JP2002502822A

JP2002502822A - 骨芽細胞の前駆細胞による骨欠損の治療

Info

Publication number: JP2002502822A
Application number: JP2000530221A
Authority: JP
Inventors: ジェフリーオー．ホーリンガー; シェリーアール．ウィン; エドモンドフランク; シュウシー．ウォン
Original assignee: オレゴンヘルスサイエンシーズユニバーシティー
Priority date: 1998-02-10
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2002-01-29
Also published as: EP1053002A1; WO1999039724A1; AU2671599A; CA2320136A1; WO1999039724A9

Abstract

(57)【要約】多孔質基質中に骨芽細胞前駆細胞（OPC）を保持させ、それを骨欠損部に移植することにより、骨欠損の治癒が促進される。OPCには、BMP-2などの骨誘導因子（BMP）を発現するように形質転換を施すことができる。骨欠損部にOPCを導入するための装置も開示される。装置の1つは、一方の通路を通して内視鏡（122）を導入することができ、細胞が障害される程度にOPCに対する圧力を高めることなく、内視鏡または別の通路を通じてOPCが導入されるような、同軸通路（122）を有するカニューレ（100）である。カテーテルを通じて骨内に細胞懸濁液を緩やかに導入するために、内視鏡を通してカートリッジユニット（126）を挿入することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、外科的切除、発生時奇形、外傷または疾患などによって生じた骨欠
損の治癒を補助するための治療に関する。より詳細には、本発明は、骨の修復お
よび再生を助ける治療用生物学的組成物（therapeutic biological composition
）、本組成物を作製するための組換えDNA技術、本方法において有用な細胞系、ならびに骨修復部位への治療用組成物の送達および局在化のための装置に関する
。

【０００２】発明の背景他のいくつかの種類の完全分化組織とは異なり、骨には著しい再生能がある。
この再生能のおかげで折れた骨の再生が可能となり、外科医は、外傷、先天奇形
および腫瘍切除によって生じた骨欠損部の治癒を目的として骨移植を行う際にこ
の能力を利用する。骨移植には、クロイツフェルト・ヤコブ病、ヒト免疫不全ウ
イルス、または他の病原体による感染のリスクがある。また、自家移植も不成功
率は高く（13〜30％）、同種移植の場合にはさらに高い（20〜35％）。これらの
容認しえない臨床転帰、さらには病原体の伝染および免疫応答（同種移植片によ
る）のために、より安全かつ効果的な別の選択肢の開発が求められている。これ
らの考察により、内部に骨が成長可能であって（骨導（osteoconduction））、同時に骨移植片の問題が回避される基質を提供する生体工学材料の探索が促され
ている。

【０００３】提唱されていることの一つは、ヒト組織の代替物として合成骨インプラントを
用いるというものである。アクリルポリマー、コラーゲン、シリコンエラストマ
ー、多孔質PTFE炭素繊維混成物、リン酸カルシウム性バイオセラミックス（生分
解性リン酸三カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなど）および吸収性ラクチ
ドポリマーはすべて、内部に骨が成長しうる多孔質基質を提供すると考えられて
いる材料である。しかし、これらの材料はいずれも著明な骨形成（骨組織発生）
を誘導するとは思われず、このため、骨誘導性を欠くといわれている。

【０００４】骨移植片および合成インプラントに伴うもう1つの問題は、骨外傷の大部分が生じる高齢者においてそれらの有効性がしばしば乏しいことである。身体が加齢
を重ねるにつれて、移植片またはインプラントを治癒過程にある骨欠損部に組み
入れようとする際に必須である骨の再生能の一部は失われていく。この骨形成調
節能の障害に関連する臨床症状の一つが骨粗鬆症であり、これは衰弱性の骨およ
び脊髄損傷をしばしば引き起こす。本疾患は骨形成（骨芽細胞による）と骨吸収
（破骨細胞による）との間の不均衡によって生じると考えられており、これはお
そらくこの系の恒常性を維持する複雑な細胞間相互作用の障害によると思われる
。

【０００５】ここ20〜30年ほどの間、骨形成過程の分子的基盤は盛んな研究テーマとなって
いる。骨誘導因子（bone morphogenetic protein（BMP））として知られる一群の調節性分子は、胚形成、維持期および修復時に骨を形成させる細胞過程の方向
付けに働くことが明らかになった。BMPはトランスフォーミング増殖因子β（TGF
-β）スーパーファミリーに分類されている。このファミリーに属するBMPにはBM
P2〜15が含まれる（BMP-1はTGF-βスーパーファミリー）。BMP2〜9の配列は、ウ
ォズニー（Wozney）ら、Prog. Growth Factors 1：267〜280（1989）、Mol. Rep
rod. Dev. 32：160〜167（1992）およびScience 242：1528〜1534（1988）ならびにワング（Wang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：9484〜9488（1988）により記載されている。

【０００６】これらのBMPの同定およびクローニングは、ウシ骨から16〜18kDのポリペプチドを単離し、それらをトリプシンで消化した後にアミノ酸配列を決定し、オリゴ
ヌクレオチドプローブを合成することによって行われた。続いてこのプローブを
用いたウシゲノム配列ライブラリーまたはcDNAライブラリーのスクリーニングに
よって組換えクローンが同定され、これを用いてヒトcDNAライブラリーのスクリ
ーニングを行うことにより、ヒトBMPをコードする組換えクローンが得られた；ワング（Wang）、Proc. Natl. Acad. Sci USA 85：9484（1988）；ウォズニー（
Wozney）ら、Science 242：1528（1988）。この戦略を用いてBMP-1からBMP-9までが得られ、それらのアミノ酸配列が導き出された。BMP-2からBMP-9までは、ア
ミノ酸配列の保存に基づき、BMP-2およびBMP-4、BMP-3（オステオゲニンと呼ばれる）、BMP-5からBMP8まで（BMP-7およびBMP-8は、それぞれ骨形成性蛋白質1（
OP-1）および骨形成性蛋白質2（OP-2）と呼ばれる）およびBMP-9という複数のサ
ブファミリーに区分された。

【０００７】さらに最近では、イナダ（Inada）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 222 ：317〜322（1996）、セレステ（Celeste）ら、J. Bone Miner. Res. 10（1S）3
34〜339（1995）およびデュベ（Dube）ら、J. Bone Miner. Res. 10：333〜339 （1995）により、BMP10〜15がハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて同定された。BMP-12およびBMP-13はマウス増殖／分化因子（それぞ
れGDF-7およびGDF-6）のヒト相同体であると思われる。

【０００８】 BMPに関して数多くの特許が発行されていることも、この分野の研究が盛んなことを示すもう一つの証拠である。米国特許第4,455,256号（Urist）は、骨組織
の脱灰、溶解剤中での骨組織の脱灰（demineralizing）、およびBMPの沈殿による、BMPの一般的な製造方法を開示している。精製されたBMP-1蛋白質の配列およ
びそれらをコードするDNA配列は米国特許第5,108,922号（Wangら）に開示されて
いる。米国特許第5,166,058号（Wangら）および第5,318,898号（Israel）は組換
えBMP-2の作製のための方法に関し、米国特許第5,618,924号（Wangら）はBMP-2 産物を開示しており、一方、米国特許第5,670,338号（Murakamiら）はBMP-2AをコードするDNAのクローニングの工程を開示している。BMP-3の蛋白質をコードす
るDNA配列は米国特許第5,116,738号（Wangら）に開示されており、BMP-5については米国特許第5,106,748号（Wozneyら）に、BMP-6については米国特許第5,187,
076号（Wozneyら）に、BMP-7については米国特許第5,141,905号（Rosenら）に、
BMP-8についてはPCT国際公開公報第91／18098号に、BMP-9についてはPCT国際公開公報第93／00432号に開示されている。骨成長を刺激する化合物の同定および評価のためのスクリーニング法は、国際公開公報第96／38590号（Harrisら）で考察されている。このように、さまざまなBMPをコードする配列が知られており、「骨誘導因子」という用語は種々のペプチドを包含する。

【０００９】 BMPの特性、役割および解剖学的所在の概要を表1に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】 BMPの発見は、骨欠損部における骨再生を援助するために外因性BMPを用いるこ
とが可能になるという大きな期待から歓迎された。しかし、それらの骨形成活性
の臨床的利用は当初に期待されたよりも困難であった。このように期待通りでな
かった理由の一部は、BMPが骨形成効果を発揮するための適切な生物環境を提供する送達システムの発見が困難であったことである。適切な担体がなければ、BM
Pは適用しようとした解剖学的部位から急速に拡散し、間葉細胞に対して望ましい生物活性を発揮しえない程度に濃度が低下してしまう。キム（Kim）ら、J. Bi
omed. Material. Res. 35：279〜285（1997）は、造骨性細胞に組換えヒトBMP-2
（rhBMP-2）によるエクスビボ刺激を加えた後に、刺激された細胞を骨癒合不全（bony non-union）の領域内に移植することによってこの問題を克服しうると提
唱した。しかし、この著者らは、この手法を用いて骨芽細胞の刺激が認められた
ことを報告していない。リパモンティ（Ripamonti）ら、South African J. Scie
nce 91：277〜280（1995）は、力学的支持を与えるとともに間葉および血管の急
速な侵入を促す、相補的で生体適合性があって彫刻造形が可能な基質を見いだせ
ないことが、BMPの効果的な担体を開発する上での障害になっていると指摘している。

【００１２】骨欠損部への移植が可能なポリマー基質中にある形で骨形成性蛋白質を提供し
ようとの提案もなされている。アクリルエステル製のポリマー基質（米国特許第
4,526,909号、Urist）または乳酸重合体（米国特許第4,563,489号、Urist）が、
骨形成性蛋白質に対する担体として提案されている。クーバー・サンパス（Kube
r Sampath）らは、米国特許第4,968,590号において、グリコール酸および乳酸の
コポリマーおよびホモポリマー、ならびにならびにヒドロキシアパタイトおよび
リン酸カルシウムでできた基質ポリマーの使用を開示している。米国特許第5,26
6,683号（Oppermanら）は、粒径70〜850μmの多孔質材料の粒子でできた基質を開示しており、その基質材料はコラーゲンのほか、グリコール酸、乳酸および酪
酸の重合体、ならびにヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムなどのセラミ
ックスであった。骨誘導因子に対する担体としてのポリ(α-ヒドロキシ酸）の使
用は、ホリンガー（Hollinger）およびレオン（Leong）、Biomaterials 17：187
〜194（1996）に開示されている。リン酸カルシウムまたは酢酸カルシウム基質は米国特許第4,789,732号（Urist）、第5,306,303号（Lynch）および第5,385,88
7号（Yimら）に開示されている。基質を含むコラーゲンは、米国特許第4,975,52
7号（Koezukaら）および第5,531,791号（Wolfinbarger）に提案されている。

【００１３】 BMPのための送達システムについては、マイヤーズ（Mayer）ら、Plastic and
Reconstruc. Surg. 98：247〜259（1996）に概説があり、そこではコラーゲン送
達システムに関して、材料に免疫誘発性があるために理想的でないと思われると
の指摘がなされている。同様に、BMP-2および自家血液をポリ(ラクチド-co-グリ
コリド)粒子に含むシステムは、軟組織の移動および被移植部の骨床からの毛細管性出血によって移動し、このために被移植部位における有効量のBMP-2の局在が妨げられることが明らかになった。このため、何年も研究が行われたものの、
生体適合性があって免疫原性がなく、骨形成性因子の保持および局在化のために
十分な基質を提供すると同時に、血管の成長を許容し、欠損部における新骨の最
終的形成を妨げることなく内部に骨が成長しうる構造を提供するような送達シス
テムに対する需要は今なおある。BMP-2を骨再生のために臨床的に用いる場合、これらの問題のいくつかを克服するにはその大量投与が必要となるが、その結果
は依然として臨床的に有用なものとはなっていない。

【００１４】骨芽細胞前駆細胞（OPC）および骨形成におけるそれらの役割も、研究者の大きな関心の的となっている。間質細胞の均質調製物からOPCを単離するための方法は、リカード（Rickard）ら、J. Bone Mm. Res. 11：312〜324（1996）に記載
されている。OPCの不死化はエバンス（Evans）ら、J. Ortho. Res. 13：317〜32
4（1995）、ハリス（Harris）ら、J. Bone Mm. Res. 10：178〜186（1995）およ
び米国特許第5,693,511号（Harrisら）によって開示されている。骨芽前駆細胞（osteoprogenitor cell）の使用は、オニイアOnyiaら、J. Bone Mm. Res. 13：
20〜30（1998）において、エクスビボ遺伝子導入の標的としても考察されており
、一方、線維芽細胞への骨形成性プラスミド遺伝子の直接導入による骨の刺激が
、ファング（Fang）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：5753〜5758（1996）によって提唱されている。C3H10T1／2間葉細胞におけるBMP-2およびBMP-4の発現
は、アーレンス（Ahrens）ら、DNA and Cell Bio. 10：871〜880（1993）に考察
されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるBMP-2の発現はイスラエル（Israel）ら、Growth Factors 7：139〜150（1992）に開示されている。

【００１５】骨修復の生物学的な理解の点では数多くの進歩が相次いでいるが、これらの概
念を臨床的に有用な技術へと応用することは容易でない。

【００１６】このため、本発明の1つの目的は、修復中の骨欠損部に対して臨床的に適用しうる、骨欠損の修復のための有効な方法を提供することである。

【００１７】発明の概要上記の目的は、欠損の修復のために骨欠損部内に移植される多孔質基質に実質
的に固定された、または隣接するOPCの治療的有効量を提供することによって達成しうる。または、本発明は、例えば骨欠損部内に移植された条件的不死化（co
nditionally immortalized）OPCにおけるBMP-2の発現などの、骨誘導因子（BMP ）がOPC内で発現される方法を含む。BMPを産生するOPCは、OPCを移植部位に保持
する多孔質基質に実質的に固定されても隣接してもよく、OPCはそれ自体が発現するBMPに反応して骨欠損部で骨を産生する。OPCを外因的な供給によっても、OP
Cの減少または機能的障害が生じている可能性のある罹患個体または高齢個体の骨形成能が増強される。本発明は、BMPを発現するようにOPCにトランスフェクシ
ョンを施すこと、および骨欠損を修復させる有効量のBMPを発現させるためにそのようなOPCの治療的有効量を投与することを含む。

【００１８】 OPC（トランスフェクションを受けたもの、または受けていないもの）は、移植時にOPCに対して緩衝的に作用する環境を提供するとともに、骨欠損の治癒のためにOPCを局在化させる分解性支持基質を提供するインプラント中にある形で投与することができる。本インプラントは、骨形成の進行に対する物理的障壁と
なることなしに、血管伸長および骨形成を許容または促進するためにも適する。
特定の態様において、本インプラントは、インプラントが骨の形成に伴って分解
するように、その局在部位での骨形成と比例した速度で分解する。骨形成が実質
的に促進または完了した時点でOPCに対して有毒な物質が放出されるような分解性インプラントを設計することも可能である。

【００１９】本インプラントは、保護および増殖のためにOPCが内部に懸濁化された細胞懸濁液成分（例えば、ヒドロゲルなどのゲル懸濁液）を含みうる。インプラントが
、例えば、ポリ乳酸（PL）やポリグリコリド（PG）のホモポリマー、およびそれ
らのコポリマーである(ラクチド-co-グリコリド)（PLG）といったポリ(α-ヒドロキシ酸)（PHA）などの、分解性で実質的に生体適合性であって免疫原性のない
材料などの多孔質支持成分を含んでもよい。この支持成分は、軟組織を支持し、
ゲル成分を保護するとともに、内部に骨成長が起こりうる生物的鋳型（biologic
al template）を提供する、比較的強固な環境をもたらす。この支持成分は、例えばゲルのコアを取り巻く隣接性皮層として、または層状もしくは多層状インプ
ラントにおける隣接層として、懸濁液成分に対して保護的な関係にあるように配
置される。支持成分が、懸濁液成分中のOPCを活性化するための治療的有効量のB
MPを含んでもよい。BMPを浸透させた支持成分中に懸濁化させた場合、特定の態様におけるOPCは、生理的または超生理的用量のBMPを発現するように形質転換を
受ける。しかし、本発明には、BMPを発現するような操作は受けていないものの多孔質支持成分の基質中に浸透したBMPに対して曝露されうる天然型のOPC、さら
にはBMPを発現するような操作を受けておらず、BMPを浸透させた基質中にもおか
れないOPCも含まれる。

【００２０】また、本発明には、BMP-2などのBMPを産生させるための発現ベクターが導入さ
れたOPCのように前記生理的量の骨形成性BMPを発現する細胞などのOPCを投与する方法も含まれる。OPCは、外傷性もしくは先天性欠損などの骨欠損部、または例えば骨粗鬆症の患者の脊椎で生じるような骨形成もしくは密度が低下した領域
（骨減少性骨）に導入される。OPCを、OPCに対する保護および内部に骨形成が生
じる構造性基質の双方をもたらすインプラントと併用して投与することもできる
。骨粗鬆症の治療のために用いる場合には、新骨形成を促すために、細胞懸濁液
またはインプラントのいずれかを骨粗鬆症性もしくは骨減少性の骨の被移植床（
recipient bed）に導入する。被移植床は、例えば、骨粗鬆症性骨の中にカテーテルを導入し、骨内部に過剰な背圧を生じずに内部に細胞またはインプラントを
導入しうる局所的空隙または空洞を骨内部に作ることによって調製することがで
きる。

【００２１】また、本発明には、OPCなどの骨形成性細胞系（osteogenic lineage）への分化が運命づけられた治療的有効量の細胞も含まれる。骨形成性細胞系への分化能
をもつ細胞には、細胞系OPC1の特徴を有する条件的不死化骨芽細胞前駆細胞が含
まれうる。特定の態様において、多孔質基質はポリ(D,L-ラクチド)およびコラー
ゲンの配合物からなる。その他の態様において、組成物は治療的有効量のBMP、より詳細にはBMP-2も含みうる。さらなる態様には、OPC1によって発現される組換えBMP-2が含まれる。

【００２２】細胞懸濁液またはインプラントを体内に導入するための送達装置は、懸濁液ま
たはインプラントを望ましい位置へと進めるためのカテーテルを含む。例えばイ
ンプラントを円柱状にすることにより、管状カテーテルと組み合わせた場合にカ
テーテル壁と適合するようにインプラントを設計してもよい。円柱状インプラン
トは、例えば、ゲル状のOPC懸濁液コアの周囲に円柱状支持皮層を用意すること、または管状カテーテル内への導入のために層状インプラントを折り曲げて円柱
状にすることによって形作ることができる。他の形態のインプラントを用いるこ
と、およびインプラントを設置する骨欠損部の形状に適合するように作製するこ
とも可能である。送達装置を用いず、インプラントを外科的に移植してもよい。

【００２３】送達装置としては、骨減少性脊椎などの骨欠損の位置決定および治療のための
最小侵襲手術の際に用いられる光ファイバー内視鏡が可能である。内視鏡は、周
囲の骨減少性骨を圧迫して、内部にOPCを設置するための空洞を作ることによって「骨形成術」を施行するために、先端を骨内に導入した後に拡張可能な（例え
ば、バルーンカテーテルの先端の拡張による）空洞形成性先端を備えた遠位端を
有することが可能である。空洞が形成された後にバルーンを脱気し、加圧下で拡
大した空洞内にカテーテルを通じてインプラントを挿入する。空洞の寸法は、イ
ンプラントが空洞を実質的に充填するように、インプラントと実質的に同一（ま
たはやや大きい）であってよい。または、細胞を懸濁液中に分散させずに、OPC を空洞内を緩やかに導入することも可能である。緩やかな導入は、内視鏡から伸
びたオーガー（auger）を用いて行いうる。骨減少性骨領域へのOPCの導入は、新
骨形成による空洞内の充填に役立つだけでなく、BMPを発現するOPCは患者体内の
天然のOPCを骨減少性骨の部位に動員し、周囲の骨における付加的な骨形成をも促す。

【００２４】また、本発明には、BMP反応性であって外因性または前記生理的濃度のBMPも発
現する新規細胞系（OPC1など）、このような細胞系を作製し、それらを条件的に
不死化させる組換え法、OPCを組み入れた組成物、およびインプラントの製造法が含まれる。開示される特別なOPCは、アスコルビン酸およびグリセロリン酸を培地に添加しなくても骨形成を開始することができ、しかも接触阻止を示す（こ
のため集密化した後に細胞増殖がみられない。これは腫瘍化のおそれがないこと
を意味する）。

【００２５】本発明の上記およびその他の目的、特徴および利点は、添付の図面を参照しな
がら進められる以下の好ましい態様の詳細な説明により、さらに明らかになると
考えられる。

【００２６】配列表付属の配列表中に列挙する核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に関
する標準的な略号文字およびアミノ酸に関する三文字コードを用いて示されてい
る。各核酸配列の一方のストランドのみが示されているが、示されたストランド
を参照することによって相補鎖も含まれるものと理解される。配列番号1：オステオカルシンの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うためのPCRプライマー。配列番号2：オステオカルシンの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うためのPCRプライマー。配列番号3：オステオネクチンの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うため
のPCRプライマー。配列番号4：オステオネクチンの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うため
のPCRプライマー。配列番号5：オステオポンチンの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うため
のPCRプライマー。配列番号6：オステオポンチンの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うため
のPCRプライマー。配列番号7：PTH受容体の発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うためのPCRプ
ライマー。配列番号8：PTH受容体の発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うためのPCRプ
ライマー。配列番号9：アルカリホスファターゼの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行
うためのPCRプライマー。配列番号10：アルカリホスファターゼの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うためのPCRプライマー。配列番号11：プロコラーゲンIの発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うため
のPCRプライマー。配列番号12：プロコラーゲンI 発現に関してOPC細胞の表現型分析を行うためのPCRプライマー。配列番号13：KS-hBMP-2プラスミドベクターのヌクレオチド配列。配列番号14：IgSP-NS-hBMP-2プラスミドベクターのヌクレオチド配列。配列番号15：IgSP-KR-hBMP-2プラスミドベクターのヌクレオチド配列。配列番号16：IgSP-RRRR -hBMP-2プラスミドベクターのヌクレオチド配列。

【００２７】詳細な説明

【表２】略号および定義

【００２８】単離された：「単離された」生物成分（核酸分子、蛋白質またはオルガネラな
ど）は、その成分が天然にみられる細胞のオルガネラにおいて他の生物成分、す
なわち、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNA、蛋白質ならびにオルガネラ
から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸および蛋白質には
、標準的な精製法によって精製された核酸および蛋白質が含まれる。この用語に
は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸および蛋白質、さらに
は化学合成された核酸も含まれる。

【００２９】オリゴヌクレオチド：長さが6〜300ヌクレオチドの範囲にある線状のポリヌク
レオチド配列。

【００３０】機能的に結合した：第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的に関係する位置に
置かれている場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能的に結合しているとい
う。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば
、プロモーターはコード配列と機能的に結合している。一般に、機能的に結合し
たDNA配列は互いに近接しており、2つの蛋白質コード領域が連結する必要がある
場合には、同じリーディングフレーム中にある。

【００３１】 ORF（オープンリーディングフレーム）：内部に終止コドンを含まない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は
通常、ペプチドへと翻訳される。

【００３２】薬学的に許容される担体：本発明において有用な薬学的に許容される担体は、
通常のものである。マーチン（E. W. Martin）によるレミントン薬学（Remingt
on's pharmaceutical Sciences）、Mack Publishing Co.、Easton、PA、第15版（1975）は、本明細書に開示される融合蛋白質の薬学的送達のために適した組成
物および製剤を記載している。

【００３３】一般に、担体の性質は、用いる個々の投与の態様に依存すると考えられる。例
えば、非経口的製剤は通常、水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロ
ース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される液体を含む注入可
能な液体を媒体として含む。固体組成物（例えば、粉剤、丸剤、錠剤またはカプ
セル剤）の場合は、例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン
またはステアリン酸マグネシウムなどの、従来の非毒性担体を含めることができ
る。投与しようとする薬学的組成物は、生物学的に中性な担体に加えて、湿潤剤
および乳化剤、保存薬およびpH緩衝薬などの非毒性佐剤を微量に含みうる。

【００３４】精製された：精製されたという用語は、絶対的に純粋であることを求めるもの
ではなく、相対的な用語として用いる。したがって、例えば、精製された融合蛋
白質調製物とは、融合蛋白質がその発生環境、例えば細胞内または生化学的反応
チャンバー内よりも豊富なものをいう。好ましくは、融合蛋白質の調製物は、融
合蛋白質が調製物の総蛋白質含有量の少なくとも50％を占める。

【００３５】組換え体：組換え核酸分子とは、天然にはみられない配列を有するもの、また
は別々に分離された2つの配列断片の人工的組み合わせによって作られた配列を有するものをいう。この人工的組み合わせは、化学合成によって、またはより一
般的には、例えば遺伝子工学技術による単離された核酸断片の人工的操作によっ
て達成しうる。

【００３６】同様に、組換え蛋白質とは、組換え核酸分子によってコードされるものをいう
。

【００３７】配列の同一性：2つの核酸配列または2つのアミノ酸配列の間の類似性は、配列
の同一性として言及しない限り、配列間の類似性として表現される。配列の同一
性はしばしば一致率（または類似度もしくは相同性）として測定され、その比率
が高いほど2つの配列は類似している。二重特異性融合蛋白質の相同体は、標準的な方法を用いて整列化した場合に比較的高度の配列同一性を有すると考えられ
る。

【００３８】比較のために配列を整列化する方法は、当技術分野で周知である。さまざまな
プログラムおよび整列化アルゴリズムが以下のものに記載されている：スミス（
Smith）およびウォーターマン（Waterman）（Adv. Appl. Math. 2：482、1981）
、ニードルマン（Needleman）およびブンシュ（Wunsch）（J. Mol. Biol. 48：4
43、1970）、ピアソン（Pearson）およびリップマン（Lipman）（PNAS. USA 85 ：2444、1988）、ヒギンズ（Higgins）およびシャープ（Sharp）（Gene、73：23
7〜244、1988）、ヒギンズおよびシャープ（CABIOS 5：151〜153、1989）、コル
ペ（Corpet）ら（Nuc. Acids Res. 16：10881〜90、1988）、ファン（Huang）ら
（Comp. Appls Biosci. 8：155〜65、1992）ならびにピアソンら（Methods in M
olecular Biology 24：307〜31、1994）。アルツシュル（Altschul）ら（Nature
Genet.、6：119〜29、1994）は、配列の整列化の方法および相同性の算出に関して詳細に考察している。

【００３９】整列化ツールであるALIGN（MyersおよびMiller、CABIOS 4：11〜17、1989）ま
たはLFASTA（PearsonおよびLipman、1988）を、配列の比較を行うために用いてもよい（Internet Program（c）1996、W. R. Pearson、およびバージニア大学（
University of Virginia）「fasta20u63」バージョン2.0u63、リリース日1996年
12月）。ALIGNは配列全体を別のものと比較し、LFASTAは局所的な類似性のある領域を比較する。これらの整列化ツールおよびそれぞれの指導マニュアルは、イ
ンターネット上でhttp://biology.ncsa.uiuc.edu.から入手可能である。

【００４０】開示される二重特異性融合蛋白質のオルソログ（ortholog）は、典型的には、
初期設定パラメータに設定したALIGNを用いて完全長整列化に関して算出された二重特異性融合蛋白質のアミノ酸配列との配列一致率が75％を上回るという特徴
をもつ。参照配列との類似度がさらに高い蛋白質をこの方法によって評価した場
合には、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、
少なくとも95％、または少なくとも98％の配列一致率といったさまざまな一致率
を示すと考えられる。さらに、開示された融合蛋白質の一方または両方の結合ド
メインの完全長にわたって配列の同一性を比較することもできる。このような場
合の一致率は、完全長配列の同一性に関して考察される値と本質的には同様であ
ると考えられる。

【００４１】配列全体よりも著しく短い配列を同一性に関して比較しようとする場合には、
ホモログ（homolog）は典型的には、10〜20アミノ酸という短いウィンドウ幅にわたって少なくとも80％の配列一致率を有すると考えられ、参照配列との類似性
に応じて、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくと
も99％の一致率を有することもある。このような短いウィンドウ幅にわたる配列
の一致率はLFASTAを用いて決定可能であり、その方法はhttp://biology.ncsa.ui
uc.edu.に記載されている。当業者はこれらの配列一致率の範囲は参考として提供されたものに過ぎないことを理解すると考えられ、実際には提供された範囲を
超える極めて意味のあるホモログを入手することも可能である。本発明は、上記
のペプチドホモログだけでなく、そのようなホモログをコードする核酸分子も提
供する。

【００４２】 2つの核酸分子が密接な関係にあることを示す代替的な指標は、2つの分子がス
トリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。ストリンジェ
ントな条件は配列依存的であり、異なる環境パラメータの下では異なる。一般に
、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特異的配列に関す
る熱融点（T_ｍ）よりも約5℃〜20℃低くなるように選択される。T_ｍは、標的配列の50％が、完全にマッチングがなされたプローブとハイブリダイズする温度（
規定のイオン強度およびpHで）である。核酸ハイブリダイゼーションの条件およ
びストリンジェンシーに関する計算は、サムブルック（Sambrook）ら（分子クロ
ーニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）、Co
ld Spring Harbor、New York、1989）およびティッセン（Tijssen）（生化学および分子生物学における実験テクニック（Laboratory Techniques in Biochemis
try and Molecular Biology）第1部、第2章、Elsevier、New York、1993）に見ることができる。開示された二重特異性融合蛋白質配列とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする核酸分子は、典型的には、融合蛋白質全体のコード配
列、結合ドメイン全体、またはコード配列のその他の選択された部分のいずれか
に基づくプローブと、0.2×SSC、0.1％SDS、65℃の洗浄条件下でハイブリダイズ
すると考えられる。

【００４３】高度の一致率を示さない核酸配列であっても、遺伝暗号の縮重性のために、類
似したアミノ酸配列をコードすることがある。この縮重性を利用して、実質的に
同じ蛋白質を互いにコードする多数の核酸配列を作製するために、核酸配列の変
化を作りだせることが理解されている。

【００４４】形質転換がなされた：形質転換細胞とは、分子生物学の技法によって核酸分子
が内部に導入された細胞のことである。本明細書で用いられる形質転換という用
語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによ
る形質転換、ならびに電気穿孔法、リポフェクション法およびパーティクルガン
法による裸のDNA（naked DNA）の導入を含む、このような細胞内に核酸分子を導
入しうるすべての技法を含む。

【００４５】ベクター：核酸分子が宿主細胞内に導入されることにより、形質転換宿主細胞
が生じる。ベクターには、複製起点などの、宿主細胞内におけるそれ自体の複製
を許容する核酸配列を含めてもよい。また、ベクターは、当技術分野で知られた
1つまたは複数の選択可能マーカーおよび他の遺伝的要素も含みうる。

【００４６】本発明は、治癒するにしても非常に緩徐と考えられる骨欠損部（重大な大きさ
の欠損部など）の治癒促進を目的とする、骨内移植用の多孔質基質中に局在させ
うる、ヒト胎児造骨性細胞（hFOB）細胞などの骨芽細胞前駆細胞（OPC）を含む、不死化造骨性細胞を提供する。OPCに対して、BMP-2、3、4、5、7または9といった組換えヒトBMP（rhBMP）などの組換え骨誘導因子（rBMP）によるトランスフ
ェクションを施してもよい。本明細書で用いる「不死（immortal）」または「不
死化（immortalized）」細胞とは、実質的に無限な細胞生存能を備え、実質的に
連続的および永続的に樹立された細胞培養物を意味する。これは実質的に無限に
培養しうる細胞である。また、本発明には、条件的不死化培地の存在下では有糸
分裂性であって分裂するが、条件的不死化成分が培地から除去されると細胞分裂
を停止し、しかしながらOPCに特徴的な蛋白質は発現し続ける細胞である、条件的不死化細胞も含まれる。これらの細胞は、正常ヒト造骨性細胞に特徴的な蛋白
質の補完物を産生し、骨芽細胞に分化しうる。

【００４７】本発明のいくつかの態様においては、条件的不死化ヒト胎児骨芽細胞がシミア
ンウイルス40（SV40）ラージT（Tag）またはスモールt（tag）抗原を発現すると
ともに、細胞の不活性化が可能である。不活性化された細胞は依然として生存可
能であって骨芽細胞に特徴的な機能的蛋白質を発現するが、それらは分裂性の低
下した状態におくことができる。この不活性化は、例えば、ヒトインターフェロ
ンまたは別の生理物質の存在に依拠するプロモーターの制御下にSV40遺伝子を置
くことによって生じうる。開示される態様においてはインターフェロン依存性プ
ロモーターの使用が好ましいが、これはインターフェロンが創傷内（細胞により
治療される骨欠損部など）で内因性に産生されるほか、治癒が起こるにつれてイ
ンターフェロンの濃度が徐々に低下するためである。このため、条件的不死化細
胞は、創傷内に最初に移植された後には急速に分裂するが、創傷が治癒すれば細
胞分裂を停止して骨形成性骨芽細胞への分化を続けるように設計される。

【００４８】これらの細胞は樹立された「細胞系」の一部ではあるが、それらは一般に非腫
瘍形成性であり、すなわちそれらは哺乳動物の体内で腫瘍を形成しない。それら
は、例えば、細胞を不死化または条件的に不死化させ、BMPの発現をコードする遺伝子によるトランスフェクションがなされた細胞系のクローン集団の一部など
の、均一な集団の一部でもよい。「クローン性（clonal）」という用語は、単一
の前駆細胞に由来する均一な細胞集団に対する言及である。「トランスフェクシ
ョン」という用語は、外来性DNAが真核細胞に導入され、発現される過程を指す。外来性DNAは、環状または線状プラスミドベクターなどの発現ベクター中に含まれることが典型的である。開示される本発明の1つの態様の調製においては、ヒト骨芽前駆細胞が、発現ベクターpMX-1-SV40Tによるトランスフェクションによって条件的不死化を受ける。さらに、細胞に対して、抗生物質、抗腫瘍薬また
は除草剤などの非形質転換細胞に対して通常は有毒である薬剤に対する耐性をコ
ードする遺伝子などの、選択可能マーカーによるトランスフェクションを施すこ
とも可能である。開示される1つの態様において、細胞は、ネオマイシンもしくは類似薬剤に対する耐性などの選択因子をコードする発現ベクター（pMX-1-SV40
T-Neo-195）または形質転換細胞を選択的に死滅させうる「自殺遺伝子」を発現する発現ベクターによるトランスフェクションを受ける。

【００４９】開示される本発明の態様は、OPC1を特定する特徴を有しており、それらは本明
細書で詳細に述べられる。これらの細胞は、クローン性の条件的不死化骨芽細胞
前駆細胞である。それらは、治療的有効量の、BMP-2などのBMPならびに／または
骨形成および治癒の刺激のために必要なその他の因子を発現する。本発明の細胞
は本発明の条件的不死化細胞から調製することができ、これは骨形成性BMPをコードする遺伝子を含む任意の複製性プロモーターを含む。開示される1つの態様において、BMP発現ベクターは、例えば、KS-hBMP-2、IgSP-NS-hBMP-2、IgSP-KR-
hBMP-2およびIgSP-RRRR-hBMP-2発現ベクターを特定する特徴を有するプラスミド
などの、プラスミドである。

【００５０】この骨芽細胞前駆細胞（OPC）系は、BMP-2に対して反応性であり（すなわち、
BMP-2への曝露によって細胞分化活動が刺激される）、骨修復反応を増強させる。 rhBMP-2遺伝子を含むプラスミドベクターによってOPCを遺伝的に改変し、このOPCを骨欠損部に局所的に導入することにより、OPCがBMPを連続的に発現することが可能になり、欠損を修復する細胞過程の刺激および協調を助ける。このた
め、本発明の方法を用いて、さまざまな骨欠損（外傷性骨損失または先天性不全
など）を治療することができる。また、本方法を、骨量減少、先天奇形の回復、
特に、骨粗鬆症による被害が最も多く生じる解剖学的部位である骨減少性椎骨の
回復に用いることも可能である。本方法では、椎骨骨量減少、骨形成の低下、骨
芽細胞と破骨細胞との間の不均衡、前駆細胞の減少、および／または骨細胞の低
反応性に対抗するために、BMP反応性細胞のプール（高齢者では枯渇していることが多い）を増幅し、局所的に発現されるBMP分子を増加させる。BMPを構成的に
発現するOPCは、骨再生にとって極めて重要なこれらの要素の局所的濃度を高める。

【００５１】 BMPの選択 BMP2〜15はトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーに分類され、
胚における細胞およびそれらの組織的構成の組織および器官への進展を指示し、
身体パターン形成、肢発生、骨の大きさおよび数に影響を及ぼし、胎児以後の軟
骨-骨形成の維持を調節する（表1）。骨再生のために特に重要なBMPの1つの例は
BMP-2であり、これは未分化間葉細胞から骨を構築する骨芽細胞への分化を促進する。この特性は、rhBMP-2を用いて頭頂骨、ラットの長骨、ウサギの尺骨および橈骨、ヒツジ長骨、イヌの下顎骨および前上顎骨、ならびにミドリザルの尺骨
を再生させる前臨床試験で開発がなされている。マーデン（Marden）ら、J. Bio
med. Mater. Res. 28：1127〜1138（1994）、スミス（Smith）ら、J. Controlle
d Rel. 36：183〜195（1995）、ヤスコ（Yasko）ら、J. Bone Joint Surg. 74-A
：659〜671（1992）、スティーヴンソン（Stevenson）ら、J. Bone Joint Surg.
76-A：1676〜1687（1994）、クック（Cook）ら、J. Bone Joint Surg. 76A：82
7〜838（1994）；Hollingerら、J. Controlled Rel. 39：287〜304（1996）、ゲ
ルハルト（Gerhart）ら、Clin. Orthop. Rel. Res. 293：317〜326（1993）。さ
らに、rh3MPはイヌおよびマカク属非ヒト霊長類における脊椎固定術に対して適用され、rhBMPは通常は新骨形成による治癒が起こらない重大な大きさの欠損部の再生を促した；ボーデン（Boden）ら、Endocrinol 137：3401〜3407（1996）。BMP-2がこれらの臨床的用途に対してすでに用いられることに鑑み、BMP-2を本
発明の開示される態様とともに説明する。しかし、骨形成を増強させる方法とと
もに、例えばBMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-7およびBMP-9、特にBMP4および9などの
任意の骨誘導性BMPを用いることができる。表1に骨形成性と記載されていないそ
の他のBMPも、それらが直接的な骨形成性をもつBMPの活性を調節または刺激する
範囲内で用いることができる。

【００５２】骨芽細胞前駆細胞（OPC）の選択培養系における造骨性細胞の分化には、プログラムされた一連の発生過程がか
かわる。この一連の過程は、細胞が比較的未分化な骨芽前駆細胞または骨前駆細
胞（OPC）である初期の増殖期、ならびに骨細胞表現型マーカーの発現および最終的に細胞外基質の石灰化がかかわる後期を特徴とする。例えば、参照として組
み入れられる、アロノウ（Aronow）ら、J. Cell Physiol. 143：213（1989）およびスタイン（Stein）ら、FASEB J. 4：3111（1990）を参照されたい。OPCは、
オステオカルシン（OSC）、オステオネクチン（OSN）、オステオポンチン（OSP ）、PTH受容体（PTHr）、アルカリホスファターゼ（AP）およびI型プロコラーゲ
ン（ProI）の発現を含む、骨芽細胞に関連する表現型マーカーを有する細胞に分
化する細胞である。BMPを発現するOPCは、発現されたBMPによって骨芽細胞へと分化する。

【００５３】本発明による骨再生のためのBMPを介した戦略は、それらが形態および機能の回復のために十分な量のOPCを骨粗鬆症に供給するという点で、他のアプローチとは異なる。多孔質基質中に局在化または固定されたOPCの存在により、骨形成が驚くべき程度で増強されることが明らかになった。その他の態様においては、
骨沈着を促進させるために十分な量の外因性BMPを基質中に供給する。1つの特定
の態様においては、BMPはOPCから発現され、OPCからのBMPをインサイチューで利
用しうるため、供給する必要のあるrhBMPの外因性用量を極力減らすことができる。OPCからのインビボ産生がなければ、局所反応性細胞集団の骨芽細胞への分化の増強によって骨形成効果を得るためには、ミリグラム単位の量のBMP（例えば、約1.7〜2.0mgを上回る用量）が必要である。OPCによるBMPがインサイチュー
産生されると、BMPが細胞により局在化され、同じく骨沈着過程に深くかかわる細胞媒体（cellular vehicle）中に送達されるため、送達する必要のあるBMPの量ははるかに少なくて済む。以上のように、OPCは、BMPをデノボ合成し、新鮮か
つ持続的なBMPの産生を可能とすることにより、細胞性「バイオリアクター」としての機能を果たすと考えられる。OPCからBMPが投与されることは、前駆細胞の
数が乏しく、機能的な障害の可能性もある高齢患者には特に有用である。

【００５４】 OPCとしては任意の種に由来するものを用いうるが、用いるには、骨欠損を治療しようとする動物と同じ種からのOPCを選択することが好ましい。このため、ヒト、イヌ、サル、ラットおよび他の種に由来するOPCを本発明に従って用いうる。OPCを従来の技法によって入手し、続いて不死化させて（または条件的に不死化させて）骨内の基質中に局在化させてもよい。また、OPCに対して、BMPを発
現する遺伝子によるトランスフェクションを施してもよい。以下の実施例では、
この工程における詳細な段階を例示する。

【００５５】本発明による特に好ましい細胞は、骨形成性細胞系に分化するように運命づけ
られる程度に十分に分化した骨前駆細胞である。この運命づけ（commitment）が
いったん起こると、細胞は本発明のOPCの由来となる間葉細胞から生じる線維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞または他の細胞にはならずに、BMP刺激に反応してさらに確実に骨を産生するようになると考えられる。骨産生への運命づけがなされる
ことには、治癒過程にある骨欠損部にかなりの量の脂肪または線維形成をもたら
す可能性のある細胞に比べて特に有利であるが、これはそのようなかなりの量の
非骨組織は骨癒合および最終的には欠損の治癒の妨げとなるためである。

【００５６】本発明において有用な細胞の具体例の一つは、1998年2月12日に寄託されたATC
C CRL-12471を特定する特徴を有する条件的不死化細胞系OPC1であり、これは骨形成性細胞系への分化を運命づけられたOPCであって、BMP-2を発現するように遺
伝子によるトランスフェクションを施すことが可能である。細胞の骨形成性細胞
系への運命づけは、細胞をBMP-2、BMP-4またはBMP-9などのBMPで刺激し、実施例
2に記載するスクリーニング法によって骨芽細胞表現型の発生を観察することにより判定可能である。寄託された細胞系からの細胞は、例えば濃度10ng／mlのrh
BMP-2、さらにおそらくは5ng／ml、またはさらに2ng／mlのrhBMP-2といった濃度
の低用量のBMPに反応して分化する能力を含め、多くの好ましい特徴を示す。また、寄託された細胞系は、少なくともP50まで、例えば約P80もの継代が可能であ
ることが示されている。

【００５７】 BMPをOPCと接触させること、またはOPCからBMPを発現させることに加えて、BM
Pをさらに成熟した骨芽細胞（実施例2に記載した表現型を備えたもの）と接触さ
せること、またはそれから発現させることも可能である。OPCと同じく、骨芽細胞も骨形成性細胞系への分化を運命づけられた細胞の一例であり、この方がわず
かに分化が進んでいる。成熟型の骨芽細胞は通常は分裂しないため、骨欠損部に
移植しうる分裂細胞のクローン系を作製することはできない。しかし、OPCにBMP
遺伝子を導入し、それを成熟させた後に骨欠損部に移植してそこに局在化させ、
治癒過程を促進するBMPを産生させることは可能である。より成熟したOPCおよび
骨芽細胞におけるBMPの産生によって骨形成はある程度改善されるため、これは本発明の方法に含められる。

【００５８】本発明とともに用いうるその他の細胞には、治癒時に存在するが、高度の炎症
反応は誘発しない（マクロファージの場合にはこれが起こる）有核血液細胞（リ
ンパ球など）が含まれる。

【００５９】実施例1 不死化ヒト骨芽前駆細胞系OPC-1の樹立シミアンウイルス40（SV40）癌遺伝子は、スモールt抗原（tag）およびラージ
T抗原（Tag）ともに、さまざまな種類の細胞の形質転換を引き起こす核内リン蛋
白質である。本発明では、条件的不死化細胞系を作製するためのトランスフェク
ション手順においてpMXl-SV40Tag-Neo-195プラスミドDNA（図3）を用いた。「条
件的不死化」細胞系とは、制御可能な一組の環境（インターフェロン駆動性プロ
モーターに対するインターフェロンの存在、など）内では細胞分裂を継続するが
、細胞分裂が停止または著しく抑制されるように選択的に誘導しうるものをいう
（例えば、プロモーターを駆動する有効量のインターフェロンを細胞環境から除
去する、などによる）。

【００６０】本実施例においては、MX-1プロモーターがSV40ラージTagの発現を指令する。p
MX-1DNAを発現するトランスフェクト細胞は、ヒトA／Dインターフェロン（PBL、
West Caldwell、NJから販売されている組換えヒトインターフェロンHu-IFN-αA およびHu-IFN-αDから作製されたハイブリッド型αインターフェロンの1つ）の存在下でSV40Tagを駆動させることにより、増殖の増強を示す。インターフェロンを除去すると、この細胞の有糸分裂活性は低下する。SV40Tagを構成的に発現する遺伝子によるトランスフェクションを受けた骨細胞系の樹立を検討している
研究機関もいくつかあるが（Keetingら、J. Bone Miner. Res. 7：127〜132（19
92）、Evansら、J. Orthoped. Res. 13：317〜324（1995））、一方、許容条件下でヒト胎児骨芽細胞系を条件的に不死化させるSV40Tagの温度感受性変異株であるtsAS8をコードする遺伝子を用いているところもある；ハリス（Harris）ら、J. Bone Miner. Res. 10：178〜186（1995）。SV40Tagは、細胞系を構成的または条件的に不死化させる方法としては最も有効なものの一つである。

【００６１】別に特記する場合を除き、試薬類はすべてシグマケミカル社（Sigma Chemical
Co.）（St. Louis、MO）またはギブコBRL社（Gibco BRL Inc.）（Grand Island
、NY）から購入した。ファルコン（Falcon）組織培養用プラスチック器具はベク
トンディッキンソン社（Becton Dickson and Co.）（Franklin Lakes、NJ）から
入手した。クイックプレプマイクロmRNA精製キット（QuickPrep Micro mRNA精製
キット）はファルマシアバイオテク社（Pharmacia Biotech, Inc.）（Piscatawa
y、NJ）から購入し、アクセスRTPCRシステム（Access RTPCR System）はプロメガ社（Promega Inc.）（Madison、WI）から購入した。PCR用プラスチック器具は
パーキンエルマー社（Perkin Elmer, Inc.）（Norwalk、CT）から購入した。NuS
ieve 3：1アガロースはFMCバイオプロダクツ（FMC BioProducts）社（Rockland 、ME）から入手した。組換えヒト骨誘導因子-2（rhBMP-2）はジェネティックインスティテュ−ト社（遺伝子tics Institute, Inc.）（Andover、MA）から提供され、BMP-2の産生および精製の方法はワング（Wang）ら、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 87：2220〜2224（1990）およびウォズニー（Wozney）、Progress in Gr
owth Factors 1：267〜280（1989）に記載されている。

【００６２】施設内で承認されたプロトコールに準拠して、在胎期間ほぼ12〜13週の胎児組
織を入手した。 10mM HEPES、pH 7.4を添加したHBSS中に細胞を維持し、精査および単離のために研究施設に搬送した。骨芽細胞は、ギャラガー（Gallagher）ら、ヒト細胞培養プロトコール（Human Cell Culture Protocol）、Humana Pres
s、p233〜262（1996）（これは参照として組み入れられる）の通りに、0.3％コラゲナーゼP（Boeringer-Mannheim、Indianapolis、IN）および0.25％トリプシンを用いる反復消化法を用いて、ヒト胎児骨膜および大腿骨から入手した。3回または4回の反復消化を用いることが可能であるが、4回目の細胞調製物の方が成
熟型骨芽細胞をより多く含む。これに対して本方法では、前駆細胞が単離および
選択されるとの予想から、1回目および2回目の消化物から細胞調製物を収集し、
それらのプレーティングを行った。細胞は、5％FBSを加えたα-MEMを入れた容量
75cm^２の組織培養フラスコ中に0.25×10^６個の密度で播いた。残った組織片を回
収して無カルシウム無マグネシウムHBSSで洗浄し、0.25％トリプシン-EDTAによる消化を30分間行った。これらの細胞も上記の通りに播いた。これらの培養物が
初回分離株P0であり、いったん集密状態に達した時点で、0.25％トリプシン-EDT
Aによる酵素的剥離の後に継代培養を行って第1継代株（P1）とした。

【００６３】初期継代骨細胞をP3まで維持および継代し、その時点で標準的なリン酸カルシ
ウム法によってそれらにトランスフェクションを行い（Strata遺伝子(登録商標)
、La Jolla、CA）、CsClで精製したpMX1-sv40T抗原-Neo-195プラスミドDNA 10μ
gを宿主細胞ゲノム中に組み入れた。プラスミドpMX1-sv40T-Neo-195は、クローニングベクターpSP65中で2.3kbのマウスMX-1プロモーターを2.1kbのSV40ラージT
断片を融合させることによって作製した。1.9kbのマウスβグロビン3'非翻訳領域（3' UTR）をプラスミドのBamHIおよびXbaI部位に導入し、その結果得られたプラスミドをpMX1-sv40Tと命名した。SV40プロモーターによって駆動されるネオ
マイシンホスホトランスフェラーゼを含む1,518bpのHindIII-XmnI断片をpcDNA3 （InVitrogen、San Diego、CA）から単離して、EcoRIにより消化したpMX1-SV40T
中にサブクローニングし、クレノウ配列でギャップ充填を行ってpMX1-sv40T抗原
-Neo-195プラスミドDNAを作製した（図3）。P3骨細胞には、抗生物質を含まない
無マイトジェン血清規定培地であるUltraCULTURE(登録商標)（BioWhittaker, In
c.、Walkersville、MD）中で一晩トランスフェクションを行った。

【００６４】トランスフェクション手順の後、プレートを培地ですすぎ、新たなαMEM／5％
FBS中で一晩培養した。その翌日に0.5mg／ml G418-硫酸（ネオマイシン類似体）
を添加したαMEM／5％FBS培地中でトランスフェクト細胞を選択した。G418により、ネオマイシン毒性に対する耐性を付与する遺伝子が組み入れられた安定的ト
ランスフェクタントの選択が可能となる。10〜14日間の選択期間をおいた後、75
0U／mLのヒトA／Dインターフェロンおよび0.2mg／mlのG418を含むαMEM／5％FBS
に培地を交換した。ポリクローン性トランスフェクタントに対する標準的な限界
希釈法によってクローン系を入手し、クローン細胞の形態、1週当たりの分裂回数がほぼ3.5〜4回という増殖速度、およびアルカリホスファターゼの発現により
、選択物を決定した。選択用の対照として偽トランスフェクト細胞を用いた。

【００６５】初回プレーティングの時点での骨芽細胞前駆細胞調製物（P0）では付着培養物
が得られ、細胞は一般に多角形であって間欠的に紡錘形を呈し、細胞の周囲にわ
ずかな複屈折を伴う形態が認められた。P0のプレーティングから5〜8日間以内に
、細胞はその他の骨形成性細胞系と一致する形態を示す集密的細胞単層を形成し
た。増殖速度および継代限界を決定するために、トランスフェクト細胞と並行し
て対照非トランスフェクト細胞の維持および継代を行った。一般に、正常ヒト骨
芽細胞様細胞の増殖速度はトランスフェクト細胞系よりも低かった（表3）。また、非形質転換細胞では、20回目の継代（P20）後に増殖速度が有意に低下し、P
25とP28との間で老化細胞となって増殖を停止した。

【００６６】

【表３】

【００６７】細胞を第3継代（P3）まで継代培養した後、それらにpMx-t-SV40T-Neo-195DNA 発現ベクターによるトランスフェクションを施した。トランスフェクション、お
よび0.5mg／mLのG418-硫酸（ネオマイシン類似体）中での10〜14日間の選択の後
、選択過程を経て生き延びた細胞は初回平板培養細胞の1〜2％であった。これに
対して、偽トランスフェクト細胞はすべて4〜7日以内に死滅した。750U／mLのヒ
トA／Dインターフェロンを含むαMEM／5％FBS中で安定的トランスフェクタントを維持し、その後は継続的選択圧（すなわち、G418含有培地）の下での培養物の
維持は行わなかった。96穴プレート中でポリクローン性トランスフェクタントに
対する標準的な限界希釈法を行うことにより、OPC1〜OPC7と命名した7種のクローン系が得られた。これらのクローンのうちOPC4、OPC5、OPC7の3種は、さらなる評価により、望ましくない形態的および／または増殖特性が認められたことか
ら除外した（表3）。特に、それらは紡錘状（両端が細くなった紡錘様）の形態を呈し、倍加時間が対照非トランスフェクト細胞と等しいか、それよりも長かっ
た。

【００６８】残る4種のクローンをさらなる増殖および特徴分析のために選択した。これらのクローン細胞は形態学的には一般に多角形を呈し、短い樹状突起が低密度で伸
長しており、増殖して集密的細胞単層となった時点では高度の超集密化（hyperc
onfluence）は認められず、すなわち細胞増殖はある程度の接触阻止を受けた。O
PC1、OPC2、OPC3およびOPC6という4種のクローンに関する増殖曲線分析により、
1週当たりの分裂回数はほぼ3.5〜4.2回（集団倍加時間は40〜49時間）と推定されたが、アルカリホスファターゼ（APase）発現レベルが最も高く、特に、第9日
の評価で10ng／mlという低用量のrhBMP-2に対してAPase活性を有意にアップレギ
ュレートする能力が認められたことから、OPC1と命名したクローンをリード候補
株（lead candidate）として選択した。OPC1は5％FBSを加えたαMEMなどの栄養分に富む培地中で維持しうるが、栄養分に乏しい条件（血清中濃度がほぼ0.6〜0
.9％v／v）における生存能も認められる。栄養分に乏しい環境におけるこの生存
能は、本細胞を栄養分に乏しい骨欠損部に細胞をインサイチュー移植する本発明
の方法において特に有用なものとする、OPC1の特に大きな利点である。

【００６９】抗生物質および抗真菌薬を含まない培地中で少なくとも3回の継代にわたって維持したOPC1株の5×10^６個の細胞を含む低温用バイアルをパッケージ化し、サイトメガロウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、HIV-1、HIV-2および
HTLV I／IIの有無に関する検査のためにViroMEDラボラトリーズ社（ViroMED Lab
oratories）（Minneapolis、MN）に送付した。馴化培地も回収し、無菌性に関す
る評価のためにマイクロバイオロジカルアソシエーツ社（Microbiological Asso
ciates, Inc.）（Rockville、MD）に送付した。さらに、CELLshipper(登録商標)
キットをBIONIQUE(登録商標)テスティングラボラトリース社（Testing Laborato
ries, Inc.）（Saranac Lake、NY）の記載通りに用いてマイコプラズマの検出も
行った。OPC1株はこれらの病原体を含まないことが明らかになった。

【００７０】実施例2 細胞がOPC表現型を有するか否かの判定 OPC1のさまざまな継代物（P10、P20、P30）に対して骨芽細胞／プレ骨芽細胞表現型の確認を行った。αMEM／5％FBS（GIBCO）基本培地を用いて6穴プレート（Falcon）中に25K個／ウェルの初回播種を行って一晩置いた後の第4、9および1
6日時点の培養物におけるAPase酵素活性をローリー（Lowry）ら、J. Biol. Chem
. 207：19〜37（1954）の方法によって定量的に評価した。骨芽細胞／プレ骨芽細胞／OPC表現型は、アルカリホスファターゼ、石灰化、オステオネクチン、オステオポンチン、PTH受容体およびプロコラーゲンからなる群から選択される、オステオカルシンに関するマーカー1種、好ましくはその他の少なくとも2種のマ
ーカーの同定を主として必要とする。

【００７１】アルカリホスファターゼ活性 OPCを入れたウェルには、初回播種から一晩はαMEM／5％FBS（GIBCO）基本培地を入れた。その翌日には基本培地を陰性対照（1）とし、そのほかの群として（2）10ng／mlのrhBMP-2を添加した基本培地、（3）50ng／mlのrhBMP-2を添加し
た基本培地、（4）100ng／mlのrhBMP-2を添加した基本培地、（5）10mMβ-グリセロリン酸、10^−７Mデキサメタゾン、50μg／mlのアスコルビン酸リン酸（Wako
Chemical、Osaka、Japan）からなる骨形成性添加物（OS）を添加した基本培地、ならびに（6）OS＋50ng／mlのrhBMP-2を添加した基本培地、を含めた。アルカ
リホスファターゼの酵素活性は、ウェルを無カルシウム無マグネシウムHBSSです
すぎ、擦過によって細胞を回収した後に、1ウェル当たり50K個の細胞を5mM p-ニ
トロフェニルリン酸、50mMグリシンおよび1mM MgCl_２を入れた96穴プレート中に
て37℃で5〜20分間インキュベートした後の培養物を用いて、3回ずつ測定した。
生成したp-ニトロフェノール産物の405nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（MRX、Dynatech Labs.、Chantilly、VA）で測定することによって酵素活性を
算出し、段階希釈を行った標準物質と比較した。酵素活性は、p-ニトロフェノー
ルのng数／分／細胞50K個として表される。さらに、シグマキット#85（Sigmaキット #85）に記載された標準的な手順に従い、P30時点の培養物に対してAPase組
織化学検査を行った。しかし、この一連の実験では、分裂促進性および／または
プログラムされた骨形成性分化に影響を及ぼす能力を評価するために、上記の（
4）群（100ng／mlのrhBMP-2を添加した基本培地）を、50ng／mlのbFGFを添加した基本培地に換えた。

【００７２】 P20の時点では、対照を除き、OPCは初回播種期間から第4、9および16日の時点
で、すべての培地条件においてAPase酵素活性の有意な上昇を示した。骨形成性添加物（OS）群（10mMβ-グリセロリン酸、10^-7Mデキサメタゾン、50μg／mlのアスコルビン酸リン酸（Wako Chemical、Osaka、Japan）を添加した基本培地）および50＋OS（OSおよび50ng／mlのrhBMP-2を添加した基本培地）群では、第4日
の時点でAPase酵素活性の著明なアップレギュレーションが認められた。ウェルが集密状態に到達するまでの期間も同じく4日間であった。これらの群の活性はそれぞれ63.2±10.2および262.3±14.8 ng p-ニトロフェノール／分／細胞50K個
であり、これに対して対照群は9.6±2.4であった。第9日までに、p-ニトロフェノール／分／細胞50K個単位によるAPase酵素活性のピークが認められた：対照＝
16.6±2.6、10ng BMP＝127.8±19.5、50ng BMP＝225.5＋228、100ng BMP＝292.2
±24.4、OS＝310.1±19.2、50＋OS＝407.8±19.5。P10およびP30のOPC1株につい
ても同様の観察結果が認められた。APase組織化学検査では酵素活性データと一致する染色が認められた。

【００７３】石灰化基本培地中で集密状態に達して7〜10日後、特に骨形成性添加物（OS）を添加した基本培地中で維持した後に細胞が細胞外基質を石灰化する能力に関してOPC1
株を評価した。細胞層をPBSで2回すすいで剥離させ、細胞を0.1N HClに対して曝
露することにより、細胞外カルシウム含有量を定量的に測定した。4℃で4時間の
振盪を加えることによって細胞を抽出し、遠心によって細胞を回収し、その上清
を、シグマキット#587（Sigmaキット #587）における製造者の手順に従ったカル
シウム測定に用いた。試薬を添加して5〜10分後にマルチプレートリーダー（MRX
、Dynatech Labs）を用いて試料の570nmの吸光度を測定した。並行して調製した
標準溶液からカルシウムの総量を算出し、μg／ウェルとして表した。

【００７４】フォンコッサ（von Kossa）の染色法を用いて、石灰化に関する組織化学分析も行った。集密状態に達した後の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）中の1％（w／v）パラホルムアルデヒド溶液にて1時間固定し、PBSですすいだ後に、暗所で5％（w／v）硝酸銀により15分間処理した。続いて細胞を蒸留水で十分にすすぎ、紫外光を5〜7分間照射し、炭酸ナトリウム／ホルムアルデヒド溶液
で2分間処理した後、最後にファーマー減力液で1分間処理した。

【００７５】 P20時点での石灰化小結節の形成時における細胞外カルシウム沈着に関して、O
PC1株の定量的特徴分析を行った。第4日にはすべての条件でカルシウム含有量は
陰性であったが、骨形成性添加物（±50ng／mlのrhBMP-2）を用いた群では第9日
に細胞外基質沈着量の有意な増加が認められた。第16日までには、すべての群で
細胞外カルシウム沈着の有意な増加が認められるようになり、骨形成性添加物に
て維持した群では6穴プレート中にほぼ20μgもの沈着が生じた。

【００７６】 50ng rhBMP-2＋OSにて維持した投与群では、集密に達して4〜5日後までにフォ
ンコッサ（von Kossa）染色標本が光学顕微鏡下で検出されるようになり、7〜10
日後までに顕著となった。細胞がいったん集密状態に達すると、初回播種から第
9日の時点で、αMEM／5％FBS基本培地中で維持した細胞内に少数の石灰化小結節
が認められた。しかし、BMP群±OSにて維持した群、特に50ng rhBMP-2＋OS培養物では、石灰化小結節の数は対照よりも著しく多かった。β-グリセロリン酸およびデキサメタゾンを含まない基本培地中で維持した細胞における石灰化小結節
の形成は、不死化ヒト胎児造骨性細胞に関する以前の報告と一致する（Harrisら
、J. Bone Miner. Res. 10：178〜186（1995））が、これを除き、骨芽細胞系で
は稀である。

【００７７】オステオカルシンインタクトオステオカルシンに対するEIAキット（Biomedical Technologies,
Inc.、Stoughton、MA）を用いて、馴化培地におけるオステオカルシン濃度を測定した。集密状態に達する前後のOPC1細胞を6穴マルチウェルプレート（3回ずつ
分析した）に入れ、APaseの測定の項で以前に説明したものと同じ種々の添加物を加えた1mlの無血清培地UltraCULTURE(登録商標)中で維持した。48時間後に試料を回収して50μlの試料をマイクロタイタープレート上に接種し、製造者の手順に従ってアッセイした。データはng／mlとして表されるが、このEIAに関する検出限界は0.1ng／mlである。

【００７８】組織培地中のインタクトオステオカルシン濃度（ng／ml／24時間）の測定結果
は以下の通りであった：対照＝1.1±0.3、10ng BMP＝*1.7±0.3、50ng BMP＝*18
±0.3、50ng bFGF＝0.8±0.2、OS＝*2.1±0.5、50＋OS＝*8.6±2.7。bFGF群を除
くすべての投与群で、対照群と比較して有意な上昇（*p＜0.05）が認められた。
対照培地中で維持したほぼ1×10^６個のOPC1細胞の可溶化物での値は無視しうる程度であり（検出限界未満）、このことは、本試験で測定したオステオカルシン
がインタクトであってOPC1株からデノボ分泌されたことを意味する。

【００７９】逆転写酵素解析オステオカルシン（OSC）、オステオネクチン（OSN）、オステオポンチン（OS
P）、PTH受容体（PTHr）、アルカリホスファターゼ（ALP）およびI型プロコラー
ゲン（ProI）の有無を検出するために（PCR表現型分析による）、確立されている逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）による定性分析法を用いた。リチャード（Rickard）ら、J. Bone Miner. Res. 11：312〜324（1996）、ビルベ（Bilbe）ら、Bone 19：437〜445（1996）。オリゴヌクレオチドRT-PCRプライマ
ー配列の一覧を表4に示すが、これらはGIBCO BRLから購入した。

【００８０】

【表４】表現型分析のための逆転写-PCRプライマー

【００８１】この手順には、微量遠心管（Eppendorf 5412、Brinkinan Instruments, Inc.
Westhury、NY）中での12,000RPMの遠心によってペレット化し、直ちに用いるか、または保存のために-80℃で凍結させた3〜5×10^６個のOPCを用いる。続いてク
イックプレプマイクロmRNA精製キット（QuickPrep Micro mRNA purificationキット）（Pharmacia Biotech, Inc.）を製造者の仕様書に従って用いてmRNAを単離し、200μlの最終的なmRNA溶出物を得た。A260×40μg／mlを用いる分光光度的吸光度によってmRNA濃度を測定した。溶出物のmRNA濃度は50〜160μg／μlの範囲にあることが明らかになった。アクセスRT-PCRシステム（Access RT-PCR Sy
stem）（Promega, Inc.、Madison、WI）により、50μgのmRNAからcDNAを合成した。全cDNAのアリコートを2.5UのTaqポリメラーゼ（Promega, Inc.）を用いるPC
Rによってそれぞれ増幅し、増幅はジーンアンプ（遺伝子Amp）2400サーマルサイ
クラー（Perkin-Elmer, Inc.、Norwalk、CT）中で、94℃で30秒間の変性、55℃ で2分間のアニーリングおよび72℃で2分間の伸長というサイクルを30サイクルに
わたって行った。増幅反応産物を、2.5％NuSieveアガロース／TBEゲル（FMC Bio
Products、Rockland、ME）で85mVで90分間の電気泳動を行うことによって分離し
、臭化エチジウムで可視化した。50bpおよび100bpのベースラダー（base ladder
）（Boehringer Mannheim, Inc.）を標準物質とした。

【００８２】 OPC1株は、オステオカルシン（OSC）、オステオネクチン（OSN）、オステオポ
ンチン（OSP）、PTH受容体（PTHr）、アルカリホスファターゼ（AP）およびI型プロコラーゲン（ProI）の有無に関する30サイクルのRT-PCRによって生成された
mRNAを大量に発現した。代表的なRT-PCR産物（バンド）がアガロースゲル電気泳
動によって分離されたが、表4に概要を示す通り、それらはそれぞれOSC、OSN、O
SP、PTHr、APおよびProIの258、369、348、571、367および599塩基対の産物長と
一致した。

【００８３】これらの陽性マーカーの発現レベルは、OPC1株が維持される条件によって影響
されるように思われる。例えば、オステオカルシンおよびPTH受容体のmRNA（骨芽細胞分化の後期に対応するマーカー）の強度は、基本培地のみよりも50＋OS培
地条件中にて維持した細胞の方が高いように思われる。ヒト由来膠芽細胞を対照
細胞種としたが、これはOSC、OSN、OSPおよびPTHrに関して陰性である。

【００８４】以上のように、本実施例は、SV40ラージT抗原（Tag）をコードする遺伝子によ
って不死化された新規なヒト胎児骨前駆細胞系（OPC1）を示すとともにその特徴
を明らかにした。DNAプラスミドを初代培養物に組み入れることにより、ヒトA／
Dインターフェロンによって活性化されると、SV40ラージT抗原を条件的に発現す
るように遺伝子、すなわちMX-1プロモーターが駆動される。しかし、OPC1株を栄
養分に富む組織培地中、すなわち5％（v／v）FBSを含むαMEM中で維持した場合には、ヒトA／Dインターフェロンの有無による細胞増殖速度の差は認められない
。このため、Tagは構成的に発現される。OPC1が標準的な二次元組織培養プラスチック容器中で集密状態に達した場合には、細胞は接触阻止を示し、同時に免疫
陽性の核内Tag染色もダウンレギュレートされる。このため、OPC1株は腫瘍発生能をもたない。さらに、これらの細胞は何度も凍結解凍を行った後も骨形成性表
現型マーカーを一定レベルで発現し続け、このことは、骨前駆細胞クローン細胞
系を誘導することに成功したことを意味する。

【００８５】多数の表現型マーカーにより、骨芽細胞への分化に伴うOPC1株における発現の
安定性が裏づけられた。これらには、アルカリホスファターゼの発現、石灰化能
、インタクトオステオカルシンの測定値、ならびにオステオカルシン（OSC）、オステオネクチン（OSN）、オステオポンチン（OSP）、PTH受容体（PTHr）、アルカリホスファターゼ（AP）およびI型プロコラーゲン（ProI）のmRNAの発現が含まれる。本試験は、集密化に達した後のOPC1株の培養物が、第10継代（P10）、P20およびP30の時点でこれらの骨芽細胞関連マーカーを高レベルに発現するこ
とを示している。

【００８６】本試験において、rhBMP-2はインビトロでOPC1株におけるAPase活性に対する刺
激作用を及ぼした。しかし、rhBMP-2はヒト腸骨から得られた分化骨芽細胞、およびさらに分化の進んだラット由来の骨芽細胞細胞であるROB-C20に対しては刺激作用を示さない。ヤマグチ（Yamaguchi）ら、J. Cell Biol. 113：681〜687（
1991）。このため、OPC1株が低用量rhBMP-2（10ng／ml）の存在下でプログラム化された骨芽細胞分化を生じうることに基づけば、OPC1株は均一な骨前駆細胞系
である。線維芽細胞性および脂肪細胞性の活性が全く認められなかったことも、
OPCが骨形成性細胞系への分化を運命づけられる程度に十分に分化していることを示す。用量10ng／mlのrhBMP-2でプログラム化された分化が示されうるという結果は、マウス由来MC3T3-E1（Takuwaら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 174
：96〜101（1991））、ラット由来の骨芽細胞前駆細胞系「と考えられるもの」（Yamaguchiら（1991））およびヒト腸骨由来の分化骨芽細胞（Kimら、J. Biome
d. Mater. Res. 35：279〜285（1997））に関して報告されている値よりも著しく低い。

【００８７】 OPC1（および本発明の方法によって入手しうる他の細胞）は、内因性ヒト骨前
駆細胞の生体模倣物（biomimetic）をもたらす、一貫性で再現可能な培養系を提
供する。

【００８８】実施例3 自殺遺伝子によるトランスフェクション本実施例は、プラスミドを取り込んだOPCが選択的に破壊されるようにする自殺遺伝子をSV40プラスミドに組み入れる、本発明の代替的な態様を開示する。初
期継代骨細胞の一部に対して、選択用のTK-ネオマイシン遺伝子を備えたpMX1-SV
40-Tt抗原作製物によるトランスフェクションを施す。このDNA作製物はラージT およびスモールt抗原を両方とも含む。P3時点のプレ骨芽細胞細胞に対して、抗生物質を含まない無マイトジェン血清規定培地であるバイオホイッテカー社（Bi
oWhittaker, Inc.）のウルトラカルチャー（UltraCULTURE）(登録商標)中に懸濁
した状態で、ギブコBRL社（GIBCO BRL）のリポフェクタミン(登録商標)プラス（
LIPOFECTAMINE PLUS）哺乳動物用トランスフェクションキットを用いて、CsClに
より精製した10μgのpMX1-sv40T t抗原-Neo-431DNA（p431）を導入した。トラン
スフェクション手順の後、トランスフェクション手順の後、プレートを培地ですすぎ、新たなαMEM／5％FBS中で一晩培養した。その翌日に0.5mg／ml G418-硫
酸（GIBCO BRL-ネオマイシン類似体）を添加したαMEM／5％FBS培地にトランスフェクト細胞を曝露させた。G418により、ネオマイシン毒性に対する耐性を付与
する遺伝子が組み入れられた安定的トランスフェクタントの選択が可能となる。

【００８９】 10〜14日間の選択期間の後、750U／mLのヒトA／Dインターフェロンおよび0.2m
g／mlのG418を含むαMEM／5％FBSに培地を交換した。ポリクローナルトランスフ
ェクタントに対する標準的な限界希釈法によってクローン系を入手し、クローン
細胞の形態、1週当たりの分裂回数がほぼ3.5〜4回という増殖速度、およびアルカリホスファターゼの発現により、選択物を決定した。MX-1プロモーターは、ヒ
トA／Dインターフェロンによって刺激されると、SV40-ラージTおよび／またはス
モールt抗原の発現を条件的に活性化する。条件的不死化遺伝子は可逆性であってよく、すなわち刺激条件（インターフェロン産生）を取り除いた場合に、好ま
しい細胞系は細胞周期から離脱して、分化した表現型に運命づけられ、安定的な
非有糸分裂状態として存在する。スモールt抗原は真の条件的不死化状態を示す細胞系を生み出す。TK-ネオマイシン遺伝子には、安全性の目的から、要求または必要に応じて、抗生物質であるガンシクロビル、バルガンシクロビル、アシク
ロビルまたは類似化合物の存在下で細胞を破壊しうる作製物中にある形で自殺遺
伝子を提供するという付加的な利点もある。

【００９０】また、プレ骨芽細胞に対してhCNTF-pNUT-DNTによるトランスフェクションを施
すことも可能である。マウスメタロチオネイン-1（MT-1）プロモーターの+600の
位置に導入されたSmaI部位を生じるリンカーを導入することにより、hCNTF遺伝子を含むプラスミド発現ベクターを作製した。このSmal部位を、hCNTF cDNAを含
む約150塩基対（bp）のヒト免疫グロブリン領域の5'末端で、クレノウ充填がなされたXbaI部位と融合させた。hCNTF遺伝子は、天然型hCNTFの開始コドンの位置
にあるEcoRI部位、およびその終止コドンの3'側7bpにあるBglII部位を含むプライマーを用いるヒトDNAのPCR増幅によって得た。5'末端にBamHI部位が付加され、3'末端にNotI部位が付加されるように、ポリアデニル化シグナルを含む325bp のPavI断片を改変した。この断片を、hCNTF遺伝子の3'末端に位置するBglII-Not
I部位にクローニングした。続いて、全2854bpのMT-t/Ig/hCNTF-2/hGH KpnI-NotI
断片を、クレノウ充填を行ったEcoRI部位にリンカーを挿入することによってEco
RI部位がNotI部位に変換されたpNUTベクターのKpn部位とNotI部位との間に挿入した。単純ヘルペスウイルス-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を含む2kbのPv
uII断片をBluescriptのEcoRV部位にクローニングし、HSV-TK遺伝子を含むNotI断
片が単離され、NotI部位に挿入されて現行のプラスミド発現ベクターが作製され
るように、XhoI部位をNotIに変換した。このベクター（図7に示す）をhCNTFを産
生させるためのOPCのトランスフェクションに用い、C2C12筋芽細胞およびBHK細胞のトランスフェクションにも用いた。

【００９１】 MX-1-KS-v-myc+NEO^ＲおよびCMV-KS-v-myc+NEO^Ｒを利用するプラスミドも用いた。MX-1プロモーターを備えたプラスミドは、ヒトインターフェロンの存在下で
v-myc癌遺伝子を条件的に活性化する。第2のプラスミドは、効果的な発現レベル
が得られるように、CMVプロモーターの制御下にあるKS-v-myc遺伝子を有する。その他の選択肢には、オステオカルシンなどの骨特異的プロモーターの活性の下
にある条件的不死化および増殖因子／骨分化因子プラスミドが含まれる。

【００９２】実施例4 導入遺伝子の発現の判定プロモーターfor Tagに対するプロモーターを駆動する培地（条件的不死化例におけるヒトA／Dインターフェロン）中に維持したOPC株、および刺激を加えなかった培養物に対して、ラージT抗原（Tag）の陽性発現の有無に関する免疫染色
を行った。Tagモノクローン抗体はサイトセラピューティクス社（CytoTherapeut
ics, Inc.）（Lincoln、RI）から入手可能であり、染色手順はベクタステインエ
リート（Vectastain Elite）(登録商標)ABC マウスキットを用いる標準的な免疫
ペルオキシダーゼ法に従った。免疫陽性の核内Tagに対する陽性対照としてSCT-1
／hNGF細胞系を用いた。シンスチン（Schinstine）ら、Cell Trans. 4：93〜102
（1995）。

【００９３】免疫染色の結果、Tagに対するプロモーターを駆動するヒトA／Dインターフェロンとともに維持したOPC1株において、ラージT抗原（Tag）の陽性発現の存在を
示す核内陽性染色が明らかになった。刺激物質の非存在下でもOPCの一部は依然としてTag抗体に対する核内陽性染色を保っており（5〜8％）、このことから、O
PC1株の一部ではラージT抗原が構成的に発現されていて、これらの細胞を不死化
させるとともに回復能を奪っているという可能性が示唆された。しかし、好まし
い態様において、本発明の方法における使用のために選択されたOPC細胞はラージT抗原を構成的に発現しなかった。陽性対照としてのSCT-1／hNGF細胞系では免
疫陽性の核内Tagが認められた。

【００９４】以上をまとめると、OPC1株は、接触阻止を示すように思われ、プログラム化さ
れた骨形成性分化を生じる、汚染物質を含まないヒト由来の不死化骨前駆細胞系
である。この細胞系は、継続的な選択圧がなくてもSV40-T抗原導入遺伝子の安定
的な組み入れを示し、これが宿主細胞の増殖、維持または分化ゲノムに対して負
の影響を及ぼすとは考えられない。OPC1株は80回を上回る継代にわたって維持す
ることができ、形質転換を受けていない親細胞系に認められる増殖障害および老
化は示さない。また、OPC1に、増殖または分化因子を産生および分泌するための
第2の導入遺伝子を安定的に組み入れて用いることも可能である。この骨前駆細胞系は、骨発生、細胞／生体材料の相互作用を評価するための高感度のインビト
ロ細胞系、および骨分化因子と推定されるもののスクリーニング系も提供する。

【００９５】 hBMP-2発現ベクターの作製本発明のOPC細胞にBMP遺伝子を導入するには、種々のhBMP発現ベクターを用い
ることが可能である。以下の実施例（5〜10）は、OPC細胞のトランスフェクショ
ンのためのhBMP-2発現ベクターの作製を例示しており、他のhBMPに対する一例と
しても有用である。

【００９６】実施例5 KS-hBMP-2発現ベクターであるpcDNA3.l(+)-KS-hBMP2-508およびpPI-DN-KS-hBMP2
-512の作製チオシアン酸グアニジニウムを基剤とするTRI試薬（Molecular Research Cent
er, Inc.、Cinciunati、OH）を用いて、OPC1株から全RNAを調製する。10mM Tris
HCl（pH 8.3）、50mM KCl、4mMの各dNTP、5mM MgCl_２、1.25mMのオリゴ（dT）1
5量体、1.25mMのランダムヘキサマー、31単位のRNaseガードRNase阻害剤（RNase
Guard RNase Inhibitor）（Pharmacia、Sweden）および200単位のスーパースク
リプトII（SuperScript II）逆転写酵素（Gibco BRL、Gaithersburg、MD）を含む 20mlの反応液中で、OPC1株の全RNA 500ngの逆転写を42℃で30分間行わせる。
上記の通りに逆転写された2μlのcDNAを、10mM Tris-HCl（pH 8.3）、50mM KCl 、800nMの各dNTP、2mM MgCl_２、400nMのプライマーohBMP2-597およびohBMP2-598
、ならびに2.5単位のサームス・アクアティクス（Thermus aquatics）（Taq）DN
Aポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、Germany）を含む25mlのPCR反応混合物に
添加する。プライマーohBMP2-597には、合成されたHindIII制限部位および共通性リボソーム結合部位（以下ではコザック配列、KSと呼ぶ）が5'末端にあり、一
方、 ohBMP2-598の5'末端にはBamHI部位がある。

【００９７】 PCR反応混合物を以下からなる30回の増幅サイクルにかける：変性94℃ 30秒間
（最初のサイクルでは2分間）、アニーリング50℃ 1分間、および伸長72℃ 3.5 分間（最終サイクルでは5分間）。1215bpのhBMP-2 PCR産物を制限酵素BamHIおよ
びHindIIIで消化し、1％Trivieアガロースゲルにて分離する。1215bpのHindIII ／BamHI DNA断片を切り出し、Spin-X DNA精製キット（Corning Costart Corpora
tion、Cambridge、MA）を用いて精製する。pcDNA3.1(+)発現ベクターも同じくBa
mHIおよびHindIIIで消化し、Spin-X DNA精製キット（Corning Costart Corporat
ion、Cambridge、MA）を用いて1％アガロースから精製する。連結混合物を大腸菌DH5α株（Gibco BRL、Gaithersburg、MD）に形質転換導入する。陽性サブクロ
ーンのスクリーニングにはクラッキングゲル法（Promega Protocol and Applica
tions Guide、1991）を用いる。

【００９８】適切なクローンの実体はBamHI／HindIII二重消化によって詳細に確認しうると
考えられる。pcDNA3.l(+)中に完全長hBMP-2のある陽性サブクローンをpcDNA3.l(
+)-hBMP-2-508と命名する。完全長hBMP-2クローンのヌクレオチド配列は、自動D
NAシークエンサー用のSequaThermキット（Epicentre Technologies、Madison、W
I）を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定される。続いて、完全長KS-hBMP-2挿入物をNheI／NotI消化によってpcDNA3.l(+)-hBMP-2-508からサブクローニングし、pPI-DN発現ベクター中に直接クローニングしてpPI-DN-KS-
hBMP2-512を得る。

【００９９】実施例6 IgSP-NS-hBMP-2発現ベクター：pcDNA3.1(+)-IgSP-NS-hBMP2-509およびpPI-DN-Ig
SP-NS-hBMP2-513の作製 IgSP-NS-hBMP-2融合遺伝子の作製には組換えPCR法を用いる。オリゴヌクレオチドoIgSP-221およびohBMP2-601は、それぞれIgGシグナルペプチド配列（IgSP）
および成熟型hBMP-2配列に対して特異的であり、それぞれ合成されたHindIIIおよびBamHI制限部位を5'末端にもつ。オリゴヌクレオチドohBMP2-599およびohBMP
2-600は互いに相補的である。さらに、オリゴヌクレオチドohBMP2-600の5'側の1
4ヌクレオチドはIgSP配列と同一であって、3'側の16ヌクレオチドは成熟型hBMP-
2配列と同一であり、ohBMP2-599についてもその逆が成り立つ。オリゴヌクレオチド対oIgSP-221／ohBMP2-599およびohBMP2-600／ohBMP2-601をそれぞれテンプレートpNUT-hCNTF-TKおよびpcDNA3.1(+)-KS-hBMP-2-508プラスミドに対して用い
る2種類の第1のPCR反応を行う。10mM Tris HCl（pH 8.3）、50mM KCl、800nMの各dNTP、2mM MgCl_２、400nMのプライマー#1および#2、ならびに2.5単位のTaq DN
Aポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、Germany）を含む50mlのPCR混合物に対し
て、100ngのテンプレートDNAを添加する。

【０１００】 PCR反応混合物を以下からなる30回の増幅サイクルにかける：変性、94℃ 30秒
間、アニーリング、50℃ 30秒間、および伸長、72℃ 30秒間。PCR産物を1％Triv
ieGel（TrivieGen）にて分離する。それぞれが第1のPCR産物の一方を含む2種類のアガロースプラグを、オリゴヌクレオチドoIgSP-221およびohBMP2-601を用いるという点を除いて上記と同一の50mlのPCR反応混合物を含むチューブに移す。以下の30回の増幅サイクルからなる第2のPCR反応を行う：変性、94℃ 30秒間（最初のサイクルでは2分間）、アニーリング、60℃ 30秒間（2回目から4回目まで
のサイクルは37℃ 2分間）および伸長、72℃ 30秒間（最終サイクルは2分間）。
535bpのIgSP-成熟型hBMP-2融合PCR産物およびクローニングベクターpcDNA3.1(+)
をBamHIおよびHindIII制限酵素で消化した後に、Spin-X DNA精製キット（Cornin
g Costart Corporation、Cambridge、MA）を用い、それぞれを1％Trivieおよびアガロースゲルにて分離する。連結混合物を大腸菌DH5α株（Gibco BRL、Gaithe
rsburg、MD）に形質転換導入する。陽性サブクローンのスクリーニングにはクラ
ッキングゲル法（Promega Protocol and Applications Guide、1991）を用いる。

【０１０１】適切なクローンの実体はBamHI／HindIII二重消化によって詳細に確認しうると
考えられる。IgSP-NS-hBMP-2に関する陽性サブクローンをpcDNA3.1(+)-IgSPNS-h
BMP2-509と命名する。IgSP-NS-hBMP-2クローンのヌクレオチド配列は、自動DNA シークエンサー用のSequaThermキット（Epicentre Technologies、Madison、WI ）を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定される。続いて、Ig
SP-NS-Hbmp-2挿入物をNheI／NotI消化によってpcDNA3.1(+)-IgSP-NS-hBMP2-509 からサブクローニングし、pPI-DN発現ベクター中に直接クローニングしてpPI-DN
-IgSP-NS-hBMP2-513を得る。

【０１０２】実施例7 IgSP-KR-hBMP-2発現ベクター：pcDNA3.1(+)-IgSP-KR-hBMP2-510およびpPI-DN-Ig
SP-KR-hEMP2-514の作製 IgSP-KR-hBMP-2融合遺伝子の作製には組換えPCR法を用いる。オリゴヌクレオチドoIgSP-221およびohBMP2-601は、それぞれIgGシグナルペプチド配列（IgSP）
および成熟型hBMP-2配列に対して特異的であり、それぞれ合成されたHindIIIおよびBamHI制限部位を5'末端にもつ。オリゴヌクレオチドohBMP2-602およびohBMP
2-603は互いに相補的である。さらに、オリゴヌクレオチドohBMP2-603の5'側の1
4ヌクレオチドはIgSP配列と同一であり、3'側の16ヌクレオチドは成熟型hBMP-2 配列と同一であって、ohBMP2-602についてもその逆が成り立つ。オリゴヌクレオ
チド対oIgSP-221／ohBMP2-602およびohBMP2-603／ohBMP2-601をそれぞれテンプレートpNUThCNTF-TKおよびpcDNA3.1(+)-KS-hBMP-2-508プラスミドに対して用いる、2種類の第1のPCR反応を行う。10mM Tris HCl（pH 8.3）、50mM KCl、800nM の各dNTP、2mM MgCl_２、400nMのプライマー#1および#2、ならびに2.5単位のTaq
DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、Germany）を含む50mlのPCR混合物に対
して、100ngのテンプレートDNAを添加する。

【０１０３】 PCR反応混合物を以下からなる30回の増幅サイクルにかける：変性、94℃ 30秒
間、アニーリング、50℃ 30秒間、および伸長、72℃ 30秒間。PCR産物を1％Triv
ieGel（TrivieGen）にて分離する。それぞれが第1のPCR産物の一方を含む2種類のアガロースプラグを、オリゴヌクレオチドoIgSP-221およびohBMP2-601を用いるという点を除いて上記と同一の50mlのPCR反応混合物を含むチューブに移す。以下の30回の増幅サイクルからなる第2のPCR反応を行う：変性、94℃ 30秒間（最初のサイクルは2分間）、アニーリング、60℃ 30秒間（2回目から4回目までの
サイクルは37℃ 2分間）および伸長、72℃ 30秒間（最終サイクルは2分間）。54
1bpのIgSP-KR-hBMP-2融合PCR産物およびクローニングベクターpcDNA3.1(+)をBam
HIおよびHindIII制限酵素で消化した後に、Spin-X DNA精製キット（Corning Cos
tart Corporation、Cambridge、MA）を用い、それぞれを1％Trivieおよびアガロ
ースゲルにて分離する。連結混合物を大腸菌DH5α株（Gibco BRL、Gaithersburg
、MD）に形質転換導入する。陽性サブクローンの選別にはクラッキングゲル法（
Promega Protocol and Applications Guide、1991）を用いる。

【０１０４】適切なクローンの実体はBamHI／HindIII二重消化によって詳細に確認しうると
考えられる。IgSP-KR-hBMP-2に関する陽性サブクローンをpcDNA3.l(+)-IgSP-KR-
hBMP2-510と命名する。IgSP-KR-hBMP-2クローンのヌクレオチド配列を、自動DNA
シークエンサー用のSequaThermキット（Epicentre Technologies、Madison、WI ）を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定する。続いて、IgSP
-NS-hBMP-2挿入物をNheI／NotI消化によってpcDNA3.1(+)-IgSP-KR-hBMP2-510からサブクローニングし、pPI-DN発現ベクター中に直接クローニングしてpPI-DN-I
gSP-KR-hBMP2-514を得る。

【０１０５】実施例8 IgSP-RRRR-hBMP-2発現ベクター：pcDNA3.1(+)-IgSP-RRRR-hBMP2-511およびpPI-D
N-IgSP-RRRR-kBMP2-515の作製 IgSP-RRRR-hBMP-2融合遺伝子の作製には組換えPCR法を用いる。オリゴヌクレオチドoIgSP-221およびohBMP2-601は、それぞれIgGシグナルペプチド配列（IgSP
）および成熟型hBMP-2配列に対して特異的であり、それぞれ合成されたHindIII およびBamHI制限部位を5'末端にもつ。オリゴヌクレオチドohBMP2-604およびohB
MP2-605は互いに相補的である。さらに、オリゴヌクレオチドohBMP2-605の5'側の14ヌクレオチドはIgSP配列と同一であり、3'側の16ヌクレオチドは成熟型hBMP
-2配列と同一であって、ohBMP2-604についてもその逆が成り立つ。オリゴヌクレ
オチド対oIgSP-221／ohBMP2-604およびohBMP2-605／ohBMP2-601をそれぞれテンプレートpNUThCNTF-TKおよびpcDNA3.1(+)-KS-hBMP-2-508プラスミドに対して用いる、2種類の第1のPCR反応を行う。10mM Tris HCl（pH 8.3）、50mM KCl、800n
Mの各dNTP、2mM MgCl_２、400nMのプライマー#1および#2、ならびに2.5単位のTaq
DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim、Germany）を含む50mlのPCR混合物に対して、100ngのテンプレートDNAを添加する。

【０１０６】 PCR反応混合物を以下からなる30回の増幅サイクルにかける：変性、94℃ 30秒
間、アニーリング、50℃ 30秒間、および伸長、72℃ 30秒間。PCR産物を1％Triv
ieGel（TrivieGen）にて分離する。それぞれが第1のPCR産物の一方を含む2種類のアガロースプラグを、オリゴヌクレオチドoIgSP-221およびohBMP2-601を用いるという点を除いて上記と同一の50mlのPCR反応混合物を含むチューブに移す。以下の30回の増幅サイクルからなる第2のPCR反応を行う：変性、94℃ 30秒間（最初のサイクルは2分間）、アニーリング、60℃ 30秒間（2回目から4回目までの
サイクルは37℃ 2分間）および伸長、72℃ 30秒間（最終サイクルは2分間）。54
7bpのIgSP-RRRR-hBMP-2融合PCR産物およびクローニングベクターpcDNA3.1(+)をB
amHIおよびHindIII制限酵素で消化した後に、Spin-X DNA精製キット（Corning C
ostart Corporation、Cambridge、MA）を用い、それぞれを1％Trivieおよびアガ
ロースゲルにて分離する。連結混合物を大腸菌DH5α株（Gibco BRL、Gaithersbu
rg、MD）に形質転換導入する。陽性サブクローンの選別にはクラッキングゲル法
（Promega Protocol and Applications Guide、1991）を用いる。

【０１０７】適切なクローンの実体をBamHI／HindIII二重消化によって詳細に確認する。Ig
SP-RRRR-hBMP-2に関する陽性サブクローンをpcDNA3.1(+)-IgSPRRRR-hBMP2-511と
命名する。IgSP-RRRR-hBMP-2クローンのヌクレオチド配列を、自動DNAシークエンサー用のSequaThermキット（Epicentre Technologies、Madison、WI）を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定法によって決定する。続いて、IgSP-RRRR-hB
MP-2挿入物をNheI／NotI消化によってpcDNA3.l(+)-IgSP-RRRR-hBMP2-511からサブクローニングし、pPI-DN発現ベクター中に直接クローニングしてpPI-DN-IgSP-
RRRR-hBMP2-515を得る。

【０１０８】本実施例で説明したプラスミドベクターのヌクレオチド配列を表5に示す。

【０１０９】

【表５】 KS-hBMP-2、IgSP-NS-hBMP-2、IgSP-KR-hBMP-2、およびIgSP-RRRR-hBM
P-2遺伝子のヌクレオチド配列

【０１１０】実施例9 その他のBMPの発現実施例8に概要を示したBMP-2の発現は、例えば、別のBMP（BMP-2、3、4、5、6
、7、8または9など）を発現する配列、またはBMPの活性を有する蛋白質（OPCの骨芽細胞への分化を刺激するモルフォゲン）を発現する配列へとBMP配列を変更することにより、本発明による他のBMPを発現させるためにも用いうる。このような配列を骨芽細胞系の不死化または条件的不死化細胞に導入するためのその他
の数多くのトランスフェクション手順が、当業者には周知である。

【０１１１】実施例10 機能的に等価なBMPの発現 BMPの骨形成活性はその厳密なアミノ酸配列にあるのではなく、DNA配列によっ
てコードされるアミノ酸配列に内在するエピトープにあることは当業者には明ら
かであると思われる。このため、厳密なアミノ酸配列を再現しなくても、これら
のペプチドのうち1つの骨形成活性を再現しうることも明らかであると考えられる。これは、遺伝暗号の縮重性のために本明細書で開示される配列とは異なるが
、それでも機能的な骨誘導因子を産生するエピトープをコードするような核酸配
列を設計することによって達成しうる。

【０１１２】したがって、コードされる蛋白質のアミノ酸配列を維持しつつも、DNA分子のヌクレオチド配列には大きな多様性が得られることから、遺伝暗号の縮重性によ
って本発明の範囲はさらに広がる。特定のアミノ酸に対する遺伝暗号およびヌク
レオチドコドンの変形物を表6および7に示す。遺伝暗号の縮重性に基づき、標準
的なDNA変異誘発法を用いて、またはDNA配列の合成により、本明細書で開示され
るDNA配列から変異型DNA分子を得ることができる。

【０１１３】

【表６】遺伝暗号「停止（och）」はオーカー終止トリプレット、「停止（amb）」はアンバーの
ことである。ATGは最も多くみられる開始コドンであり、GTGは通常はバリンをコ
ードするが、mRNA鎖を開始するメチオニンもコードしうる。

【０１１４】

【表７】遺伝暗号の縮重性

【０１１５】さらに、標準的な変異誘発法を用いて、本明細書で開示するDNA分子によってコードされるペプチドとはアミノ酸配列が異なるペプチドを産生させることも可
能である。しかし、このようなペプチドは、本明細書で開示されるDNA分子によってコードされるペプチドの本質的特徴、すなわち、間葉前駆細胞の骨芽細胞系
への分化を誘導して骨沈着を開始させる能力を保っている。この特徴は、実施例
2の方法を用いる、このような様式へと分化したOPCによって産生される特徴的蛋
白質の検出のための、本明細書に記載されるアッセイ法によって容易に判定しう
る。変異型ペプチドには、わずかな欠失、付加および置換を含む、アミノ酸配列
の変化を有するものが含まれる。

【０１１６】アミノ酸配列の変化を導入するための部位はあらかじめ決定されるが、変異そ
れ自体をあらかじめ決定する必要はない。例えば、特定の部位での変異による成
績を最適化するために、標的コドンまたは領域に対してランダム変異誘発を加え
、発現された蛋白質を望ましい活性の最適な組み合わせに関してスクリーニング
してもよい。上記のような既知の配列を有するDNA中の所定の部位に置換変異を作製するための技法はよく知られている。

【０１１７】機能的ポリペプチドを維持するために好ましいペプチド変異体は、天然型のDN
A配列によってコードされるペプチドとのアミノ酸の違いがごくわずかな数に留まるものと考えられる。好ましくは、このような変異体は、単一残基のアミノ酸
置換物であると考えられる。置換変異体とは、アミノ酸配列における少なくとも
1つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものをいう。蛋白質の特性を細かく調節することが望ましい場合には、このような置換物は一般に表
8に従って作製される。すでに指摘した通り、このようなペプチド変異体にはすべて、OPCの骨芽細胞系への分化を誘導し、骨形成性を開始させる能力を保持していることを確かめるための試験が行われる。

【０１１８】本発明には、OPCが反応して骨形成性表現型を示す細胞へと分化するようなBMP
をコードする、あらゆるDNAを発現するOPCが含まれる。

【０１１９】

【表８】

【０１２０】生物活性の変化は、表8に示されたものよりも保存の程度が低い置換を選択すること、すなわち、（a）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シート状もしくはらせん状の立体構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖の大きさ（bulk）の維持に対する効果がさらに大きく異なる残基を選択することによって作り出せる。特定の態様においては、BM
P中のアミノ酸の少なくとも90または95％が天然型BMPと同一である。

【０１２１】実施例11 rhBMP-2を分泌するイヌ由来の骨芽細胞前駆細胞（dOPC）本実施例では、rhBMP-2を分泌するように組換え操作を加えることができ、イヌまたは他の動物における骨欠損部（標準化された下顎骨欠損など）への移植に
よる送達が可能な、条件的不死化を受けたイヌ由来OPC株を説明する。抗体および補体を介する細胞溶解を避けるために、移植細胞は移植を行う種に由来するこ
とが好ましい。しかし、種に関係しない汎用的なドナー細胞を用いることも可能
である。本実施例で開示するdOPC株はイヌ新生仔骨膜細胞系に由来し、得られた
dOPCは特異的な骨芽細胞様マーカーを発現するほか、さらにdOPCには、細胞の骨
形成性分化を促し、続いて骨形成を促進させるためのrhBMP-2を発現するように組換え操作を加えることが可能である。

【０１２２】イヌ骨膜に由来するOPCは、0.2％コラゲナーゼ、続いて0.25％トリプシンによ
り、それぞれ約30分間ずつ段階的処理を行うことによって単離される。4回にわたる消化を用いる代わりに、1回目および2回目の消化によって得られた細胞調製
物のプレーティングを行う。単離した時点の細胞（P0）を、5％FBSを加えたα-M
EM（GIBCO BRL、Inc）を入れた容量75cm²の組織培養フラスコ中に0.25×10⁶個の
密度で播く。残った組織片を回収して無カルシウム無マグネシウムHBSSで洗浄し
、0.25％トリプシン-EDTAによる消化を30分間行う。フラスコ培養物が増殖して集密状態に達した時点で、0.25％トリプシン-EDTAによる酵素的剥離の後に継代培養を行って第1継代株（P1）とする。BMP遺伝子は実施例に記載された技法を用
いてdOPCに導入することができる。

【０１２３】実施例2〜4の通りに、そのほかの特徴分析およびトランスフェクション手順を
行うことも可能である。dOPCは、OPC1などのヒトOPC／rhBMP-2株の代用物として
用いることができる。dOPCをヒトに用いる場合には、短期的に免疫抑制治療を行
うことが、動物体内における組換え細胞の生存能を評価する上で有用と考えられ
る。

【０１２４】同様の技法を用いることにより、サル、ラットおよび他の種々の種に由来する
OPCを入手することができる。

【０１２５】使用方法以下の実施例12〜16では、ラット、イヌおよびアカゲザルにおける本発明の遺
伝子組換えOPCの用い方、およびそれらのヒトでの用い方について説明する。これらの実施例では、BMPを発現するOPCを、下顎骨および上顎骨などの種々の骨に
おける重大な大きさの欠損部（CSD）に設置する。後の方の実施例では、rBMP発現のための形質転換を受けていないOPCを含む基質の使用について示す。しかし、これらの実施例で説明する技法はいずれも、形質転換を受けていないOPCを導入するために用いることが可能である。

【０１２６】 CSDとは、BMPを発現するように組換え操作を受けた本発明のOPCなどの骨形成促進製剤による治療を行わない限り、新骨形成による自然治癒が生じないような
十分な大きさの骨欠損部のことをいう。（基質に局在化されたその他の実施例の
OPCの）BMPを発現する本実施例のOPCは、開頭術による欠損、洞閉塞（例えば、上顎洞および前頭洞における）の治療のための頭蓋骨の平坦骨部を含むさまざま
な解剖学的部位において、ルフォール骨切り術による空隙の治療（顔面中央にお
ける）、下顎骨、上顎骨および長骨において、脊椎固定のための治療として、骨
減少性骨の骨密度の改善のため（骨粗鬆症における脊椎の病的骨折の予防的治療
などにおいて）、ならびに嚢状欠損の充填のために、用いることができる。

【０１２７】 BMPに対する反応性のある骨芽細胞系のBMP発現細胞（またはOPCなどのそれらの前駆細胞）を骨欠損部に移植する。細胞は欠損の治癒を改善するのに十分な治
療量のBMPを発現する。細胞は、ごく一部の例を挙げると、ゲル懸濁液、ポリマー製インプラント（実施例20および21で開示されるポリ(D,L-ラクチド)など）、
ゲル成分（実施例20で開示されるポリマー製インプラントのコラーゲンヒドロゲ
ルのコアなど）またはヘリスタット（Helistat）(登録商標)コラーゲンスポンジ
などを含む、種々の送達システム中にある形で投与することができる。細胞は、
骨欠損部への直接的な外科移植により、または実施例20における記載の通りに内
視鏡的に送達することにより送達可能である。いったん移植されると、細胞は治
癒過程を開始するために、約24〜72時間で移植部位に保たれる程度に十分に固定
されることが好ましい。固定は、細胞の局在化および保護の両方に作用する担体
によって達成される。また、担体は細胞付着のための足場としても作用し、シグ
ナル伝達分子の方向付けのためのプラットフォームとしても作用する。

【０１２８】骨細胞への運命づけがなされた本発明のBMP発現細胞は、骨芽細胞への分化および細胞における骨形成を刺激するために十分な、超生理的な量のBMPを産生する必要がある。産生されるBMPの局所的濃度は、例えば1〜100mg、より詳細には1
〜5mgまたは約1mg未満、例えば500μg、35μg、1μg、例えば100ngまたはそれ未
満でありうる。骨欠損部の体積1ml当たり約0.5mgの用量のrhBMP-2は、若年または中年の健康成人に対して適切であると考えられる。典型的な創傷における用量
の目標値は、例えば、約5〜10×10⁵個／cm²または骨欠損体積約1ml当たり約100 万個である。高齢である、健康状態が悪い、または治癒が一般に遅い部位にある
患者では用量を増やすことができる。これらの条件下では、骨修復は少なくとも
約1μm／日の速度で進行すると期待される。

【０１２９】実施例12 イヌにおける下顎骨欠損の治療イヌに対して予防用抗生物質の投与、静脈内輸液および麻酔を行う。外科手術
部位を外科的に調製した後、下顎骨の左側下面を覆う組織に対して、1：100,000
エピネフリンを含む2％塩酸リドカイン3.6mlによる浸潤麻酔を行う。犬歯から2c
mの部位から始めて、下顎骨体の下方の境界に沿って7cmの切開を加える。全層皮
弁を挙上して下顎骨の中央体を露出させ、欠損部から骨膜を切開し、703型歯科用バーを装着して豊富な滅菌洗浄水とともに高速回転ホール（Hall）ドリルを用
いて、長さ2.5cmおよび高さ1.0cmという既知の寸法の全層骨「サドル状欠損」を
下顎骨の下面に沿って作製する。欠損部は犬歯から3cmの部位から始まり、遠位境界では5.5cmとなる。止血が得られた後に、例えば、実施例20または21に記載されたインプラント中にある形でBMP産生細胞を移植し、3-0 Vicryl縫合糸で軟組織を再接合して、切開部を2-0ナイロン縫合糸で閉鎖する。

【０１３０】実施例13 アカゲザルにおける下顎骨欠損の治療アカゲザル（体重6〜9kg）に対して、上記の実施例12の通りに予防用抗生物質
の投与、静脈内輸液および麻酔を行う。犬歯から1cmの部位から始めて、下顎骨体の下方の境界からみて内側および中央側に6cmの切開を加える。全層皮弁を挙上して下顎骨の中央体を露出させ、欠損部から骨膜を切開する。実施例12の通り
に703型歯科用バーを装着して豊富な滅菌洗浄水とともに高速回転ホールドリルを用い、犬歯から2〜5cmの範囲に及ぶ、長さ1.5cmおよび高さ1.0cmの全層骨サド
ル状欠損を下顎骨の下面に沿って作製する。止血が得られた後に、実施例12の通
りに骨欠損部に1つまたは複数のインプラントを設置し、軟組織および皮膚を再接合する。

【０１３１】実施例14 イヌにおける上顎骨歯槽突起裂の治療右上顎骨犬歯から左上顎骨犬歯までの基部の周囲にある連続した口蓋および歯
肉頬移行部粘膜に麻酔を施し、口蓋および歯肉頬移行部の全層皮弁を挙上して、
下顎門歯、口蓋突起および歯槽頂骨を露出させる。中線の各側にある3本の下顎門歯のうち2本を抜歯鉗子で抜き取り、703型歯科用バーを装着して豊富な滅菌洗
浄水とともに高速回転ホールドリルを用いて、切歯管小孔の頭側から鼻床までに
及ぶ1.5cm幅の骨欠損を調製する。瘻孔形成が促進されるように、十字切開を加え、鼻粘膜を口腔粘膜と3-0 Dexon縫合糸で固定する。虚脱の予防および瘻孔形成の促進のためのステントとなるように、急速固化する常温重合ポリメチルメタ
クレートを6号気管内チューブ（ET-tube）に充填する。

【０１３２】 3カ月後にステントを抜去し、丁寧に触知することによって瘻孔の開通性を確かめる。数週間後に両側上顎の間隙性欠損部に切開を加えて肉芽組織を除去し、
703型歯科用バーを装着して豊富な滅菌洗浄水とともに高速回転ホールドリルを用いて、口蓋突起の骨性壁の剥皮を行う。鼻粘膜を3-0 Dexon縫合糸で縫合して「蓋」を形成し、インプラントを挿入して、歯周および口蓋粘膜を3-0 Dexon縫合糸で閉鎖する。

【０１３３】実施例15 アカゲザルにおける上顎歯槽裂溝の処置歯肉組織を、上顎の側方切歯および犬歯からゆっくりと反転させ、抜歯鉗子を
用いて抜歯した。抜歯後、多量の灌流液（0.9％生理的食塩水）によりドリルバー(burr)および回転器具を用いて歯槽整形術を行った。骨を片側方から鼻粘膜レ
ベルまで除去し、幅1cmの口鼻フィステルを形成した。気管チューブ５番を、口腔開口部からフィステルを通り外鼻孔へと、鼻粘膜欠損部を通じて挿管し、その
後口腔開口部へ戻し、鼻−歯槽裂溝欠損を形成した。管にポリ（メチルメタクリ
レート）を充填した。

【０１３４】８週間後、対象を手術室に戻し、気管チューブをゆっくり抜管し、裂溝を検証
し、この部位を0.9％生理的食塩水で灌流した。さらに４週間後、裂溝欠損部の開存性を再度調べた。次に実施例12に記したように、欠損部にインプラントを配
置した。

【０１３５】実施例16 ウサギおよびサルにおける骨切除術ギャップの処置ニュージーランドホワイトウサギに麻酔をかけ、手術を施す左右いずれかの前
肢を剃毛した。中間点より上側に長さ約4cmの切開部を形成し、橈骨骨幹を覆う組織を剥離した。外科的振動骨鋸により、橈骨に20mmの切片欠損部を作製し、多
量の0.9％生理的食塩水灌流により補充し、かつCSDに適切にPDS処置を施した。

【０１３６】成熟した雄の成体Macaca mulatta（アカゲザル）を麻酔し、橈骨上を切開し、
ゆるやかな鈍的剥離により十分な厚さの皮弁（骨膜を含む）を露出した。橈骨切
除術は、動物1匹につき1箇所、左右橈骨のいずれかに無作為に割付けた。骨切除
は長さ35mm（橈骨の直径のおよそ4倍）で行った。欠損部は、窒素駆動式往復骨鋸を用い、多量に灌流しながら（0.9％生理的食塩水）、外科的に形成した。骨幹切片を除去した後、残留する骨破片を除去し、この部位を骨折固定プレートお
よびスクリューを備えた内固定（Leibinger Corporation、ダラス、TX）を用いて安定させた。適当な実験的処置（インプラントなど）を各欠損部に配置し、か
つ創傷を縫合した。

【０１３７】臨界寸法欠損部(CSD)をウサギ60匹の頭蓋に形成し、５処置および２期間の間で均等に分割した。これらのウサギを仰臥位に固定し、骨膜下十分な厚さの切開
創を、鼻骨から後頭隆起後方まで半月状に形成し、軟組織を鋭的に剥離し、頭頂
骨を露出し、低速回転式手術用ドリルの直径15mmのトレフィンを用いて、多量に
灌流しながら正中線開頭術を施した。血流途絶後、インプラントを開頭切開創に
挿入した。

【０１３８】実施例17 送達システムこれまでは骨欠損を治療するためにrhBMPを使用する場合、治療効果を達成するには非常に高用量(mg)のrhBMPが必要とされていた。本発明は、骨形成を促進するためにOPCを維持しかつrhBMPを局在化し局所濃度を高めるように独自に設計
された高分子送達システム(PDS)インプラントである点が利点である。PDSと組合
わせた（個別にまたは一緒の）rhBMP-2およびOPCは、広範な患者スペクトルに対
し強力な治療パッケージを構築している。

【０１３９】ここでは、PDSデザインの２例：表層(cortex)−コア装置(CCD)および一体化さ
れたポリマーラミネート(IPL)について例証する。CCDは、本発明のOPCを既知量含有するゲル様マトリックスコア（例えばヒドロゲル）を取り囲んでいる、rhBM
P-2を既知の用量含有するポリ（ラクチド−コ−グリコシド）(PLG)の表層を含ん
でいる。IPLは、PLGラミネートおよび既知のrhBMP-2用量およびOPC量を含むヒド
ロゲルラミネートを交互に含んでいる。PDS戦略は、BMP-反応性細胞集団の増幅および局所的に発現されたBMP分子の増加という重要な機能を満たしており、かつ特に骨修復が遅延し、前駆体細胞が減少し、かつ細胞応答性が減弱した高齢者
において価値がある。従ってこの治療は特に高齢者に有用であり、その理由は局
所的BMPを高めるrhBMP-2およびOPCの局在が、BMP-反応性OPC群を支え、骨再生能
を高めるからである。さらにPDSは、細胞付着を支持し、細胞分化を促進し、骨再生を方向付け、かつ軟組織の脱離を防止する多孔質足場(scaffold)を提供する
重大な機能を発揮する。PDSは、宿主の多能性細胞の付着のための停留所(haven)
を提供し、それらの骨芽細胞への転換を支え、かつ骨欠損部へrhBMPおよびOPCを
運搬する基層である。

【０１４０】これまでのラット、ヒツジおよびイヌにおける骨および頭蓋の欠損部の修復の
ためにrhBMP-2を送達しようとする試みとは異なり、rhBMPの超生理学的用量は、
OPCおよびrhBMPを局在化するPDSを必要とせず、かつこれらの物質を投与の必要要件が減るように戦略的に位置づける。図１および２に示したPDSの２種の具体的な態様は、多孔質PLG足場がOPCを含有する内側ヒドロゲル部材を取り囲んでい
る２成分マトリックスを提供している。ヒドロゲル担体は、OPCを支持しかつ局在化する一方で、取り囲んでいるPLG（または他のポリマー）マトリックスは、最終的な骨形成を損なうことなく骨伝導を促進する生分解性足場を提供する。

【０１４１】表層−コアの態様図１の態様において、表層10は、PLGおよびBMPの混合物から形成され、中空の
コア11の周囲に成形される。適当な寸法のテフロン鋳型を用い、これらのポリマ
ーを所望の形状に、例えば１個の表層容積32mm³につき、15ミリトル(2.0Pa)の真
空チャンバー内１気圧、40℃で、72時間硬化する。次に表層にrhBMP-2を、例えば用量約100μg〜約500μg BMP／mm³再生骨容積となるよう充填する。本発明のO
PS（または骨芽細胞）（これはrhBMPを発現する）を、組織培養物12中でヒドロゲルと混合し、その後この混合物を表層10のコア11中に配置し、インプラント14
を形成する。ヒドロゲル中に配置されたOPCの量は大きく変動することができるが、この具体的な実施例においては、約100,000 OPC／cm³骨欠損部を使用する。

【０１４２】その後細胞のコアを保持するPLGインプラントを、図１に示した下顎欠損部のような骨欠損部に配置する。表層を造形するかもしくは切断し、実質的に骨欠損
部の縁をふさぎかつぴったり合うようにする。長骨の剥離創傷において、骨断片
を固定プレートおよびスクリューにより固定することができ、一旦処理された(p
lated)近位および遠位の骨断片を、インプラントに合致するように加圧すること
ができる。外科的な軟組織の縫合も、インプラントを筋膜、腱、表皮下組織およ
び皮膚の積層によりその場に固定する。頭蓋創傷においては（扁平骨の頭蓋開口
術による欠損部など）、インプラントは、創傷、ならびに下側の硬膜および積層
する頭蓋骨膜組織の周縁に一致するように造形し、かつ配置することができる。

【０１４３】一旦インプラントを配置した場合、表層10中のBMPはコア11中のOPCの活性を刺
激し、このことはさらにBMPを産生する。OPCの周囲のBMPの豊富さは、取り囲んでいる多孔質PLGマトリックス中の骨形成を増強し、かつ宿主からより多くのOPC
を動員する。骨形成の際には、PLGマトリックスは分解し、このことがマトリックスの干渉を伴うことなく骨形成が完了することを可能にする。

【０１４４】マルチ-ラミネートインプラント図２は、このマトリックスの別の態様を示しているが、ここではPLGのBMPが含
浸されたシート16が形成されている。その後シート16の表面に、その中にOPCが硬化されているヒドロゲル17（コラーゲンゲル、アガロースまたはアルギン酸塩
など）の別の層が積層される。BMP/PLGおよびOPC/ヒドロゲルの複数の交互の層は、マルチ-ラミネートインプラント18を形成する。次にこのインプラント18は、骨性欠損部（図２に示した下顎欠損部19など）へ配置されるか、もしくは、骨
破壊の並置された縁の間に挿入される。

【０１４５】このラミネートは更に、PLG成分層およびヒドロゲル層の間で、より大きい境界面、円形の断面、またはより大きい物質移動能が望ましいような状況において
、巻いて渦巻き状のモジュール18aとすることができる。この渦巻き状モジュールは、渦巻きの連続層間の連絡により、シグナル伝達成分の最大限の交換および
細胞増殖を促進する。円形の断面も管状内視鏡(tubular endoscope)によるインプラントの移動を促進する。

【０１４６】このインプラントのラミネートの態様は、特に間に置かれた骨欠損にとって有
用である。更に渦巻き状モジュールのラミネートは、１片の表層の態様よりもよ
り柔軟であり、その結果このラミネートは、顎前骨および口蓋の裂溝のような不
定形の壁を有する骨欠損深部へ挿入することができる。更にこの渦巻き状モジュ
ールは、頭蓋顔面複合体の凹所のような不規則な形状の骨欠損部、例えば上顎骨
および前頭の凹所欠損部への配置のためにも有用である。

【０１４７】インプラント内のPLGは、体液中で非特異的な加水分解を受ける。PDSの合成時
および合成後の修飾も、該マトリックスの生分解速度のキャリブレートのために
使用され、その結果該マトリックスは、マトリックス分解時の骨のマトリックス
への内方成長を最適化するような速度で、分解する。

【０１４８】ポリマー（例えばPLG）マトリックスは、宿主辺縁からの血管組織の内方成長を向上し、その後の新生骨形成（骨伝導）を向上するのに十分な程多孔質である
。最適な孔径の確立を補助するために、孔径100μm、200μm、および350μmを有
するポリ(D,L-ラクチド)(DLPL)の円盤(厚さ3.5mm)を、ウサギの頭蓋冠に移植した。孔径350μmの円盤により、他の孔のものよりも多くの骨形成が認められ、従
って350μm細孔の円盤を、本発明のPDSに関連して使用することとする。徐々に円盤の多量の侵蝕が見られ、かつ骨の内方成長は、制御されたDLPL塊の喪失を裏
付けている。

【０１４９】本発明のマトリックスは、様々な化学組成物、例えば、50:50ポリ(D,L-ラクチ
ド-コ-グリコリド)(PLG)フィルムまたはポリ(D,L-ラクチド)(DLPL)フィルム（例
えば、THM Biomedical, Inc.、ダルース、MNから入手)を有することができる。この多孔質ポリ(α-ヒドロキシ酸)は、別の目的とするデザインを実現することを補助するために、様々な分子量、孔径及び固有粘度を有することができる。代
表的分子量は10〜700kDであり、空隙率70〜95％を特徴とする多孔度、15〜400μ
mの範囲の孔径、および細孔の75％が250〜400μmの範囲に収まりかつ細孔の約25
％未満が15〜250μmの範囲であるような孔径分布を示す。この多孔質ポリマーの
固有粘度は、例えば約１未満である。

【０１５０】実施例18 マトリックスの二次加工前述のインプラントデザインの物理化学的特性は、OPCの付着を促進し、OPCの
骨芽細胞への分化を支持し、かつrhBMP-2放出を最適化し、骨形成を促進かつ支持する。このようなインプラントを二次加工するために、高度に特徴付けられた
生分解性ポリ(α-ヒドロキシ酸)（50:50 PLGなど）が、市場の供給業者（例えば
Birmingham Polymers Incorporated, バーミンハム、AL）から得られ、かつクロ
ロホルム溶液からのメタノール中での反復沈殿により精製される。分子量は、25
℃での粘度測定法により証明される。粘度平均分子量strは、マーク−ホーウィンク式から算出される：λ＝5.45 x 10^-4M 0.73。

【０１５１】多孔質ポリマーは、複数の溶媒／熱力学法により二次加工され、この方法では
、ポリ(α-ヒドロキシ酸)（例えばPLG）が、塩化メチレン／シクロヘキサンまた
はジオキサン／水の混合溶媒中に溶解され、これらの溶液は0〜-4℃に凍結され、かつ真空下で昇華される。これらの２種の混和可能な溶媒を使用すると、ポリ
マー溶液の熱力学、鎖延長及び凝集が制御され、かつ適当な細孔の形態を持つ固
体状態のポリマーを生じると予想される。適当な寸法のテフロン型を用いて、こ
れらのポリマーを硬化し、かつシートまたは表層の構造を形成する。細孔の形態
は、溶媒組成および昇華温度の関数として描くことができる。これらの各変数は
、細孔工学(pore engineering)における修飾を可能にし、細孔容積90％で、骨伝
導および骨誘導に適した寸法の製品生じる。

【０１５２】詳細な実施例として、既知量のポリ(α-ヒドロキシ酸)またはポリ(L-ラクチド
)(PLLA)もしくはポリ(D,L-ラクチド)(PDLLA)を、量を測定した溶融ナフタレン（
約90℃）に溶解し、この溶液を加熱した型に注型しかつ液体窒素で冷却し、固形
ブロックを製造することができる。このブロックを、50℃および10ミリトル(1.3
3Pa)で12時間加熱し、残留ナフタレンを除去することができる。この製品の多孔
度は、溶液中のポリマー濃度を変動することによって制御することができ、再現
可能な多孔度を有する製品を調製することができる。

【０１５３】更に多孔質マトリックスは、Mikosらの論文（Biomaterials, 14:323(1993)およびPolymer, 35:1068(1994)）に記された技術により製造することができる。簡
単に述べると、高度に精製された形のPLLA（またはPDLLA）を塩化メチレン中に入れ、濃度がわかっている塩化ナトリウム塩結晶と共に激しく攪拌する。この濃
度は、例えば塩：PLLAが50、80および90重量％であり、結晶サイズは300および5
00μmであることができる。この塩懸濁液を、清浄なガラス基体上に注型またはスピンコーティングし、被覆したフィルムから塩化メチレンを室温で蒸発させる
ことができる。フィルムを真空乾燥し、残留する溶媒を完全に除去する。このフ
ィルムを、PLLAの融点以上(Tm≧l80℃)で加熱し、膜の注型成形時に形成されたP
LLA-塩クリスタライトの溶融が完全であることを確実にし、かつ膜の熱履歴を喪
失させる。その後この膜を、液体窒素中で冷却するか、または室温でアニーリン
グし、特異的なクリスタリン含量を持つ非晶質半結晶性膜を製造する。

【０１５４】 PLLA-塩膜は、純粋な脱イオン水に25℃で48時間含浸し、塩を除去し、塩−非含有の多孔質膜（メッシュ）を残留する。このメッシュを、24時間風乾し、48時
間真空乾燥し、かつ使用時まで真空デシケータまたは乾燥窒素中に貯蔵する。こ
の方法で製造された膜は、再現性のある特性を有し、塩結晶の各寸法が300〜500
μmに制御された多孔性に制御された膜、ならびに制御されたPLLA結晶化度および分解特性を有する。この多孔質メッシュは、rhBMPを充填し、本発明の多孔質マトリックスを製造することができる。

【０１５５】別の多孔質メッシュの製造法は、PLLA-塩の懸濁液がアセトン中に調製される逆相凝結に関連している。このシステムは、室温で自然にゲル化するが、しかし
エタノールのアセトン懸濁液への緩徐な添加により、多孔質PLLAメッシュ膜を製
造することができる。アセトンおよびエタノールは、真空下で除去し、乾燥した
多孔質PLLA-塩の膜メッシュを生じる。蒸留水で塩を除去し、多孔質で柔軟なメッシュが得られる。

【０１５６】あるいは、ポリ(α-ヒドロキシ酸)のいくつかのコポリマーを用いて、多孔質マトリックスを調製することができる。例えば、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイ
ソプロパノール(HFIP)中30℃で粘度が0.45dL/gであり、重量平均分子量が35kDで
ある、分子比1:1のD,L-ラクチド-コ-グリセリド（PLG、米国特許第4,578,384号に開示）を使用することができる。別のコポリマーは、様々なモル比、例えば3:
1、4:1、および9:1のPLGを有する。これらの固有粘度は、20kDから80kDの範囲で
ある。合成後製品の調製において、PLG 15gをアセトン100mLに溶解し、25℃で10
分間攪拌し、引き続き100％エタノール100mLで再沈殿する。塩化メチレンを用い
て類似の比重量を外挿することができ、その後無水メタノールで再沈殿する。PL
Gマトリックス合成に有用な他の方法は、Coombesらの論文（Biometerials, 14:2
97(1992)およびBiomaterials, 13:217(1992)）に見ることができる。

【０１５７】試料コポリマーを、ジオキサン／水または塩化メチレン／シクロヘキサン(96/
4〜95/5、v/v)中に、濃度10mg/mLで溶解する。この溶液を結晶皿に移し、-24℃ で凍結し、生成された固形円盤を4〜5日間凍結乾燥する。凍結乾燥後、まず室温
で、その後37℃で２日間、真空中に置き、残留溶媒を除去する。

【０１５８】合成前ポリマーおよび合成後生成物の物理特性は、走査型示差熱測定(DSC)を用いることで誘導することができる。例えば、良く配合されたPLLA-ナフタレン混合物10mgを90℃に低下し、かつ５分間維持し、その後0.2℃／分の割合で70℃ に徐々に低下する。相転移は、発熱事象がこの低下している範囲で生じるような
温度で認められる。同じ方法を、異なるPLLA 濃度で、平衡対組成物相の概略図が作成されるまで繰り返すことができる。PLLA組成物と時点の様々な組合せで冷
却を変更し、ナフタレン昇華後のPLLAの物理化学特性を試験する。

【０１５９】ポリマーは、均一性を確認するように特徴付けることができる。分子量は、ゲ
ル浸透クロマトグラフィー(GPC)および固有粘度で決定することができる。GPCは
、カラム温度制御装置、ダイオードアレイおよび屈折率のための屈折計を装備し
たヒューレット・パッカード1090Mシステムを用いて行うことができる。固有粘度(iv)測定は、クロロホルムまたはジメチルホルムアミド中でウッベローデ粘度
計を用いて行うことができる。単分散されたポリスチレンを基にしたiv測定値と
万能検量線(universal calibration curve)の組合せを用いて、PLLAの「絶対」分子量を決定することができる。

【０１６０】熱特性を、走査型示差熱測定器(DSC)により評価し、PLLA泡のサーモグラムおよびガラス転移点(tg)および結晶化度を誘導することができる。ASTM法D3418に従い、Seiko DSC 220を用いて、先に詳述したように調製したPLLA-ナフタレン混
合物に関する相図を誘導することができる。PLLA生成物は更に、Hummer C溶射(s
putter)コーターの中で金で被覆することができ、かつAMRay（シリーズ1810）走
査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、表面の構造的特徴、または内部多孔度（凍結破断された場合）を視覚化することができる。多孔度は、細孔直径、細孔の範囲、
分布および連結性が均等であることを測定する、ライカ970画像分析装置により定量化する。細孔容積および表面積は、マーキュリーポロシメーター（モデル30
K-A-1）を用いて水銀注入多孔度測定により決定した。ASTM法D5024に従い圧縮を
測定し、およびASTM法D2990に従い圧縮クリープを測定した。

【０１６１】実施例19 細胞付着を増強するための化学修飾フィブリノーゲン、フィブロネクチンおよびビトロネクチン由来のRGD配列は、インテグリン-結合ペプチドモチーフである。Massiaら、Curr. Opin. Cell Bi
ol., 6:656-662(1991)；Massiaら、J. Cell Biol., 114:1089-1093(1991)。同様
に、ペプチド断片p15(GTPGPQGIAGQRGVV)は、I型コラーゲンの細胞受容体結合活性を模倣し、かつこれは、骨芽細胞の細胞結合活性およびその後の骨形成に関連
したI型コラーゲンα(I)鎖（ペプチド766-780）に由来する配列である。結果として、本発明のインプラントは、細胞の接近容易性および接着を増強するために
、ポリマー基層表面の上に固定された生体活性のあるペプチドモチーフを含むこ
とができる。Cookらの論文のように（J. Biomed. Mater. Res., 35:513-523(199
7)）、インプラントの多孔質マトリックスに対する細胞接着は、更にラクチドモ
ノマーがリシンと共重合し、リシン／ラクチドランダムコポリマーを生成するこ
とにより促進し得る。しかしながら、この方法は、OPCとの最適の関係であるようポリマー表面に細胞接着分子を優先的に配置することはない。

【０１６２】 RGDおよびp15細胞接着ペプチドは、標準の固相ペプチド合成法により生成され
る。フッ素化された（好ましくは過フッ素化された）アルキル鎖（例えばペルフ
ルオロドデカン酸）は、通常のアミド結合化学により、該ペプチドのアミノ末端
に共有結合する一方で、このペプチドは、固相合成条件下でビーズに結合されて
いる。ペルフルオロアルキルペプチド複合体は、固相から切断され、精製され、
ポリマーの表面局在および表面の定量分析の両方に有用である化学的マーカーの
タグをつけた細胞接着ペプチドを生じる。Schnurerら、Chem. Mater., 8:1475-1
481(1996)；Sunら、J. Am. Chem. Soc., 118:1856-1866(1996)；Wangら、Supram
olec. Sci., 4:488-497(1997)。

【０１６３】ペルフルオロ-複合化されたRGDまたはp15ペプチドは、選択されたポリマーと共に、塩化メチレン溶液中に溶解され、かつシクロヘキサンと混合され、昇華の
ための２成分溶媒ポリマー溶液を生成する。これらの材料の多孔質泡は、指定し
たペプチドの充填を用い、実施例18に説明した二溶媒昇華法により調製される。

【０１６４】 PDS装置の内部形態は、X-線回折法、音波スペクトログラフ法、および共焦顕微鏡のような常法を用いて調べることができる。必要ならば追加の分析を行うこ
とができ、これらは、染色拡散、水銀多孔度測定、毛管流多孔度測定、および微
孔質ポリマー構造の連続性を測定するBrunauer-Immett Teller(BET)面積測定を含む。他の合成後装置の特性は、空隙の大きさ、範囲、分布および連続性である
。

【０１６５】走査型示差熱測定器(DSC)を用い、PLGの結晶化度を決定する。ガラス転移およ
び結晶転移ならびに結晶化度（％）を、パーキン−エルマーDSC-7（加熱速度＝1
0℃／分）で測定したこれらの物質の熱転移／エンタルピー変化から決定する。試料(10〜20mg)を、20〜200℃でスキャニングし、冷却し、再度スキャニングし、吸熱を生じる。

【０１６６】ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)を用いて、一連のStyragel（登録商標）サイズ排除GPCカラム、屈折計を装備し、かつ移動相として塩化メチレンを使用するヒューレッド−パッカード1050 HPLCシステムで、ホモポリマーおよびコポリマーの分子量分布を決定することができる。ポリスチレン標準を、検量参照とし
て使用する。

【０１６７】ポリマー試料は、JEOL SEM画像を用い金−溶射を細孔の形態、寸法、分布およ
び連続性について評価した後、SEMにより分析する。細孔の寸法分布は、水銀注入多孔度計を用いて決定する。細孔の空隙画分および細孔面積の値は、水銀圧の
関数としての測定値から得た。標準の分析法を用いて、多孔度、泡密度、面積／
容積比を決定した。ヘリウム比重びん法はこの情報をもたらし得る。

【０１６８】実施例20 代替マトリックスデザイン PLG成分（すなわち「表層」および「ラミネートシート」の両態様）の代替材料は、Albany International Corporation（アクトン、MA）およびJohnson & Jo
hnson（ニューブランズウィック、NJ）から入手できる市販のポリ（α-ヒドロキ
シ酸)布地である。生吸収性PLG布は、特定のテクスチュア、厚さ、繊維直径およ
び多孔度に合成後に修飾することができるベロアおよび織物として製造される。
柔軟なシートを、マトリックスの所望の形状に合わせて裁断することができる。
これらの布は、細胞の相互作用を増強するために、細胞接着ペプチドで表面を修
飾および被覆することができる。表面修飾は、(1)PLG布の表面の膨潤と相溶性が
ある有機溶媒を主成分とした溶液を用いる、直接布表面へのペルフルオロアルキ
ル化されたRGDまたはp15の被覆、または(2)ペプチド複合体の溶解、それに続く溶媒除去のための乾燥により行うことができる。これらの複合体は、測定できる
ほどの水への溶解度を有さず、その結果PLG布表面に疎水的につながれている。

【０１６９】これらのラミネートのいくつかの態様を製造する場合の目標のひとつは、円筒
形への変形が可能であるような柔軟なシートを提供することである。このような
形状を作製するためには、PLGの分子量は約20kD〜90kDの範囲であることができる。しかし一部の場合、約20kD未満のPLGが、前記実施例において示した寸法の骨性創傷における生分解に最適である場合がある。しかし、このような比較的小
さい分子量は、脆性ラミネートシートを生じ得る。このシートが脆性である場合
は、これらを多孔質ポリエステル製外科用織物で補強することができる。この方
法は、緩徐な生分解性となるが、外科用織物の薄い外側足場は、緩徐な生分解を
相殺する構造的一体性を提供する。

【０１７０】前述のCCDは、ヒドロゲル中にOPCコアの周囲にrhBMPを含むPLG表層を有する。
このコアを実施する変わりに、表層を、その中にコアが後に突き出る(bore)よう
な多孔質ブロックとして二次加工してもよい。緩衝液中の既知の濃度のrhBMPを、多孔質CCD表層に投与することができる。

【０１７１】実施例21 ヒドロゲル-OPCコア OPC用のヒドロゲル担体は、ウシまたはヒトのI型コラーゲンであってよい。コ
ラーゲンのゲルまたはスポンジは、周知の培養材料であり、細胞の増殖、形状お
よびコラーゲン合成を調節することが示されている。Mauchら、Exp. Cell. Res.
, 178:493-503(1988)；Nakagawaら、J. Invest. Dermatol., 93:792-798(1989) ；Watt、TIBS, 11:482-485(1986)。加えて、グリコサミノグリカン(GAG)は、Bou
vierら（Differentiation, 45:128-137(1990)）が示したように、コラーゲンに添加し表現型の分化を誘導することができ、かつHarakas（Clin. Orthop. Rel.
Res., 188:239-251(1984)）が示したように、骨形成の増強に対し追加の特性を提供することができる。

【０１７２】 I型コラーゲン(Vitrogen（登録商標）、Collagen Corp.の提供）3mg/mlを、コ
ラーゲン8部を1O x PBS 1部と混合し、pHを0.1N NaOHを添加して7.3〜7.4に調節
することにより調製する。コラーゲン担体内での３次元OPC培養を行うために、O
PC(10⁶細胞／mlゲル)を、I型コラーゲン溶液にゆっくり混合し、その後45〜60分
間静置し、かつ5％FBSを含有するαMEMに浸潤する。細胞培養培地は、３回／週交換し、30日間以上培養を継続する。I型コラーゲンゲル表面へのOPC播種は、ゲ
ル内に混合する代わりに、成形されたコラーゲンゲル表面上の培地に直接OPCを置いた以外は類似している。

【０１７３】ゲル形成およびOPC播種の前に、既知の指定量のコンドロイチン-4硫酸塩をコラーゲン溶液の選択されたセットに添加しても良い。コンドロイチン-4硫酸塩の
ようなグリコサミノグリカン(GAG)は、骨芽細胞表現型へのOPCの進行を増強する
ために、添加することができる。

【０１７４】 OPC用の担体の候補となるのは、繊維状コラーゲン、およびポリエチレングリコール(PEG)などのポリマーのような、多くの代替ヒドロゲル材料である。しかし、I型コラーゲンが、他の成分（GAGなど）の添加が容易であるので好ましい。

【０１７５】実施例22 rhBMPおよびOPCを含むPDSの調製 rhBMP-2を調製し、無菌状態で該ポリマーに導入した。材料の滅菌は、例えばエチレンオキシドまたはコバルト-60γ線照射滅菌により行うことができる。インプラントにrhBMPを充填する前に、インプラントを、殺菌／殺ウイルス線量のコバルト-60γ線照射で滅菌する。ポリマー特性に対する有害作用を避けるために、照射線量は3Mradを越えないことが好ましい。その後この製品を、使用時まで滅菌包装中に貯蔵する。このヒドロゲル組成物は、組織培養品質であり、かつ
無菌的に維持される。このヒドロゲルにOPCを導入し、かつ該インプラントは、汚染を防ぐために手術室に配置される。

【０１７６】実施例23 薬物動態学的測定 hOPCおよびPLG-ヒドロゲルを伴うrhBMP-2の選択された用量の組合せをスクリーニングし、所望の期間での骨形成の促進に必要なrhBMPの至適用量を決定することができる。様々な用量のrhBMP-2は、用量−依存型の骨芽細胞-様細胞マーカ
ーの発現を引き起こし、これは薬物動態を決定することを可能にする。

【０１７７】先に示したチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞発現システムを使用し、rhB
MP-2を、グリコシル化された32-kDaのホモダイマーとして生成する。このアミノ
酸配列および糖質の位置は、Rosenらの論文（Trends in Genetics, 8:97-102(19
92)）およびWozneyの論文（Progress in Growth Factors, 1:267-280(1989)）に
従い決定されている。rhBMP-2は、無菌的に調製し、滅菌ガラスバイアル中に入れ、ゴム栓で密閉し、かつ凍結乾燥する。

【０１７８】このrhBMP-2を、ショ糖／アルギニン(SA)緩衝液中のカルボキシメチルセルロース(CMC)中、または、I型熱硬化性コラーゲン(COL)中のいずれかの多孔質ポリマーに添加することができる。CMCは、既知量のrhBMP-2を伴う粘性液体として調
製される水溶性巨大分子であり、この溶液はその後多孔質ポリマーマトリックス
を含浸するために使用される。更にショ糖／アルギニン(SA)緩衝液は特にrhBMP を安定化するので、この緩衝液をこの方法で調製し使用する。

【０１７９】層流フード内の無菌条件下で、既知濃度のrhBMP-2/CMC、rhBMP-2/SA、またはr
hBMP-2/COLを、ポリマー「表層」またはラミネート「シート」に塗布し、かつこ
のポリマーに圧力をかけ、均質性を高め、かつ細孔含浸およびポリマー吸着によ
り充填を完了する。この含浸したrhBMP-2/PDS成分を乾燥し、かつ使用時まで無菌バイアル中に保存する。

【０１８０】 PDSからのrhBMP-2放出の薬物動態を、125I-標識したrhBMP-2（Genetics Insti
tute、ケンブリッジ、MA.から入手したもの、または市販のヨウ素化試薬を用いて製造したもの）を用いるか、またはELISAにより測定する。Thiesらの方法（En
docrinol., 130:1318-1324(1992)）に従い、既知濃度の125I-rhBMP-2を、前述の
多孔質ポリマーに添加した。中点値薬理活性(mid-point pharmacologic activit
y)のための125I-rhBMP-2の充填は、例えば100μg 125I-rhBMP-2／100mm²ラミネートシートで行わなければならない。推定される薬用量の各側面における３種の
ひとまとめにされた用量は以下を含む：rhBMP-2が、0、10、50、200、400および
800μg。充填されたポリマーシートの各型を、10倍過剰量のPBS＋1％ BSAを含む
適当なバイアル中に入れ、37℃で回転運動させゆっくり攪拌する。PBS溶液を、下記の時点で、γ線の計数のために取り除き、新鮮な緩衝液に交換する：1、2、
4、8、12時間；1、2、4、5、7、14日目。全ての試料を計数し、125I-rhBMP-2の累積放出の割合を決定する。残留しているポリマーを物質収支を決定するために
溶解する。

【０１８１】線形回帰および直交対比（すなわちFishers PLSD）を行い、インビトロにおけ
る最適の薬物動態プロファイルを生じるrhBMP-2用量を決定する。

【０１８２】更にインビボ法を用いて、rhBMP-2用量を決定する。PL円盤（直径8mm）には、
rhBMP-2の0、10、50、または100μg、またはラットの脱塩した骨マトリックス(D
BM)のいずれかを充填し、かつ35日齢のLong-Evansラット54匹の大胸筋に移植する。移植の4週間後、レシピエント部位を回収し、先に報告した放射線形態計測および組織形態計測で解析した（Mardenら、Calcif. Tissue. Int., 53:262-268
(1993))。

【０１８３】実施例24 インプラントのインビトロスクリーニング CCDおよびIPL装置を、インビボ試験の前に設定した、組織培養において最適化
し、複数の構造を、4、15および30日目に、細胞増殖、骨芽細胞表現型、および無機化する能力について評価する。試験することができる変種の例を表９に示す
。

【０１８４】

【表９】インビトロにおけるアッセイ

【０１８５】 OPC-充填したインプラントは、組織培養培地に添加されたテトラゾリウム塩を
切断する生存可能な細胞数を決定するWST-1(Boehringer Mannheim, Inc.)のよう
な非破壊比色アッセイ法を使用し、細胞増殖について評価することができる。生
成されたホルマザン色素の量は、この培養システム中の代謝活性のある細胞の数
に直接相関している。加えて、無機化、APase発現、ならびにオステオカルシン、オステオネクチン、PTH受容体、およびI型コラーゲン（プロコラーゲン）に関
するPCR表現型決定のような骨芽細胞マーカーをスクリーニングすることができる。

【０１８６】実施例25 無胸腺ラットにおけるインプラントの使用本実施例のインプラントは、インプラント（多孔質ポリマーまたはゲル成分な
ど）に含浸されたrhBMP-2の既知の用量を、BMP-2を発現するように操作されたhO
PCの積荷(cargo)と共に含有する。本実施例は、無胸腺ラットにおいて、このインプラントが、hOPCおよびrhBMP-2を異所性創傷へと送達し、異所性骨化（骨誘導）を、該インプラントによって提供される外来性BMP用量に応じた量で促進することができるを示している。

【０１８７】手術室において、無菌的に調製されたrhBMP-2の既知の用量が、ラミネートま
たは表層装置の予め測定されたラミネートに添加される。このインプラントは、
各大胸筋を覆う組織中に皮下的両側性に配置される。14および28日後に、ラット
を安楽死させ、インプラントを回収し、かつ70％エタノール中に24時間放置した
。先に記したように、インプラントに定量的X線撮影および組織形態計測を行い、異なる処置により誘導された骨量を決定する。

【０１８８】インビボ骨誘導は、表10にまとめた下記実験に従い、rhBMP-2／担体の薬物動態学的プロファイルに関連付ける。

【０１８９】

【表１０】無胸腺ラットのインビボ骨における情報

【０１９０】これらの実験のデータは、骨誘導に対する様々なrhBMP-2の用量−反応曲線の決定を可能にする。しかし骨形成は、解剖学的位置および種によって変動した。

【０１９１】同様の試験を、イヌ、サル、ヒトおよび他の種について、様々な部位で行い、
BMPのそれぞれの型が発現するOPCの至適用量、およびインプラントにおいてOPC の活性化のために多孔質ポリマーマトリックス中に入れられるBMPの至適量（必要ならば）を決定することができる。

【０１９２】骨誘導性反応を評価する他の技法は、放射線形態計測および組織形態計測を含
む。

【０１９３】放射線形態計測標本を、70％エタノール中に24時間静置した後、X-OMAT（登録商標）TL高コン
トラストX線フィルム（Eastman Kodak Company、ロチェスター、NY)を用い、Mim
shotベンチトップキャビネット(TFI Corporation、ウェストヘブン、CT) 内で、
25 KVp、3Ma、10秒間、放射線撮影する。各X線像を、標本に重ねられた標準の参
照フレーム内で放射線不透過性について評価する。ライカ970画像分析システム(
Leica Instruments Inc.、ケンブリッジ、英国)で、放射線不透過性面積を測定する（フレーム総面積に占めるパーセンテージで示す）。

【０１９４】組織形態計測放射線写真を撮影した後、標本を脱水し、エタノール濃度を高め、その後ポリ
（メチルメタクリレート）中に包埋し、かつ4.5μmの冠状断面切片を作製し、Go
ldner-Massonトリクロム染色液（光学顕微鏡ならびに細胞および基質の詳細な検
証のため）およびフォン・コッサ染色液により染色した。フォン・コッサ染色し
た組織標本は、Zeiss Axiophot顕微鏡(Zeiss Instrument Company, Inc.、NY、N
Y)に接続したライカ970画像分析システムを用い標準倍率で、定量的に骨を評価する。容認された画像増強法（全ての標本について標準化）を用い、全ての切片
について一貫性のあるグレーレベルを選択することによって、線維性結合組織、
軟骨、骨および細胞の特徴について満足できる光学的コントラストを達成する。

【０１９５】実施例26 無胸腺ラットにおける頭蓋冠の臨界寸法欠損部のインビボ再生本実施例は、無胸腺ラットの頭蓋冠の臨界寸法欠損部への、特異的インプラン
トであるポリ(D,L-ラクチド)単独またはrhBMP-2、OPC、もしくはrhBMP-2およびO
PCの存在下での、投与について説明する。

【０１９６】骨インプラントを、ポリ(D,L-ラクチド)(PL)(670kDa；0.8iv)（THM Biomedica
l, Inc.（ダルース、MN）からの寄贈、本来Sofamor Danek（メンフィス、TN)社製）から製造した。溶媒および試薬は全てACS等級であり、特に記さない限りは、Fisher, Inc.から購入した。PLを塩化メチレンに溶解し、無水メタノール中で
沈殿し、真空乾燥し、精製した。精製後、金属ナトリウム上で還流し蒸留したジ
オキサンを用いて、PLを溶解し濃度0.01g/mL（室温）とした。このPL溶液(80 mL
)を、直径15cmの結晶皿に注ぎ、-20℃で凍結した。溶媒を、真空下(＜50mTorr(6
.65Pa))0℃で3日間かけた凍結乾燥により除去した。形成されたPLシートを、各々23、30および37℃で12時間温め、溶媒除去を確実にした。

【０１９７】直径8mmの円盤をPLシートから調製し、8-10/容器に入れ、Sterrad（登録商標）100滅菌装置中で過酸化水素プラズマガス(58％)を用いて、以下のサイクルで滅菌した：真空ステージ、297mTorr(40Pa)で7分間；射出ステージ、7Torr(931Pa
)で6分間；拡散ステージ、9.2Torr(1220Pa)で44分間；プラズマステージ、497mT
orr(66Pa)で16分間；排気ステージ、4分間。この装置は、移植前に４日間脱気す
ることができる。各試行の無菌性は、米国医療用具協会(American Association
of Medical Instrument)(AAMI)の生物学的規格(Biological Standard)により決定した。試行の最高温度は43℃であった。

【０１９８】精製したrhBMP-2（＞98％；ロット番号0213J01、Genetics Institute（アンド
バー、MA）の提供）を、実施例23に記したように作製した。製造業者の指示に従
いグルタミン酸ナトリウム緩衝液(5mM、pH5.5)中で再構成した後、滅菌ガラスバ
イアル中で適当に希釈し、ゴム栓で封をし、かつ無菌的に取り扱った。rhBMP-2 投与量を決定するために、PL円盤を用いるインビボアッセイ法（実施例23を参照
のこと）を行った。データ解析には、用量50μgが都合がよい。

【０１９９】手術の３時間前に、滅菌したPL円盤を、70％イソプロパノールで予め15分間湿
らせ、かつフィルター滅菌し蒸留した脱イオン水で２回（各10分間）掃流し、表
面の疎水性を低下した。このPL円盤を、HEPES-緩衝したEBSS、pH7.4で30分間洗浄した。手術の２時間前に、液体容量22μLをPL円盤に添加し、以下の４処置物を調製した：1)PLC：グルタミン酸ナトリウム緩衝液(5mM、pH6.0)11μLに混合し
た、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を溶媒とするI型ウシの皮膚コラーゲンマトリッ
クスであるVitrogen（登録商標）（Collagen Corp., パロアルト、CA)3mg/mL、
pH7.0の11μL；2)PLC/OPC：グルタミン酸ナトリウム緩衝液(5mM、pH6.0)11μL中
、Vitrogen（登録商標）11μL 、2 x l0⁵ OPC；3)PLC/rhBMP-2：グルタミン酸ナ
トリウム緩衝液(5mM、pH6.0)中、Vitrogen（登録商標）11μL、50μg rhBMP-2 1
1μL；および4)PLC/OPC/rhBMP-2：グルタミン酸ナトリウム緩衝液(5mM、pH6.0)1
1μL中、Vitrogen（登録商標）11μL、50μg rhBMP-2 11μLと共に、2 x 10⁵ OP
C。

【０２００】骨のバイオミメティック装置を、Sigmacote（登録商標）で処理する前にペトリ皿に配置し、非特異的rhBMP-2の吸収を阻害し、引き続き移植前に加湿した37 ℃のインキュベーターに90分間放置し、Vitrogen（登録商標）を熱ゲル化にした
。骨インプラント装置を無菌的に、移植のために手術室に移した。

【０２０１】無菌操作に従い、頭蓋冠骨に直径8mmの欠損部を8mmトレフィンで形成し、生理
食塩水で多量の灌流を行った。付着した骨膜を伴う開頭術切片をゆっくり剥がし
、硬膜を完全に残し、１〜４に指示した処置物を挿入した。PLCインプラントを、軟組織が取り囲む部位に保持し、これを4-0縫合糸で閉じた。ラットを、術後２および４週間目に安楽死させ、頭蓋冠切除術(calvarectomy)を行い、かつ組織
を調製し、実施例25に示したように、放射線形態計測および組織形態計測につい
て評価した。データを、多重比較に関する多次元分散分析(ANOVA)およびフィッシャーの保護された(protected)最小有意差検定により解析し、処置法間および時間の差異を決定した。統計的有意差は、p≦0.05とした。

【０２０２】二次加工したPLは、開放細孔メッシュワークの内部連結を示し、このことは浸
透、増殖および分化のための細胞のアクセスを可能にした。直径8mmのPL装置は、平均単位質量21.7mgおよび空隙率約85〜90％を有した。PL足場の定量的走査型
電子顕微鏡(SEM)による評価は、50〜250μmの間の細孔を有する多孔構造を明らかにした。プラズマガス滅菌は20〜25％の縮みを生じるにもかかわらず、湿潤お
よび再水和後、足場はそれらの滅菌前の構成(architecture)および形態を再度得
ていた。

【０２０３】実験の骨インプラントは、手術時で管理し易く、かつ開頭術欠損部に容易に挿
入され、骨辺縁に保持され、止血管理ができ、かつ軟組織の脱離が防止された。
本試験の経過を通じて死亡例は生じず、組織癒合は顕著ではなかった。

【０２０４】２週目までに、PLC/OPC、PLC/rhBMP-2およびPLC/OPC/rhBMP-2処置群は、PLC単
独と比べより多くの放射線不透過性を示した。この結果は、放射線形態測定デー
タで確認された（図8)。PLC/OPCは、平均放射線不透過性が38％であるのに対して、PLCは22％を示した。PLC単独よりも優れた放射線不透過性は、PLC/rhBMP-2 およびPLC/OPC/rhBMP-2についても認められた。２週目の組織学的分析は、PLCま
たはPLC/OPCのいずれかで処置した欠損部にいくつかの新生骨形成を示し、線維性組織が支配的であった。PLC/OPC-処置部位において、多くの多核性巨大細胞が
認められた。PLCの残余は、明視野顕微鏡法または偏光顕微鏡法のいずれにおいても検出されなかった。PLC/BMP-2およびPLC/BMP/OPCが移植された欠損部は、多
数の骨性小柱(bony trabeculae)、より多量の新生骨、更には硬膜面に沿った層板骨の硬着(consolidation)を有した。新生骨形成に関する組織形態測定データは、組織学的観察(図9)で裏付けられた。

【０２０５】４週目までに、PLC/OPC、PLC/rhBMP-2およびPLC/OPC/rhBMP-2処置は、PLCより
も多くの放射線不透過性を有した。PLC/rhBMP-2は、他の群よりも有意に高い割合の放射線不透過性を有した(図8)。加えて、PLC/OPC/rhBMP-2は、PLCまたはPLC
/OPCのいずれよりも有意に大きい放射線不透過性を有した。更にPLC/rhBMP-2で処理した欠損部は、２から４週間にかけて放射線不透過性の割合は時間依存型の
増加を示した。４週目の処置間の組織学的プロファイルは、２週間目のプロファ
イルよりも類似していた。しかし、PLC/BMPおよびPLC/BMP/OPC群に関する新生骨
の量は、２週目よりも大きく(図9)、かつ４週目のPLC/BMP/OPCにおける新生骨の
出現は、２週目の同じ処置よりも更に層板状であった。多核性巨大細胞は、PLC/
OPC-処置した欠損部において４週目に明らかであったが、この細胞表現型は、４
週目のPLC/BMP部位およびPLC/BMP/OPC部位には見られなかった。これらの結果は
、無胸腺ラットの頭蓋冠CSDにおいて、組織-操作した骨インプラントは、時間に
依存した骨再生を促進することを示している。

【０２０６】４週目のPLC/OPCは、反応を強固なものとして示唆することはなかったが、l0⁵ から10⁶まで（１対数の増加）から細胞負荷を高めることにより、より多く骨形成されると予想される。加えて、PLC/OPC/rhBMP-2の反応は、OPC量の対数増加に
より増強することができる。播種密度2 x 10⁵ OPC／骨インプラントを用いたが、これはこれまでの研究で移植された細胞量よりもかなり少なかった：W-20-BMP
-2産生細胞については5 x 10⁶を、無胸腺ラットの 8mmの大腿ギャップモデルに移植し(Liebermanら、J. Orthop. Res.、16:330-339(1998))、ヒトMSCについては7.5 x 10⁶を、無胸腺ラットへセラミックス担体と共に送達し、かつイヌMSCに
ついては7.5 x 10⁶を、イヌの大腿部ギャップモデルへセラミックスと共に適用した(Bruderら、J. Bone Joint Surg.、80A:985-996(1998))。結果的に、OPC細胞密度の対数増加は、骨再生に対するPL/OPCおよびPL/OPC/rhBMP-2の両方の作用
を増強し得る。

【０２０７】結論として、本実施例は最初に、PLC/OPCまたはPLC/OPC/rhBMP-2の組合せが、
頭蓋冠CSDにおいて骨を再生することができることを示している。未処置のCSDは
本実験デザインではなかったが、実質的な明確に報告された以前のデータは、ラ
ットにおける未処置の直径8mmのCSDが新生骨形成で修復されないことを明確かつ
明瞭に確認している。

【０２０８】実施例27 OPCの内視鏡送達本実施例は、骨性欠損部を修復するかもしくは骨減少領域における密度の高い
骨の増殖を促進するために、OPCを骨へ送達するための改善された方法および内視鏡装置を明らかにしている。この方法の概略は図4〜6に示しているが、これら
は、カニューレ42、内視鏡46および／またはバルーンカテーテル48を使った、骨
粗しょう症性の脊柱(vertebral trabeculae)領域24へのOPCの導入を例示している。図10A-10Dはこのような装置の具体的な態様を示している。

【０２０９】 OPCの送達図4Aは、低密度の海綿質の骨（柱）部分24を取り囲んでいる皮質22を含む脊椎
20を示している。各椎は、椎弓根(pedicle)26、横突肋骨窩(transverse process
)28、棘突起(spinous process)30、および椎弓根26と棘突起30の間に広がる椎弓
板(lamina)31を含んでいる。これらの構造は、脊髄32をとりこ囲みかつ封入して
いる脊椎管を形成し、脊髄の繊細な神経組織の損傷を避けるための保護器となっ
ている。図4Aは、椎体20中の海綿質の骨24が密度が低くなっている（椎体の海綿
質の骨24の部分36は顕微鏡写真の引伸印画に示す）骨粗しょう症性椎体20を例示
している。この骨密度の喪失は、椎体20を、疼痛を伴い、脊柱の圧迫に寄与し、
かつ神経損傷を随伴する脊髄損傷につながり得るような病的骨折を起こしやすく
する。

【０２１０】本発明のOPCを椎体の海綿質の骨24へ送達するために、硬質で鋭端を備えた器具（図4AのKワイヤ40など）を、皮膚を通しかつ椎弓根26の骨へと、もしくは、側方椎壁(vertebral wall)22へと、経皮的に導入する。Kワイヤ40を配置した後、この管を硬質カニューレ42の直径まで拡張器で拡張する。次にカニューレ42を
、Kワイヤ40の外側に挿入し、かつKワイヤ40を取り除き、カニューレ42を残し、
椎体20への経路を形成する。カニューレ42を通じて内視鏡ドリル44を導入し、椎
弓根26を通って椎体20への経路を穿孔する(図4B)。側方のアプローチが選択され
た場合は、ドリルは、椎体の側方皮質壁22を侵攻するようにする。

【０２１１】カニューレ42は、内視鏡ドリル44と共に、椎弓根26または側方椎壁22を通って
、椎体の海綿質の骨24に出会うまで進める。内視鏡ドリル44は、特別な構造のド
リルであり、ドリルビットの中心に小さい光ファイバー内視鏡を有する。この内
視鏡ドリル44は、使用者が、ドリルの侵入経路を目視することを可能にし、その
結果ドリル44は、高度に制御された方法で、椎弓根26または椎壁22を通って進行
する。これは、脊髄32または神経根の損傷につながり得る椎孔または脊柱管への
侵入の可能性を制限する。

【０２１２】図4Cは、操縦可能な内視鏡46のカニューレ42を使った椎体20への導入を示して
いる。バルーンカテーテル48を、椎体の海綿質の骨24へと、操縦可能な内視鏡46
を通して導入する。このカテーテル48の経路は、操縦可能な内視鏡46により導か
れるであろう。バルーンカテーテル48は１個以上の側方開口部50(図5および6)を
有し、これを通じてOPCが椎体の海綿質の骨24に送達される。開口部50は、細胞の生理的破壊を伴うことなく、内視鏡／カテーテルユニットからの細胞の自在経
路を提供するのに十分な大きさの寸法（例えば内径20μm）を有する。一旦バルーンカテーテル48を、椎体20の適当な予め定められた位置に内視鏡により導いた
後、バルーンカテーテル48を通して海綿質の骨24へとOPCを送達することができる。細胞は、バルーンカテーテル48を通って伸びるオーガー機構(図1OB)により操縦可能な内視鏡46を通ってゆっくり移動する、ヒドロゲル中、またはリン酸カ
ルシウムを主成分とした市販の「セラミック」調製物（例えばBone Source（登録商標）HAセメント、LEIBINGER社製（ダラス、TX）またはAlpha BSM（登録商標
）、ETEX Corporation（ケンブリッジ、MA）製）中に懸濁された状態で導入され
る。あるいは、OPCは、保護的表層コアまたはマルチ-ラメラマトリックス態様中
に配置し（円形断面を持つ脊髄の損傷）、かつバルーンカテーテル48を通じて導
入される。このマトリックス態様は、OPCがバルーンカテーテル48を通過し、かつ骨に導入される際に、更にOPCを保護する。

【０２１３】図4CにおいてOPCが既に付着した領域は黒点で示し、かつこの領域の顕微鏡写真の引伸印画は、脊柱24が、OPC（またはインプラントマトリックス）が支持された多孔質構造を提供していることを示している。バルーンカテーテル48を進め
かつ引き抜くことで、椎体20全体に複数の間隔を置いた位置または所定の位置に
OPCを付着することができる。必要に応じて、バルーンカテーテル48を膨張すること、または操縦可能な内視鏡46をフロントガラスのワイパー様に動かすことに
よって、カテーテル先端近傍の海綿質の（柱）骨24をゆっくり圧迫することがで
きる。この局所的椎骨の圧迫により、大きい陽圧の下で細胞のバルーンカテーテ
ル48から骨性マトリックスへの細胞の排出を強制するのに必要なバルーンカテー
テル48内に過剰な背圧を生じることなく、その中にOPCを導入することができるような小腔が形成される。

【０２１４】この操縦可能な内視鏡46は、内視鏡の位置の方向を決定するために、外部コン
トロールの操作により方向付けることができる柔軟な先端を有する。図6に示したように、次にバルーンカテーテル48を、操縦可能な内視鏡46を通じて、それが
OPCが付着される位置に到達するまで進めることができる。この位置で、バルーンカテーテル48の先端を膨らませ、周囲の骨を穏やかに圧迫する。バルーンをし
ぼませ、開口部50を通じてOPCが導入される小腔を残す。その後バルーンカテーテル48を操縦可能な内視鏡46を通じて抜管し、かつその後内視鏡をカニューレ42
を通じて抜管する。

【０２１５】実施例28 具体的な送達の態様 OPCを骨に送達するための同軸性の(coxaxial)カニューレ100の特定の態様を、
図10Aに示す。一旦内視鏡ドリルが椎体20の骨へのアクセスポートに到達したならば、同軸性カニューレ100が、カニューレ42を通じて椎体20へ導入される(図4B
)。この同軸性カニューレ100は、いずれか適当な滅菌可能な材料（例えば、プラ
スチックまたはステンレス鋼）で製造することができる。このカニューレ100は、内部（中心）管腔102の境界を示している円筒形の内壁101およびこの内壁101 と同軸である円筒形外壁103を有し、その結果外側（周囲）管腔104は、内壁と外
壁の間に限定されている。外側管腔は、実質的にカニューレ100長に沿って、縦方向にまたはらせん状に伸びている連続する仕切り114、116、118および120によ
り、セクション106、108、110および112に分割されている。図示したカニューレ
100は、４個のセクションに分割された外側管腔を有している。この数は、小は２セクションから無限大であることができる。内側管腔および外側管腔のセクシ
ョンは、カニューレ100を通じての縦方向の通路として利用される。

【０２１６】操縦可能な先端124(図1OD)を具備する操縦可能な内視鏡122(図10C)は、カニュ
ーレ100の内側管腔102を通じて導入される(図10A)。特定の態様において、内視鏡122の管腔を通じてOPCを導入することができる。内壁と外壁の間のカニューレ
セクション(図1OA)は、圧縮空気および骨髄(bone barrow)／血液が、椎体20(図4
)に導入されるOPCの圧力障害を妨げ、かつ静脈血栓を妨げることのないようにす
る。

【０２１７】別の送達システムの態様を図1OBおよび1ODに示しているが、ここでは操作可能
な内視鏡122が、内側カートリッジユニット126と共に提供されている。このカー
トリッジユニットは、らせん状のスクリュー／オーガー130を含む軟質の管状の外側本体またはカニューレ128に連結された貯蔵部134で構成されている。オーガ
ー130は、オーガーの回転でカニューレを通じて液状または粒状の物質を運搬することができるカニューレ128の内径に関して十分な直径を持つ。図1ODに示され
たように、同軸カニューレ100は、操作可能な内視鏡122を具備し、これは更にカ
ートリッジユニット126のカニューレ128を具備する。これらの構成部品を一緒に
用いると、圧力はカニューレ100の外側管腔104を通じて排除されるので、骨に過
剰な圧力がかかる（これはOPCを損うか、もしくは、静脈血栓を引き起こす）ことを避けることができる。

【０２１８】カートリッジユニット126にOPCを充填する。手動またはモーターのいずれかに
よりオーガースクリュ130を回転(図10B)し、OPCを徐々に椎体24へと進めていく(
図4)。らせん状スクリュ130は、撚線(twisted- in wire)または他のスクリュ− ブラシの形状で製造することができる。オーガーを製造する材料は、滅菌されな
ければならず、かつOPCを損なってはならない（ステンレス鋼、プラスチック、または他の材料であることができる）。オーガーは柔軟であるので、操縦可能な
内視鏡122内で曲がることができる。オーガーが操縦可能な内視鏡122内で曲がる
際にカニューレ128内でへこまないように維持するために、スクリュブレードまたはブラシブリストルの部分は硬質材料で製造され、その結果カニューレ128の中程でのオーガーの位置が維持される。

【０２１９】あるいは、カートリッジユニット126は、体内のいずれかの骨の海綿質の構成要素へ投与することができる非常に広い範囲の生物学的化合物、プラスチック、
または他の材料を送達するために使用することができる。加えて、カートリッジ
ユニット126は、材料を生体内のいずれかの骨に、内視鏡を使わず直接送達するために使用することができる。例えば、カートリッジユニット128は、骨髄を送達するために使用することができる。

【０２２０】実施例29 BMP発現システム組換えBMPの産生に使用することができる様々な発現システムを、表11に示した。

【０２２１】

【表１１】

【０２２２】本発明者らの発明の原理が適用される多くの可能性のある態様に関して、例証
された態様は、単に本発明の好ましい実施例であり、本発明の範囲を限定するも
のではないことは理解されなければならない。むしろ、本発明の範囲は、下記の
クレームにおいて限定される。従って本発明者らは、これらの特許請求の範囲お
よび精神において明らかになる全てを本発明者らの発明として請求するものであ
る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、本発明に係る皮層コア装置（cortex core device）（CCD
）インプラントの製造、および下顎骨中の重大な大きさの欠損部へのその移植の
方法の模式図である。

【図２】図2は、本インプラントの一体型ポリマー多層（IPL）態様の製造
、および下顎骨中の重大な大きさの欠損部へのその移植の方法の模式図である。

【図３】図3は、プラスミドpMX1-sv40T-Neo-195の模式図である。

【図４】図4A、4B、4Cおよび4Dは、骨粗鬆症性脊椎にOPCを導入するための開示される方法におけるいくつかの段階の模式図である。

【図５】図5は椎体の平面図であり、椎弓根を介して導入された中空カニューレを、カニューレを通じて導入された内視鏡およびバルーンカテーテルとと
もに示している。

【図６】図6は図5と同様の図であるが、周囲の骨減少性椎骨を圧迫するた
めに拡張したバルーンカテーテルを示している。

【図７】図7は、プラスミドhCNTF-pNUT-DNTの模式図である。

【図８】図8は、PLCのみ、PLCおよびOPC、PLCおよびrhBMP-2、またはPLC 、OPCおよびrhBMP-2という4種類の治療のうちいずれか1つを受けた無胸腺ラット
での、頭頂骨の重大な大きさの欠損部における骨治癒に関するX線形態計測学的解析の結果を表すヒストグラムである。

【図９】図9は、PLCのみ、PLCおよびOPC、PLCおよびrhBMP-2、またはPLC 、OPCおよびrhBMP-2という4種類の治療のうちいずれか1つを受けた無胸腺ラット
での、頭頂骨の重大な大きさの欠損部における骨治癒に関する組織形態計測学的
解析の結果を表すヒストグラムである。

【図10A】図10Aは、内部チャンネルが内視鏡の進入路を提供し、同軸の外
部チャンネルがその内部を通じてOPCを導入しうる構造を提供する、カニューレの模式図である。

【図10B】図10Bは、オーガー機構を用いるOPC送達用のカートリッジユニットを示す模式図である。

【図10C】図10Cは、10Aのカニューレを通じて挿入された内視鏡を示す模式図である。

【図10D】図10Dは、オーガー機構によってカートリッジから骨内へのOPC の制御的送達を行うための、図10Aのカニューレ内に挿入された図10Bのカートリ
ッジユニットを示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｌ 27/00 Ａ６１Ｌ 29/00 Ｚ４Ｃ０８４ 29/00 Ａ６１Ｐ 19/00 ４Ｃ０８７Ａ６１Ｐ 19/00 19/10 ４Ｃ０９７ 19/10 Ｃ０７Ｋ 14/51 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 14/51 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ウィンシェリーアール．アメリカ合衆国オレゴン州テュアラタンエス．ダブリュ．ティラムックコート 20104 (72)発明者フランクエドモンドアメリカ合衆国オレゴン州ポートランドエス．ダブリュ．ヒュエットブールバード 5144 (72)発明者ウォンシュウシー．アメリカ合衆国カリフォルニア州ロスアラミトスドニーアンロード 3361 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 BA80 CA04 CA07 DA03 EA04 GA11 HA17 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C060 LL20 MM24 4C076 AA95 BB32 CC30 EE10 EE43 FF32 4C081 AB04 BA12 CD122 CD34 CF012 DC01 4C084 AA02 BA44 DB60 MA02 MA67 NA14 ZA961 ZA971 ZB211 4C087 AA01 AA02 BB63 MA02 MA67 NA05 NA14 ZA96 ZA97 ZB21 4C097 AA01 DD15 EE08 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA01 EA20 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項1】多孔質基質、および骨形成性細胞系（osteogenic lineage）への分化を運命づけられた治療的有効量の細胞を含む、骨欠損を治療するための
組成物。
【請求項2】骨形成性細胞系への分化を運命づけられた細胞が、骨形成性前駆細胞系1（OPC1）を特定する特徴を有する条件的不死化骨芽細胞前駆細胞である、請求項1記載の組成物。
【請求項3】骨形成性前駆細胞による骨形成を誘導する治療的有効量の骨誘導因子（BMP）をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項4】 BMPがBMP-2である、請求項3記載の組成物。
【請求項5】 BMP-2がOPC1によって治療的有効量として発現される組換えBM
P-2である、請求項4記載の組成物。
【請求項6】多孔質基質がポリ(D,L-ラクチド)およびコラーゲンを含む、請求項1記載の組成物。
【請求項7】請求項1記載の組成物を欠損部に導入することによる、骨欠損
を治療するための方法。
【請求項8】請求項2記載の組成物を欠損部に導入することによる、骨欠損
を治療するための方法。
【請求項9】請求項3記載の組成物を欠損部に導入することによる、骨欠損
を治療するための方法。
【請求項10】請求項4記載の組成物を欠損部に導入することによる、骨欠損を治療するための方法。
【請求項11】請求項5記載の組成物を欠損部に導入することによる、骨欠損を治療するための方法。
【請求項12】請求項6記載の組成物を欠損部に導入することによる、骨欠損を治療するための方法。
【請求項13】骨形成性細胞系への分化を運命づけられた細胞であってその
細胞による骨形成を誘導する骨形成性の骨誘導因子（bone morphogenetic prote
in）を発現する細胞を欠損部に導入することによる、骨欠損を治療するための方
法。
【請求項14】骨誘導因子がBMP-2である、請求項13記載の方法。
【請求項15】細胞が条件的不死化を受けた骨芽前駆細胞である、請求項13
記載の方法。
【請求項16】 OPC1を特定する特徴を有する、条件的不死化骨芽細胞前駆細
胞。
【請求項17】多孔質で骨導性で生分解性の保護成分によって保護される緩
衝成分を含む、骨欠損領域に骨形成性前駆細胞を投与するためのインプラント。
【請求項18】緩衝成分がヒドロゲルであって、多孔質で骨導性で生分解性
の保護成分がポリ(α-ヒドロキシ酸)基質である、請求項17記載のインプラント。
【請求項19】保護成分中に骨形成性骨誘導因子を浸透させた、請求項17記
載のインプラント。
【請求項20】骨形成性前駆細胞が、その骨形成性前駆細胞による骨形成性
分化および骨形成の促進のために十分な治療的有効量の骨誘導因子を発現させる
ためのベクターによるトランスフェクションを受けている、請求項17記載のイン
プラント。
【請求項21】骨形成性前駆細胞の供給物、および骨形成性前駆細胞を骨内に送達するためのカニューレを含む、骨を治療するための器具。
【請求項22】請求項17記載のインプラントを送達するための大きさおよび
形状を有するカテーテルを含む器具。
【請求項23】内視鏡を含む、請求項21記載の器具。
【請求項24】骨形成を促進する材料を骨内に送達することを含む、骨欠損
の治療の方法。
【請求項25】材料が、骨誘導因子の発現のためのベクターが導入された不
死化骨芽細胞前駆細胞である、請求項24記載の方法。
【請求項26】材料が、外因性の治療的有効用量の骨芽細胞前駆細胞および
骨形成の促進に有効な1種類の骨誘導因子を含むインプラントである、請求項24 記載の方法。
【請求項27】骨欠損が、骨粗鬆症、嚢腫状空洞、外科的切除、外傷性剥脱
および先天性不全によって引き起こされた、請求項24記載の方法。
【請求項28】中央の管腔および周辺の管腔を含むカニューレ。
【請求項29】周辺の管腔が複数の小管腔（lumena）を含む、請求項28記載
のカニューレ。
【請求項30】カニューレ、ならびに周辺部にらせん状ねじを有する回転可能な構成部分（rotatable member）であ
って、カニューレから伸びる回転可能な構成部分を含む、カートリッジユニット。
【請求項31】回転可能な構成部分を回転させるための駆動体をさらに含む
、請求項30記載のカートリッジユニット。
【請求項32】骨芽細胞前駆細胞をらせん状ねじに供給するためにカニュー
レの一端に取り付けられた貯蔵槽をさらに含む、請求項30記載のカートリッジユ
ニット。
【請求項33】生きた対象の体内の領域に流動性物質を送達するための方法
であって、カニューレが体外の位置から体内の標的位置まで伸びるように、外部カニュー
レ（outer cannula）を体内に挿入すること、複数の長軸方向通路が区分けされた内部カニューレ（inner cannula）を外部カニューレ内に設置すること、通路の1つを通して体内に流動性治療物質を流し込み、同時に別の通路を通じて材料を体外に流出させることを含む方法。