BR112015003110B1 - Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, método para produzir anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, uso do anticorpo isolado ou de seu fragmento de ligação a antígeno, composição farmacêutica, e, uso da composição farmacêutica - Google Patents
Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, método para produzir anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, uso do anticorpo isolado ou de seu fragmento de ligação a antígeno, composição farmacêutica, e, uso da composição farmacêutica Download PDFInfo
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Abstract
ANTICORPO ISOLADO MONOCLONAL OU UM SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR ANTICORPO OU SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, USO DO ANTICORPO ISOLADO OU DE SEU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente revelação apresenta anticorpos que se ligam a GFRa3 de humano e métodos de uso dos mesmos. De acordo com determinadas modalidades aqui reveladas, os anticorpos são anticorpos totalmente de humano que se ligam a GFRa3 de humano. Os anticorpos da revelação são úteis para o tratamento de doenças e transtornos associadas (associados) com uma ou mais atividades biológicas de GFRa3, incluindo o tratamento de condições de dor aguda ou de dor crônica, ou condições inflamatórias.
Description
[001] A presente invenção é relacionada aos anticorpos de humano e aos fragmentos de ligação a antígeno de anticorpos de humano que especificamente se ligam ao receptor alfa 3 da família de fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais de humano (GFRa3, glial cell-line derived neurotrophic factor [GDNF] family receptor alpha 3), e aos métodos terapêuticos de uso daqueles anticorpos.
[002] A família relacionada ao fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais é composta de fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF), neurturina (NRTN), artemina (ARTN) e persefina (PSPN). Cada membro da família GDNF liga-se a um receptor ancorado em glicosilfosfatidilinositol (GPI, glycosylphosphatidylinositol) associado à membrana plasmática. Esta família de receptores é chamada de os receptores alfas da família GDNF (GFRas, GDNF-family receptor alphas). Esta família de receptores é composta de quatro receptores GFRa diferentes, GFRa1-4. GDNF liga-se preferencialmente a GFRal, NRTN liga-se preferencialmente a GFRa2, ARTN liga-se preferencialmente a GFRa3, e PSPN liga-se preferencialmente a GFRa4. Cada ligante da família GDNF sinaliza mediante o receptor tirosina-cinase rearranjado durante transfecção RET (“rearranged during transfection”), que foi primeiro descoberto como um proto-oncogene. RET é ativado pelos membros da família GDNF apenas Petição 870160043426, de 15/08/2016, pág. 6/28 se o ligante for primeiro ligado ao seu receptor GFRa (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience(2002), 3:383-394).
[003] Ambos ARTN e GFRa3 são elevadamente expressados durante o desenvolvimento e estão envolvidos em desenvolvimento de sistema nervoso simpático. Em adulto, a expressão deGFRcG é predominantemente restrita aos neurônios sensoriais dos gânglios da raiz dorsal (DRG, dorsal root ganglia) (Orozco, O.E., et al., European J. Neuroscience, (2001), 13:2177-2182). Em camundongo adulto, artemina é expressada em testículo, útero, tireoide, próstata, e epididimo, e também em bulbos olfativos e arteríolas e mesentério (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience(2002), 3:383-394; Airaksinen, M.S. et al., Brain, Behavior and Evolution, (2006), 68:181 -190).
[004] Foi demonstrada uma possível função de GFRa3 e de artemina em hiperalgesia em vários estudos. Por exemplo, foi demonstrado que uma injeção da proteína artemina na pata traseira de um roedor causou hiperalgesia térmica e esta nocicepção foi intensificada quando artemina foi coinjetada com NGF (Malin, S.A., et al., J. Neuroscience,(2006), 26(33): 8588-8599). Outros estudos mostraram que a expressão de mRNA codificador de artemina foi suprarregulada em um modelo inflamatório murino (Elitt, C.M., et al., J. Neuroscience,(2006), 26(33): 8578-8587). Ademais, outros estudos mostraram que camundongos artemina-transgênicos têm expressão elevada de TRPV1 e TRPA1 e têm sensibilidade comportamental aumentada ao calor e ao frio (Elitt, C.M., et al., J. Neuroscience,(2006), 26(33): 8578-8587). Em adição, foi demonstrada, por estudos de camundongos com gene GFRa3 inativado, uma possível função do GFRa3 em hipersensibilidade visceral, de acordo com o qual estes camundongos mostraram atenuação de hipersensibilidade visceral após tratamento intracolônico com TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico, 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid)em relação aos camundongos C57BL/6 de tipo selvagem (Tanaka, T., et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. (2011), 300:G418-G424). Também foi demonstrado, por um estudo realizado em pacientes submetidos à ressecção de cabeça pancreática, uma possível função da artemina e de seu receptor GFRa3 em dor associada com pancreatite (Ceyhan, G.O., et al.. Gut,(2007), 56:534-544). Com base no relato acima, outros estudos são justificados para determinar se os pacientes que sofrem de dor/hiperalgesia e/ou hipersensibilidade poderiam se beneficiar do tratamento com um inibidor da atividade de GFRa3.
[005] Os anticorpos que se ligam a GFRa3 são descritos em US 6.861.509. Em adição, US 6.677.135 revela uma sequência de comprimento total de GFRa3, enquanto que as variantes de encadeamento da molécula de GFRa3 são descritas em US 7.026.138; US2007/0232535 e US2006/0216289. US 7.138.251 revela sequências que têm 99% de identidade com GFRa3 de comprimento total e a preparação de anticorpos monoclonais humanizados para esta molécula é descrita nesta patente.
[006] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais (mAbs, monoclonal antibodies)totalmente de humano e seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a GFRa3 de humano e inibem ou bloqueiam sua atividade, por exemplo, bloqueiam a ligação de GFRa3 ao fator neurotrófíco derivado de linhagem de células gliais, artemina, e possivelmente bloqueiam a ativação subsequente do receptor tirosina-cinase RET e/ou bloqueiam a sinalização mediante RET e/ou bloqueiam a sinalização mediante um mediador diferente de RET. Os anticorpos ou seus fragmentos de ligação a antígeno podem ser úteis para o tratamento de hiperalgesia, alodinia e/ou hipersensibilidade a qualquer estímulo sensorial, incluindo, mas não se limitando a pressão, calor e/ou frio. Os anticorpos também podem ser usados para tratar dor/hipersensibilidade associada a uma ampla variedade de condições e transtornos nas quais (nos quais) é desejado o bloqueio da interação de GFRa3 com artemina. O anticorpos também podem ser usados para inibir o crescimento, a proliferação e/ou a metástase de células tumorais.
[007] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno que especificamente se liga a GFRa3 de humano e tem uma ou mais dentre as seguintes características: (i) apresenta uma KD na faixa de cerca de IO’8Ma cerca de IO’13 M conforme medida por ressonância de plasmon de superfície; (ii) demonstra a capacidade para bloquear cerca de 50- 100% da ligação de GFRa3 ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 40 pM a cerca de 15 nM; (iii) demonstra a capacidade para bloquear cerca de 20% a cerca de 100% da ligação de GFRa3 a um suporte sólido revestido com uma mistura de artemina e RET; (iv) bloqueia ou inibe a ativação de RET dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 200 pM a cerca de 50 nM; (v) inibe ou reduz uma ou mais respostas nociceptivas em um modelo in vivo de dor de câncer ósseo; (vi) inibe ou reduz hiperalgesia térmica sensibilizada por artemina in vivo; (vii) inibe ou reduz alodinia em um modelo in vivo de osteoartrite; (viii) não reage cruzadamente com outros correceptores GFR para RET; (ix) compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR, heavy chain variable region)que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194,210,226,242,258,274,290,306, 322, 338, 354, 381 e 397; ou (x) compreende um região variável de cadeia leve (LCVR, light chain variable region)que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405.
[0008] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno é selecionado dentre o grupo consistindo em um anticorpo murino, quimérico, humanizado e um anticorpo de humano.
[0009] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno não reage cruzadamente com GFRal de humano ou GFRa2 de humano.
[0010] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e 397 e (b) uma região variável de cadeia leve (LCVR) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26,42,58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202,218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405.
[0011] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno demonstra a capacidade para bloquear cerca de 50-95% da ligação de GFRa3 de humano ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 40 pM a cerca de 750 pM.
[0012] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno bloqueia cerca de 75-100% da ligação de GFRa3 de humano ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 400 pM a cerca de 15 nM.
[0013] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno bloqueia ou inibe a ativação de RET de humano dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 300 pM a cerca de 5 nM.
[0014] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno bloqueia ou inibe a ativação de RET de macaco cinomolgo dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 0,7 nM a cerca de 2,5 nM.
[0015] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende as três CDRs (complementarity determining regions,regiões determinantes complementaridade) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de uma sequência de aminoácidos de HCVR selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e 397; e as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de uma sequência de aminoácidos de LCVR selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405.
[0016] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e397.
[0017] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende um região variável de cadeia leve (LCVR) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405.
[0018] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácido de HCVR/LCVR selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 381/389 e 397/405.
[0019] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácido de HCVR/LCVR selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 50/58, 146/154, 210/218 e 290/298.
[0020] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio de HCDR1 (heavy-chain complementarity determining region 7, região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 e 399; (b) um domínio de HCDR2 (heavy-chain complementarity determining region 2, região determinante de complementaridade de cadeia pesada 2) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 385 e 401; (c) um domínio de HCDR3 (heavy-chain complementarity determining region 3, região determinante de complementaridade de cadeia pesada 3) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 e 403; (d) um domínio de LCDR1 (light-chain complementarity determining region 7, região determinante de complementaridade de cadeia leve 1) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 e 407; (e) um domínio de LCDR2 (light-chain complementarity determining region 2, região determinante de complementaridade de cadeia leve 2) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 e 409; e (f) um domínio de LCDR3 (light-chain complementarity’ determining region3, região determinante de complementaridade de cadeia leve 3) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 395 e 411.
[0021] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno compete pela ligação específica a GFRa3 de humano com um anticorpo ou fragmento ligante a antígeno que compreende pares de sequências de cadeia pesada e de cadeia leve selecionados dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 e 354/362, 381/389 e 397/405.
[0022] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno liga-se ao mesmo epítopo em GFRa3 de humano que é reconhecido por um anticorpo que compreende pares de sequências de cadeia pesada e de cadeia leve selecionados dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346 e 354/362, 381/389 e 397/405.
[0023] Os anticorpos da presente invenção podem ser de comprimento total (por exemplo, um anticorpo IgGl ou IgG4) ou podem compreender apenas uma porção de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, Ffab’)? ou scFv), e podem estar modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, para eliminar as funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol.164:1925-1933).
[0024] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a GFRa3 de humano, compreende uma HCVR que compreende as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas nas sequências de aminoácidos de HCVR selecionadas dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e 397; e/ou uma LCVR que compreende as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas nas sequências de aminoácidos de LCVR selecionadas dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186,202,218,234,250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405. Métodos e técnicas para identificar as CDRs dentro de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos (conhecidas) na arte e podem ser usados (usadas) para identificar as CDRs nas sequências de aminoácidos de HCVR e/ou de LCVR especificadas aqui reveladas. Convenções exemplificadoras que podem ser utilizadas para identificar os limites de CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia, e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat é baseada na variabilidade de sequência, a definição de Chothia é baseada na localização das regiões de alça estruturais, e a definição de AbM é uma acomodação entre as abordagens de Kabat e de Chothia. Consulte, por exemplo Rabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:92fâ-9272(1989). As bases de dados públicas também estão disponíveis para identificar as sequências de CDR em um anticorpo.
[0025] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno que especificamente se liga a GFRa3 de humano compreende: (a) um domínio de HCDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 e 403; e (b) um domínio de LCDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 395 e 411.
[0026] Em uma modalidade, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno que especificamente se liga a GFRa3 de humano, conforme descrito em (a) e (b) acima, adicionalmente compreende: (c) um domínio de HCDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 e 399; (d) um domínio de HCDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358,385 e 401; (e) um domínio de LCDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 e 407; e (f) um domínio de LCDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 e 409.
[0027] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal de comprimento total de humano ou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a GFRa3 de humano, em que o anticorpo ou seu fragmento apresenta uma ou mais das seguintes características: (i) compreende uma HCVR que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e 397; (ii) compreende uma LCVR que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405; (iii) compreende um domínio de HCDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 387 e 403, ou uma sua sequência substanciaimente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192,208,224,240, 256, 272, 288,304,320,336, 352, 368, 395 e 411 ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio de HCDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 383 e 399 ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 385 e 401 ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 391 e 407 ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 393 e 409 ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) apresenta uma Kp na faixa de cerca de 10's M a cerca de 10‘13 M conforme medida por ressonância de plasmon de superfície; (vi) demonstra a capacidade para bloquear cerca de 50-100% da ligação de GFRa3 ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 40 pM a cerca de 15 nM; (vii) demonstra a capacidade para bloquear cerca de 20% a cerca de 100% da ligação de GFRa3 a um suporte sólido revestido com uma mistura de artemina e RET; (viii) bloqueia ou inibe a ativação de RET dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 200 pM a cerca de 50 nM; (ix) inibe ou reduz uma ou mais respostas nociceptivas em um modelo in vivo de dor de câncer ósseo; (x) inibe ou reduz hiperalgesia térmica sensibilizada por artemina in vivo; (xi) inibe ou reduz alodinia em um modelo in vivo de osteoartrite; (xii) não reage cruzadamente com outros correceptores GFR para RET.
[0028] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que compreende um domínio de HCDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0029] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento que adicionalmente compreende um domínio de EICDR1 que tem uma sequência de aminoácidos dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 que tem uma sequência de aminoácidos dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 que tem uma sequência de aminoácidos dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 que tem uma sequência de aminoácidos dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0030] Em determinadas modalidades, o anticorpo ou a porção de um anticorpo de ligação a antígeno que especificamente se liga a GFRa3 de humano compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 selecionado dentre quaisquer das sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 mostradas na Tabela 1. De acordo com determinadas modalidades, o anticorpo ou a porção de um anticorpo de ligação a antígeno compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 387/395 e 403/411.
[0031] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ 1D NOs: 4, 6 e 8, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 12, 14 e 16, respectivamente.
[0032] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 22 e 24, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, respectivamente.
[0033] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 36, 38 e 40, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 44, 46 e 48, respectivamente.
[0034] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 52, 54 e 56, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 60, 62 e 64, respectivamente.
[0035] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, EICDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 68, 70 e 72, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 76, 78 e 80, respectivamente.
[0036] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 84, 86 e 88, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 92, 94 e 96, respectivamente.
[0037] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de E1CDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ 1D NOs: 100, 102 e 104, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 108, 110 e 112, respectivamente.
[0038] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 116, 118 e 120, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 124, 126 e 128, respectivamente.
[0039] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 132, 134 e 136, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 140, 142 e 144, respectivamente.
[0040] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 148, 150 e 152, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 156, 158 e 160, respectivamente.
[0041] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 164, 166 e 168, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 172, 174 e 176, respectivamente.
[0042] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 180, 182 e 184, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 188, 190 e 192, respectivamente.
[0043] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 196, 198 e 200, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 204, 206 e 208, respectivamente.
[0044] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 212, 214 e 216, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 220, 222 e 224, respectivamente.
[0045] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ 1D NOs: 228, 230 e 232, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ 1D NOs: 236, 238 e 240, respectivamente.
[0046] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 244, 246 e 248, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 252, 254 e 256, respectivamente.
[0047] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 260, 262 e 264, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 268, 270 e 272, respectivamente.
[0048] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 276, 278 e 280, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 284, 286 e 288, respectivamente.
[0049] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDRl, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 292, 294 e 296, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 300, 302 e 304, respectivamente.
[0050] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 308, 310 e 312, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 316, 3 18 e 320, respectivamente.
[0051] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 324, 326 e 328, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 332, 334 e 336, respectivamente.
[0052] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de EICDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 340, 342 e 344, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 348, 350 e 352, respectivamente.
[0053] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, EICDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 356, 358 e 360, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 364, 366 e 368, respectivamente.
[0054] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 383, 385 e 387, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 391, 393 e 395, respectivamente.
[0055] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende as sequências de EICDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 399, 401 e 403, respectivamente e as sequências de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 407, 409 e 41 I, respectivamente.
[0056] Determinados anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno exemplificadores, não limitadores da invenção compreendem domínios de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, selecionados dentre qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 1.
[0057] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que codificam anticorpos anti-GFRa3 ou seus fragmentos anti-GFRa3. Vetores de expressão recombinantes que transportam os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, também estão incluídos (incluídas) na invenção, do mesmo modo os métodos de produzir os anticorpos pela cultura de células hospedeiras sob condições que permitem a produção dos anticorpos, e a recuperação dos anticorpos produzidos.
[0058] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento que compreende uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 380 e 396 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia com a mesma. Em uma modalidade, a HCVR é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 49, 145, 209 e 289.
[0059] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento adicionalmente compreende uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 388 e 404 ou uma sequência substancialmente idêntica que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia com a mesma. Em uma modalidade, a LCVR é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ 1D NOs: 57, 153, 217 e 297.
[0060] Em uma modalidade, a invenção também fornece um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que compreende um domínio de HCDR3 codificado por uma sequência de ácido nucleico localizada dentro das regiões variáveis dentre qualquer um dos anticorpos mostrados na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR.3 codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0061] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou seu fragmento que adicionalmente compreende um domínio de HCDRl codificado por uma sequência de ácido nucleico dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 codificado por uma sequência de ácido nucleico dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 codificado por uma sequência de ácido nucleico dentre qualquer uma daquelas mostradas na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 codificado por uma sequência de ácido nucleico mostrada na Tabela 1, ou uma sua sequência substancialmente similar que tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0062] Em um terceiro aspecto, a invenção apresenta um anticorpo anti-hGFRo.3 ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de humano anti-hGFRa3 que compreende uma HCVR codificada por segmentos de sequência de nucleotídeos derivados de sequências de linhagem germinativa de VH, DH e JH e uma LCVR codificada por segmentos de sequência de nucleotídeos derivados de sequências de linhagem germinativa de VK e J«, com as combinações conforme mostradas na Tabela 2.
[0063] A invenção inclui anticorpos anti-hGFRa3 que têm um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, modificação para remover os sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou por exemplo, remoção de uma porção de fucose para aumentar a função de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC, antibody dependent cellular cytotoxicity)(consulte Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação de galactosilação pode ser feita com o propósito de modificar a citotoxicidade dependente de complemento (CDC, complement dependent cytotoxicity).
[0064] Em um quarto aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo recombinante de humano ou seu fragmento, que especificamente se liga a hGFRci3 e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a invenção apresenta uma composição, que é uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção, e um segundo agente terapêutico. O segundo agente terapêutico pode ser qualquer agente que é vantajosamente combinado com o anticorpo ou seu fragmento da invenção, por exemplo, um agente capaz de reduzir dor, tal como, mas não se limitando a, opioides, morfina, um inibidor de COX-2, aspirina, ou outros anti-inflamatórios não esteroidais, acetaminofeno, duloxetina, anestésicos locais, moduladores de NMDA, agonistas de receptor de canabinoide, moduladores da família P2X, antagonistas de VR1, e antagonistas de substância P. O segundo agente terapêutico pode ser um inibidor de interleucina-1 (IL-1), por exemplo, uma proteína de fusão (US 6.927.044); ou um fármaco antiepiléptico/anticonvulsivo, como gabapentina, pregabalina, topiramato; ou um antidepressivo tricíclico, como amitriptilina; um antagonista ou inibidor de citocina, como um antagonista de IL-6, IL-6R, IL-18 ou IL-18R, ou um inibidor de um canal de sódio ativado por voltagem, como inibidor de Nav1.7, ou um inibidor de Nav1.8, ou um inibidor de Nav1.9; um inibidor de um canal de potássio ou canal de cálcio; ou um inibidor de NGF (um inibidor molecular pequeno ou um anticorpo anti-NGF), ou um antagonista ou inibidor secundário de GFRa3, um fator de necrose tumoral (TNF, tumor necrosis factor)ou inibidor de receptor de TNF, um inibidor de TWEAK (indutor FRACO de apoptose relacionado com TNF), um inibidor de RET, um inibidor de um ligante da família GDNFd, um inibidor de GFRal, GFRa2 ou GFRa4, um inibidor de um canal de íon sensível a ácido (por exemplo ASIC1 ou ASIC3), ou um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (SSRI, selective serotonin reuptake inhibitor),ou um inibidor da recaptação de serotonina e norepinefrina (SNRI, serotonin norepinephrine reuptake inhibitor),ou um inibidor de um receptor de proquineticina (por exemplo PROK1 e PROK2), ou um inibidor de caspase, um inibidor de p38, um inibidor de IKK 1/2, CTLA-4Ig, ou uma corticosteroide. O segundo agente terapêutico pode ser um fármaco molecular pequeno ou um inibidor de proteína/polipeptídeo. O segundo agente terapêutico pode ser sintético ou naturalmente derivado. O segundo agente terapêutico pode ser um segundo anticorpo específico para GFRa3, um antagonista de polipeptídeo, um siRNA específico para GFRa3 ou uma molécula anti-senso específica para GFRcx3. Também será reconhecido que os anticorpos e as composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser utilizados (utilizadas) em terapias de combinação, isto é, os anticorpos e as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser administrados (administradas) simultaneamente com, antes de, ou subsequentemente a, um ou mais outros agentes terapêuticos desejados ou procedimentos médicos desejados. A combinação específica de terapias (agentes terapêuticos ou procedimentos) a ser utilizada em um regime de combinação levará em consideração os agentes terapêuticos / procedimentos desejados e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Também será reconhecido que as terapias utilizadas podem alcançar um efeito desejado para o mesmo transtorno (por exemplo, um anticorpo pode ser administrado simultaneamente com um outro agente usado para tratar o mesmo transtorno), ou podem alcançar efeitos diferentes (por exemplo, controle de alguns efeitos adversos). Conforme aqui usados, os agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar ou evitar um doença, ou condição específica, são apropriados para a doença, ou condição, sendo tratada.
[0065] Em um quinto aspecto, a invenção apresenta métodos para inibir a atividade de hGFRa3 com o uso de um anticorpo anti-hGFRa3 ou uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção, em que os métodos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos da invenção, ou de seus fragmentos de ligação a antígeno, ou de uma composição farmacêutica que compreende um ou mais anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno.
[0066] Em um sexto aspecto, a invenção apresenta um método para tratar uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou a dor associada com uma condição ou doença relacionada com GFRa3, to método compreendendo administrar um anticorpo anti-GFR«3 uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo da invenção, ou uma composição compreendendo um anticorpo anti-GFRa3 ou um seu fragmento, a um paciente que necessita do mesmo (da mesma), em que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é evitada, melhorada, reduzida em severidade ou frequência de ocorrência, ou a dor associada com a condição ou doença é evitada, melhorada, reduzida em severidade ou frequência de ocorrência.
[0067] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno isolado, ou uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno da invenção para uso no tratamento de uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou da dor associada com a condição ou doença relacionada com GFRa3, em que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é evitada, melhorada, reduzida em severidade ou frequência de ocorrência, ou a dor associada com a condição ou doença é evitada, melhorada, reduzida em severidade ou frequência de ocorrência.
[0068] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno isolado da invenção, ou uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo da invenção na fabricação de um medicamento para tratar uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou a dor associada com a condição ou doença relacionada com GFRa3, em que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é evitada, melhorada, reduzida em severidade ou frequência de ocorrência, ou a dor associada com a condição ou doença é evitada, melhorada, reduzida em severidade ou frequência de ocorrência.
[0069] Em uma modalidade, a condição ou doença relacionada com GFRa3 é selecionada dentre o grupo consistindo em dor aguda, dor crônica, dor neuropática, dor inflamatória, uma síndrome de dor funcional, artrite, pancreatite, osteoartrite, cefaleias em salvas, neuralgia trigeminal, neuralgia herpética, neuralgias generalizadas, transtornos neurodegenerativos, transtornos de movimento, transtornos neuroendócrinos, ataxia, dor visceral, gota aguda, neuralgia pós-herpética, neuropatia diabética, ciática, dor lombar, cefaleia ou dor de pescoço, dor severa ou intratável, dor incidental, dor pós- cirúrgica, eritromelalgia hereditária, dor dentária, rinite, dor de câncer, síndrome da dor regional complexa (CRPS, complex regional pain syndrome),doença inflamatória intestinal (por exemplo doença de Crohn ou colite ulcerativa) e transtornos da bexiga.
[0070] Em uma modalidade, a síndrome de dor funcional é selecionada dentre o grupo consistindo em dor lombar inferior crônica, síndrome do intestino irritável (IBS, síndrome do intestino irritável), fibromialgia (FM), síndrome da fadiga crônica, dor abdominal, transtorno da articulação temporomandibular (TMJD, temporomandibular joint disorder), síndrome da bexiga dolorosa (cistite intersticial), transtomos/síndromes gastrointestinais funcionais, síndrome da dor torácica funcional, enxaquecas e cefaleias tensionais, síndrome da dor pélvica crônica, síndrome prostática dolorosa (prostatite crônica), síndrome da sensibilidade química múltipla e síndrome da Guerra do Golfo.
[0071] Em uma modalidade, a dor de câncer é associada com um câncer selecionado dentre o grupo consistindo em câncer endometrial, câncer da próstata, câncer da mama, câncer cervical, câncer hepático, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer do estômago, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer cerebral, uma leucemia, um linfoma, câncer ósseo e dor associada com metástase de um câncer.
[0072] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é administrado ao paciente em combinação com um segundo agente terapêutico.
[0073] Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é selecionado dentre o grupo consistindo em um opioide, um inibidor de COX- 2, um anestésico local, um modulador de NMDA, um agonista de receptor canabinoide, um modulador da família P2X, um antagonista de VR1, um antagonista de substância P, um segundo antagonista de GFRa3 , um antagonista de citocina ou de receptor de citocina, um inibidor de fator de crescimento de nervo (NGF) (um inibidor molecular pequeno ou um anticorpo anti-NGF), aspirina, um NSAID, um esteroide, morfina, um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (SSRI), um inibidor seletivo da recaptação de serotonina e norepinefrina (SNRI, serotonin norepinephrine reuptake inhibitor),um tricíclico, um inibidor de urn canal de sódio ativado por voltagem (Nav), um inibidor de canal de cálcio, um inibidor de canal de potássio, um fator de necrose tumoral (TNF) ou inibidor de receptor de TNF, um inibidor “TWEAK” (indutor FRACO de apoptose relacionado com TNF), um inibidor de RET, um inibidor de um ligante da família GDNF, um inibidor de um canal de íon sensível a ácido (ASIC1 ou ASIC3), um anticonvulsivo (gabapentina ou pregabalina), um inibidor de um receptor de proquineticina (PROK1 e PROK2), um inibidor de caspase, um inibidor de p38, um inibidor de IKK 1/2, CTLA-4Ig e um corticosteroide.
[0074] Em uma modalidade, o segundo antagonista de GFRa3 é uma molécula orgânica pequena, um segundo anticorpo específico para GFRa3, um antagonista de polipeptídeo, um siRNA específico para GFRa3 ou uma molécula de anti-senso específica para GFRa3.
[0075] Em uma modalidade, o antagonista de citocina ou de receptor de citocina é um antagonista de interleucina-1 (IL-1), um antagonista de IL-6, ou um antagonista de IL-8.
[0076] O transtorno tratado é qualquer doença ou condição, que é aprimorada, melhorada, inibida ou evitada por remoção, inibição ou redução de atividade de hGFRa3. Populações específicas tratáveis pelos métodos terapêuticos da invenção incluem uma doença, um transtorno, ou uma condição selecionada (selecionado) dentre dor aguda, crônica, isquêmica, neuropática, ou inflamatória, hipersensibilidade, como hipersensibilidade visceral, térmica, ou mecânica, pancreatite crônica, artrite, enxaqueca, cefaleias em salvas, neuralgia trigeminal, neuralgia herpética, neuralgias generalizadas, epilepsia ou condições epilépticas, miotinia, arritmia, transtornos de movimento, transtornos neuroendócrinos, ataxia, doença inflamatória intestinal, inflamação esplénica, dor estomacal, trigonite, fibroides, peritonite, urgência fecal, incontinência, hipersensibilidade retal, dor visceral, dor de osteoartrite, neuralgia pós-herpética, neuropatia diabética, dor radicular, ciática, dor lombar, cefaleia ou dor de pescoço, dor incidental, dor pós-cirúrgica, dor de câncer, ou dor induzida por quimioterapia. Outras condições tratáveis pelos métodos terapêuticos da invenção incluem doença de Hirschsprung, eritromelalgia hereditária, transtornos da bexiga, rinite, câncer da próstata, câncer da mama, câncer cervical, câncer hepático, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer do estômago, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, um câncer hematológico (de origem sanguínea), como uma leucemia ou um linfoma, câncer ósseo, ou dor associada com metástase de um câncer, por exemplo, dor associada com metástase de um câncer para o osso. Os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno também podem ser usados para tratar as seguintes condições: dor aguda não maligna, dor crônica, ou dor de fratura; artrite reumatoide, estenose espinhal; dor lombar inferior neuropática; síndrome da dor miofascial; dor pancreática; cefaleia crônica; cefaleia tensional; neuropatia diabética; neuropatia associada com HIV; neuropatia de Charcot-Marie-Tooth; neuropatias sensoriais hereditárias; lesão nervosa periférica; neuromas dolorosos; descargas proximais e distais ectópicas; radiculopatia; dor neuropática induzida por quimioterapia; dor neuropática induzida por radioterapia; dor de pós- mastectomia; dor central; dor de lesão na medula espinhal; dor após acidente vascular cerebral; dor talâmica; síndrome da dor regional complexa (CRPS, também conhecida como Distrofia Simpática Reflexa); dor de membro fantasma; dor intratável; dor musculoesquelética aguda; dor articular; gota aguda dor; dor lombar inferior mecânica; dor do pescoço; tendinite; dor de lesão/exercício; dor abdominal; pielonefrite; apendicite; colecistite; obstrução intestinal; hérnias; etc; dor torácica, incluindo, dor cardíaca; dor pélvica, dor de cólica renal, dor obstétrica aguda, incluindo, dor de trabalho de parto; dor de secção cesariana; dor de queimadura e trauma; endometriose; dor de herpes zóster; anemia de célula falciforme; pancreatite aguda; dor incidental; orofacial dor incluindo sinusite dor, dor dentária; dor de esclerose múltipla; dor de hanseniase; dor de doença de Behcet; adipose dolorosa; dor flebitica; dor de Guillain-Barre; movimentação dolorosa de dedos e pernas; síndrome de Haglund; dor da doença de Fabry; doença urogenital e da bexiga; e bexiga hiperativa. Em uma modalidade os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar uma síndrome de dor funcional, em que a síndrome de dor funcional é selecionada dentre o grupo consistindo em dor lombar inferior crônica, síndrome do intestino irritável (IBS), fíbromialgia (FM), síndrome da fadiga crônica, dor abdominal, transtorno da articulação temporomandibular (TMJD), síndrome da bexiga dolorosa (cistite intersticial), transtomos/síndromes gastrointestinais funcionais, síndrome da dor torácica funcional, enxaquecas e cefaleias tensionais, síndrome da dor pélvica crônica, síndrome prostática dolorosa (prostatite crônica), síndrome da sensibilidade química múltipla e síndrome da Guerra do Golfo.
[0077] Os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno também podem ser usados para inibir proliferação/crescimento de células de tumor, ou metástase de células de tumor. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno, podem ser usados para tratar um câncer, ou a “dor associada com um câncer” ou “dor associada a câncer”, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a, câncer endometrial, câncer da próstata, câncer da mama, câncer cervical, câncer hepático, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer do estômago, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer cerebral, um câncer hematológico (de origem sanguínea), como uma leucemia ou um linfoma, câncer ósseo, ou dor associada com metástase de um câncer, por exemplo, dor associada com metástase de um câncer para o osso. “Dor associada a câncer” também inclui dor mais geralmente associada com condições cancerosas como, por exemplo, carcinoma de célula renal, carcinoma pancreático, câncer de cabeça e pescoço, gliomas malignos, osteossarcoma, câncer colorretal, câncer gástrico, mesotelioma maligno, mieloma múltiplo, sarcoma sinovial, câncer de tireoide, ou melanoma. Os anticorpos da presente invenção também são úteis para tratar ou evitar dor causada por ou associada com terapia de câncer ou tratamentos médicos anticâncer, por exemplo, dor induzida por quimioterapia neuropática como dor causada por ou associada com tratamento com paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere®); nitrosoureia, ciclofosfamida, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracil, topotecan, irinotecan, carmustina, estramustina, e compostos quimioterapêuticos à base de platina, como cisplatina, carboplatina, e iproplatina.
[0078] Outras modalidades se tornarão evidentes a partir de uma análise da seguinte descrição detalhada.
[0079] Figura 1. Inibição de hiperalgesia térmica causada por capsaicina sensibilizada por artemina em animais injetados com anticorpos de camundongo anti-GFRa3 (bloqueador indireto M1M6977N ou bloqueador direto M1M6986N, n=8 cada) ou anticorpo isotípico de controle (negativo) (M2M180N, n=8) a 30mg/kg s.c. 2 dias antes do recebimento de capsaicina (1 dia antes do recebimento de 0,5µg de artemina).
[0080] Figura 2A e 2B. Alodinia tátil medida por von Frey Hairs em animais de dois experimentos (A & B) injetados com células de fibrossarcoma e tratados com anticorpo isotípico de controle (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti- GFRa3 (n=8-l 1 por grupo). *p<0,05, **p<0,01, ou ***p<0,001 em comparação com o controle isotípico no mesmo instante de tempo.
[0081] Figuras 3A e 3B. Suportação de peso ipsilateral percentual em animais de dois experimentos (A & B) injetados com células de fibrossarcoma e tratados com controle isotípico (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti-GFRa3 (n=8-l I por grupo).
[0082] Figuras 4A e 4B. Pontuações de guarda em animais de dois experimentos (A & B) injetados com células de fibrossarcoma e tratados com controle isotípico (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti-GFRa3 (n=8-l 1 por grupo). **p<0,01 em comparação com o controle isotípico no mesmo instante de tempo.
[0083] Figura 5. Alodinia tátil medida por von Frey Hairs em animais injetados com células de carcinoma e tratados com controle isotípico (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti-GFRa3 (n=9-10 por grupo). *p<0,05, **p<0,01, ou ***p<0,001 em comparação com controle isotípico (negativo) no mesmo instante de tempo.
[0084] Figuras 6A e 6B. Suportação de peso ipsilateral percentual em dois instantes de tempo (A=l 1 dias & B=18 dias) injetados com células de carcinoma e tratados com controle isotípico (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti-GFRa3 (n-9-10 por grupo). *p<0,05 em comparação com anticorpo de controle isotípico por análise de Dunnettpost hoc.
[0085] Figura 7. Pontuações de guarda em animais injetados com células de carcinoma e tratados com controle isotípico (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti- GFRa3 (n=9-10 por grupo). *p<0,05, ***p<0,001 em comparação com o controle isotípico no mesmo instante de tempo.
[0086] Figura 8. Alodinia tátil medida por von Frey Hairs em animais com DMM tratados com controle isotípico (negativo) (M2M180N) ou anticorpos de camundongo M1M6977N ou M1M6986N anti-GFRa3 (n=10 por grupo). **p<0,01 ou ***p<0,001 em comparação com o controle isotípico no mesmo instante de tempo.
[0087] Figura 9. Análise de competição cruzada de anticorpos anti- GFRa3 pela ligação à biotina-hGFRa3-mmH.
[0088] Antes da descrição dos presentes métodos, é para ser entendido que esta invenção não é limitada aos métodos específicos descritos, e às condições experimentais descritas, porque tais métodos e condições podem variar. Também é para ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas para o propósito de descrever modalidades específicas, e não é intencionada para ser limitadora, porque o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.
[0089] A não ser que sejam definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendidos por uma pessoa ordinariamente versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Definições
[0090] “GFRa3”, ou “hGFRa3”, conforme aqui usado, refere-se à proteína receptora ancorada em glicosilfosfatidilinositol (GPI) que se liga à artemina, que pertence à família de fatores neurotróficos derivados de linhagem de células gliais (GDNF). E uma das proteínas receptoras alfa da família GDNF que, quando ligadas ao seu ligante, artemina, medeia a ativação do receptor tirosina-cinase RET {'‘'rearranged during transfection” t rearranjada durante a transfecção). Até o presente foram reconhecidos quatro membros da família GFRa, GFRa-1-4 (Lindsay RM et al., Neuron,(1996), 17:571-574; Airaksinen, MS, et al., Mol. Cell Neurosci., (1999), 13:313-325). GFRa3 também é conhecido na técnica como receptor ligado a GPI do tipo receptor alfa-3 da família GDNF, ou receptor alfa-3 de fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais. A expressão de “GFRa3”, ou “hGFRa3”, ou de seus fragmentos, conforme aqui usada, refere-se a GFRa3 de proteína de humano ou seu fragmento, a não ser que seja especificado como sendo de uma espécie não humana, “GFRa3 de camundongo”, “GFRa3 de rato”, ou “GFRa3 de macaco”. Além disso, “GFRa3”, ou “hGFRa3”, conforme aqui usado, refere-se a GFRa3 de humano codificado pela sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO: 374 (número de acesso ao Genbank: NM_001496) e tem a sequência de aminoácidos conforme mostrada em SEQ ID NO: 375 (número de acesso ao Genbank: NP_001487.2), ou um seu fragmento biologicamente ativo. A sequência de sinalização inclui os resíduos de aminoácido 1-31 de SEQ ID NO: 375, a proteína madura inclui os resíduos de aminoácido 32-382 de SEQ ID NO: 375, enquanto que a região Pro carboxi-terminal inclui os resíduos de aminoácido 383-400 de SEQ ID NO: 375. O sítio de clivagem de GPI é encontrado no resíduo de aminoácido 374 de SEQ ID NO: 375 (asparagina). A sequência de aminoácidos de artemina de humano é encontrada no Genbank com o número de acesso Q5T4W7 e a sequência de aminoácidos de artemina de humano (dos aminoácidos A108-G220 de número de acesso Q5T4W7) com uma etiqueta myc-myc-hexa-histidina conforme é mostrada na SEQ ID NO: 369 (com resíduos de aminoácido 114-141 de SEQ ID NO: 369 sendo a etiqueta myc-myc-hexa-histidina).
[0091] Embora GFRa3 seja estrutural e funcionalmente similar aos outros membros da família GFRa, GFRa3 é o mais distantemente relacionado dos quatro membros da família. GFRctl e GFRa2 compartilham cerca de 50% de identidade (Sanicola, M. et al., PNAS, USA, (1997), 94:6238-43; Klein, RD, et al., (1997), Nature,387:717-21; Buj-Bello, A. et al., Nature(1997), 387:721-4; Baloh, RH, et al., Neuron,(1997), 18:793-802), enquanto que GFRa3 tem apenas 32% e 37% de identidade, respectivamente, com estas proteínas (Masure, S. et al., Eur. J. Biochem., (1998), 251:622-30; Nomoto, S. et al., BBRC, (1998), 244:849-53). A sequência de aminoácidos de GFRa3 de camundongo tem o seguinte número de acesso ao Genbank: NP_034410.3. A sequência de aminoácidos de GFRal de humano tem o seguinte número de acesso ao Genbank: NP 005255.1 e também é encontrada como SEQ ID NO: 376. A sequência de aminoácidos de GFRa3 de macaco cinomolgo é mostrada em SEQ ID NO: 377 e a sequência de aminoácidos de RET de macaco cinomolgo é mostrada em SEQ ID NO: 378.
[0092] O termo “anticorpo”, conforme aqui usado, é intencionado para se referir às moléculas de imunoglobulina compreendidas de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto (isto é, “moléculas de anticorpo completas”), e também seus multímeros (por exemplo IgM) ou seus fragmentos de ligação a antígeno. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (“HCVR” ou “VH”) e uma região constante de cadeia pesada (compreendida de domínios Cnl, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (“LCVR ou “VL”) e uma região constante de cadeia leve (CL). AS regiões VH e V [. podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas de regiões determinantes de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões de molde (FR, framework regions).Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, posicionadas desde a terminação-amino até a terminação-carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em determinadas modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-GFRa3 (ou seu fragmento de ligação a antígeno) podem ser idênticas às sequências de linhagem germinativa de humano, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência de aminoácidos de consenso pode ser definida com base em uma análise lado-a-lado de duas ou mais CDRs.
[0093] A substituição de um ou mais resíduos de CDR ou a omissão de uma ou mais CDRs também é possível. Têm sido descritos na literatura científica anticorpos nos quais uma ou duas CDRs podem ser prescindidas para ligação. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analisaram as regiões constantes dentre anticorpos e seus antígenos, com base em estruturas de cristal publicadas, e concluíram que apenas cerca de um quinto a um terço dos resíduos de CDR realmente contatam o antígeno. Padlan também descobriu muitos anticorpos nos quais uma ou duas CDRs não tinham aminoácidos em contato com um antígeno (consulte também, Vajdos et al. 2002 J. Mol. Biol. 320:415-428).
[0094] Os resíduos de CDR que não contatam antígeno podem ser identificados com base em estudos prévios (por exemplo resíduos H60-H65 em CDRH2 com frequência não são necessários), das regiões de CDRs de Rabat que estão fora das CDRs de Chothia, por modelagem molecular e/ou de modo empírico. Se uma CDR ou seu resíduo(s) é omitida (omitido), ela (ele) habitualmente será substituída (substituído) por um aminoácido que ocupa a posição correspondente em outra sequência de anticorpo de humano ou um consenso de tais sequências. As posições para substituição dentro de CDRs e aminoácidos para substituir também podem ser selecionadas (selecionados) de modo empírico. As substituições empíricas podem ser substituições conservativas ou não conservativas.
[0095] Os anticorpos anti-hGFRa3 de comprimento total de humano aqui revelados podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deteções de aminoácido nas regiões de molde e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeias pesadas e leves como em comparação com as sequências de linhagem germinativa correspondentes. Tais mutações podem ser facilmente averiguadas por comparação das sequências de aminoácidos aqui reveladas com as sequências de linhagem germinativa disponíveis, por exemplo, nas bases de dados de anticorpos públicas. A presente invenção inclui anticorpos, e seus fragmentos de ligação a antígeno, que são derivados de qualquer uma das sequências aqui reveladas, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de molde e/ou CDR são retromutados para o(s) resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente(s) ou para uma substituição de aminoácido conservativa (natural ou não natural) do(s) resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente(s) (tais mudanças de sequências são aqui chamadas de “retromutações de linhagem germinativa”). Uma pessoa comumente versada na técnica, partindo das sequências de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves aqui reveladas, pode facilmente produzir numerosos anticorpo e fragmentos de ligação a antígeno que compreendem uma ou mais retromutações de linhagem germinativa individuais ou suas combinações. Em determinadas modalidades, todos os resíduos de região de molde e/ou de CDR dentro dos domínios de VH e/ou VL são retromutados para a sequência de linhagem germinativa. Em outras modalidades, apenas determinados resíduos são retromutados para a sequência de linhagem germinativa, por exemplo, apenas os resíduos mutados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou para retromutações de linhagem germinativa dentro de todas as regiões de molde FR1, FR2, FR3, FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Ademais, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais retromutações de linhagem germinativa dentro das regiões de molde e/ou CDR, isto é, em que determinados resíduo individuais são retromutados para a sequência de linhagem germinativa enquanto que determinados outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa são mantidos. Quando obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que contêm uma ou mais retromutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testados para uma ou mais propriedades desejadas como, especificidade de ligação aprimorada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas agonísticas ou antagonísticas melhoradas (conforme for o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno obtidos nesta maneira geral estão incluídos dentro da presente invenção.
[0096] O termo “anticorpo de humano”, conforme aqui usado, é intencionado para incluir anticorpos que têm regiões constantes e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa. Os mAbs de humano da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitroou por mutação somática in vivo), por exemplo nas CDRs e em particular CDR3. Entretanto, o termo “anticorpo de humano”, conforme aqui usado, não é intencionado para incluir mAbs nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo), foram enxertados em sequências de FR de humanos. Os anticorpos de humano anti-GFRa3 da invenção podem ser chamados de “anti-hGFRa3” ou “anti-GFRa3”.
[0097] O termo “especificamente se liga a”, ou semelhante, significa que um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. A ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação em equilíbrio de pelo menos cerca de 1x10’6 M ou menor (por exemplo, uma KD menor denota uma ligação mais forte). Métodos para determinar se duas moléculas especificamente se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise em equilíbrio, ressonância de plasmon de superfície, e semelhantes. Um anticorpo isolado que especifícamente se liga a hGFRa3 pode, contido, apresentar reatividade cruzada com outros antígenos como moléculas de GFRa3 de outras espécies. Além disso, anticorpos multiespecíficos que se ligam a hGFRa3 e um ou mais antígenos adicionais ou um anticorpo biespecífíco que se liga a duas regiões diferentes de hGFRa3 são todavia considerados anticorpos que “especificamente se ligam a” hGFRct3, conforme aqui usado.
[0098] Conforme aqui usado, o termo “não se liga a” uma molécula alvo especificada (por exemplo um peptídeo GFRa3 específico) significa que o anticorpo, quando testado para a ligação à molécula alvo a 25°C em um ensaio de ressonância de plasmon, apresenta uma KD maior que 500 nM, ou se testado para a ligação à molécula alvo a 25°C em um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA, enzyme linked immunosorbent assay)apresenta uma EC50 maior que 50 nM, ou falha em apresentar qualquer ligação em qualquer tipo de ensaio ou seu equivalente.
[0099] O termo anticorpo de “afinidade alta” refere-se àqueles mAbs que têm uma afinidade de ligação a hGFRa3 de pelo menos 10'4 M; IO’10 M; mais preferencialmente 10’11 M, ainda mais preferencialmente 10'12 M, conforme medida por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE™ ou “solution-affinity ELISA".
[0100] O termo “dissociação (off-rate) lenta”, “Koff” ou “kd” significa um anticorpo que se dissocia de hGFRa3 com uma constante de velocidade de 1 x 10’ s’1 ou menor, preferencialmente 1 x 10’4 s'1 ou menor, conforme determinado por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE™.
[0101] Os termos “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo, “fragmento de ligação a antígeno” de um anticorpo, e semelhantes, conforme aqui usados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético (sintética), ou geneticamente modificado (modificada) que especificamente se liga a um antígeno para formar um complexo. Os termos “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo, ou “fragmento de anticorpo”, conforme aqui usados, referem-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade para especifícamente se ligarem a hGFRa3.
[0102] Em modalidades específicas, anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção pode(m) ser conjugado(s) a uma porção terapêutica (“imunoconjugado”) , como um opioide, um inibidor de COX-2, um anestésico local, um antagonista de citocina, como um inibidor de IL-1 ou IL- 6, um segundo inibidor de GFRa3, um modulador de NMDA, um agonista de receptor canabinoide, um modulador da família P2X, um antagonista de VR1, um antagonista de substância P, um agente quimioterapêutico, ou um radioisótopo.
[0103] Um “anticorpo isolado”, conforme aqui usado, é intencionado para se referir a um anticorpo que está substancialmente isento de outros anticorpos (Abs) que têm especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado, ou um seu fragmento, que especificamente se liga a hGFRa3, está substancialmente isento de Abs que especificamente se ligam a antígenos diferentes de hGFRa3).
[0104] Um “anticorpo neutralizador”, conforme aqui usado (ou um “anticorpo que neutraliza a atividade de GFRa3”), é intencionado para se referir a um anticorpo cuja ligação a hGFRa3 resulta na inibição de pelo menos uma atividade biológica de GFRa3. Esta inibição da atividade biológica de GFRa3 pode ser avaliada pela medição de um ou mais indicadores de atividade biológica de GFRa3 por um ou mais dos vários ensaios padrão in vitroou in vivo conhecidos na técnica (consulte os exemplos abaixo).
[0105] O termo “ressonância de plasmon de superfície”, conforme aqui usado, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações biomoleculares em tempo real pela detecção de alterações em concentrações de proteínas dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo com o uso de sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J., EUA).
[0106] O termo “KD conforme aqui usado, é intencionado para se referir à constante de dissociação em equilíbrio de uma interação específica de anticorpo-antígeno.
[0107] O termo “epítopo” refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação a antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais que um epítopo. Por conseguinte, anticorpos diferentes podem se ligar a áreas diferentes em um antígeno e podem ter efeitos biológicos diferentes. O termo “epítopo” também se refere a um sítio em um antígeno ao qual células- B e/ou células-T respondem. Também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são de modo geral um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que diretamente contribuem para a afinidade da interação. Os epítopos também podem ser conformacionais, isto é, compostos de aminoácidos não lineares. Em determinadas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, grupos fosforila, ou grupos sulfonila, e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas.
[0108] O termo “identidade substancial” ou “substancialmente idêntico”, quando se refere a um ácido nucleico ou seu fragmento, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleçòes de nucleotídeos apropriados com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 90%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeo, conforme medida por qualquer algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, como FASTA, BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo. Urna molécula de ácido nucleico que tem identidade substancial com uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em determinadas situações, codificar um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos igual ou a sequência de aminoácidos substancialmente similar à do polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.
[0109] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo “similaridade substancial” ou “substancialmente similar” significa que duas sequências de peptídeo, quando otimamente alinhadas, como pelo programa GAP ou BESTF1T com o uso de pesos de lacuna pré-definidos, compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferencialmente, as posições de resíduo, que não são idênticas, diferem em algumas substituições de aminoácido conservativas. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem um cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não modificará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos nos quais duas ou mais sequências de aminoácidos diferem uma da outra por substituições conservativas, a porcentagem ou o grau de similaridade pode ser ajustada (ajustado) para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Todos os meios para realizar este ajuste são bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica (consulte, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem: 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxiladas alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. As substituições de aminoácido conservativas são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. Altemativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança que tem um valor positivo na PAM250 log-matriz de probabilidade revelada em Gonnet et al. (consulte Gonnet et al., Science, (1992), 256:1443 45). Uma substituição “moderadamente conservativa” é qualquer mudança que tem um valor não negativo na matriz PAM250 de log-probabilidades (PAM, Point Accepted Mutation).
[0110] A similaridade de sequência para polipeptídeos é tipicamente medida com o uso de programas de computador de análise de sequências. Os programas de computador de análise de proteína emparelham sequências similares com o uso de medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativa. Por exemplo, programa de computador GCG contém programas como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros pré-definidos para determinar a homologia de sequência ou a identidade de sequência entre polipeptídeo estreitamente relacionados, como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma sua muteína. Consulte, por exemplo, GCG Version 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas com o uso de FASTA com parâmetros pré-definidos ou recomendados; um programa em GCG Version 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição (coincidência) entre as sequências de consulta (query’) e de pesquisa (search) (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se comparam uma sequência da invenção com uma base de dados que contém um número grande de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, com o uso de parâmetros pré-definidos. (Consulte, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 e (1997) Nucleic Acids Res.25:3389 402).
[0111] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso no método da invenção pode ser monoespecífico, biespecífico, ou multiespecífico. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação a antagonista específicos para epítopos de mais que um polipeptídeo alvo. Um formato de anticorpo biespecífico exemplificador que pode ser utilizado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 de Ig, em que os primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que uma diferença em pelo menos um aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico que não tem diferença em aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig liga-se à Proteína A e o segundo domínio Cn3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole a ligação à Proteína A tal como uma modificação H95R (numeração de éxon conforme IMGT [IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system®]; H435R (numeração conforme EU). O segundo domínio CH3 pode adicionalmente compreender uma modificação Y96F (numeração conforme IMGT); Y436F (numeração conforme EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo domínio Cn3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (numeração conforme IMGT); D356E, E358M, N384S, K392N, V397M, e V4221 (numeração conforme EU) no caso de mAbs IgGl; N44S, K52N, e V82I (numeração conforme IMGT); N384S, K392N, e V422I (numeração conforme EU) no caso de mAbs IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (numeração conforme IMGT); Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I (numeração conforme EU) no caso de mAbs IgG4. Variações no formato de anticorpo biespecífico descrito acima são consideradas dentro do escopo da presente invenção.
[0112] A frase “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual ela é administrada. A quantidade exata dependerá do propósito do tratamento, e será averiguável por uma pessoa versada na técnica com o uso de técnicas conhecidas (consulte, por exemplo, Lloyd (1999) “The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding”).
[0113] O termo “síndrome(s) de dor funcional”, refere-se às síndromes baseadas em sintoma crônico que afetam até 15% da população mundial. São caracterizadas por dor crônica e desconforto relativo a diferentes regiões do corpo. Não têm sido identificadas anormal idades estruturais, inflamatórias, ou bioquímicas de modo geral consensuais que poderiam explicar totalmente os sintomas. Os pacientes mostram uma qualidade de vida enormemente reduzida, as opções de tratamento ainda são limitadas, e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas têm sido decepcionante. Alguns dos transtornos comuns, que caem dentro desta categoria, incluem dor lombar inferior crônica, síndrome do intestino irritável (IBS), fibromialgia (FM), síndrome da fadiga crônica, síndrome da dor abdominal funcional, transtorno da articulação temporomandibular (TMJD), síndrome da bexiga dolorosa (cistite intersticial), transtornos/síndromes gastrointestinais funcionais, síndrome da dor retal funcional, síndrome da dor torácica funcional, enxaquecas e cefaleias tensionais, síndrome da dor pélvica crônica, síndrome prostática dolorosa (prostatite crônica), síndrome da sensibilidade química múltipla, e síndrome da Guerra do Golfo.
[0114] A família relacionada com o fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais inclui fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF), neurturina (NRTN), persefma (PSPN), e artemina (ARTN). As proteínas da família GDNF estào diferentemente envolvidas no desenvolvimento e na manutenção de neurônios sensoriais, entéricos, simpáticos e parassimpáticos e uma variedade de tecidos não neuronais (Henderson, C.E., et al., (1994), Science 266:1062-1064; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature384:467-470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol. 127:167-170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol.124:368-371). GDNF é um fator de sobrevivência especialmente potente para neurônios dopaminérgicos, noradrenérgicos e motores (Yan, Q. et al. (1995), Nature, 373:341-344; Henderson, C.E., et al., (1994), Science, 266:1062-1064; Buj- Bello, A. et al., (1995), Neuron,15:821-828). Outros membros de crescimento da família GDNF têm funções fora do sistema nervoso (Trupp, M. et al., (1995), J. Cell Biol.130:137-148; Kotzbauer, P.T. et al., (1996), Nature384:467-470; Springer, J.E., et al. (1994), Exp. Neurol.127:167-170; Schaar. D.G., et al., (1993), Exp. Neurol.124:368-371). Por exemplo, NRTN, ARTN, e PSPN também são expressadas no rim sob desenvolvimento. GDNF também tem funções críticas fora do sistema nervoso na regulação de espermatogênese e morfogênese renal (Airaksinen, M.S. et al., (2002), Nature Reviews3:383-392).
[0115] Cada membro da família GDNF liga-se preferencialmente (isto é, é um ligante de) à proteína receptora ancorada em glicosilfosfatidilinositol (GP1) dinamicamente associado com a membrana plasmática. A família de receptores-alfa da família GDNF é composta de quatro receptores diferentes: GFRalfal (GFRal, GDNFR-alfa); GFRalfa2 (GFRa2/TrnR2/GDNFR- beta/NTNR-alfa/RETL2); GFRalfa3 (GFRa3); e GFRalfa4 (GFRa4). GDNF liga-se preferencialmente a GFRal, NRTN liga-se preferencialmente a GFRa2, ARTN liga-se preferencialmente a GFRa3 e PSPN liga-se preferencial mente a GFRa4 (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience(2002), 3:383-394).
[0116] GFRa2 é elevadamente expressado em córtex, prosencéfalo basal, e camadas específicas do bulbo olfativo, e fracamente expressado em substância negra, cerebelo, e núcleos motores. GFRa3 é expressado em nervos de camundongos fetais e adultos, gânglios sensoriais e simpáticos, intestino, coração, cérebro, pulmão e rim. GFRa4 é expressado em teores baixos em áreas diferentes do cérebro no adulto e também em alguns tecidos periféricos incluindo testículo e coração. Embora as preferências de ligação dos membros da família GDNF mostradas acima sejam GDNF se liga a GFRal; neurturina se liga a GFRa2; artemina se liga a GFRa3; e persefma se liga a GFRa4, o pareamento de ligante-receptor não é estrito (Airaksinen, M.S., et al. Nature Reviews Neuroscience(2002), 3:383-394). Por exemplo, GDNF liga-se a GFRa2 e GFRa3 com eficiências mais baixas que a eficiência quando se liga a GFRa 1.
[0117] Os ligantes da família GDNF, tipicamente mas não exclusivamente, transmitem seus sinais mediante complexos de multicomponentes compostos de um ligante, seu receptor GFR-alfa e o receptor tirosina-cinase, c-Ret. Ret é um elemento comum daqueles complexos de sinalização ligante-receptor. Ret é um proto-oncogene que fortemente ativa os sinais anti-apoptóticos mediante a ativação das fosfoinositol-3-cinases (PI3-K)/PDK/AKT(PKB) e as rotas Ras/Raf/MEK/ERK. Ret também é capaz de ativar fosfolipase C-gama (PLCgama) que eleva o cálcio intracelular e facilita a ativação de membros da família de proteínas cinase C (PKC, protein kinaseC) novas e convencionais. Os complexos de ligante-receptor da família GDNF não são restritos à sinalização mediante Ret. GDNF:GFRalfal pode se ligar a NCAM em células desprovidas de RET e ativar Fyn e FAK. Sob algumas condições os complexos de GDNF:GFRalfa ativam diretamente a cinase src.
[0118] Em determinadas modalidades da presente invenção, qualquer um ou mais dos três domínios globulares ricos em cisteína (1, 2, ou 3) de GFRa3, ou um seu fragmento, podem ser usados para preparar os anticorpos que se ligam a GFRa3 e inibem sua função, ou inibem sua capacidade para se ligar ao seu ligante, como, artemina. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção específico para GFRa3 pode se ligar a um domínio de ligação a ligante em GFRa3, e como tal, pode bloquear a ligação do complexo ligante (artemina)-GFRa3 a RET. A sequência de aminoácidos de comprimento total de GFRa3 de humano é mostrada como SEQ ID NO: 375. O ácido nucleico que codifica GFRa3 de humano é mostrado em SEQ ID NO: 374. O domínio 1 inclui os resíduos 44-124 de SEQ ID NO: 375; o domínio 2 inclui os resíduos 162-239 de SEQ ID NO: 375; o domínio 3 inclui os resíduos 248-340 de SEQ ID NO: 375. (Consulte quer SEQ ID NO. 375 quer Genbank NP 001487.2).
[0119] Qualquer um destes domínios, 1, 2, ou 3, ou fragmentos derivados dos mesmos, pode(m) ser usado(s) para preparar anticorpos que se ligam especificamente a GFRa3 e inibem sua atividade, ou pelo menos uma função associada com GFRa3. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção ligam-se especificamente a GFRa3 e podem evitar a sinalização mediada por GFRa3. Em determinadas modalidades, os anticorpos que se ligam especificamente a GFRa3 podem evitar a ligação de GFRa3 ao seu ligante, como artemina (Wang, X. et al. Structure,(2006), 14:1083-1092). Em determinadas modalidades, os anticorpos que se ligam especificamente a GFRa3 podem evitar a ativação do receptor tirosina-cinase RET. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção podem se ligar especificamente a GFRa3 sem evitar a ativação do receptor tirosina-cinase RET. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção podem ligar- se especificamente a GFRa3 e evitar a sinalização mediante RET, ou mediante um mediador diferente de RET. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção podem ser usados para inibir a proliferação/o crescimento de células de tumor e como tais, podem ser úteis para tratar determinados cânceres/determinadas malignidades, ou a dor associada com tais, ou a dor associada com metástase de tais cânceres/malignidades (consulte Tang, J-Z, et al. Mol. Cancer Ther. (2010), 9(6): 1697-1708; Kang, J. et al. Oncogene,(2009), 28:2034-2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery,(2006), 244(2):274-281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res. (2011), 13:R112; Pandey, V. et al., Endocrinology, (2010), 151 (3 ):909-920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228-3240; Li, S. et al. J. Biomed. Sci. (2011), 18:24). Em determinadas modalidades, os anticorpos que se ligam especificamente a GFRa3 podem ser preparados com o uso de fragmentos das regiões anotadas acima, ou de peptídeos que se estendem para além das regiões indicadas em cerca de 10 a cerca de 50 resíduos de aminoácido a partir de qualquer uma das, ou ambas as, extremidade amino-terminal ou extremidade carboxi-terminal das regiões aqui descritas. Em determinadas modalidades, qualquer combinação das regiões anotadas acima ou de seus fragmentos pode ser usada na preparação de anticorpos específicos para GFRa3. Conforme anotado acima, o comprimento de resíduos de aminoácido, o número de resíduos de aminoácido que incluem os três domínios de hGFRa3 podem variar em cerca de dez a cinquenta resíduos de aminoácido que se estendem a partir de qualquer uma das, ou ambas as, extremidade amino-terminal ou extremidade carboxi-terminal do domínio de comprimento total, ou de um seu fragmento, para a preparação de anticorpo específicos anti-hGFRa3.
[0120] A não ser que seja especificamente indicado de outra maneira, o termo “anticorpo”, conforme aqui usado, deve ser entendido para incluir as moléculas de anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, “moléculas de anticorpo completas”) e também seus fragmentos de ligação a antígeno. Os termos “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo, “fragmento de ligação a antígeno” de um anticorpo, e semelhantes, conforme aqui usados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína que ocorre na natureza, enzimaticamente obtenível, sintético (sintética), ou geneticamente modificado (modificada) que especificamente se liga a um antígeno para formar um complexo. Os termos “porção de ligação a antígeno” de um anticorpo, ou “fragmento de anticorpo”, conforme aqui usados, referem-se a um ou mais fragmentos um anticorpo que retêm a capacidade para especificamente se ligarem a hGFRcú. Um fragmento de anticorpo pode incluir um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fv, um fragmento de dAb, um fragmento que contém uma CDR, ou fragmentos de CDR isolados. Os fragmentos de ligação a antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo completas com o uso de qualquer uma das técnicas padrão adequadas como digestão proteolítica ou técnicas de engenharia genética recombinante que envolvem a manipulação de DNA que codifica os domínios variáveis e (opcionalmente) constantes do anticorpo. Tal DNA é conhecido e/ou é facilmente disponível em, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de anticorpos de fago), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou pelo uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para posicionar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, produzir resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[0121] Exemplos não limitadores de fragmentos de ligação a antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de cadeia única (scFv, single-chain Fv)', (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada). Outras moléculas modificadas, como diacorpos, triacorpos, tetracorpos e minicorpos, também estão incluídas dentro da expressão “fragmento de ligação a antígeno”, conforme aqui usada.
[0122] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e de modo geral compreenderá menos uma CDR, que é adjacente a ou está em fase com uma ou mais sequências de região de molde. Em fragmentos de ligação a antígeno que têm um domínio de VH associado a um domínio de VL, OS domínios de VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter os dímeros VH - VH, VH - VL OU VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um domínio de VH ou V], monomérico.
[0123] Em determinadas modalidades, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplificadoras, não limitadoras de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH -CHI; (ii) VH -CH2; (iii) VH - CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (V) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2-CH3; (vii) VH - CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL -CH2; (x) V,. -CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL - CH1-CII2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; e (xiv) VL -CL- Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificadoras listadas acima, os domínios variáveis e constantes quer podem ser diretamente ligados um ao outro quer podem ser ligados por uma região de ligação (linker)ou de dobradiça parcial ou total. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, que resulta em uma ligação flexível ou semi flexível entre os domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de quaisquer das configurações de domínios variáveis e constantes listadas acima em associação não covalente de um com o outro e/ou com um ou mais domínios de Vn ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação (ligações) de dissulfeto).
[0124] Como com as moléculas de anticorpo completas, os fragmentos de ligação a antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecífico (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação a antígeno multiespecífico de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada um dos domínios variáveis é capaz de especificamente se ligar a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecífico exemplificadores aqui revelados, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção com o uso de técnicas rotineiras disponíveis na técnica.
[0125] Métodos para gerar anticorpos de humano em camundongos transgênicos são conhecidos na técnica. Qualquer um de tais métodos pode ser usado no contexto da presente invenção para preparar anticorpos de humano que especificamente se ligam a GFRa3 de humano.
[0126] Com o uso da tecnologia VELOCIMMUNE™ ou de qualquer outro método conhecido para gerar anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para GFRa3 são inicialmente isolados tendo uma região variável de humano e uma região constante de camundongo. Conforme na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis que incluem afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante de humano para gerar um anticorpo de comprimento total de humano da invenção, por exemplo IgGl ou IgG4 de tipo selvagem ou modificada. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de alta afinidade de ligação a antígeno e de especificidade ao alvo residem na região variável.
[0127] Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem afinidades muito altas, tipicamente possuindo KD de cerca de 10'13 a cerca de 10-x M, ou de cerca de 10’12 a cerca de 10'9 M quando medida por ligação ao antígeno quer imobilizado em fase sólida quer em fase de solução. As regiões constantes de camundongo são substituídas por regiões constantes de humano desejadas para gerar os anticorpos de comprimento total de humano da invenção. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de alta afinidade de ligação a antígeno e de especificidade ao alvo residem na região variável. Bioequivalentes
[0128] Os anticorpos anti-GFRa3 e fragmentos de anticorpo anti- GFR«3da presente invenção incluem proteínas que têm sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que retêm a capacidade para se ligarem a GFRct3 de humano. Tais variantes de anticorpos e de fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de aminoácido quando comparação com a sequência parental, mas apresentam atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Igualmente, as sequências de DNA que codificam o anticorpo anti-GFRa3 da presente invenção incluem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções, ou substituições de nucleotídeos quando em comparação com a sequência revelada, mas que codificam um anticorpo anti-GFRa3 ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-GFRa3 ou fragmento de anticorpo da invenção.
[0129] Duas proteínas de ligação a antígeno, ou anticorpos, são consideradas equivalentes se, por exemplo, são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cujas taxa e extensão de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, quer como uma dose única quer como doses múltiplas. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se forem equivalentes na extensão de sua absorção mas não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para o alcance das concentrações corporais eficazes de fármaco, por exemplo, sob uso crônico, e são consideradas medicamente insignificantes para o produto farmacêutico específico estudado.
[0130] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se não houver diferenças clinicamente significativas em suas segurança, pureza, e potência.
[0131] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se um paciente puder ser mudado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento presumido no risco para efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa em imunogenicidade, ou efetividade diminuída, em comparação com terapia continuada sem tal mudança.
[0132] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se ambas atuarem por um mecanismo de ação comum ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, na medida que tais mecanismos sejam conhecidos.
[0133] Bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e/ou in vitro.Medidas de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, no qual a concentração do anticorpo ou de seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro, ou outro fluido biológico como uma função do tempo; (b) um teste in vitroque tem sido correlacionado com e é razoavelmente preditivo dos dados de biodisponibilidade de humano in vivo; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos no qual o efeito farmacológico agudo do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) em um teste clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia, ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.
[0134] Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-GFRa3 da invenção podem ser construídas, por exemplo, por realização de várias substituições de resíduos ou sequências ou deleção de resíduos terminais ou internos ou de sequências terminais ou internas não necessários (não necessárias) para a atividade biológica. Por exemplo, resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser deletados ou substituídos por outros aminoácidos para evitar a formação de pontes de dissulfeto intramoleculares incorretas ou desnecessárias após renaturação. Em outros contextos, os anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo anti-GFRa3 compreendendo mudanças de aminoácido, que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação.
[0135] De acordo com determinadas modalidades da presente invenção, são fornecidos anticorpos anti-GFRa3 que compreendem um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações, que intensificam ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com pFl neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-GFRa3 que compreendem uma mutação em uma região C]|2 ou uma região CR3 do domínio Fc, em que a(s) mutação (mutações) aumenta(m) a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossomo no qual o pH está na faixa de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitadores de tais modificações em Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo. H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo. N434S); uma modificação 428L, 2591 (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo. V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e uma modificação 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254, e 256 (por exemplo. 252Y, 254T, e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[0136] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti- GFRa3 que compreendem um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionadas dentre o grupo consistindo em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações de domínio Fc precedentes, e outras mutações dentro do das variáveis de domínio de anticorpo aqui reveladas, são consideradas dentro do escopo da presente invenção.
[0137] Em geral, os anticorpos da presente invenção podem funcionar pela ligação a qualquer um ou mais dos três domínios globulares ricos em cisteína (1, 2, ou 3) de hGFRa3. Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem se ligar a um epítopo localizado em pelo menos um dos domínios ricos em cisteína de hGFRa3. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção pode se ligar aos resíduos de aminoácido de domínio 1 de GFRa3, na faixa de cerca de o resíduo 44 a cerca de o resíduo 124 de SEQ ID NO: 375. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção anticorpo da invenção pode se ligar aos resíduos de aminoácido de domínio 2 de GFRa3, na faixa de cerca de o resíduo 162 a cerca de o resíduo 239 de SEQ ID NO: 375. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção anticorpo da invenção pode se ligar aos resíduos de aminoácido de domínio 3 de GFRa3, na faixa de cerca de o resíduo 248 a cerca de o resíduo 340 de SEQ ID NO: 375. Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem funcionar por bloqueio ou inibição da atividade de GFRa3 pela ligação a uma região em qualquer um dos domínios que atua como o domínio de ligação de ligante, evitando assim a ligação do ligante, tal como, artemina, àquele sítio. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção pode se ligar ao sítio de ligação de ligante em um dos domínios de GFRa3 e evitar a subsequente ligação do complexo de artemina-GFRa3 a RET. Em uma modalidade, um anticorpo da invenção pode se ligar a um ou mais dos epítopos no complexo de artemina- GFRa3 que pode determinar ou desempenhar uma função na especificidade entre o ligante e o GFRa3, como na região na faixa de os resíduos 167-184 de SEQ ID NO: 375. Em determinadas modalidades, um anticorpo da invenção pode ser ligar a um ou mais dos resíduos de domínio 2 que são responsáveis pela especificidade entre a artemina e o GFRa3, por exemplo, os resíduos de aminoácido nas posições 167 (met), 176 (asp) e/ou na posição 184 (glu), de SEQ ID NO: 375 e em tal ligação, pode evitar a ligação de ligante ao seu receptor, e subsequentemente pode evitar a sinalização mediante o receptor tirosina-cinase RET, ou mediante um modulador ou mediador de sinalização diferente de RET. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção podem se ligar à forma ligada em membrana de GFRa3 ou à forma solúvel de GFRa3. Em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção podem se ligar a GFRa3, mas não reagir cruzadamente com GFRal, GFRa2, ou GFRa4. Em determinadas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos da invenção podem se ligar a um epítopo em uma região rica em cisteína de um domínio e também podem se ligar a uma região rica em cisteína em um segundo domínio de hGFRa3. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem se ligar a duas regiões diferentes no mesmo domínio. Em determinadas modalidades, um braço de um anticorpo biespecífico da invenção pode se ligar a uma região rica em cisteína de um domínio de hGFRa3 e o outro braço pode se ligar a RET, ou a um modulador diferente de RET. Em determinadas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a um domínio em GFRa3 e a um domínio em GFRal ou GFRa2.
[0138] Mais especificamente, os anticorpos anti-GFRa3 da invenção podem apresentar uma ou mais das seguintes características: (i) apresentam uma KD na faixa de cerca de 10'8 M a cerca de 10’13 M conforme medida por ressonância de plasmon de superfície; (ii) demonstram a capacidade para bloquear cerca de 50-100% da ligação de GFRa3 ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 40 pM a cerca de 15 nM; (iii) demonstram a capacidade para bloquear cerca de 20% a cerca de 100% da ligação de GFRa3 a um suporte sólido revestido com uma mistura de artemina e RET; (iv) bloqueiam ou inibem a ativação de RET dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 200 pM a cerca de 50 nM; I (v) inibem ou reduzem uma ou mais respostas nociceptivas em um modelo in vivo de dor de câncer ósseo; (vi) inibem ou reduzem hiperalgesia térmica sensibilizada por artemina in vivo; (vii) inibem ou reduzem alodinia em um modelo in vivo de osteoartrite; (viii) não reagem cruzadamente com outros correceptores GFR para RET; (ix) compreendem uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e 397; ou (x) compreendem um região variável de cadeia leve (LCVR) que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405.
[0139] Determinados anticorpos anti-GFRa3 da presente invenção são capazes de inibir ou atenuar a atividade de GFRa3 em um ensaio in vitro. A capacidade dos anticorpos da invenção para se ligarem a ou inibirem a ligação de GFRa3 ao seu ligante artemina sozinhos ou na presença de RET pode ser medida com o uso de qualquer método padrão conhecido por aquelas pessoas versadas na técnica, incluindo ensaios de ligação, ou ensaios para determinar se os anticorpos bloqueiam a ativação de RET pela inibição da ligação de GFRa3 ao seu receptor artemina, como aqueles aqui descritos. Ensaios in vitroexemplificadores, não limitadores para a medição da atividade de GFRa3 são ilustrados nos Exemplos 4 e 5, abaixo.
[0140] A presente invenção inclui anticorpos anti-GFRa3 e seus fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a um ou mais dos domínios j globulares ricos em cisteína de GFRa3, conforme mostrado em SEQ ID NO: 375, ou a um seu fragmento. Os anticorpos específicos para GFRa3 podem conter nenhumas porções ou marcações adicionais, ou podem conter um marcação ou porção amino-terminal ou carboxi-terminal. Em uma modalidade, a marcação ou porção é biotina. Em um ensaio de ligação, a localização de uma marcação (se houver) pode determinar a orientação do peptídeo em relação à superfície sobre a qual o peptídeo está ligado. Por exemplo, se uma superfície está revestida com avidina, um peptídeo que contém uma biotina amino-terminal estará orientado de tal modo que a porção carboxi-terminal do peptídeo estará distante da superfície.
[0141] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal de comprimento total de humano ou seu fragmento de ligação a antígeno que especificamente se liga a hGFRa3 e neutraliza a atividade de hGFRa3, em que o anticorpo ou seu fragmento apresenta uma ou mais das seguintes características: (i) compreende uma HCVR que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 381 e 397; (ii) compreende uma LCVR que tem uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 389 e 405; (iii) compreende qualquer uma ou mais das sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada ou de cadeia leve representadas na Tabela 1 e suas combinações; (iv) é específico para ligação a GFRa3 e/ou bloqueia a atividade de GFRa3 sem se ligar a outros receptores GFR-alfa e/ou bloquear outros receptores GFR-alfa, incluindo GFRal, GFRa2 e GFRa4; (v) demonstra capacidade de ligação a qualquer um ou mais dos domínios globulares ricos em cisteína de GFRa3; (vi) bloqueia a ativação de e a sinalização mediante o receptor tirosina-cinase RET; (vii) inibe ou reduz hiperalgesia térmica sensibilizada por artemina in vivo; (viii) inibe ou reduz alodinia em um modelo in vivo de osteoartrite; ou inibe ou reduz uma ou mais respostas nociceptivas em um modelo in vivo de dor de câncer ósseo.
[0142] Podem ser usadas várias técnicas conhecidas pelas pessoas comumente versadas na técnica para determinar se um anticorpo “interage com um ou mais aminoácidos” dentro de um polipeptídeo ou de uma proteína. Técnicas exemplificadoras que incluem, por exemplo, um ensaio de bloqueio cruzado rotineiro tal corno aquele descrito em Antibodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) podem ser utilizadas. Outros métodos incluem análise mutacional de varredura de alanina, análise de transferência (blot)de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248:443-63), análise de clivagem de peptídeo, estudos cristalográficos, e análise por RNM. Em adição, métodos como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser utilizados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Outro método que pode ser utilizado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massas. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve a marcação da proteína de interesse com deutério, seguida pela ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. A seguir, o complexo de proteína/anticorpo é transferido para a água e os prótons permutáveis dentro dos aminoácidos que estão protegidos pelo complexo de anticorpo experimentam troca de volta de deutério por hidrogênio em uma velocidade mais baixa que a dos prótons permutáveis dentro dos aminoácidos que não são parte da interface. Como um resultado, os aminoácidos que formam parte da interface de proteína/anticorpo podem reter deutério e portanto apresentam massa relativamente mais alta em comparação com os aminoácidos não incluídos na interface. Após a dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem por protease e à análise por espectrometria de massas, revelando deste modo os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Consulte, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry267(2):252-259; Engen e Smith (200\) Anal. Chem. 75:256A-265A.
[0143] O termo “epítopo” refere-se a um sítio em um antígeno ao qual as células-B e/ou células-T respondem. Os epítopos de célula-B podem ser formado de ambos aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contínuos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir dos aminoácidos contíguos são tipicamente retidos sob exposição a solventes desnaturantes, enquanto que os epítopos formados pelo dobramento terciário são tipicamente perdidos sob tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e mais habitualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em um conformação espacial peculiar.
[0144] Definição de Perfil Auxiliada por Modificação (Modification- Assisted Profiling, MAP), também conhecida como Definição de Perfil Baseada em Estrutura de Antígeno (Antigen Structure-based Anticorpo Profiling, ASAP) é um método que categoriza números grandes de anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados contra o mesmo antígeno de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo às superfícies de antígeno química ou enzimaticamente modificadas (consulte, por exemplo, US 2004/0101920). Cada categoria pode refletir um epítopo peculiar quer distintamente diferente de quer parcialmente coincidente com o epítopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite a filtragem rápida de anticorpos geneticamente idênticos, de tal modo que a caracterização pode concentrar-se em anticorpos geneticamente diferentes. Quando aplicada à triagem de hibridoma, MAP pode facilitar a identificação de clones de hibridoma raros que produzem mAbs que têm as características desejadas. MAP pode ser usada para separar os anticorpos da invenção em grupos de anticorpos que se ligam a epítopos diferentes.
[0145] Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-GFRa3 ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-GFRa3 liga-se a um epítopo dentro de pelo menos um dos domínios 1, 2, ou 3 ricos em cisteína de GFRa3, ou um seu fragmento, em que o domínio 1 está na faixa de cerca de o resíduo de número 44 a cerca de o resíduo de número 124 de SEQ ID NO: 375; domínio 2 está na faixa de cerca de o resíduo de número 162 a cerca de o resíduo de número 239 de SEQ ID NO: 375; domínio 3 está na faixa de cerca de o resíduo de número 248 a cerca de o resíduo de número 340 de SEQ ID NO: 375.
[0146] Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-GFRa3 ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-GFRa3 liga-se a um epítopo dentro do domínio 1, ou a um seu fragmento, de GFRa3 de humano.
[0147] Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-GFRa3 ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-GFRa3 liga-se a um epítopo dentro do domínio 2, ou a um seu fragmento, de GFRa3 de humano.
[0148] Em determinadas modalidades, o anticorpo anti-GFRa3 ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-GFRa3 liga-se a um epítopo dentro do domínio 3, ou a um seu fragmento, de GFRa3 de humano.
[0149] Em determinadas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo liga-se a um epítopo, que inclui mais que um dos epítopos enumerados de GFRa3 dentro do domínio 1, 2, ou 3, e/ou dentro de domínios diferentes (por exemplo, epítopos dentro dos domínios 1 e 2, ou dentro dos domínios 2 e 3, ou dentro dos domínios I e 3).
[0150] Em determinadas modalidades, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a um epítopo dentro de um domínio de GFRa3 e a outro epítopo dentro de um domínio diferente de GFRa3. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a um epítopo em domínio 1 de GFRa3 e a outro epítopo em domínio 2 de GFRa3. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a um epítopo em domínio 1 de GFRa3 e a outro epítopo dentro do domínio 3 de GFRa3. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico que se liga a um epítopo em domínio 2 de GFRa3 e a outro epítopo dentro do domínio 3 de GFRa3.
[0151] A presente invenção inclui anticorpos anti-GFRa3 que se ligam ao mesmo epítopo como qualquer um dos anticorpos exemplificadores específicos aqui descritos (por exemplo, H4H2207N, H4H2212N, H4H2236N3, H4H2243N2, H4H2210N, H4H2234N, H4H2291S, H4H2292S, H4H2293P, H4H2294S, H4H2295S, H4H2296S, H4H2341S, H4H2342P, H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, H4H2350P, H4H2352S, H4H2354S, H4H2355S, H4H2357S, H4H2364S, H1M2243N e H1M2236N). Igualmente, a presente invenção também inclui anticorpos anti-GFRa3 que competem pela ligação a GFRa3 ou a um fragmento de GFRa3 com qualquer um dos anticorpos exemplificadores específicos aqui descritos.
[0152] Pode-se determinar facilmente se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que o de um anticorpo anti-GFRa3 de referência, ou compete pela ligação com um anticorpo anti-GFRa3 de referência, pelo uso de métodos rotineiros conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que o de um anticorpo anti- GFRa3 de referência da invenção, o anticorpo de referência é permitido se ligar a um peptídeo GFRa3 ou a uma proteína GFRa3 sob condições de saturação. A seguir, é avaliada a capacidade de um anticorpo de teste para se ligar à molécula de GFRa3. Se o anticorpo de teste é capaz de se ligar a GFRa3 após a ligação de saturação com o anticorpo anti-GFRa3 de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do epítopo do anticorpo anti-GFRa3 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não é capaz de se ligar à molécula de GFRa3 após a ligação de saturação com o anticorpo anti-GFRa3 de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti-GFRa3 de referência da invenção.
[0153] Para determinar se um anticorpo compete pela ligação com um anticorpo anti-GFRa3 de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é permitido se ligar a uma molécula de GFRa3 sob condições de saturação seguido pela avaliação da ligação do anticorpo de teste à molécula de GFRa3. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é permitido se ligar a uma molécula de GFRa3 sob condições de saturação seguido pela avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula de GFRa3. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (saturação) é capaz de se ligar à molécula de GFRa3, então é concluído que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem pela ligação a GFRa3. Como será reconhecido por uma pessoa comumente versada na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente se ligar ao epítopo idêntico ao epítopo do anticorpo de referência, mas pode estericamente bloquear a ligação do anticorpo de referência pela ligação a um epítopo coincidente ou adjacente.
[0154] Dois anticorpos ligam-se ao mesmo epítopo ou a epítopos coincidentes se cada um competitivamente inibe (bloqueia) a ligação do outro ao antígeno. Isto é, um excesso de 1,5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe a ligação do outro em pelo menos 50% mas preferencialmente 75%, 90% ou mesmo 99% conforme medido em um ensaio competitivo de ligação (consulte, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Aitemativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos coincidentes se algumas mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam a ligação do outro.
[0155] Experimentação rotineira adicional (por exemplo, análises de ligação e mutação de peptídeo) pode ser realizada para confirmar se a falta de ligação observada do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epítopo que o epítopo do anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados com o uso de ELISA, RIA, ressonância de plasmon de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio qualitativo ou quantitativo de ligação de anticorpo disponível na técnica.
[0156] De acordo com determinadas modalidades da invenção, os anticorpos anti-GFRa3 ligam-se a GFRa3 de humano mas não a GFRa3 de outras espécies. Altemativamente, os anticorpos anti-GFRa3 da invenção, em determinadas modalidades, ligam-se a GFRa3 de humano e a GFRa3 de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti-GFRa3 da invenção podem se ligar a GFRa3 de humano e podem ou não se ligar, conforme for o caso, a um ou mais GFRa3 de camundongo, rato, porquinho- da-índia, hamster, gerbo, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, macaco cinomolgo, sagui, macaco rhesusou chimpanzé.
[0157] A invenção inclui um anticorpo monoclonal de humano anti- GFRa3 conjugado a uma porção terapêutica (“imunoconjugado”), tal como um agente que é capaz de reduzir dor e/ou inflamação, um fármaco quimioterapêutico, ou um radioisótopo. O tipo de porção terapêutica que pode ser conjugada ao anticorpo anti-GFRa3 terá que levar em consideração a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Por exemplo, para tratar dor aguda ou dor crônica, um agente tal como NSAID, um opioide, ou um inibidor de COX-2, ou um agente anestésico local, ou um inibidor secundário de GFRa3 pode ser conjugado ao anticorpo anti-GFRa3. Altemativamente, se o efeito terapêutico desejado é tratar a inflamação associada com uma condição dolorosa, pode ser vantajoso conjugar um agente anti-inflamatório ao anticorpo anti-GFRa3, tal como, mas não se limitando a, celecoxib, ou um antagonista de citocina, tal como um inibidor de IL-1 ou de IL-6. Se a condição a ser tratada é uma condição cancerosa, pode ser benéfico conjugar um fármaco quimioterapêutico, ou um radioisótopo ao anticorpo anti-GFRa3. Exemplos de agentes adequados para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica, consulte por exemplo, WO 05/103081.
[0158] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, ou multiespecíficos. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação a antígeno específicos para mais que um polipeptídeo alvo. Consulte, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol.147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-GFRa3 da presente invenção podem ser ligados à ou ser coexpressados com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou outra proteína. Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais entidades moleculares, como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos em que um braço de uma imunoglobulina é específico para GFRa3 de humano ou um seu fragmento, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo agente terapêutico ou é conjugado a uma porção terapêutica. Em determinadas modalidades da invenção, um braço de uma imunoglobulina é específico para um epítopo em um domínio de hGFRa3 ou um seu fragmento, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um epítopo em um segundo domínio de hGFRa3. Em determinadas modalidades, um braço de uma imunoglobulina é específico para um epítopo on um domínio de hGFRo.3 e o outro braço é específico para um segundo epítopo no mesmo domínio de hGFRa3.
[0159] Um formato de anticorpo biespecífico exemplificador que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve a utilização de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio Cn3 de Ig, em que os primeiro e segundo domínios Cj|3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A em comparação com um anticorpo biespecífico desprovido de diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig liga-se à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou elimina a ligação à Proteína A tal como uma modificação H95R (numeração de éxon conforme IMGT; H435R, numeração conforme EU). O segundo domínio C||3 pode adicionalmente compreender uma modificação Y96F (numeração conforme IMGT; Y436F numeração conforme EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo domínio CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (numeração conforme IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I numeração conforme EU) no caso de anticorpos IgG; N44S, K52N, e V821 (numeração conforme IMGT; N384S, K392N, e V422I numeração conforme EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (numeração conforme IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I numeração conforme EU) no caso de anticorpos IgG4. Variações no formato de anticorpo biespecífico descrito acima são consideradas dentro do escopo da presente invenção.
[0160] A presente invenção fornece composições terapêuticas que compreendem os anticorpos anti-GFRa3 ou seus fragmentos de ligação a antígeno da presente invenção. As composições terapêuticas serão administradas com veículos, excipientes adequados, e outros agentes que são incorporados às formulações para conceder transferência, liberação (fornecimento), tolerância aprimoradas, e semelhantes. Uma multiplicidade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, PA, EUA. Estas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, unguentos, geleias, ceras, óleos, lipídios, vesículas (catiônicas ou aniônicas) contendo lipídio (como LIPOFECTIN™), conjugados de DNA, pastas anidras de absorção, emulsões de óleo-em-água e de água-em-óleo, emulsões de carbowax (poli(glicóis etilênicos) de vários pesos moleculares), géis semissólidos, e misturas semissólidas contendo carbowax. Consulte também Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA (1998) J. Pharm. Set. Technol. 52:238-311.
[0161] A dose de anticorpo pode variar dependendo da idade e do tamanho de um sujeito que receberá a administração, da doença alvo, das condições, da rota de administração, e semelhantes. Quando o anticorpo da presente invenção é usado para tratar dor associada com atividade de GFRcx3 em várias condições e doenças, em que a condição ou doença resulta em dor aguda ou dor crônica, dor inflamatória, dor neuropática, e semelhantes, em um paciente adulto, é vantajoso administrar intravenosamente o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso corporal, mais preferencial mente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal. Dependendo da severidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas.
[0162] Vários sistemas de fornecimento são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (consulte, por exemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não se limitam a, rotas intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, e oral. A composição pode ser administrada por qualquer rota conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolo, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosas retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.
[0163] A composição farmacêutica também pode ser fornecida em uma vesícula, em particular um lipossoma (consulte, por exemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
[0164] Em determinadas situações, a composição farmacêutica pode ser fornecida em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada. Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser utilizados. Em ainda uma outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser posicionado próximo do alvo da composição, necessitando assim de apenas uma fração da dose sistêmica.
[0165] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosa, intracutânea e intramuscular, infusões por gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou de seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente utilizado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, há, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que pode ser usada em combinação com um agente solubilizante apropriado como um álcool(por exemplo, etanol), a poliálcool (por exemplo, glicol propilênico, poli(glicol etilênico)), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mols) com óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são utilizados, por exemplo, óleo de gergelim, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferencialmente adicionada a uma ampola.
[0166] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser fornecida subcutânea ou intravenosamente com uma seringa e agulha normais. Em adição, com respeito à aplicação subcutânea, um dispositivo de liberação do tipo caneta tem aplicações na liberação de uma composição farmacêutica da presente invenção. Um tal dispositivo de liberação do tipo caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de liberação do tipo caneta reutilizável de modo geral utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Quando toda a composição farmacêutica dentro do cartucho foi administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser facilmente jogado fora e substituído por um cartucho novo que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de liberação do tipo caneta pode ser então reusado. Em um dispositivo de liberação do tipo caneta descartável, não há cartucho substituível. Em vez disso, o dispositivo de liberação do tipo caneta descartável é recebido preenchido com a composição farmacêutica mantida dentro de um reservatório dentro do dispositivo. Quando o reservatório é esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é jogado fora.
[0167] Numerosos dispositivos de liberação do tipo caneta e de autoinjetor têm aplicações na liberação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas certamente não se limitam a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), DISETRONIC™ pen (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), HUMALOG MIX 75/25™ pen, HUMALOG™ pen, HUMALIN 70/30™ pen (Eli Lilly e Co., Indianapolis, IN, EUA), NOVOPEN™ I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), BD™ pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA), OPT1PEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, e OPTICLIK™ (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Alemanha), para apenas nomear alguns. Exemplos de dispositivos de liberação do tipo caneta que têm aplicações em liberação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas certamente não se limitam a SOLOSTAR™ pen (Sanofi-Aventis), o FLEXPEN™ (Novo Nordisk), e o KWIKPEN™ (Eli Lilly), o SURECLICK ™ Autoinjector (Amgen, Thousands Oaks, CA, EUA), o PENLET ™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), o EPIPEN (Dey, L.P.) e o HUMIRA ™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL, EUA), para apenas nomear alguns.
[0168] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para suprir uma dose unitária dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc.. A quantidade do anticorpo supracitado contida é de modo geral cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo supracitado esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem.
[0169] Os anticorpos da invenção são úteis para o tratamento, a evitação e/ou a melhoria de qualquer doença, transtorno, ou condição associada (associado) com a atividade de GFRa3, ou para a melhoria de pelo menos um sintoma associado com a doença, o transtorno, ou a condição, ou para o alívio da dor associada com tal doença, transtorno, ou condição. Condições, doenças e/ou transtornos exemplificadoras (exemplificadores) e/ou a dor associada com tais condições, doenças, ou transtornos, que podem ser tratadas (tratados) com os anticorpos anti-GFRa3 da presente invenção incluem dor aguda, dor crônica, dor neuropática, ou dor inflamatória, artrite, cistite intersticial, pancreatite, enxaqueca, cefaleias em salvas, neuralgia trigeminal, neuralgia herpética, neuralgias generalizadas, epilepsia ou condições epilépticas, miotinia, arritmia, transtornos de movimento, transtornos neuroendócrinos, ataxia, síndrome do intestino irritável, síndrome inflamatória intestinal, urgência fecal, incontinência, hipersensibilidade retal, dor visceral, dor de osteoartrite, gota, neuralgia pós-herpética, neuropatia diabética, dor radicular, ciática, dor lombar, cefaleia ou dor de pescoço, dor incidental, dor pós-cirúrgica, dor de câncer, incluindo dor associada com câncer ósseo ou câncer pancreático.
[0170] Outras condições tratáveis pelos métodos terapêuticos da invenção incluem eritromelalgia hereditária, rinite, câncer da próstata, câncer da mama, câncer ósseo, câncer cervical, ou transtornos da bexiga. Os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno também podem ser usados para tratar as seguintes condições: dor aguda não maligna, crônica, ou de fratura; artrite reumatoide, estenose espinhal; dor lombar inferior neuropática; síndrome da dor miofascial; fibromialgia; temporomandibular dor articular; dor visceral, incluindo, abdominal; dor pancreática; cefaleia crônica; cefaleia tensional, incluindo, cefaleias em salvas; neuropatia diabética; neuropatia associada com HIV; neuropatia de Charcot-Marie-Tooth; neuropatias sensoriais hereditárias; lesão nervosa periférica; neuromas dolorosos; descargas proximais e distais ectópicas; radiculopatia; dor neuropática induzida por quimioterapia; dor neuropática induzida por radioterapia; dor de pós-mastectomia; dor central; dor de lesão na medula espinhal; dor após acidente vascular cerebral; dor talâmica; síndrome da dor regional complexa (CRPS); dor de membro fantasma; dor intratável; dor musculoesquelética; dor articular; gota aguda dor; dor lombar inferior mecânica; dor do pescoço; tendinite; dor de lesào/exercício; dor abdominal; pielonefrite; apendicite; colecistite; obstrução intestinal; hérnias; etc; dor torácica, incluindo, dor cardíaca; dor pélvica, dor de cólica renal, dor obstétrica aguda, incluindo, dor de trabalho de parto; dor de secção cesariana; dor de queimadura e trauma; endometriose; dor de herpes zóster; anemia de célula falciforme; pancreatite aguda; dor incidental; orofacial dor incluindo sinusite dor, dor dentária; dor de esclerose múltipla; dor de hanseniase; dor de doença de Behcet; adipose dolorosa; dor flebitica; dor de Guillain-Barre; movimentação dolorosa de dedos e pernas; síndrome de Haglund; dor da doença de Fabry; doença urogenital e da bexiga; bexiga hiperativa.
[0171] Em uma modalidade os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar uma síndrome de dor funcional, em que a síndrome de dor funcional é selecionado dentre o grupo consistindo em dor lombar inferior crônica, síndrome do intestino irritável (IBS), fibromialgia (FM), síndrome da fadiga crônica (CFS), dor abdominal, transtorno da articulação temporomandibular (TMJD), síndrome da bexiga dolorosa (cistite intersticial), transtornos/síndromes gastrointestinais funcionais, síndrome da dor torácica funcional, enxaquecas e cefaleias tensionais, síndrome da dor pélvica crônica, síndrome prostática dolorosa (prostatite crônica), síndrome da sensibilidade química múltipla e síndrome da Guerra do Golfo.
[0172] Os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno também podem ser usados para inibir proliferação/crescimento de células de tumor ou metástase de células de tumor. Consequentemente, em determinadas modalidades, os anticorpos da invenção ou seus fragmentos de ligação a antígeno, podem ser usados para tratar um câncer, que incluem, mas não se limitam a, câncer endometrial, câncer da próstata, câncer da mama, câncer cervical, câncer hepático, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer do estômago, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer cerebral, uma leucemia, um linfoma, câncer ósseo, ou dor associada com metástase de um câncer, por exemplo, metástase de um câncer para o osso. (Consulte Tang, J-Z, et al. Mol. Cancer Ther. (2010), 9(6): 1697-1708; Kang, J. et al. Oncogene,(2009), 28:2034-2045; Ceyhan, G.O. et al. Annals of Surgery,(2006), 244(2):274-281; Banerjee, A., et al. Breast Cancer Res. (2011), 13 :R 112; Pandey, V. et al., Endocrinology’, (2010), 151(3):909-920; Kang, J. et al., Oncogene, (2010), 29:3228-3240; Li, S. et al. J. Biomed. Sci. (2011), 18:24).
[0173] Os anticorpos da presente invenção também são úteis para tratar ou evitar dor associada a câncer. “Dor associada a câncer” inclui, por exemplo, dor de câncer ósseo, incluindo dor de câncer que apresenta metástase para osso (por exemplo, câncer da mama, câncer da próstata, câncer de pulmão, sarcoma, câncer renal, mieloma múltiplo, etc.). “Dor associada a câncer” também inclui dor mais generalizada associada com condições cancerosas como, por exemplo, carcinoma de célula renal, carcinoma pancreático, câncer da mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer da próstata, gliomas malignos, osteossarcoma, câncer colorretal, câncer gástrico, mesotelioma maligno, mieloma múltiplo, câncer ovariano, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, sarcoma sinovial, câncer de tireoide, ou melanoma. Os anticorpos da presente invenção também são úteis para tratar ou evitar dor causada por ou associada com terapia de câncer ou tratamentos médicos anticâncer, por exemplo, dor induzida por quimioterapia neuropática como dor causada por ou associada com tratamento com paclitaxel (Taxol™), docetaxel (Taxotere®); nitrosoureia, ciclofosfamida, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracil, topotecan, irinotecan, carmustina, estramustina, e compostos quimioterapêuticos à base de platina, como cisplatina, carboplatina, e iproplatina.
[0174] As terapias de combinação podem incluir um anticorpo anti- hGFRa3 anticorpo da invenção e, por exemplo, outro antagonista de GFRa3 (por exemplo, anticorpo anti-GFRa3 ou inibidor molecular pequeno de GFRa3); um inibidor de COX-2; um anestésico local; um modulador de NMDA; um agonista de receptor canabinoide; um modulador da família P2X; um antagonista de VR1; um antagonista de substância P; um inibidor de um canal de sódio ativado por voltagem (Nav), por exemplo, um antagonista de Nav1.7, ou um antagonista de Nav1.8 (por exemplo, inibidor molecular pequeno de Nav1.7 ou Nav1.8 ou anticorpo anti-Nav1.7 ou anti-NavL8), um antagonista de Nav1.9 (por exemplo, anti-Nav1.9 anticorpo ou inibidor molecular pequeno de NavL9); um inibidor de canal de cálcio; um inibidor de canal de potássio; um inibidor de citocina ou antagonista de receptor de citocina (por exemplo, um inibidor de interleucina-1 (IL-1) (como rilonacept (“IL-1 trap”; Regeneron) ou anaquinra (KINERET®, Amgen), um antagonista molecular pequeno de IL-1, ou um anticorpo anti-IL-1); um inibidor de IL-18 (como um antagonista molecular pequeno de IL-18 ou um anticorpo anti-IL-18); um inibidor de IL-6 ou IL-6R (como um antagonista molecular pequeno de IL-6, um anticorpo anti-IL-6 ou um anticorpo anti- receptor de IL-6); um fármaco antiepiléptico/anticonvulsivo (por exemplo, gabapentina, pregabalina); um inibidor de fator de crescimento de nervo (NGF) (por exemplo, um antagonista molecular pequeno de NGF ou um anticorpo anti-NGF); um inibidor de BDNF, TrkA, TrkB ou p75; um opioide; morfina; coquicina em dose baixa; aspirina ou outro NSAID; esteroides (por exemplo, prednisona, metotrexato, etc.); ciclosporina A em dose baixa; um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (SSRI); um inibidor seletivo da recaptação de serotonina e norepinefrina (SNRI); um tricíclico; um fator de necrose tumoral (TNF) ou inibidor de receptor de TNF (por exemplo, um antagonista molecular pequeno de TNF ou TNFR ou um anticorpo anti-TNF ou TNFR); um inibidor de TWEAK (indutor FRACO de apoptose relacionado com TNF); um inibidor de RET; um inibidor de um ligante da família GDNF; um inibidor de GFRal, GFRa2 ou GFRa4; um inibidor de um canal de ion sensível a ácido (por exemplo ASICl ou ASIC3; inibidores da síntese de ácido úrico (por exemplo, alopurinol); promotores da excreção de ácido úrico (por exemplo, probenecid, sulfimpirazona, benzobromarona, etc.); um inibidor de um receptor de proquineticina (PROK1 e PROK2); outros inibidores de agentes inflamatórios (por exemplo, inibidor de caspase-1, p38, IKK 1/2, CTLA-41g, etc.); e/ou corticosteroides.
[0175] De acordo com determinadas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de um anticorpo anti-GFRa3 podem ser administradas a um sujeito no decorrer de um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem administrar sequencialmente a um sujeito doses múltiplas de um anticorpo anti-GFRa3. Conforme aqui usado, “administrar sequencialmente” significa que cada dose de anticorpo anti-GFRa3 é administrada ao sujeito em um instante de tempo diferente, por exemplo, em dias diferentes separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem administrar sequencialmente ao paciente uma dose inicial única de um anticorpo anti-GFRa3, seguida por uma ou mais doses secundárias do anticorpo anti-GFRa3, e opcionalmente seguidas por uma ou mais doses terciárias do anticorpo anti-GFRa3.
[0176] Os termos “dose inicial”, “doses secundárias”, e “doses terciárias”, referem-se à sequência temporal de administração do anticorpo anti-GFRa3. Por conseguinte, a “dose inicial” é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também chamada de “dose basal”); as “doses secundárias” são as doses que são administradas após a dose inicial; e as “doses terciárias” são as doses que são administradas após as doses secundárias. Todas as doses inicial, secundária, e terciária podem conter quantidade igual de anticorpo anti-GFRa3, mas de modo geral podem diferir de uma para a outra em termos de frequência de administração. Em determinadas modalidades, entretanto, a quantidade de anticorpo anti-GFRa3 contida nas doses inicial, secundária e/ou terciária varia de uma para outra (por exemplo, ajustada para mais ou para menos conforme a conveniência) durante o curso do tratamento. Em determinadas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como “doses de carregamento” seguidas por doses subsequentes que são administradas em uma base de frequência menor (por exemplo, “doses de manutenção”).
[0177] Em uma modalidade exemplificadora da presente invenção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 1 4 2, 24 3, 34 4, 44 5, 54 6, 64 7, 74 8, 84 9, 94 10, 104 11,114 12, 124 13, 134 14, 144 15, 154 16, 164 17, 174 18, 184 19, 194 20, 204 21, 214 22, 224 23, 234 24, 244 25, 254 26, 264 ou mais) semanas após a dose imediatamente precedente. A frase “dose imediatamente precedente”, conforme aqui usada, significa, em uma sequência de administrações múltiplas, a dose de anticorpo anti-GFR«3, que é administrada a um paciente antes da administração da dose imediatamente seguinte sem doses interpostas.
[0178] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender administrar a um paciente qualquer número de doses secundárias e/ou terciárias de um anticorpo anti-GFRa3. Por exemplo, em determinadas modalidades, apenas uma única dose secundária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses secundárias são administradas ao paciente. Igualmente, em determinadas modalidades, apenas uma única dose terciária é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses terciárias são administradas ao paciente.
[0179] Em modalidades que envolvem múltiplas doses secundárias, cada dose secundária pode ser administrada em frequência igual à frequência das outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas após a dose imediatamente precedente. Similarmente, em modalidades que envolvem múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada em frequência igual à frequência das outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 4 semanas após a dose imediatamente precedente. Altemativamente, a frequência na qual as doses secundárias e/ou terciárias são administradas a um paciente podem variar no decorrer do curso do regime de administração. A frequência de administração também pode ser ajustada durante o curso do tratamento por um médido dependendo das necessidades do paciente individual.
[0180] Os anticorpos anti-GFRa3 da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir GFRa3 em uma amostra, por exemplo, para propósitos diagnósticos. Por exemplo, um anticorpo anti- GFRa3, ou seu fragmento, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão aberrante (por exemplo, sobre-expressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de GFRa3. Ensaios diagnósticos exemplificadores para GFRa3 podem compreender, por exemplo, contatar uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-GFRa3 da invenção, em que o anticorpo anti-GFRa3 está marcado com uma molécula repórter ou um marcador detectável. Alternativamente, um anticorpo anti- GFRa3 não marcado pode ser usado em aplicações diagnósticas em combinação com um anticorpo secundário que está ele mesmo detectavelmente marcado. A molécula repórter ou o marcador detectável pode ser um radioisótopo, como 'H, l4C, 32P, 35S, ou l25I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente como isotiocianato de fluoresceína, ou rodamina; ou uma enzima como fosfatase alcalina, ß-galactosidase, peroxidase de rábano, ou luciferase. Ensaios específicos exemplificadores que podem ser usados para detectar ou medir GFRa3 em uma mostra incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay), radioimunoensaio (RIA, radioimmunoassay), e fracionamento de células ativado por fluorescência (FACS, fluorescence-activated cell sorting).
[0181] As amostras que podem ser usadas em ensaios diagnósticos de GFRa3 de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou amostra de fluido obtenível de um paciente, que contém quantidades detectáveis de proteína GFRa3, ou de seus fragmentos, sob condições normais ou patológicas. De modo geral, os teores de GFRa3 em uma amostra específica obtida de um paciente saudável (por exemplo, a paciente não sofrendo de uma doença ou condição associada com atividade de GFRa3 anormal ou teores de GFRa3 anormais) serão medidos para inicialmente estabelecer um teor basal, ou normal de GFRa3. Este teor basal de GFRa3 pode ser então comparado com os teores de GFRa3 medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos de terem uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou dor associada com tal condição ou doença.
[0182] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a fornecerem aquelas pessoas comumente versadas na técnica uma revelação completa e uma descrição completa de como preparar e usar os métodos e as composições da invenção, e não são intencionados para limitarem o escopo do que os inventores consideram como a invenção deles. Têm sido feitos esforços para garantir acurácia com relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns desvios e erros experimentais devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados, e pressão é a pressão atmosférica ou próxima da pressão atmosférica.
[0183] Um imunógeno compreendendo qualquer um dos peptídeos GFRa3 que têm as sequências de aminoácidos mostradas como SEQ ID NOS: 370, 371, 372 e 373, ou seus fragmentos, pode ser utilizado para gerar anticorpo anti-GFRa3 de humano. Estes peptídeos são conjugados a uma proteína carreadora, por exemplo, KLH {Keyhole Limpet Hemocyanin),então administrados com um adjuvante para estimular a resposta imune, a um camundongo VELOCIMMUNE* que compreende DNA que codificada as regiões variáveis de cadeias leve capa e pesada de Imunoglobulina. A resposta imune de anticorpo é monitorada por um imunoensaio específico para GFRa3. Quando uma resposta imune desejada é alcançada, esplenócitos são colhidos e fusionados com células de mieloma de camundongo para preservar a sua viabilidade e formar linhagens de células de hibridoma. As linhagens de células de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar as linhagens de células que produzem anticorpo específicos para GFRa3. Com o uso desta técnica vários anticorpos quiméricos anti-GFRa3 (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis de humano e domínios constantes de camundongo) foram obtidos. Os anticorpos anti-GFRa3 gerados com o uso deste método foram chamados de H1M2207N, H1M2212N, H1M2236N, H1M2236N3, H1M2243N, H1M2243N2, H1M2210N e H1M2234N.
[0184] Anticorpos anti-GFRa3 também foram isolados diretamente de células-B positivas para antígeno sem fusão em células de mieloma, conforme descrito em U.S. 2007/0280945A1. Com o uso deste método, vários anticorpos anti-GFRa3 totalmente de humano (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis de humano e domínios constantes de humano) foram obtidos; anticorpos exemplificadores gerados nesta maneira foram chamados como segue: H4H2207N, H4H2212N, H4H2236N, H4H2243N, H4H2210N, H4H2234N, H4H2291S, H4H2292S, H4H2293P, H4H2294S, H4H2295S, H4H2296S, H4H2341S, H4H2342P, H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, H4H2350P, H4H2352S, H4H2354S, H4H2355S, H4H2357S e H4H2364S.
[0185] As propriedades biológicas dos anticorpos anti-GFRa3 exemplificadores gerados de acordo com os métodos neste Exemplo são descritas em detalhe nos Exemplos apresentados abaixo.
[0186] A Tabela 1 apresenta os pares de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia pesada e de região variável de cadeia leve de anticorpos anti-GFRa3 selecionados e seus identificadores de anticorpo correspondentes. Os anticorpos são tipicamente chamados aqui de acordo com a seguinte nomenclatura: prefixo Fc (por exemplo “H4H”, “HIM, “H2M”), seguido por um identificador numérico (por exemplo “2207” conforme mostrado na Tabela 1), seguido por um sufixo “P”, “S”, ou “N”. Dessa forma, de acordo com esta nomenclatura, um anticorpo pode ser chamado como, por exemplo “H4H2207N”. Os prefixos H4H, HIM, e H2M nas designações de anticorpo aqui usadas indicam a região Fc específica do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo “H2M” tem um Fc de IgG2 de camundongo, enquanto que um anticorpo “H4H” tem um Fc de IgG4 de humano. Como será reconhecido por uma pessoa comumente versada na técnica, um anticorpo HIM ou H2M pode ser convertido em um anticorpo H4H, e vice versa, mas em qualquer evento, os domínios variáveis (incluindo as CDRs), que são identificados pelos identificadores numéricos mostrados na Tabela 1, permanecerão os mesmos. Os anticorpos que têm a mesma designação numérica de anticorpo, mas diferem por um sufixo de letra de N, B, S ou P referem-se aos anticorpos que têm cadeias pesadas e leves com sequências de CDR idênticas mas com variações de sequência nas regiões que caem fora das sequências de CDR (isto é, nas regiões de molde). Dessa forma, as variantes N, B, S e P de anticorpo específico têm sequências de CDR idênticas dentro de suas regiões variáveis de cadeias pesadas e leves mas diferem umas das outras dentro de suas regiões de molde. Tabela 1
[0187] Para analisar a estrutura dos anticorpos produzidos, os ácidos nucleicos que codificam as regiões variáveis do anticorpo foram clonados e sequenciados. A partir da sequência de ácido nucleico e da sequência de aminoácidos predita dos anticorpos, o uso de gene foi identificado para cada região variável de cadeia pesada (HCVR) e região variável de cadeia leve (LCVR). A Tabela 2 apresenta o uso de gene para os anticorpos selecionados de acordo com a invenção. Tabela 2
[0188] As constantes de velocidade associativa e dissociativa de ligação (ka e kd, respectivamente) e as constantes de dissociação em equilíbrio e as meias-vidas dissociativas calculadas (KD e ti/2, respectivamente) para ligação do antígeno aos anticorpos anti-GFRa3 foram determinadas com o uso de ensaio de biossensor de ressonância de plasmon de superfície em tempo real (Biacore T200) a 25°C e 37°C. Os anticorpos foram ligados a GFRa3 de humano expressada com quer uma etiqueta myc-myc-hexa- histidina carboxi-terminal (hGFRa3-mmh; SEQ ID: 370), uma etiqueta hFc carboxi-terminal (hGFRa3-hFc; SEQ ID:371), quer uma etiqueta mFc carboxi-terminal (hGFRa3-mFc; SEQ ID:372), e também GFRa3 de macaco expressada com uma etiqueta myc-myc-hexa-histidina carboxi-terminal (MfGFRa3-mmh; SEQ ID:373). Os anticorpos anti-GFRa3 foram capturados em quer um anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de camundongo (GE Healthcare, n° BR-1008-38) quer um anticorpo monoclonal de camundongo anti-IgG de humano (GE Healthcare, n° BR-1008-39) produzido em superfície mediante acoplamento de amina direto em uma pastilha de sensor Biacore CM5. Os experimentos cinéticos foram realizados com o uso de HBS-EP (HEPES lOmM, NaCl 150mM, EDTA 3mM, Tensoativo P20 0,05%, em pH 7,4) ou tampão PBS contendo 0,05% v/v de tensoativo P20 como ambos o tampão de corrida e o tampão de amostra. A ligação a GFRa3- mmh de humano ou a GFRa3-mmh de macaco foi avaliada por injeção de várias concentrações na faixa de 200 a 7,4 nM (diluições triplas) na superfície de anticorpo capturado. A ligação a GFRa3-mFc de humano ou a GFRa3-hFc de humano foi avaliada por injeção de várias concentrações na faixa de 100 a 3,7 nM (diluições triplas) na superfície de anticorpo capturado. A associação de anticorpo-antígeno foi monitorada durante até 4 minutos, enquanto que a dissociação em tampão foi monitorada durante até 20 minutos. As constantes de velocidade de associação cinética (ka) e de velocidade de dissociação cinética (kj) foram determinadas pelos processamento e ajuste dos dados a um modelo de ligação 1:1 com o uso do programa de ajuste de curva Scrubber 2.0c. As constantes de dissociação de ligação em equilíbrio (KD) e as meias- vidas dissociativas (ti/2) foram calculadas a partir das constantes de velocidade cinética como: KD (M) = ka / ka e t/2(min) = [ln2/(60*kd)].
[0189] Conforme mostrado na Tabela 3, a 25°C, todos os 25 anticorpos anti-GFRa3 ligaram-se a hGFRa3-mmh com valores de KD na faixa de 82,0pM a 29,7nM. A 37°C, todos os 25 anticorpos anti-GFRa3 ligaram-se a hGFRa3-mmh com valores de KDna faixa de 118pM a 47,3nM. Conforme mostrado na Tabela 4, a 25°C, todos os 23 anticorpos anti-GFR«3 ligaram-se a MfGFRa3-mmh com valores de KD na faixa de 2,90pM a 97,2nM. A 37°C, todos os 23 anticorpos anti-GFRa3 ligaram-se a MfGFRa3- mmh com valores de KD na faixa de 1 l,7pM a 145nM. Conforme mostrado na Tabela 5, a 25°C e 37°C, 6 dos 23 anticorpos anti-GFRa3 foram testados para a ligação a hGFRa3-hFc, enquanto que os outros 17 anticorpos foram testados para a ligação a hGFRoG-mFc. A 25°C, os 6 anticorpos anti-GFRa3 testados para a ligação a hGFRcx3-hFc ligaram-se com valores de KD na faixa de 7,50pM a 220pM. A 37°C, os 6 anticorpos anti-GFRa3 testados para a ligação a hGFRa3-hFc ligaram-se com valores de KD na faixa de 41,3pM a 531pM. A 25°C, os 17 anticorpos anti-GFRa3 testados para a ligação a hGFRa3-mFc ligaram-se com valores de KD na faixa de 0,467pM a 58,4pM. A 37°C, os 17 anticorpos anti-GFRa3 testados para a ligação a hGFRa3-mFc ligaram-se com valores de KD na faixa de 13,2pM a 106pM. Tabela 3: Cinética de ligação de liGFRa3-mmH aos anticorpos anti-GFRa3 diferentes a 25°C e a 37°C
[0190] A capacidade de anticorpos anti-GFRa3 para bloquear a ligação de GFRa3 de humano à artemina (ARTEMIN, ARTEMINA) de humano na presença ou ausência de correceptor de humano RET foi determinada com o uso de dots formatos de ELISA de bloqueio diferentes.
[0191] No primeiro formato, proteína artemina recombinante de humano com etiqueta myc-myc-hexa-histidina carboxi-terminal (hARTEMIN-mmH; SEQ ID:369) foi revestida a 2 µg/ml em placas de microtitulaçào de 96 cavidades em tampão PBS de um dia para outro a 4°C e então bloqueada com uma solução de BSA 0,5% (p/v). Uma quantidade constante de GFRa3 de humano fusionada com uma etiqueta Fc de humano carboxi-terminal (hGFRa3-hFc; SEQ ID:371) a 120 pM foi pré-misturada com quantidades variadas de anticorpos, na faixa de 0 a ~10 nM em diluições seriais, seguida por uma incubação de 1 hora à temperatura ambiente (RT, room temperature)para permitir que a ligação do anticorpo-hGFRa3-hFc alcançasse o equilíbrio. As soluções de amostra equilibradas foram então transferidas para a placa revestida com hARTEMIN-mmH. Após 1 hora de ligação, a placa foi lavada, então as hGFRa3-hFc ligadas foram detectadas com o uso de anticorpo específico anti-Fc de IgG de humano conjugado a HRP (Jackson Immunochemical, n° 109-035-098), e os sinais colorimétricos foram revelados com o uso de um substrato TMB HRP (BD Biosciences, n° 51-2606KC e n° 51-2607KC). A absorbância foi registrada a 450nm em um leitor de placa Victor X5 (Perkin Elmer) para determinar a quantidade de hGFRa3-hFc livre nas soluções pré-equilibradas de hGFRa3-hFc-anticorpo que foi capaz de se ligar à placa revestida com hARTEMIN-mmH. Valores de IC50, definida como a concentração de anticorpo necessária para reduzir o sinal a partir de uma concentração constante de hGFRa3-hFc em 50%, foram calculados dos dados com o uso de programa de computador Prism da GraphPad. A absorbância medida na quantidade constante de 120pM de hGFRa3-hFc na ausência de anticorpo anti-GFRa3 é definida como 0% de bloqueio e a absorbância sem hGFRa3-hFc adicionada é definida como 100% de bloqueio. A absorbância observada nas cavidades que contêm a concentração mais alta de anticorpo foi usada para calcular a porcentagem de bloqueio máxima mostrada na Tabela. Os resultados são resumidos na Tabela 6.
[0192] No segundo formato de ELISA, as placas, as amostras e os dados foram processados similarmente ao primeiro formato exceto que ambas hARTEMIN-mmH e RET de humano com uma etiqueta de 10 histidinas carboxi-terminais (hRET-lOHis; R&D Systems, n° 1168-CR/CF) foram revestidas para o experimento de ELISA de bloqueio. As placas de microtitulação de 96 cavidades foram revestidas com uma mistura de 1,2 µg/ml de proteína hARTEMIN-mmH e 6,9 µg/ml de proteína hRET-10His em PBS de um dia para outro a 4°C e então bloqueadas com uma solução de BSA 0,5% (p/v). Uma quantidade constante de GFRa3 de humano biotinilada com uma etiqueta myc-myc-hexa-histidina carboxi-terminal (biotina- hGFRa3-mmH; SEQ ID:370) a InM foi pré-misturada com quantidades variadas de anticorpos anti-GFRa3, na faixa de 0 a -100 nM em diluições seriais, seguido por incubação de 1 hora à RT para permitir que a ligação de anticorpo-biotina-hGFRa3-mmH alcançasse o equilíbrio. As amostras equilibradas foram então transferidas para a placa revestida. Após 1 hora de ligação, a placa foi lavada, então a biotina-hGFRa3-mmH ligada foi detectada com o uso de estreptavidina conjugada a HRP (Pierce, n° N200), e os sinais colorimétricos foram revelados com o uso de substratos TMB HRP. Valores de IC50 e o bloqueio máximo por cada anticorpo são mostrados na Tabela 6.
[0193] Conforme mostrado na Tabela 6, 9 dos 23 anticorpos anti- GFRa3 bloquearam 51-94% da ligação de hGFRct3-hFc à hARTEMIN-mmH revestida com valores de IC50 na faixa de 43,8pM a 723pM no primeiro formato de ELISA. Oito dos 23 anticorpos anti-GFRa3 causaram aumento do sinal de ligação de hGFRa3-hFc (“intensificador” na Tabela 6) em muitas das concentrações mais altas de anticorpo testado no primeiro formato de ELISA. Seis dos 23 anticorpos testados no primeiro formato de ELISA não bloquearam ou intensificaram o sinal de ligação de hGFRa3-hFc à hARTEMIN-mmH revestida. Conforme mostrado na Tabela 6, para o segundo formato de ELISA, 17 dos 23 anticorpos anti-GFRa3 bloquearam 75-100% da ligação de biotina-hGFRa3-mmH às hARTEMIN-mmH e hRET- lOHis revestidas, com valores de IC50 na faixa de 403pM a 14,6nM. Também no segundo formato de ELISA, cinco dos 23 anticorpos anti-GFRa3 causaram aumento do sinal de ligação de biotina-hGFRa3-mmH em concentrações mais baixas de anticorpo mas bloquearam 28-95% da ligação de biotina-hGFRa3- mmH à hARTEMIN-mmH e à hRET-10His nas concentrações de anticorpo de InM e acima (“intensificador” na Tabela 6). Um anticorpo anti-GFRa3 causou aumento de sinal de ligação de biotina-hGFRa3-mmH (“intensificador” na Tabela 6) nas concentrações mais altas de anticorpo testado, sem bloqueio em nenhuma concentração, no segundo formato de ELISA. Tabela 6: Bloqueio em ELISA de GFRa3 de humano à artemina de humano sozinha ou à artemina de humano e à RET de humano NB = não-bloqueador
[0194] A capacidade dos anticorpos anti-GFRa3 para bloquearem a ativação de GFRa3 e de RET por seu ligante ARTEMINA in vitrofoi determinada com o uso de um ensaio à base de células. Células HEK293 modificadas para estavelmente expressarem ambas GFRa3 de humano (aminoácidos 1-400 de número de acesso NP 001487,2) e RET de humano (aminoácidos 1-1072 de número de acesso NP 065681) foram geradas e então transduzidas com um gene repórter de luciferase responsive a SRE (Serum Response Element,elemento de resposta ao soro) (SRE-luc; Sabiosciences, CCS-010L) (células HEK293/hGFRa3/hRET).
[0195] Vinte mil células HEK293/hGFRa3/hRET/SRE-luc foram inoculadas em placas de 96 cavidades revestidas com Poli-D-Lisina (Greiner, n° 35-4620) em Optimem (GIBCO, n° 31985) contendo 0,5% de FBS e então crescidas de um dia para outro em 5% de CO2 a 37°C. As células foram então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com diluições seriais de anticorpos anti-GFRa3 na faixa de 5pM a 300nM. Uma dose constante (lOOpM) de artemina de humano expressada com uma etiqueta myc-myc- hexa-histidina carboxi-terminal (SEQ ID:369) foi então adicionada às células e as células foram incubadas durante um adicional de 6 horas. Atividade de luciferase foi medida como unidades de luz relativas (RLU, relative light units)em um luminômetro Victor (Perkin Elmer) após a adição de reagente OneGlo (Promega, n° E6051). Os valores de EC50 e IC50 foram calculados de uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de resposta de 12 pontos com o uso do programa de computador de análise de dados GraphPad Prism.
[0196] Vinte e três anticorpos anti-GFRa3 foram testados para a sua capacidade para inibir a ativação dependente de ARTEMINA das células HEK293/hGFRa3/hRET/SRE-luc. Conforme mostrado na Tabela 7, todos os 23 anticorpos testados bloquearam a atividade de luciferase com valores de IC50 na faixa de 0,2nM a 48,3nM, e 19 dos 23 anticorpos bloquearam para o valor basal em uma concentração de 300nM. Quatro dos 23 anticorpos (H4H2344S, H4H2345S, H4H2346S, e H4H2354S-1) não bloquearem para o valor basal em nenhumas das concentrações de anticorpo testadas. Tabela 7: Inibição da estimulação dependente de ARTEMINA das células HEK293/hGFRa3/hRET/ SRE-luc pelos anticorpos anti-GFRa3
[0197] Para induzir hiperalgesia térmica sensibilizada por ARTEMINA em camundongos, cada camundongo foi pré-tratado com uma injeção intra-plantar de 0,5 micrograma de artemina recombinante de camundongo (R&D Systems, n° 1085-AR) 24 horas antes da administração de uma injeção intra-plantar de 0,5 micrograma de capsaicina (uma dose subótima) de uma solução a 100 mM em DMSO (Sigma-Aldrich, n° M- 2028). A hiperalgesia térmica foi avaliada com o uso do Teste de Hargreaves, no qual um feixe de luz é direcionado para a pata injetada até que o animal afaste a sua pata. A latência para afastar a pata é registrada como uma medição comportamental de nocicepção. A hiperalgesia térmica é consistentemente sensibilizada por ARTEMINA 3 dias após a administração de capsaicina com base nas latências de retirada da pata. Para estes estudos, um valor basal para latência de retirada da pata foi medido antes da dosagem com quer ARTEMINA quer capsaicina seguida por uma segunda medição três dias após o tratamento com capsaicina. O experimentador que conduz estes ensaios desconhecia o grupo de tratamento dos animais.
[0198] Para todos os experimentos que avaliam a eficácia dos anticorpos de humano anti-GFRa3 na hiperalgesia sensibilizada por ARTEMINA, foram usados camundongos adultos homozigóticos para a expressão de GFRa3 de humano no lugar de GFRa3 de camundongo (“GFRa3 humanizada”). Foram utilizados ambos camundongos machos e fêmeas em cada ensaio, com o equilíbrio de sexos entre os grupos de tratamento (um total de 8 camundongos por grupo de tratamento ou por grupo de controle). Foi previamente determinado que camundongos com GFRct3 humanizada têm respostas de latência à hiperalgesia térmica causada por capsaicina induzida por ARTEMINA similares àquelas observadas em camundongos de tipo selvagem.
[0199] Seis anticorpos anti-GFRa3 (H4H2212N, H4H2243N2, H4H2292S, H4H2294S, H4H2342P, e H4H2352S-1) foram testados no modelo. Todos os anticorpos foram diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS, phosphate-buffered saline)e foram administrados subcutaneamente a 25mg/kg em um volume de Iml/lOOg de peso corporal 24 antes da injeção de ARTEMINA na pata traseira. Em cada experimento, um grupo de animais recebeu um anticorpo de controle isotípico.
[0200] A sensibilidade à dor para cada grupo de tratamento ou grupo de controle foi definida como a porcentagem de latência basal de retirada da pata (%BWL, baseline withdrawal latency),calculada como uma mudança fracionária para cada latência de retirada da pata (WL, withdrawal latency) baseada no tempo do animal três dias após o tratamento com capsaicina em comparação com sua latência basal de retirada da pata sem o tratamento com capsaicina:
[0201] Com o uso de %BWL, valores negativos maiores indicam hiperalgesia térmica mais intensa.
[0202] A Tabela 8 mostra o resumo de médias de grupo (em negrito) e erro padrão de médias (em itálico) para a porcentagem de latência basal de retirada da pata (%BWL) no modelo de hiperalgesia térmica causada por capsaicina sensibilizada por AR TEMINA avaliado três dias após a injeção de capsaicina.
[0203] Conforme mostrado na Tabela 8, os camundongos tratados com anticorpos anti-hGFRa3 apresentaram aumentos em %BWL (valores negativos ou positivos menores) em comparação com os camundongos tratados com o anticorpo de controle isotípico. Quatro anticorpos, H4H2352S, H4H2243N2, H4H2294S, e H4H2342P proporcionaram a resistência mais alta à hiperalgesia térmica em todos os experimentos realizados. Tabela 8: Resumo dos dados no modelo de hiperalgesia térmica causada por capsaicina sensibilizada por ARTEMINA avaliada três dias após a injeção de capsaicina. significativamente diferente do controle isotípico, **p<0,01; ***p<0,00l (nd= não testado no experimento)
[0204] A capacidade de anticorpos anti-GFRa3 para se ligarem aos receptores da família GDNF foi avaliada com o uso de biossensor Octet Red (Fortebio, Inc.). Anticorpos foram testados para a ligação a quer GFRal de humano expressada com um etiqueta Fc de humano carboxi-terminal e uma etiqueta de hexa-histidina carboxi-terminal (hGFRa l-hFc-6His, R&D Systems n° 714-GR), GFRal de humano expressada com apenas uma etiqueta Fc de humano carboxi-terminal (hGFRal-hFc; SEQ ID: 376), GFRa2 de humano expressada com uma etiqueta Fc de humano carboxi- terminal e uma etiqueta hexa-histidina carboxi-terminal (hGFRa2-hFc-6His, R&D Systems n° 613-FR), GFRa3 de humano expressada com uma etiqueta Fc de humano carboxi-terminal (hGFRa3-hFc, SEQ ID:371), quer uma proteína etiquetada com Fc de humano irrelevante. Os antígenos foram capturados em pontas de sensor anti-Fc de humano de soluções a 10µg/mL durante 5 minutos. A pontas de sensor revestidas foram bloqueadas com uma solução a 100µg/mL de anticorpos anti-Fc de humano irrelevante durante 5 minutos. As pontas de sensor bloqueadas foram então submersas em cavidades contendo 667µM de cada anticorpo anti-GFRa3 ou tampão sozinho durante 10 minutos. O experimento foi realizado a 25°C com uma taxa de fluxo de 1.000 com o uso de tampão HBST+BSA (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,05% p/v, BSA 0,1 mg/mL, pH 7,4). A resposta de ligação (medida em unidades de nm) em cada etapa do experimento foi monitorada e registrada.
[0205] Todos os seis anticorpos anti-GFRa3 testados mostraram ligação acima de 1,0 nm à proteína hGFRa3-hFc, mas não demonstraram nenhuma ligação mensurável aos outros receptores da família GDNF ou à proteína etiquetada com Fc de humano irrelevante, conforme mostrado na Tabela 9. Tabela 9. Reatividade de anticorpos anti-GFRa3 com GFRal, GFRa2 e GFRa3
[0206] A capacidade dos anticorpos anti-GFRa3 para bloquearem a ativação de GFRa3 de macaco cinomolgo e de RET de macaco cinomolgo mediante o seu ligante ARTEMINA in vitrofoi determinada com o uso de um ensaio baseado em células. Células HEK293 modificadas para estavelmente expressarem tanto GFRa3 de macaco cinomolgo (MfGFRa3; SEQ ID: 377) quanto RET de macaco cinomolgo (MflRET; SEQ ID: 378) foram geradas e então transduzidas com um Cignal Lenti SRE Reporter (SA Biosciences, n° CLS-010L) que expressa o gene de luciferase de pirolampo sob o controle de um promotor de CMV mínimo e repetições em tandem de elemento de resposta ao soro para gerar a linhagem de células HEK293/MfGFRa3/MfRet/SRE-Luc.
[0207] Para o bioensaio, 20.000 células HEK293/MfGFRa3/MfRet/SRE-Euc foram inoculadas sobre placas de 96 cavidades revestidas com Poli-D-Lisina (Greiner, n° 35-4620) em Optimem (GIBCO, n° 31985) contendo 0,5% de FBS e então crescidas de um dia para outro a 5% CO2 a 37°C. As células foram então incubadas durante 1 hora com diluições seriais de anticorpos anti-GFRa3 na faixa de 5pM a 300nM. Uma dose constante (500pM) de artemina de humano expressada com uma etiqueta myc-myc-hexa-histidina carboxi-terminal (ARTEMINA-de-humano-MMH; SEQ ID: 369) foi então adicionada às células e incubada durante um adicional de 6 horas. Para determinar o valor de EC50 de ARTEMINA-de-humano- MMH das curvas de resposta à dose, diluições seriais de ARTEMINA-de- humano-MMH na faixa de 0,5 pM a 1 OnM foram adicionadas às células sem anticorpos e incubadas durante 6 horas a 37°C. A atividade de luciferase foi medida como unidades de luz relativas (RLU) em um luminômetro Victor (Perkin Elmer) após a adição de reagente OneGlo (Promega, n° E6051). Os valores de EC50 e IC50 foram calculados a partir de uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de resposta de 12 pontos com o uso do programa de computador para análise de dados GraphPad Prism.
[0208] Seis anticorpos anti-GFRa3 foram testados para a sua atividade para inibirem a ativação dependente de ARTEMINA das células HEK293/MfGFRa3/MfRET/SRE-luc. Conforme mostrado na Tabela 10, todos os seis anticorpos testados bloquearam completamente a atividade de luciferase com valores de IC50 na faixa de 0,7nM a 2,5nM. ARTEMINA-de- humano-MMH estimulou a atividade de luciferase dependente de SRE na linhagem de células HEK293/mfGFRa3/mfRet/SRE-LUC com um valor de EC50 de 70pM. Tabela 10: Inibição da estimulação dependente de ARTEMINA das células HEK293/MfGFRa3/MfRET/ SRE-luc por anticorpos anti-GFRa3
[0209] Vários anticorpos biespecíficos são gerados para uso na prática dos métodos da invenção. Por exemplo, anticorpos específicos para GFRa3 são gerados em um formato biespecífico (um “biespecífico”) no qual as regiões variáveis que se ligam aos epítopos distintos em GFRa3 são ligadas juntas para concederem especificidade por epítopo dual dentro de uma única molécula ligante. Biespecíficos apropriadamente projetados podem intensificar a eficácia de bloqueio total de GFRa3 mediante o aumento de ambas a atividade de ligação à e a especificidade por GFRa3. As regiões variáveis com especificidade por epítopos diferentes individuais dentro de quaisquer três repetições de cisteína ou que podem se ligar às regiões diferentes dentro de um epítopo de qualquer uma das três repetições de cisteína são pareadas em um arcabouço estrutural que permite que cada região variável se ligue simultaneamente aos epítopos separados, ou às regiões diferentes dentro de um epítopo. Em um exemplo de um biespecífico, regiões variáveis de cadeia pesada (VH) de um ligante com especificidade por um epítopo dentro de uma repetição de cisteína são recombinadas com regiões variáveis de cadeia leve (VL) de uma série de ligantes que têm especificidade por um segundo epítopo dentro de qualquer uma das outras duas repetições de cisteína para identificar parceiros de VL não cognatos que podem ser pareados com uma VH original sem prejudicar a especificidade original por aquela VH. Nesta maneira, um elemento único de VL (por exemplo, Vi.l) pode ser combinado com dois domínios de VH diferentes (por exemplo, VHI e VH2) para gerar um biespecífico compreendido de dois “braços” de ligação (Vj|l - Vi.l e V| [2- VLI). O uso de um segmento único de VL reduz a complexidade do sistema e com isso simplifica e aumenta a eficiência em processos de clonagem, expressão, e purificação usados para gerar o biespecífico (consulte, por exemplo, USSN13/022759 e US2010/0331527).
[0210] Alternativamente, os anticorpos que se ligam tanto a GFRct3 quanto a um segundo alvo, tal como, mas não se limitando a, por exemplo, RET, podem ser preparados em um formato biespecífico com o uso de técnicas conhecidas por aquelas pessoas versadas na técnica. As regiões variáveis do anticorpo que se ligam às regiões de GFRa3 distintas que são extracelu I armente expostas são ligadas juntas com regiões variáveis que se ligam aos sítios relevantes, por exemplo, no ligante, artemina, outros receptores GFRa, ou à RET, para conferir especificidade por antígeno dual dentro de uma única molécula ligante. As regiões variáveis com especificidade por epítopos individuais de GFRa3, são combinadas com uma região variável com especificidade por, por exemplo, artemina, e pareadas em um arcabouço estrutural que permite que cada região variável se ligue aos antígenos separados.
[0211] Os ligantes biespecíficos são testados para ligação e bloqueio funcional dos antígenos alvo, por exemplo, GFRa3 e/ou artemina, outros receptores GFRa, ou RET, em qualquer um dos ensaios descritos acima para anticorpos. Por exemplo, métodos padrão para medir a ligação de proteína solúvel são usados para avaliar a interação biespecífica dentro de seu(s) antígeno(s), como Biacore, ELISA, cromatografia por exclusão de tamanho, espalhamento multiangular de luz laser, calorimetria de varredura direta, e outros métodos. A ligação de anticorpos biespecíficos às células que expressam GFRa3 é determinada mediante citometria de fluxo com o uso de um segundo anticorpo fluorescentemente marcado que reconhece o antígeno alvo sobre as células. Os experimentos de ligação com peptídeos também podem ser conduzidos com o uso de experimentos de ressonância de plasmon de superfície, nos quais a interação de ligação em tempo real do peptídeo ao anticorpo é medida pelo fluxo de um peptídeo ou biespecífico através de uma superfície de sensor sobre a qual o biespecífico ou o peptídeo, respectivamente, é capturado. O bloqueio funcional in vitroda proteína receptora GFRa3 por um biespecífico é determinado com a utilização de qualquer bioensaio tal como aquele aqui descrito, ou pela determinação in vivo de reação à dor em modelos animais apropriados, como aqueles aqui descritos. O bloqueio funcional in vitro de GFRa3 ou de seu ligante, artemina, por um biespecífico é determinado com o uso de qualquer bioensaio como aquele descrito em WO2010/077854, ou em US2010/0166768, ou pela determinação in vivo de hipersensibilidade aos estímulos térmicos em modelos animais apropriados, como aqueles aqui descritos.
[0212] As constantes de velocidade de ligação associativa e dissociativa (ka e kd,respectivamente) e as constantes de dissociação em equilíbrio e as meias-vidas dissociativas calculadas (/fo e ti/2, respectivamente) para ligação de antígeno a anticorpos anti-GFRa3-de- camundongo foram determinadas com o uso de ensaio com biossensor de ressonância de plasmon de superfície em tempo real (Biacore 3000) a 25°C. Os anticorpos foram testados para a ligação a GFRa3 de camundongo expressada com etiqueta myc-myc-hexa-histidina (mGFRa3-MMH; SEQ ID: 379,). Os anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo foram capturados sobre uma superfície de anticorpo policlonal de cabra anti-IgG de camundongo (GE Healthcare, n° BR-1008-38) produzida mediante acoplamento de amina direto a uma pastilha de sensor Biacore CM5. Os experimentos cinéticos foram realizados com o uso de HBS-EP (HEPES lOmM, NaCl 150mM, EDTA 3mM, Tensoativo P20 0,05%, em pH 7,4) como ambos o tampão de corrida e o tampão de amostra. A ligação a GFRa3-de-camundongo-MMH foi avaliada por injeção de várias concentrações na faixa de lOOnM a 6,25 nM (diluições duplas) através da superfície de anticorpo capturada. A associação de anticorpo-antígeno foi monitorada durante até 5 minutos, enquanto que a dissociação em tampão foi monitorada durante até 10 minutos. As constantes de velocidade de associação cinética (ka) e de velocidade de dissociação cinética (^) foram determinadas pelos processamento e ajuste dos dados a um modelo de ligação 1:1 com o uso de programa de computador de ajuste de curva Scrubber 2.0c. As constantes de dissociação de ligação em equilíbrio (KM) e as meias-vidas dissociativas (ti/2) foram calculadas a partir das constantes de velocidade cinética como: KM (M) = ká / kã e t>/2(min) = [ln2/(60*Â;d)].
[0213] Conforme mostrado na Tabela 11, os dois anticorpos anti- GFRa3-de-camundongo testados, M1M6986N e M1M6977N, ligaram-se a mGFRa3-MMH a 25°C com valores de KD de 23,lpM e 107pM, respectivamente. Tabela 11: Cinética de ligação de mGFRa3-MMH a anticorpos anti-GFRa3- de-camundongo diferentes a 25°C
[0214] A capacidade dos anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo para bloquearem a ligação de GFRa3 de camundongo à ARTEMINA de camundongo na presença de ou na ausência de correceptor RET de camundongo foi determinada com o uso de dois formatos diferentes de ELISA de bloqueio. No primeiro formato, a proteína ARTEMINA recombinante de camundongo (R&D n° de cat. 1085-AR/CF) foi revestida a 2µg/mL (166nM) em placas de microtitulação de 96 cavidades em tampão PBS de um dia para outro a 4°C e então bloqueada com uma solução de BSA 0,5% (p/v). Uma quantidade constante (3,5nM) de GFRa3 de camundongo biotinilada com uma etiqueta myc-myc-hexa-histidina carboxi-terminal (Biotina-mGFRa3-MMH, SEQ ID:379) foi pré-misturada com quantidades variadas de anticorpos, na faixa de lOOnM a 1,6 pM em diluições seriais, seguida por incubação de 1 hora à temperatura ambiente (RT) para permitir que a ligação de anticorpo-biotina-mGFRoG-MMH alcançasse o equilíbrio. As soluções de amostra equilibradas foram então transferidas para a placa revestida com mARTEMINA. Após 1 hora de ligação, a placa foi lavada, então a biotina-mGFRa3-MMH ligada foi detectada com o uso de Estreptavidina-HRP (Pierce, n° N200) e os sinais colorimétricos foram revelados com a utilização de um substrato TMB HRP (BD Biosciences, n° 51-2606KC e n° 51-2607KC). A absorbância foi registrada a 450nm em um leitor de placa Victor X5 (Perkin Elmer) para determinar a quantidade de biotina-mGFRa3-MMH livre na solução salina de biotina-mGFRa3-MMH- anticorpo pré-equilibrada que foi capaz de se ligar à mARTEMINA revestida na placa. Os valores de IC50, definida como a concentração de anticorpo necessária para reduzir o sinal a partir de uma concentração constante de biotina-mGFRa3-MMH em 50%, foram calculados dos dados com o uso de programa de computador Prism da GraphPad. A absorbância medida na quantidade constante de biotina-mGFRa3-MMH na ausência de anticorpo anti-GFRa3-de-camundongo é definida como 0% de bloqueio e a absorbância sem biotina-mGFRa3-MMH adicionada é definida como 100% de bloqueio. A absorbância observada nas cavidades que contêm a concentração mais alta de anticorpo foi usada para calcular a porcentagem de bloqueio máxima mostrada na Tabela. Os resultados são resumidos na Tabela 12.&&
[0215] No segundo formato de ELISA, as placas, amostras e os dados foram processados similarmente como para o primeiro formato exceto que tanto RET de camundongo expressada com etiquetas hFc e hexa-histidina carboxi-terminais (mRET-hFc-6His; R&D n° de cat. 482-RT/CF) e mARTEMINA (R&D n° de cat. 1085-AR/CF) foram revestidas para o experimento de ELISA de bloqueio. As placas de microtitulação de 96 cavidades foram revestidas com uma mistura de l,2µg/mL (lOOnM) de proteína mARTEMINA e 9,5µg/mL (lOOnM) de proteína mRET-hFc-6His em PBS de um dia para outro a 4°C e então bloqueadas com uma solução de BSA 0,5% (p/v). Uma quantidade constante (350pM) de biotina-mGFRa3- MMH foi pré-misturada com quantidades variadas de anticorpos anti-GFRa3- de-camundongo, na faixa de lOOnM a l,6pM em diluições seriais, seguida por uma incubação de 1 hora a RT para permitir que a ligação de anticorpo- biotina-mGFRa3-MMH alcançasse o equilíbrio. As amostras equilibradas foram então transferidas para a placa revestida. Após 1 hora de ligação, a placa foi lavada, então a biotina-mGFRa3-MMH ligada foi detectada com o uso de estreptavidina conjugada a HRP e os sinais colorimétricos foram revelados com o uso de substratos TMB HRP. Os valores de IC50 e o bloqueio máximo por cada anticorpo são mostrados na Tabela 12.
[0216] Conforme mostrado na Tabela 12, apenas um anticorpo anti- GFRa3-de-camundongo testado, M1M6986N, demonstrou a capacidade para bloquear a ligação de biotina-mGFRa3-MMH à placa revestida com mARTEMINA com um valor de IC50 de 69,lpM. O outro anticorpo anti- GFRa3-de-camundongo testado, M1M6977N, não demonstrou nenhum bloqueio mensurável neste formato de ELISA. Ambos os anticorpos anti- GFRa3-de-camundongo testados, M1M6986N e M1M6977N, demonstraram a capacidade para completamente bloquearem a ligação de biotina-mGFRa3- MMH às placas revestidas com ambas mARTEMINA e mRET-hFc-6His, com valores de IC50 de 47,2pM e 366pM, respectivamente. Tabela 12: ELISA de bloqueio de GFRa3 de camundongo em ARTEMINA de camundongo sozinha ou em Artemina de camundongo e RET de camundongo
[0217] A capacidade dos anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo para bloquearem a ativação de GFRa3 de camundongo e de RET de camundongo por seu ligante ARTEMINA de camundongo in vitrofoi determinada com o uso de um bioensaio baseado em células. Células HEK293 modificadas para estavelmente expressarem tanto GFRa3 de camundongo (aminoácidos 1-397 de número de acesso AAH66202,l) quanto RET de camundongo (aminoácidos 1-1115 de número de acesso NP_033076,2) foram geradas e então transduzidas com um gene repórter de luciferase responsivo a SRE (SRE-luc; Sabiosciences, CCS-010L) (células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc).
[0218] Vinte mil células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc foram inoculadas em placas de 96 cavidades revestidas com Poli-D-Lisina (Greiner, n° 35-4620) em Optimem (GIBCO, n° 31985) contendo 0,5% de FBS e então crescidas de um dia para outro em 5% CCE a 37°C. As células foram então incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com diluições seriais de anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo na faixa de 3 nM a 44 nM. Uma dose constante (100 pM) de ARTEMINA de camundongo (R&D, n° 1085-AR/CF) foi então adicionada às células e incubada durante um adicional de 6 horas. A atividade de luciferase foi medida como unidades de luz relativas (RLU) em um luminômetro Victor (Perkin Elmer) após a adição de reagente OneGlo (Promega, n° E6051). Os valores de EC50 e IC50 foram calculados a partir de uma equação logística de quatro parâmetros sobre uma curva de 12 pontos com o uso do programa de computador para análise de dados GraphPad Prism.
[0219] Conforme mostrado na Tabela 13, ambos os anticorpos anti- GFRa3-de-camundongo testados, M1M6986N e M1M6977N demonstraram a capacidade para inibirem a estimulação dependente de ARTEMINA de camundongo de células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc com valores de IC50 de aproximadamente 44nM e 3nM, respectivamente. Tabela 13: Inibição da estimulação dependente de ARTEMINA de células 293/mGFRa3/mRET/SRE-luc por anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo
[0220] Os anticorpos aqui descritos sào anticorpos de humano de afinidade alta pelo receptor-alfa GPI-ligado que se liga à artemina, GFRa3. Visto que estes anticorpos para GFRa3 de humano não reagem cruzadamente com GFRa3 de camundongo, ensaios in vivo com estes anticorpos apenas podem ser conduzidos em camundongos geneticamente alterados para substituir a sequência de GFRa3 de camundongo por aquela de GFRct3 de humano. Experimentos iniciais in vivo nestes camundongos GFRa3hu hucom o uso de inibição farmacológica de capsaicina sensibilizada por artemina revelaram eficácia de quatro anticorpos de humano neste ensaio in vivo. Com o propósito de acelerar a geração de dados de eficácia, os anticorpos de camundongo anti-GFRa3 foram gerados para servirem como substitutos dos anticorpos de humano. Camundongos de uma cepa mista C57BL6/129Sv que foram homozigóticos para deleção do gene endógeno GFRa3 foram imunizados com domínio extracelular de GFRa3 recombinante de camundongo expressado em células de ovário de hamster chinês. Uma resposta imune específica para GFRa3 foi confirmada por imunoensaios de soro dos camundongos imunizados. Foram selecionados baços de camundongos que apresentam uma resposta imune específica alta, e células de hibridoma que produzem anticorpo foram geradas pela fusão dos esplenócitos isolados com células de mieloma de camundongo seguindo procedimentos de hibridoma padrão. Os sobrenadantes de hibridoma foram adicionalmente triados em imunoensaios para a ligação a GFRa3 e para a sua capacidade para bloquearem a ligação de GFRa3 a quer artemina quer artemina/Ret revestida sobre uma superfície sólida em um formato de imunoensaio. Os sobrenadantes também foram triados para a sua capacidade para bloquearem a estimulação por artemina da rota de correceptor GFRa3/Ret em um bioensaio baseado em células. As sequências de região variável de anticorpo foram obtidas por amplificação por PCR de clones de hibridoma selecionados cujas proteínas anticorpo apresentavam bloqueio potente no ensaio baseado em células, e estas sequências foram usadas para produzir anticorpos recombinantes de comprimento total anti-GFRa3-de- camundongo com um isótipo IgGl de camundongo. Dois anticorpos foram selecionados para o teste in vivo que potencialmente inibiram a sinalização de artemina no ensaio baseado em células. No imunoensaio de ligação in vitro,o anticorpo M1M6986N bloqueou a ligação de GFRa3 a ambas artemina ou artemina/Ret revestidas sobre uma superfície sólida e é aqui chamado de um bloqueador direto. O anticorpo M1M6977N bloqueou a ligação de GFRa3 à artemina/Ret revestida mas não a ligação à artemina sozinha no imunoensaio in vitro e é aqui chamado de um bloqueador indireto. Estes dois anticorpos de camundongo, M1M6986N e M1M6977N, foram selecionados para teste no modelo de analgesia térmica causada por capsaicina sensibilizada por artemina (descrito no Exemplo 6), porque estes dois anticorpos demonstraram perfis de bloqueio e de ligação similares aos dos anticorpos de humano eficazes. Estes dois anticorpos foram triados para a sua capacidade para bloquearem a sensibilização induzida por artemina de hiperalgesia in vivo em camundongos de tipo selvagem. Como suas contrapartes anticorpo de humano, ambos os anticorpos significativamente inibiram o efeito sensibilizante de artemina sobre a hiperalgesia causada por capsaicina três dias após a injeção de capsaicina (Figura 1).
[0221] Camundongos adultos machos de uma cepa de origem C57B16 foram usados em dois experimentos de fibrossarcoma a aproximadamente 12 semanas de idade. Os experimentadores que mediram os dados produzidos deste experimento desconheciam o grupo de tratamento dos animais durante todas as coleta de dados, compilação de dados, e análises de dados.
[0222] Para induzir dor de câncer ósseo, os camundongos foram anestesiados e então receberam injeção intrafemoral com 1,0x106 células de fibrossarcoma MC57G. Estas células são derivadas de uma linhagem de tumor de fibrossarcoma de camundongo C57B1/6. Os tumores tipicamente crescem de modo agressivo neste modelo, de tal maneira que a destruição óssea é evidente a aproximadamente 14 dias após a implantação do tumor. Radiografias foram obtidas a dias 7, e 10, e 14 após a implantação para verificar o crescimento de tumor e a destruição óssea. A destruição óssea foi pontuada em uma escala de três pontos de tal modo que 0 representou nenhuma destruição e 3 representou destruição completa do fêmur na região do tumor.
[0223] Cada animal recebeu injeções s.c. de anticorpo a 30mg/kg administradas no dia antes da implantação de células cancerosas e de novo no dia 7. Os animais foram pseudoaleatoriamente distribuídos em um dos dois ou três grupos de tratamento: 1) anticorpo isotípico de controle M2M180N (negativo) em dois experimentos separados, 2) anticorpo M1M6977N anti- GFRa3-de-camundongo em dois experimentos separados ou 3) anticorpo M1M6986N anti-GFRa3-de-camundongo apenas no segundo experimento. M1M6986 bloqueia a interação de artemina com GFRa3, e é por causa disso considerado um bloqueador “direto” da ação de artemina. Em contraste, M1M6977N inibe a ação de artemina mediante o complexo GFRa3/RET, e é por conseguinte considerado um bloqueador “indireto”.
[0224] As respostas nociceptivas para o tumor ósseo foram medidas com o uso do teste de Frey Hair para evocar alodinia mecânica (tátil), do teste de suportação dinâmica de peso (DWB) para a disposição para suportar peso sobre um membro, e do comportamento de guarda. Os resultados do teste de Von Frey são expressos como gramas de pressão necessários para a retirada da pata. Os resultados de suportação de peso são expressos como peso corporal percentual posicionado sobre o membro ipsilateral. Comportamento de guarda é expresso como o tempo decorrido guardando o membro durante um período de dois minutos.
[0225] Não houve efeito significativo de tratamento com anticorpo sobre a pontuação de destruição óssea em cada experimento sugerindo que o tratamento com anticorpo não teve influência sobre a severidade do próprio câncer ósseo (dados não mostrados).
[0226] Houve um decréscimo estatisticamente significativo em alodinia tátil com tratamento com anticorpo anti-GFRa3 após a injeção de células de fibrossarcoma no primeiro experimento (F(l,20)=9,189, p = 0,007, Figura 2A) e uma tendência estatística para a eficácia total no segundo experimento (F(2,29)=3,069, p<0,062, Figura 2B), com composições individuais algumas vezes alcançando significância no segundo estudo (Figura 2B).
[0227] Não houve efeito estatisticamente significativo de anticorpos anti-GFRa3 sobre a suportação dinâmica de peso sobre o membro ipsilateral medida 14 dias após a implantação de osso com células de fibrossarcoma em cada experimento, embora o primeiro experimento tenha revelado uma tendência estatística para eficácia com o tratamento com M1M6977N (t(10)=2,047, p=0,068, Figura 3A; F(2,28)=l,598, p=0,220, Figura 3B).
[0228] O anticorpos anti-GFRa3 significativamente reduziram a guarda de membro após a implantação de câncer ósseo em ambos os experimentos de fibrossarcoma (F( 1,20)= 12,270, p=0,002, Figura 4A; F(2,29)=3,576, p=0,041, Figura 4B).
[0229] O tratamento com anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo significativamente reduziu os comportamentos nociceptivos neste modelo de dor de câncer ósseo conforme medido pela avaliação de guarda e do teste de von Frey de alodinia tátil. Em adição, houve uma tendência estatística para a eficiência do anticorpo M1M6977N em diferença de suportação de peso em um experimento. As pontuações de destruição óssea não foram diferentes em grupos que receberam anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo, sugerindo que as diferenças em medições relacionadas com dor não puderam ser explicadas pelas diferenças em severidade de câncer. Portanto, nossos dados sugerem que os anticorpos neutralizadores contra GFRa3 puderam ser eficazes contra dor de câncer ósseo. Devido ao fato de as células de sarcoma serem mais frequentemente tumores primários que metástases em osso, e devido ao fato de que a maioria dos cânceres ósseos deriva de metástases de tumores primários provenientes de outros sítios, estes anticorpos também foram testados em um modelo de dor de câncer ósseo induzida por carcinoma de mama (mamário). Os tumores de mama e de próstata estão dentre os tumores mais comuns que apresentam metástase para osso.
[0230] Camundongos machos adultos de uma cepa de origem Balb/c foram usados em um experimento de câncer ósseo induzido por carcinoma mamário a aproximadamente 12 semanas de idade. Os experimentadores que mediram os dados produzidos deste experimento desconheciam o grupo de tratamento de animais durante todas as coleta de dados, compilação de dados, e análises de dados.
[0231] Para induzir dor de câncer ósseo, os camundongos foram anestesiados e então receberam injeção intrafemoral com 10.000 células de carcinoma mamário 4T-1. Estas células são derivadas de uma linhagem de tumor de carcinoma mamário Balb/c. Os tumores tipicamente crescem de modo agressivo neste modelo, de tal modo que os tumores são severos aproximadamente 18 dias após a implantação. Radiografias foram obtidas a dias 10, 14, e 19 após a implantação para verificar o crescimento de tumor e a destruição óssea. A destruição óssea foi pontuada em uma escala de três pontos de tal modo que 0 representou nenhuma destruição e 3 representou destruição completa do fêmur na região do tumor.
[0232] Cada animal recebeu injeções s.c. de anticorpo a 30mg/kg administradas no dia antes da implantação de células cancerosas e depois duas vezes por semana. Os animais foram pseudoaleatoriamente distribuídos para um dos três grupos de tratamento: 1) anticorpo isotípico de controle M2M180N (negativo), 2) anticorpo M1M6977N anti-GFRa3-de- camundongo, ou 3) anticorpo M1M6986N anti-GFRa3-de-camundongo. M1M6986N bloqueia a interação de artemina com GFRa3, e é por causa disso considerado um bloqueador “direto” da ação de artemina. Em contraste, M1M6977N inibe a ação de artemina mediante o complexo GFRa3/RET, e é por conseguinte considerado um bloqueador “indireto”.
[0233] As respostas nociceptivas para o tumor ósseo foram medidas com o uso do teste de Frey Hair para alodinia mecânica (tátil) evocada, do teste de suportação dinâmica de peso (DWB) para a disposição para suportar peso sobre um membro, e do comportamento de guarda. Os resultados do teste de von Frey são expressos como gramas de pressão necessários para a retirada da pata. Os resultados de suportação de peso são expressos como peso corporal percentual posicionado sobre o membro ipsilateral. Comportamento de guarda é expresso como o tempo decorrido guardando o membro durante um período de dois minutos.
[0234] Não houve efeito significativo de tratamento com anticorpo sobre a pontuação de destruição óssea neste modelo, sugerindo que o tratamento com anticorpo não teve influência sobre a severidade do próprio câncer ósseo.
[0235] Houve um decréscimo estatisticamente significativo em alodinia tátil com o tratamento com anticorpo anti-GFRa3 após o carcinoma (F(2, 25)=8,626, p=0,001, Figura 5).
[0236] Não houve efeitos totais estatisticamente significativos de anticorpos anti-GFRa3 sobre a suportação dinâmica de peso sobre o membro ipsilateral, embora o efeito total do tratamento tenha alcançado uma tendência estatística e M1M6977N alcançou eficácia significativa em relação à comparação post hoc a 11 dias (A), mas não a 18 dias (B), após a implantação de osso com células de carcinoma (F(2,25) dia 1 1 = 2,939, p=0,071, Figura 6A; F(2,25) dia 18 = 0,149, p=,862, Figura 6B).
[0237] Os anticorpos anti-GFRa3 significativamente reduziram a guarda de membro após a implantação de câncer ósseo neste modelo (F(2,25) = 4,222, p=0,026, Figura 7).
[0238] O tratamento com anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo significativamente reduziu os comportamentos nociceptivos neste modelo de dor de câncer ósseo conforme medido pela avaliação de guarda e do teste de von Frey de alodinia tátil. Em adição, houve evidência de eficácia do anticorpo REGNI967 na diferença de suportação de peso no primeiro instante de tempo. As pontuações de destruição óssea não foram diferentes em grupos que receberam anticorpos anti-GFRa3-de-camundongo, sugerindo que as diferenças em medições relacionadas com dor não puderam ser explicadas pelas diferenças em severidade de câncer. Portanto, nossos dados sugerem que os anticorpos neutralizadores contra GFRa3 puderam ser eficazes contra dor de câncer ósseo neste modelo de dor de câncer ósseo metastásico.
[0239] Camundongos adultos machos de uma cepa de origem C57B16 foram usados no experimento de DMM iniciando a aproximadamente 12 semanas de idade. Os experimentadores que mediram os dados produzidos deste experimento desconheciam o grupo de tratamento de animais durante todas as coleta de dados, compilação de dados, e análises de dados.
[0240] No modelo de DMM, o menisco medial de um joelho é desestabilizado e é permitido que o animal desenvolva a doença durante 16 semanas. Durante o período de 16 semanas, os animais desenvolvem alodinia tátil e aumentos no volume ósseo e no teor de mineral ósseo no joelho lesionado que se parece com osteoartrite precoce de humano. Alodinia tátil foi verificada em animais pelo teste de von Frey durante 16 semanas antes do início do tratamento com anticorpo.
[0241] Cada animal recebeu injeções s.c. de anticorpo a 30mg/kg administradas semanalmente durante 16 semanas após a cirurgia de DMM. Os animais foram pseudoaleatoriamente distribuídos em um dos três grupos de tratamento: 1) anticorpo isotípico de controle M2M180N (negativo), 2) anticorpo M1M6977N anti-GFRa3-de-camundongo, ou 3) anticorpo M1M6986N anti-GFRa3-de-camundongo. M1M6986N bloqueia a interação de artemina com GFRa3, e é por causa disso considerado um bloqueador “direto” da ação de artemina. Em contraste, M1M6977N inibe a ação de artemina mediante o complexo GFR«3/RET, e é por conseguinte considerado um bloqueador “indireto”.
[0242] Repostas nociceptivas à patologia de joelho foram medidas com o uso do teste de Frey Hair para alodinia mecânica (tátil) evocada.
[0243] Houve um decréscimo estatisticamente significativo em alodinia tátil com o tratamento com anticorpo anti-GFRa3 após DMM (F(2, 27)=21,68, p=0,0001, Figura 8).
[0244] O tratamento com anticorpos de camundongo anti-GFRa3 teve efeito estatisticamente significativo sobre alodinia tátil de tal modo que os grupos tratados com os dois anticorpos anti-GFRa3 consistentemente mostraram menos alodinia que o controle isotípico começando 14 dias após o início do tratamento semanal. Estes dados sugerem a possibilidade de que os anticorpos anti-GFRa3 serão eficazes contra dor osteoartrítica crônica de humano.
[0245] Um ensaio de competição cruzada foi realizado para avaliar a capacidade dos anticorpos para competirem uns com os outros pela ligação a GFRa3 de humano com o uso de um biossensor Octet RED384 (Fortebio Inc.). O experimento inteiro foi realizado a 25°C com taxa de fluxo de 1.000 rpm em tampão Octet HBST (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,05% v/v, BSA 0,lmg/mL). Para avaliar se os 2 anticorpos seriam capazes de competir um com o outro pela ligação aos seus respectivos epítopos em GFRa3 recombinante biotinilada de humano expressada com etiqueta myc-myc-hexa-histidina carboxi-terminal (biotina- hGFRa3-mmH; SEQ ID:370), cerca de ~l,2nM de biotina-hGFRa3-mmH foram primeiro capturados sobre pontas de sensor Octec revestidas com estreptavidina (Fortebio Inc, n° 18-5019) por submersão das pontas durante 1 minuto em uma solução a 10µg/mL de biotina-hGFRa3-mmH. As pontas de sensor revestidas com antígeno foram então deixadas posicionadas dentro de cavidades contendo solução a 25µg/mL de um primeiro anticorpo monoclonal anti-GFRa3 durante 4 minutos para saturar a superfície de biotina-hGFRa3- mmH. As pontas do sensor foram então subsequentemente deixadas imersas em cavidades contendo solução a 25µg/mL de um segundo anticorpo monoclonal anti-GFRa3. As pontas do sensor foram lavadas no tampão Octet HBST entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante o curso do experimento e a resposta de ligação no término de cada etapa foi registrada conforme mostrado na Figura 9. A resposta de ligação de mAb-2 à biotina-hGFRa3-mmH pré-complexada com o primeiro anticorpo foi comparada e foi determinado comportamento competitivo/não competitivo de anticorpos monoclonais diferentes anti- GFRa3.
[0246] Conforme mostrado na Figura 9, os retângulos cinzas escuros com dígitos pretos representam a resposta de ligação para autocompetição. Anticorpos que competem em ambas as direções, independentemente da ordem de ligação são representados com retângulos pretos e dígitos brancos. Competição inexistente entre os anticorpos que sugere epítopo de ligação diferente é representada como retângulo branco com dígito preto.
[0247] Nove anticorpos (H4H2236N3, H4H2342P, H4H2295S, H4H2294S, H4H2291S, H4H2357S, H4H2355S, H4H2296S, e H4H2243N2) competem bidirecionalmente uns com os outros pela ligação à biotina- hGFRa3-mmH. Oito dos 9 anticorpos (H4H2236N3, H4H2342P, H4H2295S, H4H2294S, H4H2291S, H4H2357S, H4H2355S, e H4H2296S) não competem com nenhum outro anticorpo anti-GFRa3 testado, enquanto que H4H2243N2 também compete bidirecionalmente com dois anticorpos anti- GFRa3 adicionais testados (H4H2212N e H4H2352S). H4H2212N e H4H2352S competem bidirecionalmente um com o outro e H4H2243N2 pela ligação à biotina-hGFRa3-mmH, mas embora H4H2212N não compita com nenhuns outros anticorpos anti-GFRa3 testados, H4H2352S também compete bidirecionalmente com um anticorpo anti-GFRa3 adicional testado (H4H2292S). Um anticorpo anti-GFRa3 testado, H4H2350P, não compete com nenhuns dos anticorpos anti-GFRa3 testados pela ligação à biotina- hGFRa3-mmH.
Claims (30)
1. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente a GFRa3 de humano, caracterizadopelo fato de que o anticorpo compreende as três CDRs da cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, e HCDR3) e três CDRs da cadeia leve (LCDR1, LCDR2, e LCDR3) contidas em um par de sequências de aminoácidos HCVR/LCVR selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 146/154, 18/26, 50/58, 114/122, 210/218, e 290/298, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno não se liga a GFRa3 de camundongo.
2. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é selecionado dentre o grupo consistindo em um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano.
3. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo não reage cruzadamente com GFRa1 de humano ou GFRa2 de humano.
4. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo demonstra a capacidade para bloquear cerca de 50-95% da ligação de GFRa3 de humano ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 40 pM a cerca de 750 pM.
5. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento de ligação a antígeno bloqueia cerca de 75-100% da ligação de GFRa3 de humano ao seu ligante, artemina, com um valor de IC50 na faixa de cerca de 400 pM a cerca de 15 nM.
6. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento de ligação a antígeno bloqueia ou inibe a ativação de RET de humano dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 300 pM a cerca de 5 nM.
7. Anticorpo isolado monoclonal ou um seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o seu fragmento de ligação a antígeno bloqueia ou inibe a ativação de RET de macaco cinomolgo dependente de artemina com uma IC50 na faixa de cerca de 0,7 nM a cerca de 2,5 nM.
8. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, e LCDR3 selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 148/150/152/156/156/158/160, 20/22/24/28/30/32, 52/54/56/60/62/64, 116/118/120/124/126/128, 212/214/216/220/222/224, e 292/294/296/300/302/304.
9. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCDR1 com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 148, uma HCDR2 com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 150, uma HCDR3 com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 152, uma LCDR1 com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 156, uma LCDR2 com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 158 e uma LCDR3 com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 160.
10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um par de sequências de aminoácido de HCVR/LCVR selecionado dentre o grupo consistindo em SEQ ID NOs: 146/154, 18/26, 50/58, 114/122, 210/218, e 290/298.
11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma HCVR com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 146 e uma LCVR com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 154.
12. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que compreende: uma primeira sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 145 e uma segunda sequência de nucleotídeo SEQ ID NO:153, ou uma primeira sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 17 e uma segunda sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 25, ou uma primeira sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 49 e uma segunda sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 57, ou uma primeira sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 113 e uma segunda sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 121, ou uma primeira sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 209 e uma segunda sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 217, ou uma primeira sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 289 e uma segunda sequência de nucleotídeo SEQ ID NO: 297; em que a molécula de ácido nucleico isolada codifica o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-11.
13. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico conforme definida na reivindicação 12.
14. Método para produzir o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno, o anticorpo sendo anti-GFRa3 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de introduzir o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 13 em uma célula hospedeira isolada, crescer a célula sob condições que permitem a produção do anticorpo ou de seu fragmento de ligação a antígeno, e recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno assim produzido.
15. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Uso do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é na manufatura de um medicamento para tratar uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou dor associada com a condição ou doença relacionada com GFRa3, em um paciente que necessita do mesmo, em que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é evitada, melhorada, ou reduzida em severidade ou frequência de ocorrência, ou a dor associada com a condição ou doença é evitada, melhorada, ou reduzida em severidade ou frequência de ocorrência.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é selecionada dentre o grupo consistindo em dor aguda, dor crônica, dor neuropática, dor inflamatória, uma síndrome de dor funcional, artrite reumatóide, pancreatite, osteoartrite, enxaqueca, cefaleias em salvas, neuralgia trigeminal, neuralgia herpética, neuralgias generalizadas, transtornos neurodegenerativos, transtornos de movimento, transtornos neuroendócrinos, ataxia, dor visceral, gota, neuralgia pós-herpética, neuropatia diabética, ciática, dor lombar, cefaleia ou dor de pescoço, dor severa ou intratável, dor incidental, dor pós- cirúrgica, eritromelalgia hereditária, dor dentária, rinite, dor de câncer, síndrome da dor regional complexa (CRPS), doença inflamatória intestinal e transtornos da bexiga.
18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que é para tratar uma síndrome de dor funcional que é selecionada dentre o grupo consistindo em dor lombar inferior crônica, síndrome do intestino irritável (IBS), fibromialgia (FM), síndrome da fadiga crônica, dor abdominal, transtorno da articulação temporomandibular (TMJD), síndrome da bexiga dolorosa (cistite intersticial), transtornos/síndromes gastrointestinais funcionais, síndrome da dor torácica funcional, enxaquecas e cefaleias tensionais, síndrome da dor pélvica crônica, síndrome prostática dolorosa (prostatite crônica), síndrome da sensibilidade química múltipla e síndrome da Guerra do Golfo.
19. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para tratar dor de câncer que é associada com um câncer selecionadas dentre o grupo consistindo em câncer endometrial, câncer da próstata, câncer da mama, câncer cervical, câncer hepático, câncer pancreático, câncer do cólon, câncer do estômago, câncer uterino, câncer ovariano, câncer renal, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer cerebral, uma leucemia, um linfoma, câncer ósseo e dor associada com metástase de um câncer.
20. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para tratar dor associada com osteoartrite.
21. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para tratar enxaqueca.
22. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno é administrado ao paciente em combinação com um segundo agente terapêutico.
23. Uso de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado dentre o grupo consistindo em um opioide, um inibidor de COX-2, um anestésico local, um modulador de NMDA, um agonista de receptor canabinoide, um modulador da família P2X, um antagonista de VR1, um antagonista de substância P, um segundo antagonista de GFRa3 , um antagonista de citocina ou de receptor de citocina, um inibidor de fator de crescimento de nervo (NGF) (um inibidor molecular pequeno ou um anticorpo anti-NGF), um inibidor de BDNF, TrkA, TrkB ou p75, aspirina, um NSAID, um esteroide, morfina, um inibidor seletivo da recaptação de serotonina (SSRI), um inibidor seletivo da recaptação de serotonina e norepinefrina (SNRI), um tricíclico, um inibidor de um canal de sódio ativado por voltagem (Nav), um inibidor de canal de cálcio, um inibidor de canal de potássio, um fator de necrose tumoral (TNF) ou inibidor de receptor de TNF, um inibidor de TWEAK (indutor FRACO de apoptose relacionado com TNF), um inibidor de RET, um inibidor de um ligante da família GDNF, um inibidor de GFRa1, GFRa2 ou GFRa4, um inibidor de um canal de íon sensível a ácido (ASIC1 ou ASIC3), um anticonvulsivo (gabapentina ou pregabalina), um inibidor de um receptor de proquineticina (PROK1 e PROK2), um inibidor de caspase, um inibidor de p38, um inibidor de IKK1/2, CTLA-4Ig e um corticosteroide.
24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o segundo antagonista de GFRa3 é uma molécula orgânica pequena, um antagonista de polipeptídeo, um segundo anticorpo específico para GFRa3, um siRNA específico para GFRa3 ou uma molécula de anti- senso específica para GFRa3.
25. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o antagonista de citocina ou de receptor de citocina é um antagonista de interleucina-1 (IL-1), um antagonista de IL-6, ou um antagonista de IL-8.
26. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e um segundo agente terapêutico conforme definido na reivindicação 23 e um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
27. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 15 ou 26, caracterizado (a) pelo fato de ser para uso no tratamento de uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou dor associada com a condição ou doença relacionada com GFRa3, em que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é evitada, melhorada, ou reduzida em severidade ou frequência de ocorrência, ou a dor associada com a condição ou doença é evitada, melhorada, ou reduzida em severidade ou frequência de ocorrência.
28. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno para uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é selecionada dentre o grupo consistindo em dor aguda, dor crônica, dor neuropática, dor inflamatória, uma síndrome de dor funcional, artrite reumatóride, pancreatite, osteoartrite, enxaqueca, cefaleias em salvas, neuralgia trigeminal, neuralgia herpética, neuralgias generalizadas, transtornos neurodegenerativos, transtornos de movimento, transtornos neuroendócrinos, ataxia, dor visceral, gout, neuralgia pós-herpética, neuropatia diabética, ciática, dor lombar, cefaleia ou dor de pescoço, dor severa ou intratável, dor incidental, dor pós-cirúrgica, eritromelalgia hereditária, dor dentária, rinite, dor de câncer, síndrome da dor regional complexa (CRPS), doença inflamatória intestinal e transtornos da bexiga.
29. Uso da composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 15 ou 26, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar uma condição ou doença relacionada com GFRa3, ou dor associada com a condição ou doença relacionada com GFRa3, em que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é evitada, melhorada, ou reduzida em severidade ou frequência de ocorrência, ou a dor associada com a condição ou doença é evitada, melhorada, ou reduzida em severidade ou frequência de ocorrência.
30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a condição ou doença relacionada com GFRa3 é selecionada dentre o grupo consistindo em dor aguda, dor crônica, dor neuropática, dor inflamatória, uma síndrome de dor funcional, artrite reumatóide, pancreatite, osteoartrite, enxaqueca, cefaleias em salvas, neuralgia trigeminal, neuralgia herpética, neuralgias generalizadas, transtornos neurodegenerativos, transtornos de movimento, transtornos neuroendócrinos, ataxia, dor visceral, gota, neuralgia pós-herpética, neuropatia diabética, ciática, dor lombar, cefaleia ou dor de pescoço, dor severa ou intratável, dor incidental, dor pós- cirúrgica, eritromelalgia hereditária, dor dentária, rinite, dor de câncer, síndrome da dor regional complexa (CRPS), doença inflamatória intestinal e transtornos da bexiga.
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