BR112012001984B1

BR112012001984B1 - anticorpos humanos com alta afinidade para angiopoietina-2 humana, uso dos mesmos e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112012001984B1
Application number: BR112012001984-8A
Authority: BR
Inventors: Gavin Thurston; Christopher Daly
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2020-10-27
Also published as: TWI527591B; TN2012000040A1; US10875911B2; HRP20161043T1; DK2459592T3; UY32812A; AR077333A1; US8987420B2; HK1166806A1; JO3182B1; NI201200014A; SI2459592T1; MX2012001094A; IL217680A; MA33534B1; EP2459592B1; CN104258390B; BR112012001984B8; CL2012000229A1; CN102549015A

Abstract

ANTICORPOS HUMANOS COM ALTA AFINIDADE PARA ANGIOPOIETINA-2 HUMANA. A presente invenção provê anticorpos que se ligam à agiopoeitina-2 (Ang-2) e métodos de uso dos mesmos. De acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos são anticorpos integralmente humanos que se ligam à Ang-2 humana. Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para o tratamento de doenças e distúrbios associados com uma ou mais atividades biológicas de Ang-2 incluindo angiogênese.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a anticorpos, e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que são específicos para angiopoie- tina-2 (Ang-2).

ANTECEDENTES

[0002] Angiogênese é o processo biológico através do qual novos vasos sanguíneos são formados. Angiogênese aberrante está associada com várias condições de doença incluindo, por exemplo, retinopa- tias prol iterativas, artrite reumatoide e psoríase. Ainda, é bem estabelecido que angiogênese é crítica para crescimento e manutenção de tumor. Angiopoietina-2 (Ang-2) é um ligante para o receptor Tie-2 (Tie-2) e foi mostrada desempenhar um papel em angiogênese. Ang-2 é também referida como ligante de Tie-2. (U.S. 5.643.755; Yancopoulos e outros, 2000, Nature407:242-248).

[0003] Anticorpos e outros inibidores de peptídeo que se ligam à Ang-2 são mencionados nas U.S. 6.166,185; 7.521.053; 7.205.275; 2006/0018909 e 2006/0246071. Há uma necessidade na técnica de novos agentes de modulação de Ang-2, incluindo anticorpos para Ang-2, que possam ser usados para tratar doenças e condições causadas por ou exacerbadas por angiogênese.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] A presente invenção provê anticorpos humanos que se ligam à Ang-2 humana. Os presente inventores, em vista de várias linhas de evidência e investigação, reconheceram a necessidade de inibidores de Ang- 2 que não se liguem a ou antagonizem a molécula relacionada Ang-1. Por exemplo, estudos anteriores demonstraram ou sugeriram um papel benéfico para Ang-1 em hemóstase (vide, por exemplo, Li e outros, 2001, Thrombosis and Haemostasis,85:191-374) e na produção da vasculature adulta contra vazamento de plasma (vide, por exemplo, Thurston e outros, 2000, Nature Medicine 6:460-463; Thurston e outros, 1999, Science 286:2511-2514). Desta maneira, os presentes inventores reconheceram que, em certas situações terapêuticas antiangiogênicas, pode ser benéfico preservar a atividade de Ang-1. Desta maneira, a presente invenção provê anticorpos que se ligam especificamente à Ang-2, mas não se ligam substancialmente à Ang-1. A presente invenção também inclui anticorpos que bloqueiam a interação entre Ang-2 e seu receptor Tie-2, mas não bloqueiam a interação entre Ang-1 e Tie-2. Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para inibição de atividades de promoção de angiogênese de Ang-2 e para o tratamento de doenças e distúrbios causados por ou relacionados com o processo de angiogênese.

[0005] Os anticorpos da invenção podem ser de comprimento integral (por exemplo, um anticorpo lgG1 ou lgG4) ou podem compreender apenas uma porção de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab’)2 ou scFv) e podem ser modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, eliminar funções efetoras residuais.

[0006] Em uma modalidade, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCRV) tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2,18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162,166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266,282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382,386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498,502, 506, 514 e 516 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de ligação a antígeno de um anticorpo compreende uma HCRV tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 18, 42, 66, 162, 210, 266 e 434.

[0007] Em uma modalidade, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154,164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264,274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380,384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490,500 e 504 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 20, 44, 68, 164, 212, 274 e 442.

[0008] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende um par de sequência de aminoácido de HCVR ou LCVR (HCVR/LCVR) selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120,122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178,186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236,238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288,290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346,354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404,406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456,458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500 e 502/504. Em uma mo-dalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma HCVR ou LCVR selecionada dos pares de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 e 434/442.

[0009] Em uma aspecto seguinte, a invenção provê um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio de CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488 e 512 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de CDR3 de cadeia leve (LCDR3) selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472 e 496 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[00010] Em certas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo compreende um par de sequência de aminoácido HCDR3//LCDR3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64, 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 296/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472 e 488/496. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo compreende um par de sequência de aminoácido HCDR3/LCDR3 selecionado do grupo consistindo em 8/16, 32/40, 56/64, 152/160, 200/208, 272/280 e 440/448. Exemplos não-limitantes de anticorpo anti-Angi-2 tendo esses pares de HCDR3/LCDR3 são os anticorpos chamados H1H685, H1H690, H1H691, H1H696, H1H706, H1M724 e H2M744, respectivamente.

[00011] Em uma modalidade adicional, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo ainda um domínio de HCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484 e 508 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486 e 510 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468 e 492 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470 e 494 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[00012] Certos anticorpos exemplares, não-limitantes, e fragmentos de ligação aantígeno da invenção compreendem domínios HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, respectivamente, selecionados do grupo consistindo em: (i) SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14 e16 (por exemplo, H1H685); (ii) SEQ ID NO: 28, 30, 32, 36, 38 e 40 (por exemplo, H1H690); (iii) SEQ ID NO: 52, 54, 56, 60, 62 e 64 (por exemplo,H1H691); (iv) SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 e 160 (por exemplo, H1H696); (v) SEQ ID NO: 196, 198, 200, 204, 206 e 208 (por exemplo, H1H706); (vi) SEQ ID NO: 268, 270, 272, 276, 278 e 280 (por exemplo, H1M724); e (vii) SEQ ID NO: 436, 438, 440, 444, 446 e 448 (por exemplo, H2M744).

[00013] Em uma modalidade relacionada, a invenção compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente à Ang-2, em que o anticorpo ou fragmento compreende os domínios de CDR de cadeias pesada e leve (isto é, CDR1, CDR2 e CDR3) contidos dentro das sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82,90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144,146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202,210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260,262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312,314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370,378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428,430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480,482/490, 498/500 e 502/504. Em uma modalidade, o anticorpo ou frag-mento do mesmo compreende as sequências de CDR contidas dentro de HCVR e LCVR selecionadas dos pares de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18/20, 42/44, 66/68, 162/164, 210/212, 266/274 e 434/442.

[00014] Em outro aspecto, a invenção provê moléculas de ácido nu- cleico codificando anticorpos anti-Ang-2 ou fragmentos dos mesmos. Vetores de expressão recombinantes carregando os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiro nas quais tais vetores foram introduzidos, são também compreendidos pela invenção, bem como os méto- dos de produção dos anticorpos através de cultura das células hospedeiro sob condições que permitem a produção dos anticorpos e recuperação dos anticorpos produzidos.

[00015] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo uma HCRV codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, 17, 21,25, 41,45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137,141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241,257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357,361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473,477, 481,497, 501,505, 513 e 515 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 17, 41,65, 161, 209, 265 e 433.

[00016] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33,43,47, 57, 67,71,81,91,95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249,259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359,369, 379, 383, 393, 403, 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475,479, 489, 499 e 503 ou uma sequência substancialmente idêntica à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 19, 43, 67, 163, 211,273 e 441.

[00017] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, 31,55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391,415, 439, 463, 487 e 511 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma; e um domínio de LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351,375, 399, 423, 447, 471 e 495 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende sequências de HCDR3 e LCDR3 codificadas pelos pares de sequência de ácido nucleico selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7/15, 31/39, 55/63, 151/159, 199/207, 271/279 e 439/447.

[00018] Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende ainda: um domínio de HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291,315, 339, 363, 387, 411,435, 459, 483 e 507 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma; um domínio de HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485 e 509 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma; um domínio de LCDR1 codificado por uma sequência de nucle- otídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11,35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467 e 491 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma; e um domínio de LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421,445, 469 e 493 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a mesma.

[00019] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende as sequências de CDR de cadeias pesada e leve codificadas pelas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO:17 e 19; SEQ ID NO:41 e43; SEQ ID NO:65e67; SEQ ID NO:161 e 163; SEQ ID NO:209 e 211; SEQ ID NO:265 e 273; ou SEQ ID NO:433 e 441.

[00020] A invenção compreende anticorpos anti-Ang-2 tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil. Por exemplo, a presente invenção compreende versões modificadas de qualquer anticorpo mostrado aqui em que a versão modificada não tem uma porção fucose presente na cadeia de oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar a função de citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) (vide Shield e outros (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação de galacto- silação pode ser feita a fim de modificar a citotoxidez dependente de complemento (CDC) (Complement Dependent Cytotoxicity).

[00021] Em outro aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento do mesmo que se liga especificamente à Ang-2 e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção refere-se a uma composição que é uma combinação de um inibidor de Ang-2 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o inibidor de Ang-2 é um anticorpo ou fragmento do mesmo. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um inibidor de Ang-2. Agentes exemplares que podem ser vantajosamente combinados com um inibidor de Ang-2 incluem, sem limitação, qualquer agente que iniba ou reduza an- giogênese, outros agentes terapêuticos para câncer, agentes anti-infla- matórios, inibidores de citocina, inibidores de fator de crescimento, fatores anti-hematopoiéticos, fármacos anti-inflamatórios não-hesteroiadis (NSAIDs) (Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs),agentes antivirais e antibióticos.

[00022] Em ainda outro aspecto, a invenção provê métodos para inibição da atividade de Ang-2 usando o anticorpo anti-Ang-2 ou porção de ligação de antígeno do anticorpo da invenção, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção. O distúrbio a ser tratado é qualquer doença ou condição que é aperfeiçoada, melhorada, inibida ou prevenida através da remoção, inibição ou redução de atividade de Ang-2. Preferivelmente, o anticorpo angi-Ang-2 ou fragmento de anticorpo da invenção é útil para tratar qualquer doença ou condição causada por, associada com ou perpetuada pelo processo de angiogênese. Em certas modalidades da invenção, os anticorpos anti-Ang-2 ou porções de ligação de antígeno dos mesmos são úteis para o tratamento de câncer. No contexto de terapias de câncer, os anticorpos anti-Ang-2 da invenção ou suas porções de ligação de antígeno podem ser administrados sozinhas ou em combinação com outros anticorpos terapêuticos anticâncer, agentes quimioterapêuticos e/ou terapia de radiação. Em outras modalidades da presente invenção, os anticorpos anti-Ang-2 ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos são úteis para o tratamento de um ou mais distúrbios do olho, por exemplo, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, etc, e/ou uma ou mais doenças inflamatórias ou infecciosas.

[00023] Outras modalidades se tornarão aparentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00024] A figura 1 é um alinhamento dos pelo menos 88 aminoácidos C-terminais de Ang-2 humana (resíduos 409 a 496 de SEQ ID NO:518) com a sequência de aminoácido correspondente de Ang-1 humana (SEQ ID NO:531). Os resíduos que diferem entre hAng-1 e hAng-2 são indicados pelo texto branco e pela sombra preta. Asteriscos (*) indicam os aminoácidos de hAng-2 que foram mostrados interagir com Tie-2 através de análise de estrutura de cristal. Vide Barton e outros, Nat. Struct. Mol. Biol.73:524-532 (2006). Triângulos (A) indicam as posições de aminoácido interagindo com Tie-2 que diferem entre hAng-2 e hAng-1.

[00025] A figura 2 (Painéis A-C) mostra os resultados de Western blotsque ilustram o grau para o qual moléculas de ligação à Ang-2 inibem, ou falham em inibir, fosforilação de Tie-2 induzida por Ang-1.

[00026] A figura 3 é um sumário do experimento de ligação mutante por ponto de Ang-2F-mFc do Exemplo 13 mostrando as mudanças de aminoácido que resultaram em redução maior do que cinco vezes em Ti/2de dissociação (mostrado por círculos sólidos •) com relação ao tipo selvagem para os vários anticorpos e pepticorpos testados.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00027] Antes da presente invenção ser descrita, deve ser compreendido que a presente invenção não é limitada a métodos e condições experimentais particulares descritos, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Deve ser também compreendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrição de modalidades particulares apenas e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações apensas.

[00028] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme geralmente compreendido por um versado comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Conforme aqui usado, o termo "cerca de", quando usado com referência a um valor numérico mencionado particular, significa que o valor pode variar do valor mencionado em não mais do que 1%. Por exemplo, conforme aqui usado, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre eles (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc).

[00029] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes a esses descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos agora.

Definições

[00030] Conforme aqui usado, o termo "angiopoietina-2" ou "Ang-2", a menos que especificado como sendo de uma espécie não-humana (por exemplo, "Ang-2 de camundongo", "Ang-2 de macaco", etc), refere- se a uma Ang-2 humana ou um fragmento biologicamente ativo da mesma (por exemplo, um fragmento da proteína Ang-2 que é capaz de induzir angiogênese in vitroou in vivo). Ang-2 humana é codificada pela sequência de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO:517 e tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:518. As sequências de aminoácido de proteínas Ang-2 de camundongo e macaco estão disponíveis do banco de dados de sequência de proteína NCBI sob Nos. de Acesso NPJD31452 e BAE89705.1, respectivamente.

[00031] O termo "angiopoietina-1" ou "Ang-1", a menos que especifi cado como sendo de uma espécie não-humana (por exemplo, "Ang-1 de camundongo", "Ang-1 de macaco, etc), refere-se a uma Ang-1 humana ou um fragmento biologicamente ativo da mesma. Ang-1 humana tem a sequência de aminoácido conforme mostrado no banco de dados de sequência de proteína NCBI sob o No. de Acesso AAB50557. O termo "Tie-2" (também referido na técnica como "TEK") a menos que especificado como sendo de uma espécie não-humana (por exemplo, "Tie-2 de camundongo", "Tie-2 de macaco", etc), refere-se a um Tie-2 humano ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo. Tie-2 humano tem a sequência de aminoácido conforme mostrado no banco de dados de sequência de proteína NCBI sob No. de Acesso AAA61130.

[00032] O termo "anticorpo" conforme usado aqui pretende se referir a moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de poli- peptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interco- nectadas por ligações dissulfeto, bem como seus multímeros (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1 , CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve com-preende um domínio (Ci_1). As regiões VH e VL podem ser subdivididas mais em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (Complementarity Determining Regions),interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR) (Framework Regions).Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em modalidades diferentes da invenção, as FRs do anti-corpo anti-Ang-2 (ou sua porção de ligação de antígeno) podem ser idênticas às sequências de linha germinativa humana ou podem ser na-turalmente ou artificialmente modificadas. Uma sequência de consenso de aminoácido pode ser definida com base em uma análise lado-a-lado de duas ou mais CDRs.

[00033] O termo "anticorpo", conforme aqui usado, também inclui fragmentos de ligação de antígeno de moléculas de anticorpo inteiras. Os termos "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo, e similar, conforme aqui usado, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente engenheirado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo inteiras usando quaisquer técnicas padrão adequadas tais como técnicas de digestão proteolítica ou de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e a expressão de DNA codificando domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpo. Tal DNA é conhecido e/ou é prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.

[00034] Exemplos não-limitantes de fragmentos de ligação de antí-geno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2j (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR)). Outras moléculas engenheiradas, tais como diacorpos, triacorpos, tetracorpos e minicorpos, são também compreendidos dentro da expressão "fragmento de ligação de antígeno", conforme usado aqui.

[00035] Um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo vai compreender tipicamente pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e vai geralmente compreender pelo menos uma CDR que é adjacente a ou em estrutura com uma ou mais sequências de estrutura principal. Em fragmentos de ligação de antígeno tendo um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem ser situados um com relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL OU VL-VL. Alterna-tivamente, o fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH OU VL monomérico.

[00036] Em certas modalidades, o fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalen- temente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares, não-limitantes, de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (Ü) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (V) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1 ; (ix) VL-CH2; (X) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1- CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ou diretamente ligados uns aos outros ou podem ser ligados por uma região de impedimento ou ligante integral ou parcial. Uma região de impedimento pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo única. Além disso, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multí- mero) de qualquer uma das configurações de domínios variável e constante listadas acima em associação não-covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínio VH OU Vimonomérico (por exemplo, por liga- ção(ões) dissulfeto).

[00037] Como com moléculas de anticorpo integrais, fragmentos de ligação de antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação de antígeno mul- tiespecífico de um anticorpo vai tipicamente compreender pelo menos dois domínios variáveis diferentes, em que cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epí- topo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo mul- tiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecífico exemplares revelados aqui, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis no campo.

[00038] A região constante de um anticorpo é importante na habilidade de um anticorpo em fixar complemento e mediar citotoxidez dependente de célula. Desta maneira, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado com base em se é desejável que o anticorpo faça mediação de citotoxidez.

[00039] O termo "anticorpo humano", conforme aqui usado, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de se- quências de imunoglobulina de linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas através de mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitroou através de mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme aqui usado, não pretende incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram inseridas em sequências de estrutura humana.

[00040] O termo "anticorpo recombinante", conforme aqui usado, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante trans- fectado em uma célula hospedeiro (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatória, recombinante, (descrito mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes da imunoglobulina humana (vide, por exemplo, Taylor e outros (1992) Nucl. Acids Res.20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de outros meios que envolvem união de sequências de gene da imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombi-nantes são submetidos à mutagênese in vitro(ou, quando um animal transgênico para sequências lg humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e então as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências VH e VL de linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germina- tiva de anticorpo humana in vivo.

[00041] Anticorpos humanos podem existir em duas formas que estão associadas com heterogeneidade de dobra. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende um construto de quatro cadeias estáveis de aproximadamente 150-160 kDa em que os dímeros são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto de cadeia pesada inter- cadeia. Em uma segunda forma, os dímeros não são ligados através de ligações dissulfeto intercadeia e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada composta de cadeias leve e pesada acopladas (metade anticorpo). Essas formas têm sido extremamente difíceis de separar, mesmo após purificação por afinidade.

[00042] A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isotipos de IgG é devido a, mas não limitado a, diferenças estruturais associadas com o isotipo da região de dobra do anticorpo. Uma substituição de aminoácido única na região de dobra da dobra de lgG4 humana pode reduzir significantemente o aparecimento da segunda forma (Angal e outros (1993) Molecular Immunology30:105) para níveis tipicamente observados usando uma dobra de lgG1 humana. A presente invenção compreende anticorpos tendo uma ou mais mutações na dobra, região CHh ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, em produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[00043] Um "anticorpo isolado", conforme aqui usado, pretende se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à Ang-2 humana ou um fragmento de Ang-2 humana é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos outros que não Ang-2 humana). O termo "se liga especificamente a", ou similar, significa que um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Ligação específica pode ser caracterizada por uma KD de cerca de 1x10'8 M ou menos. Métodos para determinação de se duas moléculas se ligam especificamente são bem conhecidos no campo e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plasmon de superfície e similar. Um anticorpo isolado que se liga especificamente à Ang-2 humana, no entanto, tem reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de Ang-2 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou agentes químicos.

[00044] Um anticorpo de "neutralização" ou "bloqueio", conforme aqui usado, pretende se referir a um anticorpo cuja ligação à Ang-2 bloqueia a interação entre Ang-2 e seu receptor (Tie-2) e/ou resulta em inibição de pelo menos uma função biológica de Ang-2. A inibição causada por um anticorpo de neutralização ou bloqueio de Ang-2 não precisa ser completa contanto que ela seja detectável usando um ensaio apropriado. Ensaios exemplares para detecção de inibição de Ang-2 são descritos em outro lugar aqui.

[00045] Os anticorpos anti-Ang-2 integralmente humanos revelados aqui podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido na estrutura e/ou regiões de CDR dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve comparado com as sequências de linha germinativa correspondentes. Tais mutações podem ser prontamente averiguadas comparando as sequências de aminoácido reveladas aqui com sequências de linha germinativa disponíveis de, por exemplo, bancos de dados de sequência de anticorpo públicos. A presente invenção inclui anticorpos, e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácido reveladas aqui, em que um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais estrutura principal e/ou regiões de CDR são retromutados para o(s) resíduo(s) de linha germinativa correspondente(s) ou para uma substituição de aminoácido conservativa (natural ou não-natural) do(s) residuo(s) de linha germinativa correspondente (tais mudanças de sequência são referidas aqui como "retromutações de linha germinativa"). Um versado comum na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeias pesada e leve reveladas aqui, pode facilmente produzir vários anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que compreendem uma ou mais retromutações de linha germinativa individuais ou suas combinações. Em certas modalidades, todos dos resíduos de estrutura principal e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são retromutados para a sequência de linha germinativa. Em outras modalidades, apenas certos resíduos são retromutados para a sequência de linha germinativa, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados dentro dos 8 primeiros aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Ainda, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais retromutações de linha germinativa dentro das regiões de estrutura principal e/ou CDR, isto é, em que certos resíduos individuais são retromutados para a sequência de linha germinativa enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência de linha germinativa são mantidos. Uma vez obtidos, anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que contêm uma ou mais retromutações de linha germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedades desejadas tais como especificidade de ligação, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas aperfeiçoadas ou aumentadas (conforme for o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno obtidos desta maneira geral são com-preendidos na presente invenção.

[00046] A presente invenção também inclui anticorpos anti-Ang-2 compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR reveladas aqui tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-Ang-2 tendo sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc, substituições de aminoácido conservativas com relação a qualquer uma das sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR reveladas aqui. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma HCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 com 8 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma HCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 com 6 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma HCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 com 4 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma HCVR tendo a sequência de ami-noácido de SEQ ID NO: 18 com 2 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma LCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20 com 8 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma LCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20 com 6 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma LCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:29 com 4 ou menos substituições de aminoácido conservativas. Em outra modalidade, o anticorpo compreendendo uma LCVR tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NQ:20 com 2 ou menos substituições de aminoácido conservativas.

[00047] O termo "ressonância de plasmon de superfície", conforme aqui usado, refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações em tempo real através da detecção de alterações em concentrações de proteína com uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIAcore® (Biacore Life Sciences divisão da GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[00048] O termo "KD", conforme aqui usado, pretende se referir à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo-antí- geno particular.

[00049] O termo "epítopo"refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação de antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como um paratopo. Um antígeno único pode ter mais de um epítopo. Desta maneira, anticorpos diferentes podem se ligar a áreas diferentes em um antígeno e podem ter efeitos biológicos diferentes. Epítopos podem ser ou confor- macionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por ami- noácidos espacialmente justapostos de segmentos diferentes da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácido adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Em certas circunstâncias, um epítopo pode incluir porções de sacarídeos, grupos fosforila ou grupos sulfonila no antígeno.

[00050] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se referindo a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas com outro ácido nucleico (ou seu filamento complementar), há identidade de sequência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99%, das bases de nucleotídeo, conforme medido através de qualquer algoritmo de identidade de sequência bem conhecido, tal como FASTA, BLAST ou Gap, conforme discutido abaixo. Uma molé-cula de ácido nucleico tendo identidade substancial com uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um po- lipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácido ou substancialmente similar que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[00051] Conforme aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeo, quando otimamente alinhadas, tal como através do programa GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna default,compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, mais preferivelmente ainda pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, posições de resíduo que não são idênticas diferem por substituições de aminoácido conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído com outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidro- fobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não vai substancialmente mudar as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos em que duas ou mais sequências de aminoácido diferem umas das outras por substituições conservativas, a identidade de sequência percentual ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, ala- nina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais hidroxila alifáticas: serina ou treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e tripto- fano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartate e glutamate; e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoáci- dos conservativa preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e aspara- gina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 revelada em Gonnet e outros (1992) Science 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança tendo um valor não-negativo na matriz de probabilidade log PAM250.

[00052] Similaridade de sequência para polipeptídeos, que é também referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequência. Software de análise de proteína compara sequências similares usando medidas de similaridade dadas a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, software GCG contém programas tais como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros de defaultpara determinar homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem ou uma muteína da mesma. Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeo podem ser também comparadas usando FASTA usando parâmetros defaultou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) provê alinhamentos e identidade de sequência per-centual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e pesquisa (Pearson (2000), supra). Outro algoritmo preferido quando comparando uma sequência da invenção com um banco de dados compreendendo um número grande de sequência de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros default.Vide, por exemplo, Altschul e outros (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Preparação de Anticorpos Humanos

[00053] Métodos para geração de anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais integralmente humanos, são conhecidos na técnica. Quaisquer tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para fazer anticorpos humanos que se ligam especificamente à Ang-2 humana e que possuem uma ou mais características de ligação de antígeno e/ou funcionais de qualquer um dos anticorpos anti-Ang-2 exemplares revelados aqui.

[00054] Usando tecnologia VELOCIMMUNE® ou qualquer outro método para geração de anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade com Ang-2 são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto a características desejáveis incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo integralmente humano da invenção, por exemplo, lgG1 ou lgG4 do tipo selvagem ou modificada. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com uso específico, características de ligação de antígeno com alta afinidade e especificidade de alvo residem na região variável.

Bioequivalentes

[00055] Os anticorpos anti-Ang-2 e os fragmentos de anticorpo da presente invenção compreendem proteínas tendo sequências de aminoácido que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que retêm a habilidade de se ligar à Ang-2 humana. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparados com sequência de origem, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Da mesma maneira, as sequências de DNA de codificação de anticorpo anti-Ang-2 da presente invenção compreendem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparadas com a sequência revelada, mas que codificam um anticorpo anti- Ang-2 ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-Ang-2 ou fragmento de anticorpo da invenção. Exemplos de tais sequências de aminoácido e DNA variantes são discutidos acima.

[00056] Duas proteínas de ligação de antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cujas taxa e grau de absorção não mostram uma diferença significante quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, ou dose única ou dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles forem equivalentes no grau de sua absorção, mas não na sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para a obtenção de concentrações de fármaco eficazes no corpo em, por exemplo, uso crônico, e são considerados medicamente insignificantes para o produto de fármaco particular estudado.

[00057] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se não houver quaisquer diferenças clinicamente significantes em suas segurança, pureza e potência.

[00058] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalentes se um paciente puder mudar uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significante em imunogenicidade, ou eficácia menor, comparado com terapia continuada sem tal mudança.

[00059] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a antígeno são bioequivalente se elas agirem ambas através de um mecanismo ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, até o ponto que tais mecanismos forem conhecidos.

[00060] Bioequivalência pode ser demonstrada através de métodos in vivoe in vitro.Medições de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos e outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou seus metabolites é medida em sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico como uma função de tempo; (b) um teste in vitroque foi relacionado com e é razoavelmente previsivo de dados de biodisponibilidade in vivo; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função de tempo; e (d) em um teste clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[00061] Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-Ang-2 da invenção podem ser construídas através de, por exemplo, realização de várias substituições de resíduos ou sequências ou deleção de resíduos ou sequências terminais ou internos não necessários para atividade biológica. Por exemplo, resíduos cisteína não essenciais para atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir formação de pontes dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas quando da renaturação.

Características Biológicas e Terapêuticas dos Anticorpos

[00062] Em geral, os anticorpos da presente invenção se ligam à Ang-2 humana com uma KD de menos do que 100 pM, tipicamente com uma KD de menos do que 50 pM e, em certas modalidades, com uma Kode menos do que 40 pM, quando medido através de ligação a antígeno ou imobilizados em fase sólida ou em fase de solução.

[00063] Ainda, certos anticorpos anti-Ang-2 exemplares da invenção podem exibir uma ou mais das características que seguem: (1) habilidade em se ligar à Ang-2 humana, mas não à Ang-2 de camundongo; (2) habilidade em se ligar à Ang-2 humana e à Ang-2 de camundongo; (3) habilidade em se ligar à Ang-2 humana, mas não à Ang-1, -3 ou -4 humana; (4) habilidade em se ligar à Ang-2 humana, mas não à Ang-1, -3 ou -4 de camundongos; (5) habilidade em se ligar à Ang-2 humana e à Ang-1, -3 ou -4 humana; (6) habilidade em se ligar à Ang-2 humana e a Ang-2, -3 ou -4 de camundongo; (7) disponibilidade para bloquear ligação de Ang-2 humana a Tie-2 humano; (8) habilidade em bloquear ligação de Ang-2 humana a Tie-2 humano; (9) habilidade em bloquear ligação de Ang-2 humana a Tie-2 humano; (10) habilidade em bloquear ligação de Ang-2 de camundongo a Tie-2 de camundongo; (11) habilidade em bloquear ligação de Ang-1 humana a Tie-2 humano; (12) habilidade em bloquear ligação de Ang-1 humana a Tie-2 de camundongo; (13) habilidade em bloquear ligação de Ang-1 de camundongos a Tie-2 humano: (14) habilidade em bloquear ligação de Ang-1 de camundongo a Tie-2 de camundongo; (15) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-2 humana de Tie-2 humano; (16) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-2 humana de Tie-2 de camundongo; (17) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-2 de camundongo de Tie-2 humano; (18) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-2 de camundongo de Tie-2; (19) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-1 humana de Tie-2 humano; (20) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-1 humana de Tie-2 de camundongo; (21) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-1 humana de Tie-2 humano; (22) habilidade em inibir fosforilação induzida por Ang-1 de camundongo de Tie-2 de camundongos; (23) habilidade em inibir angiogênese in vivo em um modelo experimental (por exemplo, angiogênese induzida por um tampão Matrigel contendo células MCF-7 subcutaneamente implantadas em camundongos nus); e/ou (24) habilidade em inibir ou diminuir volume de tumor em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

[00064] A presente invenção também inclui anticorpos que se ligam com alta afinidade a um construto compreendendo o domínio tipo fibro- nectina de Ang-2, mas sem o domínio de hélices enroladas (coiled-coil) N-terminal de Ang-2 (tais construtos são referidos aqui como "Ang- 2FD"). Construtos de Ang-2FD exemplares incluem Ang-2FD humano (SEQ ID NO:519), Ang-2FD de camundongo (SEQ ID NO:520) e Ang- 2FD de macaco (SEQ ID NO:521). Os construtos de Ang-2FD humanos, de camundongo e macaco podem ser monoméricos ou diméricos. Construtos de Ang-2FD podem também incluir outras sequências de aminoácido não-Ang-2 tal como um domínio Fc humano ou de camundongo ligado a moléculas de Ang-2FD. Outro construto de Ang-2FD exemplar é referido aqui como "hBA2" (ou "bow-Ang2" humano) que é um tetrâ- mero de domínios tipo fibrinogênio de Ang-2 humana associados com um outro através de um domínio Fc humano ou de camundongo para formar uma configuração tipo "bow-tie". Tipicamente, hBA2 consiste em dois dímeros de Ang-2, em que cada dímero de Ang-2 contém dois domínios tipo fibronectina de Ang-2 conectados uns aos outros através de um domínio Fc. Componentes hBA2 exemplares incluem os polipeptí- deos chamados hBA2-hlgG1 (SEQ ID NO:52) e hBA2-mlgG2a (SEQ ID NO:523). Inesperadamente, certos anticorpos anti-Ang-2 da presente invenção foram verificados se ligar a construtos de Ang-2FD com afinidades muito maiores do que um anticorpo controle de Ang-2 conhecido (vide Exemplos mostrados aqui).

[00065] Ligação com alta afinidade, no contexto de anticorpo anti- Ang-2 se ligando a um construto Ang-2FD dimérico humano ou de ca- mundongo, significa que o anticorpo anti-Ang-2 se liga ao Ang-2FD di- mérico humano ou de camundongo com uma KD de menos do que 300 pM. Por exemplo, anticorpos anti-Ang-2 que se ligam com alta afinidade a Ang-2FD dimérico humano ou de camundongo incluem anticorpos que se ligam a Ang-2-FD dimérico humano ou de camundongo com uma KD de menos do que 300 pM, menos do que 250 pM, menos do que 200 pM, menos do que 190pM, menos do que 180 pM, menos do que 170 pM, menos do que 160 pM, menos do que 150 pM, menos do que 140 pM, menos do que 130 pM, menos do que 120 pM, menos do que 110 pM, menos do que 100 pM, menos do que 90 pM, menos do que 80 pM, menos do que 70 pM, menos do que 60 pM ou menos do que 50 pM, conforme medido a 25° C em um ensaio de ressonância de Plasmon de superfície.

[00066] Ligação com alta afinidade, no contexto de anticorpo anti- Ang-2 se ligando a um construto Ang-2FD dimérico de macaco, significa que o anticorpo anti-Ang-2 se liga a Ang-2FD dimérico de camundongo com uma KD de menos do que 500 pM. Por exemplo, anticorpos anti- Ang-2 que se ligam com alta afinidade a Ang-2FD dimérico de camundongo incluem anticorpos que se ligam a Ang-2-FD de camundongo com uma KD de menos do que 500 pM, menos do que 450 pM, menos do que 400 pM, menos do que 350 pM, menos do que 300 pM, menos do que 250 pM, menos do que 200 pM, menos do que 190 pM, menos do que 180 pM, menos do que 170 pM, menos do que 160 pm, menos do que 150 pM, menos do que 140 pM, menos do que 130 pM, menos do que 120 pM, menos do que 110 pM, menos do que 100 pM, menos do que 90 pM ou menos do que 80 pM, conforme medido a 25° C em um ensaio de ressonância de Plasmon de superfície.

[00067] Ligação com alta afinidade, no contexto de ligação de anticorpo anti-Ang-2 a um construto de Ang-2FD monomérico humano, sig- nifica que o anticorpo anti-Ang-2 se liga ao Ang-2FD monomérico humano com uma KD de menos do que 40 nM. Por exemplo, anticorpos anti-Ang-2 que se ligam com alta afinidade a Ang-2FD monomérico humano incluem anticorpos que se ligam a Ang-2FD monomérico com uma KD de menos do que 40 nM, menos do que 30 nM, menos do que 25 nM, menos do que 20 nM, menos do que 15 nM, menos do que 10 nM, menos do que 9 nM, menos do que 8 nM, menos do que 7 nM, menos do que 6 nM, menos do que 5 nM, menos do que 4 nM, menos do que 3 nM, menos do que 2 nM, menos do que 1 nM, menos do que 0,9 nM, menos do que 0,8 nM, menos do que 0,7 nM ou menos do que 0,6 nM conforme medido a 25° C em um ensaio de ressonância de Plasmon de superfície.

[00068] Ligação com alta afinidade, no contexto de anticorpo anti- Ang-2 se ligando a um construto hBA2, significa que o anticorpo anti- Ang-2 se liga a hBA2 com uma KD de menos do que 80 pM. Por exemplo, anticorpos anti-Ang-2 que se ligam com alta afinidade a hBA2 incluem anticorpos que se ligam a hBA2 com uma KD de menos do que 80 pM, menos do que 75 pM, menos do que 70 pM, menos do que 65 pM, menos do que 60 pM, menos do que 55 pM, menos do que 50 pM, menos do que 45 pM, menos do que 40 pM, menos do que 35 pM, menos do que 30 pM, menos do que 25 pM, menos do que 20 pM, menos do que 18 pM, menos do que 16 pM, menos do que 14 pM ou menos do que 12 pM, conforme medido a 25° C em um ensaio de ressonância de Plasmon de superfície.

[00069] A presente invenção inclui anticorpos que se ligam à Ang-2, mas não se ligam substancialmente à Ang-1. Conforme aqui usado, um anticorpo "não se liga substancialmente à Ang-1" se o anticorpo, quando testado quanto à ligação à Ang-1 em um ensaio de ressonância de Plasmon de superfície em que o anticorpo é capturado em uma Ang-1 humana do tipo selvagem de superfície e comprimento integral em uma concentração de cerca de 25 nM, é injetado na superfície do anticorpo capturado em uma taxa de fluxo de cerca de 60 pl/min por cerca de 3 minutos a 25° C, exibe uma KD maior do que cerca de 1 nM, por exemplo, uma KD maior do que cerca de 5 nM, maior do que cerca de 10 nM, maior do que cerca de 50 nM, maior do que cerca de 100 nM, maior do que cerca de 150 nM, maior do que cerca de 200 nM, maior do que cerca de 250 nM, maior do que cerca de 300 nM, maior do que cerca de 350 nM, maior do que cerca de 400 nM, maior do que cerca de 450 nM, maior do que cerca de 500 nM ou mais (vide, por exemplo, Exemplo 4). Ainda, um anticorpo "não se liga substancialmente à Ang-1" se o anticorpo falhar em exibir qualquer ligação à Ang-1 quando testado em tal ensaio ou equivalente do mesmo.

[00070] A presente invenção também inclui anticorpos que blo-queiam a ligação de Ang-2 a Tie-2, mas não bloqueiam substancialmente a ligação de Ang-1 a Tie-2. Conforme aqui usado, um anticorpo "não bloqueia substancialmente a ligação de Ang-1 a Tie-2" se, quando o anticorpo é pré-misturado com antígeno de Ang-1 em uma razão de cerca de 100:1 (anticorpo:antígeno) e deixado incubar a 25° C por cerca de 60 minutos e então a mistura equilibrada é testada quanto a ligação à Tie-2 através de ressonância de Plasmon de superfície em uma superfície revestida com Tie-2 (5 pl/min por 5 min a 25° C), a quantidade de Ang-1 ligada a Tie-2 é pelo menos 50% a quantidade de Ang-1 ligada a Tie-2 na presença de uma molécula controle irrelevante. (Vide, por exemplo, Exemplo 6). Por exemplo, se a quantidade de Ang-1 ligada a Tie-2 seguindo pré-incubação com um anticorpo é pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou cerca de 100% a quantidade de Ang-1 que se liga a Tie-2 seguindo pré-incubação com uma molécula controle irrelevante sob as condições experimentais mencionadas acima, então o anticorpo é considerado "não bloquear substancialmente a ligação de Ang-1 a Tie-2".

[00071] Além disso, a presente invenção inclui anticorpos que bloqueiam ou substancialmente atenuam uma atividade biológica de Ang- 2 (por exemplo, fosforilação de Tie-2 mediada por Ang-2; Ang-2 induz angiogênese, etc), mas não bloqueiam ou substancialmente atenuam a atividade biológica correspondente de Ang-1 (por exemplo, fosforilação de Tie-2 mediada por Ang-1; angiogênese induzida por Ang-1, etc). Ensaios e testes úteis para determinação de se um anticorpo satisfaz uma ou mais das características listadas acima serão prontamente conhecidos e facilmente praticados por pessoas de habilidade comum na téc-nica e/ou podem ser totalmente determinados a partir da presente invenção. Por exemplo, os procedimentos experimentais detalhados abaixo podem ser usados para determinar se um dado anticorpo se liga ou não se liga à Ang-2 e/ou Ang-2; bloqueia ou não bloqueia ligação de Ang-2 e/ou Ang-2 a Tie-2; inibe ou não inibe fosforilação de Tie-2 mediada por Ang-2 e/ou Ang-2; etc.

Mapeamento de Epítopo e Tecnologias Relacionadas

[00072] Para avaliar anticorpos que se ligam a um epítopo particular (por exemplo, aqueles que bloqueiam ligação de IgE a seu receptor de alta afinidade), um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como aquele descrito "Antibodies", Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY) pode ser realizado. Outros métodos incluem mutan- tes de varredura de alanina, blotsde peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol.248:443-63) ou análise de clivagem de peptídeo. Ainda, mé-todos tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496).

[00073] O termo "epítopo"refere-se a um sítio em um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Epítopos de célula B podem ser formados a partir de ambos os aminoácidos contíguos ou os aminoácidos não-contíguos justapostos por dobra terciária de uma proteína. Epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a solventes de desnaturação, enquanto epítopos formados por dobra terciária são tipicamente perdidos em tratamento com solventes de desnaturação. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e, mais co- mumente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma única conformação espacial.

[00074] Traçado de perfil Auxiliado por Modificação (MAP) (Modification-Assisted Profiling),também conhecido como Traçado de Perfil de Anticorpo com Base em Estrutura de Antígeno (ASAP) (Antigen Structure-based Antibody Profiling),é um método que categoriza números grandes de anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados contra o mesmo antígeno de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo a superfícies de antígeno quimicamente ou enzimatica- mente modificadas (US 2004/0101920). Cada categoria pode refletir um epítopo único ou distintamente diferente de ou parcialmente se sobrepondo com epítopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite filtragem rápida de anticorpos geneticamente idênticos, de ma-neira que caracterização pode ser focada em anticorpos geneticamente distintos. Quando aplicado à avaliação de hibridoma, MAP pode facilitar identificação de clones de hibridoma raros que produzem mAbs tendo as características desejadas. MAP pode ser usado para classificar os anticorpos anti-Ang-2 da invenção em grupos de anticorpos se ligando a epítopos diferentes.

[00075] Anticorpos anti-Ang-2 podem ser ligar a um epítopo dentro do domínio de hélices enroladas amino-terminal ou dentro do domínio tipo fibrinogênio carbóxi-terminal ("FD"). Em modalidades preferidas da presente invenção, os anticorpos anti-Ang-2 e os fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos se ligam a um epítopo dentro do FD.

[00076] Os aminoácidos dentro do FD de Ang-2 que interagem com Tie-2 foram determinados a partir de análise de estrutura de cristal. Vide Barton e outros, Nat. Struct. Mol. Biol.13:524-532 (Maio 2006). Com relação a anticorpos que bloqueiam a ligação de Ang-2 a Tie-2, mas não bloqueiam substancialmente ligação de Ang-1 a Tie-2 (por exemplo, H1H685P, vide Exemplos 5 e 6 abaixo), o epítopo ao qual tais anticorpos se ligam pode incluir um ou mais aminoácidos de Ang-2 que (a) interagem com Tie-2 e (b) são não-idênticos ao aminoácido correspondente em Ang-1. (Vide figura 1). Desta maneira, o epítopo ao qual tal tais anticorpos preferenciais de Ang-2 se ligam pode incluir um ou mais dos aminoácidos de hAng-2 que seguem (SEQ ID NO:518); S-417; K- 432; I-434; N-467; F-469; Y-475 ou S-480. Por exemplo, os presente inventores constataram que anticorpos que interagem com aminoácidos F-469, Y-475 e S-480 de Ang-2 (SEQ ID NO:518) interagem preferivelmente com Ang-2 em relação à Ang-1, e esta ligação preferencial pode ter benefícios terapêuticos. Desta maneira, a presente invenção inclui anticorpos anti-Ang-2 que se ligam especificamente à angiopoietina-2 humana (hAng-2), mas não se ligam substancialmente à hAng-1, em que os anticorpos se ligam a um epítopo em hAng-2 (SEQ ID NO:518) compreendendo aminoácidos F-469, Y-475 e S-480. Similarmente, a presente invenção inclui anticorpos anti-Ang-2 que bloqueiam a ligação de hAng-2 a Tie-2, mas não bloqueiam substancialmente a ligação de hAng-1 a Tie-2, em que os anticorpos se ligam a um epítopo em hAng-2 (SEQ ID NO:518) compreendendo os aminoácidos F-469, Y-475 e S-480.

[00077] A presente invenção inclui anticorpos anti-Ang-2 que se ligam ao mesmo epítopo que qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui (por exemplo, H1H685, H1H690, H1H691, H1H696, H1H706, H1M724 e/ou H2M744). Da mesma maneira, a presente invenção também inclui anticorpos anti-Ang-2 que competem para ligação com Ang-2 com qualquer um dos anticorpos exemplares descritos aqui (por exemplo, H1H685, H1H690, H1H696,H1H706, H1M724 e/ou H2M744).

[00078] Uma pessoa pode facilmente determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que, ou compete para ligação com, um anticorpo anti-Ang-2 de referência usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-Ang-2 de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína ou peptídeo Ang-2 sob condições de saturação. Em seguida, a habilidade de um anticorpo de teste em se ligar à molécula de Ang-2 é avaliada. Se o anticorpo de teste foi capaz de se ligar à Ang-2 seguindo ligação de saturação com o anticorpo anti-Ang-2 de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo anti-Ang- 2 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula Ang-2 seguindo ligação de saturação com o anticorpo anti-Ang-2 de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti-Ang-2 de referência da invenção. Experimentação de rotina adicional (por exemplo, análises de mutação e ligação) pode então ser realizada para confirmar se a falta de ligação observada do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica. De acordo com certas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo (ou sobrepondo) se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe ligação do outro por pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, 90% ou até mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitivo (vide, por exemplo, Junghans e outros, Cancer Res., 1990:50:1495- 1502). Alternativamente, dois anticorpos são considerados se ligar ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem ligação do outro. Dois anticorpos são considerados ter "epítopos de sobreposição" se apenas um subconjunto das mutações de aminoácido que reduz ou elimina ligação de um anticorpo reduzir ou eliminar ligação do outro.

[00079] Para determinar se um anticorpo compete para ligação com um anticorpo anti-Ang-2 de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma molécula de Ang-2 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de teste à molécula de Ang-2. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado se ligar a uma molécula de Ang-2 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula de Ang-2. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (saturação) for capaz de se ligar à molécula de Ang- 2, então é concluído que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem para ligação com Ang-2. Como será compreendido por um versado comum na técnica, o anticorpo que compete para ligação com um anticorpo de referência pode não se ligar necessariamente ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, mas pode bloquear este- ricamente ligação do anticorpo de referência através da ligação de um epítopo de sobreposição ou adjacente.

Seletividade de Espécie e Reatividade Cruzada de Espécie

[00080] De acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos anti-Ang-2 se ligam à Ang-2 humana, mas não à Ang-2 de outras espécies. Alternativamente, os anticorpos anti-Ang-2 da invenção, em certas modalidades, se ligam à Ang-2 humana e à Ang-2 de uma ou mais espécies não-humanas. Por exemplo, os anticorpos Ang-2 da invenção podem se ligar à Ang-2 humana e podem se ligar ou não, conforme for o caso, a uma ou mais Ang-2 de camundongo, rato, porquinho- da-índia, hamster, gerbil,porco, gato, cachorro, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cinomólogo, marmota, rhesuse chimpanzé.

Imunoconjugados

[00081] A invenção compreende anticorpos monoclonais anti-Ang-2 conjugados a uma porção terapêutica ("imunoconjugados"), tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Agentes citotóxicos incluem qualquer agente que é prejudicial para células. Exemplos de agentes citotóxicos e agentes qui- mioterapêuticos adequados para formação de imunoconjugados são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, WO 05/10381).

Anticorpos Multiespecíficos

[00082] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespe- cíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. mAbs multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação de antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Vide, por exemplo, Tutt e outros (1991) J. Immunol.147:60-69. Os anticorpos anti-Ang-2 da presente invenção, ou suas porções, podem ser ligados a ou co-expressos com outra molécula fun-cional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína, para formar uma molécula multiespecífica. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outra maneira) a uma ou mais outras entidades de molécula, tal como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir um anticorpo bi- específico ou um multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação.

[00083] Um formato de anticorpo biespecífico exemplar que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (lg) e um segundo domínio CH2 de lg, em que os primeiro e segundo domínios CH3 diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A comparado com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, 0 primeiro domínio CH3 de lg se liga à Proteína A e 0 segundo domínio CH3 de lg contém uma mutação que reduz ou abole a ligação à Proteína A tal como uma modificação de H95R (pela numeração de exon IMGT; H435R pela numeração EU). O segundo CH3 pode compreender ainda uma modificação de Y96 (pela IMGT; Y436F pela EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas no segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (pela IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG; N44s, K52N e V821 (IMGT; N384S, N392N e V422I pela EU) no caso de anticorpo lgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V81I (pela IMGT; Q355R, N384N, V397M, R409K, E419Q e V422I pela EU) no caso de anticorpo lgG4. Variações do formato de anticorpo biespecífico descrito acima são compreendidas dentro do escopo da presente invenção.

Formulação e Administração Terapêuticas

[00084] A presente invenção provê composições terapêuticas compreendendo os anticorpos anti-Ang-2 ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos da presente invenção. As composições terapêuticas na presente invenção podem compreender ainda um ou mais carrea- dores, excipientes e outros agentes farmaceuticamente aceitáveis que são incorporados a formulações para prover transferência, aplicação, tolerância e similar aperfeiçoadas (aqui coletivamente referidos como "carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis"). Uma variedade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido de todos os químicos farmacêuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company, Easton, PA. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, unguentos, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeo (catiônicas ou aniônicas) (tal como LIPOFECTIN®), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões carbowax (polieti- leno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Vide também Powell e outros "Compendium of excipientes for parenteral formulations", PDA, 1998, J. Pharm. Sei. Technol. 52:238-311.

[00085] A dose de anticorpo pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, doença alvo, condições, via de administração e similar. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso do corpo ou área de superfície do corpo. Quando um anticorpo da presente invenção é usado para tratamento de uma condição ou doença associada com atividade de Ang-2 em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar intravenosamente o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso do corpo, mais preferivelmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5 ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso do corpo. Dependendo da severidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Dosagens e programas eficazes para administração de anticorpos Ang-2 podem ser determinados empiricamente, por exemplo, progresso do paciente pode ser monitorado através de avaliação periódica, e a dose ajustada de acordo. Além disso, aumento interespécie de dosagens pode ser realizado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mor- denti e outros, 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

[00086] Vários sistemas de aplicação são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsu- las, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, en- docitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e outros, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, vias intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada através de qualquer via conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção de bolo, através de absorção por revestimentos epiteliais ou monocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosas retal e intestinal, etc) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistêmica ou local.

[00087] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser aplicada, por exemplo, subcutaneamente ou intravenosamente com uma agulha e seringa padrão. Ainda, com relação à aplicação subcutânea, um dispositivo de aplicação de caneta prontamente tem aplicações na aplicação de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de aplicação de caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de aplicação de caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez a composição farmacêutica dentro do cartucho tendo sido administrada e o cartucho estando vazio, o cartucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído com um cartucho novo que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de aplicação de caneta pode então ser reutilizado. Em um dispositivo de aplicação de caneta descartável, não há nenhum cartucho reutilizável. Ao contrário, o dispositivo de aplicação de caneta descartável vem pré-cheio com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez o reservatório estando sem a composição farmacêutica, todo o dispositivo é descartado.

[00088] Vários dispositivos de aplicação de caneta e autoinjetores reutilizáveis têm aplicações na aplicação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas certamente não estão limitados a, AUTOPEN® (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), caneta DISETRONIC® (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 72/25®, caneta HUMALOG®, caneta HUMALIN 70/30® (Eli Lilly e Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN® I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR® (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN®, OPTIPEN PRO®, OPTIPEN STARLET® e OPTICLIK® (Sanofi-aventis, Frankfurt, Alemanha), para mencionar alguns. Exemplos de dispositivos de aplicação de caneta descartáveis tendo aplicações em aplicação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas certamente não estão limitados a, a caneta SOLOSTAR® (Sanofi-aventis), a FLEX- PEN® (Novo Nordisk) e KWIKPEN® (Eli Lilly).

[00089] Para o tratamento de distúrbios do olho, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno da invenção podem ser administrados, por exemplo, através de colírios, injeção subconjuntival, implante sub- conjuntival, injeção intravítrea, implante intravítreo, injeção de sub-Te- non ou implante de sub-Tenon.

[00090] A composição farmacêutica pode ser também aplicada em uma vesícula, em particular um lipossoma (vide Langer, 1990, Science, 249:1527-1533; Treat e outros (1989) em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327, vide geral- mente ibid.).

[00091] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser aplicada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (vide Langer, supra, Sefton 1987, CRC, Crít. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, materiais poli- méricos podem ser usados. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser posto em proximidade do alvo da composição, desta maneira requerendo apenas uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, 1984, em Medicai Applicatons of Controlled Release, supra,vol. 2, pp. 115-138).

[00092] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosa, subcutânea, intracutânea e intramuscular, infusões por gotejamento, etc. Essas preparações injetáveis podem ser preparadas através de métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, suspendendo ou emulsificando o anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, há, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo gli-cose e outros agentes auxiliares, etc, que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização apropriado tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não-iônico [por exemplo, polysorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 moles) de óleo de rícino hidroge- nado)], etc. Como o meio oleoso são empregados, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc, que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção então preparada é preferivelmente cheia em uma ampola apropriada.

[00093] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para usos oral e parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para caber uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo mencionado acima contida é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo mencionado acima esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para outras formas de dosagem.

Usos Terapêuticos dos Anticorpos

[00094] Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para o tratamento, prevenção e/ou melhora de qualquer doença ou distúrbio associado com atividade de Ang-2, incluindo doenças ou distúrbios associados com angiogênese. Os anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno da presente invenção podem ser usados para tratar, por exemplo, tumores primários e/ou metastáticos que surgem no cérebro e meninges, orofaringe, pulmão e árvore bronquial, trato gastrintestinal, trato reprodutor de macho e fêmea, músculo, osso, pele e apêndices, tecido conectivo, baço, sistema imune, células de formação de sangue e medula óssea, fígado e trato urinário e órgãos sensoriais especiais tal como o olho. Em certas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno da invenção são usados para tratar um ou mais dos cânceres que seguem: carcinoma de célula renal, carcinoma pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, gliomas malignos, osteossarcoma, câncer colorretal, mesotelioma maligno, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não-pequena, sarcoma sinovial, câncer da tireoide ou melanoma.

[00095] Os anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno da presente invenção podem também ser úteis para o tratamento de um ou mais distúrbios do olho. Distúrbios do olho exemplares que podem ser tratados com os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno da invenção incluem, por exemplo, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética e outros distúrbios do olho associados com neovascularização coroidal, vazamento vascular, edema retinal e inflamação. Ainda, os anticorpos anti-Ang-2 da invenção podem ser administrados como um adjuvante para cirurgia de glaucoma para prevenir hem- e linfangiogênese precoces e recrutamento de macrófago para a bolha de filtragem após cirurgia de glaucoma e melhorar o resultado clínico.

[00096] Em outras modalidades da presente invenção, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno são usados para tratar hipertensão, diabetes (incluindo diabetes mellitus não-insulino dependente), psoríase, artrite (incluindo artrite reumatoide), asma, sepse, doença renal e edema associados com lesão, derrame ou tumor.

[00097] Expressão de Ang-2 foi mostrada se relacionar com a severidade de várias doenças inflamatórias e/ou infecciosas (vide, por exemplo, Siner e outros, 2009, Shock, 31:348-353; Yeo e outros, 2008, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA): 105:17097-17102). Desta maneira, os anticorpos anti-Ang-2 da presente invenção podem ser usados para tratar, prevenir ou melhorar uma ou mais doenças inflamatórias ou infecciosas. Doenças infecciosas exemplares que podem ser tratadas, prevenidas ou melhoradas através da administração dos anticorpos anti-Ang-2 da invenção incluem, mas não estão limitadas a: malária (infecção por Plasmo-dium falciparum),febres hemorrágicas virais (por exemplo, febre da dengue), infecção rickettsial,síndrome do choque tóxico, sepse, hepatite C, infecção por Bartonella bacilliformis, leishmaniose, infecção mi- cobacteriana e infecção pelo vírus Epstein-Barr.

Terapias de Combinação

[00098] Terapias de combinação podem incluir um anticorpo anti- Ang-2 da invenção e, por exemplo, outro antagonista de Ang-2 (por exemplo, um anticorpo anti-Ang-2, pepticorpo ou CovX-corpo tal como CVX-060 (vide U.S. 7.521.425)). Os anticorpos anti-Ang-2 da invenção podem também ser administrados juntos com outro agente antiangiogê- nico tal como, por exemplo, um antagonista de VEGF (por exemplo, um VEGF-Trap, vide, por exemplo, U.S. 7.087.411 (também referida aqui como "proteína de fusão de inibição de VEGF"), anticorpo anti-VEGF (por exemplo, bevacizumabe), um inibidor de cinase de molécula pequena de receptor de VEGF (por exemplo, sunitinibe, sorafenibe e pa- zopanibe) e anticorpos anti-DLL4 (por exemplo, um anticorpo anti-DLL4 revelado na U.S. 2009/0142354 tal como REG421), etc) ou com um antagonista de receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) (por exemplo, anticorpo anti-EGFR ou inibidor de molécula pequena de atividade de EGFR). Outros agentes que podem ser beneficamente administrados em combinação com os anticorpos anti-Ang-2 da invenção incluem inibidores de citocina, incluindo inibidores de citocina de molécula pequena e anticorpos que se ligam a citocinas tais como IL-1, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 ou a seus respectivos receptores. A presente invenção também inclui combinações terapêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti- Ang-2 mencionados aqui e um inibidor de um ou mais de VEGF, DLL4, EGFR ou qualquer uma das citocinas mencionadas acima, em que o inibidor é um aptâmero, uma molécula de antissentido, uma ribozima, um siRNA, um pepticorpo, um nanocorpo ou um fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab’)2j fragmento Fd; fragmento Fv; scFv; fragmento dAb; ou outras moléculas engenheiradas, tais como diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos e unidades de reconhecimento mínimas). Os anticorpos anti-Ang-2 da invenção podem ser também administrados em combinação com antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteroides e/ou NSAIDs. Os anticorpos anti- Ang-2 da invenção podem ser também administrados como parte de um regime de tratamento que também inclui tratamento com radiação e/ou quimioterapia convencional. Quando combinados com os um ou mais agentes adicionais, os anticorpos anti-Ang-2 da invenção podem ser administrados antes da, simultaneamente com (por exemplo, na mesma formulação ou em formulações separadas) ou subsequente à administração do(s) outro(s) agente(s).

Usos para Diagnóstico dos Anticorpos

[00099] Os anticorpos anti-Ang-2 da presente invenção podem ser também usados para detectar e/ou medir Ang-2 em uma amostra, por exemplo, para propósitos de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-Ang-2, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada pela expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc) de Ang-2. Ensaios de diagnóstico exemplares para Ang-2 podem compre-ender, por exemplo, contato de uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-Ang-2 da invenção, em que o anticorpo anti-Ang- 2 é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter. Alternativamente, um anticorpo anti-Ang-2 não-marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é em si detectavelmente marcado. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125l; uma porção fluorescente ou quimioluminescente tal como isoti- ocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfa- tase alcalina; β-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou luciferase. Ensaios exemplares específicos que podem ser usados para detectar ou medir Ang-2 em uma amostra incluem ensaio imunoabsor- vente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).

EXEMPLOS

[000100] Os exemplos que seguem são mostrados para prover aqueles versados comuns na técnica com revelação e descrição completas de como fazer e usar os métodos e composições da invenção e não pretendem limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços têm sido feitos para assegurar precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que de outro modo indicado, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados e pressão está na ou próximo da atmosférica.

Exemplo 1. Geração de Anticorpos Humanos para Ang-2 Humana

[000101] Antígeno de Ang-2 humana foi administrado diretamente, com um adjuvante para estimular a resposta imune, a um camundongo VELOCIMMUNE® compreendendo DNA codificando regiões variáveis de cadeia pesada e leve kappade Imunoglobulina humana. A resposta imune de anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico de Ang-2. Quando uma resposta imune desejada foi obtida esplenócitos foram coletados e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens de célula de hibridoma. As linhagens de célula de hibridoma foram avaliadas e selecionadas para identificar linhagens de célula que produzem anticorpos específicos de Ang-2. Usando esta técnica vários anticorpos anti-Ang-2 quiméricos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta maneira foram chamados: H1M724, H1M727, H1M728, H2M730, H1M732, H1M737, H2M742, H2M743, H2M744, H1M749, H2M750 e H1M810.

[000102] Anticorpos anti-Ang-2 foram também isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão a células de mieloma, conforme descrito na U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, vários anticorpos anti-Ang-2 integralmente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes huma-nos) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta maneira foram chamados: H1H685, H1H690, H1H691, H1H693, H1H694, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706 e H1H707.

[000103] As propriedades biológicas dos anticorpos anti-Ang-2 exemplares gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos mostrados abaixo.

Exemplo 2. Análise de Utilização de Gene Variável

[000104] Para analisar a estrutura de anticorpos produzidos, ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de anticorpo foram clonados e sequenciados. Da sequência de ácido nucleico e da sequência de aminoácido prevista dos anticorpos, uso de gene foi identificado para cada região variável de cadeia pesada (HCVR) e região variável de cadeia leve (LCVR) (Tabela 1). Tabela 1

[000105] A Tabela 2 mostra os pares de sequência de aminoácido de região variável de cadeias leve e pesada de anticorpos anti-Ang-2 selecionados e seus identificadores de anticorpo correspondentes. As designações N, P e G referem-se a anticorpos tendo cadeias pesada e leve com sequências de CDR idênticas, mas com variações de sequência em regiões que estão fora das sequências de CDR (isto é, nas regiões de estrutura principal). Desta maneira, variantes de N, P e G de um anticorpo particular têm sequências de CDR idênticas dentro de regiões variáveis de cadeias pesada e leve, mas contêm modificações dentro das regiões de estrutura principal.

*A sequência de aminoácido de LCVR de H1M737 não é mostrada.

Construtos Controle Usados nos Exemplos que Seguem

[000106] Vários construtos controle (anticorpos anti-Ang-2 e pepticor- pos anti-Ang-2) foram incluídos nos experimentos que seguem para propósitos comparativos. Os construtos controle são chamados: Controle I: um anticorpo anti-Ang-2 humano com domínios variáveis de cadeias pesada e leve tendo as sequências de aminoácido dos domínios correspondentes de "Ab536(THW)", conforme mostrado na U.S. 2006/0018909 (vide também Oliner e outros, 2004, Cancer Cell6:507- 516); Controle II: um peptídeo que se liga à Ang-2 humana tendo a se-quência de aminoácido de "2XCon4(C)", conforme mostrado na U.S. 7.205.275 (vide também Oliner e outros, 2004, Cancer Cell6:507-516); Controle III:um pepticorpo que se liga à Ang-2 humana tendo a sequência de aminoácido de "L1-7", conforme mostrado na U.S. 7.138.370; Controle IV: um anticorpo anti-Ang-2 humano com regiões variáveis de cadeias pesada e leve tendo as sequências de aminoácido dos domínios correspondentes de "3.19.3" conforme mostrado na U.S. 2006/0246071; e Controle V: um anticorpo anti-Ang-2 humano com regiões variáveis de cadeias pesada e leve tendo as sequências de aminoácido dos domínios correspondentes de "MEDI1/5" conforme mostrado no WO 2009/097325. (Nem todos os construtos controle foram usados em cada Exemplo). Nas tabelas que seguem, as notações "Ab" e "Pb" estão incluídas para identificar anticorpo e pepticorpo controles, respectivamente (isto é, Controle 1 = Ab; Controle II = Pb; Controle III = Pb; Controle IV = Ab; e Controle V = Ab).

Exemplo 3. Determinação da Afinidade de Ligação de Antígeno

[000107] Constantes de dissociação de equilíbrio (valores KD) para a ligação de anticorpos de Ang-2 purificados selecionados a domínio tipo fibrinogênio dimérico de Ang-2 humana (SEQ ID NO:519), de camundongo (Mus musculus', SEQ ID NO:520) e de macaco (Macca fascicula- ris; SEQ ID NO:521) (Ang-2FD) conjugada à lgG1 humana (SEQ ID NO:528) foram determinadas através de cinética de superfície usando um ensaio de ressonância de plasmon de superfície de biossensor de tempo real. Anticorpo foi capturado em uma superfície de anticorpo policlonal de IgG anticamundongo, uma superfície de anticorpo policlonal K anti-humano de cabra (Southern Biotech, Birmingham, AL) ou uma superfície de anticorpo policlonal IgG anti-humano de cabra (Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA) criadas através de acoplamento de amina direta a um sensor chipBIACORE® CM5 para formar uma superfície de anticorpo capturado. Concentrações variáveis (variando de 50 nM a 6,25 nM) de proteína foram injetadas em 100 pl/min na superfície do anticorpo capturado por 90 segundos. Ligação e dissociação de antígeno-anticorpo foram monitoradas em tempo real em temperatura ambiente. Análise cinética foi realizada para calcular a KDθ a meia-vida de dissociação do complexo antígeno/anticorpo. Os resultados são sumarizados na Tabela 3 abaixo.

[000108] O experimento acima foi repetido usando anticorpos anti-Ang-2 purificados selecionados clonados em lgG1 humana.Os resultados são sumarizados na Tabela 4 abaixo.

[000109] Experimentos de ligação adicionais foram conduzidos usando anticorpos anti-Ang-2 selecionados em duas temperaturas diferentes para avaliar mais a afinidade de espécies cruzadas. Cada anticorpo ou construto controle selecionado foi capturado em uma taxa de fluxo de 40 pL/min por 1 minuto em uma superfície de anticorpo policlo- nal kappa anti-humano de cabra criada através de acoplamento químico a um chipBIACORE® para formar uma superfície de anticorpo captu-rada. Ang-2FC-Fc humano, de macaco e camundongo em uma concentração de 25 nM ou 0,78 nM foi injetado na superfície de anticorpo capturado em uma taxa de fluxo de 60 pL/min por 3 minutos e a dissociação de antígeno-anticorpo foi monitorada em tempo real por 20 minutos a 25°C ou 37°C.

[000110] Os resultados são sumarizados nas Tabelas 5 (ligação a 25° C) e 6 (ligação 37° C) abaixo.

[000111] Em outro experimento, valores de KD para anticorpos purificados selecionados que se ligam a um construto tetramérico "bow- Ang-2" ("hBA2") foram determinados (usando os métodos descritos acima). hBA2 consiste em dois dímeros, cada dímero contendo dois domínios tipo fibronectina de Ang-2 conectados um ao outro por um domínio Fc humano. A sequência de aminoácido dos constituintes do dímero de hBA2 é representada pela SEQ ID NO:522. Os resultados são suma- rizados na Tabela 7 abaixo.Tabela 7

[000112] Em ainda outro experimento, valores KD para anticorpos purificados selecionados que se ligam à Ang-2 humana do tipo selvagem (hAng-2-WT; SEQ ID NO:518) e o domínio tipo fibrinogênio de Ang2 humana (hAng-2FD) foram determinados (conforme descrito acima). Os resultados são sumarizados na Tabela 8 abaixo. Tabela 8

[000113] Experimentos adicionais foram conduzidos para medir as propriedades de ligação de anticorpos anti-Ang-2 selecionados a hAng- 2Fd monomérico a 25° C e 37° C. Cada anticorpo ou construto controle selecionado foi capturado em uma taxa de fluxo de 40 pL/min por 1 minuto em uma superfície de anticorpo monoclonal IgG anti-humano de cabra criada através de acoplamento químico direto a um chipBIACORE® para formar uma superfície de anticorpo capturado. Ang-2FD humano em uma concentração de 500 nM ou 7,8 nM foi injetado na superfície de anticorpo capturado em uma taxa de fluxo de 60 pL/min por 3 minutos e dissociação de antígeno/anticorpo foi monitorada em tempo real por 20 minutos ou a 25° C ou 37° C.

[000114] Os resultados são sumarizados nas Tabelas 9 (25° C) e 10 (37° C) abaixo. N/D = não determinado.Tabela 9

Tabela 10

[000115] Conforme mostrado neste Exemplo, vários dos anticorpos anti-Ang-2 gerados de acordo com os métodos do Exemplo 1 se ligaram a construtos de Ang-2 com afinidades equivalentes ou maiores do que os controles. Por exemplo, anticorpos H1H685, H1H690, H1H724 e H1H744 se ligaram a Ang-2-FD humano dimérico com KD’s de 71,4, 79, 115 e 114 pM, respectivamente, enquanto o anticorpo Controle I se ligou a Ang-2-FD dimérico com uma Kode 339 pM (vide Tabela 4). Similarmente, anticorpos H1H685, H1H690, H1H724 e H1H744 se ligam a BA2 humano (um construto de domínio tipo fibrinogênio de Ang-2 tetramé- rico) com KD’S de 11,9,17,9, 23,3 e 17,2 pM, respectivamente, enquanto o anticorpo Controle de ligou a hBA2 com uma KD de 83 pM (vide Tabela 7). Desta maneira, conforme comparado com construtos controle, muitos dos anticorpos da invenção exibem ligação aumentada à Ang-2. O anticorpo H1H685P mostrou propriedades de ligação especialmente robustas à Ang-2 comparado com construtos controle.

Exemplo 4. Ligação Preferencial à Ang-2 com relação à Ang-1

[000116] Experimentos de ligação (ensaios de ressonância de plasmon) foram conduzidos para averiguar se anticorpos selecionados se ligaram a ambas a Ang-2 e a Ang-1 ou se eles se ligaram preferivelmente à Ang-2 apenas. Cada anticorpo ou construto controle selecionado foi capturado em uma taxa de fluxo de 40 pL/min por 1 minuto em uma superfície de anticorpo policlonal IgG anti-humano de camundongo criada através de acoplamento químico direto a um chipBIACORE® para formar uma superfície de anticorpo capturado. Ang-1 ou Ang-2 humana do tipo selvagem de comprimento integral em uma concentração de 25 nM ou 0,78 nM foi injetada na superfície de anticorpo capturado em uma taxa de fluxo de 60 pL/min por 3 minutos e dissociação de an- tígeno-anticorpo foi monitorada em tempo real por 20 minutos ou a 25° c ou 37° C.

[000117] Os resultados desses experimentos são sumarizados nas Tabelas 11-14 abaixo. N/D = não determinado. "Sem ligação" significa que nenhuma ligação detectável foi observada sob as condições experimentais particulares usadas nesses experimentos.

[000118] Esses resultados mostram que H1H685P é único dentre os anticorpos testados neste experimento pelo fato dele se ligar com alta afinidade à Ang-2, mas não se ligar à Ang-1. O único outro construto que exibe ligação com Ang-2, mas não Ang-1, é Controle III. Deve ser enfatizado, no entanto, que Controle III é um pepticorpo e que todos os outros anticorpos testados neste experimento se ligaram a ambas a Ang-2 e a Ang-1. A seletividade para ligação à Ang-2 pode conferir benefícios terapêuticos a H1H685P que não são possuídos por anticorpos que se ligam a ambas a Ang-2 e a Ang-1.

Exemplo 5. Inibição de Ligação de Ang-2 a Tie-2

[000119] Tie-2 é um receptor natural para Ang-2. Anticorpos anti-Ang- 2 foram testados quanto à sua habilidade em bloquear ligação de Ang- 2 a Tie-2 humano (hTie-2). hTie-2-mFc (um construto quimérico consistindo em Tie-2 humano conjugado à IgG de camundongo; SEQ ID NO:525) foi revestido em placas de 96 cavidades em uma concentração de 2 pg/ml e incubado da noite para o dia seguido por lavagem quatro vezes em tampão de lavagem (PBS com Tween-20 0,05%). A placa foi então bloqueada com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 0,5% (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) por uma hora em temperatura ambiente. Em uma placa separada, anticorpos anti-Ang-2 purificados, em uma concentração de partida de 50nM, foram serialmente diluídos por um fator de três na placa toda. Proteína Ang-2FD humana, de camundongo ou macaco conjugada à IgG humana (Ang-2FD-hFc) foi adicionada para concentrações finais de 2nM, 8nM ou 2nM, respectivamente e incubada por uma hora em temperatura ambiente. A mistura de anticorpo/Ang-2FD-Fc foi então adicionada à placa contendo hTie-2- mFc e incubada por uma hora em temperatura ambiente. Detecção de Ang-2-FD-hFc ligada à proteína hTie-2-mFc foi determinada com Peroxidase de Rábano Silvestre (HPR) conjugada a anticorpo IgG anti-hu- mano (Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA) e desenvolvida através de resposta colorimétrica padrão usando substrato de tetrame- tilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA). Absorbância foi lida em OD450 por 0,1 segundo. Bloqueio percentual de ligação de Ang-2FD- hFC à hTIE-2-mFc por 16,67nM de anticorpos anti-Ang-2 selecionados é mostrado na Tabela 15.Tabela 15

[000120] Em um experimento similar, anticorpos anti-Ang-2 purificados selecionados clonados em lgG1 humana foram testados quanto à sua habilidade em bloquear ligação de Ang-2FD a hTie-2 (conforme acima descrito). Bloqueio percentual de Ang-2FD-hFc se ligando a hTie- 2-mFc por 16,67 nM de anticorpos anti-Ang-2 selecionados é mostrado na Tabela 16. NT: não testado. Tabela 16

[000121] Em outro experimento, anticorpos anti-Ang-2 purificados selecionados foram testados quanto à sua habilidade em bloquear ligação de hBA2 a hTie-2 biotinilado 20pM (conforme acima descrito). Para este experimento, Tie-2 humano conjugado a tag de histidina (hTie-2-His; SEQ ID NO:526) foi usado de uma maneira similar ao hTie-2-mFc descrito acima. Concentrações de anticorpo de 5nM foram serialmente diluídas três vezes. Um valor de IC50 (Concentração Inibidora) foi gerado através do cálculo da quantidade de anticorpo requerida para bloquear 50% do sinal da ligação de biotina-hBA2 a Tie-2. Um valor de IC50 médio para cada anticorpo foi calculado com base em dois experimentos separados. Os resultados são sumarizados na Tabela 17. NB: nenhum bloqueio observado em concentração de 5nM. Tabela 17

[000122] Em um experimento similar, anticorpos anti-Ang-2 purificados selecionados clonados em IgG1 humana foram testados quanto à sua habilidade em bloquear ligação de hBA2 biotinilado a hTie-2 (conforme acima descrito). Os resultados são mostrados na Tabela 18. NB: nenhum bloqueio observado em concentração de 5nM.Tabela 18

[000123] Este Exemplo ilustra que vários dos anticorpos anti-Ang-2 gerados de acordo com os métodos do Exemplo 1 bloquearam a interação entre o domínio tipo fibrinogênio de Ang-2 e seu receptor (TIE-2) para um grau equivalente ou maior do que o anticorpo controle. Por exemplo, os anticorpos H1H690, H1H691, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706, H1H707, H1H724 e H1H744 causaram, cada um, mais de 95% de bloqueio de construtos de Ang-2FD humano, de camundongo e de macaco para o receptor TIE-2, similar aos resultados observados com os construtos controle (vide Tabela 16).

Exemplo 6: Inibição de Ligação de Ang-2 e Ang-1 de Comprimento Integral a Tie-2 humano

[000124] Tie-2 é um receptor para Ang-1 bem como Ang-2. Desta maneira, no presente Exemplo, a habilidade de certos anticorpos anti-Ang- 2 em bloquear ligação de Ang-2 ou Ang-1 a Tie-2 humano foi medida e comparada.

[000125] Os experimentos ELISA mostrados neste Exemplo foram conduzidos de uma maneira similar aos experimentos do Exemplo 5. Em suma, hTie-2-mFc (um construto quimérico consistindo em Tie-2 humano conjugado à IgG de camundongo; SEQ ID NO:525) foi revestido em placas de 96 cavidades em uma concentração de 2 pg/ml e incubado da noite para o dia seguido por lavagem quatro vezes em tampão de lavagem (PBS com Tween-20 0,05%). A placa foi então bloqueada com BPS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo BSA 0,5% (Sigma-AI- drich Corp., St. Louis, MO) por uma hora em temperatura ambiente. Em uma placa separada, anticorpos anti-Ang-2 purificados e construtos controle, em uma concentração de partida de 300 nM, foram serialmente diluídos por um fator de três por toda a placa. Proteína Ang-2 ou Ang-1 humana de comprimento integral conjugada a tag de histidina 6X (R&D Systems, Minneapolis, MN) foi adicionada para uma concentração final de 0,6nM e incubada por uma hora em temperatura ambiente. A mistura de anticorpo/antígeno foi então adicionada à placa contendo hTie-2- mFc e incubada por uma hora em temperatura ambiente. Detecção de Ang-2His e Ang-1 -His ligado à proteína hTie-2-mFc foi determinada com Peroxidase de Rábano Silvestre (HRP) conjugada a um anticorpo Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) e desenvolvida através de resposta colorimétrica padrão usando substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA). Absorbância foi lida em OD450 por 0,1 segundo. Um valor de IC50 (Concentração Inibidora) foi gerado através do cálculo da quantidade de anticorpo requerida para bloquear 50% do sinal da ligação de Ang-2 ou Ang-1 humana a Tie-2. Os resultados, ex-pressos em termos de IC50 são mostrados na Tabela 19, colunas (1) e (2). O ponto até 0 qual os anticorpos ou construtos controle bloqueiam a interação de hAng-2/Tie-2 com relação à interação de hAng-1 /Tie-2 é refletida na diferença de vezes em IC50 mostrada na coluna (3); isto é, um número maior na coluna (3) indica uma capacidade maior em bloquear a interação de hAng-2/Tie-2 do que a interação de hAng-1 /Tie-2.Tabela 19

*Calculada dividindo a IC50 de bloqueio de hAng-1 (coluna 2) pela IC50 de bloqueio de hAng-2 (coluna 1)

[000126] Em um esforço em avaliar mais a habilidade de anticorpos anti-hAng-2 selecionados em bloquear a ligação de Ang-2 a Tie-2, um experimento de ressonância de plasmon de superfície de biossensorfoi conduzido. Neste experimento, um construto de domínio extracelular de comprimento integral de Tie-2 humano (hTie-2-mFc-ecto) foi acoplado à amida em um chipBIACORE® para criar uma superfície revestida com receptor. Anticorpos anti-hAng-2 selecionados e construtos controle, a 1 pm (excesso de 100 vezes com relação ao antígeno), foram pré-mis- turados com 10 nM de hAng-1-WT, seguido por 60 minutos de incubação a 25° C para permitir ligação de anticorpo-antígeno para atingir equilíbrio para formar soluções equilibradas. As soluções equilibradas foram injetadas nas superfícies do receptor a 5 pL/min por 5 minutos a 25° C. Mudanças em unidades de ressonância (RU) {Resonance Units)devido à ligação de hAng-1-WT a hTie-2-mFc foram determinadas. Um construto de pepticorpo irrelevante com nenhuma ligação com hAng-1 foi incluído neste experimento para estabelecer a linha de base de bloqueio de 0% e um construto de Tie-2-mFc humano foi usado como um controle positivo para bloqueio. A quantidade de Ang-1 ligada a Tie-2 seguindo pré-incubação do anticorpo, expressa como a porcentagem da quantidade de Ang-1 ligada a Tie-2 seguindo pré-incubação de controle negativo, é mostrada na Tabela 20. Uma quantidade maior de ligação de Ang-1 a Tie-2 significa um grau menor de bloqueio de anticorpo).Tabela 20

[000127] O experimento acima foi repetido usando quantidades diferentes de bloqueadores de Ang-2 e controles. Em particular, construto de domínio ex- tracelular de comprimento integral de Tie-2 (hTie-2-mFc-ecto) foi acoplado à amina em um chipBIACORE® para criar uma superfície revestida com receptor. Anticorpos anti-hAng-2 selecionados e construtos controle (50 ou 150 nM) foram misturados com hAng-2-WT (25 nM) seguido por 60 minutos de incubação a 25° C para permitir que ligação de anticorpo-antígeno atingisse equilíbrio. As solu-ções equilibradas foram injetadas nas superfícies do receptor a 10 pL/min por 5 minutos a 25° C. Para avaliar a habilidade dos anticorpos anti-hAng-2 selecionados em bloquear Ang-1-WT se ligando a hTie-2, um procedimento similar foi seguido exceto que os anticorpos foram testados em três concentrações (50, 100 ou 1000 nM) e incubados com 10 nM de hAng-1-WT. Mudanças em unidades de ressonância (RU) devido à ligação de Ang-2-WT ou hAng-1-WT a hTie-2-mFc foram determinadas. Um anticorpo irrelevante sem nenhuma ligação a nenhuma angiopoietina foi incluído nesses experimentos para estabelecer a linha de base de bloqueio de 0% e um construto de Tie-2-mFc humano foi usado como um controle positivo para bloqueio. Os resultados são sumarizados nas Tabelas 21 (hAng-1 aplicado a uma superfície de hTie-2) e 22 (hAng-2 aplicado a uma superfície de hTie-2).

[000128] Os resultados obtidos a partir desses experimentos estão de acordo com resultados anteriores que mostraram que H1H6685P preferivelmente se liga à Ang-2 com relação à Ang-1 (vide exemplo 4). Em particular, os resultados desses Exemplos mostram que vários anticorpos anti-Ang-2 (por exemplo, H1H685P e H1H706P) não bloqueiam significantemente a ligação de Ang-1 humana a Tie-2 humano, no entanto, em outros experimentos, foi demonstrado que esses anticorpos bloquearam potentemente a interação entre Ang-2 e Tie-2 (vide Exemplo 5, Tabela 16). Além disso, nesses experimentos nenhum dos cons-trutos controle, exceto o pepticorpo Controle III, exibiu o mesmo grau de ligação/bloqueio preferencial de Ang-2 com relação à Ang-1 como os anticorpos anti-Ang-2 exemplares da presente invenção, tal como H1H685P.

Exemplo 7. Inibição de Fosforilação de Tie-2 Mediada por Ang-2 por Anticorpos anti-Ang-2

[000129] Os inventores da presente invenção demonstraram que expressão de Ang-2 pode ser induzida em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) pelo fator de transcrição FOXO1 (Daly e outros, 2006. PNAS, 103:15491). Ainda, os inventores mostraram que infecção de HUVECs com um adenovirus codificando FOXO1 resulta em expressão e secreção de Ang-2, seguido por ativação de fosforilação de Tie-2 (Daly e outros, 2006. PNAS, 103:15491).

[000130] Anticorpos anti-Ang-2 foram testados quanto à sua habilidade em inibir fosforilação de Tie-2. Em suma, 7x105 HUVECs (Vec Technologies, Rensselaer, NY) foram plaqueadas em placas de cultura de célula de 6 cm em 3,5 ml de Meio Completo MCDB131 (Vec Technologies, Rensselaer, NY). No dia seguinte, as células foram lavadas com Opti-MEM (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) e alimentadas com 2 ml de Opti-MEM. Adenovirus recombinantes codificando ou proteína verde flu- orescente (GFP; controle) ou FOXO1 humana (Daly e outros, 2004, Genes Dev., 18:1060) foram adicionados às células em uma concentração de 10 pfu/célula e incubados por quatro horas. As células foram então lavadas com MCDB131 e alimentadas com 2 ml de MCDB131 contendo anticorpos anti-Ang-2 em uma concentração de 0,5 pg/ml. Vinte e quatro horas depois da infecção, as células foram lisadas e submetidas à imu- noprecipitação com Tie-2 conforme descrito por Daly e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:15491-15496 (2006). Imunoglobulina foi coletada em contas de proteína A/G (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, SA) por uma hora. As contas foram lavadas com tampão de lise frio e ressuspensas em tampão de amostra de SDS para análise através de wester blotcom anticorpos específicos para fosfotirosina (Millipore, Billerica, MA) ou Tie-2. Os sinais foram detectados usando anticorpos se-cundários conjugados a HRP e reagentes ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Películas de raio-X foram varridas e o sinais de fosfo-Tie-2 e Tie-2 foram quantificados usando softwareImaged. As razões de fosfo-Tie-2/Tie-2 foram usadas para determinar a inibição % para cada anticorpo anti-Ang-2 (isto é, Inibição percentual = Redução em fosfo- Tie-2/Tie-2 comparado com controle). Por exemplo, uma redução em fosforilação de Tie-2 para o nível observado na amostra controla é considerada ser 100% de inibição. Inibição relativa (+, ++, +++) para cada anticorpo anti-Ang-2 testado de acordo com a inibição percentual observada (25-50%, 50-75%, 75-100%, respectivamente) é mostrada na Tabela 23.Tabela 23

[000131] Conforme demonstrado neste Exemplo, os anticorpos anti- Ang-2 gerados de acordo com os métodos do Exemplo 1 inibiram fosfo- rilação de Tie-2 para um grau maior do que o anticorpo Controle I. Inibição especialmente robusta foi observada com anticorpo H1H685, H1H690, H1H691, H1H693, H1H695, H1H696, H1H704, H1H706, H1H707, H1M724, H1M744 e H1M750.

Exemplo 8. Inibição de Fosforilação de Tie-2 Mediada por Ang-1

[000132] Conforme mostrado no exemplo anterior, Ang-2 pode mediar a fosforilação de Tie-2. Ang-1 é também capaz de promover fosforilação de Tie-2. No presente Exemplo, a habilidade de anticorpos anti-Ang-2 selecionados em bloquear fosforilação de Tie-2 mediada por Ang-1 foi avaliada.

[000133] Células EA.hy926 (Edgell e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3734-3737 (1983)) foram plaqueadas em 5x106 células por placa de 10 cm em DMEM 10 ml com FBS 10%, HAT, L-glutamina e penicilina/estreptomicina. Após 24 horas, as células foram privadas de soro por 1 hora em 10 ml de DMEM + 1 mg/ml de BSA. As células foram então estimuladas por 10 minutos com 500 ng/ml de Ang-1 humana re- combinante (R&D Systems) na presença ou de um anticorpo controle de isotipo irrelevante ("9E10") a 400 nM ou o anticorpo anti-Ang-2 H1H685P, ou agentes controle (Controle I, Controle II, Controle IV ou Controle V) em concentrações variando de 10 a 400 nM.

[000134] Seguindo a incubação, as células foram lisadas e Tie-2 foi imunoprecipitado conforme descrito por Daly e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:15491-15496 (2006). Complexos imunes foram coletados através de incubação com contas A/G de proteína (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) por 60 minutos. As contas foram lavadas com tampão de lise frio e proteínas ligadas foram eluídas através de aquecimento em tampão de amostra de SDS. As amostras foram então submetidas à análise Western blotcom anticorpos monoclonais contra Tie-2 ou fosforotirosina (clone 4G10, Millipore, Billerica, MA). Os resultados são mostrados na figura 2.

[000135] Os sinais foram detectados usando anticorpos secundários conjugados a HRP e reagentes ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Películas de raio-X foram varridas e os sinais de fosfo-Tie-2 e Tie-2 foram quantificados usando SoftwareImaged. As razões de fosfo-Tie- 2/Tie-2 foram usadas para determinar a inibição % para cada anticorpo ou peptidocorpo. Inibição percentual = redução em fosfo-Tie-2/Tie-2 comparado com a amostra controle (anticorpo controle isotipo 400 nM).

[000136] Na presença do anticorpo controle 9E10, Ang-1 ativou forte-mente fosforilação de Tie-2 (figura 2, painel A - comparar faixas 2 e 3 vs. faixa 1). Todos os agentes controle que foram testados inibiram sig- nificantemente fosforilação de Tie-2, com inibição completa ocorrendo a 50 nM para Controle II (figura 2, painel B - faixa 17), 100 nM para Controle IV (figura 2, painel A - faixa 11) e 200 nM para Controle I (figura 2,painel B - faixa 24) e Controle V (figura 2, painel C, faixa 9). Em contraste, H1H685P não teve nenhum efeito inibidor significante mesmo a 400 nM (figura 2, painel A - faixas 4-8). Esses resultados proveem confirmação adicional da especificidade de H1H685P para Ang-2 com relação à Ang-1.

Exemplo 9. Inibição de Crescimento de Tumor por Anticorpos Anti-Ang-2

[000137] O efeito de anticorpos anti-Ang-2 purificados selecionados sobre crescimento de tumor foi determinado usando duas linhagens de célula de tumor.

[000138] PC3 (Linhagem de célula de câncer de próstata humana). Em suma, 5x106 células PC3 em 100 pl de Matrigel reduzida em fator de crescimento (BD Biosciences) foram injetadas subcutaneamente nos flancos de camundongos nus NCr machos de 6-8 semanas de vida (Ta- conic, Hudson, NY). Após os volumes do tumor terem atingido uma média de cerca de 200 mm3, os camundongos foram aleatorizados em grupos para tratamento. Os camundongos em cada grupo de tratamento foram administrados com um anticorpo anti-Ang-2, proteína Fc, ou construto controlado, em uma concentração de 10 mg/kg através de injeção intraperitoneal duas vezes por semana por aproximadamente três semanas (Tabela 24) ou em concentrações de 2,5, 12,5 ou 25 mg/kg através de injeção subcutânea duas vezes por semana por aproximadamente três semanas (Tabela 25). Os volumes do tumor foram medidos duas vezes por semana durante o curso do experimento e os pesos do tumor foram medidos quando da excisão de tumores na conclusão do experimento. Médias (média +/- desvio padrão) de peso e crescimento de tumor foram calculadas para cada grupo de tratamento. A diminuição percentual de peso e crescimento de tumor foi calculada a partir da comparação para medições de proteína Fc. Os resultados são sumarizados nas Tabelas 24 e 25.

[000139] Conforme mostrado acima, anticorpos H1H744N e H1H685P demonstraram atividade antitumor especialmente notável no modelo de tumor de camundongo PC3 comparado com os construtos controle.

[000140] Os resultados de experimentos similares usando o modelo de tumor de camundongo PC3 e anticorpos experimentais diferentes (dosados a 2 mg/kg, duas vezes por semana) são mostrados nas Tabelas 26 e 27.

[000141] COLO 205 (Linhagem de célula de adenocarcinoma colorre- tal humana). Em suma, 2x106 células COLO 205 em 100 pl de meio livre de soro foram injetadas subcutaneamente no flanco de camundongos nus NCr machos de 6-8 semanas de vida (Taconic, Hudson, NY). Após os volumes do tumor terem atingido uma média de cerca de 150 mm3, os camundongos foram alea- torizados em grupos para tratamento com anticorpo ou proteína Fc. Os camundongos em cada grupo de tratamento foram administrados com um anticorpo anti-Ang-2 ou proteína Fc em uma concentração de 4 mg/kg através de injeção intraperitoneal duas vezes por semana por aproximadamente duas semanas. Os volumes do tumor foram medidos duas vezes por semana durante o curso do experimento e os pesos do tumor foram medidos quando da excisão de tumores na conclusão do experimento. Médias (média +/- desvio padrão) de peso e crescimento de tumor foram calculadas para cada grupo de tratamento. "Crescimento de Tumor Médio" representa o crescimento médio do momento do início do tratamento (quando os tumores eram de aproximadamente 150 mm3). A diminuição percentual de peso e crescimento de tumor é calculada a partir da comparação com medições de proteína Fc. Os resultados são sumarizados na Tabela 28.Tabela 28

[000142] Um experimento similar foi realizado para avaliar o efeito de H1H685P, em particular, sobre crescimento de tumor COLO 205. Em suma, 2x106 células COLO 205 em 100 pL de meio livre de soro foram implantadas subcutaneamente no flanco traseiro direito de camundongos SCID CB17 machos de 9-11 semanas de vida. Quando os tumores atingiram ~125 mm3, os camundongos foram aleatoriza- dos em 5 grupos (n = 7-8 camundongos/grupo) e tratados duas vezes por semana com proteína Fc (15 mg/kg), H1H685P (5 ou 25 mg/kg) ou Controle II (5 ou 25 mg/kg) por um período de 19 dias. Volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana durante o curso do experi-mento e os pesos dos tumores foram medidos quando da excisão de tumores no final do experimento. Médias de peso e crescimento de tumor do início do tratamento foram calculadas para cada grupo. Diminuição percentual de peso e crescimento de tumor é calculada a partir da comparação com o grupo controle Fc. Os resultados são mostrados na Tabela 29.

[000143] Como com o modelo de tumor de camundongo PC3, vários dos anticorpos da invenção, incluindo H1H685P, exibiram atividades antitumor substanciais no modelo de camundongo COLO 205 que eram pelo menos equivalentes às atividades antitumor exibidas pelas moléculas controle.

Exemplo 10. Inibição de Fator de Crescimento e Perfusão de Tumor por uma Combinação de um Anticorpo Anti-Ang-2 e um Inibidor de VEGF

[000144] Para determinar o efeito de combinação de um anticorpo anti-Ang-2 com um inibidor de VEGF sobre o crescimento de xenoen- xertos de COLO 205, 2 x 106 células foram implantadas subcutanea- mente no flanco traseiro direito de camundongos SCID fêmeas de 6-8 semanas de vida. Quando os tumores atingiram um volume médio de ~350 mm3, os camundongos foram aleatorizados em 4 grupos (n = 6 camundongos/grupo) e tratados com: proteína Fc humana (7,5 mg/kg), H1H685P (5 mg/kg), VEGF Trap (vide U.S. 7,087,411) (2,5 mg/kg) ou a combinação de H1H685P + VEGF Trap. Os camundongos receberam um total de 3 doses durante 10 dias de tratamento. Os volumes do tumor foram medidos duas vezes por semana durante o curso do experimento. Médias de crescimento de tumor do início do tratamento (média +/- desvio padrão) foram calculadas para cada grupo de tratamento. Diminuição percentual de crescimento de tumor foi calculada a partir da com-paração do grupo controle Fc. Os resultados são mostrados na Tabela 30. Notar que nos grupos VEGF Trap e H1H685P + VEGF Trap o tamanho de tumor médio foi menor no final do tratamento do que no início, isto é, regressão de tumor foi observada.

[000145] O resultado deste experimento demonstram que a combinação de H1H685P + VEGF Trap causa uma diminuição em crescimento de tumor que é maior do que a diminuição percentual em crescimento de tumor causada por qualquer componente sozinho.

[000146] Para prover evidência adicional de eficácia de combinação, o efeito da combinação de H1H685P + VEGF TRAP sobre o crescimento de tumores MMT foi avaliado. 0,5 x 106 células MMT foram implantadas subcutaneamente no flanco traseiro direito de camundongos SCID fêmeas de 6-8 semanas. Quando os tumores atingiram um volume médio de ~400 mm3, os camundongos foram aleatorizados em 4 grupos (n = 11 camundongos/grupo) e tratados com: proteína Fc humana (17,5 mg/kg), H1H685P (12,5 mg/kg), VEGF Trap (5 mg/kg) ou a combinação de H1H685P + VEGF Trap. Os grupos de Fc e H1H685P receberam 3 doses durante 9 dias. Os grupos de VEGF Trap e combinação receberam 4 doses durante 12 dias. Os volumes do tumor foram medidos duas vezes por semana durante o curso do experimento e os pesos do tumor foram medidos quando da excisão de tumores no final do experimento (devido ao seu tamanho grande, tumores dos grupos Fc e H1H685P foram coletados 3 dias antes dos tumores dos grupos VEGF Trap e combinação). Médias (média +/- desvio padrão) de crescimento de tumor do início de tratamento e peso do tumor foram calculadas para cada grupo. A diminuição percentual de peso e crescimento de tumor é calculada a partir da comparação com o grupo controle Fc. Os resultados são mostrados na Tabela 31.

[000147] Esses resultados confirmam o efeito de inibição de tumor aumentado de H1H685P + VEGF Trap com relação ao tratamento com agente único.

[000148] Para determinar se a combinação de H1H685P + VEGF Trap tem um efeito maior sobre a função de vaso de tumor do que os agentes sozinhos, um microultrassom (sistema de imagem Vevo 770 da Visual- Sonics) foi usado para avaliar mudanças em perfusão de tumor. Tumores COLO 205 foram cultivados para ~125 mm3 e os camundongos foram então tratados por 24 horas com H1H685P, VEG Trap ou a combi-nação de ambos os agentes. Seguindo o tratamento, perfusão de vaso de tumor foi determinada com base em aquisição de imagem 2D de microultrassom de contraste aumentado e análise de uma curva "wash- in", que representa a quantidade de agente de contraste que entra no tumor. Média (média +/- desvio padrão) de perfusão de tumor foi calculada para cada grupo. A diminuição percentual foi calculada a partir da comparação com o grupo controle Fc. Os resultados são mostrados na Tabela 32.

[000149] Em consonância com o efeito aumentado do tratamento de combinação sobre perfusão, fingimento com anti-CD31 de seções de tumor demonstrou um efeito mais potente da combinação sobre densidade de vaso sanguíneo de tumor (dados não mostrados). O efeito aumentado da combinação H1H685P + VEGF Trap sobre a função da vasculature do tumor provê uma explicação potencial para os efeitos aumentados da terapia de combinação sobre crescimento de tumor.

Exemplo 11. Inibição de Crescimento de Tumor por uma Combinação de um Anticorpo Anti-Ang-2 e um Agente Quimioterapêutico

[000150] Para testar o efeito de H1H685P em combinação com um agente quimioterapêutico sobre crescimento de tumor, 2,5 x 106 células de tumor COLO 205 foram implantadas subcutaneamente no flanco traseiro direito de camundongos SCID machos de 8-9 semanas de vida. Quando os tumores atingiram um volume médio de ~150 mm3 (dia 17 após implante), os camundongos foram aleatorizados em 4 grupos (n = 5 camundongos/grupo) e tratados como segue: o primeiro grupo foi tratado s.c. com 15 mg/kg de hFc e intraperitonealmente (i.p.) com veículo 5-FU; o segundo grupo foi tratado s.c. com 15 mg/kg de H1H685P; o terceiro grupo foi tratado i.p. com 75 mg/kg de 5-FU; o quarto grupo foi tratado com a combinação de 15 mg/kg de H1H685P s.c. mais 75 mg/kg de 5-FU i.p. Os camundongos receberam um total de três tratamentos, administrados a cada 3-4 dias. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana durante o curso do experimento. A média (média +/- desvio padrão) de crescimento de tumor do início do tratamento até o dia 38 foi calculada para cada grupo. A diminuição percentual de crescimento de tumor foi calculada a partir da comparação com o grupo controle. Os resultados são mostrados na Tabela 33.

[000151] Os resultados deste experimento mostram que a combinação de H1H685P e 5-FU causou uma diminuição maior em crescimento de tumor do que qualquer agente administrado separadamente.

Exemplo 12. Anticorpos Anti-Ang-2 Atenuam Angiogênese Ocular In Vivo

[000152] Neste Exemplo, os efeitos de anticorpos anti-Ang-2 selecionados sobre vascularização retinal em um modelo de camundongo foram avaliados.

[000153] Em um conjunto de experimentos camundongos do tipo selvagem foram usados. Em outro conjunto, camundongos expressando uma Ang-2 humana no lugar de Ang-2 de camundongo do tipo selvagem (chamado "camundongo hu-Ang-2") foram usados. Os camundongos de dois dias de vida (P2) foram injetados subcutaneamente ou com controle Fc ou com anticorpos anti-Ang-2 selecionados em uma dose de 12,5 mg/kg. Três dias depois (em P5), os filhotes foram eutanizados e os globos oculares foram enucleados e fixados em PFA 4% por 30 minutos. As retinas foram dissecadas, tingidas com lectina-1 de Griffonia simplicifolia por 3 horas ou da noite para o dia a 4o C para visualizar a vasculatura, e montadas lisas em lâminas de microscópio. As imagens foram feitas usando uma câmera de microscópio Nikon Eclipse 80i e analisadas usando software Adobe Photoshop CS3, Fovea 4,0, e Scion 1,63.

[000154] Áreas da retina cobertas com vasculatura superficial foram medidas e usadas como uma leitura de atividade de anticorpo. A redução no tamanho das áreas da vasculatura em camundongos tratados com anticorpo comparado com controles tratados com Fc é apresentada na Tabela 34. A redução percentual em área de vasculatura reflete a potência antiangiogênica do anticorpo. (N/D = não determinado).

[000155] Conforme mostrado neste Exemplo, os anticorpos anti-Ang-2 se-lecionados da presente invenção inibiram substancialmente angiogê- nese ocular in vivo, desta maneira refletindo o potencial antiangiogênico provável desses anticorpos em outros contextos terapêuticos.

Exemplo 13. Aminoácidos de Ang-2 Importantes para Ligação de Anticorpo

[000156] Para caracterizar mais a ligação entre mAbs de hAng2 e anti- hAng2 da invenção, sete proteínas hAng-2FD-mFc foram geradas, cada uma contendo uma mutação por ponto única. Os aminoácidos selecionados para mutação eram baseados na diferença em sequência entre hAng-2 e hAng-1 na região que interage com hTie-2 (figura 1). Em particular, aminoácidos dentro do domínio tipo fibrinogênio (FD) de Ang-2 que são acreditados interagir com Tie-2 com base em análise de estrutura de cristal, mas que diferem do aminoácido correspondente em Ang- 1, foram individualmente mutados para o resíduo de hAng-1 correspondente. Os resultados deste exemplo indicam os resíduos de aminoácido de hAng-2 com os quais os anticorpos de ligação preferencial com Ang- 2 interagem. Isto é, se um resíduo particular (ou resíduos) de hAng-2 é/são mudados para o resíduo correspondente de hAng-1, e a ligação de um anticorpo de ligação preferencial de Ang-2 é substancialmente reduzida, então pode ser concluído que o anticorpo interage com esse resíduo(s) particular de hAng-2.

[000157] Neste experimento, cada uma das sete proteínas mutantes hAng-2-mFc foi capturada (-147-283 RU) em uma superfície anti-ca- mundongo-Fc criada através de acoplamento químico direto a um chip BIACORE®. Então cada anticorpo Angi-2 (ou pepticorpo, conforme for o caso) a 100 nM foi injetado na superfície de proteína hAng-2FD marcada com mFc em uma taxa de fluxo de 50 pl/min por 180 segundos, e a dissociação de hAng2-FD-mFc variante e anticorpo foi monitorada em tempo real por 20 minutos a 25° C. Os resultados são sumarizados nas Tabelas 35a-35d e figura 3.

1] A numeração de aminoácido é baseada na numeração de aminoácido de SEQ ID NO:518, [2] WT = construto de Ang-2FD-mFc do tipo selvagem N/B = nenhuma ligação observada

[000158] Para propósitos da presente invenção, um anticorpo anti- Ang-2 é considerado interagir com um resíduo de aminoácido de Ang-2 particular se, quando o resíduo é mutado para o resíduo correspondente de Ang-1, o Ti/2de dissociação é pelo menos 5 vezes menos do que o Ti/2de dissociação observado para o construto do tipo selvagem sob as condições experimentais usadas neste Exemplo. Em vista desta definição, o anticorpo H1H685P parece ser único dentre os anticorpos testados pelo fato dele interagir com H469, Y475 e S480. Uma vez que H1H685P é também único por causa de sua ligação preferencial forte com Ang-2 com relação à Ang-1, pode ser concluído que F469, Y475 e S480 compreendem um epítopo que permite a distinção imunológica de Ang-2 de Ang-1. Os outros anticorpos/peptidocorpos testados neste experimento parecem interagir com no máximo um ou dois desses resíduos; isto é, H1H744 e Controle I interagem com Y475; Controle III interage com Y475 e S480; e Controle V interage com F469. Interessan- temente, Controle II, que foi mostrado bloquear ambas a Ang-1 e a Ang- 2 se ligando a Tie-2 com potência igual, não interage com nenhum dos aminoácidos específicos para Ang-2 identificados neste experimento.

[000159] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas aqui. Na verdade, várias modificações da invenção em adição àquelas descritas aqui se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir do relatório acima. Tais modificações pretendem se encaixar no escopo das reivindicações apensas.

Claims

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à angiopoietina-2 humana (hAng- 2), caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR-1 de cadeia pesada (HCDR-1) possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:4, um CDR-2 HCDR-2 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:6, uma HCDR-3 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8, uma LCDR-1 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:12, LCDR-2 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:14, uma LCDR-3 possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:16.

2. Anticorpo isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à angiopoietina-2 humana (hAng-2), caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia pesada possuindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 e uma região variável de cadeia leve com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 1 e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antagonista do fator de crescimento de células endoteliais vasculares (VEGF).

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o antagonista de VEGF é selecionado de um anticorpo anti-VEGF, um inibidor de cinase de molécula pequena de receptor de VEGF e uma proteína de fusão de inibição de VEGF.

6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreendendo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 2 e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antagonista do fator de crescimento de células endoteliais vasculares (VEGF).

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o antagonista de VEGF é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo anti-VEGF, um inibidor de cinase de molécula pequena do receptor de VEGF e uma proteína de fusão inibidora de VEGF.

9. Uso do anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um paciente tendo um tumor.

10. Uso do anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ocular associada com angiogênese.