KR20060031618A - 뉴블라스틴 분비 증진 방법 - Google Patents

뉴블라스틴 분비 증진 방법 Download PDF

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메테 그뢴보르그
필립 쿠스크
옌스 토르뇌에
넬스 이 페더슨
윌리암 피 시슥
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엔에스진 에이/에스
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Abstract

본 발명은, 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및 조성물 뿐만 아니라 중추신경계를 포함한 신경계의 특정 영역 및 안구에 유전자요법 등을 통해 뉴블라스틴을 국소 전달하는 방법에 관한 것이다. 여기서, 생물학적 활성 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연의 뉴블라스틴 프로영역을 암호화하지 않는 작제물, 즉 시그널 펩타이드와 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하고 뉴블라스틴 프로영역을 암호화하지 않는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열을 갖는 핵산을 포함하는 작제물로부터 생산된다.
뉴블라스틴, 시그널 펩타이드, 안구 질환, 신경계 질환, 신경병성 통증

Description

뉴블라스틴 분비 증진 방법{Improved secretion of neublastin}
본 발명은, 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및 조성물 뿐만 아니라 중추신경계를 포함한 신경계의 특정 영역 및 안구에 유전자요법 등을 통해 뉴블라스틴을 국소 전달하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 반투과성 막으로 된 마크로피막(macrocapsule)에 피막화된(encapsulated) 형질도입 또는 형질감염 세포를 통해 뉴블라스틴을 전달하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 뉴블라스틴을 증가된 양으로 생산할 수 있는 포유동물 세포에 관한 것이다.
세포는 처음 합성된 단백질을 다양한 세포 구역과 세포외 공간으로 유도하는 방식을 갖고 있다. 시그널 펩타이드는 염색체 DNA의 암호 부분에 포함되어, 리보솜 기구에 의해 단백질의 일부로서 합성된다. 시그널 펩타이드는 N-말단을 구성하며, 새롭게 합성된 폴리펩타이드를 조면성 소포체로 유도한다. 그곳에서, 시그널 펩타이드는 상기 폴리펩타이드로부터 절단되고, 성숙 단백질이 주위로 분비된다. 따라서, 시그널 펩타이드는 세포 안에 남게 된다.
단백질의 프로 부분은 단백질의 성숙 부분에서 절단되고 세포 외측에 남는 다. 일부 향신경성(neurotropic) 인자(예컨대, NGF)의 경우, 단백질의 프로 부분은 신경펩타이드로서 생체활성적이다.
삽입 유전자가 분비된 단백질을 암호화하는 유전자요법에서 시그널 서열은 조면성 소포체와 골지체를 통한 적당한 가공(processing)을 보장하기 위해 성숙 단백질의 전방에 위치될 것을 필요로 한다. 따라서, 최선의 선택은 거의 예외없이 당해 단백질의 천연 시그널 서열인데, 그 이유는 단백질의 분비 및/또는 가공이 천연 세포에 의한 분비 및 가공과 동일한 방식으로 이루어지는 것이 일반적으로 요구되기 때문이다. 몇몇 용도에서는, 발현되는 단백질의 양이 천연 세포에서의 발현 양과 동일할 것을 요구하기도 한다. 또한, 절단된 시그널 서열이 세포 대사에 관여할 가능성을 배제할 수는 없다. 마지막으로, 당업자는 성숙 단백질의 정확한 가공 및 폴딩(folding)을 보장하기 위해 단백질의 프리프로 부분을 선택할 수도 있다.
대부분의 경우, 치료 인자를 분비하는 것으로 추정되는 생체내 형질도입 및 형질감염 세포는 치료 인자를 치료적으로 충분한 양과 충분한 시간 동안 분비하지 않는 것으로 판명되었다. 이는, 세포를 체외에서 형질감염 또는 형질도입시키고, 유전자 변형 후 환자에게 삽입하는 생체외 유전자요법에서도 문제가 될 수 있다.
종래 기술에서는 포유동물 중에서 이종 단백질과 시그널 펩타이드의 커플링에 관해 제공하는 정보가 많지 않은 실정이다. 곰팡이나 효모에서의 포유동물 단백질의 이종 발현을 위해 일반적으로 실시되는 것은 포유동물의 시그널 펩타이드를 생산 종에서 기능성인 것으로 대체하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은, 시그널 펩타이드와 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하고 뉴블라스틴 프로 영역을 암호하지 않는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한 세포를 배양하는 것을 포함하여, 생물학적 활성 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
천연 사람 프리프로 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 길이가 220개의 아미노산으로 이루어져 있다(도 17a)(서열번호 10). 이러한 뉴블라스틴의 시그널 펩타이드는 1번 위치의 메티오닌에서 시작하여 39번 위치의 알라닌으로 종결되는 39개 아미노산으로 구성된 것이다(도 17b). 뉴블라스틴의 가장 긴 전장의 프로도메인은 40번 위치의 세린에서부터 시작하여 107번 위치의 아르기닌으로 종결되는 69개 아미노산으로 구성된 것이다(도 17c). 하나의 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 108번 위치의 알라닌에서부터 시작하여 220번 위치의 글리신으로 종결되는 C 말단의 113개 아미노산으로 구성된 것이다. 프리프로-뉴블라스틴은 여러 개의 가능한 프로펩타이드 절단 부위를 함유하여, 포유동물 세포에서의 프리프로-뉴블라스틴의 발현은 다양한 성숙 펩타이드를 분비하는데, 가능한 형태로는 C 말단 140개, 113개, 107개 및 104개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 있다. 이러한 성숙 형태들은 각각 40번 위치에서부터 성숙 펩타이드의 첫 잔기 앞의 위치까지의 아미노산으로 구성된 상응하는 하나의 프로도메인이 존재한다.
본 발명은 생체내 및 시험관내 모두에서 바이러스 벡터를 이용한 포유동물 세포의 형질도입 시 종종 경험한 적이 있는, 뉴블라스틴을 포함한 향신경성 인자의 거의 완전한 분비 부재 문제에 대한 해결안을 제공한다. 이러한 현상은 플라스미드계 발현 벡터에서도 관찰된다. 미지의 몇몇 이유로 인해, 포유동물 세포는 종종 상기 벡터에 의해 암호화된 향신경성 인자의 분비가 차단된다. 한가지 가능한 해석은 분비 단백질의 정확한 가공이 세포 특이적이기 때문일 수 있다. 이러한 해석은 바이러스 벡터 유전자요법의 사용에 중대한 문제를 나타낸다. 오늘날, 바이러스 유전자요법은 형질도입된 세포의 게놈으로 바이러스 벡터의 안정된 통합이 보장됨으로 인해 생체내 또는 생체외 유전자요법의 가장 바람직한(유일한 적절한 경우가 아니더라도) 방법인 것으로 생각되고 있다.
본 발명은 성숙 사람 뉴블라스틴, 또는 성숙 사람 뉴블라스틴의 생물학적 활성 절두형, 즉 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 프리프로 단백질이 아닌 프리 단백질로서 효율적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 뉴블라스틴 프리단백질은 일반적으로 2 성분, 즉 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드(전술한 바와 같음) 및 이종 시그널 서열을 포함한다.
또한, 본 발명자들은 뉴블라스틴의 천연 시그널 펩타이드 대신에 다른 단백질 유래(예컨대, 면역글로불린 중쇄 가변부 유래)의 대체 시그널 펩타이드를 사용함으로써, 뉴블라스틴 분비가 특히 형질도입된 세포로부터 더욱 증진된다는 것을 발견했다.
또한, 본 발명자들은 뉴블라스틴 폴리펩타이드뿐만 아니라 시그널 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로부터 프로 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제거하면, 프로 영역이 포함된 경우보다 분비된 뉴블라스틴을 발현시켜 다량의 분비 뉴블라스틴을 얻을 수 있다는 것을 발견했다.
많은 단백질에서 프로 영역은 정확한 폴딩에 필수적인 것이지만, 프로 영역없이 생물학적 활성 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하는 것이 가능하다는 것을 발견했다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 시그널 펩타이드 및 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 이러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터, 본 발명에 따른 벡터와 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 약제학적 조성물은 생체내 및 생체외 유전자요법에 사용될 수 있다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 본 발명에 제시된 벡터로 형질도입되거나 형질감염된, 분리된 숙주 세포에 관한 것이다.
이러한 유전자변형된 숙주 세포는 천연 시그널 서열을 보유한 뉴블라스틴을 암호화하는 벡터로 형질도입 또는 형질감염된 세포에 비해, 예상치 못한 다량의 뉴블라스틴을 생산하는 것으로 판명되었다. 따라서, 이러한 형질도입 또는 형질감염된 숙주 세포는 뉴블라스틴의 공업적 규모의 생산에 생산자 세포의 촉망된 공급원이 된다. 또한, 이러한 뉴블라스틴 분비 세포는 뉴블라스틴의 공급원으로 포유동물 검체에 이식용으로 사용될 수 있다. 특별한 한가지 용도는 생체외 유전자요법이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 감염성 벡터 입자를 생산할 수 있는 패키징(packaging) 세포주로서, 상기 벡터 입자가 5' 레트로바이러스 LTR, tRNA 결합 부 위, 패키징 시그널, 뉴블라스틴과 면역글로불린 시그널 펩타이드를 함유한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터, 제2 가닥 DNA 합성의 오리진(origin) 및 3'레트로바이러스 LTR을 포함하는 것이 특징인 패키징 세포주에 관한 것이다.
이러한 패키징 세포주는 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 생산하는데 사용할 수 있다. 또한, 피막되어 CNS에 이식되는, 생체내 유전자요법에도 사용할 수 있다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 형질도입 또는 형질감염된 세포를 하나 이상 함유하는, 인간을 제외한 유전자전이된(transgenic) 포유동물에 관한 것이다. 이러한 동물은 뉴블라스틴을 과잉발현하여 유전자 프로필화 및 약물의 선별과 개발에 사용할 수 있다.
형질도입 또는 형질감염된 세포는 각 동물의 유전형을 갖고 있는, 즉 동종이계성 또는 이종성 이식체가 아닌 것이 바람직하다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 향신경성 인자를 확산시킬 수 있는 반투과성 막; 및 본 발명에 제시된 1종 이상의 분리된 숙주 세포를 함유하는, 이식성 세포 배양물 장치에 관한 것이다.
이러한 피막은 중추신경계에 이식하여 뉴블라스틴을 국소 전달하는데 사용할 수 있다. 성장인자의 국소 및 지속 전달 방법은 파킨슨병, 알쯔하이머병, 헌팅톤병, 발작 및 근육위축 측색 경화증(ALS) 등을 포함한, 이에 국한되지 않는 다양한 CNS 장애를 치료하는 바람직한 투여 방법이다. 이러한 피막은 신경병증 및 신경성 통증을 이에 국한됨이 없이 포함하는 말초 장애에 대해 뉴블라스틴을 국소 및 지속 전달하는 방법에도 유사하게 사용할 수 있다. 또 다른 징후에는 안구 장애가 포함된다.
본 발명의 피막은 피막 접근을 이용해 환자의 표적 부위로 바이러스 입자를 전달하는 작용을 한다. 벡터 생산 세포주의 피막화(encapsulation)는 단독 주입과는 대조적으로 바이러스 입자를 표적 부위에 연속 전달하게 해준다. 또한, 면역 공격의 가능성 감소로 인해 반복 치료도 가능하다. 이러한 피막은 패키징 세포에서 방출되는 바이러스 입자는 투과시키에 충분히 큰 소공(pore)을 갖고 있지만, 이 피막으로 숙주 세포의 통과는 억제된다.
이러한 피막 접근법은 이 장치의 회수(형질도입 처리 완료 후) 또는 외식 및 재이식(처리의 변경)이 용이할 수 있기 때문에 치료의 안전성 및 조절을 향상시킨다. 또한, 피막 장치가 개방형이 아니거나 외면화되지 않기 때문에 감염 기회가 감소된다.
마지막으로, 피막화는 패키징 세포가 환자 내로 이동하는 것을 방지하고, 이식 시 패키징 세포의 생존능력을 연장시키기 때문에, 이러한 치료법에 필요한 세포의 수를 줄일 수 있다. 이러한 효과는 환자의 면역반응을 더욱 감소시키는데 유리할 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 약물로서 사용되는 본 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 신경계 장애의 치료에 유용한 약물의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 CNS 장애의 치료용 약물의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 신경계 질환의 치료를 요하는 개체에게 본 발명에 따른 벡터의 치료학적 유효량; 또는 이러한 벡터를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 신경계 질환의 치료방법에 관한 것이다.
이러한 관점에 따라, 본 발명은 신경계 질환을 치료하는 개선된 생체내 유전자 치료방법을 제공한다. 후속 실시예에서 증명되는 바와 같이, 본 발명의 바이러스 벡터에 의한 형질도입은 지금까지 밝혀진 바 없는, 암호화된 뉴블라스틴의 분비 및 결과적으로 개선된 치료 효과를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 신경계 질환의 치료를 필요로 하는 개체에게
- 본 발명에 따른 형질도입된 세포의 치료학적 유효량; 또는
- 본 발명에 따른 이식 장치를 이식하는 것을 포함하는, 신경계 질환의 치료방법에 관한 것이다.
이러한 관점은 생체외 유전자요법 및 뉴블라스틴의 증가량을 분비할 수 있는 치료 세포의 이식에 근거한 신경계 장애를 치료하는 또 다른 방법을 제공한다.
현재 이용되는 뉴블라스틴의 대량 생산의 바람직한 방법은 대장균에서의 이종 발현, 후속 용해, 추출, 정제, 리폴딩 및 선택적인 단백질 절단이 그것이다. 연구 규모량의 생산에 사용되는 대안적인 방법에는 배양액에 정확하게 가공 및 폴딩된 뉴블라스틴을 분비하는 CHO세포와 같은 포유동물 생산자 세포를 배양하는 방법이 포함되며, 이로부터 뉴블라스틴은 쉽게 분리할 수 있다. 본 발명의 포유동물 세 포는 종래 포유동물 세포에서 관찰된 것보다 더 많은 양의 뉴블라스틴을 생산하는 바, 정확히 가공 및 폴딩된 뉴블라스틴인 생체활성 뉴블라스틴을 생산하는 개선된 세포 공급원임을 나타낸다.
도 1: 다양한 포유동물 유래의 IgSP 서열의 정렬.
도 2: 실시예 2의 형질도입 실험에서 사용된 렌티바이러스 벡터 작제물 pHsC.IgSP.hNBN.W의 벡터 지도.
도 3: pNS1n.IgSP.hNBN의 벡터 지도. 실시예 1에서 사용된 BamH1 및 XhoI 제한 부위 사이에 존재하는 pHsC.IgSP.hNBN.W와 동일한 IgSP-NBN 서열.
도 4: RetL3 ELISA(이중 시료)에 의한 NBN 활성의 측정. (a) 기준물로서 대장균에서 생산되는 재조합 마우스 Artemin(mART)을 사용하여 측정한 세포 상청액 중의 NBN 활성. (b) 형질감염된 세포 유래의 상청액 분석. (c) 형질도입된 세포 유래의 상청액 분석.
도 5: 항NBN 항체 #378에 의한 웨스턴 블롯 분석. (a) CHO-NBN16 세포(CHO-NBN) 유래의 GFR[알파]3 친화성 정제된 NBN 및 20ng 래트 재조합 NBN(rNBN)의 분석. (b) IgSO-NBN 발현 작제물로 형질감염 또는 형질도입된 ARPE-19, 및 야생형 작제물에서 유래하는 NBN을 안정하게 과잉발현하는 2종의 CHO 세포 클론(CHO-NBN25c 및 CHO-NBN16)으로부터 수득한 상청액의 분석. 화살표는 항체 #378에 의한 환원 후 뉴블라스틴의 글리코실화 및 비글리코실화 단량체의 위치를 나타낸다.
도 6: 시그널P에 의한 시그널 펩타이드 절단 예상도. 자세한 설명은 실시예 4에 제시되어 있다.
도 7: 도 7a는 플라스미드 pHsC.hNBN.W를 도시하고, 도 7b는 플라스미드 pHsCXW를 도시한 것이다. 자세한 설명은 실시예 6에 제시되어 있다.
도 8: 도 8a는 상대적인 NBN 방출 조정 배지를 도시한 것이고, 도 8b 및 도 8c는 다른 세포주의 NBN을 도시한 것이다. 실시예 7 참조.
도 9는 천연 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드(서열번호 19)의 104개 카르복시(C) 말단 아미노산 서열과 이에 상응하는 천연 사람 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 58) 및 이와 정렬된 CHO 세포 발현에 대해 최적화된 천연 사람 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산을 암호화하는 합성 유전자(서열번호 59)를 나타낸다. 천연 서열에서 변화된 합성 유전자의 뉴클레오타이드에는 (*)가 표시되어 있다.
도 10은 플라스미드 pNBN026-35(서열번호 60)에 존재하는 뉴블라스틴 서열을 도시한 것이다. 제시된 서열의 인접 상류는 XhoI 제한 부위 작용을 하는 "CT" 디뉴클레오타이드이다. 인접 하류는 BamHI 제한 부위이다.
도 11은 합성 시그널 서열과 융합된 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산의 DNA(서열번호 61) 및 아미노산(서열번호 62) 서열을 도시한 것이다. 시그널 서열은 밑줄 친 부분이다.
도 12는 뉴블라스틴 시그널 서열과 융합된 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산의 DNA(서열번호 63) 및 아미노산(서열번호 64) 서열을 도시한 것이다. 시그널 서열은 밑줄 친 부분이다.
도 13a는 알부민 시그널 서열과 융합된 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산의 DNA(서열번호 65) 및 아미노산(서열번호 66) 서열을 도시한 것이다. 시그널 서열은 밑줄 친 부분이다.
도 13b는 변형된 알부민 시그널 서열과 융합된 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산의 DNA(서열번호 69) 및 아미노산(서열번호 70) 서열을 도시한 것이다. 시그널 서열은 밑줄 친 부분이다.
도 14는 사람 성장 호르몬 시그널 서열과 융합된 뉴블라스틴의 104 C 말단 아미노산의 DNA 서열(서열번호 67) 및 아미노산 서열(서열번호 68)을 도시한 것이다. 인트론을 함유한 시그널 서열은 밑줄 친 부분이다.
도 15는 알부민 시그널 서열(15a) 또는 사람 성장 호르몬 시그널 서열(15b) 및 (15c)를 이용하여 CHO 세포로부터 분비시킨 뉴블라스틴의 질량 분광계 결과를 도시한 것이다. 11,156 달톤 및 11,157 달톤의 피크는 104 아미노산 뉴블라스틴 C 말단 단편에 상응한다. 11,084 및 11,085 달톤의 피크는 103 아미노산 뉴블라스틴 C 말단 단편에 상응한다. 도 15의 (a)는 알부민 유도 분비 유래의 탈글리코실화된 뉴블라스틴을 도시한 것이다. 도 15의 (b)는 사람 성장 호르몬 유도 분비 유래의 탈글리코실화된 뉴블라스틴을 도시한 것이다. 도 15의 (c)는 사람 성장 호르몬 유도 분비 유래의 뉴블라스틴을 도시한 것이다. 보다 큰 질량에 상응하는 피크는 다양한 당 형태의 존재에 해당한다.
도 16은 CHO 세포에서 생산된 재조합 생산성 뉴블라스틴의 활성을 입증하는 KIRA 분석 결과를 도시한 것이다.
도 17a는 성숙 단백질, 프로도메인 및 시그널 펩타이드를 포함하는 전장 뉴블라스틴의 아미노산 서열(서열번호 10)을 도시한 것이다. 도 17b는 전장 천연 뉴블라스틴의 시그널 펩타이드의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 도 17c는 전장의 뉴블라스틴의 프로도메인의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 "C 말단 아미노산"은 폴리펩타이드의 아미노(N) 말단과 가장 멀리 위치한, 폴리펩타이드 사슬의 일련의 인접 아미노산을 의미한다.
"뉴블라스틴 프로 영역"은 적어도 서열번호 10, 11 및 12의 아미노산 -41 내지 -11에 상응하는 아미노산을 포함하는 영역을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "프리프로뉴블라스틴 폴리펩타이드"(서열번호 10)는 성숙 사람 뉴블라스틴, 즉 뉴블라스틴의 113 C 말단 아미노산(서열번호 10의 아미노산 108 내지 220), 전장 사람 뉴블라스틴 프로도메인, 즉 성숙 뉴블라스틴의 N 말단에 근접한 68개 아미노산(서열번호 10의 아미노산 40 내지 107), 및 사람 뉴블라스틴 시그널 펩타이드, 즉 뉴블라스틴 프로도메인의 N 말단에 근접한 39개 아미노산(서열번호 10의 아미노산 1 내지 39)으로 이루어진 폴리펩타이드를 의미한다.
시그널 펩타이드 - 진핵성 시그널 펩타이드. 진핵성 시그널 펩타이드는 분비될 예정이거나 또는 막 성분이 될 예정인 단백질에 존재하는 펩타이드이다. 일반적 으로 단백질의 N-말단에 존재한다. 당해 문장중에서, 시그널P(2.0판 또는 바람직하게는 3.0판)로 표시된 모든 시그널 펩타이드는 시그널 펩타이드로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "기능성 뉴블라스틴 시그널 펩타이드"는 세포로부터 성숙 뉴블라스틴의 분비에 영향을 미치는 서열번호 10의 처음 39개 아미노산 또는 이의 임의의 일부분을 의미한다.
"기능성 뉴블라스틴 시그널 서열"은 기능성 뉴블라스틴 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 의미한다.
포유동물 시그널 펩타이드는 ER을 통해 분비된 포유동물 단백질 유래의 시그널 펩타이드이다.
본 명세서에서 사용된 성숙 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 사람 뉴블라스틴의 C-말단 113개 아미노산, 즉 서열번호 10의 아미노산 108 내지 220을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 마우스 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 마우스 뉴블라스틴의 C-말단 113개 아미노산, 즉 서열번호 11의 아미노산 112 내지 224를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 성숙 래트 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 래트 뉴블라스틴의 C-말단 113개 아미노산, 즉 서열번호 12의 아미노산 112 내지 224를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 성숙 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 사람 뉴블라스틴의 C-말단 99-140 아미노산, 천연 래트 또는 마우스 뉴블라스틴의 C-말단 99-144 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 보다 바람직하게는, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 천연 사람 뉴블라스틴의 C-말단 99-113 아미노산, 천연 래트 뉴블라스틴의 C-말단 99-113 아미노산, 또는 마우스 뉴블라스틴의 C-말단 99-113 아미노산을 함유하고, 각각 천연 서열에 15개 이하의 아미노산 치환이 있는 것이다. 특정 문장에서, "분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드"는 이미 분비된 것과는 달리 분비될 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 뉴블라스틴 프로 영역을 함유하지 않는다.
기능성 뉴블라스틴 프로도메인은 시그널 펩타이드와 성숙 펩타이드 사이에 위치한 펩타이드로서, 이러한 프로펩타이드는 시그널 펩타이드의 절단 후 퓨린(furin)에 의해 성숙 펩타이드로부터 절단될 수 있다.
생체활성: 이량체화되었을 때 GFRα3과 함께 RET에 결합하고 RET 이량체화 및 자가인산화를 유도하는 성질. 키라 엘리사(Kira Elisa) 또는 RET L3 엘리사 분석으로 측정한다.
핵산 서열이나 아미노산 서열을 언급할 때 사용되는 "이종"이란 용어는 특정 숙주 세포와 다른 공급원에서 기원하는 서열, 또는 동일 숙주 세포 유래인 경우에는 기원 형태에서 변경된 서열을 의미한다.
이종 시그널 펩타이드 - 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 천연적으로 작동가능하게 결합되어 있지 않은 시그널 펩타이드.
본 발명은 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 프로 영역을 암호화하지는 않는 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 생산방법에 관한 것이다. 당해 문장에서, 프로 영역은 서열번호 10, 11 또는 12의 적어도 -41 내지 -11의 아미노산을 함유하는 것이다. 보다 바람직하게는, 프로 영역 서열번호 10, 11 또는 12 중은 적어도 임의의 서열의 -41 내지 -1의 아미노산을 함유하는 것이다. 보다 바람직하게는, 프로 영역은 서열번호 10, 11 또는 12 중 적어도 임의의 서열의 -41 내지 10 아미노산을 함유하고, 가장 바람직하게는 서열번호 10의 -41 내지 27 아미노산, 또는 서열번호 11의 -41 내지 31 아미노산, 또는 서열번호 12의 아미노산 -41 내지 31 아미노산에 상응하는 서열의 프로 도메인을 함유하는 것이다.
시그널 펩타이드
본 발명에 따른 발현 벡터는 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 작동가능하게 결합된 시그널 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열을 함유한 핵산 함유 발현 벡터로 형질도입된 세포를 배양할 수 있는, 프로모터 서열을 함유한 핵산을 포함하는 것으로서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 프로 영역을 함유하지는 않는다.
분비 과정 동안, 뉴블라스틴 프리단백질의 시그널 펩타이드는 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하는 숙주 세포에 의해 절단된다. 절단 부위는 일반적으로 규명되어 있지만, 당업자는 시그널 펩타이드 절단 부위에 가변성이 있을 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 정확한 절단 부위에 있어서 일부 다의성(多義性)이 있는 구체예도 본 발명의 영역에 속하는 것이다.
시그널 펩타이드는 포유동물 시그널 펩타이드와 같은 이종 시그널 펩타이드 등의 임의의 기능성 시그널 펩타이드일 수 있다. 이러한 시그널 펩타이드는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 고양이, 소 또는 말 등의 임의의 적당한 종에서 유래하는 것일 수 있다.
이러한 시그널 펩타이드는 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 결합하는데, 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 N-말단 단부에 시그널 펩타이드의 C-말단 단부가 융합되는 것과 같이, 상기 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 직접 융합되는 것이 바람직하다.
후속 실시예에서 입증되듯이, 이러한 시그널 펩타이드의 사용은 일반적으로 시험관내 및 생체내 모두에서 뉴블라스틴의 분비를 향상시킨다. 이러한 결과는 렌티바이러스 형질도입 세포(생체내 및 시험관내) 및 플라스미드 형질감염 세포(시험관내) 모두에서 재현적으로 나타났다. 이러한 세포들은 상기 시그널 펩타이드가 성숙 단백질을 암호화하는 유전자에 직접 융합되어 있을 때(즉, 프로 부분이 배제될 때), 성숙 단백질을 생물학적 활성 단백질로서 생산한다.
본 발명자들은 천연 뉴블라스틴 시그널 펩타이드가 시그널 펩타이드로서 작용할 뿐만 아니라 이종 시그널 펩타이드가 유용하며 종종 천연 시그널 펩타이드보다 더 높은 수율을 제공한다는 것을 발견했다. 이종 시그널 펩타이드는 성장인자 시그널 펩타이드, 호르몬 시그널 펩타이드, 사이토킨 시그널 펩타이드 및 면역글로불린 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
즉, 시그널 펩타이드의 예에는 TGFβ 시그널 펩타이드, GDF 시그널 펩타이드, IGF 시그널 펩타이드, BMP 시그널 펩타이드, 뉴로트로핀 시그널 펩타이드, PDGF 시그널 펩타이드 및 EGF 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시그널 펩타이드, 호르몬 시그널 펩타이드 중에서 선택되는 시그널 펩타이드(여기서 호르몬은 성장 호르몬, 인슐린, ADH, LH, FSH, ACTH, MSH, TSH, T3, T4 및 DHEA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다), 또는 인터류킨 시그널 펩타이드가 있다.
일 구체예에서, 시그널 펩타이드는 뉴르투린(neurturin) 시그널 펩타이드, GDNF 시그널 펩타이드, 퍼세핀(persephin) 시그널 펩타이드 및 NGF 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다.
다른 구체예에서, 시그널 펩타이드는 알부민 시그널 펩타이드, 변형된 알부민 시그널 펩타이드, 성장 호르몬 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것으로서, 예컨대 래트 알부민 시그널 펩타이드, 변형된 래트 알부민 시그널 펩타이드 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시그널 펩타이드, 특히 래트 알부민 시그널 펩타이드 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드가 있다.
따라서, 일부 구체예에서 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 래트 알부민 시그널 펩타이드와 융합한다. 이는, 서열번호 66에 예시된 것이다. 다른 구체예에서, 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 변형된 래트 알부민 시그널 서열과 결합한다. 이는 서열번호 70에 예시되어 있다. 다른 구체예에서, 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 사람 성장 호르몬 시그널 서열과 융합한다. 이는 서열번호 68에 예시되어 있다.
또 다른 구체예에서, 시그널 펩타이드는 면역글로불린 시그널 펩타이드, 예컨대 면역글로불린 중쇄 시그널 펩타이드이다. 구체적으로, 면역글로불린 시그널 펩타이드는 마우스 IgSP(서열번호 4), 래트 IgSP(서열번호 6), 돼지 IgSP(서열번호 5), 원숭이 IgSP(서열번호 2 또는 3), 사람 IgSP(서열번호 1)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 시그널 펩타이드, 예컨대 마우스 IgSP(서열번호 4) 또는 사람 IgSP(서열번호 1)일 수 있다.
면역글로불린 시그널 펩타이드(IgSP)는 많은 그룹의 포유동물 중에서 알려진 작은 19개 아미노산 펩타이드이다. 사람, 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 명주원숭이, 래트, 마우스 및 돼지 유래의 서열은 도 1에 정렬하였다. 사람 IgSP와 비교한 서열 동일성 백분율은 21%(돼지)에서부터 68%(명주원숭이)까지 다양하다. 이와 같은 비교적 큰 차이는 특정 서열이 시그널 펩타이드의 생물학적 기능에 실질적인 변화 없이 다양하게 변경될 수 있음을 시사한다. 또한, 후속되는 실시예에서 입증되듯이 교차 종 반응성이 있다는 것도 관찰되었다. 이 실험들은 래트(생체내 실험) 및 사람 세포(ARPE-19 세포)에서 기능성인 마우스 IgSP에 의해 수행되었다.
IgSP는 마우스 또는 사람 기원인 것이 바람직한데, 그 이유는 마우스 IgSO가 마우스, 래트 및 사람에서 기능성인 것으로 알려져 있기 때문이다. 사람에 사용하는 경우에, IgSP는 가능한 임의의 교차 종 부작용의 위험을 줄이기 위하여 사람 기원인 것이 바람직하다.
다른 구체예에서, 시그널 펩타이드는 천연 뉴블라스틴 시그널 펩타이드, 예컨대 천연 사람 뉴블라스틴 시그널 펩타이드이다. 이러한 상황에서, 후자의 천연 뉴블라스틴 시그널 펩타이드와 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 작제물은 델타-프로뉴블라스틴이라 부른다.
또 다른 구체예에서, 시그널 펩타이드는 합성 시그널 펩타이드, 예컨대 서열번호 62의 아미노산 서열 AA1-AA38을 보유한 시그널 펩타이드이다(MetSerTrpAlaTrpAlaAlaCysProProCysProThrAlaLeuGlyLeuGlyGlySerAlaLeuTrpProThr- LeuAlaAlaLeuAlaLeuLeuSerSerValAlaGluAla).
뉴블라스틴
뉴블라스틴 폴리펩타이드는, 생존을 촉진하고, 표현형 분화를 유지하고, 퇴행을 방지하고, 재생을 촉진하며, 신경 세포 및 조직의 활성을 복구시키는 단백질이다. 뉴블라스틴(최초로 WO 00/01815 등에 기술되었음)은 달리 "아르테민"(예컨대, WO 00/18799) 및 "에노빈"(예컨대, WO 00/04050)으로 불리기도 한다.
뉴블라스틴은 TGF-β 상위계열(superfamily) 중 근연성이 먼 구성원으로 분류되어 있으며(Massague, et al., 1994, Trends in Cell Biology, 4:172-178), GDNF, 퍼셉핀("PSP"; Milbrandt et al., 1998, Neuron 20: 245253) 및 뉴르투린("NTN"; WO 97/08196)을 포함하는 계열(family) 중에서, 아교세포주 유래 향신경성 인자 리간드 계열("GDNF"; WO 93/06116)의 구성원이다. GDNF 하위계열(subfamily)의 리간드들은 RET 수용체 티로신 키나제를 통한 시그널전달을 유도하는 성질을 공통적으로 갖고 있다. 이러한 GDNF 하위계열의 3가지 리간드들은 향신경성 수용체의 계열, 즉 GFR[알파] 수용체에 대한 상대적 친화성이 상이하다. 뉴블라스틴은 GFR[알파]3-RET 복합체를 통해 작용하는 것이 바람직하다[Baudet et al., Development, 127, pp. 4335-44(2000); Baloh et al., Neuron, 21, pp. 1291-1302(1998); Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience, 13, pp. 313-325(1999)].
GDNF 하위계열 구성원인 뉴르투린, 퍼셉핀 및 GDNF와 뉴블라스틴(서열번호 10)의 아미노산 서열 비교는 표 1에 제시했다. 본 발명에 유용한 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 GDNF 하위계열 핑거프린트, 즉 표 1에 밑줄 친 아미노산 잔기를 보유하는 것이 바람직하다.
Figure 112005072029087-PCT00001
* 단독의 완전 보존성 잔기가 있는 위치를 나타낸다.
: 다음과 같은 '강한' 그룹 중의 하나가 완전 보존성임을 나타낸다: -STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW.
. 다음과 같은 '약한' 그룹 중의 하나가 완전 보존성임을 나타낸다: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY.
표 1에 제시된 아미노산 서열 정렬로부터, 뉴블라스틴이 TGF[베타] 상위계열 중에서 보존적인 위치들에 7개의 시스테인 잔기를 갖고 있음을 볼 수 있다. 이러한 서열 정렬에 기초할 때, 뉴블라스틴은 향신경성 인자의 GDNF 하위계열의 구성원인 것으로 확인되었다(표 1에 밑줄 친 GDNF 하위계열 핑거프린트, LGLG - FR(Y/F)CSGSC - QxCCRP - SAxxCGC).
본 발명에 유용한 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 프리단백질, 성숙 단백질, 글리코실화된 단백질, 인산화된 단백질, 절두 형태 또는 임의의 다른 해독후 변형된 단백질 형태를 포함한 임의의 생체활성 형태로 제공될 수 있다. 생체활성 뉴블라스틴은 각 NBN 변이체(variant)의 이량체 형태인 것으로 추정되는데, 그 이유는 이량체 형성이 활성에 필수적이기 때문이다. 단량체 NBN 폴리펩타이드에서는 활성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다. 생체활성 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 보조인자(예, GFR[알파]3 또는 RET)의 존재하에 GFR[알파]3에 결합하거나, 또는 GFR[알파]3과 RET의 복합체에 결합하고, RET의 이량체화, 및 RET의 자가인산화를 유도한다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "뉴블라스틴 폴리펩타이드"는 향신경성 활성을 보유하는 폴리펩타이드이다(예, WO 00/01815에 기술된 바와 같다).
본 발명의 방법에 의해 생산되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 뉴블라스틴의 생물학적 활성을 하나 이상 나타낸다. 본 발명의 목적에서 생물학적 활성은 임의의 적당한 방법으로 측정할 수 있다. 생물학적 활성의 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 이량체화되었을 때 GFRα3과 함께 RET에 결합하고, RET 이량체화 및 자가인산화를 유도한다(예컨대, Sanicola et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 6238 참조). 수용체 결합과 수용체 자가인산화를 측정하는 방법이라면 어떠한 방법이라도 본 발명의 방법에 의해 생산된 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 평가하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 실시예 17에 KIRA 분석(ELISA)은 뉴블라스틴 생물학적 활성을 평가하는데 사용할 수 있다(Sadick et al., 1996, Anal. Biochem., 235 (2): 207 참조).
또한, 생체활성 형태의 뉴블라스틴은 실시예 1에 기술된 RetL3 ELISA 분석을 사용하여 검출할 수도 있다. 따라서, 생물학적 기능이 없는 뉴블라스틴은 RetL3 ELISA 분석으로 검출할 수 없을 것이다.
다음과 같은 전장 서열들은 야생형 시그널 펩타이드를 보유한 야생형 프리프로 뉴블라스틴을 나타낸 것이다. 포유동물 세포를 형질도입 또는 형질감염했을 때, 수득되는 성숙 뉴블라스틴은 매우 소량만이 분비된다. 사람, 마우스 및 래트 뉴블라스틴의 천연 시그널 펩타이드는 처음 39개 아미노산이다.
--서열번호 10의 AA-80-AA140("야생형" 사람 프리프로),
--서열번호 11의 AA-80-AA144(마우스 프리프로),
--서열번호 12의 AA-80-AA144(래트 프리프로).
본 발명에 따라 분비되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 다양한 길이를 가질 수 있다. 성숙 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 일반적으로 프리프로 뉴블라스틴의 C 말단 113 아미노산으로 구성되지만, 뉴블라스틴 생물학적 활성을 성취하는데 113개 아미노산 전부가 필요한 것은 아니다. 아미노 말단 절두가 허용된다. 따라서, 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 천연 사람 뉴블라스틴의 C 말단 99-113 아미노산에 상응하는 것으로서, 그 길이는 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 또는 113개 아미노산일 수 있다. 분비될 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 정확한 길이의 선택은 설계상의 선택 사항으로서, 이는 당업자에 의해 수행될 수 있는 것이다. 천연 사람 뉴블라스틴의 C 말단 104 아미노산으로 이루어진 분비된 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 이하의 실시예에 예시되고 있다. 다양한 길이 외에도, 분비된 사람 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 서열도 다양할 수 있다.
다음의 "야생형" 뉴블라스틴 아미노산("aa" 또는 "AA") 서열은 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 것 중의 일 예이다:
--서열번호 10의 AA1-AA140(성숙 140AA; 이하, "140NBN"),
--서열번호 10의 AA25-AA140(성숙 116AA; 이하, "116NBN"),
--서열번호 10의 AA28-AA140(성숙 113AA(서열번호 14); 이하, "113NBN"),
--서열번호 11의 AA1-AA144(마우스 성숙 144AA),
--서열번호 12의 AA1-AA144(래트 성숙 144AA),
-- 서열번호 10의 AA107-AA140으로 기술되는 C-말단 서열, 보다 바람직하게는 서열번호 10의 AA76-AA140으로 기술되는 C-말단 서열을 갖고, GDNF 과 및 TGF-β 상위계열의 특징인 7개 Cys 잔기를 보유하는 펩타이드.
일 구체예에서, 바람직한 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 서열번호 10에서와 같이 보존적인 (7개) 시스테인을 위치 43, 70, 74, 107, 108, 136 및 138에 함유한다. 이러한 7개의 보존적 시스테인 잔기는 TGF-상위계열 중에서 3개의 단량체내 이황화 결합(예컨대, 서열번호 10에서, 시스테인 잔기 43-108, 70-136 및 74-138 사이인 것으로 사료됨) 및 하나의 단량체간 이황화 결합(예컨대, 서열번호 10에서 시스테인 잔기 107-107 사이인 것으로 사료됨)을 형성하는 것으로 알려져 있으며, 연장된 베타 가닥 영역과 함께 TGF-β 상위계열의 보존적 구조 모티프를 구성한다[예컨대, Daopin et al., Proteins 1993, 17:176-192 참조].
뉴블라스틴 폴리펩타이드는 야생형 단백질의 성숙 형태 중 하나인 것이 바람직하다. 현재는 프로영역의 제거가 유전자 변형된 포유동물 세포에서 고분비량을 제공하는데 중요한 역할을 하는 것으로 추정된다.
본 발명에 유용한 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 또한 전장 뉴블라스틴 분자의 절두 형태를 포함한다. 이러한 절두 분자에서, 결실된 하나 이상의 아미노산은 N-말단 또는 C-말단 유래이며, 바람직한 것은 N-말단 유래인 것이다. 이러한 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 제공한 뒤, 이러한 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 1종 이상의 프로테아제와, 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하기에 충분한 조건하에서 접촉시킴으로써 수득할 수 있다. 바람직하게는, 1종 이상의 프로테아제는 엑소프로테아제이고, 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드와의 접촉으로 엑소펩티다제 뉴블라스틴 폴리펩타이드 분해 산물이 형성되는 는데, 이는 디펩타이드성 펩티다제에 의해 추가 분해될 수 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터에 의해 암호화된 단백질은 절두 형태이고 추가 가공을 필요로 하지 않는 것이 보다 바람직하다.
본 명세서에 기술된 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 성숙 뉴블라스틴 서열에서 보존적인 7개의 시스테인 잔기를 포함하는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 특정 바람직한 구체예에서, 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 성숙 113NBN 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 적어도 85개 카르복시 말단 아미노산을 포함하는 것이다. 보다 바람직한 구체예에서, 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 성숙 사람 113 NBN의 적어도 98개 카르복시 말단 아미노산을 포함하는 것이다.
한가지 절두형은 성숙 뉴블라스틴의 7개의 시스테인 잔기를 처음부터 마지막까지 보유한 97개 아미노산을 포함하는 것이다. 이것은 서열번호 20의 아미노산 2 내지 97에 상응하는 것이다.
다른 뉴블라스틴 변이체로서, 절두된 NBN 형태가 포함된다. 이의 예에는 다음과 같은 것이 있다:
(i) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 112개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 29-140을 보유하는, 112AA 폴리펩타이드 서열(NBN112로 표시).
(ii) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 111개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 30-140을 보유하는, 111AA 폴리펩타이드 서열(NBN111로 표시).
(iii) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 111개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 31-140을 보유하는, 110AA 폴리펩타이드 서열(NBN110으로 표시).
(iv) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 109개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 32-140을 보유하는, 109AA 폴리펩타이드 서열(NBN109로 표시).
(v) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 108개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 33-140을 보유하는, 108AA 폴리펩타이드 서열(NBN108로 표시).
(vi) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 107개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 34-140을 보유하는, 107AA 폴리펩타이드 서열(NBN107로 표시).
(vii) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 106개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 35-140을 보유하는, 106AA 폴리펩타이드 서열(NBN106으로 표시).
(viii) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 105개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 36-140을 보유하는, 105AA 폴리펩타이드 서열(NBN105로 표시).
(ix) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 104개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 37-140(서열번호 19로서 제시)을 보유하는, 104AA 폴리펩타이드 서열(NBN104로 표시).
(x) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 103개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 38-140을 보유하는, 103AA 폴리펩타이드 서열(NBN103으로 표시).
(xi) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 102개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 39-140을 보유하는, 102AA 폴리펩타이드 서열(NBN102로 표시).
(xii) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 101개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 40-140을 보유하는, 101AA 폴리펩타이드 서열(NBN101로 표시).
(xiii) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 100개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 41-140을 보유하는, 100AA 폴리펩타이드 서열(NBN100으로 표시).
(xiv) 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 카르복시 말단 99개 아미노산, 예컨대 서열번호 10의 아미노산 42-140(서열번호 20으로서 제시)을 보유하는, 99AA 폴리펩타이드 서열(NBN99로 표시).
본 명세서에 개시된 뉴블라스틴의 절두 형태(예컨대, 112AA 내지 99AA 형태)는 당연히 향신경성 활성을 보유하는 것으로 생각된다.
가장 바람직한 구체예에서, 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 성숙 113AA 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 99aa, 100aa, 101aa, 102aa, 103aa, 104aa, 105aa, 106aa, 107aa, 108aa, 109aa, 110aa, 111aa 또는 112aa 카르복시 말단 아미노산(즉, 각각 NBN99, NBN100, NBN101, NBN102, NBN102, NBN103, NBN104, NBN105, NBN106, NBN107, NBN108, NBN109, NBN110, NBN111 또는 NBN112)이다. 이러한 서열들은 서열번호 11 및 12에서의 각 카르복시 말단 99a, 100aa, 101aa, 102aa, 103aa, 104aa, 105aa, 106aa, 107aa, 108aa, 109aa, 110aa, 111aa 또는 112aa과 같이 마우스 및 래트 뉴블라스틴 폴리펩타이드에서 찾아볼 수 있는 것이다. 이러한 절두된 NBN 형태의 가장 바람직한 예는 향신경성 활성이 있는 것으로 입증된 바와 같이 생체활성인 것이다("생체활성 절두된 뉴블라스틴 폴리펩타이드"라고 부름). 전술한 바와 같이, NBN 이량체화는 생체활성에 필수적인 것으로서, NBN 단량체 폴리펩타이드에서는 활성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않는다.
마우스 및 래트 뉴블라스틴의 절두 형태는 또한 본 발명에 속하는 것이다. 이러한 형태는 서열번호 16(마우스)의 C-말단 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115 또는 116 아미노산으로 구성되거나, 또는 서열번호 18(래트)의 C-말단 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 또는 112 아미노산으로 구성되는 것이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 1 내지 140, 또는 서열번호 11 또는 12의 아미노산 1 내지 144로 표시되는 서열, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17 또는 18로 표시되는 서열을 갖는 뉴블라스틴 중에서 선택되는 성숙 NBN, N-말단 절두된 NBN, 돌연변이된 NBN, 또는 돌연변이되고 N-절두된 NBN으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 포함하며, 예컨대 서열번호 13, 14, 15, 16, 17 또는 18로 표시되는 서열을 갖는 뉴블라스틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 성숙 NBN이 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 10의 106, 104, 102 또는 99 C-말단 아미노산을 보유한 N-말단 절두된 뉴블라스틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드, 또는 사람 뉴블라스틴의 116 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 113 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 104 C-말단 아미노산, 및 사람 뉴블라스틴의 116 C-말단 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드, 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 뉴블라스틴 폴리펩타이드, 또는 서열번호 20의 99개 아미노산을 함유하는 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 있다.
본 발명에 유용한 NBN에는 또한 전술한 각종 프리프로, 프로, 성숙 및 절두된 "뉴블라스틴" 폴리펩타이드들과 실질적인 유사성 또는 동일성이 있는 아미노산 서열을 가진 NBN 폴리펩타이드가 포함된다. 사용되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 서열번호 10 내지 23에 제시된 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 성숙 펩타이드와 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 더 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95%의 동일성 또는 유사성이 있는 것이다. 가장 바람직하게는, 사용되는 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 서열번호 10 내지 23의 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 성숙 펩타이드와 적어도 99% 유사성 또는 동일성이 있는 것이다.
후보 폴리펩타이드가 본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드와 공유하는 상동성의 정도는 두 아미노산 서열 사이의 유사성 또는 동일성의 정도로서 측정한다.
높은 수준의 서열 동일성은 제1 서열이 제2 서열로부터 유래되었을 가능성을 시사한다. 아미노산 서열 동일성은 정렬된 두 서열 사이에 동일한 아미노산 서열을 필요로 한다. 따라서, 대조 서열과 70% 아미노산 동일성을 공유하는 시험 서열은 정렬 후, 시험 서열의 아미노산 중 70%가 대조 서열의 상응하는 아미노산과 동일할 것을 필요로 한다. 동일성은 예컨대, ClustalX 컴퓨터 정렬 프로그램(Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG:"The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools" ; Nucleic Acids Res. 1997, 25(24): 4876-82) 및 여기에 제시된 디폴트 파라미터들과 같은 컴퓨터 분석으로 측정하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이 프로그램을 사용하면, 본 발명의 유사 DNA서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 성숙 부분은 서열번호 10(사람 NBN), 서열번호 11 및 12(설치류 NBN)로 본 명세서에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 더 바람직하게는 90%, 더욱 더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 동일성 정도를 나타낸다.
다른 정렬 수단도 알려져 있는데, 그 예로는 문헌[Needleman et al., J.Mol.Biol. 48:443(1970)]에 기술된 동적 프로그래밍 알고리듬, 및 디엔에이스타, 인크(DNAstar, Inc.)에서 제조한 상용 소프트웨어 패키지인 Align Program이 있으며, 이들의 교시는 본 발명에 참고 인용된다. 시험 서열 및 대조 서열이 일단 서로 정렬되고, 세밀히 구별되면 상동성 백분율이 계산되어진다. 각 서열의 개개의 아미노산은 서로의 유사성별로 연속적으로 비교된다.
유사성 인자는 유사 크기, 형태 및 전기적 전하를 포함한다. 아미노산 유사성을 측정하는 특히 바람직한 한가지 방법은 본 발명에 참고 인용된 문헌[Dayhoff et al., Atlas of protein sequence and structure 345-352(1978 & Supp.)]에 기술된 PAM250 매트릭스(matrix)이다. 먼저, 유사성 점수를 정렬된 쌍끼리의 아미노산 유사성 점수의 총합으로 계산한다. 상동성 및 동일성 백분율을 위해 삽입 및 결실은 무시한다. 따라서, 이러한 계산법에서 갭 페널티는 사용되지 않는다.
그 다음, 이러한 일차 점수(raw score)를 시험 화합물 점수와 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 7개 시스테인 골격 점수의 기하평균으로 나누어 표준화한다. 기하 평균은 상기 점수들의 곱의 제곱근이다. 표준화된 일차 점수가 상동성 백분율이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 변이체 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 내용 중에서, "변이체 폴리펩타이드"란 용어에는 서열번호 10, 13, 14, 19, 20,21, 22 또는 23(사람 NBN) 또는 서열번호 11, 12, 15-18(설치류 NBN)의 일부로 제시된 성숙 펩타이드와 1 이상의 아미노산 위치에서 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(또는 단백질)가 포함된다. 이러한 변이체 폴리펩타이드에는 전술한 변형된 폴리펩타이드뿐만 아니라, 보존적 치환, 스플라이스 변이체, 이소폼(isoform), 다른 종 유래의 동족체 및 다형성체도 포함된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은, "보존적 치환"이란 용어는 아미노산 잔기의 다른 생물학적 유사 잔기로의 치환을 의미한다. 일반적으로, 전술한 바와 같은 생물학적 유사성은 야생형 서열의 보존적 아미노산으로의 치환을 반영한다.
뉴블라스틴 폴리펩타이드 서열에 있어서 아미노산의 치환들은 그 아미노산이 속하는 클래스(class)의 다른 구성원들 중에서 선택할 수 있다(표 1 참조). 또한, 많은 아미노산은 중성 아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌으로 흔히 치환된다(예컨대, MacLennan et al., 1998, Acta Physiol.Scand. Suppl., 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv.Biophys., 35:1-24). 다수의 치환들은 본 발명의 범위에 속하지만, 본 발명의 모든 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 이하 섹션 C에서 기술하는 바와 같은 천연 뉴블라스틴의 활성을 적어도 하나 이상 갖고 있어야 한다(하기 표 참조).
표
Figure 112005072029087-PCT00002
예를 들어, 보존적 아미노산 치환은, 특히 폴리펩타이드 또는 단백질의 잔기들의 총 수 중 10% 미만인 경우, 생물학적 활성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않을 것으로 예측된다. 바람직하게는, 보존적 아미노산 치환이 폴리펩타이드 또는 단백질의 5% 미만의 변화이고, 가장 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 단백질의 2% 미만인 것이 좋다.
일 구체예에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 15개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 것으로서, 예컨대 12개 이하, 10개 이하, 8개 이하, 5개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 것이다. 일 예로서, 사람 113NBN을 가지고 계산했을 때, 가장 바람직한 보존적 치환은 야생형 성숙 아미노산 서열 중에서 아미노산 치환이 3개 미만의 수인 것이다. 특히 바람직한 구체예에서, 아미노산 치환은 성숙 서열 중의 단 하나의 아미노산 치환이 존재하는 것이며, 여기서 치환 아미노산과 대체 아미노산은 비환형인 것이다. 특히 보존적인 치환의 다른 예에는 하나의 소수성 잔기의 다른 소수성 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌으로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 리신 대신 아르기닌으로의 치환, 아스파르트산 대신 글루탐산으로의 치환, 또는 아스파라긴 대신 글루타민으로의 치환 등이 포함된다.
보존적 치환이란 용어에는 또한, 치환된 폴리펩타이드에 대해 유발된 항체가 미치환된 폴리펩타이드와 면역반응하기만 한다면 미치환된 모 아미노산 잔기 대신 치환된 아미노산 잔기를 사용하는 것도 포함된다.
이러한 1차 아미노산 서열의 변형은 미변형된 대응 폴리펩타이드와 비교했을 때 활성이 거의 동등한 단백질을 제공할 수 있으며, 이에 따라 모 단백질의 기능성 유사체로 간주할 수 있다. 이러한 변형은 예컨대 부위-지시된 돌연변이유발과 같이 고의적이거나, 또는 자연 발생적으로 일어날 수도 있고, 그 예에는 스플라이스 변이체, 이소폼, 다른 종 유래의 동족체 및 다형성체가 포함된다. 이러한 기능성 유사체 역시 본 발명에 속하는 것이다.
다음은 사람, 마우스 및 래트에서 유래하는 99 C-말단 아미노산들의 정렬을 나타낸 것이다:
CLUSTAL W (1.82) 다중 서열 정렬
Figure 112005072029087-PCT00003
치환은 "미별표", "." 또는 ":"로 표시된 비보존 위치에서 수행되는 것이 바람직하다.
다른 바람직한 치환 위치는 "%"로 표시된 부분이다.
더욱이, 1차 아미노산 서열의 변형은 모 단백질의 생물학적 활성을 보유하지 않는 단백질, 예컨대 우성 음성(dominant negative) 형태 등의 단백질을 제공할 수 있다. 우성 음성 단백질은 조절 인자, 예컨대 일반적으로 폴리펩타이드와 기능적으로 상호작용하는 상류 또는 하류 성분과 결합에 의해 또는 다른 방식의 격리에 의해 야생형 단백질을 방해할 수 있다. 이러한 우성 음성 형태 역시 본 발명에 속하는 것이다.
절두된 뉴블라스틴의 생물학적 활성 형태는 WO 02/072826(NsGene and Biogen)에 공지되어 있다. 절두 및 돌연변이된 뉴블라스틴 분자는 또한 WO 02/060929(Biogen)에 공지되어 있는데, 구체적으로 서열번호 14의 아미노산 8-113 유래의 아미노산 서열을 함유하는 돌연변이된 뉴블라스틴이 공지되어 있다. 여기서, 변이체 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 상기 변이체 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 위치 14에 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 위치 39에 아르기닌 이외의 아미노산, 상기 변이체 폴리펩타이드의 위치 68에 아르기닌 이외의 아미노산, 및 상기 변이체 폴리펩타이드의 위치 95에 아스파라긴 이외의 아미노산(예컨대, 리신 잔기)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 치환을 하나 이상 포함하는 것이며, 상기 아미노산의 위치는 서열번호 10의 폴리펩타이드 서열에 따라 번호를 매긴 것이다. 이러한 돌연변이된 형태는 전술한 바와 같이 절두될 수 있고, 또는 성숙 단백질의 전장(서열번호 14의 아미노산 1-113)을 포함할 수도 있다. 위치 14, 39 또는 68의 아미노산은 리신인 것이 바람직하다.
시그널 펩타이드의 절단
발현 작제물에 도입시킬 특정 뉴블라스틴을 결정하기에 앞서, 시그널 펩타이드(예컨대 Igsp)의 절단 가능성을 당해 기술 수준의 예측 도구를 사용하여 검사할 수 있다. 이러한 예측 도구로서 바람직한 한가지는 시그널P WWW 서버에서 입수용이한 시그널P 소프트웨어(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/), 또는 바람직하게는 상기 서버에서 입수용이한 새 버전(3.0)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)이다.
시그널P WWW 서버는 서열의 각 위치마다 0과 1 사이의 세가지 점수를 제공할 것이다:
C-점수(일차 절단 부위 점수)
절단 부위 vs. 다른 서열 위치를 인식하도록 학습된 네트웍의 출력 점수. 다음과 같이 조작되었다:
높은 값: 위치 +1에서(절단 부위 바로 다음)
낮은 값: 다른 모든 위치
S-점수(시그널 펩타이드 점수)
시그널 펩타이드 vs. 비시그널 펩타이드 위치를 인식하도록 학습된 네트웍의 출력 점수. 다음과 같이 조작되었다:
높은 값: 절단 부위 앞의 모든 위치
낮은 값: 절단 부위 다음의 30개 위치와 비분비된 단백질의 N-말단.
Y-점수(조합 절단 부위 점수)
절단 부위 위치의 예상은 C-점수가 높은 값이고, S-점수가 높은 값에서 낮은 값으로 변화되는 위치를 관찰함으로써 최적화된다. Y-점수는 S-점수의 기울기와 C-점수의 고도를 조합하여 표준화한다. 구체적으로, Y-점수는 S-점수의 평활화된 미분계수(smoothed derivative) 과 C-점수 사이의 기하 평균이다(즉, 현 위치 앞에 d 위치와 현 위치 뒤에 d 위치에 있어서의 평균 S-점수 간의 차이이다).
이러한 세 점수는 모두 여러 분배의 데이터에 대해 학습된 5가지 네트웍의 평균이다.
각 서열에 대한 시그널P는 최대 C-점수, S-점수 및 Y-점수와 N-말단과 예상 절단 부위 사이의 평균 S-점수를 보고한다. 이 값들은 시그널 펩타이드와 비시그널 펩타이드를 구별하는 데 사용된다. 시험 서열이 시그널 펩타이드를 갖고 있다면 생각된다면, 절단 부위는 최대 Y-점수를 나타내는 위치 바로 앞으로 추정한다. 일반적인 시그널 펩타이드에 대한 C-점수와 Y-점수는 위치 +1에서 높고, S-점수는 절단 부위 전은 높지만 그 이후는 낮다. 비교 목적으로 이러한 예상값을 야생형 뉴블라스틴 시그널 펩타이드의 예상 절단 부위(프리프로 NBN의 아미노산 39와 40 사이의 절단)와 비교할 수 있다.
바람직한 뉴블라스틴은 시그널P-NN 또는 시그널P-HMM 프로그램 중 어느 하나에서 시그널 펩타이드와 뉴블라스틴 사이에 예상 절단 부위를 갖는 것이다. 그 예에는 NBN113, NBN106, NBN104, NBN102 및 NBN99가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특히 바람직한 것은 시그널P-NN과 시그널P-HMM 프로그램 모두에서 상기 위치에 예상 시그널 펩타이드가 있는 뉴블라스틴이다. 그 예에는 NBN113 및 NBN99가 있다.
신 버전(3.0)은 또한 분비율과 상관성이 있는 것으로 밝혀진 "시그널 펩타이드성(signal peptidedness)"을 당해 단백질과 상기 시그널 펩타이드를 사용하여 나타내는 신규 점수 D 또는 Dmax(구별 점수)도 포함하고 있다.
본 발명에 사용된 시그널 펩타이드는 선발된 뉴블라스틴 폴리펩타이드와 함께 Dmax값이 0.5 이상, 예컨대 0.6 이상, 예컨대 0.7 이상, 예컨대 0.8 이상인 것이 바람직하다.
참조문헌: Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, Seren Brunak and Gunnar von Heijne: Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10, 1-6 (1997). For the SignalP-HMM out-put model: Henrik Nielsen and Anders Krogh: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. In Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130 (1998). Improved prediction of signal peptides - SignalP 3.0. Jannick Dyrlov Bendtsen, Henrik Nielsen, Gunnar von Heijne and Soren Brunak. JMB (2004). Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. Henrik Nielsen and Anders Krogh. Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130, 1998.
의학적 용도 및 치료방법
일 관점으로서, 본 발명은 신경계 장애 치료용 약물의 제조에 사용되는 본 발명에 따른 벡터의 용도에 관한 것이다. 상기 신경계 장애는 말초신경계 또는 중추신경계의 장애일 수 있다.
뉴블라스틴은 신경세포, 예컨대 손상된 신경세포 및 외상성 신경세포(이에 국한되지 않는다)의 결함을 치료하는 데 유용하다. 외상의 경험이 있는 말초 신경에는 골수 신경 또는 척수 신경이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 뉴블라스틴은 CNS 장애, 구체적으로 신경퇴행성 질환(예컨대, 대뇌허혈 신경세포 손상); 신경병증, 예컨대 말초 신경병증, 알쯔하이머병, 헌팅톤병 및 근육위축 측색 경화증(ALS)의 치료에 유용하다. 또한, 뉴블라스틴은 손상된 기억, 예컨대 치매 관련 기억 손상의 치료에 유용한 것으로 생각된다.
또한, 뉴블라스틴은 포유동물의 신경병성 통증과 같은 말초 신경병을 치료할 수 있는 후보 치료제로서 공지되어 있다. 여기서, 신경병성 통증은 독소 유도성 신경 손상, 병원균 유도성 신경 손상, 외상 유도성 신경 손상, 약물 유도성 신경 손상, 특발 신경병증, 당뇨 신경병증, 염증 유도성 신경 손상 또는 신경퇴행성과 관련이 있는 것일 수 있다. 또한, 뉴블라스틴은 포유동물의 말초 신경병증을 치료하는데 사용될 수도 있다. 말초 신경병증은 외상 유도성 신경병증, 바이러스 유도성 신경병증, 화학요법 유도성 신경병증, 독소 유도성 신경병증, 약물 유도성 신경병증, 비타민 결핍 유도성 신경병증; 특발 신경병증; 및 당뇨성 신경병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것일 수 있다. 뉴블라스틴을 이용한 신경병성 통증을 치료하는 방법 및 조성물은 WO 02/078730(Biogen)에 개시되어 있다.
뉴블라스틴은 신경병성 통증, 척수 상해, 척수근 찢김, 틱 돌로록스(tic doloreaux), 작열통, 각막 상처 및 망막병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 장애를 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 치료되는 신경퇴행성 질환은 파킨슨병이다. 뉴블라스틴은 도파민 신경의 생존을 증가시키는 것으로 알려져 있다(WO 00/01815 NsGene; Baloh et al 1998 Neuron 21:1291-1302).
또한, 본 발명의 벡터, 피막 및 조성물은 안구 질환, 예컨대 색소 망막염, 황반 변성, 녹내장 및 당뇨성 망막병증의 치료에도 사용할 수 있다. 뉴블라스틴은 또한 각막 상처 및 궤양의 치료에도 사용할 수 있다(EP 1 223 966 Biopharm).
신경계 질환은 이의 치료를 필요로 하는 개체에게 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 벡터, 또는 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 투여함으로써 치료할 수 있다.
또한, 나출형 세포 또는 피막된 세포가 이식되거나 형질도입될 뇌 부분에 대한 정위법적 좌표도 제공된다(표 II):
Figure 112005072029087-PCT00004
상기 표에서, 안쪽-가쪽 치수는 뇌의 중심선과 관련된 것이다; 앞쪽-뒤쪽 치수는 앞쪽 경계와 뒤쪽 경계 사이의 중심점과 관련된 것으로서, - 값은 뒤쪽 방향을 나타낸다; 등쪽-배쪽 치수는 앞쪽과 뒤쪽 경계의 중심점을 연결하는 선과 관련된 것으로서, - 값은 상기 선에 대해 배쪽인 것이다; 모든 치수는 센티미터이고; Gpe는 창백외핵을 의미하고; Gpi는 창백내핵을 의미하며; Snr은 흑색질그물부를 의미하고; STN은 시상밑핵을 의미하고; NBM은 마이네르트 기저핵을 의미하고; 미부는 미상핵을 의미한다.
생체내 형질도입 대신에 신경계 질환은 치료를 필요로 하는 개체에게
i. 본 발명에 따른 치료학적 유효량의 형질도입 또는 형질감염 세포; 또는
ii. 형질도입 또는 형질감염 세포를 함유하는 이식 장치
를 이식함으로써 치료할 수도 있다.
이식은 세포 또는 이식 장치를 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 이식은 자가 이식체, 동종이계 이식체 또는 이종성 이식체를 포함할 수 있다.
중추신경계의 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 표적 조직
중요한 변수는 적당한 표적 조직의 선발이다. 뇌 부위의 선발은 향신경성 인자에 대한 보유 반응성에 따라 실시한다. 부위의 표적화는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자요법 벡터의 투여량 단위를 투여하거나 또는 본 발명에 따른 나출형 또는 피막화된 세포를 이식하여 완수할 수 있다.
사람의 경우, 성인기에 향신경성 인자에 대한 반응성을 보유하는 CNS 신경세포에는 콜린성 기저 전뇌 신경세포, 내비 피질 신경세포, 시상 신경세포, 청반 신경세포, 척수 감각 신경세포 및 척수 운동 신경세포가 있다.
MRI 스캔과 같은 초기 스캔은 치료 부위의 정확한 위치를 측정하기 위해 환자에게 수행할 수 있다. 예를 들어, 파킨슨 병의 치료 시, 치료 부위는 흑색질을 포함한 기저핵이다. 뇌의 환부는 5개 이하의 전달 부위 선발이 임상적으로 유의적인 수의 도파민 신경세포의 복원에 충분하게 되는 크기일 가능성이 있다. 이와 동일한 수의 전달 부위가 뇌의 외측에도 적용될 수 있다.
생체내 유전자요법 시, 전달은 전신 또는 국소 전달일 수 있다. 유전자요법 벡터를 근육내, 피하 또는 복강내로 투여하는 것은 전신 전달하기 위한 것으로서, 뉴블라스틴을 순환계에 연속 방출시킬 수 있다.
생체내 유전자요법 시, 특정한 생체내 유전자 전달 부위는 신경세포 또는 말단 상실이 있는 부위에 집중되도록 선택한다. 이러한 부위는 자기공명영상화(MRI) 및 생검을 포함한 다수의 공지 기술을 사용하여 임상적으로 동정할 수 있다. 사람의 경우, MRI와 같은 비침습적 생체내 영상화 방법이 바람직할 것이다. 이러한 신경세포 또는 말단 상실 부위가 동정되면, 전달 부위는 뉴블라스틴의 각 단위 투여량이 표적 세포로부터 500㎛ 부위 또는 그 이내이고, 다른 전달 부위로부터 약 10mm 이내 부위의 뇌 또는 척수로 전달되도록 정위 분포적으로 선택한다. 뇌에서는 유전자요법 벡터를 실질 또는 뇌실로 투여할 수 있다.
안구에서는 유전자요법 벡터를 유리체, 망막밑공간 및 서브테나 피막(sub-tenar capsule)으로 투여할 수 있다.
신경병성 통증을 포함한 말초 신경병 치료 시, 유전자요법 벡터는 통각 전달에 관여하는 신체 부위로 투여할 수 있다. 이러한 투여에는 척수 및 수막공간내 투여가 포함될 수 있다.
제1 구체예에서, 벡터는 근육내, 피하 또는 복강내로 투여된다. 제2 구체예에서, 벡터 또는 조성물은 통각 전달에 관여하는 신체 부위로 투여된다. 제3 구체예에서, 벡터 또는 조성물은 수막공간 또는 척수로 투여된다. 제4 구체예에서, 벡터는 실질 및 뇌실을 포함한 뇌로 투여된다. 제5 구체예에서, 벡터는 유리체, 망막밑공간 및 서브테나 피막을 포함한 안구로 투여된다.
생체내 유전자요법에 유용한 투여 요건 및 전달 프로토콜
또 다른 중요한 변수는 표적 조직으로 전달되는 뉴블라스틴의 투여량이다. 이와 관련하여, "단위 투여량"은 일반적으로 뉴블라스틴 조성물 1ml 당 뉴블라스틴의 농도를 의미한다. 바이러스 벡터의 경우, 뉴블라스틴 농도는 향신경성 조성물 1ml 당 바이러스 입자의 수로 정의되어진다. 바이러스 발현 벡터를 이용하여 뉴블라스틴을 전달하는 경우에, 뉴블라스틴의 각 단위 투여량은 뉴블라스틴 조성물 2.5 내지 25㎕를 포함하는 것이다. 이 때, 조성물은 약제학적으로 허용되는 유체 중에 바이러스 발현 벡터를 함유하는 것으로서, 뉴블라스틴 조성물 1ml 당 1010 내지 1015 이하의 뉴블라스틴 함유 바이러스 입자를 함유한다. 이와 같은 고역가는 아데노-수반 바이러스에 특히 유용하다. 렌티바이러스의 경우에 역가는 일반적으로 낮아서, 예컨대 실시예 2에 기술된 바와 같이 측정된, 108 내지 1010 형질도입 단위/ml(TU/ml) 범위이다.
이러한 뉴블라스틴 조성물은 표적 조직 중의 각 전달 세포 부위로 미량주사, 주입, 찰과 부하법(scrape loading), 전기침투법 또는 수술적 절제를 통해 전달 부위 조직으로 조성물을 직접 전달하기에 적합한 다른 방법을 통해 전달된다. 이러한 전달은 서서히 수행되며, 예컨대 약 5 내지 10분간에 걸쳐 수행되기도 한다(전달되는 뉴블라스틴 조성물의 총 부피에 따라 결정).
본 발명에 의해 이용되는 직접 전달 방법은 생체내 유전자요법과 관련된 제한 위험 요인, 즉 뉴블라스틴을 암호화하는 전이유전자(transgene)를 운반하는 벡터에 의한 비표적 세포의 형질도입 가능성을 제거한다는 것을 당업자라면 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명에서, 전달은 직접적이고 전달 부위는 분비된 뉴블라스틴의 확산이 뇌의 제어된 소정 부위 상에서 일어나, 표적 신경세포와 최고로 접촉하면서 비표적 세포와는 최소로 접촉하도록 선택되어진다.
유전자요법 벡터
간략히 설명하면, 유전자요법은 최종 치료 효과가 환자에게 제공되도록 환자 세포로 새로운 유전자 물질을 전달하기 위한 것이다. 상기 효과에는 광범위한 질환, 장애 및 기타 상태의 치료 또는 예방이 포함된다.
생체외 유전자요법 접근법은 분리 세포의 변형, 및 그 다음 환자에게 주입하거나 이식하거나 또는 다른 방식으로 이식하는 단계를 수반한다(예컨대, 미국 특허 4,868,116, 5,399,346 및 5,460,959 참조). 생체내 유전자요법은 생체내에서 숙주 환자 조직을 직접 표적화하는 것이다.
유전자 전달 벡터로서 유용한 바이러스에는 파포바바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-수반 바이러스, 헤르페스바이러스 및 레트로바이러스가 포함된다. 적당한 레트로바이러스에는 HIV, SIV, FIV, EIAV, MoMLV로 이루어진 그룹이 포함된다.
신경계 장애의 치료에 바람직한 바이러스는 렌티바이러스 및 아데노-수반 바이러스이다. 이러한 두 유형의 바이러스는 세포 분열없이 게놈내로 통합될 수 있고, 신경계, 특히 중추신경계의 징조를 위해 임상전 동물 연구에서 시험되었다.
AAV 제조방법은 미국 특허 5,677,158에 기술되어 있다. 미국 특허 6,309,634 및 6,683,058은 중추신경계에 AAV를 전달하는 실시예를 설명하고 있다.
특히 바람직한 유형의 레트로바이러스에는 세포를 형질도입시키고 세포분열없이 게놈내로 통합될 수 있는 렌티바이러스가 있다. 이러한 벡터는 복제 결손형 렌티바이러스 입자인 것이 바람직하다. 이러한 렌티바이러스 입자는 5' 렌티바이러스 LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 시그널, 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 시그널에 작동가능하게 결합된 프로모터, 제2 가닥 DNA 합성 오리진 및 3' 렌티바이러스 LTR을 함유하는 렌티바이러스 벡터로부터 생산될 수 있다. 렌티바이러스의 제조방법 및 신경세포로의 생체내 투여방법에 대해서는 미국 2002 0037281(렌티바이러스 벡터를 이용한 신경세포의 형질도입 방법)에 기술되어 있다.
레트로바이러스 벡터는 사람의 임상 시험에 가장 일반적으로 사용되는 벡터인데, 그 이유는 이 벡터가 많은 다른 바이러스 벡터보다 큰 7 내지 8kb를 운반하고, 세포를 감염시키는 성질을 갖고 있고, 숙주 세포에 높은 효율로 안정되게 통합되는 유전자 물질을 보유하고 있기 때문이다(예컨대, WO 95/30761; WO 95/24929 참조). 종양바이러스는 외인성 핵산 서열을 환자에게 전달 및 통합시키기 위해 표적 세포 증식을 적어도 1회 이상 필요로 한다. 레트로바이러스 벡터는 환자의 게놈으로 불규칙하게 통합된다.
레트로바이러스 입자는 마우스 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있는 동종숙주역(ecotropic) 및 다양한 종의 세포를 감염시킬 수 있는 양종숙주역(amphotropic), 두 유형이 개시되어 있다. 제3의 유형은 바이러스 생산 종과 다른 종의 세포를 감염시킬 수 있는 이종숙주역(xenotropic) 레트로바이러스이다. 분열세포의 게놈으로만 통합되는 이들의 성질은 레트로바이러스를 발생 연구에서 세포 계통을 표식화하고, 치료 또는 자살 유전자를 암이나 종양으로 전달하기에 바람직한 바이러스로 만들었다. 이러한 벡터는 성체 환자 중, 세포 분열이 비교적 적은 중추신경계에서 특히 유용하게 사용될 수 있다.
사람 환자에게 사용하기 위해서는, 레트로바이러스 벡터는 복제 결손형이어야 한다. 이는 표적 조직 내에서 감염성 레트로바이러스 입자의 추가 생성을 방지하고, 복제 결손형 벡터는 표적 세포 게놈으로 안정되게 통합된 "포획적(captive)" 전이유전자가 된다. 일반적으로, 복제 결손형 벡터에는 gag, env 및 pol 유전자가 결실되어 있다(나머지 바이러스 게놈 대부분과 함께). 이와 같이 결실된 바이러스 유전자 대신에 이종 DNA가 삽입되어진다. 이러한 이종 유전자는 내인성 이종 프로모터, 또는 표적 세포에서 활성적인 다른 이종 프로모터, 또는 레트로바이러스 5' LTR(바이러스 LTR은 다양한 조직에서 활성적이다)의 조절하에 위치할 수 있다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 약 7 내지 8kb의 전이유전자 수용력을 갖고 있다.
복제 결손형 레트로바이러스 벡터는 유전자조작된 패키징 세포주 등으로부터 복제 및 트랜스 형태의 어셈블리에 필요한 바이러스 단백질이 제공될 것을 필요로 한다. 패키징 세포는 복제 능력(competent) 바이러스 및/또는 헬퍼 바이러스를 방출하지 않는 것이 중요하다. 이는, ψ 시그널이 결실된 RNA로부터 바이러스 단백질을 발현시키고, 별도의 전사 단위로부터 gag/pol 유전자 및 env 유전자를 발현시켜 얻을 수 있다. 또한, 일부 패키징 세포주에서는 5' LTR이 상기 유전자의 발현을 조절하는 비바이러스 프로모터로 치환되고, 폴리아데닐화 시그널이 첨가되었다. 이러한 설계는 복제 능력 벡터 또는 헬퍼 바이러스를 생산시키는 재조합의 가능성을 최소화한다. 예컨대, 본원에 참조원용된 미국 특허 4,861,719를 참조한다.
또한, 본 발명은 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열과 시그널 서열을 함유하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 여기서, 시그널 펩타이드와 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 전술한 바와 같다. 따라서, 일부 양태에서, 상기 핵산 작제물은 프리프로 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 113 C 말단 코돈으로 이루어진 서열을 암호화한다. 특정 양태에서, 핵산은 프리프로 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 104 C 말단 코돈으로 이루어진 서열을 암호화하기도 한다.
이러한 핵산 서열은 알부민 시그널 서열(예컨대, 래트 알부민 시그널 서열)과 같은 이종 시그널 펩타이드를 포함할 수 있으며, 서열번호 65의 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산 작제물은 래트 알부민 시그널 서열과 같은 변형된 알부민 시그널 서열을 암호화한다. 예시적인 일 양태는 서열번호 69를 포함하는 핵산 작제물이다. 다른 양태에서, 핵산 작제물은 사람 성장 호르몬 시그널 서열을 암호화한다. 예시적 일 양태는 서열번호 67을 포함하는 핵산 작제물이다. 사람 성장 호르몬 시그널 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 핵산 작제물은 형질감염된 숙주 세포에서의 발현이 최적화된 핵산 서열을 함유한다. 코돈 용법의 최적화는 폴리펩타이드 수율 증가, 전사 또는 해독의 효율 향상을 제공하여 유리할 수 있다. 본 발명에 따른 최적화된 핵산 작제물의 예시적 일 양태는 서열번호 59에 제시한 것이다.
1 이상의 코돈이 동일 아미노산을 암호할 수 있다는 유전자 코드의 공지된 축퇴성으로 인하여, DNA 서열은 서열번호 65, 67 또는 69에 제시된 서열과 같이 다양할 수 있고, 이로부터 각각 서열번호 66, 68 또는 70의 상응하는 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드가 암호화될 수 있다. 이러한 변이체 DNA 서열은 침묵 돌연변이(예컨대, PCR 증폭 동안 발생된 것)에 의한 것일 수도 있고, 코돈 최적화와 같은 천연 서열의 고의적 돌연변이유발의 산물일 수도 있다.
핵산 작제물은 벡터일 수 있다. 적당한 플라스미드 벡터의 예에는 pFRT/lac Z대, pFRT/dhfr-1(Invitrogen, Carlsbad, CA), pUC, pGEM 및 pGEX(Pharmacia, Peapack, NJ)이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 적당한 벡터에는 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결손형 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-수반 바이러스)도 있다.
발현 벡터
발현 벡터는 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 1 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열의 예에는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 시그널이 포함된다. 이러한 조절 서열에 대해서는, 예컨대 문헌[Goeddel, 1990 Methods Enzymol., 185:3]에 기술되어 있다. 조절 서열에는 다양한 종류의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성적 발현을 유도하는 서열과, 특정 숙주 세포에서 유일하게 뉴클레오타이드 서열의 발현을 유도하는 서열(예컨대, 조직 특이적 조절 서열)이 있다. 당업자는, 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 농도 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포로 도입되어 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 뉴블라스틴의 재조합 발현용 벡터의 작제는 당업자에게 상세한 설명을 할 필요가 없는 통상적인 기술을 통해 수행할 수 있다. 하지만, 검토하기 위해 당업자는 문헌[Maniatis et al., in Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982)]을 참고할 수 있다.
간략히 설명하면, 재조합 발현 벡터의 작제는 표준 결합 기술을 이용한다. 작제된 벡터에서 서열의 정확성을 확인 분석하기 위하여, 결합 혼합물을 숙주 세포의 형질감염/형질도입에 사용한 뒤, 성공적인 유전자 변경 세포를 적당하다면 항생제 내성을 통해 선발할 수 있다.
형질감염/형질도입된 세포 유래의 벡터는 예컨대 메싱 등의 방법[Messing, et al. (Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981)], 맥삼 등의 방법[Maxam, et al. (Methods in Enzymology, 65: 499,1980)], 생거 디데옥시 방법 또는 당업자에게 공지된 기타 다른 적당한 방법을 통해 제조, 제한 분석 및/또는 서열분석될 수 있다.
절단된 단편의 크기 분리는 예컨대, 매니아티스 등(Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982)에 의해 기술된 바와 같은 통상적인 겔 전기영동법으로 수행한다.
본 발명에 사용되는 발현 인자들은 이들의 강도 및 특이성에 따라 달라질 수 있다. 사용되는 숙주/벡터계에 따라서, 임의의 수의 전사 및 해독 인자, 예컨대 구성형 및 유도성 프로모터 등이 발현 벡터에 사용될 수 있다. 포유동물 세포계에서의 클로닝 시, 프로모터는 포유동물 세포의 게놈 유래 프로모터(예컨대, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 유래 프로모터(예컨대, CMV 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)가 사용될 수 있고; 다중 카피수의 발현 산물을 함유하는 세포 주의 생산 시에는, SV40-, BPV- 및 EBV계 벡터가 적당한 선발용 마커와 함께 사용될 수 있다.
유전자 발현은 전사, 해독 또는 해독후 레벨에서 조절된다. 전사 개시는 유전자 발현의 초기 및 중요한 단계이다. 전사는 프로모터 및 인핸서 서열에 좌우되고 이러한 서열과 상호작용하는 특정 세포 인자의 영향을 받는다. 많은 원핵세포 유전자의 전사 단위는 프로모터와 몇몇 경우에는 인핸서 또는 조절인자로 구성되어진다(Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); and Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)). 레트로바이러스의 경우, 레트로바이러스 게놈의 복제와 관련있는 조절 인자는 장말단 반복체(LTR)에 존재한다(Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982)). 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 로우스 육종바이러스(RSV) LTR들은 프로모터 서열과 인핸서 서열을 함유한다(Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., In : Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman and Shenk, eds. , pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991)). 다른 유력한 프로모터에는 사이토메갈로바이러스(CMV) 유래 프로모터 및 다른 야생형 바이러스 프로모터가 있다.
또한, 많은 비바이러스성 프로모터들의 프로모터 및 인핸서 영역에 대해서도 개시되어 있다(Schmidt et al., Nature 314: 285(1985); Rossi and deCrombrugghe, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84: 5590-5594 (1987)). 정지기 세포에서 전이유전자의 발현을 유지시키고 증가시키는 방법은 콜라겐 타입 I(1 및 2)(Prockop and Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311: 376 (1984); Smith and Niles, Biochem. 19: 1820 (1980); de Wet et al., J. Biol. Chem., 258: 14385 (1983)), SV40 및 LTR 프로모터를 포함한 프로모터의 사용을 포함한다.
포유동물 숙주 세포에는 다양한 바이러스 기반 발현계가 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현벡터로서 사용되는 경우에, 암호 서열은 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체, 예컨대 후기 프로모터 및 3원성 리더 서열과 결합될 수 있다. 이러한 키메라성 유전자는 그 다음 시험관내 또는 생체내 재조합을 통해 아데노바이러스 게놈으로 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 영역(예컨대, 영역 E1 또는 E3)으로의 삽입은 감염된 숙주에서 생존할 수 있고 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 제공할 것이다(Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3655). 대안적으로, 백시니아 7.5 K 프로모터도 사용될 수 있다(Mackett et al., 1982, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 79: 7415; Mackett et al., 1984, J. Virol., 49: 857; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927).
본 발명의 일 양태에 따르면, 프로모터는 유비퀴틴 프로모터, CMV 프로모터, JeT 프로모터, SV40 프로모터 및 신장 인자 1 알파 프로모터(EF1-알파)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 구성적 프로모터이다.
유도성/억제성 프로모터의 예에는 Tet-On, Tet-Off, 라파마이신 유도성 프로모터, Mx1이 포함된다.
전이유전자 발현을 유도하기 위해 바이러스성 및 비바이러스성 프로모터를 사용하는 것 외에도, 전이유전자 발현의 농도를 증가시키기 위하여 인핸서 서열을 사용할 수 있다. 인핸서는 자신의 천연 유전자뿐만 아니라 일부 이종 유전자의 전사 활성을 증가시킬 수 있다(Armelor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2702(1973)). 예컨대, 본 발명에서 콜라겐 인핸서 서열은 전이유전자 발현을 증가시키기 위한 목적으로 콜라겐 프로모터 2(I)와 함께 사용되고 있다. 또한, SV40 바이러스에서 발견되는 인핸서 인자는 전이유전자 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 인핸서 서열은 본 발명에 참조인용된 문헌([Gruss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 943 (1981); Benoist and Chambon, Nature 290: 304 (1981), and Fromm and Berg, J. Mol. Appl. Genetics, 1: 457 (1982)]에 기술된 바와 같이 72 염기쌍 반복체로 구성되어 있다. 이러한 반복 서열은 각종 프로모터와 일렬로 존재할 때 다수의 상이한 바이러스 및 세포 유전자의 전사를 증가시킬 수 있다(Moreau et al., Nucleic Acids Res. 9: 6047 (1981).
또한, 전이유전자 발현은 프로모터 활성을 조절하는 사이토킨을 사용하여 장기간 안정된 발현으로 인해 증가될 수 있다. 콜라겐 2(I) 및 LTR 프로모터 유래의 전이유전자 발현을 조절하는 것으로 보고된 사이토킨에는 여러 가지가 있다(Chua et al., connective Tissue Res., 25: 161-170 (1990); Elias et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 580: 233-244 (1990)); Seliger et al., J. Immunol. 141: 2138-2144 (1988) and Seliger et al., J. Virology 62: 619-621 (1988)). 예를 들어, 형질전환 성장 인자(TOF), 인터류킨(IL)-1 및 인터페론(INF)은 LTR과 같은 다양한 프로모터에 의해 유도되는 전이유전자의 발현을 억제조절한다. 종양 괴사 인자(TNF) 및 TGF1은 상향조절하여, 프로모터에 의해 유도된 전이유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 유용성이 입증된 기타 다른 사이토킨에는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 표피 성장 인자(EGF)가 있다.
또한, 콜라겐 인핸서 서열(Coll(E))과 함께 콜라겐 프로모터는 면역보호된 상태에도 불구하고 치료된 뇌에서 생성될 수 있는 임의의 벡터에 대한 면역반응을 추가 억제함으로써 전이유전자 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 또한, 덱사메타손과 같은 스테로이드를 포함한 항염증성 제제는 벡터 조성물 전달 직후 치료된 숙주에게 투여할 수도 있고, 바람직하게는 임의의 사이토킨 매개 염증 반응이 감소될 때까지 지속 투여하는 것이 좋다. 인터페론의 생산 감소를 위해 사이클로스포린과 같은 면역억제제를 투여할 수도 있는데, 이는 LTR 프로모터 및 Coll(E) 프로모터-인핸서를 억제조절하고, 전이유전자 발현을 감소시킨다.
벡터는 Cre-재조합효소 단백질을 암호화하는 서열 및 LoxP 서열과 같은 서열을 추가로 포함할 수 있다. 뉴블라스틴의 일시적 발현을 보장하는 또 다른 방법은 Cre-재조합효소를 세포에 투여했을 때(Daewoong et al, Nature Biotechnology 19: 929-933) 또는 재조합효소를 암호화하는 유전자를 바이러스 작제물에 도입시켰을 때(Pluck, Int J Exp Path, 77: 269-278), 삽입된 DNA 서열의 일부를 절제시키는 Cre-LoxP 시스템의 사용을 통한 방법이 있다. 바이러스 작제물에 LoxP 부위 및 구조 유전자(본 발명의 경우 뉴블라스틴)와 함께 재조합효소의 유전자를 도입시키는 방법은 종종 대략 5일 동안의 구조 유전자 발현을 제공하기도 한다.
본 발명에 방법에 사용되는 벡터는 또한 성공적으로 형질전환된 숙주 세포의 동정에 사용할 수 있는 선발용 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 배양된 포유동물 세포에 사용하기에 적당한 선발용 마커에는 네오마이신, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 유전자가 있다. 선발용 마커는 증폭될 수 있는 선발용 마커일 수도 있다. 증폭될 수 있는 선발용 마커 중 하나는 DHFR 유전자이다. 또 다른 적당한 증폭성 마커는 DHFRr cDNA(Simonsen and Levinson, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 80: 2495)이다. 또 다른 선발용 마커는 틸리[Thilly, Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA]에 의해 검토된 바 있다. 적당한 선발용 마커는 뉴블라스틴 프리 서열과 동일한 벡터에서 또는 다른 벡터의 일부로서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 선발용 마커 및 뉴블라스틴 서열은 다른 프로모터 또는 동일 프로모터의 조절하에 위치할 수 있고, 후자 배열은 이중시스트론성 메시지를 생산한다. 이러한 유형의 작제물은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 4,713,339 참조).
본 발명의 방법에 사용되는 발현 벡터는 또한 재조합 생산된 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하는 태그를 암호화할 수 있다. 그 예에는 본 발명에 기술된 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 암호 서열이 lacZ 암호 영역과 정확한 골격으로 벡터에 결합되어 하이브리드 단백질을 생산할 수 있는 벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. , 2: 1791)이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, pGEX 벡터는 또한 글루타치온 S-트란스퍼라제(GST) 태그를 가진 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 이러한 단백질들은 일반적으로 가용성이어서, 글루타치온-아가로스 비드에 흡착시킨 뒤, 유리 글루타치온의 존재하에 용출시켜 세포로부터 용이하게 정제할 수 있다. 상기 벡터들은 정제 후 태그의 용이한 제거를 위해 절단 부위(트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 또는 PreScission Protease™(Pharmacia, Peapack, N.J.))를 포함한다. 다른 융합 태그, 예컨대 히스티딘 태그, 말토스 결합 단백질 태그들도 당업계에 공지되어 있다.
유전자요법을 위한 약제학적 제제
본 발명에 사용되는 뉴블라스틴 조성물을 제조하기 위해, 뉴블라스틴 암호화 발현 벡터를 약제학적으로 허용되는 현탁액, 용액 또는 에멀젼에 첨가할 수 있다. 적당한 매질에는 식염수 및 리포좀 제제가 있다.
보다 구체적으로, 약제학적으로 허용되는 담체에는 멸균 수성/비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함될 수 있다. 비수성 용매의 예에는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸올레이트와 같은 주사성 유기 에스테르가 있다. 수성 담체에는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예컨대 식염수 및 완충 매질이 포함된다. 비경구성 비히클에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산염화된 링거액 또는 고정 오일이 포함된다.
정맥내 비히클에는 수액 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스가 주성분인 것) 등이 있다.
보존제 및 기타 첨가제도 첨가될 수 있는데, 그 예에는 항미생물제, 산화방지제, 킬레이트화제 및 불활성 기체 등이 있다. 또한, 뉴블라스틴 전이유전자 조성물은 본 발명에 따른 후속 복원과 사용을 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 동결건조할 수 있다.
또한, 콜로이드성 분산계도 표적화된 유전자 전달에 사용될 수 있다.
콜로이드성 분산계에는 거대분자 복합체, 나노피막, 미소구, 비드 및 지질 기반계, 예컨대 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀 등이 포함된다. 리포좀은 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 유용하게 사용될 수 있는 합성 막 소포이다. 크기가 0.2 내지 4.0㎛ 범위인 거대 단층 소포(LUV)는 거대 마크로분자 함유 수성 완충액을 상당량(%) 함유할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. RNA, DNA 및 본래의 비리온은 수성인 내부에 피막되어 생물학적 활성 형태로 세포에 전달될 수 있다(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. , 6: 77,1981). 포유동물 세포외에, 리포좀은 식물, 효모 및 박테리아 세포에도 작동적으로 암호화하는 전이유전자를 전달하는 데 사용되어왔다. 리포좀은 효율적인 유전자 전달 비히클이 되기 위하여 다음과 같은 특징을 갖고 있어야 한다: (1) 생물학적 활성을 손상시킴이 없이 높은 효율로 뉴블라스틴을 암호화하는 유전자의 피막화; (2) 비표적 세포에 비해 표적 세포에 대한 우선적이고 실질적인 결합성; (3) 소포의 수성 함유물을 높은 효율로 표적 세포 세포질로 전달하는 성질; 및 (4) 유전자 정도의 정확하고 효과적인 발현(Manniono et al., Biotechniques, 6: 682, 1988).
리포좀 조성물은 일반적으로 콜레스테롤과 같은 스테로이드와 혼합된 인지질, 특히 고-상전이온도 인지질의 복합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 사용될 수도 있다. 리포좀의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 따라 달라진다.
리포좀 생산에 유용한 지질의 예에는 포스파티딜 화합물, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고리피드, 세레브로사이드 및 강글리오사이드 등이 포함된다. 특히 유용한 것은 지질 부가 14 내지 18개의 탄소 원자, 특히 16 내지 18개의 탄소원자를 함유하고 포화되어 있는 디아실포스파티딜글리세롤이다. 인지질의 예에는 계란 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린이 있다.
리포좀의 표적화는 해부학적 및 기작적 요인에 따라 분류할 수 있다. 해부학적 분류는 선택성, 예컨대 기관 특이성, 세포 특이성 및 소기관 특이성의 레벨을 기반으로 한다. 기작적 표적화는 수동 또는 능동인지의 여부를 기반으로 구별할 수 있다. 수동 표적화는 리포좀을 굴모세혈관을 함유하는 기관의 세망내피세포계(RES)의 세포로 분포시키는 자연적 경향을 이용한다.
한편, 능동 표적화는 모노클로날 항체, 당, 당지질 또는 단백질과 같은 특정 리간드에 리포좀을 커플링시키거나 또는 리포좀의 조성이나 크기를 변화시킴으로써 리포좀을 변형시키는 것을 수반하여 자연 발생의 국재화 부위외의 다른 기관 및 세포 유형을 표적화하게 하는 것이다.
표적화된 유전자 전달계의 표면은 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 리포좀 표적화된 전달계에서, 리포좀의 지질 이중막에는 리포좀 이중막과 안정된 결합 상태로 표적화 리간드를 유지시키기 위한 지질기가 도입될 수 있다. 이러한 지질 사슬을 표적화 리간드와 결합시키기 위해 다양한 결합기가 사용될 수 있다.
또 다른 전달계의 예에는 본 발명에 기술된 바와 같은 벡터 입자를 생산할 수 있는 패키징 세포 조성물을 치료 부위로 이식하는 방법이 포함된다. 이러한 세포의 피막화 및 이식 방법에 대해서는 당업계, 특히 WO 97/44065(Cytotherapeutics)에 공지되어 있다. 렌티바이러스 입자를 생산할 수 있는 패키징 세포주를 선발하면, 치료 부위에 비분열성 세포를 형질도입시킬 수 있다. 분열 세포만을 형질도입시킬 수 있는 레트로바이러스 입자를 사용하면, 치료 부위의 새로 분화된 세포에만 형질도입이 제한된다.
유전자요법 벡터 조성물의 전달 방법
본 발명에 의해 규정된 프로토콜 이후, 뉴블라스틴 조성물의 직접 전달은 당업자에게 익숙한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 그 예에는 수술 절제를 통한 미량주사(Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)); 전기침투법(예컨대, Andreason and Evans, Biotechniques, 6: 650-660 (1988) 참조); 주입, 표적화 분자 또는 공동침전물(예, 리포좀, 칼슘)과의 화학적 복합체화, 및 표적 조직의 미세입자 포격법(Tang, et al., Nature, 356: 152-154 (1992)) 등이 있다.
세포 피막화
피막화된 세포 요법은 수용체 숙주 면역계로부터 세포를 분리한 뒤, 이 세포를 숙주에게 이식하기 전에 반투과성 생체적합성 물질로 포위시킨다는 개념을 기반으로 한다. 본 발명은 면역분리성 피막에 세포를 피막화하는 장치를 포함한다. "면역분리성 피막"은 수용체 숙주에 이식 시, 장치 코어에 존재하는 세포에 미치는 숙주의 면역계의 유해 효과를 최소화하는 피막을 의미한다. 숙주로부터 세포의 면역분리는 미세다공성 막으로 형성된 이식용 중합체 피막으로 세포를 포위함으로써 수행한다. 이러한 접근법은 숙주와 이식된 조직 사이의 세포간 접촉을 방지하고, 직접 제공을 통한 항원 인식이 일어나지 않게 한다. 또한, 사용된 막은 항원 및 보체와 같은 분자의 분자량에 근거한 확산을 조절할 수 있도록 가공될 수도 있다(Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). 피막화 기술을 사용하면, 면역억제성 약물의 사용 여부를 불문하고 면역 거부없이 숙주로 세포를 이식할 수 있다. 유용한 생체적합성 중합체 피막은 일반적으로 액체 매질에 현탁 상태이거나 고정화 기질(matrix)에 고정화되어 있는 세포를 함유하는 코어, 및 분리된 세포를 함유하지 않고 생체적합성이며 유해한 면역학적 공격으로부터 코어 중의 세포를 방어하기에 충분한 주위 또는 주변 투과선택적 기질 또는 막 영역("재킷")을 함유한다. 피막화는 면역계의 성분이 피막으로 유입되는 것을 방해하여 피막화된 세포를 면역 파괴로부터 방어한다. 피막의 반투과성 성질은 또한 당해 생물학적 활성 분자가 피막으로부터 주위 숙주 조직으로 용이하게 확산될 수 있게 한다.
피막은 생체적합성 물질로 제조할 수 있다. "생체적합성 물질"이란, 숙주로 이식된 후, 피막 거부를 초래하거나 또는 분해 등을 통해 수행불능성을 만들기에 충분한 유해 숙주 반응을 유도하지 않는 물질이다. 이러한 생체적합성 물질은 큰 분자, 예컨대 숙주 면역계의 성분에 대해 비교적 불투과성이지만, 작은 분자, 예컨대 인슐린, 성장인자 및 영양소는 투과성이며, 대사 폐기물은 제거시킬 수 있다. 본 발명의 조성물을 통해 성장 인자를 전달하기에 적당한 생체적합성 물질에는 다양한 종류가 있다. 생체적합성 물질은 다양한 외측 표면 형태와 다른 기계적 및 구고적 특징을 가진 다수의 종류가 공지되어 있다. 본 발명의 피막은 모두 본원에 참고원용된 PCT 국제특허출원 WO 92/19195 또는 WO 95/05452; 또는 미국 특허 5,639,275; 5,653,975; 4,892,538; 5,156,844; 5,283,187; 또는 5,550,050에 기술된 것과 유사한 것이 바람직하다. 이러한 피막은 숙주 면역계의 유해 효과를 최소화하면서 대사물질, 영양소 및 치료 물질을 통과시킨다. 생체적합성 물질의 구성부는 주위 반투과성 막과 내부 세포-지지 스캐폴딩(scaffolding)을 포함할 수 있다. 따라서, 유전자 변형된 세포는 스캐폴딩 위에 파종되고, 이것이 투과선택성 막으로 피막되는 것이 바람직하다. 사상의 세포-지지 스캐폴딩은 아크릴, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 폴리아세토니트릴, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 나일론, 폴리아미드류, 폴리우레탄류, 폴리부트에스테르, 실크 면, 키틴, 탄소 또는 생체적합성 금속류로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 임의의 생체적합성 물질로 제조할 수 있다. 또한, 세포 이식용으로는 접합된 섬유 구조체를 사용할 수 있다(참고원용된 미국 특허 5,512,600 참조). 생체분해성 중합체에는 폴리(락트산) PLA, 폴리(락트-코글리콜 산) PLGA 및 폴리(글리콜산) PGA 및 이의 등가물로 구성된 중합체가 포함된다. 이식 세포가 부착할 수 있는 표면의 제공을 위해 포말형 스캐폴딩이 사용된 적도 있다(본원에 참고원용된 PCT 국제특허출원 98/05304). 제직된 망상 튜브는 혈관 이식체로서 사용된 바 있다(본원에 참고원용된 PCT 국제특허출원 WO 99/52573). 또한, 코어는 세포의 위치를 안정화시키는, 하이드로겔로 제조된 고정화 기질로 구성될 수 있다. 하이드로겔은 실질적으로 물로 구성된, 겔 형태의 가교 결합된 친수성 중합체의 3차원 망제품이다.
주위 반투과성 막의 제조에는 다양한 중합체 및 중합체 배합물을 사용할 수 있으며, 그 예에는 폴리아크릴레이트류(아크릴 공중합체류 포함), 폴리비닐리덴류, 폴리비닐 클로라이드 공중합체류, 폴리우레탄류, 폴리스티렌류, 폴리아미드류, 셀룰로스 아세테이트류, 셀룰로스 니트레이트류, 폴리설폰류(폴리에테르 설폰류 포함), 폴리포스파젠류, 폴리아크릴로니트릴류, 폴리(아크릴로니트릴/코비닐 클로라이드)뿐만 아니라, 이의 유도체, 공중합체 및 혼합물이 있다. 이러한 주위 반투과성 막은 생체적합성 반투과성 중공 섬유막인 것이 바람직하다. 이러한 막 및 이의 제조방법에 대해서는 본원에 참고원용된 미국 특허 5,284,761 및 5,158,881에 개시되어 있다. 또한, 주위 반투과성 막은 본원에 참고원용된 미국 특허 4,976,859 또는 미국 특허 4,968,733에 기술된 바와 같은 폴리에테르 설폰 중공 섬유로 제조될 수 있다. 또 다른 주위 반투과성 막 재료로는 폴리(아크릴로니트릴/코비닐 클로라이드)가 있다.
피막은 생물학적 활성의 유지에 적당하면서 산물이나 기능의 전달에 용이한 임의의 형태일 수 있으며, 그 예에는 원주형, 직사각형, 원반형, 패치형, 난형, 별형 또는 구형이 있다. 더욱이, 피막은 망형 또는 둥지형 구조로 감기거나 둘러싸일 수 있다. 피막이 이식 후 회수되어야 한다면, 이식 부위로부터 피막의 이동을 유도하는 경향이 있는 형태, 예컨대 수용체 숙주의 혈관에서 이동하기에 충분히 작은 구형 피막은 바람직하지 않다. 회수하고자 한다면, 직사각형, 패치형, 원반형, 원주형 및 평판 시트형과 같은 특정 형태가 보다 큰 구조 완전성을 제공하며 바람직하다.
마크로피막이 사용될 때, 각 장치에는 103 내지 108 세포가 피막화되는 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 105 내지 107 세포가 피막화되는 것이다. 투여량은피막의 수를 적게 또는 많게 이식하여 조절할 수 있으며, 특히 환자당 1 내지 10개의 피막이 바람직하다.
스캐폴딩은 세포외 기질(ECM) 분자로 코팅될 수 있다. 세포외 기질 분자의 적당한 예에는 콜라겐, 라미닌 및 피브로넥틴이 있다. 스캐폴딩 표면은 또한 세포 부착 향상을 위해 전하를 부여하는 플라즈마 조사 처리로 변형시킬 수도 있다.
피막을 봉인하는 방법은 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있는데, 그 예에는 중합체 접착제를 사용하거나, 또는 권축, 결절 및 열 봉인이 포함된다. 또한, 본원에 참고원용된 미국 특허 5,653,687에 기술된 바와 같은 임의의 적당한 "무수" 봉인 방법도 사용할 수 있다.
피막화된 세포 장치는 공지의 기술에 따라 이식한다. 본 발명의 장치 및 방법으로는 다수의 이식 부위가 고려되어야 한다. 이러한 이식 부위에는 중추신경계, 예컨대 뇌, 척수(예컨대, 참고원용된 미국 특허 5,106,627, 5,156,844 및 5,554,148), 수막공간내 이식, 및 안구의 수액 및 유리체액(참고원용된 PCT 국제특허출원 WO 97/34586 참조), 망막밑 공간 및 서브테나 피막이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 뇌에서, 이러한 장치는 실질 및 뇌실에 이식될 수 있다. 전신 전달 시, 이식은 근육내, 피하 또는 복강내에 이루어질 수 있다.
ARPE-19 세포주는 피막화된 세포 기반 전달 기술에 우수한 기준 세포주이며, 또한 피막화되지 않은 세포 기반 전달 기술에도 유용하게 사용된다. ARPE-19 세포주는 내구성이다(즉, 이 세포주는 중추신경계 또는 안내 환경으로의 이식과 같은 엄중 조건하에서 생존할 수 있다). ARPE-19 세포는 당해 치료제 물질을 분비하도록 유전자 변형될 수 있다. ARPE-19 세포는 수명이 비교적 길다. ARPE-19 세포는 사람 기원의 세포이다. 또한, 피막화된 ARPE-19 세포는 생체내 장치 생존능력이 양호하다. ARPE-19 세포는 효능적 함량의 성장인자를 전달할 수 있다. ARPE-19 세포는 무시할 수 있는 숙주 면역반응을 유도한다. 더욱이, ARPE-19 세포는 비종양원성이다.
피막을 CNS로 이식하는 방법 및 장치는 미국 특허 5,487,739에 기술되어 있다.
일 관점으로, 본 발명은 표적 세포를 감염시키기 위한 바이러스 벡터를 분비하는 살아있는 패키징 세포를 포함하는 코어; 및 이 코어 주위를 에워싸는 외부 재킷으로 구성된 생체적합성 피막으로서, 상기 바이러스 벡터는 본 발명에 따른 벡터이고, 상기 외부 재킷은 100nm 직경의 레트로바이러스 벡터가 통과되도록 선택된 다공도를 보유한 투과성 생체적합성 물질로 구성되어 상기 바이러스 벡터를 상기 피막으로부터 방출시킬 수 있는 것이 특징인, 생체적합성 피막에 관한 것이다.
상기 코어는 패키징 세포를 고정시키기 위한 기질을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 일 양태에 따르면, 상기 재킷은 하이드로겔 또는 열가소성 물질로 구성되는 것이다.
패키징 세포주에 적당한 세포의 예에는 HEK293, NIH3T3, PG13 및 ARPE-19 세포가 있다. 바람직한 세포에는 PG13 세포 및 3T3 세포가 포함된다.
패키징 세포를 피막화하는 방법 및 장치는 전문이 본원에 참고원용된 미국 특허 6,027,721호에 개시되어 있다.
숙주 세포
본 발명의 핵산 작제물은 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 생산에 사용될 수 있다. 진핵세포는 이종 시그널 서열에 작동가능하게 결합된 재조합 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 작제물로 형질감염될 수 있다. 핵산 작제물의 제조방법 및 이 작제물을 이용한 세포의 형질감염 방법은 당업계에 공지되어 있다(Ausubel et al., eds., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience : New York; Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY). 예를 들어, 세포는 전기침투, 인산칼슘 침전 또는 바이러스 벡터에 의한 감염을 이용하여 형질감염시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 형질전환된 숙주 세포는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포, COS 세포, HeLa 세포 또는 NIH 3T3 세포이다.
형질전환된 숙주 세포는 적당한 성장 배지에서, 분비된 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 발현되어 세포로부터 분비되게 하는 조건하에 배양한다. 적당한 성장 배지는 세포 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지이다. 세포 성장에 필요한 영양소는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 무기 성분 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 경우에 따라, 배지는 송아지 혈청 또는 태내 송아지 혈청을 함유할 수도 있다. 성장 배지는 핵산 작제물을 함유하는 세포의 선발을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물 상의 선발용 마커에 의해 상보적이거나 또는 핵산 작제물과 공동형질감염된 약물 선발 또는 필수 영양소 결핍을 통해 수행될 수 있다. 배양된 포유동물 세포는 때로 시판되는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지(예, MEM, DMEM)(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서도 성장된다. 사용된 특정 세포주에 적당한 배지 선발에 고려되어야 하는 요인은 당업계에 공지되어 있다.
즉, 일 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 형질도입 또는 형질감염된 분리된 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 세포는 포유동물 숙주 세포인 것이 바람직한데, 그 이유는 암호화된 뉴블라스틴을 정확하게 분비 및 가공할 수 있기 때문이다.
바람직한 종에는 설치류(마우스, 래트), 토끼, 개, 고양이, 돼지, 원숭이, 사람으로 이루어진 그룹이 포함된다.
본 발명의 벡터를 이용한 형질도입의 양호한 후보인 주요 배양물 및 세포주의 예에는 CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, 신경세포, 태아 세포, RPE 세포주, ARPE-19, 사람 불멸화된 섬유아세포, C2C12, HeLa, HepG2, 선조 세포, 신경원, 성상세포, 사이신경세포로 이루어진 그룹이 포함된다.
피막화 및 나출형 세포요법에 바람직한 한가지 세포주 유형은 망막 색소 상피세포(RPE 세포)이다. RPE 세포의 공급원은 포유동물 망막으로부터 분리된 원시 세포이다. RPE 세포를 수거하는 프로토콜은 공지되어 있고(Li and Turner, 1988, Exp. Eye Res. 47: 911-917; Lopez et al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 586-588), 통상의 방법론으로 간주된다. RPE 세포 공동이식에 관해 공개된 대부분의 보고서에서, 세포는 래트에서 유래하는 것이다(Li and Turner, 1988; Lopez et al., 1989). 하지만, RPE 세포는 사람에서 유래하는 것이 바람직하다. 분리된 원시 RPE 세포외에, 배양된 사람 RPE 세포주도 본 발명의 수행에 사용될 수 있다.
생체내 형질도입 시, 바람직한 숙주 세포 그룹에는 선조 세포, 신경세포, 성상세포 및 사이신경세포가 포함된다. 생체외 유전자요법 시, 바람직한 세포 그룹에는 신경 세포, 신경세포 전구 세포, 신경세포 조상 세포, 줄기 세포 및 태아 세포가 포함된다. 줄기 세포 및 신경세포 전구 세포는 조직으로 통합되어 이동할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 나출형 세포의 피막화 및 이식 시, 바람직한 세포에는 망막 색소 상피 세포, 예컨대 ARPE-19 세포; 사람 불멸화된 섬유아세포; 및 사람 불멸화된 성상세포가 포함된다. 특히 바람직한 세포는 ARPE-19이다.
다른 구체예에서, 치료 세포주는 사람 섬유아 세포주, 사람 성상세포 세포주, 사람 중뇌 세포주 및 사람 내피세포 세포주로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이며, 바람직하게는 TERT, SV40T 또는 vmyc로 불멸화된 것이다.
불멸화된 사람 성상세포주를 제조하는 방법은 이미 개시되어 있다(Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line (A735) with astrocyte-specific neurotransmitter function. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999 May ; 35 (5) 279-88.). 이 프로토콜은 성상세포의 세포주를 제조하는데 사용할 수 있다.
이 프로토콜의 다음과 같은 3가지 변형은 또 다른 사람 성상세포의 세포주를 생산하는데 바람직하다:
12 내지 16주령의 조직 대신에 5 내지 12주령의 태아로부터 절개된 사람 태아 뇌 조직을 사용할 수 있다.
SV40 T 항원 대신에 무한증식 유전자 v-myc 또는 TERT(텔로머라제)를 사용할 수 있다.
플라스미드를 이용한 형질감염 대신에 레트로바이러스 유전자 전달법을 사용할 수 있다.
또한, 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 설치류, 소, 돼지, 양 또는 염소와 같은 유전자전이된 동물에서 발현될 수 있다. 유전자전이된 동물은 이종 유전자가 모체에서 자손으로 전달되도록 이종 유전자를 게놈에 도입시킨, 인간을 제외한 동물이다. 이종 유전자는 단세포화된 배아로 도입될 수도 있다(Brinster et al,. 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 4438). 유전자전이된 동물의 생산 방법은 당업계에 공지되어 있다(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al., 1983, Cell 34: 335; Brinster et al., 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al., 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al., 2003, Theriogenology 59: 831; Robl et al., 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al., 2003, Xenotransplantation 10(3): 267).
뉴블라스틴의 시험관내 생산
또 다른 관점에서, 본 발명은 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 500ng/106 세포/24시간 초과량, 보다 바람직하게는 600ng/106 세포/24시간 초과량, 보다 바람직하게는 700ng/106 세포/24시간 초과량, 보다 바람직하게는 800ng/106 세포/24시간 초과량, 보다 바람직하게는 900ng/106 세포/24시간 초과량, 예컨대 1000ng/106 세포/24시간 초과량으로 분비할 수 있는 포유동물 세포(예컨대, 전술한 바와 같은 세포)에 관한 것이다.
분비된 뉴블라스틴은 실시예 1에 기술된 RetL3 ELISA 분석법으로 측정되는 바와 같이 생물학적 활성인 것이 바람직하다. 이로 인해, 글리코실화, 절단 및 재폴딩을 수행할 필요가 없다.
바람직한 숙주 세포는 CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, C2C12, HeLa, HepG2 및 ARPE-19 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이다. 보다 바람직하게는 CHO, HEK293, COS 및 ARPE-19를 포함하는 그룹이다.
뉴블라스틴 또는 이의 기능성 등가물은 이러한 세포를 배양한 뒤, 이 배양액으로부터 단백질의 재폴딩 또는 글리코실화 없이 뉴블라스틴을 회수함으로써 수득할 수 있다.
WPRE와 같은 인핸서 인자의 도입을 통해 발현을 더욱 증가시킬 수도 있다(미국 특허 6,136,597).
뉴블라스틴 생산 세포용 지지체 기질
본 발명은 또한 포유동물 신경계에 이식하기에 앞서, 지지체 기질 상에서 뉴블라스틴 생산 세포를 시험관내 배양하는 방법을 포함한다. 이와 같이 이식 전에 미세담체에 세포를 예비부착하는 방법은 이식된 세포의 장기 생존능력을 촉진시키고 장기간 기능성 잇점을 제공하기 위한 것이다.
이식된 세포, 즉 이식된 뉴블라스틴 분비 세포의 장기 생존능력을 증가시키기 위하여, 이식할 세포를 이식에 앞서 지지체 기질에 시험관내에서 부착시킬 수 있다. 지지체 기질을 구성할 수 있는 재료에는 세포가 시험관내 배양 후 부착하여, 세포가 성장할 수 있으며, 이식 세포를 파괴하거나 또는 이식 세포의 생물학적 또는 치료적 활성을 방해하는 염증 반응이나 독성 반응을 유발함이 없이 포유동물 체내로 이식될 수 있는 재료가 포함된다. 이러한 재료에는 합성 또는 천연 화학 물질, 또는 생물 기원의 물질일 수 있다.
이러한 기질 재료에는 유리 및 기타 다른 규소 산화물류, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리우레탄, 폴리알기네이트, 폴리설폰, 폴리비닐 알코올, 아크릴로니트릴 중합체류, 폴리아크릴아미드, 폴리카보네이트, 폴리펜턴트, 나일론, 아밀라제류, 천연 및 변형 젤라틴 및 천연 또는 변형 콜라겐, 천연 및 변형 다당류, 예컨대 덱스트란 및 셀룰로스(예, 니트로셀룰로스), 아가 및 마그네타이트가 포함된다. 재흡수성 또는 비-재흡수성 재료가 사용될 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 세포외 기질 재료도 사용될 수 있다. 세포외 기질 재료는 시중에서 입수하거나, 또는 그런 기질을 분비하는 세포를 성장시키고, 분비 세포를 제거한 뒤, 남은 기질을 이식될 세포와 상호작용시켜 세포를 기질에 부착시켜 제조할 수 있다. 이식될 세포가 성장하는 기질 재료 또는 세포와 혼합되는 기질 재료는 RPE 세포 유래의 산물일 수 있다. 즉, 예를 들어 기질 재료는 이식될 RPE 세포에 의해 생산되고 분비되는 세포외 기질 또는 기저 막 재료일 수 있다.
세포 부착, 생존 및 기능의 향상을 위해, 고체 기질은 경우에 따라 세포 부착, 성장 또는 생존을 촉진하는 것으로 당업계에 공지된 인자들로 외측 표면이 코팅될 수 있다. 이러한 인자에는 세포 부착 분자, 세포외 기질, 예컨대, 피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐, 엘라스틴, 글리코스아미노글리칸 또는 프로테오글리칸 또는 성장인자가 포함된다.
또는, 이식된 세포가 부착되는 고체 기질이 다공성 재료로 제작된다면, 성장 또는 생존 촉진 인자(들)를 기질 재료에 혼입시켜, 생체내 이식후 서서히 방출될 수 있게 할 수도 있다.
본 발명에 따른 지지체에 부착된 경우, 이식에 사용된 세포는 일반적으로 지지체의 "외측 표면"에 존재한다. 이 때, 지지체는 고체 또는 다공성일 수 있다. 하지만, 다공성 지지체인 경우에도, 세포는 중간 막이나 다른 장벽없이 외부 환경과 직접 접해있다. 즉, 본 발명에 따르면, 세포가 부착되는 표면이 다공성 지지체 물질의 내부 주름 또는 회선 형태이어서 입자 또는 비드 자체가 외측에 존재하지 않아도, 세포는 지지체의 "외측 표면"에 존재하는 것으로 간주된다.
지지체의 형태는 비드처럼 구형인 것이 바람직하나, 원주형, 타원형, 평판 시트 또는 스트립, 침 또는 핀 형 등일 수도 있다. 지지체 기질의 바람직한 형태는 유리 비드이다. 다른 바람직한 형태는 폴리스티렌 비드이다.
비드 크기는 직경이 약 10㎛ 내지 1mm 범위, 바람직하게는 약 90㎛ 내지 약 150㎛ 범위일 수 있다. 각종 미세담체 비드에 대한 설명은 문헌[예컨대, Fisher Biotech Source 87-88, Fisher Scientific Co., 1987, pp. 72-75; Sigma Cell Culture Catalog, Sigma Chemical Co., St, Louis, 1991, pp. 162-163; Ventrex Product Catalog, Ventrex Laboratories, 1989; 이들 문헌은 본원에 참고원용된 것이다]을 참조한다. 비드 크기의 상한선은 이식된 세포의 기능을 방해하거나 주위 조직에 손상을 유발할 수 있는 비드에 의한 부적절한 숙주 반응의 자극에 의해 좌우될 수 있다. 또한, 비드 크기의 상한선은 투여 방법에 의해서도 좌우될 수 있다. 이러한 상한은 당업자라면 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
뉴블라스틴 폴리펩타이드
본 발명은 또한 뉴블라스틴 프로 영역이 결실된 뉴블라스틴 폴리펩타이드와 시그널 펩타이드를 포함하는 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 시그널 펩타이드에 융합된 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 예로 들 수 있다. 구체적으로, 시그널 펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 이의 C-말단을 통해 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 N-말단에 결합된다. 이러한 시그널 펩타이드 및 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 전술한 바와 같은 것이다.
실시예 1: IgSP - NBN 작제물을 이용한 시험관내 형질감염
IgSP - NBN 작제물의 작제
IgSP.NBN은 중복 PCR로 제조했다. 제1 증폭 단계에서, NBN의 성숙 단편은 프라이머 NBNs-IgSP.Flap(5'-GGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCC-3') 및 NBNas+XhoI (5'-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3')을 사용하여 벡터 pUbi1z.NBN.BamH1에서 PCR로 증폭시켰다. 제2 PCR 반응에서, IgSP 서열은 프라이머 IgSPKozak1s+BamHl (5'-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3') 및 IgSPas-NBN.Flap (5'-GGCCCCCAGCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3')을 사용하여 벡터 pNUT-IgSP-CNTF (참조 US 6,361,741)에서 증폭시켰다. 제3 단계에서, 단계 1과 2의 산물을 최종 PCR 반응에서 혼합하여, 주형으로서 동량의 두 산물을 사용하고 프라이머 IgSPKozak1s+BamH1 및 NBN-as+XhoI을 사용하여 IgSP-NBN을 제조했다.
플라스미드-계 발현 벡터의 제조를 위해, 수득한 단편을 BamH1/Xho1로 분해된 pNS1n에 클로닝했다. 이 벡터에서, IgSP-NBN 서열은 CMV 프로모터의 전사 조절하에 두었다(도 3 참조). 또한, 이 벡터는 포유동물 세포에서 발현될 때 G418 내성을 제공하는 Neo 유전자를 함유하고 있다.
일시적 형질감염 연구
ARPE-19는 10% 태내 송아지 혈청(Sigma-Aldrich, Denmark)을 보충한 DMEM/Nutrient Mix F-12+Glutamax(Invitrogen, Denmark)에서 37℃, 5% CO2에서 성장된 사람 망막 색소 상피 세포(Dunn et al., 1996)이다. 세포를 계대하기 위하여 대략 주당 2회씩 트립신처리 및 재접종(분할 비 1:5)을 수행했다. 형질감염 연구를 위해 세포를 105 세포/웰의 밀도로 6웰 평판(Corning Costar, Biotech Line, Denmark)에 접종했다. 다음 날, 세포를 Fugene6(Roche, Germany)을 제조자의 설명서에 따라 중복 웰에 웰당 주입한 3㎍ 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 3일 후 수거한 세포 상청액에 존재하는 NBN 활성을 RetL3 ELISA에서 분석했다.
RetL3 ELISA
RetL3 ELISA는 NBN-특이적 GFRα3 수용체와 결합된 NBN 복합체에 대한 Ret-AP 접합체의 결합성을 측정한다. 이 분석은 기능적으로 활성인 NBN 분자만을 측정 한다. 간략히 설명하면, 96웰 평판(B&W Isoplate HB, Perkin Elmer, Denmark)을 50mM NaHCO3(pH 9.6) 중의 1㎍/ml 염소 항사람 Fc(Jackson Immunoresearch Laboratories, TriChem. Denmark) 100㎕로 4℃에서 16시간 동안 코팅했다. PBS/0.05% Tween20(PBST)으로 세척 후, 웰을 PBST 중의 0.2% I-Block(Tropix, Applied Biosystems, Denmark)으로 실온에서 1시간 동안 차단시킨 후, PBST로 간단히 세척했다. 세포 상청액 또는 재조합 마우스 Artemin(R&D systems, UK)을 DMEM/10% FCS로 희석하고, 그 다음 RET-AP 조절 배지(Biogen, USA) 중의 1㎍/ml GFRα3/Fc 융합 단백질(R&D Systems, UK)과 웰에서 실온하에 1.5시간동안 항온배양했다. 웰을 그 다음 먼저 PBST로 세척한 뒤, AP 완충액(200mM Tris(pH=9.8), 10mM MgCl2)으로 세척한 다음, AP 완충액 중의 10% Sapphire Enhancer(Tropix, Applied Biosystems, Denmark) 및 2% CSPD(Tropix, Applied Biosystems, Denmark)와 30분 동안 항온배양했다. Microbeta Trilux 계수기(Perkin Elmer, Denmark)를 사용하여 발광도를 측정했다.
결과(도 4, 패널(b))
상기 RetL3 ELISA에 의해 pNS1n-IgSP.NBN 작제물로 일시적 형질감염된 ARPE-19 세포로부터 수거한 상청액에서 25.3 내지 33.8 ng/ml의 NBN 활성이 측정되었다. 이에 반해, 동일 실험으로 조사된 야생형 (프리프로)NBN 발현 작제물(pUbi1z.hNBN)로 일시적으로 형질감염된 ARPE-19 세포에서는 약 5배 낮은 NBN 활성(4.4 내지 6.4ng/ml)이 측정되었다. EGFP 발현 작제물(pNS1z-EGFP)로 일시적 형질감염된 ARPE-19의 세포 상청액에서는 매우 낮거나 측정불가능한 NBN 활성이 관찰되었고, 이는 이 분석법의 특이성을 확인시켜 주었다.
이러한 결과는 키메라 IgSP-NBN 작제물의 사용이 야생형 (프리프로)NBN 작제물을 이용한 NBN 방출에 비해, 특이적 NBN 수용체 복합체에 결합하여 활성화될 수 있는 포유동물 세포 유래의 성숙 NBN의 방출을 보다 많이 유도한다는 것을 시사한다.
실시예 2: IgSP - NBN 작제물에 의한 시험관내 형질도입
렌티바이러스 IgSP - NBN 작제물 및 바이러스 스톡의 제조
렌티바이러스 작제물 제조를 위해, pNS1n-IgSP-NBN을 BamH1-Xho1로 분해하고, IgSP-hNBN PCR 단편(실시예 1에 기술된 것)을 BamH1/Xho1 분해된 pHsCXW에 결합시켜 pHsCXW.IgSP.NBNw(도 3)를 수득했다. pHsCXW는 자기-불활성화 렌티바이러스 전이 작제물의 유도체로서, 이 전이 작제물의 큰 비바이러스 부분을 pUC19 주쇄로 치환시켜 제조한, WPRE 인자(Dull et al., J. Virol., 72 (11): 8463-71 (1998); Zufferey et al., J. Virol., 72 (12): 9873-80 (1998): Zufferey et al. J. virol., 73 (4): 2886-92 (1999))를 함유한 pHR'-SIN-18 이다. 이러한 pHsCXW의 서열은 진뱅크 ID: AY468486을 통해 입수할 수 있다.
복제 결손형 LV-sC.IgSP.NBN.W 바이러스 입자는 pMD.G(VSV-G 허위형 벡터) 및 pBR8.91(패키징 벡터)(Zufferey et al., Nat.Biotech., 15:871-75(1997))과 함 께 pHsC.IgSP.NBN.W를 이용하여, 필요한 바이러스 단백질을 트란스로 제공하는 293T 세포를 형질감염시켜 제조했다. 간략히 설명하면, 293T 세포는 10% FCS(Life Technologies, 10099-141)를 보충한 글루타맥스(Life Techonologies, 32430-027) 및 글루코스 4.5g/l 첨가된 DMEM에서 배양한 뒤, 형질감염 전날에 T75 플라스크(2.106 세포/플라스크)에 접종했다. 각 T75 플라스크의 세포를 리포펙타민을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 pMD.G 5㎍, pBR8.91 15㎍ 및 전이 벡터 20㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 2 내지 3일째 바이러스를 함유하는 세포 상청액을 수거하여, 0.45m 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리설폰산 필터를 통해 필터 살균하고, 4℃에서 50,000xg로 90분 동안 초원심분리하여 농축했다. 2차 초원심분리 후, 농축된 바이러스 펠릿을 DMEM에 재현탁시키고, 분할한 뒤, -80℃에 보관했다. 바이러스 역가 측정을 위해, 역전사효소(RT) 활성을 분석하고(Cepko and Pear, Current Protocols in Molecular Biology, 9.13.5-6, supplement 36), 측정된 RT 활성으로부터 대조군으로 공지의 형질도입 활성을 가진 EGFP 렌티바이러스를 사용하여 형질도입 단위(TU)/ml를 계산했다.
형질도입 연구
ARPE-19 세포를 NBN 발현 벡터로 형질도입시켰다. 간략히 설명하면, 세포를 105 세포/웰의 밀도로 6웰 평판(Corning Costar, Biotech Line, Denmark)에 접종했다. 다음 날, 2x105 TU의 바이러스를 5㎍/ml 폴리브렌과 함께 웰마다(중복) 첨가하 여 4시간 동안 반응시켰다. 배지를 교환하고, 배양물을 3일 동안 항온배양했다. 그 다음, 세포 상청액을 수거하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 RetL3 ELISA를 수행했다.
결과(도 4, 패널(c))
LV-sC.IgSP.NBN.W 바이러스로 형질도입된 ARPE-19 세포로부터 수거한 상청액에서 RetL3 ELISA를 사용하여 측정한 NBN 활성은 39ng/ml이었다. 이에 반해, 야생형 (프리프로)NBN cDNA를 함유하는 렌티바이러스(LV-sC-NBN.W) 또는 대조용 EGFP 렌티바이러스(LV-sCEW)로 형질도입된 ARPE-19 세포에서는 NBN 활성이 매우 낮거나 측정불가능했다.
이와 같은 결과는, 야생형 (프리프로)NBN cDNA를 함유하는 바이러스 작제물과는 대조적으로, 키메라성 IgSP-NBN 바이러스 작제물의 사용이 특이적인 NBN 수용체 복합체와 결합하여 활성화시킬 수 있는, 포유동물 세포 유래의 성숙 NBN의 다량 방출을 유도한다는 것을 시사한다.
실시예 3: IgSP - NBN 작제물로부터 발현된 NBN 단백질의 분석
세포 상청액의 웨스턴 블롯 분석
형질감염 또는 형질도입된 세포 배양물의 세포 상청액에 존재하는 NBN을 웨스턴 블롯 분석하기에 앞서, GFRα3-Ig에 대한 친화성 결합을 통해 농축시켰다. 간략히 설명하면, Nunc MaxiSorp 평판의 4 웰을 50mM NaHCO3(pH 9.6) 중의 1㎍/ml 염 소 항사람 Fc(Jackson Immunoresearch Laboratories, TriChem, Denmark) 300㎕로 4℃에서 16시간 동안 코팅시켰다. 이 웰을 PBS 중의 1% BSA 400㎕로 실온에서 1시간 동안 차단시킨 뒤, PBST로 3회 세척했다. 그 다음, 1㎍/ml의 GFRα3/Fc 융합 단백질(R&D Systems, US) 300㎕/웰를 첨가하고, 결합을 최대화하기 위해 이 평판을 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 웰을 비우고, PBST로 다시 3회 세척했다. 형질감염 또는 형질도입된 세포 배양물에서 수거한 상청액 300㎕를 4개의 웰 각각에 첨가하고, 실온에서 부드러운 진탕하에 3시간 이상 동안 항온배양했다. 웰을 그 다음 PBST로 2회 세척했다. 첫 번째 웰에 비환원성 시료 완충액(2% SDS, 0.4M Tris(pH 8.0)) 20㎕를 첨가하고, 평판을 5분동안 빠르게 진탕시켜 결합된 단백질을 용출시켰다. 그 내용물을 다음 웰로 이동시켜, 같은 절차를 반복하여 나머지 웰에 결합되어 있는 단백질을 용출시켰다. DTT를 10mM로 첨가한 후, 시료를 96℃에서 5분 동안 가열하고, MultiPhor II 시스템을 제조자의 추천(Amersham Pharmacia, Denmark)에 따라 사용하여 15% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 SDS PAGE로 분석했다. 단백질을 PVDF 막(BioRad, Denmark)에 블롯팅하고, 검출 항체로서 토끼 폴리클론 항NBN 항체(#378)를 사용하여 면역염색했다. 이러한 막을 ECL+시스템(Amersham Pharmacia, Denmark)을 사용하여 발색시키고 필름을 광 노출시켰다.
결과
#378은 NBN 유래 펩타이드(ALRPPPGSRPVSQPC)에 대해 유발된 토끼 폴리클론 항체이다. 도 5의 패널(a)에 도시된 바와 같이, 대장균에서 생산된, 정제된 래트 재조합 NBN을 함유하는 환원된(+DTT) 시료에서는 비글리코실화 단량체 NBN113에 상응하는 7.2 내지 18.5kDa 사이 분자량의 단일 밴드가 확인되었다. 이와 동일한 MW의 밴드가 다른 여러 밴드와 함께, wt(프리프로)NBN 형질감염으로 구축된 안정된 CHO-NBN 클론 유래의 환원 시료에서 확인되었다. 이러한 다수 밴드의 확인은 탈글리코실화 및 N-말단 서열분석을 통해 종래 연구들에서 측정되었다. 분자량이 약간 작은 밴드는 성숙 NBN의 약간 작은 비글리코실화 형태를 나타낸다(NBN104). 또한, 겉보기 분자량이 약 21kDa인 아주 넓은 밴드는 NBN113 및 NBN104의 글리코실화 형태를 나타낸다. 보다 높은 분자량의 밴드는 GFRα3-친화성 정제된 시료에서 때로 관찰되는 프로-NBN(글리코실화된 형태)을 나타낸다.
도 5 패널 b에서 관찰되듯이, 비글리코실화 NBN113 및 NBN104에 상응하는 6.4 내지 21.3kDa 사이 분자량의 이중 밴드는 안정된 두 CHO-NBN 세포 클론에서 측정되었다. 이와 동일한 이중 밴드는 또한 IgSP-NBN 발현 작제물로 형질도입 또는 형질감염된 ARPE-19에서도 측정되었다. 더욱이, 글리코실화 NBN113 및 NBN104에 상응하는 21kDa에 가까운 MW의 이중 밴드는 모든 분석 시료에서 관찰되었다. 이러한 결과는 가공과 해독후 변형은 wt(프리프로)NBN 및 IgSP-NBN 작제물로부터 발현되었을 때와 유사하다는 것을 시사해준다.
실시예 4: 키메라 IgSP - NBN 바이러스 작제물의 서열 및 시그널 펩타이드의 예측
IgSP-NBN - 작제물에 존재하는 뉴클레오타이드 서열
Figure 112005072029087-PCT00005
IgSP-NBN은 면역글로불린 유전자 유래의 시그널 펩타이드가 성숙 NBN(113)에 직접 융합되어 있는 융합 작제물이다.
IgSP-NBN은 인트론을 함유한다.
NetGene(CBS-DTU 서버)에 의한 인트론-엑손 예측:
Figure 112005072029087-PCT00006
해독된 융합 단백질은 시그널 P(CBS DTU 서버 www.cbs.dtu.dk에서 입수가능) 를 사용하여 성숙 NBN(113) 서열로부터 절단된 19개 아미노산 시그널 펩타이드를 함유하는 것으로 예측되었다(참조 문헌: Identification of prokaryotic and eukaryotic peptides and prediction of their cleavage sites. H. Nielsen, J. Engelbrecht, S. Brunak, G. von Hejne, Protein Engineering 10,1-6, 1997.).
시그널P - NN 결과(도 6a 참조):
>서열 길이=70
Figure 112005072029087-PCT00007
#위치 19와 20 사이에 가능성이 가장 큰 절단 부위: VNS-AG
시그널P-HMM 결과(도 6b 참조):
예측: 시그널 펩타이드
시그널 펩타이드 확률: 0.999
시그널 앵커 확률: 0.000
최대 절단 부위 확률: 위치 19와 20 사이에 0.660
신경계 네트웍(NN)과 은닉 마르코브 모델(HMM)을 사용하여 진핵생물을 학습했다.
실시예 5: 시그널 펩타이드 위치 예측
Igsp가 다양한 길이의 뉴블라스틴 폴리펩타이드와 융합되었을 때 절단 부위의 예측은 전술한 시그널P 프로그램 2.0을 사용한 결과 다음과 같았다.
절단 부위:
단백질 시그널P-NN 시그널P-HMM 비고
프리프로 NBN 39/40*(0.852) 39/40(0.348) N-말단 확률이 낮은 매우 긴 시그널 펩타이드
IgSP-NBN113 19/20(0.757) 19/20(0.660)
IgSP-NBN106 19/20(0.831) 22/23(0.586) HMM에서 확률이 낮게 예측된 19/20 절단부위(0.2).
IgSP-NBN104 19/20(0.643) 22/23(0.440) HMM에서 확률이 낮게 예측된 19/20 절단부위(0.18). 또한, 추가 절단 부위 25/26은 동일 확률로 예측되었다.
IgSP-NBN102 16/17(0.643) 19/20(0.359) NN에서 확률이 0.5로 예측된 19/20 절단 부위
IgSP-NBN99 19/20(0.718) 19/20(0.496)
IgSP:
(19)MKCSWVIFFLMAVVTGVNS
NBN의 성숙 형태:
(113)AGGPGSR(106)AR(104)AA(102)GAR(99)GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG
실시예 6: pHsCXW 로의 델타프로 - NBN 의 클로닝
델타프로-NBN(서열번호 82)은 3단계 증폭에서 중복 PCR로 제조했다: 1) 성숙 NBN과 10개 염기의 3' 중복부와 5' BamHI/Kozak 돌출부를 보유한 프로프로NBN의 비 교적 긴 117bp 리더 서열(즉, 39 a.a. 시그널 펩타이드)(143bp); 2) 5' 10개 염기 NBN 리더 서열 중복부 및 3' XhoI를 보유한 성숙 NBN(362bp); 3) 단계 1과 2의 산물을 합하여 최종 PCR 반응을 수행하여 △프로-NBN(492bp)을 수득했다.
제1 PCR 반응(NBN 리더):
사용된 프라이머:
BamHI+Kozak+hNBNsp, 5'-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTG-GACTTG-GAGG-3'
hNBNsp3'-matNBN FLAP, 5'-GGCCCCCAGCGGCCTCTGCGACGCTGCTCA-3'
플라스미드 pHsC.hNBN.W(도 7a의 플라스미드 지도 참조)는 Pfu-turbo 폴리머라제를 사용하여 수행한 PCR 반응의 주형으로 사용했다.
PCR 조건:
94℃ 3분
94℃ 30초
55℃ 30초 35회
72℃ 1분
72℃ 5분
제2 PCR 반응(성숙NBN)
사용된 프라이머:
hNBNsp3'FLAP-matNBN s, 5'-CGCAGAGGCCGCTGGGGGCCCGGGCAGC-3'
NBNas+XhoI, 5'-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3'
플라스미드 pHsC.hNBN.W(도 7a의 플라스미드 지도 참조)는 Pfu-turbo 폴리머 라제를 사용하여 수행한 PCR 반응의 주형으로 사용했다.
PCR 반응:
94℃ 3분
94℃ 30초
65℃ 30초 35회
72℃ 1분
72℃ 5분
제3 PCR 반응(델타프로NBN)
사용된 프라이머:
BamHI+Kozak+hNBNsp,
5'-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTGGACTTGGAGG-3'
NBNas+XhoI, 5'-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3'
두 번의 제1 PCR 반응으로부터 얻은 PCR 단편(NBN 리더 및 성숙 NBN)을 둘 다 1:10 희석율로 희석한 뒤, Pfu-turbo 폴리머라제에 의해 수행되는 제3 PCR 반응의 주형으로 사용하고, 제1 PCR 반응과 동일한 PCR 프로필로 진행시켰다.
제3 PCR 반응에서 얻은 PCR 단편은 BamHI 및 XhoI으로 절단하고, pHsCXW(도 7b의 플라스미드 지도 참조) 내의 BamHI 및 XhoI 부위 사이에 클로닝했다.
실시예 7: 상이한 세포주에서 IgSP - NBN 작제물 및 델타프로NBN 작제물을 이용한 시험 관내 형질감염
wt 프리프로 NBN, 델타프로 NBN 및 IgSP-NBN을 포함한 상이한 NBN 작제물로의 일시적 형질감염 후 관찰되는 NBN 분비를 비교했다. 일시적 형질감염은 ARPE-19, HEK293, CHO 및 HiB5 세포를 이용하여 수행했다.
세포주
ARPE-19 세포는 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양했다. HiB5(Renfranz et al.1991), HEK293 및 CHO 세포는 10% 태내송아지 혈청(Invitrogen, Denmark)을 보충한 DMEM(Invitrogen, Denmark)에서 배양하고, CHO 세포용 배지에는 추가로 20mg/l L-프롤린을 보충했다. ARPE-19, HEK293 및 CHO 세포는 37℃에서 성장시키고, HiB5 세포는 5% CO2 하에 33℃에서 성장시켰다. 트립신처리 및 재접종(1:5 분할 비)을 통해 주당 거의 2회씩 세포를 계대배양했다.
일시적 형질감염 후 NBN 분비
세포를 6웰 평판(Corning Costar, Biotech Line, Denmark)에 약 105 세포/웰의 밀도로 접종했다. 다음 날, 세포를 pHsC.hNBN.W, pHsC.IgSP.hNBN.W 및 pHsC.델타프로-hNBN.W로 각각 형질감염시켰다. ARPE-19 세포는 실시예 1에 기술된 바와 같이 Fugene6을 사용하여 삼중복으로 웰에서 형질감염시킨 반면, 다른 3가지 세포주는 Lipofectamine Plus(Invitrogen, Denmark)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 삼중복 웰에서 2㎍ 플라스미드/웰로 형질감염시켰다. 다음 날, 각 웰에 새로운 성 장 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 추가 배양한 뒤, 조절 배지를 수거했다. pHsC.EGFP.W로 나란히 형질감염된 웰에서의 EGFP 발현 측정을 통해 충분한 형질감염 효율을 확인했다. 조절 배지 중의 NBN 결합 활성은 실시예 1에 기술된 바와 같이 RetL3 ELISA로 측정했다. RetL3 ELISA는 NBN 특이적 GFRα3 수용체와 결합된 NBN 복합체에 대한 Ret-AP 접합체의 결합성을 측정한다. 측정값은 NBN ng/ml/24h 및 NBN ng/105 세포/24h 로 계산했는데, wt NBN 작제물로 형질감염된 세포의 측정값을 1로 설정하고 상대적 NBN 방출량으로 조정했다. 도 8의 데이터는 이러한 3회 계산값을 나타내며, 평균±SEM(n=3)으로 제시했다. 패널 A에서, *는 wt NBN 작제물로 형질감염된 세포와의 유의적 차이(P<0.05, 1방향 ANOVA, Fisher LSD 법)를 나타낸다.
결과
하기 표와 도 8a에 제시된 바와 같이, 시험된 4 세포주는 wtNBN 작제물에 비해 델타프로-NBN 작제물을 사용했을 때 NBN 방출 증가를 보여주었다(세포주에 따라 9 내지 17개 높은 NBN 방출). 4 세포주를 pHsC.IgSP.hNBN 작제물로 형질감염시켰을 때, NBN 분비는 더욱 증가되었다(wtNBN에 비해 28 내지 91배 높은 NBN 방출). EGFP 발현 작제물(pHs.C.EGFP.W)로 일시적 형질감염된 ARPE-19의 세포 상청액에서는 NBN 활성이 매우 낮거나 측정 불가능했으며, 이는 이 분석법의 특이성을 확인시켜준다.
Figure 112005072029087-PCT00008
도 8b의 패널 B는 일시적 형질감염된 세포주의 조절 배지(24h)에 존재하는 NBN 농도를 보여준다. 가장 높은 농도(1240±54 ng NBN/ml)는 IgSP-NBN 작제물로 형질감염된 HEK293 세포의 조절 배지에서 확인되었다. 도 8c의 패널 C는 24시간 당 105 세포당 NBN 방출을 나타낸다. IgSP-NBN 형질감염된 ARPE-19 세포는 최고 NBN 방출(133±35ng/105 세포/24h)을 보여주었다.
이러한 결과는 포유동물 세포로부터 성숙 NBN의 분비를 증가시키기 위한 키메라 IgSP-NBN 작제물 및 델타프로 NBN 작제물의 사용이 다양한 세포 유형에 적용될 수 있음을 시사한다.
실시예 8: 시그널P 3.0을 이용한 예측
버전 3.0을 이용한 시그널 펩타이드 위치 예측. 여기서, 예측은 다음과 같은 서열의 델타프로 NBN 및 IgSP-NBN을 사용하여 수행했다.
NBN - SP 를 보유한 키메라 NBN 분자( 델타프로 NBN ):
Figure 112005072029087-PCT00009
IgSP 를 보유한 키메라성 NBN 분자( IgSP - NBN ):
Figure 112005072029087-PCT00010
래트 알부민 SP 를 보유한 키메라성 NBN 분자( AlbSP - NBN ):
Figure 112005072029087-PCT00011
변형된 래트 알부민 SP 를 보유한 키메라성 NBN 분자( ModAlbSP - NBN ):
Figure 112005072029087-PCT00012
사람 성장 호르몬 SP 를 보유한 키메라성 NBN 분자( GHSP - NBN ):
Figure 112005072029087-PCT00013
시그널 펩타이드 예측은 이하 표에 제시한 바와 같다:
Figure 112005072029087-PCT00014
Figure 112005072029087-PCT00015
Figure 112005072029087-PCT00016
Figure 112005072029087-PCT00017
Figure 112005072029087-PCT00018
실시예 9: 뉴블라스틴 유전자 서열 최적화
천연의 사람 뉴블라스틴 유전자 서열을 가지고 CHO 세포에서 사람 뉴블라스틴을 최적 발현하는 코돈 사용에 대하여 조사했다. CHO 세포에서 가장 일반적으로 사용되는 코돈은 당업계에 공지된 방법(Nakamura et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27 (1) : 292)을 사용하여 2002년까지의 현존 데이터에 근거하여 분석했다. 크라이스툴러스 그리서스(Cricetulus griseus)가 의존적인 코돈 사용은 하기 표에 제시한 바와 같다.
표.
Figure 112005072029087-PCT00019
C 말단 104 아미노산 단편을 암호화하는 천연 사람 뉴클레오타이드 서열(Roseblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci. 15 (2): 199; Baloh et al., Neuron 21: 1291) 및 합성 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 도 9에 정렬시키고, 변화된 뉴클레오타이드에 표시했다. 두 서열은 83.33% 동일했다.
실시예 10: 뉴블라스틴 유전자 클로닝
뉴블라스틴 유전자의 3' 100개 코돈(300 뉴클레오타이드) 형태를 합성하여, 뉴블라스틴의 5' 코돈에 결합된 각종 시그널 펩타이드 서열의 삽입을 촉진하기 위해 발현 플라스미드에 클로닝했다. 뉴블라스틴 유전자의 100개 코돈 형태는 딥 벤트 폴리머라제(Deep Vent Polymerase)(New England BioLabs, Beverly, MA)를 함유한 200㎕ 완충액(10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 20mM Tris-Cl, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, pH 8.8)에서 올리고뉴클레오타이드 KD3-464 내지 KD3-469(표 2) 40pmol을 혼합하여 조립했다. 이 내용물을 95℃로 4분 동안 가열한 뒤, 다음과 같이 20회 순환시켰다: 95℃ 1분, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 그 다음 72℃ 4분간 연장 단계. 말단은 SalI 및 NheI로 순차 분해하여 제조했다. 30개 염기쌍의 비암호 영역이 뉴블라스틴 유전자에 인접해 있는 330개 염기쌍 단편을 겔 정제하고, 역시 겔 정제하여 NheI 및 XhoI로 분해시킨 플라스미드 pFRT/dhfr-1(하이그로마이신 유전자를 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자로 치환시킨 pcDNA/FRT 유도체(Invitrogen, Carlsbad, CA))에 결합시켰다. 수득되는 플라스미드를 pNBN026-35로 명명했다. pNBN026-35내의 뉴블라스틴 서열은 도 10에 제시한 바와 같다.
이하 표에는 시그널 펩타이드-뉴블라스틴 융합 유전자 제조를 위해 PCR 및 합성 서열 조립에 사용된 올리고뉴클레오타이드를 제시했다. 서열은 모두 5'에서 3' 방향으로 표시했다.
표
Figure 112005072029087-PCT00020
실시예 11: 시그널 펩타이드 - 뉴블라스틴 융합체 작제
4가지 다른 시그널 펩타이드를 암호화하는 서열을 시험했다. 이 서열에는 뉴 블라스틴, 래트 알부민 및 사람 성장 호르몬 유래의 시그널 서열이 포함된다. 추가로, 뉴블라스틴 시그널 펩타이드를 제조하기 위한 PCR 증폭 중에 2개의 프레임-이동 돌연변이로 초래된 합성 시그널 서열도 포함된다. 융합체는 올리고뉴클레오타이드 조립법 또는 PCR 중 하나를 사용하여 합성했다. DNA 단편은 pNBN026에 결합시켰다. 표시된 4분자 각각의 상대적 DNA 서열은 DNA 서열분석으로 확인했다.
상기 합성 시그널 서열은 올리고뉴클레오타이드 KD3-487, KD3-480, KD3-481 및 KD3-482(표) 및 puReTaq 폴리머라제(Pharmacia, Peapack, NJ.)를 사용한 PCR 증폭으로 합성했다. PCR 조건에는 반응액을 95℃까지 4분동안 가열하는 단계 및 그 다음 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 반응을 20회 순환하는 단계, 그 다음 72℃에서 4분 동안 연장반응시키는 단계가 포함된다. 말단은 PstI 및 XhoI으로 분해하여 제조했다. 330개 염기쌍 단편을 겔 정제하고, PstI 및 XhoI으로 겔정제하고 분해한 플라스미드 pNBN026에 결합시켰다. 수득되는 플라스미드를 pNBN030으로 명명했다. 서열에는 서로 보상성이고 프레임 상태의 해독 단백질을 유지하는 올리고뉴클레오타이드들에 의해 예측되거나 암호화되지 않는 2개의 자발적 프레임이동 돌연변이가 존재했다. 그 DNA 서열 및 단백질 서열은 도 11에 제시했다.
뉴블라스틴 시그널 서열은 올리고뉴클레오타이드 KD3-513 및 KD3-514(표)를 이용한 PCR 증폭으로 합성했다. 폴리머라제로는 puReTaq(Pharmacia, Peapack, NJ)을 사용했다. PCR 조건은 95℃까지 4분간 가열하는 단계 및 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 반응을 3회 순환하는 단계, 및 72℃에서 4분간 연장하 는 단계를 포함한다. 말단은 NheI 및 XhoI로 분해하여 제조했다. 330개 염기쌍 단편을 겔 정제하고, 역시 겔정제하여 NheI 및 XhoI로 분해한 플라스미드 pNBN030에 결합시켰다. 수득되는 플라스미드를 pNBN038로 명명했다. 이 DNA 및 단백질 서열을 도 12에 제시했다.
알부민 시그널 서열은 올리고뉴클레오타이드 KD3-487, KD3-471 및 KD3-472(표)를 이용한 PCR 증폭을 통해 합성했다. 폴리머라제로는 puReTaq(Pharmacia, Peapack, NJ)을 사용했다. PCR 조건은 95℃까지 4분간 가열하는 단계 및 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 반응을 20회 순환하는 단계, 및 72℃에서 4분간 연장하는 단계를 포함한다. 말단은 PstI 및 XhoI로 분해하여 제조했다. 330개 염기쌍 단편을 겔 정제하고, 역시 겔정제하여 PstI 및 XhoI로 분해한 플라스미드 pNBN026에 결합시켰다. 수득되는 플라스미드를 pNBN029로 명명했다. 이 DNA 및 단백질 서열을 도 13에 제시했다.
사람 성장 호르몬 시그널 서열은 올리고뉴클레오타이드 KD3-487, KD3-477 및 KD3-485(표 2)를 이용하여 플라스미드 pV30(사람 성장 호르몬 유전자의 5' 말단 게놈 카피를 함유하는 pUC계 플라스미드)으로부터 PCR 증폭을 통해 합성했다. 폴리머라제로는 puReTaq(Pharmacia, Peapack, NJ)을 사용했다. PCR 조건은 95℃까지 4분간 가열하는 단계 및 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분간의 반응을 20회 순환하는 단계, 및 72℃에서 4분간 연장하는 단계를 포함한다. 말단은 PstI 및 XhoI로 분해하여 제조했다. 330개 염기쌍 단편을 겔 정제하고, 역시 겔정제하여 PstI 및 XhoI로 분해한 플라스미드 pNBN026에 결합시켰다. 수득되는 플라스미드를 pNBN031로 명명했다. 이 DNA 및 단백질 서열을 도 14에 제시했다.
실시예 12: CHO 세포 형질감염
Flp 재조합 표적(frt)을 함유한 DNA 서열을 이용하여 CHO-DG44 세포를 미리 형질전환시켰다(A1 세포). 이러한 A1 숙주 세포주는 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR)를 함유하지 않아서, DHFR- 이다. 제시된 각 플라스미드는 DHFR 유전자, 뉴블라스틴 융합 유전자 및 frt 부위를 암호화한다. 플라스미드 pOG44는 Flp 재조합효소 유전자를 암호화한다. 이러한 플라스미드들을 이용한 A1 세포의 공동형질감염은 시그널 펩타이드-뉴블라스틴 융합 유전자의 단일 카피와 DHFR을 염색체에 삽입시켰다. A1 세포에 당해 플라스미드 및 플라스미드 pOG44를 제조사의 설명과 일치되는 조건(즉, 0.4mm 큐벳, 280볼트, 950마이크로패러드)(BioRad, Hercules, California)으로 전기침투시켰다. DHFR을 발현하는 형질전환 세포를, 10% 투석 태내송아지 혈청(Hyclone, Logan, UT) 보충된, 뉴클레오사이드 없는 알파-마이너스 배지 Minimal Essential Medium-Alpha(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 성장하는 능력을 토대로 선발했다. 약 2주 후, 콜로니를 분리하여 동일한 선발 배지의 증량 용기에서 확대배양했다. 세포 배양물을 무혈청 배지로 옮기고 분석했다.
실시예 13: 형질감염된 세포주 분석
세포주 후보는 뉴블라스틴 발현 능력에 따라 선발했다. 현탁 세포 배양물의 일정량을 원심분리하여 세포를 조절 배지로부터 분리했다. 세포 펠릿와 조절 배지 를 분리하고, 배지와 세포 펠릿 모두를 16% 폴리아크릴아미드 겔에서의 환원 변성 전기영동으로 공지된 바(Ausubel et al. 상기 문헌 설명 참조)와 같이 처리했다. 전기영동 완료 후, 단백질을 PVDF 막에 전기블롯팅하고 뉴블라스틴에 대해 유발된 토끼 폴리클론 항혈청으로 탐침했다. 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 염소 항토끼 폴리클론 항혈청(BioRad, Hercules, California)을 사용하여 항체-뉴블라스틴 복합체를 검출했다.
뉴블라스틴, 합성, 알부민 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드를 암호화하는 플라스미드로부터 발현된 단백질은 각각 세포 펠릿 분획에서 면역반응성 뉴블라스틴을 발현했다. 하지만, 알부민 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드는 조절 배지에서 검출가능한 양의 뉴블라스틴을 발현했다. 발현된 모든 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 전기영동적 이동성은 11Kd, 104 아미노산 형태의 뉴블라스틴과 일치했다.
실시예 14: CHO 세포에서 생산된 뉴블라스틴의 서열
조절 배지의 뉴블라스틴은 널리 공지된 바와 같이(Ausubel et al., 상기 문헌설명 참조) 면역친화성 컬럼을 사용하여 정제했다. 알부민 및 성장 호르몬 시그널 펩타이드를 함유한 세포주로부터 정제된 단백질의 아미노 말단 서열을 분석했다. 뉴블라스틴을 마이크로 TFA 필터(Applied Biosystems, Foster City, CA)상에 도포하고, 자동 에드만 분해 화학법을 수행했다. 아미노 말단 서열분석은 ABI Procise 494 서열분석기로 실시했다. 수득되는 PTH 아미노산은 PTH C18 역상 컬럼이 장착된 ABI 140C 미량구배 시스템을 사용하여 분리하고 ABI 7785A 흡광도 검출 기를 사용하여 분석했다. 두 작제물 모두 1차 단백질 서열은 전장 뉴블라스틴의 104 아미노산 C 말단 단편의 제1 잔기(즉, 알라닌)으로 시작되었다. 성장 호르몬 시그널 펩타이드에 의해 발현된 뉴블라스틴 제제에는 또한 아미노-말단의 알라닌 잔기가 없는 103 아미노산 뉴블라스틴 C 말단 단편도 포함되어 있었다. 103 아미노산 형태의 뉴블라스틴은 알라닌으로 시작되었다. 두 경우 모두, 시그널 펩타이드는 예상한 바와 같이 기능하여, 즉 세포로부터 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 분비되고 시그널 펩타이드는 세포에 의해 절단되었다.
실시예 15: 재조합 뉴블라스틴의 질량 분광분석
알부민 및 성장 호르몬 시그널 펩타이드를 암호화하는 작제물을 함유한 세포주의 조절 배지로부터 정제된 뉴블라스틴을, ZMD 질량 분광분석기(Waters, Milford, MA)를 제조사가 일반적으로 설명한 바와 같이 사용하여 순수 질량 분광법으로 분석했다. 두 작제물에 대한 탈글리코실화된 시료의 주 피크는 104 아미노산 뉴블라스틴 폴리펩타이드에 상응했다(도 15). 이러한 두 시그널 펩타이드는 예상한 바와 같이 기능하여, 즉 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 세포로부터 분비되고, 시그널 펩타이드는 세포에 의해 절단되었다. 또한, 뉴블라스틴 및 성장 호르몬 시그널 펩타이드를 암호하하는 작제물로 형질감염된 세포로부터 분비된 글리코실화된 뉴블라스틴도 다양한 당형태로 포함되어 있었다.
실시예 16: 뉴블라스틴 및 이종 시그널 서열을 암호화하는 작제물로 형질 감염된 CHO 세포 배양액의 뉴블라스틴 활성 측정
생물학적 활성은 키나제 수용체 활성화 ELISA(KIRA)를 사용하여 평가했다. 이 방법은 이미 개시된 방법이다(Sadick et al., 1996, Anal. Biochem., 1996. 235(2): 207). 간략히 설명하면, Ret 및 GFRα3을 발현하는 부착성 쥐의 신경모세포종 세포주인 NB41A3-mRL3 세포를 10% 태내송아지 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에 24웰 평판의 웰 당 2x105 세포로 접종하고, 37℃, 5% CO2에서 18시간 동안 배양했다.
세포를 PBS로 세척하고, DMEM 0.25ml에 뉴블라스틴을 연속 희석한 희석물로 37℃, 5% CO2에서 처리했다. 각 시료는 중복으로 분석했다. 세포를 PBS 1ml로 세척하고, 10mM Tris HCl, pH 8.0, 0.5% Nonidet P40, 0.2% 나트륨 데옥시 콜레이트, 50mM NaF, 0.1mM Na3VO4, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드의 혼합물 0.30ml로 4℃에서 1시간 동안 평판의 부드러운 진탕하에 용해시켰다. 용해물을 반복적 피펫팅으로 추가 교반한 후, 시료 0.25ml를 96웰 ELISA 평판에 주입했는데, 이 평판은 50mM탄산염 완충액 pH 9.6 중의 항Ret mAb(AA.GE7.3)(Upstate Biotechnology, Waltham, MA) 5㎍/ml로 4℃에서 18시간 동안 코팅시킨 후, 차단 완충액(20mM Tris HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1% Tween-20(TBST), 1% 정상 마우스 혈청 및 3% 소혈청알부민)으로 1시간 동안 실온에서 차단시킨 것이다.
실온에서 2시간 항온배양 후, 웰을 TBST로 6회 세척했다. 이 평판을 다시 한번 세척한 후 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 이염산염을 첨가했다. 발색 반응 후, 용 해물 또는 용해완충액 만으로 처리된 웰의 흡광도를 450nm에서 판독하고, 배경 보정된 시그널은 자극에 사용된 리간드 농도의 함수로서 플로팅했다.
연속 희석한 일련의 조절 배지를 시험한 결과, 앞서 확인된 대장균에서 발현, 정제 및 재폴딩된 뉴블라스틴 배취와 유사한 프로필의 기능성 뉴블라스틴이 검출되었다(도 16).
실시예 17: 이종 시그널 펩타이드로 발현된 성숙 뉴블라스틴
실시예 9에 기술된 방법에 따라, 성숙 뉴블라스틴(즉, 전장 뉴블라스틴의 113 C 말단 단편)을 암호화하는 DNA 서열을 클로닝하는 적당한 올리고뉴블레오타이드를 제조할 수 있다. 래트 알부민 또는 사람 성장 호르몬 유래의 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 실시예 10에 기술된 바와 같은 성숙 뉴블라스틴 폴리펩타이드 암호 DNA 서열과 융합시킬 수 있다. 이러한 DNA 서열을 이용하여 CHO 세포와 같은 진핵세포를 형질감염시킴으로써 분비형 성숙 뉴블라스틴을 생산할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고 원용된 것이다. 참고원용된 공개 간행물 및 특허 또는 특허출원들이 본 명세서에 포함된 개시내용과 모순되는 정도에 대해, 본 명세서는 그러한 모순된 내용보다 우선하고(하거나) 우위적인 것으로 간주되어야 한다.
본 발명의 다양한 변형과 변경은 당업자에게 자명하듯이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기술된 특정 구체예들은 예 시의 목적으로만 제공된 것인 바, 어떠한 방식으로든지 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 즉, 본 명세서 및 실시예는 예시적인 것으로만 해석되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위와 취지는 청구의 범위에 표시된 것으로 간주되어야 한다.
서열
서열번호 유형 설명
1 P IgSP 사람
2 P IgSP 원숭이
3 P IgSP 명주원숭이
4 P IgSP 마우스
5 P IgSP 돼지
6 P IgSP 래트
7 N 키메라성 마우스 IgSP-사람 113 NBN 작제물의 뉴클레오타이드 서열
8 N 서열번호 7의 스플라이싱된 전사체
9 P 서열번호 8과 7에 의해 암호화된 키메라성 단백질
10 P 사람 프리프로 뉴블라스틴
11 P 마우스 프리프로 뉴블라스틴
12 P 래트 프리프로 뉴블라스틴
13 P 성숙 사람 116 아미노산(aa) 뉴블라스틴
14 P 성숙 사람 113 aa 뉴블라스틴
15 P 성숙 마우스 119 aa 뉴블라스틴
16 P 성숙 마우스 116 aa 뉴블라스틴
17 P 성숙 래트 116 aa 뉴블라스틴
18 P 성숙 래트 113 aa 뉴블라스틴
19 P N-절두된 사람 104 aa 뉴블라스틴
20 P N-절두된 사람 99 aa 뉴블라스틴
21 P N-절두된 사람 140 aa 뉴블라스틴
22 P N-절두된 사람 106 aa 뉴블라스틴
23 P N-절두된 사람 102 aa 뉴블라스틴
24 P 사람 NBN-SP
25 P 델타프로NBN140
26 P 델타프로NBN113
27 P 델타프로NBN106
28 P 델타프로NBN104
29 P 델타프로NBN102
30 P 델타프로NBN99
31 P 키메라성 마우스 IgSP-사람 140NBN 단백질
32 P 키메라성 마우스 IgSP-사람 113NBN 단백질
33 P 키메라성 마우스 IgSP-사람 106NBN 단백질
34 P 키메라성 마우스 IgSP-사람 104NBN 단백질
35 P 키메라성 마우스 IgSP-사람 102NBN 단백질
36 P 키메라성 마우스 IgSP-사람 99NBN 단백질
37 P 래트 알부민 시그널 펩타이드
38 P 키메라성 래트 AlbSP-사람 140NBN 단백질
39 P 키메라성 래트 AlbSP-사람 113NBN 단백질
40 P 키메라성 래트 AlbSP-사람 106NBN 단백질
41 P 키메라성 래트 AlbSP-사람 104NBN 단백질
42 P 키메라성 래트 AlbSP-사람 102NBN 단백질
43 P 키메라성 래트 AlbSP-사람 99NBN 단백질
44 P 변형된 래트 알부민 시그널 펩타이드
45 P 키메라성 ModAlbSP-사람 140NBN 단백질
46 P 키메라성 ModAlbSP-사람 113NBN 단백질
47 P 키메라성 ModAlbSP-사람 106NBN 단백질
48 P 키메라성 ModAlbSP-사람 104NBN 단백질
49 P 키메라성 ModAlbSP-사람 102NBN 단백질
50 P 키메라성 ModAlbSP-사람 99NBN 단백질
51 P 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드
52 P 키메라성 GHSP-사람 140NBN 단백질
53 P 키메라성 GHSP-사람 113NBN 단백질
54 P 키메라성 GHSP-사람 106NBN 단백질
55 P 키메라성 GHSP-사람 104NBN 단백질
56 P 키메라성 GHSP-사람 102NBN 단백질
57 P 키메라성 GHSP-사람 99NBN 단백질
58 N 사람 104 NBN 뉴클레오타이드 서열
59 N 합성 104 NBN 뉴클레오타이드 서열
60 N 플라스미드 pNBN026-35 내의 뉴블라스틴 서열
61 N 키메라성 합성 SP-합성 104NBN 뉴클레오타이드 서열
62 P 키메라성 합성 SP-합성 104NBN 단백질
63 N 키메라성 NBNSP-합성 104NBN 뉴클레오타이드 서열
64 P 키메라성 NBNSP-합성 104NBN 단백질
65 N 키메라성 AlbSP-합성 104NBN 뉴클레오타이드 서열
66 P 키메라성 AlbSP-합성 104NBN 단백질
67 N 인트론 보유한 키메라성 GHSP-합성 104NBN 뉴클레오타이드 서열
68 P 키메라성 GHSP-합성 104NBN 단백질
69 N 키메라성 ModAlbSP-합성 104NBN 뉴클레오타이드 서열
70 P 키메라성 ModAlSP-합성 104NBN 단백질
71 N 프라이머 KD3-464
72 N 프라이머 KD3-465
73 N 프라이머 KD3-466
74 N 프라이머 KD3-467
75 N 프라이머 KD3-468
76 N 프라이머 KD3-469
77 N 프라이머 KD3-471
78 N 프라이머 KD3-472
79 N 프라이머 KD3-477
80 N 프라이머 KD3-479
81 N 프라이머 KD3-480
82 N 델타프로NBN113 뉴클레오타이드 서열
<110> NsGene A/S Biogen Idec MA, Inc. <120> Improved secretion of neublastin <130> P 951 PC00 <150> DK PA 2003 00861 <151> 2003-06-10 <150> US 60/507,483 <151> 2003-10-02 <160> 82 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Thr His Ala <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 2 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Callithrix jacchus <400> 3 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 5 Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Gln Gly <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Leu 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<222> (20)..() <400> 46 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp -15 -10 -5 Ala Phe Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala -1 1 5 10 Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly 15 20 25 Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly 30 35 40 45 Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu 50 55 60 Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser 65 70 75 Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp 80 85 90 Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys 95 100 105 Gly Cys Leu Gly 110 <210> 47 <211> 125 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified rat albumin signal peptide - NBN106 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <220> <221> mat_peptide <222> (20)..() <400> 47 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp -15 -10 -5 Ala Phe Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser -1 1 5 10 Gln Leu Val Pro Val 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Modified rat albumin signal peptide - NBN99 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <220> <221> mat_peptide <222> (20)..() <400> 50 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp -15 -10 -5 Ala Phe Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala -1 1 5 10 Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys 15 20 25 Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala 30 35 40 45 Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro 50 55 60 Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe 65 70 75 Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr 80 85 90 Ala Cys Gly Cys Leu Gly 95 <210> 51 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala 20 25 <210> 52 <211> 166 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Human Growth Hormone SP- NBN140 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(26) <220> <221> 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ccggcgggcc 240 cggtcccctc acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct 300 cctggctccc ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc 360 ttcatggacg tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc 420 tgcctgggct ga 432 <210> 64 <211> 143 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NBN signal peptide - NBN104 synthetic sequence <400> 64 Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu 20 25 30 Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu 35 40 45 Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser 50 55 60 Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala 65 70 75 80 Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala 85 90 95 Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg 100 105 110 Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp 115 120 125 Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala 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Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro 65 70 75 80 Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu 85 90 95 Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg 100 105 110 Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 115 120 <210> 67 <211> 662 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> GHSP with intron- NBN104 synthetic sequence <400> 67 atggctacag taagcgcccc taaaatccct ttgggcacaa tgtgtcctga ggggagaggc 60 ggcgtcctgt agatgggacg ggggcactaa ccctcaggtt tggggcttat gaatgttagt 120 atcgccatct aagcccagta tttggccaat ctccgaatgt tcctggtccc tggagggagg 180 cagagagaga gagaaaaaaa aaaacccagc tcctggaaca gggagagcgc tggcctcttg 240 ctctccagct ccctctgttg ccctccggtt tctccccagg ctcccggacg tccctgctcc 300 tggcttttgg cctgctctgc ctgtcctggc ttcaagaggg cagtgccgcc gccggcgctc 360 gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg ggccaccggt 420 ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc cggtcccctc 480 acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct cctggctccc 540 ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc ttcatggacg 600 tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc tgcctgggct 660 ga 662 <210> 68 <211> 130 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> GHSP-NBN104 synthetic sequence <400> 68 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly 20 25 30 Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly 35 40 45 His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys 50 55 60 Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly 65 70 75 80 Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro 85 90 95 Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn 100 105 110 Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys 115 120 125 Leu Gly 130 <210> 69 <211> 372 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Modified Albumin signal peptide sequence- NBN104 synthetic sequence <400> 69 atgaagtggg tgaccttcct gctgttcctg ctgttcatct ccggcgatgc cttcgctgcc 60 gccggcgctc gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg 120 ggccaccggt ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc 180 cggtcccctc acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct 240 cctggctccc ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc 300 ttcatggacg tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc 360 tgcctgggct ga 372 <210> 70 <211> 123 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Modified rat albumin signal peptide - NBN104 synthetic sequence <400> 70 Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu 20 25 30 Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val 35 40 45 Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His 50 55 60 Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro 65 70 75 80 Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr 85 90 95 Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp 100 105 110 Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly 115 120 <210> 71 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 71 aagcttgcta gcatgaattc atctcgaggc tgccggctgc ggtcccagct ggtgcctgtg 60 cgggccctgg gcctgggcca c 81 <210> 72 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 72 ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg 60 ctgggcgccg gcgccctgcg g 81 <210> 73 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 73 cagccttgct gccggcctac ccggtacgag gccgtgtcct tcatggacgt gaactccacc 60 tggcggaccg tggaccggct g 81 <210> 74 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 74 ggcccgccgg caggagccgg agcagaaccg gaaccgcacc agctcgtcgg accggtggcc 60 caggcccagg gcccgcacag g 81 <210> 75 <211> 81 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 75 gtaccgggta ggccggcagc aaggctggga cacaggccgg gagccaggag gaggccgcag 60 ggcgccggcg cccagcaggg a 81 <210> 76 <211> 78 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 76 cttggaattg tcgacggatc ctcagcccag gcagccgcag gcggtggcgg acagccggtc 60 cacggtccgc caggtgga 78 <210> 77 <211> 55 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 77 aagcttagct agcggatcca tgaagtgggt gaccttcctg ctgctgctgt tcatc 55 <210> 78 <211> 61 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 78 ggcagcctcg agcgccggcg gcggagaagg cggagccgga gatgaacagc agcagcagga 60 a 61 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 79 aagcttagct agcggatcca tggctacagg taagc 35 <210> 80 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 80 aagcttagct agcggatcca tggagctggg cctgggcggc ctgtccaccc 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Claims (97)

  1. 시그널 펩타이드와 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 암호화하고 뉴블라스틴 프로 영역을 암호화하지 않는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함한 세포를 배양하는 것을 포함하여, 생물학적 활성 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 시그널 펩타이드가 이종 시그널 펩타이드인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 시그널 펩타이드가 포유동물 시그널 펩타이드인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 시그널 펩타이드가 사람 시그널 펩타이드, 래트 시그널 펩타이드, 마우스 시그널 펩타이드, 돼지 시그널 펩타이드, 원숭이 시그널 펩타이드, 개 시그널 펩타이드, 고양이 시그널 펩타이드, 소 시그널 펩타이드 또는 말 시그널 펩타이드인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드가 성장인자 시그널 펩타이드, 호르몬 시그널 펩타이드, 사이토킨 시그널 펩타이드 및 면역글로불린 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 시그널 펩타이드가 TGFβ 시그널 펩타이드, GDF 시그널 펩타이드, IGF 시그널 펩타이드, BMP 시그널 펩타이드, 뉴로트로핀 시그널 펩타이드, PDGF 시그널 펩타이드 및 EGF 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 시그널 펩타이드가 호르몬 시그널 펩타이드 중에서 선택되고, 상기 호르몬이 성장 호르몬, 인슐린, ADH, LH, FSH, ACTH, MSH, TSH, T3, T4 및 DHEA로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 시그널 펩타이드가 인터류킨 시그널 펩타이드인 방법.
  9. 제5항에 있어서, 시그널 펩타이드가 뉴르투린(neurturin) 시그널 펩타이드, GDNF 시그널 펩타이드, 퍼세핀(persephin) 시그널 펩타이드 및 NGF 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 시그널 펩타이드가 알부민 시그널 펩타이드, 변형된 알부민 시그널 펩타이드 및 성장 호르몬 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 시그널 펩타이드가 래트 알부민 시그널 펩타이드, 변형된 래트 알부민 시그널 펩타이드 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 예컨대 래트 알부민 시그널 펩타이드 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드가 합성 시그널 펩타이드, 예컨대 서열번호 70을 포함하는 시그널 펩타이드인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 시그널 펩타이드가 면역글로불린 시그널 펩타이드인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 시그널 펩타이드가 마우스 IgSP(서열번호 4), 래트 IgSP(서열번호 6), 돼지 IgSP(서열번호 5), 원숭이 IgSP(서열번호 2 또는 3), 사람 IgSP(서열번호 1)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, IgSP가 마우스 IgSP(서열번호 4)인 방법.
  16. 제13항에 있어서, IgSP가 사람 IgSP(서열번호 1)인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 시그널 펩타이드가 천연 뉴블라스틴 시그널 펩타이드인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 시그널 펩타이드가 천연 사람 뉴블라스틴 시그널 펩타이드인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 서열번호 10의 아미노산 1 내지 140으로 표시되는 서열, 또는 서열번호 11 또는 12의 아미노산 1 내지 144로 표시되는 서열, 서열번호 13, 14, 15, 16, 17 또는 18로 표시되는 서열을 갖는 뉴블라스틴 중에서 선택되는 성숙 NBN, N-말단 절두된 NBN, 돌연변이된 NBN, 또는 돌연변이되고 N-절두된 NBN으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 서열번호 13, 14, 15, 16, 17 또는 18로 표시되는 서열을 갖는 뉴블라스틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 성숙 NBN인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 사람 성숙 113NBN(서열번호 14)인 방법.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 사람 뉴블라스틴의 116 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 115 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 114 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 113 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 112 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 111 C-말단 아미노산,사람 뉴블라스틴의 110 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 109 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 108 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 107 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 106 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 105 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 104 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 103 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 102 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 101 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 100 C-말단 아미노산, 및 사람 뉴블라스틴의 99 C-말단 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  23. 제1항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 서열번호 10의 106, 104, 102 또는 99 C-말단 아미노산을 가진 N-말단 절두된 뉴블라스틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 사람 뉴블라스틴의 116 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 113 C-말단 아미노산, 사람 뉴블라스틴의 104 C-말단 아미노산, 및 사람 뉴블라스틴의 116 C-말단 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  25. 제1항에 있어서, N-말단 절두된 뉴블라스틴이 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 것이 특징인 생산방법.
  26. 제1항에 있어서, N-말단 절두된 뉴블라스틴이 서열번호 20의 99개 아미노산을 함유하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 서열번호 14의 아미노산 8 내지 113에서 유래된 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 변이체 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 변이체 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 위치 14에 아르기닌 이외의 아미노산, 변이체 폴리펩타이드의 아미노산 서열 중 위치 39에 아르기닌 이외의 아미노산, 변이체 폴리펩타이드의 위치 68에 아르기닌 이외의 아미노산, 및 변이체 폴리펩타이드의 위치 95에 아스파라긴 이외의 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 치환을 하나 이상 포함하며, 이때 아미노산의 위치는 서열번호 14의 폴리펩타이드 서열에 따라 번호를 매긴 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 위치 14, 39 또는 68에서의 치환이 리신인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 플라스미드인 방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 포유동물 발현 벡터인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 벡터가 복제 결손형 렌티바이러스 입자인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 벡터 입자가 5' 렌티바이러스 LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 시그널, 시그널 펩타이드 및 뉴블라스틴 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 시그널에 작동가능하게 결합된 프로모터, 제2 가닥 DNA 합성의 오리진(origin) 및 3' 렌티바이러스 LTR을 포함하는 렌티바이러스 벡터로부터 생산되는 방법.
  34. 제30항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스, 예컨대 HIV, SIV, FIV, EIAV, AAV, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 및 MoMLV로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 유비퀴틴 프로모터, CMV 프로모터, JeT 프로모터, SV40 프로모터, 연장 인자 1 알파 프로모터(EF1-알파), 병아리 베타-액틴, PGK 및 MT-1로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 프로모터가 유도성/억제성 프로모터, 예컨대 Tet-On, Tet-Off, 라파마이신 유도성 프로모터, Mx1 및 RU486인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 포유동물 숙주 세포인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 포유동물이 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 원숭이 및 사람으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 세포가 CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, 신경 세포, 태아세포, ARPE-19, 불멸화된 섬유아세포, C2C12, HeLa, HepG2, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 선조(striatal) 세포, 신경세포, 성상세포, 사이신경세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 세포가 CHO 세포인 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 시그널 펩타이드 및 뉴블라스틴 펩타이드를 암호화하고, 뉴블라스틴 프로 영역은 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  42. 제41항에 있어서, a) 서열번호 64, 66 또는 68의 뉴클레오타이드 서열, 또는 b) 서열번호 65, 67 또는 69의 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 포유동물 숙주에서 발현되기에 최적화된 핵산.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  45. 제44항에 기재된 벡터 및 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포유하는 약제학적 조성물.
  46. 제44항에 기재된 바와 같은 벡터로 형질도입 또는 형질감염된 분리된 숙주 세포.
  47. 제46항에 있어서, 포유동물 세포인 분리된 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 500ng/106 세포/24시간을 초과하는 양의 뉴블라스틴 또는 이의 기능성 등가물을 분비할 수 있는 포유동물 세포.
  49. 제47항에 있어서, CHO, HEK293 COS, PC12, HiB5, RN33b, 불멸화된 섬유아세 포, C2C12, HeLa, HepG2, RPE 세포주 및 ARPE-19 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 세포.
  50. 제48항에 있어서, CHO, HEK293, COS 및 ARPE-19로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 세포.
  51. 제47항에 있어서, RPE 세포, 신경세포, 신경세포 전구 세포, 줄기 세포 및 태아세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 포유동물 세포.
  52. 제47항에 있어서, 지지체 기질에 부착되는 포유동물 세포.
  53. 5' 레트로바이러스 LTR을 포함하는 레트로바이러스 유래 게놈, tRNA 결합 부위, 패키징 시그널, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 시그널 펩타이드 및 뉴블라스틴 폴리펩타이드는 암호화하고 뉴블라스틴 프로 영역은 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터, 제2 가닥 DNA 합성의 오리진(origin) 및 3'레트로바이러스 LTR을 포함하는 감염성 벡터 입자를 생산할 수 있는 패키징(packaging) 세포주.
  54. 제53항에 있어서, 벡터 입자가 복제 결손형인 패키징 세포주.
  55. 제53항에 있어서, 게놈이 렌티바이러스 유래이고, LTR은 렌티바이러스 LTR인 패키징 세포주.
  56. 제44항에 기재된 바와 같은 벡터로 형질도입 또는 형질감염된 1종 이상의 세포를 포함하는, 인간을 제외한 유전자전이된(transgenic) 포유동물.
  57. 제56항에 있어서, 형질도입 또는 형질감염된 1종 이상의 세포가 포유동물의 게놈을 포함하는 포유동물.
  58. i. 성장 인자가 관통하여 확산될 수 있는 반투과성 막; 및
    ii. 제46항에 기재된 바와 같은 1종 이상의 분리된 숙주 세포를 포함하는, 이식성 세포 배양물 장치.
  59. 제56항에 있어서, 반투과성 막이 면역분리성인 장치.
  60. 제56항에 있어서, 반투과성 막이 미세다공성인 장치.
  61. 제56항에 있어서, 반투과성 막 내에 배치된 기질을 추가로 포함하는 장치.
  62. 제56항에 있어서, 테더 앵커를 추가로 포함하는 장치.
  63. 제44항에 기재된 벡터 또는 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 기재된 장치의 약물로서의 용도.
  64. 신경계 장애의 치료용 약물의 제조에 사용되는 제44항에 기재된 벡터의 용도.
  65. 제64항에 있어서, 신경계 장애가 신경병성 통증을 포함한 말초 신경병, 척수 상해, 척수근 찢김, 틱 돌로록스(tic doloreaux), 및 작열통으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  66. 제63항에 있어서, 약물이 각막 상처 및 궤양, 및 망막병증과 같은 안구 질환의 치료를 위한 것인 용도.
  67. CNS 장애의 치료용 약물의 제조에 사용되는 제44항에 기재된 벡터의 용도.
  68. 제67항에 있어서, CNS 장애가 신경퇴행성 질환인 용도.
  69. 제64항에 있어서, 신경퇴행성 질환이 신경병성 통증을 포함한 말초 신경병인 용도.
  70. i. 제44항에 기재된 바와 같은 벡터의 치료학적 유효량, 또는
    ii. 제45항에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을
    신경계 질환의 치료를 요하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경계 질환의 치료방법.
  71. 제70항에 있어서, 벡터가 근육내, 피하 또는 복강내 투여되는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 벡터 또는 조성물이 통각 전달에 관여하는 신체 부위로 투여되는 방법.
  73. 제70항에 있어서, 벡터 또는 조성물이 수막공간내 또는 척수로 투여되는 방법.
  74. 제70항에 있어서, 벡터가 실질 및 뇌실을 포함한 뇌로 투여되는 방법.
  75. 제70항에 있어서, 벡터가 유리체, 망막밑공간 및 서브테나(sub-tenar) 피막(capsule)을 포함한 안구로 투여되는 방법.
  76. 제70항에 있어서, 신경계 질환이 신경병성 통증을 포함한 말초 신경병, 척수 상해, 척수근 찢김, 틱 돌로록스, 작열통, 각막 상처 및 망막병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  77. 제46항에 기재된 세포의 치료학적 유효량을 신경계 질환의 치료를 요하는 개체에게 이식하는 것을 포함하는, 신경계 질환의 치료방법.
  78. 제77항에 있어서, 이식이 자가 이식체, 동종이계 이식체 또는 이종 이식체를 포함하는 방법.
  79. 제77항에 있어서, 세포가 수막공간내 또는 척수로 투여되는 방법.
  80. 제77항에 있어서, 세포가 실질 및 뇌실을 포함하는 뇌로 투여되는 방법.
  81. 제77항에 있어서, 세포가 유리체, 망막밑공간 및 서브테나 피막을 포함하는 안구로 투여되는 방법.
  82. 제77항에 있어서, 신경계 질환이 신경병성 통증을 포함한 말초 신경병, 척수 상해, 척수근 찢김, 틱 돌로록스, 작열통, 각막 상처 및 망막병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  83. 제56항에 기재된 바와 같은 이식 장치를 신경계 질환의 치료를 요하는 개체에게 이식하는 것을 포함하는, 신경계 질환의 치료방법.
  84. 제77항에 있어서, 이식이 자가 이식체, 동종이계 이식체 또는 이종 이식체를 포함하는 방법.
  85. 제83항에 있어서, 장치가 수막공간내 또는 척수로 투여되는 방법.
  86. 제83항에 있어서, 장치가 실질 및 뇌실을 포함하는 뇌로 투여되는 방법.
  87. 제83항에 있어서, 장치가 유리체, 망막밑공간 및 서브테나 피막을 포함하는 안구로 투여되는 방법.
  88. 제83항에 있어서, 신경계 질환이 신경병성 통증을 포함한 말초 신경병, 척수 상해, 척수근 찢김, 틱 돌로록스, 작열통, 각막 상처 및 망막병증으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  89. 제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 신경병성 통증의 치료를 위해 제44항에 기재된 바와 같은 벡터, 또는 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 세포 조성물, 또는 제56항에 기재된 바와 같은 세포 장치의 치료학적 유효량을 신경병성 통증의 치료를 요하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  90. 시그널 펩타이드 및 뉴블라스틴 폴리펩타이드를 포함하되, 뉴블라스틴 프로 영역은 결실되어 있는 뉴블라스틴 폴리펩타이드.
  91. 제90항에 있어서, 뉴블라스틴 폴리펩타이드가 시그널 펩타이드에 융합된 폴리펩타이드.
  92. 제91항에 있어서, 시그널 펩타이드가 펩타이드 결합에 의해 이의 C-말단을 통해 뉴블라스틴 폴리펩타이드의 N-말단에 결합되는 폴리펩타이드.
  93. 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드가 이종 시그널 펩타이드인 폴리펩타이드.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드가 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같은 시그널 펩타이드인 폴리펩타이드.
  95. 제94항에 있어서, 시그널 펩타이드가 천연 래트 알부민 시그널 펩타이드, 변형된 래트 알부민 시그널 펩타이드 및 사람 성장 호르몬 시그널 펩타이드 중에서 선택되는 시그널 펩타이드의 그룹 중에서 선택되는 폴리펩타이드.
  96. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드가 뉴블라스틴 시그널 펩타이드인 폴리펩타이드.
  97. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드가 IgSP인 폴리펩타이드.
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
JP4571776B2 (ja) * 2002-11-05 2010-10-27 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 潤滑油組成物
CA2522364C (en) 2003-04-18 2014-12-09 Biogen Idec Ma Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
US7261544B2 (en) 2003-05-21 2007-08-28 Genzyme Corporation Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
WO2004108760A2 (en) 2003-06-10 2004-12-16 Nsgene A/S Improved secretion of neublastin
US7598059B2 (en) * 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
US20060239966A1 (en) * 2003-10-20 2006-10-26 Tornoee Jens In vivo gene therapy of parkinson's disease
SI1786454T1 (sl) * 2004-08-19 2010-10-29 Biogen Idec Inc Variante neoblastina
CA2577690C (en) 2004-08-19 2013-08-06 Biogen Idec Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
WO2006122822A2 (en) 2005-05-20 2006-11-23 Lonza Biologics Plc. High-level expression of recombinant antibody in a mammalian host cell
EP1937295A2 (en) * 2005-10-11 2008-07-02 NS Gene A/S Treatment of retinopathies using gfr 3 agonists
WO2007078922A2 (en) * 2005-12-30 2007-07-12 Neurotech Usa Inc. Micronized device for the delivery of biologically active molecules and methods of use thereof
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
US20100056440A1 (en) * 2006-03-01 2010-03-04 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods for administering gdnf ligand family proteins
CA2685686A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-13 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin polypeptides for use increasing vascularization in a tissue
EP2048237A1 (en) 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
ATE535607T1 (de) * 2007-06-29 2011-12-15 Hoffmann La Roche Promotor
WO2009020964A2 (en) * 2007-08-08 2009-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Anti-neublastin antibodies and uses thereof
JP6125751B2 (ja) * 2008-03-21 2017-05-10 ティシュージーン，インク． 椎間板変性症の治療
WO2009146183A1 (en) 2008-04-15 2009-12-03 Genzyme Corporation Methods to produce rod-derived cone viability factor (rdcvf)
US20120021039A1 (en) * 2009-01-23 2012-01-26 Nsgene A/S Expression of neuropeptides in mammalian cells
JP5897335B2 (ja) 2009-01-23 2016-03-30 エヌエスジーン・アクティーゼルスカブＮｓＧｅｎｅ Ａ／Ｓ 改良された細胞株及びカプセル化細胞生体送達におけるその使用
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PT2691530T (pt) 2011-06-10 2018-05-10 Univ Oregon Health & Science Glicoproteínas e vectores recombinantes cmv
EP4154914A1 (en) 2015-05-07 2023-03-29 University of South Florida Modified ube3a gene for a gene therapy approach for angelman syndrome
GB201519086D0 (en) * 2015-10-28 2015-12-09 Syncona Partners Llp Gene Therapy
US20170299608A1 (en) * 2016-03-04 2017-10-19 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating body weight
CN108610398B (zh) * 2018-01-15 2020-08-11 武汉海特生物制药股份有限公司 一段功能序列及在分泌蛋白表达中的应用
EP3749754A4 (en) 2018-02-08 2021-10-20 Applied Stemcell, Inc. PROCEDURE FOR SCREENING VARIANTS OF A TARGET
EP3898940A4 (en) * 2018-12-21 2022-09-28 Gloriana Therapeutics Sarl NEUBLASTIN ANTIBODIES PRODUCED BY MAMMALIAN CELL CULTURE

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
AU6131086A (en) 1985-07-05 1987-01-30 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
WO1989002468A1 (en) 1987-09-11 1989-03-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
US5156844A (en) 1987-11-17 1992-10-20 Brown University Research Foundation Neurological therapy system
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5487739A (en) 1987-11-17 1996-01-30 Brown University Research Foundation Implantable therapy systems and methods
JP2791418B2 (ja) * 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
DE3829752A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
DE3829766A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
IL95330A0 (en) * 1989-08-11 1991-06-30 Lilly Co Eli Expression of a functional insect specific toxin gene in mammalian cells
DK0585368T3 (da) 1991-04-25 1998-03-16 Univ Brown Res Found Implanterbart biokompatibelt immunisolatorisk vehikel til afgivelse af udvalgte terapeutiske produkter
CA2119463C (en) 1991-09-20 2003-09-16 Leu-Fen H. Lin Glial cell line-derived neutrophic factor
US5512600A (en) 1993-01-15 1996-04-30 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of bonded fiber structures for cell implantation
EP0708670A4 (en) 1993-06-23 1998-07-01 Cytotherapeutics Inc METHOD AND APPARATUS FOR HERMETICALLY CLOSING IMPLANTABLE MEMBRANE ENCAPSULATING DEVICES
DK0802800T3 (da) 1993-08-12 2002-10-07 Neurotech Sa Biokompatible immunoisolatoriske kapsler indeholdende genetisk ændrede celler for levering af biologisk aktive molekyler
AU710504B2 (en) 1994-03-15 1999-09-23 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
US5550050A (en) 1994-04-15 1996-08-27 Cytotherapeutics, Inc. Method for implanting encapsulated cells in a host
US5656465A (en) 1994-05-04 1997-08-12 Therion Biologics Corporation Methods of in vivo gene delivery
US5677158A (en) 1995-06-07 1997-10-14 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5739307A (en) 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US5904144A (en) 1996-03-22 1999-05-18 Cytotherapeutics, Inc. Method for treating ophthalmic diseases
US6027721A (en) 1996-05-20 2000-02-22 Cytotherapeutics, Inc. Device and method for encapsulated gene therapy
US6054142A (en) 1996-08-01 2000-04-25 Cyto Therapeutics, Inc. Biocompatible devices with foam scaffolds
US6136597A (en) 1997-09-18 2000-10-24 The Salk Institute For Biological Studies RNA export element
EP1053002A1 (en) * 1998-02-10 2000-11-22 Oregon Health Sciences University Treatment of bony defects with osteoblast precursor cells
US6303136B1 (en) 1998-04-13 2001-10-16 Neurotech S.A. Cells or tissue attached to a non-degradable filamentous matrix encapsulated by a semi-permeable membrane
US6683058B1 (en) 1998-04-15 2004-01-27 Regents Of The University Of California Methods for therapy of neurodegenerative disease of the brain
DE69940899D1 (de) 1998-05-27 2009-06-25 Genzyme Corp AAV Vektoren zur Herstellung der Medikamente zur konvektion-erhöhten Verabreichung
US20020055467A1 (en) * 1998-07-06 2002-05-09 Johansen Teit E. Novel neurotrophic factors
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
PL209952B1 (pl) 1998-07-14 2011-11-30 Janssen Pharmaceutica Nv Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, wyizolowany ludzki neurotroficzny czynnik wzrostu, plazmid, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, zastosowania cząsteczki kwasu nukleinowego, zastosowania neurotroficznego czynnika wzrostu, kompozycje faramaceutyczne, przeciwciało oraz sposób wykrywania neurotroficznego czynnika wzrostu
US6284540B1 (en) 1998-09-29 2001-09-04 Washington University Artemin, a novel neurotrophic factor
IL126562A0 (en) * 1998-10-14 1999-08-17 Interpharm Lab Ltd Expression and secretion of icil-1 receptor antagonist type ii
US6361741B1 (en) 1999-02-01 2002-03-26 Alcoa Inc. Brazeable 6XXX alloy with B-rated or better machinability
US6420345B1 (en) * 1999-03-01 2002-07-16 Cell Genesys, Inc. Methods and reagents for inhibiting angiogenesis
US6361771B1 (en) 1999-04-06 2002-03-26 Neurotech S.A. ARPE-19 as a platform cell line for encapsulated cell-based delivery
DK1223966T3 (da) 1999-10-29 2003-08-18 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Anvendelse af GDNF til behandling af hornhindedefekter
US6866851B1 (en) 1999-12-28 2005-03-15 Washington University GFRα1-RET specific agonists and methods therefor
EP1301214A2 (en) 2000-05-26 2003-04-16 Chiron Corporation Methods of transducing neural cells using lentivirus vectors
GB0018876D0 (en) * 2000-08-01 2000-09-20 Applied Research Systems Method of producing polypeptides
NZ526610A (en) * 2000-12-22 2009-08-28 Genentech Inc New use of artemin, a member of the GDNF ligand family
WO2002060929A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 Biogen, Inc. Polymer conjugates of neublastin and methods of using same
AU2002250203B2 (en) * 2001-03-28 2006-08-10 Biogen Ma Inc. Use of neublastin polypeptides for treating neuropathic pain
CA2522364C (en) 2003-04-18 2014-12-09 Biogen Idec Ma Inc. Polymer-conjugated glycosylated neublastin
WO2004108760A2 (en) 2003-06-10 2004-12-16 Nsgene A/S Improved secretion of neublastin
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
NZ547185A (en) 2003-10-20 2009-03-31 Nsgene As In vivo gene therapy of parkinson's disease

Also Published As

Publication number Publication date
EP1636260B1 (en) 2009-02-18
NZ544263A (en) 2009-04-30
WO2004108760A3 (en) 2005-04-07
JP5623685B2 (ja) 2014-11-12
CN1835971A (zh) 2006-09-20
ATE478092T1 (de) 2010-09-15
IL172270A (en) 2015-04-30
AU2004245175C1 (en) 2010-03-18
WO2004108760A2 (en) 2004-12-16
EP2058329A1 (en) 2009-05-13
EP1636260A2 (en) 2006-03-22
CA2527914A1 (en) 2004-12-16
DK1636260T3 (da) 2009-06-22
HK1082752A1 (en) 2006-06-16
ES2353457T3 (es) 2011-03-02
DE602004019524D1 (de) 2009-04-02
AU2004245175A1 (en) 2004-12-16
BRPI0411243A (pt) 2006-07-11
ATE423134T1 (de) 2009-03-15
AU2004245175B2 (en) 2009-10-15
CA2527914C (en) 2014-10-28
IL172270A0 (en) 2006-04-10
DE602004028769D1 (de) 2010-09-30
US7601518B2 (en) 2009-10-13
RU2005138368A (ru) 2006-07-27
ES2323066T3 (es) 2009-07-06
CN100475846C (zh) 2009-04-08
EP2058329B1 (en) 2010-08-18
US20050089960A1 (en) 2005-04-28
DK2058329T3 (da) 2010-12-06
JP2007535898A (ja) 2007-12-13

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