ES2964555T3 - Péptido para uso en la prevención o tratamiento de la degeneración macular - Google Patents

Péptido para uso en la prevención o tratamiento de la degeneración macular Download PDF

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ES2964555T3 ES20156769T ES20156769T ES2964555T3 ES 2964555 T3 ES2964555 T3 ES 2964555T3 ES 20156769 T ES20156769 T ES 20156769T ES 20156769 T ES20156769 T ES 20156769T ES 2964555 T3 ES2964555 T3 ES 2964555T3
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Abstract

La presente invención proporciona métodos para prevenir o tratar enfermedades o afecciones oftálmicas en un sujeto mamífero, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido catiónico aromático representado por la fórmula D-Arg-2',6'-Dmt-Lys. -Phe-NH2 (SS-31) o Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (SS-20). La presente invención proporciona métodos para prevenir o tratar enfermedades o afecciones oftálmicas tales como retinopatía diabética, cataratas, retinitis pigmentosa, glaucoma, degeneración macular, neovascularización coroidea, degeneración de la retina y retinopatía inducida por oxígeno. Estará acompañada, cuando se publique, de la Figura 1. de los dibujos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido para uso en la prevención o tratamiento de la degeneración macular
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU N.° 61/236,440, presentada el 24 de agosto de 2009; Solicitud Provisional de EE. UU. N.° 61/237,745, presentada el 28 de agosto de 2009; y Solicitud Provisional de EE. UU. N.° 61/348,470, presentada el 26 de mayo de 2010.
Campo técnico
La presente tecnología se refiere generalmente a composiciones y métodos para prevenir o tratar enfermedades o afecciones oftálmicas. En particular, la presente tecnología se refiere a la administración de péptidos catiónicos aromáticos en cantidades eficaces para prevenir o tratar enfermedades o afecciones oftálmicas, p. ej., retinopatía diabética, cataratas, retinitis pigmentaria, glaucoma, neovascularización coroidea y retinopatía inducida por oxígeno, en sujetos mamíferos.
Antecedentes
La siguiente descripción se proporciona para ayudar a la comprensión del lector. Ninguna de la información proporcionada o las referencias citadas se admite como técnica anterior a la presente invención.
Las enfermedades y afecciones degenerativas del nervio óptico y la retina son las principales causas de ceguera en el mundo. Una afección degenerativa importante de la retina es la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). La DMAE es la causa más común de ceguera en personas por encima de 50 años en EE. UU. y su prevalencia aumenta con la edad. La DMAE se clasifica como húmeda (neovascular) o seca (no neovascular); la forma seca de la enfermedad es más común. La degeneración macular ocurre cuando la retina central se distorsiona y adelgaza, normalmente asociado con la edad, pero también se caracteriza por inflamación intraocular y angiogénesis (DMAE húmeda únicamente) y/o infección intraocular. La posterior generación de radicales libres, que produce daño tisular oxidativo, inflamación local y producción de factores de crecimiento (tales como VEGF y FGF) y mediadores inflamatorios, conduce a una neovascularización inadecuada, común con la forma húmeda de DMAE.
La retinopatía es una causa principal de ceguera en la diabetes tipo I y también es común en la diabetes tipo II. El grado de retinopatía depende de la duración de la diabetes y generalmente comienza a ocurrir diez o más años después del inicio de la diabetes. La retinopatía diabética puede clasificarse como no proliferativa, donde la retinopatía se caracteriza por un aumento de la permeabilidad capilar, edema y exudados, o proliferativa, donde la retinopatía se caracteriza por una neovascularización que se extiende desde la retina al vítreo, cicatrices, depósito de tejido fibroso y posibilidad de desprendimiento de retina. Se cree que la retinopatía diabética es causada por el desarrollo de proteínas glicosiladas debido al nivel alto de glucosa en sangre. Varias otras retinopatías menos comunes incluyen la membrana neovascular coroidea (CNVM), edema macular cistoide (CME), membrana epirretiniana (ERM) y el agujero macular.
El glaucoma se compone de un conjunto de enfermedades oculares que producen pérdida de la visión por daño al nervio óptico. La presión intraocular (PIO) elevada debido al drenaje ocular inadecuado es la causa principal del glaucoma. El glaucoma a menudo se desarrolla a medida que el ojo envejece, o puede ocurrir como resultado de una lesión ocular, inflamación, tumor o en casos avanzados de cataratas o diabetes. También puede deberse al aumento de la PIO producida por tratamiento con esteroides. Las terapias farmacológicas que han demostrado ser eficaces en el glaucoma reducen la PIO, ya sea disminuyendo la producción de humor vítreo o facilitando el drenaje ocular. Dichos agentes son a menudo vasodilatadores y como tales actúan sobre el sistema nervioso simpático e incluyen antagonistas adrenérgicos.
Jarrett et al. (2008) indican que dirigirse a las mitocondrias con agentes farmacológicos capaces de proteger contra el daño oxidativo o promover la reparación del daño mitocondrial puede ofrecer alternativas potenciales para el tratamiento de la DMAE seca.
Brennan et al. (2009) describe el papel potencial de la función mitocondrial y el equilibrio redox en las enfermedades oculares relacionadas con la edad, y detalla cómo el sistema de reparación de la proteína metionina sulfato reductasa (Msr) y otros sistemas redox desempeñan funciones clave en la función y el mantenimiento del ojo que envejece.
Resumen
En un aspecto, la presente invención proporciona un péptido representado por la fórmula D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 o Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2, para usar en el tratamiento o prevención de una afección oftálmica, en donde la afección oftálmica es la degeneración macular.
Los péptidos catiónicos aromáticos se pueden administrar de diversas formas. En algunas realizaciones, los péptidos se pueden administrar por vía intraocular, oral, tópica, intranasal, intravenosa, subcutánea o transdérmica (p. ej., por iontoforesis).
En una realización, el péptido comprende además un agente activo seleccionado del grupo que consiste en: un antioxidante, un complejante de metales, un fármaco antiinflamatorio, un antibiótico y un antihistamínico. En una realización, el antioxidante es vitamina A, vitamina C, vitamina E, licopeno, selenio, ácido a-lipoico, coenzima Q, glutatión o un carotenoide. En una realización, la formulación comprende además un agente activo seleccionado del grupo que consiste en: aceclidina, acetazolamida, anecortava, apraclonidina, atropina, azapentaceno, azelastina, bacitracina, befunolol, betametasona, betaxolol, bimatoprost, brimonidina, brinzolamida, carbacol, carteolol, celecoxib, cloranfenicol, clortetraciclina, ciprofloxacina, cromoglicato, cromolín, ciclopentolato, ciclosporina, dapiprazol, demecario, dexametasona, diclofenaco, diclorfenamida, dipivefrina, dorzolamida, ecotiofato, emedastina, epinastina, epinefrina, eritromicina, etoxzolamida, eucatropina, fludrocortisona, fluorometolona, flurbiprofeno, fomivirsen, framicetina, ganciclovir, gatifloxacina, gentamicina, homatropina, hidrocortisona, idoxuridina, indometacina, isoflurofato, ketorolaco, ketotifeno, latanoprost, levobetaxolol, levobunolol, levocabastina, levofloxacina, lodoxamida, loteprednol, medrisona, metazolamida, metipranolol, moxifloxacina, nafazolina, natamicina, nedocromilo, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, olopatadina, oximetazolina, pemirolast, pegaptanib, fenilefrina, fisostigmina, pilocarpina, pindolol, pirenoxina, polimixina B, prednisolona, proparacaína, ranibizumab, rimexolona, escopolamina, sezolamida, escualamina, sulfacetamida, suprofeno, tetracaína, tetraciclina, tetrahidrozolina, tetrizolina, timolol, tobramicina, travoprost, triamcinulona, trifluorometazolamida, trifluridina, trimetoprim, tropicamida, unoprostona, vidarbina, xilometazolina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.
El sujeto puede ser un ser humano.
El péptido se puede administrar por vía intraocular, iontoforética, oral, tópica, sistémica, intravenosa, subcutánea o intramuscular.
El péptido puede comprender además un segundo agente activo.
El segundo agente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en: un antioxidante, un complejante metálico, un fármaco antiinflamatorio, un antibiótico y un antihistamínico.
El antioxidante puede ser vitamina A, vitamina C, vitamina E, licopeno, selenio, ácido a-lipoico, coenzima Q, glutatión o un carotenoide.
El segundo agente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en: aceclidina, acetazolamida, anecortava, apraclonidina, atropina, azapentaceno, azelastina, bacitracina, befunolol, betametasona, betaxolol, bimatoprost, brimonidina, brinzolamida, carbacol, carteolol, celecoxib, cloranfenicol, clortetraciclina, ciprofloxacina, cromoglicato, cromolín, ciclopentolato, ciclosporina, dapiprazol, demecario, dexametasona, diclofenaco, diclorfenamida, dipivefrina, dorzolamida, ecotiofato, emedastina, epinastina, epinefrina, eritromicina, etoxzolamida, eucatropina, fludrocortisona, fluorometolona, flurbiprofeno, fomivirsen, framicetina, ganciclovir, gatifloxacina, gentamicina, homatropina, hidrocortisona, idoxuridina, indometacina, isoflurofato, ketorolaco, ketotifeno, latanoprost, levobetaxolol, levobunolol, levocabastina, levofloxacina, lodoxamida, loteprednol, medrisona, metazolamida, metipranolol, moxifloxacina, nafazolina, natamicina, nedocromilo, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, olopatadina, oximetazolina, pemirolast, pegaptanib, fenilefrina, fisostigmina, pilocarpina, pindolol, pirenoxina, polimixina B, prednisolona, proparacaína, ranibizumab, rimexolona, escopolamina, sezolamida, escualamina, sulfacetamida, suprofeno, tetracaína, tetraciclina, tetrahidrozolina, tetrizolina, timolol, tobramicina, travoprost, triamcinulona, trifluorometazolamida, trifluridina, trimetoprima, tropicamida, unoprostona, vidarbina, xilometazolina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y combinaciones de los mismos.
Breve descripción de las figuras
Las FIGs. 1A y 1B muestran los efectos de diferentes concentraciones de SS-31 (10 nM, 100 nM, 1 pM y 10 pM) utilizadas como cotratamiento con glucosa 30 mM (HG). La FIG. 1A muestra el análisis de apoptosis, evaluado mediante citometría de flujo después de tinción con anexina V/PI, que mostró que las tasas de supervivencia para HREC (Q3) fueron 99.3%, 83.2%, 84.3%, 90.7%, 92.8% y 94.3%, respectivamente 24 horas después del tratamiento. La FIG. 1B es una representación gráfica de la tasa de supervivencia de las HREC. Los datos para las concentraciones de SS-31 de 100 nM, 1 pM y 10 pM fueron significativamente más altos que los observados con células expuestas a niveles elevados de glucosa en ausencia de cotratamiento con SS31. *p<0.05 frente al grupo tratado con niveles altos de glucosa 30 mM.
Las FIGs. 2A-2F son una serie de micrografías que muestran que el cotratamiento con SS-31 reducía las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en HREC expuestas a glucosa 30 mM durante 24 h y 48 h. Las ROS intracelulares se midieron utilizando dihidroetidio. 2A, 2D medios de cultivo normales; 2B, 2E glucosa 30 mM; y 2C, 2F glucosa 30 mM SS-31 (100 nM) a las 24 y 48 h, respectivamente.
Las FIGs. 3A y 3B muestran que SS-31 previene la pérdida de potencial mitocondrial de las HREC tratadas con nivel alto de glucosa. FIG. 3A. El A^m de las HREC se midió mediante citometría de flujo después de la tinción con sonda fluorescente JC-1. El tratamiento con alto nivel de glucosa (30 mM) dio como resultado una rápida pérdida del potencial de membrana mitocondrial de las HREC cultivadas a las 24 y 48 horas. Por el contrario, el análisis de citometría de flujo mostró que la glucosa 30 mM en cotratamiento con SS-31 aumentó el A ^m en comparación con el grupo solo con alto nivel de glucosa. FIG. 3B. Análisis cuantitativo del A^m en HREC con alto nivel de glucosa cotratadas con SS-31 durante 24 y 48 horas. La glucosa en alto nivel sola afectó negativamente al A^m . Por el contrario, SS-31 restableció A^m a niveles de control. Los valores representan la media ± DE de seis experimentos separados realizados por triplicado. *P<0.05.
Las FIGs. 4A y 4D son imágenes de microscopía confocal que muestran que las HREC en el grupo de glucosa normal y en el grupo cotratado con SS-31 tienen una superposición más exacta de la tinción de citocromo c y la tinción de HSP60 a las 24 y 48 horas, lo que indica la colocalización de citocromo c y mitocondrias. Veinticuatro y 48 horas después del tratamiento, el citocromo c obviamente aumentó en el citoplasma de las HREC tratadas con glucosa 30 mM. Las FIGs. 4B y 4E muestran el contenido de citocromo c en mitocondrias y citoplasma determinado por transferencia Western. Las FIGs. 4C y 4F muestran análisis cuantitativo del porcentaje de contenido de citocromo c en mitocondrias y citoplasma de HREC cotratadas con alto nivel de glucosa y SS-31 durante 24 y 48 h.
Las FIG. 5A y FIG. 5B muestran que el aumento de la expresión de caspasa-3 en HREC tratadas con alto nivel de glucosa (HG) se redujo mediante el cotratamiento con SS-31, detectado por transferencia Western. La expresión de caspasa-3 se normalizó con respecto a la expresión de p-actina. Las FIGs. 5C-E muestran que SS-31 aumenta la expresión de Trx2 en las HREC tratadas con alto nivel de glucosa. La FIG. 5C muestra el nivel de ARNm de Trx2 en HREC expuestas a glucosa 30 mM tratada con SS-31 durante 24 h y 48 h. La FIG. 5D muestra el nivel de expresión de la proteína Trx2 medido por transferencia Western. La FIG. 5E muestra el análisis cuantitativo del nivel de proteína de Trx2 en HREC 24 y 48 h después de un nivel alto de glucosa con o sin cotratamiento de SS-31.
La FIG. 6 es una fotografía de los efectos de SS-31 en los cristalinos de ratas diabéticas. Fila superior: cristalinos obtenidos de ratas diabéticas; fila inferior: cristalinos obtenidos de ratas diabéticas tratadas con SS-31 o SS-20.
La FIG. 7 es una serie de fotografías que muestran los efectos de SS-31 y SS-20 en los cristalinos de ratas diabéticas. La diabetes fue inducida por una dieta alta en grasas y estreptozotocina (HFD/STZ) (fila superior) o estreptozotocina (STZ) sola (fila inferior).
La FIG. 8 es una serie de micrografías que muestran el epitelio del cristalino de ratas normales, ratas diabéticas y ratas diabéticas tratadas con SS-31. La diabetes fue inducida por STZ.
La FIG. 9 es una serie de micrografías que muestran el epitelio del cristalino de ratas normales, ratas diabéticas y ratas diabéticas tratadas con SS-31. La diabetes fue inducida por HFD/STZ.
La FIG. 10 es una serie de gráficos que muestran la integridad de la barrera hematorretiniana de ratas normales (NRC), ratas diabéticas y ratas diabéticas tratadas con SS-20 o SS-31, analizado mediante extravasación de azul de Evans. (A) diabetes inducida por STZ; (B) diabetes inducida por HFD/STZ.
La FIG. 11 es una serie de micrografías que muestran microvasos retinianos de ratas normales (NRC), ratas diabéticas (HFD/STZ) y ratas diabéticas tratadas con SS-31.
La FIG. 12 es una serie de micrografías que muestran microvasos retinianos de ratas normales, ratas diabéticas (STZ) y ratas diabéticas tratadas con SS-31.
Las FIGs. 13A-13D es una serie de micrografías que muestran la distribución de la proteína de uniones estrechas claudina-5 en microvasos retinianos en ratas normales (A), ratas STZ (B), ratas STZ tratadas con SS-20 (C), o ratas STZ tratadas con SS-31 (D).
La FIG. 14 es un gráfico que muestra la falta de citotoxicidad de SS-31 en células de la red trabecular de individuos no enfermos (HTM) y células de la red trabecular de pacientes con glaucoma (GTM) a los que se les administró SS-31.
La FIG. 15 es una serie de micrografías confocales que muestran que el cotratamiento con SS-31 inhibió de forma dependiente de la dosis la disminución del potencial mitocondrial (A^m) provocada por H2O2200 gM en células de la red trabecular de pacientes con glaucoma (GTM).
La FIG. 16 es una serie de gráficos que muestran que el cotratamiento con SS-31 inhibió la disminución del potencial de membrana mitocondrial (A^m), medido por TMRM y citometría de flujo, en células de la red trabecular de pacientes con glaucoma (GTM) inducido por H2O2200 gM.
La FIG. 17 es un gráfico que compara el potencial de membrana mitocondrial (A^m) en células GTM y HTM.
La FIG. 18 es una serie de micrografías que muestran los cambios morfológicos en células GTM en respuesta al tratamiento con SS-31 vistos usando microscopía de contraste de fase invertida.
La FIG. 19 es una serie de micrografías que muestran que el cotratamiento con SS-31 redujo la pérdida de potencial de membrana mitocondrial en células GTM causada por H2O2400 gM de una manera dependiente de la dosis visto usando microscopía confocal.
La FIG. 20 es una serie de micrografías que muestran que el cotratamiento con SS-31 redujo la pérdida de potencial de membrana mitocondrial (A^m) en células GTM causada por H2O2400 pM visto por TMRM y microscopía confocal (aumento 200x).
La FIG. 21 es una serie de micrografías que muestran los cambios morfológicos en células GTM en respuesta al tratamiento con SS-31 vistos usando microscopía de contraste de fase invertida.
La FIG. 22 es un gráfico que muestra que SS-31 no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad de las células epiteliales pigmentarias de la retina (RPE) humanas primarias (medido mediante el ensayo MTT).
La FIG. 23A es un gráfico que muestra el efecto de diferentes concentraciones de tBHP sobre la viabilidad (medida mediante un ensayo MTT) de células RPE. La FIG. 23B es un gráfico que muestra los efectos de diferentes concentraciones de SS-31 sobre la viabilidad celular cuando se exponen a concentraciones crecientes de tBHP.
Las FIGs. 24A-24C es una serie de micrografías que ilustran los efectos patológicos en un modelo de ratón con neovascularización coroidea (CNV). La FIG. 24D es un gráfico que muestra el área de CNV en los grupos tratado y de control.
La FIG. 25 es una serie de micrografías que ilustran diferentes hallazgos patológicos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno (OIR). Observe las áreas de avascularidad y nueva vascularización en un ratón P17 con OIR en comparación con un ratón normal P17.
Las FIGs. 26A-26D es una serie de micrografías que muestran los efectos de la administración de SS-31 en el modelo de ratón con OIR. La FIG. 26E es un gráfico que muestra el área neovascular de los grupos de control y tratado. SS-31 redujo el área avascular.
La FIG. 27A es un gráfico que muestra el efecto de diferentes dosis de tBHP sobre la viabilidad celular de una línea celular de conos 661W derivada de un tumor de retina de ratón. La FIG. 27B es un gráfico que muestra el efecto de SS-31 1 pM en la reducción de la muerte celular de 661W inducida por tBHP.
La FIG. 28 es una serie de micrografías que muestran el espesor de la capa nuclear externa de la retina (ONL) en un modelo de ratón de degeneración de la retina, en ratones de control y tratados con SS-31.
La FIG. 29 es una serie de micrografías que muestran la densidad de las células conos en montajes planos de retina teñidos con aglutinina de cacahuete (PNA), que tiñe selectivamente los segmentos internos y externos de los conos en ratones de control y tratados con SS-31.
La FIG. 30 es una serie de micrografías que muestran tinción para acoleína, un marcador de daño lipídico oxidativo en un modelo de ratón de degeneración de la retina.
La FIG. 31 es una serie de gráficos que muestran la intensidad de fluorescencia de la producción de ROS intracelular en tres grupos de células de RPE usando análisis FACS. La FIG. 31A muestra la producción de ROS en células de RPE de control; la FIG. 31B muestra la producción de ROS en células de RPE tratadas con tBHP 500 pM durante 3 h; la FIG. 31C muestra la producción de ROS en células de RPE tratadas con tBHP 500 pM durante 3 h y SS-31 1 pM.
La FIG. 32 es una serie de gráficos que muestran el análisis de MMP marcada por JC-1 en un ensayo de FACS. Se analizaron tres concentraciones diferentes de grupos SS-31.
Las FIGs. 33A-33C es una serie de gráficos que muestran el efecto de SS-31 1 pM en la disminución de MMP inducida por tBHP. FIG. 33A: grupo de control; FIG. 33B: grupo de tBHP 500 pM durante 3 h; FIG. 33C: grupo de SS-31 1 pM durante 4 h tBHP 500 pM durante 3 h. FIG. 33D es un gráfico que compara la relación de fluorescencia para los diferentes grupos. *P<0.01, C frente a B.
Las FIGs. 34A-34C es una serie de gráficos que muestran el efecto de SS-31 en la apoptosis celular inducida por tBHP 250 pM durante 24 h. FIG. 34A: grupo de control; FIG. 34B: grupo de tBHP 250 pM durante 24 h; FIG. 34c : grupo de SS-31 1 pM durante 4 h tBHP 250 pM durante 24 h. La FIG. 34D es un gráfico que compara la relación de fluorescencia para los diferentes grupos. *P<0.05 C frente a B.
La FIG. 35 es un gráfico que muestra el nivel de MDA inducido por tBHP en 3 grupos de células de RPE. *P<0.05, grupo de SS-31 1 pM durante 4 h tBHP 250 pM durante 24 h frente a tBHP 250 pM durante 24 h.
La FIG. 36 es un gráfico que muestra la intensidad de fluorescencia de TMRM de células GTM y HTM en grupos de control y tratados con SS-31, medida usando análisis FACS.
La FIG. 37 es un gráfico que muestra la intensidad de fluorescencia de ROS de células GTM y HTM en grupos de control y tratados con SS-31, medida usando análisis FACS.
La FIG. 38 es una serie de gráficos que muestran la apoptosis celular de los grupos control y tratados con SS-31 valorada por porcentaje de células en el cuadrante Q2+Q4.
La FIG. 39 es una serie de gráficos que muestran que SS-31 redujo la producción de ROS intracelular en células GTM3 e iHTM tratadas con H2O2.
La FIG. 40 es una serie de gráficos que muestran que SS-31 protegió contra la despolarización mitocondrial inducida por H2O2 de células GTM3 e iHTM.
Descripción detallada
Debe apreciarse que ciertos aspectos, modos, realizaciones, variaciones y características de la invención se describen a continuación en varios niveles de detalle con el fin de proporcionar una comprensión sustancial de la presente invención. La invención está definida por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o realización establecidos en el presente documento que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones son solo para información.
Al poner en práctica la presente invención, se utilizan muchas técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica de proteínas, biología celular, inmunología, microbiología y ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas y se explican en, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vols. I y II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); y Meth. Enzymol., Vols. 154 and 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds., respectivamente.
Las definiciones de ciertos términos utilizados en esta memoria descriptiva se proporcionan a continuación. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento generalmente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células y similares.
Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" lo entenderán los expertos en la técnica y variará hasta cierto punto dependiendo del contexto en el que se utilice. Si hay usos del término que no están claros para los expertos en la técnica, dado el contexto en el que se utiliza, "aproximadamente" significará hasta más o menos 10% del valor mencionado.
Como se usa en el presente documento, la "administración" de un agente, fármaco o péptido a un sujeto incluye cualquier vía de introducción o administración a un sujeto de un compuesto para realizar su función prevista. La administración puede realizarse por cualquier vía adecuada, incluyendo oral, intraocular, intranasal, parenteral (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea) o tópica. La administración incluye la autoadministración y la administración por otro.
Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y aminoácidos sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que posteriormente se modifican, p.ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metil-sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido natural. En el presente documento se puede hacer referencia a los aminoácidos mediante sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.
Como se usa en el presente documento, la expresión “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico deseado. p. ej., una cantidad que da como resultado la prevención o la disminución de los síntomas asociados con una afección oftálmica. La cantidad de una composición administrada al sujeto dependerá del tipo y gravedad de la enfermedad y de las características del individuo, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a los fármacos. También dependerá del grado, gravedad y tipo de enfermedad. El experto en la técnica podrá determinar las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Las composiciones también se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos terapéuticos adicionales.
En los métodos descritos en el presente documento, los péptidos catiónicos aromáticos se pueden administrar a un sujeto que tenga uno o más signos o síntomas de una afección oftálmica. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de los péptidos catiónicos aromáticos significa niveles en los que se mejoran, como mínimo, los efectos fisiológicos de una afección oftálmica.
Un polipéptido o péptido "aislado" o "purificado" está sustancialmente exento de material celular u otros polipéptidos contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva el agente, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Por ejemplo, un péptido catiónico aromático aislado estaría exento de materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del agente. Dichos materiales que interfieren pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos.
Como se usan en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos. Polipéptido se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, glicopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos incluyen secuencias de aminoácidos modificadas mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica.
Como se usa en el presente documento, el término uso terapéutico "simultáneo" se refiere a la administración de al menos dos ingredientes activos por la misma vía y al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo.
Como se usa en el presente documento, el término uso terapéutico "separado" se refiere a una administración de al menos dos ingredientes activos al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo por vías diferentes.
Como se usa en el presente documento, el término uso terapéutico "secuencial" se refiere a la administración de al menos dos ingredientes activos en momentos diferentes, siendo la vía de administración idéntica o diferente. Más particularmente, el uso secuencial se refiere a la administración completa de uno de los ingredientes activos antes de que comience la administración del otro u otros. Por lo tanto, es posible administrar uno de los ingredientes activos durante varios minutos, horas o días antes de administrar el otro ingrediente o ingredientes activos. En este caso no hay un tratamiento simultáneo.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o ralentizar (disminuir) la afección o trastorno patológico objetivo. Un sujeto es "tratado" con éxito para una afección oftálmica si, después de recibir una cantidad terapéutica de los péptidos catiónicos aromáticos según los métodos descritos en el presente documento, el sujeto muestra una reducción observable y/o medible o ausencia de uno o más signos y síntomas de una afección oftálmica. También debe apreciarse que los diversos modos de tratamiento o prevención de afecciones médicas como se describen pretenden significar "sustancial", que incluye tratamiento o prevención total pero también menos que total, y en donde se logra algún resultado biológica o médicamente relevante.
Como se usa en el presente documento, "prevención" o "prevenir" un trastorno o afección se refiere a un compuesto que, en una muestra estadística, reduce la aparición del trastorno o afección en la muestra tratada con respecto a una muestra de control no tratada, o retrasa la aparición o reduce la gravedad de uno o más síntomas del trastorno o afección en relación con la muestra de control no tratada.
Péptidos catiónicos aromáticos
La presente tecnología se refiere al tratamiento o prevención de una afección oftálmica mediante la administración de ciertos péptidos catiónicos aromáticos. Sin desear estar limitados por la teoría, los péptidos catiónicos aromáticos pueden tratar o prevenir enfermedades o afecciones oftálmicas reduciendo la gravedad o aparición del daño oxidativo en el ojo. Los péptidos catiónicos aromáticos son solubles en agua y altamente polares. A pesar de estas propiedades, los péptidos pueden penetrar fácilmente las membranas celulares. Los péptidos catiónicos aromáticos normalmente incluyen un mínimo de tres aminoácidos o un mínimo de cuatro aminoácidos, unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. El número máximo de aminoácidos presentes en los péptidos catiónicos aromáticos es de aproximadamente veinte aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. De manera adecuada, el número máximo de aminoácidos es aproximadamente doce, más preferiblemente aproximadamente nueve y lo más preferiblemente aproximadamente seis.
Los aminoácidos de los péptidos catiónicos aromáticos pueden ser cualquier aminoácido. Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se usa para referirse a cualquier molécula orgánica que contiene al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxilo. Normalmente, al menos un grupo amino está en la posición a con respecto a un grupo carboxilo. Los aminoácidos pueden ser de tipo natural. Los aminoácidos naturales incluyen, por ejemplo, los veinte aminoácidos levógiros (L) más comunes que normalmente se encuentran en las proteínas de mamíferos, es decir, alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), triptófano (Trp), Tirosina (Tyr) y valina (Val). Otros aminoácidos naturales incluyen, por ejemplo, aminoácidos que son sintetizados en procesos metabólicos no asociados con la síntesis de proteínas. Por ejemplo, los aminoácidos ornitina y citrulina son sintetizados en el metabolismo de los mamíferos durante la producción de urea. Otro ejemplo de un aminoácido natural incluye la hidroxiprolina (Hyp).
Los péptidos contienen opcionalmente uno o más aminoácidos no naturales. Adecuadamente, el péptido no tiene aminoácidos que sean naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser levógiros (L-), dextrógiros (D-) o mezclas de los mismos. Los aminoácidos no naturales son aquellos aminoácidos que normalmente no se sintetizan en procesos metabólicos normales en los organismos vivos y no se encuentran de forma natural en las proteínas. Además, los aminoácidos no naturales tampoco son reconocidos adecuadamente por proteasas comunes. El aminoácido no natural puede estar presente en cualquier posición del péptido. Por ejemplo, el aminoácido no natural puede estar en el extremo N, el extremo C o en cualquier posición entre el extremo N y el extremo C.
Los aminoácidos no naturales pueden comprender, por ejemplo, grupos alquilo, arilo o alquilarilo que no se encuentran en los aminoácidos naturales. Algunos ejemplos de alquilaminoácidos no naturales incluyen ácido a -aminobutírico, ácido p-aminobutírico, ácido Y-aminobutírico, ácido 5 -aminovalérico y ácido £-aminocaproico. Algunos ejemplos de arilaminoácidos no naturales incluyen el ácido orto, meta y para-aminobenzoico. Algunos ejemplos de alquilarilaminoácidos no naturales incluyen ácido orto-, meta- y para-aminofenilacético y ácido Y-fenil-p-aminobutírico. Los aminoácidos no naturales incluyen derivados de aminoácidos naturales. Los derivados de aminoácidos naturales pueden incluir, por ejemplo, la adición de uno o más grupos químicos al aminoácido natural.
Por ejemplo, se pueden añadir uno o más grupos químicos a una o más de las posiciones 2', 3', 4', 5' o 6' del anillo aromático de un resto de una fenilalanina o tirosina, o a la posición 4', 5', 6' o 7' del anillo benzo de un resto triptófano. El grupo puede ser cualquier grupo químico que pueda añadirse a un anillo aromático. Algunos ejemplos de tales grupos incluyen alquilo C<1>-C<4>ramificado o no ramificado, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo o t-butilo, alquiloxi C<1>-C<4>(es decir, alcoxi), amino, alquil(C<1>-C<4>)-amino y di-alquil(C<1>-C<4>)-amino (p. ej., metilamino, dimetilamino), nitro, hidroxilo, halógeno (es decir, fluoro, cloro, bromo o yodo). Algunos ejemplos específicos de derivados no naturales de aminoácidos naturales incluyen norvalina (Nva) y norleucina (Nle).
Otro ejemplo de modificación de un aminoácido en un péptido es la derivatización de un grupo carboxilo de un resto ácido aspártico o uno ácido glutámico del péptido. Un ejemplo de derivatización es la amidación con amoniaco o con una amina primaria o secundaria, p. ej. metilamina, etilamina, dimetilamina o dietilamina. Otro ejemplo de derivatización incluye esterificación con, por ejemplo, alcohol metílico o etílico. Otra modificación de este tipo incluye la derivatización de un grupo amino de un resto lisina, arginina o histidina. Por ejemplo, tales grupos amino pueden estar acilados. Algunos grupos acilo adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo benzoílo o un grupo alcanoílo que comprende cualquiera de los grupos alquilo Ci-C<4>mencionados anteriormente, tales como un grupo acetilo o propionilo.
Los aminoácidos no naturales son preferiblemente resistentes y más preferiblemente insensibles a las proteasas comunes. Ejemplos de aminoácidos no naturales que son resistentes o insensibles a las proteasas incluyen la forma dextrógira (D-) de cualquiera de los L-aminoácidos naturales mencionados anteriormente, así como L- y/o D-aminoácidos no naturales. Los D-aminoácidos normalmente no se encuentran en las proteínas, aunque se encuentran en ciertos antibióticos peptídicos que se sintetizan por medios distintos a la maquinaria sintética de proteínas ribosómicas normales de la célula. Tal como se utilizan en el presente documento, los D-aminoácidos se consideran aminoácidos no naturales.
Con el fin de minimizar la sensibilidad a las proteasas, los péptidos deben tener menos de cinco, preferiblemente menos de cuatro, más preferiblemente menos de tres y, lo más preferiblemente, menos de dos L-aminoácidos contiguos reconocidos por proteasas comunes, independientemente de si los aminoácidos son naturales o no naturales. De manera adecuada, el péptido tiene sólo D-aminoácidos y ningún L-aminoácido. Si el péptido contiene secuencias de aminoácidos sensibles a proteasas, al menos uno de los aminoácidos es preferiblemente un D-aminoácido no natural, confiriendo de este modo resistencia a proteasas. Un ejemplo de una secuencia sensible a proteasas incluye dos o más aminoácidos básicos contiguos que son fácilmente escindidos por proteasas comunes, tales como endopeptidasas y tripsina. Ejemplos de aminoácidos básicos incluyen arginina, lisina e histidina.
Los péptidos catiónicos aromáticos deben tener un número mínimo de cargas positivas netas a pH fisiológico en comparación con el número total de restos de aminoácidos en el péptido. El número mínimo de cargas positivas netas a pH fisiológico se denominará a continuación como (p<m>). El número total de restos de aminoácidos en el péptido se denominará a continuación (r). El número mínimo de cargas positivas netas que se analizan a continuación son todas a pH fisiológico. La expresión "pH fisiológico" como se usa en el presente documento se refiere al pH normal en las células de los tejidos y órganos del cuerpo de los mamíferos. Por ejemplo, el pH fisiológico de un ser humano es normalmente de aproximadamente 7.4, pero el pH fisiológico normal en los mamíferos puede ser cualquier pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.8.
"Carga neta", como se utiliza en el presente documento, se refiere al equilibrio del número de cargas positivas y el número de cargas negativas que llevan los aminoácidos presentes en el péptido. En esta memoria descriptiva, se entiende que las cargas netas se miden a pH fisiológico. Los aminoácidos naturales que están cargados positivamente a pH fisiológico incluyen L-lisina, L-arginina y L-histidina. Los aminoácidos naturales que están cargados negativamente a pH fisiológico incluyen el ácido L-aspártico y ácido L-glutámico.
Normalmente, un péptido tiene un grupo amino N-terminal cargado positivamente y un grupo carboxilo C-terminal cargado negativamente. Las cargas se anulan entre sí a pH fisiológico. Como ejemplo de cálculo de la carga neta, el péptido Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-D-Arg tiene un aminoácido cargado negativamente (es decir, Glu) y cuatro aminoácidos cargados positivamente (es decir, dos restos Arg, uno Lys y uno His). Por lo tanto, el péptido anterior tiene una carga neta positiva de tres.
En una realización, los péptidos catiónicos aromáticos tienen una relación entre el número mínimo de cargas positivas netas a pH fisiológico (p<m>) y el número total de restos de aminoácidos (r) en donde 3p<m>es el número más grande que es menor o igual a r 1. En esta realización, la relación entre el número mínimo de cargas positivas netas (p<m>) y el número total de restos de aminoácidos (r) es el siguiente:
Tabla 1. Número de aminoácidos y cargas positivas netas (3p<m>< p+1)
En otra realización, los péptidos catiónicos aromáticos tienen una relación entre el número mínimo de cargas positivas netas (p<m>) y el número total de restos de aminoácidos (r) en donde 2p<m>es el número más grande que es menor o igual a r 1. En esta realización, la relación entre el número mínimo de cargas positivas netas (p<m>) y el número total de restos de aminoácidos (r) es el siguiente:
Tabla 2. Número de aminoácidos y cargas positivas netas (2p<m>< p+1)
En una realización, el número mínimo de cargas positivas netas (p<m>) y el número total de restos de aminoácidos (r) son iguales. En otra realización, los péptidos tienen tres o cuatro restos de aminoácidos y un mínimo de una carga positiva neta, preferiblemente, un mínimo de dos cargas positivas netas y más preferiblemente un mínimo de tres cargas positivas netas.
También es importante que los péptidos catiónicos aromáticos tengan un número mínimo de grupos aromáticos en comparación con el número total de cargas positivas netas (pt). El número mínimo de grupos aromáticos se denominará a continuación (a). Los aminoácidos naturales que tienen un grupo aromático incluyen los aminoácidos histidina, triptófano, tirosina y fenilalanina. Por ejemplo, el hexapéptido Lys-Gln-Tyr-D-Arg-Phe-Trp tiene una carga neta positiva de dos (aportada por los restos de lisina y arginina) y tres grupos aromáticos (aportados por los restos de tirosina, fenilalanina y triptófano).
Los péptidos catiónicos aromáticos también deben tener una relación entre el número mínimo de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas a pH fisiológico (pt) en donde 3a es el número mayor que es menor o igual a pt 1, excepto que cuando p<t>es 1, a también puede ser 1. En esta realización, la relación entre el número mínimo de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) es la siguiente:
Tabla 3. Grupos aromáticos y cargas positivas netas (3a < pt+1 o a=pt=1)
En otra realización, los péptidos catiónicos aromáticos tienen una relación entre el número mínimo de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) en donde 2a es el número más grande que es menor o igual a pt 1. En esta realización, la relación entre el número mínimo de restos de aminoácidos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) es la siguiente:
Tabla 4. Grupos aromáticos y cargas positivas netas (2a < p<t>+1 o a=p<t>=1)
En otra realización, el número de grupos aromáticos (a) y el número total de cargas positivas netas (pt) son iguales. Los grupos carboxilo, especialmente el grupo carboxilo terminal de un aminoácido C-terminal, preferiblemente se amidan con, por ejemplo, amoniaco para formar la amida C-terminal. Alternativamente, el grupo carboxilo terminal del aminoácido C-terminal puede amidarse con cualquier amina primaria o secundaria. La amina primaria o secundaria puede ser, por ejemplo, un alquilo, especialmente un alquilo C<1>-C<4>ramificado o no ramificado o una arilamina. Por consiguiente, el aminoácido en el extremo C del péptido se puede convertir en un grupo amido, N-metilamido, N-etilamido, N,N-dimetilamido, N,N-dietilamido, N-metil-N-etilamido, N-fenilamido o N-fenil-N-etilamido. Los grupos carboxilato libres de los restos de asparagina, glutamina, ácido aspártico y ácido glutámico que no se encuentran en el extremo C de los péptidos catiónicos aromáticos también pueden amidarse dondequiera que se encuentren dentro del péptido. La amidación en estas posiciones internas puede ser con amoniaco o cualquiera de las aminas primarias o secundarias descritas anteriormente.
En una realización, el péptido catiónico aromático es un tripéptido que tiene dos cargas positivas netas y al menos un aminoácido aromático. En una realización particular, el péptido catiónico aromático es un tripéptido que tiene dos cargas positivas netas y dos aminoácidos aromáticos.
Los péptidos catiónicos aromáticos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes ejemplos de péptidos:
Lys-D-Arg-Tyr-NH<2>
Phe-D-Arg-His
D-Tyr-Trp-Lys-NH<2>
Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH<2>
Tyr-His-D-Gly-Met
Phe-Arg-D-His-Asp
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH<2>
Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg
D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg
Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH<2>
Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His
Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH<2>
Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH<2>
Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys
Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH<2>
Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys
Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH<2>
D-His-Lys-Tyr- D-Phe-Glu- D-Asp- D-His- D-Lys-Arg-Trp-NH<2>
Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe
Tyr-D-His-Phe- D-Arg-Asp-Lys- D-Arg-His-Trp-D-His-Phe
Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH<2>
Phe-Try-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr
Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe- D-Lys- D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys
Glu-Arg-D-Lys-Tyr- D-Val-Phe- D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH<2>
Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu- D-Lys-Arg-D-Trp-Lys- D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly
D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH<2>
Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe
His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH<2>
Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp
Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH<2>
En una realización, un péptido que tiene actividad agonista del receptor opioide mu tiene la fórmula Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH<2>(denominado en el presente documento “SS-01”). SS-01 tiene una carga neta positiva de tres, aportada por los aminoácidos tirosina, arginina y lisina y tiene dos grupos aromáticos aportados por los aminoácidos fenilalanina y tirosina. La tirosina de SS-01 puede ser un derivado modificado de tirosina tal como en 2’,6’-dimetiltirosina para producir el compuesto que tiene la fórmula 2’,6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (denominado en el presente documento “SS-02”). SS-02 tiene un peso molecular de 640 y lleva una carga neta positiva de tres a pH fisiológico. SS-02 penetra fácilmente la membrana plasmática de varios tipos de células de mamíferos de una manera independiente de la energía (Zhao et al.,J. PharmacolExp Ther.304: 425-432, 2003).
Los péptidos que no tienen actividad agonista del receptor opioide mu generalmente no tienen un resto tirosina o un derivado de tirosina en el extremo N (es decir, posición 1 de aminoácidos). El aminoácido en el extremo N puede ser cualquier aminoácido natural o no natural distinto de tirosina. En una realización, el aminoácido en el extremo N es fenilalanina o su derivado. Los derivados de ejemplo de fenilalanina incluyen 2’-metilfenilalanina (Mmp), 2’,6’-dimetilfenilalanina (2’,6’-Dmp), N,2’,6’-trimetilfenilalanina (Tmp) y 2’-hidroxi-6’-metilfenilalanina (Hmp).
Un ejemplo de un péptido catiónico aromático que no tiene actividad agonista del receptor opioide mu tiene la fórmula Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH<2>(denominado en el presente documento “SS-20”). Alternativamente, la fenilalanina N-terminal puede ser un derivado de fenilalanina tal como 2’,6’-dimetilfenilalanina (2’6’-Dmp). SS-01 que contiene 2’,6’-dimetilfenilalanina en la posición 1 de aminoácidos tiene la fórmula 2’,6’-Dmp-D-Arg-Phe-Lys-NH2. En una realización, la secuencia de aminoácidos de SS-02 se reordena de manera que Dmt no esté en el extremo N-terminal. Un ejemplo de un péptido catiónico aromático que no tiene actividad agonista del receptor opioide mu tiene la fórmula D-Arg-2’6’-Dmt-Lys-Phe-NH<2>(SS-31).
SS-01, SS-20, SS-31 y sus derivados pueden incluir además análogos funcionales. Un péptido se considera un análogo funcional de SS-01, SS-20 o SS-31 si el análogo tiene la misma función que SS-01, SS-20 o SS-31. El análogo puede ser, por ejemplo, una variante de sustitución de SS-01, SS-20 o SS-31, en donde uno o más aminoácidos están sustituidos por otro aminoácido.
Las variantes de sustitución adecuadas de SS-01, SS-20 o SS-31 incluyen sustituciones de aminoácidos conservadoras. Los aminoácidos se pueden agrupar según sus características fisicoquímicas de la siguiente manera:
(a) Aminoácidos no polares: Ala(A) Ser(S) Thr(T) Pro(P) Gly(G) Cys (C);
(b) Aminoácidos ácidos: Asn(N) Asp(D) Glu(E) Gln(Q);
(c) Aminoácidos básicos: His(H) Arg(R) Lys(K);
(d) Aminoácidos hidrofóbicos: Met(M) Leu(L) Ile(I) Val(V); y
(e) Aminoácidos aromáticos: Phe(F) Tyr(Y) Trp(W) His (H).
Las sustituciones de un aminoácido en un péptido por otro aminoácido del mismo grupo se denominan sustitución conservadora y pueden mantener las características fisicoquímicas del péptido original. Por el contrario, las sustituciones de un aminoácido en un péptido por otro aminoácido de un grupo diferente generalmente tienen más probabilidades de alterar las características del péptido original.
En algunas realizaciones, el péptido catiónico aromático tiene una fórmula como se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5. Análogos de péptidos con actividad opioide Mu
Ejemplos de otros péptidos catiónicos aromáticos que no activan los receptores opioides mu incluyen, pero no se limitan a, los péptidos catiónicos aromáticos que se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Análogos de péptidos que carecen de actividad opioide Mu
Los aminoácidos de los péptidos mostrados en las Tablas 5 y 6 pueden estar en la configuración L o D.
Los péptidos pueden sintetizarse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados para sintetizar químicamente la proteína incluyen, por ejemplo, los descritos por Stuart y Young en Solid Phase Peptide Synthesis, segunda edición, Pierce Chemical Company (1984), y enMethods Enzymol.289, Academic Press, Inc, Nueva York (1997).
Usos profilácticos y terapéuticos de los péptidos catiónicos aromáticos
Los péptidos catiónicos aromáticos descritos en el presente documento son útiles para prevenir o tratar enfermedades. Específicamente, la descripción proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) una enfermedad o afección oftálmica. Por consiguiente, los presentes métodos proporcionan la prevención y/o el tratamiento de una afección oftálmica en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de un péptido catiónico aromático a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, se pueden administrar a un sujeto composiciones de péptidos catiónicos aromáticos en un esfuerzo por mejorar uno o más de los factores que contribuyen a una enfermedad o afección oftálmica.
Un aspecto de la tecnología incluye métodos para reducir una afección oftálmica en un sujeto con fines terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un sujeto que se sospecha que padece o que ya padece dicha enfermedad en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad, incluidas sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo de la enfermedad. Así pues, la descripción proporciona métodos para tratar a un individuo que padece una afección oftálmica. En algunas realizaciones, la tecnología proporciona un método para tratar o prevenir trastornos oftálmicos específicos, tales como retinopatía diabética, cataratas, retinitis pigmentaria, glaucoma, neovascularización coroidea, degeneración de la retina y retinopatía inducida por oxígeno, en un mamífero mediante la administración de un péptido catiónico aromático.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir la retinopatía diabética. La retinopatía diabética se caracteriza por microaneurismas capilares y hemorragia de punto. Posteriormente, las obstrucciones microvasculares provocan la formación de parches algodonosos en la retina. Además, se puede formar edema retiniano y/o exudados duros en individuos con retinopatía diabética debido al aumento de la hiperpermeabilidad vascular. Posteriormente aparece la neovascularización y el desprendimiento de retina se produce por la tracción del tejido conectivo que ha crecido en el cuerpo vítreo. También pueden producirse rubeosis del iris y glaucoma neovascular que, a su vez, pueden provocar ceguera. Los síntomas de la retinopatía diabética incluyen, pero no se limitan a, dificultad para leer, visión borrosa, pérdida repentina de la visión en un ojo, ver anillos alrededor de las luces, ver manchas oscuras y/o ver luces intermitentes.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir cataratas. Las cataratas son una enfermedad congénita o adquirida caracterizada por una reducción de la claridad del cristalino natural. Las personas con cataratas pueden presentar uno o más síntomas, que incluyen, pero no se limitan a, nubosidad en la superficie del cristalino, nubosidad en el interior del cristalino y/o hinchamiento del cristalino. Ejemplos típicos de enfermedades congénitas asociadas a cataratas son pseudocataratas, cataratas de membrana, cataratas coronarias, cataratas laminares, cataratas puntuadas y cataratas filamentosas. Ejemplos típicos de enfermedades adquiridas asociadas a cataratas son cataratas geriátricas, cataratas secundarias, cataratas pardas, cataratas complicadas, cataratas diabéticas y cataratas traumáticas. Las cataratas adquiridas también son inducibles por descargas eléctricas, radiación, ultrasonido, fármacos, enfermedades sistémicas y trastornos nutricionales. Las cataratas adquiridas incluyen además cataratas postoperatorias.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir la retinitis pigmentaria. La retinitis pigmentaria es un trastorno que se caracteriza por daño de las células bastones y/o conos. La presencia de líneas oscuras en la retina es típica en individuos que padecen retinitis pigmentaria. Las personas con retinitis pigmentaria también presentan una variedad de síntomas que incluyen, pero no se limitan a, dolores de cabeza, entumecimiento u hormigueo en las extremidades, destellos de luz y/o cambios visuales. Véase, p. ej., Heckenlively et al., Clinical findings and common symptoms in retinitis pigmentosa.Am J Ophthalmol.105(5): 504 511 (1988)).
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir el glaucoma. El glaucoma es una enfermedad genética caracterizada por un aumento de la presión intraocular, lo que conduce a una disminución de la visión. El glaucoma puede surgir de diversas afecciones oftalmológicas que ya están presentes en un individuo, tales como heridas, cirugía y otras malformaciones estructurales. Aunque el glaucoma puede ocurrir a cualquier edad, con frecuencia se desarrolla en personas de edad avanzada y conduce a la ceguera. Los pacientes con glaucoma suelen tener una presión intraocular superior a 21 mmHg. Sin embargo, el glaucoma de tensión normal, en el que se encuentran alteraciones glaucomatosas en el campo visual y la papila óptica, puede ocurrir en ausencia de dicho aumento de la presión intraocular, es decir, superior a 21 mmHg. Los síntomas del glaucoma incluyen, entre otros, visión borrosa, dolor ocular intenso, dolor de cabeza, ver halos alrededor de las luces, náuseas y/o vómitos.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir la degeneración macular. La degeneración macular suele ser una enfermedad relacionada con la edad. Las categorías generales de degeneración macular incluyen degeneración macular húmeda, seca y no relacionada con la edad. La degeneración macular seca, que representa aproximadamente 80-90 por ciento de todos los casos, también se conoce como degeneración macular atrófica, no exudativa o drusenoide. En la degeneración macular seca, las drusas suelen acumularse debajo del tejido del epitelio pigmentario de la retina. Posteriormente, la pérdida de visión ocurre cuando las drusas interfieren con la función de los fotorreceptores en la mácula. Los síntomas de la generación macular seca incluyen, pero no se limitan a visión distorsionada, distorsión de la visión central, distorsión de la luz u oscuridad y/o cambios en la percepción del color. La degeneración macular seca puede producir una pérdida gradual de la visión.
La degeneración macular húmeda también se conoce como neovascularización, neovascularización subretiniana, degeneración exudativa o disciforme. Con la degeneración macular húmeda, crecen vasos sanguíneos anómalos debajo de la mácula. Los vasos sanguíneos filtran líquido hacia la mácula y dañan las células fotorreceptoras. La degeneración macular húmeda puede progresar rápidamente y causar daños graves a la visión central. La degeneración macular húmeda y seca tiene síntomas idénticos. Sin embargo, la degeneración macular no relacionada con la edad es poco común y puede estar relacionada con la herencia, diabetes, déficits nutricionales, lesiones, infecciones u otros factores. Los síntomas de la degeneración macular no relacionada con la edad también incluyen, pero no se limitan a, visión distorsionada, distorsión de la visión central, distorsión de la luz u oscuridad y/o cambios en la percepción del color.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir la neovascularización coroidea. La neovascularización coroidea (CNV) es una enfermedad caracterizada por el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos en la capa coroidea del ojo. Los vasos sanguíneos recién formados crecen en la coroides, a través de la membrana de Bruch, e invaden el espacio subretiniano. La CNV puede conducir a problemas de visión o pérdida total de la visión. Los síntomas de la CNV incluyen, pero no se limitan a, ver luces titilantes o parpadeantes o manchas grises en el ojo u ojos afectados, visión borrosa, visión distorsionada y/o pérdida de la visión.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir la degeneración de la retina. La degeneración de la retina es una enfermedad genética que se relaciona con la degradación de la retina. El tejido de la retina puede degenerar por diversas razones, tales como oclusión de arterias o venas, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro y/o fibroplasia retrolental. La degradación de la retina generalmente incluye retinosquisis, degeneración reticular y está relacionada con la degeneración macular progresiva. Los síntomas de la degradación de la retina incluyen, pero no se limitan a, problemas de visión, pérdida de visión, ceguera nocturna, visión de túnel, pérdida de visión periférica, desprendimiento de retina y/o sensibilidad a la luz.
En una realización, se administra un péptido catiónico aromático a un sujeto para tratar o prevenir la retinopatía inducida por oxígeno. La retinopatía inducida por oxígeno (OIR) es una enfermedad caracterizada por degeneración microvascular. La OIR es un modelo reconocido para estudiar la retinopatía del prematuro. La OIR está asociada con daño de las células vasculares que culmina en una neovascularización anormal. La degeneración microvascular conduce a isquemia que contribuye a los cambios físicos asociados con la OIR. El estrés oxidativo también juega un papel importante en la vaso-obliteración de OIR, donde las células endoteliales son propensas al daño peroxidativo. Sin embargo, los pericitos, las células del músculo liso y los astrocitos perivasculares generalmente son resistentes a la lesión peroxidativa. Véase, p. ej., Beauchamp et al., Role of thromboxane in retinal microvascular degeneration in oxygen-induced retinopathy,J Appl Physiol.90: 2279-2288 (2001). La OIR, incluida la retinopatía del prematuro, generalmente es asintomática. Sin embargo, los movimientos oculares anormales, ojos cruzados, miopía severa y/o la leucocoria pueden ser un signo de OIR o retinopatía del prematuro.
En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir, en un sujeto, una afección oftálmica mediante la administración al sujeto de un péptido catiónico aromático que modula uno o más signos o marcadores de una afección oftálmica. Los sujetos en riesgo de sufrir una afección oftálmica pueden identificarse mediante, p. ej., cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en el presente documento. En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos de péptidos catiónicos aromáticos se administran a un sujeto susceptible o en riesgo de sufrir una enfermedad o afección en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el inicio de la enfermedad, incluidos los síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. La administración de un compuesto catiónico aromático profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración, de manera que se previene una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrasa su progresión. Dependiendo del tipo de aberración, p. ej., se puede utilizar un péptido catiónico aromático que actúa para potenciar o mejorar la función mitocondrial o reducir el daño oxidativo, para tratar al sujeto. El compuesto apropiado puede determinarse basándose en los ensayos de cribado descritos en el presente documento.
Determinación del efecto biológico del agente terapéutico basado en péptidos catiónicos aromáticos. En diversas realizaciones, se realizan ensayosin vitrooen vivoadecuados para determinar el efecto de un agente terapéutico basado en péptido catiónico aromático específico y si su administración está indicada para el tratamiento. En diversas realizaciones, se pueden realizar ensayosin vitrocon células representativas del tipo o tipos implicados en el trastorno del sujeto, para determinar si un agente terapéutico basado en un péptido catiónico aromático determinado ejerce el efecto deseado sobre el o los tipos de células. Los compuestos para usar en terapia se pueden ensayar en sistemas de modelos animales adecuados que incluyen, pero no se limitan a, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, conejos y similares, antes de ensayarlos en sujetos humanos. De manera similar, para el ensayoin vivo, se puede utilizar cualquiera de los sistemas de modelos animales conocidos en la técnica antes de la administración a sujetos humanos. En una realización, la administración de un péptido catiónico aromático a un sujeto que presenta síntomas asociados con una afección oftálmica provocará una mejora en uno o más de esos síntomas.
Modos de administración y dosis efectivas
Se puede emplear cualquier método conocido por los expertos en la técnica para poner en contacto una célula, órgano o tejido con un péptido. Los métodos adecuados incluyen métodosin vitro, ex vivo o in vivo.Los métodosin vivoincluyen típicamente la administración de un péptido catiónico aromático, tal como los descritos anteriormente, a un mamífero, preferiblemente un ser humano. Cuando se usain vivopara la terapia, los péptidos catiónicos aromáticos se administran al sujeto en cantidades eficaces (es decir, cantidades que tienen el efecto terapéutico deseado). La dosis y pauta posológica dependerán del grado de la afección oftálmica del sujeto, las características del péptido catiónico aromático particular utilizado, p. ej., su índice terapéutico, el sujeto y los antecedentes del sujeto.
La cantidad eficaz puede determinarse durante ensayos preclínicos y ensayos clínicos mediante métodos familiares para los médicos y especialistas clínicos. Una cantidad eficaz de un péptido útil en los métodos de la presente invención, preferiblemente en una composición farmacéutica, puede administrarse a un mamífero que lo necesite mediante cualquiera de una serie de métodos bien conocidos para administrar compuestos farmacéuticos. En algunas realizaciones, el péptido se puede administrar por vía sistémica, tópica o intraocular.
Los péptidos catiónicos aromáticos descritos en el presente documento se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas para su administración, solos o en combinación, a un sujeto para el tratamiento o prevención de un trastorno descrito en el presente documento. Tales composiciones normalmente incluyen el agente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye solución salina, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas normalmente se formulan para que sean compatibles con la vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen parenteral (p. ej., intravenosa, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea), administración oral, por inhalación, transdérmica (tópica), intraocular, iontoforética y transmucosa. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis de vidrio o plástico. Para comodidad del paciente o del médico tratante, la forma farmacéutica se puede proporcionar en un kit que contiene todo el equipo necesario (p. ej., viales de medicamento, viales de diluyente, jeringas y agujas) para un ciclo de tratamiento.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, una composición para administración parenteral debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil aplicación con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos.
Las composiciones de péptidos catiónicos aromáticos pueden incluir un vehículo, que puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, tiomerasol y similares. Se pueden incluir glutatión y otros antioxidantes para prevenir la oxidación. En muchos casos, puede ser deseable incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio. Se puede conseguir una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes mencionados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos típicos de preparación incluyen secado al vacío y liofilización, que pueden producir un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente filtrada de forma estéril.
Para aplicaciones oftálmicas, el compuesto terapéutico se formula en soluciones, suspensiones y pomadas apropiadas para usar en el ojo. Para formulaciones oftálmicas en general, véase Mitra (ed.), Ophthalmic Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y. (1993) y también Havener, W. H., Ocular Pharmacology, C.V. Mosby Co., San Luis (1983). Las composiciones farmacéuticas oftálmicas pueden adaptarse para administración tópica en el ojo en forma de soluciones, suspensiones, pomadas, cremas o como un inserto sólido. Para una dosis única, se pueden aplicar al ojo humano entre 0.1 ng y 5000 pg, de 1 ng a 500 pg o de 10 ng a 100 pg de los péptidos catiónicos aromáticos.
La preparación oftálmica puede contener sustancias auxiliares no tóxicas tales como componentes antibacterianos que no son perjudiciales en uso, por ejemplo, timerosal, cloruro de benzalconio, metil y propilparabeno, bromuro de bencildodecinio, alcohol bencílico o feniletanol; ingredientes tamponantes tales como cloruro sódico, borato sódico, acetato sódico, citrato sódico o tampones gluconato; y otros ingredientes convencionales tales como monolaurato de sorbitán, trietanolamina, monopalmitilato de sorbitán polioxietilenado, ácido etilendiaminotetraacético y similares.
La solución o suspensión oftálmica se puede administrar con la frecuencia necesaria para mantener un nivel aceptable del péptido catiónico aromático en el ojo. La administración en el ojo de los mamíferos puede realizarse aproximadamente una o dos veces al día.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Para fines de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas para chupar o cápsulas. p. ej., cápsulas de gelatina. Se pueden incluir como parte de la composición agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas para chupar y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos pueden administrarse en forma de pulverización de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado. p. ej., un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador. Dichos métodos incluyen los descritos en la patente de EE. UU. N.° 6,468,798.
La administración sistémica de un compuesto terapéutico como se describe en el presente documento también puede ser por medios transmucosa o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se utilizan penetrantes apropiados para la barrera que se va a atravesar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de pulverizadores nasales. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en forma de pomadas, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica. En una realización, la administración transdérmica se puede realizar mediante iontoforesis.
Se puede formular una proteína o péptido terapéutico en un sistema vehículo. El vehículo puede ser un sistema coloidal. El sistema coloidal puede ser un liposoma, un vehículo de bicapa de fosfolípidos. En una realización, el péptido terapéutico se encapsula en un liposoma manteniendo la integridad del péptido. Como apreciará un experto en la técnica, existe una variedad de métodos para preparar liposomas. (Véase, Lichtenberg et al.,Methods Biochem. Anal.,33:337-462 (1988); Anselem et al., Liposome Technology, CRC Press (1993)). Las formulaciones liposomales pueden retrasar el aclaramiento y aumentar la absorción celular. (Véase Reddy,Ana. Pharmacother., 34(7-8):915-923 (2000)). También se puede cargar un agente activo en una partícula preparada a partir de ingredientes farmacéuticamente aceptables que incluyen, pero no se limitan a, polímeros o liposomas solubles, insolubles, permeables, impermeables, biodegradables o gastrorretentivos. Dichas partículas incluyen, pero no se limitan a, nanopartículas, nanopartículas biodegradables, micropartículas, micropartículas biodegradables, nanoesferas, nanoesferas biodegradables, microesferas, microesferas biodegradables, cápsulas, emulsiones, liposomas, micelas y sistemas de vectores virales.
El vehículo también puede ser un polímero, p. ej., una matriz polimérica biodegradable y biocompatible. En una realización, el péptido terapéutico puede insertarse en la matriz polimérica, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la proteína. El polímero puede ser natural, tal como polipéptidos, proteínas o polisacáridos, o sintético, tal como poli(a-hidroxiácidos). Los ejemplos incluyen vehículos hechos de, p. ej., colágeno, fibronectina, elastina, acetato de celulosa, nitrato de celulosa, polisacárido, fibrina, gelatina y combinaciones de los mismos. En una realización, el polímero es poli(ácido láctico) (PLA) o copoli(ácido láctico/glicólico) (PGLA). Las matrices poliméricas se pueden preparar y aislar en una variedad de formas y tamaños, incluidas microesferas y nanoesferas. Las formulaciones poliméricas pueden dar lugar a una duración prolongada del efecto terapéutico. (Véase Reddy,Ana. Pharmacother.,34 (7-8):915-923 (2000)). En ensayos clínicos se ha utilizado una formulación polimérica para la hormona del crecimiento humano (hGH). (Véase Kozarich y Rich,ChemicalBiology,2:548-552 (1998)).
Ejemplos de formulaciones de liberación sostenida de microesferas poliméricas se describen en la publicación PCT WO 99/15154 (Tracy et al.), en las patentes de EE. UU. N.° 5,674,534 y 5,716,644 (ambas de Zale et al.), en la publicación P<c>T<w>O 96/40073 (Zale et al.), y en la publicación PCT<w>O 00/38651 (Shah et al.). Las patentes de EE. UU. N.° 5,674,534 y 5,716,644 y la publicación<p>C<t>WO 96/40073 describen una matriz polimérica que contiene partículas de eritropoyetina que están estabilizadas contra la agregación con una sal.
En algunas realizaciones, los compuestos terapéuticos se preparan con vehículos que protegerán los compuestos terapéuticos contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido acético). Tales formulaciones se pueden preparar usando técnicas conocidas. Los materiales también se pueden obtener comercialmente, p. ej., de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposomales (incluidos liposomas dirigidos a células específicas con anticuerpos monoclonales contra antígenos específicos de células) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. N.° 4,522,811.
Los compuestos terapéuticos también pueden formularse para mejorar la administración intracelular. Por ejemplo, los sistemas de administración liposomales son conocidos en la técnica, véase, p. ej., Chonn y Cullis, "Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems",Current Opinion in Biotechnology6:698-708 (1995); Weiner, "Liposomes for Protein Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes",Immunomethods4 (3) 201-9 (1994); y Gregoriadis, "Engineering Liposomes for Drug Delivery: Progress and Problems",Trends Biotechnol.13 (12): 527 37 (1995). Mizguchi et al.,Cancer Lett.100:63-69 (1996), describe el uso de liposomas fusogénicos para administrar una proteína a las células tantoin vivocomoin vitro.
La dosificación, toxicidad y eficacia terapéutica de los agentes terapéuticos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación. p. ej., para determinar la LD50 (la dosis letal para 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz para 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos elevados. Si bien se pueden usar compuestos que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden utilizar para formular una variedad de dosificaciones para uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática en circulación que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) según se determina en cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Normalmente, una cantidad eficaz de péptidos catiónicos aromáticos, suficiente para lograr un efecto terapéutico o profiláctico, varía de aproximadamente 0.000001 mg por kilogramo de peso corporal por día a aproximadamente 10 000 mg por kilogramo de peso corporal por día. Preferiblemente, los intervalos de dosificación son de aproximadamente 0.0001 mg por kilogramo de peso corporal por día a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. Por ejemplo, las dosis pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal cada día, cada dos días o cada tres días o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg cada semana, cada dos semanas o cada tres semanas. En una realización, una dosis única de péptido varía de 0.1-10000 microgramos por kg de peso corporal. En una realización, las concentraciones de péptidos catiónicos aromáticos en un vehículo varían de 0.2 a 2000 microgramos por mililitro administrado. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez al día o una vez a la semana. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles sanguíneos de glucosa o insulina en el sujeto y ajustando la dosis o administración en consecuencia. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el sujeto muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido catiónico aromático se puede definir como una concentración de péptido en el tejido diana de 10-11 a 10-6 molar, p. ej., aproximadamente 10-7 molar. Esta concentración puede administrarse mediante dosis sistémicas de 0.001 a 100 mg/kg o una dosis equivalente por superficie corporal. El programa de dosis se optimizaría para mantener la concentración terapéutica en el tejido diana, lo más preferiblemente mediante una administración única diaria o semanal, pero también incluyendo la administración continua (p. ej., infusión parenteral o aplicación transdérmica).
En algunas realizaciones, la dosificación del péptido catiónico aromático se proporciona en un nivel de dosis "bajo", "medio" o "alto". En una realización, la dosis baja se proporciona de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 0.5 mg/kg/h, adecuadamente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/kg/h. En una realización, la dosis media se proporciona de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1.0 mg/kg/h, adecuadamente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.5 mg/kg/h. En una realización, la dosis alta se proporciona de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 10 mg/kg/h, adecuadamente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 2 mg/kg/h.
El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el momento oportuno requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero no limitados a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos.
El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el momento oportuno requeridos para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero no limitados a, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento puede incluir un tratamiento único o una serie de tratamientos.
El mamífero tratado según los presentes métodos puede ser cualquier mamífero, incluidos, por ejemplo, animales de granja, tales como ovejas, cerdos, vacas y caballos; animales de compañía, tales como perros y gatos; animales de laboratorio, tales como ratas, ratones y conejos. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano.
Terapia de combinación con un péptido catiónico aromático y otros agentes terapéuticos
En ciertos casos, puede ser apropiado administrar al menos uno de los péptidos catiónicos aromáticos descritos en el presente documento (o una sal, éster, amida, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable) en combinación con otro agente terapéutico. Sólo a modo de ejemplo, si uno de los efectos secundarios experimentado por un paciente al recibir uno de los péptidos catiónicos aromáticos del presente documento es inflamación, entonces puede ser apropiado administrar un agente antiinflamatorio en combinación con el agente terapéutico inicial. O, sólo a modo de ejemplo, la eficacia terapéutica de uno de los compuestos descritos en el presente documento puede mejorarse mediante la administración de un adyuvante (es decir, por sí solo el adyuvante puede tener sólo un beneficio terapéutico mínimo, pero en combinación con otro agente terapéutico, se mejora el beneficio terapéutico general para el paciente). O, sólo a modo de ejemplo, el beneficio experimentado por un paciente puede incrementarse administrando uno de los compuestos descritos en el presente documento con otro agente terapéutico (que también incluye una pauta posológica) que también tiene un beneficio terapéutico en la prevención o el tratamiento de afecciones oftálmicas. Sólo a modo de ejemplo, en un tratamiento para la degeneración macular que implica la administración de uno de los péptidos catiónicos aromáticos descritos en el presente documento, puede resultar un mayor beneficio terapéutico proporcionando también al paciente otros agentes terapéuticos o terapias para la degeneración macular. En cualquier caso, independientemente de la enfermedad, trastorno o afección oftálmica que se esté tratando, el beneficio general experimentado por el paciente puede ser simplemente una suma de los dos agentes terapéuticos o el paciente puede experimentar un beneficio sinérgico.
Ejemplos específicos, no limitantes, de posibles terapias de combinación incluyen el uso de al menos un péptido catiónico aromático con inductores de óxido nítrico (NO), estatinas, fosfolípidos cargados negativamente, antioxidantes, minerales, agentes antiinflamatorios, agentes antiangiogénicos, inhibidores de metaloproteinasas de matriz y carotenoides. En varios casos, los agentes de combinación adecuados pueden caer dentro de múltiples categorías (solo a modo de ejemplo, la luteína es un antioxidante y un carotenoide). Además, los péptidos catiónicos aromáticos también se pueden administrar con agentes adicionales que pueden proporcionar beneficios al paciente, incluyendo a modo de ejemplo sólo ciclosporina A.
Además, los péptidos catiónicos aromáticos también se pueden usar en combinación con procedimientos que pueden proporcionar un beneficio adicional o sinérgico al paciente, incluyendo, solo a modo de ejemplo, el uso de reoféresis extracorpórea (también conocida como filtración diferencial de membrana), el uso de telescopios en miniatura implantables, fotocoagulación con láser de drusas y terapia de microestimulación.
Se ha mostrado que el uso de antioxidantes beneficia a los pacientes con degeneraciones y distrofias maculares. Véase, p. ej,Arch. Ophthalmol.,119: 1417-36 (2001); Sparrow et al.,J. Biol. Chem,278: 18207-13 (2003). Ejemplos de antioxidantes adecuados que podrían usarse en combinación con al menos un péptido catiónico aromático incluyen vitamina C, vitamina E, betacaroteno y otros carotenoides, coenzima Q, 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxilo (también conocido como Tempol), luteína, hidroxitolueno butilado, resveratrol, un análogo del trolox (PNU-83836-E) y extracto de arándano.
También se ha mostrado que el uso de ciertos minerales beneficia a los pacientes con degeneraciones y distrofias maculares. Véase, p. ej., Arch. Ophthalmol., 119: 1417-36 (2001). Ejemplos de minerales adecuados que podrían usarse en combinación con al menos un péptido catiónico aromático incluyen minerales que contienen cobre, tales como óxido cúprico; minerales que contienen zinc, tales como óxido de zinc; y compuestos que contienen selenio.
También se ha mostrado que el uso de ciertos fosfolípidos cargados negativamente beneficia a los pacientes con degeneraciones y distrofias maculares. Véase, p. ej., Shaban y Richter,Biol. Chem.,383 :537-45 (2002); Shaban et al.,Exp. Eye Res.,75:99-108 (2002). Ejemplos de fosfolípidos cargados negativamente adecuados que podrían usarse en combinación con al menos un péptido catiónico aromático incluyen cardiolipina y fosfatidilglicerol. Los fosfolípidos neutros y/o cargados positivamente también pueden proporcionar beneficios a los pacientes con degeneraciones y distrofias maculares cuando se usan en combinación con péptidos catiónicos aromáticos.
El uso de determinados carotenoides se ha correlacionado con el mantenimiento de la fotoprotección necesaria en las células fotorreceptoras. Los carotenoides son pigmentos naturales de color amarillo a rojo del grupo de terpenoides que se pueden encontrar en plantas, algas, bacterias y ciertos animales, tales como aves y mariscos. Los carotenoides son una clase grande de moléculas en las que se han identificado más de 600 carotenoides naturales. Los carotenoides incluyen hidrocarburos (carotenos) y sus derivados alcohólicos oxigenados (xantofilas). Incluyen actinioeritrol, astaxantina, cantaxantina, capsantina, capsorrubina, p -8'-apocarotenal (apocarotenal), p -12'-apocarotenal, a -caroteno, p-caroteno, "caroteno" (una mezcla de a - y p -carotenos), Y-carotenos, p -criptoxantina, luteína, licopeno, violeritrina, zeaxantina y ésteres de miembros que contienen hidroxilo o carboxilo de los mismos. Muchos de los carotenoides se encuentran en la naturaleza en formas isoméricas cis y trans, mientras que los compuestos sintéticos son frecuentemente mezclas racémicas.
En los seres humanos, la retina acumula selectivamente principalmente dos carotenoides: zeaxantina y luteína. Se cree que estos dos carotenoides ayudan a proteger la retina porque son poderosos antioxidantes y absorben la luz azul. Estudios con codornices establecen que los grupos criados con dietas deficientes en carotenoides tenían retinas con bajas concentraciones de zeaxantina y sufrieron graves daños por la luz, puesto de manifiesto por un número muy elevado de células fotorreceptoras apoptóticas, mientras que el grupo con altas concentraciones de zeaxantina tuvo daños mínimos. Ejemplos de carotenoides adecuados para combinación con al menos un péptido catiónico aromático incluyen luteína y zeaxantina, así como cualquiera de los carotenoides antes mencionados.
Los inductores de óxido nítrico adecuados incluyen compuestos que estimulan el NO endógeno o elevan los niveles del factor relajante derivado del endotelio (EDRF) endógenoin vivoo son sustratos para la óxido nítrico sintasa. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, L-arginina, L-homoarginina y N-hidroxi-L-arginina, incluidos sus análogos nitrosados y nitrosilados (p. ej., L-arginina nitrosada, L-arginina nitrosilada, N-hidroxi-L-arginina nitrosada, N-hidroxi-L-arginina nitrosilada, L-homoarginina nitrosada y L-homoarginina nitrosilada), precursores de L-arginina y/o sus sales fisiológicamente aceptables, que incluyen, por ejemplo, citrulina, ornitina, glutamina, lisina, polipéptidos que comprenden al menos uno de estos aminoácidos, inhibidores de la enzima arginasa (p. ej., N-hidroxi-L-arginina y ácido 2(S)-amino-6-boronohexanoico) y los sustratos de la óxido nítrico sintasa, citoquinas, adenosina, bradiquinina, calreticulina, bisacodilo y fenolftaleína. El EDRF es un factor relajante vascular secretado por el endotelio y se ha identificado como óxido nítrico o un derivado estrechamente relacionado del mismo (Palmer et al.,Nature,327:524-526 (1987); Ignarro et al.,Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84:9265-9269 (1987)).
Las estatinas sirven como agentes hipolipemiantes y/o inductores de óxido nítrico adecuados. Además, se ha demostrado una relación entre el uso de estatinas y el retraso en la aparición o desarrollo de la degeneración macular. G. McGwin, et al.,British Journal of Ophthalmology,87: 1121-25 (2003). Por lo tanto, las estatinas pueden proporcionar beneficios a un paciente que padece una afección oftálmica (tal como degeneraciones y distrofias maculares y distrofias retinianas) cuando se administran en combinación con péptidos catiónicos aromáticos. Las estatinas adecuadas incluyen, sólo a modo de ejemplo, rosuvastatina, pitivastatina, simvastatina, pravastatina, cerivastatina, mevastatina, velostatina, fluvastatina, compactina, lovastatina, dalvastatina, fluindostatina, atorvastatina, atorvastatina cálcica (que es la sal hemicálcica de la atorvastatina) y dihidrocompactina.
Los agentes antiinflamatorios adecuados con los que se pueden usar los péptidos catiónicos aromáticos incluyen, sólo a modo de ejemplo, aspirina y otros salicilatos, cromolín, nedocromil, teofilina, zileutón, zafirlukast, montelukast, pranlukast, indometacina e inhibidores de la lipoxigenasa; fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) (tales como ibuprofeno y naproxina); prednisona, dexametasona, inhibidores de la ciclooxigenasa (es decir, Inhibidores de COX-1 y/o COX-2 tales como naproxeno™ o Celebrex™); estatinas (solo a modo de ejemplo, rosuvastatina, pitivastatina, simvastatina, pravastatina, cerivastatina, mevastatina, velostatina, fluvastatina, compactina, lovastatina, dalvastatina, fluindostatina, atorvastatina, atorvastatina cálcica (que es la sal hemicálcica de atorvastatina) y dihidrocompactina); y esteroides disociados.
También se pueden administrar inhibidores de metaloproteinasas de matriz (MMP) adecuados en combinación con péptidos catiónicos aromáticos con el fin de tratar afecciones oftálmicas o síntomas asociados con degeneraciones maculares o retinianas. Se sabe que las MMP hidrolizan la mayoría de los componentes de la matriz extracelular. Estas proteinasas desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos, tales como la remodelación del tejido normal, la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la angiogénesis. Sin embargo, se ha observado una expresión excesiva de MMP en muchos estados patológicos, incluida la degeneración macular. Se han identificado muchas MMP, la mayoría de las cuales son endopeptidasas de zinc multidominio. Se conocen varios inhibidores de metaloproteinasas (véase, por ejemplo, la revisión de inhibidores de MMP por Whittaker M. et al,Chemical Reviews99(9):2735-2776 (1999)). Ejemplos representativos de inhibidores de MMP incluyen inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP) (p. ej., TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 o TIMP-4), a-2-macroglobulina, tetraciclinas (p. ej., tetraciclina, minociclina y doxiciclina), hidroxamatos (p. ej., BATIMASTAT, MARIMISTAT y Tr Oc ADE), quelantes (p. ej., EDTA, cisteína, acetilcisteína, D-penicilamina y sales de oro), fragmentos de MMP sintéticos, succinil mercaptopurinas, fosfonamidatos y ácidos hidroxamínicos. Ejemplos de inhibidores de MMP que pueden usarse en combinación con péptidos catiónicos aromáticos incluyen, sólo a modo de ejemplo, cualquiera de los inhibidores antes mencionados.
También se ha mostrado que el uso de fármacos antiangiogénicos o anti-VEGF proporciona beneficios a pacientes con degeneraciones y distrofias maculares. Ejemplos de fármacos antiangiogénicos o anti-VEGF adecuados que podrían usarse en combinación con al menos un péptido catiónico aromático incluyen Rhufab V2 (Lucentis™), triptofanil-ARNt sintetasa (TrpRS), Eye001 (aptámero pegilado anti-VEGF), escualamina, Retaane™ 15 mg (acetato de anecortava para suspensión de depósito; Alcon, Inc.), profármaco combretastatina A4 (CA4P), Macugen™, Mifeprex™ (mifepristona--ru486), acetónido de triamcinolona subtenoniano, acetónido de triamcinolona cristalino intravítreo, Prinomastat (AG3340--inhibidor de metaloproteinasa de matriz sintética, Pfizer), acetónido de fluocinolona (incluido el implante intraocular de fluocinolona, Bausch & Lomb/Control Delivery Systems), inhibidores de VEGFR (Sugen) y VEGF-Trap (Regeneron/Aventis).
Otras terapias farmacéuticas que se han utilizado para aliviar el deterioro visual se pueden utilizar en combinación con al menos un péptido catiónico aromático. Dichos tratamientos incluyen, pero no se limitan a, agentes tales como Visudyne™ con el uso de un láser no térmico, PKC 412, Endovion (NeuroSearch A/S), factores neurotróficos, incluyendo a modo de ejemplo el factor neurotrófico derivado de la glía y el factor neurotrófico ciliar, diatazem, dorzolamida, Phototrop, 9-cis-retinal, medicamentos para el ojo (incluida eco-terapia), incluidos yoduro de fosfolina o ecotiofato o inhibidores de la anhidrasa carbónica, AE-941 (AEterna Laboratories, Inc.), Sirna-027 (Sirna Therapeutics, Inc.), pegaptanib (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), neurotrofinas (incluidas , sólo a modo de ejemplo, NT-4/5, Genentech), Cand5 (Acuity Pharmaceuticals), ranibizumab (Genentech), INS-37217 (Inspire Pharmaceuticals), antagonistas de integrinas (incluidos los de Jerini AG y Abbott Laboratories), EG-3306 (Ark Therapeutics Ltd.), BDM-E (BioDiem Ltd.), talidomida (como se usa, por ejemplo, en EntreMed, Inc.), cardiotrofina-1 (Genentech), 2-metoxiestradiol (Allergan/Oculex), DL-8234 (Toray Industries), NTC-200 (Neurotech), tetratiomolibdato (Universidad de Michigan), LYN-002 (Lynkeus Biotech), compuesto de microalgas (Aquasearch/Albany, Mera Pharmaceuticals), D-9120 (Celltech Group p1c), ATX-S10 (Hamamatsu Photonics), TGF-beta 2 (Genzyme/Celtrix), inhibidores de la tirosina quinasa (Allergan, SU<g e>N, Pfizer), NX-278-L (NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences), Opt-24 (OPTIS France SA), neuroprotectores de células ganglionares de la retina (Cogent Neurosciences), derivados de N-nitropirazol (Texas A&M University System), KP-102 (Krenitsky Pharmaceuticals) y ciclosporina A.
En cualquier caso, los múltiples agentes terapéuticos pueden administrarse en cualquier orden o incluso simultáneamente. Si es simultáneamente, los múltiples agentes terapéuticos se pueden proporcionar en una sola forma unificada, o en formas múltiples (solo a modo de ejemplo, ya sea como una solución única o como dos soluciones separadas). Uno de los agentes terapéuticos se puede administrar en dosis múltiples, o ambos se pueden administrar en dosis múltiples. Si no es simultáneo, el tiempo entre las múltiples dosis puede variar desde más de cero semanas hasta menos de aproximadamente cuatro semanas, menos de aproximadamente seis semanas, menos de aproximadamente 2 meses, menos de aproximadamente 4 meses, menos de aproximadamente 6 meses o menos de aproximadamente un año. Además, los métodos, composiciones y formulaciones de combinación no deben limitarse al uso de sólo dos agentes. Sólo a modo de ejemplo, un péptido catiónico aromático puede estar provisto de al menos un antioxidante y al menos un fosfolípido cargado negativamente; o un péptido catiónico aromático puede estar provisto de al menos un antioxidante y al menos un inductor de la producción de óxido nítrico; o un péptido catiónico aromático puede estar provisto de al menos un inductor de la producción de óxido nítrico y al menos un fosfolípido cargado negativamente; etcétera.
Además, también se puede utilizar un péptido catiónico aromático en combinación con procedimientos que pueden proporcionar beneficios adicionales o sinérgicos al paciente. Los procedimientos conocidos, propuestos o considerados para aliviar el deterioro visual incluyen, pero no se limitan a, "translocación retiniana limitada", terapia fotodinámica (que incluye, únicamente a modo de ejemplo, PDT dirigida a receptores, Bristol-Myers Squibb, Co.; porfímero sódico para inyección con PDT; verteporfina, QLT Inc.; rostaporfina con PDT, Miravent Medical Technologies; talaporfina sódica con PDT, Nippon Petroleum; motexafina lutecio, Pharmacyclics, Inc.), oligonucleótidos antisentido (incluidos, a modo de ejemplo, productos ensayados por Novagali Pharma SA e ISIS-13650, Isis Pharmaceuticals), fotocoagulación láser, tratamiento con láser de drusas, cirugía del agujero macular, cirugía de translocación macular, telescopios en miniatura implantables, angiografía Phi-Motion (también conocida como terapia con microláser y tratamiento de vasos alimentadores), terapia con haz de protones, terapia de microestimulación, desprendimiento de retina y cirugía vítrea, hebilla escleral, cirugía submacular, termoterapia transpupilar, terapia del fotosistema I, uso de ARN de interferencia (ARNi), reoféresis extracorpórea (también conocida como filtración diferencial de membrana y reoterapia), implantación de microchips, terapia con células madre, terapia génica de reemplazo, terapia génica con ribozimas (incluida la terapia génica para el elemento de respuesta a la hipoxia, Oxford Biomedica; Lentipak, Genetix; terapia génica de PDEF, GenVec), trasplante de células fotorreceptoras/de la retina (incluidas células epiteliales de la retina trasplantables, Diacrin, Inc.; trasplante de células de la retina, Cell Genesys, Inc.) y acupuntura.
Otras combinaciones que pueden usarse para beneficiar a un individuo incluyen el uso de ensayos genéticos para determinar si ese individuo es un portador de un gen mutante que se sabe que está correlacionado con ciertas afecciones oftálmicas. Sólo a modo de ejemplo, se cree que los defectos en el gen humano ABCA4 están asociados con cinco fenotipos retinianos distintos, incluida la enfermedad de Stargardt, distrofia de conos y bastones, degeneración macular relacionada con la edad y retinitis pigmentaria. Véase p. ej., Allikmets et al., Science, 277: 1805 07 (1997); Lewis et al.,Am. J. Hum. Genet.,64:422-34 (1999); Stone et al.,Nature Genetics,20:328-29 (1998); Allikmets,Am. J Hum. Gen.,67:793-799 (2000); Klevering, et al.,Ophthalmology,11 1:546-553 (2004). Además, una forma autosómica dominante de la enfermedad de Stargardt es causada por mutaciones en el gen ELOV4. Véase Karan et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.(2005). Se espera que los pacientes que poseen cualquiera de estas mutaciones encuentren beneficios terapéuticos y/o profilácticos en los métodos descritos en el presente documento.
Ejemplos
La presente invención se ilustra mejor mediante los siguientes ejemplos, que no deben considerarse limitativos de ninguna manera.
Ejemplo 1: Prevención de lesión inducida por niveles altos de glucosa en células epiteliales de la retina humana
Los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención en la prevención de lesiones inducidas por niveles altos de glucosa en células epiteliales de la retina humana (HREC) se investigaron en HREC cultivadas.
Se conocen métodos de cultivo de HREC útiles en los estudios de la presente invención. Véase en general, Li B, Tang SB, Zhang G, Chen JH, Li BJ. Culture and characterization of human retinal capillary endothelial cell.Chin Ophthal Res2005; 23: 20-2; Premanand C, Rema M, Sameer MZ, Sujatha M, Balasubramanyam M. Effect of curcumin on proliferation of human retinal endothelial cells under in vitro conditions.Invest Ophthalmol Vis Sci2006; 47: 2179-84.
Brevemente, las células HREC se dividieron en tres grupos: un grupo de control normal; un grupo al que se le administró glucosa 30 mM; y un grupo al que se le administró glucosa 30 mM SS-31. La supervivencia de las HREC en niveles altos de glucosa cotratadas con diferentes concentraciones de SS-31 (10 nM, 100 nM, 1 pM, 10 pM) se midió utilizando un ensayo de anexina V+PI y citometría de flujo. Véase en general, Koopman, G., Reutelingsperger, C. P., Kuijten, G. A. M., Keehnen, R. M. J., Pals, S. T. y van Oers, M. H. J. 1994. “Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis”.Blood84: 1415; Homburg, C. H., de Haas, M., von dem Borne, A. E., Verhoeven, A. J., Reutelingsperger, C. P. y Roos, D. 1995. “Human neutrophils lose their surface Fc gamma RIII and acquire Annexin V binding sites during apoptosis in vitro”.Blood85: 532; Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H. y Reutelingsperger, C. 1995. “A novel assay for apoptosis - flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V”.J. Immunol. Meth.184: 39; Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L. y Henson, P. M. 1992. “Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages”.J. Inmunol.148: 2207.
La supervivencia de HREC en niveles altos de glucosa cotratadas con SS-31 se ensayó a las 24 h y 48 h. Los resultados se muestran en la FIG. 1 e indican que la supervivencia de las HREC mejoró significativamente con la administración de SS-31, con una reducción de las células apoptóticas y necróticas. El tratamiento de SS-31 también redujo la producción de ROS (FIG. 2).
Se examinó la evaluación de SS-31 como protector contra la pérdida de potencial mitocondrial de HREC tratadas con nivel alto de glucosa. Para determinar si una ruta mediada por mitocondrias era importante en el efecto protector de SS31 contra la muerte celular inducida por niveles altos de glucosa, se midió el A ^m mediante citometría de flujo. Después de tratar las HREC con niveles altos de glucosa sin SS31 durante 24 o 48 horas, se detectó una rápida pérdida del potencial de membrana mitocondrial mediante la sonda fluorescente JC-1, como lo indica una disminución significativa en la relación de fluorescencia roja a verde observada en el grupo de niveles altos de glucosa. Por el contrario, el A ^m en el grupo cotratado con SS31 100 nM permaneció prácticamente sin cambios y era comparable al grupo de control de glucosa normal (FIG. 3). Estos datos sugieren que SS31 evitó la pérdida de potencial de la membrana mitocondrial causada por la exposición a un entorno con alto nivel de glucosa.
La glucosa (30 mmol/l) indujo la liberación de citocromo c de las mitocondrias de las HREC. Las HREC fijadas se inmunomarcaron con un anticuerpo contra el citocromo c y un anticuerpo contra proteína específica mitocondrial (HSP60). El análisis microscópico confocal mostró que las HREC en cultivo normal y en SS-31 cotratadas con glucosa tienen tinción de citocromo c y tinción de mitocondrias que se superponen, lo que indica colocalización de citocromo c y las mitocondrias (FIG. 4). Después del tratamiento con 30 mmol/l de glucosa durante 24 h o 48 h, se observó algo de citocromo c en el citoplasma de las HREC, lo que indica que la glucosa induce la liberación de citocromo c de las mitocondrias al citoplasma en las células HREC, pero SS-31 puede disminuir dicha translocación entre mitocondrias y citoplasma.
La prevención de la liberación de citocromo c de las mitocondrias dio como resultado una actividad reducida de la caspasa-3. Como se muestra en la FIG. 5, SS-31 disminuyó la expresión de proteína de caspasa-3 en HREC tratadas con alto nivel de glucosa. El nivel de expresión de proteína caspasa-3 escindida se midió por transferencia Western (FIG. 5A). Cuando las HREC se expusieron a glucosa 30 mM durante 24 h y 48 h, el nivel de expresión de caspasa-3 aumentó notablemente. Al mismo tiempo, en el grupo cotratado con SS-31, se mostró una notable disminución en el nivel de proteína caspasa-3 (*p<0.05). La FIG. 5B muestra un análisis cuantitativo del nivel de expresión de caspasa-3 de HREC en niveles altos de glucosa cotratadas con SS-31 durante 24 y 48 h.
SS-31 aumentó la expresión de Trx2 en las HREC tratadas con alto nivel de glucosa. La FIG. 5C muestra el nivel de ARNm de Trx2 en HREC expuestas a glucosa 30 mM cotratadas con SS-31 durante 24 h y 48 h. El nivel de expresión de ARNm de Trx2 se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles relativos de ARNm de Trx2 se normalizaron respecto a los niveles de ARNm de 18S (*p<0.05 frente al grupo con nivel medio de glucosa normal y el grupo tratado con alto nivel de glucosa 30 mM). Se utilizaron tres muestras independientes para cada punto temporal. La FIG. 5D muestra el nivel de expresión de la proteína Trx2 medido mediante transferencia Western. La expresión de la proteína de Trx2 en el grupo con alto nivel de glucosa cotratado con SS-31 aumentó significativamente en comparación con el grupo de glucosa normal (*p<0.05). La FIG. 5E muestra el análisis cuantitativo del nivel de proteína de Trx2 en HREC 24 y 48 h después de un nivel alto de glucosa sin o con cotratamiento con SS-31.
Estos resultados indican que SS-31 puede promover la supervivencia de las células HREC en un entorno con alto nivel de glucosa. Como tal, SS-31 y otros péptidos catiónicos aromáticos pueden ser útiles en métodos para la prevención de la retinopatía diabética.
Ejemplo 2 - Prevención de la retinopatía diabética en ratas alimentadas con una dieta alta en grasas
Los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención en la prevención del desarrollo de retinopatía diabética se investigaron en un modelo de rata Sprague-Dawley. El ejemplo describe los resultados de tales experimentos.
Se estableció un modelo de diabetes en ratas mediante una combinación de HFD de 6 semanas y una inyección de dosis baja de STZ (30 mg/kg) o una única dosis alta de STZ (65 mg/kg) en ratas SD. Véase en general, K. Srinivasan, B. Viswanad, Lydia Asrat, C.L. Kaul y P. Ramarao, “Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocintreated rat: A model for type 2 diabetes and pharmacological screening”,Pharmacological Research,52(4): 313-320, 2005. Como control se utilizaron ratas del mismo lote alimentadas con comida normal (NRC). Las tablas 7-10 muestran el programa terapéutico y el protocolo experimental.
Tabla 7. Grupos de tratamiento - modelo de HFD/STZ
Tabla 8. Programa terapéutico - Modelo de HFD/STZ
Tabla 9. Grupos de Tratamiento - Modelo de STZ
Tabla 10. Programa terapéutico - Modelo de STZ
De acuerdo con el protocolo experimental que se acaba de describir, se demostraron los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos en el tratamiento de afecciones asociadas con la diabetes en un modelo de rata SD. La administración de SS-20 y SS-31 dio como resultado una prevención o reversión de la formación de cataratas en el cristalino de ratas diabéticas (FIGs. 6 y 7, Tablas 11 y 12).
Tabla 11. Modelo de rata de HFD/STZ
Grupo Grado de turbidez Porcentaje de opacidad Porcentaje de opacidad grave (%) (%)
- + ++ +++
NRC 4 0 0 0 0 0 0
HFD/STZ 1 0 2 3 0 83.3 0
SS203 mg 1 1 1 0 1 75.0 25.0
SS20 10 mg 1 2 1 0 0 75.0 0
SS31 1 mg 1 1 1 0 0 67.7 0
SS31 3 mg 3 1 0 0 1 20.0 20.0
SS31 10 mg 6 1 0 0 0 14.3 0
-: transparente;
: ligeramente opaco;
+: opaco;
++: moderadamente opaco;
+++: muy opaco
Tabla 12. Modelo de rata de STZ
Grupo Grado de opacidad Porcentaje de opacidad (%) Porcentaje de opacidad grave (%) + ++ +++
NRC 6 0 0 i0 0 0 0
STZ 1 0 0 1 3 80.0 60.0 SS20 10 mg 2 0 2 0 1 60.0 20.0
SS31 10 mg 2 2 0 0 1 60.0 20.0
Se investigó el efecto de los péptidos catiónicos aromáticos sobre el epitelio del cristalino en el modelo de rata SD. La administración de SS-31 redujo los cambios celulares epiteliales tanto en el modelo de rata de STZ (FIG. 8) como en el modelo de rata de HFD/STZ (FIG. 9).
Se investigó el efecto de los péptidos catiónicos aromáticos en la función de la barrera hematorretiniana interna en el modelo de rata SD. La administración de SS-20 y SS-31 dio como resultado una función mejorada de la barrera hematorretiniana interna en comparación con ratas en HFD a las que no se les administró SS-20 o SS-31 (FIG. 10). Se investigó el efecto de los péptidos catiónicos aromáticos en los microvasos retinianos en el modelo de rata SD (FIGs. 11-12). La administración de SS-31 redujo los cambios microvasculares retinianos observados en ratas de STZ o HFD/STZ.
Se investigó el efecto de los péptidos catiónicos aromáticos en la distribución de la proteína de uniones estrechas claudina-5 en los microvasos retinianos en el modelo de rata SD. La distribución de la proteína de uniones estrechas claudina-5 se detectó con un microscopio confocal (FIG. 13). La claudina-5 se distribuyó a lo largo de los vasos retinianos de manera suave, lineal y uniforme en ratas normales (A), pero la forma lineal se rompió en la rata de STZ (B, flecha). La distribución de claudina-5 en los vasos retinianos en ratas de STZ tratadas con SS-20 (10 mg/kg) o SS-31 (10 mg/kg) fue similar a la de ratas normales (Paneles C y D, respectivamente).
En resumen, estos hallazgos establecen colectivamente que los péptidos catiónicos aromáticos previenen o compensan los efectos negativos de la diabetes en el ojo, p. ej., cataratas y microvasculatura. Así pues, la administración de los péptidos catiónicos aromáticos de la presente invención es útil en métodos para prevenir o tratar afecciones oftálmicas asociadas con la diabetes en sujetos humanos.
Ejemplo 3 - SS-31 previene el estrés oxidativo en células de la red trabecular glaucomatosas
Los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención en la prevención o el tratamiento del glaucoma se investigaron estudiando los efectos de los péptidos en células de la red trabecular glaucomatosas. El glaucoma es la segunda causa de ceguera irreversible en todo el mundo. El glaucoma primario de ángulo abierto (POAG) es el subtipo principal de glaucoma. En el POAG, no hay ninguna anomalía visible de la red trabecular. Sin embargo, se cree que la capacidad de las células de la red trabecular para llevar a cabo su función normal está alterada.
En este ejemplo, se compararon los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención entre células de la red trabecular de pacientes con POAG (GTM) y células de la red trabecular de individuos no enfermos (HTM). Se han descrito métodos útiles en los estudios de la presente invención. Véase en general, He Y, Ge J, Tombran-Tink J., “Mitochondrial defects and dysfunction in calcium regulation in glaucomatous trabecular meshwork cells”.Invest Ophthalmol Vis Sci.2008, 49(11 ):4912-22; He Y, Leung KW, Zhang YH, Duan S, Zhong XF, Jiang RZ, Peng Z, Tombran-Tink J, Ge J. “Mitochondrial complex I defect induces ROS release and degeneration in trabecular meshwork cells of POAG patients: protection by antioxidants”.Invest Ophthalmol Vis Sci.2008, 49(4):1447-58. Las células GTM muestran un deterioro significativo del potencial de membrana mitocondrial en comparación con las células HTM (FIG.
18).
Las células se dividieron en tres grupos: Las células del "Grupo A" se expusieron a peróxido de hidrógeno antes de la administración de SS-31. Las células del "grupo B" se expusieron a SS-31 antes de la administración de peróxido de hidrógeno. A las células del "Grupo C" se les administró SS-31 y peróxido de hidrógeno simultáneamente.
Para evaluar si SS-31 tenía efectos citotóxicos en las células HTM o GTM, se administraron varias concentraciones de SS-31 a las células y se midió la citotoxicidad utilizando un ensayo de LDH. Un ensayo de citotoxicidad de LDH es un método colorimétrico para evaluar la citotoxicidad celular. El ensayo mide cuantitativamente la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) citosólica estable, que es liberada de células dañadas. La LDH liberada se mide con una reacción enzimática acoplada que da como resultado la conversión de una sal de tetrazolio (yodonitrotetrazolio (INT)) en formazán de color rojo mediante la diaforasa. Se conocen métodos para detectar LDH de células útiles en los estudios de la presente invención. Véase en general, Haslam, G. et al. (2005)Anal. BioChem.336: 187; Tarnawski, A. (2005)Biochem. Biophys. Res. Comm.333: 207; Ronda, J. L et al. (2005)J. Exp. Med.201: 419; Bose, C. et al. (2005)Am. J. Physiol. Gastr. L.289: G926; Chen, A. y Xu, J. (2005)Am. J. Physiol. Gastr. L.288: G447. La actividad de la LDH se determina como oxidación de NADH o reducción de INT durante un período de tiempo definido. Los resultados se muestran en la FIG. 14 e indican que SS-31 no afecta a la viabilidad de las células HTM y GTM.
Los métodos para medir el potencial de membrana mitocondrial usando TMRM útiles en los estudios de la presente invención han sido descritos por Andrea Rasola y Massimo Geuna, “A flow cytometry assay simultaneously detects independent apoptotic parameters”,Cytometry45:151-157, 2001; Kit JC-1 Mitprobe™ para citometría de flujo, Molecular Probes, Invitrogen, EE. UU. La FIG. 16 muestra los resultados en células GTM. En conjunto, estos resultados establecen que el tratamiento con SS-31 mejora el potencial de membrana mitocondrial de las células que estuvieron expuestas al peróxido de hidrógeno antes de la administración de SS-31.
Grupo A. Se investigó el potencial de membrana mitocondrial (A^m) de las células HTM y GTM cuando esas células se expusieron a peróxido de hidrógeno antes de la administración de SS-31. En primer lugar, se midió el potencial de membrana mitocondrial usando microscopía confocal de células marcadas con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM, 500 nM x 30 min) (FIG. 15). El potencial de membrana mitocondrial también se midió usando citometría de flujo (FIGs. 16-17) marcando las células con la sonda selectiva para mitocondrias de éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM, 500 nM x 30 min).
Grupo B. Se investigó la morfología de las células GTM cuando esas células se expusieron a SS-31 antes de la administración de peróxido de hidrógeno. La FIG. 18 muestra los resultados de la microscopía de contraste de fase invertida de células a las que se les administraron diversas concentraciones de SS-31. Los resultados indican que SS-31 protege a las células de los cambios morfológicos mediados por el peróxido de hidrógeno de una manera dependiente de la concentración y dependiente del tiempo. Es decir, la pérdida de células y el redondeo mediados por peróxido de hidrógeno disminuyeron en las células expuestas al péptido SS-31. También se investigó el potencial de membrana mitocondrial (A^m) de las células HTM y GTM cuando esas células se expusieron a SS-31 antes de la administración de peróxido de hidrógeno. El potencial de membrana mitocondrial se midió usando microscopía confocal de células marcadas con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM, 500 nM x 30 min) (FIG. 19-21). Estos resultados muestran que el tratamiento previo con SS-31 mejora de forma dependiente de la dosis el potencial de la membrana mitocondrial de las células que se expusieron al peróxido de hidrógeno. Así pues, SS-31 proporciona un efecto protector contra el estrés oxidativo en las células GTM.
Se investigaron los efectos de SS-31 para mitigar la lesión oxidativa aguda en células GTM y HTM. La FIG. 36 muestra la intensidad de fluorescencia de TMRM de células GTM y HTM usando análisis FACS. El porcentaje de intensidad de fluorescencia en comparación con el control de GTM en H2O2, SS-31 10-6 M, SS-31 10-7 M, SS-31 10-8 M fue 35.2±2.12%, 56.2±4.04%, 50.3±4.46%, 47.5±2.82% respectivamente, n=4; en los grupos de HTM fue 37.4±0.725%, 57.7±1.80%, 50.6±3.06%, 49.4±2.27% respectivamente, n=4. ** significa P<0.01 en comparación con el grupo de GTM de H2O2; * significa P<0.05 en comparación con el grupo de GTM de H2O2; A A A significa P<0.001 en comparación con el grupo de HTM de H2O2.
La FIG. 37 muestra la intensidad de fluorescencia de ROS de células GTM y HTM en grupos de control y tratados con SS-31 usando análisis FACS. El porcentaje de producción de ROS intracelular en comparación con el control de GTM en grupos de GTM de H2O2, SS-31 10-6 M, SS-31 10-7 M, SS-31 10-8 M fue 146.0±2.27%, 84.5±8.75%, 102.0±5.69%, 133.0±5.17% respectivamente (n=3); en los grupos de HTM fue 153.0±3.46%, 79±2.39%, 91.8±3.49%, 129.0±8.24% respectivamente (n=4). P<0.001 Grupo de GTM y HTM de H2O2 comparado con el control; *** significa P<0.001 en comparación con el grupo de GTM de H2O2; ▲▲▲ significa P<0.001 en comparación con el grupo de HTM de H2O2; ▲ ▲ significa P<0.01 en comparación con el grupo de HTM de H2O2. La FIG. 38 muestra que SS-31 redujo la cantidad de apoptosis celular inducida por H2O2.
Se examinaron los efectos de SS-31 en la lesión oxidativa sostenida de las células GTM y HTM. Las células se pretrataron con SS-31 10-6, 10-7, 10-8 M durante 1 h, y luego se incubaron con H2O2200 pM durante 24 h para investigar el efecto protector de SS-31 en el estrés oxidativo sostenido. La FIG. 39 y la Tabla 13 muestran los efectos de SS-31 en la producción de ROS por lesión oxidativa sostenida de células GTM y HTM. La FIG. 40 y la Tabla 14 muestran el cambio de MMP en células GTM y HTM en cada grupo de tratamiento.
Tabla 13. Producción de ROS en células GTM3 e iHTM tratadas con H2O2.
Tabla 14. Disminución de MMP en células GTM3 e iHTM tratadas con H2O2.
En conjunto, estos resultados demuestran que SS-31 no tiene citotoxicidad a 10-4 M tanto para las células GTM como para las HTM y que el estrés oxidativo agudo y sostenido inducido por el peróxido de hidrógeno puede prevenirse mediante SS-31 (>10-9 M). Así pues, los péptidos catiónicos aromáticos de la presente invención son útiles en métodos para prevenir o tratar el glaucoma en sujetos humanos.
Ejemplo 4 - SS-31 previene el estrés oxidativo en células epiteliales pigmentarias primarias de la retina
Se cultivaron células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (RPE) para ensayar los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención para prevenir o reducir el daño oxidativo en estas células. Se han descrito métodos útiles para el estudio de las células epiteliales pigmentarias primarias de la retina. Véase, Dunn et al., ARPE-19, “A Human Retinal Pigment Epithelial Cell Line with Differentiated Properties”,Experimental Eye Research,1996, 62(2): 155-170. En primer lugar, se demostró que SS-31 no afectaba negativamente a estas células. Las células RPE humanas primarias cultivadas se incubaron con diferentes concentraciones de SS-31 solo durante un período de 24 h, y se determinó la viabilidad celular mediante un ensayo MTT (FIG. 22).
A continuación, se ensayó la viabilidad de las células RPE primarias en presencia de tBHP y varias concentraciones de SS-31. Las células se sembraron a 10.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h, luego se dejaron sin alimento durante 24 h. Después de eso, las células se expusieron a concentraciones crecientes de tBHP (FIG. 23A), o se preincubaron durante 4 h con diferentes concentraciones de SS-31, luego se estimularon con tBHP durante 6 h (FIG. 23B). Estos resultados indican que SS-31 mejoró la viabilidad celular en respuesta a la administración de tBHP. También se examinó la producción intracelular de ROS en tres grupos de células RPE mediante análisis FACS. La FIG. 31A muestra la producción de ROS en células RPE de control; la FIG.
31B muestra la producción de ROS en células RPE tratadas con tBHP 500 pM durante 3 h; y la FIG. 31C muestra la producción de ROS en células RPE tratadas con tBHP 500 pM durante 3 h y SS-31 1 pM. La FIG. 32 muestra MMP marcada por JC-1 en un análisis FACS. Se analizaron tres concentraciones diferentes de grupos SS-31. La relación de rojo a verde en tBHP 500 pM para el grupo de 3 h es 1.08, la relación de rojo a verde en el grupo de SS-31 10 nM durante 4 h tBHP 500 pM durante 3 h es 1.25; la relación de rojo a verde en el grupo de SS-31 100 nM durante 4 h tBHP 500 pM durante 3 h es 1.4; y la relación de rojo a verde en el grupo de SS-31 1 pM durante 4 h tBHP 500 pM durante 3 h es 2.28. La FIG. 33 muestra el efecto de SS-31 1 pM en la disminución de MMP inducida por tBHP. FIG. 33A: grupo de control, R/G es 3.63 ± 0.24; FIG. 33B: grupo de tBHP 500 pM durante 3 h, R/G es 1.08 ± 0.11; FIG. 33C: grupo de SS-31 1 pM durante 4 h tBHP 500 pM durante 3 h, R/G es 2.38 ± 0.18. La FIG. 33D es un gráfico que compara la relación de fluorescencia para los diferentes grupos. *P<0.01, C frente a B.
La FIG. 34 muestra el efecto de SS-31 en la apoptosis celular inducida por tBHP 250 pM durante 24 h. FIG. 34A: grupo de control; (Q2+Q4)%=1.27±0.3%; FIG. 34B: grupo de tBHP 250 pM durante 24 h; (Q2+Q4)%=15.7±0.6%; FIG.
34C: grupo de SS-31 1 pM durante 4 h tBHP 250 pM durante 24 h; (Q2+Q4)%=8.4±0.8%. La FIG. 34D es un gráfico que compara la relación de fluorescencia para los diferentes grupos. *P<0.05 C frente a B. La FIG. 35 es un gráfico que muestra el nivel de MDA inducido por tBHP en 3 grupos de células RPE. (*P<0.05).
En conjunto, estos resultados demuestran que SS-31 previene el estrés oxidativo en las células epiteliales pigmentarias primarias de la retina. Así pues, los péptidos catiónicos aromáticos de la presente invención son útiles en métodos para prevenir o tratar daños a las células de la retina en sujetos humanos.
Ejemplo 5 - Prevención y tratamiento de la neovascularización coroidea mediante péptidos catiónicos aromáticos de la invención en un modelo de ratón de CNV
Para demostrar aún más la prevención de la neovascularización coroidea (CNV), por un lado, y el tratamiento de la CNV, por otro lado, se ensayaron los péptidos catiónicos aromáticos de la invención en un modelo de ratón de CNV (FIG. 24). Las CNV se indujeron en el ojo mediante quemaduras con láser. Los métodos útiles en los presentes estudios han sido descritos por Reich,Mol Vis2003; 9:210-216.
Brevemente, se anestesiaron ratones macho C57BL/6 de cinco a seis semanas de edad con hidrato de cloral y se dilataron las pupilas con tropicamida. Con un cubreobjetos utilizado como lente de contacto, se aplicaron cuatro puntos láser (532 nm, 260 mw, 0.01 s, 50 pm; Novus Spectra, Lumenis, EE. UU.) al fondo de ojo en un círculo alrededor del disco óptico en el ojo derecho. El día antes de la fotocoagulación con láser se iniciaron inyecciones intraperitoneales diarias de 1 mg/kg, 9 mg/kg de SS-31 o vehículo.
Después de una semana, los ratones se anestesiaron profundamente y se perfundió a través del ventrículo izquierdo 1 ml (50 mg/ml) de fluoresceína-dextrano tamponada con PBS. Los ojos se enuclearon y fijaron en paraformaldehído al 4% durante 2 h. Los ojos se seccionaron en el ecuador y se retiraron la mitad anterior y la retina. El segmento posterior del ojo que contiene la esclerótica y la coroides se diseccionó en cuartos mediante cuatro a cinco cortes radiales y se montó en un portaobjetos. Todos los montajes planos se examinaron con un microscopio de fluorescencia (AxioCam MRC; Carl Zeiss). Se utilizó el software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) para medir el área de cada lesión de CNV.
Había 48 localizaciones de neovascularización en cada grupo. El área de neovascularización se calculó utilizando el software IMAGE-PROPLUS6.0. El área de neovascularización en los grupos de modelo de CNV, de SS-31 1 mg/kg y SS-31 9 mg/kg fue 0.0130 ± 0.0034, 0.0068 ± 0.0025, 0.0067 ± 0, respectivamente. Estos resultados indican que las dos concentraciones de SS-31 redujeron significativamente el área de neovascularización coroidea (P<0.05) (FIG. 24).
Ejemplo 6 - Prevención y tratamiento de la retinopatía inducida por oxígeno (OIR) mediante péptidos catiónicos aromáticos de la invención en un modelo de ratón de OIR
Para demostrar aún más la prevención de la retinopatía inducida por oxígeno (OIR), los péptidos catiónicos aromáticos de la invención se ensayaron en un modelo de ratón de OIR (FIG. 25). En este modelo, crías de ratón de 7 días con vasculatura retiniana parcialmente desarrollada se sometieron a hiperoxia (75% de oxígeno) durante 5 días, lo que detiene el crecimiento de los vasos retinianos y produce una vaso-obliteración significativa. El día 12 posnatal, las crías se devolvieron al aire ambiente y, el día 17 posnatal, se produjo una neovascularización retiniana compensatoria florida. Este modelo de neovascularización patológica ha sido ampliamente utilizado como sustituto de la retinopatía diabética (DR) proliferativa.
Para examinar los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención en la prevención de la OIR, se indujo OIR en crías de ratón y a los ratones se les administró simultáneamente un péptido catiónico aromático (p. ej., SS-20 o SS-31) durante aproximadamente 6 semanas. Los resultados se muestran en la FIG. 26 e indican que el tratamiento con SS-31 evitó la neovascularización retiniana compensatoria. Como tales, los péptidos catiónicos aromáticos de la invención son útiles en métodos para prevenir la retinopatía diabética proliferativa en sujetos mamíferos.
Ejemplo 7 - Los antioxidantes reducen la muerte de las células fotorreceptoras en un modelo de retinosis pigmentaria
Una línea específica de células de cono 661W se derivó de un tumor de retina de ratón. Los métodos útiles en los presentes estudios de células 661W se han descrito anteriormente. Véase en general, Gearóid Tuohy, Sophia Millington-Ward, Paul F. Kenna, Peter Humphries y G. Jane Farrar, Sensitivity of Photoreceptor-Derived Cell Line (661W) to Baculoviral p35, ZVAD.FMK, and Fas-Associated Death Domain,Investigative Ophthalmology and Visual Science2002;43:3583-3589. Estas células se cultivaron para ensayar los efectos de los péptidos catiónicos aromáticos de la invención para prevenir o reducir el daño oxidativo en las células de cono (FIG. 27). En primer lugar, se demostró que tBHP afectaba a la supervivencia de las células 661W (FIG. 27A). Se administraron diferentes dosis de tBHP a las células durante 3 h. A continuación, se demostró que diferentes dosis de SS-31 reducían la muerte celular de 661W inducida por tBHP (FIG. 27B).
Para el potencial de SS-31 para proteger contra la pérdida de viabilidad mitocondrial inducida por tBHP, se administraron 100 nmol/l de SS-31 a los cultivos de células 661w. Los resultados se muestran en la FIG. 30 e indican que SS-31 mejoró significativamente la viabilidad mitocondrial en comparación con las células a las que no se les administró SS-31, como se muestra mediante un ensayo de JC-1.
Ejemplo 8 - Efectos de SS-31 en un modelo de ratón de degeneración de retina.
Para demostrar aún más la prevención de la degeneración de la retina, los péptidos catiónicos aromáticos de la invención se ensayaron en un modelo de ratón de degeneración de la retina. La CNV se induce en el ojo mediante quemaduras con láser. (véase Ejemplo 5). Durante muchos años se han investigado modelos de ratón de degeneración de la retina con la esperanza de comprender las causas de la muerte de las células fotorreceptoras. Se han encontrado mutantes de ratón de origen natural que manifiestan degeneración de los fotorreceptores de la retina con preservación de todos los demás tipos de células de la retina: degeneración de la retina (anteriormenterd,idéntico a la retina sin bastones, r, ahoraPde6b rd1);degeneración de las células de Purkinje (pcd); nervioso (nr); degeneración de la retina lenta(rds,ahoraPrph Rd2); degeneración de la retina 3 (rd3); degeneración de neuronas motoras (mnd); degeneración de la retina 4(Rd4); degeneración de la retina 5 (rd5); vitíligo(vit,ahoraMitf mi-vit);degeneración de la retina 6 (rd6); degeneración de la retina 7 (rd7); lipofuscinosis ceroide neuronal (nclf); degeneración de la retina 8(rd8); degeneración de la retina 9(Rd9); degeneración de la retina 10 (rd10); y pérdida de la función de fotorreceptores del cono(cpfl1).
La FIG. 28 es una serie de micrografías que muestran el espesor de la capa nuclear externa de la retina (ONL) en un modelo de ratón de degeneración de la retina en ratones de control y tratados con SS-31. Los resultados indican que los ratones tratados con SS-31 retuvieron un mayor número de filas de células en la ONL en comparación con los ratones no tratados. Los montajes planos de retina teñidos con aglutinina de cacahuete (PNA), que tiñen selectivamente los segmentos internos y externos del núcleo, también muestran que la densidad de las células de los conos es mayor en los ratones tratados con SS-31 (FIG. 29). Estos resultados indican que el tratamiento con SS-31 evitó el daño compensatorio a la capa nuclear externa de la retina en un modelo de ratón de degeneración retiniana. Así pues, los péptidos catiónicos aromáticos de la invención son útiles en métodos para prevenir la degeneración de la retina en sujetos mamíferos.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido representado por la fórmula D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2 o Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2, para usar en el tratamiento o prevención de una afección oftálmica, en donde la afección oftálmica es degeneración macular.
2. El péptido para usar según la reivindicación 1, en donde el péptido es D-Arg-2'6'-Dmt-Lys-Phe-NH2.
3. El péptido para usar según la reivindicación 1, en donde el péptido es Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2.
4. El péptido para usar según la reivindicación 1, en donde el sujeto es un ser humano.
5. El péptido para usar según la reivindicación 1, en donde el péptido está formulado para ser administrado por vía intraocular, iontoforética, oral, tópica, sistémica, intravenosa, subcutánea o intramuscular.
6. El péptido para usar según la reivindicación 1, en donde el péptido está formulado para ser administrado con un segundo agente activo.
7. El péptido para usar según la reivindicación 6, en donde el segundo agente activo se selecciona del grupo que consiste en: un antioxidante, un complejante de metales, un fármaco antiinflamatorio, un antibiótico y un antihistamínico.
8. El péptido para usar según la reivindicación 7, en donde el antioxidante es vitamina A, vitamina C, vitamina E, licopeno, selenio, ácido a-lipoico, coenzima Q, glutatión o un carotenoide.
9. El péptido para usar según 6, en donde el segundo agente activo se selecciona del grupo que consiste en: aceclidina, acetazolamida, anecortava, apraclonidina, atropina, azapentaceno, azelastina, bacitracina, befunolol, betametasona, betaxolol, bimatoprost, brimonidina, brinzolamida, carbacol, carteolol, celecoxib, cloranfenicol, clortetraciclina, ciprofloxacino, cromoglicato, cromolín, ciclopentolato, ciclosporina, dapiprazol, demecario, dexametasona, diclofenaco, diclorfenamida, dipivefrina, dorzolamida, ecotiofato, emedastina, epinastina, epinefrina, eritromicina, etoxzolamida, eucatropina, fludrocortisona, fluorometolona, flurbiprofeno, fomivirsen, framicetina, ganciclovir, gatifloxacina, gentamicina, homatropina, hidrocortisona, idoxuridina, indometacina, isoflurofato, ketorolaco, ketotifeno, latanoprost, levobetaxolol, levobunolol, levocabastina, levofloxacina, lodoxamida, loteprednol, medrisona, metazolamida, metipranolol, moxifloxacina, nafazolina, natamicina, nedocromilo, neomicina, norfloxacina, ofloxacina, olopatadina, oximetazolina, pemirolast, pegaptanib, fenilefrina, fisostigmina, pilocarpina, pindolol, pirenoxina, polimixina B, prednisolona, proparacaína, ranibizumab, rimexolona, escopolamina, sezolamida, escualamina, sulfacetamida, suprofeno, tetracaína, tetraciclina, tetrahidrozolina, tetrizolina, timolol, tobramicina, travoprost, triamcinulona, trifluorometazolamida, trifluridina, trimetoprima, tropicamida, unoprostona, vidarbina, xilometazolina, sus sales farmacéuticamente aceptables y combinaciones de los mismos.
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