JP2007535898A - ニューブラスチンの改良された分泌 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法および組成物、ならびに、例えば、遺伝子治療による、中枢神経系および眼を含む神経系の特定の領域へのニューブラスチンの局所的送達に関する。本発明は、半透性の膜を有するマクロカプセルにカプセル化された、形質転換またはトランスフェクトされた細胞からのニューブラスチンの送達を含む。本発明はさらに、増加量のニューブラスチンを産生することが可能である哺乳動物細胞に関する。
細胞は、デノボ合成されるタンパク質を種々の細胞内の小器官および細胞外空間に方向付けるための方法を有する。シグナルペプチドは、染色体DNAのコード部分に封入されており、リボソーム装置によってタンパク質の一部として合成される。シグナルペプチドはN末端を形成し、新規に合成されたポリペプチドを粗面小胞体に方向付ける。ここでシグナルペプチドはポリペプチドから切断され、成熟タンパク質が周囲に分泌される。従って、シグナルペプチドは細胞内部に残る。
本発明は、生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法に関し、上記方法は、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸を含む発現ベクターを含む細胞を培養する工程を包含し、ここで上記ヌクレオチド配列はニューブラスチンプロ領域をコードしていない。
i.そこからの神経栄養因子の分散を可能にする半透性膜;および
ii.本発明に従う少なくとも1つの単離された宿主細胞。
治療有効量の本発明に従うベクター;または
このベクターを含む治療有効量の薬学的組成物
をその必要がある個体に投与する工程を包含する。
−本発明の形質転換された細胞の治療有効量;または
−本発明に従う移植可能デバイス
をその必要がある個体に移植する工程を包含する。
「C末端アミノ酸」とは、本明細書で使用される場合、ポリペプチドのアミノ(N)末端から最も遠位のポリペプチド鎖中の一連のアミノ酸を意味する。
本発明は、ニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法に関し、ここで、ニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はプロ領域をコードしない。本発明の状況において、プロ領域は、配列番号10、11、または12の少なくともアミノ酸−41から−11を含む。より好ましくは、このプロ領域は、配列番号10、11、または12の少なくともアミノ酸−41から−1を含む。より好ましくは、このプロ領域は、配列番号10、11、または12の少なくともアミノ酸−41から10を含み、最も好ましくは、これは、配列番号10のアミノ酸−41から27、または配列番号11もしくは配列番号12のアミノ酸−41から31に対応する配列のプロドメインを含む。
本発明に従う発現ベクターは、ニューブラスチンポリペプチドに作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の方向付けを可能にするプロモーター配列を含む核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞を培養することが可能である、プロモーター配列を含む核酸を含み、ここで、このヌクレオチド配列はニューブラスチンポリペプチドのプロ領域をコードしない。
ニューブラスチンポリペプチドは、神経細胞および組織の生存を促進、その表現型分化を維持、変性を予防、再生を促進、ならびに活性を回復するタンパク質である。ニューブラスチンは(最初に記載された、例えば、WO 00/01815において)、代替的に、「アーテミン(artemin)」(例えば、WO 00/18799)および「エノビン(enovin)」(例えば、WO 00/04050)と呼ばれている。
配列番号10の−−AA−80−AA140(「野生型」ヒトプレプロ)、
配列番号11の−−AA−80−AA144(マウスプレプロ)、
配列番号12の−−AA−80−AA144(ラットプレプロ)。
配列番号10の−−AA1−AA140(成熟140AA;本明細書中以後「140NBN」)、
配列番号10の−−AA25−AA140(成熟116AA;本明細書中以後「116NBN」)、
配列番号10の−−AA28−AA140(成熟113AA(配列番号14);本明細書中以後「113NBN」)、
配列番号11の−−AA1−AA144(マウス成熟144AA)、
配列番号12の−−AA1−AA144(ラット成熟−−144AA)、
配列番号10の−−AA107−AA140、より好ましくは、配列番号10のAA76−AA140に記載され、かつGDNFファミリーおよびTGFβスーパーファミリーに特徴的な7個のCys残基を保持しているC末端配列を有するペプチド。
(i)成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端112アミノ酸を有する、本明細書でNBN112と称される112AAポリペプチド配列(例えば、配列番号10のアミノ酸29〜140)。
(シグナルペプチドの切断)
発現構築物に取り込むための特定のニューブラスチン型について決定する前に、シグナルペプチド、例えば、Igspの切断の可能性が、最先端の予測ツールを使用してチェックされ得る。1つのこのような好ましい予測ツールは、シグナルP WWWサーバー(http://www.cbs.dtu.dk/services/シグナルP−2.0/)において入手可能なシグナルPソフトウェアであり、より好ましくは、より新しいバージョン3.0が同じサーバーから入手可能である(http://www.cbs.dtu.dk/services/シグナルP−3.0/)。
ネットワークからの出力スコアは切断部位対他の配列位置を認識するように指向されている。以下のように指向されている:
ハイ +1位(切断部位の直後)
ロー すべての他の位置。
ネットワークからの出力スコアはシグナルペプチド対非シグナルペプチド位置を認識するように指向されている。以下のように指向されている:
ハイ 切断部位の前のすべての位置
ロー 切断部位の後30位 および
非分泌タンパク質のN末端。
切断部位の位置の予測は、C−スコアが高く、かつS−スコアがハイ値からロー値までの変化する箇所を観察することによって最適化される。Y−スコアは、S−スコアの傾きと、C−スコアの高さを組み合わせることによってこれを定式化する。具体的には、Y−スコアは、C−スコアと、S−スコアの平滑化された派生値との間の相乗平均である(すなわち、現在の位置の前のd位置および後のd位置にわたる平均S−スコア間の違いであり、ここで、dは選択されたネットワークアンサンブルとともに変化する)。
1つの局面において、本発明は、神経系障害の治療のための医薬の調製のための本発明に従うベクターの使用に関する。この神経系障害は、末梢神経系または中枢神経系の障害であり得る。
i.本発明に従う形質転換もしくはトランスフェクトされた細胞の治療有効量;または
ii.形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む移植可能デバイス
を移植することによって治療され得る。
重要なパラメーターは適切な標的組織の選択である。脳の領域は、神経栄養因子に対するその保持された応答性について選択される。領域の標的化は、本明細書に記載されるような遺伝子治療ベクターの投薬量単位を送達することによって、または本発明に従う裸の細胞もしくはカプセル化された細胞を移植することによって達成され得る。
さらなる重要なパラメーターは、標的組織に送達されるニューブラスチンの投薬量である。この点に関して、「単位投薬量」とは、一般的に、ニューブラスチン組成物のニューブラスチン/mlの濃度をいう。ウイルスベクターについては、ニューブラスチン濃度は、神経栄養組成物のウイルス粒子の数/mlによって規定される。最適には、ウイルス発現ベクターを使用するニューブラスチンの送達のためには、ニューブラスチンの各単位投薬量は、2.5〜25μLのニューブラスチン組成物を含み、ここで、この組成物は、ウイルス発現ベクターを薬学的に受容可能な液体中に含み、ニューブラスチン組成物のmlあたり1010から1015までのニューブラスチン含有ウイルス粒子を提供する。このような高い力価は特にアデノ関連ウイルスのために使用される。レンチウイルスについては、力価は通常より低く、例えば、108から1010形質転換単位/ml(TU/ml)であり、実施例2に記載されるように決定される。
広範に、遺伝子治療は、患者への治療的利益を生じることを伴って、患者の細胞に新たな遺伝子物質を移動させることを探求する。このような利益には、広い範囲の疾患、障害、および他の状態の治療または予防が含まれる。
発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結された1つ以上の調節配列を含み得る。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。このような調節配列は、例えば、Goeddel、1990 Methods Enzymol.185:3に記載されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの(例えば、組織特異的調節配列)が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存することが当業者によって理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それによってタンパク質またはペプチドを産生する。
本発明における使用のためにニューブラスチン組成物を形成するために、ニューブラスチンをコードする発現ウイルスベクターが、薬学的に受容可能な懸濁物、溶液、または乳化物に配置される。適切な媒体には、生理食塩水およびリポソーム調製物が含まれる。
本発明者らによって規定されたプロトコールに従って、ニューブラスチン組成物の直接送達が、当業者がよく知っている手段(外科的切開を通してのマイクロインジェクション(例えば、Capecchi、Cell、22:479−488(1980)を参照のこと);エレクトロポレーション(例えば、AndreasonおよびEvans、Biotechniques、6:650−660(1988)を参照のこと);注入、標的化分子または共沈殿物(例えば、リポソーム、カルシウム)との化学複合体化、および標的組織の微粒子ボンバードメント(Tangら、Nature、356:152−154(1992))を含む)によって達成され得る。
カプセル化細胞治療は、宿主内での移植の前に、半透性の生体適合性物質で細胞を取り囲むことにより、レシピエント宿主の免疫系から細胞を単離するという概念に基づく。本発明は、細胞が免疫単離カプセル中にカプセル化されているデバイスを含む。「免疫単離カプセル」とは、カプセルが、レシピエント宿主への移植に際して、デバイスのコアにおける細胞上の宿主の免疫系の有害な効果を最小化することを意味する。細胞は、微小孔膜によって形成された移植可能なポリマー性カプセル中にそれらを封入することによって、宿主から免疫単離される。このアプローチは、宿主と移植された組織との間の細胞対細胞接触を妨害し、直接的提示を通しての抗原認識を除去する。使用される膜はまた、それらの分子量に基づいて、抗体および補体などの分子の拡散を制御するように調整され得る(Lysaghtら、56 J.Cell Biochem.196(1996)、Colton、14 Trends Biotechnol.158(1996))。カプセル化技術を使用して、細胞は、免疫抑制剤の使用を伴って、または伴わずにのいずれかで、宿主に免疫拒絶なしで移植され得る。有用な生体適合性ポリマーカプセルは通常、液体媒体中に懸濁されたか、または固定化マトリックス内に固定化されたかのいずれかである細胞を含むコア、ならびに、単離された細胞を含まず、生体適合性であり、および有害な免疫学的攻撃からコア中の細胞を保護するために十分である、選択透過性のマトリックスまたは膜の周囲または末梢領域(「ジャケット」)を含む。カプセル化は、免疫系のエレメントがカプセルに入ることを妨害し、それによってカプセル化細胞を免疫破壊から保護する。カプセル膜の半透性性質はまた、目的の生物学的に活性な分子がカプセルから周囲の宿主組織に容易に拡散することを可能にする。
本発明の核酸構築物は、ニューブラスチンポリペプチドを産生するために使用され得る。真核生物細胞が、異種シグナル配列に作動可能に連結された組換えニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸構築物でトランスフェクトされ得る。核酸構築物を作製する方法、およびその構築物で細胞にトランスフェクトする方法は当該分野で公知である(例えば、Ausubelら編、1988、Current Protocols in Molecular Biology、Gneene Publishing Associates & Wiley−Interscience:New York;Sambrookら、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,NYを参照のこと)。例えば、細胞は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはウイルスベクターを用いる感染を使用してトランスフェクトされ得る。ある実施形態において、形質転換された宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、またはNIH3T3細胞である。
別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞、例えば、500ng/106細胞/24時間を超える量で、より好ましくは600ng/106細胞/24時間、より好ましくは700ng/106細胞/24時間を超える量で、より好ましくは800ng/106細胞/24時間を超える量で、より好ましくは900ng/106細胞/24時間を超える量で、例えば、1000ng/106細胞/24時間を超える量で、ニューブラスチンポリペプチドを分泌することが可能である、上記に規定した細胞に関する。
本発明はさらに、哺乳動物神経系への移植の前に、支持体マトリックス上でインビトロでニューブラスチン産生細胞を培養する工程をさらに包含する。移植の前のマイクロキャリアへの細胞の事前の接着は、移植細胞の長期的な生存度を増強するため、および長期的な機能的利点を提供するために設計される。
本発明はさらに、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドを含むニューブラスチンポリペプチドに関し、ここで、このポリペプチドはニューブラスチンプロ領域、例えば、シグナルペプチドに融合されたニューブラスチンポリペプチドを欠く。特に、シグナルペプチドは、そのC末端から、ペプチド結合を通して、ニューブラスチンポリペプチドのN末端に連結される。シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドは、上記に規定した通りである。
(IgSP−NBN構築物の構築)
IgSP.NBNを重複PCRによって生成した。第1の増幅工程において、NBNの成熟フラグメントを、pUbi1z.NBN.BamHIベクターから、プライマー
ARPE−19は、10%ウシ胎仔血清(Sigma−Aldrich,Denmark)を補充した、Glutamax(Invitrogen,Denmark)を有するDMEM/栄養ミックス中F−12で、37℃、5%CO2でヒト網膜色素上皮細胞株(Dunnら、1996)を増殖させる。細胞を、1週間にほぼ2回、トリプシン処理および再播種(1:5スプリット比率)によって継代した。細胞を6ウェルプレート(Corning Costar,Biotech Line,Denmark)に、トランスフェクト研究のために105細胞/ウェルで播種した。翌日、細胞を、Fugene6(Roche,Germany)を製造業者の指示書に従って使用して、2連のウェル中で3μgプラスミド/ウェルでトランスフェクトした。トランスフェクト3日後に収集される細胞上清中に存在するNBN活性を、RetL3 ELISAにおいてアッセイした。
RetL3 ELISAは、NBN特異的GFRα3レセプターに結合するNBNの複合体へのRet−AP結合体の結合を検出する。このアッセイは、機能的に活性であるNBN分子を検出するのみである。手短に述べると、96ウェルプレート(B&W Isoplate HB,Perkin Elmer,Denmark)を、50mM NaHCO3(pH=9.6)中の100μl 1μg/mlヤギ抗ヒトFc(Jackson Immunoresearch Laboratories,TriChem,Denmark)で、16時間、4℃でコートした。PBS/0.05% Tween20(PBST)中の洗浄後、ウェルを、PBST中の0.2% I−Block(Tropix,Applied Biosystems,Dennmark)中で、1時間、室温でブロックし、続いて手短にPBST中で洗浄した。細胞上清または組換えマウスArtemin(R&D systems,UK)をDMEM/10% FCS中で希釈し、続いてウェル中で、1.5時間、室温にて、RET−AP馴化培地(Biogen,USA)中の1μg/ml GFRα3/Fc融合タンパク質(R&D systems,UK)とインキュベートした。次いで、ウェルを、PBST中で最初に洗浄し、次いで、AP−緩衝液(200mM Tris(pH=9.8)、10mM MgCl2)で洗浄し、続いてAP−緩衝液中の10%Sapphire Enhancer(Tropix,Applied Biosystems,Denmark)および2% CSPD(Tropix,Applied Biosystems,Denmark)とともに30分間のインキュベーションを行った。発光を、Microbeta Trilux Counter(Perkin Elmer,Denmark)を使用することによって決定した。
25.3〜33.8ng/mlのNBN活性を、RetL3 ELISAを使用することによって、pNS1n−IgSP.NBN構築物で一過性にトランスフェクトしたARPE−19細胞から収集した上清中で検出した。対照的に、約5倍低いNBN活性(4.4〜6.4ng/ml)を、同じ実験に含まれた野生型(プレプロ)NBN発現構築物(pUbi1z.hNBN)で一過性にトランスフェクトしたARPE−19細胞中で検出する。非常に低いかまたは検出不可能であるNBN活性を、EGFP発現構築物(pNS1z−EGFP)で一過性にトランスフェクトしたARPE−19の細胞上清中で検出し、アッセイの特異性を確認した。
(レンチウイルスIgSP−NBN構築物およびウイルスストックの生成)
レンチウイルス構築物を生成するために、pNS1n−IgSP−NBNを、BamHI−XhoIおよびIgSP−hNBN PCRフラグメントで消化し(実施例1において記載されるように)、BamHI/XhoI消化したpHsCXWにライゲートし、pHsCXW.IgSP.NBNwを生じた(図3)。pHsCXWは自己不活性化レンチウイルス導入構築物、pHR’−SIN−18の誘導体であり、導入構築物の大きな非ウイルス部分をpUC19骨格で置き換えることによって生成したWPREエレメントを含む(Dullら、J.Virol.72(11):8463−71(1998);Zuffereyら、J.Virol.72(12):9873−80(1998):Zuffereyら、J.Virol.,73(4):2886−92(1999))。pHsCXWの配列は、GenGank ID:AY468486を通してアクセス可能である。
ARPE−19細胞を、NBN発現ベクターを用いて形質転換した。手短に述べると、細胞を6ウェルプレート(Corning Coastar,Biotech line,Denmark)に、105細胞/ウェルで播種した。翌日、2×105TUのウイルスを、好ましくウェルに(2連で)、5μg/ml ポリブレンとともに4時間加えた。培地を交換し、培養物を3日間インキュベートした。次いで、細胞上清を、実施例2に記載されるように、RetL3 ELISAのために収集した。
39ng/mlのNBN活性を、LV−sC.IgSP.NBN.Wウイルスで形質転換したARPE−19細胞から収集された上清中のRetL3 ELISAを使用することによって検出した。対照的に、非常に低いか、または検出不可能なNBN活性を、野生型(プレプロ)NBN cDNA(LV−sC−NBN.W)またはコントロールEGFPレンチウイルス(LV−sCEW)を含むレンチウイルスで形質転換されたARPE−19細胞中で検出した。
(細胞上清のウェスタンブロット分析)
トランスフェクトまたは形質転換された細胞培養物からの細胞上清中に存在するNBNを、ウェスタンブロット分析の前に、GFRα3−Igへのアフィニティー結合によって濃縮した。手短に述べると、Nunc MaxiSorpプレートの4ウェルを、50mM NaHCO3(pH=9.6)中の300μlのヤギ抗ヒトFc 1μg/ml(Jackson Immunoresearch Laboratories,TriChem,Denmark)で、4℃で16時間コートした。ウェルを、PBS中の400μlの1% BSAで室温で1時間ブロックし、続いてPBST中で3回洗浄した。次いで、300μl/ウェル GFRα3/Fc融合タンパク質 1μg/ml(R&D Systems,UK)を加え、プレートを、結合を最大化するために室温で1時間インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、PBST中で3回洗浄した。次いで、トランスフェクトまたは形質転換された細胞培養物から収集した300μlの上清を4ウェルの各々に加え、少なくとも3時間、穏やかに攪拌しながら室温でインキュベートした。次いで、ウェルを、PBST中で2回洗浄した。20μlの非還元サンプル緩衝液(2% SDS、0.4M Tris (ph=8.0))を第1のウェルに加え、プレートを迅速に5分間振盪して、結合したタンパク質を溶離した。内容物を次のウェルに移し、手順を反復して結合したタンパク質を残りのウェルに溶離した。10mMまでのDTTの付加後、サンプルを96℃で5分間加熱し、MultiPhorIIシステムを、製造業者(Amersham Pharmacia,Denmark)の指示書に従って使用して、15%ポリアクリルアミドゲル上のSDS PAGEによって分析した。タンパク質をPVDFメンブレン(BioRad,Denmark)にブロットし、これを、検出抗体としてウサギポリクローナル抗NBN抗体(#378)を使用して免疫染色した。メンブレンをECL+システム(Amersham Pharmacia,Denmark)を使用して発色させ、フィルム露光に供した。
#378は、NBN由来ペプチド(ALRPPPGSRPVSQPC)に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体である。図5パネル(a)において見られるように、7.2kDaと18.5kDaの間の分子量の単一バンドが、モノマー性非グリコシル化NBN113に対応するE.coli中で産生された精製ラット組換えNBNを含む還元(+DTT)サンプルにおいて認識された。いくつかの付加的なバンドに加えて、同じ分子量のバンドが、野生型(プレプロ)NBNを用いるトランスフェクトによって樹立された安定なCHO−NBNクローンからの還元サンプルにおいて認識される。これらのバンドの多くの同一性が、脱グリコシル化およびN末端配列決定を使用して以前の研究において決定されている。わずかにより低い分子量を有するバンドは、成熟NBNのより小さくかつ非グリコシル化のバージョン(NBN104)を表す。さらに、約21kDaの見かけの分子量を有する非常に広範なバンドは、NBN113およびNBN104のグリコシル化バージョンを表す。より高い分子量のバンドは、GFRα3−アフィニティー精製サンプル中で偶然見られた(グリコシル化)プロNBNを表す。
(IgSP−NBN−構築物中に存在するヌクレオチド配列)
予測:シグナルペプチド
シグナルペプチド確率:0.999
シグナルアンカー確率:0.000
最大切断部位確率:19位と20位の間で0.660
neural netwarks(NN)およびhidden Markovモデル(HMM)を使用して真核生物に方向付けた。
Igspが種々の長さのニューブラスチンポリペプチドに融合されるときに、切断部位の予測は、上記に同定されるシグナルPプログラム2.0を使用して以下に示される。
δプロNBN(配列番号82)は、3段階の増幅工程で重複PCRによって生成した:1)成熟NBNに対する5’BamHI/Kozak突出および10塩基の3’重複を有するプレプロNBNの比較的長い117bpリーダー配列(すなわち、39a.a.シグナルペプチド)(143bp);2)5’10塩基NBNリーダー配列重複および3’XhoIを有する成熟NBN(362bp);3)工程1)および2)の生成物をPCR反応において合わせ、これがδプロNBNを生成した。
使用したプライマー:
PCR条件:
94℃ 3分間
94℃ 30秒間
55℃ 30秒間 35サイクル
72℃ 1分間
72℃ 5分間。
使用したプライマー:
PCR条件:
94℃ 3分間
94℃ 30秒間
65℃ 30秒間 35サイクル
72℃ 1分間
72℃ 5分間。
使用したプライマー:
野生型プレプロNBN、δプロNBN、およびIgSP−NBNを含む、異なるNBN構築物を用いる一過性トランスフェクト後のNBNの分泌を比較した。一過性トランスフェクトを、ARPE−19、HEK293、CHO、およびHiB5細胞中で実行した。
ARPE−19細胞を実施例1に記載されるように培養した。HiB5(Renfranzら、1991)、HEK293、およびCHO細胞を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen,Denmark)を有するDMEM(Invitrogen,Denmark)中で増殖させた。CHO細胞のための培地は、20mg/l L−プロリンをさらに補充した。ARPE−19、HEK293、およびCHO細胞を37℃にて、HiB5細胞を33℃にて、5%CO2中で培養した。細胞をほぼ週に2回、トリプシン処理および再播種によって継代した(1:5スプリット比率)。
細胞を、約105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレート(Corning Costar,Biotech Line,Denmark)中に播種した。翌日、細胞をpHsC.hNBN.W、pHsC.IgSP.hNBN.W、およびpHs.δプロhNBN.Wでそれぞれトランスフェクトした。ARPE−19細胞を、実施例1に示されるように、Fugene6を使用して3連のウェル中にトランスフェクトするのに対して、他の3種の細胞株は、製造業者の指示書に従って、Lipofectamine Plus(Invitrogen,Denmark)を使用して3連のウェル中で、2μgプラスミド/ウェルを使用してトランスフェクトした。翌日、新鮮な増殖培地をウェルに加え、細胞をさらに24時間、馴化培地を収集する前にインキュベートした。十分なトランスフェクト効率を、pHsC.EGFP.Wと並行してトランスフェクトしたウェル中のEGFP発現の評価によって保証した。馴化培地中のNBN結合活性を、実施例1に記載されるように、RetL3 ELISAを使用して測定した。RetL3 ELISAは,NBN特異的GFRα3レセプターに結合するNBNの複合体へのRet−AP結合体の結合を検出する。値は、ng NBN/ml/24時間およびng NBN/105細胞/24時間として計算し、1に設定された野生型NBN構築物を用いてトランスフェクトされた細胞からの値を用いて、相対的NBN放出に調節した。図8におけるデータは、これらの3つの計算を表し、平均±SEM(n=3)として表現される。パネルAにおいて、*は、野生型NBN構築物を用いてトランスフェクトされた細胞からの有意な差を意味する(p<0.05、片側ANOVA、Fisher LSD法)。
以下の表および図8Aに示されるように、4つの試験された細胞株は、野生型NBN構築物と比較すると、δプロNBN構築物を使用したときにNBN放出の増加を示した(細胞株に依存して、9〜17倍高いNBN放出)。pHsC.IgSP.hNBN構築物を用いて4つの細胞株にトランスフェクトした場合には、NBN分泌はさらに増強された(野生型NBNと比較して、28〜91倍高いNBN放出)。非常に低いかまたは検出不可能なNBN活性が、EGFP発現構築物(pHs.C.EGFP.W)を用いて一過性にトランスフェクトされたARPE−19からの細胞上清において観察され、このアッセイの特異性を確証した。
バージョン3.0を使用する、シグナルペプチドについての位置の予測。予測は、以下の配列のδプロNBNおよびIgSP−NBN上で実行された。
CHO細胞中のヒトニューブラスチンの発現を最適化するために、ネイティブニューブラスチン遺伝子の配列を、コドン使用頻度について調べた。CHO細胞中で最も共通して使用されているコドンを、2002年までの現在のデータに基づいて、当該分野で公知の方法(Nakamuraら、1999、Nucleic Acids Res.27(1:292))を使用して分析した。依存しているCricetulus griseusについてのコドン使用頻度は、以下の表において提示される。
ニューブラスチンの5’コドンに連結された種々のシグナルペプチド配列の挿入を容易にするために、ニューブラスチン遺伝子の100コドン(300ヌクレオチド)3’型を合成し、そして発現プラスミドにクローニングした。100コドン型ニューブラスチン遺伝子は、Deep Ventポリメラーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)を含む200μL緩衝液(10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、20mM Tris−Cl、2mM MgSO4、0.1% Triton X−100、pH 8.8)中で、KD3−464からKD3−469(表2)のオリゴヌクレオチド40pmolまでを合わせることによってアセンブルした。内容物を95℃で4分間加熱し、以下のサイクル、すなわち95℃1分間、60℃30秒間、および72℃1分間を20サイクル行い、その後72℃で4分間伸長を行った。末端を、SalIおよびNheIを用いる連続的消化によって調製した。ニューブラスチン遺伝子に隣接する30塩基対の非コード領域を含む330塩基対フラグメントを、ゲル精製し、そしてゲル精製されかつNheIおよびXhoIで消化されているプラスミドpFRT/dhfr−1(ハイグロマイシン遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子で置換されているpcDNA/FRT(Invitrogen,Carlsbad,CA)の誘導体)にライゲートした。得られるプラスミドをpNBN026−35と名付けた。pNBN026−35中のニューブラスチン配列を図10に示す。
4種の異なるシグナルペプチドをコードする配列を試験した。これらには、ニューブラスチン、ラットアルブミン、およびヒト成長ホルモンからのシグナル配列が含まれた。さらに、合成シグナル配列が、ニューブラスチンシグナルペプチドを生成するためのPCR増幅の間の2つのフレームシフト変異から生じた。融合物は、オリゴヌクレオチドアセンブリーまたはPCRのいずれかを使用して合成した。DNAフラグメントは、pNBN026にライゲートした。記載される4種の分子の各々の関連するDNA配列を、DNA配列分析によって確認した。
CHO−DG44細胞を、事前にFlp組換え標的(frt)を含むDNA配列で形質転換した(A1細胞)。このA1宿主細胞はジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子(DHFR)を含まず、従って、DHFRマイナスである。記載されるプラスミドの各々はDHFR遺伝子、ニューブラスチン融合遺伝子、およびfrt部位をコードする。プラスミドpOG44はFlpリコンビナーゼ遺伝子をコードする。これらのプラスミドのA1細胞への同時トランスフェクトは、染色体へのシグナルペプチド−ニューブラスチン融合遺伝子およびDHFRの単一コピーの挿入を生じた。A1細胞を、製造業者によって記載されるものと一致する条件下で(すなわち、0.4mmキュベット、280ボルト、950マイクロファラッド)(BioRad,Hercules,California)目的のプラスミドおよびプラスミドpOG44でエレクトロポレーションを行った。DHFRを発現する形質転換した細胞を、10%透析胎仔ウシ血清(Hyclone,Logan,UT)を補充した、ヌクレオシドを含まないα−マイナス培地最小必須培地−α(Invitrogen,Carlsbad,CA)中でのそれらの増殖能力について選択した。約2週間後、コロニーを単離し、同じ選択培地中でより大きなベッセルに拡大した。細胞培養を無血清培地に移行し、分析した。
細胞株候補を、ニューブラスチンを発現するそれらの能力についてスクリーニングした。懸濁細胞培養のアリコートを遠心分離して、馴化培地から細胞を分離した。馴化培地を細胞ペレットから取り出し、培地および細胞ペレットの両方を、一般的に記載されるような(Ausubelら、前出)、16%ポリアクリルアミド上での還元および変性電気泳動のために処理した。電気泳動の完了の際、タンパク質をPVDFメンブレンにエレクトロブロッティングし、ニューブラスチンに対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清を用いてプローブした。この抗体−ニューブラスチン複合体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(BioRad,Hercules,California)と結合体化されたヤギ抗ウサギポリクローナル抗血清を使用して検出した。
ニューブラスチンを、一般的に記載されるように(Ausubelら、前出)、免疫アフィニティーカラムを使用して馴化培地から精製した。アミノ末端配列を、アルブミンシグナルペプチドおよび成長ホルモンシグナルペプチドを含む細胞株から精製したタンパク質から決定した。ニューブラスチンをマイクロTFAフィルター(Applied Biosystems,Foster City,CA)に適用し、自動化エドマン分解化学反応に供した。アミノ末端配列決定を、ABI Procise 494シークエンサー上で実行した。得られるPTHアミノ酸を、PTHC18逆相カラムを備えたABI 140C Microgradientシステムを使用して分離し、ABI 7785A吸収検出器を使用して分析した。両方の構築物について、一次タンパク質配列は、全長ニューブラスチンの104アミノ酸C末端フラグメントの最初の残基(すなわち、アラニン)で開始した。成長ホルモンシグナルペプチドとともに発現されたニューブラスチン調製物もまた、アミノ末端アラニン残基を欠く、103アミノ酸ニューブラスチンC末端フラグメントを含んだ。ニューブラスチンの103アミノ酸型は、アラニンで開始した。両方の場合において、シグナルペプチドは予想されたように機能した。すなわち、ニューブラスチンポリペプチドは細胞から分泌され、そしてシグナルペプチドが細胞によって切断された。
アルブミンシグナルペプチドおよび成長ホルモンシグナルペプチドをコードする構築物を含む細胞株の馴化培地からの精製したニューブラスチンを、ZMD質量分析装置(Waters,Milford,MA)上のインタクト質量スペクトル分析によって、一般的に製造業者によって記載されているように分析した。両方の構築物について、脱グリコシル化サンプルの主要なピークは104アミノ酸ニューブラスチンポリペプチドに対応した(図15)。これらの2つのシグナルペプチドは予想されたように機能した。すなわち、ニューブラスチンポリペプチドは細胞から分泌され、そしてシグナルペプチドが細胞によって切断された。さらに、グリコシル化ニューブラスチンは、ニューブラスチンをコードする構築物でトランスフェクトされた細胞から分泌され、そして成長ホルモンシグナルペプチドは種々の糖型を含んだ。
生物学的活性を、キナーゼレセプター活性化ELISA(KIRA)を使用して評価した。この方法は以前に記載されている(Sadickら、1996、Anal.Biochem.1996.235(2):207)。手短に述べると、NB41A3−mRL3細胞、RetおよびGFRα3を発現する接着性マウス神経芽腫細胞株を、10%ウシ胎仔血清で補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中、24ウェルプレートのウェルあたり2×105細胞でプレートし、18時間、37℃および5%CO2下で培養した。
適切なオリゴヌクレオチドが、成熟ニューブラスチン(すなわち、全長ニューブラスチンの113C末端フラグメント)をコードするDNA配列をクローニングするために、実施例9に記載される方法に従って、産生され得る。ラットアルブミンまたはヒト成長ホルモンからのシグナルペプチドをコードするDNA配列が、実施例10に記載されるように、成熟ニューブラスチンポリペプチドをコードするDNA配列に融合され得る。このDNA配列は、真核生物細胞、例えば、CHO細胞にトランスフェクトされて、分泌される成熟ニューブラスチンを産生し得る。
Claims (97)
- 生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法であって、以下、
シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸を含む発現ベクターを含む細胞を培養する工程であって、該ヌクレオチド配列は、ニューブラスチンプロ領域をコードしていない、工程
を包含する、方法。 - 前記シグナルペプチドが、異種シグナルペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、哺乳動物シグナルペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、ヒトシグナルペプチド、ラットシグナルペプチド、マウスシグナルペプチド、ブタシグナルペプチド、サルシグナルペプチド、イヌシグナルペプチド、ネコシグナルペプチド、ウシシグナルペプチド、またはウマシグナルペプチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、成長因子シグナルペプチド、ホルモンシグナルペプチド、サイトカインシグナルペプチド、および免疫グロブリンシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、TGFβシグナルペプチド、GDFシグナルペプチド、IGFシグナルペプチド、BMPシグナルペプチド、ニューロトロフィンシグナルペプチド、PDGFシグナルペプチド、およびEGFシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、ホルモンシグナルペプチドから選択され、該ホルモンが、成長ホルモン、インスリン、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH、T3、T4、およびDHEAからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、インターロイキンシグナルペプチドである、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、ニュールツリンシグナルペプチド、GDNFシグナルペプチド、パーセフィンシグナルペプチド、およびNGFシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、アルブミンシグナルペプチド、修飾アルブミンシグナルペプチド、および成長ホルモンシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、ラットアルブミンシグナルペプチド、修飾ラットアルブミンシグナルペプチド、およびヒト成長ホルモンシグナルペプチド、例えば、ラットアルブミンシグナルペプチドおよびヒト成長ホルモンシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、配列番号70を含むシグナルペプチドなどの合成シグナルペプチドである、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、免疫グロブリンシグナルペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、マウスIgSP(配列番号4)、ラットIgSP(配列番号6)、ブタIgSP(配列番号5)、サルIgSP(配列番号2または3)、ヒトIgSP(配列番号1)からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記IgSPが、マウスIgSP(配列番号4)である、請求項13に記載の方法。
- 前記IgSPが、ヒトIgSP(配列番号1)である、請求項13に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、ネイティブなニューブラスチンシグナルペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナルペプチドが、ネイティブなヒトニューブラスチンシグナルペプチドである、請求項17に記載の方法。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸1〜140、または配列番号11もしくは12のアミノ酸1〜144、配列番号13、14、15、16、17、もしくは18、N末端短縮型NBN、変異型NBN、または変異型かつN末端短縮型NBNとして同定された配列を有するニューブラスチンから選択される成熟NBNからなる群より選択される、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号13、14、15、16、17、または18によって同定される配列を有するニューブラスチンからなる群より選択される成熟NBNである、請求項19に記載の方法。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、ヒト成熟113NBN(配列番号14)である、請求項20に記載の方法。
- 前記ニューブラスチンペプチドが、ヒトニューブラスチンの116個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの115個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの114個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの113個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの112個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの111個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの110個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの109個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの108個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの107個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの106個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの105個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの104個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの103個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの102個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの101個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの100個のC末端アミノ酸、およびヒトニューブラスチンの99個のC末端アミノ酸からなる群より選択される、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号10の106個、104個、102個、または99個のC末端アミノ酸を有するN末端短縮型ニューブラスチンからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、ヒトニューブラスチンの116個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの113個のC末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの104個のC末端アミノ酸、およびヒトニューブラスチンの116個のC末端アミノ酸からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記N末端短縮型ニューブラスチンが、配列番号19のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記N末端短縮型ニューブラスチンが、配列番号20の99アミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号14のアミノ酸8〜113までに由来するアミノ酸配列を含み、ここで、改変体ニューブラスチンポリペプチドが、該改変体ポリペプチドのアミノ酸配列における14位のアルギニン以外のアミノ酸、該改変体ポリペプチドのアミノ酸配列における39位のアルギニン以外のアミノ酸、該改変体ポリペプチドの68位のアルギニン以外のアミノ酸、および該改変体ポリペプチドの95位のアスパラギン以外のアミノ酸からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸置換を含み、ここで該アミノ酸の位置は、配列番号14のポリペプチド配列に従って番号付けされている、請求項1に記載の方法。
- 前記14位、39位、または68位における置換がリジンである、請求項27に記載の方法。
- 前記ベクターが、プラスミドである、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。
- 前記ベクターが、哺乳動物発現ベクターである、請求項1〜30のいずれかに記載の方法。
- 前記ベクターが、複製欠損レンチウイルス粒子である、請求項30に記載の方法。
- 前記ベクター粒子が、5’レンチウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、前記シグナルペプチドおよび前記ニューブラスチンペプチドをコードするポリヌクレオチドシグナルに作動可能に連結されたプロモーター、第2鎖DNA合成の起点、ならびに3’レンチウイルスLTRを含むレンチウイルスベクターから産生される、請求項32に記載の方法。
- 前記ベクターが、HIV、SIV、FIV、EIAV、AAV、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびMoMLVなどのレトロウイルスからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記プロモーターが、ユビキチンプロモーター、CMVプロモーター、JeTプロモーター、SV40プロモーター、伸長因子1αプロモーター(EF1−α)、ニワトリβ−アクチン、PGK、およびMT−1からなる群より選択される、請求項1〜34のいずれかに記載の方法。
- 前記プロモーターが、Tet−On、Tet−Off、ラパマイシン誘導性プロモーター、Mx1、およびRU486などの誘導性/抑制性プロモーターである、請求項34に記載の方法。
- 前記細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項1〜36のいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳動物が齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サル、ヒトからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記細胞が、CHO、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、神経細胞、胎児細胞、ARPE−19、不死化線維芽細胞、C2C12、HeLa、HepG2、網膜色素上皮(RPE)細胞、線条体細胞、ニューロン、星状細胞、介在ニューロンからなる群より選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記細胞が、CHO細胞である、請求項39に記載の方法。
- シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、該ポリヌクレオチド配列は、ニューブラスチンプロ領域をコードしておらず、該シグナルペプチドおよび該ニューブラスチンペプチドが、請求項1〜40のいずれかにおいて規定される、核酸。
- a)配列番号64、66、もしくは68に記載のヌクレオチド配列、またはb)配列番号65、67、もしくは69に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項41に記載の核酸。
- 前記ヌクレオチド配列が、哺乳動物宿主における発現のために最適化されている、請求項41または42に記載の核酸。
- 請求項41〜43のいずれかに規定される核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項44に規定されるベクター、および1種以上の薬学的に受容可能なアジュバント、賦形剤、キャリア、および/または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
- 請求項44に規定されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、単離された宿主細胞。
- 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項46に記載の細胞。
- 前記細胞が、500ng/106細胞/24時間を超える量でニューブラスチンまたはその機能的等価物を分泌可能である、請求項47に記載の哺乳動物細胞。
- CHO、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、不死化線維芽細胞、C2C12、HeLa、HepG2、RPE細胞株、およびARPE−19細胞からなる群より選択される、請求項47に記載の哺乳動物細胞。
- CHO、HEK293、COS、およびARPE−19からなる群より選択される、請求項48に記載の哺乳動物細胞。
- RPE細胞、神経細胞、神経前駆細胞、幹細胞、および胎児細胞からなる群より選択される、請求項47に記載の哺乳動物細胞。
- 支持マトリックスに結合される、請求項47に記載の哺乳動物細胞。
- 感染性ベクター粒子を産生することが可能なパッケージング細胞株であって、該ベクター粒子が、5’レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージングシグナル、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むレトロウイルス由来のゲノムを含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、ニューブラスチンプロ領域をコードせず、該シグナルペプチドおよび該ニューブラスチンペプチドが、請求項1〜40のいずれかにおいて規定され、第2鎖DNA合成の起点、ならびに3’レトロウイルスLTRを含む、パッケージング細胞株。
- 前記ベクター粒子が、複製欠損性である、請求項53に記載のパッケージング細胞株。
- 前記ゲノムがレンチウイルス由来であり、かつ前記LTRがレンチウイルスである、請求項53に記載のパッケージング細胞株。
- 請求項44に規定されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされている少なくとも1つの細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記少なくとも1つの形質転換またはトランスフェクトされた細胞が、哺乳動物のゲノムを含む、請求項56に記載の哺乳動物。
- 移植可能な細胞培養デバイスであって、
i.該細胞培養デバイスを通じて増殖因子の分散を可能にする半透性膜;および
ii.請求項46に規定される少なくとも1つの単離された宿主細胞
を備える、デバイス。 - 前記半透性膜が、免疫隔離的である、請求項56に記載のデバイス。
- 前記半透性膜が微小孔性である、請求項56に記載のデバイス。
- 前記デバイスが、半透性膜中に配置されたマトリックスをさらに備える、請求項56に記載のデバイス。
- 前記デバイスが、つなぎアンカーをさらに備える、請求項56に記載のデバイス。
- 請求項44に記載のベクターまたは請求項56〜60までのいずれかに記載のデバイスの、医薬としての使用。
- 神経系障害の治療のための医薬の調製のための、請求項44に記載のベクターの使用。
- 前記神経系障害が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、脊髄神経根剥離、疼痛性チック、およびカウザルギーを含む末梢神経障害からなる群より選択される、請求項64に記載の使用。
- 前記医薬が、角膜の損傷および潰瘍、ならびに網膜症などの眼の疾患の治療のためである、請求項63に記載の使用。
- CNS障害の治療のための医薬の調製のための請求項44に記載のベクターの使用。
- 前記CNS障害が、神経変性性疾患である、請求項67に記載の使用。
- 前記神経変性性疾患が、神経障害性の疼痛を含む末梢神経障害である、請求項64に記載の使用。
- 神経系疾患を治療する方法であって、該方法は、
i 治療有効量の請求項44に規定されるベクター、または
ii 治療有効量の請求項45に規定される薬学的組成物
を、治療を必要とする個体に投与する工程を包含する、方法。 - 前記ベクターが、筋肉内、皮下、または腹腔内に投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記ベクターまたは組成物が、痛覚の伝達に関与する身体の領域に投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記ベクターまたは組成物が、クモ膜下腔内、または脊髄に投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記ベクターが、実質および脳室を含む脳に投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記ベクターが、硝子体、網膜下腔、およびサブテナーカプセルを含む眼に投与される、請求項70に記載の方法。
- 前記神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、脊髄神経根剥離、疼痛性チック、カウザルギー、角膜損傷、および網膜症を含む末梢神経障害からなる群より選択される、請求項70に記載の方法。
- 神経系疾患を治療する方法であって、請求項46に記載の細胞の治療有効量を、治療を必要とする個体に移植する工程を包含する、方法。
- 移植が自系移植、同種異系移植、または異種移植を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記細胞が、クモ膜下腔内または脊髄に投与される、請求項77に記載の方法。
- 前記細胞が、実質および脳室を含む脳に投与される、請求項77に記載の方法。
- 前記細胞が、硝子体、網膜下腔、およびサブテナーカプセルを含む眼に投与される、請求項77に記載の方法。
- 前記神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、脊髄神経根剥離、疼痛性チック、カウザルギー、角膜損傷、および網膜症を含む末梢神経障害からなる群より選択される、請求項77に記載の方法。
- 神経系疾患を治療する方法であって、請求項56に規定される移植可能デバイスを、治療を必要とする個体に移植する工程を包含する、方法。
- 移植が自系移植、同種異系移植、または異種移植を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記デバイスが、クモ膜下腔内または脊髄に移植される、請求項83に記載の方法。
- 前記デバイスが、実質および脳室を含む脳に移植投与される、請求項83に記載の方法。
- 前記デバイスが、硝子体、網膜下腔、およびサブテナーカプセルを含む眼に移植投与される、請求項83に記載の方法。
- 前記神経系疾患が、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、脊髄神経根剥離、疼痛性チック、カウザルギー、角膜損傷、および網膜症を含む末梢神経障害からなる群より選択される、請求項83に記載の方法。
- 神経障害性の疼痛の治療のための、請求項72〜80のいずれかに記載される方法であって、治療有効量の請求項44に規定されるベクター、または請求項46〜50のいずれかに規定される細胞の組成物、または請求項56に規定される細胞デバイスを、治療の必要がある個体に投与する工程を包含する、方法。
- シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドを含むニューブラスチンポリペプチドであって、該ポリペプチドがニューブラスチンプロ領域を欠く、ニューブラスチンポリペプチド。
- 前記ニューブラスチンポリペプチドが、前記シグナルペプチドに融合されている、請求項90に記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、ペプチド結合を介してニューブラスチンポリペプチドのC末端からN末端を通して連結される、請求項91に記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、異種シグナルペプチドである、請求項90〜92のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、請求項1〜40のいずれかに規定されるとおりである、請求項90〜93のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、ネイティブのラットアルブミンシグナルペプチド、修飾ラットアルブミンシグナルペプチド、およびヒト成長ホルモンシグナルペプチドから選択されるシグナルペプチドの群より選択される、請求項94に記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、ニューブラスチンシグナルペプチドである、請求項90〜94のいずれかに記載のポリペプチド。
- 前記シグナルペプチドが、IgSPである、請求項90〜94のいずれかに記載のポリペプチド。
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