BR112020006976A2

BR112020006976A2 - anticorpos monoclonais anti-trkb e métodos de uso

Info

Publication number: BR112020006976A2
Application number: BR112020006976-0A
Authority: BR
Inventors: Susan D. Croll; Min Gao; Ying Hu
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2017-11-30
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-10-13
Also published as: JP7438937B2; IL273538A; US20190161551A1; MX2020003550A; CN111372949A; US11066474B2; KR20200090779A; CA3083452A1; EA202090966A1; MA51207A; JP2024016204A; CL2020000855A1; WO2019108662A1; SG11202002665UA; JP2021507677A; US20220411515A1; EP3717514A1; AU2018375340A1; CO2020004075A2

Abstract

Anticorpos que se ligam especificamente a TrkB e métodos de uso dos mesmos são descritos. Os anticorpos agonistas que são neuroprotetores, tal como mostrado pelo seu efeito na melhora da sobrevivência de células ganglionares da retina in vitro são descritos e estes anticorpos agonistas podem ser usados em tratamentos tais como disfunções do olho, incluindo glaucoma. Além disso, outras doenças neuronais ou disfunções se beneficiam do tratamento com estes anticorpos agonistas, incluindo aqueles caracterizados, em parte, por dano neuronal. Em determinadas modalidades, a invenção inclui anticorpos que se ligam a TrkB e mediam a sinalização celular. Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos completamente humanos, de ocorrência não natural formulados com excipientes para injeção.

Description

ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-TRKB E MÉTODOS DE USO CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a anticorpos monoclonais anti-receptor quinase B da tropomiosina (TrkB). Mais especificamente, a invenção se refere a composições compreendendo anticorpos monoclonais anti-TrkB e métodos de uso destes anticorpos.

ANTECEDENTES

[0002] O receptor quinase B da tropomiosina (TrkB pertence à família dos receptores tirosina quinase transmembrana únicos, os quais incluem TrkA e TrkC. Estes receptores quinase mediam a atividade das neurotrofinas, as quais são requeridas para a sobrevivência e desenvolvimento neuronal. As neurotrofinas incluem, porém não estão limitadas a, fator de crescimento nervoso (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) e neurotrofina-4/5 (NT-4/5). (Lo, K Y et al., O. Biol. Chem., 280: 41744 - 52 (2005)).

[0003] O TrkB é o receptor para BDNF de alta afinidade (Minichiello, et al., Neuron 21: 335 - 45 (1998) ), porém ele é também conhecido por se ligar a NT4/5. A ligação de BDNF ao TrkB causa a dimerização do receptor, resultando na auto fosforilação de resíduos de tirosina específicos no receptor e ativação da vias de sinalização que envolvem proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), fosfatidil inositol 3-quinase (PI3K), e fosfolipase C-y (PLC-y). (Jing, et al. Neuron 9: 1067 - 1079 (1992); Barbacid, J. Neurobiol. 25: 1386 - 1403 (1994); Bothwell Ann. Rev. Neurosci. 18: 223 - 253 (1995); Segal e Greenberg, Ann. Rev. Neurosci. 19: 463 - 489 (1996); Kaplan e Miller, Curr. Opinion Neurobiol. 10: 381 - 391 (2000)). Após a ligação ao BDNF, o TrkB media os múltiplos efeitos da neurotrofina, os quais incluem a diferenciação e sobrevivência neuronal.

[0004] Uma vez que TrkB atua em um papel principal na sobrevivência, diferenciação e função neuronal, os agonistas do TrkB podem apresentar potencial terapêutico para o tratamento de um número de disfunções neuro degenerativas e metabólicas.

[0005] Determinados agonistas do TrkB foram descritos em US 2010/0150914; Us 2003/0157099; Us 2010/0196390 e US 2017/0157099. No entanto, ainda existe uma necessidade de identificação e desenvolvimento de agonistas do TrkB adicionais que fornecem especificidade melhorada, além de exibir sobrevivência neuronal e propriedades neuroprotetoras, tais como aquelas aqui descritas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção fornece anticorpos monoclonais isolados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao receptor quinase B da tropomiosina (TrkB) . Os anticorpos isolados e fragmentos de ligação ao antígeno da invenção são úteis para o tratamento de doenças e disfunções associadas à atividade ou expressão do TrkB.

[0007] Em seu aspecto mais amplo, a invenção fornece anticorpos agonistas anti-TrkB, os quais ativam o TrkB e promovem a sobrevivência neuronal. Estes anticorpos podem ser usados para melhorar a função nervosa e para o tratamento de qualquer doença ou disfunção caracterizada em parte pela degeneração celular, incluindo dano celular nervoso associado à lesão do sistema nervoso e/ou doenças neurodegenerativas crônicas.

[0008] Em determinadas modalidades, os anticorpos anti-TrkB podem ser úteis para tratar diversas doenças ou disfunções do olho e podem ser formulados para distribuição intraocular ou intravitreal, a fim de tratar doenças do olho, tais como, porém não limitadas a, glaucoma.

[0009] Os anticorpos da invenção podem ser de comprimento completo (por exemplo, um anticorpo IgGl ou IgG4) ou podem compreender apenas uma porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')>, ou scFv) e podem ser modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, para eliminar funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164: 1925 - 1933).

[0010] Exemplos de anticorpos anti-TrkB da presente invenção são aqui listados nas Tabelas 1 e 2. A Tabela 1 indica os identificadores da sequência de aminoácido de regiões variáveis de cadeia pesada (HCVRsS), regiões variáveis de cadeia leve (LCVRs), regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDRlI, HCDR2 e HCDR3) e regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) dos exemplos de anticorpos anti-TrkB. A tabela 2 indica os identificadores da sequência de ácido nucleico das HCVRs, LCVRs, HCDRI1, HCDR2, HCDR3, LCDRlI, LCDR2 e LCDR3 dos exemplos de anticorpos anti-TrkB.

[0011] A presente invenção fornece anticorpos Ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma HCVR compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido da HCVR listadas na tabela 1, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0012] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma LCVR compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido LCVR listadas na tabela 1, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0013] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo um par de sequências de aminoácido de uma HCVR e uma LCVR (HCVR/LCVR) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido da HCVR listadas na tabela 1 emparelhada com qualquer uma das sequências de aminoácido da LCVR listadas na tabela 1. De acordo com determinadas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR contidas dentro de qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-TrkB listados na tabela 1.

[0014] sendo assim, em um primeiro aspecto, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor quinase B da tropomiosina (TrkB), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDRl, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido tal como definida na tabela 1, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma; e três CDRs de cadeia leve (LCDR1I, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido tal como definida na tabela 1, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma.

[0015] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TrkB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo exibe uma ou mais propriedades selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) ser um anticorpo agonista; (b) se ligar ao TrkB humano com um Kp de menos de cerca de 200 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou a 37 ºC; (c) se ligar ao TrkB humano com uma meia vida dissociativa (t%) maior do que cerca de 10 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC oua 37 ºC; (d) ativar a sinalização de TrkB humano na ausência de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)

nas células projetadas para expressar TrkB humano com um ECs5o que varia de cerca de 35 a 82 pM; (e) melhorar a fosforilação do TrkB quando injetado no hipocampo de camundongos homozigóticos para receptor TrkB humano (TrkB "e/nv); (£) promover a perda de peso quando injetado em camundongos homozigóticos para receptor TrkB humano (TrkB hu/hu) ; (g) aumentar a sobrevivência de células ganglionares da retina (RGC) tal como avaliado em um modelo de transecção do nervo óptico em ratos com TrkB humanizado; (h) ativar as vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/Akt; (i) aumentar a sobrevivência de células neuronais in vitro; e (3) bloquear a ligação de TrkB ao BDNF e/ou NT-4 com um ICsºo de menos do que 5nM.

[0016] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente aos receptores quinase B da tropomiosina (TrkB), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo — uma sequência de aminoácido tal como definida na tabela 1; e (b) as CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido tal como definida na tabela 1.

[0017] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências das HCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 59 e 68, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma; e três CDRs de cadeia leve (LCDRlI, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências das LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53, 63 e 72, Ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma.

[0018] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende uma HCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 59 e 68.

[0019] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB ainda compreende uma LCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53, 63 e 72.

[0020] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende uma HCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 59 e 68; e uma LCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53,

63 e 72.

[0021] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende as CDRs de um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

[0022] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende: as CDRs de um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, e 34/42.

[0023] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

[0024] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreende um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26 e 34/42.

[0025] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma cadeia pesada CDR1 (HCDR1) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDR1 listadas na tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0026] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma cadeia pesada CDR2 (HCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDR2 listadas na tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0027] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma cadeia pesada CDR3 (HCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDR3 listadas na tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0028] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma cadeia leve CDRl (LCDRl1) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido LCDR1 listadas na tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0029] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma cadeia leve CDR2 (LCDR2) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido LCDR2 listadas na tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0030] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma cadeia leve CDR3 (LCDR3) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma das sequências de aminoácido LCDR3 listadas na tabela 1 ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0031] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo um par de sequências de aminoácido de uma HCDR3 e uma LCDR3 (HCDR3/LCDR3) compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDR3 listadas na tabela 1 emparelhadas com qualquer uma das sequências de aminoácido LCDR3 listadas na tabela 1. De acordo com determinadas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo um par de sequências de aminoácido de HCDR3/LCDR3 contidas dentro de qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-TrkB listados na tabela 1. Em determinadas modalidades, o par de sequências de aminoácido de HCDR3/LCDR3 é selecionado a partir do grupo que consiste em: 8/16, 24/32, 40/48, 52/56, 62/66 e 71/75.

[0032] A presente invenção também fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDRl1, HCDR2, HCDR3, LCDRI1, LCDR2, LCDR3) contidas dentro de qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-TrkB listados na tabela 1. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácido da HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 definida é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 12, 14, 16; (b) SEQ ID NOs: 20, 22, 24, 28, 30, 32; (c) SEQ ID NOs: 36, 38, 40, 44, 46, 48; (d) SEQ ID NOs: 50, 51, 52, 54, 55, 56; (e) SEQ ID NOs: 60, 61, 62, 64, 65, 66; e (f£) SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 73, 74, 75.

[0033] Em uma modalidade relacionada, a presente invenção fornece anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo um conjunto de seis CDRs (isto é, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDRl1, LCDR2, LCDR3) contidas dentro de um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR tal como definidas por qualquer um dos exemplos de anticorpos anti- TrkB listados na tabela 1. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo as sequências de aminoácido de HCDRl1, HCDR2, HCDR3, LCDRI1,

LCDR2, LCDR3 definidas contidas dentro de um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63, e 68/72. Métodos e técnicas para a identificação de CDRs dentro das sequências de aminoácido da HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar os CDRs dentro das sequências de aminoácido da HCVR e/ou LCVR especificadas aqui descritas. Exemplos de convenções que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição Kabat, a definição Chothia e a definição AbM. Em termos gerais, a definição Kabat está baseada na variabilidade da sequência, a definição Chothia está baseada na localização das regiões de loop estrutural, e a definição AbM é um acordo entre as abordagens Kabat e Chothia. Vide, por exemplo, Kabat, “Sequências de proteínas de interesse imunológico”, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md. (1991); Al- Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927 - 948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268 - 9272 (1989). Bancos de dados públicos estão também disponíveis para a identificação de sequências de CDR dentro de um anticorpo.

[0034] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreendendo: (a) um domínio HCDR1 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 50, 60 e 69; (b) um domínio HCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em

SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 51, 61 e 70; (Cc) um domínio HCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 62 e 71; (d) um domínio LCDR1I apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 54, 64 e 73; (e) um domínio LCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 55, 65 e 74; e (£) um domínio LCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 56, 66 e 75.

[0035] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB compreendendo: (a) um domínio HCDRl apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 20 e 36; (b) um domínio HCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 22 e 38; (c) um domínio HCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 24 e 40; (d) um domínio LCDR1I apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 28 e 44; (e) um domínio LCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em

SEQ ID NOs: 14, 30 e 46; e (f) um domínio LCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 32 e 48.

[0036] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis CDRs (HCDRl - HCDR2 - HCDR3 - LCDRI - LCDR2 - LCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOs: 4 - 6 - 8 - 12 - 14 - 16; (Db) SEQ ID NOs: 20 - 22 - 24 - 28 — 30 - 32; (c) SEQ ID NOs: 36 — 38 — 40 — 44 - 46 -— 48; (d) SEQ ID NOs: 50 - 51 - 52 - 54 — 55 - 56; (e) SEQ ID NOs: 60 - 61 - 62 - 64 - 65 - 66; Ee (f) SEQ ID NOs: 69 -— 70 — 71 -— 73 — 74 - 75.

[0037] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete pela ligação ao TrkB com um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

[0038] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

[0039] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um Kr de menos de cerca de 300 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0040] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um Kr” de menos de cerca de 200 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0041] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um K” de menos de cerca de 150 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0042] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um K” de menos de cerca de 50 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0043] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um Kr” de menos de cerca de 100 pM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0044] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com uma meia vida dissociativa (t») maior do que cerca de 10 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 “ºC.

[0045] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um t% maior do que cerca de 40 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0046] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga ao TrkB humano com um t% maior do que cerca de 120 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

[0047] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB ativa a sinalização de TrkB humano na ausência de BDNF nas células projetadas para expressar TrkB, com um ECso de menos de cerca de 100 pM.

[0048] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB ativa a sinalização de TrkB humano na ausência de BDNF nas células projetadas para expressar TrkB, com um ECso que varia de cerca de 35 pM a cerca de 82 pM.

[0049] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB melhora a ativação da sinalização de TrkB humano na presença de BDNF nas células projetadas para expressar TrkB, com um ECso de menos de cerca de 100 pM.

[0050] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB, o qual, quando injetado no hipocampo de camundongos com TrkB humanizado, demonstra a ativação do TrkB, tal como mostrado por um aumento na fosforilação do TrkB.

[0051] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao

TrkB demonstra a ativação das vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/Akt, tal como demonstrado após a incubação de neurônios corticais primários de camundongo com um anticorpo agonista anti-TrkB.

[0052] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB melhora/aumenta a sobrevivência de células ganglionares da retina tal como mostrado em um modelo de transecção do nervo óptico em ratos com TrkB humanizado.

[0053] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB melhora/aumenta a sobrevivência de células neuronais in vitro.

[0054] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB promove a perda de peso em camundongos com TrkB humanizado.

[0055] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB promove uma perda de massa de gordura em camundongos com TrkB humanizado.

[0056] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB promove uma diminuição no consumo de alimentos e água em camundongos com TrkB humanizado.

[0057] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TrkB promove um aumento na atividade de locomoção em camundongos com TrkB humanizado.

[0058] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TrkB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB e bloqueia a ligação do TrkB ao BDNF com um ICso de menos de cerca de 5 nM.

[0059] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TrkB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB e bloqueia a ligação do TrkB ao BDNF com um ICso de menos de cerca de 500 pM.

[0060] Em uma modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-TrkB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TrkB e bloqueia a ligação do TrkB ao BDNF com um ICso de menos de cerca de 200 pM.

[0061] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece “moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-TrkB ou porções dos mesmos. Por exemplo, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido de HCVR listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma de sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0062] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da LCVR listadas na tabela 1; em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da LCVR listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0063] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDRI listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da HCDR1 listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0064] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDR2 listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da HCDR2 listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0065] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da HCDR3 listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da HCDR3 listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0066] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da LCDRI listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da LCDR1 listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0067] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da LCDR2 listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da LCDR2 listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0068] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências de aminoácido da LCDR3 listadas na tabela 1; em determinadas modalidades a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da LCDR3 listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma.

[0069] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma HCVR, em que a HCVR compreende um conjunto de três CDRs (isto é, HCDRl, HCDR2, HCDR3), em que o conjunto de sequências de aminoácido da HCDR1, HCDR2, HCDR3 é tal como definido por qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-TrkB listados na tabela 1.

[0070] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam uma LCVR, em que a LCVR compreende um conjunto de três CDRs (isto é, LCDRl, LCDR2, LCDR3), em que o conjunto de sequências de aminoácido da LCDR1, LCDR2, LCDR3 é tal como definido por qualquer um dos exemplos de anticorpos anti-TrkB listados na tabela 1.

[0071] A presente invenção também fornece moléculas de ácido nucleico que codificam ambas uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR compreende uma sequência de aminoácido de qualquer uma das sequências de aminoácido da HCVR listadas na tabela 1, e em que a LCVR compreende uma sequência de aminoácido de qualquer uma das sequências de aminoácido da LCVR listadas na tabela 1. Em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma de Sequências de ácido nucleico de HCVR listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma, e uma sequência de polinucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das sequências de ácido nucleico da LCVR listadas na tabela 2, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência com a mesma. Em determinadas modalidades de acordo com este aspecto da invenção, a molécula de ácido nucleico codifica uma HCVR e uma LCVR, em que a HCVR e a LCVR são ambas derivadas do mesmo anticorpo anti-TrkB listados na tabela 1.

[0072] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece vetores de expressão recombinantes capazes de expressar um polipeptídeo compreendendo uma região variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo anti-TrkB. Por exemplo, a presente invenção inclui vetores de expressão recombinantes compreendendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico mencionadas acima, isto é, moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer uma das sequências da HCVR, LCVR e/ou CDR tal como definida na tabela 1. Também incluídas no escopo da presente invenção estão as células hospedeiras dentro das quais os referidos vetores foram introduzidos, bem como os métodos de produção dos anticorpos ou porções dos mesmos pelo cultivo das células hospedeiras sob condições que permitem a produção dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo e a recuperação dos anticorpos e fragmentos de anticorpo então produzidos.

[0073] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB apresentando um padrão de glicosilação modificado. Em algumas modalidades, a modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo que não tem uma porção fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (vide Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). Em outras aplicações, a modificação da galactosilação pode ser feita a fim de modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).

[0074] Em um quarto aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo da invenção, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o qual especificamente se liga ao TrkB e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0075] Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição, a qual é uma combinação de um anticorpo anti-TrkB e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo anti-TrkB. O segundo agente terapêutico pode ser útil para aliviar pelo menos um sintoma da doença ou disfunção neurodegenerativa.

[0076] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um método para a melhora de uma atividade biológica mediada por TrkB, o método compreendendo colocar o TrkB em contato com uma quantidade biologicamente eficaz de um anticorpo agonista anti-TrkB da tabela 1, Ou colocar o TrkB em contato com uma composição farmacêutica contendo uma quantidade biologicamente eficaz de um anticorpo agonista anti-TrkB da tabela 1.

[0077] Em determinadas modalidades, a atividade biológica é proteção neuronal ou sobrevivência neuronal e a proteção neuronal ou a sobrevivência neuronal são melhoradas quando do contato do TrkB com um anticorpo agonista anti-TrkB.

[0078] Em determinadas modalidades, a atividade biológica é neuroproteção e sobrevivência de células ganglionares da retina (RGCs).

[0079] Em um sexto aspecto, a invenção fornece métodos terapêuticos para o tratamento de uma doença ou disfunção associada à atividade ou expressão do TrkB, ou pelo menos um sintoma associado a doença ou disfunção, usando um anticorpo anti-TrkB ou porção de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção. Os métodos terapêuticos de acordo com este aspecto da invenção compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo. A disfunção tratada é qualquer doença ou condição a qual é melhorada, amenizada, inibida Ou evitada pelo direcionamento do TrkB e/ou pela ativação da sinalização celular mediada por TrkB.

[0080] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método de prevenção de lesão ou morte dos neurônios da retina. Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método de tratamento de doenças patológicas em que a degeneração da retina ocorre. Em uma modalidade, os anticorpos anti- TrkB da invenção podem fornecer um método de tratamento do olho vivo antes ou após a cirurgia ocular, exposição à luz ou outro trauma ambiental assim evitando a degeneração das células da retina. Em uma modalidade, os anticorpos anti- TrkB da invenção podem fornecer um método de prevenção da lesão do fotorreceptor e degeneração no olho vivo. Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método de proteção de neurônios da retina sem a indução de efeitos colaterais, possivelmente devido à reatividade cruzada com outros receptores, tais como o receptor p75. Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método que permita que fotorreceptores lesionados se recuperem ou se regenerem.

[0081] Em determinadas modalidades, a doença Ou disfunção a ser tratada com um anticorpo da invenção é uma doença ou disfunção do olho selecionada a partir do grupo que consiste em glaucoma, retinopatia diabética degeneração macular relacionada com a idade, neuropatia isquêmica óptica, neurite óptica, isquemia da retina, degeneração do fotorreceptor, retinite pigmentosa, amaurose congênita de Leber, neuropatia óptica hereditária de Leber, síndrome de Usher, doença Stargardt e oclusões da artéria ou veia da retina.

[0082] Outras condições patológicas tratáveis com um ou mais anticorpos anti-TrkB da invenção incluem descolamento da retina, retinopatias fóticas, retinopatias induzidas por cirurgias (seja mecanicamente ou induzida por luz), retinopatias tóxicas, retinopatia de prematuridade, retinopatias virais tais como retinopatia CMV ou HIV relacionada à AIDS; uveíte; retinopatias isquêmicas devido a oclusão venosa ou arterial ou outra disfunção vascular, retinopatias devido ao trauma ou lesões de penetração do olho, vitreoretinopatia periférica ou degenerações hereditárias da retina.

[0083] Em uma modalidade, a doença ou disfunção do olho a ser tratada com um anticorpo agonista anti-TrkB da invenção é glaucoma.

[0084] Um sétimo aspecto da invenção fornece alcançar uma redução no peso corporal em um indivíduo, o método “compreendendo a administração de um anticorpo agonista do TrkB da tabela 1, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.

[0085] Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um método para alcançar uma redução de massa de gordura em um indivíduo, o método compreendendo a administração de um anticorpo agonista do TrkB da tabela 1, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.

[0086] Um oitavo aspecto da invenção fornece um método de promoção da sobrevivência neuronal em um indivíduo, o método compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo agonista do TrkB da tabela 1, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.

[0087] Em uma modalidade, os métodos descritos acima podem ser alcançados pela administração de um anticorpo agonista anti-TrkB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo a um indivíduo em necessidade do mesmo, em que o anticorpo agonista anti-TrkB compreende três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDRl1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido tal como definida na tabela 1, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma; e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido tal como definida na tabela 1, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com à mesma.

[0088] Em uma modalidade, os métodos da invenção podem ser alcançados pela administração de um anticorpo agonista do TrkB da invenção, em que oO anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDRl, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências das HCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 59 e 68, Ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma; e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências das LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53, 63 e 72, ou uma sequência substancialmente similar da mesma apresentando pelo menos 90 % de identidade de sequência com a mesma.

[0089] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 59 e 68.

[0090] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma LCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53, 63 e 72.

[0091] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49 59 e 68; e uma LCVR apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53, 63 e 72.

[0092] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as CDRs de um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

[0093] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um par de sequências de aminoácido de HCVR/LCVR selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

[0094] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) um domínio HCDR1 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 50, 60 e 69; (b) um domínio HCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 51, 61 e 70; (c) um domínio HCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 62 e 71; (d) um domínio LCDR1 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 54, 64 e 73; (e) um domínio LCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 55, 65 e 74; e (£) um domínio LCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 56, 66 e 75.

[0095] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um conjunto de seis CDRs (HCDRlI - HCDR2 - HCDR3 - LCDR1 - LCDR2 - LCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOs: 4 -— 6 — 8 -— 12 -— 14 - 16; (b) SEQ ID NOs: 20 - 22 - 24 —- 28 - 30 - 32; (c) SEQ ID NOs: 36 - 38 - 40 - 44 - 46 - 48; (d) SEQ ID NOs: 50 - 51 - 52 - 54 - 55 - 56; (e) SEQ ID NOs: 60 - 61 - 62 - 64 - 65 - 66; e (f) SEQ ID NOs: 69 - 70 - 71-73 —- 74 - 75.

[0096] Em uma modalidade, a doença ou disfunção a ser tratada com um anticorpo anti-TrkB da invenção é obesidade, e qualquer complicação resultante da obesidade.

[0097] É previsto que qualquer doença ou disfunção associada à atividade ou expressão do TrkB é passível de tratamento com um anticorpo da invenção. Estas doenças podem incluir qualquer doença na qual a degradação celular é evidente, tais como em uma condição neurodegenerativa ou após uma lesão do nervo.

[0098] Outras modalidades se tornarão visíveis a partir de uma revisão da descrição detalhada que se segue.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0099] Figura 1. Mostra western blots que avaliam os níveis totais de TrkB e fosfo-TrkB em camundongos homozigóticos com TrkB humanizado em 1 hora, 4 horas e 18 horas após a injeção hipocampal direta do anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 ou anticorpo controle do isotipo.

[0100] Figura 2. Mostra que o anticorpo agonista do TrkB, H4H9816P2, ativou as vias à jusante de MAPK/ERK e PI3K/Akt. A figura mostra western blots de fosfo-TrkB, TrkB total, fosfo-Akt, Akt total, fosfo-ERK e ERK total em 15 minutos e 2 horas após o tratamento de neurônios corticais primários isolados a partir de filhotes de camundongos com TrkB humanizado homozigóticos no dia 1 pós-natal com diversos anticorpos agonista do TrkB ou BDNF.

[0101] Figura 3. Mostra que três anticorpos agonista do TrkB aumentaram, de forma dependente da dose, a sobrevivência de células SH-SY5Y in vitro. O anticorpo controle do isotipo não apresentou efeito na sobrevivência celular.

[0102] Figura 4, Mostra os perfis de farmacocinética do anticorpo agonista anti-TrkB H4H9816P2 em camundongos TrkB "“/!m e camundongos do tipo selvagem. Camundongos “foram administrados com uma única dose subcutânea de 10 mg/kg no dia 0. Concentrações do H4H9816P2 total no soro foram medidas usando um imunoteste Gyros.

Pontos de dados em uma pós dose de 6 horas, 1, 2, 3, 6, 9, 16, 21 e 30 dias indicam a concentração média do anticorpo. As concentrações totais dos anticorpos H4H9816P2 são representadas como círculos sólidos pretos para camundongos TrkB ""/"" e quadrados sólidos pretos para camundongos do tipo selvagem. Os dados são plotados como média + DP.

[0103] Figura 5. Consiste na Figura 5A e Figura 5B, as quais mostram a capacidade dos anticorpos monoclonais TrkB anti-camundongo de bloquear a interação entre TrkB de camundongo ou rato e seu ligante BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro). Métodos baseados em ELISA foram usados para avaliar a ligação do (Figura 5A com dois gráficos) camundongo TrkB.hfFc e (Figura 5B com dois gráficos) do rato TrkB.mmh em placas com BDNF revestido na presença de uma faixa de concentrações de mAbs TrkB anti- camundongo e controle do isotipo. A inserção em (Figura 5A com dois gráficos) mostra a curva dose-resposta do camundongo TrkB.hFc (REGN2277) que se liga ao BDNF com um valor ECso de 780 pM. A inserção em (Figura 5B com dois gráficos) mostra a curva dose-resposta do rato TrkB.mmh (REGN1808) que se liga ao BDNF com um valor ECsº de 2.2 nM. A molaridade (M) indica à concentração de anticorpo para mãbs. As barras de erro representam o desvio padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0104] Antes de a presente invenção ser descrita, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a métodos particulares e condições experimentais descritas, uma vez que métodos e condições podem variar. É também para ser entendido que a terminologia aqui utilizada é para fins de descrição de modalidades particulares apenas, e não pretende ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

[0105] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados apresentam o mesmo significado tal como comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Tal como aqui utilizado, o termo “cerca de”, quando usado em referência a um valor numérico particular citado, significa que o valor pode variar a partir do valor citado por não mais do que 1 %. Por exemplo, tal como aqui utilizada, a expressão “cerca de 100” inclui 99 e 101 e todos os valores entre os mesmos (por exemplo, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, etec.).

[0106] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, todos os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as patentes, pedidos e publicações não patentária mencionadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

Definições

[0107] A expressão “TrkB” e similares, também conhecida como “receptor quinase B da tropomiosina”, se refere ao receptor humano (a menos que seja designado como sendo de outra espécie) compreendendo a sequência de aminoácido tal como definida nos resíduos de aminoácido 32 até 430 do número de acesso NP 001018074.1. O TrkB humano contendo uma tag myc-myc-hexahistidina é mostrado como a SEQ ID NO: 76 (com os resíduos de aminoácido 1 - 399 sendo o TrkB humano e os resíduos de aminoácido 400 - 427 sendo a tag myc-myc-hexahistidina). Outros formatos contendo proteínas humanas de TrkB são aqui descritos, incluindo a SEQ ID NO: 77, a qual é TrkB humano (resíduos 1 - 399) com uma região Fc de camundongo (resíduos 400 - 632); e SEQ ID NO: 78, a qual é TrkB humano (resíduos 1 - 399) com uma região Fc humana (resíduos 400 - 626). O TrkB de camundongo compreende a sequência de aminoácido tal como definida nos resíduos de aminoácido 32 até 429 do número de acesso NP 001020245. O TrkB de camundongo contendo uma tag myc- myc-hexahistidina é mostrado como a SEQ ID NO: 79 (com os resíduos de aminoácido 1 - 398 sendo o TrkB de camundongo e os resíduos de aminoácido 399 - 426 sendo a tag myc-myc- hexahistidina). Outros formatos contendo as proteínas do TrkB de camundongo são aqui descritos, incluindo a SEQ ID NO: 80, a qual é o TrkB de camundongo (resíduos 1 - 398) com uma região Fc de camundongo (resíduos 399 - 631); e SEQ ID NO: 81, a qual é o TrkB de camundongo (resíduos 1 - 398 com uma região Fc humana (resíduos 399 - 625). O TrkB de coelho compreende a sequência de aminoácido tal como definida nos resíduos de aminoácido 32 até 430 do número de acesso XP 002721319.1. O TrkB de coelho contendo uma tag myc-myc-hexahistidina é mostrado como a SEQ ID NO: 82 (com os resíduos de aminoácido 1 - 399 sendo o TrkB de coelho e os resíduos de aminoácido 400 - 427 sendo a tag myc-myc- hexahistidina). Outros formatos contendo proteínas de TrkB de coelho são aqui descritos, incluindo a SEQ ID NO: 83, a qual é o TrkB de coelho (resíduos 1 - 399) com uma região Fc de camundongo (resíduos 400 - 632). O TrkB de rato compreende a sequência de aminoácido tal como definida nos resíduos de aminoácido 32 até 429 do número de acesso

NP 036863.1. O TrkB de rato contendo uma tag myc-myc- hexahistidina é mostrado como a SEQ ID NO: 84 (com resíduos de aminoácido 1 - 398 sendo o TrkB de rato e os resíduos de aminoácido 399 - 426 sendo a tag myc-myc-hexahistidina). Outros formatos contendo as proteínas de TrkB de rato são aqui descritos, incluindo a SEQ ID NO: 85, a qual é o TrkB de rato (resíduos 1 - 398) com uma região Fc de camundongo (resíduos 399 - 631). O TrkB de macaco Rhesus (Macaca mulatta) é mostrado como a SEQ ID NO: 95 (aminoácidos 32 até 838 do número de acesso NP 001248226.1) e o TrkB de macaco cinomolgos (Macaca fascicularis) é mostrado como a SEQ ID NO: 96 (aminoácidos 32 até 838 do número de acesso XP 005582102.1).

[0108] A proteína humana “TrkA” é mostrada como a SEQ ID NO: 86, com os aminoácidos 1 - 375 sendo TrkA (aminoácidos 34 - 414 do número de acesso NP 001012331.1 com V263L, C300S), aminoácidos 376 - 378 sendo um ligante GPG e os aminoácidos 379 - 605 sendo um Fc humano.

[0109] A proteína humana “TrkC” é mostrada como a SEQ ID NO: 87, com os aminoácidos 1 - 398 sendo TrkC (aminoácidos 32 - 429 do número de acesso NP 001012338.1) e os aminoácidos 399 - 426 sendo uma tag myc-myc-his.

[0110] A proteína de camundongo “TrkC” é mostrada como a SEQ ID NO: 88, com os aminoácidos 1 - 398 sendo TrkC (aminoácidos 32 - 429 do número de acesso NP 032772.3) e os aminoácidos 399 - 426 sendo uma tag myc-myc-his.

[0111] A proteína de macaco cinomolgos “TrkC” é mostrada como a SEQ ID NO: 89, com os aminoácidos 1 - 398 sendo Trkc (aminoácidos 32 - 429 do número de acesso XP 015308837.1) e os aminoácidos 399 - 426 sendo uma tag myc-myc-his.

[0112] Em determinados casos, as linhagens celulares foram preparadas para expressar as proteínas TrkB, incluindo o domínio ecto, bem como os domínios transmembrana e citoplasmático da proteína de TrkB. Por exemplo, a SEQ ID NO: 91 é a proteína humana TrkB contendo todos os três domínios contidos dentro dos aminoácidos 32 - 822 do número de acesso NP 001018074.1 ou Uniprot Q16620 - 1, com os aminoácidos 1 - 398 sendo o domínio ecto, e a região transmembrana/citoplasmática definida por cerca dos resíduos de aminoácido 399 - 790. Em um caso, uma linhagem celular TrkB foi preparada a qual expressou TrkB de camundongo (aminoácidos 32 - 476 do número de acesso NP 032771.1; vide também a SEQ ID NO: 92). Em outro caso uma linhagem celular foi preparada para expressar uma proteína de TrkB quimérica, com o domínio ecto do TrkB de camundongo a partir dos aminoácidos 32 - 429 do número de acesso NP 001020245.1 (vide também a SEQ ID NO: 93) ou número Uniprot P15209-1 e os domínios transmembrana e citoplasmático do TrkB humano (aminoácidos 431 - 822 do número de acesso NP 001018074.1) (vide também SEQ ID NO: 91). Uma linhagem celular foi também preparada para expressar TrkB de macaco verde africano (Chlorocebus sabaeus) (aminoácidos 32 - 822 do número de acesso XP 007967815.1 (vide também a SEQ ID NO: 94)).

[0113] O termo “fator neurotrófico derivado do cérebro” ou “BDNF” se refere ao ligante para TrkB e a sequência de aminoácido de BDNF é mostrada na SEQ ID NO: 90 (isoforma A 1 - 120, com os aminoácidos 129 - 247 do número de acesso NP 733928.1 com uma Met adicionada no terminal

N). Em determinados experimentos aqui descritos, a fonte do BDNF é de R & D Systems, 248-BD/CF.

[0114] Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteína pretendem se referir aqui à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína a menos que seja explicitamente especificado como sendo de uma espécie não-humana. Sendo assim, a expressão “TrkB” significa o TrkB humano a menos que seja especificado como sendo de uma espécie não-humana, por exemplo, “TrkB de macaco”, “TrkB de camundongo”, “TrkB de rato”, etc.

[0115] Tal como aqui utilizada, a expressão “anticorpo anti-TrkB” inclui ambos os anticorpos monovalentes com uma única especificidade, bem como anticorpos biespecíficos compreendendo um primeiro braço que se liga ao TrkB e um segundo braço que se liga a um segundo —“antígeno (alvo), em que o braço anti-TrkB compreende qualquer uma das sequências de HCVR/LCVR ou CDR tal como aqui definida na tabela l. A expressão “anticorpo anti-TrkB” também inclui conjugados anticorpo - fármaco (ADCs) compreendendo um anticorpo anti-TrkB ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos conjugados a um fármaco ou toxina (isto é, agente citotóxico). A expressão “anticorpo anti-TrkB” também inclui conjugados anticorpo - radionuclídeo (ARCS) compreendendo um anticorpo anti-TrkB ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos conjugados a um radionuclídeo.

[0116] O termo “anticorpo anti-TrkB”, tal como aqui utilizado, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) que se liga especificamente ao ou interage com o TrkB ou uma porção do TrkB. O termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações bissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou Vx) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, Cul, Cx2 e Crx3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou V1L) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CLl). As regiões VV; e Vr podem ser, ainda, subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRS), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões framework (FR). Cada Vi e V, é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do amino terminal para o carboxi terminal na seguinte ordem: FRl, CDRl1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-TrkB (ou porção de ligação ao antígeno dos mesmos) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinal humana ou podem ser naturalmente ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácido pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[0117] O termo “anticorpo”, como aqui utilizado, também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de anticorpo de comprimento completo. Os termos “porção de ligação ao antígeno” de um anticorpo, “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo, e similares, tais como aqui utilizados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína enzimaticamente obteníveis, sintéticos ou geneticamente projetados que se ligam especificamente a um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, a partir de moléculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrão adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão do DNA que codifica domínios variáveis e opcionalmente constantes do anticorpo. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir, por exemplo, de fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas fago - anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou pelo uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes dentro de uma configuração adequada Ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar os aminoácidos, etc.

[0118] Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (1) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv (scFv) de cadeia única; (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácido que mimetizam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada tal como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3 - CDR3 - FR4 limitado. Outras moléculas projetadas, tais como anticorpos específicos para o domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos de deleção de domínio, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), pequenos imuno- farmacêuticos modulares (SMIPs), e domínios IgNAR variáveis dos tubarões, estão também abrangidos dentro da expressão “fragmento de ligação ao antígeno”, tal como aqui utilizado.

[0119] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo irá tipicamente compreender pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e irá, em geral, compreender pelo menos um CDR, o qual está adjacente a ou enquadrado com uma ou mais sequências framework. Em fragmentos de ligação ao antígeno apresentando um domínio Vx associado a um domínio V1L, os domínios Vx e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e contém dímeros Vu - Vu, Vn - VL ou V1, - V1r. De forma alternativa, O fragmento de ligação ao antígeno a um anticorpo pode conter um domínio Vx ou V1 monomérico.

[0120] Em determinadas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Exemplos não limitativos de configurações de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (1i) Vi — Crl; (ii) Vi — Cn2; (iii) Veg - Cs3; (iv) Vi — Cnl — Crn2; (v) Vig - CHl - CrH2 - Cn3; (vi) Vig - Cr2 - Cn3; (vii) VE - Cu; (viii) V, — Cnl; (ix) V1, - Cr2; (x) V1, — Cn3; (xi) V1, — Cnl - Cn2; (xii) V, -— Cnl -— Cs2 - Cr3; (xiii) V, -— Cr2 - Cnô3; e (xiv) Vi - Cr. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer um dos exemplos de configurações listados acima, os domínios variáveis e constantes podem estar tanto diretamente ligados um ao outro ou podem estar ligados por uma dobra ou região de dobra completa ou parcial. Uma região de dobra pode consistir de pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, os quais resultam em uma ligação flexível ou semi-flexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção podem compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente de um com o outro e/ou com um ou mais domínios Vr ou Vz monoméricos (por exemplo, por ligação (ões bissulfeto).

[0121] Assim como com moléculas de anticorpo, os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo irá tipicamente compreender pelo menos dois diferentes domínios variáveis, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os exemplos de formatos de anticorpo biespecíficos aqui descritos, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis na técnica.

[0122] Em determinados casos, pode ser desejável antagonizar o TrkB, por exemplo, para a inibição do crescimento ou proliferação de, por exemplo, uma célula tumoral neuronal. No entanto, os anticorpos da presente invenção atuam como anticorpos agonistas, os quais atuam como —“melhoradores da sobrevivência neuronal e como neuroprotetores. Os anticorpos da presente invenção podem atuar para a melhora da interação entre TrkB e seu ligante, BDNF. De forma alternativa, os anticorpos da invenção podem mediar a sinalização do TrkB através de um mecanismo que não envolve a melhora da interação do TrkB com seu ligante.

[0123] O termo “anticorpo humano”, tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos humanos de ocorrência não natural. O termo inclui anticorpos que são produzidos de forma recombinante em um mamífero não humano, ou em células de um mamífero não humano. O termo não pretende incluir anticorpos isolados de ou gerados em um indivíduo humano.

[0124] Os anticorpos da invenção podem, em algumas modalidades, ser anticorpos humanos recombinantes e/ou de ocorrência não natural. O termo “anticorpo humano recombinante”, tal como aqui utilizado, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos,

criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos “expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado dentro de uma célula hospedeiro (descrita mais adiante), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória (descrita mais adiante), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para os genes da imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287 - 6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem o encaixe de sequências de gene da imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Em determinadas modalidades, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para as sequências de Tg humano é utilizado, mutagênese somática in vivo) e, então, as sequências de aminoácido das regiões Vx e V, dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto relacionadas às sequências V'x e Vi, da linhagem germinal humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linhagem germinal do anticorpo humano in vivo.

[0125] Anticorpos humanos podem existir em duas formas que estão associadas com heterogeneidade das dobras. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um constructo de quatro cadeias estáveis de aproximadamente 150 - 160 kDa no qual os dímeros são mantidos juntos por uma ligação bissulfeto entre cadeias da cadeia pesada. Em uma segunda forma, os dímeros são estão ligados por meio de ligações bissulfeto entre cadeias e uma molécula de cerca de 75 - 80 kDa é formada composta de uma cadeia leve e pesada covalentemente acoplada (meio anticorpo). Estas formas têm sido extremamente difíceis de separa, mesmo após a purificação de afinidade.

[0126] A frequência do aparecimento da segunda forma em diversos isotipos de IgG intatos é devido a, porém não limitadas a, as diferenças estruturais associadas ao isotipo da região de dobra do anticorpo. Uma única substituição do aminoácido na região de dobra da dobra da IgG4 humana pode reduzir significativamente o aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) para níveis tipicamente observados usando uma dobra da IgGl humana. A presente invenção abrange anticorpos que apresentam uma ou mais mutações na dobra, região Ch2 ou Cr3, as quais podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[0127] O termo “se liga especificamente”, ou “se liga especificamente a” ou similares significa que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. A ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de equilíbrio de dissociação de pelo menos cerca de 1 x 10-º M ou menos (por exemplo, uma Kpv menor denota uma ligação mais forte). Métodos para a determinação se duas moléculas se ligam especificamente são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plasma de superfície, e similares. Tal como aqui descrito, anticorpos foram identificado por ressonância de plasma de superfície, por exemplo, BIACORE”", os quais se ligam especificamente ao TrkB. Além disso, um anticorpo multiespecífico que se liga à proteína de TrkB e um ou mais antígenos adicionais ou um anticorpo biespecífico que se liga a duas diferentes regiões do TrkB são, no entanto, considerados anticorpos que “se ligam especificamente”, tal como aqui utilizados.

[0128] os anticorpos da invenção podem ser anticorpos isolados. Um “anticorpo isolado”, tal como aqui utilizado, significa um anticorpo que tenha sido identificado e separado e/ou recuperado a partir de pelo menos um componente do seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que tenha sido separado ou removido a partir de pelo menos um componente de um organismo, ou a partir de um tecido ou célula na qual o anticorpo naturalmente existe ou é naturalmente produzido, é um “anticorpo isolado” para fins da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Os anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou de isolamento. De acordo com determinadas modalidades, um anticorpo isolado por estar substancialmente livre de outros materiais celular e/ou agentes químicos.

[0129] Os anticorpos anti-TrkB aqui descritos podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas regiões framework e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve. Tais mutações podem ser prontamente constatadas pela comparação das sequências de aminoácido aqui descritas com as sequências disponíveis de, por exemplo, bancos de dados de sequências de anticorpo públicas. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contém uma ou mais mutações podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas tais como, especificidade de ligação melhorada, afinidade de ligação melhorada, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas melhoradas ou aprimoradas (dependendo do caso), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos em sua maneira geral são abrangidos pela presente invenção.

[0130] A presente invenção também inclui anticorpos anti-TrkB compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR aqui descritas apresentando uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-TrkB apresentando sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácido conservativas em relação a qualquer uma das sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR aqui indicadas na tabela 1.

[0131] o termo “epítopo” se refere a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação específico do antígeno na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode apresentar mais do que um epítopo. Sendo assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem apresentar diferentes efeitos biológicos. Os epítopos podem ser tanto conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos a partir de diferentes segmentos da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácido adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Em algumas circunstâncias, um epítopo pode incluir porções de sacarídeos, grupos fosforil ou grupos sulfonil no antígeno.

[0132] o termo “identidade substancial” ou “substancialmente idêntico”, quando se refere a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhado com as inserções ou deleções de nucleotídeo adequadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), existe uma identidade da sequência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 95 &, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % das bases de nucleotídeos, tal como medidas por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tais como FASTA, BLAST ou Gap, tal como discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico apresentando identidade substancial para uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em determinados casos codificar um polipeptídeo apresentando a mesma sequência de aminoácido ou substancialmente similar, tal como o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[0133] Tal como aplicado aos polipeptídeos, o termo “similaridade substancial” ou “substancialmente similar” significa que duas sequências de peptídeo, quando otimamente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesagens padrão de diferença, compartilham pelo menos 95 % de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 98 % ou 99 % de identidade de sequência.

Preferencialmente, posições de resíduo as quais não são idênticas diferem por substituições de aminoácido conservativas.

Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido apresentando uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não modificará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína.

Nos casos em que duas ou mais sequências de aminoácido diferem uma da outra por substituições conservativas, o percentual da identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado à montante para corrigir a natureza conservativa da substituição.

Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos por um técnico no assunto.

Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol.

Biol. 24: 307 - 331, aqui incorporado por referência.

Exemplos de grupos de aminoácidos que apresentam cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais alifático - hidroxil: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; (5 cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina.

Grupos de substituições de aminoácido conservativas preferidos são: valina - leucina - isoleucina, fenilalanina - tirosina, lisina - arginina, alanina - valina, glutamato

- aspartato e asparagina - glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer modificação que apresenta um valor positivo na matriz de probabilidades de registros PAM250 descrita em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 - 1445, aqui incorporado por referência. Uma substituição “moderadamente conservativa” é qualquer modificação que apresenta um valor não negativo na matriz de probabilidades de registros PAM250.

[0134] A similaridade de sequência para os polipeptídeos, a qual é também referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando um software de análise de sequência. O software de análise de proteína combina sequências similares usando medições de similaridade atribuída a diversas substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como Gap e Bestfit os quais podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequências ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína da mesma. Vide, por exemplo, a versão 6.1 do GCG. As sequências de polipeptídeos podem também ser comparadas utilizando FASTA com parâmetros padrão ou recomendados, um programa na versão 6.1 do GCG. O FASTA (por exemplo, FASTA2? e FASTA3) fornece alinhamentos e percentuais de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências consultadas e buscadas (Pearson (2000), acima). Outro algoritmo preferido para a comparação de uma sequência da invenção com um banco de dados contendo um grande número de sequências a partir de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros padrão. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 - 402, cada um aqui incorporado por referência.

Características biológicas dos anticorpos

[0135] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que se ligam ao TrkB humano com um Kp” de menos de cerca de 200 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC, ou a 37 ºC. De acordo com determinadas modalidades, a invenção inclui anticorpos anti-TrkB que se ligam ao TrkB humano com um K” de menos de cerca de 600 pM, menos do que cerca de 300 pM, menos do que cerca de 200 pM, menos do que cerca de 150 pM, menos do que cerca de 100 pM, menos do que cerca de 80 pM, menos do que cerca de 50 pM, menos do que cerca de 40 pM, menos do que cerca de 30 pM, menos do que cerca de 20 pM, menos do que cerca de 10 pM, menos do que cerca de 5 pM, menos do que cerca de 3 pM, ou menos do que cerca de 1 pM.

[0136] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que se ligam ao TrkB humano com uma meia vida dissociativa (t%) maior do que cerca de 10 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 “ºC, ou 37 ºC. De acordo com determinadas modalidades, a invenção inclui anticorpos anti-TrkB que se ligam ao TrkB humano com um t maior do que cerca de 20 minutos, maior do que cerca de 50 minutos, maior do que cerca de 100 minutos, maior do que cerca de 120 minutos, maior do que cerca de 150 minutos, maior do que cerca de 300 minutos, maior do que cerca de 350 minutos, maior do que cerca de 400 minutos, maior do que cerca de 450 minutos, maior do que cerca de 500 minutos, maior do que cerca de 550 minutos, maior do que cerca de 600 minutos, maior do que cerca de 700 minutos, maior do que cerca de 800 minutos, maior do que cerca de 900 minutos, maior do que cerca de 1000 minutos, maior do que cerca de 1100 minutos, ou maior do que cerca de 1200 minutos.

[0137] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que podem ou não se ligar ao TrkB de macaco ou TrkB de camundongo ou rato. Tal como aqui utilizado, um anticorpo “não se liga” a um antígeno particular (por exemplo, TrkB de macaco, camundongo ou rato se o anticorpo, quando testado em um ensaio de ligação ao antígeno tal como ressonância de plasma de superfície, exibe um Ko maior do que cerca de 1000 nM, ou não exibe qualquer ligação ao antígeno, no referido ensaio. Outro formato de ensaio que pode ser usado para determinar se um anticorpo se liga ou não se liga a um antígeno particular, de acordo com este aspecto da invenção, é o ELISA.

[0138] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que ativam a sinalização de TrkB humano em células projetadas para expressar um receptor TrkB com um ECsº de menos de cerca de 100 pM. Usando um formato de ensaio descrito no Exemplo 5, ou um formato de ensaio substancialmente similar, um valor ECso pode ser calculado como a concentração do anticorpo requerida para ativar a sinalização mediada por TrkB para o sinal semi máximo observado. Sendo assim, de acordo com determinadas modalidades, a invenção inclui anticorpos anti-TrkB que mediam a sinalização de TrkB humano em células projetadas para expressar um receptor TrkB na presença ou na ausência de BDNF com um ECso de menos de cerca de 500 pM, menos do que cerca de 400 pM, menos do que cerca de 300 pM, menos do que cerca de 200 pM, menos do que cerca de 100 pM, menos do que cerca de 90 pM, menos do que cerca de 80 pM, menos do que cerca de 70 pM, menos do que cerca de 60 pM, menos do que cerca de 50 pM, menos do que cerca de 40 pM, menos do que cerca de 30 pM, menos do que cerca de 20 pM, menos do que cerca de 10 pM, ou menos do que cerca de 5 pM, tal como medido usando o formato de ensaio aqui descrito no Exemplo ou um ensaio substancialmente similar.

[0139] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que ativam o receptor TrkB tal como mostrado pela fosforilação do TrkB após injeção hipocampal direta em camundongos humanizados para expressar o receptor TrkB humano, tal como mostrado em Exemplo 6.

[0140] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que promovem a perda de peso em camundongos humanizados para expressar o receptor TrkB humano. Os anticorpos da invenção também atuam para promover a perda massa de gordura e aumentar a atividade locomotora nestes camundongos, enquanto diminui a ingestão de alimentos e água (vide o Exemplo 7).

[0141] os anticorpos da invenção promovem a sobrevivência de células ganglionares da retina (RGCs) em ratos humanizados para expressar o receptor TrkB humano, quando testado em um modelo de transecção do nervo óptico. Vide o Exemplo 8.

[0142] Os anticorpos da invenção ativam as vias à jusante MAPK/ERK e PI3K/Akt, tal como mostrado pela exposição dos neurônios corticais primários de camundongo obtidos a partir de camundongos com TrkB humanizado para os anticorpos da invenção. (Vide o Exemplo 9).

[0143] os anticorpos agonistas anti-TrkB da invenção também promovem a sobrevivência de células SH-SY5Y de maneira dependente da dose, tal como mostrado no Exemplo

10.

[0144] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que bloqueiam a ligação do TrkB ao BDNF com um ICsºo de menos de cerca de 5 nM. Por exemplo, tal como mostrado no Exemplo 12, todos os três anticorpos testados bloquearam > 50 % de ligação de TrkB de camundongo ou rato ao BDNF. Usando o formato de ensaio descrito no Exemplo 12, ou um formato de ensaio substancialmente similar, um valor de ICso pode ser calculado como a concentração de anticorpo requerida para bloquear a ligação do TrkB ao BDNF quando comparada com o sinal máximo observado na ausência de anticorpo. Sendo assim, de acordo com determinadas modalidades, a invenção inclui anticorpos anti-TrkB que bloqueiam a ligação do TrkB ao BDNF com um ICso de menos de cerca de 5 nM, menos do que cerca de 4 nM, menos do que cerca de 3 nM, menos do que cerca de 2 nM, menos do que cerca de 1 nM, menos do que cerca de 900 pM, menos do que cerca de 800 pM, menos do que cerca de 700 pM, menos do que cerca de 600 pM, menos do que cerca de 500 pM, menos do que cerca de 400 pM, menos do que cerca de 300 pM, menos do que cerca de 200 pM, menos do que cerca de 100 pM, menos do que cerca de 90 pM, menos do que cerca de 80 pM, menos do que cerca de 70 pM, menos do que cerca de 60 pM, menos do que cerca de 50 pM, menos do que cerca de 40 pM, menos do que cerca de 30 pM, ou menos do que cerca de 20 pM, tal como medido usando o formato de ensaio aqui descrito no Exemplo 12 ou um ensaio substancialmente similar. Em uma modalidade, os anticorpos TrkB da invenção bloqueiam a ligação do TrkB ao BDNF com um ICso que varia de cerca de 180 pM a cerca de 4 nM.

[0145] Uma característica de ligação de um anticorpo da invenção (por exemplo, qualquer uma das características de ligação aqui mencionadas acima), quando descrita em termos de ser “medida por ressonância de plasma de superfície” significa que a característica de ligação relevante que pertence à interação entre o anticorpo e o antígeno são medidas usando um instrumento de ressonância de plasma de superfície (por exemplo, um instrumento Biacore6, GE Healthcare) usando condições de ensaio Biacore padrão tal como aqui ilustradas nos Exemplos 3 e 4, ou formatos de ensaio substancialmente similares. Em determinadas modalidades, os parâmetros de ligação são medidos a 25 ºC, enquanto em outras modalidades, os parâmetros de ligação são medidos a 37 “ºC.

[0146] A presente invenção inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao TrkB, compreendendo uma HCVR e/ou uma LCVR compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir de qualquer uma de sequências de aminoácido da HCVR e/ou LCVR listadas na tabela 1.

[0147] Os anticorpos da presente invenção podem possuir uma ou mais das características biológicas acima mencionadas ou qualquer combinação das mesmas. A lista acima de características biológicas dos anticorpos da invenção não pretende ser exaustiva. Outras características biológicas dos anticorpos da presente invenção serão evidentes para uma pessoa com habilidades comuns na técnica a partir da revisão da presente divulgação incluindo os Exemplos de trabalho da mesma.

Mapeamento do epítopo e tecnologias relacionadas

[0148] O epítopo ao qual os anticorpos da presente invenção se ligam podem consistir de uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais aminoácidos de uma proteína de TrkB. Alternativamente, o epítopo pode consistir de uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácido) de TrkB. Em algumas modalidades, o epítopo está localizado em ou próximo da superfície de TrkB, por exemplo, no domínio que interage com seu ligante, BDNF. Em outras modalidades, o epítopo está localizado em ou próximo da superfície de TrkB que não interage com o ligante TrkB, por exemplo, em uma localização na superfície de TrkB na qual um anticorpo, quando ligado a tal epítopo, não interfere com a interação entre o TrkB e seu ligante.

[0149] Diversas técnicas conhecidas por uma pessoa com habilidades comuns na técnica podem ser usadas para determinar se um anticorpo “interage com um ou mais dos aminoácidos” dentro de um polipeptídeo ou proteína. Exemplos de técnicas incluem, por exemplo, ensaios de bloqueio cruzado de rotina, tais como aqueles descritos em Antibodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análise mutacional por varredura de alanina, análise de blots de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443 - 463) e análise de clivagem de peptídeo. Além disso, os métodos tais como excisão do epítopo, extração do epítopo e modificação química dos antígenos podem ser empregados (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487 - 496). Outros métodos que podem ser usados para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectado por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve marcar a proteína de interesse com deutério, seguida da ligação do anticorpo com a proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína/anticorpo é transferido para a água para permitir que a troca de hidrogênio/deutério ocorra em todos os resíduos, exceto os resíduos protegidos pelo anticorpo (o qual permanece marcado com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem por protease e análise de espectrometria de massa, assim revelando os resíduos marcados com deutério os quais correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267 (2): 252 — 259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A - 265A.

[0150] A presente invenção inclui anticorpos anti- TrkB que se ligam ao mesmo epítopo tal como qualquer um dos exemplos de anticorpos específicos aqui descritos (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido tal como aqui definida na tabela 1). Da mesma forma, a presente invenção também inclui anticorpos anti-TrkB que competem pela ligação ao TrkB com qualquer um dos exemplos de anticorpos específicos aqui descritos (por exemplo, anticorpos compreendendo qualquer uma das sequências de aminoácido tal como aqui definida na tabela 1).

[0151] Uma pessoa pode facilmente determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que, ou compete pela ligação com, um anticorpo de referência anti-TrkB pelo uso de métodos de rotina conhecidos na técnica e aqui exemplificados. Por exemplo, para determinar se um anticorpo teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo de referência anti-TrkB da invenção, o anticorpo de referência é permitido se ligar a uma proteína de TrkB. Em seguida, a capacidade de um anticorpo teste em se ligar a molécula de TrkB é avaliada. Se o anticorpo teste é capaz de se ligar ao TrkB após a ligação de saturação com o anticorpo de referência anti-TrkB, pode ser concluído que o anticorpo teste se liga a epítopo diferentes do anticorpo de referência anti-TrkB. Por outro lado, se o anticorpo teste não é capaz de se ligar à molécula de TrkB após a ligação de saturação com o anticorpo de referência anti- TrkB, então o anticorpo teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo de referência anti-TrkB da invenção. Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação do peptídeo e análise de ligação) podem, então, ser realizadas para confirmar se a falta de ligação observada do anticorpo teste é, de fato, devido à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação ao anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica. De acordo com determinadas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam ao mesmo (ou se sobrepõem) epítopo, por exemplo, a um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50 %, porém preferencialmente 75 %, 90 % ou até mesmo 99 % tal como medido em um ensaio de ligação competitiva (vide, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990: 50: 1495 - 1502). Alternativamente, dois anticorpos são considerados para se ligar a um mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos são considerados para apresentar “epítopo sobrepostos” se apenas um subconjunto das mutações dos aminoácidos que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.

[0152] Para determinar se um anticorpo compete pela ligação (ou tem competição cruzada para a ligação) com um anticorpo de referência anti-TrkB, a metodologia de ligação acima descrita é realizada em duas orientações: em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é permitido se ligar a uma proteína de TrkB sob condições de saturação seguida pela avaliação da ligação do anticorpo teste à molécula de TrkB. Em uma segunda orientação, o anticorpo teste é permitido se ligar a uma molécula de TrkB sob condições de saturação seguida pela avaliação da ligação do anticorpo de referência à molécula de TrkB. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro (saturação) anticorpo é capaz de se ligar à molécula TrkB, então se conclui que o anticorpo teste e o anticorpo de referência competem pela ligação ao TrkB (vide, por exemplo, o formato de ensaio aqui descrito no Exemplo 4, no qual a proteína de TrkB é capturada nas pontas do sensor e as pontas do sensor revestidas com TrkB são tratadas com um anticorpo de referência [MAb-l] e um anticorpo teste anti-TrkB [mAb-2] sequencialmente e em ambas as ordens de ligação). Como será apreciado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente se ligar ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, porém pode estericamente bloquear a ligação do anticorpo de referência pela ligação em um epítopo sobreposto ou adjacente.

Preparação de anticorpos humanos

[0153] Os anticorpos anti-TrkB da presente invenção podem ser anticorpos completamente humanos, porém de ocorrência não natural. Métodos para a geração de anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais completamente humanos são conhecidos na técnica. Quaisquer métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para fazer com que os anticorpos humanos se liguem especificamente ao TrkB humano.

[0154] Usando tecnologia VELOCIMMUNEO (vide, por exemplo, Us 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNEO) ou qualquer outro método conhecido para a geração de anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para um alergeno são inicialmente isolados apresentando uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNEG envolve a geração de um camundongo transgênico que apresenta um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas operacionalmente ligadas ao loci da região constante de camundongo endógena de modo que o camundongo produz um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta a um estímulo antigênico. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves do anticorpo é isolado e operacionalmente ligado ao DNA que codifica as regiões constantes de cadeia leve e pesada humanas. O DNA é, então, expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo completamente humano.

[0155] Em geral, um camundongo VELOCIMMUNEO é desafiado com o antígeno de interesse, e células linfáticas (tais como células B) são recuperadas a partir de camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem mielo celular para preparar linhagens celulares de hibridoma imortal, e tais linhagens celulares de hibridoma são exibidas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para O antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e cadeia leve pode ser isolado e ligado às regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. A referida proteína do anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos para antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada podem ser isolados diretamente a partir de linfócitos específicos para antígeno.

[0156] Tal como descrito na seção experimental abaixo, os anticorpos quiméricos de alta afinidade, os quais são isolados apresentando uma região variável humana e uma região constante de camundongo, são caracterizados e selecionados para as características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são, então, substituídas com uma região constante humana desejada para gerar os anticorpos completamente humanos da invenção, por exemplo, IgGl ou IgG4 do tipo selvagem ou modificados. Enquanto a região constante selecionada pode variar de acordo com o uso específico, as características de alta afinidade de ligação ao antígeno e especificidade alvo estão na região variável.

[0157] Em determinadas modalidades, pode ser desejável testar anticorpos anti-TrkB humanos em camundongos ou ratos que foram projetados para expressar um receptor TrkB humano. Estes camundongos ou ratos podem ser benéficos em circunstâncias em que os anticorpos anti-TrkB podem apenas se ligar ao TrkB humano, porém não irá reagir de forma cruzada com o TrkB de camundongo ou rato. Determinados exemplos na presente invenção foram realizados usando camundongos e ratos que foram geneticamente modificados para expressar o TrkB humano. Qualquer método conhecido para um técnico no assunto pode ser usado para a geração dos referidos camundongos e ratos humanizados com TrkB.

[0158] Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem afinidades muito altas, tipicamente possuindo Kpr de cerca de 10? até cerca de 10º M, quando medidos por ligação ao antígeno tanto imobilizado em fase sólida ou em fase de solução.

Bioequivalentes

[0159] Os anticorpos anti-TrkB e fragmentos de anticorpo da presente invenção abrangem proteínas que apresentam sequências de aminoácido que variam daquelas dos anticorpos descritos, porém que retém a capacidade de se ligar ao TrkB humano. Tais variantes de anticorpos e fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparado com as sequências pai, porém exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Da mesma forma, o anticorpo anti-TrkB que codifica sequências de DNA da presente invenção abrange sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparado à sequência descrita, porém que codifica um anticorpo anti- TrkB ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-TrkB ou fragmento de anticorpo da invenção. Exemplos das referidas variantes de sequências de aminoácido e DNA são discutidas acima.

[0160] Duas proteínas de ligação ao antígeno, Ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão da absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, tanto em dose única ou em múltiplas doses. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles forem equivalente na extensão da sua absorção, porém não em sua taxa de absorção e ainda, podem ser considerados bioequivalentes uma vez que as referidas diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas nas marcações, não são essenciais para a obtenção de concentrações de fármaco no corpo eficazes sobre, por exemplo, o uso crônico, e são consideradas medicamente não significativas para o produto de fármaco estudado em particular.

[0161] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não existir diferenças clinicamente significativas na sua segurança, Pureza Ee potência.

[0162] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se um paciente puder trocar uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa na imunogenicidade ou eficácia diminuída, tal como comparado a uma terapia continuada sem tal troca.

[0163] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se ambas atuarem por um mecanismo ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, na extensão de que os referidos mecanismos são conhecidos.

[0164] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. As medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, nos quais a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que tenha sido correlacionado com e que seja razoavelmente previsível dos dados de biodisponibilidade in vivo humana; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, nos quais o efeito farmacológico agudo adequado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabeleça a segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[0165] As variantes bioequivalentes dos anticorpos anti-TrkB da invenção podem ser interpretadas como, por exemplo, a realização de diversas substituições de resíduos ou sequências ou deleção de resíduos ou sequências terminais ou internas não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para evitar a formação de pontes bissulfeto intramoleculares desnecessárias Ou incorretas após a renaturação. Em outros contextos, os anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpos anti-TrkB compreendendo mudanças de aminoácido as quais modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações as quais eliminam ou removem a glicosilação.

Seletividade das espécies e reatividade cruzada das espécies

[0166] A presente invenção, de acordo com determinadas modalidades, fornece anticorpos anti-TrkB que se ligam ao TrkB humano, porém não ao TrkB de outras espécies. A presente invenção também inclui anticorpos anti-TrkB que se ligam a TrkB humano e ao TrkB de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti- TrkB da invenção podem se ligar ao TrkB humano e podem ou não se ligar ao, dependendo do caso, um ou mais de TrkB de camundongo, rato, cobaia, hamster, gerbo, porco, gato, cachorro, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cinomolgos, mico, macaco rhesus ou chimpanzé. De acordo com determinados exemplos de modalidades da presente invenção, os anticorpos anti-TrkB são fornecidos os quais se ligam especificamente ao TrkB humano, porém não se ligam, ou se ligam apenas fracamente, a TrkB de camundongo ou rato.

Anticorpos multiespecíficos

[0167] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecífico ou multiespecífico (por exemplo biespecífico). o anticorpo multiespecífico pode ser específico para diferentes epítopos de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios específicos de ligação ao antígeno para mais do que um polipeptídeo alvo. Vide, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60 - 69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238 - 244. Os anticorpos anti- TrkB da presente invenção podem estar ligados a ou ser co- expressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo Ou fragmento do mesmo pode estar funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra) para uma ou mais outras entidades “moleculares, tais como outro anticorpo Ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação.

[0168] A presente invenção inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina se liga ao TrkB humano, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo antígeno. O braço de ligação ao TrkB pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácido da HCVR/LCVR ou CDR tal como aqui definida na tabela 1.

[0169] Exemplos de formatos de anticorpo biespecífico que podem ser usados no contexto da presente invenção envolvem o uso de um primeiro domínio Cxn3 da imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio Cx3 da Ig, em que o primeiro e o segundo domínios Crx3 da Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à proteína A quando comparado com um anticorpo biespecífico que não tem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio Cx3 da Ig se liga à proteína A e o segundo domínio Cr3 da Ig contém uma mutação que reduz ou elimina a proteína A de ligação tal como uma modificação H95R (pela numeração do éxon IMGT; H435R pela numeração EU). O segundo Cx3 pode ainda compreender uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas dentro do segundo Cun3 incluem: DI6E, LI18M, N44S, K52N, V57M e V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I por EU) no caso dos anticorpos IgGl; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q1l5R, N44S K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG4. As variações no formato de anticorpo biespecífico descritas acima são contempladas dentro do escopo da presente invenção.

[0170] Outros exemplos de formatos biespecífico que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecífico a base de scFv ou diacorpos, fusões IgG - scFv, domínio variável dual (DVD) - Ig, quadroma, protuberâncias em buracos (em inglês, knobs-into-holes), cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com knobs-into-holes, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED) corpos, zíper de leucina, Duocorpo, IgGl/IgG2, Fab de atuação dual (DAF) - IgG, e formatos MAb 2 biespecíficos (vide, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4: 6, 1 - l11, e referências aqui citadas, para uma revisão dos formatos acima citados). Os anticorpos biespecífico podem também ser construídos usando uma conjugação de peptídeo/ácido nucleico, por exemplo, em que aminoácidos não naturais com reatividade química ortogonal são usados para gerar conjugados anticorpo - oligonucleotídeo específicos para um sítio os quais, então, se auto montam em complexos multiméricos com composição, valência e geometria definidas. (Vide, por exemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de dezembro de 2012]).

Formulação terapêutica e administração

[0171] A invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-TrkB ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com carreadores, excipientes e outros agentes adequados que fornecem transferência melhorada, distribuição, tolerância e similares. Uma grande variedade de formulações adequadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Ciências Farmacêuticas de Remington, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeos (catiônicas ou aniônicas) (tais como LIPOFECTIN"", Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões carbowax (polietileno glicois de diversos pesos moleculares), geis semissólidos e misturas semissólidos contendo carbowax. Vide também Powell et al. “Compêndio de excipientes para formulações parenterais” PDA (1998) JJ Pharm Sci Technol 52: 238 - 311.

[0172] A dose de anticorpo administrada a um paciente pode variar dependendo da idade e do tamanho do paciente, doença alvo, condições, via de administração e similares. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso corporal ou área de superfície corporal. Em um paciente adulto, o anticorpo da presente invenção pode ser vantajosamente administrado intravenosamente normalmente em uma única dose de cerca de 0,01 a cerca de mg/kg do peso corporal, mais preferencialmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg do peso corporal. Dependendo da severidade da condição, a frequência e a duração do tratamento pode ser ajustada. Dosagens eficazes e cronogramas para a administração de anticorpos anti-TrkB podem ser determinadas empiricamente; por exemplo, O progresso do paciente pode ser monitorado por avaliação periódica e a dose é, então, ajustada. Além disso, o escalonamento de dosagens interespécies pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351).

[0173] Diversos sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulamento em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429 - 4432). Os métodos de introdução incluem, porém não estão limitadas a, vias intravitreal, intraocular, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção in bolus, por absorção até o revestimento epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[0174] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser distribuída subcutaneamente ou intravenosamente com uma agulha e seringa padrões. Além disso, em relação à distribuição subcutânea, um dispositivo para a pronta distribuição em caneta apresenta aplicações na distribuição de uma composição farmacêutica da presente invenção. O referido dispositivo para distribuição em caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo para distribuição em caneta reutilizável, em geral, utiliza um cartucho reutilizável que contém uma composição farmacêutica. Uma vez que toda a composição farmacêutica dentro do cartuxo tenha sido administrada e o cartuxo está vazio, O cartuxo vazio pode prontamente ser descartado e substituído por um novo cartuxo que contém a composição farmacêutica. O dispositivo para distribuição em caneta pode, então, ser reutilizado. Em um dispositivo para distribuição em caneta descartável, não há cartuxo substituível. Em vez disso, o dispositivo para distribuição em caneta descartável vem pré-preenchido com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez que o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é descartado.

[0175] Diversos dispositivo para distribuição em caneta reutilizáveis e de auto injeção apresentam aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, porém não estão limitados a AUTOPEN" (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), caneta DISETRONIC" (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25", caneta HUMALOG", caneta HUMALIN 70/30" (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN" LI, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR" (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD" (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN", OPTIPEN PRO”, OPTIPEN STARLET" e OPTICLIK" (Sanofi-aventis, Frankfurt, Alemanha), para nomear apenas algumas. Exemplos de dispositivo para distribuição em caneta descartável apresentando aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, porém não estão limitadas a caneta SOLOSTAR" (Sanofi-aventis), a FLEXPEN" (Novo Nordisk) e a KWIKPEN" (Eli Lilly), o auto injetor SURECLICK'"" (Amgen, Thousand Oaks, CA), o PENLET!" (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), o EPIPEN (Dey, L.P.) ea caneta HUMIRA"* (Abbott Labs, Abbott Park IL), para nomear apenas algumas.

[0176] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser distribuída em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (vide Langer, acima; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados; vide, Aplicações Médicas de Liberação Controlada, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Flórida. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser posicionado em proximidade do alvo da composição, assim, requerendo apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, 1984, em Aplicações Médicas de Liberação Controlada, acima, volume 2, páginas 115 - 138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249: 1527 - 1533.

[0177] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosa, intravitreal, intraocular, subcutânea, intracutânea e intramuscular, infusões por gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, pela dissolução, suspensão Ou emulsificação do anticorpo ou seu sal acima descrito em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente utilizado para injeções. Como meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., os quais podem ser usados em combinação com um agente de solubilização adequado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poli álcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., os quais podem ser usados em combinação com um agente de solubilização, tais como benzil benzoato, benzil álcool, etc. A injeção então preparada é preferencialmente preenchida em uma ampola adequada.

[0178] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para caber uma dose de ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas) supositórios, etc. A quantidade de anticorpo acima mencionada contida é, em geral, cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo acima mencionado esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem.

Usos terapêuticos dos anticorpos

[0179] A presente invenção inclui métodos compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma composição terapêutica compreendendo um anticorpo anti-TrkB (por exemplo, um anticorpo anti-TrkB compreendendo qualquer uma das sequências da HCVR/LCVR ou CDR, tal como aqui definida na tabela 1). A composição terapêutica pode compreender qualquer um ou mais dos anticorpos anti-TrkB ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

[0180] Os anticorpos da invenção são úteis, dentre outros, para o tratamento, prevenção e/ou melhora de qualquer doença ou disfunção associada com ou mediada pela expressão ou atividade do TrkB. Os anticorpos agonistas do TrkB da invenção podem ser usados para melhorar a função nervosa e podem ser usados para tratar ou evitar qualquer doença ou condição que é caracterizada, em parte, pela degradação celular, em particular pela lesão da célula nervosa ou degeneração da célula nervosa, por exemplo, uma lesão aguda do sistema nervoso ou uma doença neurodegenerativa crônica.

[0181] A presente invenção inclui métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou disfunção do olho pela administração a um paciente em necessidade de tal tratamento de um anticorpo anti-TrkB ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tal como aqui descrito em outro lugar.

[0182] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método de prevenção da lesão ou morte de neurônios da retina. Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método de tratamento de doenças patológicas em que a degeneração da retina ocorre. Em uma modalidade, os anticorpos anti- TrkB da invenção podem fornecer um método de tratamento do olho antes ou após a cirurgia ocular, exposição à luz ou outro trauma ambiental assim evitando a degeneração das células da retina. Em uma modalidade, os anticorpos anti- TrkB da invenção podem fornecer um método de prevenção da lesão do fotorreceptor e degeneração no olho. Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método de proteção dos neurônios da retina sem a indução de efeitos colaterais. Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem fornecer um método para permitir que fotorreceptores lesionados se recuperem Ou se regenerem.

[0183] Em determinadas modalidades, as doenças do olho tratáveis pelo uso de um ou mais dos anticorpos anti- TrkB da invenção podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em glaucoma, retinopatia diabética degeneração macular relacionada com a idade ou outras maculopatias, neuropatia isquêmica óptica, neurite óptica, isquemia da retina, degeneração do fotorreceptor, retinite pigmentosa, amaurose congênita de Leber, neuropatia óptica hereditária de Leber, síndrome de Usher, doença de Stargardt e oclusões da artéria ou veia da retina.

[0184] Outras condições patológicas tratáveis com um ou mais anticorpos anti-TrkB da invenção incluem descolamento da retina, retinopatias fóticas, retinopatias induzidas por cirurgias (seja mecanicamente ou induzida por luz), retinopatias tóxicas, retinopatia de prematuridade, retinopatias virais tais como retinopatia CMV ou HIV relacionada à AIDS; uveíte; retinopatias isquêmicas devido a oclusão venosa ou arterial ou outra disfunção vascular, retinopatias devido ao trauma ou lesões de penetração do olho, vitreoretinopatia periférica ou degenerações hereditárias da retina.

[0185] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TrkB da invenção podem ser formulados para distribuição intraocular ou intravitreal.

[0186] A presente invenção também fornece métodos para o tratamento de outras doenças ou disfunções do sistema nervoso central ou periférico, tais como derrame, ou lesão cerebral traumática. Além disso, uma vez que os anticorpos da presente invenção atuam para promover a sobrevivência neuronal e atuam como neuroprotetores, qualquer um ou mais destes anticorpos agonistas podem mostrar-se benéficos no tratamento de um paciente que sofre de uma doença ou disfunção do sistema nervoso em que a sobrevivência neuronal é de importância primordial para a recuperação ou reparo do dano celular causado por uma lesão ao sistema nervoso ou causado por uma doença que apresenta um efeito principal no sistema nervoso, incluindo doenças neurodegenerativas.

[0187] No contexto dos métodos de tratamento aqui descritos, o anticorpo anti-TrkB pode ser administrado como uma monoterapia (isto é, como o único agente terapêutico) ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

Terapias e formulações de combinação

[0188] A presente invenção inclui composições e formulações terapêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-TrkB aqui descritos em combinação com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais, e métodos de tratamento compreendendo a administração de tais combinações a indivíduos em necessidade dos mesmos.

[0189] Os anticorpos anti-TrkB da presente invenção podem ser co-formulados com e/ou administrados em combinação com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em: um fármaco que ajuda a diminuir a pressão intraocular (um fármaco de diminuição da pressão intraocular), uma neurotrofina e um antagonista do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tais como um captador de VEGF, por exemplo aflibercept (EYLEAG). Outros medicamentos que podem ser combinados com os anticorpos TrkB da invenção incluem, porém não estão limitadas a, um análogo da prostaglandina (por exemplo ZIOPTAN", XALATANO), um beta bloqueador, (por exemplo TIMOPTIC XEG, ISTALOLO, BETOPTICOS); um agonista adrenérgico alfa-2 (por exemplo apraclonidina), inibidores da anidrase carbônica (por exemplo TRUSOPTO, AZOPTO), um agente colinérgico (por exemplo ISOPTOGCARPINE, gel de PILOPINE HSO) ou um terapêutico combinado (um beta bloqueador mais um inibidor da anidrase carbônica, por exemplo COMBIGAN", COSOPTGO).

[0190] Os anticorpos anti-TrkB da invenção podem também ser administrados e/ou co-formulados em combinação com antivirais, antibióticos, analgésicos, antioxidantes, inibidores da COX e/ou AINEs. Os anticorpos anti-TrkB podem também ser usados em conjunto com outros tipos de terapia incluindo terapia com células tronco, cirurgia de filtração de glaucoma, cirurgia a laser ou terapia gênica.

[0191] os componentes terapeuticamente ativos adicionais, por exemplo, qualquer um dos agentes listados acima ou derivados dos mesmos, podem ser administrados logo antes da, juntos com ou brevemente após a administração de um anticorpo anti-TrkB da presente invenção; (para fins da presente divulgação, tais regimes de administração são considerados a administração de um anticorpo anti-TrkB “em combinação com” um componente terapeuticamente ativo adicional). A presente invenção inclui composições farmacêuticas nas quais um anticorpo anti-TrkB da presente invenção é co-formulado com um ou mais dos componentes terapeuticamente ativos adicionais tal como aqui descritos em outro lugar.

Regimes de administração

[0192] De acordo com determinadas modalidades da presente invenção, múltiplas doses de um anticorpo anti- TrkB (ou uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-TrkB e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais aqui mencionados) podem ser administradas a um indivíduo ao longo de um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem sequencialmente a administração a um indivíduo de múltiplas doses de um anticorpo anti-TrkB da invenção. Tal como aqui utilizado, “a administração sequencial” significa que cada dose do anticorpo anti-TrkB é administrada ao indivíduo em um diferente ponto no tempo, por exemplo, em diferentes dias separados por um intervalo pré-determinado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos os quais compreendem a administração sequencial ao paciente de uma única dose inicial de um anticorpo anti-

TrkB, seguida por uma ou mais doses secundárias do anticorpo anti-TrkB e, opcionalmente, seguida por uma ou mais doses terciárias do anticorpo anti-TrkB.

[0193] os termos “dose inicial”, “doses secundárias”, e “doses terciárias” se referem à sequência temporal de administração do anticorpo anti-TrkB da invenção. Sendo assim, como “dose inicial” é a dose a qual é administrada no começo do regime de tratamento (também referida como a “dose da linha de base”); as “doses secundárias” são as doses as quais são administradas após a dose inicial; e as “doses terciárias” são as doses as quais são administradas após as doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem, todas, conter a mesma quantidade de anticorpos anti-TrkB, porém, em geral, podem diferir uma da outra em termos de frequência de administração. Em determinadas modalidades, no entanto, a quantidade de anticorpo anti-TrkB contida nas doses inicial, secundária e terciária variam de uma para a outra (por exemplo, ajustadas para cima ou para baixo, como adequado) durante o curso do tratamento. Em determinadas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no começo do regime de tratamento como “doses de carregamento” seguidas por doses subsequentes que são administradas com menor frequência (por exemplo, “doses de manutenção”).

[0194] Em determinados exemplos de modalidades da presente invenção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada de 1 a 26 (por exemplo, 1, 1%, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, T4, 8, 84, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 174, 18,

18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26% ou mais) semanas após a dose imediatamente precedente. A expressão “a dose imediatamente precedente”, tal como aqui utilizada, significa, em uma sequência de múltiplas administrações, a dose de anticorpo anti-TrkB, a qual é administrada a um paciente antes da administração da próxima dose na sequência sem nenhuma dose interveniente.

[0195] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender a administração a um paciente de qualquer número de doses secundárias e/ou terciárias de um anticorpo anti-TrkB. Por exemplo, em determinadas modalidades, apenas uma única dose secundária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses secundárias são administradas ao paciente. Da mesma forma, em determinadas modalidades, apenas uma única dose terciária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou more) doses terciárias são administradas ao paciente. o regime de administração pode ser realizado indefinidamente ao longo do tempo de vida de um indivíduo particular ou até que tal tratamento não seja mais terapeuticamente necessário ou vantajoso.

[0196] Em modalidades que envolvem múltiplas doses secundárias, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que a outra dose secundária. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente de 1 a 2 semanas ou l a 2 meses após a dose imediatamente precedente. De forma similar, em modalidades que envolvem múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente de 2 a 12 semanas após a dose imediatamente precedente. Em determinadas modalidades da invenção, a frequência na qual as doses secundárias e/ou terciárias são administradas a um paciente podem variar ao longo do curso do regime de tratamento. A frequência da administração pode também ser ajustada durante o curso do tratamento por um médico dependendo das necessidades do paciente individual após o exame clínico.

[0197] A presente invenção inclui regimes de administração nos quais 2 a 6 doses de carregamento são administradas a um paciente em uma primeira frequência (por exemplo, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez ao mês, uma vez a cada dois meses, etc.), seguida pela administração de duas ou mais doses de manutenção ao paciente em uma menor frequência. Por exemplo, de acordo com este aspecto da invenção, se as doses de carregamento são administradas em uma frequência de uma vez ao mês, então, as doses de manutenção podem ser administradas ao paciente uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, etc.

Usos diagnósticos dos anticorpos

[0198] Os anticorpos anti-TrkB da presente invenção podem também ser usados para detectar e/ou medir TrkB, ou células que expressam TrkB em uma amostra, por exemplo, para fins de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti- TrkB, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada pela expressão aberrante (por exemplo, super expressão, sub expressão, falta de expressão, etc.) de TrkB. Exemplos de ensaios de diagnósticos para TrkB podem compreender, por exemplo, o contato de uma amostra, obtida a partir de um paciente, com um anticorpo anti-TrkB da invenção, em que oO anticorpo anti-TrkB é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-TrkB não marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário o qual é, por si só, detectavelmente marcado. A marcação detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, tal como ?H, “ºC, 32P, >S ou !??IT; uma porção fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou luciferase. Exemplos de ensaios específicos que podem ser usadas para detectar ou medir o TrkB em uma amostra incluem ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), rádio imunoensaio (RIA) e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[0199] As amostras que podem ser usadas nos ensaios de diagnóstico de TrkB de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou de fluido obtenível de um paciente, a qual contém quantidades detectáveis de proteína de TrkB ou fragmentos da mesma, sob condições normais ou patológicas. Em geral, níveis de TrkB em uma amostra particular obtida a partir de um paciente saudável (por exemplo, um paciente que não está afligido com uma doença ou condição associada com níveis ou atividade anormais de TrkB) serão medidos para inicialmente estabelecer um nível de TrkB na linha de base ou padrão.

Este nível de TrkB na linha de base pode, então, ser comparado contra os níveis de TrkB medidos em amostras obtidas a partir de indivíduos suspeitos de apresentar uma doença ou condição relacionada ao TrkB.

EXEMPLOS

[0200] Os exemplos a seguir são apresentados para fornecer para um técnico no assunto uma divulgação completa e descrição de como fazer e utilizar os métodos e composições da invenção, e não pretendem limitar o escopo daquilo que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos de modo a garantir a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades temperatura, etc.), porém alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, peso molecular é o peso molecular médio, temperatura está em graus Centígrados, a temperatura ambiente é de cerca de 25 ºCea pressão é ou está próxima da atmosférica.

Exemplo 1: Geração de anticorpo humanos para TrkB

[0201] Anticorpos humanos para TrkB foram gerados em um camundongo compreendendo DNA que codifica uma região variável de cadeia pesada e leve humana da imunoglobulina kappa. Em uma modalidade, os anticorpos humanos foram gerados em um camundongo VELOCIMMUNE”. Em uma modalidade, os camundongos VelocImmuneO (VI) foram imunizados com TrkB(ecto)mFc humano (SEQ ID NO: 77). Em uma modalidade, os camundongos VelocImmuneO (VI) foram imunizados com TrkB(ecto)mFc de camundongo (SEQ ID NO: 80). A resposta imune ao anticorpo foi monitorada por imuno ensaio específico para TrkB. Por exemplo, os soros foram avaliados para titulações de anticorpos específicos para TrkB de comprimento completo purificado. Os clones produtores de anticorpo foram isolados usando ambas as tecnologias de classificação de células B (BST) e métodos de hibridoma. Por exemplo, quando uma resposta imune desejada foi alcançada, os esplenócitos foram colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongo para Preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma foram avaliadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos específicos para TrkB. Determinados anticorpos TrkB anti-camundongo foram gerados neste sentido e são designados M2aMl4173N, M2aMl14178N e M2aM14179N.

[0202] Anticorpos anti-TrkB foram também isolados diretamente a partir de células B de camundongos positivos para o antígeno sem fusão às células de mieloma, tal como descrito na patente norte americana US 7582298, aqui especificamente incorporada por referência em sua totalidade. Usando este método, diversos anticorpos anti- TrkB completamente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos foram obtidos; exemplos de anticorpos gerados desta maneira foram denominados como H4H9780P, H4H9814P e H4H9816P2.

[0203] As propriedades biológicas dos exemplos de anticorpos gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos indicados abaixo.

Exemplo 2: Região variável de cadeia pesada e leve de sequências de os aminoácidos e nucleotídeos

[0204] A Tabela la indica os identificadores da sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia pesada e leve e CDRs dos anticorpos anti-TrkB selecionados da invenção. A tabela lb indica os identificadores da sequência de aminoácido para as cadeias pesadas e leves de comprimento completo de anticorpos anti-TrkB selecionados da invenção. Os identificadores da sequência de ácido nucleico correspondentes para os anticorpos anti-TrkB selecionados da invenção são indicados na tabela 2. Tabela la: Identificadores da sequência de aminoácido VR constante Lumen | 2 1a [6 bs [o e 4 das | | | [uemoener | 16 | 20 [22 fas [os | 2 [3 be | | | ane [36 [on [30 [0 [e] u Lu [e] 1 besmaion| se | 69 [790 [nn [2 dos Ds dos Ds | se | Tabela 1b Cadeia pesada de Cadeia leve de Nome Ab comprimento comprimento completo completo | raoreor a Tabela 2: Identificadores da sequência de ácido nucleico HCDR | HCDR | HCDR LCDR | LCDR | LCDR Nome Ab VH VK 1 2 3 1 2 3 H4H9780P 1 3 5 7 9 11 13 15

[0205] Anticorpos são tipicamente aqui referidos de acordo com a seguinte nomenclatura: prefixo Fc (por exemplo “H4H”, “HOM”, etc.), seguido por um identificador numérico (por exemplo “9780”, “9816”, etc., tal como mostrado na tabela 1 ou 2), seguido por um sufixo “P”, “P2” ou “N”. O prefixo H4H nas designações do anticorpo indicam a região Fc particular do isotipo do anticorpo. Sendo assim, de acordo com esta nomenclatura, um anticorpo pode ser aqui referido como, por exemplo, “H4H9780P”, o que indica uma região Fc de IgG4 humana e M2aMl14179N, por exemplo, que indica uma região Fc de IgG2a de camundongo. As regiões variáveis são completamente humanas se denotado pelo primeiro 'H'" na designação do anticorpo. Um prefixo 'M" designa uma região variável de camundongo. Como será apreciado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo apresentando um isotipo Fc particular pode ser convertido a um anticorpo com um isotipo Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um Fc de IgGl de camundongo pode ser convertido a um anticorpo com IgG4 humana, etc.), mas em qualquer caso, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - os quais são indicados pelos identificadores numéricos mostrados na tabela 1 ou 2 - irão permanecer os mesmos, e espera-se que as propriedades de ligação ao antígeno sejam idênticas ou substancialmente similares independente da natureza do domínio Fc.

Exemplo 3. Cinética de ligação Biacore da ligação de anticorpos monoclonais anti-TrkB a diferentes reagentes de TrkB medidos a 25 ºC e 37 ºC

[0206] As constantes de equilíbrio de dissociação (valores K5)) para a ligação do TrkB aos anticorpos monoclonais anti-TrkB purificados foram determinadas usando um biossensor de ressonância de plasma de superfície em tempo real usando um instrumento Biacore 4000. Todos os estudos de ligação foram realizados em 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, e tensoativo Tween 20 a 0,05 % v/v (tampão de corrida HBS - ET) a 25 ºC e 37 ºC.

À superfície do sensor Biacore foi, primeiro, derivatizada pelo acoplamento de amina com o fragmento F(ab')2 anticorpo policlonal específico Fcy anti-humano de cabra (Jackson ImmunoResearch Laboratories, ft 109-006-098) ou anticorpo policlonal Fc anti-camundongo de coelho(GE Healthcare * BR- 1008-38) para capturar anticorpos monoclonais anti-TrkB.

Estudos de ligação foram realizados nos seguintes reagentes de TrkB; domínio extracelular do TrkB humano expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C terminal (hTRKB.mmH; SEQ ID NO: 76; número de acesso NP 001018074.1), domínio extracelular de TrkB de camundongo expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C terminal (mMTRKB.mmH; SEQ ID NO: 79; número de acesso NP 001020245), domínio extracelular de TrkB de rato expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C terminal (rTRKB.mmH; SEQ ID NO: 84; número de acesso NP 036863.1) e domínio extracelular do TrkB humano expresso com uma tag de Fc de IgG2a de camundongo C terminal (hTrkB- mFc; SEQ ID NO: 77; número de acesso NP 001018074.1). Diferentes concentrações de reagentes de TrkB foram, primeiro, preparadas em tampão de corrida HBS - ET (100 nM —- 1.23 nM; diluição serial em 3 vezes) e foram injetadas na superfície da Fc anti-humano capturada pelo anticorpo monoclonal anti-TrkB por 4 minutos em uma taxa de fluxo de 30pL/minuto, enquanto a dissociação do anticorpo monoclonal ligado ao reagente de TrkB foi monitorada por 10 minutos em tampão de corrida HBS - ET. As constantes das taxas de associação (ka) e dissociação (ka) cinéticas foram determinadas por um ajuste dos sensogramas de ligação em tempo real para um modelo de ligação 1:1 com limite de transporte de massa usando o software de ajuste da curva Scrubber 2.0c. As constantes de equilíbrio de dissociação da ligação (Kp”) e meias-vidas dissociativas (t%) foram calculadas a partir das constantes das taxas cinéticas como: Kp (M) = ka/ka e t= (min) = l1n(2)/60 x ka

[0207] Parâmetros —“cinéticos de ligação para a ligação de hTrkB.mmH, mTrkB.mmH, rTrkB.mmH ou hTrkB-mFc a diferentes anticorpos monoclonais anti-TrkB da invenção a ºC e37 ºC são mostrados nas Tabelas 3 até 10.

Resumo dos resultados:

[0208] A 25 ºC, os anticorpos monoclonais anti-TrkB se ligam ao hTrkB.mmH com valores de Kp” que variam de 545 pM a 41,3 nM, tal como mostrado na tabela 3. A 37 ºC, os anticorpos monoclonais se ligam ao hTrkB.mmH com valores de Ko que variam de 2,28 nM a 135 nM, tal como mostrado na tabela 4.

[0209] A 25 ºC, os anticorpos monoclonais anti-TrkB se ligam ao hTrkB-mFc com valores de Kp” que variam de 31,1 pM a 4,48 nM, tal como mostrado na tabela 5. A 37 ºC, os anticorpos monoclonais anti-TrkB se ligam ao hTrkB-mFc com valores de Kp que variam de 73,3 pM a 3,46 nM, tal como mostrado na tabela 6.

[0210] A 25 ºC, o comparador do anticorpo monoclonal anti-TrkB, aqui referido como HIM8037C, (vide US 2010/0196390, o anticorpo denominado como C2; vide também as SEQ ID NOs: 97 e 98 para as sequências de aminoácido das cadeias pesada e leve do comparador, respectivamente) se liga ao mIrkB.mmH com um valor de Kp” de 40,8 nM, tal como mostrado na tabela 7. Os anticorpos anti-TrkB da invenção não se ligam ao mTrkB.mmH a 25 ºC, tal como mostrado na tabela 7. A 37 ºC, o comparador do anticorpo monoclonal anti-TrkB se liga ao mIrkB.mmH com um valor de Kp” de 94,1 nM, tal como mostrado na tabela 8. Os anticorpos anti-TrkB da invenção não se ligam ao mTrkB.mmH a 37 ºC, tal como mostrado na tabela 8.

[0211] A 25 ºC, o comparador do anticorpo monoclonal anti-TrkB se liga ao rTrkB.mmH com um valor de Kpr de 31.8 nM, tal como mostrado na tabela 9. Os anticorpos anti-TrkB da invenção não se ligam ao rTrkB.mmH a 25 ºC, tal como mostrado na tabela 9. A 37 ºC, o comparador do anticorpo monoclonal anti-TrkB se liga ao rTrkB.mmH com um valor de Kp” de 87,5 nM, tal como mostrado na tabela 10. Os anticorpos anti-TrkB da invenção não se ligam ao rTrkB.mmH a 37 ºC, tal como mostrado na tabela 10.

Tabela 3: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do hTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 25 ºC. Analito ka ka analito hTrkB.mmH t. (min) capturado (1/Ms) (1/s) capturado (RU)| ligado (RU) Comparado de 757 23 4,65 E+04| 1,92 E-03/4,13 E-O8 H1MBO37C*

* indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc Tabela 4: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do hTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 37 *“C.

Quantidade 100 nM de Analito de analito ka ka hTrkB-mFc Ko (M) |t. (min) capturado capturado (1/Ms) (1/s) ligado (RU) (RU) HAH9814P [erra | so um E+O6 |5,95 E OS 13,11 EL? H4H9816P2 131 + 1 | cs eso E+04 |7,98 E-O5 |1,22 E-O9 145 Comparador de 753 8,80 E+04 [9,55 E-0O5 (1,09 E-09 121 H1M8037C* * indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc Tabela 6: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do hTrkB.mFc aos anticorpos monoclonais TrkB a 37 *“C.

Quantidade 100 nM de Analito de analito ka ka hTrkB-mFc Ko (M) (min) capturado capturado (1/Ms) (1/s) ligado (RU) (RU) H4H9780P 56 + 1 14 6,65 E+04 |2,22 E-04 B,33 sos) 52 | HAH9814P [asso | e as E+O6 Comparador de 814,46 58 2,35 E+05 2,92 E-04 1,24 E-0O9 H1MB037C* * indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc Tabela 7: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do mTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 25 ºC.

Quantidade | 100 nM de Analito de analito | mTrkB.mmH ka ka t. (min) capturado | capturado ligado (1/Ms) (1/s) (RU) (RU) H4H9816P? 135 + 0,6 RNNSNINIPE Comparador de 755 26 4,12 E+04| 1,68 E-03| 4,08 E-O8 7 HI1M8037C* * indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc Tabela 8: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do mTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 37 ºC.

capturado de analito | mTrkBmmH (1/Ms) (1/s) (min) capturado ligado (RU) (RU) H4H9814P 49 + 0,6 o NB NB NB NB Ene eee 815,95 31 7,40 E+04| 6,96 E-03| 9,41 E-O8 1,7 HI1MBO037C* * indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc Tabela 9: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do rTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 25 ºC.

Quantidade 100 nM de Analito de analito | rTrkB.mmH ka ka t. (min) capturado capturado ligado (1/Ms) (1/s) (RU) (RU) |orenonnes fases | o fo dos [e | e | ms o o 756 26 7 de H1MB037C* E+04 E-O03 E-O08 * indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc Tabela 10: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do rTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 37 “C.

Quantidade | 100 nM de Analito de analito | rTrkB.mmH ka ka Ko (M) t. (min) capturado | capturado ligado (1/Ms) (1/s) (RU) (RU)

H4H9780P 59 + 0,2 [ NB NB | NB | NB 7,93 6,94 8,75 de 815,45 32 1,7 E+04 E-03 E-O8 HI1M8037C* * indica que o mAb foi capturado usando uma superfície imobilizada anti-mFc.

Exemplo 4. Cinética de ligação Biacore da ligação de anticorpos monoclonais anti-TrkB substitutos a diferentes reagentes de TrkB medidos a 25 “ºC

[0212] As constantes de equilíbrio de dissociação (valores de Kp”) para a ligação do TrkB a anticorpos monoclonais anti-TrkB purificados foram determinadas usando um biossensor de ressonância de plasma de superfície em tempo real usando um instrumento Biacore T200. Todos os estudos de ligação foram realizados em 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 MM de NaCl, 3 mM de EDTA e tensoativo Tween 20 a 0,05 % v/v (tampão de corrida HBS - ET) a 25 ºC. A superfície do sensor Biacore foi, primeiro, derivatizada pelo acoplamento de amina com anticorpo policlonal Fc anti- camundongo de coelho (GE Healthcare t+ BR-1008-38) para capturar anticorpos monoclonais anti-TrkB. Os estudos de ligação foram realizados nos seguintes reagentes de TrkB; domínio extracelular do TrkB humano expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C terminal (hTrkB.mmH; SEQ ID NO: 76; NP 001018074.1), domínio extracelular de TrkB de camundongo expresso com uma tag myc-myc-hexahistidina C terminal (MTRKB .mmH; SEQ ID NO: 79; NP 001020245) e domínio extracelular de TrkB de rato expresso com uma tag myc-myc-

hexahistidina C terminal (rFTRKB.mmH; SEQ ID NO: 84; XP 002721319.1). Diferentes concentrações de reagentes de TrkB foram, primeiro, preparadas em tampão de corrida HBS - ET (90 nM - 3,33 nM; diluição serial em 3 vezes) e foram injetadas na superfície da Fc anti-camundongo capturada pelo anticorpo monoclonal anti-TrkB por 4 minutos em uma taxa de fluxo de 50 uL/minuto, enquanto a dissociação do anticorpo monoclonal ligado ao reagente de TrkB foi monitorada por 10 minutos em tampão de corrida HBS - ET. As constantes das taxas de associação (k.) e dissociação (ka) cinéticas foram determinadas por um ajuste dos sensogramas de ligação em tempo real para um modelo de ligação 1:1 com limite de transporte de massa usando o software de ajuste da curva Scrubber 2.0c. As constantes de equilíbrio de dissociação da ligação (K”) e meias-vidas dissociativas (1%) foram calculadas a partir das constantes das taxas cinéticas como: Kp (M) = ka/ka e t%» (min) = 1n(2)/60 x ka

[0213] Os parâmetros cinéticos de ligação para a ligação de hTrkB.mmH, mTrkB.mmH ou rTrkB.mmH a diferentes anticorpos monoclonais anti-TrkB da invenção a 25 “ºC são mostrados nas Tabelas 11 até 13.

Resultados:

[0214] A 25 ºC, os anticorpos monoclonais anti-TrkB substitutos da invenção não mostram ligação ao hTrkB.mmH, tal como mostrado na tabela 11.

[0215] A 25 ºC, os anticorpos monoclonais anti-TrkB substitutos da invenção se ligam ao mTrkB.mmH com valores de Kp que variam de 2,39 nM a 32,4 nM, tal como mostrado na tabela 12.

[0216] A 25 ºC, os anticorpos monoclonais anti-TrkB substitutos da invenção se ligam ao rTrkB.mmH com valores de Ko que variam de 2,56 nM a 26,9nM, tal como mostrado na tabela 13. Tabela 11: Parâmetros cinéticos de ligação da ligação do hTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 25 ºC. Quantidade 90 nM de Analito de analito ka ka Ko ts hTrkB.mmH capturado capturado (1/Ms) (1/s) (M) | (min) ligado (RU) (RU) M2aM14173N 230 t+ 0,8 o | NB NB | NB | NB Tabela 12: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do mTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 25 ºC.

Quantidade 90 nM de Analito de analito ka ka K, ts mMTrkB.mmH capturado capturado (1/Ms) (1/s) (M) (min) ligado (RU) (RU) 6,30 E- 8,49 M2aM14173N | 236 + 1,1 33 7,41 E+04 18 04 E-09 2,47 E- 2,39 M2aM14178N | 126 + 0,3 12 1,03 E+05 47 04 E-09 3,72 E- 3,24 M2aM14179N | 416 + 4,3 32 1,15 E+05 3,1 o3 E-08 Tabela 13: Parâmetros de cinética de ligação da ligação do rTrkB.mmH aos anticorpos monoclonais TrkB a 25 ºC. Analito Quantidade 90 nM de ka ka K ts capturado |de analito| rTrkB.mmH (1/Ms) (1/s) (M) (min)

capturado | ligado (RU) (RU eo eee M2aM14173N 233 + 0,7 33 7,90 E+04 18 04 E-09 Es 2,30 E- | 2,56 M2aM14178N 125 + 0,3 11 9,00 E+04 50 o4 E-09 e ee M2aM14179N 404 + 2,5 33 1,48 E+0O5 2,9 o3 E-O8 Exemplo 5. Ensaio biológico com células HEK293/SRE- luc/hTrkB e HEK293/SRE-luc/mTrkB(Ecto)-hTrkB (TM-Cyto).

[0217] Um ensaio biológico foi desenvolvido para detectar a ativação da TrkB usando um gene repórter luciferase sob o controle do elemento de resposta do soro (SRE) e o ligante, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF, R & D Systems). As linhagens celulares HEK293 foram geradas para estavelmente expressarem um repórter luciferase (elemento de resposta SRE - luciferase, SRE-luc, SA Bioscience, À CLS-010L) tanto com TrkB humano (hTrkB, aminoácidos 32 - 429 de NP 001018074.1 ou número Uniprot Q16620-1) ou domínio extracelular de TrkB de camundongo fundido aos domínios transmembrana e citoplasmático do TrkB humano (mTrkB, aminoácidos 32 - 429 de NP 001020245.1 ou número Uniprot P15209-1 fundido ao hTrkB, aminoácidos 431 - 822). As linhagens celulares estáveis, HEK293/SRE-Luc/hTrkB e HEK293/SRE-Luc/mTrkB, foram mantidas em DMEM suplementado com 10 % de FBS, aminoácidos não essenciais, penicilina/estreptomicina/glutamina, 1 po/mL de puromicina e 500 vg/mL de G418.

[0218] Para o ensaio biológico, as células foram semeadas em placas de ensaio de 96 poços com 20000 células/poço em Opti-MEM'M suplementado com 0,1 % de FBS, penicilina/estreptomicina e L-glutamina e, então, incubadas a 37 ºCem 5 % de CO, ao longo da noite. Na manhã seguinte, BDNF humano ou anticorpos foram serialmente diluídos a partir de 100 nM a 0,002 nM (mais uma amostra contendo apenas tampão sem ligante) e adicionados às células para determinar a ativação da sinalização de TrkB. Os anticorpos serialmente diluídos foram também testados com 100 pM de BDNF (R & D Systems, 248-BD/CF). As células foram, então, incubadas por 5,5 horas a 37 ºC na presença de 5 % de CO>. A atividade da luciferase foi medida após a adição de reagente OneGlo (Promega) usando um instrumento Victor X (Perkin Elmer). Os resultados foram analisados usando regressão não linear (logística de 4 parâmetros) com o software Prism 5 (GraphPad) para obter os valores de ECsº e ICso. A ativação máxima dos anticorpos foi calculada usando o seguinte: (RLU máximo alcançado pelo anticorpo) Ativação —- (RLU alcançado por nenhum BDNF) máxima (%) " (RLU máximo alcançado pelo BDNF) - x oo (RLU alcançado por nenhum BDNF) Resumo dos resultados e conclusões:

[0219] Tal como mostrado na tabela 14, três anticorpos anti-TrkB da invenção H4H9816P2, H4H9814P, H4H9780P mostraram ativação da sinalização de TrkB humano em células HEK293/SRE-luc/hTrkB na ausência de BDNF com ECsos de 35 - 82 pM com ativação máxima que varia de 88 - 92 %. Três anticorpos da invenção foram também testados na presença de 100 pM de BDNF. Considerando que 100 pM de BDNF mostrou ativação da 56 % na presença de mAb controle irrelevante, Controle mAb 2, os anticorpos da invenção mostraram ainda ativação com ECsos de 45 - 76 pM com ativação máxima que varia de 77 - 80 %. Três anticorpos anti-TrkB da invenção não mostraram ativação da sinalização de TrkB de camundongo em células HEK293/SRE-luc/mTrkB na ausência de BDNF ou presença de 100 pM de BDNF. O Controle mAb 1, um comparador do anticorpo anti-TrkB HI1M8037C, mostrou ativação da sinalização de TrkB humano com um ECrso de 76 pM com ativação máxima de 78 % e TrkB de camundongo com um ECso de 43 pM com ativação máxima de 85 % sem BDNF. Na presença de 100 pM de BDNF, o Controle mAb 1 ativou a sinalização de TrkB humano com um ECso de 110 pM com ativação máxima de 79 % e o TrkB de camundongo com um ECso de 42 pM com ativação máxima de 69 %, maior do que a ativação pelo Controle mAb 2 com 100 pM de BDNF. O Controle mAb 2, um anticorpo IgG4 humano irrelevante, não mostrou qualquer ativação na ausência ou na presença de 100 pM de BDNF.

[0220] Tal como mostrado na tabela 15, três anticorpos anti-TrkB da invenção M2aMl4173N, M2aMl4178N, M2aM14179N mostraram ativação da sinalização de TrkB de camundongo em células HEK293/SRE-luc/mMTrkB na ausência de BDNF com ECsos de 34 - 190 pM com ativação máxima que varia de 76 - 94 %. Três anticorpos da invenção foram também testados na presença de 100 pM de BDNF. Considerando que 100 pM de BDNF mostrou ativação de 60 % na presença de controle do isotipo mAb irrelevante, Controle mAb 4, os anticorpos da invenção ainda mostraram ativação com ECsoS de 17 - 100 pM com ativação máxima que varia de 67 - 75 %&. Três anticorpos anti-TrkB da invenção não mostraram ativação da sinalização de TrkB humano em células HEK293/SRE-luc/hTrkB na ausência de BDNF ou presença de 100 pM de BDNF.

O Controle mAb 1 mostrou a ativação da sinalização de TrkB humano com um ECso de 57 pM com ativação máxima de 80 % e TrkB de camundongo com um ECsoº de 43 pM com ativação máxima de 85 % sem BDNF.

Na presença de 100 pM de BDNF, o Controle mAb 1 ativou a sinalização de TrkB humano com um ECso de 110 pM com ativação máxima de 79 % e TrkB de camundongo com um ECso de 42 pM com ativação máxima de 69 %, maior do que a ativação pelo Controle mAb 4 com 100 pM de BDNF.

O Controle mAb 3 e o Controle mAb 4, controles do isotipo do anticorpo IgG2a de camundongo irrelevante, não mostrou qualquer ativação na ausência ou na presença de 100 pM de BDNF.

Resumos dos dados tabulados: Tabela 14: Ativação de células HEK293/SRE-Luc/hTrkB e HEK293/SRE-Luc/mTrkB por anticorpos anti-TrkB ativação Ativaçã Ativação ativação Anticorpo ECso (M) ECso (M) ECso (M) ECso (M (*) o (*) (s) (s) Nenhuma Nenhuma H4H9780P 8,2 E-11 88 7,6 E-11 717 o 55 ativação ativação Nenhuma Nenhuma H4H9814P 3,5 E-11 92 4,9 E-11 80 o 54 ativação ativação Nenhuma Nenhuma H4H9816P2 6,3 E-11 4,5 E-11 78 o 58 ativação ativação Controle mAb 1 7,6 E-11 78 1,1 E-10 79 4,3 E-11 85 4,2 E-11 (Comparador de eso PI o 1 | Controle do Não Não Nenhuma Nenhuma isotipo 3 56 o 54 ativado ativado ativação ativação negativo mAb 2 Tabela 15: Ativação das células HEK293/SRE-Luc/hTrkB e HEK293/SRE-Luc/mTrkB por anticorpos anti-TrkB (substitutos) Células HEK293/SRE-luc/hTrkB HEK293/SRE-luc/mTrkB 100 pM de BDNF 100 PM de BDNF Ativação) Ativação) Ativação Ativação Anticorpo | ECso (M) ECso (M) ECso (M) ECso (M) (%) (%) (%) (%) Não Não M2aM14173N 2 59 3,6 E-11 94 1,7 E-11 74 ativado ativado Não Não M2aM14178N o 52 1,9 E-10 76 1,0 E-10 67 ativado ativado Não Não M2aM14179N 4 52 3,4 E-11 87 2,1 E-11 75 ativado ativado Controle mAb 1 (Comparador) 5,7 E-11 1,1 E-10 79 4,3 E-11 85 4,2 E-11 de H1M8037C) Controle do) isotipo Não Não Não Não Não Não Não o negativo | ativado testado | testado| testado | testado| testado| testado mab 3 Controle do Não Não Não Não Não isotipo testado | testado | ativado ativado ativado negativo

A Exemplo 6. Comparação in vivo do efeito do anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 e do controle do isotipo IgG4 REGN1945 na fosforilação do TrkB no cérebro após injeção estereotáxica em camundongos TrkB hv/hu

[0221] A fim de determinar o efeito de um anticorpo agonista do TrkB da invenção, H4H9816P2, na ativação da cinética do TrkB, um estudo de tempo-curso da fosforilação do TrkB após injeção hipocampal direta foi realizado em camundongos homozigóticos para o receptor TrkB humano no lugar do receptor TrkB de camundongo (referidos como camundongos TrkB "»/"m"), Os camundongos TrkB "u/"" (N = 48 receberam injeções estereotáxicas bilaterais tanto com 2 pL de veículo (PBS), REGN1945 aqui notado como controle do isotipo do anticorpo IgG4 (concentração final de 27,5 mg/mL) ou anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 (concentração final de 27,5 mg/ml) no hipocampo, -2 mm posterior e +1,5 mm lateral ao bregma. A fim de minimizar o dano tecidual, a injeção e remoção da agulha foram, ambas, realizadas gradualmente ao longo de intervalos de 5 minutos. Os camundongos TrkB "“/"2 foram, então, sacrificados por eutanásia com CO; por aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 4 horas ou 18 horas após a injeção. Um sangramento terminal foi realizado por meio de punção cardíaca para coletar sangue e os camundongos foram, então, perfurado transcardialmente com soro fisiológico heparinizado a frio. O cérebro foi cuidadosamente removido do crânio e uma seção de 2 mmê de tecido em torno do local da injeção foi dissecado, coletado em um tubo Eppendorf e armazenado em gelo. A seção do cérebro foi, então, lisada em 300 ul de tampão de lise RIPA (ThermoFisher Scientific, Catálogo + 89901) contendo 2x de protease e inibidores da fosfatase (ThermoFisher Scientific, Catálogo * 78444) e armazenada em gelo. O tecido lisado foi, então, homogeneizado para processamento posterior, aliquotado e armazenado a -80 “ºC.

[0222] Para avaliar a fosforilação do TrkB no tecido cerebral, imunoprecipitação e western blotting foram realizados. O anticorpo anti-TrkB humano H4H10108N que não compete por ligação com H4H9816P2 foi acoplado aos grânulos de Sepharose ativados com NHS (preparados usando o protocolo do fabricante; GE Healthcare, Catálogo t+ 17-0906) e lavados com DPBS três vezes para remover qualquer solução de preservação residual. Lisados homogeneizados do cérebro foram descongelados em gelo e diluídos para uma concentração de 1 mg/mL (peso de cérebro para o volume de tampão) em um tampão composto de 1 % de NP-40, 0,1 % de Tween 20, protease e inibidores da fosfatase em TBST. A concentração da proteína do lisado de cérebro homogeneizado foi quantificada pela realização de um ensaio BCA padrão de acordo com as instruções do fabricante (Thermo Scientific Pierce, Catálogo * 23225). Para cada 100 ug de proteína, 15 pl de grânulos de Sepharose ativados com NHS com anticorpo anti-TrkB humano (H4H10108N) foram adicionados à solução de lisado de cérebro e a mistura foi incubada ao longo da noite a 4 ºC com agitação suave a 20 rpm (Thermo rotador). No dia seguinte, as amostras foram centrifugadas a 1000 x g por um minuto e o sobrenadante foi, então, cuidadosamente removido. Os grânulos foram subsequentemente lavados duas vezes com 400 nl de salina tamponada com Tris (Bio-Rad, Catálogo * 1706435) com 1 % de Tween 20 (Sigma Aldrich,

Catálogo t P9416) (TBST). Após cuidadosamente aspirar ao tampão de lavagem, 60 ul de 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA; Sigma-Aldrich, T62200) em água em pH 3,0 foi adicionado para cada amostra. A solução foi misturada e permitida permanecer por dois minutos antes de ser coletada e transferida dentro de um tubo separado. Este processo foi repetido com outros 60 ul de 0,1 % de TFA em pH 3,0. As duas soluções de 0,l % de TFA para cada amostra foram, então, combinadas e 2 pl de IM de Tris-HCl (ThermoFisher Scientific, Catálogo + 15567-027), em pH 8,5, foi adicionado.

[0223] A solução foi secada usando um vácuo de velocidade e, então, ressuspendida e reduzida com uma mistura de 20 pl de lx de tampão Laemmli (Bio-Rad, Catálogo É 1610737) mais 355 nM de 2-mercaptoetanol (BME; Gibco, Catálogo f* 21985-023). As amostras foram fervidas a 95 “ºC por 10 minutos e carregadas em um gel Tris-Glicina com 10 poços, Mini-Protean a 4 - 15 % (Bio-Rad, Catálogo * 4561086). Após a eletroforese, amostras de proteína foram transferidas a partir do gel Tris-Glicina em uma membrana PVDF (Bio-Rad, Catálogo * 170-4156) por meio de um sistema de transferência turbo Trans-Blot (Bio-Rad, Catálogo + 1704156) ao longo do curso de 30 minutos em uma taxa constante de 1,3 A e 25 V. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com 2,5 % de leite (Bio-Rad, Catálogo * 170- 6406) em TBST por uma hora em temperatura ambiente e, subsequentemente, sondados ao longo da noite tanto com um anticorpo anti-fosfo-TrkB (Novus, Catálogo * NB100-92656) diluído a 1:1000 em uma solução de 2,5 % de BSA ou anticorpo primário anti-TrkB (sinalização celular, Catálogo

É 4603) diluído a 1:1000 em 2,5 % de TBST de leite a 4 ºC em um agitador a 30 rpm. No dia seguinte, os blots foram lavados com TBST e incubados com um anticorpo IgG anti- coelho conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Jackson, Catálogo H 111-035-144) a 1:1000 em 1 % de leite em TBST por 1 hora em temperatura ambiente. Os blots foram, então, novamente lavados, desenvolvidos com solução de ECL (PerkinElmer, Inc. Catálogo f* RPN2106) e as exposições de imagens subsequente foram tomadas a cada 30 segundos.

Resumo dos resultados e conclusões:

[0224] Imunoprecipitação e o western blotting subsequente da proteína derivada de lisados de cérebro de camundongos TrkB "“/"WÀ demonstraram que a fosforilação do TrkB hipocampal foi detectável em camundongos injetados com um anticorpo agonista do TrkB, H4H9816P2, porém não em camundongos tratados com veículo ou anticorpo controle do isotipo, tal como mostrado na Figura l. Dentre os pontos no tempo avaliados, a fosforilação do TrkB teve pico em 4 horas após a injeção estereotáxica em camundongos doseados com H4H9816P2. A fosforilação do TrkB foi também detectada por western blot em 18 horas após a dosagem em alguns, porém não em todos os camundongos. Por outro lado, a injeção de veículo e controle do isotipo do anticorpo IgG4 não induziu a fosforilação do TrkB em qualquer ponto no tempo. O Western blotting também indicou que os níveis totais de receptor TrkB foram regulados negativamente em alguns, porém não em todos os camundongos TrkB "“/nº doseados com H4H9816P2 em relação aos camundongos tratados com veículo e controle do isotipo. Os níveis totais de TrkB pareceram ser levemente regulados negativamente em indivíduos tratados com H4H9816P2 em 18 horas após a dosagem. Sendo assim, estes resultados indicam que a injeção direta de anticorpo agonista do TrkB, H4H9816P2, induz a fosforilação de receptores TrkB hipocampais em camundongos TrkB hu/hu, Exemplo 7. Comparação in vivo do efeito dos anticorpos H4H9816 e controle do isotipo REGN1945 no peso corporal e metabolismo em camundongos TrkB "v“/hu,

[0225] Para determinar o efeito de um anticorpo agonista do TrkB da invenção, H4H9816P2, no peso corporal e composição, um estudo metabólico dos camundongos homozigóticos para a expressão do receptor TrkB humano no lugar do receptor TrkB de camundongo (camundongos TrkB hbu/hu) foi conduzido após uma única injeção subcutânea de anticorpo. Os camundongos TrkB "“/"Wm) (machos, 20 semanas de idade) foram, primeiro, transferidos de uma gaiola de grupo para uma gaiola única por duas semanas para aclimatação. Após este período, os camundongos foram transferidos para gaiolas metabólicas (CLAMS, Columbus Instruments) para avaliar mudanças no consumo de alimentos e água, locomoção, gasto de energia e respiração após a administração do anticorpo. A ração em pó regular foi armazenada em uma câmara de chão em uma balança com mola (Mettler Toledo, PL602E) para medir o consumo de alimento por meio de mudanças no peso total da ração. A água era acessível por meio de um bico de gaiola e a ingestão foi medida pelo acompanhamento das mudanças no volume da linha da bomba (unidade líquida Oxymax”CLAMS). As gaiolas metabólicas CLAMS mediam cada um destes parâmetros em continuidade, em intervalos de 16 a 18 minutos ao longo da duração do estudo. Os dados metabólicos foram analisados em medidas únicas e resumidos em intervalos de 24 horas contendo um ciclo completo escuro e claro usando o software OXYMAX*/CLAMS (Columbus instruments, v5.35). Após a aclimatação das gaiolas por duas semanas, os camundongos TrkB ""/"mWm" receberam uma única dose subcutânea de 50 mg/kg tanto de um anticorpo agonista do TrkB, H4H9816P2, ou um controle do isotipo do anticorpo IgG4 em PBS em pH 7,2. Um grupo de camundongos TrkB "“/"= controle naive não recebeu uma injeção. Os camundongos foram pesados imediatamente antes da dosagem e em 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a dosagem. A fim de medir cada composição corporal do camundongo, Relaxometria de Ressonância Magnética Nuclear, também referida como Ressonância Magnética Quantitativa, foi realizada usando um analisador EchoMRI*"“-500 (EchoMRI LLC). Antes da dosagem, os camundongos foram posicionados em um suporte de plástico transparente e inseridos no dispositivo de RMN - IRM para medir cada massa magra, massa de gordura e estado de hidratação dos indivíduos. As medidas foram realizadas ao longo do curso de 0,5 - 3,2 minutos por camundongo e foram novamente tomadas aproximadamente 120 horas após a dosagem.

Resumo dos resultados e conclusões:

[0226] O monitoramento do peso corporal diário foi realizado para determinar se uma única injeção subcutânea de H4H9816P2 induz a perda de peso em camundongos TrkB bu/hu, Antes da dosagem, não houve diferença significativa no peso corporal médio dos três grupos de tratamento, uma vez que cada um apresentou um peso corporal pré dosagem de 28,39 - 29,85 g (Tabela 16). Em 48 horas após a dosagem, no entanto, camundongos TrkB "hà tratados com H4H9816P2 perderam uma média de 1,70 g ou 5,96 % do seu peso corporal antes da dosagem.

No mesmo ponto no tempo, camundongos TrkB hu/hu tratados com anticorpos naive e controle do isotipo ganharam entre 1,79 - 2,37 % do seu peso corporal antes da dosagem.

Os camundongos TrkB N"/"mm" tratados com H4H9816P2 continuaram a perder peso ao longo do tempo completo do curso do estudo e por 72 e 9 horas após a dosagem estes camundongos tinham perdido uma média de 8,42 % e 11,80 % do seu peso corporal antes da dosagem, respectivamente.

Em 120 horas após a dosagem, camundongos TrkB "“/t= tratados com H4H9816P2 tinham perdido uma média de 12.67 % do seu peso corporal antes da dosagem.

Por outro lado, camundongos TrkB hu/hu tratados com naive e controle do isotipo não exibiram qualquer perda no peso corporal antes da dosagem ao longo do estudo.

Como o peso corporal em camundongos TrkB hu/hu tratados com H4H9816P2 foi significativamente reduzido em relação a ambos os naive e controle do isotipos em 48, 72, 96 e 120 horas após a dosagem, foi determinado que o anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 induziu uma perda de peso corporal significativa em camundongos TrkBhu/h", Tabela 16: Peso corporal de camundongos TrkB "ut!" após a dosagem com anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 Peso Peso Peso Peso Peso Peso corporal corporal corporal corporal corporal corporal Grupo médio (g) médio (g) médio (g) médio antes médio (g) 24 médio (9) 72 experimental 48 horas 96 horas 120 horas da dosagem | horas após à horas após a após a dose após a dose após a dose (9) (+ DP) dose (+ DP) dose (t+ DP) (t+ DP) (+ DP) (+ DP)

Mudança Mudança Mudança Mudança Mudança Mudança percentual percentual | percentual | percentual | percentual |percentual do peso do peso do peso do peso do peso do peso corporal corporal corporal corporal corporal corporal antes da antes da antes da antes da antes da antes da dosagem dosagem dosagem dosagem dosagem dosagem (+ DP) (+ DP) (t+ DP) (+ DP) (t DP) (+ DP) 28,85 29,69 29,36 29,32 29,29 28,88 Naive (+ 0,81) (E 0,97) (É 1,10) (4 1,29) (É 1,10) (E 1,04) (n = 3) +2,91 % +1,79 % +1,65 % +1,54 % +0,10 % N/A (+ 0,62) (+ 1,62) (+ 2,24) (+ 1,22) (+ 1,05) 29,21 30,27 29,90 30,08 29,87 29,69 Controle do (+ 2,68) (E 2,51) (+ 2,63) (+ 2,69) (+ 2,52) (+ 2,68) isotipo +3,61 % +2,37 8 +2,98 % +2,25% +1,65 % (n = 4) N/A (+ 1,68) (+ 1,50) (4 1,09) (£ 1,56) (+ 0,81) 28,39 27,87 26,69 26,00* 25,04** 24,79** H4H9816P2 (+ 1,35) ( 1,29) (+ 0,87) (+ 0,98) (+ 1,03) (+ 1,36) (n = 4) 1,83% 5,96 % 8,42 % 11,80 % 12,67 % N/A (+ 0,56) (+ 1,88) (+ 1,85) (+ 1,52) (+ 1,66) Nota: Significância estatística determinada por ANOVA de duas vias com o teste post-hoc de comparação múltipla de Tukey é indicada (* = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001, comparado com o grupo controle do isotipo: camundongos TrkB “mr doseados com 50 mg/kg de anticorpo controle do isotipo.

[0227] O efeito da injeção do anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 na composição corporal foi também medido pela realização de RMN - IRM em cada indivíduo antes e após a dosagem. Antes da dosagem, os três grupos de tratamento de camundongos TrkB N"“/h" não exibiu qualquer diferença significativa na massa de gordura ou massa magra, uma vez que cada grupo apresentou uma média de 4,19 - 4,75 g de massa de gordura e 21,32 - 21,70 gq de massa magra (Tabela 17). Após a administração do anticorpo, no entanto, os camundongos TrkB "“/h" doseados com H4H9816P2 perderam uma média de 48,90 % da sua massa corporal de gordura total ao longo do curso do estudo (Tabela 17). Os camundongos TrkB hu/hu tratados com anticorpo naive e anticorpo controle do isotipo perderam uma média de 8,49 % e 9,48 % da sua massa de gordura antes da dosagem, respectivamente, o qual foi significativamente menor do que os indivíduos tratados com H4H9816P2 (Tabela 17). Além disso, os camundongos TrkB hu/hv tratados com H4H9816P2 perderam uma média de 7,84 % de sua massa magra ao longo do estudo, o que foi significativamente maior do que 2,41 % e 1,75 % da perda meia de massa magra antes da dosagem por grupos tratados com anticorpo naive e anticorpo controle do isotipo, respectivamente (Tabela 17). Dessa forma, a perda de peso corporal descrita pode ser explicada por uma perda massa de gordura significativa e uma perda de massa magra modesta após a injeção do anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 em camundongos TrkBhu/m", Tabela 17: Composição corporal de camundongos TrkB "u“/h“ após a dosagem com anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 Massa de Massa de Mudança na Massa Massa Mudança na Grupo gordura gordura massa de magra magra massa experimen | média antes | média (%) gordura antes da média magra tal da dosagem | 120 horas | média (%) dosagem (8) 120 | média (%) (%) (£ DP) após a 120 horas (6) (t horas 120 horas dose (t após a dose DP) após a após a DP) (+ DP) dose (+ dose (+ DP) DP) Naive 4,65 4,27 8,49 21,45 20,94 -2,41 (n = 3) (+ 0,32) (+ 0,55) (+ 7,18) (4 0,79) (+ 0,98) (+ 1,81) Controle do 4,75 4,40 -9,48 21,70 21,32 -1,75 isotipo (+ 2,98) (+ 2,98) (+ 6,00) (4 0,50) (4 0,35) (+ 0,98) (n = 4) H4H9816P2 4,19 2,14 —48,90**** 21,32 19,64 —7,84%*** (n = 4) (É 1,15) (+ 0,64) (+ 5,06) (4 1,87) (4 1,69) (+ 0,94) Nota: Significância estatística determinada por Kruskal- Wallis para ANOVA de uma via com o teste post-hoc de comparação múltipla de Tukey é indicada (* = p < 0,05, ** = bp < 0,01, *** =p < 0,001, **** = p < 0,0001, comparado com o grupo controle do isotipo: camundongos TrkB "“/tº doseados com 50 mg/kg de anticorpo controle do isotipo.

[0228] Além disso, para avaliar os efeitos da injeção do anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 no peso e composição corporal em camundongos TrkB hu/hu, a alimentação, hidratação e atividade locomotora foram continuamente medidos por gaiolas metabólicas. Antes da dosagem, os camundongos TrkB "“/t" consumiram uma média de 3,49 - 3,73 g de ração por dia. Dentro de 24 horas da dosagem, no entanto, camundongos TrkB "“/h" tratados com H4H9816P2 reduziu significativamente sua ingestão de alimentos para 2,20 g de ração por dia. O nível médio de ingestão de alimentos em camundongos TrkB "“/hu tratados com H4H9816P2 não excedeu 2,49 g de ração por dia ao longo do restante do estudo, enquanto camundongos TrkB "%/t" tratados com anticorpo naive e anticorpo isotipo consistentemente consumiram uma média de 3,62 - 4,07 g de ração por dia (Tabela 18).

[0229] De forma similar, não houve diferença significativa no consumo diário de água entre os grupos de tratamento antes da dosagem. Os camundongos TrkB hu/hs consumiram uma média de 4,67 - 5,55 mL de água por dia em cada grupo de tratamento (Tabela 19). Após a dosagem, camundongos TrkB "%/h" tratados com H4H9816P2 reduziram sua ingestão de água para 2,05 - 3,24 mL de água por dia. Isto foi significativamente menor do que os camundongos TrkB hu/hu tratados com anticorpo naive e anticorpo controle do isotipo, os quais consistentemente consumiram 4,50 - 5,77 mL de água por dia ao longo do estudo (Tabela 19). Sendo assim, a injeção do anticorpo agonista do TrkB, H4H9816P2, pareceu resultar em uma redução significativa em ambas a ingestão de alimentos e água em camundongos TrkB ""/""= em relação a ambos os anticorpos naive e controle do isotipo.

Tabela 18: Consumo de alimentos dos camundongos TrkB hu/hu após a dosagem com anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 Ingestão | Ingestão de | Ingestão de | Ingestão de | Ingestão de de alimentos alimentos alimentos alimentos alimentos total total total total Grupo total médio (g) médio (g) médio (g) médio (g) experimental | médio(g) o -24 24 - 48 48 - 72 72 - 96 o -24 horas após | horas após | horas após | horas após horas a dose a dose a dose a dose antes da (+ DP) (+ DP) (+ DP) (+ DP)

dose (t+ DP) Naive 3,51 3,98 3,76 3,62 3,91 (n = 3) (+ 0,53) (+ 0,08) (t+ 0,19) (+ 0,35) (t+ 0,18) Controle do 3,73 4,07 3,99 3,89 3,80 isotipo (+ 0,48) (+ 0,23) (+ 0,17) (+ 0,22) (+ 0,22) (n = 4) H4H9816P2 3,49 2,20%*** 2,08*x*** 2,18%*** 2,49*** (n = 4) (+ 1,07) (+ 0,16) (+ 0,36) (+ 0,37) (+ 0,47) Nota: Significância estatística determinada por Kruskal- Wallis para ANOVA de uma via com o teste post-hoc de comparação múltipla de Tukey é indicada (* = p < 0,05, ** = p< 0,01, *** =p < 0,001, **** = p < 0,0001, comparado com o grupo controle do isotipo: camundongos TrkB h"u/h"4 dosados com 50 mg/kg de anticorpo controle do isotipo.

Tabela 19: Consumo de água de camundongos TrkB "u“/"" após a dosagem com o anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 Ingestão de Ingestão de | Ingestão de | Ingestão de | Ingestão de água total água total água total água total água total média (mL) Grupo média (mL) média (mL) média (mL) média (mL) o -24 experimental O - 24 horas 24 = 48 48 = 72 72 = 96 horas antes após a dose | horas após a | horas após a | horas após a da dose (+ DP) dose (t DP) dose (t+ DP) dose (t DP) (+ DP) Naive 4,79 5,42 4,96 4,57 4,88 (n = 3) (+ 0,21) (+ 0,94) (+ 0,91) (+ 0,56) (+ 0,32) Controle do 5,55 4,50 5,08 5,09 5,77 isotipo (4 1,23) (+ 1,08) (4 1,39) (+ 1,10) (+ 1,62)

co H4H9816P2 4,67 2,25** 3,24* 2,05*** 2,25%t** (n = 4) (X 1,13) (+ 0,55) (+ 1,10) (+ 0,29) (+ 0,24) Nota: Significância estatística determinada por Kruskal- Wallis para ANOVA de uma via com o teste post-hoc de comparação múltipla de Tukey é indicada (* = p < 0,05, ** = p< 0,01, *** =p < 0,001, **** = p < 0,0001, comparado com o grupo controle do isotipo: camundongos TrkB""/hu dosados com 50 mg/kg de anticorpo controle do isotipo.

[0230] Para determinar os efeitos do tratamento com anticorpo na atividade, a locomoção foi analisada pelo software OXYMAXº/CLAMS (Columbus instruments, v5.35), o qual mediu continuamente o número total de movimentos no plano x de cada camundongo. Um camundongo exibiu hiperatividade antes da dosagem e foi removido da análise estatística após a dosagem. Enquanto os indivíduos tratados com anticorpos naive e isotipo consistentemente registraram uma média de 11000 -15000 movimentos por dia ao longo do estudo, TrkB "*/mh tratados com H4H9816P2 registraram 28260 movimentos entre 24 - 48 horas após a dosagem, e registraram 21193 e 27028 movimentos de 48 - 72 e 72 - 96 horas após a dosagem, respectivamente (Tabela 20). Os camundongos TrkB hP“/hr tratados com H4H9816P2 registraram mais contagens de movimento total em cada ponto no tempo após a administração do anticorpo, sugerindo hiperatividade como sendo um efeito adicional da injeção de H4H9816P2. Em combinação, estes efeitos sugerem que uma única injeção subcutânea do anticorpo agonista do TrkB, H4H9816P2, induziu mudanças significativas no peso corporal,

composição corporal, metabolismo e locomoção em camundongos TrkB nhu/na, Tabela 20: Locomoção de camundongos TrkB "“/"" após a dosagem com anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 Movimentos Movimentos Movimentos | Movimentos | Movimentos médio totais |médio totais | médio totais Médio totais Médio totais Grupo (contagens) O |(contagens) O | (contagens) | (contagens) | (contagens) experimental| - 24 horas - 24 horas 24 - 48 48 - 72 72 - 96 antes da dose | após a dose | horas após a horas após a horas após a (4 DP) (4 DP) dose (t+ DP) |dose (+ DP) |dose (t DP) Naive 16562 14692 14387 13279 12525 (n = 3) (+ 3380) (+ 2792) (+ 6126) (2 3607) (2 4121) controle do isotipo 18105 13380 13049 11371 11468 (REGN1945) (+ 4085) (+ 2730) (+ 3376) (+ 2552) (+ 2088) (n = 4) H4H9816P2 13292 16575 28260 21193 27028* (n = 4) (+ 5294) (+ 6836) (+ 19874) (+ 6668) (+ 10969) Nota: Significância estatística determinada por Kruskal- Wallis para ANOVA de uma via com o teste post-hoc de comparação múltipla de Tukey é indicada (* = p < 0,05, ** = bp < 0,01, *** =p < 0,001, **** = p < 0,0001, comparado com o grupo controle do isotipo: camundongos TrkB *"“/h" doseados com 50 mg/kg de anticorpo controle do isotipo.

Exemplo 8. Modelo de transecção do nervo óptico para determinar o efeito de um anticorpo anti-TrkB na sobrevivência de células ganglionares da retina (RGC)

[0231] Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais na

Pesquisa Oftalmológica e da Visão e o Regeneron Pharmaceutical Inc. IACUC. Ratos fêmea adultos humanizados com TrkB (Velocigene, Regeneron Pharmaceutical Inc.), com 8 —- 10 semanas de idade, cada um pesando de 200 - 250 g, foram usados. Todos os procedimentos cirúrgicos em ratos foram realizados sob anestesia geral usando uma injeção intraperitoneal de quetamina (63 mg/kg) e xilazina (6,0 mg/kg). Pomada ocular contendo eritromicina (0,5 %, Bausch & Lomb) foi aplicada para proteger a córnea.

Axotomia intraorbital do nervo óptico e injeção intravitreal

[0232] O nervo óptico (ON) esquerdo foi exposto intraorbitalmente e sua dura foi aberta. O ON foi transectado cerca de 1,5 mm por trás do globo. Cuidado foi tomado para evitar o dano do suprimento sanguíneo na retina. Injeções intravitreais foram realizados logo depois do pars plana com uma pipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton de 50 nl. Cuidado foi tomado para não danificar as lentes. Os ratos com quaisquer complicações pós-operatórias significativas (por exemplo, isquemia da retina, catarata) foram excluídos da análise posterior. Os animais foram alocados em diferentes grupos experimentais. Um grupo controle recebeu injeções intravitreais de 3 pl de controle do isotipo REGN1945 (46,6 ug/ul); o outro grupo recebeu uma injeção de 3 1pl de anticorpo anti-TrkB humano H4H9816P2 (45,7 pg/pul) em 3 e 10 dias após a axotomia do ON.

[0233] Em outro experimento, uma dose - resposta do anticorpo anti-TrkB humano H4H9816P2 foi testada. Ratos homozigóticos humanizados com TrkB com 1 - 9 meses de idade receberam injeção intravitreal de 3 pl de anticorpo anti- TrkB humano H4H9816P2 (0,01, 0,1, 1 ou 10 unug/pnl) ou controle do isotipo REGN1945 (10 ug/ul) em 3 e 10 dias após axotomia do ON.

Coramento imunohistoquímico e contagem de RGCs viáveis

[0234] Brn3ôa (proteína 3A de domínio homeobox/POU específica para o cérebro) foi usado como um marcador para a sobrevivência de células ganglionares da retina (RGCs) uma vez que ela mostrou ser um método eficiente e confiável para a marcação seletiva de RGCs viáveis em montagens da retina completa após a lesão do ON (Nadal-Nicolás FEM, Jiménez-López M, Sobrado-Calvo P, Nieto-López L, Cánovas- Martínez TI, Salinas-Navarro M, Vidal-Sanz M, Agudo M., Invest Ophthalmol Vis Sci. Agosto de 2009; 50 (8): 3860 - 8). Para imunocorar com Brn3a, as retinas foram bloqueadas em 10 % de soro de burro normal e 0,5 % de Triton X-100 por 1 hora, então, incubado no mesmo meio com anticorpo Brn3a (1:400; Catálogo À : sc-31984, Santa Cruz) por 2 horas em temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, as retinas foram incubadas com anticorpo secundário anti-cabra de burro conjugado com Alexa594 (1:400; Catálogo * : A-11058 Invitrogen) ao longo da noite a 4 ºC.

Resumo dos resultados e conclusões:

[0235] Para avaliar o efeito do anticorpo agonista do TrkB na sobrevivência RGC in vivo, nós usamos um modelo de transecção do nervo óptico completo. O anticorpo agonista do TrkB (H4H9816P2) ou anticorpo isotipo (controle negativo) foi aplicado por 3 e 10 dias após a cirurgia. Os animais foram eutanasiados 14 dias após a axotomia. A densidade das RGC no olho contralateral não lesionado é similar nos três genótipos de TrkB, com média em torno de 1600 por mm? tal como mostrado na tabela 21. A densidade de sobrevivência das RGCs tal como avaliado nas montagens da retina completa usando coramento com Brn3a.

Foi observado que, em ratos homozigóticos humanizados com TrkB, o anticorpo agonista do TrkB (H4H9816P2) aumentou significativamente (p < 0,01, no teste de Mann-Whitney) a sobrevivência das RGC se comparada com os controles (685 + 106 vs. 255 + 66 de RGCs por nmm?). Nos ratos heterozigóticos humanizados com TrkB, também houve efeito significativo da sobrevivência (p < 0,05, teste de Mann- Whitney) do anticorpo agonista do TrkB (444 + 90 vs. 208 + 50 de RGCs por mm?º?). Nos ratos TrkB do tipo selvagem, houve um aumento leve, porém, não significativo do número da RGC no anticorpo agonista do TrkB quando comparado com o controle do isotipo (Tabela 22). No experimento de dose - resposta, a densidade das RGC foi quantificada em montagens de retina completa usando coramento com Brn3a 14 dias após a axotomia.

Há uma clara dose - resposta do anticorpo agonista do TrkB.

Quando comparado ao anticorpo grupo controle (168 + 43 de RGCs por mmº), o anticorpo agonista do TrkB (H4H9816P2) aumentou significativamente (p < 0,01, ANOVA de uma via com posterior teste de Tukey) a sobrevivência das RGC em 3 ug (564 + 124 de RGCs por mm?) ou 30 ug (543 + 242 de RGCs por mm2) por grupo de injeção.

Não há diferença entre os grupos de 3 e 30 pg.

Nos grupos que receberam 0,03 pg (202 + 96 de RGCs por mmº) ou 0,3 ug (337 + 210 de RGCs por mmê) por grupo de injeção, existe apenas uma tendência, porém não houve aumento significativo na sobrevivência das RGC (Tabela 23). Em conclusão, o anticorpo agonista do TrkB H4H9816P2 mostrou uma sobrevivência significativamente aumentada das RGC em ratos TrkB "a/ma e TrkB no/s, Conclusão:

[0236] O Ab agonista do TrkB (H4H9816P2) de forma dependente da dose, aumentou significativamente a sobrevivência das RGC em um rato humanizado com TrkB.

Tabela 21: Quantificação das RGC (RGCs/mmº) em olhos controle não lesionados nu/no oe ares Loss | ano Lama | Tabela 22: Quantificação das RGC (RGCs/mmºe) após lesão no nervo óptico [47 [320 alas. sfase.olaz.a| fas | | | | Tabela 23: Quantificação das RGC (RGCs/mmº) em um estudo dose-resposta

[0237] Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais na Pesquisa Oftalmológica e da Visão e o Regeneron Pharmaceutical Inc. IACUC. Neurônios corticais primários de camundongo foram isolados e cultivados a partir de camundongos com TrkB humanizado (MAID 7139) (Nat Protoc. Setembro de 2012; 7 (9): 1741 - 54. doi: 10.1038/nprot.

2012.099). Um Western Blot (WB) foi realizado para determinar os efeitos do Ab agonista do TrkB nas vias à jusante de Akt e Erk (p-Akt, p-Erkl/2). Neurônios corticais primários de filhotes de camundongo humanizados com TrkB no dia 1 pós-natal (Pl) foram cultivados por 4 dias (DIV-4) em meio NeuralQ Basal (Global Stem, catálogo *+ GSM-9420) suplementado com suplemento neural GS21 (Global Stem, catálogo t+ GSM-3100), Glutamax (Invitrogen, catálogo + 35050-061) e penicilina/estreptomicina. As células foram tratadas com Abs agonista do TrkB: H4H9816P-L1 (10 ug/mL), H4H9780P-L1 (10 ug/mL), H4H9814P-L1 (10 ug/mL), controle do isotipo IgG4 REGNI945 (10 ug/mL), anticorpo controle HIM8037C-L1 (10 pvg/mL), BDNF (1 pg/mL), por 15 minutos ou 2 horas. O Western Blot foi realizado para determinar se os agonistas apresentam uma diferença na manutenção e força da sinalização à jusante. Células tratadas foram rinsadas e raspadas em PBS frio contendo 1 % de protease e inibidores da fosfatase (Sigma). A concentração da proteína foi determinada por ensaio da proteína Bradford (Pierce). As amostras (50 pg) foram separadas por SDS-PAGE em 3 - 8 % de geis reduzidos com Tris-acetato (Novex) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad).

[0238] A membrana foi incubada por 1 hora em solução de bloqueio contendo 5 % de leite e 0,1 % de Tween 20, pH 7,6. Isto foi seguido por incubação ao longo da noite a 4 ºC em tampão de bloqueio contendo 5 % de BSA, 0.1 % de Tween 20 e anticorpo anti-fosfo-Trk de coelho (Cell Signalizing, catálogo * 9141, 1:500), anticorpo anti-fosfo- Akt de coelho (Cell Signalizing, catálogo * 9271, 1:1000) ou anticorpo anti-fosfo-ERK1/2 de coelho (Sigma, catálogo * E7028, 1:5000). De forma subsequente, as proteínas marcadas foram visualizadas por incubação com IgG anti-cabra, camundongo ou coelho conjugada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) seguida pelo desenvolvimento com um substrato —“quimioluminescente para HRP (Pierce). Para determinar as quantidades de TrkB, MAPK ou Akt total presentes em cada pista, as membranas de nitrocelulose foram removidas dos anticorpos em um tampão de remoção (Pierce) por 20 min e incubadas com anticorpo anti-TrkB de coelho (Cell Signalizing, catálogo + 4603, 1:1000), anticorpo anti-Erkl/2 de coelho (Cell Signalizing, catálogo

É 06-182, 1:1000) ou anticorpo anti-Akt de coelho (Cell Signalizing, catálogo H 9272, 1:1000) e, então, visualizados tal como descrito acima. Beta-actina (Sigma, catálogo * A5316, 1:20000) e GAPDH (Sigma, catálogo + G9295) foram sondados como amostras controle de carregamento.

Resumo dos resultados e conclusões:

[0239] Tal como mostrado na figura 2, em 15 minutos após a incubação, enquanto todo o Ab agonista do TrkB mostrou ativação da via MAPK/ERK e PI3K/Akt, apenas o BDNF e H4H9814P mostraram fosforilação do TrkB. 2 horas após a incubação, todos os Abs agonista do TrkB mostraram ativação do TrkB.

Exemplo 10. Efeito dos anticorpos agonistas anti-TrkB na sobrevivência de células SH-SY5Y Cultura de linhagem celular SH-SY5Y de neuroblastoma in vitro:

[0240] As células da linhagem celular SH-SY5Y de neuroblastoma (Sigma ATCC ft 94030304, catálogo * 11C016) foram plaqueadas em meio de crescimento contendo DMEM:F12 (Invitrogen catálogo * 11330), penicilina/estreptomicina (Invitrogen catálogo t* 15140), FBS 10 &% (Invitrogen catálogo * 10082-147) a 37 ºC em 5 % de CO». Na passagem, 23 - 27 células foram semeadas em placas de 96 poços em meio de diferenciação contendo 10 pM de ácido retinoico all-trans (Alfa —Aesar catálogo t 44540), DMEM: F12 (Invitrogen catálogo * 11330), penicilina/estreptomicina (Invitrogen catálogo t+ 15140), FBS 10 % (Invitrogen catálogo * 10082-147). As células (30K/poço) foram diferenciadas por 4 dias. Os anticorpos foram avaliados em um ensaio biológico de sobrevivência no qual a cultura foi modificada para meio de diferenciação livre de soro (100 upl/poço) contendo diferentes doses de anticorpos (100 - 0,01 po/mL). Após 2 dias, o reagente CCK8 (Dojindo, catálogo * CKO4) foi adicionado (10 ul/poço), as placas foram incubadas por 3 - 4 horas, o OD foi medido a 450 nm (Victor ou FlexStation III) para determinar a porcentagem de sobrevivência das células. Os dados foram normalizados para o meio livre de soro sem tratamento. O tratamento livre de soro sem anticorpos = 100 % sobrevivência. Resumo dos resultados e conclusões:

[0241] Tal como mostrado na figura 3 e na tabela 23, todos os anticorpos agonista do TrkB da invenção mostraram um aumento significativo dependente da dose na sobrevivência de células SH-SY5Y quando comparados ao controle negativo do isotipo do anticorpo (p < 0,0001 para ANOVA de duas vias). Tabela 24 REGN1945-L14 Dose (controle do H4H9816P-LI1 H4H9780P-L1 H4H9814P-L1 (ug/ml) isotipo negativo) er so | nes | ns | 52%0 | Exemplo 11. Avaliação farmacocinética de um anticorpo anti-TrkB em camundongos humanizados com TrkB e do tipo selvagem

[0242] A avaliação da farmacocinética de um anticorpo anti-TrkB, H4H9816P2 foi conduzida em camundongos com TrkB humanizado (camundongos homozigóticos para a expressão de TrkB humano, TrkB "*/"") e camundongos do tipo selvagem (WT). Coortes contendo 5 camundongos por cepa de camundongo. Todos os camundongos receberam uma única dose subcutânea (SC) de 10 mg/kg. Amostras de sangue foram coletadas em 6 horas e 1, 2, 3, 6, 9, 16, 21 e 30 dias após a dosagem. O sangue foi processado em soro e congelado a - 80 ºC até ser analisado.

[0243] As concentrações de anticorpo circulante foram determinadas por análise do anticorpo IgG4/hIgGl humano total usando GyroLab xPlore" (Gyros, Uppsala, Sweden). Brevemente, anticorpo monoclonal específico para IgG4/IgGl anti-humano biotinilado de camundongo (REGN2567) diluído para 100 pg/mL em tampão de diluição de anticorpo (0,05 % de Tween 20 + PBS) foi capturado em um Gyrolab Bioaffy 200 CD, o qual continha colunas de afinidade pré carregadas com grânulos revestidos com estreptavidina (Dynospheres”). O uso padrão para a calibração neste ensaio foi de H4H9816P em concentrações que variam de 0,488 a 2000 ng/ml em tampão de diluição (0,5 % de BSA + PBS) contendo 0,1 % de soro de camundongo normal (NMS). Amostras de soro foram diluídas 1:100 no tampão de diluição de anticorpo. IgG humana capturada nas colunas de afinidade revestidas com anti-REGN2567 no CD, corridas em temperatura ambiente, foi detectada pela adição de 0,5 ug/mlL de anticorpo monoclonal kappa anti-humano de camundongo conjugado com Alexa-647 (REGN654) diluído em tampão de detecção (tampão

Rexxip F) e o sinal fluorescente resultante foi gravado em unidades de resposta (RU) pelo instrumento GyroLab xPlore. As concentrações da amostra foram determinadas por interpolação de uma curva padrão que foi ajustada usando uma curva de logística de 5 parâmetros ajustada usando o software Gyrolab Evaluator. As concentrações médias de experimentos com 2 replicatas foram usadas para a análise farmacocinética subsequente.

[0244] os parâmetros farmacocinéticos foram determinados pela análise não compartimental (NCA) usando o software Phoenixº*WinNonlinº versão 6.3 (Certara, L.P., Princeton, NJ) e um modelo de dosagem extra vascular. Usando os respectivos valores de concentração média para cada anticorpo, todos os parâmetros farmacocinéticos incluindo concentração máxima observada no soro (Cnmax), meia vida estimada observada (t1/)) e área sob a curva de concentração versus tempo até a última concentração mensurável (AUCiast) foram determinados usando uma regra trapezoidal linear com interpolação linear e pesagem uniforme.

Resumo dos resultados e conclusões:

[0245] Após a administração subcutânea de 10 mg/kg de anticorpo anti-TrkB, H4H9816P2, concentrações máximas similares (Crmax) de anticorpos foram observadas no dia 1 ou 2 em ambos camundongos TrkB "mm" e do tipo selvagem (135 e 131 ug/mL, respectivamente, vide a tabela 26). Pelo dia 9, H4H9816P2 exibiu uma eliminação de fármacos mais acentuada em camundongos TrkB "»/"" do que em camundongos do tipo selvagem, indicando em efeito mediado pelo alvo. No dia 30, as concentrações de anticorpo foram cerca de 35 vezes menores em camundongos TrkB "“/hu, A exposição ao anticorpo (AUC1ast) pelo H4H9816P2 em camundongos do tipo selvagem foi -— 1,7 vezes mais alta do que a observada em camundongos TrkB neh (1730 e 1020 d* ug/mL, respectivamente). Os camundongos do tipo selvagem também exibiram um aumento de cerca de 3 vezes na meia vida (T1/)) em relação aos camundongos TrkB "ut" (8,4 e 2,9 dias, respectivamente).

[0246] Um resumo dos dados para as concentrações totais de anticorpo anti-TrkB estão resumidos na tabela 25, parâmetros farmacocinéticos médios são descritos na tabela 26 e média das concentrações totais de anticorpo versus tempo são mostradas na Figura 4.

Tabela 25: Concentrações médias (+ DP) do IgG total no soro após uma única injeção subcutânea de 10 mg/kg de H4H9816P2 em camundongos TrkB "“/t!l e do tipo selvagem ao longo do tempo Concentração total de mAb no soro do camundongo e a o | mg/kg 78,72 9,98 TrkB hu/na 9 37,74 14,0 Lo

| 101,9 11,4 tipo selvagem 9 75,94 7,06 21 27,75 16,9 Abreviações: Tempo = Tempo em dias após uma injeção de dose única; d = dia do estudo; DP = desvio padrão.

Tabela 26: Resumo dos parâmetros farmacocinéticos Parâmetro Unidades Camundongos Camundongos do TrkB bu/ne tipo selvagem ee ao | nasoss | 2020 | Os parâmetros farmacocinéticos foram derivados de perfis de concentração média versus tempo.

Ti/2 e AUCiast são baseadas em concentrações fora do dia 30. Abreviações: Crmax= Pico de concentração; AUC = Área sob a curva de concentração - tempo; AUCiast = AUC calculada a partir do tempo zero até o tempo da última concentração positiva; Tirz = Meia vida terminal de eliminação; Tmax = Tempo após a administração do anticorpo quando à concentração de soro máxima é alcançada Exemplo 12: Capacidade dos anticorpos monoclonais TrkB anti-camundongo em bloquear a interação entre TrkB de camundongo ou rato e seu ligante BDNF (fator neurotrófico derivado do cérebro).

[0247] os anticorpos monoclonais TrkB anti- camundongo (mAbs) foram gerados pela imunização dos camundongos humanizados com TrkB com a proteína de TrkB de camundongo. Os três principais mAbs identificados a partir desta imunização são: M2aM14173N, M2aMl14178N e M2aMl4179N. Os principais mAbs da invenção foram caracterizados pela sua capacidade de bloquear a interação do TrkB de camundongo ou rato com o BDNF ligado na placa em um ELISA de bloqueio.

[0248] Os experimentos foram realizados usando o seguinte procedimento. O BDNF humano foi revestido em uma concentração de 0,5 ug/mLl (para o bloqueio da interação TrkB.hFc de camundongo) ou 0,3 ug/mLl (para o bloqueio da interação TrkB.mmh de rato) em PBS em placa de micro titulação de 96 poços e incubadas ao longo da noite a 4 ºC. Sítios de ligação não específica foram subsequentemente bloqueados usando 5 % (p/v) de uma solução de BSA em PBS (tampão de ensaio). Em uma placa de diluição de 96 poços, 850 pM de TrkB.hFc de camundongo ou TrkB.mmh de rato foram misturados com anticorpos TrkB anti-camundongo e anticorpo controle serialmente diluídos por três vezes. As concentrações finais de anticorpo variaram de 1,69 pM a 100 nM. A mistura proteína - anticorpo foi incubada em temperatura ambiente (RT) por 1 hora. A mistura pré ligada foi, então, transferida em duplicatas para placas de micro titulação revestidas com BDNF. Um controle contendo o tampão de ensaio isolado foi incluído para calcular a linha de base do ensaio. As placas de ELISA foram incubadas em RT por 1 hora e, então, lavadas com solução de lavagem de placas. O TrkB.hFc de camundongo ligado à placa foi detectado com anticorpo específico para o fragmento Fcy anti-humano de cabra conjugado com HRP (Jackson Immunoresearch) e TrkB.mmh de rato foi detectada com anticorpo anti-histidina conjugado com HRP (Qiagen). As placas foram incubadas com anticorpo de detecção por 1 hora em RT e, então, lavadas com solução de lavagem de placa. As placas de ensaio foram desenvolvidas com substratos TMB colorimétricos de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante.

[0249] A absorbância a 450 nm para cada poço foi registrada e plotada como uma função da concentração do anticorpo. Os dados foram analisados em software GraphPad Prism usando uma equação logística de quatro parâmetros por uma curva de dose - resposta de 11 pontos e valores TICso foram calculados. O valor ICso calculado, definido como a concentração do anticorpo requerida para reduzir 50 % da ligação do TrkB ao BDNF, foi usado como um indicador da potência de bloqueio. O percentual de bloqueio na concentração máxima do anticorpo testado foi calculado como um indicador da capacidade dos anticorpos em bloquear a ligação de TrkB ao BDNF na placa em relação à linha de base do ensaio. O sinal da ligação de 850 pM de TrkB de camundongo ou rato na ausência do anticorpo foi definida como 100 % de ligação ou O % de bloqueio. O sinal da linha de base do tampão de ensaio isolado foi definido como 0 % de ligação ou 100 % de bloqueio.

Resumo dos resultados e conclusões

[0250] A capacidade de os anticorpos TrkB anti-

camundongo em bloquear a ligação ao TrkB de camundongo ou rato ao BDNF foi avaliada usando ELISAs de bloqueio.

[0251] Os resultados do bloqueio estão resumidos na tabela 27 e na Figura 5A e B. A % de bloqueio é reportada para todos os anticorpos e calculada na concentração de anticorpo mais alta (100 nM) testada. Os valores de TICso são mostrados apenas para o bloqueio da ligação de > de 50 % dos anticorpos do TrkB de camundongo ou rato ao BDNF. Além dos três anticorpos desta invenção, o mAb TrkB anti- camundongo, M2aMl14178N bloqueou > 50 % da ligação de ambas as proteínas de TrkB de camundongo e rato ao BDNF. M2aM14178N bloqueou a ligação de 850 pM de TrkB.hFc de camundongo com um ICso de 426 pM e % de bloqueio de 84,4 %. M2aM14178N bloqueou a ligação de 850 pM de TrkB.mmh de rato ao BDNF com um valor de ICso de 184 pM e % de bloqueio de 89,5 %. M2aMl14173N mostrou 29,7 % de bloqueio da ligação de 850 pM de TrkB.hFc de camundongo ao BDNF. M2aMl4173N mostrou 80,7 % de bloqueio da ligação de 850 pM de TrkB.mmh de rato ao BDNF com um valor de ICsºo de 3,81 nM. M2aMl14179N bloqueou 11,6 % de ligação do TrkB.hFc de camundongo ao BDNF. M2aM14179N mostrou um aumento na ligação do TrkB.mmh de rato ao BDNF em concentrações maiores do que 1 nM.

[0252] O comparador de mAb TrkB anti-camundongo, HIM8037C, bloqueou 850 pM da ligação de TrkB.hFc de camundongo ao BDNF com um valor de ICsºo de 180 pM e % de bloqueio de 91,5 %. HI1M8037C bloqueou 850 pM de ligação de TrkB.mmh de rato com um valor de ICsº de 1,42 nM e % de bloqueio de 83,3 %. O mAb controle do isotipo mIgG2a, REGN1097, não mostrou qualquer bloqueio de TrkB de camundongo ou rato, sob condições de ensaio idênticas. Em concentrações maiores do que 10 nM, REGN1027 mostrou um aumento de ligação ao TrkB de rato.

Tabela 27: Resumo de valores de ICso(M) para o bloqueio TrkB anti-camundongo da ligação ao TrkB de camundongo ou rato ao BDNF Bloqueio da ligação de 780 Bloqueio da ligação de PM de Ab TrkB.hFc de 780 pM de Ab TrkB.mmh de camundongo ao BDNF rato ao BDNF revestido na revestido na placa placa % do % do bloqueio bloqueio com Ab PID ICso [M] IC5so [M] com 100 nM 100 nM de de anticorpo anticorpo não M2aM14173N 29,7 3,81 E-09 80,7 calculado não não M2aM14179N 11,6 -38,1 calculado calculado H1M8037C 1,80 E-10 291,5 1,42 E-O09 83,3 (Comparador) Controle do isotipo Não Não Sem bloqueio -9,33 negativo calculado calculado (REGN1097) 100 % de bloqueio = o valor de OD 450 nm dos poços com anticorpo secundário conjugado com HRP no tampão de ensaio isolado (nenhuma proteína de TrkB de camundongo ou rato).

O % de bloqueio = o valor de OD 450 nm dos poços com anticorpo secundário conjugado com HRP em tampão de ensaio na presença de proteína de TrkB de camundongo ou rato (nenhum anticorpo TrkB). % de bloqueio máximo negativo indica um aumento da ligação do TrkB detectado na presença de anticorpo. Não calculado = valores de ICso não quantitativos para o bloqueio dos anticorpos < 50 % na concentração mais alta testada.

Exemplo 13. Capacidade de os anticorpos monoclonais anti-TrkB humanos para bloquear a interação entre o TrkB humano e seus ligantes naturais BDNF e NT4 humanos.

[0253] A capacidade de os anticorpos anti-TrkB humanos, denominados como H4H9814P, H4H9816P2 e H4H9780P em bloquear a ligação da proteína de TrkB ao BDNF ou NT-4 capturado na placa foi medida usando dois ELISAS sanduíche por competição. Nos ensaios, diversas concentrações de anticorpo anti-TrkB foram pré misturadas com uma quantidade constante de proteína de TrkB dimérica e a redução da ligação do TrkB ao BDNF ou NT4 imobilizado na placa, devido à presença do anticorpo, foram calculadas.

[0254] A proteína de TrkB dimérica recombinante usada nos experimentos foi compreendida de uma porção do domínio extracelular do TrkB humano (aa Cys32 - His430) expressa com a porção Fc do IgGl humano no terminal C (hTrkB-hFc; acesso * NP 006171.2, peso molecular 69,700 daltons). As proteínas BDNF e NT-4 foram compreendidas do domínio extracelular de BDNF humana (aa Hisl29 - Arg247, acesso * P23560, R&D Systems) ou NT-4 (aa Gly81 - Ala210, acesso tt P34130, R&D Systems), respectivamente. Dois anticorpos controle do isotipo, um anticorpo IgG4 humano anti-Feld 1, e um anticorpo específico para o anticorpo anti-Feld 1 com IgGl de camundongo, foram incluídos como controles para a detecção do fundo do IgG.

[0255] Os experimentos foram realizados usando o seguinte procedimento.

O BDONF ou NTA4 humano foram separadamente revestidos em uma concentração de 0,5 ug/mL ou 2 ug/mL, respectivamente, em PBS em uma placa de micro titulação de 96 poços ao longo da noite a 4 ºC.

Sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados usando solução BSA em PBS.

Solução de bloqueio e tampão de diluição continham 5 % (p/v) de solução de BSA em PBS para o ensaio com o revestimento de BDNF, ou 0,5 % (p/v) de solução de BSA em PBS para o ensaio com o revestimento de NT-4. Em placas de micro titulação separadas, uma quantidade constante de 500 pM de proteína hTrkB-hFc foi adicionado em diluições seriadas de anticorpos com concentrações finais que variam de 1,7 pM a 100 nM e soluções com nenhum anticorpo presente. (A concentração constante de hTrkB-hFc para os ensaios de inibição do anticorpo foi selecionada a partir do ponto médio aproximado dentro da porção linear das curvas de ligação individuais do hTrkB-hFc para o hBDNF ou hNT-4 revestido na placa). Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, os complexos anticorpo - proteína com 500 pM de concentração constante da proteína hTrkB-hFc foram transferidos para placas de micro titulação revestidas com hBDNF ou hNT-4. Após uma hora de incubação em temperatura ambiente, os poços foram lavados e a hTrkB-hFc ligada à placa foi detectada com anticorpos policlonais de cabra específicos para o fragmento Fcy anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (JacksonImmunoResearch). A placa foi, então, desenvolvida usando solução de substrato TMB (BD Biosciences) de acordo com as recomendações do fabricante e a absorbância em 450 nm foi medida usando um leitor de placa Victor (PerkinElmer"").

[0256] A análise dos dados foi realizada usando um modelo dose - resposta sigmoidal dentro do software Prism" (GraphPad) . O valor 1ICso calculado, definido como a concentração de anticorpo requerida para reduzir 50 % da ligação do hTrkB-hFc ao hBDNF ou hNT-4, foi usado como um indicador da potência de bloqueio. Percentuais de bloqueio na concentração máxima do anticorpo testada foram calculados como um indicador da capacidade dos anticorpos em bloquear a ligação de 500 pM de hTrkB-hFc ao hBDNF ou hNT-4 na placa, em relação à linha de base do ensaio. No cálculo, o sinal da ligação da amostra de 500 pM de hTrkB- hFc sem a presença do anticorpo foi referenciada como 100 % de ligação ou O % de bloqueio; e o sinal da linha de base da amostra de tampão sem hTrkB-hFc ou o anticorpo foi referenciada como 0 % de ligação ou 100 % de bloqueio.

Resumo dos resultados e conclusões:

[0257] A capacidade de os anticorpos anti-TrkB em bloquear a ligação do TrkB ao BDNF ou NT-4 foi avaliada usando dois ELISAS sanduíche por competição. A ligação do TrkB-hFc humano ao hBDNF ou hNT-4 revestido em placas de micro titulação de 96 poços, na presença de anticorpos serialmente diluídos ou nenhum anticorpo controle, foi detectada com anticorpos policlonais específicos para o fragmento Fcy anti-humano conjugado com HRP. Os valores de ICso foram calculados e usados como o indicador da potência do anticorpo em bloquear a ligação do hTrkB-hFc ao hBDNF ou hNT-4. Além disso, o bloqueio máximo de 500 pM de hTrkB-hFc com cada anticorpo na concentração mais alta testada foi calculado e comparado.

[0258] Os resultados do bloqueio são resumidos na tabela 28. O % de bloqueio é reportado para todos os anticorpos e calculado na concentração mais alta de anticorpo testada de 100 nM. O % de bloqueio negativo indica um aumento de ligação ao TrkB detectado na presença de anticorpo. Os valores de ICso são mostrados para os anticorpos que bloqueiam > de 50 % da ligação do TrkB ao BDNF ou NT4. Os valores de ICso não são quantitativos para os anticorpos que bloqueiam < de 50 % e foi reportado como (-).

[0259] Na concentração mais alta do anticorpo testado, um (H4H9780P) dos três anticorpos anti-TrkB bloqueou > de 50 % da ligação do hTrkB aos ligantes BDNF ou NT-4 com valores de TCso de 150 PM e 180 PM, respectivamente, com percentuais de bloqueio a 100 nM de anticorpo de 93 % para BDNF e 80 % para NT-4. Em 3,7 nM, este anticorpo bloqueou 500 pM da ligação do hTrkB-hFc ao NT-4 com 99 %. A diminuição da % de bloqueio nas concentrações mais altas testadas pode ser atribuída à ligação não específica do H4H9780P à placa de micro titulação e detecção desta ligação com anticorpos policlonais específicos para o fragmento Fcy anti-humano conjugado com HRP.

[0260] Dois dos três anticorpos anti-TrkB (H4H9814P e H4H9816P2) e anticorpos controle de bloqueio irrelevante bloquearam < 50 % da ligação do hTrkB ao BDNFE ou NT4. O comparador bloqueou a ligação de 500 pM de hTrkB-hFc > 50 % para ambos BDNF e NT-4.

Tabela 28

Bloqueio da ligação de 500 | Bloqueio da ligação de 500 pM de PM de Ab hTrkB-hFc a hBDNF Ab hTrkB-hFc a hNT-4 revestido revestido na placa na placa Ab PID % do bloqueio % do bloqueio ICso (M) com 100 nM de ICso (M) com 100 nM de anticorpo anticorpo | H4H9816P2 | - | -56 - | -123 a-TrkB- mIgG1 1,7 E-10 97 4,5 E-11 E (Comparador HI1M8037C) controle do isotipo - -31 - 45 negativo hIgGA controle do isotipo -19 negativo mIgG1 (*) Bloqueou 99 &% da concentração de anticorpo H4H9780P a 3,7 nM. Exemplo 14. Competição cruzada do octeto entre diferentes anticorpos monoclonais anti-hTrkB

[0261] Para avaliar se dois anticorpos competem um com o outro pela ligação em seus epítopos em hTrkB-mmh, a competição da ligação entre anticorpos monoclonais anti- hTrkB foi determinada usando um teste de interferometria de camada biológica livre de marcação em tempo real em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Experimentos de competição cruzada foram realizados a 25 ºC em 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3.4 mM de EDTA, tensoativo Tween 20 a 0,05 % v/v, 0,1 mg/ml de BSA (tampão HBS - EP) com a agitação da placa à velocidade de 1000 rpm. Todos os anticorpos anti-hTrkB e soluções hTrkB-mmh testados foram preparados em tampão HBS - EP Octet. Para avaliar se 2 anticorpos eram capazes de competir um com o outro pela ligação aos seus respectivos epítopos em hTrkB-mmh, aproximadamente -0,14 - 0,24 nm de hTrkB-mmh foram primeiro capturados em pontas dos biossensores Octet revestidos com anti-His a partir de poços contendo 50 ug/mL de hTrkB-mmh por 5 minutos. Os hTrkB-mmh capturados nas pontas do biossensor Octet foram saturados por submersão por 5 minutos em poços contendo 50 ug/mL do primeiro anticorpo monoclonal anti-hTrkB (aqui referido como mAb-l1), seguido pela submersão em poços contendo o segundo anticorpo monoclonal anti-HTrkB (aqui referido como mAb-2) por mais 5 minutos. Entre as etapas, as pontas do biossensor Octet foram lavadas em tampão HBS - EP por 30 segundos.

[0262] A resposta da ligação em tempo real foi monitorada durante o curso do experimento e a resposta da ligação no final de cada etapa foi registrada. A resposta da ligação de mAb-2 ao hTrkB.mmh pré-complexado com maAb-1l foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos —“monoclonais anti-hTrkB foi determinado usando um limite de inibição de 60 %.

[0263] A tabela 29 define explicitamente as relações dos anticorpos concorrentes em ambas às direções,

independentemente da ordem de ligação.

Resultados: Tabela 29: Competição cruzada de anticorpos anti-hTrkB para a ligação ao hTrkB.mmh humano. Loma | mz | H4H9814P H4H9816P2 H4H9816P2 H1M8037C H1M8037C (Comparador) | (Comparador) Exemplo 15. Cinética de ligação Biacore de ligação dos anticorpos monoclonais TrkB anti-camundongo substitutos a diferentes reagentes de TrkB medidos a 25 “ºC

[0264] Para avaliar se dois anticorpos competem um com o outro pela ligação em seus epítopos em mTrkB-mmh, a competição da ligação entre anticorpos monoclonais anti- mTrkB foi determinada usando um teste de interferometria de camada biológica livre de marcação em tempo real em um biossensor Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Experimentos de competição cruzada foram realizados a 25 ºC em 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3,4 mM de EDTA, tensoativo Tween 20 a 0,05 % v/v, 0,1 mg/ml de BSA (tampão HBS - EP) com a agitação da placa à velocidade de 1000 rpm. Todos os anticorpos anti-mTrkB e soluções de mTrkB-mmh testados foram preparados em tampão HBS - EP Octet. Para avaliar se 2 anticorpos eram capazes de competir um com o outro pela ligação aos seus respectivos epítopos em mTrkB-mmh, aproximadamente +- 0,20 - 0,27 nm de mTrkB-mmh foram primeiro capturados em pontas dos biossensores Octet revestidos com anti-His a partir de poços contendo 20 pg/mL de mTrkB-mmh por 5 minutos. O mTrkB-mmh capturados nas pontas do biossensor Octet foram saturados por submersão por 5 minutos em poços contendo 50 ug/mL do primeiro anticorpo monoclonal anti-mTrkB (aqui referido como mAb-1), seguido pela submersão em poços contendo o segundo anticorpo monoclonal anti-mTrkB (aqui referido como mAb-2) por mais 3 minutos. Entre as etapas, as pontas do biossensor Octet foram lavadas em tampão HBS - EP por 30 segundos.

[0265] A resposta da ligação em tempo real foi monitorada durante o curso do experimento e a resposta da ligação no final de cada etapa foi registrada. A resposta da ligação de mAb-2 ao mTrkB.mmh pré-complexado com mAb-1l foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos —“monoclonais anti-mTrkB foi determinado usando um limite de inibição de 50 %.

[0266] A Tabela 30 define explicitamente as relações dos anticorpos concorrentes em ambas as direções, independentemente da ordem de ligação.

Resultados: Tabela 30: Competição cruzada de anticorpos anti-mTrkB para a ligação ao hTrkB.mmh de camundongo. Lomeno | mana | memo [emana M2aM14173N oem nica M2aM14178N

H1M8037C HI1M8037C (Comparador) | (Comparador) Exemplo 16: Bloqueio do octeto: o bloqueio de anticorpos anti-TrkB humano ou TrkB anti-camundongo a partir da ligação ao TrkB por BDNF ou NT-4 Experimento 1.

[0267] O bloqueio de anticorpos anti-TrkB humano ou TrkB anti-camundongo a partir da ligação ao TrkB pelo BDNF ou NT-4 foi avaliado usando um instrumento Octet HTX para interferometria de camada biológica (BLI) em tempo real. O estudo completo foi realizado em 10 mM de HEPES pH 7,4, 300 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 1 mg/mL de BSA, NaN3 a 0,02 % e tensoativo Tween 20 a 0,05 % v/v (tampão de corrida HBS - EBT) a 25 ºC. Todas as amostras foram distribuídas em uma placa de 384 poços inclinados e a placa foi posicionada no agitador orbital com a velocidade de agitação de 1000 rpm. hTrkB.mFc foi capturado em sensores Octet anti-mFc (AMC) enquanto hTrkB.hFc ou mITrkB.hfc foram capturados em sensores Octet anti-hFc (AHC) por imersão em poços contendo ug/mL de reagentes de TrkB por 2 minutos. hTrkB.mFc ou hTrkB.hFc capturados em biossensores Octet foram saturados por imersão em poços contendo 20 nM de BDNF, hNT-4 ou mNT-4 durante 2 minutos, seguido de imersão dos biossensores Octet em poços contendo 300 nM de diferentes mAbs de TrkB durante 4 minutos. A ligação de mAbs de TrkB ao complexo de TrkB e BDNF, IhNT-4 ou mNT-4 foi determinada usando o software de análise Scrubber 2.0c.

[0268] A ligação de quaisquer anticorpos anti-TrkB humano ou TrkB anti-camundongo desta invenção não foi bloqueada por ambos BDNF e NT-4 tal como reportado na tabela 31 e tabela 32.

Tabela 31: Ligação de anticorpos monoclonais anti-TrkB humanos ao complexo de hTrkB-mFc e BDNF ou NT-4 humana. Lo usesto so anticoro anti-vms munano com | Superfície Nenhum captura BDNF (0,05 t hNT-4 (0,05 de captura Ligante (nm) 0,007) nm + 0,006) nm REGN1945 0,29 + (controle do hTrkB.mFc 0,01 + 0,01 0,00 + 0,00 0,00 + 0,00 0,01 isotipo negativo) [sanar | 22 | EIS Josue] cnsna fone] hTrkB.hFc 0,38 + 0,01 0,07 + 0,00 0,10 t+ 0,006 0,01 (Comparador) Os valores de ligação dos anticorpos anti-TrkB humanos ao complexo de hTrkB.mFc ou hTrkB.hFc com BDNF ou hNT-4 representam uma média de resposta de ligação medida usando 3 biossensores Octet independentes junto com o desvio padrão. A ligação de BDNF ou hNT-4 ao hGFRa3.mFc não inibiu a ligação de quaisquer anticorpos anti-TrkB humanos.

Tabela 32: Ligação de anticorpos monoclonais TrkB anti- camundongo ao complexo de mTrkB-hFc e BDNF ou NT-4 de camundongo.

Ligação ao anticorpo TrkB anti-camundongo (nm) Superfície | Nível de Nenhum Saturação do Saturação do de captura | captura Ligante EBDNF (0,07 + mNT-4

0,006) nm (0,07 t 0,005) nm REGN1318 0,47 + (controle do mTrkB.hFc 0,01 + 0,00 0,00 + 0,00 0,00 + 0,006 0,01 isotipo negativo) eta een] mrisos [nan 0,42 + 0,006 0,06 + 0,006 0,11 + 0,00 (Comparador) Os valores de ligação de anticorpos TrkB anti-camundongo ao complexo de mTrkB.mFc com BDNF ou mNT-4 representam uma média de resposta de ligação medida usando 3 biossensores Octet independentes junto com o desvio padrão. A ligação de BDNF ou mNT-4 ao mGFRa3.hFc não inibiu a ligação de quaisquer anticorpos TrkB anti- camundongo.

Experimento 2.

[0269] O bloqueio de BDNF ou NT 4 a partir da ligação ao TrkB por anticorpos anti-TrkB humano ou TrkB anti-camundongo foi avaliado usando um instrumento Octet HTX para interferometria de camada biológica (BLI) em tempo real. O estudo completo foi realizado em 10 mM de HEPES pH 7,4, 300 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 1 mg/mL de BSA, NaN3 a 0,02 % e tensoativo Tween 20 a 0,05 % v/v (Tampão de corrida HBS - EBT) a 25 ºC. Todas as amostras foram distribuídas em uma placa de 384 poços inclinados e a placa foi posicionada no agitador orbital com a velocidade de agitação de 1000 rpm. hTrkB.mFc foi capturado em sensores Octet anti-mFc (AMC) enquanto hTrkB.hFc ou mTrkB.hFc foram capturados em sensores Octet anti-hFc (AHC) por imersão em poços contendo 10 ug/mL de reagentes de TrkB por 2 minutos. hTrkB.mFc ou hTrkB.hFc capturados em sensores Octet foram saturados por imersão em poços contendo 300 nM de diferentes mAbs TrkB por 4 minutos, seguido de imersão dos biossensores Octet em poços contendo 20 nM de BDNF, hNT-4, ou mMNT-4 por 2 minutos. A ligação de BDNF, hNT-4 ou mNT-4 ao complexo de TrkB e diferentes mAÃbs TrkB foi determinada usando o software de análise Scrubber 2.0c.

[0270] A ligação de 1 dentre 3 anticorpos anti-TrkB humanos desta invenção bloqueou a ligação de BDNF e hNT-4 tal como reportado na tabela 33. A ligação de 1 dentre 3 anticorpos TrkB anti-camundongo desta invenção bloqueia parcialmente a ligação de BDNF e mNT-4 tal como reportado na tabela 34.

Tabela 33: Ligação de BDNF ou NT-4 humano ao complexo de hTrkB-mFc e anticorpos monoclonais anti-TrkB humanos. Lo] sesecemm | nisso comes | Nível de Ligação Ligação Superfície captura ao mAb ao maAb de captura (nm) (nm) (nm) 0,28 + 0,05 + 0,04 t hTrkB.mFc Nenhum mAb N/A N/A 0,01 0,007 0,005 REGN1945 (controle do | 0,01 t+ 0,04 + 0,01 t+ 0,033 + isotipo 0,01 0,01 0,01 0,006 negativo) 0,18 + 0,01 + 0,18 + 0,007 + H4H9780P 0,01 0,00 0,01 0,006 0,18 + 0,05 + 0,18 + 0,04 + H4H9814P 0,01 0,00 0,01 0,00

0,19 + | 0,057 + 0,18 + 0,043 + H4H9816P2 0,00 0,006 0,01 0,006 0,48 + H1MB037C 0,38 + | -0,017 + 0,39 + 0,013 + hTrkB.hFc 0,01 (Comparador) 0,01 0,006 0,01 0,006 Os valores de ligação do BDNF ou hNT-4 ao complexo de hTrkB.mFc ou hTrkB.hFc com anticorpos anti-TrkB humanos representam uma média de resposta de ligação medida usando 3 biossensores Octet independentes junto com o desvio padrão.

A ligação de H4H9780P ao hGFRa3.mFc bloqueou a ligação de BDNF e hNT-4. Tabela 34: Ligação do BDNF ou NT-4 de camundongo ao complexo de mTrkB-hFc e anticorpos monoclonais TrkB anti- camundongo.

Ligação ao BDNF Ligação ao hNT-4 Nível de Ligação Ligação Superfície captura ao mAb ao maAb hNT-4 de captura (nm) (nm) (nm) 0,48 + 0,07 + 0.07 + mMTrkB.hFc Nenhum mAb N/A N/A 0,01 0,01 0,005 REGN1318 (controle do | 0,01 t 0,06 + 0,01 0,06 + isotipo 0,00 0,00 0,00 0,00 negativo) 0,42 + 0,07 + 0,413 + 0,06 + M2aM14173N 0,006 0,00 0,006 0,00 0,47 + 0,05 + 0,47 0,033 + M2aM14178N 0,00 0,00 0,01 0,006 0,42 + 0,07 + 0,41 + 0,06 + M2aM14179N 0,006 0,00 0,00 0,00 H1MB037C 0,42 + 0,017 0,40 + 0,02 t (Comparador) 0,006 + 0,006 0,00 0,00 Os valores de ligação do BDNF ou mNT-4 ao complexo de anticorpos mTrkB.hFc e

TrkB anti-camundongo representam uma média de resposta de ligação medida usando 3 biossensores Octet independentes junto com o desvio padrão. A ligação de M2aM14178N ao mTrkB.hFc bloqueia parcialmente a ligação de BDNF e mNT-4.

[0271] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, diversas modificações da invenção além daquelas aqui descritas se tornarão evidentes para um técnico no assunto a partir do relatório descritivo acima e das figuras anexas. Tais modificações pretendem se enquadrar dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao receptor quinase B da tropomiosina (TrkB), CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1l, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 49, 59 e 68; e três CDRs de cadeia leve (LCDRI, LCDR2 e LCDR3 contidas dentro de uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 53, 63 e 72.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender as CDRs de um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

3. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um par de sequências de aminoácido da HCVR/LCVR selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 49/53, 59/63 e 68/72.

4, Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) um domínio HCDR1l apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 50, 60 e 69; (b) um domínio HCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 51, 61 e 70; (c) um domínio HCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 52, 62 e 71; (d) um domínio LCDR1I apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 54, 64 e 73; (e) um domínio LCDR2 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 55, 65 e 74; e (f) um domínio LCDR3 apresentando uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 56, 66 e 75.

5. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreender um conjunto de seis CDRs (HCDRl - HCDR2 - HCDR3 - LCDR1 - LCDR2 - LCDR3) selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NOs: 4 -— 6 — 8 -— 12 -— 14 - 16; (b) SEQ ID NOs: 20 - 22 - 24 — 28 - 30 - 32; (c) SEQ ID NOs: 36 - 38 —- 40 - 44 —- 46 - 48; (d) SEQ ID NOs: 50 - 51 - 52 - 54 - 55 - 56; (e) SEQ ID

NOs: 60 - 61 - 62 — 64 — 65 - 66; e (f£) SEQ ID NOs: 69 - 70 — 71-73 — 74 - 75.

6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligar a TrkB humano com um K” de menos de cerca de 300nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligar ao TrkB humano com um Kp selecionado a partir do grupo que consiste em menos do que cerca de 150 nM, menos do que cerca de 50 pM, menos do que cerca de 100 pM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 ºC.

8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de l a 5, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se ligar ao TrkB humano com uma meia vida dissociativa (t») selecionada a partir do grupo que consiste em maior do que cerca de 10 minutos, maior do que cerca de 40 minutos, maior do que cerca de 120 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou 37 “ºC.

9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ativar a sinalização de TrkB humano na ausência de BDNF nas células projetadas para expressar TrkB, com um ECso de menos de cerca de 100 pM.

10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo melhorar a ativação da sinalização de TrkB humano na presença de BDNF nas células projetadas para expressar TrkB, com um ECso de menos de cerca de 100 pM.

11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de, quando injetado no hipocampo de camundongos com TrkB humanizado, demonstrar ativação do TrkB, tal como mostrado por um aumento na fosforilação do TrkB.

12. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo demonstrar a ativação das vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/Akt, tal como demonstrado após a incubação de neurônios corticais primários de camundongo com um anticorpo agonista anti- TrkB.

13. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo melhorar a sobrevivência de células ganglionares da retina tal como mostrado em um modelo de transecção do nervo óptico em ratos com TrkB humanizado.

14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo promover a perda de peso em camundongos com TrkB humanizado.

15. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo promover uma perda de massa de gordura em camundongos com TrkB humanizado.

16. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo promover uma diminuição no consumo de alimentos e água em camundongos com TrkB humanizado.

17. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo promover um aumento na atividade de locomoção em camundongos com TrkB humanizado.

18. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo exibir uma ou mais propriedades selecionadas a partir do grupo que consiste em: (a) ser um anticorpo agonista; (b) se ligar ao TrkB humano com um Kpr de menos de cerca de 200 nM tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC ou a 37 ºC;

(c) se ligar ao TrkB humano com uma meia vida dissociativa (t%) maior do que cerca de 10 minutos tal como medido por ressonância de plasma de superfície a 25 ºC oua 37 ºC; (d) ativar a sinalização de TrkB humano na ausência de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) nas células projetadas para expressar TrkB humano com um ECso de menos de cerca de 100 pM; (e) melhorar a fosforilação do TrkB quando injetado no hipocampo de camundongos homozigóticos para o receptor TrkB humano (TrkB "u/hv); (f) promover a perda de peso quando injetado em camundongos homozigóticos para o receptor TrkB humano (TrkB pe/pe) ; (gq) aumentar a sobrevivência de células ganglionares da retina (RGC) tal como avaliado em um modelo de transecção do nervo óptico em ratos com TrkB humanizado; (h) ativar as vias de sinalização MAPK/ERK e PI3K/Akt; (i) melhorar/aumentar a sobrevivência de células neuronais in vitro; e (3) bloquear a ligação de TrkB ao BDNF e/ou NT-4 com um ICso de menos do que 5 nM.

19. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de compreender o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

20. Molécula de ácido nucleico isolada CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo anti-TrkB ou fragmento do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l1 a

12.

21. Vetor CARACTERIZADO pelo fato de compreender a sequência de polinucleotídeo, conforme definida na reivindicação 20.

22. Célula CARACTERIZADA pelo fato de expressar o vetor, conforme definido na reivindicação 21.

23. Uso de uma composição para a melhora de uma atividade biológica mediada por TrkB, o uso CARACTERIZADO pelo fato de compreender: colocar o TrkB em contato com uma quantidade biologicamente eficaz de um anticorpo agonista anti-TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l a 12, Ou colocar o TrkB em contato com uma composição farmacêutica contendo uma quantidade biologicamente eficaz de um anticorpo agonista anti-TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de a atividade biológica ser proteção neuronal ou sobrevivência neuronal e a proteção neuronal ou a sobrevivência neuronal serem melhoradas quando do contato do TrkB com um anticorpo agonista anti- TrkB.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de colocar o TrkB em contato com um anticorpo agonista anti-TrkB resulta na neuroproteção e sobrevivência de células ganglionares da retina (RGCs).

26. Uso de uma composição para o tratamento ou a prevenção de uma doença ou disfunção associada à atividade ou expressão do TrkB, ou para a melhora de pelo menos um sintoma associado à doença ou disfunção associada à atividade ou expressão do TrkB, o uso CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo agonista anti-TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l1 a 12, Ou a administração de uma composição farmacêutica contendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo agonista anti-TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, a um indivíduo em necessidade do referido tratamento.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de doença ou disfunção ser uma doença ou disfunção do olho selecionada a partir do grupo que consiste em glaucoma, retinopatia diabética degeneração macular relacionada com a idade, neuropatia isquêmica óptica, neurite óptica, isquemia da retina, degeneração do fotorreceptor, retinite pigmentosa e oclusões da artéria ou veia da retina.

28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de a doença ou disfunção ser glaucoma.

29. Uso de uma composição para alcançar uma redução do peso corporal em um indivíduo, o uso CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração de um agonista do TrkB, em que o agonista do TrkB é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.

30. Uso de uma composição para alcançar uma redução de massa de gordura em um indivíduo, o uso compreendendo a administração de um agonista do TrkB, CARACTERIZADO pelo fato de o agonista do TrkB ser um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.

31. Uso de uma composição para promover a sobrevivência neuronal em um indivíduo, o método CARACTERIZADO pelo fato de compreender a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agonista do TrkB, em que o agonista do TrkB é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para TrkB, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l1 a 5, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ao indivíduo.

32. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de colocar o TrkB em contato ser realizado pela injeção de um paciente com uma formulação injetável compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de l1 a

12.