ES2820855T3 - Antagonistas del receptor de integrina y sus métodos de uso - Google Patents

Antagonistas del receptor de integrina y sus métodos de uso Download PDF

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Hampar Karageozian
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un péptido inhibidor de integrina que consiste en Glicinil-Arginil- Glicinil-Ácido cisteico-Treonil-Prolina-COOH o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en el tratamiento del edema macular mediante la inhibición de la angiogénesis.

Description

DESCRIPCIÓN
Antagonistas del receptor de integrina y sus métodos de uso
Campo de la invención
La presente invención se refiere, en general, a los campos de la química y la medicina y más particularmente a los antagonistas del receptor de integrina.
Antecedentes de la invención
La secuencia del tripéptido RGD se encuentra en una serie de proteínas, donde juega un papel en la adhesión celular. Los ejemplos de las proteínas en las que está presente la secuencia del tripéptido RGD incluyen los colágenos, la fibronectina, la vitronectina, el factor de von Willebrand (VWF), ciertas desintegrinas y ciertas discoidinas.
Las integrinas son receptores heterodiméricos de la superficie celular que median la adhesión entre las células y la matriz extracelular (ECM) mediante la unión a los ligandos que tienen una secuencia RGD expuesta. Se cree que la unión normal de integrina-RGD desempeña un papel en la expresión génica implicada en el crecimiento celular, la migración y la supervivencia. La regulación defectuosa de dicho crecimiento celular, migración y supervivencia puede dar lugar a una serie de estados de enfermedad que incluyen la trombosis, la inflamación y el cáncer. Por lo tanto, los péptidos RGD se han investigado como posibles imitadores de las proteínas de adhesión celular y por su capacidad para unirse a las integrinas con fines terapéuticos, tales como inhibir la adhesión celular, la migración celular, la proliferación celular, la diferenciación celular, la apoptosis, la angiogénesis, la tumorigénesis, para inhibir la entrada de microbios en las células, para el uso en su forma multimérica como agentes radioterapéuticos internos, así como también agentes de imágenes de cáncer y por sus capacidades de transporte de fármacos contra el cáncer. En el ojo, las integrinas afectan una serie de procesos que incluyen el desarrollo ocular, la migración celular, la curación y algunos procesos patológicos. Las integrinas también pueden modular la inflamación y la trombosis en el tejido ocular. También se ha informado que el péptido RGD inyectado intravítreamente provoca el desprendimiento vitreorretiniano posterior en un modelo animal y, por lo tanto, puede ser útil en el tratamiento de ciertos trastornos retinianos y/o para facilitar la extracción del cuerpo vítreo en un procedimiento de vitrectomía. Ver Olivera, L.B. y otros, RGD Peptide-Assisted Vitrectomy to Facilítate Induction of a Posterior Vitreous Detachment: a New Principie in Pharmacological Vitreolysis; Current Eye Research (8):333-40 (25 de diciembre de 2002). También se sabe que las proteínas se usan por varios virus con y sin envoltura y las bacterias para infectar las células huésped. Schornberg, Kathryn L.; asfiilntegrin Controls Ebolavirus Entry by Regulating Endosomal Cathespins; Proc. Nat. Acad. Sci. USA; Vol. 106, No. 19, pp. 8003-8008 (2009)
Resumen de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido inhibidor de integrina que consiste en glicinil-arginil-glicinil-ácido cisteico-treonil-prolina-COOH o una sal farmacéuticamente aceptable de este para usar en el tratamiento del edema macular de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas. La presente invención también proporciona derivados de este (que incluyen sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, estereoisómeros, multímeros, formas cíclicas, formas lineales, conjugados de fármacos, profármacos y sus derivados).
La presente invención proporciona la inhibición terapéutica o profiláctica de los receptores de integrina en sujetos humanos o animales. También se describen en la presente descripción las composiciones que pueden usarse para el tratamiento o la prevención de la neovascularización o la formación de vasos sanguíneos en tumores u otros tejidos (por ejemplo, la retina del ojo), para tratar o prevenir las enfermedades virales, impedir diversos trastornos virales, que incluye la retinopatía diabética y otros afecciones que implican la neovascularización no deseada, para prevenir o tratar la inhibición de la adhesión celular a los sitios de unión a RGD o la administración de otros agentes de diagnóstico o terapéuticos a los sitios de unión a RGD en sujetos humanos o animales mediante la administración al sujeto de una cantidad efectiva de una composición que comprende un péptido de R-G-Ácido cisteico o un derivado de este (que incluye sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, estereoisómeros, multímeros, formas cíclicas, formas lineales, conjugados de fármacos, profármacos y sus derivados). Los ejemplos específicos del péptido de R-G-Ácido cisteico de esta invención incluyen una forma lineal de Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH (ejemplo al que se hace referencia en la presente descripción como el Compuesto 1) y una forma cíclica de Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH) (ejemplo al que se hace referencia en la presente descripción como el Compuesto 2).
También se describen en la presente descripción los compuestos que tienen las Fórmulas generales I-VII como sigue:
Fórmula general I:
Figure imgf000003_0001
donde X se selecciona de: H, alquilo Ci - Ce, Ph o SO3H y Y = OH o NH2.
Fórmula general II:
Figure imgf000003_0002
donde X se selecciona de: H, alquilo C1 - Ca, Ph o SO3H.
Fórmula general III:
Figure imgf000003_0003
donde X se selecciona de: H, alquilo Ci - Ca, Ph o SO3H y en donde Z se selecciona de: H o SO3H Fórmula general IV:
Figure imgf000003_0004
o donde X se selecciona de: H, alquilo Ci - Ca, Ph o SO3H; Y se selecciona de OH o NH2.
Fórmula general V:
Figure imgf000004_0001
donde X se selecciona de: H, alquilo Ci - C6, Ph o SO3H.
Fórmula general VI:
Figure imgf000004_0002
donde X se selecciona de: H alquilo C1 - C6, Ph o SO3H.
Fórmula general VII:
X1-R-G-Ácido cisteico-X
donde X y X1 se seleccionan de: -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe-Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val cíclico o lineal, o cualquier sal de cualquier combinación del isómero D o isómero L de: Arg, Gly, Cisteico, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr.
Los ejemplos de las formas cíclicas de la Fórmula general VII incluyen, pero no se limitan necesariamente a:
Figure imgf000004_0003
donde X' se selecciona de: H, alquilo C1 - C6, Ph o SO3H y Z se selecciona de H o Me; Y se selecciona de OH, NH2.
Los ácidos sulfónicos son ácidos más fuertes que los ácidos carboxílicos correspondientes. Esta mayor polaridad del grupo ácido sulfónico conduce a un enlace intermolecular más fuerte. Por ejemplo, el R-G-Ácido cisteico, que tiene un enlace O-H más polarizado, puede formar enlaces de hidrógeno más fuertes que el R-G-Ácido aspártico (péptido RGD), que tiene un enlace O-H relativamente menos polarizado, con los grupos amida de las proteínas en el sitio de unión a integrina y/o tienen interacciones más fuertes con iones metálicos complejados en el sitio de unión a integrina.
Como se describe con más detalle en otra parte en la presente descripción, un ejemplo específico de la Fórmula general VII, glicinil-arginil-glicinil-cisteico-treonil-prolina-COOH (GRG Ácido cisteico TP; referido a continuación como el Compuesto 1) se sintetizó y se probó en animales y se descubrió que es eficaz para inducir el desprendimiento del vítreo posterior (PVD) de la superficie de la retina al inhibir las interacciones integrina-matriz extracelular (ECM). Como se describe también con más detalle en otra parte en la presente descripción, el Compuesto 1 se probó en un modelo de cicatrización de heridas mediante el uso de las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y se demostró que inhibe la adhesión celular en un 74 % en 12 horas en comparación con una inhibición del 40 % por un péptido RGD cíclico. Estos estudios sugieren y corroboran la justificación de que glicinil-arginil-glicinil-cisteico-treonil prolina-COOH puede unirse a la integrina incluso más fuertemente que los péptidos RGD.
La secuencia del péptido de RG Ácido cisteico, que puede estar en forma L o en forma D, es un inhibidor competitivo de las interacciones integrina-ECM. La secuencia del péptido de RG Ácido cisteico puede ser de derivados resistentes a proteasas o de derivados cíclicos o de derivados de profármacos o asociados con sistemas de administración de fármacos o de anticuerpos monoclonales.
También se describen en la presente descripción las composiciones que pueden usarse para inhibir la angiogénesis, que pueden ser útiles para tratar la inflamación, la cicatrización de heridas, la trombosis, las metástasis del cáncer y los tumores. Se puede encontrar una aplicación útil adicional en la oftalmología que incluye el tratamiento de la retinopatía diabética proliferativa o no proliferativa, la licuefacción del vítreo, la inducción del desprendimiento vitreorretiniano posterior (PVD), la patogénesis de las enfermedades vitreorretinianas, tales como el agujero macular idiopático, los flotadores, la tracción vitreomacular, la degeneración macular relacionada con la edad, la degeneración macular húmeda, la neovascularización coroidea, la cirugía vitreorretiniana, la oclusión venosa y la prevención de la formación de cicatrices en la cirugía del glaucoma. También se describen en la presente descripción las composiciones multiméricas y/o radiomarcadas que pueden usarse como agentes de diagnóstico/imagen para la detección de tumores y agentes radioterapéuticos para el tratamiento de tumores y como portadores de fármacos contra el cáncer debido a sus propiedades de dirección al tumor.
Los biomateriales que incorporan un péptido de RG Ácido cisteico también pueden proporcionar un microambiente adhesivo sintético para la supervivencia a largo plazo y el crecimiento de las células y para la ingeniería de tejidos vivos para las aplicaciones en la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. A través de su propiedad de unirse a los receptores de adhesión de la integrina, los péptidos de RG Ácido cisteico pueden proporcionar una señal promotora de adhesión cuando se unen a un biomaterial o andamio. Los materiales a base de RG Ácido cisteico median la adhesión celular, la propagación y la migración de las células. Además, la adhesión celular mediada por la integrina promueve la proliferación y la supervivencia celular y juega un papel clave en el ensamblaje y la organización de estructuras multicelulares y tejidos.
Los fármacos para el tratamiento de la degeneración macular como el Lucentis y el Avastin se basan en la inhibición del VEGF, que de cualquier otra manera provoca el crecimiento de nuevos vasos, la angiogénesis y, en consecuencia, contribuye al edema macular. Se sabe que un pequeño péptido RGD puede inducir apoptosis al inhibir la unión de la célula a la matriz extracelular1 por la unión competitiva como se muestra en la patente de los Estados Unidos núm.
6,500, 924 de Brooks y otros.
El motivo de unión o reconocimiento del péptido RGD puede encontrarse en las proteínas de la matriz extracelular y las integrinas que unen el citoesqueleto intracelular de las células con la ECM al reconocer los epítopos de adhesión RGD. Ver, por ejemplo, Foos, R Y., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1972) 11, 801-808. Las células, sin la unión a la ECM, normalmente sufren apoptosis.
En general, las interacciones entre los fibroblastos y los componentes de la glucoproteína de la matriz extracelular provocan una importante formación de cicatrices mediada principalmente por la secuencia de aminoácidos que contiene RGD que interactúa en las integrinas de la superficie celular. También se sabe que la secuencia RGD participa en las interacciones célula-ECM durante las reacciones inflamatorias y homeostáticas (ver Flershkoviz, S. M. y otros, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., (1994), 35, 2585-2591) y las integrinas juegan un papel importante en la migración celular en la cicatrización de heridas o los procesos patológicos y modulan la inflamación y la trombosis. Por lo tanto, los antagonistas potentes de la integrina, como los péptidos RGD, podrían ser muy útiles como agentes farmacológicos como agentes antiinflamatorios, antimetastásicos o antitrombóticos (ver Elner, S.G. y Elner, V.M., IOVS (1996) 37:696-701. También se informa en la literatura que el receptor CD44 para el ácido hialurónico media las interacciones célula-célula y célula-matriz a través de su afinidad por el ácido hialurónico, y posiblemente también por su afinidad por otros ligandos tales como la osteopontina, los colágenos y las metaloproteasas de matriz (MMP).
La adhesión con hialuronano desempeña un papel importante en la migración celular, el crecimiento y la progresión tumoral y también participa en la activación de los linfocitos, la recirculación y la migración y la hematopoyesis. La expresión o disfunción alterada provoca numerosos fenotipos patógenos (ver, por ejemplo, Jiang D., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (2007) 23: 435-461; y Knudson, W. y otros, Matrix Bio. (2002), 21: 15-23).
Recientemente, se ha demostrado que la interacción de CD44 y los componentes de la matriz celular (por ejemplo, HA) desempeña un papel importante en el desarrollo de diversas enfermedades inflamatorias y la interrupción de las interacciones hialuronano-CD44 conduciría a la mejora de la neovascularización coroidea (ver Hiroshi Mochimaru y otros, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2009) 50: 4410-4415).
Estas evidencias demuestran que una molécula de adhesión como el péptido RGD o CD44 en las interacciones célulacélula y célula-ECM juega un papel importante en el desarrollo de numerosas enfermedades patogénicas y la inhibición de las interacciones puede ser un nuevo objetivo terapéutico en el tratamiento y la curación de enfermedades.
También se ha demostrado que los péptidos sintéticos se unen a las integrinas y a los factores de crecimiento. Se ha descubierto que los pentapéptidos ciclados que contienen secuencias RGD inhiben la unión de la vitronectina a la integrina avp3 (ver Michael A. Dechantsreiter y otros, J. Med. Chem. (1999) 42: 3033-3040) y tanto la vitronectina como la fibronectina a las integrinas avp3 y anbp3 (ver Roland Haubner y otros, J. Am. Chem. Soc., (1996)118:7461-7472). Se ha demostrado que esta inhibición es útil en el tratamiento de múltiples enfermedades no relacionadas. En estudios en hámster, los pentapéptidos cíclicos retrasaron el crecimiento y la metástasis de los tumores en comparación con los animales de control (ver M. A. Buerkle y otros, British J. Cancer (2002) 86: 788-795). También se ha demostrado que los pentapéptidos reducen la unión de los glóbulos rojos falciformes al endotelio vascular y mejoran el comportamiento hemodinámico (ver Eileen M. Finnegan y otros, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., (2007) 293: H1038-H1045). Otro péptido cíclico que contiene la secuencia RGD ha mostrado una fuerte unión aa4p1, una integrina que se sabe que desempeña un papel en la unión de los leucocitos en las respuestas inflamatorias e inmunitarias (ver Pina M. Cardarelli y otros, J. Biol. Chem. (1994) 269:18668-18673). Se ha demostrado que un tetrapéptido sintético sulfatado se une fuertemente al VEGF (ver Maynard, J.A. Hubbell, Acta Biomaterialia (2005) 1: 451-459).
Además, en una aplicación importante y útil, se ha demostrado que un conjugado fármaco-péptido RGD dimérico es útil para la administración de fármacos dirigidos a integrinas para la focalización de tumores (ver Chen y otros, J. Med. Chem., (2005)48(4): 1098-1106).
En otra aplicación igualmente importante y útil, se ha demostrado que los péptidos RGD multiméricos radiomarcados son útiles como agentes de diagnóstico/imagen para la detección de tumores y, como agentes radioterapéuticos para la focalización y el tratamiento específico de tumores por la focalización a la integrina av(B3 (ver Zi-Bo Li y otros, J. Nucl. Medicine, (2007)48: 1162-1171).
En la oftalmología, la formación de cicatrices en la cicatrización de heridas por los fibroblastos es uno de los principales problemas, particularmente en el glaucoma. Esto surge de las interacciones entre los fibroblastos y los componentes de las glucoproteínas de la ECM. El reconocimiento de las glucoproteínas de la ECM se produce a través de las integrinas de la superficie celular que son específicas para los epítopos de adhesión, como la secuencia Arg-Gly-Asp (o RGD). La secuencia RGD, que está presente en varias matrices de las proteínas plasmáticas, que incluyen la fibronectina (FN) y la vitronectina (VN), participa en las interacciones célula-ECM que ocurren durante las reacciones inflamatorias y homeostáticas. La inhibición de las interacciones entre los fibroblastos y las glucoproteínas de la ECM alivió la formación de cicatrices (ver Rami Hershkoviz y otros, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2585- 2591).
Las fibrillas de colágeno de la corteza vítrea posterior se adhieren a la interfaz vitreorretiniana, específicamente a la lámina limitante interna de la superficie retiniana (ver Sebag J., Eye (1992), 6: 541-552). La adherencia en la base del vítreo, el disco óptico, a lo largo de los principales vasos retinianos y de manera facial a todo el polo posterior juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades vitreorretinianas, tales como el agujero macular idiopático, la tracción vitreomacular, la retinopatía diabética proliferativa, etc. (Akiba J. Quiroz M.A. y otros, Ophthalmol. (1990)97, 1619-1655).
La inhibición de la angiogénesis se muestra prometedora con la retinopatía diabética y la degeneración macular, que resultan de un crecimiento excesivo de los vasos sanguíneos oculares. En estos trastornos, los vasos interfieren con las estructuras normales del ojo o impiden que la luz llegue a la parte posterior del ojo.
Los nuevos vasos sanguíneos son en sí mismos la principal patología, y detener el crecimiento de los vasos sanguíneos podría prevenir la ceguera. Por lo tanto, la angioinhibición podría dar como resultado no solo un tratamiento de estos trastornos; sino que podría ser una cura. Además, se ha postulado que la separación del vítreo de la retina puede aliviar la tracción macular, reduciendo el riesgo de formación de agujeros maculares. En consecuencia, el desprendimiento del vítreo posterior mediante la inhibición de la unión de la fibronectina y la laminina a las integrinas en la interfaz vitreorretiniana, puede prevenir la neovascularización retiniana en los ojos con la retinopatía diabética y la oclusión venosa retiniana (ver Akiba J. Quiroz MA, Ophthalmol. (1990) 97, 1619- 1655; Kelly N.E. y otros, Arch. Ophthalmol. (1991) 109, 654-659; y Kado M y otros, Am. J. Ophthalmol. (1988) 105: 20-24).
En los últimos años, los procedimientos quirúrgicos vítreos se han mejorado enormemente para aliviar las tracciones vitreorretinianas y reducir el edema retiniano. A pesar del avance continuo en las técnicas quirúrgicas y la instrumentación, todavía es difícil lograr una extracción atraumática de la corteza vítrea en algunos pacientes, particularmente en la retinopatía diabética y en los pacientes pediátricos debido a las complicaciones tales como las roturas retinianas, el desprendimiento de la retina y el daño de la fibra nerviosa retiniana, (ver Sebag J., Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. (1987)225: 89-93; y Han D.P. y otros, Arch. Ophthalmol. (1998) 106: 998-1000) etc. Por lo tanto, es altamente conveniente un enfoque menos traumático para escindir selectivamente la interfaz vítrea sin dañar la retina. En los últimos años, han aparecido en la literatura informes sobre varios agentes farmacológicos para la separación de la interfaz vitreorretiniana (ver Trese M.T., Eye. (2002) 16: 365- 368; Gandorfer A. y otros, Am. J. Ophthalmol. (2002) 133: 156-159; y Hesse L. y otros, Eye Res. (2000) 70: 31-39). La vitreólisis farmacológica mediante el uso de enzimas como la hialuronidasa (ver la patente de los Estados Unidos núm. 6,863,886 de Karageozian y otros) y la plasmina autóloga (Sakuma T y otros, Nippon Ganka Gakkai Zassi (2003) 107: 709-718) se han explorado para promover la digestión de la matriz extracelular y para inducir el desprendimiento del vítreo posterior en el pasado. Sin embargo, una destrucción no específica de los tejidos adyacentes por las enzimas empleadas impide el éxito de su aplicación terapéutica. En los últimos años, se ha investigado un enfoque novedoso que usa agentes farmacológicos no enzimáticos como la urea (ver Nickerson, C. y otros, en J. Biomechanics, (2008) 41: 1840-1846, y en Macromol. Symp. (2005): 183-189) y el péptido RGD (ver Leonardo B. Oliviera y otros, Curr. Eye Res. (2002) 25: 333-340), concentrándose en la separación de la interfaz vitreorretiniana. Se ha demostrado que un análogo sintético del péptido RGD compite por el motivo RGD de las proteínas de la ECM para alterar las interacciones integrina-ECM y aflojar los enlaces in vitro (Williams J.A., Pathol. Bio. (1992) 40: 813-821; Gehlsen K.R. y otros, J. Cell. Biol. (1988) 106: 925­ 930; Pierschbacher, M.D. y otros, J. Biol. CHem., (1987) 262: 17294-17298; y Zhon L.L. y otros, IOVS. (1996) 37: 104­ 113) e in vivo. Por lo tanto, la inyección intravítrea de péptidos RGD solubles condujo a la liberación de los epítopos RGD de las proteínas de la ECM insolubles de la superficie retiniana, lo que facilitó el PVD no enzimático en modelos de conejo. Claramente, estos resultados indican que la interfaz vitreorretiniana implica la conexión de la integrina al motivo RGD de la ECM, así como también la adhesión de colágenos corticales vítreos a la lámina limitante interna (ILL). Los péptidos RGD y sus derivados promueven la migración de las células epiteliales en una herida (ver P.M. Mertz y otros, J. Burn Care Res. (1996) 17: 199-206) y mantienen su bioactividad cuando se incorporan a biomateriales sintéticos como los hidrogeles (ver MP Lutolf y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. (2003) 100: 5413-5418; y MP Lutolf y otros, Nature Biotechnol. (2003) 21: 513 - 518), otras matrices de polímeros (ver Horng-Ban Lin y otros, J. Biomed. Material. Res. (2004)28: 329-342) o como películas de superficie sobre sustratos duros (D.M. Ferris y otros, Biomaterials (1999) 20: 2323-2331). Los péptidos RGD también promueven una mayor adhesión de las células epiteliales o endoteliales a las prótesis vasculares (ver K.Walluscheck y otros, Eur. J. Vascular and Endovascular Surgery (1996) 12: 321-330) y otros órganos artificiales (ver Jeschke, Brigette, Biomaterials (2002) 23: 3455-3463) recubiertos con la secuencia peptídica y se ha demostrado que respaldan la regeneración nerviosa (ver M. Rafiuddin Ahmed y otros, Brain Res. (2003) 993:208-216). La superficie biológicamente activa de las prótesis puede contener fibras de resina sintética o polímeros.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra el efecto de tres péptidos, específicamente, el péptido RGD cíclico, el péptido de RG Ácido cisteico (Compuesto 1) y el péptido RGE, sobre la cinética de la cicatrización de heridas.
La Figura 2 muestra un cromatograma de HPLC del péptido de RG Ácido cisteico (Compuesto 1).
La Figura 3 muestra un cromatograma de masa por electropulverización del péptido de RG Ácido cisteico (Compuesto 1).
La Figura 4 muestra un cromatograma de HPLC del péptido de RG Ácido cisteico cíclico (Compuesto 2).
La Figura 5 muestra un cromatograma de masa por electropulverización del péptido de RG Ácido cisteico cíclico (Compuesto 2).
La Figura 6 es un diagrama esquemático que ilustra el mecanismo de acción de los compuestos de la presente invención.
Las Figuras 7A y 7B son diagramas esquemáticos que ilustran adicionalmente el mecanismo de acción de las composiciones de la presente invención.
La Figura 8 es un gráfico que muestra el área total de la neovascularización en un modelo de ratón CNV 14 días después del tratamiento con varias dosis del Compuesto 1 y el control (solamente el vehículo).
La Figura 9 es un gráfico de barras que compara el área medida de la neovascularización en un modelo de ratón ROP después de varias dosis del Compuesto 1 y el control (solamente el vehículo).
Las Figuras de 10A a 10J son gráficos y diagramas que muestran los resultados de un ensayo clínico de dosis múltiples del Compuesto 1 en humanos.
Las Figuras de 11A a 11C son gráficos de barras que comparan los efectos del ranibizumab y el Compuesto 1 solos y en combinación sobre la neovascularización retiniana en ratones transgénicos productores del VEGF.
Descripción detallada y ejemplos
La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido de unión a integrina que consiste en glicinil-arginil-glicinil-ácido cisteico-treonil-prolina-COOH o una sal farmacéuticamente aceptable de este para usar en el tratamiento del edema macular, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los ejemplos específicos incluyen la forma lineal de Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH (ejemplo al que se hace referencia en la presente descripción como el Compuesto 1) y la forma cíclica de Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH) (ejemplo al que se hace referencia en la presente descripción como el Compuesto 2) así como también los derivados de estos, que incluyen sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, estereoisómeros, multímeros, formas cíclicas, formas lineales, formas multiméricas, conjugados de fármacos, profármacos y sus derivados.
Síntesis de los Compuestos 1 y 2
Puede llevarse a cabo la síntesis de péptidos en fase sólida convencional (SPPS; ver R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963) 85 (14): 2149-2154) conocida por un experto en la técnica común. La SPPS es un método preferido de síntesis debido a los altos rendimientos. En general, la primera etapa de la técnica de síntesis de péptidos en fase sólida consiste en el ensamblaje de la cadena peptídica con derivados de aminoácidos protegidos sobre un soporte polimérico. La segunda etapa de la técnica es la escisión del péptido a partir del soporte de resina con la escisión concurrente de todos los grupos protectores de la cadena lateral para dar el péptido libre crudo. El principio general de la SPPS es uno de los ciclos repetidos de acoplamiento-desprotección. La amina N-terminal libre de un péptido unido a la fase sólida se acopla a una única unidad de aminoácidos N-protegida. Esta unidad se desprotege y revela una nueva amina N-terminal a la que puede unirse un aminoácido adicional. Ver Asymmetric Synthesis de Von G. M. Coppola y H. F. Schuster; John Wiley & Sons, New York 1987, para las estrategias de síntesis, protección y desprotección, y Greene's Protective Groups en Organic Synthesis por Peter G.M. Wuts y Theodora W. Greene, (2a edición) J. Wiley & Sons, 1991, para las estrategias de protección y desprotección.
De las dos formas principales usadas de la síntesis de péptidos en fase sólida - Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo; grupo protector de alfa-amino base lábil) y t-Boc (t-butiloxicarbonilo; grupo protector ácido lábil), Fmoc puede usarse preferentemente en la síntesis de los presentes péptidos. Cada método implica diferentes resinas y protección de la cadena lateral de los aminoácidos y las consiguientes etapas de escisión/desprotección. Después de la escisión de la resina, los péptidos generalmente se purifican por HPLC de fase inversa mediante el uso de columnas como C-18, C-8 y C-4.
Un ejemplo de la síntesis de péptidos en fase sólida
El siguiente es un resumen de las etapas sintéticas para la síntesis de los péptidos en la resina Wang como soporte sólido, mediante el uso del grupo protector base lábil 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc).
Desprotección Fmoc
Cargue 0,08 mmol de resina Fmoc-Pro-Wang en una columna con frita equipada con una tapa de plástico. Lave la resina con 2 partes de 3 ml de DMF (dimetilformamida) durante 1 minuto cada una. A continuación, añada aproximadamente 3 ml de piperidina al 20 % en DMF y permita que la desprotección de Fmoc continúe durante 15 minutos. Durante este tiempo, agite suavemente o agite la columna para asegurar una mezcla completa. Después de que se complete la reacción (aproximadamente 15 minutos), drene la columna de reacción y lave la resina nuevamente con DMF (4 x 3 ml).
Acoplamiento de enlace amida
El aminoácido protegido con Fmoc deseado, Fmoc-Thr-tBu, (3 eq.; en relación con la carga de resina indicada por el proveedor) y DIEA (6 eq.) en DCM (0,5 M con respecto al aminoácido) se añaden luego a la resina. La mezcla se enfría a -20 °C durante 20 minutos. A continuación, se añade a la reacción benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), un reactivo de acoplamiento de péptidos usado en la síntesis de péptidos en fase sólida (3 eq.). Después de agitar a -20 °C durante 8 horas, la mezcla de reacción se drena y la resina se lava con DCM (3x).
Después de la desprotección de Fmoc mediante el uso de piperidina al 20 % en DMF (15 min) y el lavado con DMF (3x), el siguiente aminoácido protegido con Fmoc (3 eq.; en relación con la carga de resina), PyBop se acopla de la misma manera que antes.
Escisión
Para obtener el péptido en forma de ácido libre, el enlace éster se escinde mediante el uso de condiciones fuertemente ácidas tales como TFA (ácido trifluoroacético). Trate la resina con 2-3 ml de una solución de ácido trifluoroacético y agua 95:5. Agite suavemente la resina durante un período de 25 minutos. Luego, drene la columna y recoja cuidadosamente el filtrado en un recipiente de vidrio de recolección.
Síntesis del Compuesto 1 (GRG ácido cisteico TP):
Figure imgf000008_0001
Etapa 1. Carga de resina: Se usa una resina de o-clorotritilo precargada con prolina como material de partida.
Etapa 2. Ensamblaje de péptidos: La síntesis de Fmoc se usa para ensamblar el péptido. Los aminoácidos protegidos se activan con PyBOP y los grupos Fmoc terminales se eliminan con piperidina al 20 % en DMF. Los siguientes aminoácidos protegidos se usan en el orden en que aparecen:
a. Fmoc-Thr-tBu (Fmoc treonina-éster de t-butilo)
b. Fmoc-ácido cisteico-Pfp (Fmoc-ácido cisteico-éster de pentafluorofenilo)
c. Fmoc-Gly (Fmoc-glicina)
d. Fmoc-Arg-Pbf (Na-Fmoc-N(A)-(2,2,4,6,7 pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil)-L-arginina)
e. Fmoc-Gly (Fmoc-glicina)
Etapa 3. Escisión del péptido de la resina: El péptido resultante se escinde del soporte sólido y los grupos protectores se eliminan con una solución de 85,5 % de TFA, 5 % de fenol, 2 % de agua, 5 % de tioanisol y 2,5 % de etanoditiol. Etapa 4. Purificación: La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se usa para purificar los péptidos de RG Ácido cisteico resultantes.
Una cantidad del Compuesto 1 preparado como se describió anteriormente, se analizó por cromatografía líquida de alta resolución para tener > 98 % de área/área en pureza [condiciones de HPLC: Amortiguador A: ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 % en agua, Amortiguador B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo, Fase móvil (MP) A: 97 % Amortiguador A y 3 % Amortiguador B, Fase móvil B: 79 % Amortiguador A y 21 % Amortiguador B, Fase móvil C: 50 % Amortiguador A y 50 % Amortiguador B; para el gradiente, ver la Tabla 1 a continuación; velocidad de flujo: 1,0 ml/minuto; columna: Waters Symmetry® C18, 5p, 4,6 x 250 mm; temperatura de la columna: 30 °C; detector: UV@220 nm; volumen de inyección de la muestra: 20,0 pl;
preparación de las muestras: 20 pl de la muestra diluida con 1,0 ml de fase móvil A (aproximadamente 0,5 mg/ml)]. El cromatograma de HPLC correspondiente se muestra en la Figura 2. Además, en función de la adición gradual de los aminoácidos correspondientes para la síntesis de la secuencia peptídica, se determinó que el peso molecular del Compuesto 1 purificado mediante espectrometría de masas por electropulverización fue 638,3 amu (masa teórica: 637,7 amu), confirmando la identidad del Compuesto 1. El espectrograma de masas por electropulverización del Compuesto 1 se muestra en la Figura 3.
Tabla 1: Programa de gradiente de bomba para detectar el Compuesto 1 por HPLC
Figure imgf000009_0002
Síntesis del Compuesto 2 (ácido R-G-cisteico cíclico fN(CH3)V):
Figure imgf000009_0001
Etapa 1. Carga de resina: Se usa una resina de o-clorotritilo como material de partida. Fmoc-ND-metil-L-Val se une a la resina.
Etapa 2. Ensamblaje de péptidos: 2. La síntesis de Fmoc se usa para el ensamblaje de péptidos. Los aminoácidos protegidos se activan con PyBOP y los grupos Fmoc terminales se eliminan con piperidina al 20 % en DMF. Los siguientes aminoácidos protegidos se usan en el orden en que aparecen:
a. Fmoc-Phe (Fmoc-fenilalanina)
b. Fmoc-ácido cisteico-PfP (Fmoc-ácido cisteico-éster de pentafluorofenilo)
c. Fmoc-Gly (Fmoc-glicina)
d. Fmoc-Arg-Pbf (Na-Fmoc-Nu)-(2,2I4,6t7 pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonil)-L-arginina)
Etapa 3. Escisión del péptido de la resina: El péptido se escinde del soporte sólido mediante el uso de ácido acético/TFA/DCM (1:3:3)
Etapa 4. Ciclación y desprotección del péptido cíclico deseado: Ciclación mediante la activación in situ mediante el uso de difenilfosforilazida y bicarbonato de sodio a alta dilución. Las cadenas laterales se desprotegen mediante el uso de 85,5 % de TFA, 5 % de fenol, 2 % de agua, 5 % de tioanisol, 2,5 % de etanoditiol.
Etapa 5. Purificación: La HPLC se usa para la purificación.
Una cantidad del Compuesto 2, preparada como se describió anteriormente, se analizó por cromatografía líquida de alta resolución para tener > 99 % de área/área de pureza (condiciones de HPLC: Fase móvil A: ácido trifluoroacético al 0,1 % en agua, B: TFA al 0,1 % en (80 % de acetonitrilo más 20 % de agua); gradiente de 26 % a 36 % de B en 20 minutos; velocidad de flujo: 1,0 ml/minuto; columna: Phenomenex C18(2)
4,6x150 mm, 5p, 100A; detector: UV@220 nm; volumen de inyección de la muestra: 100,0 jl). El cromatograma de HPLC correspondiente se muestra en la Figura 4. Además, en función de la adición gradual de los aminoácidos correspondientes para la síntesis de la secuencia peptídica, se determinó que el peso molecular del Compuesto 2 purificado mediante espectrometría de masas por electropulverización fue 625,3 amu (masa teórica: 625,77 amu), confirmando la identidad del Compuesto 2. El espectrograma de masas por electropulverización del Compuesto 2 se muestra en la Figura 5.
Métodos para inhibir la adhesión celular
También se describen en la presente descripción los métodos para inhibir la adhesión celular a los sitios de unión a RGD en un sujeto humano o animal mediante la administración al sujeto de una cantidad efectiva de R-G-Ácido cisteico (es decir, la forma lineal de R-G-NH-CH(CH2-SO3H)COOH o la forma cíclica de R-G-NH-CH(CH2-SOaH)COOH) o un derivado de este (que incluye sales farmacéuticamente aceptables, hidratos, estereoisómeros, multímeros, formas cíclicas, formas lineales, conjugados de fármacos, profármacos y sus derivados).
El solicitante ha descubierto que los péptidos de RG Ácido cisteico sintéticos de la presente invención inducen la apoptosis al inhibir competitivamente la unión celular a los componentes de la ECM. Por lo tanto, los presentes péptidos de RG Ácido cisteico sintéticos y sus derivados pueden usarse como potentes antagonistas de integrinas como agentes terapéuticos contra la angiogénesis, la inflamación, las metástasis de cáncer, la trombosis, la prevención y el tratamiento de la formación de cicatrices, así como también agentes farmacológicos de la vitreólisis. Además, en un aspecto importante de la presente invención, se prevé una focalización mejorada de las integrinas a, p mediante el uso de los péptidos de RG Ácido cisteico multimerizados y radiomarcados, para su uso como agentes radioterapéuticos internos para la detección de tumores (agente de diagnóstico o imagen) y el tratamiento de tumores. En otro aspecto importante, los conjugados del péptido de RG Ácido cisteico mejorado o los conjugados del péptido de RG Ácido cisteico multimérico funcionan como portadores de fármacos, por ejemplo, como portadores de fármacos contra el cáncer para una focalización eficaz del tumor.
Como se describe en otra parte en la presente descripción, los ácidos sulfónicos en los péptidos de RG Ácido cisteico son ácidos más fuertes que los ácidos carboxílicos correspondientes en los péptidos RDG. Esta mayor polaridad del grupo ácido sulfónico conduce a un enlace intermolecular más fuerte. Por ejemplo, el R-G-Ácido cisteico, que tiene un enlace O-H más polarizado, puede formar enlaces de hidrógeno más fuertes que el R-G-Ácido aspártico, que tiene un enlace O-H relativamente menos polarizado, con los grupos amida y/o las cadenas laterales de los aminoácidos de las proteínas en el sitio de unión a integrina y/o tienen interacciones más fuertes con los iones metálicos complejados en el sitio de unión a integrina. Por lo tanto, los nuevos péptidos de RG Ácido cisteico y sus derivados de la presente invención presentan compuestos y composiciones mejoradas sobre los péptidos RGD correspondientes en el reconocimiento y la unión al receptor de integrina.
Adicionalmente, en los pacientes diabéticos con hiperglucemia crónica asociada con IOP elevada, se informa que el glaucoma de ángulo abierto se relaciona particularmente con la acumulación de fibronectina en el tejido de malla trabecular y se cree que el exceso de fibronectina inhibe el flujo de salida acuoso (ver Oshitari, T y otros, Am. J.
Ophthalmol. (2007) 143:363-365). La participación de la fibronectina en la interacción célula-ECM en la malla trabecular se indicó en el glaucoma primario de ángulo abierto (ver Mark S. Filla y otros, Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. (2002) 43:151-161; y Cheryl R. Hann y otros, Ophthalmic Res. (2001) 33: 314-324). También se ha informado que las células endoteliales del canal de Schlemm interactúan con la matriz extracelular para influir en la facilidad del flujo de salida (ver Cindy K. Bahler y otros, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2004) 45: 2246- 2254). A la luz de la inhibición del flujo de salida acuoso por la presencia de un exceso de los componentes de la matriz extracelular como la fibronectina, la aplicación de los péptidos de RG Ácido cisteico y sus derivados para tratar la IOP elevada de los pacientes diabéticos sería altamente beneficiosa para los pacientes diabéticos.
Los péptidos de RG Ácido cisteico preferidos pueden ser un polipéptido de fusión, un polipéptido cíclico o lineal, un polipéptido derivatizado, que incluye el péptido de RG Ácido cisteico derivatizado o asociado o acoplado con sistemas de administración de fármacos u otros fármacos, tales como, por ejemplo, fármacos contra el cáncer, un péptido de RG Ácido cisteico multimerizado, un anticuerpo monoclonal que contiene la secuencia de RG Ácido cisteico que inmunorreacciona con el sitio de unión de integrinas o el fragmento funcional de este.
Los polipéptidos que contienen RG Ácido cisteico pueden tener una secuencia correspondiente a la secuencia de residuos de aminoácidos de la región de unión adhesiva de la integrina natural, tal como los presentes en el fibrinógeno, la fibronectina, la vitronectina, el factor de von Willebrand, la laminina, la trombospondina y los ligandos similares.
La presente secuencia peptídica consta de tres aminoácidos que tienen grupos guanidino, sulfónicos y carboxílicos terminales y sus derivados acoplados y/o asociados con sistemas de administración de fármacos, que incluyen fragmentos de péptidos, glicoproteínas y grupos de polímeros como PEG, Pluronic y otros grupos de polímeros, y liposomas y nanopartículas. Las composiciones farmacéuticas que las comprenden para el tratamiento de diversos trastornos patológicos incluyen formas de dosificación inyectables, en gel, en suspensión, ungüentos, sólidas y líquidas.
Los receptores de integrina asociados con un motivo de adhesión celular como la fibronectina, la vitronectina, la laminina, el fibrinógeno, la trombospondina y el factor de von Willebrand, son el epítopo diana del péptido de RG Ácido cisteico y sus derivados. El tripéptido, RG Ácido cisteico, se ha descubierto como una secuencia de aminoácidos mínima reconocible por los dominios de unión celular. Esta secuencia también puede interferir con funciones inmunitarias no relacionadas con las integrinas. Por lo tanto, se ha descubierto que la secuencia de RG Ácido cisteico sintético es para imitar el dominio de unión celular RGD, y una sustitución en el a-carbono del ácido aspártico proporciona una afinidad de unión más fuerte a las integrinas diana. Los ácidos sulfónicos en los péptidos de RG Ácido cisteico son ácidos más fuertes que los ácidos carboxílicos correspondientes en los péptidos RDG. Esta mayor polaridad del grupo ácido sulfónico conduce a un enlace intermolecular más fuerte. Por ejemplo, el R-G-Ácido cisteico, que tiene un enlace O-H más polarizado, puede formar enlaces de hidrógeno más fuertes que el R-G-Ácido aspártico, que tiene un enlace O-H relativamente menos polarizado, con los grupos amida y/o las cadenas laterales de los aminoácidos en el sitio de unión a integrina y/o tienen interacciones más fuertes con los iones metálicos complejados en el sitio de unión a integrina.
En la presente descripción se describen las secuencias de RG Ácido cisteico como sigue:
Fórmula A:
Figure imgf000011_0001
Donde X= -CH(Ri)-S(=O)2-Y;
-CH(R-i)-SH;
-CH(R-i)-OZ;
-CH(R-,)S(=O)Y;
-CH(R1)-O-S(=O)2-OX-i ; y
-CH(R1)-O-P(=O)2-OX-i ; y
En donde Y = OXi, NH2; Xi = -H, alquilo de cadena lineal C1-C6, fenilo; Ri = H, alquilo de cadena lineal Ci-Ce, fenilo o SO3H Z = H, SO3H
Fórmula B:
Figure imgf000012_0001
Donde X = -CH(Ri)-S(O)2-Y;
-CH(Ri)-SH;
-CH(Ri)-OZ;
-GH(Ri)S(=O)Y;
-CH(Ri)-O-S(=O)-OXi; y
-CH(Ri)-O-P(=O)-OXi; y
En donde Y = OXi, NH2; Xi = -H, alquilo de cadena lineal CiC6, fenilo;
Ri = H, alquilo de cadena lineal C1-C6, fenilo o SO3H
Z = H, SO3H; y
A2 se selecciona de: -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe-Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val, o la sal o el derivado N-alquilado de este. Se puede usar cualquier combinación de la forma D o la forma L de Arg, Gly, Cisteico, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr, así como también la forma cíclica de la secuencia anterior.
Los ejemplos de las formas cíclicas incluyen:
Fórmula C:
Figure imgf000012_0002
donde X' se selecciona de: H, alquilo Ci - Ce, Ph, SO3H; Y = OH, NH2 y Z = H, CH3.
Las formas cíclicas también incluyen los péptidos penta y hepta, como por ejemplo un compuesto específico de la Fórmula general C, específicamente, el Compuesto 2 (RG Ácido cisteico cíclico fN(CH3)V), se muestra a continuación:
i2
Figure imgf000013_0001
La Fórmula A abarca las Fórmulas generales l-VI descritas en otra parte en la presente descripción. La Fórmula B abarca la Fórmula general VII descrita en otra parte en la presente descripción.
Fórmula D:
A1 —Arg—Gly— NH—CH(X)—CO—A2
Donde X = -CH(R-,)-S(=O)2-Y;
-CH(R-i)-SH;
-CH(R-i)-OZ;
-CH(R-,)S(=O)Y;
-CH(R1)-O-S(=O)2-OX1; y-CH(R1)-O-P(=O)2-OX1; y
En donde Y = OX1, NH2; X1 = -H, alquilo de cadena lineal C1-C6, fenilo;
R1 = H, alquilo de cadena lineal C1-C6, fenilo o SO3H
Z = H, SOgH; y
A1 y A2 se seleccionan de: -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe- Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val, o la sal o el derivado N-alquilado de estos. Se puede usar cualquier combinación de la forma D o la forma L de Arg, Gly, Cisteico, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr, así como también la forma cíclica de la secuencia anterior.
Las secuencias del RG Ácido cisteico sustituidas incluyen los análogos cíclicos del RG Ácido cisteico.
La aplicación del RG Ácido cisteico y sus derivados puede realizarse por vía subcutánea, dermatológica, oftálmica y sistémica, mediante el empleo de un sistema de administración de fármacos o cualquier forma de dosificación farmacéuticamente aceptable de inyección o formulación sólida o de ungüento.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía que sea adecuada para lograr el efecto terapéutico pretendido, que incluye pero no se limita a: oral, rectal, intravenoso, intraarterial, intradérmico, subcutáneo, intramuscular, intratecal, sublingual, bucal, intranasal, transmucoso, transdérmico, tópico, intraocular, intravítreo, otra enteral, otra parenteral y/u otras vías posibles de administración.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse a cualquier dosificación que proporcione el efecto terapéutico pretendido mientras se evitan efectos adversos o tóxicos. Las dosis típicas a las que los compuestos de la presente invención pueden administrarse a sujetos humanos están en el intervalo de aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1,0 g/kg.
Cuando sea posible y apropiado, los compuestos de la presente invención pueden prepararse opcionalmente en forma de liposomas o nanopartículas (por ejemplo, nanocápsulas). La formación y el uso de los liposomas es generalmente conocida por los expertos en la técnica. Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos dispersos en un medio acuoso, de modo que forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilamelares, a veces denominadas vesículas multilamelares (MLV). Las MLV son típicamente de 25 nm a 4 pl de diámetro. Cuando se sonican, las MLV forman pequeñas vesículas unilamelares (SUV) de aproximadamente 200 a 500 angstroms en diámetros que tienen núcleos que contienen la solución acuosa. En general, cuando se dispersan en un medio acuoso, los fosfolípidos pueden formar diversas estructuras distintas de los liposomas, dependiendo de la relación molar de lípido a agua. Los liposomas se formarán a bajas relaciones molares de lípido a agua. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la tonicidad y la presencia o no de cationes divalentes. Los liposomas pueden interactuar con las células mediante diferentes mecanismos, que incluyen 1) endocitosis (por ejemplo, fagocitosis del liposoma por células tales como los macrófagos y los neutrófilos), adsorción a la superficie celular, 2) interacción con los componentes de la superficie celular, 3) fusión con la membrana celular plasmática mediante la inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática o 4) transferencia de los lípidos del liposoma a las membranas celulares o subcelulares, o viceversa. La variación de la formulación de los liposomas puede alterar los mecanismos mediante los cuales los liposomas interactuarán con las células en el seno paranasal, la mucosa nasal, etc.
Una nanocápsula es cualquier nanopartícula que consiste en un caparazón y un espacio en el que pueden colocarse las sustancias deseadas. Las técnicas para formar las nanocápsulas son conocidas en la técnica. Las nanocápsulas poliméricas pueden fabricarse de tamaños y formas específicas. Pueden producirse como partículas monodispersas que tienen propiedades físicas y químicas definidas con precisión y, por lo tanto, pueden adaptarse para facilitar la liberación de la sustancia terapéutica o de diagnóstico en respuesta a los mecanismos desencadenantes bimoleculares particulares, como el pH, el flujo mucoso u otras condiciones presentes dentro del seno paranasal u otra área en el oído, nariz o garganta donde se implanta el dispositivo. Las nanocápsulas pueden usarse en la presente invención como “fármacos inteligentes” que tienen receptores químicos específicos o sitios de unión que se unirán a células diana específicas (por ejemplo, células cancerosas o células asociadas con afecciones inflamatorias.
Los siguientes son ejemplos no limitantes de formulaciones para preparaciones farmacéuticas que contienen los compuestos de la presente invención. También se incluyen los ejemplos de la seguridad y/o la eficacia demostrada mediante el uso de péptidos de RG Ácido cisteico ilustrativos o los derivados para inhibir la adhesión celular. Como puede usarse en la presente descripción, los términos “péptido de RG Ácido cisteico”, “péptido de RGÁcido cisteico”, “RGC” y “péptido de RGCys” y “compuestos de la presente invención” significarán sinónimamente las composiciones que contienen la secuencia R-G-Ácido cisteico y sus derivados, que incluyen, pero no se limitan a los definidos por las reivindicaciones.
Métodos para la terapia dirigida al receptor de intearina para el tratamiento de las enfermedades oculares
Entre los numerosos usos terapéuticos potenciales de las composiciones de la presente invención se incluye el tratamiento de ciertos trastornos del ojo caracterizados por una vascularización excesiva de la retina (en la presente descripción generalmente denominada “enfermedad ocular neovascular”). Los siguientes ejemplos no limitantes discuten los usos de las composiciones de la presente invención
solo, y en combinación con otros agentes, para tratar tales trastornos oculares neovasculares.
Si se usa en esta solicitud de patente y cuando se usa, las siguientes siglas y abreviaturas tendrán los siguientes significados:
AE Eventos adversos
Allegro Allegro Ophthalmics, LLC
AMD Degeneración macular relacionada con la edad
BCVA Mejor agudeza visual corregida
CNV Neovascularización Coroidea
CRA Asociado de investigación clínica
DME Edema macular diabético
DR Retinopatía diabética
AMD seca Degeneración macular relacionada con la edad seca
ERG Electrorretinografía
ETDRS Estudio de tratamiento temprano de la retinopatía diabética
FDA Agencia de Alimentos y Medicamentos
GCP Buena práctica clínica
IOP Presión intraocular/Tonometría
IRB Junta de Revisión Institucional
OCT Tomografía de coherencia óptica
OD Ojo derecho
OS Ojo izquierdo
PI Investigador principal
PDR Retinopatía diabética proliferativa
PVD Desprendimiento del vítreo posterior
RVO Oclusión venosa retiniana
SAE Evento adverso grave
SC Coordinador de estudio
USP Farmacopea de los Estados Unidos
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
AMD húmeda Degeneración macular relacionada con la edad húmeda
La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es la principal causa de ceguera en el mundo occidental, y los pacientes con esta afección sufren daños irreversibles en la mácula o la parte central de la retina. La AMD seca provoca una pérdida visual lentamente progresiva, mientras que la AMD húmeda puede conducir a un rápido deterioro de la visión central. La AMD húmeda provoca la gran mayoría de la pérdida grave de la visión en los pacientes afectados, pero ambas formas representan una preocupación importante de salud pública en el siglo 21. Aproximadamente 1,5 millones de estadounidenses tienen neovascularización coroidea (CNV) secundaria a AMD, y cada año se desarrollan 200 000 casos nuevos. Se ha documentado que la prevalencia, la incidencia y las tasas de progresión de la AMD aumentan con la edad. En los Estados Unidos, las personas mayores de 65 años constituyen uno de los segmentos más grandes de la población, y se prevé que esta categoría demográfica aumente sustancialmente en las próximas décadas. Se espera que la población mayor de 85 años en los Estados Unidos se duplique para el 2020. Por lo tanto, la AMD representa un importante problema de salud pública para los Estados Unidos. En particular, la AMD húmeda es el factor más significativo que provoca una visión deficiente en los pacientes con la AMD. La AMD húmeda se caracteriza por la angiogénesis coroidea, es decir, el desarrollo de vasos sanguíneos anormales debajo de la retina. Estos vasos pierden líquido, sangran y se transforman en tejido cicatricial fibrovascular. Este proceso interrumpe los fotorreceptores suprayacentes y provoca una pérdida visual grave. Hay buena evidencia de que la disminución de la perfusión coroidea conduce a la disfunción epitelial del pigmento retiniano (RPE) y a la pérdida de los fotorreceptores en la AMD. El edema macular diabético (DME) es el resultado del engrosamiento de la parte central de la retina debido al daño de los capilares retinianos por la diabetes. El DME es la principal causa de ceguera en la población en edad laboral, y también provoca deficiencia visual de leve a moderada en esta población, así como también en las personas que ya no pueden trabajar. La aplicación de láser a los capilares dañados dentro de la retina engrosada ha sido el pilar del tratamiento durante más de 25 años. Los resultados recientes de la Red de Investigación Clínica de la Retinopatía Diabética demostraron que en los ojos con agudeza visual reducida por el DME que involucra el centro de la mácula, la terapia anti-VEGF con Lucentis en combinación con láser focal/de cuadrícula proporciona resultados de visión superiores y un perfil de seguridad aceptable en comparación con el tratamiento estándar previo de láser solo. Los eventos moleculares implicados en el desarrollo de la neovascularización coroidea y prerretiniana no se han dilucidado completamente; sin embargo, se ha demostrado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) desempeña un papel importante en el proceso. Las integrinas a5p1, avp3 y avp5 también participan en el proceso angiogénico, y se sabe que se expresan en el tejido ocular neovascular de los pacientes con AMD húmeda y PDR. También hay una serie de otras moléculas que juegan papeles importantes: bFGF, IL-8, PDGF, diversas proteasas, que incluyen el activador de plasminógeno y las metaloproteinasas de matriz, las quimiocinas y otros mediadores inflamatorios. La proliferación de células endoteliales, el aumento de la permeabilidad vascular, la inflamación y la producción excesiva del VEGF son algunos de los principales desarrollos patológicos en la AMD húmeda y el DME.
La presente invención proporciona una nueva clase de fármacos terapéuticos para las enfermedades vasculares retinianas, que incluyen el DME. Los compuestos de la presente invención tienen múltiples mecanismos de acción contra las enfermedades vasculares retinianas, que incluyen a) provocar la antiangiogénesis mediante la inhibición directa de la producción del VEGF, b) provocar la inhibición del receptor de VEGF-2, c) provocar una disminución de la regulación o la inhibición de la tirosina quinasa y d) provocar la licuefacción del cuerpo vítreo y el desprendimiento del vítreo posterior, permitiendo de esta manera la difusión del VEGF fuera del ojo. Los mecanismos de acción pueden emplearse solos (por ejemplo, por la terapia mediante el uso solo del compuesto o los compuestos de la presente invención) o pueden ser de inhibición aditiva o complementaria del VEGF existente (por ejemplo, por la terapia de combinación mediante el uso del compuesto o los compuestos de la presente invención en combinación con una composición que se une, atrapa, elimina o de cualquier otra manera disuade el efecto del VEGF que ya se ha producido, ejemplos de los cuales incluyen, pero no necesariamente se limitan a: Avastin, Lucentis y/o Eylea). El Avastin (bevacizumab) es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. El Lucentis (ranibizumab) es un fragmento de anticuerpo monoclonal isotipo lgG1 kappa humanizado recombinante. El Eylea (aflibercept) es una proteína de fusión recombinante que consiste en porciones de los receptores 1 y 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano.
Al disminuir la producción del VEGF en lugar de secuestrar el suministro del VEGF preexistente, los compuestos de la presente invención tienen mecanismos de acción únicos que permiten la intervención mucho antes en la cascada angiogénica en comparación con el tratamiento de referencia actual. Esto se ilustra esquemáticamente en la Figura 6. Además de trabajar en una etapa mucho más temprana de la cascada angiogénica, los compuestos de la presente invención se unen a múltiples subunidades de la integrina, a diferencia de los enfoques de los anticuerpos monoclonales que son 500 veces más grandes y específicos para una sola subunidad de la integrina como se muestra en la Figura 7A. Por el contrario, un oligopéptido es capaz de unirse de manera mucho más efectiva a múltiples subunidades de la integrina involucradas en la angiogénesis, como se muestra en la Figura 7B.
Los compuestos de la presente invención pueden usarse para tratar el edema macular diabético (DME). Los tratamientos farmacéuticos disponibles actualmente para este trastorno incluyen ciertos fármacos que se unen, atrapan, eliminan, o de cualquier otra manera, disuaden el efecto del VEGF que ya se ha producido (denominado en general en la presente descripción trampas de VEGF). Los ejemplos disponibles comercialmente de tales “trampas de VEGF” incluyen el bevacizumab (Avastin), el ranibizumab (Lucentis) y el aflibercept (Eylea). El bevacizumab se describe como un anticuerpo monoclonal anti-VEGF. El ranibizumab se describe como un fragmento de anticuerpo monoclonal isotipo lgG1 kappa humanizado recombinante. El aflibercept se describe como una proteína de fusión recombinante que consiste en porciones de los receptores 1 y 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) humano. Estos tratamientos basados en anticuerpos anti-VEGF típicamente se administran mediante inyecciones intravítreas repetidas, a intervalos de 4 a 6 semanas, potencialmente de manera indefinida, y con un inconveniente sustancial, costo y riesgo acumulativo de infección.
A diferencia de las trampas de VEGF existentes, las composiciones de la presente invención tienen múltiples mecanismos de acción contra las enfermedades oculares neovasculares, específicamente: antiangiogénesis mediante la inhibición directa de la producción del VEGF,
la inhibición del receptor de VEGF-2, la regulación negativa de la tirosina quinasa y la inducción de la licuefacción vítrea y el desprendimiento del vítreo posterior (que facilita la difusión del VEGF u otras entidades nocivas fuera de la retina y fuera del ojo). Algunos de los ejemplos expuestos a continuación describen los usos del Compuesto 1 solo y en combinación con otros agentes (trampas de VEGF) en el tratamiento de las enfermedades oculares neovasculares.
También se describen en la presente descripción las composiciones que pueden usarse para tratar varios otros trastornos oculares que provocan o no la neovascularización retiniana. Los ejemplos de trastornos oculares que pueden tratarse mediante las composiciones descritas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan necesariamente a, la degeneración macular relacionada con la edad húmeda, la retinopatía diabética proliferativa o no proliferativa, la licuefacción del humor vítreo, la inducción del desprendimiento de vítreo-retina posterior (PVD), la patogénesis de enfermedades vitreorretinianas, tales como el agujero macular idiopático, la tracción vitreomacular, la degeneración macular relacionada con la edad, la neovascularización coroidea, la cirugía vitreorretiniana, la oclusión venosa, la neovascularización corneal, el nervio óptico isquémico, la rubeosis iridis y la prevención de la formación de cicatrices en la cirugía del glaucoma.
Formulaciones farmacéuticas
Los siguientes son ejemplos de las formulaciones farmacéuticas l-X, que contienen los péptidos de R-G-Ácido cisteico de la presente invención, tales como cualquiera de los definidos por las Fórmulas generales l-VII o cualquiera de los Compuestos 1-5 como se describe en la presente descripción.
Formulación I
Péptido de R-G-Ácido cisteico (péptido RGCys) 0,0001 mg a 10 g
NaCl 0,01 mg a 0,9 g
Agua CS hasta 100,0 ml
Formulación II
Péptido de RG Ácido cisteico (péptido RGCys) 0,0001 mg a 10 g
EDTA 0,001 mg a 100 mg
NaCl 0,01 mg a 0,9 g
Agua CS hasta 100,0 ml
Formulación III
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g
EDTA 0,001 mg a 100 mg
NaCl 0,01 mg a 0,9 g
Ácido cítrico 0,0001 mg a 500 mg
Agua CS hasta 100,0 ml
Formulación V
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g
EDTA 0,001 mg a 100 mg
NaCl 0,01 mg a 0,9 g
Amortiguador fosfato a pH = 3,0 -9 ,0
Agua CS hasta 100,0 ml Formulación VI
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g NaCI 0,01 mg a 0,9 g Amortiguador borato a pH = 3,0 -9 ,0 Agua CS hasta 100,0 ml Formulación VII
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g Ácido hialurónico sal de sodio 0,01 a 10 % Ácido bórico 0,01 a 1,0 % Polietilenglicol (PEG 8000) 0,01 a 10 % Cloruro de sodio 0,10 a 0,9 % Cloruro de potasio 0,01 a 0,20 % Dihidrato de cloruro de calcio 0,001 a 0,05 % Hexahidrato de cloruro de magnesio 0,01 a 0,20 % Conservante
pH
Figure imgf000017_0001
Agua CS hasta 100,0 ml Formulación VIII
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g Ácido hialurónico sal de sodio 0,01 a 10 % Carboximetil celulosa 0,01 a 10 % Ácido bórico 0,01 a 1,0 % Polietilenglicol (PEG 8000) 0,01 a 10 % Cloruro de sodio 0,10 a 0,9 % Cloruro de potasio 0,01 a 0,20 % Dihidrato de cloruro de calcio 0,001 a 0,05 % Hexahidrato de cloruro de magnesio 0,01 a 0,20 % Conservante
pH
Agua CS hasta 100,0 ml Formulación IX
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g Ácido hialurónico sal de sodio 0,01 a 10 % Alginato de sodio 0,01 a 10 % Ácido bórico 0,01 a 1,0 % Polietilenglicol (PEG 8000) 0,01 a 10 % Cloruro de sodio 0,10 a 0,9 % Cloruro de potasio 0,01 a 0,20 % Dihidrato de cloruro de calcio 0,001 a 0,05 % Hexahidrato de cloruro de magnesio 0,01 a 0,20 % Conservante
pH 3,0 -8 ,0 Agua CS hasta 100,0 ml Formulación X
Péptido de RGCisteico 0,0001 mg a 10 g Ácido hialurónico sal de sodio 0,01 a 10 %
Ácido algínico 0,01 a 10 %
Ácido bórico 0,01 a 1,0 %
Polietilenglicol (PEG 8000) 0,01 a 10 %
Cloruro de sodio 0,10 a 0,9 %
Cloruro de potasio 0,01 a 0,20 %
Dihidrato de cloruro de calcio 0,001 a 0,05 %
Hexahidrato de cloruro de magnesio 0,01 a 0,20 %
Conservante
pH 3,0 -8 ,0
Agua CS hasta 100,0 ml
Comparación de los efectos inductores en el PVD de los péptidos RGD y alicil-arainil-alicil-cisteico-treonilprolina-COOH (GRG AcidoCisteico TP;
Compuesto 1) en conejos
En este ejemplo, se compararon los efectos inductores en el PVD de los péptidos RGD y glicil-arginil-glicil-cisteicotreonil-prolina-COOH (péptido de RG Ácido cisteico; GRG Ácido Cisteico TP; Compuesto 1) en conejos. El protocolo para este estudio fue como sigue:
Protocolo:
Modelo animal
a) 20 conejos machos y hembras
b) Con un peso aproximado de 1,5 - 2,5 kg.
c) Divididos en 2 grupos
i) Se inyectaron 10 conejos intravítreamente con solución de RGD al 2,5 % a pH = 6,5
a) 10 ojos derechos se inyectaron con solución de RGD al 2,5 %
b) 5 ojos izquierdos se usaron como control de BSS
c) 5 ojos izquierdos se inyectaron con RGD al 2,5 % EDTA al 0,02 % a pH = 6,5
ii) 10 conejos se inyectaron intravítreamente con solución de RGCisteico al 2,5 % a pH = 6,5
a) 10 ojos derechos se inyectaron con solución de RGCisteico al 2,5 % a pH = 6,5
b) 10 ojos izquierdos se inyectaron con solución de RGCisteico al 2,5 % EDTA al 0,02 % a pH = 6,5 Productos químicos activos
d) EDTA sódico - 99,0 - 100,5 % de Spectrum Chemical Corp.
e) RG Ácido cisteico - proveedor de cGMP (Pureza > 98 %).
f) RGD - proveedor de cGMP (Pureza > 98 %).
g) Solución de BSS
Tanto RG Ácido cisteico, RGD, RG Ácido cisteico EDTA sódico, RGD EDTA sódico y las soluciones de BSS se inyectaron en la cavidad vítrea 24 horas antes de la cirugía. Los conejos (10 mg/kg de peso corporal) se anestesiaron con una inyección intramuscular de 2,0 ml de una combinación 1:1 de xilazina (100 mg/ml) y clorhidrato de ketamina (100 mg/ml). Las pupilas se dilatan con clorhidrato de ciclopentolato tópico al 1 % y clorhidrato de fenilefrina al 10 %. Todos los animales se examinaron inicialmente con biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para excluir a cualquier animal con anomalías vitreorretinianas preexistentes. La inyección intravítrea de 0,1 cc se administró 2 mm por detrás del limbo en el cuadrante supranasal mediante el uso de una aguja de calibre 30 unida a una jeringa de 1,0 cc. Se debe tener cuidado para evitar daños a la lente o la retina.
Veinticuatro horas después de la inyección e inmediatamente antes del inicio de una vitrectomía mecánica, se realizó una ecografía de barrido B para determinar el estado del vítreo posterior y también la licuefacción del vítreo. Se realizó una vitrectomía pars plana de dos puertos mediante el uso de una fibra óptica de infusión y un cortador vítreo conectado a una unidad de vitrectomía. Después de una vitrectomía central de 30 segundos, el cortador vítreo se dirigió a la superficie retiniana peripapilar donde, mediante el uso de baja aspiración (<30 mmHg), se intentó una separación del vítreo cortical posterior de la superficie retiniana en 4 cuadrantes. Las esclerotomías se suturaron y se realizó una ecografía de barrido B postoperatoria para determinar la presencia y la extensión de cualquier PVD presente en cada cuadrante. Los animales se sacrificaron con inyecciones intracardiacas de pentobarbital sódico y los ojos se enuclearon inmediatamente.
La clasificación de la licuefacción del vítreo y el PVD se calificó siguiendo este sistema de clasificación para evaluar la extensión del PVD según el examen de la ecografía de barrido B postoperatoria;
Grado 0. a) No se observa desprendimiento del vítreo posterior.
b) Licuefacción vítrea
Grado 1, a) Consiste en ojos en los que el vítreo se separa en 2 o menos cuadrantes.
b) Licuefacción vítrea
Grado 2. a) Consiste en ojos en los que el vítreo se separa en 3 o más cuadrantes, pero con uniones focales restantes a lo largo de los rayos medulares
b) Licuefacción vítrea
Grado 3. a) Consiste en ojos en los que el vítreo se separa totalmente de la superficie retiniana
b) Licuefacción vítrea
Todos los ojos experimentaron una penetración de cuchilla afilada en el polo superior subadyacente a la pars plana inmediatamente después de enuclearse para asegurar una rápida penetración del fijador. Se tuvo cuidado para evitar daños a la retina y al lente adyacentes. Los ojos se sumergieron en paraformaldehído al 2 % más glutaraldehído al 2,5 % durante un mínimo de 24 horas a 4 grados centígrados. Se retiró una calota posterior única, se deshidrató en metanol y se secó en dióxido de carbono hasta el punto crítico, se recubrió con pulverización catódica en oro y se fotografió mediante el uso del microscopio electrónico de barrido.
Resultados:
Inyección: RG Acido cisteico al 2,5 %
Grupo 1. Al inicio del estudio ningún animal tenía PVD en ambos ojos
Figure imgf000019_0002
Inyección: RGD al 2,5 %
Grupo 2. Al inicio del estudio ningún animal tenía PVD en ambos ojos
Figure imgf000019_0001
Inyección: RG Acido cisteico al 2,5 % NaEDTA al 0,02 %
Grupo 3. Al inicio del estudio ningún animal tenía PVD en ambos ojos
Figure imgf000020_0001
Inyección: RGD al 2,5 % NaEDTA al 0,02 %
Grupo 4. Al inicio del estudio ningún animal tenía PVD en ambos ojos
Figure imgf000020_0002
Los resultados de este estudio muestran que RGD y RG Ácido cisteico (GRG Ácido cisteico TP; Compuesto 1) tienen propiedades similares y la inyección de RG Ácido cisteico al 2,5 % intravítreamente provoca la separación completa del vítreo de la retina en 24 horas, y además los vítreos de los conejos con RGD y RG Ácido cisteico se licuaron completamente.
Sobre todo, la actividad de RG Ácido cisteico es igual o ligeramente mejor que la de RGD para inducir el PVD completo en los conejos y licuar el vítreo. Esto posiblemente se deba a su mayor capacidad de unión competitiva a los sitios de unión de las interacciones integrina-matriz extracelular que RGD. Como se describe en otra parte en la presente descripción, los ácidos sulfónicos son ácidos más fuertes que los ácidos carboxílicos correspondientes. Esta mayor polaridad del grupo ácido sulfónico conduce a un enlace intermolecular más fuerte. Por ejemplo, el R-G-Ácido cisteico, que tiene un enlace O-H más polarizado, puede formar enlaces de hidrógeno más fuertes que el R-G-Ácido aspártico, que tiene un enlace O-H relativamente menos polarizado, con los grupos amida y/o las cadenas laterales de los aminoácidos en el sitio de unión a integrina y/o tienen interacciones más fuertes con iones metálicos complejados en el sitio de unión a integrina.
Los resultados también indican que cuando estos compuestos se administran con edetato de sodio al 0,02 %, la actividad de RGD y de RG Ácido cisteico no se altera.
Los resultados también muestran que no hubo efectos adversos o efectos adversos para la seguridad de la inyección intravítrea del compuesto de RG Ácido cisteico, Compuesto 1, o el compuesto RGD.
Estudio de seguridad de las inyecciones múltiples del péptido de RGÁcido cisteico, Compuesto 1 (GRG Ácido cisteico TP), en ojos de conejo
En este ejemplo, múltiples inyecciones del péptido RGÁcido cisteico, Compuesto 1, se administraron a los ojos de 5 conejos machos y 4 hembras de Nueva Zelanda que pesaban aproximadamente 1,5 - 2,5 kg y los ojos se examinaron como se describe en los siguientes párrafos.
El protocolo del estudio fue como sigue:
A) Exámenes de referencia: Al inicio, los ojos derecho e izquierdo de los 9 conejos se examinaron con biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para confirmar que ningún animal tenía anomalías vitreorretinianas preexistentes. Además, se realizaron ecografías de barrido p, así como exploraciones ERG en los ojos izquierdo y derecho de los 9 animales para obtener lecturas de referencia.
B) Tratamientos experimentales: Los 9 conejos recibieron inyecciones
intravítreas de solución o solución salina (control). Las soluciones de tratamiento
se prepararon de la siguiente manera:
Solución de RGÁcido cisteico: una solución de 2,5 mg/100 |jl de RGÁcido cisteico (Compuesto 1) que contiene 0,02 mg de EDTA disódico 0,80 mg de cloruro de sodio y agua estéril USP para inyección con un pH ajustado a 6,5.
Solución salina (control): una solución salina estéril isotónica USP que tiene un pH ajustado de 6,5.
La dosificación se realizó de la siguiente manera:
1) Se inyectó intravítreamente el ojo derecho de cada uno de los 9 conejos con 100 de la solución de RGÁcido cisteico 2,5 mg/100 j l (administración de una dosis = 2,5 mg del Compuesto 1)
2) El ojo izquierdo de cada uno de los 9 conejos se inyectó intravítreamente con 100jL de la solución salina (control).
3) Un día después de las inyecciones intravítreas iniciales, se examinaron los ojos derecho e izquierdo de los 9 conejos, mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para verificar si alguno de los conejos tenía algún efecto adverso por la inyección.
4) En el 7mo día después de las 1eras inyecciones, los ojos derecho e izquierdo de los 9 conejos se examinaron nuevamente mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para determinar si alguno de los conejos mostraba efectos adversos por la inyección. Además, se realizó una exploración ERG en todos los ojos derechos e izquierdos de todos los animales para determinar si había algún cambio desde el inicio
5) Luego se seleccionó al azar un grupo de 3 conejos, los números 901, 904 y 909, y se realizó la vitrectomía mecánica en los ojos derecho e izquierdo de esos 3 animales seleccionados para determinar el estado del vítreo posterior.
6) Los 3 animales seleccionados al azar, los números 901, 904 y 909, se sacrificaron con inyecciones intracardiacas de pentobarbital sódico, y los ojos se enuclearon inmediatamente. Todos los ojos experimentaron una penetración de cuchilla afilada en el polo superior subadyacente a la pars plana inmediatamente después de la enucleación para asegurar una rápida penetración del fijador. Se tuvo cuidado para evitar daños a la retina y al lente adyacentes. Los ojos se sumergieron en paraformaldehído al 2 % más gluteraldehído al 2,5 % durante un mínimo de 24 horas a 4 grados centígrados. Se retiró una calota posterior única, se deshidrató en metanol y se secó en dióxido de carbono hasta el punto crítico, se recubrió con pulverización catódica en oro y se fotografió mediante el uso del microscopio electrónico de barrido. Las otras muestras se sometieron a examen histopatológico.
Los 6 conejos restantes, los números 902, 903, 905, 906, 907 y 908, se inyectaron por segunda vez 7 días después de la primera inyección.
1) El ojo derecho de cada uno de los 6 conejos restantes se inyectó intravítreamente de nuevo con 100 de la solución de RGÁcido cisteico de 2,5 mg/100 j l (administración de una segunda dosis de 2,5 mg del Compuesto 1).
2) El ojo izquierdo de cada uno de los 6 conejos restantes se inyectó intravítreamente de nuevo con 100 j l de solución salina (control).
3) Un día después de las 2das inyecciones intravítreas, los ojos derecho e izquierdo de los 6 conejos restantes se examinaron mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para verificar si alguno de los conejos tenía algún efecto adverso por la inyección.
4) En el 7mo día después de las 2das inyecciones, se examinaron los ojos derecho e izquierdo de los 6 conejos restantes, mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para verificar cualquier efecto adverso por las inyecciones. Además, se realizaron exploraciones ERG de los ojos izquierdo y derecho de todos los animales para determinar si había algún cambio con respecto a la referencia.
5) Tres conejos, los números 902, 903 y 907, se seleccionaron al azar de los 6 animales restantes y se realizó la vitrectomía mecánica en los ojos derecho e izquierdo de esos 3 animales seleccionados al azar para determinar el estado del vítreo posterior.
6) Los 3 animales seleccionados al azar, los números 902, 903 y 907, se sacrificaron con inyecciones intracardiacas de pentobarbital sódico, y los ojos se enuclearon inmediatamente. Todos los ojos se sometieron a una penetración de cuchilla afilada en el polo superior subyacente a la pars plana inmediatamente después de la enucleación para asegurar una rápida penetración del fijador. Se tuvo cuidado para evitar daños a la retina y al lente adyacentes. Los ojos se sumergieron en paraformaldehído al 2 % más gluteraldehído al 2,5 % durante un mínimo de 24 horas a 4 grados centígrados. Se retiró una calota posterior única, se deshidrató en metanol y se secó en dióxido de carbono hasta el punto crítico, se recubrió con pulverización catódica en oro y se fotografió mediante el uso del microscopio electrónico de barrido. Las otras muestras se sometieron a examen histopatológico.
El grupo restante de 3 conejos, los números 905, 906 y 908, se inyectaron por tercera vez, 14 días después de la primera inyección, de la siguiente manera:
1) El ojo derecho de cada uno de los 3 conejos restantes se inyectó intravítreamente de nuevo con 100 de la solución de RGÁcido cisteico de 2,5 mg/100 pl (administración de una tercera dosis de 2,5 mg del Compuesto 1) 2) El ojo izquierdo de cada uno de los 3 conejos restantes se inyectó intravítreamente de nuevo con 100pL de la solución salina (control).
3) Un día después de las 3eras inyecciones intravítreas, se examinaron los ojos derecho e izquierdo de los 6 conejos restantes, mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para verificar si alguno de los conejos tenía algún efecto adverso por la inyección.
4) En el 7mo día después de las 3eras inyecciones, los ojos derecho e izquierdo de los 3 conejos restantes se examinaron nuevamente mediante biomicroscopía con lámpara de hendidura y oftalmoscopia indirecta para verificar cualquier efecto adverso por las inyecciones. Además, se realizaron exploraciones ERG de los ojos izquierdo y derecho de todos los animales para determinar si había algún cambio con respecto a la referencia.
5) Se realizó la vitrectomía mecánica en los ojos derecho e izquierdo de los 3 animales restantes (números 905, 906 y 908) para determinar el estado del vítreo posterior.
6) Los 3 animales restantes (números 905, 906 y 908) se sacrificaron con inyecciones intracardiacas de pentobarbital sódico y los ojos se enuclearon inmediatamente. Todos los ojos experimentaron una penetración de cuchilla afilada en el polo superior subadyacente a la pars plana inmediatamente después de la enucleación para asegurar una rápida penetración del fijador. Se tuvo cuidado para evitar daños a la retina y al lente adyacentes. Los ojos se sumergieron en paraformaldehído al 2 % más glutaraldehído al 2,5 % durante un mínimo de 24 horas a 4 grados centígrados. Se retiró una calota posterior única, se deshidrató en metanol y se secó en dióxido de carbono hasta el punto crítico, se recubrió con pulverización catódica en oro y se fotografió mediante el uso del microscopio electrónico de barrido. Las otras muestras se sometieron a examen histopatológico.
3) Productos químicos activos
Los productos químicos activos usados en este estudio fueron los siguientes:
a. EDTA disódico - 99,0 - 100,5 % de Spectrum Chemical Corp.
b. Péptido de RGÁcido cisteico (Compuesto 1)
c. Solución salina isotónica estéril USP
4) Formulaciones del estudio
a) Solución de RGÁcido cisteico: Solución de 2,5 mg/100 pl de RGÁcido cisteico que contiene 0,02 mg de EDTA disódico 0,80 mg de cloruro de sodio y agua estéril USP para inyección ajustada a un pH = 6,5. Filtrada estéril a través de un filtro de 0,22 p en un vial de 2,0 ml.
b) Solución salina (control): Solución salina estéril isotónica USP, pH ajustado a 6,5. Filtrada estéril a través de un filtro de 0,22 p en un vial estéril.
5) Anestesia para la preparación de las inyecciones
a. Inyección intramuscular de 2,0 ml de una combinación 1:1 de xilazina (100 mg/ml) y clorhidrato de ketamina (100 mg/ml)
b. Las pupilas se dilataron con clorhidrato de ciclopentolato tópico al 1 % y clorhidrato de fenilefrina al 10 %.
6) Preparación de la inyección intravítrea:
Se proporcionó un vial estéril que contenía la solución de RGÁcido cisteico que contenía 2,5 mg/100 pl y la solución salina estéril isotónica, pH ajustado a 6,5.
Antes de la inyección, el investigador confirmó que había 0,10 cc (100 microlitros) de solución en la jeringa de 1,0 cc.
7) Procedimiento de inyección:
Dado que las inyecciones intravítreas no dan como resultado un nivel de discapacidad visual suficiente para interrumpir la actividad diaria normal de los conejos, esto no se considera un procedimiento de supervivencia importante de acuerdo con la resolución animal de las pautas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología.
Tanto la solución de RGÁcido cisteico como las soluciones salinas estériles se inyectaron en la cavidad vítrea después que se completó el examen de referencia de la biomicroscopía con lámpara de hendidura, la oftalmoscopia y la ERG en los conejos. Los conejos (10 mg/kg de peso corporal) se anestesiaron con una inyección intramuscular de 2,0 ml de una combinación 1:1 de xilazina (100 mg/ml) y clorhidrato de ketamina (100 mg/ml). Las pupilas se dilataron con clorhidrato de ciclopentolato tópico al 1 % y clorhidrato de fenilefrina al 10 %.
Todos los animales se examinaron inicialmente con la biomicroscopía con lámpara de hendidura y la oftalmoscopia indirecta para excluir a cualquier animal con anomalías vitreorretinianas preexistentes. La inyección intravítrea de 0,1 cc se administró 2 mm por detrás del limbo en el cuadrante supranasal mediante el uso de una aguja de calibre 30 unida a una jeringa de 1,0 cc. Se tuvo cuidado para evitar daños a la lente o la retina.
Siete (7) días después de la inyección, se realizó una vitrectomía mecánica en los animales. Se realizó una vitrectomía pars plana de dos puertos mediante el uso de una fibra óptica de infusión y un cortador vítreo conectado a una unidad de vitrectomía. Después de una vitrectomía central de 30 segundos, el cortador vítreo se dirigió a la superficie retiniana peripapilar donde, mediante el uso de baja aspiración (<30 mmHg), se intentó una separación del vítreo cortical posterior de la superficie retiniana en 4 cuadrantes. Los animales se sacrificaron con inyecciones intracardiacas de pentobarbital sódico y los ojos se enuclearon inmediatamente.
Todos los ojos experimentaron una penetración de cuchilla afilada en el polo superior subadyacente a la pars plana inmediatamente después de la enucleación para asegurar una rápida penetración del fijador. Se tuvo cuidado para evitar daños a la retina y al lente adyacentes. Los ojos se sumergieron en paraformaldehído al 2 % más glutaraldehído al 2,5 % durante un mínimo de 24 horas a 4 grados centígrados. Se retiró una calota posterior única, se deshidrató en metanol y se secó en dióxido de carbono hasta el punto crítico, se recubrió con pulverización catódica en oro y se fotografió mediante el uso del microscopio electrónico de barrido.
Análisis de los resultados
Se analizaron los datos sobre la seguridad entre los ojos tratados con la solución de RGÁcido cisteico y la solución salina estéril mediante el uso de las siguientes técnicas:
i) Biomicroscopía con lámpara de hendidura;
ii) Oftalmoscopia;
iii) ERG;
iv) Histopatología; y
v) Microscopio electrónico.
Perfil de seguridad:
La primera administración intravítrea de 100 j l de la solución de RGÁcido cisteico al 2,5 % al grupo de nueve conejos, números 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909, no se asoció con ninguna toxicidad significativa en todos los puntos de tiempo. No hubo diferencias significativas en los efectos adversos informados entre el grupo con el RGÁcido cisteico al 2,5 % y el grupo con la solución salina isotónica. Esta falta de toxicidad se determinó mediante examen clínico, oftalmoscopia indirecta y ecografía de barrido b y vitrectomía mecánica.
La biomicroscopía con lámpara de hendidura se realizó en todas las visitas del estudio y se centró en los párpados, la conjuntiva y la esclera, la córnea, los cambios endoteliales, la reacción de la cámara anterior, el iris, el cristalino y la cápsula, así como también el vítreo anterior para detectar signos de inflamación que demuestran una falta casi completa de reacción inflamatoria a las inyecciones intravítreas de 100 j l de la solución de RGÁcido cisteico al 2,5 % y el grupo de la solución salina isotónica. En todos los puntos del estudio y en todos los grupos del estudio no parecía haber signos de toxicidad significativa inducida por los productos en prueba.
La evaluación clínica del segmento posterior también se siguió durante todo el estudio para garantizar que no hubiera toxicidad retiniana significativa presente. Se realizaron evaluaciones oftalmoscópicas indirectas y de fondo con lámpara de hendidura en cada punto de tiempo de la evaluación con atención específica a cualquier signo de toxicidad retiniana. El segmento posterior se evaluó para cualquier cambio en la densidad vitrea, la licuefacción vitrea, la fijación del vítreo y la posible hemorragia. La retina se evaluó para detectar cualquier signo de toxicidad de RPE, compromiso vascular retiniano, hemorragia retiniana, exudados, desgarros, roturas o desprendimientos de la retina. No hubo cambios en el RPE al inicio del tratamiento, en todos los puntos del estudio y en todos los grupos del estudio no parecía haber signos de cambios significativos en el segmento posterior inducidos por los productos en prueba. Es importante tener en cuenta que las exploraciones ERG realizadas en los nueve animales antes de las inyecciones intravítreas, así como también las exploraciones ERG realizadas en todos los animales 1 día y 7 días después de la inyección, no parecen provocar ningún signo de cambio significativo o toxicidad inducida por los productos en prueba.
La segunda administración intravítrea de 100 pl de la solución de RGÁcido cisteico al 2,5 % al grupo de seis conejos, los números 902, 903, 905, 906, 907, 908, no se asoció con ninguna toxicidad significativa en todos los puntos de tiempo. No hubo diferencias significativas en los efectos adversos informados entre el grupo con el RGÁcido cisteico al 2,5 % y el grupo con la solución salina isotónica. Esta falta de toxicidad se determinó mediante examen clínico, oftalmoscopia indirecta y ecografía de barrido p y vitrectomía mecánica.
La biomicroscopía con lámpara de hendidura se realizó en todas las visitas del estudio y se centró en los párpados, la conjuntiva y la esclera, la córnea, los cambios endoteliales, la reacción de la cámara anterior, el iris, el cristalino y la cápsula, así como también el vítreo anterior para detectar signos de inflamación que demuestran una falta casi completa de reacción inflamatoria a las inyecciones intravítreas de 100 pl de la solución de RGÁcido cisteico al 2,5 % y el grupo de la solución salina isotónica. En todos los puntos del estudio y en todos los grupos del estudio no parecía haber signos de toxicidad significativa inducida por los productos en prueba.
La evaluación clínica del segmento posterior también se siguió durante todo el estudio para garantizar que no hubiera toxicidad retiniana significativa presente. Se realizaron evaluaciones oftalmoscópicas indirectas y de fondo con lámpara de hendidura en cada punto de tiempo de la evaluación con atención específica a cualquier signo de toxicidad retiniana. El segmento posterior se evaluó para cualquier cambio en la densidad vítrea, la licuefacción vítrea, la fijación del vítreo y la posible hemorragia. La retina se evaluó para detectar cualquier signo de toxicidad de RPE, compromiso vascular retiniano, hemorragia retiniana, exudados, desgarros, roturas o desprendimientos de la retina. No hubo cambios en el RPE al inicio del estudio 7 días antes del segundo tratamiento, en todos los puntos del estudio y en todos los grupos del estudio no parecía haber signos de cambios significativos en el segmento posterior inducidos por los productos en prueba. Es importante tener en cuenta que las exploraciones ERG realizadas en los seis animales por segunda vez después de las inyecciones intravítreas, así como las exploraciones ERG realizadas en todos los animales 8 días y l4 días después de la inyección no parecían provocar ningún signo de cambio significativo o toxicidad inducida por los productos en prueba.
La tercera administración intravítrea de 100 pl de la solución de RGÁcido cisteico al 2,5 % al grupo de seis conejos, los números 905, 906, 908, no se asoció con ninguna toxicidad significativa en todos los puntos de tiempo. No hubo diferencias significativas en los efectos adversos informados entre el grupo con el RGÁcido cisteico al 2,5 % y el grupo con la solución salina isotónica. Esta falta de toxicidad se determinó mediante examen clínico, oftalmoscopia indirecta y ecografía de barrido p y vitrectomía mecánica.
La biomicroscopía con lámpara de hendidura se realizó en todas las visitas del estudio y se centró en los párpados, la conjuntiva y la esclera, la córnea, los cambios endoteliales, la reacción de la cámara anterior, el iris, el cristalino y la cápsula, así como también el vítreo anterior para detectar signos de inflamación que demuestran una falta casi completa de reacción inflamatoria a las inyecciones intravítreas de 100 pl de la solución de RGÁcido cisteico al 2,5 % y el grupo de la solución salina isotónica. En todos los puntos del estudio y en todos los grupos del estudio no parecía haber signos de toxicidad significativa inducida por los productos en prueba.
La evaluación clínica del segmento posterior también se siguió durante todo el estudio para garantizar que no hubiera toxicidad retiniana significativa presente. Se realizaron evaluaciones oftalmoscópicas indirectas y de fondo con lámpara de hendidura en cada punto de tiempo de la evaluación con atención específica a cualquier signo de toxicidad retiniana. El segmento posterior se evaluó para cualquier cambio en la densidad vítrea, la licuefacción vítrea, la fijación del vítreo y la posible hemorragia. La retina se evaluó para detectar cualquier signo de toxicidad de RPE, compromiso vascular retiniano, hemorragia retiniana, exudados, desgarros, roturas o desprendimientos de la retina. No hubo cambios en el RPE al inicio del estudio 14 días antes del tercer tratamiento, en todos los puntos del estudio y en todos los grupos del estudio no parecía haber ningún signo de cambios significativos en el segmento posterior inducidos por los productos en prueba. Es importante tener en cuenta que las exploraciones ERG realizadas en los tres animales por tercera vez después de las inyecciones intravítreas, así como también las exploraciones ERG realizadas en todos los animales 15 días y 21 días después de la inyección no parecían provocar ningún signo de cambio significativo o toxicidad inducida por los productos en prueba.
Propiedades antiadhesivas de los péptidos de RGÁcido cisteico: Estudio cinético de la cicatrización de heridas con el Compuesto 1 (GRG Ácido cisteico TP), RGD cíclico y RGE
En este ejemplo, en un modelo de cicatrización de heridas, se ha demostrado que los péptidos de RGÁcido cisteico tienen propiedades antiadhesivas y, por lo tanto, pueden prevenir el desarrollo de muchas enfermedades vitreorretinianas patológicas y pueden inhibir las metástasis en las células de melanoma humano y cáncer de colon.
Para probar las propiedades antiadhesivas de los péptidos de RGÁcido cisteico in vitro, se realizó un ensayo de cicatrización de heridas con células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC). Se sembraron las HUVEC y se dejaron crecer hasta una monocapa confluente en una superficie recubierta de fibronectina. Se generó una herida (una grieta por rasguño) arrastrando una pequeña punta de pipeta a través de la monocapa de las HUVEC. Las células se incubaron en medio de crecimiento fresco que contiene el péptido de RGÁcido cisteico (Compuesto 1; 10 mM), y el área de la herida se fotografió en cinco campos diferentes en varios puntos de tiempo (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 horas) para determinar la cinética del cierre de la herida. El nivel del cierre de la herida se cuantificó determinando la fracción del área original de la herida que se ocupó nuevamente por las HUVEC a través de la adhesión celular, la migración y la proliferación.
En estudios de control, se usaron los siguientes péptidos en lugar de RGÁcido cisteico (Compuesto 1): péptido RGD cíclico (1 mM, control positivo) y péptido RGE (1 mM, control negativo).
El efecto de los péptidos sobre la cinética de la cicatrización de heridas se presenta en la Figura 1. Los resultados se muestran como un porcentaje del área original. Las barras de error corresponden a la desviación estándar en el tamaño de la herida en 2-6 ensayos independientes. Los resultados muestran que el péptido de RGÁcido cisteico inhibe la cicatrización de heridas de las HUVEC en un 70 % después de 24 horas, mientras que el RGD cíclico (péptido basado en RGD; RGDf-N(Me)V cíclico N-metilado; Cilengitida) inhibe la cicatrización de heridas de las HUVEC en un 45 % después de 24 horas. Ambos se compararon con un péptido RGE de control negativo que inhibió la cicatrización de heridas de las HUVEC en un 0 % después de 24 horas. El efecto del RGÁcido cisteico (Compuesto 1) es cuantitativamente comparable a la actividad del péptido basado en RGD, un inhibidor bien establecido de la actividad de unión a integrina. Además, el péptido de RGÁcido cisteico exhibe propiedades similares a las actividades del péptido basado en RGD sin apoptosis de las células HUVEC. Tanto RGD cíclico como el Compuesto 1 son potentes inhibidores de la integrina en este ensayo.
La interacción de la célula con la ECM a través de la adhesión focal es un elemento crucial de la migración celular que dicta la tasa de cierre de la herida. En la migración celular bidimensional, el extremo anterior de la célula con lamelipodios en crecimiento forma nuevas adhesiones con el sustrato, mientras que las adhesiones en el extremo posterior se desprenden después de la contracción del citoesqueleto.
Como se describe en otra parte en la presente descripción, la fuerte adhesión entre el vítreo y la retina podría explicar el desarrollo eventual de muchas enfermedades vitreorretinianas patológicas como la tracción vitreomacular, la retinopatía diabética proliferativa, el agujero macular, la degeneración macular relacionada con la edad y los flotadores. Por lo tanto, es altamente conveniente un enfoque atraumático no invasivo para lograr un desprendimiento del vítreo posterior, que no sea la separación mecánica del vítreo de la superficie retiniana interna (verTezel, T.H. y otros, Retina (1998) 18: 7-15; y Verstraeten, T.C. y otros, Arch. Ophthalmol. (1993)111: 849 -854).
Como se describe en otra parte en la presente descripción, se cree que los componentes de la ECM, particularmente las fibrillas de colágeno del vítreo cortical, se anclan a la superficie interna de la retina a través de los sitios de unión a integrina (ver Foos, R.Y., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (1972) 11:801 -808) en la lámina limitante interna (ILL). También se sabe que las principales glucoproteínas adhesivas de la ILL en el ojo, como la fibronectina y la laminina, se unen fuertemente a las integrinas (ver Curtis, T. M. y otros, Am. J. Physiol., (1995) 269: L248 -L260; Elner, S.G. y otros, IOVS (1996) 37:696-701; y Horman, S.M. y otros, Am. J. Physiol. (1995) 269: L248-L260) a través de las secuencias RGD (Arg-Gly-Asp) y varias integrinas se unen a través del motivo RGD presente en las proteínas de la ECM. Además, se sabe que la fibronectina se une a varias otras integrinas además de avp3, mientras que la vitronectina es específica a avp3.
La conexión primaria de las integrinas a la ECM involucra la secuencia Arg-Gly-Asp (RGD) y la secuencia RGD se une a una grieta poco profunda ubicada entre las subunidades a y P de la cabeza de la integrina (ver Xiong y otros, Science (2002) 296: 151-155). Dicha unión ayuda a modular diversas vías de señalización celular, que incluyen la adhesión celular, la migración, la diferenciación, la angiogénesis y la cicatrización de heridas (ver Ruoslahti, E. y otros, Science (1987) 238: 491-497; y J. Clin. Invest. (1991) 87: 1-5).
Desde la matriz extracelular vítrea; por ejemplo, las fibrillas de colágeno se conectan a la retina celular por los sitios de unión a integrina, la inyección intravítrea de los péptidos de RGÁcido cisteico (oligopéptidos) podría liberar el motivo RGD de la matriz extracelular vítrea de la retina celular mediante una unión competitiva a los mismos sitios receptores de integrina.
Varios investigadores (ver Ruoslahti, E. y otros, Science (1987) 238: 491- 497; Hynes, R.A. y otros, Cell (1992) 68: 303 -322; y Humphries, M.J., J. Cell Sci., (1990) 97: 585 -592) demostraron que muchas integrinas (avp3, asp-i, a-np3, etc.) pueden inhibirse por pequeños péptidos que poseen el motivo de secuencia RGD. También se ha documentado bien que estas integrinas avp3 y a5p1, así como también la vitronectina y la fibronectina, se regulaban positivamente en los tumores tales como las células de melanoma humano (ver Nip, J., J. Clin. Invest., (1992) 90: 1406-1413), las células de cáncer de mama humano (ver Rong, L. y otros, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2009) 50: 5988 -5996), y las células epiteliales del pigmento retiniano humano (Peter C. Brooks y otros, J. Clin. Invest., (1995) 96: 1815-1822). Por lo tanto, se ha demostrado que existe una buena correlación entre los potenciales metastásicos de las células de melanoma humano y la adhesión de las células de melanoma a la vitronectina de los ganglios linfáticos a través del receptor de integrina ayp3 y que la adhesión se inhibió por un péptido que contiene RGD (Nip, J., J. Clin. Invest., (1992) 90: 1406-1413). Esto demuestra que los péptidos RGD pueden ser un importante agente antiangiogénico.
Además, se ha demostrado en una línea celular de cáncer de colon humano que cuando hay un aumento significativo en la adhesión celular, entonces hay una actividad metastásica aumentada (Lehmann, M., Cancer Res., (1994), 54: 2102-2107). Por lo tanto, los agentes que inhiben la adhesión celular inhiben eficazmente el cáncer de colon y el melanoma de la formación de metástasis.
Según los resultados del estudio de la cicatrización de heridas donde el ácido RGÁcido cisteico ha demostrado inhibir la adhesión celular, y tras la extrapolación del potencial metastásico de RGD en los modelos de melanoma y cáncer de colon, los péptidos de RGÁcido cisteico y sus derivados pueden inhibir eficazmente las metástasis tumorales, para ejemplo, en el melanoma y el cáncer de colon.
Uso de los péptidos de RGÁcido cisteico para dirigir o administrar agentes a los tumores
También se describe en la presente descripción un conjugado dimérico del péptido de RGÁcido cisteico-Paclitaxel (Compuesto 3), que se muestra a continuación. Esta composición es útil como agente antitumoral. El péptido de RGÁcido cisteico dimérico se une selectivamente a los receptores de integrina que se expresan altamente en ciertas células cancerosas y es útil para tratar ciertos cánceres metastásicos como, por ejemplo, el cáncer de mama metastásico, al inhibirla adhesión celular.
Figure imgf000026_0001
correspondiente del Compuesto 3 son como se describe en Chen, X. y otros; Synthesis and Biological Evaluation of Dimeric RGD Peptide- Paclitaxel Conjugate as a Model for Integrin-Targeted Drug Delivery; J. Med. Chem., (2005) 48 (4): 1098-1106).
Aunque el Compuesto 3 comprende un agente antitumoral particular, el Paclitaxel, unido al péptido de RGÁcido cisteico dimérico, se debe apreciar que esto incluye todas las formas monoméricas o multiméricas de los péptidos de RGÁcido cisteico unido a cualquier agente de diagnóstico o terapéutico factible que pueda ser útil en diagnosticar, obtener imágenes o tratar un tumor u otro tejido o estructura que contenga integrina. Los ejemplos de las sustancias antitumorales que pueden unirse a los péptidos de RGÁcido cisteico monoméricos o multiméricos pueden incluir agentes antitumorales (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos contra el cáncer, modificadores de la respuesta biológica, inhibidores de la vascularización, bloqueadores de los receptores hormonales, agentes crioterapéuticos u otros agentes que destruyen o inhiben la neoplasia o la tumorigénesis) como; agentes alquilantes u otros agentes que matan directamente las células cancerosas atacando su ADN (por ejemplo, ciclofosfamida, isofosfamida), nitrosoureas u otros agentes que matan las células cancerosas al inhibir los cambios necesarios para la reparación del ADN celular (por ejemplo, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU)), antimetabolitos y otros agentes que bloquean el crecimiento de las células cancerosas al interferir con ciertas funciones celulares, generalmente la síntesis de ADN (por ejemplo, 6 mercaptopurina y 5-fluorouracilo (5FU), antibióticos antitumorales y otros compuestos que actúan uniendo o intercalando el ADN y evitando la síntesis de ARN (por ejemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C y bleomicina), alcaloides vegetales (vinca) y otros agentes antitumorales derivados de plantas (por ejemplo, vincristina y vinblastina), hormonas esteroides, inhibidores hormonales, antagonistas de los receptores hormonales y otros agentes que afectan el crecimiento de cánceres sensibles a las hormonas (por ejemplo, tamoxifeno, herceptina, inhibidores de aromatasa como aminoglutetamida y formestano, triazol e inhibidores como letrozol y anastrazol, inhibidores esteroideos como exemestano), proteínas antiangiogénicas, moléculas pequeñas, terapias génicas y/u otros agentes que inhiben la angiogénesis o la vascularización de tumores (por ejemplo, meth-1, meth-2, talidomida), bevacizumab (Avastin), escualamina, endostatina, angiostatina, angiozima, AE-941 (Neovastat), CC-5013 (Revimid), medi-522 (Vitaxin), 2-metoxiestradiol (2ME2, Panzem), carboxiamidotriazol (CAI), profármaco combretastatina A4 (CA4P), SU6668, SU11248, BMS-275291, COL-3, EMD 121974, IMC-1C11, IM862, TNP-470, celecoxib (Celebrex), rofecoxib (Vioxx), interferón alfa, interleucina-12 (IL- 12) o cualquiera de los compuestos identificados en Science Vol. 289, páginas 1197-1201 (17 de agosto de 2000) que se incorporan expresamente en la presente descripción como referencia, modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferón, bacilo calmette-guerina (BCG), anticuerpos monoclonales, interluken 2, factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), etc.), antagonistas del receptor de PGDF, herceptin, asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, carmustina, clorambucil, citarabina, dacarbazina, etopósido, flucarbazine, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, ifosfamida, irinotecan, lomustina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, tioguanina, tiotepa, tomudex, topotecan, treosulfan, vinblastine, vincristine, mitoazitrone, oxaliplatin, procarbazina, streptocin, taxol, taxotere, análogos/congéneres y derivados de tales compuestos, así como también otros agentes antitumorales no mencionados en la presente descripción.
Péptidos de RGÁcido cisteico multiméricos marcados con 64CU para la obtención de imágenes de tumores que expresan integrina
También se describen en la presente descripción los péptidos de RGÁcido cisteico tetramérico y octamérico marcados con 64CU (Compuestos 4 y 5 respectivamente), que se muestran a continuación, que son útiles como agentes radioterapéuticos para fines de obtención de imágenes y el diagnóstico (por ejemplo, radiomarcado de tumores para exploración PET), así como también para dirigir o administrar agentes terapéuticos a los tumores u otras células que expresan integrinas, como tumores que expresan integrinas ayp3.
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La síntesis y los mecanismos de acción, la biodistribución, la selectividad tumoral y el uso relacionado con PET de los análogos de RGD correspondientes de los Compuestos 4 y 5 se describen en Li, Z. y otros, 64CU-Labeled Tetrameric and Octameric RGD Peptides for Small-Animal PET of Tumor ayp3 Integrin Expression; J. Nucl. Med. 48 (7) pp. 1162­ 1171 (2007).
Supresión de la neovascularización coroidea (CNV) in vivo por el Compuesto 1
En este ejemplo, el Compuesto 1 se probó para determinar la CNV en un modelo de ratón publicado. Ver, Umeda N, Kachi S, Akiyama H, Zahn G, Vossmeyer D, Stragies R, Campochiaro P., Suppression and Regression of Choroidal Neovascularization by Systemic Administration ofan as|3i Integrin Antagonist: Molecular Pharmacology:2006, 69,1820­ 1828.
Los ratones del estudio tuvieron ruptura de la membrana de Bruch inducida por láser, seguida de una inyección intravítrea de una dosis única del Compuesto 1 a una concentración de 1,0 pg/1 pl, 25 pg/1 pl y a 50 pg/1 pl, así como también un vehículo inmediatamente después del tratamiento con láser. Catorce días después del tratamiento con láser, se midió el área de la CNV mediante análisis de imagen. El tamaño de las lesiones de la CNV parecía algo menor en los ojos tratados con 1,0 pg/1 pl y las concentraciones de 50 pg/1 pl del Compuesto 1. La Figura 8 es un gráfico que muestra el área total de la neovascularización en un modelo de ratón CNV 14 días después del tratamiento con varias dosis del Compuesto 1 y el control (solamente el vehículo).
La concentración de 25 pg/1 pl del Compuesto 1 exhibió una reducción estadísticamente significativa del 43 % en la CNV en comparación con los ojos tratados con el vehículo. Esto sugiere que una sola inyección intravítrea del Compuesto 1 a 25 pg/1 pl es suficiente para inhibir significativamente la CNV.
Estudio in vivo- Modelo para la retinopatía diabética
En este ejemplo, el Compuesto 1 se probó en un modelo de ratón con retinopatía isquémica para explorar la viabilidad de suprimir la neovascularización prerretiniana.
Los ratones que tenían retinopatía isquémica se inyectaron intravítreamente con una dosis única del Compuesto 1 a la concentración de 0,125 pg/1 pl, 12,5 pg/1 pl, 25,0 pg/1 pl y a 50,0 pg/1 pl (Grupos B, D, F y H, respectivamente), así como también un vehículo (BSS) (Controles 1, 2, 3 y 4) en el día postnatal 12. El día postnatal 17, 5 días después de la inyección intravítrea, se midió el área de la neovascularización mediante análisis de imagen. La Figura 9 es un gráfico de barras que compara el área medida de la neovascularización en los ratones tratados con estas dosis variables del Compuesto 1 o el control (solamente el vehículo). Como se muestra en la Figura 9, el tamaño de las lesiones de la neovascularización parecía algo menor en los ojos tratados con (B) 0,125 pg/1 pl, sin embargo, los Grupos D (12,5 pg/1 pl), F (25,0 pg/1 pl) y H (50,0 pg/1 pl) disminuyeron mucho y se encontró que las tres concentraciones eran estadísticamente significativas en comparación con los Controles 2, 3 y 4.
Los resultados de este estudio sugieren que una sola inyección intravítrea del Compuesto 1 a 12,5 pg/1 pl, 25,0 pg/1 pl y a 50,0 pg/1 pl es suficiente para inhibir significativamente la neovascularización prerretiniana.
Toxicología Animal del Compuesto 1
Las siguientes Tablas de A a E resumen los datos de toxicidad animal obtenidos de los siguientes estudios
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Tabla A
Toxicidad ocular de la inyección intravítrea de 2,5 mg/100 pl del Compuesto 1 con y sin urea en conejos de Nueva Zelanda
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Tabla B
Toxicidad ocular de la inyección intravítrea de 2,5 mg/100 pl del Compuesto 1 y 2,5 mg/100 pl de RGD en conejos machos y hembras de Nueva Zelanda
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Tabla C
Toxicidad ocular de la inyección subconjuntival de 5,0 mg/100 pl del Compuesto 1 en conejos de Nueva
Zelanda
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Tabla D
Toxicidad ocular de tres inyecciones intravítreas de 2,5 mg/100 pl del Compuesto 1 en conejos de Nueva
Zelanda
Figure imgf000032_0002
Tabla E
Toxicidad ocular de tres inyecciones intravítreas de 2,5 mg/100 pl, 5,0 mg/100 pl y 10,0 mg/100 pl del Compuesto 1 en conejos pigmentados de Nueva Zelanda
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Estudio de dosis múltiples en humanos
Quince pacientes humanos con DME en etapa tardía recibieron tres inyecciones intravítreas mensuales del Compuesto 1 como parte de un estudio de seguridad humana en Fase 1 de inyección múltiple. No hubo eventos adversos graves ni eventos adversos significativos. Si bien este estudio fue en primer lugar un estudio de seguridad, también se evaluó la eficacia. Ocho de los pacientes mejoraron tres o más líneas en BCVA (que representan el 53 % de los pacientes tratados) y cuatro de los pacientes mejoraron de una visión casi legalmente ciega a funcional en el intervalo de 20/40 a 20/60. Adicionalmente, se observó una mejora significativa en la anatomía macular en la OCT en ocho pacientes, que varía del 30 % al 80 %. Estas mejoras en la BCVA y en el grosor macular central en la OCT persistieron durante 90 días de seguimiento del tratamiento. Estos resultados se han logrado a pesar del hecho de que estos pacientes humanos sufrían de DME en etapa tardía y muchos se habían considerado refractarios a las opciones de tratamiento actuales tanto del Avastin como del láser de fotocoagulación. La siguiente Tabla F muestra un resumen de aquellos pacientes del estudio que recibieron tratamiento previo con Avastin o terapia con láser de fotocoagulación:
Tabla F
Figure imgf000034_0001
Los detalles y resultados adicionales de este estudio se muestran en la siguiente Tabla F, en los gráficos y diagramas de las Figuras 10A a 10J y los párrafos escritos a continuación.
Tabla G
Seguridad y eficacia de tres inyecciones intravítreas de 2,5 mg/100 pl del Compuesto 1 en humanos con edema macular diabético
Resumen de ensayos clínicos
Figure imgf000034_0002
El objetivo del estudio de Fase 1 fue evaluar la seguridad y la eficacia inicial de la inyección intravítrea oftálmica del Compuesto 1 en sujetos humanos con edema macular diabético en etapa terminal (DME). El objetivo primario de este estudio fue la observación de la toxicidad limitante de la dosis. Un objetivo secundario de este estudio fue la observación de un beneficio clínico en la reducción del edema macular diabético en BCVA (líneas ETDRS) y el grosor macular central en la OCT.
Quince sujetos humanos con DME crónico en etapa terminal completaron este estudio abierto. Los sujetos en la inscripción tenían BCVA de 20/100 o peor, principalmente debido a DME, y no habían recibido tratamiento anti-VEGF o láser focal dentro de los 90 días anteriores a la inscripción. Muchos sujetos del estudio fueron refractarios a los tratamientos previos de Avastin. Los sujetos del estudio recibieron tres inyecciones intravítreas mensuales de 2,5 mg del Compuesto 1 y se siguieron mensualmente durante 3 meses adicionales. Las medidas de seguridad se siguieron por BCVA, evaluación con lámpara de hendidura, examen de fondo de ojo dilatado, medidas de IOP, OCT, FA, fotos de fondo de ojo, ecografía de barrido B y ERG.
Un total de 15 sujetos se inscribieron en este estudio. En general, todos los sujetos del estudio toleraron el fármaco del estudio, el Compuesto 1, extremadamente bien. No hubo informes de reacciones inflamatorias ni en la cámara anterior ni en la cavidad vítrea. No se observaron elevaciones sostenidas en la IOP. No se observó descompensación corneal ni progresión de cataratas durante este estudio. No se observaron desgarros o desprendimientos de la retina durante este estudio, sin embargo, se observó una alta incidencia (55 %) de desprendimiento del vítreo posterior mediante ecografía de barrido B como se vio en los estudios previos con conejos. Además, no se observaron oclusiones vasculares durante el transcurso de estos estudios. De los 15 sujetos, no se informaron eventos adversos graves o eventos adversos significativos.
El 53 % (8 de 15) de los sujetos informaron un aumento de 3 líneas o más en BCVA en el día 90 del estudio después de recibir 3 inyecciones intravítreas. Ningún sujeto del estudio perdió BCVA con relación a la referencia. Curiosamente, se observó que la misma proporción de sujetos (53 % u 8 de 15) tenían una reducción significativa en el grosor macular central en la OCT de al menos 30 %. La reducción máxima en el edema macular fue de 505 micras (608 a 103), una reducción de casi el 80 % en el edema macular. Las mejoras en BCVA típicamente rastrearon mejoras en la reducción del edema macular por la OCT. Un sujeto del estudio demostró la progresión de su edema macular diabético de referencia, inicialmente mejoró durante su curso de tratamiento pero luego progresó más allá de su grosor macular en la OCT de referencia en el día 150 del estudio, 3 meses después de la terapia intravítrea. La BCVA de este sujeto del estudio inicialmente mejoró 5 líneas, pero luego retrocedió a la línea inicial en el día 150 del estudio.
En este estudio, como se muestra gráficamente en las Figuras de 10A a 10J, hubo consistencia en la falta de toxicidad demostrada por BCVA, grosor macular central en la OCT, falta de respuesta inflamatoria o patología retiniana en el examen clínico, FA, barrido B o ERG. En general, el Compuesto 1 se toleró muy bien.
Curiosamente, a pesar de la naturaleza de la etapa final de los sujetos del estudio y el pequeño tamaño del estudio, parece haber un claro indicador clínico de eficacia con mejoras en el seguimiento de BCVA, mejoras anatómicas en el grosor macular central en la OCT. Además, las mejoras clínicas parecen perdurar al menos 90 días después del último tratamiento intravítreo con el Compuesto 1 en casi todos los sujetos del estudio que demuestran mejoras. Los autores creen que se requiere un estudio más amplio para evaluar y confirmar la seguridad y la eficacia de esta nueva clase de fármacos antiangiogénicos y comprender mejor las características de su nuevo mecanismo de acción.
Efectos del ranibizumab y el Compuesto 1 solos y en combinación en ratones transgénicos que expresan el VEGF humano
Los ratones transgénicos en los que el promotor de rodopsina impulsa la expresión del VEGF humano en los fotorreceptores (ratones rho/VEGF) se seleccionaron al azar en grupos de tratamiento separados y se realizaron los estudios para proporcionar las siguientes comparaciones:
Figure imgf000035_0001
Las mediciones previas al tratamiento del área de la neovascularización subretiniana se realizaron en cada animal mediante el uso del análisis de imágenes por un observador enmascarado. Cada animal recibió su tratamiento designado en una sola inyección intraocular.
Siete días después de la dosis, se realizaron nuevamente las mediciones del área de la neovascularización subretiniana y se compararon con las mediciones previas a la dosis para determinar el cambio en el área de la neovascularización subretiniana. Además, los animales se sacrificaron y las retinas se disecaron, se inmunotiñeron con lectina GSA y se examinaron por microscopía de fluorescencia.
La Figura 11A es un gráfico de barras que compara el cambio medio en el área de la neovascularización subretiniana de los animales que reciben 25 |jg del Compuesto 1 (5 animales) frente a los animales que reciben la combinación de 10 jg de ranibizumab 25 jg del Compuesto 1 (5 animales). Los animales que recibieron la combinación de 10 jg de ranibizumab 25 jg del Compuesto 1 exhibieron una reducción 35,34 % mayor en el área de la neovascularización subretiniana que los animales que recibieron 25 jg del Compuesto 1 solo. Estos datos indican que, a las dosis probadas, la combinación de ranibizumab y el Compuesto 1 fue más efectiva para reducir la neovascularización subretiniana que el Compuesto 1 solo.
La Figura 11B es un gráfico de barras que compara el cambio medio en el área de la neovascularización subretiniana de los animales que reciben 10 jg de ranibizumab (5 animales) frente a los animales que reciben la combinación de 10 jg de ranibizumab 25 jg del Compuesto 1 (5 animales). Los animales que recibieron la combinación de 10 jg de ranibizumab 25 jg del Compuesto 1 exhibieron una reducción 34,70 % mayor en el área de la neovascularización subretiniana que los animales que recibieron 10 jg de ranibizumab solo. Estos datos indican que, a las dosis probadas, la combinación de ranibizumab y el Compuesto 1 fue más efectiva para reducir la neovascularización subretiniana que el Compuesto 1 solo.
La Figura 11C es un gráfico de barras que compara el cambio medio en el área de la neovascularización subretiniana de los animales que reciben 25 jg del Compuesto 1 (3 animales) frente a los animales que reciben la solución salina amortiguada con fosfato (vehículo/control) (3 animales). Los animales que recibieron 25 jg del Compuesto 1 exhibieron una reducción 37,06 % mayor en el área de la neovascularización subretiniana que los animales de control. Estos datos indican que, a la dosis probada, el Compuesto 1 fue más efectivo que el control para reducir la neovascularización subretiniana.
La Figura 11D es un gráfico de barras que compara el cambio medio en el área de la neovascularización subretiniana de los animales que reciben 10 jg de ranibizumab (3 animales) frente a los animales que reciben la solución salina amortiguada con fosfato (vehículo/control) (3 animales). Los animales que recibieron 10 jg de ranibizumab exhibieron una reducción 38,96 % mayor en el área de la neovascularización subretiniana que los animales de control. Estos datos indican que, a la dosis probada, el ranibizumab fue más efectivo que el control para reducir la neovascularización subretiniana.
En resumen, a las dosis probadas en estos estudios de comparación, el ranibizumab y el Compuesto 1 provocaron una reducción estadísticamente significativa en el área de la neovascularización subretiniana cuando se administraron solos. Sin embargo, la combinación del ranibizumab y el Compuesto 1 provocó una reducción significativamente mayor en el área de la neovascularización subretiniana que el ranibizumab solo o el Compuesto 1 solo. En base a estos datos, la terapia de combinación que usa el Compuesto 1 (u otro compuesto inhibidor de la integrina de la presente invención) en combinación con una trampa de VEGF (como el ranibizumab) tiene un beneficio clínico potencial en los pacientes que padecen enfermedades oculares neovasculares,
Como se usa en la presente descripción, cualquier referencia al tratamiento de una enfermedad o trastorno se interpretará, a menos que se indique de cualquier otra manera, para incluir la prevención de la enfermedad o trastorno antes de que ocurra o se detecte, así como también el tratamiento de la enfermedad o trastorno después de que ha ocurrido o se ha detectado.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un péptido inhibidor de integrina que consiste en Glicinil-Arginil-Glicinil-Ácido cisteico-Treonil-Prolina-COOH o una sal farmacéuticamente aceptable de este para su uso en el tratamiento del edema macular mediante la inhibición de la angiogénesis.
2. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe al menos la integrina a5 pi, la integrina avp3 y la integrina avp5.
3. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el péptido inhibe los receptores de integrina asociados con un motivo de adhesión celular.
4. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el péptido inhibe los receptores de integrina asociados con la fibronectina, la vitronectina, la laminina, el fibrinógeno, la trombospondina y el factor de von Willebrand.
5. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde la composición es para la administración al ojo mediante inyección intravítrea.
6. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición es para la administración al ojo una vez al mes mediante inyección intravítrea.
7. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el péptido inhibidor de integrina también reduce la inflamación en el ojo.
8. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que provoca una reducción del 30 % al 80 % en el grosor macular central.
9. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido comprende Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH.
10. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde el péptido es un péptido lineal que comprende Arg-Gly-NH-CH(CH2-sO3H)COOH.
11. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde el péptido es un péptido cíclico que comprende Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH.
12. Una composición para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde el péptido tiene la fórmula:
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ES17159955T 2011-05-09 2012-05-09 Antagonistas del receptor de integrina y sus métodos de uso Active ES2820855T3 (es)

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