluorenilmetoksikar-bonialaninpentafluoofenil estra koji stvara alaninski poveyivač između peptida i membrane. Na primer, automatizovana linearna sinteza postepenog dodavanja različitih aminokiselina zaštićenih na njihovom N-terminalnom kraju pomoću 9-fluorenil-metoksikarbonil i odgovarajuća zaštita bočnog lanca za rastući lanac peptida. U nekim primerima izvođenja, obrazac uklanjanja zaštitne grupe, aktivacije i kuplovanje se nastavlja sve dok se ne proizvedu 16-merni peptidi, što rezultuje ravnomerno raspoređenim nizom kovalentno postavljenih peptida na nosač celuloze na njihovim C-terminalnim krajevima sa slobodnim N-terminalnim krajevima (Scharn, D et al., (2000) J. Comb. Chem. 2, 361-369). U nekim primerima izvođenja, uklanjanje bočne zaštitne grupe može se izvršiti u dva koraka. Prvo, membrana se može tretirati sa 90% trifluorosirćetne kiseline (u dihlormetanu, koja obuhvata 3% triizobutilsilana i 2% H2O); i drugo sa, na primer, 60% trifluorosirćetne kiseline (u dihlormetanu, koji obuhvata 3% triizobutilsilana i 2% H2O). Za uklanjanje soli trifluorosirćetne kiseline, membrana se može isprati nekoliko puta sa H2O, etanolom, Tris- puferisanim fiziološkim rastvorom i etanolom, a zatim osušiti. Konačno, membrana je blokirana u blokirajućem puferu dilatiranom u Tris-puferovanom fiziološkom rastvoru (pH 8.0) i dopunjena sa 5% saharoze 2 sata pre nego što unapred definisana biblioteka peptida bude spremna za analizu vezivanja liganda. U nekim primerima izvođenja, za studije vezivanja peptida vezanih za celulozu, biblioteke vezane za membranu mogu se inkubirati sa kombinovanim S-peptidnim i polihistidinski označenim ligandima u prisustvu ili odsustvu antitela protiv sortilina, na primer, u blokirajućem puferu preko noći na 4 °C, nakon čega sledi druga inkubacija sa 1 mg/ml HRP-konjugovanog S-proteina takođe u puferu za blokiranje, ali tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, membrana se može isprati, na primer, tri puta po 10 minuta sa Tris- puferisanim fiziološkim rastvorom, pre nego što se može izvršiti kvantitativna karakterizacija vezanog liganda pomoću UptiLight hemiluminiscentne podloge i LumiImager instrumenta, obezbeđujući intenzitetete
1
tačkastih signala u Boehringer-ovim jedinicama svetlosti. Alternativno, detekcija vezanog liganda može se izvršiti imunohemijskom analizom sa antitelom protiv histidinske oznake iz i sekundarnog anti-mišjeg antitela konjugovanog sa HRP. Inkubacije se mogu izvesti primenom standardnih Western blot procedura i detekcijom tačaka.
[0259] Ovde su dalje obezbeđeni postupci skrininga za antitela protiv sortilina koja blokiraju interakcije (npr. vezivanje) sortilina i liganda sortilina (npr. progranulin, pro-neurotrofin, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP , LpL, APOA5, APOE).
[0260] U nekim primerima izvođenja, obeleženi oblici liganda sortilina za detekciju, konstrukti se mogu pripremiti za svaki protein koji omogućavaju dodavanje N-terminalnog S-peptida i polihistidinskih oznaka. Templat cDNK za humani NGF i BDNF uključuje ATCC klonove koji se koriste za generisanje fragmenata koji obuhvataju ostatke Glu<1>–Arg<102>NGF i Ala<1>–Arg<110>BDNF pomoću para prajmera 5′-GGTATTGAGGGTCGCGAACCACACTCAGAGAGCAATGTCCC-3′ (SEQ ID BR:695) i 3′-GGGGGAAGTTGTCCTGAGTGTCCTCGTTCGCCACTCCGAG ATTGAGAGGAGA-5′ (SEQ ID BR: 696); i para prajmera 5′-GGTATTGAGGGTCGCGC CCCCATGAAAGAAGCAAACAT CCGAGG-3′ (SEQ ID BR: 697) i 3′-CACGTTTGTAC AGGTACTCCCAGGCCGCGACTCCGAGATTGA GAGGAGA-5′ (SEQ ID BR: 698). cDNK može uključivati kompatibilna nadvišenjaza kloniranje nezavisno od ligacije u vektoru pET-30 Xa/LIC, i amplifikaciju pomoću DNK polimeraze za fuziju i prema protokolu koji je obezbedio proizvođač. Proteini se mogu eksprimirati u BL21/DE3 soju Escherichia coli, efikasno ekstrahovati iz bakterijskih inkluzivnih tela korišćenjem Bugbuster-ovog reagensa sa dodatkom benzonaze, i prečistiti standardnom afinitetnom hromatografijom na osnovu niklnitrilotrisirćetne kiseline, na primer, u 500 mM NaCl, 5 mM imidazolu, i 20 mM Tris-HCl, pH 8.0. Elucija proteina se vrši u puferu dopunjenom sa 20 mM EDTA. Provera intaktnih označenih verzija HisS-NGFpro i HisS-BDNFpro može se izvršiti pomoću SDS-PAGE analize, nakon čega sledi Coomassie bojenje ili Western blot analiza korišćenjem bilo antitela protiv histidinske oznake iz Sigme (H-1029) i sekundarnog anti-mišjeg antitela konjugovanog sa HRP, ili alternativno direktnim vezivanjem HRP-konjugovanog S-proteina iz Novagena (kataloški br. 69047-3) (npr. Andersen, OS et al., P (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210–12222). Slični postupci se takođe mogu koristiti za generisanje GST-označenih liganda sortilina (npr. Quistgaard, EM et al., (2009) Nat. Struct. Mol. Biol.16, 96–98).
1 4
[0261] U nekim primerima izvođenja, interakcija između sortilina i liganda sortilina (npr. progranulina, pro-neurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) može se okarakterisati pomoću analize površinske plazmonske rezonance (npr. Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287:43798; i Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). Određivanje direktnog vezivanja liganda sortilina za imobilizovani sortilin u prisustvu ili odsustvu blokirajućih antitela protiv sortilina može se izvršiti, na primer, na instrumentu Biacore2000 (Biacore, Švedska) koristeći CaHBS kao standardni aktivni pufer (10 mM HEPES, pH 7.4 , 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM EGTA i 0.005% Tween 20). U nekim primerima izvođenja, Biacore biosenzorski čip (CM5) može se aktivirati primenom NHS/EDC postupka, nakon čega sledi premazivanje sortilinom do gustine proteina od 79 fmol/mm<2>i koristiti se za merenje afiniteta rekombinantnih pro-domena NGF, BDNF , i NT3. Priprema površine biosenzora sa pro-sortilinom će slediti istu proceduru. Regeneracija protočne ćelije nakon svakog ciklusa eksperimenata vezivanja liganda može se izvršiti pomoću dva impulsa od 10 μl pufera za regeneraciju (10 mM glicin-HCl, pH 4.0, 500 mM NaCl, 20 mM EDTA i 0.005% Tween 20) i jednim ubrizgavanjem 0.001% SDS. Prilagođavanje senzorgrama za procenu afiniteta može se izvršiti, na primer, korišćenjem BIAevaluation verzija 3.1. Prateći slične protokole, imobilizacija HisS-NGFpro ili HisS-BDNFpro takođe se može izvršiti na CM5 biosenzorskom čipu pomoću kompleta za kuplovanje NHS/EDC, koji daju slične površinske gustine imobilizovanog proteina (∼300 fmol/mm<2>). Biosenzorski čip sa imobilizovanim NGFpro ili BDNFpro može se takođe koristiti za ispitivanje vezivanja sortilina u odsustvu ili prisustvu kompetitivnih antitela sortilina. Neobrađene verzije pro-NGF i pro-BDNF, kao i drugi ligandi sortilina (npr. protein povezan sa receptorom (RAP), neurotenzin, progranulin, p75, LpL, APOA5, APOE ili APP) takođe se mogu primeniti na imobilizovanom sortilinu a vezivanje u odsustvu ili prisustvu kompetitivnih antitela se može meriti.
[0262] U nekim primerima izvođenja, interakcija između sortilina i liganda sortilina (npr. progranulina, pro-neurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) može se okarakterisati pomoću pulldown analize (npr. Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). Na primer, eksprimirani vanćelijski domeni sortilina mogu se inkubirati sa označenim ligandima sortilina u odsustvu ili prisustvu antitela koja blokiraju sortilin i talože se pomoću 100 µl kuglica glutation (GSH)-sefaroze (Amersham Biosciences, kataloški br. 17-0756-01). Količina
1
primenjenih domena receptora može se odrediti taloženjem koristeći Talon kuglice kao kontrolu. Vezani proteini se mogu odvojiti SDS-PAGE analizom i vizualizovati pomoću antitela protiv histidina standardnom Western blot analizom.
[0263] U nekim primerima izvođenja, interakcija između sortilina i liganda sortilina (npr. progranulina, pro-neurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) može se okarakterisati korišćenjem proteina vezanih za celulozu (npr. Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222). Na primer, proteini vezani za membranu mogu se inkubirati sa S-peptidom i polihistidinom označenim pro-NGF, pro-BDNF, progranulinom ili drugim ligandom sortilina, kao što su progranulin, pro-neurotrofin, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5 ili APOE; u puferu za blokiranje preko noći na 4 °C, nakon čega sledi druga inkubacija sa 1 μg/ml HRP-konjugovanog S-proteina takođe u puferu za blokiranje, ali tokom 3 sata na sobnoj temperaturi. Nakon toga, membrana se može isprati tri puta tokom 10 minuta sa Trispuferisanim fiziološkim rastvorom pre nego što se izvrši kvantitativna karakterizacija vezanog liganda pomoću UptiLight hemiluminiscentnog supstrata i LumiImager instrumenta, obezbeđujući tačkaste intenzitete signala u Boehringer-ovim jedinicama svetlosti. Alternativno, detekcija vezanog liganda može se izvršiti imunohemijskom analizom sa antitelom protiv histidinske oznake i sekundarnim anti-mišjim antitelom konjugovanim sa HRP. Inkubacije mogu pratiti standardna Western blot analiza i detekcija tačaka.
[0264] U nekim primerima izvođenja, interakcija između sortilina i liganda sortilina (npr. progranulina, pro-neurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5, APOE) može se okarakterisati pomoću analize blizinske ligacije (npr. Gustafsen, C et al., (2013) The Journal of Neuroscience, 33:64-71). Na primer, analiza blizinske ligacije (PLA) (DuolinkII) na ćelijama koje eksprimiraju ili su izložene sortilinu i njegovom partneru za vezivanje može se izvesti sa primarnim antitelima anti-sortilin/F11, anti-sorLA/20C11 i antitelima protiv partnera za vezivanje, kao što su anti-APP/AF1168 antitela, nakon čega sledi inkubacija sa sekundarnim antitelima konjugovanim na oligonukleotidima, koja se hibridizuju da bi se naknadno dodali oligonukleotidima koji formiraju krug i podstiču kotrljajući krug amplifikacije kada se antigeni nalaze u blizini od 40 nm. Amplifikovana DNK se može vizuelizovati dodavanjem komplementarnih fluorescentno obeleženih oligonukleotida.
[0265] U nekim primerima izvođenja, interakcija između sortilina i liganda sortilina (npr. progranulina, pro-neurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, pro-NT3, p75, APP, LpL, APOA5,
1
APOE) može se okarakterisati korišćenjem liganda označenih alkalnom fosfatazom u analizama vezivanja ćelija (npr. Hu, F et al., (2005) J. Neurosci.25, 5298-5304; Fournier, AE et al., (2001) Nature 409, 341-346; Lauren, J et al., (2009) Nature 457, 1128-1132; i Hu, F et al., (2010) Neuron 68, 654-667). Na primer, mogu se napraviti ligandi označeni alkalnom fosfatazom (AP) za procenu vezivanja za sortilin na transficiranim ćelijama ili primarnim neuronima. Da bi se otkrilo vezivanje liganda označenog sa AP za ćelije koje eksprimiraju sortilin, kulture se mogu oprati, na primer, Hanks-ovim izbalansiranim rastvorom soli koji obuhvata 20 mM natrijum HEPES, pH 7.05 i 1 mg ml-1 goveđeg seruma albumina (BSA) (HBH). Zatim se pločice mogu inkubirati sa AP označenim ligandima u prisustvu ili odsustvu antitela koja blokiraju sortilin, na primer, u HBH 2 sata na 23 °C. Ligandi vezan za AP mogu se detektovati i kvantifikovati prema postupcima dobro poznatim u tehnici.
Analize bazirane na ćelijama
[0266] Ovde su dalje obezbeđeni postupci skrininga za antagoniste koji vezuju sortilin, kao što je antitelo protiv sortilina, koji uključuju sredstva za dovođenje u kontakt (npr. antitela protiv sortilina) sa ćelijom koja eksprimira protein sortilin na svojoj površini ćelije. U nekim primerima izvođenja, sredstvo i ćelija su dalje u kontaktu sa ligandom sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, sama ćelija eksprimira ligand sortilina prema ovom otkriću. Postupci zasnovani na ćelijama su posebno pogodni za skrining i validaciju antagonista koji vezuju sortilin (npr. antitela protiv sortilina) procenom efekta na interakciju između sortilina i liganda sortilina u kontekstu ćelije.
[0267] Shodno tome, određeni aspekti ovog otkrića se odnose na ćeliju koja na svojoj površini ćelije eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ćelija endogeno eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ćelija je rekombinantno konstruisana da eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću. U bilo kom od ovih primera izvođenja, protein sortilin prema ovom otkriću (bio endogen ili rekombinantni) kodiran polinukleotidom poželjno će uključivati najmanje proteinske domene potrebne za post-translacionu obradu, membransku translokaciju i ciljano delovanje na površinu ćelije, uključujući bez ograničenja signalni peptid i transmembranski domen. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid i/ili transmembranski domen mogu se odnositi na endogeni signalni peptid sortilina i/ili transmembranski domen. U drugim primerima
1
izvođenja, signalni peptid i/ili transmembranski domen mogu se odnositi na egzogeni signalni peptid i/ili transmembranski domen za koji je poznato da promoviše ekspresiju na površini ćelije u željenoj ćeliji domaćinu. U poželjnim primerima izvođenja, protein sortilin će takođe obuhvatati domen dovoljan za vezivanje liganda sortilina prema ovom otkriću.
[0268] Standardne molekularno -biološke tehnike dobro poznate u tehnici, kao što su one opisane i one na koje se poziva u ovom otkriću, mogu se koristiti za rekombinantno projektovanje ćelije (npr. ćelija domaćina prema ovom otkriću) za ekspresiju proteina sortilina prema ovom otkriću . U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju kultivisanje ćelije domaćina prema ovom otkriću koja obuhvata polinukleotid koji kodira protein sortilin prema ovom otkriću, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela.
[0269] Za rekombinantnu proizvodnju proteina sortilina prema ovom otkriću, izoluje se nukleinska kiselina koja kodira protein sortilin i koja je insertovana u jedan ili više vektora zbog daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina može se lako izolovati i sekvencirati primenom konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gen koji kodira protein sortilin).
[0270] Pogodni vektori koji obuhvataju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bilo koji od proteina sortilina prema ovom otkriću, ili njihove fragmente eksprimirane na površini ćelije, opisani ovde uključuju, bez ograničenja, vektore za kloniranje i ekspresione vektore. Pogodni vektori za kloniranje mogu se konstruisati prema standardnim tehnikama, ili se mogu odabrati iz velikog broja vektora za kloniranje koji su dostupni u tehnici. Dok odabrani vektor za kloniranje može varirati u zavisnosti od ćelije domaćina koja se namerava koristiti, korisni vektori za kloniranje generalno imaju sposobnost samoreplikacije, mogu posedovati jedno ciljano delovanje za određenu restrikcionu endonukleazu i/ili mogu nositi gene za marker koji se može koristiti za odabir klonova koji obuhvataju vektor. Odgovarajući primeri uključuju plazmide i bakterijske viruse, npr. pUC18, pUC19, Bluescript (npr. pBS SK+) i njegove derivate, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNK faga i šatl vektore kao što su pSA3 i pAT28 . Ovi i mnogi drugi vektori za kloniranje dostupni su od komercijalnih prodavaca kao što su BioRad, Strategene i Invitrogen.
[0271] Ekspresioni vektori su generalno replikabilni polinukleotidni konstrukti koji obuhvataju nukleinsku kiselinu prema ovom otkriću. Ekspresioni vektor se može replicirati u ćelijama domaćina ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK. Pogodni
1
ekspresioni vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na plazmide, virusne vektore, uključujući adenoviruse, adeno-povezane viruse, retroviruse, kozmide i ekspresione vektore otkrivene u PCT publikaciji br. WO 87/04462. Komponente vektora mogu generalno uključivati, ali se ne ograničavaju na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu; poreklo replikacije; jedan ili više gena markera; odgovarajući transkripcioni kontrolni elementi (kao što su promotori, pojačivači i terminatori). Za ekspresiju (tj. translaciju), takođe su obično potrebni jedan ili više kontrolnih elemenata za translaciju, kao što su mesta vezivanja ribosoma, mesta inicijacije translacije i stop kodoni.
[0272] Vektori koji obuhvataju nukleinske kiseline od interesa mogu se uneti u ćeliju domaćina na bilo koji od brojnih odgovarajućih načina, uključujući elektroporaciju, transfekciju upotrebom kalcijum hlorida, rubidijum hlorida, kalcijum fosfata, DEAE-dekstrana ili drugih supstanci; bombardovanjem mikroprojektilima; lipofekcijom i infekcijom (npr. gde je vektor infektivno sredstvo kao što je virus vakcinije). Izbor uvođenja vektora ili polinukleotida često će zavisiti od karakteristika ćelije domaćina. U nekim primerima izvođenja, vektor obuhvata nukleinsku kiselinu koja obuhvata jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koja kodira protein sortilin prema ovom otkriću.
[0273] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela uključuju eukariotske ćelije. U poželjnim primerima izvođenja, ćelija domaćin prema ovom otkriću je ćelija sisara, uključujući bez ograničenja CV1 liniju bubrega majmuna transformisanu pomoću SV40 (COS-7); linija embrionalnog bubrega čoveka (293 ili 293 ćelije kao što je opisano, na primer, u Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (ćelije TM4 kao što je opisano, na primer, u Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA); ćelije bubrega pasa (MDCK; ćelije jetre bizonskog pacova (BRL 3A); humane ćelije pluća (W138); humane ćelije jetre (Hep G2); tumor dojke miša (MMT 060562); ćelije TRI, kao što je opisano, na primer, u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); ćelije MRC 5; i ćelije FS4. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući ćelije DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je humana ćelija. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je HEK293T ćelija.
1
[0274] Osim ćelija sisara, eukariotski mikroorganizmi, kao što su filamentozne gljive ili kvasac, takođe su pogodni klonirajući ili ekspresioni domaćini za vektore koji kodiraju proteine, uključujući gljive i sojeve kvasca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što rezultuje proizvodnjom proteina sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije (npr. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004); i Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)). Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikoziliranog proteina takođe se mogu dobiti iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata (npr. ćelije Sf9 ili S2). Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
[0275] U nekim primerima izvođenja, postupci prema ovom otkriću uključuju dovođenje u kontakt ćelije koja eksprimira protein sortilin na svojoj površini ćelije sa sredstvom (npr. antitelom protiv sortilina) i ligandom sortilina pod uslovima u kojima je protein sortilin sposoban da se veže sa ligandom sortilina. Kako je upotrebljeno ovde, stanje u kojem je protein sortilin sposoban da se veže za ligand sortilina može se odnositi na parametar ili aspekt okruženja u kojem se nalaze protein sortilin i ligand sortilina (npr. temperatura, pH, rastvor itd.), a uslovi se mogu odnositi na okruženje u kojem se nalaze protein sortilin i ligand sortilina (npr. zbir ukupnih više pojedinačnih uslova). Ovi uslovi će omogućiti interakciju sortilin- ligand sortilina, kao što je prethodno opisano. U poželjnim primerima izvođenja, ovi postupci su takođe dozvoljeni za održavanje vitalnosti ćelija u vremenskom okviru analize.
[0276] U nekim primerima izvođenja, ligand sortilina je vezan za fluorofor. Može se koristiti bilo koji fluorofor poznat u tehnici. U nekim primerima izvođenja, fluorofor može biti fluorescentni protein ili peptid, uključujući bez ograničenja GFP, RFP, YFP, CFP, njihove derivate i slično. U nekim primerima izvođenja, fluorofor može biti ne-proteinski organski fluorofor, uključujući bez ograničenja derivat ksantena (npr. rodamin, fluorescein, teksas crveno itd.), derivat skvadrena, derivat naftalena, derivat cijanina (npr. cijanin , indokarbocijanin, oksakarbocijanin itd.), derivat kumarina, derivat pirena, derivat antracena, derivat oksadiazola, derivat akridina, derivat tetrapirola, derivat arilmetina ili derivat oksazina. U nekim primerima izvođenja, fluorofor može biti kvantna tačka. Liste odgovarajućih fluorofora i njihovih svojstava (npr. apsorpcioni i emisioni spektri, koeficijent molarnog izumiranja, svojstva fotoizbeljivanja, osvetljenost, fotostabilnost itd.) obično se dobijaju od proizvođača, na primer, The Molecular Probes® Handbook, 11<th>ed. (Life
14
Technologies, Carlsbad, CA). U nekim primerima izvođenja, ligand sortilina je vezan za nefluorescentni deo za detekciju, kao što je luminiscentni ili bioluminiscentni deo (npr. luciferaza kao što je Renilla luciferaza ili njen derivat), a bioluminogeni supstrat je dalje uključen (npr. luciferin, kao što je koelenterazin ili derivat koelenterazina, uključujući, bez ograničenja, DeepBlueC™).
[0277] U nekim primerima izvođenja, fluorofor vezan za ligand sortilina je povezan sa ćelijom nakon vezivanja liganda sortilina za protein sortilina. Fluorofor vezan za ligand sortilina može biti povezan sa ćelijom, na primer, ako se može detektovati na površini ćelije i/ili otkriti unutar ćelije (npr. u endocitnom, endozomalnom ili lizozomalnom delu). Na ovaj način, detekcija emitovane fluorescencije povezane sa ćelijom (npr. fluorescencija na površini ćelije ili unutar ćelije) omogućava detekciju interakcije između sortilina i liganda sortilina u kontekstu ćelije koja eksprimira sortilin. Poželjno je da sam fluorofor i veza fluorofora za ligandom sortilina ne narušavaju vezivanje između liganda sortilina i proteina sortilina kojeg ćelija eksprimira.
[0278] U nekim primerima izvođenja, fluorofor povezan sa ćelijom se tretira talasnom dužinom svetlosti dovoljnom da izazove fluorofor da emituje fluorescenciju. U nekim primerima izvođenja, otkrivena je naknadna fluorescencija koju emituje fluorofor povezan sa ćelijom. U nekim primerima izvođenja, talasna dužina dovoljna da izazove fluorofor da emituje fluorescenciju je unutar apsorpcionog spektra fluorofora. U nekim primerima izvođenja, talasna dužina kojom se ćelija tretira je talasna dužina maksimalne apsorpcije ili maksimalne ekscitacije. U nekim primerima izvođenja, otkrivena talasna dužina je unutar emisionog spektra fluorofora. U nekim primerima izvođenja, otkrivena talasna dužina je maksimalna emisija. Kao neograničavajući primer, DyLight-650 vezan za protein progranulin prema ovom otkriću može se ekcitovati na 652 nm, a emitovana fluorescencija može se detektovati na 672 nm. Informacije o talasnim dužinama svetlosti dovoljnim da izazovu fluorofor prema ovom otkriću da emituje fluorescenciju i talasne dužine svetlosti koju emituje fluorofor široko su dostupne u tehnici i obično ih isporučuje proizvođač (npr. Life Technologies, Pierce Biotechnology, Thermo Scientific, abcam, itd.).
[0279] Može se koristiti bilo koji odgovarajući postupak za detekciju fluorescencije emitovane na odgovarajućoj talasnoj dužini (npr. prethodno opisana talasna dužina). Tehnike detekcije fluorescencije mogu koristiti čitač ploča (npr. PHERAstar čitač ploča iz BMG LABTECH, Ortenberg, Germany), fluorescentni mikroskop, protočni citometar ili bilo koju drugu opremu poznatu u tehnici za detekciju fluorescencije.
[0280] U nekim primerima izvođenja, fluorofor je direktno kuplovan sa ligandom sortilina. U nekim primerima izvođenja, ligand sortilina je kuplovan za biotin, a fluorofor je kuplovan za streptavidin, koji je vezan za ligand sortilina vezivanjem za biotin. Slično tehnikama pričvršćivanja donora/akceptora fluorescencije poznatim u tehnici, fluorofor se može vezati za ligand sortilina direktnim kuplovanjem, ili mogu biti indirektno kuplovani preko posrednika (npr. vezivanjem antitela, vezivanjem biotin: streptavidina, oznakom afiniteta, itd.). Na primer i bez ograničenja, ako je fluorofor fluorescentni protein, ligand sortilina može biti translatiran sa pričvršćenom kodirajućom sekvencom fluorescentnog proteina (npr. peptidnim povezivačem) u okviru sa kodirajućom sekvencom liganda sortilina, tako da se proizvodi fuzioni protein. Na primer i bez ograničenja, ako je fluorofor ne-proteinski organski fluorofor, fluorofor se može hemijski vezati (npr. preko kovalentne veze) za ligand sortilina. Kompleti za obeležavanje za vezivanje fluorofora na protein od interesa (na primer, ligand sortilina prema ovom otkriću) su komercijalno dostupni i tipično primenjuju hemijsku reakciju između primarnog amina proteina i amina reaktivnog fluorofora ili unakrsnog povezivača. Član fluorescentnog para donor/akceptor može biti vezan za N-terminalni kraj, C- terminalni kraj ili za bilo koju odgovarajuću poziciju duž sekvence aminokiselina liganda sortilina. Obično, fluorescentni protein može biti vezan za N- ili C-terminalni kraj liganda sortilina.
[0281] U nekim primerima izvođenja, ćelija koja eksprimira protein sortilin na svojoj površini ćelije dolazi u kontakt sa sredstvom (npr., antitelom protiv sortilina) i ligandom sortilina pod uslovima u kojima je protein sortilin sposoban da se veže za ligand sortilina, ligand sortilina je vezan za fluorofor, a fluorofor je povezan sa ćelijom nakon vezivanja liganda sortilina za protein sortilin. Fluorofor povezan sa ćelijom tretira se talasnom dužinom svetlosti dovoljnom da izazove fluorofor da emituje fluorescenciju; i detektuje se smanjenje fluorescencije koju emituje fluorofor povezan sa ćelijom, u poređenju sa fluorescencijom koju emituje fluorofor povezan sa ćelijom u odsustvu sredstva. Smanjenje emitovane fluorescencije ukazuje da je sredstvo antagonist koji vezuje sortilin. Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da će interakcija između proteina sortilina prema ovom otkriću eksprimiranog na površini ćelije i liganda sortilina prema ovom otkriću obeleženog fluoroforom prema ovom otkriću dovesti do uočljive fluorescencije povezane sa ćelijom (npr. na površini ćelije i/ili u unutrašnjosti ćelije, ako je ligand sortilina internalizovan u ćeliji). Smatra se da antagonist koji vezuje sortilin smanjuje signal fluorescencije koji emituje fluorofor povezan sa ćelijom smanjujući ovu interakciju.
[0282] U nekim primerima izvođenja, koristi se analiza zasnovana na ćelijama koja se sprovodi bez emitovane fluorescencije. Na primer, u nekim primerima izvođenja, ćelija koja eksprimira protein sortilin na svojoj površini ćelije dolazi u kontakt sa sredstvom (npr., antitelo protiv sortilina) i ligandom sortilina pod uslovima u kojima je protein sortilin sposoban da se veže za ligand sortilina; i otkriven je neuspeh smanjenja nivoa liganda sortilina u poređenju sa smanjenjem nivoa liganda sortilina u odsustvu sredstva. Neuspeh smanjenja nivoa liganda sortilina ukazuje na to da je sredstvo antagonist koji vezuje sortilin. Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da kontaktiranje ćelije koja eksprimira sortilin sa ligandom sortilina prema ovom otkriću dovodi do smanjenja vanćelijskog liganda sortilina putem vezivanja za sortilin, endocitozom i lizozomskom degradacijom. Smatra se da će inkubiranje ćelije koja eksprimira sortilin sa određenim nivoom liganda sortilina dovesti do smanjenja liganda sortilina tokom vremena, i da je antagonist koji vezuje sortilin prema ovom otkriću (npr. antitelo protiv sortilina) u stanju da se smanji ovo smanjenje (npr. neuspeh smanjenja). Prema tome, u poređenju sa kontrolnim tretmanom, tretman antagonistom koji vezuje sortilin prema ovom otkriću dovodi do neuspeha smanjenja liganda sortilina.
[0283] U ovim primerima izvođenja, može se koristiti bilo koja ćelija koja na svojoj površini ćelije eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ćelija endogeno eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću na svojoj površini ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija je rekombinantno konstruisana da eksprimira protein sortilina prema ovom otkriću na svojoj površini ćelije. Može se koristiti bilo koji pogodan ligand sortilina prema ovom otkriću, tako da zadržava sposobnost vezivanja za protein sortilin eksprimiran na površini ćelije. Ligand sortilina ne mora biti fluorescentno obeležen. Nivoi liganda sortilina mogu se detektovati bilo kojom analizom poznatom u tehnici, uključujući, bez ograničenja ELISA, SPR, Western blot, masenu spektrometriju, imunoprecipitaciju, peptidni mikročip itd.
[0284] U nekim primerima izvođenja, ćelija koja na svojoj površini ćelije eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću je kultivisana u medijumu za ćelijsku kulturu koji obuhvata nivo liganda sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, poznata količina liganda sortilina je dodata u medijum ćelijske kulture. U nekim primerima izvođenja, može da se koristi kondicionirani medijum ćelijske kulture (npr. kondicionirani medijum ćelijske kulture
14
sa ligandom sortilina), na primer, u kojem je ligand sortilina prema ovom otkriću eksprimiran i izlučen u medijum ćelijske kulture pomoću ćelije koja proizvodi ligand sortilina (nakon čega se kondicionirani medijum ćelijske kulture sa ligandom sortilina odvaja od ćelije koja proizvodi ligand sortilina i zatim se dodaje u ćeliju koja eksprimira protein Sortilin).
[0285] Može se koristiti bilo koji pogodan medijum ćelijske kulture koristan za kultivisanje ćelije koja na svojoj površini ćelije eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću. Medijumi ćelijske kulture koji su korisni za kultivisanje različitih tipova ćelija poznati su u tehnici i komercijalno su dostupni. Komercijalno dostupni mediji, kao što su Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), i Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) mogu biti pogodni za kultivisanje ćelije koja eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću. Pored toga, bilo koji od medijuma opisanih u . Ham et al., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), U.S. Pat. Br.-jevi 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Pat. Re. 30,985 mogu se koristiti kao medijumi za kulturu. Bilo koji od ovim medijuma mogu biti obogaćeni ako je neophodno sa solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), faktorima rasta ili hormonima (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), nukleotidima, antibioticima, elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutni u konačnoj koncentraciji u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi neophodni dodatak takođe može biti uključen u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u tehnici. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i biće očigledni prosečnom stručnjaku u tehnici.
[0286] U nekim primerima izvođenja, ovde opisani postupci uključuju kultivisanje ćelije koja eksprimiraju i protein sortilin na svojoj površini ćelije i ligand sortilina u medijumu pod uslovima u kojima se protein sortilin i ligand sortilina eksprimiraju i ligand sortilina se oslobađa u medijum; dovođenje u kontakt ćelije sa sredstvom (npr. antitelom protiv sortilina) pod uslovima u kojima je protein sortilin sposoban da se veže za ligand sortilina; i detektovanje povećanja nivoa liganda sortilina u medijumu, u poređenju sa nivoom liganda sortilina u medijumu u odsustvu sredstva. Povećanje nivoa liganda sortilina ukazuje da je sredstvo antagonist koji vezuje sortilin. Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da će interakcija između proteina sortilina eksprimiranog na površini ćelije i izlučenog liganda sortilina dovesti do endocitoze i lizozomske degradacije liganda sortilina. Zbog toga se smatra da smanjenje ove interakcije (npr. dodavanjem antagonista koji vezuje sortilin prema ovom otkriću) dovodi do povećanja nivoa liganda sortilina u medijumu tokom vremena.
[0287] U ovim primerima izvođenja, može se koristiti bilo koja ćelija koja na svojoj površini ćelije eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću i eksprimira i izlučuje ligand sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ćelija može endogeno da eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću na svojoj površini ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija može endogeno da eksprimira i izlučuje ligand sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ćelija je U-251 ćelija, a ligand sortilina je protein progranulin. U nekim primerima izvođenja, ćelija se može rekombinantno konstruisati da eksprimira protein sortilin prema ovom otkriću na površini svoje ćelije. U nekim primerima izvođenja, ćelija se može rekombinantno konstruisati da eksprimira i izluči ligand sortilina prema ovom otkriću.
[0288] U bilo kojoj od ovde opisanih analiza zasnovanih na ćelijama, može se koristiti ligand sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ligand sortilina je protein progranulin. Ligand sortilina može biti protein cele dužine, ili može biti fragment njegovog peptida koji vezuje sortilin.
Nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćini
[0289] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu se proizvesti primenom rekombinantnih postupaka i kompozicija, na primer, kao što je opisano u US patentu br.
4,816,567. U nekim primerima izvođenja, obezbeđene su izolovane nukleinske kiseline koje imaju nukleotidnu sekvencu koja kodira bilo koje od antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. Takve nukleinske kiseline mogu kodirati sekvencu aminokiselina koja obuhvata VL i/ili sekvencu aminokiselina koja obuhvata VH antitela protiv sortilina (npr. laki i/ili teški lanac antitela). U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresioni vektori) koji obuhvataju takve nukleinske kiseline. U nekim izvođenjima, takođe je obezbeđena ćelija domaćin koja obuhvata takvu nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin obuhvata (npr. transdukovanana je sa): (1) vektor koji obuhvaza nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu aminokiselina koja obuhvata VL antitela i sekvencu aminokiselina koja obuhvata VH antitela, ili (2) prvi vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu aminokiselina koja obuhvata VL antitela i drugi vektor koji obuhvata
14
nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu aminokiselina koja obuhvata VH antitela. U nekim primerima izvođenja, ćelija domaćin je eukariotska, na primer, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr. ćelija Y0, NS0, Sp20).
[0290] Obezbeđeni su postupci za dobijanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje kultivisanje ćelije domaćina prema ovom otkriću koja obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo protiv sortilina, pod uslovima pogodnim za ekspresiju antitela. U nekim primerima izvođenja, antitelo se naknadno oporavlja iz ćelije domaćina (ili medijuma za kulturu ćelija domaćina).
[0291] Za rekombinantnu proizvodnju antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, izoluje se nukleinska kiselina koja kodira antitelo protiv sortilina i ubacuje se u jedan ili više vektora zbog daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćinu. Takva nukleinska kiselina se može lako izolovati i sekvencirati primenom konvencionalnih procedura (npr. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
[0292] Pogodni vektori koji obuhvataju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira bilo koje od antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, ili njihove fragmenti polipeptida (uključujući antitela) opisane ovde, uključuju, bez ograničenja, vektore za kloniranje i ekspresione vektore. Pogodni vektori za kloniranje mogu se konstruisati prema standardnim tehnikama, ili se mogu odabrati od velikog broja vektora za kloniranje koji su dostupni u tehnici. Dok odabrani vektor za kloniranje može varirati u zavisnosti od ćelije domaćina koja se namerava koristiti, korisni vektori za kloniranje generalno imaju sposobnost samorepliciranja, mogu posedovati jedno ciljano delovanje za određenu restrikcionu endonukleazu i/ili mogu nositi gene za marker koji se mogu koristiti za odabir klonova koji obuhvataju vektori. Odgovarajući primeri uključuju plazmide i bakterijske viruse, npr. pUC18, pUC19, Bluescript (npr. pBS SK+) i njegove derivate, mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNK faga, i šatl vektore kao što su pSA3 i pAT28. Ovi i mnogi drugi vektori za kloniranje dostupni su od komercijalnih prodavaca kao što su BioRad, Strategene i Invitrogen.
[0293] Ekspresioni vektori su generalno replikabilni polinukleotidni konstrukti koji obuhvataju nukleinsku kiselinu prema ovom otkriću. Ekspresioni vektori se mogu replicirati u ćelijama domaćina ili kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK. Pogodni ekspresioni vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na, plazmide, virusne vektore, uključujući adenoviruse, adeno-povezane viruse, retroviruse, kozmide i ekspresione vektore
14
otkrivene u PCT publikaciji br. WO 87/04462. Komponente vektora mogu generalno uključivati, ali se ne ograničavaju na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu; poreklo replikacije; jedan ili više gena markera; odgovarajuće transkripcione kontrolne elemente (kao što su promotori, pojačivači i terminatori). Za ekspresiju (tj. translaciju), takođe je obično potreban jedan ili više translacionih kontrolnih elemenata, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta inicijacije translacije i stop kodoni.
[0294] Vektori koji obuhvataju nukleinske kiseline od interesa mogu se uneti u ćeliju domaćina na bilo koji od brojnih odgovarajućih načina, uključujući elektroporaciju, transfekciju upotrebom kalcijum hlorida, rubidijum hlorida, kalcijum fosfata, DEAE-dekstrana ili drugih supstanci; bombardovanjem mikroprojektilima; lipofekcijom; i infekcijom (npr. gde je vektor infektivno sredstvo kao što je virus vakcinije). Izbor uvođenja vektora ili polinukleotida često će zavisiti od karakteristika ćelije domaćina. U nekim primerima izvođenja, vektor obuhvata nukleinsku kiselinu koja obuhvata jednu ili više sekvenci aminokiselina koje kodiraju antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću.
[0295] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije. Na primer, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu se proizvesti u bakterijama, posebno kada glikozilacija i Fc efektorska funkcija nisu potrebne. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama (npr. U.S. Patent Br.-jevi. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523; i Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.
248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, koja opisuje ekspresiju fragmenata antitela kod E. coli). Posle ekspresije, antitelo se može izolovati iz lepljivih bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji i može se dodatno prečistiti.
[0296] Osim prokariota, eukariotski mikroorganizmi, kao što su filamentozne gljive ili kvasac, takođe su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitela, uključujući gljive i sojeve kvasca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što rezultuje proizvodnjom antitela sa delimičnim ili potpunim obrascem humane glikozilacije (npr. Gerngross, Nat. Biotech.22:1409-1414 (2004); i Li et al., Nat. Biotech.24:210-215 (2006)).
[0297] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikoziliranog antitela takođe se mogu dobiti iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji se mogu koristiti zajedno sa ćelijama insekata, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda. Kulture ćelija biljaka takođe mogu biti korišćene kao domaćini (npr., U.S. Patent Br.-jevi
14
5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 i 6,417,429 koji su opisani PLANTIBODIES™ tehnologijom za poizvodnju antitela kod transgenih biljaka).
[0298] Ćelije kičmenjaka takođe mogu biti korišćene kao domaćini. Na primer, mogu biti korisne ćelijske linije sisara koje su prilagođene za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); linija embrionalnog bubrega čoveka (293 ili 293 ćelije kao što je opisano, na primer, u Graham et al., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (ćelije TM4 kao što je opisano, na primer, u Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA); ćelije bubrega pasa (MDCK; ćelije jetre bizonskog pacova (BRL 3A); humane ćelije pluća (W138); humane ćelije jetre (Hep G2); tumor dojke miša (MMT 060562); ćelije TRI, kao što je opisano, na primer, u Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); ćelije MRC 5; i ćelije FS4. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući ćelije DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) i ćelijske linije mijeloma kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, videti npr. Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
Farmaceutske kompozicije
[0299] Antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu se ugraditi u različite formulacije za terapeutsku primenu kombinovanjem antitela sa odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, i mogu se formulisati u preparate u čvrstom, polučvrstom, tečnom ili gasovitom obliku. Primeri takvih formulacija uključuju, bez ograničenja, tablete, kapsule, praškove, granule, masti, rastvore, supozitorije, injekcije, inhalante, gelove, mikrosfere i aerosole. Farmaceutske kompozicije mogu uključivati, u zavisnosti od željene formulacije, farmaceutski prihvatljive, netoksične nosače razblaživača, koji su sredstva koja se obično koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija za životinjsku ili humanu primenu. Razblaživač je odabran tako da ne utiče na biološku aktivnost kombinacije. Primeri takvih razblaživača uključuju, bez ograničenja, destilovanu vodu, puferisanu vodu, fiziološki
14
rastvor, PBS, Ringer-ov rastvor, rastvor dekstroze i Hank-ov rastvor. Farmaceutska kompozicija ili formulacija prema ovom otkriću može dalje uključivati druge nosače, ađuvante ili netoksične, neterapeutske, neimunogene stabilizatore, ekscipijente i slično. Kompozicije mogu takođe uključivati dodatne supstance za približavanje fiziološkim uslovima, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferska sredstva, sredstva za podešavanje toksičnosti, sredstva za vlaženje i deterdženti.
[0300] Farmaceutska kompozicija prema ovom otkriću takođe može uključivati bilo koji od različitih stabilizatora, kao što je na primer antioksidans. Kada farmaceutska kompozicija uključuje polipeptid, polipeptid se može složiti sa različitim dobro poznatim jedinjenjima koja povećavaju stabilnost polipeptida in vivo, ili na drugi način povećavaju njegova farmakološka svojstva (npr. povećavaju poluživot polipeptida, smanjuju njegovu toksičnost , i poboljšavaju rastvorljivost ili usvajanje). Primeri takvih modifikacija ili kompleksnih sredstava uključuju, bez ograničenja, sulfat, glukonat, citrat i fosfat. Polipeptidi kompozicije takođe mogu biti složeni sa molekulima koji poboljšavaju njihova in vivo svojstva. Takvi molekuli uključuju, bez ograničenja, ugljene hidrate, poliamine, aminokiseline, druge peptide, jone (npr. natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, mangan) i lipide.
[0301] Dalji primeri formulacija koje su pogodne za različite tipove primene mogu se pronaći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985). Za kratak pregled postupaka za isporuku lekova, pogledajte, Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
[0302] Za oralnu primenu, aktivni sastojak se može primeniti u čvrstim oblicima doziranja, kao što su kapsule, tablete i praškovi, ili u tečnim oblicima doziranja, kao što su eliksiri, sirupi i suspenzije. Aktivne komponente mogu biti inkapsulirane u želatinske kapsule zajedno sa neaktivnim sastojcima i nosačima u prahu, kao što su glukoza, laktoza, saharoza, manitol, skrob, celuloza ili derivati celuloze, magnezijum stearat, stearinska kiselina, natrijum saharin, talk, magnezijum karbonat . Primeri dodatnih neaktivnih sastojaka koji se mogu dodati da bi se obezbedila željena boja, ukus, stabilnost, puferski kapacitet, disperzija ili druge poznate poželjne karakteristike su crveni oksid gvožđa, silika gel, natrijum lauril sulfat, titanijum dioksid i jestivo belo mastilo. Slični razblaživači mogu se koristiti za pravljenje komprimovanih tableta. I tablete i kapsule mogu se proizvesti kao proizvodi sa produženim oslobađanjem da bi se obezbedilo kontinuirano oslobađanje leka tokom perioda od nekoliko sati. Komprimovane tablete mogu biti obložene šećerom ili obložene filmom da bi se
14
maskirao svaki neprijatan ukus i zaštitila tableta od atmosfere, ili enterično obložene za selektivno raspadanje u gastrointestinalnom traktu. Tečni oblici doziranja za oralnu primenu mogu obuhvatati boje i arome za povećanje prihvatanja od strane pacijenata.
[0303] Formulacije pogodne za parenteralnu primenu uključuju vodene i nevodene, izotonične sterilne ubrizgavajuće rastvore, koji mogu obuhvatati antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvore koji čine formulaciju izotoničnom u odnosu na krv namenjenog primaoca, i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu uključivati sredstva za suspenziju, rastvarače, sredstva za zgušnjavanje, stabilizatore i konzervanse.
[0304] Komponente koje se koriste za formulisanje farmaceutskih kompozicija su poželjno visoke čistoće i suštinski bez potencijalno štetnih zagađivača (npr. najmanje gradus nacionalne hrane (NF), generalno najmanje analitički gradus, a tipičnije najmanje farmaceutski gradus). Štaviše, kompozicije namenjene za in vivo upotrebu obično su sterilne. U meri u kojoj se dato jedinjenje mora sintetizovati pre upotrebe, nastali proizvod je obično u suštini bez bilo kakvih potencijalno toksičnih sredstava, posebno od bilo kakvih endotoksina, koji mogu biti prisutni tokom postupka sinteze ili prečišćavanja. Kompozicije za parenteralnu primenu su takođe sterilne, uglavnom izotonične i napravljene u GMP uslovima.
[0305] Formulacije se mogu optimizovati za zadržavanje i stabilizaciju u mozgu ili centralnom nervnom sistemu. Kada se sredstvo primenjuje u kranijalni deo, poželjno je da se sredstvo zadrži u delu, a ne da difunduje ili na drugi način prelazi krvno-moždanu barijeru. Tehnike stabilizacije uključuju unakrsno povezivanje, multimerizovanje ili povezivanje sa grupama kao što su polietilen glikol, poliakrilamid, neutralni nosači proteina itd. da bi se postiglo povećanje molekulske težine.
[0306] Druge strategije za povećanje zadržavanja uključuju zarobljavanje antitela, kao što su antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, u biorazgradivi ili bioerodibilni implant. Brzina oslobađanja terapijski aktivnog sredstva kontroliše se brzinom transporta kroz polimerni matriks i biorazgradnjom implantata. Na transport leka kroz polimernu barijeru takođe će uticati rastvorljivost jedinjenja, hidrofilnost polimera, obim unakrsnog povezivanja polimera, širenje polimera nakon apsorpcije vode tako da bi polimerna barijera postala permeabilnija za lek, geometrija implanta, i slično. Implantati su dimenzija srazmernih veličini i obliku regiona odabranog kao mesto implantacije. Implantati mogu biti čestice, ploče, parče, plakovi, vlakna, mikrokapsule i slično i mogu biti bilo koje veličine ili oblika kompatibilnih sa odabranim mestom insercije.
1
[0307] Implantati mogu biti monolitni, tj. imati aktivno sredstvo homogeno raspoređeno kroz polimerni matriks, ili inkapsulirano, gde je rezervoar aktivnog sredstva inkapsuliran polimernim matriksom. Izbor polimerne kompozicije koja će se koristiti zavisiće od mesta primene, željenog perioda lečenja, tolerancije pacijenta, prirode bolesti koja se leči i slično. Karakteristike polimera će uključivati biorazgradljivost na mestu implantacije, kompatibilnost sa sredstvom od interesa, lakoću inkapsulacije, poluživot u fiziološkom okruženju.
[0308] Biorazgradive polimerne kompozicije koje se mogu koristiti mogu biti organski estri ili etri, koji pri razgradnji rezultuju fiziološki prihvatljivim proizvodima razgradnje, uključujući monomere. Anhidridi, amidi, ortoestri ili slično, sami ili u kombinaciji sa drugim monomerima, mogu da nađu primenu. Polimeri će biti kondenzacioni polimeri. Polimeri mogu biti unakrsno povezani ili ne-unakrsno povezani. Od posebnog interesa su polimeri hidroksialifatičnih karboksilnih kiselina, bilo homo- ili kopolimeri, i polisaharidi. Među poliestrima od interesa su polimeri D-mlečne kiseline, L-mlečne kiseline, racemske mlečne kiseline, glikolne kiseline, polikaprolakton i njihove kombinacije. Upotrebom L-laktata ili D-laktata postiže se polako biorazgradiv polimer, dok je razgradnja značajno pojačana sa racematom. Kopolimeri glikolne i mlečne kiseline su od posebnog interesa, gde se stopa biorazgradnje kontroliše odnosom glikolne i mlečne kiseline. Najbrže razgrađeni kopolimer ima otprilike jednake količine glikolne i mlečne kiseline, pri čemu je bilo koji homopolimer otporniji na razgradnju. Odnos glikolne kiseline prema mlečnoj kiselini takođe će uticati na krhkost implantata, gde je fleksibilniji implantat poželjan za veće geometrije. Među polisaharidima od interesa su kalcijum alginat i funkcionalizovane celuloze, posebno estri karboksimetilceluloze za koje je karakteristično da su nerastvorljivi u vodi, molekulske mase od oko 5 kD do 500 kD itd. Biorazgradivi hidrogelovi se takođe mogu koristiti u implantima prema ovom otkriću. Hidrogelovi su tipično kopolimerni materijal, koji se odlikuje sposobnošću upijanja tečnosti. Primeri biorazgradivih hidrogelova koji se mogu koristiti opisani su u Heller in: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, N. A. Peppes ed., Vol. III, CRC Press, Boca Raton, Fla., 1987, pp 137-149.
Farmaceutske doze
[0309] Farmaceutske kompozicije prema ovom otkriću koji obuhvata antitelo protiv sortilina prema ovom otkriću mogu se davati pojedincu kome je potrebno lečenje sa antitelom protiv
1 1
sortilina, poželjno humanom, u skladu sa poznatim postupcima, kao što je intravenozna primena kao bolus ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerobrospinalnim, intrakranijalnim, intraspinalnim, potkožnim, intra-artikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, topikalnim ili inhalacionim putem.
[0310] Doze i željena koncentracija leka farmaceutskih kompozicija prema ovom otkriću mogu varirati u zavisnosti od predviđene upotrebe. Određivanje odgovarajuće doze ili puta primene je u okviru veština običnog stručnjaka. Eksperimenti na životinjama obezbeđuju pouzdane smernice za određivanje efikasnih doza za humanu terapiju. Skaliranje efikasnih doza između vrsta može se izvesti prema principima opisanim u Mordenti, J. and Chappell, W. “The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,” In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, New York 1989, pp.42-46.
[0311] Za in vivo primenu bilo kog od antitela protiv sortilina prema ovom otkriću, normalne količine doze mogu varirati od oko 10 ng/kg do oko 100 mg/kg telesne težine pojedinca ili više dnevno, poželjno oko 1 mg /kg/dan do 10 mg/kg/dan, u zavisnosti od načina primene. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od težine bolesti, poremećaja ili stanja koje treba lečiti, lečenje se nastavlja sve dok se ne postigne željeno suzbijanje simptoma.
[0312] Ogledni režim doziranja može uključivati davanje početne doze antitela protiv sortilina, od oko 2 mg/kg, nakon čega sledi održavanje doze tokom nedelju dana od oko 1 mg/kg svake druge nedelje. Drugi režimi doziranja mogu biti korisni, u zavisnosti od obrasca farmakokinetičkog raspada koji lekar želi da postigne. Na primer, ovde se razmatra doziranje pojedinca od jednog do dvadeset i jednog puta nedeljno. U nekim primerima izvođenja, doziranje koje se kreće od oko 3 μg/kg do oko 2 mg/kg (kao što je oko 3 μg/kg, oko 10 μg/kg, oko 30 μg/kg, oko 100 μg/kg, oko 300 μg/kg , oko 1 mg/kg i oko 2/mg/kg) se može koristiti. U nekim primerima izvođenja, učestalost doziranja je tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom svaki drugi dan, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom u pet nedelja, jednom u šest nedelja, jednom u sedam nedelja, jednom u osam nedelja, jednom u devet nedelja, jednom u deset nedelja, ili jednom mesečno, jednom u dva meseca, jednom u tri meseca ili duže. Napredak terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i analizama. Režim doziranja, uključujući primenjeno antitelo protiv sortilina, može se vremenom menjati nezavisno od upotrebljene doze.
1 2
[0313] Doze za određeno antitelo protiv sortilina mogu se empirijski odrediti kod pojedinaca koji su dobili jedno ili više primanja antitela protiv sortilina. Pojedincima se daju postepene doze antitela protiv sortilina. Da bi se procenila efikasnost antitela protiv sortilina, može se pratiti klinički simptom bilo koje bolesti, poremećaja ili stanja prema ovom otkriću (npr. frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti i nepoželjnih simptoma normalnog starenja).
[0314] Primena antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može biti kontinuirana ili povremena, u zavisnosti, na primer, od fiziološkog stanja primaoca, da li je svrha primene terapeutska ili profilaktička, i drugih faktora poznatih stručnim praktičarima. Primena antitela protiv sortilina može biti u suštini kontinuirana tokom unapred odabranog vremenskog perioda ili može biti u seriji razmaka između doza..
[0315] U literaturi su obezbeđene smernice u vezi sa određenim dozama i postupcima isporuke; videti, na primer, U.S: patente br.-jevi 4,657,760; 5,206,344; ili 5,225,212. U okviru obima ovog otkrića je da će različite formulacije biti efikasne za različite tretmane i različite poremećaje, i da primena namenjena lečenju određenog organa ili tkiva može zahtevati isporuku na drugačiji način od onog za drugi organ ili tkivo. Štaviše, doze se mogu primeniti jednom ili u više odvojenih primena ili kontinuiranom infuzijom. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se nastavlja sve dok se ne pojavi željeno suzbijanje simptoma bolesti. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i analizama.
Terapeutske upotrebe
[0316] Daljnji aspekti prema ovom otkriću obezbeđuju postupke za povećanje nivoa progranulina kod pojedinca kome je to potrebno, kao što je u mozgu, krvi i/ili perifernim organima pojedinca, primenom na pojedincu terapijski efikasne količine jednog ili više antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. Drugi aspekti prema ovom otkriću obezbeđuju postupke za povećanje vanćelijskih nivoa progranulina, dovođenjem u kontakti jedne ili više ćelija sa jednim ili više antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima
1
izvođenja, nivoi progranulina se povećavaju bez smanjenja ćelijskog nivoa sortilina. Drugi aspekti prema ovom otkriću obezbeđuju postupke za smanjenje ćelijskog nivoa sortilina kod pojedinca kome je to potrebno, kao što je u mozgu i/ili perifernim organima pojedinca, primenjivanjem na pojedincu terapijski efikasne količine jednog ili više antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. Drugi aspekti prema ovom otkriću obezbeđuju postupke za smanjenje ćelijskog nivoa sortilina jedne ili više ćelija, koji sadrže kontaktiranje jedne ili više ćelija sa jednim ili više antitela protiv sortilina prema ovom otkriću.
[0317] Dalji aspekti prema ovom otkriću obezbeđuju postupke za povećanje efektivnih koncentracija progranulina i/ili smanjenje efektivnih koncentracija neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-neurotrofina, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9, i proteina povezanog sa receptorima (RAP) kod pojedinaca kojima je to potrebno, primenom na pojedincu terapeutski efikasne količine antitela protiv sortilina prema ovom otkriću da bi se inhibirala interakcija između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina, proneurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE) i/ili proteina povezanog sa receptorima (RAP).
[0318] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke za inhibiranje interakcije između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina, pro-neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE), PCSK9, i/ili proteina povezanog sa receptorima (RAP) kao i jednu ili više aktivnosti sortilina, progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina, proneurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE) i/ili proteina povezanog sa receptorima (RAP) kod pojedinca
1 4
primenjivanjem na pojedincu terapijski efikasne količine antitela protiv sortilina prema ovom otkriću.
[0319] Kako je otkriveno ovde, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu takođe biti korisna za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje frontotemporalne demencije, Alzheimerove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti, nepoželjnih simptoma normalnog starenja, demencije, mešovite demencije, Creutzfeldt-Jakob-sove bolesti, normalnog pritiska hidrocefalusa, amiotrofične lateralne skleroze, Huntington-ove bolesti, taupatijske bolesti, moždanog udara, akutne traume, hronične traume, lupusa, akutnog i hroničnog kolitisa, Crohn-ove bolesti, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, malarije, esencijalnog tremora, lupusa centralnog nervnog sistema, Behcet-ove bolesti, Parkinson-ove bolesti, demencije sa Lewy-jevim telima, višestruke sistemske atrofije, degeneracije intervertebralnog diska, Shy-Drager-ovog sindroma, progresivne supranuklearne paralize, kortikalne bazalne ganglionske degeneracije, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, granulomatoznih poremećaja, sarkoidoze, bolesti starenja, makularne degeneracije povezane sa starenjem, glaukoma, pigmentoze retinitisa, degeneracije mrežnjače, infekcije respiratornog trakta, sepse, infekcije oka, sistemske infekcije, inflamatornih poremećaja, artritisa, multiple skleroze, metaboličkih poremećaja, gojaznosti, insulinske rezistencije, dijabetesa tipa 2, oštećenja tkiva ili krvnih sudova, povrede i jednog ili više neželjenih simptoma normalnog starenja.
[0320] U nekim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje postupke za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje pojedinca koji ima frontotemporalnu demenciju, Alzheimer-ovu bolest, vaskularnu demenciju, napade, distrofiju mrežnjače, traumatsku povredu mozga, povredu kičmene moždine, dugotrajnu depresiju, aterosklerotične vaskularne bolesti, nepoželjne simptome normalnog starenja, demenciju, mešovitu demenciju, Creutzfeldt-Jakobsovu bolest, normalni pritisak hidrocefalusa, amiotrofičnu lateralnu sklerozu, Huntington-ovu bolest, taupatijske bolesti, moždani udar, akutne traume, hronične traume, lupus , akutni i hronični kolitis, Crohn-ovu bolest, inflamatornu bolest creva, ulcerozni kolitis, malariju, esencijalni tremor, lupus centralnog nervnog sistema, Behcet-ovu bolest, Parkinson-ovu bolest, demenciju sa Lewy-jevim telima, višestruke sistemske atrofije, degeneraciju intervertebralnog diska, Shy-Drager-ov sindrom, progresivnu supranuklearnu paralizu, kortikalnu bazalnu ganglionsku degeneraciju, akutni diseminirani encefalomijelitis,
1
granulomatozni poremećaj, sarkoidozu, bolest starenja, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, glaukom, pigmentozu retinitis, degeneraciju mrežnjače, infekciju respiratornog trakta, sepsu, infekciju oka, sistemsku infekciju, inflamatorne poremećaje, artritis, multiplu sklerozu, metabolički poremećaj, gojaznost, insulinsku rezistenciju, dijabetes tipa 2, oštećenje tkiva ili krvnih sudova, povredu i jedan ili više neželjenih simptoma normalnog starenja kod pojedinca kome je to potrebno primenom na pojedinca terapeutski efikasne količine antitela protiv sortilina prema ovom otkriću da bi se: (i) inhibirala interakcija između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina, pro-neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE) i/ili proteina povezanog sa receptorima (RAP) i/ili (ii) inhibirala jedna ili više aktivnosti sortilina, progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina, pro-neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, propeptida sortilina (Sort-pro), prekursora proteina amiloida (APP), A beta peptida, lipoproteina lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE) i/ili proteina povezanog sa receptorima (RAP). U nekim primerima izvođenja, ovo otkriće obezbeđuje postupke za izazivanje zarastanja rana kod pojedinca kome je to potrebno primenom na pojedincu terapeutski efikasne količine antitela protiv sortilina prema ovom otkriću.
[0321] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke za podsticanje preživljavanja ćelija, kao što je preživljavanje ćelija neurona, primenjivanjem antitela protiv sortilina prema ovom otkriću da bi se inhibirala interakcija između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofina, pro-neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, prekursora proteina amiloida (APP) i A beta peptida. Antitelo protiv sortilina se može primeniti u ćelijama in vitro da bi se podstaklo preživljavanje ćelija. Alternativno, antitelo protiv sortilina se može primeniti in vivo (npr. primenom antitela na pojedinca) da bi se podstaklo preživljavanje ćelija.
[0322] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke za inhibiranje neuroinflamacije, aksonopatije koju karakteriše izrastanje kratkog aksona i aberantno grananje, mikroglijalne aktivacije i inflamatornog odgovora i pospešivanja zarastanja rana, autofagije i uklanjanja skupine
1
proteina primenjivanjem antitela protiv sortilina prema ovom otkriću da bi se inhibirala interakcija između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. proneurotrofina, pro-neurotrofina-3, pro-neurotrofina-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzina, p75, prekursora proteina amiloida (APP) i A beta peptida. Antitelo protiv sortilina se može primeniti u ćelijama in vitro. Alternativno, antitelo protiv sortilina se može primeniti in vivo (npr. primenjivanjem antitela na pojedincu).
[0323] Ovo otkriće takođe obezbeđuje postupke za smanjenje ekspresije jednog ili više proinflamatornih posrednika primenom na pojedincu kome je to potrebno antitela protiv sortilina prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više pro-inflamatornih posrednika je odabrano iz IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1β, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 i CCL5.
Demencija
[0324] Demencija je nespecifični sindrom (tj. skup znakova i simptoma) koji se predstavlja kao ozbiljan gubitak globalnih kognitivnih sposobnosti kod prethodno neoštećene osobe, izvan onoga što bi se moglo očekivati od normalnog starenja. Demencija može biti statična kao rezultat jedinstvene globalne povrede mozga. Alternativno, demencija može biti progresivna, što dovodi do dugoročnog opadanja usled oštećenja ili bolesti u telu. Iako je demencija mnogo češća u gerijatrijskoj populaciji, može se javiti i pre 65-te godine života. Kognitivna područja pogođena demencijom uključuju, bez ograničenja, pamćenje, raspon pažnje, jezik i rešavanje problema. Uopšteno, simptomi moraju biti prisutni najmanje šest meseci pre nego što se osobi dijagnostikuje demencija.
[0325] Ogledni oblici demencije uključuju, bez ograničenja, frontotemporalnu demenciju, Alzheimer-ovu bolest, vaskularnu demenciju, semantičku demenciju i demenciju sa Lewyjevim telima.
[0326] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da primenjivanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti demenciju. U nekim primerima izvođenja, primenjivanje antitela protiv sortilina može izazvati jednu ili više aktivnosti progranulina kod pojedinca koji ima demenciju (npr. neurotrofična aktivnost i/ili aktivnost preživljavanja na neuronima i anti-inflamatorna aktivnost).
1
Frontotemporalna demencija
[0327] Frontotemporalna demencija (FTD) je stanje koje je rezultat progresivnog propadanja frontalnog režnja mozga. Vremenom, degeneracija može napredovati do temporalnog režnja. Na drugom mestu po učestalosti pored Alzheimer-ove bolesti (AD), FTD čini 20% slučajeva pre senilne demencije. Kliničke karakteristike FTD uključuju deficite memorije, abnormalnosti u ponašanju, promene ličnosti i jezičke smetnje (Cruts, M. & Van Broeckhoven, C., Trends Genet. 24:186-194 (2008); Neary, D., et al., Neurology 51:1546-1554 (1998); Ratnavalli, E., Brayne, C., Dawson, K. & Hodges, J. R., Neurology 58:1615-1621 (2002)).
[0328] Značajan broj slučajeva FTD je nasleđen na autosomno dominantan način, ali čak i u jednoj porodici simptomi mogu da obuhvataju spektar od FTD sa smetnjama u ponašanju, do primarne progresivne afazije, do kortiko-bazalne ganglionske degeneracije. FTD, slično kao većine neurodegenerativnih bolesti, može se okarakterisati patološkim prisustvom specifičnih nagomilanih proteina u bolesnom mozgu. Istorijski gledano, prvim opisima FTD prepoznato je prisustvo intraneuronskih akumulacija hiperfosforilisanog Tau proteina u neurofibrilarnim zapletima ili Pick-ovim telima. Uzročnu ulogu proteina Tau povezanog sa mikrotubulama podržala je identifikacija mutacija u genu koji kodira Tau protein u nekoliko porodica (Hutton, M., et al., Nature 393:702-705 (1998). Međutim, većina mozgova sa FTD ne pokazuju akumulaciju hiperfosforilisanog Tau, ali pokazuju imunoreaktivnost na ubikvitin (Ub) i TAR DNK koji vezuje protein (TDP43) (Neumann, M., et al., Arch. Neurol. 64:1388-1394 (2007)). Pokazalo se da većina tih FTD slučajeva sa Ub inkluzijama (FTD-U) nosi mutacije u genu progranulina.
[0329] Mutacije progranulina rezultuju haploinsuficijencijom i poznato je da su prisutne u skoro 50% porodičnih FTD slučajeva, što čini mutaciju progranulina glavnim genetičkim doprinosom FTD. Bez želje za vezivanjm za teoriju, veruje se da gubitak funkcije heterozigotnog karaktera mutacijama progranulina ukazuje na to da kod zdravih osoba ekspresija progranulina ima ulogu zavisnu od doze, kritičnu ulogu u zaštiti zdravih pojedinaca od razvoja FTD.
[0330] Shodno tome, povećanje nivoa progranulina inhibiranjem interakcije između sortilina i progranulina može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti FTD.
1
Alzheimer-ova bolest
[0331] Alzheimer-ova bolest (AD), najčešći je oblik demencije. Ne postoji lek za bolest koja se pogoršava kako napreduje i na kraju dovodi do smrti. Najčešće se AD dijagnostikuje kod ljudi starijih od 65 godina. Međutim, manje zastupljena Alzheimer-ova bolest sa ranim pojavljivanjem može se pojaviti mnogo ranije.
[0332] Uobičajeni simptomi Alzheimer-ove bolesti uključuju simptome u ponašanju, kao što je teškoća u pamćenju nedavnih događaja; kognitivni simptomi, konfuzija, razdražljivost i agresivnost, promene raspoloženja, problemi sa jezikom i dugotrajni gubitak pamćenja. Kako bolest napreduje, gube se telesne funkcije, što na kraju dovodi do smrti. Alzheimer-ova bolest se razvija na nepoznati način i varijabilna je količina vremena pre nego što postane potpuno očigledna i može napredovati nedijagnostikovana godinama.
[0333] Pokazano je da se sortilin vezuje za prekursor proteina amiloida (APP) i enzim BACE1 koji obrađuje APP. Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da su ove interakcije uključene u Alzheimer-ovu bolest. Shodno tome, i bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da se antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu koristiti da bi se inhibirale takve interakcije i sprečila, smanjio rizik ili lečila Alzheimer-ova bolest kod pojedinaca kojima je to potrebno.
[0334] Nedavne studije su takođe pokazale da se nivoi pro-neurotrofina (npr. pro-NGF, pro-BDNF, itd.) povećavaju u ranim stadijumima Alzheimer-ove bolesti (npr. Fahnestock, M et al., (2001) Cell Neurosci. 18, 210-220; Michalski, B et al., (2003) Brain Res. Mol. Brain Res.
111, 148-154; Pedraza, CE et al., (2005) Am. J. Pathol.166, 533-543; i Peng, S et al., (2005) J. Neurochem. 93, 1412-1421). Štaviše, pro-neurotrofini podležu glikaciji i lipoksidaciji u hipokampusu i entorhinalnom korteksu pacijenata sa Alzheimer-ovom bolešću (Counts, SE et al., (2004) Ann. Neurol.56, 520-531; i Counts, SE et al., (2005) J. Neuropathol. Exp. Neurol.
64, 263-272). Ovo čini pro-neurotrofine manje podložnim preradi u zrele neurotrofine. Nadalje, kod pacijenata sa in Alzheimer-ovom bolešću ekspresija TrkA je smanjena, ekspresija p75 i sortilina su nepromenjene. Shodno tome, i bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između
1
sortilina i neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, proneurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), p75, prekursor proteina amiloida (APP) i/ili A beta peptid,; ili koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina mogu koristiti za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje Alzheimer-ove bolesti kod pojedinaca kojima je to potrebno.
Vaskularna demencja
[0335] Vaskularna demencija (VaD) je suptilno progresivno pogoršanje pamćenja i drugih kognitivnih funkcija za koje se veruje da su nastali usled cerebrovaskularne bolesti (vaskularna bolest u mozgu). Cerebrovaskularna bolest je progresivna promena u našim krvnim sudovima (vaskulaturi) u mozgu (veliki mozak). Najčešća vaskularna promena povezana sa godinama je nakupljanje holesterola i drugih supstanci u zidovima krvnih sudova. To dovodi do zadebljanja i otvrdnjavanja zidova, kao i sužavanja krvnih sudova, što može rezultovati smanjenjem ili čak potpunim prekidom dotoka krvi u regione mozga koje napaja zahvaćena arterija. Pacijenti sa vaskularnom demencijom često imaju simptome slične pacijentima sa Alzheimer-ovom bolesti (AD). Međutim, povezane promene u mozgu nisu posledica AD patologije, već hroničnog smanjenog protoka krvi u mozgu, što je na kraju rezultovalo demencijom. VaD se smatra jednim od najčešćih tipova demencije kod starijih osoba. Simptomi VaD uključuju poteškoće s pamćenjem, poteškoće u organizaciji i rešavanju složenih problema, usporeno razmišljanje, rasejanost ili "odsutnost", poteškoće pri preuzimnju reči iz memorije, promene u raspoloženju ili ponašanju kao što su depresija, razdražljivost ili apatija i halucinacije ili zablude .
[0336] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da jedna ili više aktivnosti sortilina, ili jedna ili više interakcija između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzin, lipoprotein lipaza, apolipoprotein AV i/ili protein povezan sa receptorom su uključeni u vaskularnu demenciju. Shodno tome, i bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između sortilina i neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzin, p75, propeptid sortilina (Sortpro), prekursor proteina amiloida (APP) , A beta peptid, lipoprotein lipaza (LpL),
1
apolipoprotein AV (APOA5), apolipoprotein E (APOE) i/ili protein povezan sa receptorom (RAP); ili koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina mogu se koristiti za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje vaskularne demencije kod pojedinaca kojima je to potrebno.
Napadi, distrofija mrežnjače, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine i dugotrajna depresija
[0337] Kao je upotrebljena ovde, distrofija mrežnjače odnosi se na bilo koju bolest ili stanje koje uključuje degeneraciju mrežnjače. Takve bolesti ili stanja mogu dovesti do gubitka vida ili potpunog slepila.
[0338] Kako su upotrebljeni ovde, napadi takođe uključuju epileptične napade i odnose se na prolazni simptom abnormalne prekomerne ili sinhrone neuronske aktivnosti u mozgu. Spoljašnji efekat može biti dramatičan kao divlji pokret udaranja ili kao blag kratak gubitak svesti. Napadi se mogu manifestovati kao promena mentalnog stanja, tonički ili klonički pokreti, konvulzije i različiti drugi psihički simptomi.
[0339] Traumatske povrede mozga (TBI), takođe mogu biti poznate kao intrakranijalne povrede. Traumatske povrede mozga nastaju kada spoljašnja sila traumatično povredi mozak. Traumatske povrede mozga mogu se klasifikovati na osnovu ozbiljnosti, mehanizma (zatvorene ili prodorne povrede glave) ili drugih karakteristika (na primer, javljaju se na određenoj lokaciji ili na širokom području).
[0340] Povrede kičmene moždine (SCI) uključuju sve povrede kičmene moždine koje su uzrokovane traumom umesto bolesti. U zavisnosti od toga gde su kičmena moždina i koreni nerava oštećeni, simptomi se mogu dosta razlikovati, od bola do paralize do inkontinencije. Povrede kičmene moždine su opisane na različitim nivoima „nepotpunosti“, koje mogu varirati od toga da nemaju efekta na pacijenta do „potpune“ povrede koja znači potpuni gubitak funkcije.
[0341] Dugotrajna depresija (LTD) je smanjenje u zavisnosti od aktivnosti u efikasnosti neuronskih sinapsi koje traje satima ili duže nakon dugotrajnog stimulansa. Dugotrajna depresija može se pojaviti u mnogim područjima centralnog nervnog sistema sa različitim mehanizmima u zavisnosti od regiona mozga i napretka u razvoju. Dugotrajna depresija se može javiti u hipokampusu, malom mozgu i u različitim tipovima neurona koji oslobađaju
1 1
različite neurotransmitere. Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da dugotrajna depresija može biti povezana sa neurodegeneracijom, demencijom i Alzheimer-ovom bolesti.
[0342] Pokazano je da pro-neurotrofini (npr, pro- neurotrofin-4/5, neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, itd.) imaju ulogu u napadima, distrofiji mrežnjače, traumatskoj povredi mozga, povredi kičmene moždine i dugotrajnoj depresiji (npr., Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375–386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci.26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49 –57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci.28, 9870 –9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci.
18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al. (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; i Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491).
[0343] Shodno tome, i bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između sortilina i neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, pro -neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.); ili koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina mogu da se koriste za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje napada, distrofije mrežnjače, traumatskih povreda mozga, povreda kičmene moždine i/ili dugotrajne depresije kod osoba kojima je to potrebno.
Aterosklerotične vaskularne bolesti
[0344] Kako je upotrebljena ovde, „arteriosklerotična vaskularna bolest“, „ASVD“ i „ateroskleroza“ se koriste naizmenično i odnose se na bilo koje stanje u kojem se zid arterije zadebljava kao rezultat nakupljanja masnih materijala, kao što su holesterol, lipidi i trigliceridi. „Arteriosklerotične vaskularne bolesti“ uključuju, bez ograničenja, bilo koje stanje, poremećaj ili bolest povezanu sa ASVD, uključujući bez ograničenja, tromboemboliju, moždani udar, ishemiju, infarkte, koronarnu trombozu, infarkt miokarda (npr. srčani udar) i klaudikaciju.
[0345] Arteriosklerotična vaskularna bolest je sindrom koji pogađa arterijske krvne sudove, hronični inflamatorni odgovor u zidovima arterija, uzrokovan velikim delom nakupljanjem makrofaga belih krvnih zrnaca i podstaknut lipoproteinima niske gustine (LDL) bez
1 2
adekvatnog uklanjanja masti i holesterola iz makrofaga pomoću funkcionalnih lipoproteina velike gustine (HDL). Arteriosklerotična vaskularna bolest se obično naziva otvrdnuće ili oblaganje arterija i uzrokovana je stvaranjem više plakova unutar arterija.
[0346] Kako je otkriveno ovde, proteini sortilina prema ovom otkriću uključeni su u regulaciju lipida, vezivanjem proteina povezanih sa lipidima, kao što su proteini povezani sa receptorima, lipoprotein lipaza i apopolipoproteini APOA5 i APOE (npr. Nisson, SK et al., (2007) Biochemistry 46: 3896-3904; Nisson, SK et al., (2008) J Biol Chem 283: 25920-25927; i Klinger, SC et al., J Cell Sci 124: 1095-1105). Takođe je pokazano da su miševi sa nedostatkom sortilina imali smanjeno opterećenje plaka u aorti i smanjeni nivo holesterola u plazmi u kontekstu nedostatka receptora LDL (npr. Kjolby, M et al., Cell Metab 12: 213-223). U skladu sa sličnim ulogama receptora sortilina u metabolizmu lipida, pokazalo se da SorLA ima sličan efekat kao sortilin na metabolizam lipida, jer je gubitak SorLA zaštićen (npr. Guo, Z et al., Mediators Inflamm 2012: 540794). SorLA je pojačano regulisan u ateromatoznim plakovima kod zečeva i miševa, a nokaut miševi su zaštićeni od povrede vaskularne manžete (npr. Guo, Z et al., Mediators Inflamm 2012: 540794).
[0347] Shodno tome, i bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između sortilina i lipoprotein lipaze (LpL), apolipoproteina AV (APOA5), apolipoproteina E (APOE) i /ili proteina povezanog sa receptorom (RAP); ili koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina mogu koristiti za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje jedne ili više arteriosklerotičnih vaskularnih bolesti kod pojedinaca kojima je to potrebno.
Neželjeni simptomi starenja
[0348] Kako su upotrebljeni ovde, nepoželjni simptomi starenja uključuju, bez ograničenja, gubitak pamćenja, promene ponašanja, demenciju, Alzheimer-ovu bolest, degeneraciju mrežnjače, aterosklerotične vaskularne bolesti, gubitak sluha i ćelijski raspad.
[0349] Pokazano je da pro-neurotrofini (npr. pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, itd.) imaju ulogu u starenju i simptomima povezanim sa starenjem (npr., Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375–386; Volosin, M et al. (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49 –57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870 –9879; Fahnestock,
1
M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) J. Neurosci. 27, 7751-7761; Arnett, MG et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Pang, PT et al., (2004) Science 306, 487-491; i Al-Shawi, R et al., Ann N Y Acad Sci.2007;1119:208-15).
[0350] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro-NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzin, p75, lipoprotein lipaza (LpL), apolipoprotein AV (APOA5) i/ili protein povezan sa receptorom (RAP); ili koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina mogu se koristiti za sprečavanje, smanjenje rizika ili lečenje jednog ili više neželjenih simptoma starenja.
Amiotrofična lateralna skleroza (ALS)
[0351] Kako je upotrebljena ovde, amiotrofična lateralna skleroza (ALS) ili, bolest motornih neurona ili, Lou Gehrig-ova bolest, koriste se naizmenično i odnose se na iscrpljujuću bolest različite etiologije koju karakteriše brza progresivna slabost, atrofija mišića i fascikulacije, spastičnost mišića, poteškoće u govoru (dizartrija), otežano gutanje (disfagija) i otežano disanje (dispneja).
[0352] Pokazano je da progranulin ima ulogu u ALS (Schymick, JC et al., (2007) J Neurol Neurosurg Psychiatry.;78:754-6) i zaštiti ponovnih oštećenja izazvanih proteinima koji izazivaju ALS, kao što su TDP-43 (Laird, AS et al., (2010). PLoS ONE 5: e13368). Takođe je pokazano da pro-NGF indukuje p75 posredovanu smrt oligodendrocita i kortikospinalnih neurona nakon povrede kičmene moždine (Beatty et al., Neuron (2002),36, pp.375-386; Giehl et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (2004), 101, pp 6226-30).
[0353] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr. pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro- NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzin, p75, lipoprotein lipaza (LpL), apolipoprotein AV (APOA5) i/ili protein povezan sa receptorom (RAP); ili koji inhibiraju jednu ili više
1 4
aktivnosti sortilina mogu se koristiti za sprečavanje ili lečenje jednog ili više neželjenih simptoma ALS.
Depresija
[0354] Kako je upotrebljena ovde, depresija ili, veliki depresivni poremećaj (MDD), klinička depresija, velika depresija, unipolarna depresija, unipolarni poremećaj, ponavljajuća depresija ili distimija, koriste se naizmenično i odnose se na mentalni poremećaj koji karakterišu epizode sveobuhvatno niskog raspoloženja praćenog niskim samopoštovanjem i gubitkom interesa ili zadovoljstva u uobičajeno prijatnim aktivnostima. Ova grupa simptoma (sindrom) nazvana je, opisana i klasifikovana kao jedan od poremećaja raspoloženja u dijagnostičkom priručniku Američkog udruženja psihijatara izdanja iz 1980. godine. Termin "depresija" je dvosmislen. Često se koristi za označavanje ovog sindroma, ali se može odnositi na druge poremećaje raspoloženja ili na stanja slabijeg raspoloženja koja nemaju klinički značaj. Veliki depresivni poremećaj je onesposobljujuće stanje koje negativno utiče na porodicu, posao ili školski život, navike spavanja i ishrane i opšte zdravlje. U Sjedinjenim Državama oko 3.4% ljudi sa teškom depresijom izvrši samoubistvo, a do 60% ljudi koji počine samoubistvo imalo je depresiju ili drugi poremećaj raspoloženja.
[0355] Pokazalo se da su neurotrofini uključeni u depresiju i antidepresivno delovanje (Duman et al., Arch Gen Psychiatry (1997) 54:597-606); na primer, infuzija BDNF u hipokampus proizvela je antidepresivni efekat u dva ponašajna modela depresije (Shirayama et al., (2002), J Neurosci 22: 3251-3261). Štaviše, utvrđeno je da je polimorfizam jednog nukleotida u genu bdnf koji dovodi do supstitucije valina (Val) metioninom (Met) na kodonu 66 u pro-domenu (BDNFMet) povezan sa povećanom osetljivošću kod ljudi heterozigotnih za polimorfizam na neuropsihijatrijske poremećaje uključujući Alzheimer-ovu bolest, Parkinsonovu bolest, depresiju i bipolarni poremećaj (Chen et al, J. Neuroscience (2005), 25:6156-6166; Kuipers and Bramham, Curr. Opin. Drug Discov. Devel. (2006) 9(5):580-6; i Bath and Lee, Cogn. Affect. Behav. Neurosci (2006) 1:79-85). Osim toga, pokazalo se da ljudi heterozigotni za BDNFMetimaju oštećenja memorije (Egan et al., Cell (2003). 112, pp 257-269).
[0356] U nekim primerima izvođenja, antitela protiv sortilina prema ovom otkriću koja inhibiraju interakciju između sortilina i progranulina, neurotrofina prema ovom otkriću (npr.
1
pro-neurotrofini, pro-neurotrofin-3, pro-neurotrofin-4/5, pro- NGF, pro-BDNF, neurotrofin-3, neurotrofin-4/5, NGF, BDNF, itd.), neurotenzin, p75, lipoprotein lipaza (LpL), apolipoprotein AV (APOA5) i/ili protein povezan sa receptorom (RAP); ili koji inhibiraju jednu ili više aktivnosti sortilina mogu se koristiti za sprečavanje ili lečenje jednog ili više neželjenih simptoma depresije.
Parkinson-ova bolest
[0357] Parkinson-ova bolest, koja se može nazvati idiopatskim ili primarnim parkinsonizmom, hipokinetičkim rigidnim sindromom (HRS) ili paralizom agitans, je neurodegenerativni poremećaj mozga koji utiče na kontrolu motornog sistema. Progresivna smrt ćelija koje proizvode dopamin u mozgu dovodi do glavnih simptoma Parkinson-ove bolesti. Najčešće se Parkinson-ova bolest dijagnostikuje kod ljudi starijih od 50 godina. Parkinson-ova bolest je idiopatska (bez poznatog uzroka) kod većine ljudi. Međutim, genetički faktori takođe imaju ulogu u bolesti.
[0358] Simptomi Parkinson-ove bolesti uključuju, bez ograničenja, drhtanje šaka, ruku, nogu, vilice i lica, ukočenost mišića u udovima i trupu, sporost kretanja (bradikinezija), nestabilnost držanja, poteškoće pri hodanju, neuropsihijatrijske tegobe, promjene u govoru ili ponašanju, depresiju, anksioznost, bol, psihozu, demenciju, halucinacije i probleme sa spavanjem.
[0359] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da primenjivanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti Parkinson-ovu bolest. U nekim primerima izvođenja, primenjivanje antitela protiv sortilina može izazvati jednu ili više aktivnosti progranulina kod pojedinca koji imaju Parkinson-ovu bolest.
Huntington-ova bolest
[0360] Huntington-ova bolest (HD) je nasledna neurodegenerativna bolest uzrokovana autosomno dominantnom mutacijom u Huntingtin genu (HTT). Ekspanzija ponovljenih tripleta citokin-adenin-guanin (CAG) unutar Huntingtin gena rezultuje proizvodnjom mutiranog oblika Huntingtin proteina (Htt) kodiranog genom. Ovaj mutirani Huntingtin protein (mHtt) je toksičan i doprinosi smrti neurona. Simptomi Huntington-ove bolesti se
1
najčešće pojavljuju u starosnoj dobi od 35 do 44 godine, iako se mogu pojaviti u bilo kojoj životnoj dobi.
[0361] Simptomi Huntington-ove bolesti uključuju, bez ograničenja, probleme s motoričkom kontrolom, trzaje, nasumične pokrete (horea), abnormalne pokrete očiju, poremećenu ravnotežu, napade, poteškoće pri žvakanju, poteškoće pri gutanju, kognitivne probleme, promenjeni govor, nedostatak pamćenja, poteškoće u razmišljanju, nesanicu, umor, demenciju, promene ličnosti, depresiju, anksioznost i kompulzivno ponašanje.
[0362] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da primenjivanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti Huntington-ovu bolest (HD). U nekim primerima izvođenja, primenjivanje antitela protiv sortilina može izazvati jednu ili više aktivnosti progranulina kod pojedinca koji imaju HD.
Taupatijska bolest
[0363] Taupatijske bolesti, ili tauopatije, su klasa neurodegenerativnih bolesti uzrokovanih nakupljanjem proteina tau povezanog sa mikrotubulama u mozgu. Alzheimer-ova bolest (AD) je najpoznatija taupatijska bolest i uključuje nakupljanje tau proteina unutar neurona u obliku nerastvorljivih neurofibrilarnih spletova (NFTs). Druge bolesti i poremećaji taupatija uključuju progresivnu supranuklearnu paralizu, dementia pugilistica (hronična traumatska encefalopatija), frontotemporalnu demenciju i parkinsonizam povezan sa hromozomom 17, Lytico-Bodig-ovu bolest (Guam Parkinson-demencija kompleks), demenciju sa predominantnim zapletima, gangliogliom i gangiocitom, meningioangiomatoza, subakutni sklerozirajući panencefalitis, olovna encefalopatija, tuberozna skleroza, Hallervorden-Spatzova bolest, lipofuscinoza, Pick-ova bolest, kortikobazalna degeneracija, bolest argirofilnih telašaca (AGD), Huntington-ova bolest, frontotemporalna demencija i frontotemporalna lobarna degeneracija..
[0364] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da primenjivanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti taupatijsku bolest. U nekim primerima izvođenja, primenjivanje antitela protiv sortilina može izazvati jednu ili više aktivnosti progranulina kod pojedinca koji imaju taupatijsku bolest.
1
Multipla skleroza
[0365] Multipla skleroza (MS) se takođe može nazvati diseminirana skleroza ili diseminirani encefalomijelitis. MS je inflamatorna bolest u kojoj su oštećeni masni mijelinski omotači oko aksona mozga i kičmene moždine, što dovodi do demijelinizacije i ožiljaka, kao i širokog spektra znakova i simptoma. MS utiče na sposobnost nervnih ćelija u mozgu i kičmenoj moždini da međusobno efikasno komuniciraju. Nervne ćelije komuniciraju slanjem električnih signala koji se nazivaju akcioni potencijali duž dugih vlakana zvanih aksoni, koja su obuhvaćene u izolacionoj supstanci zvanoj mijelin. U MS, imunološki sistem tela napada i oštećuje mijelin. Kada se mijelin izgubi, aksoni više ne mogu efikasno provoditi signale. Početak MS se obično javlja kod mladih polno zrelih osoba, a češći je kod žena.
[0366] Simptomi MS uključuju, bez ograničenja, promene u osećaju, kao što su gubitak osetljivosti ili trnci; bockanje ili utrnulost, kao što su hipoestezija i parestezija; slabost mišića; klonus; grčenje mišića; poteškoće u kretanju; poteškoće u koordinaciji i ravnoteži, kao što je ataksija; problemi u govoru, kao što je dizartrija, ili u gutanju, kao što je disfagija; vizuelni problemi, kao što je nistagmus, optičkog neuritisa uključujući fosfene i diplopije; umor; akutni ili hronični bol; tegobe bešike i creva; kognitivno oštećenje različitog stepena; emocionalni simptomi depresije ili nestabilnog raspoloženja; ; Uhthoff-ov fenomen, koji predstavlja pogoršanje postojećih simptoma usled izloženosti višim od uobičajenih temperatura okoline; i Lhermitte-ov znak, koji je električni osećaj koji prolazi niz leđa pri savijanju vrata.
[0367] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da primenjivanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti multiplu sklerozu. U nekim primerima izvođenja, primenjivanje antitela protiv sortilina može izazvati jednu ili više aktivnosti progranulina kod pojedinca koji imaju multiplu sklerozu.
Glaukom i makularna degeneracija
[0368] Glaukom opisuje, bez ograničenja, grupu bolesti koje karakteriše oštećenje optičkog nerva, što dovodi do gubitka vida i slepila. Glaukom je obično uzrokovan povećanim pritiskom tečnosti (= intraokularni pritisak) u prednjoj komori ispod rožnjače. Glaukom rezultuje uzastopnim gubitkom retinalnih ganglijskih ćelija važnih za vid. Makularna degeneracija povezana sa starenjem obično pogađa starije ljude i prvenstveno uzrokuje
1
gubitak vida u makuli, centralnom vidnom polju. Makularna degeneracija uzrokuje, bez ograničenja, drusen, pigmentne promene, izobličen vid, krvarenje oka, atrofiju, smanjenu oštrinu vida, zamagljen vid, centralne skotome, smanjen vid boja i smanjenu osetljivost na kontrast.
[0369] Bez želje za vezivanjem za teoriju, veruje se da primenjivanje antitela protiv sortilina prema ovom otkriću može sprečiti, smanjiti rizik i/ili lečiti glaukom i makularnu degeneraciju. U nekim primerima izvođenja, primenjivanje antitela protiv sortilina može izazvati jednu ili više aktivnosti progranulina kod pojedinca koji imaju glaukom ili makularnu degeneraciju.
Degenerativna bolest diska (DDD)
[0370] Degenerativna bolest diska (DDD) opisuje, bez ograničenja, grupu bolesti u kojima intervertebralni disk (IVD) prolazi kroz opsežne morfološke i biomehaničke promene i obično se klinički manifestuje kod pacijenata sa bolovima u donjem delu leđa. Degenerativni diskovi obično pokazuju degenerativnu fibroznu hrskavicu i skupine hondrocita, što ukazuje na popravku. Inflamacija može ili ne mora biti prisutna. Patološki nalazi DDD uključuju protruziju, spondilolizu i/ili subluksaciju pršljenova (spondilolisteza) i spinalnu stenozu.
Kompleti/Proizvodi proizvođnje
[0371] Ovo otkriće takođe obezbeđuje komplete koji obuhvataju izolovano antitelo prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina), ili njegov funkcionalni fragment. Kompleti prema ovom otkriću mogu uključivati jedan ili više posuda koji sadrže prečišćeno antitelo prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, kompleti dalje uključuju uputstva za upotrebu u skladu sa postupcima prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, ova uputstva sadrže opis primene izolovanog antitela prema ovom otkriću (npr. ovde opisanog antitela protiv sortilina) da bi se sprečilo, smanjio rizik ili lečio pojedinac koji ima bolest, poremećaj ili povredu izabranu od frontotemporalne demencije, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, traumatske povreda mozga, povrede kičmene moždine, dugotrajne depresije, aterosklerotičnih vaskularnih bolesti, nepoželjnih simptome normalnog starenja, demencije, mešovite demencije, Creutzfeldt-Jakob-sove bolesti, normalni pritisak hidrocefalusa, amiotrofične lateralne skleroze, Huntington-ove
1
bolesti, taupatijske bolesti, Nasu-Hakola-ove bolesti, moždanog udara, akutne traume, hronične traume, lupusa, akutnog i hroničnog kolitisa, zarastanja rana, Crohn-ove bolesti, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, malarije, esencijalnog tremora, lupusa centralnog nervnog sistema, Behcet-ove bolesti, Parkinson-ove bolest, demencije sa Lewyjevim telima, višestruke sistemske atrofije, Shy-Drager-ovog sindroma, progresivne supranuklearne paralize, kortikalne bazalne ganglionske degeneracije, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, granulomatoznog poremećaja, sarkoidoze, bolesti starenja, makularne degeneracije povezane sa starenjem, glaukoma, pigmentoze retinitis, degeneracije mrežnjače, infekcije respiratornog trakta, sepse, infekcije oka, sistemske infekcije, lupusa, artritisa, multiple skleroze i zarastanja rana prema bilo kom postupku prema ovom otkriću.
[0372] U nekim primerima izvođenja, uputstva sadrže opis kako da se detektuje protein sortilin, na primer kod pojedinca, u uzorku tkiva ili u ćeliji. Komplet može dalje sadržati opis odabira pojedinca pogodnog za lečenje na osnovu identifikacije da li ta osoba ima bolest i stadijum bolesti.
[0373] U nekim primema izvođenja, kompleti mogu dalje uključivati drugo antitelo prema ovom otkriću (npr. najmanje jedno antitelo koje se specifično vezuje za molekul inhibitorne kontrolne tačke, najmanje jedno antitelo koje se specifično vezuje za inhibitorni citokin, i/ili najmanje jedno agonističko antitelo koje se specifično vezuje za protein stimulativne kontrolne tačke) i/ili najmanje jedan stimulativni citokin. U nekim primerima izvođenja, kompleti mogu dalje uključivati uputstva za upotrebu antitela i/ili stimulativnog citokina u kombinaciji sa izolovanim antitelom prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina), uputstva za upotrebu izolovanog antitela prema ovom otkriću u kombinaciji sa antitelom i/ili stimulativnim citokinom, ili uputstva za upotrebu izolovanog antitela prema ovom otkriću i antitela i/ili stimulativnog citokina, prema bilo kom postupku prema ovom otkriću.
[0374] Uputstva generalno sadrže informacije o doziranju, rasporedu doziranja i načinu primene za predviđeno lečenje. Posude mogu biti jedinične doze, bulk pakovanja (na primer, pakovanja sa više doza) ili podjedinične doze. Uputstva koja se isporučuju u kompletima ovog otkrića obično su pisana uputstva na etiketi ili umetku pakovanja (npr. papirni list koji je uključen u komplet), ali uputstva koja se mogu čitati mašinski (npr. uputstva koja se nose na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje) su takođe prihvatljiva.
1
[0375] Nalepnica ili umetak na pakovanju označavaju da se kompozicija koristi za lečenje, na primer, bolesti prema ovom otkriću. Mogu se obezbediti uputstva za izvođenje bilo kog postupka opisanog ovde.
[0376] Kompleti prema ovom otkriću su u odgovarajućem pakovanju. Pogodno pakovanje uključuje, ali se ne ograničava na, bočice, boce, tegle, fleksibilno pakovanje (npr. zapečaćene Mylar ili plastične kese) i slično. Takođe se razmatraju pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa određenim uređajem, kao što je inhalator, uređaj za nazalnu primenu (npr. raspršivač) ili uređaj za infuziju, kao što su mini pumpe. Komplet može imati sterilni pristupni otvor (na primer, posuda može biti intravenozna vrećica sa rastvorom ili bočica koja ima čep koji se može probiti iglom za potkožno ubrizgavanje). Posuda može takođe imati sterilni pristupni otvor (na primer, posuda može biti intravenozna vrećica sa rastvorom ili bočica koja ima čep koji se može probiti iglom za potkožno ubrizgavanje). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je izolovano antitelo prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina). Posuda može dalje da sadrži drugo farmaceutski aktivno sredstvo.
[0377] Kompleti mogu izborno obezbediti dodatne komponente kao što su puferi i interpretativne informacije. Obično komplet sadrži posudu i nalepnicu ili umetak (umetke) na pakovanju ili povezane sa posudom.
Dijagnostičke upotrebe
[0378] Izolovana antitela prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina) takođe imaju dijagnostičku korist. Ovo otkriće stoga obezbeđuje postupke korišćenja antitela prema ovom otkriću, ili njihovih funkcionalnih fragmenata, u dijagnostičke svrhe, kao što je detekcija proteina sortilina kod pojedinca ili u uzorcima tkiva dobijenim od pojedinca.
[0379] U nekim primerima izvođenja, pojedinac je čovek. U nekim primerima izvođenja, pojedinac je humani pacijent koji pati ili je u riziku za razvoj bolesti, poremećaja ili povrede prema ovom otkriću. U nekim primerima izvođenja, dijagnostički postupci uključuju otkrivanje proteina sortilina u biološkom uzorku, kao što je uzorak biopsije, tkivo ili ćelija. Izolovano antitelo prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina) dolazi u kontakt sa biološkim uzorkom i detektuje se antitelo vezano za antigen. Na primer, uzorak biopsije može biti obojen sa ovde opisanim antitelom protiv sortilina da bi se otkrile i/ili kvantifikovale ćelije povezane sa bolešću. Postupak uočavanja može uključivati kvantifikaciju
1 1
antitela vezanog za antigen. Otkrivanje antitela u biološkim uzorcima može se uraditi bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, uključujući imunofluorescentnu mikroskopiju, imunocitohemiju, imunohistohemiju, ELISA, FACS analizu, imunoprecipitaciju ili mikropozitronsku emisionu tomografiju. U nekim primerima izvođenja, antitelo je radioaktivno obeleženo, na primer sa<18>F i naknadno detektovano korišćenjem analize mikropozitronske emisione tomografije. Vezivanje antitela se takođe može kvantifikovati kod pacijenata neinvazivnim tehnikama kao što su pozitronska emisiona tomografija (PET), rendgenska kompjuterizovana tomografija, kompjuterizovana tomografija emisije pojedinačnog fotona (SPECT), kompjuterizovana tomografija (CT) i kompjuterizovana aksijalna tomografija (CAT).
[0380] U drugim primerima izvođenja, izolovano antitelo prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina) može se koristiti za otkrivanje i/ili kvantifikaciju, na primer, mikroglije u uzorku mozga uzetog iz modela predkliničke bolesti (npr. model ne-humane bolesti). Kao takvo, izolovano antitelo prema ovom otkriću (npr. ovde opisano antitelo protiv sortilina) može biti korisno u proceni terapijskog odgovora nakon tretmana u modelu za bolest ili povredu nervnog sistema, kao što je frontotemporalna demencija, Alzheimer-ova bolest, vaskularna demencija , napadi, distrofija mrežnjače, aterosklerotične vaskularne bolesti, Nasu-Hakola bolest ili multipla skleroza, u poređenju sa kontrolom.
[0381] Ovo otkriće će biti potpunije shvaćeno pozivanjem na sledeće primere. Ne treba ih, međutim, tumačiti kao ograničenje obima ovog otkrića.
PRIMERI
Primer 1: Proizvodnja, identifikacija i karakterizacija antitela protiv sortilina
Uvod
[0382] Antitela protiv sortilina se mogu identifikovati pomoću utvrđenih biblioteka za prezentaciju antitela na bazi kvasca, na primer, kako je otkriveno u WO 2009/036379, WO 2010/105256, WO2012/009568, US 2009/0181855, i US 2010/0056386. Takve biblioteke se mogu koristiti za identifikaciju antitela protiv sortilina koja blokiraju interakciju između sortilina i liganda sortilina, kao što su progranulin i/ili pro-NGF, i/ili antitela protiv sortilina
1 2
koja unakrsno reaguju sa drugim proteinima sortilina sisara, kao što je kao mišji sortilin, sortilin pacova i/ili sortilin primata.
[0383] Alternativno, mogu se koristiti standardni protokoli prikaza skrininga kvasca, kako je opisano u Patrick Chames (ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 907, Springer Science+Business Media, LLC 2012 Chapter 15, Selection of Antibody Fragments by Yeast Display by Nathalie Scholler.
[0384] Antitela se takođe mogu stvoriti bilo kojim drugim utvrđenim postupkom proizvodnje antitela, kao što su oni opisani u Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 907, Springer Science+Business Media, LLC 2012.
[0385] Sposobnost antitela da inhibiraju interakcije između sortilina i njegovih liganda tada se može potvrditi u više, utvrđenih biohemijskih i/ili analiza na osnovu ćelija, uključujući, ali bez ograničenja, analizu površinske plazmonske rezonance, koimunoprecipitaciju, postupak prečišćavanja afinitetnom hromatografijom, analize proteina vezanih za celulozu, analize komplementacije β -galaktozidaze, FRET analize populacije ćelija, analize vezivanja u blizini i analize vezivanja ćelija.
[0386] Kako je opisano ovde, 85 antitela protiv sortilina je identifikovano i okarakterisano.
Materijali i postupci
Proivodnja monomernog i Fc-konjugovanog humanog i mišjeg sortilina
[0387] Ekspresija antigena sortilina kod sisara izvedena je kloniranjem sintetičkih gena zasnovanih na cDNK u ekspresionim vektorima sisara, nakon čega je usledila prolazna transfekcija i ekspresija u ćelijama HEK293T. Konstrukti su uključivali heterologni signalni peptid i humani IgG1 Fc za Fc fuzione konstrukte. Ukratko, ekspresioni vektori koji obuhvataju antigen od interesa su transficirani kompleksiranjem sa transficiranim reagensom, nakon čega je usledila izloženost ćelijama HEK293T tokom jednog sata, a zatim razblaživanje podloge za kulturu do konačne gustine od 4 miliona ćelija po mL. Ćelije su zatim kultivisane 7 dana sa svežim hranjivim medijumima svakih 48 sati. Nakon 7 dana, supernatant je sakupljen nakon centrifugiranja i izvršeno je prečišćavanje upotrebom proteina Ni-sefaroze i, ako je potrebno, SEC prečišćavanjem kolone da se dostigne> 95 % ne-agregiranog sadržaja
1
monomera. Monomerni antigeni sortilina su pripremljeni fragmentiranjem sortilin Fc fuzionisanog antigena sa modifikovanim regionom za povezivanje (Lynaugh et al., MAbs.
2013 Oct;5(5):641-45) sa FabRICATOR (IdeS) proteazom (Genovis, Cat # A2-FR2-1000), nakon čega sledi afinitetno prečišćavanje proteina A da bi se uklonio nedigestirani Fc fuzioni protein i SEC da bi se uklonio agregirani monomer.
Biotiniliran sortilin i progranulin
[0388] Biotinilacija proteinskog reagensa izvedena je pomoću EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit, Thermo Scientific, Cat #21425.
[0389] Sortilin i progranulin su koncentrovani na ~ 1 mg/mL i pufer je razmenjen u PBS pre dodavanja biotinilizovanog reagensa molarnog odnosa 1: 7.5 (EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit, Thermo Scientific, Cat #21425.). Smeša je držana na 4 °C preko noći pre nove razmene pufera da bi se uklanio slobodni biotin u rastvoru. Biotinilacija je potvrđena vezivanjem Streptavidin senzora za obeležene proteine na ForteBio.
Razdvajanje antitela sortilina
[0390] Osam naivnih biblioteka humanog sintetičkog kvasca, svaka od ~ 10<9>diverziteta, dizajnirano je, generisano i prošireno kao što je prethodno opisano (videti, npr .: Xu et al, 2013; WO2009036379; WO2010105256; WO2012009568; Xu et al., Protein Eng Des Sel.
2013 Oct;26(10):663-70). Izvršeno je deset paralelnih selekcija, korišćenjem osam naivnih biblioteka za selekcije humanog sortilin Fc fuzionog antigena i dva skupa od osam biblioteka za selekcije humanog monomera sortilina. Za prva dva kruga selekcije, izvedena je tehnika razvrstavanja magnetnim kuglicama pomoću sistema Miltenyi MACs, u suštini kako je opisano (Siegel et al., J Immunol Methods. 2004 Mar;286(1-2):141-53). Ukratko, ćelije kvasca (~ 10<10>ćelija/biblioteka) inkubirane su sa 3 ml 10 nM biotinilizovanog sortilin Fc fuzionog antigena ili 100 nM biotinilizovanog antigena monomera sortilina 15 minuta na sobnoj temperaturi u puferu za ispiranje FACS PBS sa 0.1% BSA. Posle jednokratnog ispiranja sa 50 ml ledenog pufera za ispiranje, ćelijski pelet je resuspendovan u 40 mL pufera za ispiranje, a u kvasac je dodato 500 μl streptavidin MicroBeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany. Cat # 130-048-101) i inkubirano 15 minuta na 4 °C. Zatim je kvasac
1 4
peletiran, resuspendovan u 5 mL pufera za ispiranje i stavljen na MACS LS kolonu (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany. Cat.# 130-042-401). Nakon što je napunjena sa 5 mL, kolona je isprana 3 puta sa 3 ml FACS pufera za ispiranje. Kolona je zatim uklonjena iz magnetnog polja, a kvasac je eluiran sa 5 mL medijuma za uzgajanje, a zatim je uzgajan preko noći. Sledeća četiri kruga sortiranja izvedena su protočnom citometrijom. Približno 1 × 10<8>kvasca je peletirano, isprano tri puta puferom za ispiranje i inkubirano sa 10 nM biotinilizovanog sortilin Fc fuzionog antigena ili 100 nM biotinilizovanog antigena monomera sortilina 10 minuta na sobnoj temperaturi. Kvasac je zatim dva puta ispran i obojen kozjim anti-humanim F (ab')2kappa-FITC razblaženim 1: 100 (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, Cat# 2062-02) i streptavidin-Alexa Fluor 633 (Life Technologies, Grand Island, NY, Cat # S21375) razblažen 1: 500, ili ekstravidin-fikoertirin (Sigma-Aldrich, St Louis, Cat # E4011) razblažen 1:50, sekundarni reagensi 15 minuta na 4 °C. Nakon dva puta ispiranja sa ledenim puferom za ispiranje, ćelijski peleti su resuspendovani u 0.4 mL pufera za ispiranje i prebačeni u epruvete za sortiranje sa zatvaračem. Sortiranje je izvedeno pomoću FACS ARIA razvrstača (BD Biosciences) i utvrđeno je da su za sortiranje odabrani samo klonovi za vezivanje sortilina za jedan krug, a drugi krug je bio negativan za smanjenje reagensa povezivača, polispecifičnih povezivača (Xu et al., PEDS. 2013 Oct;26(10):663-70), i povezivača za kontrolni protein humanog SorCS1 HIS označenog monomera. U trećem krugu je korišćeno obeležavanje sa 10 nM humanih i mišjih sortilina Fc fuzionih antigena, 100 nM humanog antigena monomera sortilina i kompeticija sa progranulinom koristeći antigene sortilina (10 nM) prethodno kompleksiran sa 500 nM progranulinom. Za kvasac koji je kompetitivan sa progranulinom, izvedena je poslednja runda da bi se obogatili povezivači sortilin Fc fuzionog antigena. Nakon poslednje runde sortiranja, kvasci su obloženi i pojedinačne kolonije su odabrane za karakterizaciju.
[0391] Teški lanci iz drugog i četvrtog kruga izlaza selekcije FACS sortiranja korišćeni su za pripremu biblioteka za diverzifikaciju lakih lanaca koje se koriste za dodatne odabire. Za ove odabire, u prvom krugu odabira korišćene su Miltenyi MACs kuglice i obeležavane sa 10 nM humanog sortilin Fc fuzionog antigena. Usledila su četiri kruga FACS sortiranja. U prvoj rundi korišćen je 100 nM humani monomer antigena sortilina. Druga runda FACS bila je negativna za smanjenje vezivanja za reagens povezivača, polispecifične povezivače i povezivače za kontrolni protein humanog SorCS1 HIS označenog monomera. U poslednja dva kruga su korišćena titracija monomera humanog sortilina (100 nM, 10 nM i 1 nM) za
1
odabir povezivača sa najvećim afinitetom, 100 nM mišjeg monomera sortilina i kompeticija sa kontrolnim 3E3 antitelom da bi se procenila zastupljenosti kompetitora u obogaćenoj populaciji. Nakon poslednje runde sortiranja, kvasci su obloženi i pojedinačne kolonije su odabrane za karakterizaciju.
Antitelo IgG i proizvodnja Fab i prečišćavanje
[0392] Klonovi kvasca su uzgajani do zasićenja i zatim indukovani 48h na 30 °C uz mućkanje. Nakon indukcije, ćelije kvasca su peletirane i supernatanti su sakupljeni zbog prečišćavanja. IgGs su prečišćeni korišćenjem kolone proteina A i eluirani sa sirćetnom kiselinom, pH 2.0. Fab fragmenti su dobijeni digestijom papaina i prečišćeni preko CaptureSelect IgG-CH1 matriksa afiniteta (LifeTechnologies, Cat # 1943200250).
Eksperimenti ForteBio vezivanja
[0393] Afinitet za antitela sortilina je određen merenjem njihovog KDpomoću ForteBio. Merenja afiniteta prema ForteBio vršena su generalno kao što je prethodno opisano (Estep et al., MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):270-8). Ukratko, merenja afiniteta prema ForteBio izvedena su učitavanjem IgGs na uključenim AHQ senzorima. Isključeni senzori su uravnoteženi u puferu za analizu 30 minuta, a zatim su nadgledani dok su uključeni tokom 60 sekundi da bi se utvrdila osnovna linija. Za merenja avidnog vezivanja, senzori sa opterećenim IgGs su bili izloženi 100 nM antigenu (humana ili mišja sortilin Fc fuzija) tokom 3, nakon toga su prebačeni u pufer za analiziranje 3 min da bi se izmerila brzina isključivanja. Dodatno avidno vezivanje je utvrđeno učitavanjem biotinilizovanog monomera sortilina na SA senzorima i izlaganjem ~ 100 nM IgG u rastvoru. Merenja monovalentnog vezivanja su dobijena učitavanjem humanih ili mišjih sortilin Fc fuzionih antigena na AHQ senzor, a zatim je izloženo ~ 100 nM Fab antitela sortilina. Dodatna monovalentna merenja su izvršena učitavanjem biotinilizovanog humanog ili mišjeg monomera sortilina na SA senzor, nakon čega je izloženo ~ 100 nM Fab u rastvoru.
[0394] Kinetički podaci su usklađeni korišćenjem modela vezivanja 1:1 u softveru za analizu podataka koji je obezbedio ForteBio.
1
Povezivanje epitopa
[0395] Povezivanje epitopa antitela protiv sortilina izvedeno je na sistemu ForteBio Octet Red384 (ForteBio, Menlo Park, CA) korišćenjem standardne analize povezivanja u sendvič formatu. Kontrolni anti-ciljani IgG je učitan na AHQ senzore i slobodna mesta za vezivanje Fc na senzoru blokirana su ne-relevantnim humanim IgG1 antitelom. Senzori su zatim izloženi 100 nM ciljanog antigena, nakon čega je usledilo drugo anti-ciljano antitelo. Podaci su obrađeni pomoću ForteBio softvera za analizu podataka 7.0. Dodatno vezivanje drugog antitela nakon udruživanja antigena ukazuje na slobodni epitop (ne-kompetitor), dok nikakvo vezivanje ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitor). Ovaj postupak je ponovljen za četiri kontrolna antitela: (i) 3E3, koje se vezuje za domen 1 sortilina (pakovanje 1); (ii) S-29, koji se vezuje za domen 2 sortilina (pakovanje 2_; (iii) S-3, koji se vezuje za domen 3 sortilina (pakovanje 3); i S-40, koji se veže za domen 4 sortilina (pakovanje 4). Pakovanja antitela navedena su u tabeli 5 u nastavku. Slični postupci povezivanja mogu se koristiti za određivanje kompeticije između antitela protiv sortilina i pune duže humanog ili mišjeg progranulina, kao i između antitela protiv sortilina i C-terminalnog peptida progranulina.
Analize kompeticije progranulina
[0396] Svi eksperimenti su izvedeni na ForteBio HTX instrumentu. Svi uzorci su razblaženi u PBSF (0.1% BSA u PBS). Svi koraci ForteBio ubacivanja i čitanja uključivali su mućkanje na 1000 rpm.
[0397] Kompeticija za progranulin je procenjena korišćenjem tri ForteBio analize.
Analiza 1: Eksperimenti kompeticije progranulina sa biotinilizovanim progranulin C terminalnim peptidom.
[0398] SA senzori su umočeni u PBS 10 minuta pre analize. Blanko senzori su umočeni u biotinilizovani progranulin (PGRN) C-terminalni peptid (Bio-TKCLRREAPRWDAPLRDPA LRQLL (SEQ ID BR:693)) na 100 nM i zatim umočeni u PBSF najmanje 10 minuta pre analize. Tipsevi napunjeni peptidima su sekvencijalno uranjani u PBSF (60 s), humani monomer sortilina (100 nM) tokom 3 min, i na kraju 100 nM antitela. Podaci su pripremljeni za analizu sa ForteBio Data Analysis Software verzija 8.1.0.36 na sledeći način. Podaci su
1
poravnjati po y-osi i i izmenjeni u više koraka do početka koraka hvatanja sortilina, a zatim izdvojeni samo određeni podaci da bi se prikazali samo koraci hvatanja sortilina i interakcije antitela. Analize u kojima nije primećen signal vezivanja nakon dodavanja datog testiranog rastvora antitela sortilina pokazali su da se mesto vezivanja testiranog antitela sortilina preklapa sa mestom vezivanja peptida PRGN na površini sortilina. Analize u kojima je primećen signal vezivanja nakon dodavanja datog testiranog rastvora antitela sortilina pokazali su da testirano antitelo sortilina ne blokira vezivanje peptida PRGN za sortilin.
Analiza 2: Eksperimenti kompeticije progranulina sa biotinilizovanim humanim monomerom sortilina:
[0399] SA senzori su umočeni u PBS 10 minuta pre analize. Blanko senzori su umočeni u biotinilizovani humani monomer sortilina (100 nM) i zatim su umočeni u PBSF 10 minuta pre analize. Tipsevi napunjeni sortilinom sekvencijalno su umočeni u PBSF (1 min), progranulin (1.0 uM) tokom 3 min i na kraju 100 nM antitela. Podaci su pripremljeni za analizu sa ForteBio Data Analysis Software verzija 8.1.0.36 na sledeći način. Podaci su poravnjati po yosi i i izmenjeni u više koraka do početka koraka hvatanja progranulina, a zatim izdvojeni samo određeni podaci da bi se prikazali samo koraci hvatanja progranulina i interakcije antitela. Analize u kojima nije primećen signal vezivanja nakon dodavanja datog testiranog rastvora antitela sortilina pokazali su da se mesto vezivanja testiranog antitela sortilina preklapa sa mestom vezivanja progranulina na površini sortilina. Analize u kojima je primećen signal vezivanja nakon dodavanja datog testiranog rastvora antitela sortilina pokazali su da antitelo sortilina ne blokira vezivanje progranulina za sortilin.
Analiza 3: Eksperimenti kompeticije progranulina sa biotinilizovanim progranulinom:
[0400] SA senzori su umočeni u PBS 10 minuta pre analize. Blanko senzori su umočeni u biotinilizovani progranulin (100 nM) i zatim su umočeni u PBSF 10 minuta pre analize. Tipsevi napunjeni progranulinom sekvencijalno su umočeni u PBSF (1 min), 100 nM humani monomerni sortilin (3 min) i na kraju 100 nM antitela. Podaci su pripremljeni za analizu sa ForteBio Data Analysis Software verzija 8.1.0.36 na sledeći način. Podaci su poravnjati po yosi i i izmenjeni u više koraka do početka koraka hvatanja sortilina, a zatim izdvojeni samo
1
određeni podaci da bi se prikazali samo koraci hvatanja sortilina i interakcije antitela. Analize u kojima nije primećen signal vezivanja nakon dodavanja datog testiranog rastvora antitela sortilina pokazali su da se mesto vezivanja antitela sortilina preklapa sa mestom vezivanja progranulina na površini sortilina. Analize u kojima je primećen signal vezivanja nakon dodavanja datog testiranog rastvora antitela sortilina pokazali su da antitelo sortilina ne blokira vezivanje progranulina za sortilin.
Rezultati
Proizvodnja antitela protiv sortilina
[0401] Antitela koja se vezuju za sortilin, posebno unutar domena Vps10p koji se nalazi na aminokiselinskim ostacima 78-611 humanog sortilina (SEQ ID BR: 1), identifikovana su iz osam naivnih biblioteka humanog sintetičkog kvasca, kao što je prethodno opisano. Proizvedeno je ukupno 85 antitela (S-1 do S-85). Antitela su zatim pregledana u pogledu vezivanja za sortilin.
Sekvence varijabilnih domena teških lanaca i lanaca lanaca antitela
[0402] Koristeći standardne tehnike, određene su sekvence aminokiselina koje kodiraju varijabilne domene teškog lanca i varijabilne domene lakog lanca nastalih antitela. EU ili Kabat CDR sekvence antitela prikazane su u Tabeli 1. EU ili Kabat okvirne sekvence lakih lanaca antitela prikazane su u Tabeli 2. Kabat okvirne sekvence teškog lanca antitela prikazane su u Tabeli 3.
1
•
1 •
11
•
12
•
1 •
14
�
�
•
1 •
1 •
1
� •
11 •
12 •
1 Karakterizacija vezivanja antitela sortilina
[0403] Početna karakterizacija antitela protiv sortilina uključivala je određivanje njihove sposobnosti vezivanja sortilina eksprimiranog na humanim embrionalnim ćelijama bubrega (293) koje eksprimiraju ili rekombinantni humani sortilin (hSort) ili rekombinantni mišji sortilin (mSort). Ćelije su sakupljene, stavljene na 10<5>/ml u ploćicu sa 96 udubljenja, isprane i inkubirane u 100 µl PBS koji sadrži 10 µg/ml Mab i 2% FBS tokom 1 sata u ledu. Ćelije su zatim isprane dva puta i inkubirane u 100 µl PBS 2% FBS koje obuhvataju 5 µg/ml PE-konjugovanog anti-humanog sekundarnog antitela 30 minuta u ledu. Ćelije su isprane dva puta u hladnom PBS i podaci su prikupljeni na BD FACS Canto. Analiza podataka i proračun MFI vrednosti izvedeni su sa softverom FlowJo (TreeStar) verzija 10.0.7.
[0404] Srednje vrednosti fluorescentnog intenziteta (MFI) za tipove ćelija povezanih sa antitelima sortilina S1-S85 navedene su u Tabeli 4. Vezivanje se upoređuje sa parentalnom ćelijskom linijom (293). Rezultati u Tabeli 4 pokazuju da se S1-S85 specifično vezuju za ćelijske linije koje prekomerno eksprimiraju humani i mišji sortilin na ćelijskoj membrani, ali ne i za kontrolne ćelijske linije koje ne eksprimiraju sortilin.
Tabela 4: Vezivanje antitela sortilina sa humanim i mišjim ćelijama
1 4
1
1
[0405] Afinitet vezivanja svakog antitela protiv sortilina određen je merenjem njihovog KDpomoću ForteBio ili MSD-SET na sobnoj temperaturi. ForteBio merenja afiniteta izvedena su kao što je prethodno opisano (Estep et al, (2013) MAbs 5(2):270-8). Ukratko, ForteBio merenja afiniteta izvedena su učitavanjem IgGs na uključene AHQ senzore. Isključeni senzori su uravnoteženi u puferu za analiziranje 30 minuta, a zatim su posmatrani uključeni tokom 60 sekundi zbog utvrđivanja osnovne linije. Senzori sa napunjenim IgGs su bili izloženi 100 nM antigenu 5 minuta, zatim prebačeni u pufer za analiziranje 5 minuta zbog merenja brzine isključivanja. Kinetika je analizirana korišćenjem modela vezivanja 1: 1.
[0406] Merenja uravnotežnog afiniteta izvedena su kako je prethodno opisano (Estep et al, (2013) MAbs 5(2):270-8). Ravnotežne titracije rastvora (SET) izvedene su u PBS 0.1% BSA bez IgG (PBSF) sa antigenom održavanim konstantnim na 50 pM i inkubiranim sa 3 do 5 puta serijskim razblaženjima antitela počevši od 10 nM. Antitela (20 nM u PBS) su
1
obložena na standardno vezanim MSD-ECL pločicama preko noći na 4 °C ili na sobnoj temperaturi 30 min. Pločice su zatim blokirane 30 minuta uz mućkanje na 700 rpm, nakon čega su usledila tri ispiranja puferom za ispiranje (PBSF 0.05% Tween 20). Primenjeni su SET uzorci i inkubirani na pločicama tokom 150 sekundi uz mućkanje na 700 rpm, nakon čega je usledilo jedno ispiranje. Antigen uhvaćen na pločici detektovan je sa 250ng/mL streptavidina obeleženog sulfo oznakom u PBSF inkubacijom na pločici 3 min. Pločice su isprane tri puta puferom za ispiranje, a zatim su očitane na instrumentu MSD Sector Imager 2400 koristeći 1x Read Buffer T sa surfaktantom. Procenat slobodnog antigena iscrtan je kao funkcija titrovanog antitela u Prism i odgovara kvadratnoj jednačini za ekstrakciju KD. Za poboljšanje protoka, roboti za rukovanje tečnošću su korišćeni tokom MSD-SET eksperimenata, uključujući pripremu SET uzorka.
[0407] U tabeli 5 navedene su vrednosti koje predstavljaju afinitet vezivanja (KD) antitela S1-S85 za humani sortilin Fc fuzioni protein (hSort-Fc) i mišji sortilin Fc fuzioni protein (mSort-Fc), kao i pakovanje kome oni pripadaju. Antitela koja pripadaju istom pakovanju u kompeticiji su međusobno pri vezivanju za sortilin. U Tabeli 5, „N.B.“ odgovara terminu bez vezivanja; i „P.F.“ odgovara slabom uklapanju krive.
Tabela 5: Afinitet vezivanja antitela sortilina
1
1
2
Primer 2: Mapiranje epitopa antitela sortilina
[0408] Antitela sortilina su testirana za njihovu sposobnost da vežu 15-merne ili 25-merne peptide koji obuhvataju ceo humani protein sortilin.
[0409] Linearni 15-merni peptidi su sintetizovani na osnovu sekvence humanog sortilina (SEQ ID BR: 1), sa preklapanjem od 14 ostataka. Osim toga, linearni 25-merni peptidi su sintetizovani na osnovu sekvence humanog sortilina (SEQ ID BR: 1), sa preklapanjem od 24 ostatka. Peptidi su sintetizovani korišćenjem standardne Fmoc hemije i zaštita je uklonjena upotrebom trifluoridne kiseline sa čistačima. Vezivanje antitela sortilina za svaki od sintetizovanih peptida testirano je postupkom zasnovanom na ELISA. U ovoj analizi, nizovi peptida su inkubirani sa rastvorom primarnog antitela (preko noći na 4 °C). Posle ispiranja, nizovi peptida su inkubirani sa 1/1000 razblaženjem konjugata antitelo peroksidaza (SBA, kat. Br. 2010-05) jedan sat na 25 °C. Nakon ispiranja, dodati su supstrat peroksidaze 2,2’-azinodi-3-etilbenztiazolin sulfonat (ABTS) i 2 µl/ml 3% H2O2. Posle jednog sata, meren je razvoj boje. Razvoj boja je kvantifikovan kamerom uređaja koji koristi kuplovana naelektrisanja (CCD) i sistemom za obradu slike.
2 1
[0410] Region vezivanja sortilina određen je za šest antitela protiv sortilina: S-1, S-8, S-44, S-49, S-65 i S-78. Regioni vezivanja su navedeni u Tabeli 6. SLIKA 1 prikazuje šematski prikaz humanog sortilina, ukazujući na regione vezane sa šest antitela protiv sortilina.
Tabela 6: Regioni vezivanja antitela sortilina
[0411] Kao što je naznačeno u Tabeli 6, peptid koji prepoznaje antitelo S-1 odgovara aminokiselinskim ostacima 623-632 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: HSTDPEDYED (SEQ ID BR: 708). Peptid koji prepoznaje antitelo S-8 odgovara aminokiselinskim ostacima 429-443 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: ITFDQGGRWTHLRKP (SEQ ID BR: 709). Peptid koji prepoznaje antitelo S-44 odgovara aminokiselinskim ostacima 740-749 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: CTSNFLSPEK (SEQ ID BR: 710). Peptid koji prepoznaje antitelo S-49 odgovara aminokiselinskim ostacima 233-243 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: LSTENGLWVSK (SEQ ID BR: 711). Peptid koji prepoznaje antitelo S-65 odgovara aminokiselinskim ostacima 175-181 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: GPENSGK (SEQ ID BR: 712). Peptid koji prepoznaje antitelo S-78 odgovara aminokiselinskim ostacima 212-221 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: LPFHPLTQMM (SEQ ID BR: 713). Peptidi vezani za svako antitelo prikazani su na SLICI 1. Peptid koji prepoznaje S-1 prikazan je zelenom bojom, peptid koji prepoznaje S-65 prikazan je crvenom bojom, peptid koji prepoznaje S-49 prikazan je plavom bojom, peptid koji prepoznaje S-78 prikazan je žutom bojom, peptid koji prepoznaje S-44 prikazan je ružičastom bojom, a peptid koji prepoznaje S-8 prikazan je ljubičastom bojom.
2 2
Primer 3: Karakterizacija interakcije između sortilina i progranulina
Uvod
[0412] Interakcija između sortilina i progranulina je okarakterisana pomoću ForteBio i analize površinske plazmonske rezonance (npr., Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287:43798; i Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222).
Materijali i postupci
[0413] Interakcija između sortilina (SORT1) i progranulina (PGRN)je okarakterisana pomoću analize površinske plazmonske resonance (SPR) (videti, npr., Skeldal, S et al., (2012) J Biol Chem., 287:43798; i Andersen, OS et al., (2010) THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285,12210-12222).
[0414] Određivanje direktnog vezivanja humanog ili mišjeg progranulina za imobilizovani sortilin, kao i vezivanje humanog ili mišjeg sortilina za imobilizovani progranulin, u prisustvu ili odsustvu blokirajućih antitela protiv sortilina, izvedeno je na instrumentu Biacore2000 (Biacore, Švedska) pomoću CaHBS kao standardnog aktivnog pufera (10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM EGTA i 0.005% Tween 20).
[0415] Biosenzorski čip kompanije Biacore (CM5, kataloški br. BR-1000-14) aktiviran je pomoću NHS/EDC postupka prema opisu dobavljača, nakon čega je obložen sortilinom do gustine proteina od 79 fmol/mm<2>i korišćen za merenje afiniteta prirodnog proteina progranulina. Regeneracija protočne ćelije nakon svakog ciklusa eksperimenta vezivanja liganda izvedena je sa dva 10-μl impulsa regeneracionog pufera (10 mM glicin-HCl, pH 4.0, 500 mM NaCl, 20 mM EDTA i 0.005% Tween 20) i jednim ubrizgavanjem 0.001% SDS. Prilagođavanje senzorskih dijagrama za procenu afiniteta izvršeno je korišćenjem BIAevaluation verzija 3.1. Prateći slične protokole, imobilizacija His-progranulina je takođe izvedena na CM5 biosenzorskom čipu pomoću kompleta za kuplovanje NHS/EDC prema uputstvima proizvođača (Biacore, Švedska), dajući slične površinske gustine imobilizovanog proteina (∼300 fmol/mm<2>). Biosenzorski čip sa imobilizovanim progranulinom je takođe
2
korišćen za ispitivanje vezivanja sortilina u odsustvu ili prisustvu kompetitivnih antitela sortilina.
[0416] Kompeticija ligandima između progranulinskih i antitela protiv sortilina izvedena je slično kao povezivanje epitopa antitela sortilina opisano u prethodno navedenom primeru 1. Ukratko, analiza kompeticije je izvedena na sistemu ForteBio Octet Red384 (Pall ForteBio Corporation, Menlo Park, CA) korišćenjem standardne analize povezivanja u sendvič formatu. Kontrolni anti-ciljani IgG je učitan na AHQ senzore i slobodna mesta za vezivanje Fc na senzoru blokirana su ne-relevantnim humanim IgG1 antitelom. Senzori su zatim izloženi 100 nM ciljanog antigena, nakon čega je usledilo drugo anti-ciljano antitelo. Podaci su obrađeni pomoću ForteBio softvera za analizu podataka 7.0. sistemu. Dodatno vezivanje drugog antitela nakon udruživanja antigena ukazuje na slobodni epitop (nekompetitor), dok nikakvo vezivanje ukazuje na blokiranje epitopa (kompetitora).
Rezultati
Karakterizacija vezivanja progranulina sa sortilinom
[0417] Interakcije između sortilina i progranulina su prvo okarakterisane pomoću SPR i ELISA analize. SLIKA 2A prikazuje kinetičku analizu vezivanja PGRN za His-uhvaćeni SORT1 koji je izveden korišćenjem Biacore SPR. Ukratko, sortilin je uhvaćen na CM5 čipu senzora koji je imobilizovan sa anti-His antitelom (komplet iz GE). Progranulin je prelazio u HBS vezujući pufer na različitim koncentracijama. Prilagođavanje senzorskih dijagrama za procenu afiniteta izvršeno je korišćenjem BIAevaluation verzija 3.1. Rezultati pokazuju da se humani progranulin vezuje za humani sortilin sa KDod 14.3 nM.
[0418] Vezivanje između sortilina i progranulina takođe je potvrđeno pomoću ELISA. Ukratko, humani ili mišji sortilin (R&D Systems) imobilizovan je preko noći na ELISA pločici (2 µg/ml u PBS). Pločice su isprane u puferu za ispiranje (PBS+ 0.05% TWEEN20) i blokirane tokom jednog sata na 37 °C puferom za vezivanje (PBS+ 1% BSA). Rekombinantni humani ili mišji progranulin (Adipogen) biotinilizovan je kompletom EZ-Link Micro NHS-PEG4 kompanije ThermoScientific/ Pierce. Biotinilizovani progranulin je dodat u različitim koncentracijama u imobilizovani sortilin i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Pločice su isprane tri puta u puferu za ispiranje i inkubirane sa streptavidin-HRP (1: 200 u
2 4
puferu za vezivanje, R&D Systems) tokom 20 minuta. Pločice su isprane još tri puta i inkubirane sa rastvorom TMB supstrata dok se ne razvije boja. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 ul 2N sumporne kiseline i boja je kvantifikovana korišćenjem čitača pločica Biotek Synergy H1. Podaci su analizirani i uklopljeni u Prism.
[0419] SLIKA 2B prikazuje vezivanje biotinilizovanog humanog progranulina za imobilizovani humani sortilin na ELISA pločici (OD = optička gustina), i SLIKA 2C prikazuje vezivanje biotinilizovanog mišjeg progranulina za imobilizovani mišji sortilin na ELISA pločici. Rezultati pokazuju da se humani progranulin vezuje za humani sortilin sa KDod 14 nM, a mišji progranulin se vezuje za mišji sortilin sa KDod 40 nM.
Analize kompeticije antitela sa peptidima progranulina
[0420] SLIKA 3A prikazuje shemu ForteBio analize za određivanje sposobnosti antitela protiv sortilina da vežu sortilin i za kvantifikovanje vezivanja (tj. KD). Na slici se „RU“ odnosi na jedinice odgovora. Ogledni rezultati su prikazani sa antitelom S-14, za koje je izračunato da ima KDod 0.8 nM.
Analize kompeticije antitela sa sortilin proteinom
[0421] SLIKA 3B prikazuje različite sheme ForteBio analize kompeticije. U levoj koloni je prikazana ForteBio analiza kompeticije pomoću biotinilizovanih peptida progranulina vezanih na SA senzorima i rekombinantnih humanih antitela sortilina (monomerna) i antitela IgG protiv sortilina (vidi levu kolonu; SORT = sortilin, PGRN = progranulin, b = biotinilizovano, H = humani, mono = monomerna).
[0422] Srednja kolona na SLICI 3B prikazuje ForteBio analizu kompeticije korišćenjem biotinilizovanog monomernog humanog proteina sortilina vezanog na SA senzorima i humanih nativnih progranulina pune dužine i antitela protiv sortilina.
[0423] Desna kolona na SLICI 3B prikazuje ForteBio analizu kompeticije korišćenjem biotinilizovanog humanog proteina progranulina vezanog na SA senzorima i humanih monomera sortilina i antitela protiv sortilina.
2
Rezultati analiza kompeticije antitela
[0424] SLIKA 4A prikazuje rezultate iz tri različite ForteBio analize prikazane na SLIKAMA 3A i 3B, i prikazuje nekoliko primera antitela protiv sortilina koja blokiraju vezivanje progranulina (PGRN) za sortilin (SORT1).
[0425] Leva kolona sa SLICI 4A prikazuje podešavanje vezivanja opisano u levoj koloni na SLICI 3B, gde je peptid PGRN koji vezuje SORT1 imobilizovan na čipu senzora. SORT1 je vezan, a zatim je testirano da li se testirano antitelo protiv sortilina može vezati. Antitela koja su bila u stanju da vežu sortilin smatrana su nekompetitorima. Rezultati ukazuju da antitela S-20 i S-22 nisu kompetitori, dok je antitelo S-14 kompetitor.
[0426] Srednja kolona sa SLICI 4A prikazuje podešavanje vezivanja opisano u srednjoj koloni na SLICI 3B, gde je biotinilizovani monomer SORT1 imobilizovan na čipu senzora. Protein PGRN pune dužine je vezan, a zatim je testirano da li se testirano antitelo protiv sortilina može vezati. Antitela koja su bila u stanju da vežu sortilin smatrana su nekompetitorima. Rezultati ukazuju na to da antitelo S-20 nije kompetitor, dok su antitela S-14 i S-22 kompetitori.
[0427] Desna kolona sa SLICI 4A prikazuje podešavanje vezivanja opisano u desnoj koloni na SLICI 3B, gde je biotinilizovani protein PGRN imobilizovan na čipu senzora. SORT1 je vezan, a zatim je testirano da li se testirano antitelo protiv sortilina može vezati. Antitela koja su bila u stanju da vežu sortilin smatrana su nekompetitorima. Rezultati ukazuju da antitela S-20 i S-22 nisu kompetitori, dok je antitelo S-14 kompetitor.
[0428] Rezultati na SLICI 4A ukazuju da nisu sva antitela protiv sortilina kompetitori, i da neka, kao što je antitelo S-22, mogu delovati kao nekompetitori u jednom ili dva formata, dok deluju kao kompetitori u drugom formatu (formatima).
[0429] SLIKA 4B prikazuje vezivanje antitela protiv sortilina (S-5, S-8, S-49, S-60, S-63, S-64, S-72 i S-83) za His-uhvaćeni sortilin (SORT1) korišćenjem Biacore SPR na pH 6.4 i pH 7.4.
[0430] Tabela 7 prikazuje rezultate SPR analiza kompeticije sprovedenih sa antitelima S1-S85. Kolona 2 u Tabeli 7 odgovara analizi opisanoj u levoj koloni na SLICI 3B. Kolona 3 u Tabeli 7 odgovara analizi opisanoj u srednjoj koloni na SLICI 3B. Kolona 4 u Tabeli 7 odgovara analizi opisanoj u desnoj koloni na SLICI 3B. U Tabeli 7, „hPGRN“ se odnosi na humani progranulin; "Da" označava da je antitelo blokirano u datom formatu, a "Ne" označava da antitelo nije blokiralo u datom formatu.
2
Tabela 7: ForteBio analize kompeticije antitela
2
2
2
Primer 4: Karakterizacija interakcije između sortilina i progranulina upotrebom analiza zasnovanih na ćelijama
Materijali i postupci
[0431] Rekombinantni humani ili mišji progranulin (Adipogen) biotinilizovan je kompletom EZ-Link Micro NHS-PEG4 kompanije ThermoScientific/Pierce prema uputstvima proizvođača. Stabilna ćelijska linija koja eksprimira neobeleženi humani sortilin cele dužine uspostavljena je virusnom infekcijom ćelija HEK293T i pozitivnom selekcijom sa higromicinom (prilagođeni projekat Genscript). Mišji sortilin pune dužine je kloniran u pCMV-AC-IRES-GFP (Origene), a ćelije HEK293T su privremeno transficirane ovim plazmidom koristeći Fugene HD (Promega). Kao kontrolne ćelije, korišćene su ili parentalne ćelije HEK293T ili ćelije HEK293T koje eksprimiraju humani SORCS1 pune dužine (kloniran u pCMV-AC-IRES-GFP).
[0432] Ćelije koje eksprimiraju sortilin ili kontrolne ćelije sakupljene su i isprane u PBS. Biotinilizovani humani ili mišji progranulin je dodat u PBS+ 2% FBS sa ili bez antitela protiv sortilina (10 µg/ml) ili kontrolnog humanog IgG1 izotipa antitela, i inkubiran na ledu 2 sata. Nakon ispiranja ćelija 3 puta u PBS+ 2% FBS, ćelije su inkubirane u streptavidin-APC (BD Biosciences, 1: 100) na ledu 30 minuta. Zatim su ćelije ponovo isprane, resuspendovane u PBS+ 2% FBS i analizirane na protočnom citometru FACSCanto™ (BD Biosciences, Mississauga, ON). Vezivanje PGRN je mereno kao srednji intenzitet fluorescencije APC populacije ćelija koje eksprimiraju sortilin.
Rezultati
Vezivanje progranulina za sortilin
21
[0433] Analizirana je sposobnost biotinilizovanog humanog progranulina (PGRN) ili biotinilizovanog mišjeg PGRN da se veže za humani ili mišji sortilin (SORT1) eksprimiran na površini HEK293T ćelija. Biotinilizovani progranulin je dodat u rastućim koncentracijama (0 nM-100 nM) u HEK293T ćelije koje eksprimiraju sortilin ili kontrolne ćelije, a vezivanje je analizirano pomoću FACSCanto™.
[0434] SLIKA 5A je dijagram FACS koji prikazuje vezivanje zavisno od doze humanog PGRN za rekombinantni SORT1 eksprimiran na HEK293T ćelijama. Kao što je prikazano na SLICI 5B, PGRN ne pokazuje mnogo vezivanje za kontrolne ćelije.
[0435] SLIKE 5C i 5D prikazuju srednji fluorescentni intenzitet (MFI) iscrtan u odnosu na koncentraciju vezanja humanog PGRN za rekombinantni humani sortilin (SORT) eksprimiran na HEK293T ćelijama (SLIKA 5C) ili vezivanja mišjeg PGRN za mišji sortilin (SORT1) eksprimiran na HEK293T ćelijama (SLIKA 5D), u poređenju sa kontrolnim ćelijama koje ne eksprimiraju rekombinantni sortilin. Rezultati pokazuju da se PGRN vezuje za sortilin na način koji zavisi od doze.
Antitela sortilina sposobna da blokiraju vezivanje progranulina
[0436] Da bi se ispitalo da li antitela protiv sortilina mogu blokirati vezivanje progranulina za sortilin, ćelije koje eksprimiraju sortilin kod ljudi ili miševa su inkubirane sa 15 nM biotinilizovanog humanog ili mišjeg progranulina zajedno sa 67 nM antitela protiv sortilina. Rezultati analize kompeticije progranulina zasnovane na ćelijama prikazani su u Tabeli 8. Antitela protiv sortilina pokazuju opseg sposobnosti da blokiraju progranulin. Antitela S-64, S-63, S-60, S-05, S-49, S-72, S-06, S-76, S-83 i S-65 identifikovana su kao najbolja antitela koja blokiraju progranulin.
[0437] U Tabeli 8, “hPGRN” se odnosi na humani progranulin, “mPGRN” se odnosi na mišji progranulin, “hSort” se odnosi na humani sortilin, i “mSort” se odnosi na mišji sortilin.
Tabela 8: Kompeticija antitela bazirana na ćelijama
21
[0438] Da bi se ispitala sposobnost blokiranja najboljih antitela protiv sortilina koja blokiraju progranulin, ćelije HEK293T koje eksprimiraju sortilin inkubirane su sa 15 nM biotinilizovanog humanog ili mišjeg progranulina zajedno sa povećanjem koncentracija antitela protiv sortilina ili kontrolnih antitela. Izmeren je srednji intenzitet fluorescencije i krive su uklopljene u Prism (nelinearna regresija: log inhibitor naspram odgovora na dozu sa tri parametra) da bi se odredile konstante blokiranja.
[0439] SLIKE 6A-6D pokazuju da antitela protiv sortilina inhibiraju vezivanje humanog progranulina za humani sortilin i mišjeg progranulina za mišji sortilin eksprimiranog na HEK293T ćelijama na način koji zavisi od doze. SLIKE 6A i 6B pokazuju da antitela S-5, S-60, S-63, S-64, S-49, S-8, S-76, S-83, S-6, S-65 i S-72 inhibiraju vezivanje humanog progranulina za humani sortilin. SLIKE. 6C i 6D pokazuju da antitela S-1, S-6, S-26, S-30, S-39, S-44, S-24, S-81 i S-85 inhibiraju vezivanje mišjeg progranulina za mišji sortilin, dok antitelo S-49 nije uspelo da inhibira vezivanje mišjeg progranulina za mišji sortilin, već je umesto toga povećalo vezivanje progranulina za sortilin. Rezultati na SLIKAMA 6A-6D ukazuju na to da su određena antitela protiv sortilina, kao što je antitelo S-6, sposobna da inhibiraju vezivanje humanog i mišjeg progranulina za odgovarajući protein sortilina.
[0440] SLIKA 6E prikazuje da postoji postepen opseg u sposobnosti antitela protiv sortilina da blokiraju vezivanje PGRN za sortilin. Antitela protiv sortilina koja smanjuju vezivanje progranulina za sortilin za 20% ili manje pri koncentraciji zasićenih antitela (67 nM) označena su kao antitela koja ne blokiraju progranulin.
[0441] U Tabeli 9 je kvantifikovana sposobnost antitela protiv sortilina da inhibiraju vezivanje progranulina (PGRN) za sortilin na osnovu podataka prikazanih na SLIKA 6.
Tabela 9 prikazuje polu-maksimalno (IC50) blokiranje i procentualno maksimalno blokiranje vezivanja sortilin:progranulin navedenim antitelima protiv sortilina (na 150 nM IgG). „NT“ se odnosi na antitela koja nisu testirana.
21
Tabela 9: Blokirajuća antitela koja inhibiraju interakciju PGRN/SORT1
Blokiranje progranulina se povećava sa kombinacijama antitela sortilina
[0442] SLIKA 7 prikazuje sinergističke efekte kombinacija antitela protiv sortilina koje blokiraju vezivanje progranulina. Ukratko, HEK293T ćelije koje eksprimiraju rekombinantni humani sortilin inkubirane su sa 15 nM biotinilizovanog progranulina sa 67 nM antitela S-49 ili S-64 ili S-16, zajedno sa 67 nM izotipa kontrolnog antitela ili različitih kombinacija S-49 ili S-64 međusobno ili S-16 (svako antitelo na 67 nM). Vezani progranulin je detektovan pomoću streptavidin-APC (1:100, BD Biosciences) i kvantifikovan kao srednji intenzitet
21
fluorescencije APC. Rezultati na SLICI 7 pokazuju da je blokiranje humanog progranulina povećano kombinacijom antitela S-49 i S-16, kombinacijom antitela S-64 i S-16 i kombinacijom antitela S-49 i S-64, u poređenju sa sposobnošću blokiranja progranulina bilo kog od antitela pojedinačno. Ovi rezultati ukazuju na to da kombinacije antitela protiv sortilina mogu biti efikasnije od pojedinačnih antitela protiv sortilina.
Ćelije koje eksprimiraju sortilin vezuju i endocitoziraju progranulin
[0443] Za rezultate prikazane na SLICI 8, HEK293T ćelije koje eksprimiraju sortilin ili LacZ (kontrola) inkubirane su sa progranulinom (PGRN) do 60 minuta na 37 °C. Vezivanje zavisno od vremena i endocitoza PGRN uočeni su fluorescentnom mikroskopijom. Rekombinantni humani progranulin (Adipogen) je obeležen sa DyLight 650 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Ćelije su prolazno transficirane sa humanim sortilinom ili lacZ (kontrola) i GFP koristeći Fugene i sakupljene nakon 24 sata. GFP je ili eksprimiran drugim vektorom (Topo3.3, Invitrogen) ili se nalazi na istom vektoru, odvojen pomoću IRES (pCMV6-AC-IRES-GFP, Origene). Sortilin cele dužine je korišćen neoznačen (Topo3.3) ili sa myc oznakom na C-terminalnom kraju (pCMV6-AC-IRES-GFP). Ćelije su zatim stavljene na staklene pločice sa mikroskopskom komorom obložene poli-l-lizinom. Posle 4-6 sati, ćelije su isprane u medijumu bez OptiMem seruma, i dodat je 40 nM progranulin-650 sa ili bez 10 uM pro-peptida sortilina kao blokatora. Ćelije su inkubirane na 37 °C do 60’. Nakon toga, ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu, isprane u PBS i snimljene na Nikon fluorescentnom mikroskopu.
[0444] SLIKA 8A prikazuje povećano vezivanje i endocitozu progranulina za ćelije koje eksprimiraju sortilin sa produženim vremenom inkubacije, što je ispitano pomoću fluorescencijom DyLight-650. Samo zanemarljivo vezivanje za progranulin je primećeno kada su ćelije eksprimirale kontrolni LacZ protein, ili kada su ćelije bile koinkubirane sa 10 µM blokirajućeg pro-peptida sortilina.
[0445] SLIKE 8B-8E prikazuju FACS analizu kojom se kvantifikuje endocitoza progranulina i sposobnost blokiranja pro-peptida sortilina da inhibira endocitozu progranulina. Fluorescentno obeleženi humani progranulin (PGRN-DyLight650) je dodat u humani sortilin (Sort) (SLIKA 8B) ili mišji sortilin (Sort) (SLIKA 8C) ili kontrolne HEK293T ćelije, a količina vezanog i endocitoziranog progranulina kvantifikovana je pomoću FACS merenjem
21
srednjeg intenziteta fluorescencije ćelija koje eksprimiraju sortilin. SLIKE 8D i 8E pokazuju kvantifikovanje sposobnosti pro-peptida sortilina da inhibira endocitozu progranulina pomoću humanog Sort (SLIKA 8D) ili mišjeg Sort (SLIKA 8E).
Primer 5: Povećan nivo izlučenog progranulina u ćelijama tretiranim sa antitelima sortilina
Povećani vanćelijski nivoi progranulina
[0446] Ćelije humanog astrocitoma U-251 posejane su u posude sa 96 ububljenja i inkubirane preko noći. Sledećeg jutra blokirajuća antitela protiv sortilina (S-1 do S-10, S-12, S-14 do S-16, S-18 do S-22, S-24 do S-26, S-28 do S-30, S-32, S-34, S-39, S-40, S-42 do S-45, S-48 do S-51, S-55, S-57 do S-61, S-63, S-64, S-65, S-67, S-69, S-71 do S-76, S-78, i S-81 do S-85), kao i pozitivno blokirajuće antitelo (kozji anti-humani sortilin (gtSort) iz R&D Systems, AF3154) i antitela kontrolnog izotipa (kozji (gt) IgG, ADI-88 (humani IgG1) i ADI-89 (humani IgG1), dodati su pri konačnom razblaženju od 50 nM ili 5 nM, i onda su ćelije inkubirane 72 h. Medijum je zatim sakupljen i koncentracija progranulina u uzorcima medijuma je merena korišćenjem R&D Systems humanog progranulina Duoset ELISA kompleta.
[0447] Kao što je prikazano na SLIKAMA 9A-9D, blokiranje vezivanja progranulina za sortilin upotrebom različitih antitela protiv sortilina rezultovalo je do 3 puta povećanjem nivoa progranulina izlučenog u medijum U-251 ćelija. SLIKE 9A i 9C pokazuju rezultate za 50 nM dodatih antitela, a SLIKE 9B i 9D pokazuju rezultate za 5 nM dodatih antitela. Rezultati na SLICI 9A i 9B pokazuju da podskup jedne klase antitela protiv sortilina koji pripadaju pakovanju 3/4 i 4 (uključujući, na primer, S-8, S-49 i S-60) ne samo da blokira vezivanje progranulina za sortilin, već zapravo povećava nivo endogenog progranulina u U-251ćelijama, koje prirodno eksprimiraju i sortilin i progranulin. Štaviše, rezultati na SLIKAMA 9C i 9D dalje pokazuju da druga klasa antitela protiv sortilina koja pripadaju pakovanjima 1/2, 2 i 3 (uključujući, na primer, S-2, S-14, S-15, S-18, S-19, S-20, S-21, S-22, S-29, S-51, S-57, S-61 i S-82) koji ne blokiraju vezivanje progranulina za sortilin, ili samo slabo blokiraju vezivanje progranulina za sortilin, takođe mogu da izazovu povećanje nivoa endogenog progranulina u U-251 ćelijama.
21
Smanjenje nivoa sortilina na površini ćelije
[0448] Nakon što su U-251 ćelije inkubirane sa 50 nM antitela protiv sortilina tokom 72 h kao što je prethodno navedeno, ćelije su sakupljene sa tripsinom, isprane u PBS i obeležene sa antitelom protiv sortilina S-20 (čije vezivanje nije značajno kompetitivno antitelima koji blokiraju progranulin). Nakon što su ćelije inkubirane sa 5 µg/ml S-20 tokom jednog sata na ledu, ćelije su isprane tri puta u PBS+ 2% FBS i zatim inkubirane sa 5 µg/ml anti-humanog PE sekundarnog antitela (Southern Biotech). Ćelije su zatim ponovo isprane i vezivanje S-20 je kvantifikovano korišćenjem FACSCanto™, kao srednji intenzitet fluorescencije PE.
[0449] SLIKA 10A pokazuje da određena antitela protiv sortilina smanjuju nivo sortilina na površini ćelije u humanim U-251 ćelijama, pri čemu antitela koja izazivaju najjači porast izlučenog progranulina (npr. S-2, S-19 i S-22) takođe indukuju najjače smanjenje nivoa sortilina na površini ćelije. Antitela kao što su S-64 i S-5, koja ne smanjuju nivo sortilina na površini ćelije, nisu bila u stanju da povećaju vanćelijske nivoe progranulina, uprkos njihovoj sposobnosti da blokiraju vezivanje progranulina za sortilin jednako dobro ili bolje od sposobnost blokiranja progranulina antitela S-49, S-60. SLIKA 10B pokazuje da neka antitela protiv sortilina smanjuju nivo sortilina na površini ćelije u mišjim Neuro-2A (N2A) ćelijama. Sve u svemu, antitela koja smanjuju nivo sortilina na površini ćelije u humanim U-251 ćelijama takođe smanjuju nivoe sortilina na površini ćelije u mišjim N2A ćelijama. Ovi rezultati ukazuju na to da je smanjenje nivoa sortilina na površini ćelije univerzalna aktivnost ovih antitela, pa stoga antitela mogu takođe biti u stanju da smanje nivoe sortilina na površini ćelije u drugim tipovima ćelija i in vitro i in vivo.
[0450] SLIKE 10C i 10D prikazuju nivoe sortilina na površini ćelije u U-251 ćelijama koje su inkubirane sa različitim koncentracijama antitela protiv sortilina tokom 72 sata. Antitela protiv sortilina indukuju smanjenje ekspresije sortilina na površini ćelije zavisno od doze. Smanjenje nivoa sortilina prikazano je smanjenjem intenziteta fluorescencije (MFI) antitela S-20 koje se vezuje za sortilin. SLIKA 10E prikazuje kvantifikaciju (korišćenjem ELISA analize) odgovarajućih nivoa PGRN u medijumu U-251 ćelija koje su inkubirane sa navedenim antitelima protiv sortilina tokom 72 sata. Antitela protiv sortilina koja smanjuju nivoe sortilina na površini ćelije takođe uzrokuju povećanje nivoa vanćelijskog PGRN zavisnog od doze.
21
[0451] SLIKA 10F pokazuje da su nivoi sortilina na površini ćelije (SORT) snažno i obrnuto povezani sa višestrukim povećanjem vanćelijskih nivoa progranulina (PGRN). Na osnovu ovih rezultata, antitela protiv sortilina koja smanjuju nivo sortilina na površini ćelije takođe povećavaju vanćelijske nivoe progranulina. Štaviše, antitela protiv sortilina koja smanjuju nivo sortilina na površini ćelije i povećavaju vanćelijske nivoe progranulina (npr. S-49, S-60 i S-8) pripadaju pakovanjima antitela 2, 3, 4 ili nekategorisanim pakovanjima (Tabela 5). Prema tome, rezultati ukazuju da će se dodatna antitela protiv sortilina koja pripadaju istim pakovanjima kao antitela S-49, S-60 i S-8 (antitela koja pripadaju istom pakovanju su u kompeticiji međusobno pri vezivanju za sortilin) biti u stanju da smanje nivo sortilina na površini ćelije i povećaju vanćelijski nivo progranulina.
[0452] Tabela 10 prikazuje antitela koja su u stanju da smanje nivoe sortilina na površini ćelije u humanim U-251 ćelijama i/ili mišjim N2A ćelijama, i/ili povećaju vanćelijske nivoe progranulina. Antitela su navedena u formiranom redosledu od najjače do najslabije aktivnosti. „N.T.“ se odnosi na antitela koja nisu testirana.
Tabela 10: Aktivnosti antitela protiv sortilina
22
Povećani nivoi progranulina u mozgu miša
[0453] Četrnaestomesečni Tg2576 miševi infuzirani su (preko implantiranih pumpi Alzet 1002) dve nedelje sa ukupno 240 µg kozjeg (gt) anti-mišjeg sortilina (R&D Systems, AF2934) ili kozjeg (gt) IgG poliklonskog antitela ili samo sa aCSF puferom (n = 3/grupa). Miševi su potom žrtvovani, a mozgovi su secirani u levom naspram desnog hipokampusa, čeoni korteks i potiljačni korteks, za ukupno 6 blokova po životinji. Blokovi su odmah ekstrahovani u N-Per (Thermo Scientific Pierce) ili su odmah zamrznuti i zatim ekstrahovani kasnije. Za izolaciju nagomilanog Abeta42 peptida, nerastvorljiva proteinska frakcija peleta je isprana sa TBSX, resuspendovana u 70% mravljoj kiselini do 150 mg/ml na osnovu težine peleta, i mešana rotacijom na sobnoj temperaturi 2 sata uz povremeni vorteks. Uzorci su centrifugirani (100,000 x g, 1 h na 4 °C), a frakcija rastvorljiva u mravljoj kiselini neutralizovana sa 20 zapremina 1 M Tris baze, alikvotirana i zamrznuta na 80 ° C. Svi ekstrakti su mereni na sadržaj proteina pomoću BCA (Thermo Scientific Pierce) ili A280 spektrofotometrije.
[0454] Nivoi mišjeg progranulina su mereni korišćenjem R&D Systems Duoset ELISA kompleta. Rastvorljivi i nerastvorljivi nivoi Abeta42 mereni su pomoću ELISA kompleta kompanije Life Technologies. Nivoi kozjeg antitela protiv sortilina u mozgu mereni su korišćenjem prilagođene ELISA analize. Ukratko, 2 µg/ml rekombinantnog mišjeg sortilina (R&D Systems) u PBS je vezano za pločicu preko noći na 4 °C na Immulon ELISA pločici. Sledećeg dana, pločica je isprana u PBS 0.05% TWEEN20 i blokirana u PBS 1% BSA tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Dodato je 100 µl razblaženih uzoraka i inkubirano 1 h na sobnoj temperaturi. Pločice su isprane i zatim inkubirane sa 100 µl antitela za otkrivanje antikozjeg HRP (1: 20,000, Jackson Immuno). Pločice su ponovo isprane i inkubirane sa 100 µl TMB supstrata dok se ne razvije boja. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl 2N sumporne kiseline i razvoj boje je kvantifikovan korišćenjem Biotek čitača pločica.
[0455] U poređenju sa kontrolnim grupama (samo gt IgG i aCSF pufer), infuzija mišjeg mozga sa kozjim poliklonskim antitelom protiv sortilina rezultovala je snažnim povećanjem nivoa progranulina kod sve tri životinje, u sva tri ispitivana regiona mozga (SLIKA 11A i 11B). Povećanje nivoa progranulina bilo je najjače na desnoj hemisferi koja je ipsilateralna u odnosu na mesto infuzije (SLIKA 11B). U skladu sa ovim rezultatima, nivoi antitela protiv sortilina bili su najveći u ipsilateralnim regionima mozga (hipokampus> čeoni korteks> potiljačni korteks) (SLIKA 11C). Kada je ucrtana koncentracija antitela u odnosu na nivo progranulina, primećena je snažna pozitivna korelacija sa R kvadratnom vrednošću od 0.92 (SLIKA 11D).
[0456] SLIKA 11E i 11F pokazuju nivoe Abeta42 peptida izmerene u ekstraktima mozga pomoću ELISA iz Life Technologies. SLIKA 11E pokazuje nivoe Abeta42 peptida u nerastvorljivoj, ekstrahovanoj mravljom kiselinom, proteinskoj frakciji i SLIKA 11F pokazuje nivoe Abeta42 peptida u rastvorljivoj frakciji proteina. Rezultati ukazuju na to da je izgleda antitelo protiv sortilina imalo uticaj na nivoe Abeta42 peptida u nerastvorljivoj, ekstrahovanoj mravljom kiselinom, proteinskoj frakciji.
Primer 6: Blokiranje vezivanja pro-NGF za sortilin
[0457] Biacore T200 SPR analiza je korišćena za ispitivanje blokiranja pro-NGF vezivanja za sortilin pomoću antitela protiv sortilina S-28, S-5, S-1, S-6, S-65, S-83, S-72, S -8, S-49, S-60, S-63, S-64 i S-76. SPR podaci su prikupljeni na 25 °C na BiaCore T200 instrumentu i analizirani pomoću BiaCore T200 Evaluation Software, verzija 2.0. HBS-EP+ (100 mM HEPES, 1.5 M NaCl, 30 mM EDTA, 0.5% zapr./zapr. surfaktanta P20, pH 7.4) je korišćen kao aktivni pufer i za pripremanje reagenasa.
[0458] Humani His-obeleženi sortilin (200 nM, R&D Systems) uhvaćen je na CM5 senzornom čipu imobilizovanom sa anti-His mišjim IgG (60 s vreme kontakta, 30 µl/min protok, 0 s vreme disocijacije). Humani pro-NGF (400 nM) ili HBS-EP+ pufer je tekao po površini čipa (60 s vreme kontakta, 30 µl/min protok, 0 s vreme disocijacije). Antitelo protiv sortilina (200 nM) je teklo po površini čipa (60 s vreme kontakta, 30 µl/min protok, 30 s vreme disocijacije). Površina čipa je regenerisana između ciklusa koristeći 10 mM glicin-HCl, pH 1.7 (75 s vreme kontakta, 30 µl/min protok, 60 s vreme stabilizacije). Nastali SPR signal dobijen je kao razlika u odgovoru od merenja izvršenih na blanko protočnoj ćeliji.
[0459] Rezultati prikazani na SLIKAMA 12A-12C pokazuju da vezivanje određenih antitela protiv sortilina za sortilin može biti delimično blokirano pomoću pro-NGF. SLIKA 12A prikazuje eksperimentalno podešavanje. SLIKA 12B prikazuje tragove odgovora za kontrolno
22
antitelo (S-28) koje ne blokira progranulin. Vezivanje S-28 za sortilin nije blokirano prethodnom inkubacijom sa pro-NGF. SLIKA 12C pokazuje da je vezivanje antitela protiv sortilina S-1 i S-65 za sortilin najsnažnije blokirano vezivanjem pro-NGF za sortilin (RU = jedinica odgovora).
Primer 7: Karakterizacija terapeutske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin korišćenjem utvrđenih životinjskih modela traumatske povrede mozga
[0460] Terapijska upotreba antitela koja blokiraju sortilin može se ispitati na utvrđenim životinjskim modelima traumatske povrede mozga (Tanaka, Y et al., (2013) Neuroscience 231 49-60).
[0461] Na primer, može se koristiti model traumatske povrede mozga koji indukuje aktivaciju mikroglije i astrocita. Mogu se koristiti mužjaci miševa C57BL/6J WT od osam ili devet nedelja starosti ili progranulin heterozigotni miševi. Miševi se kupuju u laboratorijama Charles River ili Jackson laboratorijama. Miševi se anesteziraju intraperitonealnom primenom ksilazin hidrohlorida (8 mg/kg) i hloral hidrata (300 mg/kg) rastvorenog u sterilnom rastvoru soli, a zatim se stavljaju u stereotaksični aparat (Narishige, Tokyo, Japan). Na koži lobanje se pravi rez i lobanja se otkriva. Periosteum se čisti iz lobanje, stomatološkom bušilicom se buši rupa preko desne moždane hemisfere, i dura mater se sklanja vrhom igle. Kanila od nerđajućeg čelika, sa spoljnim prečnikom 0.5 mm, koristi se za pravljenje uzdužne ubodne rane na desnoj hemisferi. Kanila je postavljena na 1.3 mm lateralno od srednje linije, i 1 mm posteriorno od bregme, i uvedena u mozak sve dok vrh ne dosegne dubinu od 2 mm. Kanila se tada pomera 2 mm kaudalno (bregma 3 mm), a zatim se pomera unazad 2 mm rostralno u početni položaj. Na kraju, kanila se uklanja iz mozga, a rana na koži lobanje se zašiva. Miševi se zatim tretiraju sa antitelima koja blokiraju sortilin prema standardnim procedurama, a zatim se analiziraju histologijom i imunofluorescentnim bojenjem i testovima ponašanja.
Primer 8: Karakterizacija terapijske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin korišćenjem modela Parkinson-ove neuro-inflamacije i gubitka neurona nakon povreda izazvanih toksinom ili sinukleinom
[0462] Terapeutska upotreba antitela koja blokiraju sortilin može se takođe testirati u modelu neuro-inflamacije i gubitka neurona nakon povrede izazvane toksinom (Martens, LH et al., (2012) The Journal of Clinical Investigation, 122, 3955).
[0463] Tromesečni miševi se tretiraju sa 4 intraperitonealna ubrizgavanja MPTP dnevno tokom 2 dana (4 μg/g telesne težine) (Sigma-Aldrich) ili PBS. MPTP, uništava dopaminergičke neurone koji se degenerišu u Parkinson-ovoj bolesti. Miševi se tretiraju antitelima koja blokiraju sortilin prema standardnim protokolima, a zatim se analiziraju pomoću stereološkog prebrojavanja za kvantifikaciju dopaminskih neurona i mikroglije u SNpc. Kako je opisano. Alternativno, mogu se koristiti Parkinson-ovi modeli koji eksprimiraju genetske mutacije u genu za alfa-sinuklein (A53T, A30P i E46K) ili, prekomerno eksprimiraju alfa-sinukleina (Maguire-Zeiss (2008) Pharmacol Res; 58(5-6): 271-280; Chesselet (2008) Exp Neurol 209: 22–27).
Primer 9: Karakterizacija terapeutske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin korišćenjem životinjskih modela za starenje, napade, povrede kičmene moždine, distrofiju mrežnjače, frontotemporalnu demenciju i Alzheimer-ovu bolest
[0464] Terapeutske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin mogu se takođe testirati u životinjskim modelima za starenje, napade, povrede kičmene moždine, distrofiju mrežnjače, frontotemporalnu demenciju i Alzheimer-ovu bolest, kako je prethodno opisano (npr., Beattie, MS et al., (2002) Neuron 36, 375-386; Volosin, M et al., (2006) J. Neurosci. 26, 7756-7766; Nykjaer, A et al., (2005) Curr. Opin. Neurobiol. 15, 49-57; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci. 28, 9870-9879; Fahnestock, M et al., (2001) Mol. Cell Neurosci. 18, 210-220; Nakamura, K et al., (2007) Cell Death. Differ. 14, 1552-1554; Yune, T et al., (2007) Brain Res. 1183, 32-42; Wei, Y et al., (2007) Neurosci. Lett. 429, 169-174; Provenzano, MJ et al., (2008) Laryngoscope 118, 87-93; Nykjaer, A et al., (2004) Nature 427, 843-848; Harrington, AW et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 6226-6230; Teng, HK et al., (2005) J. Neurosci. 25, 5455-5463; Jansen, P et al., (2007) Nat. Neurosci. 10, 1449-1457; Volosin, M et al., (2008) J. Neurosci.
28, 9870-9879; Fan, YJ et al., (2008) Eur. J. Neurosci. 27, 2380-2390; Al-Shawi, R et al., (2008) Eur. J. Neurosci. 27, 2103-2114; i Yano, H et al., (2009) J. Neurosci. 29, 14790-14802).
22
Primer 10: Karakterizacija terapijske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin koristeći modele ateroskleroze
[0465] Terapijske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin mogu se takođe testirati u modelima ateroskleroze, kako je prethodno opisano (npr., Lance, A et al., (2011) Diabetes, 60, 2285; i Kjolby, M et al., (2012) Cell Metabolism 12, 213-223).
Primer 11: Karakterizacija terapijske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin koristeći model infekcije
[0466] Terapijske upotrebe antitela koja blokiraju sortilin mogu se takođe testirati u modelu infekcije. Na primer, mogu se koristiti Listeria monocytogenes ili druga infekcija kod normalnih miševa ili progranulin heterozigotnih, kao što je prethodno opisano (npr., Yin, F et al., (2009) J. Exp. Med, 207, 117-128).
Primer 12: In Vivo zaštita od EAE i kuprizona kod cele životinje
[0467] Odrasle ženke miševa C57BL/6 stare 7-9 nedelja (dobijene iz Charles River Laboratories) se ubrizgavaju u bazu repa bilateralno sa 200 µl inokuluma koji obuhvata 100 µg peptida glikoproteina oligodendrocita mijelina 35–55 (aminokiseline MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ) ID BR: 707); Seqlab) i 1 mg Mycobacterium tuberculosis H37 Ra (Difco) u nepotpunom Freund-ovom ađuvantu (Difco). Pertussis toksin (200 ng; List Biological Laboratories) se ubrizgava na dan 0 i dan 2 nakon imunizacije. Klinički znaci se boduju na sledeći način: 0, nema kliničkih znakova; 1, potpuno opušten rep; 2, potpuni opušten rep i nenormalan hod; 3, parapareza jednog od zadnjih udova; 4, potpuna parapareza zadnjih udova; i 5, paraliza prednjih i zadnjih udova ili umiranje. Za eksperimente se koriste samo miševi koji imaju početak bolesti (klinički rezultat 1 ili više) na 14. dan. Antagonistička antitela protiv sortilina i/ili bispecifična antitela sortilina se ubrizgavaju intraperitonealno ili intravenozno u miševe obolele od EAE na dan prvih kliničkih simptoma ili u bilo koje drugo željeno vreme (PLoS Med (2007) 4(4): e124).
22
[0468] Mladi ili stari miševi divljeg tipa (WT) hranjeni su standardnom ishranom (Harlan) koja obuhvata 0.2 % kuprizon (CPZ) oksalnog bis u prahu (cikloheksilidenhidrazid) (Sigma-Aldrich) tokom 4, 6 ili 12 nedelja. Za histološke i imunohistohemijske analize, mozak se uklanja nakon perfuzije miša sa 4 % paraformaldehida (PFA), fiksiranog u 4 % PFA tokom 24 sata, nakon čega sledi uranjanje u 30 % saharoze na 24-48 sati. Za procenu integriteta i oštećenja mijelina, kao i proliferacije ćelija i inflamacije delova u mozgu miša obojeni su sa anti-MBP (1:100; Abcam, ab7349), -dMBP (1:2000; Millipore, ab5864), -β APP (1:100; Invitrogen, 51-2700), -SMI-31 (1:1000;Covance, smi-31R), -Iba1 (1:600; Wako, 019-19741),-BrdU (1:250; Abcam, ab1893), -GFAP (1:200; Invitrogen,13-0300), -iNOS (1:100; BD Pharmingen, 610329), -LPL(1:400, from Dr. G. Olivecrona) i -MHC II (1:100; BD Pharmingen, 553549). Za ponašajne efekte antitela, miševi se analiziraju na lokomotornu aktivnost pomoću providnih kućišta od polistirena i kompjuterizovanih instrumenata fotozraka. Analiziraju se opšte varijable aktivnosti (ukupna kretanja, vertikalno uspravljanje), zajedno sa indeksima emocionalnosti, uključujući provedeno vreme, pređenu udaljenost i ulaske. Baterija senzomotornih testova se vrši da bi se procenila ravnoteža (ivica i platforma), snaga (obrnute pregrade), koordinacija (stubovi i nagnute pregrade) i iniciranje pokreta (inicijacija hodanja). Motorička koordinacija i ravnoteža se proučavaju pomoću rotarod protokola (Cantoni et al., Acta Neuropathol (2015)129(3):429-47).
Primer 13: Karakterizacija terapeutske upotrebe antagonističkih antitela sortilina ili bispecifičnih antitela u utvrđenim životinjskim modelima traumatske povrede mozga
[0469] Terapijska upotreba antitela sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina testirana je na utvrđenim životinjskim modelima traumatske povrede mozga (Tanaka, Y et al. (2013) Neuroscience 231 49-60). Na primer, može se koristiti model traumatske povrede mozga koji indukuje aktivaciju mikroglije i astrocita. Mogu se koristiti mužjaci miševa C57BL/6J WT od osam ili devet nedelja starosti ili progranulin heterozigotni miševi (kupljeni u laboratorijama Charles River ili Jackson laboratorijama). Miševi se anesteziraju intraperitonealnom primenom ksilazin hidrohlorida (8 mg/kg) i hloral hidrata (300 mg/kg) rastvorenog u sterilnom rastvoru soli, a zatim se stavljaju u stereotaksični aparat (Narishige, Tokyo, Japan). Na koži lobanje se pravi rez i lobanja se otkriva. Periosteum se čisti iz lobanje, stomatološkom bušilicom se buši rupa preko desne moždane hemisfere, i dura mater se sklanja vrhom igle.
22
Kanila od nerđajućeg čelika, sa spoljnim prečnikom 0.5 mm, koristi se za pravljenje uzdužne ubodne rane na desnoj hemisferi. Kanila je postavljena na 1.3 mm lateralno od srednje linije, i 1 mm posteriorno od bregme, i uvedena u mozak sve dok vrh ne dosegne dubinu od 2 mm. Kanila se tada pomera 2 mm kaudalno (bregma 3 mm), a zatim se pomera unazad 2 mm rostralno u početni položaj. Na kraju, kanila se uklanja iz mozga, a rana na koži lobanje se zašiva. Miševi se zatim tretiraju sa antagonističkim antitelima protiv sortilina i/ili bispecifičnim antitelima sortilina prema standardnim procedurama, a zatim se analiziraju histologijom i imunofluorescentnim bojenjem i testovima ponašanja.
Primer 14: Karakterizacija terapeutske upotrebe antitela sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina u modelu neuro-inflamacije i gubitka neurona nakon povrede izazvane toksinom
[0470] Terapijska upotreba antitela sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina je ispitana na modelu neuro-inflamacije i gubitka neurona nakon povrede izazvane toksinom (Martens, LH et al., (2012) The Journal of Clinical Investigation, 122, 3955). Miševi stari tri meseca lečeni su sa 4 intraperitonealne injekcije MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) dnevno tokom 2 dana (4 μg/g telesne težine) (Sigma-Aldrich ) ili PBS. Miševi se leče antagonističkim antitelima protiv sortilina i/ili bispecifičnim antitelima sortilina prema standardnim protokolima, a zatim analiziraju pomoću Stereološkog prebrojavanja za kvantifikaciju dopaminskih neurona i mikroglije u substantia nigra pars compacta (SNpc), kako je opisano.
Primer 15: Analiza sposobnosti antitela protiv sortilina da stimuliše vitalnost urođenih imunoloških ćelija i/ili neurona
[0471] Makrofagi izvedeni iz koštane srži divljeg tipa (WT) miševa kultivišu se u prisustvu M-CSF, ili su kulture nervnih ćelija u standardnim uslovima izložene antitelu sortilin i izmerena je vijabilnost ćelija. Makrofagi izolovani iz koštane srži WT i KO miševa stavljaju se na pločice sa 96 udubljenja koje nisu tretirane kulturom tkiva, prethodno obložene ili antitelima protiv sortilina ili kontrolnim antitelima. Ćelije su kultivisane 48 sati u prisustvu 10 ng/ml M-CSF. Analiza vijabilnost se vrši pomoću Cell Titer Glo kompleta (Promega). Pločice se čitaju sa BioTek SynergyMicroplate Reader upotrebom softvera GEN52.04.
22
Primer 16: Analiza efekata antitela sortilina protiv moždanog udara
[0472] Prolazna okluzija srednje cerebralne arterije (MCAO), model koji veoma podseća na moždani udar kod ljudi, koristi se za izazivanje cerebralnog infarkta kod miševa. Monofilament (70SPRe, Doccol Corp, USA) uvodi se u unutrašnju karotidnu arteriju kroz rez desne zajedničke karotidne arterije. Srednja cerebralna arterija je začepljena na 30 minuta sa rasponom vremena reperfuzije (6 h, 12 h, 24 h, 2 d, 7 d i 28 d). Učinak operacije se kontroliše pomoću lažnih životinja na 12 sati i na 7 dana. Lažne životinje podležu istoj hirurškoj proceduri bez okluzije srednje cerebralne arterije. MCAO životinje su lečene antagonističkim antitelima protiv sortilina ili kontrolnim antitelima i testirane na infarktnu volumetriju, akutni inflamatorni odgovor (12 h reperfuzija), transkripciju pro-inflamatornih citokina TNFa, IL-1a i IL-1b, mikroglijalnu aktivnost (CD68, Iba1), transkripciju hemokina CCL2 (MCP1), CCL3 (MIP1a) i receptora hemokina CX3CR1 i invaziju na CD3-pozitivne T-ćelije (Sieber et al. (2013) PLoS ONE 8(1): e52982).
Primer 17: Analiza efekta antitela protiv sortilina protiv Alzheimer-ove bolesti
[0473] Da bi se procenila sposobnost antitela protiv sortilina da odlože, spreče ili obrnu razvoj Alzheimer-ove bolesti (AD), koriste se 5X FAD miševi. 5X FAD miševi prekomerno eksprimiraju mutirani humani APP (695) sa Švedskim (K670N, M671L), Floridskim (I716V) i Londonskim (V717I) familijarnim mutacijama Alzheimer-ove bolesti (FAD), zajedno sa humanim PS1 koji sadrži dve FAD mutacije, M146L i L286V. Oba transgena su regulisana mišjim Thy1 promotorom da bi se prešlo preko ekspresije u mozgu i rekapitulirali glavne karakteristike AD. Miševi tretirani antagonističkim antitelima protiv sortilina ili sa kontrolnim antitelima se testiraju na opterećenje A beta plakom sa imunohistohemijom i ELISA ekstraktom tkiva. Oni se dalje testiraju na broj mikroglija u mozgu i na smanjenje kognitivnog deficita pomoću Morris Water labirinta, prostornog učenja i pamćenja, Radial Arm Water Maze, prostornog učenja i pamćenja, Y Maze (kvantifikuje spontanu alternaciju kao meru prostorne kognicije), sklonosti ka novinama na otvorenom polju, operativnog učenja za procenu učenja i pamćenja i uslovljavanjem straha (mousebiology.org website; Wang et al.,(2015) Cell. pii: S0092-8674(15)00127-0).
22
Primer 18: Analiza zaštitnog dejstva antitela sortilina u zarastanju rana
[0474] Da bi se procenila sposobnost antitela protiv sortilina da povećaju popravku rane debelog creva nakon povrede, koristi se mišji model povrede biopsijom u debelom crevu. U ovom modelu, endoskop sa spoljnim operativnim omotačem se ubacuje u srednje silazno crevo i sluznica se pregleda do ano-rektalnog spoja. Zatim se pojedinačna površina pune debljine čitave sluznice i submukoze uklanja fleksibilnim kleštima za biopsiju prečnika 3 stope, izbegavajući prodiranje muscularis propria. Svaki miš je biopsijom povređen na 3–5 mesta duž dorzalne strane debelog creva (videti, na primer, Seno H, 2008, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan 6; 106(1): 256-261). Kohorte miševa se tretiraju antitelima sortilina 2 ili 3 dana nakon povrede biopsijom. Miševi se svakodnevno prate 15 dana, da bi se proverilo smanjenje telesne težine i zarastanje rana merenjem lezija na površini.
Primer 19: Analiza zaštitnog efekta antitela sortilina u degeneraciji mrežnjače
[0475] Antagonistička antitela protiv sortilina smanjuju nakupljanje i/ili funkciju inflamatornih makrofaga, i kao rezultat toga odlažu, sprečavaju i/ili leče makularnu degeneraciju vezanu sa starenjem (AMD). AMD je degenerativna bolest spoljašnje mrežnjače. Smatra se da inflamacija, posebno inflamatorni citokini i makrofagi, doprinose progresiji bolesti AMD. Dokumentovano je prisustvo makrofaga u blizini lezija AMD, u drusenu, Bruch-ovoj membrani, sudovnjači i mrežnjači. Makrofagi oslobađaju faktor tkiva (TF) i faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF), što pokreće širenje novih krvnih sudova kod pacijenata koji pokazuju horoidalnu neovaskularizaciju.
[0476] Vrsta makrofaga prisutna u makularnoj sudovljači se menja sa godinama, pokazujući povišene nivoe M2 makrofaga u starijim očima u poređenju sa mlađim očima. Međutim, napredne AMD makule imale su veće odnose M1 do M2 u poređenju sa normalnim obdukcionim očima slične starosti. (videti, na primer, Cao X et al, (2011), Pathol Int 61(9): pp528-35). Ovo sugeriše vezu između klasične aktivacije makrofaga M1 u oku u kasnom pojavljivanju progresije AMD.
[0477] Ćelije mikroglije mrežnjače su makrofagi tkiva koji su takođe normalno prisutni u unutrašnjoj mrežnjači. U slučaju oštećenja, mikroglija se može aktivirati i delovati kao posrednik inflamacije. Aktivirana mikroglija je otkrivena u uzorcima tkiva AMD i predložena
2
je kao jedan od potencijalnih doprinosa inflamatorne obrade koja dovodi do AMD patogeneze (Gupta et al., (2003) Exp Eye Res., 76(4):463-71.). Sposobnost antagonističkih antitela sortilina da spreče, odlože ili obrnu AMD testirana je u jednom ili više AMD modela (videti, na primer, Pennesi et al., (2012) Mol Aspects Med.; 33(4): 487–509).
[0478] Ukupni inflamatorni makrofagi (ili M1 i/ili aktivirana mikroglija) su dokumentovani da koreliraju sa progresijom bolesti AMD i stoga predstavljaju terapijski cilj za antagonistička antitela sortilina. Slična terapeutska korist može se postići kod glaukoma i genetičkih oblika ili degeneracije mrežnjače, kao što je retinitis pigmentosa.
[0479] Sposobnost antitela protiv sortilina da spreče, odlože ili obrnu degeneraciju ganglionskih ćelija retine u glaukomu testirana je u modelu glaukoma (videti, na primer, El-Danaf et al., (2015) .J Neurosci. 11;35(6):2329-43; Demetriades et al., (2013) Invest Ophthalmol Vis Sci 54: Abstract 4940). Slično, terapeutska korist antitela protiv sortilina u genetički indukovanoj degeneraciji mrežnjače i retinitis pigmentosa je testirana kako je opisano u Chang et al., (2002) Vision Res.; 42(4):517-25, i u Gargin et al, (2007) J Comp Neurol. 500(2): 222–238; i u „ Retinal Degeneration Rat Model Resource Availability of P23H and S334 the Mutant Rhodopsin Transgenic Rats and RCS Inbred and RCS Congenic Strains of Rats“ MM LaVail, 30. juna 2011. Slično, terapijska korist antitela protiv sortilina u modelima neovaskularizacije sudovnjače i mrežnjače izazvane virusima i toksinima mogu se testirati kako je opisano u Hans et al., (2010) Prog Retin Eye Res.; 29(6): 500–519.. Krajnji ciljevi takvih studija uključuju elektroretinografiju i snimanje fundusa, optičku koherentnu tomografiju, kao i histopatologiju.
Primer 20: Karakterizacija terapeutske upotrebe antitela sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina u modelu infekcije
[0480] Terapijska upotreba agonističkih antitela protiv sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina je ispitana u modelu infekcije. Na primer, Listeria monocytogenes ili druga infekcija kod normalnih miševa ili progranulin heterozigotnih miševa se mogu koristiti, kao što je prethodno opisano (npr., Yin, F et al., (2009) J. Exp. Med, 207, 117-128).
Primer 21: Karakterizacija terapeutske upotrebe antitela sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina u modelu inflamatornih bolesti i patologiji kostiju
2 1
[0481] Terapijska upotreba antitela protiv sortilina i/ili bispecifičnih antitela sortilina je ispitana na modelu inflamatornih bolesti. Na primer reumatoidni artritis ili u ustaljenom modelu druge inflamatorne bolesti (Mizoguchi (2012) Prog Mol Biol Transl Sci.,105:263-320; i Asquith et al., (2009) Eur J Immunol. 39:2040-4). Alternativno, antitela protiv sortilina i/ili bispecifična antitela sortilina se testiraju u modelu degeneracije intervertebralnog diska (IVD) (Zhao, PY et al., (2015). SCIENTIFIC REPORTS.5: 9102).
Primer 22: Skrining na antitela protiv sortilina i/ili na bispecifična antitela sortilina koja podstiču opstanak osteoklasta, mikroglije i/ili neurona
[0482] Ćelije prekursora koštane srži miševa dobijaju se ispiranjem ćelija srži tibije i femoralne srži sa hladnim PBS. Nakon jednog ispiranja sa PBS, eritrociti se liziraju pomoću ACK pufera za liziranje (Lonza), isperu dva puta sa PBS i suspenduju na 0.5×10<6>ćelija/ml u kompletnim RPMI medijumima (10% FCS, Pen/Strep, Gln, neAA) sa naznačenim količinama 50 ng/ml M-CSF za stvaranje makrofaga ili 10 ng/ml GM-CSF. Za makrofage tipa M2, 10 ng/ml IL-4 se dodaje u kultivisane ćelije. Za makrofage tipa M1, dodaje se 50 ng/ml IFN- γ. U nekim eksperimentima LPS ili zimozan se dodaje ćelijskoj kulturi 5-og dana, u koncentraciji od 1 µg/ml-0.01 ng/ml. Rekombinantni citokini su kupljeni od Peprotech. Da bi se analizirala vijabilnost makrofaga izvedenih iz BM, ćelije navedenog genotipa se pripremaju kao što je prethodno navedeno i kultivišu se u postepenim koncentracijama MCSF. Ćelije su ili stavljene na 10<5>/200 µl u pločicu sa 96 udubljenja (za analizu vijabilnosti korišćenjem analize zasnovane na luciferazi) ili na 0.5×10<6>/1 ml u pločicu sa 6 udubljenja (Tripan Blue isključenje broja ćelija) u pločicama tretiranim kulturom bez tkiva. Medijum koji obuhvata sveži M-CSF dodaje se 3-eg dana. U naznačeno vreme ćelije se nežno odvajaju od pločica sa 3 mM EDTA i broje pomoću Burker komore. U nekim eksperimentima ćelije su takođe obojene za FACS analizu pomoću CD11b antitela i DAPI. Alternativno, ćelije se direktno inkubiraju sa ToxGlo reagensom (Promega) i određuje se aktivnost luciferaze. U nekim eksperimentima MCSF se povlači ili ne iz medijuma za kulturu 5-og dana, a vijabilnost ćelija se analizira 36 sati kasnije pomoću FACS.
[0483] Ćelijske kulture zrelih osteoklasta se diferenciraju u posudama sa 24 udubljenja sa RANKL i M-CSF. Posle 4 dana, kompletan medijum je zamenjen medijumom bez seruma da
2 2
bi se izazvala apoptoza. Ćelije se tretiraju sa RANKL, PBS i antitelima protiv sortilina i/ili bispecifičnim antitelom sortilina, ili kontrolnim antitelom usklađenim sa izotipom, tokom serumskog gladovanja preko noći. Ćelije su fiksirane u 1% paraformaldehidu i obojene sa kompletom na bazi TUNEL (Millipore Corporation) prema uputstvima proizvođača. Apoptotička jezgra se broje pomoću Nikonovog mikroskopa TE2000-E sa uvećanjem 20×. Rezultati su izraženi kao procenat apoptotičnih ćelija u odnosu na ukupan broj ćelija u šest nasumično odabranih polja dva udubljenja, kao što je opisano (npr. Peng et al., (2010) Sci Signal., 3(122): ra38) . Slične analize se izvode sa primarnim mikroglijalnim ćelijama.
Primer 23: Proizvodnja, identifikacija i karakterizacija afinitetno sazrelih antitela protiv sortilina
Materijali i postupci
Razdvajanje antitela sortilina
[0484] Antitela protiv sortilina S-2, S-15, S-22, S-60 i S-82 (nazvana "parentalna" antitela) su afinitetno zrela. Ukratko, u kvascu su stvorene raznolike biblioteke antitela za svako od početnih parentalnih antitela. Raznolikost je nastala korišćenjem standardnih tehnika molekularnog kloniranja za kombinovanje parentalnog teškog lanca CDR-H3 i lakog lanca (LC) sa već postojećom genetičkom raznolikošću u CDR-H1 i CDR-H2 regionima teškog lanca (HC) (nazvana „H1/H2“ optimizacija). Ovo je rezultovalo sa šest biblioteka veličine otprilike 10<8>koje su bile spremne za odabir da bi se obogatila antitela sa poboljšanim afinitetom. Pritisci selekcije koji su korišćeni za skrining biblioteka uključivali su ravnotežnu titraciju humanog i mišljeg antigena sortilina, kinetiku nadmetanja Fab parentalnog antitela i upotrebu poništavanja odabira polispecifičnog reagensa (kao što je opisano, na primer, u WO 2014/179363; Xu et al., Protein Eng Des Sel, Vol. 26(10), pp. 663-670). FACS protočna citometrija je zatim korišćena za vizualizaciju i odabir antitela, korišćenjem standardnih tehnika (videti, na primer, Chao et al. Nature Protocols, 2006). Željena populacija je zatim preneta u dodatne krugove odabira. Posle 6 krugova obogaćivanja, kvasac je izbačen da bi se dobili pojedinačni izolati antitela, koji su zatim proizvedeni i okarakterisani kao što je opisano
2
u Primeru 1. Tako je dobijeno pedeset antitela poboljšanih afinitetom iz svakog od šest početnih parentalnih antitela.
[0485] Tri klona parentalnog antitela su odabrana za drugi krug afinitetnog sazrevanja: 1) S-60, pošto prvi krug afinitetnog sazrevanja nije dao klonove sa značajno poboljšanim afinitetom; 2) klon afinitetno sazrelog antitela S-15-6; i 3) klon afinitetno sazrelog antitela S-15-10. Klonirani afinitetno zreli su odabrani za drugi krug afinitetnog sazrevanja, pošto se razlike u afinitetu i funkciji ovih klonova nisu mnogo poboljšale u prvom krugu sazrevanja. Za drugi krug afinitetnog sazrevanja, sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VK) su optimizovane, sa posebnim fokusom na CDR-H3.
Proizvodnja i prečišćavanje antitela IgG i Fab
[0486] Klonovi kvasca su uzgajani do zasićenja i zatim indukovani 48 h na 30 °C uz mućkanje. Nakon indukcije, ćelije kvasca su peletirane i supernatanti su sakupljeni zbog prečišćavanja. Imunoglobulini su prečišćeni upotrebom proteina A kolone i eluirani sirćetnom kiselinom, pH 2.0. Fab fragmenti su generisani digestijom papaina i prečišćeni preko CaptureSelect IgG-CH1 matriksa afiniteta (LifeTechnologies).
Određivanje afiniteta
[0487] Afinitet antitela protiv sortilina određen je merenjem njihovog KDpomoću ForteBio i MSD. ForteBio merenja afiniteta su vršena, na sobnoj temperaturi, generalno kao što je prethodno opisano (Estep et al., MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):270-8). Ukratko, ForteBio merenja afiniteta izvedena su učitavanjem imunoglobulina (IgGs) na uključene AHQ senzore. Isključeni senzori su uravnoteženi u puferu za analiziranje 30 minuta, a zatim su posmatrani uključeni tokom 60 sekundi zbog utvrđivanja osnovne linije. Za avidno merenje vezivanja, senzori sa napunjenim IgGs su bili izloženi 100 nM antigenu (fuzija humanog ili mišjeg sortilin Fc) tokom 3 minuta, zatim prebačeni u pufer za analiziranje 3 minuta zbog merenja brzine isključivanja. Dodatno avidno vezivanje je utvrđeno učitavanjem biotinilizovanog monomera sortilina na SA senzore i izlaganjem ~ 100 nM IgG u rastvoru. Merenja monovalentnog vezivanja su dobijena učitavanjem humanih ili mišjih fuzionih sortilin Fc antigena na AHQ senzoru, a zatim izlaganjem ~ 100 nM Fab antitela sortilina. Dodatna
2 4
monovalentna merenja su izvršena ubacivanjem biotinilovanog humanog ili mišjeg monomera sortilina u SA senzor, nakon čega je izložen ~ 100 nM Fab u rastvoru. Kinetički podaci su usklađeni korišćenjem modela vezivanja 1: 1 u softveru za analizu podataka koji je obezbedio ForteBio.
[0488] Za MSD-SET KDmerenja, ravnotežne titracije rastvora (SET) su izvedene u PBS 0.1% BSA bez IgG (PBSF) sa rekombinantnim humanim ili mišjim sortilinom, održavane konstantne na 100 pM i inkubirane sa 3 do 5 puta serijskim razblaživanje antitela počevši od oko 50 nM. Antitela (20 nM u PBS) su obložena na standardno vezane MSD-ECL pločice preko noći na 4 °C ili na sobnoj temperaturi 30 min. Pločice su zatim blokirane sa 1% BSA tokom 30 minuta uz mućkanje na 700 rpm, nakon čega su usledila tri ispiranja puferom za ispiranje (PBSF 0.05% Tween 20). Primenjeni su SET uzorci i inkubirani na pločicama tokom 150 sekundi uz mućkanje na 700 rpm, nakon čega je usledilo jedno ispiranje. Antigen uhvaćen na pločici detektovan je sa 250 ng/ml streptavidina obeleženog sa sulfo oznakom u PBSF inkubacijom na pločici 3 min. Pločice su isprane tri puta puferom za ispiranje, a zatim su očitane na instrumentu MSD Sector Imager 2400 korišćenjem 1x pufera T za čitanje sa surfaktantom. Procenat slobodnog antigena iscrtan je kao funkcija titrovanog antitela u Prism i odgovara kvadratnoj jednačini za ekstrakciju KD. Za poboljšanje protoka, roboti za rukovanje tečnošću su korišćeni tokom MSD-SET eksperimenata, uključujući pripremu SET uzorka.
[0489] Merenje afiniteta vezivanja za ćelije je izvedeno na 4º koristeći HEK293T ćelije ili prolazno transficirane sa mišjim sortilinom ili stabilno eksprimirajućim humanim sortilinom. Ukratko, ćelije su sakupljene, isprane u PBS i inkubirane sa količinom antitela blizu KDantitela (KDparentalnog za vezivanje za humani sortilin: S2 = 1.1nM, S15 = 3.3nM, S22 = 2.4nM, S60 = 1.0 nM, S82 = 1.4 nM; Kd za vezivanje za mišji sortilin: S2 = 6.6 nM, S15 = 6.4 nM, S22 = 5.0 nM). Antitela su razblažena u FACS puferu (PBS 2% FBS 0.01% NaAzid). Nakon 1 h inkubacije na ledu, ćelije su isprane tri puta u FACS puferu i inkubirane sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa anti-humanim PE (BD Biosciences, razblaženje 1: 100) 30 minuta na ledu. Zatim su ćelije isprane dva puta u 200 ul FACS pufera, a zatim analizirane na FACS Canto ili iQE FACS instrumentu za skrining (Intellicyt Corp). Za dalju analizu su odabrana prva tri antitela sa povećanim vezivanjem za humani i mišji sortilin (mereno kao srednji intenzitet fluorescencije PE).
[0490] Za određivanje prividnog afiniteta prema sortilinu eksprimiranom u ćeliji, antitela su dodata ćelijama u titraciji od 0.16-40 nM za humani sortilin i 0.39-50 nM za mišji sortilin, a
2
njihove KDvezivanja su određene nelinearnim prilagođavanjem krive (modifikovani OneSiteTotal , Graph Pad Prism).
[0491] Smanjena regulacija sortilina u U-251 i N2A ćelijama, blokiranje progranulina (PGRN) u ćelijama i izlučivanje PGRN u U-251 ćelijama izvedeno je kao što je opisano u Primeru 5.
Rezultati
Odabir antitela protiv sortilina
[0492] Klonovi afinitetno zrelih antitela protiv sortilina koji su pokazali bolji afinitet u poređenju sa odgovarajućim parentalnim antitelom dodatno su okarakterisani. Nakon početnog skrininga svih klonova afinitetno sazrelih antitela, klonovi za svako parentalno antitelo su odabrani za dalju analizu.
Sekvence varijabilnog domena teškog lanca i lakog lanca antitela
[0493] Korišćenjem standardnih tehnika, određene su sekvence aminokiselina koje kodiraju varijabilne domene teškog lanca i varijabilne domene lakog lanca odabranih klonova afinitetno zrelih antitela. EU ili Kabat CDR sekvence varijanti S-2 antitela prikazane su u Tabeli 11, varijanti antitela S-15 prikazane su u Tabeli 12, varijanti antitela S-22 prikazane su u Tabeli 13, varijanti antitela S-60 su prikazane u Tabeli 14, a varijanti antitela S-82 prikazane su u Tabeli 15.
2
•
2 •
2
� •
24 •
•
24
��
��
��
��
�� Karakterizacija vezivanja za afinitetno zrelo antitelo protiv sortilina
[0494] Afiniteti vezivanja ćelija za odabrana afinitetno zrela antitela protiv sortilina prikazani su u Tabelama 16A i 16B. U tabeli „N.B.“ označava da nema vezivanja, „P.F.“ ukazuje na loše uklapanje, „N.D.“ označeno da nije determinisano, „Bt-“ označava biotinilizovan, „hSort“ označava humani sortilin, „msSort“ označava mišji sortilin, a „(M)“ označava monovalentni.
Tabela 16A: Afiniteti klonova vrhunskih afinitetno sazrelih antitela
2
Tabela 16B: Afiniteti klonova vrhunskih afinitetno sazrelih antitela
[0495] Zatim su afinitetno zrela antitela upoređena međusobno i sa njihovim odgovarajućim parentalnim antitelom u njihovoj sposobnosti da smanje nativne nivoe sortilina na površini ćelije u humanim U-251 ćelijama i mišjim N2A ćelijama. Antitela su dodavana u ćelije 72
2 1
sata u različitim koncentracijama i nivoi sortilina su mereni pomoću FACS koristeći DyLight konjugovano antitelo drugačijeg pakovanja od test antitela (bilo S-29-DyLight650 ili S-30-DyLight650). Afinitetno sazrela antitela su u celini pokazala povećanu sposobnost da smanje nativne nivoe sortilina na površini ćelije i u humanim ćelijama i u mišjim ćelijama (SLIKE 13A-13G), posebno pri najnižoj koncentraciji antitela (IgG) od 1.25 nM.
[0496] Parentalno antitelo S-15 i afinitetno zrela antitela nastala od njih testirana su na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje 15 nM PGRN za sortilin eksprimiran na HEK293T ćelijama. Kao što je prikazano na SLICI 14, klonovi afinitetno zrelih antitela S-15 (npr. S-15-1 do S-15-7 i S-15-12 do S-15-14) indukovali su mala povećanja sposobnosti blokiranja vezivanja 15 nM PGRN za sortilin, u poređenju sa parentalnim S-15 antitelom.
[0497] Ukratko, identifikovali smo do tri afinitetno sazrela klona sa poboljšanim vezivanjem i za humani i za mišji sortilin i sa poboljšanom funkcionalnošću ili snižavanjem nivoa proteina sortilina i/ili blokiranjem vezivanja PGRN.
[0498] Rezultati su ukazali na identifikaciju afinitetno sazrelih antitela protiv sortilina koja su poboljšala vezivanje za humani sortilin i mišji sortilin i koja su poboljšala funkcionalnost u smanjenju nativnog nivoa sortilina na površini ćelije i/ili blokiranju vezivanja PGRN za sortilin, u poređenju sa odgovarajućim parentalnim antitelom.
Primer 24: Mapiranje epitopa antitela protiv sortilina
Materijali i postupci
Vezivanje za linearne epitope
[0499] Epitopi antitela su mapirani kao što je opisano u nastavku. Za karakterizaciju antigena, merenja su izvedena korišćenjem Ultraflex III MALDI ToF (Bruker) opremljenog interaktivnim modulom HM4. Ovaj modul obuhvata poseban sistem detekcije dizajniran za optimizaciju detekcije do 2MDa sa nano-molarnom osetljivošću.
[0500] Uzorci antigena i antitela su pomešani do finalne koncentracije od 1 µM do 0.5 µM, respektivno. 1 µl dobijene smeše pomešano je sa 1 µl matriksa sastavljenog od rekristalizovanog matriksa sinapinske kiseline (10 mg/ml) u acetonitrilu/vodi (1:1, zapr./zapr.), TFA 0.1% (K200 MALDI kompleta ). Nakon mešanja, 1 µl svakog uzorka je
2 2
uočeno na MALDI pločici (SCOUT 384). Nakon kristalizacije na sobnoj temperaturi, pločica je stavljena u MALDI maseni spektrometar i odmah je analizirana, a analiza je ponovljena tri puta.
[0501] Smeša pripremljena za kontrolni eksperiment je unakrsno povezana korišćenjem K200 MALDI MS kompleta za analizu. Devet mikrolitara smeše se pomeša sa 1 µl reagensa za stabilizaciju K200 (2 mg/ml) i inkubira na sobnoj temperaturi. Nakon vremena inkubacije (180 minuta) uzorci su pripremljeni za MALDI analizu kao i za kontrolne eksperimente. Uzorci se analiziraju pomoću High-Mass MALDI odmah nakon kristalizacije.
[0502] Da bi se testiralo da li je epitop za vezivanje linearne prirode, izvršena je proteoliza rekombinantnog humanog antigena sortilina sa imobilizovanim pepsinom. Pedeset mikrolitara antigena u koncentraciji od 4 µM pomešano je sa imobilizovanim pepsinom na 2.5 µM i inkubirano na sobnoj temperaturi 30 minuta. Nakon vremena inkubacije, uzorak je centrifugiran, a supernatant je pipetiran. Završetak proteolize se kontroliše High-Mass MALDI masenom spektrometrijom u linearnom režimu i refleksionom režimu. Proteoliza pepsina je optimizovana da bi se dobila velika količina peptida u opsegu 1000-3500 Da. Pet mikrolitara antigenskih peptida nastalih proteolizom pomešano je sa 5 µl antitela S-2-11, S-15-6, S-60, S-22-9 ili S-82-8 na 2 µM i inkubirano na 37 ° C 2 sata. Posle toga, smeša je pomešana sa 5 µl intaktnog antigena na 2 µM. Interakcija između antitela i antigena je izvedena kao što je prethodno opisano.
Maseni otisak peptidna antigena sortilina i karakterizacija interfejsa za vezivanje
[0503] Za otisak peptida, 10 μl sortilina (5 μM) je pomešano sa 10 μl antitela (2.5 μM). Dodato je 2 μl DSS d0/d12 (2 mg/mL; DMF), nakon čega je usledila 3 h inkubacija na sobnoj temperaturi. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 2 μl amonijum bikarbonata na 400 mM (finalno = 20 mM), nakon čega je usledila 1 h inkubacija na sobnoj temperaturi. Rastvor je osušen pomoću speedvac pre suspenzije sa 20 μl H2O 8 M uree. Posle mešanja u rastvor je dodato 2 μl DTT (500 mM). Smeša je zatim inkubirana 1 sat na 37ºC. Posle inkubacije, 2 μl jodioacetamida (1M) je dodato pre 1 časovne inkubacije na sobnoj temperaturi u tamnoj prostoriji. Nakon inkubacije, dodato je 80 μl proteolitičkog pufera. Zatim je 100 μl redukovanog/alkilovanog antigena pomešano sa digestivnim enzimima iz Roche Diagnostics (1.66 μl tripsina ili 0.83 μl himotripsina ili 0.83 μl ASP-N ili 1.66 μl elastaze ili 3.32 μl
2
termolizina) i inkubirano preko noći na 37 °C (tripsin, ASP- N, elastaza), 25ºC (himotripsin) ili 70ºC (termolizin). Nakon digestije, u rastvor je dodato 1% finalne mravlje kiseline. Uzorci su zatim podvrgnuti SPE ispiranju na Atlantis dC183μM 2.1*30mm koloni.
[0504] Nakon proteolize, 10 μl nastalih peptida stavljeno je u sistem za nano-tečnu hromatografiju (Ultimate 3000, Dionex) i izvedena je LTQ orbitrap masena spektrometrija.
[0505] Da bi se odredio epitop antitela S-2-11, S-15-6, S-22-9, S-60 i S-82-8 na antigenu sortilina sa visokom rezolucijom, inkubirani su kompleksi antitelo/antigen sa deuterisanim unakrsnim povezivačima i podvrgnuti multienzimskom cepanju. Nakon obogaćivanja unakrsno povezanih peptida, uzorci su analizirani masenom spektrometrijom visoke rezolucije (nLC-Orbitrap MS), a dobijeni podaci su analizirani pomoću XQuest i Stavrox softvera. Korišćen je nLC u kombinaciji sa Orbitrap masenom spektrometrijom. Pet mikrolitara uzorka antigena (koncentracija 4 μM) pomešano je sa 5 μl uzorka antitela (koncentracija 2 μM) da bi se dobila mešavina antitelo/antigen sa finalnom koncentracijom 2 μM/1 μM. Smeša je inkubirana na 37 °C tokom 180 minuta. U prvom koraku, 1 mg d0 unakrsnog povezivača je pomešano sa 1 mg d12 unakrsnog povezivača. Pripremljena 2 mg su pomešana sa 1 ml DMF da bi se dobilo 2 mg/ml rastvora DSS do/d12. Deset mikrolitara prethodno pripremljene mešavine antitelo/antigen pomešano je sa 1 μl rastvora unakrsnog povezivača d0/d12 (2 mg/ml). Rastvor je inkubiran 180 minuta na sobnoj temperaturi da bi se dovršila reakcija unakrsnog povezivanja. Deset mikrolitara rastvora za unakrsno povezivanje pomešano je sa 40 μl amonijum bikarbonata (25 mM, pH 8.3). Posle mešanja u rastvor je dodato 2 μl DTT (500 mM). Smeša je inkubirana 1 sat na 55ºC. Nakon inkubacije, dodato je 2 μl jodioacetamida (1 M), a zatim inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi u tamnoj prostoriji. Nakon inkubacije, rastvor je razblažen 1/5 dodavanjem 120 μl pufera koji se koristio za proteolizu. Do 145 μl redukovanog/alkilovanog antigena pomešano je sa 0.7 μl tripsina, 0.35 μl himotripsina, 0.35 μl ASP-N, 0.7 μl elastaze ili 1.4 μl termolizina. Proteolitičke smeše su inkubirane preko noći na 37 °C (tripsin, ASP-N, elastaza), ili 25 °C (himotripsin), ili 70 °C (termolizin). Unakrsno povezani peptidi su zatim analizirani koristeći Xquest verziju 2.0 i Stavrox 2.1 softver.
Rezultati
Vezivanje za linearne epitope
2 4
[0506] Afinitetno sazrela antitela protiv sortilina S-2-11, S-15-6 i S-60 se vezuju za sortilin u kompleksu 1: 1stehiometrije. Vezivanje nije inhibirano prisustvom peptida (SLIKA 15). Afinitetno zrela antitela protiv sortilina S-22-9 i S-82-8 svi formiraju i 1: 1 i 1: 2 (antitelo:antigen) komplekse sa sortilinom. Ni ovi kompleksi nisu inhibirani prisustvom peptida. SLIKA 15 takođe ukazuje da se peptidi sortilina nisu u kompeticiji sa antitelom S-2-11 koje se vezuje za sortilin. Uočili smo sličan nedostatak kompeticije peptida sortilina koji je takođe primećen za antitela S-15-6, S-22-9, S-82-8 i S-60. Rezultati ukazuju da su epitopi koji se vezuju za antitela S-2-11, S-15-6, S-22-9, S-82-8 i S-60 konformacijski i/ili diskontinuirani. Ovo je u skladu sa nemogućnošću mapiranja antitela S-2-11, S-15-6, S-22-9, S-82-8 i S-60 na sortilin korišćenjem pristupa biblioteke peptida.
Maseni otisak peptidna antigena sortilina i karakterizacija interfejsa za vezivanje
[0507] Nakon proteolize tripsina, 52 peptida su identifikovana u sekvenci sortilina, pokrivajući 57.72 % sekvence. Nakon proteolize himotripsina, 73 peptida su identifikovana u sekvenci sortilina, pokrivajući 81.12 % sekvence. Nakon proteolize ASP-N, 12 peptida je identifikovano u sekvenci sortilina, pokrivajući 24.22 % sekvence. Nisu identifikovani peptidi u sekvenci sortilina nakon proteolize elastaze. Nakon proteolize termolizina, 2 peptida su identifikovana u sekvenci sortilina, pokrivajući 1.47 % sekvence. Kombinovanjem peptida iz svih proteoliza, pokriveno je 94.78% sekvence sortilina (SLIKA 16A). Pošto je 94.78% vanćelijskog domena sortilina bilo prekriveno peptidima nastalim proteolizom, veruje se da ovim postupkom nisu propušteni epitopi.
[0508] Tabela 17 sumira rezultate eksperimenata unakrsnog povezivanja da bi se odredili epitopi. Digestija termolizina nije rezultovala otkrivanjem peptida ni za jedno od antitela. Za antitela S-2-11, S-15-6 i S-22-9, identifikovana su dva različita epitopa. Za antitela S-60 i S-82-8, identifikovan je jedan epitop. U tabeli su unakrsno povezane aminokiseline prikazane podebljanim tekstom.
2
Tabela 17A:Broj peptida
2
Tabela 17B: Regioni zavezivanje antitela sortilina
[0509] Kao što je naznačeno u Tabeli 17, peptidi koje prepoznaje antitelo S-2-11 odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-260 i 297-317 SEQ ID BR: 1 i imaju sekvence aminokiselina: NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK (SEQ ID BR: 703 ) i KTIGVKIYSFGLGGRFLFA SV (SEQ ID BR: 699). Dalje, unakrsno povezani ostaci unutar peptida odgovaraju ostacima K243i K248unutar aminokiselinskih ostataka 237-260 SEQ ID BR: 1; i ostacima S305, R311i S316unutar aminokiselinskih ostataka 297-317 SEQ ID BR: 1. Peptidi koje prepoznaje antitelo S-15-6 odgovaraju aminokiselinskim ostacima 237-247 i 314-338 SEQ ID BR: 1 i imaju sekvence aminokiselina: NGLWVSKNFGG (SEQ ID BR: 700) i FASVMAD KDTTRRIHVSTDQGDTWS (SEQ ID BR: 701). Dalje, unakrsno povezani ostaci unutar peptida odgovaraju ostacima S242i K243unutar aminokiselinskih ostataka 237-247 SEQ ID BR: 1; i ostacima S316i R325unutar aminokiselinskih ostataka 314-338 SEQ ID BR: 1. Peptidi koje prepoznaje antitelo S-22-9 odgovaraju aminokiselinskim ostacima 207-227 i 237-260
2
SEQ ID BR: 1 i imaju sekvence aminokiselina: FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNS (SEQ ID BR: 702) i NGLWVSKNFGGKWEEIHKAVCLAK (SEQ ID BR: 703). Dalje, unakrsno povezani ostaci unutar peptida odgovaraju ostacima T210, T218i S223unutar aminokiselinskih ostataka 207-227 SEQ ID BR: 1; i ostacima K243, K248i K254unutar aminokiselinskih ostataka 237-260 SEQ ID BR: 1. Peptid koji prepoznaje antitelo S-60 odgovara aminokiselinskim ostacima 207-231 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: FVQTDLPFHPLTQMMYSPQNSDYLL (SEQ ID BR: 704). Dalje, unakrsno povezani ostaci unutar peptida odgovaraju ostacima T218, Y222, S223i S227unutar aminokiselinskih ostataka 207-231 SEQ ID BR: 1. Peptid koji prepoznaje antitelo S-82-8 odgovara aminokiselinskim ostacima 367-391 SEQ ID BR: 1 i ima sekvencu aminokiselina: EPGDTGFGTIFT SDDRGIVYSKSLD (SEQ ID BR: 705). Dalje, unakrsno povezani ostaci unutar peptida odgovaraju ostacima S379, R382i Y386unutar aminokiselinskih ostataka 367-391 SEQ ID BR: 1.
Funkcionalno mapiranje
[0510] Varijante mutiranih sortilina HVPLVIMT131QVPLVIVS (SEQ ID BR: 706) (u kojima su podvučeni ostaci H, M i T sekvence aminokiselina divljeg tipa sortilina supstituisani sa Q, V i S, respektivno) i S595R su dobijeni korišćenjem mutiranih prajmera i kloniranjem u plazmidnom vektoru pCMV-AC-IRES-GFP (od Origene). Antitela protiv sortilina S-30 i S-60 konjugovana su sa DyLight 650 kompletom za obeležavanje antitela (Thermo Scientific Pierce) prema uputstvima proizvođača.
[0511] HEK293T ćelije su prolazno transficirane plazmidima koristeći Fugene HD (Promega) prema uputstvima proizvođača. Transficirane HEK293T ćelije su sakupljene nakon 24 sata, isprane sa PBS i inkubirane sa 5 µg/ml antitela tokom jednog sata na ledu u FACS puferu (PBS 2% FBS). Ćelije su zatim isprane dva puta sa 200 µl FACS pufera i analizirane na FACS Canto i FlowJo softveru. Odabrane su GFP pozitivne ćelije i izmerena je ekspresija sortilina kao srednji intenzitet fluorescencije u APC kanalu.
[0512] Mutant sortilina HVPLVIMT131QVPLVIVS snažno je smanjio vezivanje antitela S-30 (SLIKA 16B), dok vezivanje antitela S-60 nije smanjeno. Nasuprot tome, vezivanje antitela S-60 za mutant sortilina S595R je snažno smanjeno (SLIKA 16C), dok vezivanje antitela S-30 nije smanjeno. Ovi rezultati ukazuju na to da su aminokiseline unutar
2
<131>HVPLVIMT<138>peptida sortilina neophodne za vezivanje S-30, a ostatak S595 je kritičan za vezivanje S-60 za sortilin.
Primer 25: Karakterizacija interakcija između sortilina i neurotenzina
Materijali i postupci
[0513] Podaci površinske plazmonske rezonance (SPR) prikupljeni su brzinom od 1 Hz na 25 °C na BiaCore T200 instrumentu. Analiza podataka je izvršena korišćenjem BiaCore T200 softvera za procenu, verzija 2.0. HBS-EP+ (100 mM HEPES, 1.5 M NaCl, 30 mM EDTA, 0.5% zapr./ zapr. surfaktant P20, pH 7.4) je korišćen kao aktivni pufer i za pripremu reagenasa.
[0514] Histidinom označeni humani sortilin (25 nM; R&D Biosystems) je uhvaćen (vreme kontakta 60 s, brzina protoka 30 µl/min, vreme stabilizacije 0 s) na CM5 senzornom čipu (GE Healthcare) imobilizovanog sa anti-histidinskim IgG. Humani progranulin (PGRN; 50 nM; AdipoGen) koji obuhvata 0 nM, 100 nM ili 500 nM neurotenzina (NTS; Sigma) je zatim pretočen preko površine zarobljenog sortilina (vreme kontakta 60 s, brzina protoka 30 µl/min, vreme disocijacija 30 s). Površina čipa je regenerisana između ciklusa koristeći 10 mM glicin-HCl, pH 1.7 (vreme kontakta 60 s, brzina protoka 30 µl/min, vreme stabilizacije 60 s). Nastali SPR signal dobijen je kao razlika u odgovoru od merenja izvršenih na blanko protočnoj ćeliji.
[0515] Antitela protiv sortilina S-15 (25 nM), S-22 (25 nM), S-49 (25 nM), i S-60 (25 nM) su uhvaćena (vreme kontakta 60 s, brzina protoka 30 µl/min, vreme disocijacije 0 s) na CM5 senzornom čipu (GE Healthcare) imobilizovanog sa anti-humanim IgG (Jackson Labs). Humani sortilin (100 nM; R&D Biosystems) je prethodno inkubiran sa 0 nM, 100 nM, 500 nM ili 10,000 nM neurotenzina (NTS; Sigma) i onda je pretočen preko površine zarobljenog anti-sortilina (vreme kontakta 60 s, brzina protoka 30 µl/min, vreme disocijacija 30 s). Površina čipa je regenerisana između ciklusa koristeći 10 mM glicin-HCl, pH 1.7 (vreme kontakta 60 s, brzina protoka 30 µl/min, vreme stabilizacije 60 s). Nastali SPR signal dobijen je kao razlika u odgovoru od merenja izvršenih na blanko protočnoj ćeliji.
2
Rezultati
[0516] Kao što je prikazano na SLICI 17A, istovremeno ubrizgavanje neurotenzina blokiralo je vezivanje rekombinantnog humanog progranulina (PGRN) za humani sortilin, potvrđujući da se PGRN i neurotenzin vezuju za isto mesto na sortilinu. Da bi se testiralo da li se antitela protiv sortilina (S-15, S-22, S-49 i S-60) vezuju za isto mesto na sortilinu kao i neurotenzin, antitela na čipu su uhvaćena i zatim istovremeno ubrizgala sa sortilinom prethodno inkubiranog sa različitim dozama neurotenzina. Za antitela S-15, S-22 i S-49 primećeno je samo manje smanjenje u vezivanju antitela za antigen sortilina (SLIKE 17B, 17C i 17D). Međutim, nije primećeno smanjenje u vezivanju S-60 za sortilin (SLIKA 17E). Kao što je prikazano u Primeru 4, antitelo S-60 je antitelo koje blokira PGRN i koje blokira vezivanje PGRN za sortilin. Rezultati pokazuju da antitela S-15, S-22, S-49 i S-60 ne vezuju sortilin na mestu vezivanja neurotenzina. Kako neurotenzin može blokirati vezivanje PGRN za sortilin, ali ne i za antitelo S-60, veruje se da je sposobnost antitela S-60 da blokira vezivanje PGRN za sortilin postignuta vezivanjem S-60 u blizini mesta vezivanja PGRN na sortilinu, i možda blokiranjem mesta vezivanja PGRN zbog steričkih smetnji, a ne direktnom kompeticijom za mesto vezivanja PGRN na sortilinu. Nadalje, antitela S-15, S-22, S-49 i S-60 predstavljaju pakovanja 2, 3, 4 i 5 (n.d.), što sugeriše da antitela protiv sortilina navedena u primerima 1 i 23 koja pripadaju pakovanjima 2, 3 i 4 se takođe ne vezuju za sortilin na mestu vezivanja neurotenzina.
Primer 26: Smanjenje nivoa sortilina u ćelijama
Materijali i postupci
[0517] Humani primarni monociti izolovani su iz heparinizirane humane krvi (Blood Centers of the Pacific) pomoću RosetteSep koktela za obogaćivanje humanih monocita (STEMCELL Technologies), prema protokolu proizvođača. Monociti su zasejani u RPMI (Invitrogen) koji obuhvata 10% fetalnog telećeg seruma (Hyclone) i 50 µg/ml M-CSF (Peprotech) da bi se izazvala diferencijacija na makrofage ili 100 µg/ml IL-4 100 µg/ml GM-CSF (Peprotech) da bi se izazvala diferencijacija u dendritičkim ćelijama. Nakon 5 dana, ćelije su sakupljene. Za makrofage, samo ćelije pričvršćene za pločicu sakupljene su pomoću strugača za ćelije. Za dendritičke ćelije, prikupljene su ćelije u suspenziji. Nakon ispiranja u PBS, ćelije su stavljene na 0.4 Mi/udubljenje u pločice sa 12 udubljenja.
2
[0518] Pedeset nanomolarnih antitela protiv sortilina (IgG) pune dužine ili Fab antitela protiv sortilina dodato je u svako ububljenje i inkubirano 48 sati. Ćelije su zatim lizirane na ledu upotrebom RIPA pufer (Thermo Fisher Scientific) sa inhibitorima proteaze (Life Technologies). Lizati su sakupljeni i centrifugirani na 10,000 xg 10 minuta na 4 °C. Sakupljeni su supernatanti i merena je koncentracija proteina pomoću BCA kompleta prema uputstvima proizvođača (Thermo Fisher Pierce). Korišćena su sledeća antitela protiv sortilina: S-2-11, S-5, S-15-6, S-22-9, S-60 i S-82-8.
[0519] Petnaest mikrograma proteina stavljeno je po traci na 4-12% Bolt Bis-Tris proteinski gel (Life Technologies) i radilo se na 150 V tokom 45 minuta. Protein je prebačen na PVDF membranu pomoću iBlot prema uputstvima proizvođača (Life Technologies). Membrana je zatim isprana u TBS 0.05% Triton (TBST) i blokirana najmanje jedan sat na RT u TBST 5% BSA. Sortilin je obeležen upotrebom anti-neurotenzina (BD Biosciences, 1: 200) i aktin upotrebom anti-beta aktina (Santa Cruz, 1: 500) razblaženog u TBST, sa inkubacijom preko noći na 4 °C. Membrane su zatim isprane tri puta sa TBST i inkubirane jedan sat na RT u sekundarnom antitelu konjugovanom sa anti-mišjim-HRP (Jackson Laboratories). Membrane su ponovo isprane tri puta u TBST i inkubirane 1 minut u ECL Western reagensu za detekciju (GE Life Sciences) i snimljene na Amersham Imager 600 (GE Life Sciences).
Rezultati
[0520] U poređenju sa kontrolama (kontrola, kontrolnim humanim IgG1 i humanim IgG1 Fab), lečenje sa 50 nM antitela pune dužine ili Fab fragmentima antitela protiv sortilina S-2-11, S-15-6, S-22-9 i S-82-8 je rezultovalo snažnim smanjenjem ekspresije proteina sortilina u humanim primarnim makrofagima (SLIKA 18A) i humanim primarnim dendritičkim ćelijama (SLIKA 18B) u roku od 48 sati. Antitelo protiv sortilina S-60 indukovalo je samo slabo smanjenje ekspresije proteina sortilina u humanim primarnim monocitima, uprkos njegovoj sposobnosti da skoro potpuno eliminiše nivoe sortilina na površini ćelije (SLIKE 18A i 18B). Antitelo protiv sortilina S-5 nije indukovalo smanjenje ekspresije proteina sortilina u humanim primarnim monocitima (SLIKE 18A i 18B). Rezultati sa antitelom S-5 su u skladu sa nemogućnošću antitela S-5 da smanji nivo sortilina na površini ćelije u U-251 ćelijama (Primer 5 i SLIKA 10). Ovi rezultati ukazuju na to da je antitelo protiv sortilina S-5 čisti blokator vezivanja PGRN.
2 1
[0521] Rezultati prikazani na SLICI 18 pokazuju da se humane primarne mijeloidne ćelije dobijene iz uzoraka krvi pacijenata mogu koristiti za merenje in vivo aktivnosti antitela protiv sortilina koja smanjuju nivoe proteina sortilina. Slični rezultati su takođe pokazani in vivo sa miševima.
Primer 27: Karakterizacija interakcija između sortilina i progranulina In Vivo
Materijali i postupci
[0522] Rekombinantna antitela protiv sortilina su klonirana u ekspresionim plazmidima i proizvedena u HEK293T ćelijama standardnom procedurom kako je opisano u William J. Harris & John R. Adair, Eds. (Antibody Therapeutics, 1997). Ekspresioni plazmidi u kojima su antitela klonirana obuhvataju konsenzus humanog ili mišjeg IgG1 konstantnog regiona teškog i lakog lanca, uključujući N297A mutaciju u teškom lancu Fc koja sprečava glikozilaciju antitela.
[0523] C57BL6 miševima (Taconic), sortilin knock-out miševima ili sortilin heterozigotnim miševima ubrizgano je intraperitonealno 40 mg/kg IgG na dan 0. Korišćena su sledeća antitela protiv sortilina: S-2-11, S-15-6, S-20 i S-30.
[0524] Krv je sakupljena nakon 4 sata i 2-og, 5-og, 8-og i 12-og dana da bi se izolovala plazma i bela krvna zrnca. Za izolaciju plazme, krv je sakupljena u heparinizirane epruvete i centrifugirana na 10,000 xg 10 minuta na 4 °C. Supernatant plazme je sakupljen uskladišten na -80ºC. Za naknadnu izolaciju belih krvnih zrnaca, dodat je 1x zapremina PBS 1 mM EDTA i ćelije su resuspendovane vorteksovanjem. Dodata je 10x zapremina 1x ACK pufera za lizu (Lonza) i ćelije su inkubirane na ledu 10 min, a zatim centrifugirane na 500xg 10 min na 4 °C. Supernatant je odbačen i ćelije su resuspendovane u 10x zapremini ACK pufera za lizu i ponovo inkubirane na ledu 5 min, a zatim centrifugirane na 500xg 10 min na 4 °C. Ćelije su isprane u 1 ml PBS 1 mM EDTA, ponovo centrifugirane, a supernatant je odbačen i pelet ćelija je uskladišten na -80 °C.
[0525] Da bi se izolovali proteini iz belih krvnih zrnaca, peleti ćelija su resuspendovani u 50 µl N-Per (Thermo Scientific Pierce) koji obuhvata koktel inhibitora proteaze. Rastvor je inkubiran na ledu 20 minuta i centrifugiran na 10,000 xg 10 minuta na 4 °C. Supernatant je prikupljen, izmeren pomoću BCA i nanet na proteinski gel kako je opisano u prethodnom
2 2
odeljku. Nivoi humanih IgG1 antitela u plazmi su određeni pomoću prilagođene ELISA analize. Ukratko, pločice sa 96 udubljenja su prekrivene preko noći na 4 °C sa 0.1 µg/udubljenju kozjeg anti-humanog Fab fragmenta specifičnog za IgG (Jackson Immuno). Pločice su isprane tri puta u 200 µl pufera za ispiranje (PBS 0.05% Tween) i blokirane u puferu za vezivanje (PBS 1% BSA) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Plazma je razblažena u puferu za vezivanje i dodata u blokirane pločice i inkubirana 1 h na 37 °C. Pločice su zatim isprane tri puta u 200 µl pufera za ispiranje i inkubirane sa sekundarnim antitelom konjugovanim sa anti-humanim Fc specifičnim HRP (Jackson Immuno Research) razblaženim u odnosu 1:10.000 u puferu za vezivanje tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Pločice su isprane tri puta u puferu za ispiranje, a zatim je dodato 100 µl TMB supstrata i inkubirano dok se ne razvije dovoljna boja. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 50 µl 2 N sumporne kiseline i pločica je očitana na Synergy H1 čitaču pločica (Biotek). Kontrolno IgG1 antitelo je korišćeno kao standardna koncentracija od 16-1000 pM. Nivoi mišjih IgG1antitela su testirani korišćenjem sličnog ELISA podešavanja. Pločice su obložene sa 0.1 µg/udubljenju rekombinantnog mišjeg sortilin proteina (R&D Systems) i anti-mišji Fc specifičan za kozji IgG (Jackson Immuno Research) je korišćen kao antitelo za detekciju u razblaženju 1:10,000 u puferu za vezivanje (PBS 3% BSA). Antitelo koje je ubrizgano korišćeno je kao standard od 37-3000 pM.
[0526] Nivoi mišjeg progranulina (PGRN) su mereni pomoću Duoset ELISA kompleta iz R&D Sistems prema protokolu proizvođača. Nivo proteina sortilina meren je u lizatima belih krvnih zrnaca koristeći Western blot i njihovu kvantifikaciju kako je opisano u Primeru 25.
[0527] Za ICV infuziju antitela u mozak miša, miševima su implantirane potkožne Alzet osmotske mini pumpe (Model 1002, brzina protoka = 0,25 µl/h), koje su prevučene i prethodno napunjene antitelom (2 mg/ml) i povezane sa Alzet kanilom (Komplet za infuziju u mozak 3) za jednostranu ICV primenu. Pre operacije, mini pumpe su pripremljene prema uputstvima koje je obezbedio Alzet. Ukratko, sva pakovanja, bočice, špricevi i rukavice su poprskani sa 70% etanolom. Mini pumpa je napunjena sa željenim predmetom za testiranje pomoću čiste igle i šprica. Zatim je očišćena sa tkivom natopljenim izopropanolom i stavljena u posudu sa sterilnim 0.9% fiziološkim rastvorom preko noći na 37<o>C da bi se pumpe pripremile.
[0528] Miševi su anestezirani pomoću izoflurana kiseonika pomoću isparivača opremljenog maskom. Nakon toga, svaki miš je stavljen u stereotaksični okvir na podesivu podlogu za
2
grejanje. Dok su bili na stereotaksičnom okviru, miševi su nastavili da primaju anesteziju izofluranom preko nosnog konusa. Miševi su tada dobili lokalnu primenu markaina (bupivakain epinefrin) na mestu reza na lobanji. Koža koja pokriva lobanju je očišćena hirurškom gazom i Betadin pilingom, a zatim je obrisana sa 75% etanola na hirurškoj gazi. Skalpel je korišćen da se napravi središnji sagitalni rez od 1 cm kroz kožu koja pokriva lobanju, izlažući kosti. Sterilni Q-tipsovi sa 0.9% normalnog fiziološkog rastvora ili 3% H2O2korišćeni su za čišćenje krvi u hirurškom polju. Hemostati su korišćeni za hvatanje preklopa kože i bočno uvlačenje. Kada su fascija i periosteum sastrugani skalpelom, bilo je moguće vizualizovati bregmu. Mini pumpa je prvo implantirana potkožno duž lopatice/leđa, levo ili desno od kičme. Zatim je vrhom skalpela ili finim markerom označeno mesto rupe za bušenje, a ručnom bušilicom je izbušena rupa u lobanji vodeći računa da se ne ošteti donja dura ili moždano tkivo. Alzet kanila (Komplet 3), pričvršćena na mini pumpu, umetnuta je u lateralno ventrikularno ili u hipokampus. Koordinate vrhova kanile za lateralno ventrikularno su: anteriorno -posteriorna (AP) = -0.3 mm do bregme, medijalno -lateralna (ML) = -1.0 mm od srednje linije i ventralna (V) = -1.7 mm do dure, traka za zube postavljena na 0 mm. Nakon operacije, miševi su pojedinačno smešteni u kaveze i davani su im hrana i voda ad libitum. Stanje miševa pratilo se svakodnevno nakon operacije. U trenutku završetka, svi miševi su eutanazirani. Nakon eutanazije ili spontane smrti, mesto implantacije mini pumpe je otvoreno i zabeležena su zapažanja, uključujući sve znakove nekroze ili nakupljanja tečnosti.
[0529] Za periferno ubrizgavanje u miševe, primenjena su antitela u sterilnom PBS ili intraperitonealno (IP) ili intravenozno (IV) prema standardnim procedurama. Uzorci krvi od 50-200 µl uzeti su i sakupljeni u heparinizirane epruvete. Zatim su uzorci krvi centrifugirani 10 minuta na 2,000 xg na 4 °C i sakupljena je plazma.
[0530] Mozak je disekovan na levi i desni hipokampus, čeoni korteks i potiljačni korteks. Za pripremu lizata mozga, dodato je 20 µl N-Per/mg tkiva zajedno sa inhibitorima proteaze i fosfataze. Tkivo i ćelije su poremećeni ultrazvukom. Nakon ometanja, tkivo i N-per smeša inkubirani su na ledu 30 minuta, a zatim su izvrteni sa 20,000 xg 30 minuta. Supernatant je sakupljen i uskladišten na -80 °C do analize. Nivoi antitela protiv sortilina i mišjeg PGRN u uzorcima lizata mozga mereni su pomoću ELISA analiza.
2 4
Rezultati
[0531] Antitela protiv sortilina S-2-11, S-15-6, S-20 i S-30 ubrizgana su miševima intraperitonealno sa 40 mg/kg na dan 0. Nivoi antitela su mereni 0 dana (4 sata nakon ubrizgavanja), 2, 5, 8 i 12 koristeći prilagođene ELISA analize. Poluživot u serumu je meren pomoću prilagođenog dodatka za Excel. Kao što je prikazano na SLICI 19A, antitelo S-20 kao huIgG1 N297A ima poluživot od 0.9 dana, dok kontrolno antitelo izotipa (huIgG1N297A) ima poluživot od 4.2 dana. U ovim eksperimentima su korišćena mišja ili humana IgG1 N297A antitela, koja imaju N297A mutaciju u svom Fc regionu koja sprečava glikozilaciju i na taj način vezivanje za Fc receptore.
[0532] Kao što je prikazano na SLICI 19B, mišje IgG1 N297A verzije antitela protiv sortilina S-2-11, S-15-6, S-20 i S-30 imaju poluživote u opsegu od 0.5 dana do 2.0 dana.
[0533] Antitela protiv sortilina imaju kraći poluživot od kontrolnog IgG, za koji se veruje da je rezultat angažovanja sa ciljanim delovanjem. Kao što je prikazano na SLICI 19, antitela S-15-6 i S-20 imaju najduži poluživot od antitela protiv sortilina.
[0534] Antitela protiv sortilina su zatim testirana da bi se utvrdilo da li mogu izazvati promene nivoa proteina PGRN u krvnoj plazmi miševa, upotrebom miša PGRN Duoset ELISA kompleta (R&D Systems). Antitela protiv sortilina S-2-11, S-15-6 i S-20, koja indukuju smanjenje nivoa sortilina u ćelijama (SLIKE 10 i 18), takođe su mogla da izazovu približno 4 puta povećanje nivoa proteina PGRN u krvnoj plazmi miševa (SLIKE 20A do 20D). Dok se čini da je povećanje nivoa proteina PGRN izazvano antitelom S-2-11 povremeno, antitela S-20 i S-15-6 indukuju značajno povećanje nivoa proteina PGRN do 8 dana (SLIKE 20A do 20D) . Čisto antitelo za blokadu vezivanja PGRN, S-30, takođe je u stanju da značajno poveća nivoe PGRN nakon 4 sata (SLIKE 20A i 20B). Rezultati sugerišu da antitela protiv sortilina koja blokiraju PGRN i koja ne indukuju smanjenje u ćelijskom nivou sortilina takođe mogu povećati nivoe proteina PGRN. Međutim, veruje se da su antitela protiv sortilina koja indukuju smanjenje ćelijskog nivoa sortilina, kao što su antitela S-15-6 i S-20, a koja su takođe u stanju da indukuju produženi efekat na nivoe proteina PGRN, u poređenju sa antitelima protiv sortilina koja samo blokiraju interakciju između sortilina i PGRN, pogodnija za in vivo studije efikasnosti.
[0535] Da bi se potvrdilo da je povećanje nivoa proteina PGRN izazvano antitelina protiv sortilina S-2-11, S-15-6 i S-20 nastalo usled indukcije smanjenja ćelijskog nivoa sortilina, lizati iz uzoraka belih krvnih zrnaca dobijeni od tretiranih miševa stavljeni su na proteinski gel i testirani Western blot-om. Pet dana nakon ubrizgavanja, antitela S-2-11, S-15-6 i S-20
2
izazvala su snažno smanjenje nivoa proteina sortilina u belim krvnim zrncima (SLIKE 21A i 21B). Uzorci belih krvnih zrnaca miševa dvanaest dana nakon tretmana antitelima S-2-11, S-20 i S-30, pokazali su nivoe proteina sortilina koji su se vratili na kontrolne nivoe (SLIKE 21C i 21D). Međutim, uzorci belih krvnih zrnaca miševa dvanaest dana nakon tretmana antitelom S-15-6 i dalje pokazuju smanjene nivoe proteina sortilina (SLIKE 21C i 21D). Čini se da antitelo S-30 ne indukuje smanjenje nivoa proteina sortilina (SLIKE 21A do 21D), što je u skladu sa in vitro rezultatima (Tabela 10). Antitelo protiv sortilina S-30 je specifični PGRN blokator.
[0536] Za merenje angažovanja sa ciljanim delovanjem nakon hroničnih injekcija, miševima je jednom nedeljno tokom šest nedelja ubrizgavano 20, 40 ili 80 mg/kg antitela S-15-6 ili kontrolnog antitela msIgG1. Nakon 35 dana, bela krvna zrnca su izolovana iz uzoraka cele krvi. Snažno smanjenje nivoa proteina sortilina primećeno je u uzorcima dobijenim od miševa pri svim ubrizganim dozama (SLIKE 21E i 21F). Ovi rezultati ukazuju na to da se može postići trajno angažovanje sa ciljanim delovanjem.
[0537] Da bi se izmerilo angažovanje sa ciljanim delovanjem antitela sortilina u mozgu, humane IgG1 N297A verzije antitela protiv sortilina S-15, S-20, S-30, kao i humani izotip kontrolnog antitela, ubrizgani su u desnu bočnu komoru mozga miševa pomoću Alzet osmotske mini pumpe. Nakon dve nedelje infuzije, mozak je disekovan u levi naspram desnog hipokampusa, frontalni korteks i potiljačni korteks. Lizati su generisani iz ovih oblasti i nivoi humanog IgG su mereni pomoću ELISA analiza. Kao što je prikazano na SLIKAMA 22A do 22C, kada su ucrtani nivoi antitela (IgG) u odnosu na nivoe proteina PGRN, pronađena je snažna pozitivna korelacija između dve varijable, što ukazuje na to da povećane doze antitela protiv sortilina mogu povećati nivoe proteina PGRN u mozgu. Nije uočena takva korelacija između nivoa kontrolnih IgG i nivoa PGRN proteina (SLIKA 22D).
[0538] Da bi se utvrdilo da li su efekti na nivoe proteina PGRN izazvani antitelima protiv sortilina posledica smanjenja nivoa sortilina, a ne bilo kakvih efekata bez ciljanog delovanja, testirana je humana IgG1 N297A verzija antitela S-15-6 (huIgG) kod sortilin knock-out (KO) miševa, i kod sortilin heterozigotnih (Het) i divljih tipova (WT) miševa koji su zajedno odgajani. Nivoi antitela S-15-6 su mereni u plazmi i primećeno je da se poluživot antitela dramatično povećao sa smanjenjem nivoa eksprimiranog sortilina (SLIKA 23A). Rezultati ukazuju na to da antitelo S-15-6 specifično prepoznaje sortilin i da se verovatno reciklira i razgradi angažovanjem receptora (tj. vezivanjem za sortilin).
2
[0539] Određeni su i nivoi PGRN kod sortilin knock-out miševa. Osnovni nivoi proteina PGRN bili su 4 puta veći kod sortilin knock-out miševa (KO), u poređenju sa divljim tipom (WT) sa kojim su zajedno odgajani (SLIKA 23B). Dodatno, 40 mg/kg antitela S-15-6 ubrizgano je u jednoj dozi u sortilin knock-out miševe, kao i u heterozigotne (Het) i divlje tipove (WT) koji su zajedno odgajani, a nivoi PGRN proteina su mereni pomoću ELISA analiza. Rezultati na SLICI 23C pokazuju da dok je ubrizgavanje antitela S-15-6 u divlje tipove i sortilin heterozigotne miševe snažno povećalo nivoe proteina PGRN, nije primećeno dalje povećanje nivoa proteina PGRN u sortilin knock-out miševima, što ukazuje da antitelo S-15-6 povećava nivoe proteina PGRN posebno smanjenjem nivoa proteina sortilina.
Primer 28: Antitela protiv sortilina ublažavaju simptome artritisa izazvanog kolagenom kod miševa
Materials and methods
[0540] Dana ispitivanja 0 i 21, miševi su anestezirani izofluranom i data su im intradermalna ubrizgavanja od ukupno 100 µl kolagena tipa II u Freund-ovom potpunom ađuvantu u bazi repa. Kolagen je pripremljen pravljenjem 4 mg/ml rastvora u 0.01 N sirćetne kiseline. Jednake količine kolagena i 5 mg/ml Freund-ovog ađuvanta emulgovano je ručnim mešanjem. Na dan ispitivanja 0, miševi su randomizovani u grupe za lečenje na osnovu telesne težine. Nakon upisa, započeto je lečenje. Kolagen je ubrizgan 0-og i 21-og dana. 40 mg/kg antitela S-15-6 kao mišji IgG1 N297A, ili kontrolno antitelo MOPC-21 ubrizgano je intraperitonealno na dane ispitivanja 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 , 24 i 28. Deksametazon se dozirao svakodnevno.
[0541] Težina tela i kliničko bodovanje sve četiri šape miševa zabeleženo je nakon upisa. Bodovanja šapa su zatim merena svakodnevno od dana ispitivanja 18 do 35. Ukupna efikasnost ispitnih predmeta zasnovana je na dnevnim bodovanjima šapa i izračunavanju površine ispod krive (AUC) bodovanja šapa tokom vremena.
[0542] Klinička bodovanja šapa su određena na sledeći način:
0 = Normalno
1 = 1 zahvaćen zglob zadnje ili prednje šape ili minimalni difuzni eritem i otok
2 = 2 zahvaćen zglob zadnje ili prednje šape ili blagi difuzni eritem i otok
2
3 = 3 zahvaćen zglob zadnje ili prednje šape ili umeren difuzni eritem i otok
4 = Izražen difuzni eritem i otok ili zahvaćeni zglobovi 4 prsta
5 = Teški difuzni eritem i jako oticanje cele šape, nesposobni za savijanje prstiju
Rezultati
[0543] Doziranje životinja sa 4 0 mg/kg antitela protiv sortilina S-15-6 rezultovalo je skromnim, ali statistički značajnim smanjenjem kliničkog bodovanja šapa, kao i jednodnevnim odlaganjem početka bolesti (SLIKA 24). Tabele 18A i 18B prikazuju pvrednosti izračunate pomoću t-testa i dvofaktorske ANOVA, što ukazuje na statističku značajnost rezultata prikazanih na SLICI 24.
Tabela 18A: T-Test
Tabela 18B: Dvofaktorska ANOVA
2
[0544] Ovi rezultati ukazuju na to da povećanje nivoa progranulina izazvano antitelima protiv sortilina može smanjiti kliničke simptome artritisa.
Primer 29: Karakterizacija aktvnosti sortilina In Vivo
Materijali i postupci
[0545] Lipopolisaharid (LPS) iz E. coli 0111: B4 je ubrizgan intraperitonealno u dozi od 0 mg/kg, 0.4 mg/kg i 4 mg/kg u miševe divljeg tipa C57Bl6 i sortilin-/- (Sortilin knock-out) miševe stare 9-10 nedelja. Uzorci seruma su sakupljeni od miševa na 1.5 sat i na 6 sati nakon primene LPS. Nivoi citokina i hemokina su zatim procenjeni korišćenjem mišjeg inflamacionog kompleta BD Cytometric Bead Array, uključujući IL-6, TNFalfa (TNF- α), IFNgama (IFN- γ), IL-10, IL12p70 i CCL2 i fleksibilni set koji obuhvata IL12/ IL-23p40, IL-1beta (IL-1 β), IL-1alfa (IL-1 α), CXCL1, CCL3, CCL4 i CCL5. Ispiranje peritonealne šupljine izvedeno je 6 sati nakon primene LPS da bi se procenila migracija ćelija i infiltracija. Analiza je izvedena korišćenjem BD FACSCanto II sistema.
Rezultati
[0546] Rezultati na SLICI 25A ukazuju na to da su nivoi progranulina u serumu povišeni kod sortilin knock-out miševa, u poređenju sa miševima divljeg tipa nakon 6 sati od primene LPS. Dodatno, intraperitonealno ubrizgavanje 0 mg/kg, 0.4 mg/kg ili 4 mg/kg LPS nije imalo uticaja na nivo progranulina u serumu (SLIKA 25A). Kako je prikazano na SLIKAMA 25b-25D, nije bilo promene u broju neutrofila, velikih peritonealnih (CD11b+F4/80hi) makrofaga ili malih peritonealnih (CD11b+F4/80lo) makrofaga.
[0547] Kako je prikazano na SLIKAMA 26A-26H, nivoi pro-inflamatornih citokina IL-6, IL12p70, IL12p40 i IL-1beta u serumu su smanjeni kod sortilin knock-out miševa posle 1.5 sata tretmana sa 4 mg/kg LPS, u poređenju sa miševima divljeg tipa. Povećanje nivoa antiinflamatornog citokina IL-10 u serumu primećeno je kod sortilin knock-out miševa tretiranih sa 0.4 mg/kg LPS (SLIKA 26D). Kako je prikazano na SLIKAMA 27A-27E, nivoi
2
hemokina u serumu, kao što su CXCL1, CCL2, CCL3 i CCL5, koji su odgovorni za regrutovanje monocita, dendritičnih ćelija, T ćelija, neutrofila i drugih granulocita, smanjen je kod sortilin knock-out miševa nakon tretmana 1.5 sat sa LPS.
[0548] Kako je prikazano na SLIKAMA 28A-28H, sortilin knock-out miševi, tretirani tokom 6 sati sa 0.4 mg/kg LPS, pokazali su skroman porast nivoa IL-6 u serumu, a sortilin knock-out miševi, tretirani 6 sati sa 4 mg/kg LPS, pokazali su smanjenje nivoa TNFalfa u serumu. Kako je prikazano na SLIKAMA 29A-29E, nivoi CCL2, CCL3 i CCL4 u serumu bili su smanjeni kod sortilin knock-out miševa lečenih 6 sati sa LPS.
[0549] Rezultati ukazuju na to da povećani nivoi progranulina u serumu kod sortilin knockout miševa može biti u osnovi korisnog efekta u slabljenju inflamatornog odgovora na LPS. Antitela protiv sortilina koja blokiraju sortilin imaju sposobnost da povećaju nivoe progranulina, što se takođe dešava kod sortilin knock-out miševa. Shodno tome, smatra se da antitela protiv sortilina prema ovom otkriću mogu imati preklapajuća dejstva kod sortilin knock-out miševa, uključujući smanjenje proinflamatornih citokina IL-6, TNFalfa, IL-12p40 i IL-1beta; kao i hemokina CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4 i CCL5. Dalje se veruje da antitela protiv sortilina takođe mogu izazvati dalje aktivnosti izazvane smanjenjem ili inhibicijom sortilina, kao što je to kod sortilin knock-out miševa.
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo protiv sortilina koje se vezuje za humani sortilin, naznačeno time da antitelo protiv sortilina povećava vanćelijske nivoe progranulina i smanjuje nivoe sortilina na površini ćelije, pri čemu antitelo protiv sortilina sadrži varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca, i pri čemu:
a) varijabilni domen lakog lanca sadži: HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 508, HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 29, i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 55, i varijabilni domen teškog lanca sadrži: HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 509, HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 510, i HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 511; ili
b) varijabini domen lakog lanca sadži: HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 580, HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 581, i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 100, i varijabilni domen teškog lanca sadrži: HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 582, HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 583, i HVR-H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 233.
2. Antitelo protiv sortilina prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da se antitelo protiv sortilina vezuje sa konstantom disocijacije (KD) za humani sortilin koja je u opsegu od 100 nM do 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM i/ili pri čemu se antitelo protiv sortilina vezuje sa konstantom disocijacije (KD) za mišji sortilin koja je u opsegu od 100 nM do 0.005 nM, ili manje od 0.005 nM.
3. Antitelo protiv sortilina prema patentom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time da je antitelo protiv sortilina humano antitelo, humanizovano antitelo, bispecifično antitelo, monoklonsko antitelo, multivalentno antitelo, konjugovano antitelo ili himerno antitelo, ili pri čemu je antitelo protiv sortilina fragment antitela, i izborno pri čemu je fragment Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab')2, Fv ili scFv fragment.
4. Antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time da je antitelo protiv sortilina bispecifično antitelo koje prepoznaje drugi antigen, izborno pri čemu drugi antigen je antigen koji olakšava transport preko krvno-moždane barijere, izborno pri čemu je drugi antigen odabran iz grupe koja se sastoji od receptora transferina (TR), receptora insulina (HIR), receptora faktora rasta sličnog insulinu (IGFR), proteina 1 i 2 povezanih sa lipoproteinskim receptorima niske gustine (LPR-1 i 2), receptora toksina difterije, CRM197, TMEM 30(A), domena transdukcije proteina, TAT, Syn-B, penetratina, poli-arginin peptida, angiopep peptida i ANG1005.
5. Antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time da:
(a) varijabilni domen lakog lanca sadrži: HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 10, HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 30 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 100, a varijabilni domen teškog lanca sadrži: HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 142, HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 170 i HVR- H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 233; ili
(b) varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 430 i varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 431.
6. Antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time da:
(a) varijabilni domen lakog lanca sadrži: HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 9, HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 29 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 55, a varijabilni domen teškog lanca sadrži: HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 129, HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 155 i HVR- H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 190; ili
(b) varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 343 i varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 342.
7. Antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time da varijabilni domen lakog lanca sadrži: HVR-L1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 9, HVR-L2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 29 i HVR-L3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 55, a varijabilni domen teškog lanca sadrži: HVR-H1 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 520, HVR-H2 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 533 i HVR- H3 koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 553.
8. Antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 ili 7, naznačeno time da varijabilni domen lakog lanca sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 343, a varijabilni domen teškog lanca sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID BR: 648.
9. Antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačeno time da antitelo protiv sortilina ima izotip IgG1 ili IgG4, izborno pri čemu:
(a) antitelo protiv sortilina ima humani IgG1 izotip i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranoj iz grupe koja se sastoji od: N297A, N297Q, D265A, L234A, L235A, C226S, C229S, P238S, E233P, L234V, P238A, A327Q, A327G, P329A, K322A, L234F, L235E, P331S, T394D, A330L, M252Y, S254T, T256E, i bilo koju njihovu kombinaciju, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU numerisanju; ili
(b) antitelo protiv sortilina ima humani IgG4 izotip i sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu na poziciji ostatka odabranoj iz grupe koja se sastoji od: E233P, F234V, L234A/F234A, L235A, G237A, E318A, S228P, L236E, S241P, L248E, T394D, M252Y, S254T, T256E, N297A, N297Q, i bilo koju njihovu kombinaciju, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU numerisanju, izborno pri čemu:
(i) IgG1 Fc region dalje sadrži jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od A330L, L234F, L235E, P331S i bilo koju njihovu kombinaciju, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU numerisanju;
(ii) Fc region IgG1 ili IgG4 dalje sadrži jednu ili više dodatnih supstitucija aminokiselina na poziciji odabranoj iz grupe koja se sastoji od M252Y, S254T, T256E i bilo koju njihovu kombinaciju, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU numerisanju; ili
1
(iii) Fc region IgG4 dalje sadrži S228P supstituciju aminokiselina prema EU numerisanju.
10. Antitelo protiv sortilina prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time da antitelo protiv sortilina ima humani IgG4 izotip i sadrži supstituciju aminokiselina na pozicijama ostataka S228P, F234A i L235A, pri čemu je numerisanje pozicije ostataka prema EU numerisanju.
11. Izolovana nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10.
12. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 11.
13. Izolovana ćelija domaćin koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 12.
14. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži antitelo protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
15. In vitro postupak povećavanja vanćelijskih nivoa progranulina, smanjenja nivoa sortilina na površini ćelije na jednoj ili više ćelija i/ili smanjenja ekspresije na jednom ili više proinflamatornih posrednika, izborno naznačen time da je odabir jednog ili više proinflamatornih posrednika iz grupe koja se sastoji od IL-6, IL12p70, IL12p40, IL-1β, TNF-α, CXCL1, CCL2, CCL3, CCL4, i CCL5, koji sadrži kontaktiranje jedne ili više ćelija sa antitelom protiv sortilina prema bilo kom od patentnih zahteva 1- 10.
16. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku sprečavanja, smanjenja rizika ili lečenja bolesti, poremećaja ili povrede kod pojedinca kome je to potrebno, naznačeno time da je odabir bolesti, poremećaja ili povrede iz grupe koja se
11
sastoji od frontotemporalne demencije, progresivne supranuklearne paralize, Alzheimer-ove bolesti, vaskularne demencije, napada, distrofije mrežnjače, amiotrofične lateralne skleroze, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, demencije, moždanog udara, Parkinson-ove bolesti, akutnog diseminiranog encefalomijelitisa, degeneracije mrežnjače, starosne makularne degeneracije, glaukoma, multiple skleroze, septičkog šoka, bakterijske infekcije, artritisa i osteoartritisa.
17. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku lečenja koji sadrži inhibiranje jednog ili više od neuroinflamacije, aksonopatije naznačene time da postoji izrastanje kratkog aksona i aberantno grananje, mikroglijalne aktivacije i inflamatornog odgovora i/ili pospešivanja zarastanja rana.
12
RS20211389A 2015-04-07 2016-04-07 Antitela protiv sortilina i postupci za njihovu upotrebu RS62546B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562144270P 2015-04-07 2015-04-07
EP16777311.8A EP3280441B1 (en) 2015-04-07 2016-04-07 Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
PCT/US2016/026519 WO2016164637A1 (en) 2015-04-07 2016-04-07 Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62546B1 true RS62546B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=57072459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211389A RS62546B1 (sr) 2015-04-07 2016-04-07 Antitela protiv sortilina i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (22)

Country Link
US (10) US10087255B2 (sr)
EP (2) EP3991748A3 (sr)
JP (4) JP6999421B2 (sr)
CN (1) CN107708733B (sr)
AU (1) AU2016245807B2 (sr)
CA (1) CA2981851A1 (sr)
CY (1) CY1124771T1 (sr)
DK (1) DK3280441T3 (sr)
EA (1) EA201792221A1 (sr)
ES (1) ES2899227T3 (sr)
HR (1) HRP20211980T1 (sr)
HU (1) HUE057432T2 (sr)
IL (1) IL254887B2 (sr)
LT (1) LT3280441T (sr)
MX (1) MX393951B (sr)
PL (1) PL3280441T3 (sr)
PT (1) PT3280441T (sr)
RS (1) RS62546B1 (sr)
SG (2) SG11201708220RA (sr)
SI (1) SI3280441T1 (sr)
SM (1) SMT202200065T1 (sr)
WO (1) WO2016164637A1 (sr)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10053513B2 (en) 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
HUE057432T2 (hu) 2015-04-07 2022-05-28 Alector Llc Anti-sortilin antitestek és ezek alkalmazási módjai
US10849992B1 (en) 2015-04-07 2020-12-01 Alector Llc Methods of screening for sortilin binding antagonists
GB201512215D0 (en) 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
PL3380495T3 (pl) 2015-11-24 2021-12-13 Transfert Plus, S.E.C. Związki peptydowe i koniugaty peptydowe do leczenia nowotworu poprzez chemioterapię receptorową
BR112018014810A2 (pt) 2016-01-22 2018-12-11 Merck Sharp & Dohme Corp. anticorpos anti-fator xi de coagulação
US11542332B2 (en) 2016-03-26 2023-01-03 Bioatla, Inc. Anti-CTLA4 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
CN116425879A (zh) 2016-06-14 2023-07-14 默沙东有限责任公司 抗-凝血因子xi抗体
WO2018148447A1 (en) * 2017-02-08 2018-08-16 Adimab, Llc Antibody heavy chain variable domains targeting the nkg2d receptor
EP4491234A3 (en) 2017-02-08 2025-04-09 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
BR112019017197A2 (pt) 2017-02-20 2020-04-14 Dragonfly Therapeutics, Inc. proteínas que se ligam a her2, nkg2d e cd16
EP3612567B1 (en) * 2017-04-19 2024-09-11 Bluefin Biomedicine, Inc. Anti-vtcn1 antibodies and antibody drug conjugates
WO2018213928A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Transfert Plus, S.E.C. Peptide compounds, conjugate compounds and uses thereof for treating inflammatory diseases
TWI843344B (zh) 2017-06-02 2024-05-21 美商輝瑞大藥廠 對ｆｌｔ３具特異性之抗體及其用途
US10894833B2 (en) * 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
JP7438119B2 (ja) * 2017-10-23 2024-02-26 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 細胞外小胞関連疾患のための材料および方法
KR20200069364A (ko) 2017-10-24 2020-06-16 마젠타 테라퓨틱스 인코포레이티드 Cd117+ 세포의 고갈을 위한 조성물 및 방법
AU2018354189A1 (en) 2017-10-24 2020-04-23 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for the depletion of CD117+ cells
WO2019084067A1 (en) * 2017-10-24 2019-05-02 Magenta Therapeutics, Inc. ANTI-CD117 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
EP4495597A3 (en) 2018-01-04 2025-04-30 Iconic Therapeutics LLC Anti-tissue factor antibodies, antibody-drug conjugates, and related methods
AU2019218125B2 (en) 2018-02-08 2025-03-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
PE20220278A1 (es) 2018-02-08 2022-02-25 Dragonfly Therapeutics Inc Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d
TW201942134A (zh) 2018-02-20 2019-11-01 美商蜻蜓醫療公司 結合cd33、nkg2d及cd16之多特異性結合蛋白及使用方法
CA3091764A1 (en) * 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting cd33, and use thereof
CN112867496B (zh) * 2018-03-27 2026-03-17 阿尔茨治疗方法公司 用于治疗神经退行性疾病的基于car-treg的疗法
US20210284702A1 (en) * 2018-06-18 2021-09-16 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising progranulin
RS64034B1 (sr) * 2018-07-13 2023-04-28 Alector Llc Anti-sortilin antitela i načini njihove upotrebe
KR20250112921A (ko) 2018-08-08 2025-07-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
EA202190468A1 (ru) 2018-08-08 2021-07-06 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Мультиспецифические связывающие белки, которые связывают bcma, nkg2d и cd16, и способы их применения
PE20211491A1 (es) * 2018-09-27 2021-08-11 Celgene Corp PROTEINAS DE FIJACION A SIRPa Y METODOS DE USO DE ESTAS
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
KR102919581B1 (ko) 2019-06-11 2026-01-30 알렉터 엘엘씨 치료요법에 사용하기 위한 항-소르틸린 항체
CN114222752B (zh) * 2019-07-03 2025-11-14 埃克塞里艾克西斯公司 抗组织因子抗体-药物缀合物及相关方法
WO2021003074A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Crystal Bioscience Inc. Anti-cd38 antibody and methods of use thereof
EP4073116A1 (en) * 2019-12-10 2022-10-19 Aarhus Universitet Compounds for treatment of eye diseases
US20230212266A1 (en) * 2020-04-27 2023-07-06 Fred Hutchinson Cancer Center Neutralizing monoclonal antibodies against covid19
EP4146271A4 (en) 2020-05-06 2024-09-04 Dragonfly Therapeutics, Inc. PROTEINS THAT BIND NKG2D, CD16 AND CLEC12A
JP7753264B2 (ja) * 2020-06-24 2025-10-14 プロシーナ バイオサイエンシーズ リミテッド ソルチリンを認識する抗体
EP3981394A1 (en) * 2020-10-07 2022-04-13 Insusense ApS A sortilin antagonist for use in the prevention or treatment of hearing loss.
CN116420078A (zh) 2020-10-14 2023-07-11 戴纳立制药公司 用于治疗和监测额颞痴呆的方法
WO2022120352A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Alector Llc Methods of use of anti-sortilin antibodies
WO2022120423A1 (en) * 2020-12-08 2022-06-16 James Cook University Peptides and uses thereof
US12377144B2 (en) 2021-03-03 2025-08-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using multi-specific binding proteins that bind NKG2D, CD16 and a tumor-associated antigen
US20250108124A1 (en) * 2021-05-19 2025-04-03 Biohaven Therapeutics Ltd. Antibody drug conjugates using mates technology for delivering cytotoxic agents
IL310535A (en) * 2021-08-10 2024-03-01 Byomass Inc Anti-gdf15 antibodies, compositions and uses thereof
SE545408C2 (en) 2021-12-02 2023-09-05 Sortina Pharma Ab Sortilin inhibitors
US20230348588A1 (en) * 2021-12-23 2023-11-02 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing sortilin
CN119630807A (zh) * 2022-05-03 2025-03-14 爱莫布瑞斯疗法公司 重组抗体产生方法和相关细胞系统
IL317511A (en) * 2022-06-16 2025-02-01 Cephalon Llc IL-2 immunoconjugates attenuated by anti-PD-1 antibody and their uses
EP4543858A1 (en) 2022-06-23 2025-04-30 Draupnir Bio ApS Bifunctional molecules that selectively induce degradation of extracellular targets in lysosomes
WO2024245719A1 (en) 2023-05-26 2024-12-05 Charité - Universitätsmedizin Berlin Sortilin inhibitors for treatment of patients with functional neuroendocrine tumors
WO2025166073A1 (en) * 2024-01-31 2025-08-07 Alector Llc Compositions comprising anti-sortilin antibodies and uses thereof

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
ES2058199T3 (es) 1987-09-23 1994-11-01 Bristol Myers Squibb Co Heteroconjugados de anticuerpos para la eliminacion de celulas infectadas por el vih.
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
FI903489A0 (fi) 1988-11-11 1990-07-10 Medical Res Council Ligander med en enda sektion, receptorer innehaollande naemnda ligander, foerfaranden foer deras framstaellning samt anvaendning av liganderna och receptorerna.
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
AU8295491A (en) 1990-06-29 1992-01-23 Biosource Technologies Incorporated Melanin production by transformed microorganisms
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
DE69308573T2 (de) 1992-08-17 1997-08-07 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JP2002514895A (ja) 1995-09-28 2002-05-21 アレクション、ファーマスーティカルズ、インコーポレーテッド ブタ細胞相互作用タンパク質
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
EP2305027B1 (en) 1996-12-03 2014-07-02 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
ES2637801T3 (es) 2000-04-11 2017-10-17 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
WO2003084569A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Drug containing antibody composition
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
JP4628679B2 (ja) 2002-04-09 2011-02-09 協和発酵キリン株式会社 Ｇｄｐ−フコースの輸送に関与する蛋白質の活性が低下または欠失した細胞
US20040132140A1 (en) 2002-04-09 2004-07-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Production process for antibody composition
EP1556684A4 (en) 2002-11-01 2008-01-23 Univ Colorado Regents QUANTITATIVE ANALYSIS OF PROTEIN ISOFORMS USING FLIGHT TIME MASS SPECTROMETRY BY MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION / IONIZATION
DK1891966T3 (da) 2002-12-20 2012-04-02 Lundbeck & Co As H Modulation af neurotrophinaktivitet; fremgangsmåde til screening
EP1682170A2 (en) 2003-11-07 2006-07-26 Lay Line Genomics SpA Compositions able to prevent neurodegenerative processes and methods of assaying the same
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
CN101120021A (zh) 2004-12-31 2008-02-06 基因技术公司 结合br3的多肽及其用途
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
WO2006138343A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Raptor Pharmaceutical Inc. Compositions comprising receptor - associated protein (rap) variants specific for lrp2 and uses thereof
EA019344B1 (ru) * 2005-07-01 2014-03-31 МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
US9062126B2 (en) 2005-09-16 2015-06-23 Raptor Pharmaceuticals Inc. Compositions comprising receptor-associated protein (RAP) variants specific for CR-containing proteins and uses thereof
FR2896881B1 (fr) 2006-01-31 2008-04-18 Biomerieux Sa Procede de dosage du prongf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation du prongf en therapie
SI2359834T1 (sl) 2006-03-15 2017-02-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Zdravljenje pacientov,ki imajo paroksizmalno nočno hemoglobinurijo, z zaviralcem komplementa
WO2007134050A2 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CN101594878A (zh) 2006-09-18 2009-12-02 雷普特药品公司 通过给予受体相关蛋白（rap）-缀合物对肝病症的治疗
WO2008052016A2 (en) 2006-10-23 2008-05-02 Columbia University The sortilin-related receptor sorl1 is functionally and genetically associated with alzheimer's disease
US20100028333A1 (en) * 2006-12-15 2010-02-04 Getty Krista L Receptor for amyloid beta and uses thereof
RS60019B1 (sr) 2006-12-21 2020-04-30 H Lundbeck As Modulacija aktivnosti proneurotrofina
UY30776A1 (es) 2006-12-21 2008-07-03 Medarex Inc Anticuerpos cd44
WO2008086452A2 (en) 2007-01-10 2008-07-17 Columbia University Treatment and prevention of alzheimer's disease
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
JP5933894B2 (ja) 2007-09-14 2016-06-15 アディマブ， エルエルシー 合理的に設計された、合成抗体ライブラリおよびその使用
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
JP5715045B2 (ja) * 2008-04-27 2015-05-07 ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット ソルチリンに対する特異的リガンドの設計
US20160359907A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Vmware, Inc. Automatically auditing virtual machines for security hardening compliance
ES2680222T3 (es) 2008-05-22 2018-09-05 H. Lundbeck A/S Modulación de los receptores con dominio Vps10p para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular
WO2009155932A2 (en) 2008-06-25 2009-12-30 H. Lundbeck A/S Modulation of the trpv : vps10p-domain receptor system for the treatment of pain
US8124093B2 (en) * 2008-07-16 2012-02-28 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof
US20120039865A1 (en) * 2008-08-19 2012-02-16 Yale University Identification of sortilin as a neuronal receptor for the frontotemporal dementia protein, progranulin
CA2736460A1 (en) 2008-09-08 2010-03-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and devices for ligating tubular structures
WO2010069331A2 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 H. Lundbeck A/S Modulation of the vps 10-domain receptor family for the treatment of mental and behavioural disorders
FR2945538B1 (fr) 2009-05-12 2014-12-26 Sanofi Aventis Anticorps humanises specifiques de la forme protofibrillaire du peptide beta-amyloide.
CN102869775A (zh) 2009-09-30 2013-01-09 哈佛大学校长及研究员协会 通过调节自噬抑制基因产物调节自噬的方法
US20130115222A1 (en) 2010-06-15 2013-05-09 Cornell University Methods of limiting microvascular damage following acute myocardial ischemia
KR102810907B1 (ko) 2010-07-16 2025-05-21 아디맵 엘엘씨 항체 라이브러리
US20130336988A1 (en) 2010-11-17 2013-12-19 New York University Methods for treating early stage or mild neurological disorders
BR112013031943B1 (pt) 2011-06-13 2021-10-13 Csl Limited Composição que compreende proteínas e anticorpos contra g-csfr
WO2014071131A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Sortilin 1 is a novel inducer of vascular calcification
US20140323315A1 (en) 2013-04-29 2014-10-30 Adimab, Llc Polyspecificity reagents, methods for their preparation and use
BR112016000106B1 (pt) 2013-07-09 2023-11-21 Annexon, Inc. Anticorpos anti-c1q e usos dos mesmos, célula de hibridoma, composição farmacêutica e métodos de detecção de sinapses em uma amostra biológica referências cruzadas a pedidos relacionados
CN106573153A (zh) 2014-02-04 2017-04-19 纽约大学 用于诊断和治疗溶酶体贮积病的颗粒蛋白前体(pgrn)及其衍生物
US20160349276A1 (en) 2014-02-12 2016-12-01 H. Lundbeck A/S Use of Sortilin as Biomarker for Affective/Mood Disorders
US20170096486A1 (en) 2014-03-26 2017-04-06 Goran Landberg Agents inhibiting granulin for treatment of cancer
US10603364B2 (en) 2014-08-11 2020-03-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lysosomal targeting and uses thereof
HUE057432T2 (hu) 2015-04-07 2022-05-28 Alector Llc Anti-sortilin antitestek és ezek alkalmazási módjai
US10849992B1 (en) * 2015-04-07 2020-12-01 Alector Llc Methods of screening for sortilin binding antagonists
US20160331746A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 University Of South Florida Sortilin-Binding Small Molecules for Increasing Glucose Uptake
GB201512215D0 (en) * 2015-07-13 2015-08-19 Lundbeck & Co As H Agents,uses and methods
US11390656B2 (en) 2015-08-04 2022-07-19 New York University Progranulin (PGRN) fragments and derivatives for treatment or alleviation of lysosomal storage diseases
US10085969B1 (en) 2016-02-12 2018-10-02 University Of South Florida Sortilin binding compounds, formulations, and uses thereof
US10894833B2 (en) 2017-07-20 2021-01-19 H. Lundbeck A/S Agents, uses and methods for treatment
JP7438119B2 (ja) 2017-10-23 2024-02-26 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド 細胞外小胞関連疾患のための材料および方法
US20210284702A1 (en) 2018-06-18 2021-09-16 Denali Therapeutics Inc. Fusion proteins comprising progranulin
RS64034B1 (sr) 2018-07-13 2023-04-28 Alector Llc Anti-sortilin antitela i načini njihove upotrebe
US20220000971A1 (en) 2018-08-24 2022-01-06 Transfert Plus, S.E.C. Methods and compounds for targeting sortilin receptors and inhibiting vasculogenic mimicry
WO2020051624A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Grophin Pty Ltd Methods and compositions for improving recovery from a brain injury
EP3666281A1 (en) 2018-12-14 2020-06-17 Insusense ApS Compositions comprising sortilin-1
EP3942049A4 (en) 2019-03-20 2023-10-18 President And Fellows Of Harvard College ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE BASED PROGRANULIN AUGMENTATION THERAPY FOR NEURODEGENERATIVE DISEASES
KR102919581B1 (ko) 2019-06-11 2026-01-30 알렉터 엘엘씨 치료요법에 사용하기 위한 항-소르틸린 항체

Also Published As

Publication number Publication date
US10428150B2 (en) 2019-10-01
CN107708733A (zh) 2018-02-16
US10308718B2 (en) 2019-06-04
EP3991748A3 (en) 2022-08-24
US20190085084A1 (en) 2019-03-21
JP2025087841A (ja) 2025-06-10
HK1249445A1 (zh) 2018-11-02
NZ736674A (en) 2024-11-29
US11339223B2 (en) 2022-05-24
SMT202200065T1 (it) 2022-03-21
EA201792221A1 (ru) 2018-08-31
US20220185899A1 (en) 2022-06-16
CY1124771T1 (el) 2022-11-25
AU2016245807B2 (en) 2022-05-19
CN107708733B (zh) 2022-11-15
US20250092144A1 (en) 2025-03-20
DK3280441T3 (da) 2021-11-15
IL254887B1 (en) 2023-07-01
LT3280441T (lt) 2021-11-25
IL254887A0 (en) 2017-12-31
WO2016164637A1 (en) 2016-10-13
US20190127475A1 (en) 2019-05-02
PT3280441T (pt) 2021-11-30
SI3280441T1 (sl) 2022-01-31
HUE057432T2 (hu) 2022-05-28
IL254887B2 (en) 2023-11-01
EP3280441B1 (en) 2021-09-29
JP6999421B2 (ja) 2022-02-04
US20200223928A1 (en) 2020-07-16
PL3280441T3 (pl) 2022-02-21
MX393951B (es) 2025-03-24
CA2981851A1 (en) 2016-10-13
JP7648584B2 (ja) 2025-03-18
US20240309097A2 (en) 2024-09-19
MX2017012802A (es) 2018-04-11
ES2899227T3 (es) 2022-03-10
US11186645B2 (en) 2021-11-30
US20220185898A1 (en) 2022-06-16
US20220251219A1 (en) 2022-08-11
US20190062433A1 (en) 2019-02-28
AU2016245807A1 (en) 2017-11-02
JP2020202842A (ja) 2020-12-24
SG10201912087SA (en) 2020-02-27
EP3280441A1 (en) 2018-02-14
JP2018517401A (ja) 2018-07-05
EP3280441A4 (en) 2018-09-12
US20180265586A1 (en) 2018-09-20
HRP20211980T1 (hr) 2022-04-01
US11208488B2 (en) 2021-12-28
JP2023029891A (ja) 2023-03-07
US10087255B2 (en) 2018-10-02
US20170210808A1 (en) 2017-07-27
EP3991748A2 (en) 2022-05-04
SG11201708220RA (en) 2017-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7648584B2 (ja) 抗ソルチリン抗体及びその使用方法
JP7725185B2 (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP6669749B2 (ja) 抗ｔｒｅｍ２抗体及びその使用方法
JP2024009818A (ja) 抗Ｓｉｇｌｅｃ－７抗体及びその使用方法
JP7497953B2 (ja) 抗ｃｄ３３抗体及びその使用方法
JP2011523359A (ja) 抗ＰｉｒＢ抗体
HK1249445B (en) Anti-sortilin antibodies and methods of use thereof
EA043015B1 (ru) Антитела против сортилина и способы их применения
HK1243006B (en) Anti-trem2 antibodies and methods of use thereof