KR20140038447A - 인테그린 수용체 길항물질 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20140038447A
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마이클 존 맥켈
존 와이. 박
함파르 엘. 카라게오지안
빅켄 에이치. 카라게오지안
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알레그로 파마슈티칼스, 인코포레이티드.
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Abstract

R-G-시스테산(R-G-Cysteic Acid)[즉, R-G-NH-CH(CH2-SO3H)COOH 또는 Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH], 및 약제학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salts), 수화물(hydrate), 입체이성질체(stereoisomers), 다합체(multimers), 고리형태(cyclic forms), 선형형태(linear forms), 약물-결합체(drug-conjugates), 프로-드러그(pro-drugs) 및 이들의 유도체를 포함하는 화합물. α5β1-인테그린, αγβ3-인테그린 및 αγβ5-인테그린을 포함하지만 필수적으로 이로 제한되지 않는 인테그린을 저해하고, RGD 바인딩 부위에 대한 세포의 부착을 저해하고, 바이러스성 또는 그 밖의 미생물성 감염을 예방하거나 치료하고, 종양, 망막 조직 또는 그 밖의 조직에서 혈관형성을 저해하고, 인간 또는 동물 피검자에서 RGD 바인딩 부위에 대한 그 밖의 진단 또는 치료제를 수송하기 위한 방법을 포함하는 이러한 화합물을 제조하고 사용하기 위한 방법을 또한 나타낸다.

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인테그린 수용체 길항물질 및 이의 사용 방법{INTEGRIN RECEPTOR ANTAGONISTS AND THEIR METHODS OF USE}
관련된 출원
본 출원은, 각각 미국 가출원(United States Provisional Patent Applications) 간행물 2011년 05월 09일에 출원된 제61/484,194호, 2011년 05월 16일에 출원된 제61/486,725호 및 2012년 05월 04일에 출원된 제61/643,118호에 대해 우선권을 청구하고, 각각의 이러한 가출원의 전체 내용은 참고문헌으로 본원에 분명하게 포함된다. 게다가, 이러한 출원은, a) 2010년 11월 10일에 출원된 공동계류중인(copending) PCT 국제 특허 출원 제PCT/US2010/056227호 및 b) 2010년 11월 10일에 출원된 미국 특허 출원 간행물 제12/943,900호의 일부 계속 출원(continuation in part)이고, 이들 둘 다의 청구항은 2009년 11월 10일에 출원된 미국 가출원 간행물 제61/259,748호에 우선한다. 각각의 상기 특허 출원의 전체의 내용은 참고문헌에 의해 본원에 명확하게 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은, 일반적으로 화학 및 의학의 분야 및 보다 특히 인테그린 수용체 길항물질 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술
RGD 트리펩티드 서열(tripeptide sequence)은, 세포 부착(cell adhesion)에서 역할을 하는 다수의 단백질에서 발견되었다. RGD 트리펩티드가 존재하는 단백질의 예는 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin), 본 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, VWF), 특정한 디스인테그린(certain disintegrins), 및 특정한 디스코이딘(certain discoidins)을 포함한다.
인테그린은, 노출된 RGD 서열을 갖는 리간드에 대한 바인딩(binding)에 의한 세포와 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 사이에서의 부착(adhesion)을 매개하는 이종이합체형 세포 표면 수용체(heterodimeric cell surface receptors)이다. 보통의 인테그린-RGD 바인딩은, 세포 성장, 이송(migration) 및 생존을 포함하는 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이러한 세포 성장, 이송 및 생존의 불완전한 조절(Faulty regulation)은, 혈전증(thrombosis), 염증 및 암을 포함하는 수많은 질병의 상태를 야기한다. 따라서, RGD 펩티드는, 세포 부착 단백질의 잠재적인 모사물(potential mimics)로서 조사되고 있고, 인테그린에 결합하는 이들의 능력, 세포 부착, 세포 이동, 세포 증식, 세포 분화, 아포토시스(apoptosis), 혈관형성(angiogenesis), 종양형성(tumorigenesis) 억제와 같은 치료 목적, 세포 내로 미생물의 유입 억제(inhibiting entry of microbes into cells), 암 조영제(cancer imaging agents) 뿐만 아니라 내부의 방사선 치료 제제(internal radiotherapeutic agents)로서의 이들의 다합체(their multimeric form)에서의 사용 및 이들의 항-암 약물 운반 능력(their anti-cancer drug carrying abilities)을 위한 것이다.
눈에서, 인테그린은, 안구 발달(ocular development), 세포 이송(cell migration), 치유(healing) 및 몇몇 병리학적 과정(some pathologic processes)을 포함하는 수많은 과정에 영향을 미친다. 인테그린은, 안구의 조직에서의 염증 및 혈전증(thrombosis)을 또한 조절할 수 있다. 안내 주사된(Intravitreally injected) RGD 펩티드는 동물 모델에서 후유리체망막 박리(posterior vitreoretinal detachment)를 일으키는 것으로 또한 보고되어 있고, 따라서 이는 특정 망막 질환의 치료에 유용하고/유용하거나 유리체 절제술 과정(vitrectomy procedure)에서 유리체(vitreous body)의 제거를 용이하게 할 수 있다. Olivera, L.B., et al., RGD Peptide - Assisted Vitrectomy to Facilitate Induction of a Posterior Vitreous Detachment : a New Principle in Pharmacological Vitreolysis; Current Eye Research (8):333-40 (December 25, 2002)를 참고하라.
인테그린은 또한, 숙주 세포를 감염시키는 다양한 외피 및 비 외피 바이러스(enveloped and non-enveloped viruses) 및 박테리아에 의해 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다. Schornberg, Kathryn L.; α 5 β 1 - Integrin Controls Ebolavirus Entry by Regulating Endosomal Cathespins; Proc. Nat. Acad. Sci. USA; Vol. 106, No. 19, pp. 8003-8008 (2009)
본 발명의 요약
본 발명은, R-G-시스테산(R-G-Cysteic Acid)[즉, R-G-NH-CH(CH2-SO3H)COOH 또는 Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH] 및 이의 유도체[약제학적으로 허용가능한 염(pharmaceutically acceptable salts), 수화물(hydrate), 입체이성질체(stereoisomers), 다합체(multimers), 고리형태(cyclic forms), 선형형태(linear forms), 약물-결합체(drug-conjugates), 프로-드러그(pro-drugs) 및 이들의 유도체]를 포함하는 신규한 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 또는 동물 피검자에서 인테그린 수용체의 치료상의 또는 예방상의 저해를 위한 조성물 및 방법을 또한 제공한다. R-G-시스테산 펩티드 또는 이의 유도체(약제학적으로 허용가능한 염, 수화물, 입체이성질체, 다합체, 고리형태, 선형형태, 약물-결합체, 프로-드러그 및 이들의 유도체를 포함)를 포함하는 조성물의 유효량을 인간 또는 동물 피검자에게 투여함으로써 인간 또는 동물 피검자에서 RGD 바인딩 부위에 대한 그 밖의 진단제 또는 치료제를 딜리버리(delivering) 또는 RGD 바인딩 부위(RGD binding sites)에 대한 세포의 부착(cellular adhesion)을 저해하는 것을 예방 또는 치료하기 위해, 바이러스성 질병을 치료 또는 예방하고, 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 원하지 않는 신혈관형성을 포함하는 그 밖의 증상을 포함하는 바이러스성 다양한 질환을 억제하기 위해, 이러한 인테그린 수용체 저해는, 종양 또는 그 밖의 조직(예를 들어, 눈의 망막)에서 신혈관형성(neovascularization) 또는 혈관 형성의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수도 있다. 이러한 발명의 R-G- 시스테산 펩티드의 특정한 예는 Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH의 선형 형태(화합물 1로서 본원에서 언급된 예) 및 Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH)의 고리 형태(화합물 2로서 본원에서 언급된 예)를 포함한다.
본 발명의 R-G-시스테산 유도체에 대한 화학식은 다음과 같은 화학식 Ⅰ 내지 Ⅶ 을 갖는 화합물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다:
[화학식 Ⅰ]
Figure pct00001
이 식에서, X 는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고, Y 는 OH 또는 NH2 이다.
[화학식 Ⅱ]
Figure pct00002
이 식에서, X 는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이다.
[화학식 Ⅲ]
Figure pct00003
이 식에서, X 는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고, Z 는 H 또는 SO3H 로부터 선택된 것이다.
[화학식 Ⅳ]
Figure pct00004
이 식에서, X 는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고; Y 는 OH 또는 NH2 로부터 선택된 것이다.
[화학식 Ⅴ]
Figure pct00005
이 식에서, X 는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이다.
[화학식 Ⅵ]
Figure pct00006
이 식에서, X 는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이다.
[화학식 Ⅶ]
Figure pct00007
이 식에서, X 및 X1 은, 고리형 또는 선형의 -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe-Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val, 또는 Arg, Gly, Cysteic, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr의 D-이성질체(isomer) 또는 L-이성질체의 어떠한 컴비네이션(combination)의 어떠한 염으로부터 선택된 것이다.
화학식 Ⅶ의 고리 형태의 예는 하기를 포함하지만 이로 필수적으로 제한되지 않는다:
Figure pct00008
이 식에서, X'는 H, C1-C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고, Z 는 H 또는 Me 로부터 선택된 것이고; Y 는 OH, NH2 로부터 선택된 것이다.
술폰산(Sulfonic acid)은 상응하는 카르복실산(corresponding carboxylic acids) 보다 더 강한 산성이다. 술폰산 기의 이러한 보다 높은 극성(higher polarity)은 보다 강한 분자 간의 결합(stronger intermolecular bonding)을 유도한다. 예를 들어, 인테그린 바인딩 부위에서의 단백질의 아미드 기(amide groups)를 갖는, 보다 양극화된(more polarized) O-H 결합을 갖는 R-G-시스테산은, 상대적으로 보다 적은 양극화된 O-H 결합을 갖는 R-G-아스파르트산(RGD 펩티드) 보다 강한 수소 결합을 형성할 수 있고 및/또는 인테그린 바인딩 부위에서 복합된(complexed) 금속 이온과 보다 강한 상호작용을 갖는다.
본원에서 다른 경우에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 화학식 Ⅶ의 하나의 특정한 예, 글리시닐-아르기닐-글리시닐-시스테익-트레오닐-프롤린-COOH(Glycinyl-Arginyl-Glycinyl-Cysteic-Threonyl-Proline-COOH)(GRG 시스테산 TP; 화합물 1로서 하기에 나타냄)를 합성하였고, 동물에서 테스트하였고, 인테그린-세포외 기질 상호작용[integrin-extracellular matrix (ECM) interactions]을 저해함으로써, 망막 표면으로부터의 후유리체 박리(posterior vitreous detachment, PVD)를 유도하는데 효과적인 것으로 발견되었다. 본원에서 또한 다른 경우에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 화합물 1 은 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)를 사용하여 상처 치유(wound healing)의 모델에서 테스트되었고, 시클릭-RGD 펩티드(cyclic-RGD peptide)에 의해 40 %의 저해와 비교하여 12 시간에 74 % 로 세포 부착을 저해하는 것으로 나타났다. 이러한 연구는, 글리시닐-아르기닐-글리시닐-시스테익-트레오닐-프롤린-COOH가 RGD 펩티드 이들 자체보다 더 강하게 인테그린에 결합할 수 있는 근거를 제시하고, 제공한다.
L-형태 또는 D-형태일 수 있는 RG 시스테산 펩티드 서열은 인테그린-ECM 상호작용의 경쟁적 저해제(competitive inhibitor)이다. RG 시스테산 펩티드 서열은 프로테아제-저항 유도체(protease-resistant derivatives) 또는 시클릭 유도체(cyclic derivatives) 또는 프로-드러그 유도체(pro-drug derivatives) 또는 약물 전달 시스템(drug delivery systems)과 관련된 또는 단일클론 항체(monoclonal antibodies)일 수 있다.
본 발명의 조성물은, 염증, 상처-치유(wound-healing), 혈전증, 암 전이(cancer metastases) 및 종양을 치료하는데 유용할 수 있는, 혈관형성(angiogenesis)을 저해하는데 사용가능하다. 추가적인 유용한 적용은, 증식성 또는 비-증식성 당뇨 망막병증(proliferative or non-proliferative diabetic retinopathy), 유리체의 액화(liquefaction of the vitreous), 후유리체-망막 박리의 유도(induction of posterior vitreo-retinal detachment)(PVD), 특발성 황반원공(idiopathic macular hole), 황반 부종(macular edema), 부유물(floaters), 유리체황반견인(vitreomacular traction), 노인 황반 변성(age related macular degeneration), 습성 황반 변성(wet macular degeneration), 맥락막의 신혈관형성(choroidal neovascularization), 유리체망막 수술, 정맥 폐쇄(vein occlusion)와 같은 유리체망막 질환(vitreoretinal diseases)의 발병(pathogenesis), 및 녹내장 수술에서의 흉터 형성의 예방(prevention of scar formation in glaucoma surgery)의 치료를 포함하는 안과(ophthalmology)에서 발견될 수 있다. 여전히 추가적으로, 본 발명의 다합체 및/또는 방사선 표지된 조성물(multimeric and/or radiolabeled compositions)은 종양의 발견(detection)을 위한 진단제/영상제(diagnostic/imaging agents) 및 종양의 치료를 위한 방사선치료제(radiotherapeutic agents) 및 이들의 종양 유도 특성(their tumor directing properties) 때문에 항-암 약물 운반체(anti-cancer drug carriers)로서 사용되었다.
RG 시스테산 펩티드가 포함된 생체물질(Biomaterial)은, 세포의 장기간 생존 및 성장 및 조직 공학 및 재생 의학(tissue engineering and regenerative medicine)에서의 적용을 위한 살아있는 조직(living tissues)의 엔지니어링(engineering)을 위한 합성의 부착 미세환경(synthetic adhesive microenvironment)을 또한 제공할 수 있다. 인테그린 부착 수용체를 바인딩시키는 이들의 특성을 통해, RG 시스테산 펩티드가 생체물질 또는 스캐폴드(biomaterial or scaffold) 내에 묶인(tethered) 경우에, RG 시스테산 펩티드는 부착-촉진 신호(adhesion-promoting signal)를 제공할 수 있다. RG 시스테산-기초 물질은 세포 부착, 확산(spreading) 및 세포의 이송을 매개한다. 게다가, 인테그린-매개된 세포 부착은 세포 증식 및 생존을 촉진시키고, 다세포 구조 및 조직(multicellular structures and tissues)의 조립(assembly) 및 구성에서 중요한 역할을 한다.
루센티스(Lucentis) 및 아바스틴(Avastin)과 같은 황반 변성(macular degeneration)의 치료를 위한 약물은 VEGF 를 저해하는 것을 기초로 하고, 이는 그 외에 새로운 혈관의 성장, 혈관형성(을 초래하고, 그 결과로 황반 부종(macular edema)에 기여한다. Brooks et al에 대한 미국 특허 번호 제6,500,924호에서 나타낸 바와 같이 작은 펩티드 RGD가 경쟁적인 바인딩(competitive binding)에 의한 세포외의 매트릭스1에 대한 세포 부착을 저해시킴으로써 아포토시스를 유도할 수 있음은 알려진 사실이다.
RGD 펩티드 바인딩 또는 인식 모티프(recognition motif)는 세포외 매트릭스 및 인테그린의 단백질에서 발견될 수 있고, 이는 RGD 부착 에피토프(RGD adhesion epitopes)를 인지함으로써 ECM 과 함께 세포의 세포 내 세포 골격과 연결된다. 예를 들어, Foos, R Y., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. (1972) 11, 801-808을 참고하라. ECM 에 대한 부착 없이, 세포는 아포토시스를 일반적으로 겪는다.
일반적으로, 세포외 매트릭스의 당단백질 컴포넌트와 섬유아세포(fibroblasts) 사이의 상호작용은 세포 표면 인테그린에서 상호작용하는 아미노산 서열을 포함하는 RGD에 의해 주로 매개되는 주요한 흉터 형성(major scar formation)을 초래한다. RGD 서열이 염증 및 항상성 반응(homeostatic reactions) 동안에 세포-ECM 상호작용을 포함하고(Hershkoviz, S. M., et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., (1994), 35, 2585-2591) 참고하라], 인테그린이 상처 치유 또는 병리과정(pathologic processes)에서의 세포를 이송(migration)하고, 염증 및 혈전증을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것은 또한 알려졌다. 따라서, RGD 펩티드와 비슷한 강한 인테그린 길항물질은, 항-염증성(anti-inflammatory), 항-전이성 또는 항-혈전 제제(anti-metastatic or anti-thrombotic agents)로서의 약학 제제로서 매우 유용할 수 있다[Elner, S.G. and Elner, V.M., IOVS (1996) 37:696-701를 참조하라]. 히알루론산을 위한 CD44 수용체가, 히알루론산에 대한 이의 친화력(affinity)을 통해, 및 또한 가능한 오스테오폰틴(osteopontin), 콜라겐(collagens) 및 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteases, MMPs)와 같은 그 밖의 리간드에 대한 이의 친화력을 통해 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 매개함은 문헌에서 또한 보고되었다.
히알루로난(hyaluronan)과 함께 부착(Adhesion with hyaluronan)은 세포 이송, 종양 성장 및 진행에서 중요한 역할을 하고, 또한 림프구 활성화(lymphocyte activation), 재순환 및 귀환(homing), 및 조혈작용(hematopoiesis)을 포함한다. 변경된 발현 또는 기능장애(dysfunction)는 수많은 발병 표현형(pathogenic phenotypes)을 초래한다[예를 들어, Jiang D., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (2007) 23: 435-461; and Knudson, W. et al, Matrix Bio. (2002), 21: 15-23 을 참고하라].
최근에, CD44 및 세포-매트릭스 컴포넌트(예를 들어, HA)의 상호작용이, 다양한 염증성 질병의 진전(development)에서 중요한 역할을 하고, 히알루로난-CD44 상호작용의 방해(interruption)는 맥락막 신혈관형성(choroidal neovascularization)의 개선을 유도한다[Hiroshi Mochimaru et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2009) 50: 4410-4415를 참고하라].
세포-세포 및 세포-ECM 상호작용에서의 RGD 펩티드 또는 CD44와 같은 부착 분자(adhesion molecule)가 수많은 발병 질병(pathogenic diseases)의 진전에 중요한 역할을 하고, 상호작용의 저해는 상기 질병의 치료 및 치유에 있어서 신규한 치료의 타겟(novel therapeutic target)일 수 있는 이러한 증거가 입증되었다.
합성 펩티드는 또한 인테그린 및 성장 인자에 바인드됨을 나타내었다. RGD 서열을 포함하는 환화된 펜타펩티드(Cyclized pentapeptides)는 αγβ3 인테그린에 대한 비트로넥틴(vitronectin)의 결합[Michael A. Dechantsreiter, et al., J. Med. Chem. (1999) 42:3033-3040를 참조하라] 및 αγβ3 및 αIIbβ3 인테그린에 대한 비트로넥틴 및 피브로넥틴 둘다의 결합[Roland Haubner et al., J. Am. Chem. Soc., (1996)118:7461-7472를 참고하라]을 저해하는 것으로 발견되었다. 이러한 저해는 복합적인, 연관되지 않은 질병(multiple, unrelated diseases)의 치료에 유용한 것으로 나타났다. 햄스터 연구에서, 시클릭 펜타펩티드(cyclic pentapeptides)는 대조 동물과 비교해 볼 때 종양의 성장 및 상태변화(metathesis)를 지연시킨다[M. A. Buerkle et al., British J. Cancer (2002) 86: 788-795를 참고하라]. 상기 펩타펩티드는 혈관 내피(vascular endothelium)에 대한 겸상 적혈구 세포(sickle red blood cell)의 바인딩을 감소시키고, 개선된 혈류역학 작용(improved hemodynamic behavior)을 나타내었다[Eileen M. Finnegan et al., Am. J. Physiol. Heart Circ.　Physiol., (2007) 293: H1038-H1045를 참고하라]. RGD 서열을 포함하는 그 밖의 시클릭 펩티드(cyclic peptide)는 α4β1, 염증 및 면역 반응에서 백혈구 바인딩(leucocyte binding)에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 인테그린에 대해서 강한 바인딩을 갖는다[Pina M. Cardarelli et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:18668-18673을 참고하라]. 합성의, 황산으로 처리된 테트라펩티드(synthetic, sulfated tetrapeptide)는 VEGF에 강하게 바인드하는 것으로 나타났다[Maynard, J.A. Hubbell, Acta Biomaterialia (2005) 1: 451-459를 참고하라].
게다가, 중요하고 유용한 응용에서, 이합체 RGD 펩티드-약물 결합체(dimeric RGD peptide-drug conjugate)는 종양 타겟팅(tumor targeting)을 위한 인테그린-타겟된 약물 수송에 유용한 것으로 나타났다[Chen et al., J. Med. Chem., (2005) 48(4): 1098-1106를 참고하라].
또 다른 동일한 중요하고 유용한 응용에서, 다합체 방사선 표지된 RGD 펩티드(multimeric radiolabeled RGD peptides)는, 종양 검출을 위한 진단제/영상제(diagnostic/imaging agents), 및 인테그린 αγβ3 를 타겟팅함으로써 종양 특정 타겟팅 및 치료를 위한 방사선치료제(radiotherapeutic agent)로서 유용한 것으로 나타났다[Zi-Bo Li et al., J. Nucl. Medicine, (2007) 48: 1162-1171 를 참고하라].
안과(ophthalmology)에서, 섬유아세포(fibroblast)에 의한 상처 치유에서의 흉터 형성은 특히 녹내장에서 주요한 문제 중 하나이다. 이는 섬유아세포 및 ECM 의 당단백질 컴포넌트(glycoprotein components) 사이의 상호작용으로부터 발생한다. ECM 당단백질의 인지는 Arg-Gly-Asp(또는 RGD) 서열과 같은, 부착 에피토프(adhesion epitopes)에 대해 특이적인 세포 표면 인테그린을 통해 발생한다. 피브로넥틴(FN) 및 비트로넥틴(VN)을 포함하는, 혈장 단백질(plasma proteins)의 몇몇의 매트릭스에 존재하는 RGD 서열은 염증 및 항상성 반응 동안에 발생하는 세포-ECM 상호작용을 포함한다. 섬유아세포 및 ECM 의 당단백질 사이의 상호작용의 저해는 흉터 형성을 완화시킨다[Rami Hershkoviz et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (1994) 35: 2585-2591를 참고하라].
후유리체 피질(posterior vitreous cortex)의 콜라겐 원섬유(collagen fibrils)는 망막의 표면의 내부의 한정된 래미너(inner limiting lamina)에 특이적으로, 유리체망막 접촉영역(vitreoretinal interface)에 부착된다[Sebag J., Eye (1992), 6: 541-552를 참조하라]. 전체적인 후극부(entire posterior pole)에 대한 표면상의 방식(facial manner) 및 주요한 망막 혈관을 따라 유리체 기저(vitreous base), 시신경유두(optic disc)에서의 부착은, 특발성 황반원공(idiopathic macular hole), 유리체황반견인(vitreomacular traction), 증식성 당뇨 망막병증(proliferative diabetic retinopathy) 등과 같은 유리체망막 질병(vitreoretinal diseases)의 발병(pathogenesis)에서의 중요한 역할을 한다. [Akiba J. Quiroz M.A., et al., Ophthalmol. (1990) 97, 1619-1655].
혈관형성 저해(Angiogenesis inhibition)는, 둘 다 눈의 혈관(ocular blood vessel)의 과잉 성장이 원인인, 당뇨 망막병증 및 황반 변성과 함께 초기의 가능성(early promise)을 나타내었다. 이러한 질환에서, 상기 혈관이 눈에서의 일반적인 구조를 방해하거나, 또는 이들이 눈의 뒷부분에 이르는 것으로부터 빛을 차단한다(they block light from reaching the back of the eye). 새로운 혈관은 이들 자체로 기본적인 병리이고, 혈관 성장을 멈추는 것(stopping blood vessel growth)은 실명을 예방할 수 있다. 따라서, 안지오인히비션(angioinhibition)은 단지 이러한 질환의 치료를 야기하지 않는다; 이는 치유(cure)될 수 있다. 게다가, 망막으로부터의 유리체(vitreous)의 분리는, 황반원공 형성(macular hole formation)의 위험을 감소시키는, 황반 견인(macular traction)을 완화시킬 수 있다. 이에 따라서, 유리체망막 접촉영역(vitreoretinal interface)에서의 인테그린에 바인딩하는 피브로넥틴 및 라미닌(laminin)의 저해에 의한 후유리체 박리는, 당뇨 망막병증 및 망막정맥 폐쇄(retinal vein occlusion)를 갖는 눈에서의 망막의 신혈관형성(retinal neovascularization)을 예방할 수 있다[Akiba J. Quiroz MA, Ophthalmol. (1990) 97, 1619-1655; Kelly N.E., et al., Arch. Ophthalmol. (1991) 109, 654-659; and Kado M, et al., Am. J. Ophthalmol. (1988) 105: 20-24를 참고하라].
최근에, 유리체 수술 절차(vitreous surgical procedures)는 유리체망막 견인(vitreoretinal tractions)을 완화시키고, 망막의 부종(retinal edema)을 감소시키도록 크게 개선되었다. 수술 기술 및 기구에서의 지속적인 개선에도 불구하고, 망막 파열(retinal breaks), 망막 박리(retinal detachment) 및 망막 신경 섬유 손상(retinal nerve fiber damage) 등과 같은 합병증 때문에, 몇몇 환자에서 특히 당뇨병성 망막증(diabetic retinophathy) 및 소아과 환자(pediatric patients)에서 유리체 피질(vitreous cortex)의 비외상성 제거(atraumatic removal)를 성취하는데 여전히 어렵다[Sebag J., Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. (1987) 225: 89-93; and Han D.P., et al., Arch. Ophthalmol. (1998) 106: 998-1000를 참고하라]. 따라서, 망막의 손상 없이 유리체 접촉영역(vitreous interface)에 대한 선택적인 분리(cleave)에 대한 보다 적은 외상성 접근법(a less traumatic approach)은 매우 바람직하다. 최근에, 유리체망막 접촉영역(vitreoretinal interface)의 분리(separation)를 위한 수많은 약리학 제제에 관한 보고(reports)가 문헌에 보고되고 있다[Trese M.T., Eye. (2002) 16: 365-368; Gandorfer A., et al., Am. J. Ophthalmol. (2002) 133: 156-159; and Hesse L., et al., Eye Res. (2000) 70: 31-39를 참조하라]. 히알루로니다아제(hyaluronidase)(Karageozian et al.에 대한 미국 특허 번호 제6,863,886호) 및 오토로고스 플라스민(autologous plasmin)[Sakuma T, et al., Nippon Ganka Gakkai Zassi (2003) 107: 709-718]과 같은 효소를 사용한 약리학적 유리체융해(pharmacologic vitreolysis)는, 과거에 세포외 매트릭스의 소화를 촉진시키고, 후유리체 박리를 유도하는 것으로 조사되었다. 그럼에도 불구하고, 사용된 효소에 의한 인접한 조직(adjacent tissues)의 비-특이적인 파괴는 이들의 치료학적 적용의 성공을 방해한다. 지난 몇 년간, 우레아[Nickerson, C., et al., in J. Biomechanics, (2008) 41: 1840-1846, and in Macromol. Symp. (2005): 183-189를 참고하라] 및 RGD 펩티드[Leonardo B. Oliviera, et al., Curr. Eye Res. (2002) 25: 333-340를 참고하라]와 같은 비-효소적 약리학 제제(non-enzymatic pharmacologic agents)는 유리체망막 접촉영역의 분리에 집중되게 조사되었다. RGD 펩티드의 합성 아날로그(synthetic analog)가, 인테그린 - ECM 상호작용을 방해하고, 생체 외(in-vitro)에서[Williams J.A., Pathol. Bio. (1992) 40: 813-821; Gehlsen K.R., et al., J. Cell. Biol. (1988) 106: 925-930; Pierschbacher, M.D., et al., J. Biol. CHem., (1987) 262: 17294-17298; and Zhon L.L., et al., IOVS. (1996) 37: 104-113] 및 생체 내(in-vivo)에서 부착(attachment)을 느슨하게(loosen) 하기 위한 ECM 단백질의 RGD 모티프(RGD motif)와 경쟁함을 나타내었다. 따라서, 가용성 RGD 펩티드(soluble RGD peptides)의 안내 주사(intravitreal injection)는 망막 표면의 불용성 ECM 단백질로부터의 RGD-에피토프의 방출로 이어지고, 그 결과로 토끼 모델에서 비-효소적 PVD 를 용이하게 한다. 분명히, 이러한 결과는, 유리체망막 접촉영역이 내부의 제한 라멜라(inner limiting lamella, ILL)에 대한 유리체의 피질 콜라겐(vitreous cortical collagens)의 부착 뿐만 아니라 ECM 의 RGD 모티프에 대한 인테그린 연결을 포함한다. RGD 펩티드 및 이들의 유도체는 상처에 상피세포의 이송을 촉진하고[P.M. Mertz el al., J. Burn Care Res. (1996) 17: 199-206를 참고하라], 히드로겔(hydrogels)[MP Lutolf, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (2003) 100: 5413-5418; and MP Lutolf, et al., Nature Biotechnol. (2003)　21: 513-518를 참고하라], 그 밖의 중합체 매트릭스[Horng-Ban Lin et al., J. Biomed. Material. Res. (2004) 28: 329-342를 참고하라] 또는 하드 기질(hard substrates)에서의 표면 필름(surface films)과 같은 합성 생체물질 내로 포함되었을 때, 이들의 생활성(bioactivity)을 유지한다. RGD 펩티드는 또한 펩티드 서열로 코팅된 혈관 인공 기관(vascular prostheses)[K.Walluscheck el al., Eur. J. Vascular and Endovascular Surgery (1996) 12: 321-330를 참고하라] 및 그 밖의 인공적인 기관(other artificial organs)[Jeschke, Brigette, Biomaterials (2002) 23: 3455-3463를 참고하라]에 대한 상피 또는 내피 세포의 증가된 부착을 촉진시키고, 신경 재성장을 지원하는 것으로 나타났다[M. Rafiuddin Ahmed et al., Brain Res. (2003) 993:208-216를 참고하라]. 인공기관의 생물학적으로 유효한 표면(prostheses's biologically active surface)은 합성의 수지 섬유 또는 중합체(synthetic resin fibers or polymers)를 포함할 수 있다.
도 1 은, 상처 치유의 반응속도론(kinetics)에서, 세 가지 펩티드, 즉 시클릭-RGD-펩티드, RG 시스테산 펩티드(화합물 1) 및 RGE 펩티드의 효과를 나타낸 것이다.
도 2 는, RG 시스테산 펩티드(화합물 1)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3 은, RG 시스테산 펩티드(화합물 1)의 전자분사 질량 크로마토그램(Electrospray mass chromatogram)을 나타낸 것이다.
도 4 는, 시클릭-RG 시스테산 펩티드(화합물 2)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5 는, 시클릭-RG 시스테산 펩티드(화합물 2)의 전자분사 질량 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6 은, 본 발명의 화합물들의 작용의 메카니즘(mechanism)을 나타내는 계통도(schematic diagram)이다.
도 7a 및 7b 는 본 발명의 조성물의 작용의 메커니즘을 나타내는 추가적인 계통도이다.
도 8 은, 다양한 투여량의 화합물 1 및 대조군(control)[비히클만(vehicle only)]을 처리한 후에 14 일에 CNV 마우스 모델에서 신혈관형성의 전체 영역을 나타내는 그래프이다.
도 9 는, 다양한 투여량의 화합물 1 및 대조군(비히클만) 후에, ROP 마우스 모델에서 신혈관형성의 측정된 영역을 비교하는 막대 그래프(bar graph)이다.
도 10a 내지 10h는, 화합물 1의 인간 다중 투여 임상 실험(human multiple dose clinical trial)의 결과를 나타내는 그래프 및 도표이다.
도 11a 내지 11c는, 유전자 변형 VEGF-생산하는 마우스(transgenic VEGF-producing mice)에서 망막의 신혈관형성에서 라니비주맙(ranibizumab) 및 단독으로 화합물 1 및 둘 다를 병용(combination)한 효과를 비교하는 막대 그래프이다.
상세한 설명 및 실시예
본 발명은, 상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅶ의 화합물을 포함하는, 신규한 화합물을 제공한다. 특정한 예는 Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH의 선형 형태(linear form)(화합물 1로서 본원에서 언급된 예) 및 Arg-Gly-NH-CH(CH2-SO3H)COOH)의 고리 형태(cyclic form)(화합물 2로서 본원에서 언급된 예) 뿐만 아니라 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물(hydrate), 입체이성질체(stereoisomers), 다합체(multimers), 고리 형태, 선형 형태, 약물-결합체(drug-conjugates), 프로-드러그(pro-drugs) 및 이들의 유도체를 포함하는 이의 유도체(derivatives)를 포함한다.
화합물 1 및 2 의 합성
본 분야에서의 일반적인 기술의 숙련자에게 알려진 본 분야에서 일반적인 고체-상 펩티드 합성(solid-phase peptide synthesis)(SPPS; R.B. Merrifield, J. Am. Chem . Soc . (1963) 85 (14): 2149-2154를 참고하라)을 실시할 수 있다. SPPS는 높은 수득률(high yields) 때문에 바람직한 합성 방법이다. 일반적으로, 고체상 펩티드 합성 기술의 첫 번째 단계는 중합체의 지지(polymeric support)에서 보호된 아미노산 유도체와 함께 펩티드 사슬 조합(peptide chain assembly)으로 구성된다. 기술의 두 번째 단계는, 정제되지 않은 유리 펩티드(the crude free peptide)를 수득하도록, 모든 곁사슬 보호 기의 동시에 발생하는 분열(the concurrent cleavage)을 갖는 수지 지원(resin support)으로부터의 펩티드의 분열(cleavage)이다. SPPS의 일반적인 원리는 커플링-탈보호(coupling-deprotection)의 반복된 주기 중의 하나이다. 고체-상 부착된 펩티드(solid-phase attached peptide)의 유리 N-말단 아민(The free N-terminal amine)은 단일 N-보호된 아미노산 단위와 결합되었다. 그리고 난 다음에, 이러한 단위는 추가적인 아미노산이 부착되는 새로운 N-말단 아민이 나타나면서 탈보호되었다. 합성, 보호 및 탈보호 전략에 대한 Von G. M. Coppola and H. F. Schuster; John Wiley & Sons, New York 1987 의 비대칭 합성 및 보호 및 탈보호 전략에 대한 Greene's Protective Groups in Organic Synthesis by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, (2nd edition) J. Wiley & Sons, 1991 을 참고하라.
고체상 펩티드 합성의 두 가지 주요한 사용된 형태 중 - Fmoc[9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; 염기성의 불안정한 알파-아미노 보호기(base labile alpha-amino protecting group)] 및 t- Boc(t-부틸옥시카르보닐; 산성의 불안정한 보호기), Fmoc는 본 펩티드의 합성에서 바람직하게 사용될 수 있다. 각각의 방법은 상이한 수지 및 아미노산 곁-사슬 보호 및 결과의 분열/탈보호 단계(cleavage/deprotection steps)를 포함한다. 수지로부터의 분열 후에, 펩티드는 C-18, C-8, 및 C-4와 같은 컬럼을 사용한 역상 HPLC로 일반적으로 정제되었다.
고체상 펩티드 합성의 예
하기는, 염기성의 불안정한 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 보호기를 사용하여, 고체 지지제(solid support)로서의 Wang 수지에서의 펩티드 합성을 위한 합성 단계의 개요이다.
Fmoc 탈보호( deprotection )
플라스틱 캡(plastic cap)이 갖추어진 용융된 컬럼 내로 0.08 mmol의 Fmoc-Pro-Wang 수지를 로딩하였다(Load). 각각 1 분 동안 DMF(디메틸포름아미드)의 2 X 3-ml 일부(portion)로 수지를 세척하였다. 그 다음에, DMF 에서의 약 3 ml 의 20 % 피페리딘을 첨가하고, Fmoc 탈보호가 15 분 동안 지속되도록 하였다. 이러한 시기 동안에, 완전한 혼합을 확인하기 위해 컬럼을 서서히 돌리거나 또는 휘저었다. 반응이 완료된 후에(약 15 min), 반응 컬럼에서 액체를 빼내고, DMF(4 x 3 ml)로 수지를 다시 세척하였다.
아미드 결합 커플링( Amide bond coupling )
원하는 Fmoc-보호된 아미노산, Fmoc-Thr-tBu, [3 eq.; 공급자에 의해 나타낸 로딩된 수지에 비례(relative to resin loading indicated by supplier)] 및 DCM(아미노산에 대해 0.5 M)에서의 DIEA(6 eq.)를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 20 분 동안 - 20℃로 냉각시켰다. 그 다음에, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate, PyBOP), 고체상 펩티드 합성(3 eq.)에서 사용된 펩티드 커플링 시약을 상기 반응물에 첨가하였다. 8 시간 동안 - 20℃에서 교반시킨 후에, 반응 혼합물을 빼내고 (drained), 수지를 DCM(3x)으로 세척하였다.
DMF(15 min)에서의 20 % 피페리딘을 사용한 Fmoc 탈보호한 후에, DMF(3x)로 세척하고, 그 다음에 Fmoc로 아미노산[3 eq.; 수지 로딩에 관하여(relative to resin loading)]을 탈보호시키고, PyBop는 상기한 바와 같이 동일한 방식으로 결합시켰다.
분열( Cleavage )
유리 산성 형태에서의 펩티드를 수득하기 위해, 에스테르 결합(ester linkage)을 TFA(트리플루오로아세트산)와 같은 강한 산성 조건을 사용하여 분리하였다(cleaved). 95 : 5 트리플루오로아세트산 및 물의 2-3 ml의 용액으로 수지를 세척하였다. 25 분의 기간 동안 수지를 서서히 휘저었다. 그 다음에, 컬럼에서 액체를 빼내고, 유리 수집 관(glass collection vessel) 내로 여과물을 조심스럽게 수집하였다.
화합물 1의 합성(GRG 시스테산 TP):
Figure pct00009

단계 1. 수지 로딩(Resin Loading) : 프롤린으로 예비로딩된(preloaded) o-클로로트리틸 수지(o-chlorotrityl resin)를 출발 물질로서 사용하였다.
단계 2. 펩티드 조립 : Fmoc 합성은 펩티드를 조립하는데 사용되었다. 보호된 아미노산은 PyBOP와 활성화되었고, 말단 Fmoc기(terminal Fmoc groups)는 DMF 에서의 20 % 피페리딘으로 제거되었다. 하기의 보호된 아미노산은 그들이 나타난 순서대로 사용되었다:
a. Fmoc-Thr-tBu (Fmoc 트레오닌-t-부틸 에스테르)
b. Fmoc-시스테산-Pfp (Fmoc 시스테산-펜타플루오로페닐 에스테르)
c. Fmoc-Gly(Fmoc 글리신)
d. Fmoc-Arg-Pbf(NαFmoc-Nω(2,2,4,6,7 펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐)-L-아르기닌)
e. Fmoc-Gly (Fmoc 글리신)
단계 3. 수지로부터의 펩티드 분열(peptide cleavage) : 결과적으로 생성된 펩티드를 고체 지지제(solid support)로부터 분열시켰고, 보호기를 85.5 % TFA, 5 % 페놀, 2 % 물, 5 % 티오아니솔(thioanisole), 및 2.5 % 에탄디티올(ethanedithiol)의 용액으로 제거되었다.
단계 4. 정제 : 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 결과적으로 생성된 RG 시스테산 펩티드를 정제하는데 사용되었다.
상기한 바와 같이 화합물 1의 양을 순도(purity)에서의 > 98 % 영역/영역(area)일 수 있는 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하였다[HPLC 조건: 완충용액 A : 물에서의 0.1 % 트리플루오로아세트산(TFA), 완충용액 B : 아세토니트릴(acetonitrile)에서의 0.1% TFA, 이동상(MP) A(Mobile Phase A): 97 % 완충용액 A 및 3 % 완충용액 B, 이동상 B: 79 % 완충용액 A 및 21 % 완충용액 B, 이동상 C: 50 % 완충용액 A 및 50 % 완충용액 B; 그래디언트(gradient)에 대해서 하기의 표 1을 참고하라; 유량(flow rate): 1.0 mL/분; 칼럼(column) : Waters Symmetry® C18, 5μ 4.6 x 250 mm; 칼럼 온도: 30 ℃; 검출기(detector): UV@220nm; 샘플 주입 부피(sample injection volume): 20.0 μL; 샘플 제조(sample preparation): 1.0 mL 이동상 A 로 희석된 20 μL 샘플(대략 0.5 mg/mL)]. 이에 해당하는 HPLC 크로마토그램을 도 2 에 나타내었다. 게다가, 펩티드 서열의 합성을 위한 이에 해당하는 아미노산의 순차적인 첨가(stepwise addition)를 기초로, 정제된 화합물 1 의 분자량은 638.3 amu으로 전기분사 질량 분석법(Electrospray Mass Spectrometry)으로 측정되었고, 화합물 1과의 동일성을 확인하였다. 화합물 1의 전기분사 질량 스펙트로그램을 도 3 에 나타내었다.
[표 1]
Figure pct00010

화합물 2(시클로-RG CYSTEIC ACIDysteic Acid fN(CH3)V)의 합성:
Figure pct00011

단계 1. 수지 로딩 : o-클로로트리틸 수지(o-chlorotrityl resin)는 출발 물질로서 사용되었다. Fmoc-N□-메틸-L-Val은 수지에 부착되었다.
단계 2. 펩티드 조립 : 2. Fmoc 합성은 펩티드를 조립하는데 사용되었다. 보호된 아미노산은 PyBOP와 활성화되었고, 말단 Fmoc기는 DMF 에서의 20 % 피페리딘으로 제거되었다. 하기의 보호된 아미노산은 이들이 나타난 순서대로 사용되었다:
a. Fmoc-Phe (Fmoc-페닐 알라닌)
b. Fmoc-시스테산-PfP (Fmoc-시스테산 펜타플루오로페닐 에스테르)
c. Fmoc-Gly (Fmoc-글리신)
d. Fmoc-Arg-Pbf (NαFmoc-Nω(2,2,4,6,7 펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐)-L-아르기닌)
단계 3. 수지로부터의 펩티드 분열 : 펩티드는 아세트산/TFA/DCM (1:3:3)을 사용한 고체 지지제로부터 분열되었다.
단계 4. 원하는 고리형 펩티드에 대한 고리화(Cyclization) 및 탈보호(deprotection) : 높은 희석(high dilution) 하에서 디페닐포스포릴아지드(diphenylphosphorylazide) 및 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate)을 사용한 원위치 활성(in situ activation)을 통한 고리화(Cyclization). 곁사슬은 85.5 % TFA, 5 % 페놀, 2 % 물, 5 % 티오아니솔(thioanisole), 2.5 % 에탄디티올(ethanedithiol)을 사용하여 탈보호되었다.
단계 5. 정제 : HPLC 은 정제를 위해 사용되었다.
상기한 바와 같이 제조된, 화합물 2의 양을 순도에서의 > 99 % 영역/영역일 수 있는 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하였다[HPLC 조건: 이동상 A : 물에서의 0.1 % 트리플루오로아세트산, B : 0.1% TFA(80 % 아세토니트릴 플러스 20 % 물); 20 분에 그래디언트(gradient) 26 % 내지 36 % B ; 유량: 1.0 mL/분; 칼럼 :Phenomenex C18(2) 4.6x150mm, 5m, 100A; 검출기: UV@220nm; 샘플 주입 부피: 100.0 μL). 이에 해당하는 HPLC 크로마토그램을 도 4 에 나타내었다. 게다가, 펩티드 서열의 합성을 위한 이에 해당하는 아미노산의 순차적인 첨가(stepwise addition)를 기초로, 정제된 화합물 2의 분자량은 625.3 amu(이론적인 질량 : 625.77 amu)으로 전기분사 질량 분석법으로 측정되었고, 화합물 2와의 동일성을 확인하였다. 화합물 2의 전기분사 질량 스펙트로그램을 도 5 에 나타내었다.
세포의 부착( Cellular Adhesion )을 저해하기 위한 방법
본 발명은, R-G-시스테산[즉, R-G-NH-CH(CH2-SO3H)COOH의 선형 형태 또는 R-G-NH-CH(CH2-SO3H)COOH의 고리 형태] 또는 이의 유도체(약제학적으로 허용가능한 염, 수화물, 입체이성질체, 다합체, 고리형태, 선형형태, 약물-결합체, 프로드러그 및 이들의 유도체를 포함)의 유효량을 인간 또는 동물 피검자에서 투여하여 상기 피검자에서의 RGD 바인딩 부위에 대한 세포의 부착을 저해하기 위한 방법을 또한 제공한다.
출원인은, 본 발명의 합성 RG 시스테산 펩티드가 ECM 컴포넌트에 대한 세포 부착을 경쟁적으로 저해하여 아포토시스를 유도함을 발견하였다. 따라서, 본 합성 RG 시스테산 펩티드 및 이들의 유도체는 혈관형성, 염증, 암 전이, 혈전증, 흉터 형성의 예방 및 치료 뿐만 아니라 약학적인 유리체융해제(pharmacological vitreolysis agents)에 대한 치료제로서의 강한 인테그린 길항물질로서 사용될 수 있다. 게다가, 본 발명의 중요한 양상에서, 종양 검출(진단제 또는 영상제) 및 종양 치료를 위한 내부의 방사선치료제(internal radiotherapeutic agents)로서 사용하기 위한, 다합체된 및 방사선 표지된 RG 시스테산 펩티드(multimerized and radiolabeled RG CYSTEIC ACID peptides)를 사용하는 α, β 인테그린의 개선된 타겟팅을 예상하였다. 또 다른 중요한 양상에서, 개선된 RG 시스테산 펩티드 결합체(improved RG CYSTEIC ACID peptide conjugates) 또는 다합체 RG 시스테산 펩티드 결합체는, 약물 전달체 예를 들어 효율적인 종양 타겟팅을 위한 항-암 약물 전달체로서 작용한다(function).
본원에서 기재된 바와 같이, RG 시스테산 펩티드에서의 술폰산은 RDG-펩티드에서 이에 상응하는 카르복실산 보다 더 강한 산성이다. 술폰산 기의 이러한 보다 높은 극성은 보다 강한 분자 간의 결합으로 이어진다. 예를 들어, 인테그린 바인딩 부위에서의 아미드기 및/또는 단백질의 아미노산의 곁사슬을 갖는, 보다 양극화된(more polarized) O-H 결합을 갖는 R-G-시스테산은, 상대적으로 낮은 양극화된 O-H 결합을 갖는 R-G-아스파르트산 보다 강한 수소 결합을 형성할 수 있고/있거나, 인테그린 바인딩 부위에서 복합된 금속 이온과 함께 보다 강한 상호작용을 갖는다. 따라서, 본 발명의 신규한 RG 시스테산 펩티드 및 이들의 유도체는, 인테그린 수용체 인식 및 바인딩에서의 이에 상응하는 RGD 펩티드 상에서의 개선된 화합물 및 조성물을 나타내었다.
게다가, 증가된 IOP와 관련된 만성 고혈당증(chronic hyperglycemia)을 갖는 당뇨 환자에서, 개방각 녹내장(open angle glaucoma)은 섬유주대 조직(trabecular meshwork tissue)에서 피브로넥틴의 축적과 연관된 것으로 보고되었고, 과량의 피브로넥틴은 수성의 유출(aqueous outflow)을 저해하는 것으로 여겨진다[Oshitari, T, et al., Am. J. Ophthalmol. (2007) 143:363-365를 참고하라]. 섬유주대에서의 세포-ECM 상호작용에서의 피브로넥틴의 개입은 초기 개방각 녹내장(primary open angle glaucoma)에서 보여주었다[Mark S. Filla, et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2002) 43:151-161; and Cheryl R. Hann, et al.,Ophthalmic Res. (2001) 33: 314-324를 참고하라]. 쉴렘관(Schlemm's canal)의 내피 세포는 유출 기능에 영향에 있어서 세포외 매트릭스와 상호작용한다[Cindy K. Bahler et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2004) 45: 2246-2254를 참고하라]. 피브로넥틴과 같은 과량의 세포외 매트릭스 컴포넌트의 존재에 의한 수성의 유출의 저해를 고려하여, 당뇨 환자의 증가된 IOP를 치료하기 위한 RG 시스테산 펩티드 및 이들의 유도체의 적용은 당뇨 환자에 대해 매우 이로울 수 있다.
선호되는 RG 시스테산 펩티드는 융합 폴리펩티드, 고리형 또는 선형 폴리펩티드, 또는 약물 수송 시스템 또는 예를 들어, 항-암 약물, 다합체된 RG 시스테산 펩티드, 인테그린의 바인딩 부위 또는 이의 기능적인 단편과 면역반응하는 RG 시스테산 서열을 포함하는 단일클론 항체와 같은 그 밖의 약물과 관련된 또는 결합된 RG 시스테산 펩티드를 포함하는, 유도된 폴리펩티드(derivatized polypeptide)일 수 있다.
폴리펩티드를 포함하는 RG 시스테산은, 피브리노겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 라미닌(laminin), 트롬보스폰딘(thrombospondin) 및 유사한 리간드로 나타낸 것과 같은, 천연의 인테그린 부착 바인딩 영역의 아미노산 잔기 서열과 일치하는 서열을 가질 수 있다.
본 펩티드 서열은, 펩티드 단편, 당단백질 및 PEG, 플루오닉(Pluronic) 및 그 밖의 중합체 그룹(polymer groups)과 같은 중합체 그룹, 리포솜(liposome) 및 나노입자를 포함하는, 약물 전달 시스템과 결합된 및/또는 관련된 말단 구아니디노(terminal guanidino), 술폰(sulphonic) 및 카르복실기 및 이의 유도체를 갖는 세 가지 아미노산으로 이루어져 있다. 다양한 병리학상의 장애의 치료를 위한 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 주사가능물질(injectable), 겔(gel), 현탁액(suspension), 연고(ointment), 고체 및 액체 제형(solid and liquid dosage forms)을 포함한다.
피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌(laminin), 피브리노겐, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 및 본 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)와 같은 세포 부착 모티프와 관련된 인테그린 수용체는 RG 시스테산 펩티드 및 이의 유도체의 타겟 에피토프이다. 트리펩티드, RG 시스테산은 세포 바인딩 도메인에 의해 인지할 수 있는 최소한의 아미노산 서열로서 발견되었다. 이러한 서열은 인테그린과 관계없는 면역 기능을 또한 간섭한다. 따라서, 합성의 RG 시스테산 서열은 모방한(mimic) RGD 세포 바인딩 도메인이고, 아스파르트산의 α-탄소는 타겟 인테그린에 대한 보다 강한 바인딩 친화도를 제공함을 발견하였다. RG 시스테산-펩티드에서의 술폰산은 RDG-펩티드에서의 이에 상응하는 카르복실산 보다 강한 산이다. 술폰산 기의 이러한 보다 높은 극성은 보다 강한 분자 사이의 결합으로 이어진다. 예를 들어, 인테그린 바인딩 부위에서의 아미드 기 및/또는 아미노산의 곁사슬을 갖는, 보다 양극화된 O-H 결합을 갖는 R-G-시스테산은, 상대적으로 보다 적은 양극화된 O-H 결합을 갖는 R-G-아스파르트산 보다 강한 수소 결합을 형성할 수 있고/있거나, 인테그린 바인딩 부위에서 복합된(complexed) 금속 이온과 보다 강한 상호작용을 할 수 있다.
본 발명의 RG 시스테산 서열에 대한 가장 일반적인 화학식은 하기와 같다:
[화학식 A]
Figure pct00012
이 식에서, X = -CH(R1)-S(=O)2-Y ;
-CH(R1)-SH;
-CH(R1)-OZ;
-CH(R1)S(=O)Y;
-CH(R1)-O-S(=O)2-OX1; 및
-CH(R1)-O-P(=O)2-OX1 ; 및
이 식에서, Y = OX1, NH2; X1 = -H, C1-C6 직쇄 알킬, 페닐; R1 = H, C1-C6 직쇄 알킬, 페닐 또는 SO3H, Z = H, SO3H.
[화학식 B]
Figure pct00013
이 식에서, X = -CH(R1)-S(=O)2-Y ;
-CH(R1)-SH;
-CH(R1)-OZ;
-CH(R1)S(=O)Y;
-CH(R1)-O-S(=O)2-OX1; 및
-CH(R1)-O-P(=O)2-OX1 ; 및
이 식에서, Y = OX1, NH2; X1 = -H, C1-C6 직쇄 알킬, 페닐; R1 = H, C1-C6 직쇄 알킬, 페닐 또는 SO3H, Z = H, SO3H; 및
A2는 하기로부터 선택된 것이다: -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe-Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val, 또는 염 또는 이의 N-알킬화된 유도체. Arg, Gly, Cysteic, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr의 D-형태 또는 L-형태의 어떠한 컴비네이션 뿐만 아니라 상기 서열의 고리형태를 사용할 수 있다.
고리형태의 예는 하기를 포함한다:
[화학식 C]
Figure pct00014
이 식에서, X'은 H, C1 - C6 알킬, Ph, SO3H 로부터 선택된 것이고; Y = OH, NH2 및 Z = H, CH3.
고리 형태는, 예를 들어 화학식 C의 특정한 화합물, 즉 하기에 나타낸 화합물 2[시클로-RG시스테산 fN(CH3)V]와 같은 펩타 및 헵타 펩티드(penta and hepta peptides)를 또한 포함한다:
Figure pct00015

화학식 A 는 본원에 기재된 화합물 Ⅰ 내지 Ⅵ을 포함한다. 화학식 B 는 본원에 기재된 화합물 Ⅶ을 포함한다.
[화학식 D]
Figure pct00016
이 식에서, X = -CH(R1)-S(=O)2-Y ;
-CH(R1)-SH;
-CH(R1)-OZ;
-CH(R1)S(=O)Y;
-CH(R1)-O-S(=O)2-OX1; 및
-CH(R1)-O-P(=O)2-OX1 ; 및
이 식에서, Y = OX1, NH2; X1 = -H, C1-C6 직쇄 알킬, 페닐; R1 = H, C1-C6 직쇄 알킬, 페닐 또는 SO3H, Z = H, SO3H; 및
A1 및 A2 은 하기로부터 선택된 것이다: -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe-Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val, 또는 염 또는 이의 N-알킬화된 유도체. Arg, Gly, Cysteic, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr 의 D-형태 또는 L-형태의 어떠한 컴비네이션 뿐만 아니라 상기의 서열의 고리형태를 사용할 수 있다.
치환된 RG 시스테산 서열은 시클릭 RG 시스테산 아날로그(cyclic RGCysteic acid analogues)를 포함한다.
RG 시스테산 및 이의 유도체의 적용은, 약물 수송 시스템 또는 주사(injection)의 어떠한 약제학적으로 허용가능한 제형 또는 고형 또는 연고 제형을 사용함으로써, 피하의(subcutaneously), 피부적으로(dermatologically), 안과적으로(ophthamically) 및 조직적으로(systemically) 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 하기를 포함하지만 이로 제한되지 않는 의도된 치료상의 효과를 유발하기에 적절한 어떠한 경로에 의해 투여될 수 있다: 경구(oral), 직장(rectal), 정맥(intravenous), 동맥 내(intraarterial), 피부 내(intradermal), 피하(subcutaneous), 근육 내(intramuscular), 척추 강내(intrathecal), 설하 동맥(sublingual), 구강(buccal), 비강 내(intranasal), 경점막(transmucosal), 피부를 통한(transdermal), 국소의(topical), 안구 내(intraocular), 안내(intravitreal), 그 밖의 장(other enteral), 그 밖의 비경구(other parenteral) 및/또는 투여의 그 밖의 가능한 경로.
본 발명의 화합물은, 부적당한 또는 유독한 효과를 피하면서 의도된 치료학적 효과를 제공하는 어떠한 투여량으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 일반적은 투여량은 약 1 ng/kg 내지 약 1.0 g/kg의 범위로 인간 피검자에게 투여될 수 있다.
가능한 및 적절한 경우에, 본 발명의 화합물은 리포솜(liposome) 또는 나노입자[즉, 나노캡슐(nanocapsules)]의 형태로 선택적으로 제조될 수 있다. 리포솜의 형태 및 용도는 본 분야의 숙련자에게 일반적으로 알려졌다. 리포솜은, 수성 배지에서 분산된 인지질로부터 형성되어서, 이들은 때때로 다중층 소포(multilamellar vesicles, MLVs)로서 언급된 멀티라멜라 중심의 이중층 소포(multilamellar concentric bilayer vesicles)를 자발적으로 형성한다. MLVs 는 일반적으로 직경이 25 nm 내지 4 μm 이다. 초음파로 분해(sonicated)시켰을 때, MLVs 는 수용액을 포함하는 중심을 갖는 약 200 내지 500 옹스트롬(angstroms)의 직경의 소형 단일층 소포(small unilamellar vesicles, SUVs)를 형성한다. 일반적으로, 수성 배지에서 분산되었을 때, 인지질은 물에 대한 지질의 몰비(molar ratio of lipid to water)에 따라, 리포솜 외의 다양한 구조를 형성할 수 있다. 물 비율에 대한 보다 낮은 몰 지질에서(At low molar lipid to water ratios), 리포솜이 형성될 것이다. 리포솜의 물리적인 특성은 pH, 탄력성(tonicity) 및 2가 양이온(divalent cation)의 존재 또는 비-존재에 의존한다. 리포솜은, 1) 엔도시토시스(endocytosis)[예를 들어, 대식세포(macrophages) 및 호중구(neutrophil)와 같은 세포에 의한 리포솜의 식세포작용(phagocytosis)], 세포 표면에 대한 흡착(adsorption), 2) 세포-표면 컴포넌트와의 상호작용, 3) 원형질막(plasma membrane) 내로의 리포솜의 지질 이중층(lipid bilayer)의 삽입에 의한 플라즈마 세포막과의 융합(fusion), 또는 4) 리포솜 지질에서 세포의 또는 아세포의 막(cellular or subcellular membranes)으로의 이동(transfer) 또는 그 반대를 포함하는, 상이한 메커니즘에 의해 세포와 상호작용할 수 있다. 다양한 리포솜 제형은, 상기 리포솜이 부비강(paranasal sinus), 비점막(nasal mucosa) 등에서 세포와 상호작용할 것이다.
나노캡슐은, 원하는 물질이 배치될 수 있는 셀(shell) 및 공간으로 이루어진 어떠한 나노입자이다. 나노캡슐 형성을 위한 기술은 본 분야에서 알려져 있다. 중합의 나노캡슐(Polymeric nanocapsules)은 특정한 크기 및 형태로 제조될 수 있다. 이들은 정확하게 밝혀진 물리적 및 화학적 특성을 갖는 단분산 입자(monodisperse particles)로서 생산될 수 있고, 따라서 pH, 점액 흐름(mucous flow), 또는 부비강 또는 장치가 이식될 귀, 코 또는 목에서 그 밖의 영역 내에 존재하는 그 밖의 조건과 같은 특정한 이분자 트리거 메커니즘(bimolecular triggering mechanisms)에 대응하는 치료상의 또는 진단상의 물질의 방출을 촉진시키도록 제작될 수 있다. 나노캡슐은, 특정한 타겟 세포[예를 들어, 암 세포 또는 염증 증상과 관련된 세포]에 결합할 수 있는 특정한 화학적인 수용체 또는 바인딩 부위를 갖는 "스마트 약물(smart drugs)"로서 본 발명에서 사용될 수 있다.
하기는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 제조(pharmaceutical preparations)를 위한 제형의 이로 제한하지 않는 예이다. 또한, 저해되는 세포 부착에서의 모범적인 RG 시스테산 펩티드 또는 유도체를 사용하여 나타낸 안전성 및/또는 효능의 예이다. 본원에 사용될 수도 있는 바와 같이, 용어 "RG 시스테산 펩티드(RG CYSTEIC ACID Peptide)", "RG 시스테산 펩티드(RGCysteic Acid peptide)", "RGC" 및 "RGCys-펩티드" 및 "본 발명의 화합물"은, 본원에 기재된 바와 같이 화학식 Ⅰ 내지 Ⅶ 및 화합물 1 및 3 내지 5로 나타낸 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 서열 R-G-시스테산 및 이들의 유도체를 포함하는 조성물을 동의어의 의미일 것이다.
눈 질병의 치료를 위한 타겟된 인테그린 수용체 치료를 위한 방법
본 발명의 조성물의 많은 잠재적인 치료용 용도 중에 포함된 것은, 망막의 지나친 혈관신생에 의해 특징지어지는 눈의 특정한 질환["신생혈관성 눈 질병(neovascular eye deisease)"으로서 일반적으로 본원에 언급됨]의 치료이다. 하기의 비-제한적인 예는, 이러한 신생혈관성 눈 질환을 치료하기 위해, 오직 본 발명의 조성물, 및 그 밖의 제제와 함께 본 발명의 조성물의 용도를 논의한다.
이러한 특허 출원에 사용된다면 및 사용된 경우에, 하기의 머리글자 및 약자는 하기의 의미를 가질 것이다:
AE 부작용(Adverse Event)
Allegro 알레그로 오프탈믹스, 엘엘씨(Allegro Ophthalmics, LLC)
AMD 노인 황반 변성(Age-Related Macular Degeneration)
BCVA 최대 교정 시력(Best corrected visual acuity)
CNV 맥락막 신혈관형성(Choroidal Neovascularization)
CRA 임상시험 전문요원(Clinical Research Associate)
DME 당뇨 황반 부종(Diabetic Macular Edema)
DR 당뇨 망막병증(Diabetic Retinopathy)
Dry AMD 건성 노인 황반 변성(Dry Age-Related Macular Degeneration)
ERG 망막전도기록(Electroretinography)
ETDRS 조기 치료 당뇨성 망막증 연구(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study)
FDA 미국식품의약국(Food and Drug Administration)
GCP 임상시험 실시기준(Good Clinical Practice)
IOP 안압/안압측정(Intraocular Pressure/Tonometry)
IRB 기관감사위원회(Institutional Review Board)
OCT 빛간섭단층촬영(Optical Coherence Tomography)
OD 오른쪽 눈(Right eye)
OS 왼쪽 눈(Left eye)
PI 주된 조사관(Principal Investigator)
PDR 증식성 당뇨 망막병증(Proliferative Diabetic Retinopathy)
PVD 후유리체 박리(Posterior Vitreous Detachment)
RVO 망막 정맥 폐쇄(Retinal Vein Occlusion)
SAE 심각한 부작용(Serious Adverse Event)
SC 연구 코디네이터(Study Coordinator)
USP 미국약전(United States Pharmacopeia)
VEGF 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor)
Wet AMD 습성 노인 황반 변성(Wet Age-Related Macular Degeneration)
노인 황반 변성(AMD)는 서방세계에서 실명의 주된 원인이고, 이러한 증상을 갖는 환자는 황반, 또는 망막의 중심 부분에 대한 돌이킬 수 없는 손상으로 고통받는다. 건성 AMD 는 서서히 점진적인 시각 손실을 일으키면서, 습성 AMD 는 중심 시력의 빠른 악화를 유도할 수 있다. 습성 AMD는 영향을 받은 환자에서 심각한 시력 손실의 압도적인 득표를 유발하지만, 둘 다의 형태는 21st 세기 동안 주요한 공중 건강 관심을 나타낸다. 대략 1.5 백만 미국인은 AMD 에 버금가는, 맥락막 신혈관형성(choroidal neovascularization, CNV)을 갖고, 매년 각각 200,000명의 새로운 케이스가 발생한다. AMD의 발생 정도(incidence) 및 보급의 비율 모두가 나이와 함께 증가됨이 뒷받침되어 있다. 미국에서, 65 세 이상의 사람은 인구의 가장 큰 부분 중의 하나를 형성하고, 이러한 인구통계학의 범위는, 다가오는 10년을 넘어 실질적으로 증가될 것으로 예상된다. 미국에서 85 세 이상의 인구는 2020년에 두 배로 예측된다. 따라서, AMD 는 미국에서 중요한 공중 건강 문제를 나타낸다. 특히, 습성 AMD 는 AMD와 함께 환자에서 안 좋은 시력(poor vision)을 일으키는 가장 현저한 요소이다. 습성 AMD 는, 맥락막 혈관형성(choroidal angiogenesis), 즉 상기 망막 하의 비정상적인 혈관의 발달에 의해 특징지어 진다. 이러한 혈관은 유동체(fluid)가 유출되고, 출혈되고, 섬유혈관성 반흔 조직(fibrovascular scar tissue)으로 변형된다. 이러한 과정은, 가로놓인 광수용기(overlying photoreceptors)를 방해하고, 심각한 시각적인 손실을 일으킨다. 줄어든 맥락막 관류(diminished choroidal perfusion)가 AMD에서 광수용기 손실 및 망막 색소 상피세포(retinal pigment epithelial, RPE)를 유도하는 좋은 증거가 있다. 당뇨 황반 부종(Diabetic macular edema, DME)은, 당뇨병으로부터 망막 모세혈관의 손상을 일으키는 망막의 중심 부분을 두껍게 하는 결과이다. DME는, 더 이상 일할 수도 없는 사람 뿐만 아니라 이러한 인구에서 또한 가벼운 내지 보통의 시각 장애를 일으키는 일하는 연령 인구에서 실명을 유도하는 원인이다. 흐려진 망막(thickened retina) 내의 손상된 모세혈관에 레이저의 적용은, 25 년 이상 동안에 치료의 중심이 되어왔다. 당뇨성 망막증 임상 연구 네트워크로부터의 최신의 결과는, 황반의 중심을 포함하는 DME로부터 감소된 시력을 갖는 눈에서, 초점/그리드 레이저(focal/grid laser)와 함께 루센티스(Lucentis)와 함께 항-VEGF 치료가 레이저 단독의 이전의 표준 치료와 비교하여 수용가능한 안전성 프로파일 및 보다 우세한 시각 결과를 제공함을 보여준다. 이전-망막의(pre-retinal) 및 맥락막 신혈관형성(choroidal neovascularization)의 발달을 포함하는 분자에 의한 사건은, 완전하게 설명되지 않고 있다; 그러나, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)는 상기 과정에서 주요한 역할을 하는 것으로 나타내고 있다. 또한, 인테그린 α5β1, αγβ3 및 αγβ5 은 혈관형성 과정에서 연루되었음을 보여주고 있고, 습성 AMD 및 PDR을 갖는 환자로부터 신생혈관성 시각 조직(neovascular ocular tissue)에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 중요한 역할을 하는 많은 그 밖의 분자들이 있다 : bFGF, IL-8, PDGF, 플라스미노겐 활성제(plasminogen activator) 및 매트릭스 메탈로프로테나이제(matrix metalloproteinases)를 포함하는 다양한 단백질 분해효소(various proteases), 케모카인(chemokines) 및 그 밖의 염증성 매개체(other inflammatory mediators). 내피 세포 증식(Endothelial cell proliferation), 증가된 혈관 투과성(increased vascular permeability), 염증, 및 VEGF의 과도한 생산은, 습식 AMD 및 DME 에서 몇몇의 주요한 병리학적 발달이다.
본 발명은, 습성 AMD, DR 및 DME를 포함하는, 망막 혈관 질병을 위한 새로운 클래스의 치료학적 약물을 제공한다. 본 발명의 화합물은, a) VEGF 생산을 직접적으로 저해함으로써 항-혈관형성(anti-angiogenesis)을 야기하는 것, b) 상기 VEGF-2 수용체의 저해를 야기하는 것, c) 티로신인산화효소(tyrosine kinase)의 저해 또는 하향 조절(down regulation)을 야기하는 것, 및 d) 유리체의 액화 및 후유리체 박리를 야기하여 눈 밖으로 VEGF 확산을 가능하게 하는 것(causing liquefaction of the vitreous body and posterior vitreous detachment thereby allowing VEGF diffusion out of the eye)을 포함하는 망막 혈관성 질병에 대항하는 작용의 다수의 메카니즘을 갖는다. 작용의 메카니즘은, 단독으로(예를 들어 본 발명의 화합물 만을 사용하는 치료에 의해) 사용될 수도 있거나, 존재하는 VEGF의 부가적인 또는 상호보완적인 저해[예를 들어, 이미 생산되어 있는 VEGF의 효과를 결속시키거나(binds), 가두거나(traps), 제거하거나(scavenges) 또는 그렇지 않으면 억제하는 조성물, 아바스틴(Avastin), 루센티스(Lucentis) 및/또는 에일리아(Eylea)를 포함하지만 필수적으로 이로 한정되지 않는 이러한 것들의 예와 함께 본 발명의 화합물을 사용하는 병용 치료(combination therapy)에 의해]일 수도 있다. 아바시틴[베바시주맙(bevacizumab)]은 항-VEGF 단일클론 항체이다. 루센티스[라비니주맙(ranibizumab)]은 재조합 인간화된 IgG1 카파 아이소타입 단일 클론 항체 단편이다(recombinant humanized IgG1 kappa isotype monoclonal antibody fragment). 에일리아[아플리버셉트(aflibercept)]는 인간의 일부로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. 혈관 내피 성장(VEGF) 수용체 1 및 2.
이미-존재하는 VEGF 공급을 격리시키는 것보다 VEGF 생산을 하향-조절함으로써, 본 발명의 화합물은, 현재 표준의 관심(care)과 비교한 바와 같이, 혈관형성 케스케이드(angiogenic cascade)에서 보다 빨리 중재(intervention)를 가능하게 하는 작용의 유일한 메카니즘을 갖는다. 이는, 도 6 에 도식으로 나타내었다. 혈관형성 케스케이드의 보다 빠른 단계에서 작용에 더하여, 본 발명의 화합물은, 도 7a 에 나타낸 바와 같이 오직 하나의 인테그린 서브유닛에만 특이적이고 500 배보다 더 큰 단일 클론 항체 접근과는 대조적으로, 다수의 인테그린 서브-유닛에 결합한다(In addition to working at a much earlier stage of the angiogenic cascade, the compounds of the present invention bind to multiple integrin sub-units, as opposed to monoclonal antibody approaches that are 500 times larger and specific to only one integrin subunit as shown in Figure 7A). 이와 대조적으로, 올리고펩티드는, 도 7b에 나타낸 바와 같이, 혈관형성에서 포함된 다수의 인테그린 서브-유닛에 보다 효과적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 화합물로 잠재적으로 치료될 수 있는 신생혈관 눈 질병의 예는, 당뇨 망막병증(DR), 당뇨 황반 부종(DME) 및 노인 황반 변성(AMD)을 포함한다. 이러한 질환에 대한 현재 가능한 약학적인 치료는, 이미 생성되어 있는 VEGF의 효과[VEGF 트랩(VEGF Traps)으로서 일반적으로 본원에 언급됨]를 결속시키거나, 가두거나(traps), 제거하거나(scavenges) 또는 그렇지 않으면 억제하는 특정한 약물을 포함한다. 이러한 "VEGF 트랩"의 상업적으로 입수가능한 예는, 베바시주맙(아바스틴), 라나비주맙(루센티스) 및 아플리버셉트(에일리아)를 포함한다. 베바시주맙은 항-VEGF 단일클론 항체로서 기재되어 있다. 라나비주맙은 재조합 인간화된 IgG1 카파 아이소타입 단일 클론 항체 단편으로서 기재되어 있다. 아플리버셉트는 인간 혈관 내피 성장 (VEGF) 수용체 1 및 2의 일부로 이루어진 재조합 융합 단백질로서 기재되어 있다. 이러한 항-VEGF 항체-기초된 치료는, 잠재적으로 무기한으로, 및 실질적인 불편, 비용 및 감염의 누적 위험으로, 4 내지 6 주 간격으로, 반복된 안내 주사에 의해 일반적으로 투여된다.
존재하는 VEGF 트랩과 달리, 본 발명의 조성물은, 신생혈관 눈 질병에 대항하는 작용의 다수의 메카니즘을 갖는다, 특이적으로 : VEGF 생산을 직접적으로 저해함으로써 항-혈관형성, 상기 VEGF-2 수용체의 저해, 티로신인산화효소의 하향조절, 및 유리체 액화 및 후유리체 박리의 유도(inducement)[눈의 밖 및 망막에서 떠나 VEGF 또는 그 밖의 해로운 독립체의 확산을 촉진함(which facilitates diffusion of VEGF or other deleterious entities away from the retina and out of the eye)]. 하기에 나타낸 몇몇의 예는, 신생혈관 눈 질병의 치료에서 화합물 1 단독 및 그 밖의 제제(VEGF 트랩)과 함께 화합물의 용도가 기재되어 있다.
신생혈관 눈 질병의 치료에 더하여, 본 발명의 조성물은, 망막의 신혈관형성을 일으키거나 일으키지 않는 다양한 그 밖의 눈의 질환을 치료하는데 사용될 수 있음을, 인정될 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수도 있는 눈 질환의 예는, 습성 노인 황반 변성, 당뇨 황반 부종, 증식성 또는 비-증식성 당뇨 망막병증, 유리액의 액화(liquefaction of the vitreous humor), 후유리체-망막 박리의 유도(PVD), 특발성 황반원공(idiopathic macular hole), 유리체황반견인(vitreomacular traction), 노인 황반 변성, 맥락막의 신혈관형성(choroidal neovascularization), 유리체망막 수술, 정맥 폐쇄, 각막의 신혈관형성(corneal neovascularization), 허혈성 시신경(ischemic optic nerve), 홍채 신생혈관(rubiosis iridis) 및 녹내장 수술에서의 흉터 형성의 예방과 같은 유리체망막 질환(vitreoretinal diseases)의 발병을 포함하지만, 이로 필수적으로 한정되지 않는다.
약제학적 제형
하기는, 본원에 기재된 바와 같은 화학식 Ⅰ 내지 Ⅶ 로 나타낸 것 중의 어떠한 것 또는 화합물 1 내지 5의 어떠한 것과 같은, 본 발명의 R-G-시스테산 펩티드를 포함하는 약제학적 제형 Ⅰ 내지 Ⅹ의 예이다.
제형 Ⅰ
R-G-시스테산 펩티드(RGCys-펩티드) 0.0001 mg 내지 10 g
NaCl 0.01 mg 내지 0.9 g
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅱ
RG 시스테산 펩티드(RGCys-펩티드) 0.0001 mg 내지 10 g
EDTA 0.001 mg 내지 100 mg
NaCl 0.01 mg 내지 0.9 g
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅲ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
EDTA 0.001 mg 내지 100 mg
NaCl 0.01 mg 내지 0.9 g
시스테산 0.0001 mg 내지 500 mg
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅳ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
NaCl 0.01 mg 내지 0.9 g
인산완충용액(Phosphate Buffer) to pH = 3.0 - 9.0
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅴ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
EDTA 0.001 mg 내지 100 mg
NaCl 0.01 mg 내지 0.9 g
인산완충용액 to pH = 3.0 - 9.0
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅵ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
NaCl 0.01 mg 내지 0.9 g
붕산염 완충용액(Borate Buffer) to pH = 3.0 - 9.0
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅶ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
히알루론산 나트륨 염(Hyaluronic Acid Sodium salt) 0.01 내지 10 %
붕산(Boric Acid) 0.01 내지 1.0%
폴리에틸렌글리콜(Polyethyleneglycol)(PEG 8000) 0.01 내지 10 %
염화나트륨(Sodium Chloride) 0.10 내지 0.9 %
염화칼륨(Potassium Chloride) 0.01 내지 0.20 %
염화칼슘 2수화물(Calcium Chloride Dihydrate) 0.001 내지 0.05 %
염화마그네슘 6수화물(Magnesium Chloride Hexahydrate)0.01 내지 0.20 %
보존제(Preservative)
pH 4.0 - 8.0
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅷ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
히알루론산 나트륨 염 0.01 내지 10 %
카르복시메틸 셀룰로오스 0.01 내지 10 %
붕산 0.01 내지 1.0 %
폴리에틸렌글리콜(PEG 8000) 0.01 내지 10 %
염화나트륨 0.10 내지 0.9 %
염화칼륨 0.01 내지 0.20 %
염화칼슘 2수화물 0.001 내지 0.05 %
염화마그네슘 6수화물 0.01 내지 0.20 %
보존제
pH 4.0 - 8.0
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅸ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
히알루론산 나트륨 염 0.01 내지 10 %
알긴산나트륨(Sodium Alginate) 0.01 내지 10 %
붕산 0.01 내지 1.0 %
폴리에틸렌글리콜(PEG 8000) 0.01 내지 10 %
염화나트륨 0.10 내지 0.9 %
염화칼륨 0.01 내지 0.20 %
염화칼슘 2수화물 0.001 내지 0.05 %
염화마그네슘 6수화물 0.01 내지 0.20 %
보존제
pH 3.0 - 8.0
물 QS 내지 100.0 mL
제형 Ⅹ
RGCysteic-펩티드 0.0001 mg 내지 10 g
히알루론산 나트륨 염 0.01 내지 10 %
알긴산(Alginic Acid) 0.01 내지 10 %
붕산 0.01 내지 1.0 %
폴리에틸렌글리콜(PEG 8000) 0.01 내지 10 %
염화나트륨 0.10 내지 0.9 %
염화칼륨 0.01 내지 0.20 %
염화칼슘 2수화물 0.001 내지 0.05 %
염화마그네슘 6수화물 0.01 내지 0.20 %
보존제
pH 3.0 - 8.0
물 QS 내지 100.0 mL
토끼에서의 RGD 펩티드 및 글리실- 아르기닐 -글리실- 시스테익 - 트레오닐 -프롤린-COOH( Glycyl - Arginyl - Glycyl - Cysteic - Threonyl - Proline - COOH )( GRG 시스테산 TP ; 화합물 1)의 PVD -유도 효과( PVD - Inducing Effects )의 비교
본 실시예에서, RGD 펩티드 및 글리실-아르기닐-글리실-시스테익-트레오닐-프롤린-COOH(Glycyl-Arginyl-Glycyl-Cysteic-Threonyl-Proline-COOH)(RG 시스테산 펩티드; GRG 시스테산 TP; 화합물 1)의 PVD-유도 효과를 토끼에서 비교하였다. 이러한 연구에 대한 프로토콜(protocol)은 다음과 같다:
프로토콜:
동물 모델
a) 20 마리의 수컷 및 암컷 토끼
b) 무게 대략 1.5 - 2.5kg
c) 2 개의 그룹으로 나눔
i) 10 마리의 토끼를 pH = 6.5로 2.5 % RGD 용액을 안내로(intravitreally) 주사하였다.
a) 10의 오른쪽 눈에 2.5 % RGD 용액을 주사하였다.
b) 5의 왼쪽 눈을 BSS 대조군(BSS Control)으로서 사용하였다.
c) 5의 왼쪽 눈을 pH = 6.5로 2.5 % RGD +0.02 % EDTA로 주사하였다.
ii) 10 마리의 토끼를 pH = 6.5로 2.5 % RG 시스테익 용액(RGCysteic solution)을 안내로(intravitreally) 주사하였다.
a) 10의 오른쪽 눈에 pH = 6,5로 2.5 % RG시스테익 용액을 주사하였다.
b) 10의 왼쪽 눈에 pH = 6.5로 2.5 % RG시스테익 용액 + 0.02% EDTA를 주사하였다.
유효 화학물질(Active Chemicals)
d) 소듐 EDTA(Sodium EDTA) - Spectrum Chemical Corp.로부터의 99.0 - 100.5%.
e) RG 시스테산 - cGMP 공급자(supplier)(순도 >98%).
f) RGD - cGMP 공급자(순도 > 98%).
g) BSS 용액.
둘 다 RG 시스테산, RGD, RG 시스테산 + 소듐 EDTA, RGD + 소듐 EDTA, 및 BSS 용액을 수술 전 24 시간에 유리체 강(vitreous cavity) 내에 주사하였다. 토끼(10mg/kg 몸무게)를 자일라진(xylazine)(100 mg/ml) 및 케타민 히드로클로라이드(Ketamine hydrochloride)(100mg/ml)의 1 : 1 컴비네이션(combination)의 2.0 ml의 근육내 주사로 마취시켰다. 동공(Pupil)을 국소 시클로펜톨레이트 히드로클로라이드(topical cyclopentolate hydrochloride) 1 % 및 페닐에프린 히드로클로라이드(Phenylephrine hydrochloride) 10 % 로 팽창시켰다(dilated).
모든 동물을, 이전부터 존재했던 유리체망막 이상(pre-existing vitreoretinal abnormalities)을 갖는 어떠한 동물을 제외하기 위해, 세극등 생체현미경검사(slit lamp biomicroscopy) 및 간접 검안경검사(indirect ophthalmoscopy)으로 처음에 검사하였다. 1.0cc 주사기(syringe)에 부착된 30-게이지 바늘(gauge needle)을 사용하여 코뼈 위에 있는 분할(supranasal quadrant)에서 연곽(limbus)에 대해 2 mm 뒤쪽(posterior)에 0.10 cc의 안내 주사(intravitreal injection)로 투여하였다. 보호(Care)는 수정체(lens) 또는 망막(retina)에 대한 손상을 피하도록 취해져야 한다.
주사한 다음에 24 시간 및 물리적인 유리체절제술(mechanical vitrectomy) 시작 전에 즉시, B-스캔 초음파 검사(B-scan ultrasonography)를 후유리체의 상태 및 또한 유리체의 액화(liquefaction of the vitreous)를 결정하기 위해 실시하였다. 투-포트 파르 플라나 유리체 해부(two-port pars plana vitrectomy)를, 유리체 절제술 기구(vitrectomy unit)에 부착된 주입 광섬유 및 유리체 커터(infusion fiberoptic and a vitreous cutter)를 사용하여 수행하였다. 30 초 코어 유리체절제술 다음에, 낮은 흡인(low aspiration)(< 30 mmHg)을 사용하면서, 유리체 커터(vitreous cutter)는, 망막의 표면으로부터 후 피질 유리체(posterior cortical vitreous)의 분리가 4 분면(4 quadrants)에서 시도된(attempted), 유두주위 망막 표면(peripapillary retinal surface)을 겨낭한다. 공막절개(sclerotom)를 봉합하고(sutured), 수술 후의 B-스캔 초음파검사를, 각각의 사분면에 존재하는 어떠한 PVD의 존재 및 정도(extent)를 측정하도록 수행하였다. 동물은 심장 내 펜토바바이탈 나트륨 주입(intracardiac sodium pentobarbital injections)으로 안락사시키고, 눈을 즉시 적출하였다.
유리체의 액화 및 PVD의 분류(Classification of Liquefaction of the Vitreous and PVD)는, 수술 후의 B-스캔 초음파 검사(postoperative B-Scan ultrasound examination)를 기초로 한 PVD의 정도를 평가하도록 하기의 이러한 분류 시스템(this grading system)으로 분류하였다;
등급( Grade ) 0. a) 어떠한 후유리체의 박리도 관찰할 수 없음.
b) 유리체 액화(Vitreous Liquefaction)
등급 1. a) 유리체(vitreous)가 2 또는 이하의 사분면(quadrants)에서 분리된(detached) 눈으로 구성.
b) 유리체 액화
등급 2. a) 유리체가 3 또는 그 이상의 사분면에서 분리된 눈으로 구성되어 있지만, 사출수(medullary rays)를 따라 초점의 부착(focal attachments)이 남아있음.
b) 유리체 액화
등급 3. a) 유리체가 망막 표면으로부터 완전하게 분리된 눈으로 구성
b) 유리체 액화
모든 눈은, 고정액의 빠른 투과를 보증하기 위해, 적출한 후에 즉시 국부 플라나에 대한 상극 보다-인접한 곳에 예리한 레이저 투과를 받았다(All eyes underwent a sharp razor penetration at the superior pole sub-adjacent to the pars plana immediately after enucleating). 인접한 망막 및 렌즈에 대한 손상을 피하도록 돌보았다. 눈을 4 섭씨 온도로 최소 24 시간 동안 2 % 파라포름알데히드 더하기 2.5 % 글루타르알데히드에 담궜다(immersed). 유일한 후면의 칼라트(A unique posterior calotte)를 제거하고, 메탄올에서 건조시키고, 임계점에 대해 이산화탄소에서 건조시키고, 금에서 스푸터 코팅시키고(sputter-coated), 주사 전자 현미경(scanning electron microscope)을 사용하여 사진을 찍었다.
결과:
Figure pct00017

Figure pct00018

Figure pct00019

Figure pct00020

본 연구의 결과는, RGD 및 RG 시스테산(GRG 시스테산 TP; 화합물 1)이 유사한 특성을 갖고, 2.5 % RG 시스테산의 주입(injection)은 24 시간에 망막으로부터의 완전한 유리체의 분리(complete separation of the vitreous)를 안내에(intravitreally) 초래하며, 게다가 RGD 및 RG 시스테산 둘 다의 토끼 유리체(vitreous)가 완전하게 액화됨을 나타내었다.
전반적으로, RG 시스테산의 활성도는 토끼에서의 완전한 PVD 유도 및 유리체의 액화에 있어서 RGD의 활성도와 동일하거나 또는 약간 더 낫다. 이는, RGD 보다 인테그린-세포외 매트릭스 상호작용의 바인딩 부위에 대해 이의 보다 강한 경쟁적인 바인딩 활성도(stronger competitive binding ability) 때문에 가능하다. 본원에 기재된 바와 같이, 술폰산은 이에 상응하는 카르복실산 보다 강한 산이다. 술폰산 기의 이러한 보다 높은 극성은 보다 강한 분자간 결합으로 이어진다. 예를 들어, 인테그린 바인딩 부위에서의 아미노산의 아미드 기 및/또는 곁사슬을 갖는, 보다 강한 O-H 결합을 갖는 R-G-시스테산은 상대적으로 보다 낮은 극성화된 O-H 결합을 갖는 R-G-아스파라트산 보다 강한 수소결합을 형성할 수 있고/있거나 인테그린 바인딩 부위에 복합된 금속 이온과 보다 강한 상호작용을 가질 수 있다.
결과는, 이러한 화합물이 0.02 % 소듐 에데테이트(Sodium Edetate)와 함께 투여되었을 때, RGD 뿐만 아니라 RG 시스테산의 활성도는 변경되지 않는 결과를 또한 나타내었다.
또한, 결과는, RG 시스테산 화합물 화합물 1 또는 RGD 화합물의 안내 주사로부터 어떠한 부작용 또는 부정적인 안전성 효과도 없음을 나타내었다.
토끼 눈에서 RG 시스테산 펩티드 화합물 1( GRG 시스테산 TP )의 다수 주사( Multiple Injections )의 안전성 연구( Safety Study )
본 실시예에서, RG시스테산 펩티드 화합물 1의 다수의 주사(multiple injections)를 대략 1.5 - 2.5 kg의 무게의 5 마리의 수컷 및 4 마리의 암컷 뉴질랜드 토끼의 눈에 투여하였고, 눈은 하기의 단락에 기재된 바와 같이 실시되었다.
본 연구의 프로토콜은 하기와 같다:
A) 베이스라인 조사( Baseline Examinations ): 베이스라인에서, 모든 9 마리의 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을, 동물이 이전부터 존재했던 유리체망막 이상(pre-existing vitreoretinal abnormalities)을 갖지 않는 것을 확인하기 위해, 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사(indirect ophthalmoscopy)로 검사하였다. 게다가, β-스캔 초음파 검사(β-scan ultrasonography) 뿐만 아니라 ERG 스캔(ERG scans)을, 베이스라인 리딩(baseline readings)을 획득하기 위해 모든 9 마리의 동물의 왼쪽 및 오른쪽 눈에서 수행하였다.
B) 실험적인 처리: 그리고 난 다음에, 용액 또는 염분(saline)(대조군)을 모두 9 마리의 토끼에게 안내 주사 하였다. 처리 용액(treatment solutions)을 다음과 같이 제조하였다:
RG시스테산 용액 : 0.02 mg의 디소듐(disodium) EDTA + 0.80 mg의 염화나트륨 및 pH 6.5 로 조절된 주사용 USP 멸균수(USP sterile Water for injection)를 포함하는 2.5 mg/100 μl 용액의 RG시스테산(화합물 1).
염분(대조군) : pH 6.5 로 조절된 USP 등장성 멸균 생리식염수(USP Isotonic sterile saline solution).
다음과 같이 투여로 진행되었다:
1) 9 마리의 토끼의 각각의 오른쪽 눈에 100의 2.5 mg/100μl RG시스테산 용액을 안내로 주사하였다[투여량 수송(delivering a dose)= 2.5 mg의 화합물 1].
2) 9 마리의 토끼의 각각의 왼쪽 눈에 100μl의 염분(Saline)(대조군)을 안내로 주사하였다.
3) 초기의 안내의 주사 후 하루가 지나, 어떠한 토끼가 주사로부터 부작용을 갖는지를 체크하기 위해, 모든 9 마리의 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을, 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 검사하였다.
4) 1st 주사 후의 7th 일에, 어떠한 토끼가 주사로부터 부작용을 갖는지를 체크하기 위해, 모든 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 검사하였다. 게다가, ERG 스캔은, 베이스라인으로부터의 어떠한 변화가 있는지를 측정하기 위해 모든 동물의 오른쪽 및 왼쪽 눈에서 실시하였다.
5) 3 마리 토끼의 그룹, 번호 901, 904 및 909 는 임의적으로 선택된 다음에, 후유리체의 상태를 확인하기 위해 물리적인 유리체절제술을 이들 3 마리의 오른쪽 및 왼쪽 눈에서 실시하였다.
6) 3 마리의 임의적으로 선택된 동물, 번호 901, 904 및 909 는 심장 내 펜토바바이탈 나트륨 주입(intracardiac sodium pentobarbital injections)으로 안락사시키고, 눈을 즉시 적출시켰다. 모든 눈은, 고정액의 빠른 투과를 보증하기 위해, 적출한 후에 즉시 국부 플라나에 대한 상극 보다-인접한 곳에 예리한 레이저 투과를 받았다. 인접한 망막 및 렌즈에 대한 손상을 피하도록 돌보았다. 눈을 4 섭씨 온도로 최소 24 시간 동안 2 % 파라포름알데히드 더하기 2.5 % 글루타르알데히드에 담궜다. 유일한 후면의 칼라트(A unique posterior calotte)를 제거하고, 메탄올에서 건조시키고, 임계점에 대해 이산화탄소에서 건조시키고, 금에서 스푸터 코팅시키고(sputter-coated), 주사 전자 현미경을 사용하여 사진을 찍었다. 그 밖의 샘플을 병리조직학적 시험(Histopathological examination) 하였다.
남아있는 6 마리의 토끼, 번호 902, 903, 905, 906, 907 및 908 은 첫 번째 주사 후 7일에 두 번째로 주사하였다.
1) 남아있는 6 마리의 토끼의 각각의 오른쪽 눈에 100의 2.5 mg/100μl RG시스테산 용액을 안내로 또 다시 주사하였다(injected)(수송 두 번째 2.5 mg 투여량의 화합물 1).
2) 남아있는 6 마리의 토끼의 각각의 왼쪽 눈에 100μl의 염분(Saline)(대조군)을 안내로 또 다시 주사하였다.
3) 2nd 안내의 주사 후 하루가 지나, 어떠한 토끼가 주사로부터 부작용(adverse effect)을 갖는지를 체크하기 위해, 남아있는 6 마리의 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을, 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 검사하였다.
4) 2nd 주사 후의 7th 일에, 어떠한 토끼가 주사로부터 부작용(adverse effect)을 갖는지를 체크하기 위해, 모든 남아있는 6 마리의 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 검사하였다. 게다가, ERG 스캔은, 베이스라인으로부터의 어떠한 변화가 있는지를 측정하기 위해 모든 동물의 오른쪽 및 왼쪽 눈에서 실시하였다.
5) 3 마리 토끼, 번호 902, 903, 및 907 는, 남아있는 6 마리의 동물로부터 임의적으로 선택된 다음에, 후유리체의 상태를 확인하기 위해 물리적인 유리체절제술을 이들 3 마리의 임의적으로 선택된 동물의 오른쪽 및 왼쪽 눈에서 실시하였다.
6) 3 마리의 임의적으로 선택된 동물, 번호 902, 903, 및 907 는 심장 내 펜토바바이탈 나트륨 주입(intracardiac sodium pentobarbital injections)으로 안락사시키고, 눈을 즉시 적출시켰다. 모든 눈은, 고정액의 빠른 투과를 보증하기 위해, 적출한 후에 즉시 국부 플라나에 대한 상극 보다-인접한 곳에 예리한 레이저 투과를 받았다. 인접한 망막 및 렌즈에 대한 손상을 피하도록 돌보았다. 눈을 4 섭씨 온도로 최소 24 시간 동안 2 % 파라포름알데히드 더하기 2.5 % 글루타르알데히드에 담궜다. 유일한 후면의 칼라트(A unique posterior calotte)를 제거하고, 메탄올에서 건조시키고, 임계점에 대해 이산화탄소에서 건조시키고, 금에서 스푸터 코팅시키고, 주사 전자 현미경을 사용하여 사진을 찍었다. 그 밖의 샘플을 병리조직학적 시험하였다.
3 마리의 토끼의 남아있는 그룹, 번호 905, 906, 및 908 은, 하기와 같이 첫 번째 수사 후 14 일에, 세 번째로 주사하였다:
1) 남아있는 3 마리의 토끼의 각각의 오른쪽 눈에 100의 2.5 mg/100μl RG시스테산 용액을 안내로 또 다시 주사하였다(수송 세 번째 2.5 mg 투여량의 화합물 1).
2) 남아있는 3 마리의 토끼의 각각의 왼쪽 눈에 100μl의 염분(Saline)(대조군)을 안내로 또 다시 주사하였다.
3) 3rd 안내의 주사 후 하루가 지나, 어떠한 토끼가 주사로부터 부작용(adverse effect)을 갖는지를 체크하기 위해, 남아있는 6 마리 모두의 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을, 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 검사하였다.
4) 3rd 주사 후의 7th 일에, 주사로부터의 부작용에 대해 체크하기 위해, 모든 남아있는 3 마리의 토끼의 오른쪽 및 왼쪽 눈을 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 또 다시 검사하였다. 게다가, 모든 동물의 오른쪽 및 왼쪽 눈의 ERG 스캔은, 베이스라인으로부터의 어떠한 변화가 있는지를 측정하기 위해 실시하였다.
5) 후유리체의 상태를 확인하기 위해, 물리적인 유리체절제술을 3 마리의 남아있는 동물(번호 905, 906 및 908)의 오른쪽 및 왼쪽 눈에서 실시하였다.
6) 3 마리의 남아있는 동물(번호 905, 906, 및 908)은 심장 내 펜토바바이탈 나트륨 주입(intracardiac sodium pentobarbital injections)으로 안락사시키고, 눈을 즉시 적출시켰다. 모든 눈은, 고정액의 빠른 투과를 보증하기 위해, 적출한 후에 즉시 국부 플라나에 대한 상극 보다-인접한 곳에 예리한 레이저 투과를 받았다. 인접한 망막 및 렌즈에 대한 손상을 피하도록 돌보았다. 눈을 4 섭씨 온도로 최소 24 시간 동안 2 % 파라포름알데히드 더하기 2.5 % 글루타르알데히드에 담궜다. 유일한 후면의 칼라트(A unique posterior calotte)를 제거하고, 메탄올에서 건조시키고, 임계점에 대해 이산화탄소에서 건조시키고, 금에서 스푸터 코팅시키고(sputter-coated), 주사 전자 현미경을 사용하여 사진을 찍었다. 그 밖의 샘플을 병리조직학적 시험 하였다.
3) 유효 화학물질( Active Chemicals )
본 연구에서 사용된 유효 화학물질은 하기와 같다:
a. 디소듐(disodium) EDTA - Spectrum Chemical Corp.로부터의 99.0 - 100.5 %
b. RG시스테산 펩티드(화합물 1)
c. USP 멸균 등장성 생리식염수(USP sterile isotonic saline solution)
4) 연구 제형( Study formulations )
a) RG시스테산 용액 : 0.02 mg의 디소듐 EDTA + 0.80 mg의 염화나트륨 및 pH = 6.5로 조절된 주사용 USP 멸균수를 포함하는 2.5 mg/100 μl 용액의 RG시스테산. 2.0 mL 유리병 내로 0.22μ필터를 통한 멸균 필터.
b) 염분(대조군) : pH 6.5로 조절된 USP 등장성 멸균 생리식염수(USP Isotonic sterile saline solution). 멸균 유리병 내로 0.22μ필터로 여과된 멸균.
5) 제제 주입을 위한 마취( Anesthesia for injection preparation )
a. 자일라진(100mg/ml) 및 염산케타민(Ketamine hydrochloride)(100mg/ml)의 1:1 컴비네이션의 2.0 mL의 근육 내 주사
b. 동공을 국소 시클로펜톨레이트 히드로클로라이드(topical cyclopentolate hydrochloride) 1 % 및 페닐에프린 히드로클로라이드(Phenylephrine hydrochloride) 10 %로 팽창시켰다.
6) 안내 주사 제제( Intravitreal Injection Preparation ):
2.5 mg/100μl의 RG시스테산 용액 및 pH 6.5로 조절된 등장성 멸균 생리식염수를 포함하는 멸균 유리병이 제공되었다.
주사 전에, 조사자는, 1.0 cc 주사기에서의 0.10 cc (100 마이크로 리터)의 용액이 있음을 확인하였다.
7) 주사 절차( Injection Procedure ):
안내 주사가, 토끼의 정상적인 매일의 활성도(normal daily activity)를 방해하는데 충분한 시각적인 장애의 수준을 야기하지 않기 때문에, 이는 시각 및 안과 가이드라인에서의 연구를 위한 협회의 동물 결의안(animal resolution)에 따른 주요한 생존 절차를 고려하지 않았다.
RG시스테산 용액 뿐만 아니라 멸균 생리 식염수 둘 다를 세극등 생체현미경검사의 베이스라인 조사 후에 유리체 강(vitreous cavity) 내로 주사하였고, 검안경 검사법(Ophthalmoscopy) 및 ERG를 토끼에서 완료하였다. 토끼(10 mg/kg 몸무게)를, 자일라진(100 mg/ml) 및 케타민 히드로클로라이드(100mg/ml)의 1:1 컴비네이션의 2.0 ml의 근육내 주사로 마취시켰다. 동공을 국소 시클로펜톨레이트 히드로클로라이드(topical cyclopentolate hydrochloride) 1 % 및 페닐에프린 히드로클로라이드(Phenylephrine hydrochloride) 10 %로 팽창시켰다.
모든 동물을, 이전부터 존재했던 유리체망막 이상(pre-existing vitreoretinal abnormalities)을 갖는 어떠한 동물을 제외하기 위해, 세극등 생체현미경검사 및 간접 검안경검사로 처음에 검사하였다. 1.0cc 주사기에 부착된 30-게이지 바늘(gauge needle)을 사용하여 코뼈 위에 있는 분할(supranasal quadrant)에서 연곽(limbus)에 대해 2 mm 뒤쪽(posterior)에 0.10 cc의 안내 주사(intravitreal injection)로 투여하였다. 보호(Care)는 수정체(lens) 또는 망막에 대한 손상을 피하도록 취해져야 한다.
주사한 다음에 7 일에, 물리적인 유리체절제술을 동물에서 실시하였다. 투-포트 파르 플라나 유리체 해부(two-port pars plana vitrectomy)를, 유리체 절제술 기구(vitrectomy unit)에 부착된 주입 광섬유 및 유리체 커터(infusion fiberoptic and a vitreous cutter)를 사용하여 수행하였다. 30 초 코어 유리체절제술 다음에, 낮은 흡인(low aspiration)(< 30 mmHg)을 사용하면서, 유리체 커터(vitreous cutter)는, 망막의 표면으로부터 후 피질의 유리체(posterior cortical vitreous)의 분리가 4 분면(4 quadrants)에서 시도된(attempted), 유두주위 망막 표면(peripapillary retinal surface)을 겨낭한다. 동물은 심장 내 펜토바바이탈 나트륨 주입(intracardiac sodium pentobarbital injections)으로 안락사시키고, 눈을 즉시 적출하였다.
모든 눈은, 고정액의 빠른 투과를 보증하기 위해, 적출한 후에 즉시 국부 플라나에 대한 상극 보다-인접한 곳에 예리한 레이저 투과를 받았다. 인접한 망막 및 렌즈에 대한 손상을 피하도록 돌보았다. 눈을 4 섭씨 온도로 최소 24 시간 동안 2 % 파라포름알데히드 더하기 2.5 % 글루타르알데히드에 담궜다. 유일한 후면의 칼라트(A unique posterior calotte)를 제거하고, 메탄올에서 건조시키고, 임계점에 대해 이산화탄소에서 건조시키고, 금에서 스푸터 코팅시키고(sputter-coated), 주사 전자 현미경을 사용하여 사진을 찍었다.
분석의 결과
RG시스테산 용액 및 멸균 생리식염수로 처리된 눈 사이의 안전성에서의 데이터는 하기의 기술을 사용하여 안전성에 대해서 분석하였다:
i) 세극등 생체현미경검사;
ii) 검안경 검사법;
iii) ERG;
iv) 조직병리학(Histopathology); 및
v) 전자 현미경(Electron microscopy).
안전성 프로파일( Safety Profile ):
9 마리의 토끼 번호 901, 902, 903, 904, 905, 906, 907, 908, 909의 그룹에 대해서 100 μl의 2.5 % RG시스테산 용액의 첫 번째 안내 투여는, 모든 시점에서 어떠한 중요한 유독성과 연관되어 있지 않다. 2.5 % RG시스테산 그룹 및 등장성 생리식염수 그룹 사이의 보고된 부작용에서 현저한 차이는 없었다. 유독성의 이러한 결핍은 임상 검사, 간접적인 검안경 검사법 및 초음파 β-스캔 및 물리적인 유리체절제술에 의해 측정되었다.
세극등 생체현미경검사는 모든 연구에서 수행하였고, 눈꺼풀(lids), 결막(conjunctiva) 및 공막(sclera)에 집중되었고, 염증에 대한 징후를 위한 각막(cornea), 내피의 변화(endothelial changes), 전방 반응(anterior chamber reaction), 홍체(iris), 렌즈(lens) 및 캡슐(capsule)에 더하여, 앞쪽의 유리체(anterior vitreous)는, 100 μl의 2.5 % RG시스테산 용액 및 등장성 생리 식염수 그룹의 안내 주사에 대한 염증성 반응의 거의 완전한 결핍을 보여주었다. 모든 연구 시점 및 모든 연구 그룹에서, 테스트(test articles)에 의해 유도된 중요한 유독성의 어떠한 징후도 나타나지 않았다.
후면의 단편(posterior segment)의 임상적인 평가는, 현저한 망막의 유독성을 나타내지 않음을 보장하도록 본 연구를 통해 또한 뒤이어 하였다. 간접 검안경검사 뿐만 아니라 세극등 안저 평가(slit lamp fundus evaluations)를, 어떠한 징후의 망막의 유독성에 대한 특정한 주의를 갖는 각각의 평가 시점에서 수행하였다. 후면의 단편은 유리체 밀도(vitreous density), 유리체 액화(vitreous liquefaction), 유리체 부착(vitreous attachment) 및 가능한 출혈(possible hemorrhage)에 있어서 어떠한 변화에 대해서 평가하였다. 망막은, RPE 독성의 어떠한 징후(any signs), 망막의 혈관 절충물 망막 출혈(retinal vascular compromise retinal hemorrhage), 삼출물(exudates), 망막 구멍(retinal tears), 파열(breaks) 또는 분리(detachments)에 대해서 평가하였다. 모든 연구 시점 및 모든 연구 그룹에서, 처리 전에 베이스라인에서의 RPE 변화가 없었고, 테스트(test articles)에 의해 유도된 현저한 후면의 단편 변화의 어떠한 징후를 나타내지 않았다. ERG 스캔이 안내 주사 전에 9 마리의 동물에서 수행되었을 뿐만 아니라, 주사 후 1 일 및 7 일에 모든 동물에서 수행된 ERG 스캔은 테스트(test articles)에 의해 유도된 현저한 변화의 어떠한 증후 또는 유독성을 초래하는 것을 나타내지 않은 것은 주목할 만하다.
6 마리의 토끼의 그룹 번호 902, 903, 905, 906, 907, 908에 대한 100 μl의 2.5 % RG시스테산 용액의 두 번째 안내 투여는 모든 시점에서 어떠한 현저한 유독성과 결부되지 않았다. 2.5 % RG시스테산 그룹 및 등장성 생리 식염수 사이에서의 보고된 부작용에서 현저한 차이가 없었다. 유독성의 이러한 결핍은 임상 검사, 간접적인 검안경 검사법 및 초음파 β-스캔 및 물리적인 유리체절제술에 의해 측정되었다.
세극등 생체현미경검사는 모든 연구에서 수행하였고, 눈꺼풀(lids), 결막(conjunctiva) 및 공막(sclera)에 집중되었고, 염증에 대한 징후(sign)를 위한 각막(cornea), 내피의 변화(endothelial changes), 전방 반응(anterior chamber reaction), 홍체(iris), 렌즈(lens) 및 캡슐(capsule)에 더하여, 앞쪽의 유리체(anterior vitreous)는, 100 μl의 2.5 % RG시스테산 용액 및 등장성 생리 식염수 그룹의 안내 주사에 대한 염증성 반응의 거의 완전한 결핍을 보여주었다. 모든 연구 시점 및 모든 연구 그룹에서, 테스트에 의해 유도된 중요한 유독성의 어떠한 징후는 나타나지 않았다.
후면의 단편(posterior segment)의 임상적인 평가는, 현저한 망막의 유독성을 나타내지 않음을 보장하도록 본 연구를 통해 또한 뒤이어 하였다. 간접 검안경검사 뿐만 아니라 세극등 안저 평가(slit lamp fundus evaluations)를, 어떠한 징후의 망막의 유독성에 대한 특정한 주의를 갖는 각각의 평가 시점에서 수행하였다. 후면의 단편은 유리체 밀도(vitreous density), 유리체 액화(vitreous liquefaction), 유리체 부착(vitreous attachment) 및 가능한 출혈(possible hemorrhage)에 있어서 어떠한 변화에 대해서 평가하였다. 망막은, RPE 독성의 어떠한 징후(any signs), 망막의 혈관 절충물 망막 출혈(retinal vascular compromise retinal hemorrhage), 삼출물(exudates), 망막의 구멍(retinal tears), 파열(breaks) 또는 분리(detachments)에 대해서 평가하였다. 모든 연구 시점 및 모든 연구 그룹에서, 두 번째 처리 전 7일(7 days prior to the second treatment)에 베이스라인에서의 RPE 변화가 없었고, 테스트(test articles)에 의해 유도된 현저한 후면의 단편 변화의 어떠한 징후를 나타내지 않았다. ERG 스캔이 안내 주사 후 두 번째로 6 마리의 동물에서 수행되었을 뿐만 아니라, 주사 후 8 일 및 14 일에 모든 동물에서 수행된 ERG 스캔은 테스트(test articles)에 의해 유도된 현저한 변화의 어떠한 증후 또는 유독성을 초래하는 것을 나타내지 않은 것은 주목할 만하다.
6 마리의 토끼의 그룹 번호 905, 906, 908에 대한 100 μl의 2.5 % RG시스테산 용액의 세 번째 안내 투여는 모든 시점에서 어떠한 현저한 유독성과 결부되지 않았다. 2.5 % RG시스테산 그룹 및 등장성 생리 식염수 사이에서의 보고된 부작용에서 현저한 차이가 없었다. 유독성의 이러한 결핍은 임상 검사, 간접적인 검안경 검사법 및 초음파 β-스캔 및 물리적인 유리체절제술에 의해 측정되었다.
세극등 생체현미경검사는 모든 연구에서 수행하였고, 눈꺼풀(lids), 결막(conjunctiva) 및 공막(sclera)에 집중되었고, 염증에 대한 징후를 위한 각막(cornea), 내피의 변화(endothelial changes), 전방 반응(anterior chamber reaction), 홍체(iris), 렌즈(lens) 및 캡슐(capsule)에 더하여, 앞쪽의 유리체(anterior vitreous)는, 100 μl의 2.5 % RG시스테산 용액 및 등장성 생리 식염수 그룹의 안내 주사에 대한 염증성 반응의 거의 완전한 결핍을 보여주었다. 모든 연구 시점 및 모든 연구 그룹에서, 테스트에 의해 유도된 중요한 유독성의 어떠한 징후는 나타나지 않았다.
후면의 단편(posterior segment)의 임상적인 평가는, 현저한 망막의 유독성을 나타내지 않음을 보장하도록 본 연구를 통해 또한 뒤이어 하였다. 간접 검안경검사 뿐만 아니라 세극등 안저 평가를, 어떠한 징후의 망막의 유독성에 대한 특정한 주의를 갖는 각각의 평가 시점에서 수행하였다. 후면의 단편은 유리체 밀도, 유리체 액화, 유리체 부착 및 가능한 출혈에 있어서 어떠한 변화에 대해서 평가하였다. 망막은, RPE 독성의 어떠한 징후, 망막의 혈관 절충물 망막 출혈(retinal vascular compromise retinal hemorrhage), 삼출물(exudates), 망막 구멍, 파열 또는 분리에 대해서 평가하였다. 모든 연구 시점 및 모든 연구 그룹에서, 세 번째 처리 전 14일(14 days prior to the third treatment)에 베이스라인에서의 RPE 변화가 없었고, 테스트(test articles)에 의해 유도된 현저한 후면의 단편 변화(significant posterior segment changes)의 어떠한 징후를 나타내지 않았다. ERG 스캔이 안내 주사 후 세 번째로 3 마리의 동물에서 수행되었을 뿐만 아니라, 주사 후 15 일 및 21 일에 모든 동물에서 수행된 ERG 스캔은 테스트(test articles)에 의해 유도된 현저한 변화의 어떠한 증후 또는 유독성을 초래하는 것을 나타내지 않은 것은 주목할 만하다.
RG시스테산 펩티드의 항-유착 성질( Anti - Adhesive Properties ): 화합물 1(GRG 시스테산 TP ), 시클릭 - RGD 및 RGE 와 함께 상처 치유( Wound Healing )의 반응속도론 연구( Kinetic Study )
본 실시예에서, 상처 치유의 모델에서, RG시스테산 펩티드는 항-부착 특성을 갖고, 따라서 많은 병리학상의 유리체망막 질병(pathological vitreoretinal diseases)의 진행(development)을 예방할 수 있고, 인간 흑색종(human melanoma) 및 결장 암 세포(colon cancer cell)에서 전이(metastases)를 저해할 수 있다.
생체 외에서, RG시스테산 펩티드의 항-부착 특성을 테스트하기 위해, 상처-치유 검정(wound-healing assay)은 인간 제정맥 내피세포(HUVEC)와 함께 수행되었다. HUVEC를 접종하였고(seeded), 피브로넥틴 코팅된 표면(fibronectin coated surface)에서의 융합성 단층막(confluent monolayer)이 성장 가능하게 하였다. 상처[긁힌 자국 틈(scratch rift)]는 HUVEC 단층막(monolayer)을 가로질러 작은 피펫팁(small pipette tip)으로 빨아들임으로써(by dragging) 생성되었다. 그리고 난 다음에 세포를 RG시스테산 펩티드(화합물 1 ; 10 mM)를 포함하는 신선한 성장 배지에서 배양시킨 다음에, 상처 영역은 상처 폐쇄(wound closure)의 반응속도론(kinetics)을 측정하기 위해, 다양한 시점(0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 시간)에서 다섯 가지 상이한 범위(five different fields)에서 표현하였다(imaged). 상처 폐쇄의 수준은, 세포의 부착(adhesion), 이송(migration) 및 증식을 통한 HUVEC에 의해 다시-채워진(re-occupied), 원래의 상처 영역(original wound area)의 부분(fraction of the original wound area)을 측정함으로써 수량화하였다.
대조군 연구에서, 하기의 펩티드는 RG시스테산(화합물 1)을 대신해서 사용되었다: 시클릭-RGD 펩티드(cyclic-RGD peptide)[1mM), 양성 대조군(positive control)] 및 RGE 펩티드[1 mM, 음성 대조군(negative control)].
상처 치유의 반응속도론에서의 펩티드의 효과는 도 1 에 나타내었다. 결과를 원래의 영역의 백분율로서 나타내었다. 에러 바(error bars)는 2 내지 6 의 독립적인 실험에 걸쳐, 상처 크기에서 표준 편차(standard deviation)에 해당한다. 결과는, RG시스테산 펩티드가 24 시간 후에 70 % 로 HUVEC 상처 치유를 억제한 반면에, 시클릭 RGD[RGD-기초 펩티드(RGD-based peptide); N-메틸화 시클릭-RGDf-N(Me)v(N-methylated cyclic-RGDf-N(Me)V); 시렌기타이드(Cilengitide)]는 24 시간 후에 45 % 로 HUVEC 상처 치유를 저해함을 나타내었다. 이는, 24 시간 후에 0 % 의 HUVEC 상처 치유를 저해하는 음성 대조군 RGE 펩티드와 둘 다 비교되었다. RG시스테산(화합물 1)의 효과는 RGD-기초 펩티드의 활성도, 인테그린 바인딩 활성도의 잘 확립된 저해제와 정량적으로 비교되었다. 게다가, RG시스테산 펩티드는 HUVEC 세포의 아포토시스 없이 RGD-기초 펩티드의 활성도에 대한 유사한 특성을 나타내었다. 시클릭 RGD 및 화합물 1 둘 다는 이러한 검정에서 강한 인테그린 저해제이다.
초점접착역(focal adhesion)을 통해 ECM과 함께 세포 상호작용은, 상처 봉합(wound closure)의 비율에 영향을 주는 세포 이동의 중대한 요소이다. 2 차원 세포 이동에서, 성장하는 라멜리포디아(lamellipodia)와 함께 세포의 앞쪽의 말단(anterior end)은 상기 기질과 함께 새로운 접착(adhesions)을 형성하면서, 뒷쪽의 말단(posterior end)에서 접착은 세포골격 수축(cytoskeletal contraction) 후에 분리된다.
본원에서 기재된 바와 같이, 유리체(vitreous) 및 망막 사이의 강한 부착(the strong adhesion)은, 유리체황반견인(vitreomacular traction), 증식성 당뇨 망막병증(proliferative diabetic retinopathy), 황반원공(macular hole), 노인황반 변성(age related macular degeneration) 및 부유물(floaters)과 같은 많은 병리학적 유리체망막 질환(many pathological vitreoretinal diseases)의 최종적인 진전(eventual development)을 설명할 수 있다. 따라서, 안쪽의 망막 표면(inner retinal surface)으로부터의 유리체의 기계적인 분리 이외에 후유리체 박리(Posterior Vitreous Detachment)를 달성하기 위한 비외상성 비-외과적인 접근법(atraumatic non-invasive approach)은 매우 바람직하다[Tezel, T.H. et al, Retina (1998) 18: 7 -15; and Verstraeten, T.C,et al., .Arch. Ophthalmol. (1993)111: 849 -854를 참고하라].
본원에서 나타낸 바와 같이, ECM 컴포넌트, 특히 피질의 유리체의 콜라겐 섬유(collagen fibrils of the cortical vitreous)는, 내부의 제한 라멜라(inner limiting lamella, ILL)에서 인테그린 바인딩 부위를 통해 망막의 안쪽의 표면에 교정되어 있다[Foos, R.Y., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (1972) 11:801 -808를 참고하라]. 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 눈에서의 ILL의 주요한 부착 당단백질(major adhesive glycoproteins)은, RGD(Arg-Gly-Asp) 서열을 통해서 인테그린과 매우 연관되어 있고, 몇몇 인테그린은 ECM 단백질에 존재하는 RGD 모티프를 통해 결합함은 또한 알려져 있다[Curtis,T.M.et al., Am. J. Physiol. , (1995) 269: L248 -L260; Elner, S.G.,et al., IOVS (1996) 37:696-701; and Horman,,S.M,et al., Am. J. Physiol. (1995) 269: L248 -L260를 참고하라]. 게다가, 피브로넥틴은 ανβ3 외의 몇몇의 그 밖의 인테그린에 결합하는 반면에, 비트로넥틴은 ανβ3-특이적인 것으로 알려져 있다.
ECM 에 대한 인테그린의 기본적인 연결(primary connection)은 Arg-Gly-Asp(RGD)서열을 포함하고, RGD 서열은 인테그린 헤드(integrin head)의 α- 및 β- 서브유닛 사이에 위치하는 얕은 틈(shallow crevice)에 결합한다[Xiong, et al., Science (2002) 296: 151-155를 참고하라]. 이러한 바인딩은, 세포 부착, 이송, 분화, 혈관형성 및 상처 치유(wound healing)를 포함하는, 다양한 세포 신호 경로를 조절하는 것을 도와준다[Ruoslahti, E., et aI., Science (1987) 238: 491-497; and J. Clin. Invest. (1991) 87: 1-5를 참고하라].
유리체 세포외 매트릭스; 예를 들어, 콜라겐 섬유(collagen fibrils)는 인테그린 바인딩 부위에 의한 세포의 망막(cellular retina)에 연결되기 때문에, RG시스테산 펩티드[올리고펩티드(oligopeptides)]의 안내의 주사는, 동일한 인테그린 수용체 부위에 경쟁적으로 바인딩함으로써(by a competitive binding), 세포의 망막으로부터 유리체의 세포 외 매트릭스의 RGD 모티프(motif)를 방출할 수 있다.
몇몇의 연구자[Ruoslahti, E. et al., Science (1987) 238: 491-497; Hynes, R.A., et al., Cell (1992) 68: 303 -322; and Humphries, M.J., J. Cell Sci., (1990) 97: 585 -592를 참고하라]는, 많은 인테그린(ανβ3, α5β1, α11β3 등)이 RGD 서열 모티프를 보유하는 작은 펩티드에 의해 저해될 수 있음을 입증하였다. ανβ3 및 α5β1 인테그린 뿐만 아니라 비트로텍틴 및 피브로넥틴이 인간 흑색종 세포(human melanoma cells)[Nip, J., J. Clin. Invest., (1992) 90: 1406-1413를 참고하라], 인간 유방암 세포[Rong, L. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2009) 50: 5988 -5996를 참고하라], 및 인간 망막의 색소 상피 세포(human retinal pigment epithelial cells)[Peter C. Brooks, et al., J. Clin. Invest., (1995) 96: 1815-1822]와 같은 종양에서 상향 조절됨(upregulated)은 또한 잘 기록되어 있다. 따라서, ανβ3 인테그린 수용체를 통한 림프절 비트로넥틴(lymph node vitronectin)에 대한 흑색종 세포의 부착(adhesion) 및 인간 흑색종 세포의 전이의 가능성(metastatic potentials) 사이에 적절한 상관관계(good correlation)가 있고, 부착이 펩티드를 포함하는 RGD 에 의해 저해됨은 입증되었다[Nip, J., J. Clin. Invest., (1992) 90: 1406-1413]. RGD펩티드가 중요한 항-혈관형성 제제(anti-angiogenic agents)일 수 있음을 이는 입증한다.
추가로, 세포 부착에서 현저하게 증가 되었을 때 증가된 전이성 활성도(increased metastatic activity)가 있음이 인간 결장암 세포주(human colon cancer cell line)에서 입증되었다[Lehmann, M., Cancer Res., (1994), 54: 2102-2107]. 따라서, 세포 부착을 저해하는 제제는 전이(metastasizing)로부터의 결장암 및 흑색종을 효율적으로 저해한다.
RG시스테산이 세포의 부착을 저해하는 것으로 나타낸, 상처 치유 연구의 결과를 기초로, 및 흑색종 및 결장암 모델에서의 RGD의 전이의 가능성의 예측에서, RG시스테산 펩티드 및 이들의 유도체는, 예를 들어 흑색종 및 결장암에서의 종양 전이(tumor metastases)를 효율적으로 저해할 수 있다.
종양에 대한 제제의 유도( Directing ) 또는 딜리버리(Delivering)를 위한 RG 시스테산 펩티드의 용도
본 실시예에서, 하기에 나타낸 이합체 RG시스테산 펩티드-파클리탁셀 결합체(화합물 3)가 제공되었다. 이러한 조성물은 항암제로서 유용하다. 이합체 RG시스테산 펩티드는, 특정한 암 세포에서 잘 발현되고, 세포 부착을 저해함으로써, 예를 들어 전이성 유방암(metastatic breast cancer)과 같은 특정한 전이 암(metastatic cancers)을 치료하는데 유용한 인테그린 수용체에 선택적으로 결합한다.
화합물 3 :
Figure pct00021

화합물 3의 이에 해당하는 RGD 아날로그(analogue)의 행동(action), 생물학적 분배(biodistribution) 및 종양 선택성의 합성 및 메커니즘은 Chen, X., et al.; Synthesis and Biological Evaluation of Dimeric RGD Peptide-Paclitaxel Conjugate as a Model for Integrin-Targeted Drug Delivery; J. Med. Chem., (2005) 48 (4):.1098-1106)에 기재된 바와 같다.
화합물 3 은, 이합체 RG시스테산 펩티드에 결합하는, 특정한 항-종양 제제(anti-tumor agent), 파클리탁셀(Paclitaxel)을 포함할지라도, 본 발명의 이러한 양상은, 종양 또는 그 밖의 인테그린-포함하는 조직 또는 구조를 진단, 이미징(imaging), 치료하는데 유용할 수 있는, 어떠한 실현가능한 진단 또는 치료제(any feasible diagnostic or therapeutic agents)에 결합하는 RG시스테산 펩티드의 모든 단량체 또는 다합체 형태(monomeric or multimeric forms)를 포함함을 인식할 수 있다. 본 발명에 따라 단량체 또는 다중체 RG시스테산 펩티드에 결합하는 항 종양 물질의 예는, 항 종양 제제[예를 들어, 암 화학요법제(cancer chemotherapeutic agents), 생체반응 조절인자(biological response modifiers), 혈관신생 억제제(vascularization inhibitors), 호르몬 수용체 차단제(hormone receptor blockers), 냉동수술요법 제제(cryotherapeutic agents) 또는 신조직 형성(neoplasia) 또는 종양형성(tumorigenesis)을 파괴 또는 저해하는 그 밖의 제제]; 알킬화제(alkylating agents) 또는 암세포의 DNA를 공격하여 직접적으로 암 세포를 죽이는 그 밖의 제제[예를 들어, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이소포스파미드(isophosphamide)], 니트로소요소(nitrosoureas) 또는 세포의 DNA 수선(cellular DNA repair)에 필요한 변화를 저해함으로써 암 세포를 살생하는 제제[예를 들어, 카르무스틴(carmustine)(BCNU) 및 로무스틴(lomustine)(CCNU)], 항대사성물질(antimetabolites) 및 특정한 세포 기능, 일반적으로 DNA 합성을 방해함으로써 암 세포 성장을 차단하는 그 밖의 제제[예를 들어, 6 메르캅토퓨린(6 mercaptopurine) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5FU)], 항종양성 항생물질 및 DNA 바인딩 또는 삽입(intercalating) 및 RNA 합성을 예방하는 역할을 하는 그 밖의 화합물[예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토마이신-C(mitomycin-C) 및 블레오마이신(bleomycin)] 식물 (빈카) 알칼로이드[plant(Vinca) alkaloids] 및 식물로부터 유도된 그 밖의 항-종양 제제[예를 들어, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine)], 스테로이드 호르몬(steroid hormones), 호르몬 저해제, 호르몬 수용체 길항물질(hormone receptor antagonists) 및 호르몬-반응성 암의 성장에 영향을 주는 그 밖의 제제[예를 들어, 타목시펜(tamoxifen), 허셉틴(herceptin), 아미노글루테아미드(aminoglutethamide) 및 포르메스탄(formestane)과 같은 아로마타제 억제제(aromatase ingibitors), 레트로졸(letrozole) 및 아나스트라졸(anastrazole)과 같은 트리아졸 저해제(trriazole inhibitors), 엑시메스탄(exemestane)과 같은 스테로이달 저해제(steroidal inhibitors), 항-혈관형성 단백질(anti-angiogenic proteins), 작은 분자(small molecules), 유전자 치료제(gene therapy agents) 및/또는 종양의 혈관형성(angiogenesis) 또는 혈관신생(vascularization)을 저해하는 그 밖의 제제[예를 들어, 메트-1(meth-1), 메트-2(meth-2), 탈리도마이드(thalidomide)], 베바시주맙(bevacizumab) (Avastin), 스쿠알라민(squalamine), 엔도스타틴(endostatin), 엔지오스타틴(angiostatin), 안지오지미(Angiozyme), AE-941 [네오바스타트(Neovastat)], CC-5013 [레비미드(Revimid)], 메디(medi)-522 [비타신(Vitaxin)], 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol)(2ME2, Panzem), 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole)(CAI), 콤브레타스타틴 A4 프로드러그(combretastatin A4 prodrug, CA4P), SU6668, SU11248, BMS-275291, COL-3, EMD 121974, IMC-1C11, IM862, TNP-470, 셀레콕시브(celecoxib)(Celebrex), 로페콕시브(rofecoxib)[바이옥스(Vioxx)], 인터페론 알파(interferon alpha), 인터루킨-12(interleukin-12, IL-12), 또는 참고문헌으로 본원에 명확하게 포함된, Science Vol. 289, Pages 1197-1201 (August 17, 2000)에서 확인된 어떠한 화합물, 생체반응 조절인자(biological response modifiers)[예를 들어, 인터페론, 바실루스 칼메트-구에린(bacillus calmette-guerin, BCG), 단일클론 항체(monoclonal antibodies), 인터루켄 2(interluken 2), 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, GCSF) 등], PGDF 수용체 길항물질(PGDF receptor antagonists), 허셉틴(herceptin), 아스파라기나제(asparaginase), 부술판(busulphan), 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 카르무스틴(carmustine), 클로람부실(cchlorambucil), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 에토포시드(etoposide), 플루카르바진(flucarbazine), 플루오로우라실(flurouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 수산화요소(hydroxyurea), 아이포스파마이드(ifosphamide), 이리노테칸(irinotecan), 로무스틴(lomustine), 멜파란(melphalan), 메르캅토푸린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 토뮤덱스(tomudex), 토포테칸(topotecan), 트레오술판(treosulfan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 미토아지트론(mitoazitrone), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 프로카르바진(procarbazine), 스트렙토신(streptocin), 탁솔(taxol), 탁소텔(taxotere), 이러한 화합물 뿐만 아니라 본원의 리스트에 언급되지 않은 그 밖의 항종양 제제의 아날로그/콘제너(analogs/congeners)를 포함할 수 있다.
인테그린 -발현된 종양( Integrin - Expressive Tumors )의 이미징(Imaging)을 위한 64 CU - 표지된 다합체 RG시스테산 펩티드( 64 CU - Labeled Multimeric RGCysteic Acid Peptides )
본 실시예에서, 하기에 나타낸 본 발명의 64CU-표지된 4합체 및 8합체 RG시스테산 펩티드(64CU-Labeled tetrameric and octameric RGCysteic Acid peptides)(각각 화합물 4 및 5)는, 이미징 및 진단 목적(imaging and diagnostic purposes)[예를 들어, PET 스캐닝(scanning)을 위한 종양의 방사선 표시(radiolabeling)] 뿐만 아니라 종양 또는 ανβ3 인테그린이 발현된 종양과 같은 인테그린이 발현된 그 밖의 세포에 대한 치료제 또는 진단제의 유도(directing) 또는 딜리버리(delivering)를 위한 방사선치료제로서 유용하다.
화합물 4
Figure pct00022

화합물 5
Figure pct00023

화합물 4 및 5의 이에 해당하는 RGD 아날로그(analogue)의 행동(action), 생물학적 분배(biodistribution) 및 종양 선택성(tumor selectivity)의 합성 및 메커니즘 및 PET 관련된 사용(PET related use)은 Li, Z. et al., 64CU-Labeled Tetrameric and Octameric RGD Peptides for Small-Animal PET of Tumor ανβ3 Integrin Expression; J. Nucl. Med. 48 (7) pp. 1162-1171 (2007)에 기재된 바와 같다.
화합물 1에 의해 체내에서 맥락막 신혈관형성( Choroidal Neovascularization, CNV )의 억제
본 실시예에서, 화합물 1은, 공개된 마우스 모델에서 이는 CNV 인지를 측정하기 위해 테스트되었다. Umeda N, Kachi S, Akiyama H, Zahn G, Vossmeyer D, Stragies R, Campochiaro P., Suppression and Regression of Choroidal Neovascularization by Systemic Administration of an α5β1 Integrin Antagonist: Molecular Pharmacology:2006, 69,1820-1828를 참고하라.
상기 연구 마우스는, 레이저 처리 후에 즉시 비히클 뿐만 아니라, 1.0 ㎍/1 μL, 25 ㎍/1 μL 및 50 ㎍/1 μL의 농도에서 화합물 1의 단일 투여량의 유리체내 주사 후에 브루크 막의 레이저-유도된 파열을 가졌다(The study mice had laser-induced rupture of Bruch's membrane followed by an intravitreal injection of a single dose of COMPOUND 1 at the concentration of 1.0 ㎍/1 μL, 25 ㎍/1 μL and at 50 ㎍/1 μL, as well as a vehicle immediately after laser treatment). 레이저 처리 후 14일에, CNV의 영역은 이미지 분석에 의해 측정되었다. CNV 병변의 크기는, 화합물 1의 1.0 ㎍/1 μL 및 50 ㎍/1 μL 농도로 처리된 눈에서 어느 정도 보다 작은 것으로 나타났다. 도 8 은, 화합물 1 및 대조군(오직 비히클만)의 다양한 투여량으로 처리된 후 14 일에 CNV 마우스 모델에서 신혈관형성의 전체 영역을 나타내는 그래프이다.
화합물 1의 25 ㎍/1 μL 농도는, 비히클 처리된 눈과 비교하여, CNV에서 통계학적으로 현저한 43 % 감소를 나타내었다. 이는 25 ㎍1/μL에서 화합물 1의 단일 유리체 내 주입이 CNV를 현저하게 저해하는데 충분함을 제시한다.
생체내 연구 - 당뇨 망막병증을 위한 Rop 모델( Rop Model )
본 실시예에서, 화합물 1은 예비-망막의 신혈관형성을 억제하는 가능성을 조사하기 위해, 허혈성 망막병증 마우스 모델에서 테스트되었다.
허혈성 망막병증을 갖는 마우스는, 출산 후 12 일에, 비히클(BSS)(대조군 1, 2, 3 및 4) 뿐만 아니라, 0.125 ㎍/1 μL, 12.5 ㎍/1 μL, 25.0 ㎍/1 μL 및 50.0 ㎍/1 μL(그룹 B, D, F 및 H, 각각)의 농도에서 화합물 1의 단일 투여량으로 유리체내로(intravitreously) 주사되었다(injected). 출산 후 17 일, 안내 주사 후 5일에, 신혈관형성의 영역은, 이미지 분석에 의해 측정되었다. 도 9는, 이러한 다양한 투여량의 화합물 1 또는 대조군(비히클만)으로 처리된 마우스에서 신혈관형성의 측정된 영역을 비교하는 막대 그래프이다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 신혈관형성 병변의 크기가 (B) 0.125 ㎍/1 μL로 처리된 눈에서 약간 더 작은 것으로 나타내었다. 그러나, 그룹 D(12.5 ㎍/1 μL), F(25.0 ㎍/1 μL) 및 H(50.0 ㎍/1 μL)은 모두 크게 감소되었고, 세 가지 농도 모두가 대조군 2, 3 및 4와 비교하여 통계적으로 현저할 수 있음이 발견되었다.
이러한 연구의 결과는, 12.5 ㎍/1 μL, 25.0 ㎍/1 μL 및 50.0 ㎍/1 μL에서 화합물 1의 단일 유리체 내 주입이 예비-망막의 신혈관형성(pre-retinal neovascularization)을 현저하게 저해하는데 충분함을, 제시한다.
화합물 1의 동물 독성학
하기의 표 A 내지 E 는, 하기의 연구로부터 수득된 동물 독성 데이터를 요약한 것이다 ::
Figure pct00024

[표 A]
Figure pct00025

[표 B]
Figure pct00026

[표 C]
Figure pct00027

[표 D]
Figure pct00028

[표 E]
Figure pct00029

인간 다중 투여 연구
마지막 단계 DME를 갖는 15 명의 인간 환자는, 다중-주사 단계 1 인간 안전성 연구(multiple-injection Phase 1 Human Safety Study)의 일부로서 화합물 1의 세달 간 세 번 안내 주사를 받았다. 어떠한 심각한 부작용 및 어떠한 현저한 부작용이 없었다. 이러한 연구가 우선 안전성 연구)이면서, 효능 또한 측정되었다. 환자 중의 8 명의 환자는 BCVA에서 셋 또는 그 이상의 라인이 향상(치료된 환자의 53 %를 나타냄)되었고, 4명의 환자는 20/40 내지 20/60 범위에서 거의 합법적으로 맹인(nearly legally blind)에서 기능적 시각(functional vision)으로 향상되었다. 게다가, OCT에서 반점이 있는 황반 해부(macular anatomy)에서 현저한 향상이, 30 % 내지 80 %의 범위로, 8 명의 환자에서 관찰되었다. BCVA 및 OCT 중심 황반 두께에서 이러한 개선은, 처리 후 추적 조사의 90 일 동안 지속되었다(These improvements in BCVA and OCT central macular thickness persisted for 90 days of follow up off treatment). 이러한 인간 환자가 마지막 단계 DME로 고통을 받고 있고, 대부분의 환자가 광응고화 레이저(photocoagulation laser) 뿐만 아니라 아바스틴 둘 다의 최신의 치료 선택권(current treatment options)에 대해 처리하기 어려운 것으로 판단되는 사실에도 불구하고, 이러한 결과가 달성되었다. 하기의 표 F 는, 아바스틴 또는 광응고화 레이저 치료와 함께 선행 치료(prior treatment)를 받은 이러한 연구 환자의 요약을 나타낸 것이다:
[표 F]
Figure pct00030

이러한 연구의 추가적인 세부 사항 및 결과는, 도 10a 내지 10h의 도표(diagram) 및 그래프 및 하기의 기재된 단락에서, 하기의 표 F 에 나타내었다.
[표 G]
Figure pct00031

단계 1 연구의 목적은, 말기의 당뇨 황반 부종(end stage diabetic macular edema, DME)을 갖는 인간 피검자에서 화합물 1의 안과의 안내 주사(ophthalmic intravitreal injection)의 안전성 및 초기의 효능을 평가하는 것이다. 이러한 연구의 일차적인 종료점(primary endpoint)은, 용량 제한하는 독성(dose limiting toxicity)의 관찰이다. 이러한 연구의 이차적인 종료점(secondary endpoint)은, BCVA (ETDRS 라인) 및 OCT 중심 황반 두께에서 당뇨 황반 부종을 감소시키는 임상적 이익(clinical benefit)의 관찰이다.
만성 말기 DMF를 갖는 15명의 인간 피검자는, 이러한 오픈 레벨 연구(this open label study)를 마쳤다. 등록에서 피검자는, DME로 인하여 20/100 또는 주로 더 나쁜 BCVA를 갖고(Subjects at enrollment had BCVA of 20/100 or worse primarily due to DME), 등록 전 90 일 내에 항-VEGF 치료 또는 초점 레이저(focal laser)를 받지 않았다. 많은 연구 피검자는 이전의 아바스틴 치료에 대해 반응하지 않는다(Many study subjects were refractory to previous Avastin treatments). 연구 피검자는 2.5 mg 화합물 1의 한 달에 세 번 안내 주사를 받고, 추가적인 3 달 동안 한 달에 한 번 받았다(Study subjects received three monthly intravitreal injections of 2.5mg COMPOUND 1 and were followed monthly for an additional 3 months). 안전성 측정한 다음에 BCVA, 세극등 평가, 확대된 기저부 검사(dilated fundus exam), IOP 측정, OCT, FA, 기저부 사진(Fundus Photos), B-스캔 초음파, 및 ERG를 한다.
15 명의 피검자 전체가 이러한 연구에 등록되었다. 전체적으로, 모든 연구 피검자는 화합물 1에 아주 잘 용인되었다(all study subjects tolerated the study drug COMPOUND 1 extremely well). 전방(anterior chamber) 또는 유리체 강(vitreous cavity)에서 염증성 반응의 어떠한 보고도 없었다. IOP에서 지속된 어떠한 증가도 나타나지 않았다. 이러한 연구 동안에 어떠한 각막 대상부전(corneal decompensation) 또는 백내장 발전도 나타나지 않았다. 어떠한 망막 구멍(retinal tears) 또는 망막 분리가 이러한 연구 동안에 나타나지 않았고, 그러나 높은 발생률(55 %)의 후유리체 박리(posterior vitreous detachment)가, 이전의 토끼 연구에서 나타낸 바와 같이, B-스캔 초음파에 의해 관찰되었다. 게다가, 어떠한 혈관의 폐쇄(vascular occlusions)가 이러한 연구의 과정 동안에 관찰되지 않았다. 15 명의 피검자 중에, 보고된 어떠한 심각한 부작용 또는 현저한 부작용이 없었다.
53 %[15 명 중 8명]의 피검자는, 3 번의 안내 주사를 받은 후에 연구 90 일에 BCVA에서 3 라인(line) 또는 그 이상 증가를 나타내었다. 어떠한 연구 피검자도 베이스라인(baseline)으로부터 BCVA 손실이 나지 않았다(No study subject lost BCVA from baseline). 흥미롭게도, 동일한 비율의 피검자(53 % 또는 15 명 중의 8 명)가, 적어도 30 %의 OCT 중심 황반 두께에서 현저한 감소를 갖는 것으로 나타내었다. 황반 부종에서 최대한의 감소는, 황반 부종에서 505 미크론(microns)(608 to 103), 거의 80 % 감소이다. BCVA에서 개선은 일반적으로, OCT에 의해 황반 부종의 감소에서 개선이 기록되었다(tracked). 하나의 연구 피검자는, 이들의 처리 동안에 초기에 개선되었지만, 안내 치료 후 3 달, 연구 150 일에 지난 이들의 베이스라인 OCT 황반 두께로 나중에 진행되는, 이들의 베이스라인 당뇨 황반 부종으로부터의 진행을 나타내었다(One study subject demonstrated progression from their baseline diabetic macular edema, initially improving during their treatment course but later progressing past their baseline OCT macular thickness at study day 150, 3 months off of intravitreal therapy). 이러한 연구 피검자의 BCVA 초기에 5 라인을 개선시켰지만, 나중에 연구 150일에 의해 베이스라인으로 퇴행되었다.
이러한 연구에서, 도 10a 내지 10h에서 그래프적으로 나타낸 바와 같이, BCVA, OCT 중심 황반 두께, 염증성 반응의 결여, 또는 임상 검사(clinical exam), FA, B-스캔, 또는 ERG에서 망막 병리학(retinal pathology)에 의해 입증된 독성의 결여에서 일관성이 있다. 전체적으로, 화합물 1은 매우 널리 용인되었다(tolerated).
흥미롭게도, 작은 연구 크기 및 연구 피검자의 말기 특성에도 불구하고, OCT 중심 황반 두께에서 해부학상의 개선(anatomic improvements)을 추적하는 BCVA에서의 개선과 함께, 효능의 분명한 임상 지표(clear clinical indicator)가 있는 것 같다. 게다가, 임상적인 개선은, 개선을 나타내는 거의 모든 연구 피검자에서 화합물 1과 함께 마지막 안내 치료를 받고 적어도 90 일 지속된 것으로 나타났다. 보다 큰 연구가, 항-혈관형성 약물의 이러한 새로운 클래스(class)의 상기 안전성 및 효능을 추가적으로 확인하고 평가하고, 작용(action)의 이의 신규한 메카니즘의 특성을 보다 이해하기 위해 필요함을, 저자는 느낀다.
인간 VEGF 를 발현하는 형질전환 마우스( Transgenic Mice )에서 라니비주맙 및 화합물 1 단독 및 병용( combination )에서의 효과
로돕신 프로모터(rhodopsin promoter)가 광수용기(photoreceptor)(rho/VEGF 마우스)에서 인간 VEGF의 발현을 유도하는 형질전환 마우스가 분리 처리 그룹 내로 임의로 추출되고, 연구는 하기의 비교를 제공하기 위해 수행되었다:
Figure pct00032

망막하의 신혈관형성(subretinal neovascularization)의 영역의 전처리 측정은, 차폐된 관찰자(masked observer)에 의해 이미지 분석을 사용하여 각각의 동물에서 하였다. 각각의 동물은, 단일 안내 주사(single intraocular injection)에서 이의 지정된 처리를 받았다. 투여 후 7일, 망막하의 신혈관형성의 영역의 측정은 또다시 하였고, 망막하의 신혈관형성 영역에서의 변화를 측정하기 위해 투여 전 측정(pre-dose measurements)과 비교되었다. 또한, 상기 동물은 희생되었고, 망막은 해부되었고, GSA 렉틴으로 면역염색되고(immunostained), 형광현미경 검사에 의해 검사되었다.
도 11a 는, 25 ㎍ 화합물 1 을 받은 동물(5 마리 동물) vs 10 μ 라니비주맙 + 25 ㎍ 화합물 1의 병용(combination)을 받은 동물(5 마리 동물)의 망막하의 신혈관형성 영역에서 평균 변화를 비교하는 막대 그래프이다. 10 μ 라니비주맙 + 25 ㎍ 화합물 1의 병용을 받은 동물은, 25 ㎍ 화합물 1 단독을 받은 동물보다, 망막하의 신혈관형성 영역에서 35.34 % 보다 크게 감소를 나타내었다. 이러한 데이터는, 테스트된 투여량에서, 라비니주맙 및 화합물 1의 병용이, 화합물 1 단독보다 망막하의 신혈관형성을 감소시키는데 보다 효율적임을 나타낸다.
도 11b는, 10 ㎍ 라비니주맙을 받은 동물(5 마리 동물) vs 10 μ 라비니주맙 + 25 ㎍ 화합물 1을 받은 동물(5 마리 동물)의 망막하의 신혈관형성에서의 평균 변화를 비교하는 막대 그래프이다. 10 μ 라비니주맙 + 25 ㎍ 화합물 1의 병용을 받은 상기 동물은, 10 ㎍ 라비니주맙만을 받은 동물보다, 망막하의 신혈관형성 영역에서 34.70 % 보다 크게 감소를 나타내었다. 이러한 데이터는, 테스트된 투여량에서, 라비니주맙 및 화합물 1의 병용이 오직 화합물 1과 비교하여 망막하의 신혈관형성을 감소시키는데 보다 효과적임을 나타낸다.
도 11c는, 25 ㎍ 화합물 1 을 받은 동물(3 마리 동물) vs 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline)(비히클/대조군)를 받은 동물(3 마리 동물)의 망막하의 신혈관형성 영역에서의 평균 변화를 비교하는 막대 그래프이다. 25 ㎍ 화합물 1을 받은 동물은, 상기 대조군 동물보다 망막하의 신혈관형성 영역에서 37.06 % 보다 크게 감소를 나타내었다. 이러한 데이터는, 테스트된 투여량에서, 화합물 1이 망막하의 신혈관형성에서 대조군보다 보다 효과적임을 나타낸다.
도 11d 는, 10 ㎍ 라비니주맙을 받은 동물(3 마리 동물) vs 인산완충식염수를 받은 동물(비히클/대조군)(3 마리 동물)의 망막하의 신혈관형성 영역에서 평균 변화를 비교하는 막대 그래프이다. 10 ㎍ 라비니주맙을 받은 상기 동물은, 상기 대조군 동물보다 망막하의 신혈관형성 영역에서 38.96 % 보다 많은 감소를 나타낸다. 이러한 데이터는, 테스트된 투여량에서, 라비니주맙이 망막하의 신혈관형성 영역을 감소시키는 점에서 대조군보다 보다 효과적이다.
요약하면, 이러한 비교 연구에서 테스트된 투여량에서, 각각 라비니주맙 및 화합물 1 은, 단독으로 투여된 경우 망막하의 신혈관형성에서 통계적으로 현저한 감소를 야기한다. 그러나, 라비니주맙 및 화합물 1의 병용은, 라비니주맙 단독 또는 화합물 1 단독보다 망막하의 신혈관형성 영역에서 현저하게 보다 큰 감소를 일으킨다. 이러한 데이터를 기초로, VEGF 트랩(VEGF Trap)(라비니주맙)과 함께 화합물 1(본 발명의 또 다른 인테그린 저해하는 화합물)을 사용한 병용 치료가 신생혈관성 눈 질병(neovascular eye diseases)으로부터 고통받는 환자에서 잠재적인 임상의 이익을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 질병 또는 질환의 치료에 대한 어떠한 참고문헌은, 다른 방식으로 언급이 없다면, 이러한 질병이 발생되거나 또는 검출되기 전의 질병 또는 질환의 예방, 또는 발생되거나 또는 검출된 후의 질병 또는 질환의 치료를 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명은 본 발명의 특정한 실시예 또는 실시형태와 관련하여 상기에 기재되었지만, 다양한 첨가, 삭제, 변경(alterations) 및 변형(modifications)이, 본 발명의 의도된 정신 및 범위(intended spirit and scope)로부터 벗어남이 없이 이러한 실시예 및 실시형태에 대해 제조될 수 있음을 인정할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시형태 또는 실시예의 어떠한 요소(element) 또는 특성(attribute)은, 이의 의도된 사용을 위한 부적절한 실시형태 또는 실시예를 제공하는 다른 방법으로 명시되지 않는 한, 또 다른 실시형태 또는 실시예 내에 포함되거나 또는 또 다른 실시형태 또는 실시예와 함께 사용될 수 있다. 또한, 방법 또는 과정의 단계가 기재되거나 또는 특정한 순서로 언급된 경우, 이러한 단계의 순서는, 이의 의도된 목적에 대한 실행 불가능한 방법 또는 과정을 제공하도록 하지 않는 한 또는 다른 방식으로 특정되지 않는 한 변경될 수 있다. 모든 적정한 첨가, 삭제, 변형 및 변경(alterations)은 기재된 실시예 및 실시형태의 등가물로 간주되고, 하기의 특허청구범위의 범위 내로 포함된다. 본원에서 인용된 모든 공개 및 특허 문서는, 만약 각각이 개별적으로 나타낸 바와 같은 동일한 정도로 모든 목적을 위해 이들의 전체가 참고문헌으로 포함된다.

Claims (31)

  1. 인간 또는 동물 피검자(subject)에 있어서 bFGF 생산을 저해하는 방법 및/또는 α3β1-인테그린, α5β1-인테그린, αvβ3-인테그린 및 αvβ5-인테그린, 및/또는 그 밖의 인테그린을 저해하는 방법으로서,
    상기 방법은 RG 시스테산 펩티드(RG Cysteic Acid Peptide) 또는 이의 유도체(derivative)의 유효량을 상기 피검자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 방사선 표지되며(radiolabeled), 종양(tumors)을 검출하는데 사용되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료상의 또는 진단상의 효과(therapeutic or diagnostic effect)를 일으키도록 행하여지는 것인, 방법:
    엔도솜의 카텝신(endosomal cathepsins)을 조절; 미생물성(예를 들어, 박테리아성 또는 바이러스성) 감염을 치료 또는 예방; 세포 내로 미생물(예를 들어, 박테리아 또는 바이러스) 유입을 억제(deterring); 혈관형성 억제(inhibiting angiogenesis)를 치료 또는 예방; 혈관형성-관련 질환(angiogenesis-related disease)의 치료 또는 예방; 종양 또는 신생물(neoplasms)의 혈관신생 또는 혈관형성을 억제; VEGF의 유효성 또는 생산을 억제; 세포의 부착, 이송(migration) 및/또는 증식(proliferation)의 억제; 염증의 치료; 암의 치료; 전이(metastasis)의 치료; 종양에 대한 치료제 또는 진단제(therapeutic or diagnostic agent)의 유도(directing) 또는 딜리버리(delivering); 혈전증(thrombosis)의 치료; 유리체융해(vitreolysis)를 초래(causing); 유리체망막 박리(vitreoretinal detachment)를 초래; 유리체절제술의 수행을 용이하게 함(facilitating performance of a vitrectomy); 상처 치유(wound healing)를 용이하게 함; 특정한 인테그린(integrins)을 발현시키는 조직의 방사선 표지 및 녹내장(glaucoma)의 치료.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 암, 혈관 기형(vascular malformation), 동맥경화증(arteriosclerosis), 혈관 부착(vascular adhesions), 부종성 경화증(edematous sclerosis), 각막 이식 신혈관형성(corneal graft neovascularization), 신생혈관성 녹내장(neovascular glaucoma), 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 익상편(pterygium), 망막의 퇴화(retinal degeneration), 건성 및 습성 황반 변성(dry and wet macular degeneration), 황반 부종(macular edema), 부유물(floaters), 각막 신혈관형성(corneal neovascularization), 허혈성 시신경(ischemic optic nerve), 홍채신생혈관(rubiosis iridis), 중심 정맥 폐쇄(central vein occlusion), 망막 전막의 제거(removal of epiretinal membranes), 수정체 후섬유 증식증(retrolental fibroplasias), 과립형 결막염(granular conjunctivitis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic Lupus erythematosus), 갑상선염(thyroiditis), 건선(psoriasis), 천식(asthma), 모세관확장(capillarectasia), 화농성 육아종(pyogenic granuloma), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis) 및 여드름(acne)으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈관형성-관련 질병 또는 질환(angiogenesis-related disease or disorder)을 치료하도록 수행되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00033

    (이 식에서, X 는, H, C1 - C6 알킬, Ph 및 SO3H 로부터 선택된 것이고, Y 는 독립적으로 OH 및 NH2 로부터 선택된 것이다).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00034

    (이 식에서, X 는 H, C1 - C6 알킬, Ph 및 SO3H 로부터 선택된 것이다).
  7. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00035


    (이 식에서, X 는 H, C1 - C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고, Z 는 H 및 SO3H 로부터 선택된 것이다).
  8. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00036

    (이 식에서, X 는 H, C1 - C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고; Y 는 OH 또는 NH2 로부터 선택된 것이다).
  9. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00037

    (이 식에서, X 는 H, C1 - C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이다).
  10. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00038

    (이 식에서, X 는 H, C1 - C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이다).
  11. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00039

    (이 식에서, X 및 X1 은 고리형 또는 선형(cyclic or linear)의 -Phe-Val-Ala, -Phe-Leu-Ala, -Phe-Val-Gly, -Phe-Leu-Gly, -Phe-Pro-Gly, -Phe-Pro-Ala, -Phe-Val, 또는 Arg, Gly, Cysteic, Phe, Val, Ala, Leu, Pro, Thr의 D-이성질체(isomer) 또는 L-이성질체의 어떠한 컴비네이션의 어떠한 염으로부터 선택된 것이다).
  12. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 하기의 화학식을 갖는 것인, 방법:
    Figure pct00040

    (이 식에서, X' 은 H, C1 - C6 알킬, Ph 또는 SO3H 로부터 선택된 것이고, Z 는 H 또는 Me 로부터 선택된 것이고; Y 는 OH, NH2 로부터 선택된 것이다).
  13. 제1항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 다합체(multimeric) RG 시스테산 펩티드를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 다합체 RG 시스테산 펩티드는 항종양 물질(antitumor substance)에 결합하고, 여기에서 상기 방법은 종양을 치료하기 위해 수행되는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 다합체 RG 시스테산 펩티드는 화합물 3 을 포함하는 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 항종양 물질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법:
    암 화학요법제(cancer chemotherapeutic agents), 생체반응 조절인자(biological response modifiers), 혈관신생 억제제(vascularization inhibitors), 호르몬 수용체 차단제(hormone receptor blockers), 냉동수술요법 제제(cryotherapeutic agents); 신조직 형성(neoplasia) 또는 종양형성(tumorigenesis)을 파괴 또는 저해하는 제제; 알킬화제(alkylating agents); 암세포의 DNA를 공격하여 직접적으로 암 세포를 죽이는 제제; 시클로포스파미드(cyclophosphamide); 이소포스파미드(isophosphamide); 니트로소요소(nitrosoureas), 세포의 DNA 수선(cellular DNA repair)에 필요한 변화를 저해함으로써 암 세포를 살생하는 제제; 카르무스틴(carmustine)(BCNU); 로무스틴(lomustine)(CCNU); 항대사성물질(antimetabolites); DNA 합성을 방해함으로써 암 세포 성장을 차단하는 제제; 6 메르캅토퓨린(6 mercaptopurine); 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5FU); 항종양성 항생물질(antitumor antibiotics); DNA 바인딩 또는 삽입(intercalating) 및 RNA 합성을 예방하는 역할을 하는 화합물; 독소루비신(doxorubicin); 다우노루비신(daunorubicin); 에피루비신(epirubicin); 이다루비신(idarubicin); 미토마이신-C(mitomycin-C); 블레오마이신(bleomycin); 빈카 알칼로이드(Vinca alkaloids); 빈크리스틴(vincristine); 빈블라스틴(vinblastine); 스테로이드 호르몬(steroid hormones); 호르몬 저해제; 호르몬 수용체 길항물질(hormone receptor antagonists); 호르몬-반응성 암의 성장에 영향을 주는 제제; 타목시펜(tamoxifen); 허셉틴(herceptin); 아로마타제 억제제(aromatase inhibitors); 아미노글루테아미드(aminoglutethamide); 포르메스탄(formestane); 트리아졸 저해제(trriazole inhibitors); 레트로졸(letrozole); 아나스트라졸(anastrazole); 스테로이달 저해제(steroidal inhibitors); 엑시메스탄(exemestane); 항-혈관형성 단백질(anti-angiogenic proteins); 유전자 치료제(gene therapy agents); 종양의 혈관형성(angiogenesis) 또는 혈관신생(vascularization)을 저해하는 제제; 메트-1(meth-1); 메트-2(meth-2); 탈리도마이드(thalidomide); 베바시주맙(bevacizumab) (Avastin); 스쿠알라민(squalamine); 엔도스타틴(endostatin); 엔지오스타틴(angiostatin); 안지오지미(Angiozyme); AE-941 [네오바스타트(Neovastat)]; CC-5013 [레비미드(Revimid)]; 메디(medi)-522 [비타신(Vitaxin)]; 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol)(2ME2, Panzem); 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazole)(CAI); 콤브레타스타틴 A4 프로드러그(combretastatin A4 prodrug, CA4P); SU6668; SU11248; BMS-275291; COL-3; EMD 121974; IMC-1C11; IM862; TNP-470; 셀레콕시브(celecoxib)(Celebrex); 로페콕시브(rofecoxib)[바이옥스(Vioxx)]; 인터페론 알파(interferon alpha); 인터루킨-12(interleukin-12, IL-12); 생체반응 조절인자(biological response modifiers); 바실루스 칼메트-구에린(bacillus calmette-guerin, BCG); 단일클론 항체(monoclonal antibodies); 인터루켄 2(interluken 2), 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, GCSF); PGDF 수용체 길항물질(PGDF receptor antagonists); 허셉틴(herceptin); 아스파라기나제(asparaginase); 부술판(busulphan); 카르보플라틴(carboplatin); 시스플라틴(cisplatin); 카르무스틴(carmustine); 클로람부실(cchlorambucil); 시타라빈(cytarabine); 다카르바진(dacarbazine); 에토포시드(etoposide); 플루카르바진(flucarbazine); 플루오로우라실(flurouracil); 젬시타빈(gemcitabine); 수산화요소(hydroxyurea); 아이포스파마이드(ifosphamide); 이리노테칸(irinotecan); 로무스틴(lomustine); 멜파란(melphalan); 메르캅토푸린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 티오구아닌(thioguanine); 티오테파(thiotepa); 토뮤덱스(tomudex); 토포테칸(topotecan); 트레오술판(treosulfan); 빈블라스틴(vinblastine); 빈크리스틴(vincristine); 미토아지트론(mitoazitrone); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 프로카르바진(procarbazine); 스트렙토신(streptocin); 탁솔(taxol) 및 탁소텔(taxotere).
  17. 제13항에 있어서,
    상기 다합체 RG 시스테산 펩티드는 방사선 표지된 화합물(radiolabeled compound)에 결합하고, 상기 방법은 종양 조직을 방사선 표지하기 위해(for radiolabeling tumor tissue) 수행되는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    방사선 표시된 화합물에 결합된 상기 다합체 RG 시스테산 펩티드는 화합물 4 를 포함하는 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    방사선 표시된 화합물에 결합된 상기 다합체 RG 시스테산 펩티드는 화합물 5 를 포함하는 것인, 방법.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 방법은, 바이러스성 또는 그 밖의 미생물성 감염(viral or other microbial infection)을 치료 또는 예방하기 위해 수행되는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 방법은 에볼라 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위해 수행되는 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 화합물은, 피검자의 몸의 세포 내로 상기 바이러스 또는 그 밖의 미생물의 유입을 억제하는 방식으로 엔도솜의 카텝신(endosomal cathepsins)을 조절하는 투여량으로 투여되는 것인, 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    이미 생성된 VEGF의 효과를 결속시키거나(bind), 가두거나(trap), 제거하거나(scavenge) 또는 그렇지 않으면 억제하는 하나 또는 그 이상의 그 밖의 조성물을 피검자에게 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 하나 또는 그 이상의 그 밖의 조성물은, 베바시주맙(아바스틴), 라니비주맙(ranibizumab)(루센티스) 및 아플리버셉트(aflibercept)(에일리아)로부터 선택된 적어도 하나의 제제를 포함하는 것인, 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 티로신 인산화효소(tyrosine kinase)를 저해하는데 더 효과적인 양으로 투여되는 것인, 방법.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체는 후유리체망막 박리(posterior vitreoretinal detachment)를 일으키는데 더 효과적인 양으로 투여되는 것인, 방법.
  27. 제23항에 있어서,
    상기 방법은 피검자의 눈의 망막의 지나친 혈관신생(vascularization)을 초래하는 질환을 치료하기 위해 수행되는 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 질환은, 습성 노인 황반 변성(Wet Age-related Macular Degenration), 당뇨 황반 부종(Diabetic Macular Edema), 증식성 또는 비-증식성 당뇨 망막병증(proliferative or non-proliferative diabetic retinopathy), 유리액의 액화(liquefaction of the vitreous humor), 후유리체-망막 박리의 유도(induction of posterior vitreo-retinal detachment, PVD), 유리체황반견인(vitreomacular traction), 노인 황반 변성(age related macular degeneration), 맥락막의 신혈관형성(choroidal neovascularization), 유리체망막 수술, 정맥 폐쇄(vein occlusion), 각막의 신혈관형성(corneal neovascularization), 허혈성 시신경(ischemic optic nerve), 홍채 신생혈관(rubiosis iridis), 특발성 황반원공(idiopathic macular hole)과 같은 유리체망막 질환(vitreoretinal diseases)의 발병 및 녹내장 수술에서의 흉터 형성의 예방(prevention of scar formation in glaucoma surgery)으로부터 선택된 것인, 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체가 유리체강내 주사(intravireal injection)에 의해 투여되는 것인, 방법.
  30. 제23항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체 및 상기 하나 또는 그 이상의 조성물은 결합되고, 단일 유리체강내 주사(single intravitreal injection)로 투여되는 것인, 방법.
  31. 제23항에 있어서,
    상기 RG 시스테산 펩티드 또는 이의 유도체 및 상기 하나 또는 그 이상의 조성물은 분리 유리체강내 주사(separate intravitreal injections)로 투여되는 것인, 방법.
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