JPH07101874A - 骨修復治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 骨形成因子を有効成分とする骨修復治療剤を
提供する。 【構成】 骨形成因子を有効成分とし、フィブリンを担
体とする骨修復治療剤であって、骨形成蛋白質含量がフ
ィブリン糊ゲル１ｍｌに対して４μｇ以上であることを
特徴とする治療剤。 【効果】 本発明により、骨形成因子を有効成分として
含有する骨修復治療剤の開発において、優れた骨形成能
を有する当該治療剤を提供することが可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨形成蛋白質の整形外
科又は歯科領域において有用な骨修復の治療への応用に
関する。即ち、本発明はバイオマテリアルとしての骨若
しくは歯の補強及び充填剤、又は骨折若しくは歯周病に
よる損傷骨の再生促進的機能を有する骨形成蛋白質を含
んだ骨の欠損部分若しくは骨折部位充填剤を提供するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】骨形成蛋白質はｉｎ ｖｉｖｏにおいて
異所性に骨形成を誘導しうる生理活性蛋白質であり、Ｂ
ｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ
（以下、ＢＭＰと略す）とも称され、通常は骨に蓄えら
れていると推測される。その作用機作としてはＢＭＰは
未分化な間葉系細胞に作用し、その細胞を骨芽細胞に分
化させ、その部位で新たな骨の形成を惹起すると考えら
れている。

【０００３】骨は臓器のなかでも高い再生能力を有して
おり、そのため骨移植は組織移植のなかでも頻度の高い
もののひとつであるが、これは上記のようにＢＭＰが通
常骨に蓄えられていることにも由来するものと思われ
る。臨床上、外傷に起因した骨の欠損、骨折の遷延治療
や偽関節置換術時及び骨腫瘍を切除したあとなどに施行
される。特に自家骨移植は組織生着率が高く、骨移植の
中でも望ましい方法のひとつである。しかしながら移植
骨を採取したあとには、骨の欠損部が生じるため人工材
料による填塞あるいは、止血を兼ねて生体材料（例えば
フィブリンなど）の利用が実用化されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】治療に適用される材料
としては、生体適合性が良く、且つ、生体分解性である
ことが望ましい。しかしながら、骨セメント、セラミッ
ク等の人工材料を使用した場合、これらは生体分解性を
持たないために代謝されることはなく、後年、生体適合
性等の問題が生じることが考えられる。

【０００５】そこで、生体中に存在するＢＭＰの手術部
位への適用が考えられるが、既に述べたようにＢＭＰ自
体が骨の形成を誘導しうる活性を有することが知られて
いても、実際に患部にＢＭＰを適用する場合にはＢＭＰ
単独ではその骨形成能が十分に発揮されないという欠点
を有する。そこで、ＢＭＰを生体中に除々に放出する、
所謂除放性を有し、且つ、骨を形成する細胞の足場とな
る生体材料、即ち担体の存在があって初めてＢＭＰの治
療への適用が実用的となる。

【０００６】今までの動物実験においては、ＢＭＰの担
体としては骨基質由来の材料が用いられてきた。例え
ば、コラーゲンを主体とする脱灰骨基質または精製コラ
ーゲンが用いられてきたが、ＢＭＰを含むコラーゲンを
乾燥状態で用いるために複雑な形状の骨欠損部等の患部
への適用は困難であった。

【０００７】一方、ＢＭＰの担体としてではなく、骨の
欠損部填塞材としてフィブリンを用いた場合、単独で十
分な骨形成能が得られるか否かについては議論が分れる
ところである（Ａｒｂｅｓ，Ｈ，Ｂｏｓｃｈ，Ｐ．，ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａｔ
Ｓｕｒｇ．，Ｖｏｌ．９８，Ｐ１８３−１８８，１９
８１；Ｚｉｌｃｈ，Ｈ ａｎｄ Ｗｏｌｆｆ，Ｒ．，
Ｚ．，Ｏｒｔｈｏｐ．，Ｖｏｌ．１２５，ｐ２１４−２
１８，１９８７；Ｒｅｃｋ，Ｒ．ａｎｄ Ｂｅｒｎａｌ
−Ｓｐｒｅｋｅｌｓｅｎ，Ｍ．，ＨＮＯ，Ｖｏｌ．３
７，ｐ１１２−１１６，１９８９）。 特に骨代謝の低
下している高齢者への適用は難しいと考えられる。ま
た、他の方法として填塞剤の十分な強度と骨形成を再現
するためフィブリンと海綿骨を組み合わせる方法が試み
られているが、この方法をもってしても旺盛な骨形成は
認められていない（中村巧：日整会誌（Ｊ．Ｊａｎ．Ｏ
ｒｔｈｏｐ．Ａｓｓｏｃ．），Ｖｏｌ．６６，ｐ７５
３．７６２，１９９２）。

【０００８】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
ＢＭＰとフィブリンとを組み合せることで上記の課題を
解決することを検討した。即ち、フィブリンが有する生
体適合性とＢＭＰが有する骨形成能を組み合せることに
より、欠損骨の修復により適した治療剤を提供すること
ができると考えた。

【０００９】ＢＭＰを含むと考えられる骨抽出画分とフ
ィブリンの組み合わせについてはこれまでも２−３報告
されている（中村巧：日整会誌（Ｊ．Ｊａｎ．Ｏｒｔｈ
ｏｐ．Ａｓｓｏｃ．），Ｖｏｌ．６６，Ｐ７５３−７６
２，１９９２）、服部寿門：日整会誌（Ｊ．Ｊａｎ．Ｏ
ｒｔｈｏｐ．Ａｓｓｏｃ．），Ｖｏｌ．６４，ｐ８２４
−８３４，１９９０）。

【００１０】しかしながら、いずれも牛骨から抽出した
粗精製のＢＭＰ標品を用いているためＢＭＰ自体の至適
濃度については言及されておらず、例えば、フィブリン
０．０８ｍｌに対し、５ｍｇの「蛋白」が必要であると
報告されているのみである（中村巧：日整会誌（Ｊ．Ｊ
ａｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ａｓｓｏｃ．），Ｖｏｌ．６６，
ｐ７５３−７６２，１９９２）。更に、上記ＢＭＰ標品
中に存在する他のファクターが、それらが協調的に作用
しているにしろ又は抑制的に作用しているにしろ、関与
していることを完全に否定する証拠はない。

【００１１】本発明者らは、既に遺伝子組換えＢＭＰを
カイコ細胞を利用して発現する方法を確立することに成
功している。従って、高純度のＢＭＰを得ることが可能
であるために当該蛋白質とフィブリンとの組み合わせを
検討することにより本発明を完成した。即ち、本発明は
ＢＭＰを有効成分とし、フィブリンを担体とする骨修復
治療剤であって、精製されたＢＭＰがその活性を発現す
るのに必要な一定以上の含有量を含む骨修復治療剤であ
る。

【００１２】本明細書において、骨形成蛋白質（ＢＭ
Ｐ）とはｉｎ ｖｉｖｏにおいて骨形成を誘導しうる生
理活性蛋白質を意味し、当該活性を有する蛋白質であれ
ば特に特定されることなく用いることができるが、好ま
しくはヒト由来のＢＭＰ（以下、ｈＢＭＰと略す）、更
に好ましくはｈＢＭＰ２（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．８７，ｐ２２２０−２２２４，
１９９０）又はｈＢＭＰ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎ
ｄｃｒｉｎｏｌ．，Ｖｏ．５，ｐ１４９−１５５，１９
９１）を用いることができる。

【００１３】また、本明細書において記載されるフィブ
リンとは、既に医薬品として市販されている市販品と同
等の機能を有するものであればよく、遺伝子組換え型又
は天然型を問わず、フィブリノーゲンを酵素（通常はト
ロンビン）によりフィブリンに変換させ、止血・組織閉
塞の機能を有する材料をいう。

【００１４】本発明の態様の一例を以下に示す。まず、
ヒトＢＭＰ２又はヒトＢＭＰ４を５０ｍＭ ＨＣｌに溶
解し、トロンビン（最終濃度１０００単位／ｍｌ）・Ｃ
ａＣｌ_２溶液（最終濃度２０−４０ｍＭ）と混合する
（これをＡ液とする）。次にフィリノーゲン液（９０ｍ
ｇ／ｍｌフィブリノーゲン）を３０００ＫＩＵ／ｍｌの
アプロチニン液に溶解する（これをＢ液とする）。これ
らを使用部位にて混合するか、または予めＡ液、Ｂ液を
混合して生じたゲル状のフィブリンを、充填部位に詰め
ることにより骨修復の治療に用いることができる。

【００１５】本発明における重要な点は、フィブリンと
ＢＭＰの至適混合比を実験的に求めたことである。この
至適混合比が得られたのは、遺伝子組換え法によりＢＭ
Ｐを発現させ、その機能を保持したまま、ポリアクリル
アミド電気泳動上ほとんど完全に単一標品にまで精製で
きたからであり、その標品を使用することにより本発明
を完成するに至った。

【００１６】その結果、フィブリン５０μｌに対し２０
０ｎｇのｈＢＭＰ２を混合したペレットに異所性の骨形
成反応を認め、８００ｎｇ以上のｈＢＭＰ２を含有させ
た場合、骨ペレット中のＣａ含量がプラトーになること
を確認した。このＢＭＰ／フィブリン比をフィブリン８
０μｌの場合にあてはめるとＢＭＰ量は約１．２８μｇ
であり、前述（ＢＭＰ標品５ｍｇ）の約４０００分の１
に当たる。

【００１７】従って、本発明におけるＢＭＰの有効な含
有量は、フィブリン１ｍｌに対して少なくとも４μｇ以
上が含有されていればよく、１６μｇ以上では骨中のＣ
ａ含量がプラトーになることから、好ましくは４μｇ以
上１６μｇ以下の含有量であればよい。

【００１８】また、前記のようにＢＭＰの骨修復への適
用においては担体が必要であり、既に種々の担体が見い
だされている。従って、本発明におけるフィブリンの役
割もＢＭＰの担体として働いている可能性が考えられる
が、フィブリン自体を担体として例示している先行技術
は調べられる限りにおいて見当たらない。例えば、特開
平２−５００２４１においては、基質（明細書中では
「マトリックス」という文言を使用している）の例示が
あるが、具体例としてのフィブリンの記述は見当たらな
い。また、特開平４−５０５１５１においても基質物質
として「リン酸三石灰、ハイドロキシアパタイト、コラ
ーゲン、バリス可塑性樹脂の硬膏、ポリ乳酸、ポリグリ
コール酸」等が記載されており、同様に特開平４−５０
５６０７においては「硫酸カルシウム、水酸化リン石
灰」等の記載があるが、何れもフィブリンを担体として
用いている例示はない。即ち、ＢＭＰを有効成分とする
骨修復の治療剤において、本発明の組み合わせのごとく
フィブリンを担体または基質として用いている先行技術
はなく、更にその至適混合比に関して記載した先行技術
もない。

【００１９】従って、本発明において初めて精製された
ＢＭＰを有効成分とし、且つ、担体としてフィブリンを
用いた場合の骨修復治療剤における至適混合比が明らか
にされた。

【００２０】フィブリンの機能に視点を移すと、フィブ
リン単独の異所性の骨誘導試験では全く骨の形成は認め
られず、むしろ移植されたフィブリン含有ペレットは２
週間後には吸収されていた。従って、フィブリンは骨欠
損部分に対して創傷面の閉鎖、填塞を確実にし、骨梁の
新生により創傷治癒を促進することが示唆されていた
が、本発明においてＢＭＰの担体として用いることによ
り旺盛な骨形成が認められたということは、骨形成能と
いうＢＭＰ単独の機能を本質的に強化する機能をフィブ
リンが有していることが明らかとなった。

【００２１】また、コラーゲン等の従来の担体を用いた
場合、その形状特性のために骨欠損部等の患部への適用
は困難であったが、それらの欠点を克服するためにポリ
マー等の使用が考えられる。

【００２２】しかし、それらが合成品である場合には生
体への影響を無視することができない。この観点からす
れば、前記のフィブリンは非常に有用なＢＭＰの担体と
なりうると考えられる。即ち、本来生体内に存在する物
質であり、溶液状態で患部に適用することができ、且
つ、生体分解性を有するからである。

【００２３】更に、本発明におけるフィブリンは後述す
るようにその使用方法において２剤を混合することによ
り固化が開始されることから穿孔部の鋳型にあった形状
で適用することが可能である。

【００２４】従って、本発明は、有効成分としてＢＭＰ
及び担体としてフィブリンを含有し、且つ、フィブリン
１ｍｌに対して４μｇ以上のＢＭＰを含有する骨修復治
療剤であり、当該治療剤を（１）骨欠損部分または骨折
部位に充填し、（２）当該部位でゲル状に固化させ、
（３）フィブリン内に含まれるＢＭＰが徐放化され、周
囲の未分化な骨の前駆細胞に作用し細胞の遊走及び／又
は分化を促進し、（４）欠損部に新しい骨を形成させる
ことにより骨修復治療を行うことを目的とする治療剤で
ある。

【００２５】

【実施例】次に、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。 実施例１ 遺伝子組換え（以下、ｒ−と示す）ｈＢＭＰ
２及びｈＢＭＰ４の作製 分子生物学的手法を用いたｒ−ｈＢＭＰ２及びｒ−ｈＢ
ＭＰ４の発現については、特願平５−８５１９に詳しく
述べられているが、以下にその概要を説明する。

【００２６】ｈＢＭＰ２ｃＤＮＡ及びｈＢＭＰ４ｃＤＮ
Ａは、Ｗｏｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２，
ｐ１５２８−１５３４，１９８８）の報告を基にプライ
マーを作製し、ヌードマウスを用いて継代増殖させたヒ
ト骨肉腫より調製したＲＮＡをテンプレートとしてｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ法
（以下、ＰＣＲ法と略す）により調製した。当該ｈＢＭ
Ｐ２ｃＤＮＡ及びｈＢＭＰ４ｃＤＮＡを各々ｐＵＣベク
ター（宝酒造（株））につなぎ、ｐＵＣ−ｈＢＭＰ２及
びｐＵＣ−ｈＢＭＰ４を作製した。

【００２７】次に、カイコ多角体ウイルス用転移ベクタ
ーであるｐＢｍ４（蚕糸・昆虫農業技術研究所より入手
可能）の遺伝子導入部位をＮｒｕＩで消化して平滑末端
を生じさせた改変ｐＢｍ４プラスミドに、それぞれｐＵ
Ｃ−ｈＢＭＰ２及びｐＵＣ−ｈＢＭＰ４を導入し、ｐＢ
ｍ４−ｈＢＭＰ２及びｐＢｍ４−ｈＢＭＰ４を得た。

【００２８】続いて、カイコ多角ウィルス遺伝子ＤＮＡ
（野生型ウイルスＰ６Ｅ株由来；蚕糸・昆虫農業技術研
究所より入手可能）とｐＢｍ４−ｈＢＭＰ２プラスミド
ＤＮＡ、又はｐＢｍ４−ｈＢＭＰ４プラスミドＤＮＡを
カイコ培養細胞ＢｏＭｏ１５ＡＩＩｃ（蚕糸・昆虫農業
技術研究所より入手可能）にリン酸カルシウム共沈法を
用いて同時に導入することによってｈＢＭＰ２及びｈＢ
ＭＰ４遺伝子を組み込んだ組換えウイルスを作製した。

【００２９】実施例２ カイコ体液の調製 カイコに接種するウィルス液を準備した。即ち、培養初
期濃度１ｘ１０^６細胞で２日間平面培養したＢｏＭｏ１
５ＡＩＩｃ細胞に実施例１で得られた組換え体ウイルス
を含むＢｏＭｏ１５ＡＩＩｃ細胞の培養液１０μｌを添
加し、さらに２５℃で１４日間培養した。培養液を１０
００ｒｐｍで５分間遠心分離して、得られた遠心上清を
接種用組換え体ウイルス液とした。

【００３０】次に、５令１日目のカイコ幼虫に、組み換
え体ウイルスのウイルスを含む液を１０倍希釈し１頭あ
たり５０μｌ注射し、２５℃で４日間、市販の人工飼育
（片倉工業製、モーラス）を与えて飼育後，体液を氷冷
したプラスチックチューブに採取し、遠心分離後の上清
を得た。１ロット当たり５００頭のカイコを使用した。

【００３１】実施例３ ＢＭＰの精製 （１）ｒ−ｈＢＭＰ２の精製 上記実施例２で得たカイコ体液に最終濃度８Ｍになるよ
うに尿素を加え、遠心分離によって上清を得た。この試
料を６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）で平衡化したＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社）に添加した。初期緩衝
液にて非吸着画分を除いた後、６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−１．５Ｍ ＮａＣｌ、
６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）
への直線濃度勾配法にて溶出を行った。

【００３２】マウス頭蓋骨由来骨芽細胞ＭＣ−３Ｔ３Ｅ
１のアルカリフォスファターゼ上昇活性を指標として活
性を示す画分を集め（この測定法に関してはＪ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．８４，ｐ１１２７−１１３２，１
９８３を参照）、６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）に対して透析を行った。この試料を６
Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で
平衡化したＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ
−６Ｂに再び添加した。初期緩衝液にて非吸着画分を除
いた後、同様に１．５Ｍ ＮａＣｌへの直線濃度勾配法
にて溶出を行った。

【００３３】Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ−６Ｂ溶出画分を１Ｎ−ＨＣｌにてｐＨ２．６に調整
し、ＴＳＫ−ｏｃｔａｄｅｃｙｌ ４ＰＷカラム（東ソ
ー株式会社、直径７．５×１５ｃｍ）に添加した。サン
プル添加後５分間は、２４％アセトニトリル、０．１％
トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略す）で洗浄し、以
後３５分まで、２４−４８％アセトニトリル、０．１％
ＴＦＡの直線濃度勾配法で溶出した。得られたピークに
ついてマウスを用いて精製コラーゲンを担体とする異所
性骨誘導活性を測定した（この測定法に関してはｃｌｉ
ｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，Ｖｏｌ．２９２，ｐ３２９−３３
６，１９９３を参照）。

【００３４】以上のようにして精製されたｒ−ｈＢＭＰ
２は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により、ほ
とんど完全に単一標品にまで精製されていることが確認
された。

【００３５】（２）ｒ−ｈＢＭＰ４の精製 同様に上記実施例２で得たカイコ体液に最終濃度８Ｍに
なるように尿素を加え、遠心分離によって上清を得た。
この試料を６尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）で平衡化したＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ＣＬ−６Ｂに添加した。初期緩衝液にて非吸着画
分を除いた後、１．５Ｍ ＮａＣｌへの直線濃度勾配法
にて溶出を行った。

【００３６】上記（１）と同様に活性を示す画分を集
め、６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）に対して透析を行ったのち、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂによる再クロマトグラフィ
ーを行った。

【００３７】更に活性を示す画分を集め、６Ｍ尿素、２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析
を行った。この試料に、３０％飽和になるように硫安を
加え、６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）硫安３０％飽和の緩衝液にて平衡化したＰｈｅ
ｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂに添加した。
初期緩衝液にて非吸着画分を除いた後、０％硫安、５０
％エチレングリコールへの直線濃度勾配法にて溶出を行
った。活性画分については、ｒ−ｈＢＭＰ２の場合と同
様の方法でＨＰＬＣによる精製を行なった。

【００３８】以上のようにして精製されたｒ−ｈＢＭＰ
４は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により、ほ
とんど完全に単一標品にまで精製されていることが確認
された。

【００３９】

【実施例４】 フィブリンを担体としたｒ−ｈＢＭＰに
よる異所性骨形成能の測定 フィブリンは市販の生体組織接着剤（例えば、商品名テ
ィシール、日本臓器製薬株式会社；商品名ベリプラス
ト、ベーリンガーヘキスト）を用いた。これらは組織の
接着、閉鎖を目的とする医薬品である。ここではティシ
ールの場合の例を以下に示す。

【００４０】フイリノーゲン（９０ｍｇ）を１ｍｌのア
プロチニン溶液（３０００ＫＩＵ／ｍｌ）に溶解した。
ｒ−ｈＢＭＰ２については、２０μｇの凍結乾燥標品を
１００μｌの５０ｍＭ ＨＣｌに溶解した標品を原液と
し、２倍希釈系列を作製した。トロンビンは５００単位
／バイアルを０．５ｍｌの４０ｍＭ ＣａＣｌ_２に溶解
した。トロンビン溶解液５０μｌに対し、ｒ−ｈＢＭＰ
２希釈液を各々３２μｌ、滅菌した蒸留水１５μｌを加
えたのち、３μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓを加え中和し、ＢＭ
Ｐ−トロンビン液１００μｌを作成した。

【００４１】次に、２５μｌのＢＭＰ−トロンビン液と
２５μｌのフィブリノーゲン液を混ぜ、小試験管内でフ
ィブリンを完成させたのち、４−５週齢のＢＡＬＢ／ｃ
−ｎｕ／ｎｕマウス（日本エスエルシー株式会社）の背
部筋膜下に標品を移植し２週間後の骨形成能を軟Ｘ線写
真および組織標本により骨形成能を判定した。

【００４２】その結果、フィブリン５０μｌ中にｒ−ｈ
ＢＭＰ２を４００ｎｇ含む移植ペレット（８μｇ ｒ−
ｈＢＭＰ２／ｍｌフィブリン）の全例に、また、２００
ｎｇｒ−ｈＢＭＰ２含有ペレット（４μｇ ｒ−ｈＢＭ
Ｐ２／ｍｌフィブリン）の４例中３例（７５％）に旺盛
な骨形成が認められ、１００ｎｇ ｒ−ｈＢＭＰ２含有
ペレット（２μｇ ｈＢＭＰ２／ｍｌフィブリン）の７
５％に弱い骨形成が認められた。

【００４３】特に、ＢＭＰを４００ｎｇ含有するペレッ
トの場合、当該ペレットによる異所性骨形成能を拡大Ｘ
線写真像により確認したところ、移植ペレット全体に海
綿様の構造物が認められ誘導骨が生じていることが確認
された。一方、フィブリンだけではいずれも軟Ｘ線では
不透過像は得られなかった。

【００４４】次に、骨ペレット中のＣａ含有量について
調べた。骨ペレットを磁性ルツボに入れ、９００度、１
時間の灰化処理を行った。冷却後、灰化物を０．１Ｎ
ＨＣｌに溶解しＣａ−Ｍｇカウンター（平沼製作所）を
用いてキレート法にて測定した。結果を図１に示す。Ｂ
ＭＰの含有量に比例してペレット内のＣａ含有量は増加
しｒ−ｈＢＭＰ２を８００ｎｇ含む移植ペレット（１６
μｇ ｒ−ｈＢＭＰ２／ｍｌフィブリン相当）において
プラトーになった。ｒ−ｈＢＭＰ４を用いた場合でもほ
ぼ同様のＣａ含有量を示した。

【００４５】実施例５ ＢＭＰ−フィブリン複合体の骨
欠損部治療への応用 動物実験にはウィスター系ラット（♀）を用いた。ネン
ブタールによる腹腔麻酔下、左右大腿骨骨幹の皮質骨を
歯科用ラウンドバー（直径１．２ｍｍ）で穿孔し、骨欠
損部を作製した。種々濃度のＢＭＰを含むトロンビン液
１０μｌとフィブリーゲン液１０μｌからなるフィブリ
ンを穿孔部に充填し、止血を目視により確認したのち皮
膚を縫合した。

【００４６】３週間後に患部を観察すると、フィブリン
２０μｌ当たり０．８μｇのＢＭＰを添加した群（４０
μｇ ｒ−ｈＢＭＰ２／ｍｌフィブリン相当）では旺盛
な骨修復により外観上欠損部位は全く認められなかった
が、フィブリンだけを添加した群では穿孔部が残ってい
た。

【００４７】次に、大腿骨を用い骨のねじり破壊抵抗性
に及ぼすＢＭＰ添加の効果を調べた。摘出大腿骨の両端
を歯科用レジンで固め、動物用骨破壊強度試験機（マル
トー株式会社）に供した。結果を第１表に示す。フィブ
リン単独に較べＢＭＰ添加群で骨強度の増加傾向を示し
た。

【００４８】

【表１】

【００４９】

【発明の効果】本発明により、有効成分としてＢＭＰ及
び担体としてフィブリンを含有する骨修復治療剤の開発
において、優れた骨形成能を有する当該治療剤を提供す
ることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、異所性骨誘導アッセイにおける骨ペレ
ット中のＣａ含有量を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金井 貞 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 骨形成蛋白質を有効成分とし、フィブリ
   ンを担体として含有する骨修復治療剤であって、骨形成
   蛋白質含量がフィブリン１ｍｌに対して４μｇ以上であ
   ることを特徴とする治療剤。