JP5623685B2 - ニューブラスチンの改良された分泌 - Google Patents

Description

本願において引用されるすべての参考文献は、その全体が参照として本明細書によって援用される。

（発明の分野）
本発明は、ニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法および組成物、ならびに、例えば、遺伝子治療による、中枢神経系および眼を含む神経系の特定の領域へのニューブラスチンの局所的送達に関する。本発明は、半透性の膜を有するマクロカプセルにカプセル化された、形質転換またはトランスフェクトされた細胞からのニューブラスチンの送達を含む。本発明はさらに、増加量のニューブラスチンを産生することが可能である哺乳動物細胞に関する。

（発明の背景）
細胞は、デノボ合成されるタンパク質を種々の細胞内の小器官および細胞外空間に方向付けるための方法を有する。シグナルペプチドは、染色体ＤＮＡのコード部分に封入されており、リボソーム装置によってタンパク質の一部として合成される。シグナルペプチドはＮ末端を形成し、新規に合成されたポリペプチドを粗面小胞体に方向付ける。ここでシグナルペプチドはポリペプチドから切断され、成熟タンパク質が周囲に分泌される。従って、シグナルペプチドは細胞内部に残る。

タンパク質のプロ部分はタンパク質の成熟部分から切断され、細胞の外部で最後を迎える。ある神経栄養因子、例えば、ＮＧＦについては、タンパク質のプロ部分は神経ペプチドとして生物活性である。

挿入された遺伝子が分泌されるタンパク質をコードする遺伝子治療において、シグナル配列は、粗面小胞体およびゴルジ装置を通してのその適切なプロセシングを保証するために、成熟タンパク質の前方に配置される必要がある。第１の選択は、ほぼ不変的に問題のタンパク質のネイティブなシグナル配列であり、なぜなら、タンパク質は、それがネイティブな細胞中で分泌およびプロセシングされるのと同じ方法で分泌および／またはプロセシングされることが一般的に望ましいからである。ある用途のために、発現されるタンパク質の量がネイティブな細胞におけるものと同じであることもまた望ましい。さらに、切断されたシグナル配列が細胞の代謝において役割を果たすという可能性を排除することはできない。最後に、当業者は、成熟タンパク質の正確なプロセシングおよびフォールディングを保証するためにタンパク質のプレプロ部分を使用することを選択する。

多くの場合において、治療因子を分泌することが予想された、インビボで形質転換された細胞およびトランスフェクトされた細胞は、十分な治療有効量および十分な時間の間で、その治療因子を分泌しないことが明らかとなった。これはまた、細胞が身体の外部でトランスフェクトまたは形質転換され、遺伝子改変の後で対象に挿入されるエキソビボ遺伝子治療において問題となり得る。

先行技術は、哺乳動物における異種タンパク質とのシグナルペプチドのカップリングに関する多くの情報を提供していない。真菌または酵母における哺乳動物のタンパク質の異種発現については、哺乳動物のシグナルペプチドをプロデューサー種において機能的であるシグナルペプチドに置き換えることは一般的実務である。

（発明の要旨）
本発明は、生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法に関し、上記方法は、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸を含む発現ベクターを含む細胞を培養する工程を包含し、ここで上記ヌクレオチド配列はニューブラスチンプロ領域をコードしていない。

ネイティブなヒトプレプロニューブラスチンポリペプチドは、２２０アミノ酸長である（図１７Ａ）（配列番号１０）。ニューブラスチンシグナルペプチドは３９アミノ酸からなり、１位のメチオニンで開始し３９位のアラニンで終了する（図１７Ｂ）。ニューブラスチンの最長の完全長プロドメインは６９アミノ酸からなり、４０位のセリンで開始し１０７位のアルギニンで終了する（図１７Ｃ）。１つの成熟ニューブラスチンポリペプチドはＣ末端１１３アミノ酸からなり、１０８位のアラニンで開始し２２０位のグリシンで終了する。プレプロニューブラスチンは可能性のあるいくつかのプロペプチド切断部位を含み、そして哺乳動物細胞におけるプレプロニューブラスチンの発現は種々の成熟ペプチドの分泌を生じ、これは、可能性のある型としてＣ末端の１４０個、１１３個、１０７個、および１０４個のアミノ酸からなるものがある。これらの成熟型の各々について、４０位から、成熟ペプチドの最初の残基の前の位置までのアミノ酸を形成する対応する１つのプロドメインが存在する。

本発明は、インビボおよびインビトロの両方で、ウイルスベクターを用いての哺乳動物細胞の形質転換の際にしばしば経験される、ニューブラスチンを含む神経栄養因子の分泌のほぼ完全な非存在の問題に対する解決を提供する。この現象はまた、プラスミドに基づく発現ベクターについても観察される。ある未知の理由により、哺乳動物細胞は、しばしば、ベクターによってコードされる神経栄養因子を分泌することからブロックされる。１つの可能性のある説明は、分泌されたタンパク質の正確なプロセシングが細胞特異的であることであり得る。このことは、ウイルスベクター遺伝子治療の使用において深刻な問題を表す。今日、ウイルスベクター遺伝子治療は、インビボまたはエキソビボの遺伝子治療のための最も好ましい（関連性があるだけではなく）方法であると考えられている。なぜなら、ウイルスベクターは形質転換された細胞のゲノムへの安定な組み込みを保証するからである。

本発明は、ヒトニューブラスチン、または生物学的に活性な短縮型の成熟ヒトニューブラスチン、すなわち、プレプロタンパク質としての代わりに、プレタンパク質としての分泌されたニューブラスチンポリペプチドの効率的な発現を提供する。本発明に従うニューブラスチンプレタンパク質は、一般的に、２つの成分、すなわち分泌ニューブラスチンポリペプチド（上記に規定するようなもの）、および異種シグナル配列を含む。

さらに、本発明者らは、ニューブラスチンのネイティブなシグナルペプチドを、他のタンパク質から、例えば、免疫グロブリン重鎖可変領域からの代替的なシグナルペプチドで置き換えることによって、とりわけ、形質転換された細胞からのニューブラスチンの分泌がさらに増強されることを示した。

さらに、本発明者らは、シグナルペプチドならびにニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からプロ領域をコードするヌクレオチド配列を除去することによって、プロ領域が含まれる場合よりも、多い量のニューブラスチンの分泌が発現かつ保持されることが可能であることを示した。

プロ領域は正しくフォールディングするために多くのタンパク質について必要であるが、プロ領域なしで生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドを産生することが可能であることが見いだされた。

さらなる局面において、本発明は、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、このヌクレオチド配列を含む発現ベクター、本発明に従うベクターを含む薬学的組成物、ならびに１種以上の薬学的に受容可能なアジュバント、賦形剤、キャリア、および／または希釈剤に関する。この薬学的組成物は、インビボおよびエキソビボ遺伝子治療のために使用され得る。

さらなる局面において、本発明は、本発明に従うベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた単離された宿主細胞に関する。

このような遺伝的に改変された宿主細胞は、そのネイティブなシグナル配列を有するニューブラスチンをコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞と比較して、予想外に大量のニューブラスチンを産生することがわかった。これらの形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、それゆえに、ニューブラスチンの工業スケールでの製造のためのプロデューサー細胞の有望な供給源を構成する。このニューブラスチン分泌細胞はまた、ニューブラスチンの供給源として哺乳動物被験体への移植のために使用され得る。１つの特定の応用は、エキソビボ遺伝子治療である。

さらなる局面において、本発明は、感染性ベクター粒子を産生可能であるパッケージング細胞株に関し、このベクター粒子は、５’レトロウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、ニューブラスチンおよび免疫グロブリンシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、ならびに３’レトロウイルスＬＴＲを含むレトロウイルス由来のゲノムを含む。

これらのパッケージング細胞株は、本発明に従うウイルスベクターを産生するために使用され得る。これらはまた、カプセル化されかつＣＮＳに移植される場合に、インビボ遺伝子治療のために使用され得る。

さらなる局面において、本発明は、本発明に従うベクターで形質転換またはトランスフェクトされる少なくとも１つの細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。ニューブラスチンを過剰発現するこのような動物は、遺伝子プロファイリングのために、および薬物のスクリーニングおよび開発において使用され得る。

好ましくは、形質転換またはトランスフェクトされた細胞は個々の動物の遺伝子型を有し、すなわち、同種異系移植または異種移植ではない。

さらなる局面において、本発明は、移植可能な細胞培養デバイスに関し、このデバイスは以下を備える：
ｉ．そこからの神経栄養因子の分散を可能にする半透性膜；および
ｉｉ．本発明に従う少なくとも１つの単離された宿主細胞。

これらのカプセルは、中枢神経系への移植の際にニューブラスチンの局所的送達のために使用され得る。増殖因子の局所的かつ延長された送達は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病、脳卒中、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含むがこれらに限定されない多数のＣＮＳ障害の治療のための好ましい投与方法である。このカプセルは、同様に、神経系障害および神経障害性の疼痛を含むがこれらに限定されない末梢障害のためのニューブラスチンの局所的かつ延長された送達のために使用され得る。さらなる適応には眼の障害が含まれる。

本発明のカプセルは、カプセル的アプローチを使用して、患者における所望の部位へのウイルス粒子の送達を提供する。ベクター産生細胞株のカプセル化は、単純な注入とは逆に、標的部位へのウイルス粒子の連続的送達を可能にする。さらに、免疫攻撃の可能性の減少を伴う、反復治療が可能である。このカプセルは、パッケージング細胞から放出されたウイルス粒子の通過を可能にするために十分な大きさであるが、カプセルへの宿主細胞の通過を妨害する大きさである孔を有する。

このカプセル的アプローチは、治療の安全性および制御を増大する。なぜなら、このデバイスは、容易に回収（形質転換治療が完了するとき）、または外植および再移植（治療を修飾するとき）可能であるからである。さらに、カプセル型デバイスが開放式または外面化されていないため、感染の可能性は減少する。

最後に、カプセル化は患者中でのパッケージング細胞の移動を妨害し、かつ移植に際してのパッケージング細胞の生存度を延長するので、より少ない細胞がこの治療のために必要とされるようである。このことは、患者における免疫反応をさらに低減することにおいて有利であり得る。

さらなる局面において、本発明は、本発明に従うベクターの医薬としての使用に関する。

なおさらなる局面において、本発明は、神経系障害の治療のための医薬の調製のための、本発明に従うベクターの使用に関する。

別の局面において、本発明は、ＣＮＳ障害の治療のための医薬の調製のための、本発明に従うベクターの使用に関する。

さらに、本発明は、神経系疾患を治療する方法に関し、この方法は：
治療有効量の本発明に従うベクター；または
このベクターを含む治療有効量の薬学的組成物
をその必要がある個体に投与する工程を包含する。

本発明のこの局面に従って、神経系疾患の治療のための改善されたインビボ遺伝子治療方法が提供される。添付の実施例によって明らかにされるように、本発明のウイルスベクターを用いる形質転換は、コードされたニューブラスチンのこれまでに見られなかった分泌、および結果として改善された治療効果を生じる。

なおさらなる局面において、本発明は、神経系疾患を治療する方法に関し、この方法は：
−本発明の形質転換された細胞の治療有効量；または
−本発明に従う移植可能デバイス
をその必要がある個体に移植する工程を包含する。

この局面は、増加量のニューブラスチンを分泌することが可能である治療細胞のエキソビボ遺伝子治療および移植に基づく神経系障害を治療する別の方法を提供する。

ニューブラスチンの大規模スケール製造のための現在好ましい方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ中での異種遺伝子発現、引き続く溶解、抽出、精製、再フォールディング、および必要に応じたタンパク質の切断である。研究スケールの量の製造のために使用される代替的方法には、正確にプロセスされかつフォールディングされたニューブラスチンを培養培地に分泌する哺乳動物プロデューサー細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）の培養が含まれ、そこからニューブラスチンが比較的容易に単離され得る。本発明の哺乳動物細胞は、以前に哺乳動物細胞について見られたよりも大量にニューブラスチンを産生し、それゆえに、正確にプロセスされかつフォールディングされたニューブラスチンである、生物活性ニューブラスチンを産生するための細胞の改善された供給源を表す。

（定義）
「Ｃ末端アミノ酸」とは、本明細書で使用される場合、ポリペプチドのアミノ（Ｎ）末端から最も遠位のポリペプチド鎖中の一連のアミノ酸を意味する。

「ニューブラスチンプロ領域」とは、少なくとも、配列番号１０、１１、１２の−４１から−１１アミノ酸に対応するアミノ酸を含む領域を意味する。

「プレプロニューブラスチンポリペプチド」（配列番号１０）とは、本明細書で使用される場合、成熟ヒトニューブラスチン（すなわち、ニューブラスチンの１１３個のＣ末端アミノ酸（配列番号１０のアミノ酸１０８〜２２０））、全長ヒトニューブラスチンプロドメイン（すなわち、成熟ニューブラスチンのＮ末端に対して近位の６８アミノ酸（配列番号１０のアミノ酸４０〜１０７））、およびヒトニューブラスチンシグナルペプチド（すなわち、ニューブラスチンプロドメインのＮ末端に対して近位の３９アミノ酸（配列番号１０のアミノ酸１〜３９））からなるポリペプチドを意味する。

シグナルペプチド−真核生物シグナルペプチド。真核生物シグナルペプチドは、分泌されるか、または膜成分であるかのいずれかであるように方向付けられるタンパク質上に存在するペプチドである。これは通常、タンパク質に対してＮ末端である。本発明の状況において、シグナルＰ（バージョン２．０または好ましくはバージョン３．０）において同定されるすべてのシグナルペプチドがシグナルペプチドと見なされる。

「機能的なニューブラスチンシグナルペプチド」とは、本明細書で使用される場合、配列番号１０の最初の３９アミノ酸、または細胞からの成熟ニューブラスチンの分泌をもたらすその任意の部分を意味する。

「機能的なニューブラスチンシグナル配列」とは、機能的なニューブラスチンシグナルペプチドをコードする核酸配列を意味する。

哺乳動物シグナルペプチドは、ＥＲを通して分泌される哺乳動物タンパク質に由来するシグナルペプチドである。

成熟ヒトニューブラスチンポリペプチドとは、本明細書で使用される場合、ネイティブヒトニューブラスチンのＣ末端１１３アミノ酸、すなわち、配列番号１０のアミノ酸１０８〜２２０を意味する。

成熟マウスニューブラスチンポリペプチドとは、本明細書で使用される場合、ネイティブマウスニューブラスチンのＣ末端１１３アミノ酸、すなわち、配列番号１１のアミノ酸１１２〜２２４を意味する。

成熟ラットニューブラスチンポリペプチドとは、本明細書で使用される場合、ネイティブラットニューブラスチンのＣ末端１１３アミノ酸、すなわち、配列番号１２のアミノ酸１１２〜２２４を意味する。

ニューブラスチンポリペプチドとは、本明細書で使用される場合、ネイティブヒトニューブラスチンのＣ末端９９〜１４０アミノ酸、ラットまたはマウスのネイティブニューブラスチンのＣ末端９９〜１４４アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。より好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドは、ネイティブヒトニューブラスチンのＣ末端９９〜１１３アミノ酸、ネイティブラットニューブラスチンのＣ末端９９〜１１３アミノ酸、またはマウスニューブラスチンのＣ末端９９〜１１３アミノ酸を含むポリペプチドを含み、各々がネイティブ配列中に１５アミノ酸までの置換を有する。特定の状況において、「分泌ニューブラスチンポリペプチド」とは、すでに分泌されたものとは逆に、分泌されるべきポリペプチドを意味することが理解される。分泌ニューブラスチンポリペプチドは、ニューブラスチンプロ領域を含まない。

機能的ニューブラスチンプロドメインは、シグナルペプチドと成熟ペプチドとの間のペプチドであり、このプロペプチドは、シグナルペプチドの切断後にフューリンによって成熟ペプチドから切断可能である。

生物活性：ＧＦＲα３とダイマー化した場合にＲＥＴに結合し、かつＲＥＴダイマー化および自己リン酸化を誘導する能力。Ｋｉｒａ ＥｌｉｓａまたはＲＥＴ Ｌ３ Ｅｌｉｓａアッセイを用いて測定される。

「異種」とは、核酸配列またはアミノ酸配列に言及する際に使用される場合、特定の宿主細胞とは無関係な供給源由来の配列、またはそれが同じ宿主細胞からの場合には、そのもともとの型から修飾されている配列を意味する。

異種シグナルペプチド−ニューブラスチンポリペプチドに天然には作動可能に連結されていないシグナルペプチド。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法に関し、ここで、ニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列はプロ領域をコードしない。本発明の状況において、プロ領域は、配列番号１０、１１、または１２の少なくともアミノ酸−４１から−１１を含む。より好ましくは、このプロ領域は、配列番号１０、１１、または１２の少なくともアミノ酸−４１から−１を含む。より好ましくは、このプロ領域は、配列番号１０、１１、または１２の少なくともアミノ酸−４１から１０を含み、最も好ましくは、これは、配列番号１０のアミノ酸−４１から２７、または配列番号１１もしくは配列番号１２のアミノ酸−４１から３１に対応する配列のプロドメインを含む。

（シグナルペプチド）
本発明に従う発現ベクターは、ニューブラスチンポリペプチドに作動可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の方向付けを可能にするプロモーター配列を含む核酸を含む発現ベクターで形質転換された細胞を培養することが可能である、プロモーター配列を含む核酸を含み、ここで、このヌクレオチド配列はニューブラスチンポリペプチドのプロ領域をコードしない。

分泌プロセスの間、ニューブラスチンプレタンパク質のシグナルペプチドは、ニューブラスチンポリペプチドを産生する宿主細胞によって切断される。切断部位は一般的に規定されるが、当業者は、シグナルペプチド切断部位における変動性が存在し得ることを理解する。従って、正確な切断部位に関するある程度のあいまいさを有する実施形態が、本発明の範囲内に含まれる。

シグナルペプチドは、任意の機能的シグナルペプチド、例えば、異種シグナルペプチド、例えば、哺乳動物シグナルペプチドであり得る。このシグナルペプチドは、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、またはウマなどの任意の適切な種からであり得る。

シグナルペプチドはニューブラスチンポリペプチドに連結され、そして好ましくは、このニューブラスチンポリペプチド、例えば、ニューブラスチンポリペプチドのＮ末端に融合されているシグナルペプチドのＣ末端に直接的に融合される。

添付の実施例によって明らかにされるように、このシグナルペプチドの使用は、一般的に、インビトロおよびインビボの両方においてニューブラスチンの改善された分泌を生じる。この結果は、レンチウイルス形質転換細胞（インビボおよびインビトロ）を用いて、およびプラスミドトランスフェクト細胞（インビトロ）を用いての両方で再現可能であった。細胞は、シグナルペプチド遺伝子が、成熟タンパク質をコードする遺伝子に直接的に融合される場合に（ずなわち、プロ部分を除外して）、生物学的に活性なタンパク質として成熟タンパク質を産生する。

本発明者らは、ネイティブニューブラスチンシグナルペプチドがシグナルペプチドとして機能するのみならず、異種シグナルペプチドが有用であり、かつネイティブなシグナルペプチドよりも高い収量をしばしば提供することを発見した。この異種シグナルペプチドは、成長因子シグナルペプチド、ホルモンシグナルペプチド、サイトカインシグナルペプチド、および免疫グロブリンシグナルペプチドからなる群より選択され得る。

従って、シグナルペプチドの例は、ＴＧＦβシグナルペプチド、ＧＤＦシグナルペプチド、ＩＧＦシグナルペプチド、ＢＭＰシグナルペプチド、ニューロトロフィンシグナルペプチド、ＰＤＧＦシグナルペプチド、およびＥＧＦシグナルペプチド、ホルモンシグナルペプチドから選択されるシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドであり、このホルモンは、成長ホルモン、インスリン、ＡＤＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＡＣＴＨ、ＭＳＨ、ＴＳＨ、Ｔ３、Ｔ４、およびＤＨＥＡ、またはインターロイキンシグナルペプチドからなる群より選択される。

１つの実施形態において、シグナルペプチドは、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）シグナルペプチド、ＧＤＮＦシグナルペプチド、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）シグナルペプチド、およびＮＧＦシグナルペプチドからなる群より選択される。

別の実施形態において、シグナルペプチドは、アルブミンシグナルペプチド、修飾アルブミンシグナルペプチド、および成長ホルモンシグナルペプチドからなる群より選択され、例えば、シグナルペプチドは、ラットアルブミンシグナルペプチド、修飾ラットアルブミンシグナルペプチド、およびヒト成長ホルモンシグナルペプチド、例えば、ラットアルブミンシグナルペプチドおよびヒト成長ホルモンシグナルペプチドからなる群より選択される。

従って、ある実施形態において、分泌ニューブラスチンポリペプチドは、ネイティブラットアルブミンシグナルペプチドに融合される。これは配列番号６６によって例示される。他の実施形態において、分泌ニューブラスチンポリペプチドは、修飾ラットアルブミンシグナル配列に連結される。これは配列番号７０によって例示される。他の実施形態において、分泌ニューブラスチンポリペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナル配列に融合される。これは配列番号６８によって例示される。

なお別の実施形態において、シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドである。特に、免疫グロブリンシグナルペプチドは、マウスＩｇＳＰ（配列番号４）、ラットＩｇＳＰ（配列番号６）、ブタＩｇＳＰ（配列番号５）、サルＩｇＳＰ（配列番号２または３）、ヒトＩｇＳＰ（配列番号１）、例えば、マウスＩｇＳＰ（配列番号４）またはヒトＩｇＳＰ（配列番号１）からなる群より選択されるシグナルペプチドであり得る。

免疫グロブリンシグナルペプチド（ＩｇＳＰ）は、多くの哺乳動物からの公知の小さな１９アミノ酸ペプチドである。ヒト、アカゲザル、マーモセット、ラット、マウス、およびブタからの配列が図１にアラインされている。ヒトＩｇＳＰと比較した配列同一性パーセントは、２１パーセント（ブタ）から６８パーセント（マーモセット）まで変動する。この比較的大きな変動は、特定の配列が、シグナルペプチドの生物学的機能を実質的に変化させることなく、高い程度まで変化され得ることを示す。添付の実施例によって明らかにされるように、種間の反応性が存在することもまた観察されている。これらは、ラット（インビボ実験）およびヒト細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞）において機能的であったマウスＩｇＳＰを用いて実行された。

好ましくは、ＩｇＳＰはマウスまたはヒト起源である。なぜなら、マウスＩｇＳＰは、マウス、ラット、およびヒトにおいて機能的であることが知られているからである。ヒトにおける使用のために、ＩｇＳＰは、好ましくは、いかなる異種間の副作用のリスクも減少させるために、ヒト起源である。

別の実施形態において、シグナルペプチドは、ネイティブニューブラスチンシグナルペプチド、例えば、ネイティブヒトニューブラスチンシグナルペプチドである。この状況において、後者の構築物のネイティブニューブラスチンシグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドは、δプロニューブラスチンと呼ばれる。

なお別の実施形態において、シグナルペプチドは、合成シグナルペプチド、例えば、配列番号６２のＡＡ１〜ＡＡ３８のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドである。

（ニューブラスチン）
ニューブラスチンポリペプチドは、神経細胞および組織の生存を促進、その表現型分化を維持、変性を予防、再生を促進、ならびに活性を回復するタンパク質である。ニューブラスチンは（最初に記載された、例えば、ＷＯ ００／０１８１５において）、代替的に、「アーテミン（ａｒｔｅｍｉｎ）」（例えば、ＷＯ ００／１８７９９）および「エノビン（ｅｎｏｖｉｎ）」（例えば、ＷＯ ００／０４０５０）と呼ばれている。

ニューブラスチンは、ＴＧＦβスーパーファミリーの遠いメンバーとして分類されており（Ｍａｓｓａｇｕｅら、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：１７２−１７８）、かつグリア細胞株由来の神経栄養因子リガンドファミリー「ＧＤＮＦ」；ＷＯ ９３／０６１１６のメンバーであり、このファミリーには、ＧＤＮＦ、パーセフィン（「ＰＳＰ」；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔら、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ ２０：２４５２５３）およびニュールツリン（「ＮＴＮ」；ＷＯ ９７／０８１９６）が含まれる。ＧＤＮＦサブファミリーのリガンドは、共通して、ＲＥＴレセプターチロシンキナーゼを通してのシグナル伝達を誘導する能力を有する。ＧＤＮＦサブファミリーのこれらの３種のリガンドは、神経栄養性レセプター、ＧＦＲ［α］レセプターのファミリーについてのそれらの相対的親和性が異なる。ニューブラスチンは、好ましくは、ＧＦＲ［α］３−ＲＥＴ複合体を通して作用する。Ｂａｕｄｅｔら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２７、４３３５−４４頁（２０００）；Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ、２１、１２９１−１３０２頁（１９９８）；Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１３、３１３−３２５（１９９９）。

ＧＤＮＦサブファミリーメンバーであるニュールツリン、パーセフィン、およびＧＤＮＦに対するニューブラスチン（配列番号１０）のアミノ酸配列比較が表１に示される。本発明において有用であるニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、ＧＤＮＦサブファミリーフィンガープリント、すなわち、表１において下線を付したアミノ酸残基を好ましく保持する。

表１に示されるアミノ酸配列アラインメントから、ニューブラスチンがＴＧＦ［β］スーパーファミリー内で保存される位置に７個のシステイン残基を有することが観察され得る。この配列アラインメントに基づいて、ニューブラスチンは、神経栄養因子のＧＤＮＦサブファミリーのメンバーであることが示された（ＬＧＬＧ−ＦＲ（Ｙ／Ｆ）ＣＳＧＳＣ−ＱｘＣＣＲＰ−ＳＡｘｘＣＧＣ、ＧＤＮＦサブファミリーフィンガープリント、表１において下線を付した）。

本発明において有用なニューブラスチンポリペプチドは、プレタンパク質、成熟タンパク質、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質、短縮型、または任意の他の翻訳後修飾タンパク質の形態を含む任意の生物活性な形態で提供され得る。生物活性ニューブラスチンは、二量体形成が活性のために必要とされるので、各ＮＢＮ改変体についての二量体型であることが仮定される。単量体ＮＢＮポリペプチドにおいては、活性はほとんど観察されないか、または活性は全く観察されない。生物活性ニューブラスチンポリペプチドは、コファクター、例えば、ＧＦＲ［α］３またはＲＥＴの存在下で、ＧＦＲ［α］３、またはＧＦＲ［α］３およびＲＥＴの複合体に結合し、ＲＥＴの二量体化およびＲＥＴの自己リン酸化を誘導する、二量体化ポリペプチドを含む。従って、「ニューブラスチンポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、神経栄養活性を有するポリペプチドである（例えば、ＷＯ ００／０１８１５に記載されるように）。

本発明の方法によって産生されるニューブラスチンポリペプチドは、ネイティブなニューブラスチンの少なくとも１つの生物学的活性を示す。本発明の目的のための生物学的活性は、任意の適切な方法によって決定され得る。生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドは、二量体化された場合、ＧＦＲα３とともにＲＥＴに結合し得る、ＲＥＴ二量体化および自己リン酸化を誘導するポリペプチドである（例えば、Ｓａｎｉｃｏｌａら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：６２３８を参照のこと）。レセプター結合およびレセプター自己リン酸化を決定する任意の方法が使用されて、本発明の方法によって産生されるニューブラスチンポリペプチドの生物学的活性を評価し得る。例えば、実施例１７において記載されるＫＩＲＡアッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ニューブラスチンの生物学的活性を評価するために使用され得る（Ｓａｄｉｃｋら、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３５（２）：２０７）。

生物活性型のニューブラスチンはまた、実施例１に記載されるＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出され得る。生物学的機能を有さないニューブラスチンは、ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイによっては検出されない。

以下の全長配列は、野生型シグナルペプチドを有する野生型プレプロニューブラスチンを表す。哺乳動物細胞への形質転換またはトランスフェクトの際に、得られる成熟ニューブラスチンは、非常に少量でのみ分泌される。ヒト、マウス、およびラットのニューブラスチンのネイティブなシグナルペプチドは、最初の３９アミノ酸によって表される。
配列番号１０の−−ＡＡ_−８０−ＡＡ_１４０（「野生型」ヒトプレプロ）、
配列番号１１の−−ＡＡ_−８０−ＡＡ_１４４（マウスプレプロ）、
配列番号１２の−−ＡＡ_−８０−ＡＡ_１４４（ラットプレプロ）。

本発明に従って分泌されるニューブラスチンポリペプチドは長さが異なり得る。成熟ヒトニューブラスチンポリペプチドは、通常、Ｃ末端１１３アミノ酸のプレプロニューブラスチンからなるが、１１３アミノ酸のすべてが、有用なニューブラスチン生物学的活性を達成するために必要であるわけではない。アミノ末端短縮が許容され得る。従って、分泌ニューブラスチンポリペプチドは、ネイティブヒトニューブラスチンのＣ末端９９〜１１３アミノ酸に対応し、すなわち、その長さは、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、または１１３個のアミノ酸であり得る。分泌されるニューブラスチンポリペプチドの正確な長さの選択は、当業者によってなされ得る設計の選択である。ネイティブヒトニューブラスチンのＣ末端１０４アミノ酸からなる分泌ヒトニューブラスチンポリペプチドは、以下に提供される実施例において例示される。長さの変動に加えて、分泌ヒトニューブラスチンポリペプチドは配列が変動し得る。

以下の「野生型」ニューブラスチンアミノ酸（「ａａ」または「ＡＡ」）配列は、本発明の方法および組成物において有用であるものの例示である：
配列番号１０の−−ＡＡ_１−ＡＡ_１４０（成熟１４０ＡＡ；本明細書中以後「１４０ＮＢＮ」）、
配列番号１０の−−ＡＡ_２５−ＡＡ_１４０（成熟１１６ＡＡ；本明細書中以後「１１６ＮＢＮ」）、
配列番号１０の−−ＡＡ_２８−ＡＡ_１４０（成熟１１３ＡＡ（配列番号１４）；本明細書中以後「１１３ＮＢＮ」）、
配列番号１１の−−ＡＡ_１−ＡＡ_１４４（マウス成熟１４４ＡＡ）、
配列番号１２の−−ＡＡ_１−ＡＡ_１４４（ラット成熟−−１４４ＡＡ）、
配列番号１０の−−ＡＡ_１０７−ＡＡ_１４０、より好ましくは、配列番号１０のＡＡ_７６−ＡＡ_１４０に記載され、かつＧＤＮＦファミリーおよびＴＧＦβスーパーファミリーに特徴的な７個のＣｙｓ残基を保持しているＣ末端配列を有するペプチド。

１つの実施形態において、好ましいニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１０の４３位、７０位、７４位、１０７位、１０８位、１３６位、および１３８位において保存された（７個の）システインを含む。これらの７個の保存性システイン残基は、ＴＧＦ−スーパーファミリー内で３個のモノマー内ジスルフィド結合（例えば、配列番号１０において、システイン残基４３〜１０８、７０〜１３６、および７４〜１３８の間で意図される）、および１つのモノマー間ジスルフィド結合（例えば、配列番号１０においてシステイン残基１０７〜１０７間で意図される）を形成することが公知であり、これらは、伸長されたβ鎖領域とともにＴＧＦ［β］スーパーファミリーについての保存性構造モチーフを構成する。例えば、Ｄａｏｐｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９９３，１７：１７６−１９２を参照のこと。

好ましくは、ニューブラスチンポリペプチドは、成熟型の野生型タンパク質の１つである。プロ領域の非存在は、遺伝子改変された哺乳動物細胞において高い分泌レベルのために重要であると現在考えられている。

本発明において有用であるニューブラスチンポリペプチドはまた、短縮型の全長ニューブラスチン分子を含む。このような短縮型分子において、１つ以上のアミノ酸がＮ末端またはＣ末端から、好ましくは、Ｎ末端から欠失されている。短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、成熟ニューブラスチンポリペプチドを提供すること、および短縮型ニューブラスチンポリペプチドを産生するのに十分な条件下で、少なくとも１種のプロテアーゼと成熟ニューブラスチンポリペプチドを接触させることによって入手され得る。好ましくは、少なくとも１種のプロテアーゼはエキソプロテアーゼであり、成熟ニューブラスチンポリペプチドを接触させることは、エキソペプチダーゼニューブラスチンポリペプチド消化生成物の形成を生じ、これはジペプチジルペプチダーゼでさらに消化され得る。より好ましくは、本発明に従って、発現ベクターによってコードされるタンパク質は短縮型であり、さらなるプロセシングの必要がない。

本明細書に記載される短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、成熟ニューブラスチン配列中で保存される７個のシステイン残基を含むポリペプチド配列を含む。特定の好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、成熟１１３ＮＢＮニューブラスチンポリペプチドの少なくとも８５カルボキシ末端アミノ酸を含む。より好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、成熟ヒト１１３ＮＢＮの少なくとも９８カルボキシ末端アミノ酸を含む。

１つの短縮型は、成熟ニューブラスチンの７個のシステイン残基の最初から最後までの９７アミノ酸を含む。これは、配列番号２０のアミノ酸番号２から９７に対応する。

他のニューブラスチンの改変体には、短縮型ＮＢＮ型が含まれる。これらの例には以下が含まれる：
（ｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１１２アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１１２と称される１１２ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸２９〜１４０）。

（ｉｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１１１アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１１１と称される１１１ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３０〜１４０）。

（ｉｉｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１１０アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１１０と称される１１０ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３１〜１４０）。

（ｉｖ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０９アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０９と称される１０９ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３２〜１４０）。

（ｖ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０８アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０８と称される１０８ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３３〜１４０）。

（ｖｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０７アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０７と称される１０７ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３４〜１４０）。

（ｖｉｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０６アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０６と称される１０６ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３５〜１４０）。

（ｖｉｉｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０５アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０５と称される１０５ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３６〜１４０）。

（ｉｘ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０４アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０４と称される１０４ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３７〜１４０）（配列番号１９としてもまた示される）。

（ｘ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０３アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０３と称される１０３ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３８〜１４０）。

（ｘｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０２アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０２と称される１０２ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸３９〜１４０）。

（ｘｉｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１０１アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１０１と称される１０１ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸４０〜１４０）。

（ｘｉｉｉ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端１００アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ１００と称される１００ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸４１〜１４０）。

（ｘｉｖ）成熟ニューブラスチンポリペプチドのカルボキシ末端９９アミノ酸を有する、本明細書でＮＢＮ９９と称される９９ＡＡポリペプチド配列（例えば、配列番号１０のアミノ酸４２〜１４０）（配列番号２０としてもまた示される）。

本明細書に開示されるニューブラスチンの短縮型（例えば、１１２ＡＡ型から９９ＡＡ型）が神経栄養活性を有することが理解される。

最も好ましい実施形態において、短縮型ニューブラスチンポリペプチドは、成熟１１３ＡＡニューブラスチンポリペプチドの９９ａａ、１００ａａ、１０１ａａ、１０２ａａ、１０３ａａ、１０４ａａ、１０５ａａ、１０６ａａ、１０７ａａ、１０８ａａ、１０９ａａ、１１０ａａ、１１１ａａ、または１１２ａａのカルボキシ末端アミノ酸である（すなわち、それぞれ、ＮＢＮ９９、ＮＢＮ１００、ＮＢＮ１０１、ＮＢＮ１０２、ＮＢＮ１０３、ＮＢＮ１０４、ＮＢＮ１０５、ＮＢＮ１０６、ＮＢＮ１０７、ＮＢＮ１０８、ＮＢＮ１０９、ＮＢＮ１１０、ＮＢＮ１１１、またはＮＢＮ１１２）。この配列はまた、配列番号１１および１２において、それぞれカルボキシ末端９９ａａ、１００ａａ、１０１ａａ、１０２ａａ、１０３ａａ、１０４ａａ、１０５ａａ、１０６ａａ、１０７ａａ、１０８ａａ、１０９ａａ、１１０ａａ、１１１ａａ、または１１２ａａとして、マウスおよびラットのニューブラスチンポリペプチドにおいても見いだされ得る。短縮型ＮＢＮのこれらの最も好ましい例は、それらが神経栄養活性を有することが実証されたので、生物活性である（「生物活性短縮型ニューブラスチンポリペプチド」とも呼ばれる）。上記に言及されるように、ＮＢＮモノマー性ポリペプチドを用いるとほとんど活性が観察されないか、または活性が全く観察されないので、ＮＢＮ二量体化は、生物活性のために必要である。

マウスおよびラットのニューブラスチンの短縮型もまた意図される。これらは、配列番号１６のＣ末端の９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、もしくは１１６個のアミノ酸（マウス）からなり得、またはこれらは配列番号１８のＣ末端の９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、もしくは１１２個のアミノ酸（ラット）からなり得る。

従って、本発明は、配列番号１０のアミノ酸１〜１４０、または配列番号１１もしくは１２のアミノ酸１〜１４４、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８、Ｎ末端短縮型ＮＢＮ、変異型ＮＢＮ、または変異型かつＮ末端短縮型ＮＢＮとして同定される配列を有するニューブラスチンから選択される成熟ＮＢＮからなる群より選択されるニューブラスチンポリペプチドを含み、例えば、成熟ＮＢＮは、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、もしくは１８によって同定される配列を有するニューブラスチンからなる群より選択され、より特定には、ニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１０の１０６個、１０４個、１０２個、もしくは９９個のＣ末端アミノ酸を有するＮ末端短縮型ニューブラスチンからなる群より選択され、またはニューブラスチンポリペプチドは、ヒトニューブラスチンの１１６個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１３個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸、およびヒトニューブラスチンの１１６個のＣ末端アミノ酸、配列番号１９のアミノ酸配列を有するニューブラスチンポリペプチド、または配列番号２０の９９アミノ酸を含むニューブラスチンポリペプチドからなる群より選択される。

本発明において有用であるＮＢＮはまた、上記の種々のプレプロ、プロ、成熟、および短縮型の「ニューブラスチン」ポリペプチドに対する実質的な類似性または同一性を有するアミノ酸配列を有するＮＢＮポリペプチドを含む。好ましくは、使用されるニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１０〜２３に記載のニューブラスチンポリペプチドの成熟ペプチドに対して、少なくとも７０％、より好ましくは８５％、なおより好ましくは９０％、またはなおさらに好ましくは９５％の同一性または類似性を有する。最も好ましくは、使用されるニューブラスチンポリペプチドは、配列番号１０〜２３におけるニューブラスチンポリペプチドの成熟ペプチドに対して、少なくとも９９％の同一性または類似性を有する。

候補ポリペプチドが本発明のニューブラスチンポリペプチドと相同性を共有する程度は、２つのアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度として決定される。

高レベルの配列同一性は、第１の配列が第２の配列に由来する可能性を示す。アミノ酸配列の同一性は、２つのアラインされた配列間での同一のアミノ酸配列を必要とする。従って、参照配列と７０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメントに従うと、候補配列中のアミノ酸の７０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。同一性は、コンピュータ分析によって決定され、これは例えば、非限定的に、ＣｌｕｓｔａｌＸコンピュータアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ、Ｇｉｂｓｏｎ ＴＪ、Ｐｌｅｗｎｉａｋ Ｆ、Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ Ｆ、およびＨｉｇｇｉｎｓ ＤＧ：「Ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｉｄｅｄ ｂｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌｓ」；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７、２５（２４）：４８７６−８２）およびそこに示唆されているデフォルトパラメーターである。このプログラムを使用して、本発明の類似のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの成熟部分は、配列番号１０（ヒトＮＢＮ）、配列番号１１および１２（齧歯類ＮＢＮ）として本明細書に提示されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは８５％、なおより好ましくは９０％、またはなおさらに好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の程度の同一性を示す。

他のアラインメントツールが公知であり、これは例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）に記載されたダイナミックプログラミングアルゴリズム、およびＤＮＡｓｔａｒ社によって製造された市販のソフトウェアパッケージであるＡｌｉｇｎ Ｐｒｏｇｒａｍがあり、これらの教示は参照として本明細書に援用される。一旦、候補配列と参照配列との間のアラインメントがなされ、リファインされたならば、相同性スコアパーセントが計算される。各配列の個々のアミノ酸は、互いに対するそれらの類似性に従って連続的に比較される。

類似性の要因には、類似のサイズ、形状、および電荷が含まれる。アミノ酸の類似性を決定する１つの特に好ましい方法は、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３４５−３５２（１９７８および補遺）（参照として本明細書に援用される）において記載されるＰＡＭ２５０マトリックスである。類似性スコアは、最初に、対でアラインされたアミノ酸類似性スコアの総計として計算される。挿入および欠失は、相同性および同一性のパーセントの目的のために無視される。従って、ギャップペナルティーはこの計算においては使用されない。

次いで、未加工スコアが、それを候補化合物およびニューブラスチンポリペプチドの７個のシステイン骨格のスコアの相乗平均によって除算することによって標準化される。相乗平均は、これらのスコアの積の平方根である。標準化された未加工スコアが相同性パーセントである。

上記に注記されるように、本発明のニューブラスチンポリペプチドは改変体ポリペプチドを含む。本発明の状況において、用語「改変体ポリペプチド」は、配列番号１０、１３、１４、１９、２０、２１、２２、もしくは２３（ヒトＮＢＮ）、または配列番号１１、１２、１５〜１８（齧歯類ＮＢＮ）の一部として提示される成熟ペプチドと、１つ以上のアミノ酸位置において異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド（またはタンパク質）を含む。このような改変体ポリペプチドは、上記の修飾ポリペプチド、ならびに保存性置換、スプライシング改変体、アイソフォーム、他の種からのホモログ、および多型を含む。

本明細書に規定されるように、用語「保存性置換」とは、別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置き換えを意味する。典型的には、生物学的類似性は、上記に言及されるように、保存性アミノ酸を有する野生型配列上の置換を反映する。

ニューブラスチンポリペプチドの配列中のアミノ酸についての置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る（表１を参照のこと）。さらに、種々のアミノ酸が、中性アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンで一般的に置換される（例えば、ＭａｃＬｅｎｎａｎら、１９９８、Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．、６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３５：１−２４を参照のこと）。複数の置換は本発明の範囲に含まれる。しかし、本発明のすべてのニューブラスチンポリペプチドは、下記Ｃ節に説明されるようなネイティブニューブラスチンの少なくとも１種の活性を有さなくてはならない。以下の表もまた参照のこと。

例えば、特に保存性置換がポリペプチドまたはタンパク質中の残基の総数の１０％未満を表す場合に、生物学的活性にほとんど効果を有さないか、または全く効果を有さない保存性アミノ酸置換が期待される。好ましくは、保存性アミノ酸置換は、ポリペプチドまたはタンパク質の５％未満、最も好ましくはポリペプチドまたはタンパク質の２％未満の変化を表す。

１つの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドは、１５アミノ酸までの置換、例えば、１２アミノ酸までの置換、例えば、１０アミノ酸までの置換、例えば、８アミノ酸までの置換、例えば、５アミノ酸までの置換を含む。例えば、ヒト１１３ＮＢＮに従って計算される場合、最も好ましい保存性置換は、野生型成熟アミノ酸配列における３個より少ないアミノ酸置換を表す。特に好ましい実施形態において、成熟配列において単一のアミノ酸置換が存在し、ここで、置換されるアミノ酸と置き換えるアミノ酸の両方が環状ではない。特定の保存性置換の他の例には、１つの疎水性残基の別の疎水性残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン）の代わりの置換、または１つの極性残基の別の極性残基の代わりの置換、例えば、アルギニンのリジンの代わりの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸の代わりの置換、またはグルタミンのアスパラギンの代わりの置換などが含まれる。

用語「保存性置換」はまた、置換されたポリペプチドに対して惹起された抗体もまた非置換のポリペプチドと免疫反応するという条件で、未置換の親のアミノ酸の残基の代わりの置換アミノ酸残基の使用を含む。

この一次アミノ酸配列の修飾は、未修飾の対応物ポリペプチドと比較した場合に、実質的に等価な活性を有するタンパク質を生じ得、従って、親のタンパク質の機能的アナログと見なされ得る。このような修飾は意図的なもの、例えば、部位特異的変異誘発によるものであり得るか、または自発的に起こり得、そしてスプライシング改変体、アイソフォーム、他の種からのホモログ、および多型を含む。このような機能的アナログもまた、本発明に従って意図される。

ヒト、マウス、およびラットからの９９個のＣ末端アミノ酸のアラインメントが以下に示される：

置換は好ましくは、「星印なし」、「．」または「：」で印付けられた非保存性の位置において行われる。

置換のための他の好ましい位置は「％」で示される。

さらに、一次アミノ酸配列の修飾は、親のタンパク質の生物学的活性を保持していないタンパク質（ドミナントネガティブ型などを含む）を生じ得る。ドミナントネガティブタンパク質は、通常ポリペプチドと機能的に相互作用する上流または下流の成分などの調節因子に結合するか、またはそれを隔離することによって、野生型タンパク質に干渉し得る。このようなドミナントネガティブ型もまた、本発明に従って意図される。

生物学的に活性型の短縮型ニューブラスチンは、ＷＯ ０２／０７２８２６（ＮｓＧｅｎｅおよびＢｉｏｇｅｎ）から公知である。短縮型および変異型のニューブラスチン分子もまた、ＷＯ ０２／０６０９２９（Ｂｉｏｇｅｎ）から公知であり、とりわけ、変異型ニューブラスチンは、配列番号１４のアミノ酸８〜１１３に由来するアミノ酸配列を含み、ここで、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、この改変体ポリペプチドのアミノ酸配列における１４位のアルギニン以外のアミノ酸、この改変体ポリペプチドのアミノ酸配列における３９位のアルギニン以外のアミノ酸、この改変体ポリペプチドの６８位のアルギニン以外のアミノ酸、およびこの改変体ポリペプチドの９５位のアスパラギン以外のアミノ酸からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸の、例えば、リジンへ残基への置換を含み、ここでこのアミノ酸の位置は配列番号１０のポリペプチド配列に従って番号付けされている。変異型は、上記のように短縮され得るか、または成熟タンパク質の全長を含み得る（配列番号１４のアミノ酸１〜１１３）。好ましくは、１４位、３９位、または６８位のアミノ酸はリジンである、
（シグナルペプチドの切断）
発現構築物に取り込むための特定のニューブラスチン型について決定する前に、シグナルペプチド、例えば、Ｉｇｓｐの切断の可能性が、最先端の予測ツールを使用してチェックされ得る。１つのこのような好ましい予測ツールは、シグナルＰ ＷＷＷサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／シグナルＰ−２．０／）において入手可能なシグナルＰソフトウェアであり、より好ましくは、より新しいバージョン３．０が同じサーバーから入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／シグナルＰ−３．０／）。

シグナルＰ ＷＷＷサーバーは、使用者の配列の各位置について０から１までの３通りのスコアを返す。

（Ｃ−スコア（未加工切断部位スコア））
ネットワークからの出力スコアは切断部位対他の配列位置を認識するように指向されている。以下のように指向されている：
ハイ ＋１位（切断部位の直後）
ロー すべての他の位置。

（Ｓ−スコア（シグナルペプチドスコア））
ネットワークからの出力スコアはシグナルペプチド対非シグナルペプチド位置を認識するように指向されている。以下のように指向されている：
ハイ 切断部位の前のすべての位置
ロー 切断部位の後３０位 および
非分泌タンパク質のＮ末端。

（Ｙ−スコア（組み合わせた切断部位スコア））
切断部位の位置の予測は、Ｃ−スコアが高く、かつＳ−スコアがハイ値からロー値までの変化する箇所を観察することによって最適化される。Ｙ−スコアは、Ｓ−スコアの傾きと、Ｃ−スコアの高さを組み合わせることによってこれを定式化する。具体的には、Ｙ−スコアは、Ｃ−スコアと、Ｓ−スコアの平滑化された派生値との間の相乗平均である（すなわち、現在の位置の前のｄ位置および後のｄ位置にわたる平均Ｓ−スコア間の違いであり、ここで、ｄは選択されたネットワークアンサンブルとともに変化する）。

３つすべてのスコアは、データの異なる分配に対して指向された５つのネットワークの平均である。

各配列について、シグナルＰは最大のＣ−スコア、Ｓ−スコア、およびＹ−スコア、ならびにＮ末端と予測切断部位との間の平均Ｓ−スコアを報告する。これらの値は、シグナルペプチドと非シグナルペプチドとの間を区別するために使用される。使用者の配列がシグナルペプチドを有すると予測される場合、その切断部位は、最大Ｙ−スコアを有する位置の直前であると予測される。

典型的なシグナルペプチドについて、Ｃ−スコアおよびＹ−スコアは、＋１位で高いのに対して、Ｓ−スコアは切断部位の前で高く、その後で低い。

比較のために、予測は、野生型ニューブラスチンシグナルペプチドの予測された切断（プレプロＮＢＮのアミノ酸番号３９と４０の間の切断）に対して比較され得る。

好ましいニューブラスチンは、シグナルＰ−ＮＮプログラムまたはシグナルＰ−ＨＭＭプログラムのいずれかにおいて、シグナルペプチドとニューブラスチンとの間の予測された切断を有するものである。これらには、ＮＢＮ１１３、ＮＢＮ１０６、ＮＢＮ１０４、ＮＢＮ１０２、およびＮＢＮ９９が含まれるがこれらに限定されない。特に好ましいものは、ＳｉｇｎａＰ−ＮＮとシグナルＰ−ＨＭＭの両方においてこの位置における予測されたシグナルペプチドを有するニューブラスチンである。これらには、ＮＢＮ１１３およびＮＢＮ９９が含まれる。

より新しいバージョン（３．０）はまた、このシグナルペプチドを使用する分泌のレベルを問題のタンパク質と相関させるために見いだされる「シグナルペプチド性」を記述する新規スコアＤまたはＤｍａｘ（識別スコア）を含む。

本発明において使用されるシグナルペプチドが少なくとも０．５、例えば、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８のＤｍａｘ値を、選択されたニューブラスチンポリペプチドとともに示すことが好ましい。

（医学的用途および治療の方法）
１つの局面において、本発明は、神経系障害の治療のための医薬の調製のための本発明に従うベクターの使用に関する。この神経系障害は、末梢神経系または中枢神経系の障害であり得る。

ニューブラスチンは、ニューロン（損傷したニューロンおよび外傷を受けたニューロンを含むがこれらに限定されない）における欠損を治療するために有用である。外傷を受けた末梢神経には、髄質の神経または脊髄の神経が含まれるがこれらに限定されない。ニューブラスチンは、神経変性性疾患（例えば、虚血性脳神経損傷）；神経障害（例えば、末梢神経障害）、アルツハイマー病、ハンティングトン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などのＣＮＳ障害の治療のために有用である。ニューブラスチンはさらに、記憶障害、例えば、痴呆に関連する記憶障害の治療における使用のために意図される。

ニューブラスチンはまた、哺乳動物における末梢神経障害、例えば、神経障害性の疼痛を治療するための治療剤候補として知られている。神経障害性の疼痛は、毒素で誘導される神経損傷、病原体で誘導される神経損傷、外傷で誘導される神経損傷、薬物で誘導される神経損傷、特発性神経障害、糖尿病性神経障害、炎症誘導性神経損傷、または神経変性に付随し得る。ニューブラスチンはまた、哺乳動物における末梢神経障害のために使用され得る。末梢神経障害は、外傷誘導性の神経障害、ウイルス誘導性の神経障害、化学療法誘導性の神経障害、毒素誘導性の神経障害、薬物誘導性の神経障害、ビタミン欠乏誘導性の神経障害、特発性神経障害および糖尿病性の神経障害からなる群を含み得る。神経障害性の疼痛の治療のための方法および組成物は、ＷＯ ０２／０７８７３０（Ｂｉｏｇｅｎ）において開示される。

好ましくは、ニューブラスチンは、神経障害性の疼痛、脊髄損傷、脊髄神経根剥離、疼痛性チック、カウザルギー、角膜損傷、および網膜症を含む末梢神経障害からなる群より選択される障害を治療するために使用される。

本発明の１つの好ましい実施形態に従うと、治療される神経変性性疾患は、パーキンソン病である。ニューブラスチンは、ドーパミン作動性ニューロンの生存を増加させることが知られている（ＷＯ ００／０１８１５ ＮｓＧｅｎｅ；Ｂａｌｏｈら、１９９８ Ｎｅｕｒｏｎ ２１：１２９１−１３０２）。

また、本発明のベクター、カプセル、および組成物は、色素性網膜炎、黄斑変性、緑内障、および糖尿病性網膜症などの眼の疾患の治療のために使用され得る。ニューブラスチンはまた、角膜損傷および潰瘍の治療において使用され得る（ＥＰ １ ２２３ ９９６ Ｂｉｏｐｈａｒｍ）。

神経系疾患は、その必要がある個体に、治療有効量の本発明のベクター、または治療有効量の本発明の薬学的組成物を投与することによって治療され得る。

形質転換されるため、または裸のもしくはカプセル化された細胞をそこに移植する脳の部分についての定位座標もまた提供される（表ＩＩ）。

上記の表において：内側外側寸法は脳の正中に関し、前方後方寸法は前交連と後交連との間の中点に関し、後方の方向をネガティブに示し、背側腹側寸法は前交連と後交連との間の中点を接続する線に関し、その線に対して腹側をネガティブとし、すべての寸法はセンチメートルであり、Ｇｐｅは淡蒼球の外部セグメントを意味し、Ｇｐｉは淡蒼球の内部セグメントを意味し、Ｓｎｒは黒質網様部を意味し；ＳＴＮは視床下核を意味し；ＮＢＭはマイネルトの基底核を意味し、そしてｃａｕｄａｔｅは尾状核を意味する。

インビボ形質転換の代わりに、神経系疾患は、その必要がある個体に、
ｉ．本発明に従う形質転換もしくはトランスフェクトされた細胞の治療有効量；または
ｉｉ．形質転換またはトランスフェクトされた細胞を含む移植可能デバイス
を移植することによって治療され得る。

好ましくは、移植は細胞または移植可能デバイスを含む。

この移植は、自系移植、同種異系移植、または異種移植を含み得る。

（中枢神経系における神経変性性障害の治療のための標的組織）
重要なパラメーターは適切な標的組織の選択である。脳の領域は、神経栄養因子に対するその保持された応答性について選択される。領域の標的化は、本明細書に記載されるような遺伝子治療ベクターの投薬量単位を送達することによって、または本発明に従う裸の細胞もしくはカプセル化された細胞を移植することによって達成され得る。

ヒトにおいては、成人期まで神経栄養因子に対する応答性を保持するＣＮＳニューロンには、コリン作動性前脳基底核ニューロン、嗅内皮質ニューロン、視床ニューロン、青斑核ニューロン、脊髄感覚ニューロン、および脊髄運動ニューロンが含まれる。

最初のスキャン、例えば、ＭＲＩスキャンは、治療部位の正確な位置を決定するために患者に対し実行され得る。例えば、パーキンソン病を治療する際には、黒質を含む基底核が治療部位である。脳の罹患した領域は、５以下の送達部位の選択がドーパミン作動性ニューロンの臨床的に有意な数の回復のために十分であるようなサイズであるらしい。同じ数の送達部位が脳の外側に提供され得る。

インビボ遺伝子治療のために、送達は全身的または局所的であり得る。全身的送達によって、筋肉内、皮下、または腹腔内の遺伝子治療ベクターの投与が意図され、これは、循環系へのニューブラスチンの連続的放出を生じる。

インビボ遺伝子治療のために、特異的インビボ遺伝子送達部位が、ニューロンまたは末端の損失の領域中でクラスター化するように選択される。このような領域は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）および生検を含む多数の公知の技術を使用して臨床的に同定され得る。ヒトにおいては、非侵襲性の、インビボ映像化方法（例えば、ＭＲＩ）が好ましい。ニューロンまたは末端の損失の領域が一旦同定されると、送達部位が定位的分布のために選択され、それゆえにニューブラスチンの各単位投薬量が、標的とされた細胞において、またはその細胞から５００μｍ以内、かつ別の送達部位から約１０ｍｍ以下で、脳または脊髄に送達される。脳内において、遺伝子治療ベクターは、実質または脳室に投与され得る。

眼内において、遺伝子治療ベクターは、硝子体、網膜下腔、およびサブテナーカプセルに投与され得る。

末梢神経障害（神経障害性の疼痛を含む）の治療のために、遺伝子治療ベクターは、痛覚の伝達に関与する身体の領域に投与され得る。このような領域は、脊髄投与およびクモ膜下腔内投与を含み得る。

１つの実施形態において、ベクターは、筋肉内、皮下、または腹腔内に投与され得る。別の実施形態において、ベクターまたは組成物は、痛覚の伝達に関与する身体の領域に投与され得る。第３の実施形態において、このベクターまたは組成物は、脊髄投与またはクモ膜下腔内に投与され得る。第４の実施形態において、ベクターは、硝子体、網膜下腔、およびサブテナーカプセルを含む眼に投与される。

（インビボ遺伝子治療のための用量要件および送達プロトコール）
さらなる重要なパラメーターは、標的組織に送達されるニューブラスチンの投薬量である。この点に関して、「単位投薬量」とは、一般的に、ニューブラスチン組成物のニューブラスチン／ｍｌの濃度をいう。ウイルスベクターについては、ニューブラスチン濃度は、神経栄養組成物のウイルス粒子の数／ｍｌによって規定される。最適には、ウイルス発現ベクターを使用するニューブラスチンの送達のためには、ニューブラスチンの各単位投薬量は、２．５〜２５μＬのニューブラスチン組成物を含み、ここで、この組成物は、ウイルス発現ベクターを薬学的に受容可能な液体中に含み、ニューブラスチン組成物のｍｌあたり１０^１０から１０^１５までのニューブラスチン含有ウイルス粒子を提供する。このような高い力価は特にアデノ関連ウイルスのために使用される。レンチウイルスについては、力価は通常より低く、例えば、１０^８から１０^１０形質転換単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）であり、実施例２に記載されるように決定される。

ニューブラスチン組成物は、マイクロインジェクション、注入、スクレイプローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、エレクトロポレーション、または外科的切開を通して送達部位組織に組成物を直接送達するために適切である他の手段によって、標的組織中の各送達細胞部位に送達される。送達は、ゆっくりと、例えば、約５〜１０分間の時間にわたって達成される（送達されるニューブラスチン組成物の総量に依存する）。

当業者は、本発明によって利用される直接的送達方法が、インビボ遺伝子治療に付随する限定的なリスク要因、すなわち、導入遺伝子をコードするニューブラスチンを有するベクターでの、標的とされていない細胞の形質転換についての潜在能力を除去することを理解する。本発明においては、送達は直接的であり、送達部位は選択され、それゆえに分泌されたニューブラスチンの拡散は、標的とされていない細胞との接触を最小化しながら、標的とされたニューロンとの接触を最適化するために、制御されかつ所定の領域にわたって起こる。

（遺伝子治療ベクター）
広範に、遺伝子治療は、患者への治療的利益を生じることを伴って、患者の細胞に新たな遺伝子物質を移動させることを探求する。このような利益には、広い範囲の疾患、障害、および他の状態の治療または予防が含まれる。

エキソビボ遺伝子治療アプローチは、単離された細胞の修飾、次いでこれを患者に注入、移植（ｇｒａｆｔ）、またはさもなくば移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）することを含む。例えば、米国特許第４，８６８，１１６号、同第５，３９９，３４６号、および同第５，４６０，９５９号を参照のこと。インビボ遺伝子治療は、インビボで宿主患者組織を直接的に標的化することを探求する。

遺伝子移入ベクターとして有用なウイルスには、パポバウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスが含まれる。適切なレトロウイルスには、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、およびＭｏＭＬＶからなる群が含まれる。

神経系の障害の治療のために好ましいウイルスは、レンチウイルスおよびアデノ関連ウイルスである。両方の型のウイルスは、細胞分裂なしでゲノムに組み込まれ得、そして両方の型が、神経系、特に中枢神経系の適応のための前臨床的動物研究において試験されてきた。

ＡＡＶの調製のための方法は当該分野において記載されており、例えば、米国特許第５，６７７，１５８号、米国特許第６，３０９，６３４号、および米国特許第６，６８３，０５８号は、中枢神経系へのＡＡＶの送達の例を記載している。

特定のかつ好ましい型のレトロウイルスには、細胞に形質転換し得、かつ細胞分裂なしでそのゲノムに組み込まれ得るレンチウイルスが含まれる。従って、好ましくは、ベクターは複製欠損レンチウイルスベクターである。このようなレンチウイルス粒子は、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、この融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドシグナルに作動可能に連結されたプロモーター、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、ならびに３’レンチウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスベクターから産生され得る。レンチウイルスの調製および神経細胞へのインビボ投与のための方法は、ＵＳ ２００２００３７２８１（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ）に記載されている。

レトロウイルスベクターはヒト臨床試験において最も一般的に使用されているベクターである。なぜなら、これらは７〜８ｋｂと、多くの他のウイルスベクターよりも大きく、かつこれらは、細胞を感染させ、それらの遺伝子物質を宿主細胞に高い効率で安定して組み込む能力を有するからである。例えば、ＷＯ ９５／３０７６１、ＷＯ ９５／２４９２９を参照のこと。オンコウイルスは、患者への外因性核酸配列の移動および組み込みのために、少なくとも１ラウンドの標的細胞増殖を必要とする。レトロウイルスベクターは、患者のゲノムにランダムに組み込まれる。

２つのクラスのレトロウイルス粒子が記載されている。マウス細胞に効率的に感染し得るエコトロピック、および多くの種の細胞に感染し得るアンホトロピックである。第３のクラスには、ゼノトロピックレトロウイルスが含まれ、これは、ウイルスを産生する種以外の別の種の細胞に感染し得る。分裂している細胞のゲノムにのみ組み込まれるこれらの能力が、発生研究において細胞系統をマークするため、および癌または腫瘍に対して治療遺伝子または自殺遺伝子を送達するための魅力的なレトロウイルスを作製した。これらのベクターは、成人患者において細胞分裂が比較的欠けている中枢神経系において特に有用であり得る。

ヒト患者における使用のために、レトロウイルスベクターは、複製欠損性でなくてはならない。これは、標的組織中での感染性レトロウイルス粒子のさらなる生成を妨害する−その代わりに、複製欠損ベクターは、標的細胞ゲノムに安定に組み込まれる「捕獲性」の導入遺伝子となる。典型的には、複製欠損ベクターにおいて、遺伝子ｇａｇ、ｅｎｖ、およびｐｏｌが欠失されている（ウイルスゲノムの残りの大部分とともに）。異種ＤＮＡは欠失したウイルス遺伝子の代わりに挿入される。この異種遺伝子は、内因性の異種プロモーター、標的細胞中で活性な別の異種プロモーター、またはレトロウイルス５’ＬＴＲ（ウイルスＬＴＲは多様な組織中で活性である）の制御下にあり得る。典型的には、レトロウイルスベクターは、約７〜８ｋｂの導入遺伝子容量を有する。

複製欠損ウイルスベクターは、複製のために必要なウイルスタンパク質の供給、および例えば、操作されたパッケージング細胞株からの、トランスでのアセンブリーを必要とする。パッケージング細胞が複製コンピテントなウイルスおよび／またはヘルパーウイルスを放出しないことは重要である。このことは、Ψシグナルを欠くＲＮＡからウイルスタンパク質を発現すること、および別個の転写単位からのｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を発現することによって達成されてきた。さらに、あるパッケージング細胞株において、５’ＬＴＲはこれらの遺伝子の発現を制御する非ウイルス性プロモーターで置換されており、ポリアデニル化シグナルが加えられている。これらの設計は、複製コンピテントベクターおよびヘルパーウイルスの産生をもたらす組換えの可能性を最小化する。例えば、米国特許第４，８６１，７１９号（参照として本明細書に援用される）を参照のこと。

本発明はさらに、ニューブラスチンポリペプチドおよびシグナル配列をコードする核酸配列を含む核酸構築物に関する。シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドは、上記に記載された通りである。従って、ある実施形態において、核酸構築物は、プレプロニューブラスチンポリペプチドの１１３Ｃ末端コドンからなる配列をコードする。特定の実施形態において、この核酸は、プレプロニューブラスチンポリペプチドの１０４Ｃ末端コドンからなる配列をコードする。

核酸配列は、アルブミンシグナル配列（例えば、ラットアルブミンシグナル配列）などの異種シグナルペプチドを含み得、かつ配列番号６５の核酸配列を含む。ある実施形態において、核酸構築物は、修飾アルブミンシグナル配列、例えば、ラットアルブミンシグナル配列をコードする。１つの例示的な実施形態は、配列番号６９を含む核酸構築物である。他の実施形態において、核酸構築物は、ヒト成長ホルモンシグナル配列をコードする。１つの例示的な実施形態は、配列番号６７を含む核酸構築物である。ヒト成長ホルモンシグナル配列はイントロンを含み得る。

本発明の特定の実施形態において、核酸構築物は、トランスフェクトされた宿主細胞中での発現のために最適化された核酸配列を含む。コドン使用頻度の最適化は、ポリペプチド収量の増加、または転写もしくは翻訳の効率の改善を提供することによって有利であり得る。本発明の最適化された核酸構築物の１つの例示的な実施形態は、配列番号５９に示される。

１つより多くのコドンが同じアミノ酸をコードし得る、遺伝コードの公知の縮重に起因して、ＤＮＡ配列は、配列番号６５、６７、または６９に記載されるものから変化され得、かつなお配列番号６６、６８、または７０の対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする。このような改変体ＤＮＡ配列は、サイレント変異から生じ得るか（例えば、ＰＣＲ増幅の間に起こる）、またはネイティブな配列の意図的な変異誘発の生成物（例えば、コドン最適化）であり得る。

核酸構築物はベクターであり得る。適切なプラスミドベクターの例には、ｐＦＲＴ／ｌａｃ Ｚｅｏ、ｐＦＲＴ／ｄｈｆｒ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＵＣ、ｐＧＥＭ、およびｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）が含まれるがこれらに限定されない。他の適切なベクターには、等価な機能を発揮するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）が含まれる。

（発現ベクター）
発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つ以上の調節配列を含み得る。調節配列の例には、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、１９９０ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３に記載されている。調節配列には、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存することが当業者によって理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され得、それによってタンパク質またはペプチドを産生する。

本発明における使用のためのニューブラスチンの組換え発現のためのベクターの構築は、当業者に対して詳細な説明を必要としない、従来的な技術を使用して達成され得る。しかし、概説として、当業者は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏａｔｏｒｙ（ＮＹ １９８２）を参考にするよう希望するかもしれない。

手短に述べると、組換え発現ベクターの構築は、標準的なライゲーション技術を利用する。構築されたベクター中の正確な配列を確認するための分析として、ライゲーション混合物が宿主細胞にトランスフェクト／形質転換するために使用され得、そして首尾よく遺伝子が変化した細胞が、適切な場合、抗生物質耐性によって選択され得る。

トランスフェクト／形質転換された細胞からのベクターは、例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９：３０９−，１９８１）、Ｍａｘａｍらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９，１９８０）、Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ法、または当業者に公知である他の適切な方法によって、調製され、制限消化され、および／または配列決定される。

切断されたフラグメントのサイズ分離は、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇ、１３３〜１３４、１９８２）によって記載されるように、従来的なゲル電気泳動を使用して実行される。

本発明において利用される発現エレメントは、それらの強度および特異性が異なり得る。利用される宿主／発現系に依存して、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメントが、発現ベクターにおいて使用され得る。哺乳動物細胞系におけるクローニングの場合、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）が使用され得る。複数コピーの発現産物を含む細胞株を生成する場合には、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−およびＥＢＶ−ベースのベクターが、適切な選択マーカーとともに使用され得る。

遺伝子の発現は、転写、翻訳、または翻訳後のレベルにおいて制御される。転写の開始は、遺伝子発現の初期でありかつ決定的な事象である。これは、プロモーター配列およびエンハンサー配列に依存し、かつこれらの配列と相互作用する特定の細胞因子によって影響される。多くの原核生物遺伝子の転写単位はプロモーターからなり、そしてある場合においてエンハンサーまたはレギュレーターエレメントからなる（Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ ２７：２９９（１９８１）；Ｃｏｒｄｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４０６（１９８０）；ならびにＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０：３４９（１９８１））。レトロウイルスについては、レトロウイルスゲノムの複製に関与する制御エレメントが長末端反復（ＬＴＲ）に存在する（Ｗｅｉｓｓら編、Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＲＮＡ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（ＮＹ １９８２））。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲはプロモーター配列およびエンハンサー配列を含む（Ｊｏｌｌｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１８５５（１９８３）；Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｅｎｈａｎｃｅｒ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＧｕｌｚｍａｎおよびＳｈｅｎｋ編、１０１−１０２頁、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＮＹ １９９１））。他の強力なプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および他の野生型ウイルスプロモーターに由来するものが含まれる。

多数の非ウイルスプロモーターのプロモーター領域およびエンハンサー領域もまた、記載されている（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８５（１９８５）；ＲｏｓｓｉおよびｄｅＣｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５５９０−５５９４（１９８７））。静止細胞中での導入遺伝子の発現を維持および増加するための方法は、１型コラーゲンプロモーター（１および２）（ＰｒｏｃｋｏｐおよびＫｉｖｉｒｉｋｋｏ、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：３７６（１９８４）；ＳｍｉｔｈおよびＮｉｌｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９：１８２０（１９８０）；ｄｅ Ｗｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８：１４３８５（１９８３））、ＳＶ４０プロモーター、およびＬＴＲプロモーターを含むプロモーターの使用を含む。

哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が利用されている。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、コード配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三成分リーダー配列にライゲートされ得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）中への挿入は、感染した宿主中で生存能力がありかつペプチドを発現可能である組換えウイルスを生じる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３６５５を参照のこと）。代替的には、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが使用され得る（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：７９；７４１５；Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：４９２７を参照のこと）。

本発明の１つの実施形態に従うと、プロモーターは、ユビキチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＪｅＴプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、および伸長因子１α（ＥＦ１−α）プロモーターからなる群より選択される構成的プロモーターである。

誘導性／抑制性プロモーターの例には、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ラパマイシン誘導性プロモーターＭｘ１が含まれる。

導入遺伝子発現を駆動するためにウイルス性および非ウイルス性プロモーターを使用することに加えて、エンハンサー配列が、導入遺伝子発現のレベルを増加させるために使用され得る。エンハンサーは、それらのネイティブな遺伝子の転写活性のみならず、ある外来性遺伝子の転写活性も増加させ得る（Ａｒｍｅｌｏｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７０：２７０２（１９７３））。例えば、本発明において、コラーゲンエンハンサー配列が、導入遺伝子発現を増加させるためにコラーゲンプロモーター２（Ｉ）とともに使用される。さらに、ＳＶ４０ウイルスにおいて見いだされたエンハンサーエレメントが、導入遺伝子発現を増加させるために使用され得る。このエンハンサー配列は、Ｇｒｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：９４３（１９８１）；ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４（１９８１）、ならびにＦｒｏｍｍおよびＢｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１：４５７（１９８２）（これらのすべては参照として本明細書に援用される）によって記載されるように、７２塩基対反復からなる。この反復配列は、種々のプロモーターと連続して存在する場合には、多くの異なるウイルス遺伝子および細胞遺伝子の転写を増加し得る（Ｍｏｒｅａｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：６０４７（１９８１））。

導入遺伝子発現はまた、プロモーター活性を調節するためにサイトカインを使用する長期的に安定な発現のために増加され得る。いくつかのサイトカインが、コラーゲン２（Ｉ）プロモーターおよびＬＴＲプロモーターからの導入遺伝子の発現を調節することが報告されている（Ｃｈｕａら、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，２５：１６１−１７０（１９９０）；Ｅｌｉａｓら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５８０：２３３−２４４（１９９０）；Ｓｅｌｉｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２１３８−２１４４（１９８８）およびＳａｌｉｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２：６１９−６２１（１９８８））。例えば、トランスフォーミング成長因子（ＴＯＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１、およびインターフェロン（ＩＮＦ）は、ＬＴＲなどの種々のプロモーターによって駆動される導入遺伝子の発現をダウンレギュレートする。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＴＧＦ１は、プロモーターによって駆動される導入遺伝子の発現をアップレギュレートし、かつこれを制御するために使用され得る。有用であることが証明され得る他のサイトカインには、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）が含まれる。

コラーゲンエンハンサー配列（Ｃｏｌｌ（Ｅ））を有するコラーゲンプロモーターはまた、その免疫保護状態にも関わらず治療された脳において生成され得るベクターに対してさらなるいかなる免疫応答も抑制することによって導入遺伝子発現を増加するために使用され得る。さらに、ステロイド、例えば、デキサメタゾンを含む抗炎症剤は、ベクター組成物が送達された直後に治療された宿主に投与され、好ましくは、任意のサイトカイン媒介炎症性応答が鎮静化されるまで継続され得る。シクロスポリンなどの免疫抑制剤もまた、インターフェロンの産生を減少するために投与され得、これは、ＬＴＲプロモーターおよびＣｏｌｌ（Ｅ）プロモーター−エンハンサーをダウンレギュレートし、そして導入遺伝子発現を減少する。

ベクターは、Ｃｒｅ−リコンビナーゼタンパク質、およびＬｏｘＰ配列をコードする配列などのさらなる配列を含み得る。ニューブラスチンの一過性の発現を保証するさらなる方法は、細胞へのＣｒｅ−リコンビナーゼの投与に際してか（Ｄａｅｗｏｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９：９２９−９３３）、またはウイルス構築物にリコンビナーゼをコードする遺伝子を組み込むことにより（Ｐｌｕｃｋ、Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈ、７７：２６９−２７８）、挿入されたＤＮＡ配列の一部の切除をもたらすＣｒｅ−ＬｏｘＰ系の使用を通してである。ＬｏｘＰ部位および構造遺伝子（本発明の場合においてはニューブラスチン）とともに、ウイルス構築物中にリコンビナーゼについての遺伝子を取り込むことは、しばしば、約５日間の期間の間、構造遺伝子の発現を生じる。

本発明の方法において使用されるベクターはまた、首尾よく形質転換された宿主細胞を同定するために使用され得る選択マーカーをコードする核酸配列を含み得る。培養された哺乳動物細胞中での使用のための適切な選択マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子を含む。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。１つの増幅可能な選択マーカーはＤＨＦＲ遺伝子である。別の適切な増幅可能なマーカーはＤＨＦＲｒ ｃＤＮＡである（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８０：２４９５）。さらなる選択マーカーはＴｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ）によって概説されている。適切な選択マーカーは当業者によって選択され得る。選択マーカーは、ニューブラスチンプレ配列と同じベクター中で、または別個のベクターの一部として宿主細胞に導入され得る。選択マーカーおよびニューブラスチン配列は、異なるプロモーターまたは同じプロモーターの制御下にあり得、後者の配列は二シストロン性メッセンジャーを産生する。この型の構築物は当該分野において公知である（例えば、米国特許第４，７１３，３３９号を参照のこと）。

本発明の方法において使用される発現ベクターはまた、組換え的に産生されるニューブラスチンポリペプチドの精製を容易にするタグをコードし得る。例には、ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９８３、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１）が含まれるがこれに限定されず、ここでは、本明細書に記載されるニューブラスチンポリペプチドのコード配列が、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターにライゲートされ得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを有するニューブラスチンポリペプチドを発現するために使用され得る。これらのタンパク質は、通常可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着、続いて遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって、細胞から容易に精製され得る。ベクターは、精製後のタグの容易な除去のための切断部位（トロンビンまたはＸａプロアテーゼ因子またはＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，Ｎ．Ｊ．））を含む。他の融合タグは当該分野において公知であり、例えば、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質タグである。

（遺伝子治療のための薬学的調製物）
本発明における使用のためにニューブラスチン組成物を形成するために、ニューブラスチンをコードする発現ウイルスベクターが、薬学的に受容可能な懸濁物、溶液、または乳化物に配置される。適切な媒体には、生理食塩水およびリポソーム調製物が含まれる。

より詳細には、薬学的に受容可能なキャリアには、滅菌した、水性または非水性の溶液、懸濁物、および乳化物が含まれ得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアには、水、アルコール性／水性溶液、乳化物、または懸濁物が含まれ、これには生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または不揮発性油が含まれる。

静脈内ビヒクルには、液体および栄養補充物、電解質補充物（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが含まれる。

保存料および他の添加物、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどもまた、存在し得る。さらに、ニューブラスチン導入遺伝子の組成物は、本発明に従う引き続く再構成および使用のために、当該分野において周知の手段を使用して凍結乾燥され得る。

コロイド分散系もまた、標的化される遺伝子送達のために使用され得る。

コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質に基づく系（水中油型乳化物、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が含まれる。リポソームは、インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用である人工膜ベシクルである。０．２〜４．０μｍの範囲のサイズである大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含む水性緩衝液の実質的なパーセンテージをカプセル化しうることが示されてきた。ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびインタクトなビリオンは、水性の内部にカプセル化され得、生物学的に活性型である細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、および細菌の細胞中に、作動可能にコードされる導入遺伝子の送達のために使用されてきた。リポソームが効率的な遺伝子移入ビヒクルであるために、以下の特徴が存在するべきである：（１）それらの生物学的活性を損なわないで、高い効率でのニューブラスチンをコードする遺伝子のカプセル化；（２）非標的細胞と比較して、優先的かつ実質的な標的細胞への結合；（３）高い効率での標的細胞細胞質へのベシクルの水性内容物の送達；および（４）遺伝情報の正確かつ効率的発現（Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、６：６８２、１９８８）。

リポソームの組成物は、通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み合わせであって、通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせる。他のリン脂質または他の脂質もまた、使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。

リポソーム製造において有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドが含まれる。特に有用なのはジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここで、脂質部分は１４〜１６炭素原子、特に１６〜１８炭素原子を含み、かつ飽和している。例証的なリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。

リポソームの標的化は解剖学的および機械的な因子に基づいて分類され得る。解剖学的な分類は、選択性のレベル、例えば、器官特異的、細胞特異的、およびオルガネラ特異的に基づく。機械的な標的化は、それが受動的か能動的かに基づいて区別され得る。受動的な標的化は、洞様毛細血管を含む器官中の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分配する、リポソームの天然の傾向を利用する。

他方、能動的な標的化は、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質などの特異的リガンドへのリポソームの結合による、または天然に存在する局在化の部位以外の器官および細胞型への標的化を達成するために、リポソームの組成もしくはサイズを変化させることによる、リポソームの変化を含む。

標的化遺伝子送達系の表面は、種々の方法において修飾され得る。リポソーム標的化送達系の場合において、脂質基が、リポソームの二重層との安定な結合でリガンドの標的化を維持するために、リポソームの脂質二重層に組み込まれ得る。種々の連結基が脂肪鎖と標的とするリガンドとを連結させるために使用され得る。

送達系のさらなる例には、本発明において記載されるベクター粒子を製造することが可能であるパッケージング細胞の組成物の治療領域への移植が含まれる。このような細胞のカプセル化および移植のための方法は当該分野において、特に、ＷＯ ９７／４４０６５（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）から公知である。レンチウイルス粒子を産生することが可能であるパッケージング細胞株を選択することによって、治療領域中での非分裂細胞の形質転換が得られる。分裂している細胞のみに形質転換することが可能であるレトロウイルス粒子を使用することによって、形質転換は、治療領域中のデノボ分化細胞のみに限定される。

（遺伝子治療ベクター組成物の送達のための方法）
本発明者らによって規定されたプロトコールに従って、ニューブラスチン組成物の直接送達が、当業者がよく知っている手段（外科的切開を通してのマイクロインジェクション（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ、２２：４７９−４８８（１９８０）を参照のこと）；エレクトロポレーション（例えば、ＡｎｄｒｅａｓｏｎおよびＥｖａｎｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６５０−６６０（１９８８）を参照のこと）；注入、標的化分子または共沈殿物（例えば、リポソーム、カルシウム）との化学複合体化、および標的組織の微粒子ボンバードメント（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：１５２−１５４（１９９２））を含む）によって達成され得る。

（細胞のカプセル化）
カプセル化細胞治療は、宿主内での移植の前に、半透性の生体適合性物質で細胞を取り囲むことにより、レシピエント宿主の免疫系から細胞を単離するという概念に基づく。本発明は、細胞が免疫単離カプセル中にカプセル化されているデバイスを含む。「免疫単離カプセル」とは、カプセルが、レシピエント宿主への移植に際して、デバイスのコアにおける細胞上の宿主の免疫系の有害な効果を最小化することを意味する。細胞は、微小孔膜によって形成された移植可能なポリマー性カプセル中にそれらを封入することによって、宿主から免疫単離される。このアプローチは、宿主と移植された組織との間の細胞対細胞接触を妨害し、直接的提示を通しての抗原認識を除去する。使用される膜はまた、それらの分子量に基づいて、抗体および補体などの分子の拡散を制御するように調整され得る（Ｌｙｓａｇｈｔら、５６ Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６（１９９６）、Ｃｏｌｔｏｎ、１４ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５８（１９９６））。カプセル化技術を使用して、細胞は、免疫抑制剤の使用を伴って、または伴わずにのいずれかで、宿主に免疫拒絶なしで移植され得る。有用な生体適合性ポリマーカプセルは通常、液体媒体中に懸濁されたか、または固定化マトリックス内に固定化されたかのいずれかである細胞を含むコア、ならびに、単離された細胞を含まず、生体適合性であり、および有害な免疫学的攻撃からコア中の細胞を保護するために十分である、選択透過性のマトリックスまたは膜の周囲または末梢領域（「ジャケット」）を含む。カプセル化は、免疫系のエレメントがカプセルに入ることを妨害し、それによってカプセル化細胞を免疫破壊から保護する。カプセル膜の半透性性質はまた、目的の生物学的に活性な分子がカプセルから周囲の宿主組織に容易に拡散することを可能にする。

カプセルは、生体適合性物質から作られ得る。「生体適合性物質」は、宿主中への移植後、カプセルの拒絶を生じるのに、および例えば、分解を通してそれを動作不可能にするのに十分な有害な宿主応答を誘発しない物質である。生体適合性物質は、大きな分子、例えば、宿主免疫系の成分に対して比較的不透過性であるが、低分子、例えば、インスリン、成長因子、および栄養成分に対しては透過性であり、代謝的廃棄物が除去されることを可能にする。種々の生体適合性物質が、本発明の組成物による成長因子の送達のために適切である。種々の外部表面形態、ならびに他の機械的特性および構造的特性を有する、多数の生体適合性物質が公知である。好ましくは、本発明のカプセルは、ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ ９２／１９１９５もしくはＷＯ ９５／０５４５２（参照として援用される）；または米国特許番号５，６３９，２７５；５，６５３，９７５；４，８９２，５３８；５，１５６，８４４；５，２８３，１８７；または米国特許番号５，５５０，０５０（参照として援用される）によって記載されるものと類似のものである。このようなカプセルは、宿主の免疫系の有害な効果を最小化しながら、代謝物、栄養成分、および治療物質の通過を可能にする。生体適合性物質の成分は、周囲の半透性膜および内部の細胞支持骨格を含み得る。好ましくは、遺伝子が改変された細胞が骨格上に播種され、これは、選択透過性膜によってカプセル化される。糸状細胞支持骨格は、アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレンポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブトエステル、シルク、コットン、キチン、カーボン、または生体適合性金属からなる群より選択されるいずれかの生体適合性物質から作られ得る。また、接合された繊維構造も、細胞移植のために使用され得る（米国特許番号５，５１２，６００、参照として援用される）。生体分解性ポリマーは、ポリ（乳酸）ＰＬＡ、ポリ（乳酸−コグリコール酸）ＰＬＧＡ、およびポリ（グリコール酸）ＰＧＡおよびそれらの等価物から構成されるものを含む。発泡体骨格は、移植細胞が接着し得る表面を提供するために使用された（ＰＣＴ国際特許出願シリアル番号９８／０５３０４、参照として援用される）。編まれたメッシュチューブが血管移植物として使用されてきた（ＰＣＴ国際特許出願シリアル番号９９／５２５７３、参照として援用される）。さらに、コアは、細胞の位置を安定化する、ヒドロゲルから形成された固定化マトリックスから構成され得る。ヒドロゲルは、実質的に水からなる、ゲルの形態である架橋親水性ポリマーの三次元ネットワークである。

種々のポリマーおよびポリマーのブレンドが周囲の半透性膜を製造するために使用され得、これには以下が含まれる：ポリアクリレート（アクリルコポリマーを含む）、ポリビニリデン、ポリビニルクロライドコポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、セルロースアセテート、ポリスルホン（ポリエーテルスルホンを含む）、ポリホスファゼン、ポリアクリロニトリル、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロライド）、ならびにその誘導体、コポリマー、および混合物。好ましくは、周囲の半透性膜は、生体適合性半透性中空ファイバー膜である。このような膜およびこれらを作製する方法は、米国特許番号５，２８４，７６１および５，１５８，８８１（参照として援用される）によって開示される。周囲の半透性膜は、ポリエーテルスルホン中空ファイバー、例えば、米国特許番号４，９７６，８５９または４，９６８，７３３（参照として援用される）に記載されるものから形成される。代替的な周囲の半透性膜物質は、ポリ（アクリロニトリル／コビニルクロライド）である。

カプセルは、生物学的活性を維持するため、および生成物の送達のためのアクセスまたは機能を提供するために適切な任意の配置であり得、これには、例えば、円筒状、長方形、円盤状、パッチ状、卵形、星形、または球形が含まれる。さらに、カプセルは、メッシュ様または入れ子状構造に巻かれるかまたは包まれ得る。カプセルが移植された後で回収される場合、移植の部位からのカプセルの移動をもたらす傾向のある配置、例えば、レシピエント宿主の血管中で移動するのに十分に小さい球状カプセルは好ましくない。特定の形状、例えば、長方形、パッチ、ディスク、円筒、および平らなシートは、より高い構造的な完全性を提供し、回収が所望される場合に好ましい。

マクロカプセルが使用される場合、好ましくは、各デバイスにおいて、１０^３から１０^４細胞がカプセル化され、最も好ましくは、１０^５から１０^７細胞がカプセル化される。投薬量は、より少ないかまたはより多い数のカプセルを移植することによって制御され得、好ましくは、患者あたり１個から１０個の間のカプセルである。

骨格は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子でコートされ得る。細胞外マトリックス分子の適切な例には、例えば、コラーゲン、ラミニン、およびフィブロネクチンが含まれる。骨格の表面はまた、細胞の接着を増強するために電荷を付与するためにプラズマ照射で処理することによって修飾され得る。

カプセルをシールする任意の適切な方法が使用され得、これには、ポリマー接着剤または圧接、結び止めおよび熱シーリングの使用が含まれる。さらに、任意の適切な「乾燥」シーリング方法もまた、例えば米国特許番号５，５６３，６８７（参照として援用される）に記載されるように使用され得る。

カプセル化された細胞デバイスは、公知の技術に従って移植される。多くの移植部位が本発明のデバイスおよび方法のために意図される。これらの移植部位には、脳および脊髄を含む中枢神経系（例えば、米国特許番号５，１０６，６２７、５，１５６，８４４、および５，５５４，１４８（参照として援用される））、クモ膜下腔内移植、および目の房水および硝子体液（ＰＣＴ国際特許出願ＷＯ ９７／３４５８６（参照として援用される）を参照のこと）、網膜下腔、およびサブテナーカプセルが含まれるがこれらに限定されない。脳の中で、デバイスは実質および脳室中に移植され得る。全身性送達のために、移植は、筋肉内、皮下、または腹腔内であり得る。

ＡＲＰＥ−１９細胞株は、カプセル化された細胞に基づく送達技術のために優れたプラットフォーム細胞株であり、カプセル化されていない細胞に基づく送達技術のためにもまた有用である。ＡＲＰＥ−１９細胞株は頑健である（すなわち、この細胞株は、中枢神経系または眼内環境における移植などのストリンジェントな条件下で生存可能である）。ＡＲＰＥ−１９細胞は、治療目的の物質を分泌するように遺伝子改変され得る。ＡＲＰＥ−１９細胞は、比較的長い寿命を有する。ＡＲＰＥ−１９細胞はヒト起源である。さらに、カプセル化されたＡＲＰＥ−１９細胞は、良好なインビボデバイス生存性を有する。ＡＲＰＥ−１９細胞は、有効量の成長因子を送達可能である。ＡＲＰＥ−１９細胞は、無視できる宿主免疫反応を誘発する。さらに。ＡＲＰＥ−１９細胞は発癌性ではない。

ＣＮＳへのカプセルの移植のための方法および装置は、米国特許第５，４８７，７３９号において記載される。

１つの局面において、本発明は、生体適合性カプセルに関し、このカプセルは、標的細胞の感染のためのウイルスベクターを分泌する生きているパッケージング細胞を含むコア（ここで、ウイルスベクターは、本発明に従うベクターである）、およびこのコアを取り囲む外部ジャケットを含み、このジャケットは透過性の生体適合性物質を含み、この物質は、そこを横切る１００ｎｍ直径の、レトロウイルスベクターの通過を可能にするように選択された多孔性を有し、このカプセルからのこのウイルスベクターの放出を可能にする。

好ましくは、コアは、付加的にマトリックスを含み、パッケージング細胞がこのマトリックスに固定化される。１つの実施形態に従って、ジャケットはヒドロゲルまたは熱可塑性物質を含む。

パッケージング細胞株のために適切な細胞株は、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＧ１３、およびＡＲＰＥ−１９細胞を含む。好ましい細胞は、ＰＧ１３および３Ｔ３細胞を含む。

パッケージング細胞のカプセル化のための方法およびデバイスは、米国特許第６，０２７，７２１号に開示されており、これはその全体が本明細書によって参照として援用される。

（宿主細胞）
本発明の核酸構築物は、ニューブラスチンポリペプチドを産生するために使用され得る。真核生物細胞が、異種シグナル配列に作動可能に連結された組換えニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸構築物でトランスフェクトされ得る。核酸構築物を作製する方法、およびその構築物で細胞にトランスフェクトする方法は当該分野で公知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８８、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｎｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと）。例えば、細胞は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはウイルスベクターを用いる感染を使用してトランスフェクトされ得る。ある実施形態において、形質転換された宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞である。

形質転換された宿主細胞は、適切な増殖培地中で、かつ分泌されたニューブラスチンポリペプチドが細胞から発現および分泌されるような条件下で培養される。適切な増殖培地は、細胞の増殖のために必要とされる栄養を含む培地である。細胞増殖のために必要とされる栄養には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および成長因子が含まれ得る。必要に応じて、培地は、または仔ウシ血清またはウシ胎仔血清を含み得る。増殖培地は、核酸構築物を含む細胞を選択するように設計され得る。これは、例えば、薬物選択によって、または核酸構築物上の、もしくは核酸構築物と同時トランスフェクトされる選択マーカーによって相補される必須栄養素の欠損によって行われ得る。培養された哺乳動物細胞は、時折、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中で増殖され得る。使用される特定の細胞株のために適切な培地の選択において考慮される要因は、当該分野で公知である。

従って、１つの局面において、本発明は、本発明に従う形質転換またはトランスフェクトされた単離された宿主細胞に関する。これらの細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。なぜなら、これらは、コードされたニューブラスチンを正確に分泌およびプロセシングすることが可能だからである。

好ましい種には、齧歯類（マウス、ラット）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サル、ヒトからなる群が含まれる。

本発明のベクターを用いる形質転換のための良好な候補である初代培養および細胞株の例には、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ、神経細胞、胎児細胞、ＲＰＥ細胞株、ＡＲＰＥ−１９、ヒト不死化線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、線条体細胞、ニューロン、星状細胞、介在ニューロンからなる群が含まれる。

カプセル化および裸の細胞の治療のための１つの好ましい型の細胞株は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。ＲＰＥ細胞の供給源は、哺乳動物網膜からの初代細胞単離物による。ＲＰＥ細胞を収集するためのプロトコールは十分に確定しており（ＬｉおよびＴｕｒｎｅｒ、１９８８、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．４７：９１１−９１７；Ｌｏｐｅｚら、１９８９、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３０：５８６−５８８）、日常的な方法論と見なされている。ＰＲＥ細胞同時移植の公開された報告の大部分において、細胞は、ラット由来である（ＬｉおよびＴｕｒｎｅｒ、１９８８；Ｌｏｐｅｚら、１９８９）。好ましくは、ＲＰＥ細胞はヒト由来である。単離された初代ＲＰＥ細胞に加えて、培養されたヒトＲＰＥ細胞株が本発明の実施において使用され得る。

インビボ形質転換のために宿主細胞の好ましい群は、線条体細胞、ニューロン、星状細胞、介在ニューロンを含む。エキソビボ遺伝子治療のための好ましい細胞の群は、神経細胞、神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、幹細胞、および胎児細胞を含む。幹細胞および神経前駆細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）はこれらが組織に組み込まれ、かつ移動することが可能であるという利点を有する。カプセル化のため、および裸の細胞の移植のために、好ましい細胞は、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞を含む）；ヒト不死化線維芽細胞；およびヒト不死化星状細胞を含む。特に好ましいのはＡＲＰＥ−１９である。

別の好ましい実施形態において、治療細胞株が、ヒト線維芽細胞株、ヒト星状細胞株、ヒト中脳細胞株、およびヒト内皮細胞株からなる群より選択され、好ましくは、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０Ｔ、またはｖｍｙｃを伴って不死化されている。

不死化ヒト星状細胞を生成するための方法は、以前に記載されている（Ｐｒｉｃｅ ＴＮ、Ｂｕｒｋｅ ＪＦ、Ｍａｙ ＬＶ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ａ７３５）ｗｉｔｈ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ Ａｎｉｍ．１９９９ Ｍａｙ；３５（５）：２７９−８８）。このプロトコールは、星状細胞株を生成するために使用され得る。

このプロトコールの以下の３つ修飾が、好ましくは、さらなるヒト星状細胞株を生成するために作製される。

５〜１２週齢胎児から切除したヒト胎児脳組織を、１２〜１６週齢組織の代わりに使用し得る。

不死化遺伝子ｖ−ｍｙｃ、またはＴＥＲＴ（テロメラーゼ）をＳＶ４０ Ｔ抗原の代わりに使用し得る。

レトロウイルス遺伝子導入を、プラスミドを用いる遺伝子移入の代わりに使用し得る。

ニューブラスチンポリペプチドはまた、齧歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、またはヤギなどのトランスジェニック動物において発現され得る。トランスジェニック動物は、外来性遺伝子が親から子孫に継代されるように、そのゲノムにその外来性遺伝子が組み込まれている非ヒト動物である。外来性遺伝子は、単一細胞胚に導入され得る（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４４３８）。トランスジェニック動物を作製する方法は当該分野で公知である（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６３７６；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３４：３３５；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ ３０６：３３２；Ｒｉｔｃｈｉｅら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：５１７；Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅら、２００３、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５９：８３１；Ｒｏｂｌら、２００３、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ５９：１０７；Ｍａｌａｓｓａｇｎｅら、２００３、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １０（３）：２６７）。

（ニューブラスチンのインビボ産生）
別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞、例えば、５００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間を超える量で、より好ましくは６００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間、より好ましくは７００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間を超える量で、より好ましくは８００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間を超える量で、より好ましくは９００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間を超える量で、例えば、１０００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間を超える量で、ニューブラスチンポリペプチドを分泌することが可能である、上記に規定した細胞に関する。

好ましくは、分泌されたニューブラスチンは、実施例１に記載されるＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるように生物学的に活性である。これは、グリコシル化、切断、および再フォールディングの必要性を除去する。

好ましい宿主細胞は、細胞ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ、Ｃ２Ｃ１２、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、およびＡＲＰＥ−１９のそれぞれの細胞からなる群より選択される。より好ましくは、この群はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、およびＡＲＰＥ−１９からなる。

ニューブラスチンまたはその機能的等価物は、これらの細胞を培養すること、ならびにタンバク質の再フォールディングおよびグリコシル化の必要性なしで、培養培地からニューブラスチンを回収することによって産生され得る。

発現は、ＷＰＲＥ（米国特許第６，１３６，５９７号）などのエンハンサーエレメントを含めることによってなおさらに増加され得る。

（ニューブラスチン産生細胞のための支持体マトリックス）
本発明はさらに、哺乳動物神経系への移植の前に、支持体マトリックス上でインビトロでニューブラスチン産生細胞を培養する工程をさらに包含する。移植の前のマイクロキャリアへの細胞の事前の接着は、移植細胞の長期的な生存度を増強するため、および長期的な機能的利点を提供するために設計される。

移植細胞、すなわち、移植ニューブラスチン分泌細胞の長期的な生存度を増加するために、移植される細胞は、移植の前に、支持体マトリックスにインビトロで結合され得る。支持体マトリックスに含まれ得る物質は、インビトロインキュベーション後に細胞が接着し、細胞がその上で増殖し得、そして、移植された細胞を破壊し、またはそれらの生物学的活性もしくは治療活性を妨害する毒性反応、または炎症反応を産生することなく哺乳動物の身体に移植され得るものを含み得る。このような物質は、合成もしくは天然の化学物質であり得、または生物学的起源を有する物質であり得る。

このマトリックス物質には以下が含まれるがこれらに限定されない：ガラスおよび他のシリコンオキサイド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリウレタン、ポリアルギン酸、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテント、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾ゼラチン、ならびに天然および修飾コラーゲン、天然および改変ポリサッカリド（デキストランおよびセルロースを含む（例えば、ニトロセルロース））、寒天、ならびにマグネタイト。吸収可能な物質または吸収可能でない物質が使用され得る。当該分野において周知である細胞外マトリックス物質もまた意図される。細胞外マトリックス物質は、商業的に入手され得るか、または、このようなマトリックスを分泌する細胞を増殖させること、分泌細胞を取り出すこと、および移植される細胞をそのマトリックスと相互作用しかつそれに接着させることによって調製され得る。移植される細胞がその上で増殖し、または細胞がそれと混合されるマトリックス物質は、ＲＰＥ細胞に固有の生成物である。従って、例えば、マトリックス物質は、細胞外マトリックスまたは基底膜物質であり得、これは、移植されるＲＰＥ細胞によって産生および分泌される。

細胞の接着、生存、および機能を改善するために、固体マトリックスは、必要に応じて、細胞の接着、増殖、または生存を改善するために当該分野で公知の因子でその外面をコートされ得る。このような因子には、接着分子、細胞外マトリックス、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン、またはプロテオグリカン、または成長因子が含まれる。

代替的には、移植される細胞が結合される固体マトリックスが多孔性材料で構築される場合、増殖または生存を促進する因子は、それらがインビボ移植後にゆっくりと放出されるマトリックス物質に取り込まれ得る。

本発明に従って支持体に結合されたとき、移植のために使用される細胞は一般的に支持体の「外表面」上にある。支持体は、固体または多孔性であり得る。しかし、多孔性支持体においてさえ、細胞は、介在する膜または他の障壁なしで外部環境と直接的に接触している。従って、本発明に従って、細胞は、それらが接着する表面が内部の折り曲がった部分にあるか、または、粒子もしくはビーズそれ自体の外部ではない多孔性支持物質のたたみこみにあり得る場合でさえ、支持体の「外表面」にあると見なされる。

支持体の配置は、ビーズ中のような好ましくは球状であるが、円筒形、楕円形、平らなシートもしくはストリップ、針またはピン状などであり得る。支持体マトリックスの好ましい形態はガラスビーズである。別の好ましいビーズはポリスチレンビーズである。

ビーズのサイズは約１０μｍから１ｍｍ直径、好ましくは約９０μｍから約１５０μｍである。種々のマイクロキャリアビースの説明については、例えば、ｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓｏｕｒｃｅ ８７−８８，Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，１９８７，７２−７５頁；Ｓｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，１９９１、１６２−１６３；Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇ，Ｖｅｎｔｒｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１９８９を参照のこと；これらの参考文献は本明細書によって参照として援用される。ビーズのサイズの上限は、望ましくない宿主反応のビーズ刺激によって決定され得、これは、移植細胞の機能を妨害し得、または周囲の組織への損傷を引き起こし得る。ビーズのサイズの上限はまた、投与の方法によって決定され得る。このような制限は、当業者によって容易に決定可能である。

（ニューブラスチンポリペプチド）
本発明はさらに、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドを含むニューブラスチンポリペプチドに関し、ここで、このポリペプチドはニューブラスチンプロ領域、例えば、シグナルペプチドに融合されたニューブラスチンポリペプチドを欠く。特に、シグナルペプチドは、そのＣ末端から、ペプチド結合を通して、ニューブラスチンポリペプチドのＮ末端に連結される。シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドは、上記に規定した通りである。

（実施例１：ＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物を用いるインビトロトランスフェクト）
（ＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物の構築）
ＩｇＳＰ．ＮＢＮを重複ＰＣＲによって生成した。第１の増幅工程において、ＮＢＮの成熟フラグメントを、ｐＵｂｉ１ｚ．ＮＢＮ．ＢａｍＨＩベクターから、プライマー

および

を使用してＰＣＲによって増幅した。第２のＰＣＲ反応において、ＩｇＳＰ配列を、ｐＮＵＴ−ＩｇＳＰ−ＣＮＴＦベクター（参考文献：米国特許第６，３６１，７４１号）から、プライマー

および

を使用して増幅した。第３の工程において、工程１および２の生成物を、プライマーＩｇＳＰＫｏｚａｋ １ｓ＋ＢａｍＨＩおよびＮＢＮ−ａｓ＋Ｘｈｏｌを用いて、テンプレートとして等量の２つの生成物を使用することによってＩｇＳＰ−ＮＢＮを生成する最終ＰＣＲ反応において合わせた。

プラスミドベースの発現ベクターを生成するために、得られるフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＮＳ１ｎ中でクローニングした。このベクターにおいて、ＩｇＳＰ−ＮＢＮ配列をＣＭＶプロモーターの転写制御下に配置する（図３を参照のこと）。さらにこのベクターは、哺乳動物細胞中で発現されたときにＧ４１８耐性を付与するＮｅｏ遺伝子を含む。

（一過性トランスフェクト研究）
ＡＲＰＥ−１９は、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を補充した、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を有するＤＭＥＭ／栄養ミックス中Ｆ−１２で、３７℃、５％ＣＯ_２でヒト網膜色素上皮細胞株（Ｄｕｎｎら、１９９６）を増殖させる。細胞を、１週間にほぼ２回、トリプシン処理および再播種（１：５スプリット比率）によって継代した。細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｉｎｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に、トランスフェクト研究のために１０^５細胞／ウェルで播種した。翌日、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の指示書に従って使用して、２連のウェル中で３μｇプラスミド／ウェルでトランスフェクトした。トランスフェクト３日後に収集される細胞上清中に存在するＮＢＮ活性を、ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。

（ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡ）
ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡは、ＮＢＮ特異的ＧＦＲα３レセプターに結合するＮＢＮの複合体へのＲｅｔ−ＡＰ結合体の結合を検出する。このアッセイは、機能的に活性であるＮＢＮ分子を検出するのみである。手短に述べると、９６ウェルプレート（Ｂ＆Ｗ Ｉｓｏｐｌａｔｅ ＨＢ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ＝９．６）中の１００μｌ １μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＴｒｉＣｈｅｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で、１６時間、４℃でコートした。ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）中の洗浄後、ウェルを、ＰＢＳＴ中の０．２％ Ｉ−Ｂｌｏｃｋ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｎｎｍａｒｋ）中で、１時間、室温でブロックし、続いて手短にＰＢＳＴ中で洗浄した。細胞上清または組換えマウスＡｒｔｅｍｉｎ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）をＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中で希釈し、続いてウェル中で、１．５時間、室温にて、ＲＥＴ−ＡＰ馴化培地（Ｂｉｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中の１μｇ／ｍｌ ＧＦＲα３／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）とインキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳＴ中で最初に洗浄し、次いで、ＡＰ−緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝９．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で洗浄し、続いてＡＰ−緩衝液中の１０％Ｓａｐｐｈｉｒｅ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）および２％ ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに３０分間のインキュベーションを行った。発光を、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｔｒｉｌｕｘ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用することによって決定した。

（結果（図４、パネル（ｂ）））
２５．３〜３３．８ｎｇ／ｍｌのＮＢＮ活性を、ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡを使用することによって、ｐＮＳ１ｎ−ＩｇＳＰ．ＮＢＮ構築物で一過性にトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９細胞から収集した上清中で検出した。対照的に、約５倍低いＮＢＮ活性（４．４〜６．４ｎｇ／ｍｌ）を、同じ実験に含まれた野生型（プレプロ）ＮＢＮ発現構築物（ｐＵｂｉ１ｚ．ｈＮＢＮ）で一過性にトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９細胞中で検出する。非常に低いかまたは検出不可能であるＮＢＮ活性を、ＥＧＦＰ発現構築物（ｐＮＳ１ｚ−ＥＧＦＰ）で一過性にトランスフェクトしたＡＲＰＥ−１９の細胞上清中で検出し、アッセイの特異性を確認した。

これらの結果は、キメラＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物の使用が、野生型（プレプロ）ＮＢＮ構築物を使用するＮＢＮの放出と比較して、特異的ＮＢＮレセプター複合体に結合およびこれを活性化することが可能である哺乳動物細胞からの成熟ＮＢＮのより高い放出をもたらすことを示す。

（実施例２：ＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物を用いるインビトロ形質転換）
（レンチウイルスＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物およびウイルスストックの生成）
レンチウイルス構築物を生成するために、ｐＮＳ１ｎ−ＩｇＳＰ−ＮＢＮを、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩおよびＩｇＳＰ−ｈＮＢＮ ＰＣＲフラグメントで消化し（実施例１において記載されるように）、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化したｐＨｓＣＸＷにライゲートし、ｐＨｓＣＸＷ．ＩｇＳＰ．ＮＢＮｗを生じた（図３）。ｐＨｓＣＸＷは自己不活性化レンチウイルス導入構築物、ｐＨＲ’−ＳＩＮ_−１８の誘導体であり、導入構築物の大きな非ウイルス部分をｐＵＣ１９骨格で置き換えることによって生成したＷＰＲＥエレメントを含む（Ｄｕｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１１）：８４６３−７１（１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（１２）：９８７３−８０（１９９８）：Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（４）：２８８６−９２（１９９９））。ｐＨｓＣＸＷの配列は、ＧｅｎＧａｎｋ ＩＤ：ＡＹ４６８４８６を通してアクセス可能である。

複製欠損ＬＶ−ｓＣ．ＩｇＳＰ．ＮＢＮ．Ｗウイルス粒子を、ｐＭＤ．Ｇを有するｐＨｓＣ．ＩｇＳＰ．ＮＢＮ．Ｗ（ＶＳＶ−Ｇシュードタイピングベクター）およびｐＢＲ８．９１（パッケージングベクター）（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：８７１−７５（１９９７））の、２９３Ｔ細胞への同時トランスフェクトによって生成し、必要とされるウイルスタンパク質をトランスで提供する。手短に述べると、１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１００９９−１４１）を補充した、４．５ｇ／ｌグルコースおよびｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３２４３０−０２７）を有するＤＭＥＭ中で培養された２９３Ｔ細胞を、トランスフェクトの前日にＴ７５フラスコ（２×１０６細胞／フラスコ）中に播種する。各Ｔ７５フラスコについて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ＋を、製造業者の指示書に従って使用して、５μｇ ｐＭＤ．Ｇ、１５μｇ ｐＢＲ８．９１、および２０μｇの移入ベクターでトランスフェクトする。ウイルス含有細胞上清をトランスフェクトの２〜３日後に収集し、０．４５ｍセルロースアセテート、またはポリスルホニックフィルターを通してフィルター滅菌し、そして５０，０００×ｇで９０分間、４℃にて超遠心分離によって濃縮する。第２のラウンドの超遠心分離の後、濃縮したウイルスペレットをＤＭＥＭ中に再懸濁し、アリコート化し、−８０℃に保存する。ウイルス力価を決定するために、逆転写酵素（ＲＴ）活性をアッセイし（ＣｅｐｋｏおよびＰｅａｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９．１３．５−６、補遺３６）、形質転換単位（ＴＵ）／ｍｌを、測定したＲＴ活性から、既知の形質転換活性を有するＥＧＦＰレンチウイルスを参照として使用して計算する。

（形質転換研究）
ＡＲＰＥ−１９細胞を、ＮＢＮ発現ベクターを用いて形質転換した。手短に述べると、細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏａｓｔａｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈ ｌｉｎｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に、１０^５細胞／ウェルで播種した。翌日、２×１０^５ＴＵのウイルスを、好ましくウェルに（２連で）、５μｇ／ｍｌ ポリブレンとともに４時間加えた。培地を交換し、培養物を３日間インキュベートした。次いで、細胞上清を、実施例２に記載されるように、ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡのために収集した。

（結果（図４、パネル（ｃ）））
３９ｎｇ／ｍｌのＮＢＮ活性を、ＬＶ−ｓＣ．ＩｇＳＰ．ＮＢＮ．Ｗウイルスで形質転換したＡＲＰＥ−１９細胞から収集された上清中のＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡを使用することによって検出した。対照的に、非常に低いか、または検出不可能なＮＢＮ活性を、野生型（プレプロ）ＮＢＮ ｃＤＮＡ（ＬＶ−ｓＣ−ＮＢＮ．Ｗ）またはコントロールＥＧＦＰレンチウイルス（ＬＶ−ｓＣＥＷ）を含むレンチウイルスで形質転換されたＡＲＰＥ−１９細胞中で検出した。

これらの結果は、野生型（プレプロ）ＮＢＮ ｃＤＮＡを含むウイルス構築物とは対照的に、キメラＩｇＳＰ−ＮＢＮウイルス構築物の使用は、特異的ＮＢＮレセプター複合体を結合および活性化することが可能である哺乳動物細胞からの成熟ＮＢＮの高い放出を可能にすることを示す。

（実施例３：ＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物から発現したＮＢＮタンパク質の分析）
（細胞上清のウェスタンブロット分析）
トランスフェクトまたは形質転換された細胞培養物からの細胞上清中に存在するＮＢＮを、ウェスタンブロット分析の前に、ＧＦＲα３−Ｉｇへのアフィニティー結合によって濃縮した。手短に述べると、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの４ウェルを、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ_３（ｐＨ＝９．６）中の３００μｌのヤギ抗ヒトＦｃ １μｇ／ｍｌ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＴｒｉＣｈｅｍ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で、４℃で１６時間コートした。ウェルを、ＰＢＳ中の４００μｌの１％ ＢＳＡで室温で１時間ブロックし、続いてＰＢＳＴ中で３回洗浄した。次いで、３００μｌ／ウェル ＧＦＲα３／Ｆｃ融合タンパク質 １μｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を加え、プレートを、結合を最大化するために室温で１時間インキュベートした。次いで、ウェルを空にし、ＰＢＳＴ中で３回洗浄した。次いで、トランスフェクトまたは形質転換された細胞培養物から収集した３００μｌの上清を４ウェルの各々に加え、少なくとも３時間、穏やかに攪拌しながら室温でインキュベートした。次いで、ウェルを、ＰＢＳＴ中で２回洗浄した。２０μｌの非還元サンプル緩衝液（２％ ＳＤＳ、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐｈ＝８．０））を第１のウェルに加え、プレートを迅速に５分間振盪して、結合したタンパク質を溶離した。内容物を次のウェルに移し、手順を反復して結合したタンパク質を残りのウェルに溶離した。１０ｍＭまでのＤＴＴの付加後、サンプルを９６℃で５分間加熱し、ＭｕｌｔｉＰｈｏｒＩＩシステムを、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｄｅｎｍａｒｋ）の指示書に従って使用して、１５％ポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にブロットし、これを、検出抗体としてウサギポリクローナル抗ＮＢＮ抗体（＃３７８）を使用して免疫染色した。メンブレンをＥＣＬ＋システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して発色させ、フィルム露光に供した。

（結果）
＃３７８は、ＮＢＮ由来ペプチド（ＡＬＲＰＰＰＧＳＲＰＶＳＱＰＣ）に対して惹起されたウサギポリクローナル抗体である。図５パネル（ａ）において見られるように、７．２ｋＤａと１８．５ｋＤａの間の分子量の単一バンドが、モノマー性非グリコシル化ＮＢＮ１１３に対応するＥ．ｃｏｌｉ中で産生された精製ラット組換えＮＢＮを含む還元（＋ＤＴＴ）サンプルにおいて認識された。いくつかの付加的なバンドに加えて、同じ分子量のバンドが、野生型（プレプロ）ＮＢＮを用いるトランスフェクトによって樹立された安定なＣＨＯ−ＮＢＮクローンからの還元サンプルにおいて認識される。これらのバンドの多くの同一性が、脱グリコシル化およびＮ末端配列決定を使用して以前の研究において決定されている。わずかにより低い分子量を有するバンドは、成熟ＮＢＮのより小さくかつ非グリコシル化のバージョン（ＮＢＮ１０４）を表す。さらに、約２１ｋＤａの見かけの分子量を有する非常に広範なバンドは、ＮＢＮ１１３およびＮＢＮ１０４のグリコシル化バージョンを表す。より高い分子量のバンドは、ＧＦＲα３−アフィニティー精製サンプル中で偶然見られた（グリコシル化）プロＮＢＮを表す。

図５パネルｂにおいて見られるように、非グリコシル化ＮＢＮ１１３およびＮＢＮ１０４に対応する６．４から２１．３ｋＤａの間の分子量の二重バンドが、ＣＨＯ−ＮＢＮ細胞の２つの安定なクローン中で検出される。同じ二重バンドがまた、ＩｇＳＰ−ＮＢＮ発現構築物で形質転換またはトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９中でも検出される。さらに、グリコシル化ＮＢＮ１１３およびＮＢＮ１０４に対応する２１ｋＤａに密接する分子量の二重バンドが分析したすべてのバンドにおいて見られる。これらの結果は、プロセシングおよび翻訳後修飾が、野生型（プレプロ）ＮＢＮ構築物およびＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物から発現されたときと同様であることを示す。

（実施例４：キメラＩｇＳＰ−ＮＢＮウイルス構築物の配列およびシグナルペプチドの予測）
（ＩｇＳＰ−ＮＢＮ−構築物中に存在するヌクレオチド配列）

ＩｇＳＰ−ＮＢＮは、成熟ＮＢＮ（１１３）に直接的に融合された免疫グロブリン遺伝子からのシグナルペプチドとの融合構築物である。
ＩｇＳＰ−ＮＢＮはイントロンを含む。

（ＮｅｔＧｅｎｅ（ＣＢＳ−ＤＴＵサーバー）からのイントロン−エキソン予測）

翻訳された融合タンパク質は、シグナルＰ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋにおけるＣＢＳ ＤＴＵサーバーにおいて利用可能である）を使用して、成熟ＮＢＮ（１１３）配列から切断される１９アミノ酸シグナルペプチドを含むことが予測される（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅｓ．Ｈ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．ｅｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ，Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｅ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０，１−６，１９９７）。

（シグナルＰ−ＮＮ結果（図６ａを参照のこと））

（シグナルＰ−ＨＭＭ結果（図６ｂを参照のこと））
予測：シグナルペプチド
シグナルペプチド確率：０．９９９
シグナルアンカー確率：０．０００
最大切断部位確率：１９位と２０位の間で０．６６０
ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗａｒｋｓ（ＮＮ）およびｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）を使用して真核生物に方向付けた。

（実施例５：シグナルペプチドの位置の予測）
Ｉｇｓｐが種々の長さのニューブラスチンポリペプチドに融合されるときに、切断部位の予測は、上記に同定されるシグナルＰプログラム２．０を使用して以下に示される。

（切断部位：）

ＩｇＳＰ：
（１９）ＭＫＣＳＷＶＩＦＦＬＭＡＶＶＴＧＶＮＳ
（成熟型ＮＢＮ）

（実施例６：δプロＮＢＮのｐＨｓＣＸＷへのクローニング）
δプロＮＢＮ（配列番号８２）は、３段階の増幅工程で重複ＰＣＲによって生成した：１）成熟ＮＢＮに対する５’ＢａｍＨＩ／Ｋｏｚａｋ突出および１０塩基の３’重複を有するプレプロＮＢＮの比較的長い１１７ｂｐリーダー配列（すなわち、３９ａ．ａ．シグナルペプチド）（１４３ｂｐ）；２）５’１０塩基ＮＢＮリーダー配列重複および３’ＸｈｏＩを有する成熟ＮＢＮ（３６２ｂｐ）；３）工程１）および２）の生成物をＰＣＲ反応において合わせ、これがδプロＮＢＮを生成した。

第１のＰＣＲ反応（ＮＢＮリーダー）：
使用したプライマー：

プラスミドｐＨｓＣ．ｈＮＢＮ．Ｗ（図７ａにおけるプラスミドマップを参照のこと）をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応はＰｆｕ−ｔｕｒｂｏポリメラーゼを使用して実行した。
ＰＣＲ条件：
９４℃ ３分間
９４℃ ３０秒間
５５℃ ３０秒間 ３５サイクル
７２℃ １分間
７２℃ ５分間。

第２のＰＣＲ反応（成熟ＮＢＮ）：
使用したプライマー：

プラスミドｐＨｓＣ．ｈＮＢＮ．Ｗ（図７ａにおけるプラスミドマップを参照のこと）をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応はＰｆｕ−ｔｕｒｂｏポリメラーゼを使用して実行した。
ＰＣＲ条件：
９４℃ ３分間
９４℃ ３０秒間
６５℃ ３０秒間 ３５サイクル
７２℃ １分間
７２℃ ５分間。

第３のＰＣＲ反応（δプロＮＢＮ）：
使用したプライマー：

２つの最初のＰＣＲ反応（ＮＢＮリーダーおよび成熟ＮＢＮ）からのＰＣＲフラグメントを両方とも１：１０の希釈で、第３のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応はＰｆｕ−ｔｕｒｂｏポリメラーゼ、および第１のＰＣＲの実行と同じＰＣＲプロフィールを使用して実行した。

第３のＰＣＲ反応からのＰＣＲフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断し、そしてｐＨｓＣＸＷ（図７ｂにおけるプラスミドマップを参照のこと）中のＢａｍＨＩ部位とＸｈｏＩ部位の間にクローニングした。

（実施例７：異なる細胞株中でのＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物およびδプロＮＢＮ構築物を用いるインビトロトランスフェクト）
野生型プレプロＮＢＮ、δプロＮＢＮ、およびＩｇＳＰ−ＮＢＮを含む、異なるＮＢＮ構築物を用いる一過性トランスフェクト後のＮＢＮの分泌を比較した。一過性トランスフェクトを、ＡＲＰＥ−１９、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、およびＨｉＢ５細胞中で実行した。

（細胞株）
ＡＲＰＥ−１９細胞を実施例１に記載されるように培養した。ＨｉＢ５（Ｒｅｎｆｒａｎｚら、１９９１）、ＨＥＫ２９３、およびＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中で増殖させた。ＣＨＯ細胞のための培地は、２０ｍｇ／ｌ Ｌ−プロリンをさらに補充した。ＡＲＰＥ−１９、ＨＥＫ２９３、およびＣＨＯ細胞を３７℃にて、ＨｉＢ５細胞を３３℃にて、５％ＣＯ_２中で培養した。細胞をほぼ週に２回、トリプシン処理および再播種によって継代した（１：５スプリット比率）。

（一過性選択後のＮＢＮ分泌）
細胞を、約１０^５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｌｉｎｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中に播種した。翌日、細胞をｐＨｓＣ．ｈＮＢＮ．Ｗ、ｐＨｓＣ．ＩｇＳＰ．ｈＮＢＮ．Ｗ、およびｐＨｓ．δプロｈＮＢＮ．Ｗでそれぞれトランスフェクトした。ＡＲＰＥ−１９細胞を、実施例１に示されるように、Ｆｕｇｅｎｅ６を使用して３連のウェル中にトランスフェクトするのに対して、他の３種の細胞株は、製造業者の指示書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して３連のウェル中で、２μｇプラスミド／ウェルを使用してトランスフェクトした。翌日、新鮮な増殖培地をウェルに加え、細胞をさらに２４時間、馴化培地を収集する前にインキュベートした。十分なトランスフェクト効率を、ｐＨｓＣ．ＥＧＦＰ．Ｗと並行してトランスフェクトしたウェル中のＥＧＦＰ発現の評価によって保証した。馴化培地中のＮＢＮ結合活性を、実施例１に記載されるように、ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡは，ＮＢＮ特異的ＧＦＲα３レセプターに結合するＮＢＮの複合体へのＲｅｔ−ＡＰ結合体の結合を検出する。値は、ｎｇ ＮＢＮ／ｍｌ／２４時間およびｎｇ ＮＢＮ／１０^５細胞／２４時間として計算し、１に設定された野生型ＮＢＮ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞からの値を用いて、相対的ＮＢＮ放出に調節した。図８におけるデータは、これらの３つの計算を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表現される。パネルＡにおいて、^＊は、野生型ＮＢＮ構築物を用いてトランスフェクトされた細胞からの有意な差を意味する（ｐ<０．０５、片側ＡＮＯＶＡ、Ｆｉｓｈｅｒ ＬＳＤ法）。

（結果）
以下の表および図８Ａに示されるように、４つの試験された細胞株は、野生型ＮＢＮ構築物と比較すると、δプロＮＢＮ構築物を使用したときにＮＢＮ放出の増加を示した（細胞株に依存して、９〜１７倍高いＮＢＮ放出）。ｐＨｓＣ．ＩｇＳＰ．ｈＮＢＮ構築物を用いて４つの細胞株にトランスフェクトした場合には、ＮＢＮ分泌はさらに増強された（野生型ＮＢＮと比較して、２８〜９１倍高いＮＢＮ放出）。非常に低いかまたは検出不可能なＮＢＮ活性が、ＥＧＦＰ発現構築物（ｐＨｓ．Ｃ．ＥＧＦＰ．Ｗ）を用いて一過性にトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９からの細胞上清において観察され、このアッセイの特異性を確証した。

図８ＢにおけるパネルＢは、一過性にトランスフェクトされた細胞株からの馴化培地中の（２４時間）ＮＢＮ濃度を示す。最も高い濃度（１２４０±５４ｎｇ ＮＢＮ／ｍｌ）は、ＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地中で見いだされた。図８ＣにおけるパネルＣは、２４時間あたりの１０^５細胞あたりのＮＢＮ放出を示す。ＩｇＳＰ−ＮＢＮトランスフェクトされたＡＲＰＥ−１９細胞は、最高のＮＢＮ放出を示した（１３３±３５ｎｇ／１０^５細胞／２４時間）。

本実施例の結果は、哺乳動物細胞からの成熟ＮＢＮの分泌を増加するためのキメラＩｇＳＰ−ＮＢＮ構築物およびδプロＮＢＮ構築物の使用が、異なる細胞株に適用可能であることを示す。

（実施例８：シグナルＰ ３．０を使用する予測）
バージョン３．０を使用する、シグナルペプチドについての位置の予測。予測は、以下の配列のδプロＮＢＮおよびＩｇＳＰ−ＮＢＮ上で実行された。

（実施例９：ニューブラスチン遺伝子配列最適化）
ＣＨＯ細胞中のヒトニューブラスチンの発現を最適化するために、ネイティブニューブラスチン遺伝子の配列を、コドン使用頻度について調べた。ＣＨＯ細胞中で最も共通して使用されているコドンを、２００２年までの現在のデータに基づいて、当該分野で公知の方法（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（１：２９２））を使用して分析した。依存しているＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓについてのコドン使用頻度は、以下の表において提示される。

Ｃ末端１０４アミノ酸フラグメントをコードしているネイティブヒトヌクレオチド配列（Ｒｏｓｅｂｌｅｄら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５（２）：１９９；Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ ２１：１２９１）および合成遺伝子のヌクレオチド配列を図９に、変化したアミノ酸を示してアラインする。２つの配列は８３．３３％同一である。

（実施例１０：ニューブラスチン遺伝子のクローニング）
ニューブラスチンの５’コドンに連結された種々のシグナルペプチド配列の挿入を容易にするために、ニューブラスチン遺伝子の１００コドン（３００ヌクレオチド）３’型を合成し、そして発現プラスミドにクローニングした。１００コドン型ニューブラスチン遺伝子は、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を含む２００μＬ緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ ８．８）中で、ＫＤ３−４６４からＫＤ３−４６９（表２）のオリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌまでを合わせることによってアセンブルした。内容物を９５℃で４分間加熱し、以下のサイクル、すなわち９５℃１分間、６０℃３０秒間、および７２℃１分間を２０サイクル行い、その後７２℃で４分間伸長を行った。末端を、ＳａｌＩおよびＮｈｅＩを用いる連続的消化によって調製した。ニューブラスチン遺伝子に隣接する３０塩基対の非コード領域を含む３３０塩基対フラグメントを、ゲル精製し、そしてゲル精製されかつＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化されているプラスミドｐＦＲＴ／ｄｈｆｒ−１（ハイグロマイシン遺伝子がジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子で置換されているｐｃＤＮＡ／ＦＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の誘導体）にライゲートした。得られるプラスミドをｐＮＢＮ０２６−３５と名付けた。ｐＮＢＮ０２６−３５中のニューブラスチン配列を図１０に示す。

以下の表は、シグナルペプチド−ニューブラスチン融合遺伝子を生成するためにＰＣＲおよび合成配列アセンブリーにおいて使用されるオリゴヌクレオチドを同定する。配列はすべて、５’から３’の方向で示される。

（実施例１１：シグナルペプチド−ニューブラスチン融合物の構築）
４種の異なるシグナルペプチドをコードする配列を試験した。これらには、ニューブラスチン、ラットアルブミン、およびヒト成長ホルモンからのシグナル配列が含まれた。さらに、合成シグナル配列が、ニューブラスチンシグナルペプチドを生成するためのＰＣＲ増幅の間の２つのフレームシフト変異から生じた。融合物は、オリゴヌクレオチドアセンブリーまたはＰＣＲのいずれかを使用して合成した。ＤＮＡフラグメントは、ｐＮＢＮ０２６にライゲートした。記載される４種の分子の各々の関連するＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。

合成シグナルペプチドを、オリゴヌクレオチドＫＤ３−４８７、ＫＤ３−４７９、ＫＤ３−４８０、ＫＤ３−４８１、およびＫＤ３−４８２（表）およびｐｕＲｅ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を使用してＰＣＲ増幅によって合成した。ＰＣＲ条件は、反応物の９５℃で４分間の加熱、次いで、以下のサイクル、すなわち９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を２０サイクル、その後の７２℃、４分間の伸長を含んだ。末端をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いる消化によって調製した。３３０塩基対フラグメントを、ゲル精製し、そしてゲル精製されかつＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化されているプラスミドｐＮＢＮ０２６にライゲートした。得られるプラスミドをｐＮＢＮ０３０と名付けた。予測されなかったか、または互いに相補されるオリゴヌクレオチドによってコードされなかった２つの自発的フレームシフト変異が存在し、翻訳されたタンパク質はインフレームであった。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を図１１に示す。

ニューブラスチンシグナル配列を、オリゴヌクレオチドＫＤ３−５１３およびＫＤ３−５１４（表）を用いるＰＣＲ増幅によって合成した。使用したポリメラーゼはｐｕＲｅ Ｔａｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）であった。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間の加熱、次いで、以下のサイクル、すなわち９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を３サイクル、その後の７２℃、４分間の伸長を含んだ。末端をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを用いる消化によって調製した。３３０塩基対フラグメントを、ゲル精製し、そしてゲル精製されかつＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで消化されているプラスミドｐＮＢＮ０３０にライゲートした。得られるプラスミドをｐＮＢＮ０３８と名付けた。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を図１２に示す。

アルブミンシグナル配列を、オリゴヌクレオチドＫＤ３−４８７、ＫＤ３−４７１、およびＫＤ３−４７２（表）を用いるＰＣＲ増幅によって合成した。使用したポリメラーゼはｐｕＲｅ Ｔａｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）であった。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間の加熱、次いで、以下のサイクル、すなわち９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を２０サイクル、その後の７２℃、４分間の伸長を含んだ。末端をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いる消化によって調製した。３３０塩基対フラグメントを、ゲル精製し、そしてゲル精製されかつＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化されているプラスミドｐＮＢＮ０２６にライゲートした。得られるプラスミドをｐＮＢＮ０２９と名付けた。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を図１３に示す。

ヒト成長ホルモンシグナル配列を、オリゴヌクレオチドＫＤ３−４８７、ＫＤ３−４７７、およびＫＤ３−４８５（表２）を用いて、プラスミドｐＶ３０（ヒト成長ホルモン遺伝子の５’末端のゲノムコピーを含むｐＵＣベースのプラスミド）から、ＰＣＲ増幅によって合成した。使用したポリメラーゼはｐｕＲｅ Ｔａｑ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）であった。ＰＣＲ条件は、９５℃で４分間の加熱、次いで、以下のサイクル、すなわち９５℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間を２０サイクル、その後の７２℃、４分間の伸長を含んだ。末端をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩを用いる消化によって調製した。３３０塩基対フラグメントを、ゲル精製し、そしてゲル精製されかつＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化されているプラスミドｐＮＢＮ０２６にライゲートした。得られるプラスミドをｐＮＢＮ０３１と名付けた。ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を図１４に示す。

（実施例１２：ＣＨＯ細胞トランスフェクト）
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、事前にＦｌｐ組換え標的（ｆｒｔ）を含むＤＮＡ配列で形質転換した（Ａ１細胞）。このＡ１宿主細胞はジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）を含まず、従って、ＤＨＦＲマイナスである。記載されるプラスミドの各々はＤＨＦＲ遺伝子、ニューブラスチン融合遺伝子、およびｆｒｔ部位をコードする。プラスミドｐＯＧ４４はＦｌｐリコンビナーゼ遺伝子をコードする。これらのプラスミドのＡ１細胞への同時トランスフェクトは、染色体へのシグナルペプチド−ニューブラスチン融合遺伝子およびＤＨＦＲの単一コピーの挿入を生じた。Ａ１細胞を、製造業者によって記載されるものと一致する条件下で（すなわち、０．４ｍｍキュベット、２８０ボルト、９５０マイクロファラッド）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）目的のプラスミドおよびプラスミドｐＯＧ４４でエレクトロポレーションを行った。ＤＨＦＲを発現する形質転換した細胞を、１０％透析胎仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を補充した、ヌクレオシドを含まないα−マイナス培地最小必須培地−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でのそれらの増殖能力について選択した。約２週間後、コロニーを単離し、同じ選択培地中でより大きなベッセルに拡大した。細胞培養を無血清培地に移行し、分析した。

（実施例１３：トランスフェクトした細胞株の分析）
細胞株候補を、ニューブラスチンを発現するそれらの能力についてスクリーニングした。懸濁細胞培養のアリコートを遠心分離して、馴化培地から細胞を分離した。馴化培地を細胞ペレットから取り出し、培地および細胞ペレットの両方を、一般的に記載されるような（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）、１６％ポリアクリルアミド上での還元および変性電気泳動のために処理した。電気泳動の完了の際、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンにエレクトロブロッティングし、ニューブラスチンに対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清を用いてプローブした。この抗体−ニューブラスチン複合体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と結合体化されたヤギ抗ウサギポリクローナル抗血清を使用して検出した。

ニューブラスチンシグナルペプチド、合成シグナルペプチド、アルブミンシグナルペプチド、およびヒト成長ホルモンシグナルペプチドをコードするプラスミドからタンパク質が発現され、各々が細胞ペレット画分に免疫反応性ニューブラスチンを発現した。しかし、アルブミンシグナルペプチドおよびヒト成長ホルモンシグナルペプチドのみが、馴化培地中に検出可能なレベルのニューブラスチンを発現した。すべての発現したニューブラスチンポリペプチドの電気泳動上の移動度は、１１ｋＤ、１０４アミノ酸型のニューブラスチンと一致していた。

（実施例１４：ＣＨＯ細胞中で産生されるニューブラスチンの配列）
ニューブラスチンを、一般的に記載されるように（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出）、免疫アフィニティーカラムを使用して馴化培地から精製した。アミノ末端配列を、アルブミンシグナルペプチドおよび成長ホルモンシグナルペプチドを含む細胞株から精製したタンパク質から決定した。ニューブラスチンをマイクロＴＦＡフィルター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に適用し、自動化エドマン分解化学反応に供した。アミノ末端配列決定を、ＡＢＩ Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４シークエンサー上で実行した。得られるＰＴＨアミノ酸を、ＰＴＨＣ１８逆相カラムを備えたＡＢＩ １４０Ｃ Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔシステムを使用して分離し、ＡＢＩ ７７８５Ａ吸収検出器を使用して分析した。両方の構築物について、一次タンパク質配列は、全長ニューブラスチンの１０４アミノ酸Ｃ末端フラグメントの最初の残基（すなわち、アラニン）で開始した。成長ホルモンシグナルペプチドとともに発現されたニューブラスチン調製物もまた、アミノ末端アラニン残基を欠く、１０３アミノ酸ニューブラスチンＣ末端フラグメントを含んだ。ニューブラスチンの１０３アミノ酸型は、アラニンで開始した。両方の場合において、シグナルペプチドは予想されたように機能した。すなわち、ニューブラスチンポリペプチドは細胞から分泌され、そしてシグナルペプチドが細胞によって切断された。

（実施例１５：組換えニューブラスチンの質量分析）
アルブミンシグナルペプチドおよび成長ホルモンシグナルペプチドをコードする構築物を含む細胞株の馴化培地からの精製したニューブラスチンを、ＺＭＤ質量分析装置（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）上のインタクト質量スペクトル分析によって、一般的に製造業者によって記載されているように分析した。両方の構築物について、脱グリコシル化サンプルの主要なピークは１０４アミノ酸ニューブラスチンポリペプチドに対応した（図１５）。これらの２つのシグナルペプチドは予想されたように機能した。すなわち、ニューブラスチンポリペプチドは細胞から分泌され、そしてシグナルペプチドが細胞によって切断された。さらに、グリコシル化ニューブラスチンは、ニューブラスチンをコードする構築物でトランスフェクトされた細胞から分泌され、そして成長ホルモンシグナルペプチドは種々の糖型を含んだ。

（実施例１６：ニューブラスチンおよび異種シグナル配列をコードする構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの培地中のニューブラスチン活性の検出）
生物学的活性を、キナーゼレセプター活性化ＥＬＩＳＡ（ＫＩＲＡ）を使用して評価した。この方法は以前に記載されている（Ｓａｄｉｃｋら、１９９６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６．２３５（２）：２０７）。手短に述べると、ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞、ＲｅｔおよびＧＦＲα３を発現する接着性マウス神経芽腫細胞株を、１０％ウシ胎仔血清で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、２４ウェルプレートのウェルあたり２×１０^５細胞でプレートし、１８時間、３７℃および５％ＣＯ_２下で培養した。

細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５ｍＬのＤＭＥＭ中のニューブラスチンの段階希釈で、１０分間、３７℃および５％ＣＯ_２で処理した。各サンプルを２連で分析した。細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、０．３０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、０．５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．２％ デオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ_２ＶＯ_４、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリドで、プレートを穏やかに揺すりながら１時間、４℃で溶解した。溶解物を、繰り返しピペッティングすることによってさらに攪拌し、０．２５ｍＬのサンプルを、５０ｍＭ カルボン酸緩衝液、ｐＨ ９．６中の、５μｇ／ｍＬの抗Ｒｅｔ ｍＡｂ（ＡＡ．Ｇｅ７．３）（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）でコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに、４℃で１８時間移し、次いで、室温で１時間、１％正常マウス血清および３％ウシ血清アルブミンを含むブロック緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ））でブロックした。

室温で２時間のインキュベーション後、ウェルをＴＢＳＴで６回洗浄した。プレートを再度洗浄し、その後３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンジヒドロクロライドを加えた。着色反応後、吸収の値を、４５０ｎｍにおいて溶解物または溶解緩衝液のみで処理したウェルから読み取り、そしてバックグラウンド補正シグナルを、刺激のために使用したリガンドの濃度の関数としてプロットした。

馴化培地の一連の希釈を試験し、機能的ニューブラスチンを、以前に実証された、Ｅ．ｃｏｌｉから発現され、精製され、およびリフォールディングされたニューブラスチンのバッチと同様のプロフィールを用いて検出した（図１６）。

（実施例１７：異種シグナルペプチドを用いて発現される成熟ニューブラスチン）
適切なオリゴヌクレオチドが、成熟ニューブラスチン（すなわち、全長ニューブラスチンの１１３Ｃ末端フラグメント）をコードするＤＮＡ配列をクローニングするために、実施例９に記載される方法に従って、産生され得る。ラットアルブミンまたはヒト成長ホルモンからのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が、実施例１０に記載されるように、成熟ニューブラスチンポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合され得る。このＤＮＡ配列は、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされて、分泌される成熟ニューブラスチンを産生し得る。

本明細書に引用されるすべての参考文献は、その全体が参照として本明細書に援用される。参照として援用される刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する程度まで、本明細書は、任意のこのような矛盾することがらよりも、優先し、および／または上位にあることを意図する。

本発明の多くの改変およびバリエーションは、当業者に明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載された特定の実施形態は、例示としてのみ提供され、いかなる場合においても限定を意図しない。詳細な説明および実施例は例示のみと見なされ、本発明の真の範囲および精神は特許請求の範囲に示されることが意図される。

種々の哺乳動物からのＩｇＳＰ配列のアラインメント。 実施例２における形質転換実験のために使用されるレンチウイルスベクター構築物ｐＨｓＣ．ＩｇＳＰ．ｈＮＢＮ．Ｗのベクターマップ。 実施例２における形質転換実験のために使用されるレンチウイルスベクター構築物ｐＨｓＣ．ＩｇＳＰ．ｈＮＢＮ．Ｗのベクターマップ。 ｐＮＳ１ｎ．ＩｇＳＰ．ｈＮＢＮのベクターマップ。実施例１において使用された、ＢａｍＨＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位との間のｐＨｓＣ．ＩｇＳＰ．ｈＮＢＮ．Ｗと同じＩｇＳＰ−ＮＢＮ配列。 ＲｅｔＬ３ ＥＬＩＳＡ（２連サンプル）におけるＮＢＮ活性の測定。（ａ）細胞上清中のＮＢＮ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生された組換えマウスＡｒｔｅｍｉｎ（ｍＡＲＴ）を標準として使用して測定された。（ｂ）トランスフェクトされた細胞からの上清の分析、（ｃ）形質転換された細胞からの上清の分析。 抗ＮＢＮ抗体＃３７８を用いるウェスタンブロット分析。（ａ）ＣＨＯ−ＮＢＮ１６細胞（ＣＨＯ−ＮＢＮ）からのＧＦＲ［α］３アフィニティー精製ＮＢＮおよび２０ｎｇラット組換えＮＢＮ（ｒＮＢＮ）の分析（ｂ）ＩｇＳｐ−ＮＢＮ発現構築物でトランスフェクトまたは形質転換されたＡＲＰＥ−１９からの上清および野生型構築物からのＮＢＮを安定して過剰発現する２つのＣＨＯ細胞クローン（ＣＨＯ−ＮＢＮ−２５ｃおよびＣＨＯ−ＮＢＮ１６）の分析。矢印は、抗体＃３７８による、還元後のニューブラスチンのグリコシル化モノマーおよび非グリコシル化モノマーの位置を示す。 シグナルＰによるシグナルペプチド切断の予測。説明については実施例４を参照のこと。 図７ＡはプラスミドｐＨｓ Ｃ．ｈＮＢＮ．Ｗを示し、図７ＢはプラスミドｐＨｓＣＸＷを示す。説明については実施例６を参照のこと。 図８Ａは馴化培地中での相対的ＮＢＮ放出を示し、図８Ｂおよび８Ｃは異なる細胞型におけるＮＢＮを示す。実施例７もまた参照のこと。 ネイティブなヒトニューブラスチンポリペプチドの１０４個のカルボキシ（Ｃ）末端アミノ酸の配列（配列番号１９）およびＣＨＯ細胞発現のために最適化されたネイティブなヒトニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸をコードする合成遺伝子（配列番号５９）とアラインするネイティブなヒトニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸をコードする対応するＤＮＡ配列（配列番号５８）を示す。ネイティブな配列から変化している合成遺伝子のヌクレオチドが示される（^＊）、 プラスミドｐＮＢＮ０２６−３５（配列番号６０）中のニューブラスチン配列を示す。提示された配列の直前に、ＸｈｏＩ制限部位に寄与する「ＣＴ」ジヌクレオチドがある。直後にはＢａｍＨＩ制限部位がある。 合成シグナル配列に融合されたニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸のＤＮＡ配列（配列番号６１）およびアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。シグナル配列に下線を付す。 ニューブラスチンシグナル配列に融合されたニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸のＤＮＡ配列（配列番号６３）およびアミノ酸配列（配列番号６４）を示す。シグナル配列に下線を付す。 アルブミンシグナル配列に融合されたニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸のＤＮＡ配列（配列番号６５）およびアミノ酸配列（配列番号７０）を示す。シグナル配列に下線を付す。 修飾アルブミンシグナル配列に融合されたニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸のＤＮＡ配列（配列番号６９）およびアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。シグナル配列に下線を付す。 ヒト成長ホルモンシグナル配列に融合されたニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸のＤＮＡ配列（配列番号６７）およびアミノ酸配列（配列番号６８）を示す。イントロンを含むシグナル配列に下線を付す。 アルブミンシグナル配列（１５Ａ）またはヒト成長ホルモンシグナル配列（１５Ｂ）（１５Ｃ）を使用してＣＨＯ細胞から分泌されたニューブラスチンの質量分析の結果を示す。１１，１５６ダルトンおよび１１，１５７ダルトンにおけるピークが１０４アミノ酸のニューブラスチンＣ末端フラグメントに対応する。１１，０８４ダルトンおよび１１，０８５ダルトンにおけるピークは、１０３アミノ酸のニューブラスチンＣ末端フラグメントに対応する。図１５Ａは、アルブミン指向性分泌からの脱グリコシル化ニューブラスチンを示す。図１５Ｂは、ヒト成長ホルモン指向性分泌からの脱グリコシル化ニューブラスチンを示す。図１５Ｃは、ヒト成長ホルモン指向性分泌からのニューブラスチンを示す。より大きな分子量を有するピークは種々の糖型に対応する。 ＣＨＯ細胞中で産生される、組換え的に産生されるニューブラスチンの活性を実証するＫＩＲＡアッセイの結果を示す。 図１７Ａは、成熟タンパク質、プロドメイン、およびシグナルペプチドを含む全長ニューブラスチンのアミノ酸配列を示す（配列番号１０）。図１７Ｂは、全長ネイティブニューブラスチンシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。図１７Ｃは、全長ニューブラスチンプロドメインのアミノ酸配列を示す。

Claims (46)

1. 生物学的に活性なニューブラスチンポリペプチドを産生するための方法であって、以下、
   免疫グロブリンシグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む核酸を含む発現ベクターを含む細胞を培養する工程であって、該ヌクレオチド配列は、ニューブラスチンプロ領域をコードしていない、工程
   を包含し、
   該ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸１〜１４０、または配列番号１１もしくは１２のアミノ酸１〜１４４、配列番号１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８、Ｎ末端短縮型ＮＢＮ、変異型ＮＢＮ、または変異型かつＮ末端短縮型ＮＢＮとして同定された配列を有するニューブラスチンから選択される成熟ＮＢＮからなる群より選択される、方法。
2. 前記免疫グロブリンシグナルペプチドが、配列番号４のマウスＩｇＳＰ、配列番号６のラットＩｇＳＰ、配列番号５のブタＩｇＳＰ、配列番号２または３のサルＩｇＳＰ、および配列番号１のヒトＩｇＳＰからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩｇＳＰが、配列番号４のマウスＩｇＳＰである、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＩｇＳＰが、配列番号１のヒトＩｇＳＰである、請求項２に記載の方法。
5. 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、または１８によって同定される配列を有するニューブラスチンからなる群より選択される成熟ＮＢＮである、請求項１に記載の方法。
6. 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号１４のヒト成熟１１３ＮＢＮである、請求項５に記載の方法。
7. 前記ニューブラスチンペプチドが、ヒトニューブラスチンの１１６個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１５個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１４個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１３個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１２個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１１個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１０個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０９個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０８個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０７個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０６個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０５個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０３個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０２個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１０１個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１００個のＣ末端アミノ酸、およびヒトニューブラスチンの９９個のＣ末端アミノ酸からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
8. 前記ニューブラスチンポリペプチドが、配列番号１０の１０６個、１０４個、１０２個、または９９個のＣ末端アミノ酸を有するＮ末端短縮型ニューブラスチンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ニューブラスチンポリペプチドが、ヒトニューブラスチンの１１６個のＣ末端アミノ酸、ヒトニューブラスチンの１１３個のＣ末端アミノ酸、およびヒトニューブラスチンの１０４個のＣ末端アミノ酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記Ｎ末端短縮型ニューブラスチンが、配列番号１９のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記Ｎ末端短縮型ニューブラスチンが、配列番号２０の９９アミノ酸を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ベクターが、プラスミドである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記ベクターが、哺乳動物発現ベクターである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ベクターが、複製欠損レンチウイルス粒子である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記ベクター粒子が、５’レンチウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、前記シグナルペプチドおよび前記ニューブラスチンペプチドをコードするポリヌクレオチドシグナルに作動可能に連結されたプロモーター、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、ならびに３’レンチウイルスＬＴＲを含むレンチウイルスベクターから産生される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ベクターが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ、ＡＡＶ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびＭｏＭＬＶなどのレトロウイルスからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
18. 前記プロモーターが、ユビキチンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＪｅＴプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、伸長因子１αプロモーター、ニワトリβ−アクチン、ＰＧＫ、およびＭＴ−１からなる群より選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 前記プロモーターが、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、ラパマイシン誘導性プロモーター、Ｍｘ１、およびＲＵ４８６などの誘導性／抑制性プロモーターである、請求項１７に記載の方法。
20. 前記細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 前記哺乳動物が齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サル、およびヒトからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記細胞が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ、神経細胞、胎児細胞、ＡＲＰＥ−１９、不死化線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、線条体細胞、ニューロン、星状細胞、および介在ニューロンからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
23. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項２２に記載の方法。
24. シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸であって、該ポリヌクレオチド配列は、ニューブラスチンプロ領域をコードしておらず、該シグナルペプチドおよび該ニューブラスチンペプチドが、請求項１〜１１のいずれかにおいて規定される、核酸。
25. 前記ヌクレオチド配列が、哺乳動物宿主における発現のために最適化されている、請求項２４に記載の核酸。
26. 請求項２４または２５のいずれかに規定される核酸を含む、発現ベクター。
27. 請求項２６に規定されるベクター、および１種以上の薬学的に受容可能なアジュバント、賦形剤、キャリア、および／または希釈剤を含有する、薬学的組成物。
28. 請求項２６に規定されるベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、単離された宿主細胞。
29. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の細胞。
30. 前記細胞が、５００ｎｇ／１０^６細胞／２４時間を超える量でニューブラスチンまたはその機能的等価物を分泌可能である、請求項２９に記載の哺乳動物細胞。
31. ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ、不死化線維芽細胞、Ｃ２Ｃ１２、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＲＰＥ細胞株、およびＡＲＰＥ−１９細胞からなる群より選択される、請求項２９に記載の哺乳動物細胞。
32. ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ、およびＡＲＰＥ−１９からなる群より選択される、請求項３０に記載の哺乳動物細胞。
33. ＲＰＥ細胞、神経細胞、神経前駆細胞、幹細胞、および胎児細胞からなる群より選択される、請求項２９に記載の哺乳動物細胞。
34. 支持マトリックスに結合される、請求項２９に記載の哺乳動物細胞。
35. 感染性ベクター粒子を産生することが可能なパッケージング細胞株であって、該ベクター粒子が、５’レトロウイルスＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、ならびに３’レトロウイルスＬＴＲを含むレトロウイルス由来のゲノムを含み、ここで、該ヌクレオチド配列は、ニューブラスチンプロ領域をコードせず、該シグナルペプチドおよび該ニューブラスチンペプチドが、請求項１〜１１のいずれかにおいて規定される、パッケージング細胞株。
36. 前記ベクター粒子が、複製欠損性である、請求項３５に記載のパッケージング細胞株。
37. 前記ゲノムがレンチウイルス由来であり、かつ前記ＬＴＲがレンチウイルスのものである、請求項３５に記載のパッケージング細胞株。
38. 移植可能な細胞培養デバイスであって、
    ｉ．該細胞培養デバイスを通じて増殖因子の分散を可能にする半透性膜；および
    ｉｉ．請求項２８に規定される少なくとも１つの単離された宿主細胞
    を備える、デバイス。
39. 前記半透性膜が、免疫隔離的である、請求項３８に記載のデバイス。
40. 前記半透性膜が微小孔性である、請求項３８に記載のデバイス。
41. 前記デバイスが、半透性膜中に配置されたマトリックスをさらに備える、請求項３８に記載のデバイス。
42. 前記デバイスが、つなぎアンカーをさらに備える、請求項３８に記載のデバイス。
43. 神経系障害を処置するための、請求項２６に記載のベクター、または、請求項３８〜４３のいずれかに記載のデバイス。
44. 末梢神経障害を処置するための請求項２６に記載のベクター、または、請求項３８〜４３のいずれかに記載のデバイス。
45. 神経障害性疼痛を処置するための、請求項２６に記載のベクター、または、請求項３８〜４３のいずれかに記載のデバイス。
46. シグナルペプチドおよびニューブラスチンポリペプチドを含むポリペプチドであって、該ポリペプチドがニューブラスチンプロ領域を欠き、該シグナルペプチドおよび該ニューブラスチンポリペプチドが請求項１〜１１のいずれかに規定される、ポリペプチド。

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