BR112014018651B1 - Anticorpos anti-asic1, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-ASIC1 E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que especificamente se ligam às células que expressam o canal iônico sensível a ácidos 1 (ASIC1). De acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos inibem as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos, nas células que expressam o ASIC1 humano. Os anticorpos da invenção são úteis para o tratamento de dor, incluindo a dor associada com a intervenção cirúrgica e diversas doenças e distúrbios.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos, e a fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são específicos para o ASIC1 humano, e aos métodos de uso dos mesmos.

ANTECEDENTES

[002] Os canais iônicos sensíveis a ácidos (ASICs) são canais catiônicos com controle de prótons, expressos nos sistemas nervosos central e periférico. A família de ASICs nos seres humanos inclui as subunidades ASIC1, ASIC2, ASIC3 e ASIC4, que se organizam nos canais iônicos homo- ou heteromultiméricos nas membranas neuronais. O ASIC1, o ASIC2 e o ASIC3 são expressos significativamente nos neurônicos sensórios nociceptivos pequenos e médios, que são capazes de detectar estímulos químicos, térmicos, e mecânicos de alto limiar, nocivos. O ASIC2 e o ASIC3 são também expressos em neurônios grandes que na maior parte correspondem aos mecanorreceptores de baixo limiar.

[003] Os ASICs são permeáveis aos íons Na+ e Ca2+ e são ativados por variações externas do pH que variam de pH 6,8 a 4,0. Acredita-se que os ASICs desempenhem um papel importante na sensibilização da acidose local. A acidose local do tecido é uma particularidade de dor e inflamação, e os tecidos inflamados frequentemente exibem baixo pH (tão baixo quanto ~4,7). O bloqueio dos ASICs foi proposto como um método para tratar uma variedade de distúrbios e condições. O bloqueio do ASIC1, em particular, foi proposto como um meio para tratar condições tais como a dor, as doenças neurodegenerativas, e as doenças psiquiátricas.

[004] Os inibidores farmacológicos do ASIC1 incluem o peptídeo de tarântula Psalmotoxina-1 (PcTx1), que especificamente inibe os homômeros de ASIC1, e os inibidores de ASIC não seletivos, de pequenas moléculas, amilorida e A-317567. A toxina peptídica de 40 aminoácidos APETx2, isolada da anêmona marinha, mostrou inibir os homômeros de ASIC3, bem como os heterômeros de ASIC3/1 e ASIC3/2.

[005] Atualmente, não existe nenhum anticorpo conhecido que especificamente bloqueie os ASICs. Desse modo, há uma necessidade na técnica por novos inibidores dos ASICs, tais como os anticorpos anti-ASIC1, que possam ser usados para tratar doenças e condições mediadas pela sinalização dos ASICs.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção proporciona anticorpos que especificamente ligam o ASIC1 humano, incluindo, por exemplo, os anticorpos que especificamente ligam o ASIC1 expresso na superfície da célula. Os anticorpos da presente invenção, de acordo com certas modalidades, inibem as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos, nas células que expressam o ASIC1 humano. Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para inibir a sinalização mediada pelo ASIC1 e para tratar doenças e distúrbios causados pela, ou relacionados à, atividade e/ou sinalização do ASIC1. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser administrados a um paciente para o tratamento ou o alívio de dor e condições relacionadas.

[007] Os anticorpos da invenção podem ser de tamanho natural (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem compreender somente uma parte de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv) e podem ser modificados para afetar a funcionalidade, por exemplo, para eliminar as funções efetoras residuais (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

[008] A presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia pesada (HCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, e 386, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[009] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável da cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, e 394, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0010] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno dele compreendendo um par de sequências da HCVR e a LCVR (HCVR/LCVR) selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, e 386/394.

[0011] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio CDR3 da cadeia pesada (HCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, e 392, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 da cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, e 400, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0012] Em certas modalidades, o anticorpo ou a parte de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende um par de sequências de aminoácidos da HCDR3/LCDR3 selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, 328/336, 344/352, 360/368, 376/384, e 392/400.

[0013] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou seu fragmento adicionalmente compreendendo um domínio CDR1 da cadeia pesada (HCDR1) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, e 388, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR2 da cadeia pesada (HCDR2) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374, e 390, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR1 da cadeia leve (LCDR1) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, e 396, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR2 da cadeia leve (LCDR2) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, e 398, ou uma sequência substancialmente similar dela tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0014] Certos anticorpos e fragmentos de ligação aos antígenos ilustrativos, não limitativos, da invenção compreendem os domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo as sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16 (por exemplo, H1M6712N); 20-22-24-28-30-32 (por exemplo, H1M6716N); 36-38-4044-46-48 (por exemplo, H1M6718N); 52-54-56-60-62-64 (por exemplo, H1M7101N); 68-70-72-76-78-80 (por exemplo, H2M7103N); 84-86-8892-94-96 (por exemplo, H3M6713N); 100-102-104-108-110-112 (por exemplo, H3M6715N); 116-118-120-124-126-128 (por exemplo, H3M6720N); 132-134-136-140-142-144 (por exemplo, H3M6721N); 148-150-152-156-158-160 (por exemplo, H3M6721N2); 164-166-168172-174-176 (por exemplo, H3M6726N); 180-182-184-188-190-192 (por exemplo, H3M6760N); 196-198-200-204-206-208 (por exemplo, H3M7102N); 212-214-216-220-222-224 (por exemplo, H3M7118N); 228-230-232-236-238-240 (por exemplo, H4H6362P); 244-246-248252-254-256 (por exemplo, H4H6363P); 260-262-264-268-270-272 (por exemplo, H4H6364P); 276-278-280-284-286-288 (por exemplo, H4H6366P); 292-294-296-300-302-304 (por exemplo, H4H6372P); 308-310-312-316-318-320 (por exemplo, H4H6374P); 324-326-328332-334-336 (por exemplo, H4H6375P); 340-342-344-348-350-352 (por exemplo, H4H6379P); 356-358-360-364-366-368 (por exemplo, H4H6380P); 372-374-376-380-382-384 (por exemplo, H4H6381P); e 388-390-392-396-398-400 (por exemplo, H4H6383P).

[0015] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que especificamente liga o ASIC1 (por exemplo, o ASIC1 expresso na superfície da célula), onde o anticorpo ou o fragmento compreende os domínios CDR das cadeias pesadas e leves contidos dentro das sequências das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves (HCVR/LCVR) selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, e 386/394. Os métodos e as técnicas para identificar as CDRs dentro das sequências de aminoácidos da HCVR e da LCVR são bastante conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar as CDRs dentro das sequências de aminoácidos da HCVR e/ou da LCVR especificadas, divulgadas neste documento. As convenções ilustrativas que podem ser usadas para identificar os limites das CDRs incluem, por exemplo, a definição de Kabat, a definição de Chothia, e a definição de AbM. Em termos gerais, a definição de Kabat é baseada na variabilidade da sequência, a definição de Chothia é baseada na posição das regiões de loop estruturais, e a definição de AbM é um meio-termo entre as abordagens de Kabat e Chothia. Vide, por exemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Os bancos de dados públicos estão também disponíveis para identificar as sequências da CDR dentro de um anticorpo.

[0016] Em outro aspecto, a invenção proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos anti-ASIC1 ou os seus fragmentos. Os vetores de expressão recombinantes que carregam os ácidos nucleicos da invenção, e as células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, são também incluídos pela invenção, como são os métodos de produzir os anticorpos por cultivo das células hospedeiras, sob condições que permitam a produção dos anticorpos, e recuperação dos anticorpos produzidos.

[0017] Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo ou um fragmento dele que compreende uma HCVR codificada por uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, e 385, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia.

[0018] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento dele compreendendo uma LCVR codificada por uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, e 393, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia.

[0019] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, e 391, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia; e um domínio LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, e 399, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia.

[0020] A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento dele que adicionalmente compreende um domínio HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, e 387, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia; um domínio HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, e 389, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia; um domínio LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, e 395, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia; e um domínio LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, e 397, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de sua homologia.

[0021] De acordo com certas modalidades, o anticorpo ou o fragmento dele compreende as sequências da CDR das cadeias pesadas e leves codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1 e 9 (por exemplo, H1M6712N), 17 e 25 (por exemplo, H1M6716N), 33 e 41 (por exemplo, H1M6718N), 49 e 57 (por exemplo, H1M7101N), 65 e 73 (por exemplo, H2M7103N), 81 e 89 (por exemplo, H3M6713N), 97 e 105 (por exemplo, H3M6715N), 113 e 121 (por exemplo, H3M6720N), 129 e 137 (por exemplo, H3M6721N), 145 e 153 (por exemplo, H3M6721N2), 161 e 169 (por exemplo, H3M6726N), 177 e 185 (por exemplo, H3M6760N), 193 e 201 (por exemplo, H3M7102N), 209 e 217 (por exemplo, H3M7118N), 225 e 233 (por exemplo, H4H6362P), 241 e 249 (por exemplo, H4H6363P), 257 e 265 (por exemplo, H4H6364P), 273 e 281 (por exemplo, H4H6366P), 289 e 297 (por exemplo, H4H6372P), 305 e 313 (por exemplo, H4H6374P), 321 e 329 (por exemplo, H4H6375P), 337 e 345 (por exemplo, H4H6379P), 353 e 361 (por exemplo, H4H6380P), 369 e 377 (por exemplo, H4H6381P), 385 e 393 (por exemplo, H4H6383P).

[0022] A presente invenção inclui anticorpos anti-ASIC1 tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, a modificação para remover os sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo não tendo uma porção de fucose presente sobre a cadeia de oligossacarídeo.

[0023] Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou fragmento dele, que especificamente liga o ASIC1 (por exemplo, o ASIC1 expresso na superfície da célula), e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção caracteriza uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti-ASIC1 e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que seja vantajosamente combinado com um anticorpo anti-ASIC1. Os agentes ilustrativos que podem ser vantajosamente combinados com um anticorpo anti-ASIC1 incluem, sem limitação, outros agentes que inibam a atividade do ASIC1 (incluindo outros anticorpos ou seus fragmentos de ligação aos antígenos, inibidores de peptídeos, antagonistas de pequenas moléculas, etc.) e/ou agentes que não liguem diretamente o ASIC1, porém, ainda assim, interfiram com, bloqueiem ou atenuem, as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1 nas células.

[0024] Ainda em outro aspecto, a invenção proporciona métodos para inibir as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1 usando um anticorpo anti-ASIC1 ou porção de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção, onde os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que seja melhorada, atenuada, inibida ou prevenida por remoção, inibição ou redução das correntes iônicas mediadas pelo ASIC1. Os anticorpos anti-ASIC1 ou os fragmentos dos anticorpos da invenção podem funcionar para bloquear as correntes mediadas pelo ASIC1 induzidas por ácidos ou, por outro lado, inibir a atividade de sinalização do ASIC1.

[0025] A presente invenção também inclui o uso de um anticorpo anti-ASIC1 ou porção de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado às, ou causado pelas, correntes iônicas mediadas pelo ASIC1 em um paciente.

[0026] As outras modalidades tornar-se-ão aparentes a partir de uma revisão da descrição detalhada subsequente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] A Figura 1 representa os começos de retraimento de camundongos tratados com um anticorpo anti-ASIC1 (H1M6718N), ou anticorpo de controle de isótipo, em resposta a um aperto mecânico da cauda (painel A) ou do músculo gastrocnêmio (painel B). Os resultados são expressos em termos de começo de retraimento ao aperto em gramas (média ± SEM para cada grupo de camundongos).

[0028] A Figura 2 mostra a porcentagem de mudança no começo de retraimento a partir da linha de base, na hiperalgesia do músculo induzida por solução salina ácida, em camundongos tratados com um anticorpo anti-ASIC1 (H1M6718N) ou controle de isótipo.

[0029] A Figura 3 (painéis A e B) mostram a porcentagem de mudança no começo de retraimento a partir da linha de base, na hiperalgesia do músculo induzida por carragenina, em camundongos tratados com o anticorpo anti-ASIC1 (H1M6718N, 10 ou 40 mg/kg - painel A; ou H4H6721N2, 10 ou 30 mg/kg - painel B), ou controle de isótipo.

[0030] A Figura 4 mostra a extensão da alodinia táctil induzida por taxol ao longo do tempo em camundongos administrados com taxol que foram tratados com 30 mg/kg (s.c.) de um anticorpo de controle de isótipo, 30 mg/kg (s.c.) de H1M6718N, ou 100 mg/kg (s.c.) de gabapentina. Os resultados são expressos em termos de começo de retraimento (g) como medido usando as fibras de Von Frey (conforme descritas no Exemplo 10).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0031] Antes da presente invenção ser descrita, é para ser entendido que esta invenção não está limitada aos métodos e condições experimentais particulares descritos, visto que tais métodos e condições podem variar. Também é para ser entendido que a terminologia usada neste documento é para o propósito de descrever modalidades particulares somente, e não é pretendida para ser limitativa, visto que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.

[0032] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendidos por alguém de habilidade comum na técnica à qual pertence esta invenção. Conforme usado neste documento, o termo "cerca de", quando usado em referência a um valor numérico citado particular, significa que o valor pode variar a partir do valor citado em não mais do que 1%. Por exemplo, conforme usada neste documento, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores no meio (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0033] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são agora descritos.

DEFINIÇÕES

[0034] As expressões "ASIC1" e "fragmento de ASIC1", como usadas neste documento, referem-se à proteína ou fragmento de ASIC1 humano, a não ser que especificado como sendo de uma espécie não humana (por exemplo, "ASIC1 de camundongo", "fragmento de ASIC1 de camundongo", "ASIC1 de macaco", fragmento de ASIC1 de macaco", etc.). O ASIC1 humano tem o aminoácido como apresentado em SEQ ID NO:401). A expressão "ASIC1", conforme usada neste documento, inclui os fragmentos solúveis do domínio extracelular de ASIC1 (por exemplo, os polipeptídeos compreendendo ou consistindo em pelo menos 30 aminoácidos contíguos encontrados dentro dos aminoácidos 63 a 424 de SEQ ID NO:401), bem como i ASIC1 expresso na superfície da célula (conforme este termo é definido aqui abaixo).

[0035] Conforme usado neste documento, "um anticorpo que liga o ASIC1" ou um "anticorpo anti-ASIC1" inclui os anticorpos, e os seus fragmentos de ligação aos antígenos, que ligam um fragmento solúvel de uma proteína ASIC1 (por exemplo, uma parte do domínio extracelular de ASIC1) e/ou i ASIC1 expresso na superfície da célula. A expressão "ASIC1 expresso na superfície da célula" significa uma ou mais proteínas ASIC1 que são expressas sobre a superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo tal que pelo menos uma parte da proteína ASIC1 (por exemplo, os aminoácidos 63 a 424 de SEQ ID NO:401) esteja exposta ao lado extracelular da membrana da célula e acessível para uma parte de ligação ao antígeno de um anticorpo. O "ASIC1 expresso na superfície da célula" inclui a proteína ASIC1 contida no contexto de um canal iônico ASIC1 funcional na membrana de uma célula. Em algumas situações, o "ASIC1 expresso na superfície da célula" é uma proteína ASIC1 que é expressa como parte de um heteromultímero sobre a superfície de uma célula (por exemplo, um heteromultímero ASIC1/2, ASIC1/3 ou ASIC1/4). Em outras situações, o "ASIC1 expresso na superfície da célula" é uma proteína ASIC1/2, ASIC1/3 or ASIC1/4 que é expressa como parte de um homomultímero sobre a superfície de uma célula. Além disso, o "ASIC1 expresso na superfície da célula" pode compreender ou consistir na proteína ASIC1 expressa sobre a superfície de uma célula que normalmente expressa a proteína ASIC1. Alternativamente, o "ASIC1 expresso na superfície da célula" pode compreender ou consistir na proteína ASIC1 expressa sobre a superfície de uma célula que normalmente não expressa o ASIC1 humano sobre a sua superfície, porém tenha sido artificialmente engenheirada para expressar o ASIC1 sobre a sua superfície.

[0036] O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região determinante da complementariedade (CDR) que especificamente liga-se a, ou interage com, um antígeno particular (por exemplo, o ASIC1). O termo "anticorpo" inclui as moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto, bem como os seus multímeros (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (abreviada neste documento como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes da complementariedade (CDRs), entremeadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de armação (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir da extremidade de amino até a extremidade de carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Nas diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-ASIC1 (ou sua porção de ligação ao antígeno) podem ser idênticas às sequências das linhas germinativas humanas, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[0037] O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, também inclui os fragmentos de ligação aos antígenos de moléculas de anticorpos inteiras. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e similar, como usados neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína que ocorra naturalmente, obtenível enzimaticamente, sintética, ou geneticamente engenheirada que especificamente ligue um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação aos antígenos de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpos inteiras usando quaisquer técnicas padrões adequadas, tais como a digestão proteolítica ou as técnicas de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e a expressão de DNA que codifica domínios variáveis e opcionalmente constantes dos anticorpos. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, as bibliotecas de fagos- anticorpos), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou por utilização de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para organizar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modificar, adicionar ou remover aminoácidos, etc.

[0038] Os exemplos não limitativos de fragmentos de ligação aos antígenos incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de uma única cadeia (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácidos que copiam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante da complementariedade (CDR) isolada, tal como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restringido. Outras moléculas engenheiradas, tais como os anticorpos de domínios específicos, os anticorpos de um único domínio, os anticorpos de domínios removidos, os anticorpos quiméricos, os anticorpos enxertados com CDR, os diacorpos, os triacorpos, os tetracorpos, os minicorpos, os nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), as substâncias imunofarmacêuticas modulares pequenas (SMIPs), e os domínios de IgNAR variáveis shark, são também incluídas na expressão "fragmento de ligação ao antígeno", conforme usado neste documento.

[0039] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que esteja adjacente a, ou em quadro com, uma ou mais sequências de armação. Nos fragmentos de ligação aos antígenos tendo um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer arranjo adequado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter os dímeros VH- VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.

[0040] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. As configurações ilustrativas, não limitativas, de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo quaisquer das configurações ilustrativas listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados um ao outro ou podem ser ligados por uma região de articulação ou ligadora total ou parcial. Uma região de articulação pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultem em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula de polipeptídeo. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de quaisquer das configurações de domínios variáveis e constantes listadas acima em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(ões) de dissulfeto).

[0041] Como com as moléculas de anticorpos inteiras, os fragmentos de ligação aos antígenos podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos dois domínios variáveis diferentes, onde cada domínio variável é capaz de ligar-se especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente sobre o mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpos biespecíficos ilustrativos divulgados neste documento, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção, usando práticas de rotina, disponíveis na técnica.

[0042] Pretende-se que o termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento, inclua os anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas das linhas germinativas humanas. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas das linhas germinativas humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica para um sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, a CDR3. Entretanto, não se pretende que o termo "anticorpo humano", conforme usado neste documento, inclua os anticorpos nos quais as sequências da CDR derivadas da linha germinativa de outras espécies mamíferas, tais como um camundongo, tenham sido enxertadas nas sequências de articulação humanas.

[0043] Pretende-se que o termo "anticorpo humano recombinante", conforme usado neste documento, inclua todos os anticorpos humanos que sejam preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante, tal como os anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrita adicionalmente abaixo), os anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatórios, recombinantes (descrita adicionalmente abaixo), os anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que seja transgênico para os genes de imunoglobulinas humanas (vide, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou os anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a remoção das sequências dos genes de imunoglobulinas humanas para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulinas das linhas germinativas humanas. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes estão sujeitos à mutagênese in vitro (ou, quando for usado um animal transgênico para as sequências de Ig humanas, mutagênese somática in vivo) e, desse modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas das, e relacionadas às, sequências de VH e VL das linhas germinativas humanas, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhas germinativas de anticorpos humanos in vivo.

[0044] Os anticorpos humanos podem existir em duas formas que estão associadas com a heterogeneidade da articulação. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende uma construção estável de quatro cadeias de aproximadamente 150-160 kDa, em que os dímeros são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto de cadeias pesadas entre as cadeias. Em uma segunda forma, os dímeros não estão ligados por meio de ligações de dissulfeto entre cadeias e uma molécula de aproximadamente 75-80 kDa é formada, composta de uma cadeia leve e pesada acoplada covalentemente (semianticorpo). Estas formas têm sido extremamente difíceis de separar, mesmo após a purificação por afinidade.

[0045] A frequência do surgimento da segunda forma em diversos isótipos de IgG intactos é devida, porém não limitada, às diferenças estruturais associadas com o isótipo da região de articulação do anticorpo. Uma única substituição de aminoácido na região de articulação da articulação da IgG4 humana pode reduzir significativamente o surgimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) até níveis tipicamente observados usando uma articulação de IgG1 humana. A presente invenção inclui os anticorpos tendo uma ou mais mutações na região de articulação, CH2 ou CH3, que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para melhorar o rendimento da forma de anticorpo desejada.

[0046] Um "anticorpo isolado", conforme usado neste documento, significa um anticorpo que tenha sido identificado e separado e/ou recuperado de pelo menos um componente de seu meio natural. Por exemplo, um anticorpo que tenha sido separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula na qual o anticorpo exista naturalmente ou é naturalmente produzido, é um "anticorpo isolado" para os propósitos da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Os anticorpos isolados são anticorpos que tenham sido submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anticorpo isolado pode estar substancialmente livre de outro material celular e/ou substâncias químicas.

[0047] Pretende-se que um anticorpo "de neutralização" ou "de bloqueio", conforme usado neste documento, refira-se a um anticorpo cuja ligação ao ASIC1 reduza ou iniba de modo detectável as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1 induzidas por ácidos. A inibição causada por um anticorpo de neutralização ou bloqueio do ASIC1 não necessita ser completa, desde que ela seja detectável usando um ensaio apropriado. Os ensaios ilustrativos para detectar a inibição do ASIC1 são descritos alhures neste documento.

[0048] Os anticorpos anti-ASIC1 divulgados neste documento podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou remoções de aminoácidos nas regiões de armação e/ou CDR dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves, em comparação com as sequências das linhas germinativas correspondentes a partir das quais os anticorpos foram derivados. Tais mutações podem ser prontamente verificadas comparando-se as sequências de aminoácidos divulgadas neste documento com as sequências das linhas germinativas disponíveis a partir de, por exemplo, bancos de dados públicos de sequências de anticorpos. A presente invenção inclui os anticorpos, e os seus fragmentos de ligação aos antígenos, que são derivados de quaisquer das sequências de aminoácidos divulgadas neste documento, onde um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de armação e/ou CDR são mutados no(s) resíduo(s) correspondente(s) da sequência da linha germinativa a partir da qual o anticorpo foi derivado, ou no(s) resíduo(s) correspondente(s) de outra sequência da linha germinativa humana, ou em uma substituição de aminoácido conservativa do(s) resíduo(s) da linha germinativa correspondente(s) (tais modificações das sequências são referidas aqui coletivamente como "mutações da linha germinativa"). Uma pessoa de habilidade comum na técnica, começando com as sequências das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves divulgadas neste documento, pode facilmente produzir diversos anticorpos e fragmentos de ligação aos antígenos que compreendam uma ou mais mutações das linhas germinativas individuais ou suas combinações. Em certas modalidades, todos os resíduos da armação e/ou da CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência da linha germinativa original a partir da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, somente certos resíduos são mutados de volta para a sequência da linha germinativa original, por exemplo, somente os resíduos mutados encontrados dentro dos primeiros 8 aminoácidos de FR1 ou dentro dos últimos 8 aminoácidos de FR4, ou somente os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dos resíduos da armação e/ou CDR são mutados no(s) resíduo(s) correspondente(s) de uma sequência da linha germinativa diferente (isto é, uma sequência da linha germinativa que é diferente da sequência da linha germinativa a partir da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações da linha germinativa dentro das regiões de armação e/ou CDR, por exemplo, onde certos resíduos individuais forem mutados no resíduo correspondente de uma sequência da linha germinativa particular, enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência da linha germinativa original são mantidos ou são mutados no resíduo correspondente de uma sequência da linha germinativa diferente. Assim que obtidos, os anticorpos e os fragmentos de ligação aos antígenos que contêm uma ou mais mutações de linha germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedades desejadas, tais como especificidade de ligação aperfeiçoada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas melhoradas ou aumentadas (conforme possa ser o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Os anticorpos e os fragmentos de ligação aos antígenos obtidos neste modo geral estão incluídos na presente invenção.

[0049] A presente invenção também inclui os anticorpos anti- ASIC1 compreendendo variantes de quaisquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR divulgadas neste documento, tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-ASIC1 tendo as sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc. substituições de aminoácidos conservativas em relação a quaisquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR divulgadas neste documento.

[0050] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo, conhecida como um parátopo. Um único antígeno pode ter mais do que um epítopo. Desse modo, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas sobre um antígeno ou podem ter diferentes efeitos biológicos. Os epítopos podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido justapondo-se espacialmente aminoácidos de diferentes segmentos da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Em certa circunstância, um epítopo pode incluir porções de sacarídeos, grupos fosforila, ou grupos sulfonila sobre o antígeno.

[0051] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se referindo a um ácido nucleico ou ao seu fragmento, indica que, quando otimamente alinhado com inserções ou remoções de nucleotídeos apropriadas com outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade da sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, como medida por qualquer algoritmo bastante conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, conforme discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico tendo identidade substancial com uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certas situações, codificar um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos igual ou substancialmente similar ao polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[0052] Conforme aplicado aos polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando valores de espaços predeterminados, compartilham pelo menos 95% de identidade da sequência, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% ou 99% de identidade da sequência. De preferência, as posições dos resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Nos casos onde duas ou mais sequências de aminoácidos diferirem uma da outra por substituições conservativas, a porcentagem de identidade da sequência ou grau de similaridade pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meios para efetuar este ajuste são bastante conhecidos para aqueles de habilidade na técnica. Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Os exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais alifáticas de hidroxila: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e (7) as cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Os grupos preferidos de substituição de aminoácidos conservativa são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina- tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração tendo um valor positivo na matriz de probabilidade de log de PAM250, divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer alteração tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade de log de PAM250.

[0053] A similaridade da sequência para os polipeptídeos, que é também referida como identidade da sequência, é tipicamente medida usando o software de análise da sequência. O software de análise da proteína seleciona sequências similares usando medidas de similaridade atribuídas a diversas substituições, remoções e outras modificações, incluindo as substituições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, o software GCG contém programas, tais como Gap e Bestfit, que podem ser usados com parâmetros predeterminados para determinar a homologia da sequência ou a identidade da sequência entre polipeptídeos muito relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína dela. Vide, por exemplo, o GCG Versão 6.1. As sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA, usando parâmetros predeterminados ou recomentados, um programa no GCG Versão 6.1. O FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhamentos e porcentagem da identidade da sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de pergunta e de busca (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando se compara uma sequência da invenção com um banco de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros predeterminados. Vide, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS DOS ANTICORPOS

[0054] A presente invenção inclui anticorpos que especificamente ligam o ASIC1 expresso na superfície da célula. Conforme usado neste documento, um anticorpo especificamente liga o ASIC1 expresso na superfície da célula, se o anticorpo mostrar ligação detectável a uma célula que natural ou artificialmente expressa o ASIC1, porém não mostrar ligação detectável a uma célula equivalente que não expressa o ASIC1. Um formato de ensaio ilustrativo que pode ser usado para determinar se um anticorpo especificamente liga o ASIC1 expresso na superfície da célula é a classificação das células ativada por fluorescência (FACS), como ilustrada no Exemplo 3 aqui contido. A ligação de FACS positiva qualitativa de um anticorpo às células que expressam o ASIC1, como mostrada na Tabela 2, pode ser usada para identificar um anticorpo como especificamente ligando o ASIC1 expresso na superfície da célula. A FACS pode também ser usada para avaliar quantitativamente a ligação do anticorpo à célula que expressa o ASIC1 em termos de um valor de EC50, conforme mostrado no Exemplo 3, Tabela 3. Desse modo, de acordo com certas modalidades da presente invenção, um anticorpo "especificamente liga o ASIC1 expresso na superfície da célula" se o anticorpo, quando testado no formato de ensaio de FACS do Exemplo 3 ou em um formato de ensaio substancialmente similar, exibir um valor de EC50 de cerca de 5 nM ou menos (por exemplo, cerca de 5,0 nM, 4,5 nM, 4,0 nM, 3,5 nM, 3,0 nM, 2,5 nM, 2,0 nM, 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1,2 nM, 1,1 nM, 1,0 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 90 pM, 85 pM, 80 pM, 75 pM, 70 pM, ou menos).

[0055] Os anticorpos da presente invenção, de acordo com certas modalidades, podem também (ou alternativamente) atuar para inibir as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos, nas células que expressam o ASIC1 humano. Conforme usada neste documento, a expressão "inibe as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos" significa que, em um ensaio no qual as correntes iônicas celulares induzidas por ácidos, ou o fluxo, podem ser detectadas e/ou quantificadas, a adição de um anticorpo da invenção reduz ou inibe de modo detectável as correntes iônicas induzidas por ácidos, comparadas às correntes iônicas observadas na ausência do anticorpo (por exemplo, na presença de um anticorpo de controle negativo não específico). Um ensaio ilustrativo não limitativo que pode ser usado para determinar se um anticorpo "inibe as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos" é ilustrado no Exemplo 4 aqui contido. Neste Exemplo, o fluxo de cálcio ativado pelo pH baixo é medido nas células que expressam o ASIC1, na presença de anticorpos anti-ASIC1 ("ensaio de FLIPR"). Por variação da quantidade de anticorpo usado neste formato de ensaio, a quantidade de anticorpo requerido para bloquear 50% do fluxo iônico induzido por pH baixo pode ser calculada e expressa como um valor de IC50 (vide, por exemplo, o Exemplo 4, Tabela 5). A presente invenção inclui os anticorpos anti-ASIC1 que inibem as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos, com uma IC50 de menos do que cerca de 10 nM, quando testados em um ensaio de FLIPR, em pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 (por exemplo, em pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, ou 6,0), conforme descrito acima, ou em um ensaio substancialmente similar. Por exemplo, a invenção inclui os anticorpos anti-ASIC1 que exibem uma IC50 de menos do que cerca de 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, ou menos, quando testados em um ensaio de FLIPR em pH 5,5, conforme descrito acima, ou em um ensaio substancialmente similar.

[0056] Os outros formatos de ensaios ilustrativos que podem ser usados para determinar se um anticorpo "inibe as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos", são ilustrados nos Exemplos 5 e 6 aqui contidos. Nestes Exemplos, os ensaios automatizados de fixação de voltagem, fixação de placa ("voltageclamp, patch-clamp") são usados para medir e/ou avaliar a inibição do fluxo de corrente nas células que expressam o ASIC1, em pH ácido, na presença de um anticorpo anti-ASIC1, em comparação com o fluxo de corrente observado sob circunstâncias equivalentes, na ausência do anticorpo (por exemplo, na presença de um anticorpo de controle negativo não específico). Um anticorpo é considerado "inibir as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos", se o anticorpo, quando testado em um ensaio de fixação de voltagem, fixação de placa, em uma concentração de anticorpo de cerca de 1 nM a cerca de 100 nM, em um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 (por exemplo, em pH 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, or 6,0), causar pelo menos uma inibição da corrente de 10% (por exemplo, pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou maior de inibição do fluxo de corrente; vide, por exemplo, o Exemplo 5, Tabela 6). Em algumas situações, os anticorpos da invenção inibem completamente o fluxo de corrente (inibição de 100%) em 10 nM ou maior (por exemplo, 100 nM), quando testados em um formato de ensaio de fixação de placa, conforme descrito acima, ou em um ensaio substancialmente similar.

[0057] A presente invenção também inclui os anticorpos que inibem ou reduzem a(s) resposta(s) de dor em diversos modelos de dor de animais. Os modelos de dor de animais ilustrativos, usados para caracterizar os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção, são ilustrados nos Exemplos 7-9 aqui contidos. Por exemplo, a presente invenção inclui os anticorpos anti-ASIC1 que atenuam ou inibem as respostas de dor à dor visceral induzida por ácido, em um modelo de camundongo (vide, por exemplo, o Exemplo 7). Em particular, a presente invenção inclui os anticorpos anti-ASIC1 que exibem pelo menos uma inibição de 20% das respostas à dor visceral (por exemplo, constrições abdominais em resposta a uma injeção intraperitoneal de 0,6% de ácido acético), quando administrados em uma dose de cerca de 1 a ou 10 mg/kg, a um modelo de camundongo como mostrado no Exemplo 7, ou a um modelo substancialmente similar. Em certas situações, a porcentagem de inibição nas respostas de dor devida à administração de um anticorpo da presente invenção pode ser tão alta quanto cerca de 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, ou maior, quando testado no modelo de dor em animal camundongo do Exemplo 7, ou em um modelo substancialmente similar. Os outros modelos de dor de animais que podem ser usados para caracterizar os anticorpos anti-ASIC da presente invenção incluem, por exemplo, os modelos de resposta de dor de nocicepção mecânica do Exemplo 8, os modelos de dores musculares do Exemplo 9, e outros modelos de animais similares, disponíveis na técnica. Desse modo, a presente invenção inclui anticorpos anti-ASIC1 capazes de atenuar ou inibir as respostas de dor a estímulos mecânicos nocivos (vide, por exemplo, o Exemplo 8); e/ou hiperalgesia do músculo induzida por solução salina ácida ou carragenina (vide, por exemplo, o Exemplo 9), como demonstrado em modelos de animais apropriados, conforme exemplificados neste documento.

MAPEAMENTO DO EPÍTOPO E TECNOLOGIAS RELACIONADAS

[0058] A presente invenção inclui os anticorpos anti-ASIC1 que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados dentro do domínio extracelular do ASIC humano (aminoácidos 63 a 424 de SEQ ID NO:401). O epítopo ao qual se ligam os anticorpos pode consistir em uma única sequência contígua de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos localizados dentro do domínio extracelular do ASIC1. Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) localizados dentro do domínio extracelular do ASIC1.

[0059] Podem ser usadas diversas técnicas conhecidas para as pessoas de habilidade comum na técnica para determinar se um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. As técnicas ilustrativas incluem, por exemplo, o ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descrito em Antibodies, Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), a análise mutacional de varredura de alanina, a análise de blots de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), e a análise da clivagem de peptídeo. Além disso, podem ser empregados métodos, tais como a excisão de epítopo, a extração de epítopo e a modificação química de antígeno (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual interage um anticorpo é a troca entre hidrogênio/deutério, detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca entre hidrogênio/deutério envolve marcar com deutério a proteína de interesse, seguido por ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. A seguir, o complexo de proteína/anticorpo é transferido para a água, para permitir que ocorra a troca entre hidrogênio-deutério em todos os resíduos, exceto pelos resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanecem marcados com deutério). Após a dissociação do anticorpo, a proteína-alvo é submetida à clivagem com protease e à análise por espectrometria de massa, com isso revelando os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.

[0060] A presente invenção adicionalmente inclui os anticorpos anti-ASIC1 que se ligam ao mesmo epítopo que quaisquer anticorpos ilustrativos específicos descritos neste documento (por exemplo, H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, H3M7118N, H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, H4H6383P etc.). Também, a presente invenção também inclui os anticorpos anti-ASIC1 que competem pela ligação ao ASIC1 ou ao ASIC1 expresso na superfície da célula com quaisquer dos anticorpos ilustrativos específicos descritos neste documento (por exemplo, H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, H3M7118N, H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, H4H6383P etc.).

[0061] Pode-se facilmente determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que, ou compete pela ligação com, um anticorpo anti- ASIC1 de referência utilizando métodos de rotina, conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-ASIC1 de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína ASIC1 (por exemplo, ASIC1 expresso na superfície da célula). A seguir, a capacidade de um anticorpo de teste de se ligar à molécula de ASIC1 é avaliada. Se o anticorpo de teste for capaz de ligar-se ao ASIC1 após a ligação por saturação com o anticorpo anti-ASIC1 de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente que o anticorpo anti-ASIC1 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de ligar-se à molécula de ASIC1 após a ligação por saturação com o anticorpo anti-ASIC1 de referência, então o anticorpo de teste pode ligar-se ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti-ASIC1 de referência da invenção. Pode então ser realizada experimentação de rotina adicional (por exemplo, análises de mutação de peptídeo e ligação) para confirmar se a ausência observada de ligação do anticorpo de teste é, na realidade, devida à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se o bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela ausência da ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser efetuados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo, disponível na técnica. De acordo com certas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo (ou epítopo de sobreposição) se, por exemplo, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibir a ligação do outro em pelo menos 50%, porém preferivelmente 75%, 90% ou mesmo 99%, como medida em um ensaio de ligação competitiva (vide, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos são considerados ligarem-se ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno, que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzirem ou eliminarem a ligação do outro. Dois anticorpos são considerados terem "epítopos de sobreposição" se somente um subgrupo das mutações dos aminoácidos, que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzir ou eliminar a ligação do outro.

[0062] Para determinar se um anticorpo compete pela ligação com um anticorpo anti-ASIC1 de referência, efetua-se a metodologia de ligação acima descrita em duas orientações. Em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado ligar-se a uma molécula de ASIC1 (por exemplo, o ASIC1 expresso na superfície da célula), sob condições de saturação, seguido por avaliação da ligação do composto de teste à molécula de ASIC1. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado ligar-se a uma molécula de ASIC1, sob condições de saturação, seguido por avaliação da ligação do anticorpo de referência à molécula de ASIC1. Se, em ambas as orientações, somente o primeiro anticorpo (de saturação) for capaz de ligar-se à molécula de ASIC1, então conclui-se que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem pela ligação ao ASIC1. Conforme será apreciado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo que compete pela ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente ligar-se ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência, porém pode bloquear estericamente a ligação do anticorpo de referência por ligação de um epítopo de sobreposição ou adjacente.

PREPARAÇÃO DOS ANTICORPOS HUMANOS

[0063] Os métodos para gerar anticorpos monoclonais, incluindo os anticorpos monoclonais totalmente humanos, são conhecidos na técnica. Quaisquer tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para preparar os anticorpos humanos que especificamente se ligam ao ASIC1 humano.

[0064] Usando a tecnologia VELOCIMMUNE® ou qualquer outro método conhecido para gerar anticorpos monoclonais, os anticorpos quiméricos de alta afinidade para o ASIC1 são inicialmente isolados, tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção experimental abaixo descrita, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto às características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada, para gerar o anticorpo totalmente humano da invenção, por exemplo, a IgG1 ou a IgG4 do tipo selvagem ou modificada. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de alta afinidade, ligação ao antígeno e especificidade-alvo estão presentes na região variável.

BIOEQUIVALENTES

[0065] Os anticorpos anti-ASIC1 e os fragmentos de anticorpos da presente invenção incluem proteínas tendo sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, porém que conservam a capacidade de ligar o ASIC1 humano. Tais anticorpos e fragmentos de anticorpos variantes compreendem uma ou mais adições, remoções, ou substituições de aminoácidos, quando comparados à sequência de origem, porém exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Também, as sequências de DNA codificando o anticorpo anti-ASIC1 da presente invenção incluem sequências que compreendem uma ou mais adições, remoções, ou substituições de nucleotídeos, quando comparadas à sequência divulgada, porém que codificam um anticorpo anti-ASIC1 ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-ASIC1 ou fragmento de anticorpo da invenção. Os exemplos de tais sequências de aminoácidos e de DNA variantes são discutidos acima.

[0066] Duas proteínas de ligação a um antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas, cuja taxa e grau de absorção não mostram uma diferença significativa quando administradas na mesma dose molar, sob condições experimentais similares, dose individual ou dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles forem equivalentes no grau de sua absorção, porém não em sua taxa de absorção, e também podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para a obtenção de concentrações efetivas de fármaco no corpo no, por exemplo, uso crônico, e são consideradas medicamente insignificantes para o produto de fármaco particular estudado.

[0067] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a um antígeno são bioequivalentes se não houver nenhuma diferença clinicamente significativa em sua segurança, pureza, e potência.

[0068] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a um antígeno são bioequivalentes se um paciente puder ser mudado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico, sem um aumento esperado no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significativa na imunogenicidade, ou eficácia diminuída, em comparação com a terapia continuada, sem tal troca.

[0069] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação a um antígeno são bioequivalentes se as duas aturarem por um mecanismo, ou mecanismos, comum de ação para a condição ou as condições uso, até o ponto em que tais mecanismos forem conhecidos.

[0070] A bioequivalência pode ser demonstrada por métodos in vivo e in vitro. As medições de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que a concentração do anticorpo ou de seus metabólitos é medida no sangue, plasma, soro, ou outro fluido biológico, como uma função do tempo; (b) um teste in vitro que tenha sido correlacionado com os, e seja razoavelmente preditivo dos, dados de biodisponibilidade in vivo em seres humanos; (c) um teste in vivo em seres humanos ou outros mamíferos, em que o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou de seu alvo) é medido como uma função do tempo; e (d) em um ensaio clínico bem controlado que estabeleça segurança, eficácia, ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[0071] As variantes bioequivalenes dos anticorpos anti-ASIC1 da invenção podem ser construídas, por exemplo, fazendo-se diversas substituições de resíduos ou sequências ou removendo-se resíduos ou sequências terminais ou internas não necessárias para a atividade biológica. Por exemplo, os resíduos de cisteína não essenciais para a atividade biológica podem ser removidos ou substituídos por outros aminoácidos, para impedir a formação de pontes de dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas, com a renaturação. Em outros contextos, os anticorpos bioequivalentes podem incluir as variantes do anticorpo anti-ASIC1 compreendendo trocas de aminoácidos que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem a glicosilação.

SELETIVIDADE DAS ESPÉCIES E REATIVIDADE CRUZADA DAS ESPÉCIES

[0072] De acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos anti-ASIC1 se ligam ao ASIC1 humano, porém não ao ASIC1 de outras espécies. A presente invenção também inclui os anticorpos anti-ASIC1 que se ligam ao ASIC1 humano e ao ASIC1 de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti- ASIC1 da invenção podem se ligar ao ASIC1 humano e podem se ligar ou não, conforme possa ser o caso, a um ou mais de ASIC1 de camundongo, rato, porquinho-da-índia, hamster, rato-do-deserto, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cynomologous, mico, reso ou chimpanzé. A presente invenção também inclui os anticorpos anti-ASIC1 que bloqueiam seletivamente as correntes iônicas induzidas por ácidos através dos canais ASIC1 humanos (porém não através dos canais ASIC1 não humanos). Alternativamente, de acordo com certas modalidades, proporcionam- se anticorpos anti-ASIC1 que bloqueiam as correntes iônicas induzidas por ácidos através dos canais ASIC1 humanos, bem como através dos canais ASIC1 não humanos (por exemplo, camundongo, rato, etc.) (Vide, por exemplo, o Exemplo 5, aqui contido).

IMUNOCONJUGADOS

[0073] A invenção inclui os anticorpos monoclonais anti-ASIC1 conjugados a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Os agentes citotóxicos incluem qualquer agente que seja prejudicial para as células. Os exemplos de agentes citotóxicos e agentes quimioterápicos adequados para formar imunoconjugados são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, o WO 05/103081).

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[0074] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, ou multiespecíficos. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo-alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais do que um polipeptídeo-alvo. Vide, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção podem ser ligados a, ou coexpressos com, outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento dele pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo, para produzir um anticorpo biespecífico ou um multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos onde um braço de uma imunoglobulina é específico para o ASIC1 humano ou um fragmento dele, e o outro braço da imunoglobulina é específico para um segundo alvo terapêutico ou está conjugado a uma porção terapêutica.

[0075] Um formato de anticorpo biespecífico ilustrativo que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 da imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 da Ig, onde o primeiro e o segundo domínios CH3 da Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e onde pelo menos uma diferença do aminoácido reduz a ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A, em comparação com um anticorpo biespecífico não tendo a diferença do aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 da Ig liga a Proteína A e o segundo domínio CH3 da Ig contém uma mutação que reduz ou anula a ligação da Proteína A, tal como uma modificação H95R (pela numeração de exon do IMGT; H435R pela numeração da UE). O segundo CH3 pode adicionalmente compreender uma modificação Y96F (pelo IMGT; Y436F pela UE). As modificações adicionais que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (pelo IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I pela UE), no caso dos anticorpos de IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I pela UE), no caso dos anticorpos de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (pelo IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I pela UE), no caso dos anticorpos de IgG4. As variações sobre o formato do anticorpo biespecífico descritas acima são contempladas no escopo da presente invenção.

FORMULAÇÃO TERAPÊUTICA E ADMINISTRAÇÃO

[0076] A invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos anti-ASIC1 ou os seus fragmentos de ligação aos antígenos da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com veículos, excipientes, e outros agentes adequados, que proporcionam transferência, distribuição, tolerância aperfeiçoadas, e similares. as múltiplas formulações apropriadas podem ser encontradas no formulário conhecido para todos os químicos-farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, os pós, as pastas, os unguentos, as geleias, as ceras, os óleos, os lipídios, as vesículas contendo lipídios (catiônicos ou aniônicos) (tais como LIPOFECTIN®, Life Technologies, Carlsbad, CA), os conjugados de DNA, as pastas de absorção anidras, as emulsões de óleo em água e de água em óleo, as emulsões carbowax (polietileno glicóis de diversos pesos moleculares), os géis semissólidos, e as misturas semissólidas contendo carbowax. Vide também Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0077] A dose de anticorpo administrado a um paciente pode variar, dependendo da idade e do tamanho do paciente, da doença- alvo, das condições, da rota de administração, e similares. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso do corpo ou a área de superfície do corpo. Quando um anticorpo da presente invenção for usado para tratar uma condição ou doença associada com a atividade do ASIC1 em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar intravenosamente o anticorpo da presente invenção normalmente uma única dose de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso do corpo, mais preferivelmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso do corpo. Dependendo da gravidade a condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. As dosagens efetivas e os programas para administrar os anticorpos anti-ASIC1 podem ser determinados empiricamente; por exemplo, o progresso do paciente pode ser monitorado por avaliação periódica, e a dose ajustada correspondentemente. Além disso, o escalonamento das dosagens entre as espécies pode ser efetuado usando métodos bastante conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

[0078] Diversos sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomos, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar os vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os métodos de introdução incluem, porém não estão limitados às rotas intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais, e orais. A composição pode ser administrada por qualquer rota conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção de bolo, por absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local.

[0079] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser distribuída subcutânea ou intravenosamente com uma agulha e uma seringa padrões. Além disso, com relação à distribuição subcutânea, um dispositivo de distribuição de caneta prontamente tem aplicações na distribuição de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de distribuição de caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de distribuição de caneta reutilizável em geral utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Assim que toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tiver sido administrada e o cartucho estiver vazio, o cartucho vazio pode prontamente ser descartado e substituído por um novo cartucho que contenha a composição farmacêutica. O dispositivo de distribuição de caneta pode então ser reutilizado. Em um dispositivo de distribuição de caneta descartável, não há nenhum cartucho substituível. Mais exatamente, o dispositivo de distribuição de caneta descartável vem pré-enchido com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Assim que o reservatório estiver esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é descartado.

[0080] Diversos dispositivos de distribuição de canetas e autoinjetores reutilizáveis têm aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Os exemplos incluem, porém não estão limitados ao AUTOPEN® (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), caneta DISETRONIC® (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25®, caneta HUMALOG®, caneta HUMALIN 70/30® (Eli Lilly e Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN® I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR® (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN®, OPTIPEN PRO®, OPTIPEN STARLET®, e OPTICLIK® (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemanha), para mencionar somente alguns. Os exemplos de dispositivos de distribuição de canetas descartáveis, tendo aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção, incluem, porém não estão limitados à caneta SOLOSTAR® (sanofi-aventis), ao FLEXPEN® (Novo Nordisk), e ao KWIKPEN® (Eli Lilly), ao Autoinjetor SURECLICK® (Amgen, Thousand Oaks, CA), ao PENLET® (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), ao EPIPEN (Dey, L.P.), e à caneta HUMIRA® (Abbott Labs, Abbott Park IL), para mencionar somente alguns.

[0081] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser distribuída em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, pode ser usada uma bomba (vide Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em outra modalidade, podem ser usados materiais poliméricos; vide, Medical Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Flórida. Ainda em outra modalidade, pode ser colocado um sistema de liberação controlada em proximidade do alvo da composição, assim requerendo somente uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, págs. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0082] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagens para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões por gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas por método publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, por dissolução, suspensão ou emulsificação do anticorpo ou de seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como o meio aquoso para as injeções, existem, por exemplo, a solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante apropriado, tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 moles) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, o óleo de gergelim, o óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante, tal como o benzoato de benzila, o álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferivelmente enchida em uma ampola apropriada.

[0083] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagens, em uma dose de unidade adequada para fornecer uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagens em uma dose de unidade incluem, por exemplo, os comprimidos, as pílulas, as cápsulas, as injeções (ampolas), os supositórios, etc. A quantidade do anticorpo supracitado contido é, em geral, cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose de unidade; especialmente na forma de injeção, prefere-se que o anticorpo supracitado esteja contido em torno de 5 a cerca de 100 mg e em torno de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagens.

USOS TERAPÊUTICOS DOS ANTICORPOS

[0084] Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para o tratamento, a prevenção e/ou a melhora de qualquer doença ou distúrbio associado com a, ou mediado pela, atividade do ASIC1 ou tratável por bloqueio ou atenuação das correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos, nas células neuronais de um indivíduo. As doenças e os distúrbios ilustrativos que podem ser tratados com os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção incluem as condições de dor, tais como a dor nociceptiva e a dor visceral (por exemplo, a dor da doença inflamatória do intestino/síndrome do intestino irritável, cistite intersticial, pancreatite, endometriose, síndrome da dor pélvica crônica, etc.), bem como a dor associada com a inflamação (por exemplo, dor do músculo inflamatória), a polimiosite, a incisão pós-operativa (por exemplo, dor pós-cirúrgica), a neuropatia (por exemplo, neuropatia diabética), a dor no nervo ciático, a neuralgia pós-herpética, as síndromes da dor miofascial (por exemplo, dor miofascial crônica), a artrite, a célula falciforme, a isquemia do nervo entérico, a dor da claudicação, a fratura do osso, a queimadura, a fratura osteoporótica, a gota, a cefaleia hemicrânia, a fibromialgia, a síndrome da dor regional complexa, a dor herpética aguda, etc. Os anticorpos da invenção podem também ser usados para tratar, prevenir e/ou melhorar as condições, tais como, por exemplo, as doenças neurodegenerativas (por exemplo, doenças desmielinizantes, tais como a esclerose múltipla, a esclerose lateral amiotrófica, etc.), a lesão do cérebro (por exemplo, acidente vascular cerebral, lesão do cérebro traumática, acidose do cérebro), os distúrbios neurológicos (por exemplo, convulsões, distúrbios de convulsões), e as doenças psiquiátricas (por exemplo, depressão, distúrbios de ansiedade, distúrbio de tensão pós-traumática, distúrbio do pânico, etc.).

[0085] Os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção são também úteis para tratar ou prevenir a dor associada ao câncer. A "dor associada ao câncer" inclui, por exemplo, a dor de câncer ósseo, incluindo a dor de câncer que tenha metastatizada no osso (por exemplo, câncer de mama, câncer da próstata, câncer de pulmão, sarcoma, câncer do rim, mieloma múltiplo, etc.). A "dor associada ao câncer" também inclui a dor mais geralmente associada com as condições cancerosas, tais como, por exemplo, o carcinoma de células renais, o carcinoma pancreático, o câncer de mama, o câncer da cabeça e do pescoço, o câncer da próstata, os gliomas malignos, o osteossarcoma, o câncer colorretal, o câncer gástrico, o mesotelioma maligno, o mieloma múltiplo, o câncer ovariano, o câncer de pulmão de pequenas células, o câncer de pulmão de células não pequenas, o sarcoma sinovial, o câncer da tireoide, ou o melanoma. Os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção são também úteis para tratar ou prevenir a dor causada pela, ou associada com a, terapia de câncer ou tratamentos médicos anticâncer, por exemplo, a dor neuropática induzida por quimioterapia, tal como a dor causada pelo, ou associada com o, tratamento com paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere+); nitrosoureia, ciclofosfamida, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracil, topotecano, irinotecano, carmustina, estramustina, e compostos quimioterápicos baseados em platina, tais como cisplatina, carboplatina, e iproplatina.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO

[0086] A presente invenção inclui os regimes de administração terapêuticos que compreendem administrar um anticorpo anti-ASIC1 da presente invenção em combinação com pelo menos um componente terapeuticamente ativo adicional. Os exemplos não limitativos de tais componentes terapeuticamente ativos adicionais incluem outros inibidores do ASIC, tais como, por exemplo, um segundo anticorpo anti-ASIC1, um anticorpo dirigido contra um componente de ASIC diferente (por exemplo, anticorpo anti-ASIC2, anticorpo anti-ASIC3, anticorpo anti-ASIC4, etc.), um inibidor de ASIC de peptídeo (por exemplo, psalmotoxina-1 [PcTx1], APETx2, etc.), e/o um inibidor de ASIC de molécula pequena (por exemplo, amilorida, A- 317567, etc.).

[0087] Os outros agentes que podem ser beneficamente administrados em combinação com os anticorpos anti-ASIC1 da invenção incluem os inibidores das citocinas (incluindo os inibidores das citocinas de moléculas pequenas e os anticorpos que se ligam às citocinas, tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL- 12, IL-13, IL-17, IL-18, ou aos seus respectivos receptores), os antivirais, os antibióticos, os analgésicos, os corticosteroides e/ou os NSAIDs.

[0088] O(s) componente(s) terapeuticamente ativo(s) adicional(is) pode(m) ser administrado(s) antes da, simultâneo(s) com a, ou depois da, administração de um anticorpo anti-ASIC1 da presente invenção; (para os propósitos da presente divulgação, tais regimes de administração são considerados a administração de um anticorpo anti- ASIC1 "em combinação com" um componente terapeuticamente ativo adicional).

USOS DIAGNÓSTICOS DOS ANTICORPOS

[0089] Os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção podem também ser usados para detectar e/ou medir o ASIC1, ou as células que expressam o ASIC1, em uma amostra, por exemplo, para propósitos de diagnóstico. Por exemplo, um anticorpo anti-ASIC1, ou o seu fragmento, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão anormal (por exemplo, superexpressão, subexpressão, ausência de expressão, etc.) do ASIC1. Os ensaios diagnósticos ilustrativos para o ASIC1 podem compreender, por exemplo, contatar uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-ASIC1 da invenção, onde o anticorpo anti-ASIC1 é marcado com uma marca ou molécula relatora detectável. Alternativamente, um anticorpo anti-ASIC1 não marcado pode ser usado em aplicações diagnósticas em combinação com um anticorpo secundário, o qual está, ele próprio, marcado de modo detectável. A marca ou molécula relatora detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, ou 125I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, ou rodamina; ou uma enzima, tal como a fosfatase alcalina, a beta-galactosidase, a peroxidase da raiz-forte, ou a luciferase. Os ensaios ilustrativos específicos que podem ser usados para detectar ou medir o ASIC1 em uma amostra incluem o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), o radioimunoensaio (RIA), e a classificação das células ativada por fluorescência (FACS).

[0090] As amostras que podem ser usadas nos ensaios diagnósticos do ASIC1 de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou fluido obtenível de um paciente, que contenha quantidades detectáveis de proteína ASIC1, ou seus fragmentos, sob condições normais ou patológicas. Em geral, os níveis de ASIC1 em uma amostra particular obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não sofrendo de uma doença ou condição associada com os níveis ou a atividade do ASIC1 anormal) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de linha de base, ou padrão, de ASIC1. Este nível de linha de base do ASIC1 pode então ser comparado contra os níveis de ASIC1 medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos de terem uma doença ou condição relacionada ao ASIC1.

EXEMPLOS

[0091] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a prover aqueles de habilidade comum na técnica com uma divulgação e uma descrição completas de como preparar e usar os métodos e as composições da invenção, e não são pretendidos para limitar o escopo do que os inventores consideram como a sua invenção. Foram feitos esforços para assegurar a acurácia em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), porém alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura está em graus Centígrado, e a pressão está na, ou próxima à, atmosférica.

EXEMPLO 1. GERAÇÃO DOS ANTICORPOS HUMANOS PARA O ASIC1 HUMANO

[0092] Para gerar os anticorpos anti-ASIC1 humanos, utilizou-se um procedimento de imunização de DNA, em que um plasmídio de DNA codificando o ASIC1 humano de tamanho natural, juntamente com um plasmídio separado codificando o adjuvante, foram injetados de modo intradérmico em um camundongo VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, NY). O local da injeção sofreu eletroporação para induzir a transfecção dos plasmídios em células hospedeiras. Os camundongos VELOCIMMUNE® usados para a imunização compreendem DNA codificando as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves capa da imunoglobulina humana e não têm o gene asic1a de camundongo endógeno. A resposta imune do anticorpo foi monitorada por um ensaio de ligação da célula, usando células engenheiradas para expressar o ASIC1 humano. Quando foi obtida uma resposta imune desejada, os esplenócitos foram coletados e fundidos com as células de mieloma de camundongo para conservar a sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma foram examinadas e selecionadas para identificar as linhagens celulares que produzem anticorpos específicos para o ASIC1. Usando esta técnica, foram obtidos diversos anticorpos quiméricos anti-ASIC1 (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo); os anticorpos ilustrativos gerados neste modo foram designados como se segue: H1M6712N, H1M6716N, H1M6718N, H1M7101N, H2M7103N, H3M6713N, H3M6715N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6721N2, H3M6726N, H3M6760N, H3M7102N, e H3M7118N.

[0093] Os anticorpos anti-ASIC1 foram também isolados diretamente de células B antígenos positivas, sem fusão com as células de mieloma, conforme descrito na US 2007/0280945A1. Usando este método, foram obtidos diversos anticorpos anti-ASIC1 totalmente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos); os anticorpos ilustrativos gerados neste modo foram designados como se segue: H4H6362P, H4H6363P, H4H6364P, H4H6366P, H4H6372P, H4H6374P, H4H6375P, H4H6379P, H4H6380P, H4H6381P, e H4H6383P.

[0094] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-ASIC1 ilustrativos, gerados de acordo com os métodos deste Exemplo, são descritas em detalhe nos Exemplos apresentados abaixo.

EXEMPLO 2: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DAS REGIÕES VARIÁVEIS DAS CADEIAS PESADAS E LEVES

[0095] A Tabela 1 apresenta os pares de sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos anticorpos anti-ASIC1 selecionados e os seus identificadores de anticorpos correspondentes. TABELA 1

[0096] Os anticorpos são tipicamente referidos aqui de acordo com a seguinte nomenclatura: prefixo de Fc (por exemplo, "H4H", "H1M", "H2M"), seguido por um identificador numérico (por exemplo, "6712" ou "6362", conforme mostrado na Tabela 1), seguido por um sufixo "P" ou "N". Desse modo, de acordo com esta nomenclatura, um anticorpo pode ser referido neste documento como, por exemplo, "H1M6712N" ou "H4H6362P". Os prefixos H4H, H1M, e H3M nas designações dos anticorpos usadas aqui indicam a região de Fc particular do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo "H1M" tem um Fc de IgG1 de camundongo, enquanto um anticorpo "H4H" tem um Fc de IgG4 humana. Conforme será apreciado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo H1M ou H3M pode ser convertido em um anticorpo H4H, e vice versa, porém, em qualquer situação, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - que são indicados pelos identificadores numéricos mostrados na Tabela 1 - permanecerão os mesmos.

EXEMPLO 3. LIGAÇÃO DO ANTICORPO ÀS CÉLULAS QUE EXPRESSAM O ASIC1 DE SER HUMANO OU DE CAMUNDONGO DE TAMANHO NATURAL

[0097] Para caracterizar adicionalmente os anticorpos anti-ASIC1, a sua capacidade de ligar (a) uma linhagem celular 3T3 de fibroblasto de camundongo, estavelmente transfectada para superexpressar o ASIC1 humano de tamanho natural (3T3/hASIC1; aminoácidos 1-528 de número de acesso do NCBI NP_001086.2 [SEQ ID NO:401]), (b) uma linhagem celular 3T3 estavelmente transfectada para superexpressar o ASIC1a de camundongo de tamanho natural (3T3/mASIC1a; aminoácidos 1-526 de número de acesso do NCBI NP_033727), ou (c) uma linhagem celular ND7 (ECACC, no. 92090903), que é uma linhagem celular de fusão de neuroblastoma de camundongo e gânglios da raiz dorsal de rato que expressa de modo endógeno o ASIC1 de rato, foi determinada usando citometria de fluxo (FACS). As células ND7 foram diferenciadas substituindo-se o meio de cultura por meio com baixo teor de soro (0,5% de FBS) contendo dibutiril-cAMP a 1 mM (No. do Cat. sc-201567A, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). A ligação por FACS foi testada para alguns anticorpos tanto sobre as células ND7 não diferenciadas quanto sobre as células ND7 diferenciadas.

[0098] Para efetuar os experimentos de ligação por FACS, as células aderentes foram coletadas usando EDTA a 1 mM em PBS, então lavadas, e suspensas novamente em PBS gelada contendo 5% de FBS. Para cada experimento de ligação, cada anticorpo anti-ASIC1 (nas concentrações finais de 10 nM de anticorpos purificados ou 3,3 nM para os sobrenadantes de anticorpos para a ligação às células 3T3/hASIC1 e 5 nM para a ligação às células 3T3/mASIC1a ou ND7) foi adicionado a 250.000 células em 500 μL de PBS com 5% de FBS. Após a incubação por 20 minutos, na temperatura ambiente, um anticorpo secundário, o qual reconhece o Fc humano (Cat. No. 109136-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) ou o Fc de camundongo (Cat. No. 550826, BD Biosciences, San Jose, CA) e é conjugado à aloficocianina, foi então adicionado à mistura de células, em uma concentração final de 13,3 nM. Após incubar por 20 minutos sobre gelo, as células foram lavadas e suspensas novamente em PBS contendo 5% de FBS, então classificadas e analisadas em um citômetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA), para determinar a ligação relativa pelos anticorpos candidatos às linhagens celulares testadas. Os histogramas das células tingidas com os anticorpos anti-ASIC1 foram comparados com aqueles das células tingidas com o anticorpo secundário sozinho. A porcentagem de sinal do ASIC1 sobre o anticorpo secundário sozinho foi calculada usando o software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). As amostras tingidas com os anticorpos anti-ASIC1 foram registradas como positivas por FACS quando com controle de mais do que 10%. As amostras tingidas com os anticorpos anti-ASIC1 foram registradas como negativas por FACS quando com controle de menos do que 1%. As amostras tingidas com o anticorpo anti-ASIC1 foram registradas como fracas quando com controle de entre 1%-10%. As especificidades das ligações dos anticorpos anti-ASIC às células 3T3/hASIC1, às células 3T3/mASIC1a e às células ND7 são resumidas na Tabela 2 (ND = não determinada). TABELA 2: ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DOS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 COMO DETERMINADA POR FACS

[0099] A afinidade de ligação dos anticorpos selecionados pelas células 3T3/hASIC1 foi adicionalmente examinada por FACS, usando concentrações múltiplas dos anticorpos (67 nM, 6,7 nM, 0,67 nM, 67 pM, e 6,7 pM), a partir das quais os valores de EC50 aproximados foram calculados. O sinal de intensidade de fluorescência média (MFI) observado para os anticorpos anti-ASIC foi subtraído pelo sinal de fundo (anticorpo secundário sozinho) e representado graficamente como uma função da concentração do anticorpo, para determinar os valores de EC50 usando GraphPad Prism (Tabela 3). TABELA 3: VALORES DE EC50 PARA OS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 SELECIONADOS LIGAÇÃO ÀS CÉLULAS 3T3/hASIC1

[00100] Conforme mostrado na Tabela 2, dezessete dos 25 anticorpos testados demonstraram ligação específica à linhagem celular 3T3/hASIC1; oito dos 10 anticorpos testados demonstraram ligação positiva às células 3T3/mASIC1a; seis dos 10 anticorpos testados demonstraram ligação positiva à linhagem celular ND7 não diferenciada; e cinco dos 7 anticorpos testados demonstraram ligação positiva à linhagem celular ND7 diferenciada. Notavelmente, um anticorpo (H3M7118N) demonstrou ligação fraca às linhagens celulares tanto 3T3/mASIC1a quanto ND7 não diferenciada, porém ligação positiva às células 3T3/hASIC1. Conforme mostrado na Tabela 3, os anticorpos anti-ASIC1, testados nas múltiplas concentrações de anticorpos, demonstraram ligação por FACS de alta afinidade, com valores de EC50 aproximados tão baixos quanto 23 pM para a ligação às células 3T3/hASIC1.

EXEMPLO 4: OS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 BLOQUEIAM A SINALIZAÇÃO DA CÉLULA MEDIADA POR ÁCIDO EM UM ENSAIO DE FLUXO DE CÁLCIO

[00101] Para caracterizar o bloqueio funcional da sinalização da célula mediada por ácido pelos anticorpos anti-ASIC1, um ensaio que mede o fluxo de cálcio celular foi executado usando uma linhagem celular, HEK293 CL:1F10 (1F10), que foi transfectada de modo transiente para expressar o ASIC1 humano (aminoácidos 1-528 de número de acesso do NCBI NP_0010862.2 [SEQ ID NO:401]). Esta linhagem celular foi criada a partir da linhagem parental HEK293/D9, que foi transfectada estavelmente para expressar Par2 humano. As células transfectadas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2, por 2 dias, antes de preparar novamente em uma placa de ensaio de fundo claro, preta, de 96 poços, em uma concentração de 100.000 células por poço. As células foram deixadas aderir à placa, na temperatura ambiente, por 20 minutos, então incubadas durante a noite, a 37°C, 5% de CO2.

[00102] O kit de ensaio de cálcio Fluo-4 NW (Invitrogen, no. F36206) foi usado para determinar o nível de fluxo de cálcio intracelular dentro das células, ativado pelos tampões de baixo pH. O tampão de ensaio foi preparado de acordo com as especificações do fabricante. Cinquenta μL de probenecid (77 μg/L) foram adicionados a 5 mL de tampão C (2xHBSSS), que foi então adicionado ao componente A (corante Fluo-4). Os anticorpos anti-ASIC1 foram diluídos no corante Fluo-4 até uma concentração de 250 nM para o ensaio de bloqueio de um único ponto. Os anticorpos que bloquearam o fluxo de cálcio estimulado pelos tampões de baixo pH foram adicionalmente caracterizados neste ensaio, usando múltiplas concentrações de anticorpos. Os anticorpos anti-ASIC1 foram diluídos até uma concentração de 250 nM no corante e uma série de diluições a 1:3 de 8 pontos (variando de 250 a 0,1 nM) foi usada para determinar a IC50 de bloqueio de cada anticorpo. O meio de cultura de células foi removido da placa de ensaio contendo as células e 50 μL do corante Fluo-4 contendo o anticorpo anti-ASIC1 foram então adicionados. As placas foram incubadas a 37°C, 5% de CO2, por 1 hora, antes da leitura por FLIPR Tetra (Molecular Devices).

[00103] O pH do tampão C foi ajustado para pH 5,0 ou pH 5,5 e adicionado a uma placa de reservatório, antes da adição às células. O FLIPR Tetra então adicionou 50 μL do tampão de baixo pH da placa de reservatório às células, na placa de ensaio, em uma velocidade de 50 μl por segundo. O sinal de cálcio produzido por cada poço por 10 segundos, antes da adição do tampão (pré-leitura), e por 100 segundos, após a adição do tampão, foi medido por FLIPR Tetra usando um ajuste de comprimento de ondas de excitação de 470-490 nm e um ajuste de comprimento de ondas de emissão de 515-575 nm. A diferença entre o valor máximo observado, obtido após a adição do tampão, e o valor mínimo durante o ensaio inteiro, incluindo tanto a pré-leitura quanto após a adição do tampão, foi calculada e colocada em gráfico usando GraphPad Prism. Os resultados são mostrados nas Tabelas 4 e 5. TABELA 4: BLOQUEIO DO FLUXO DE CÁLCIO CELULAR MEDIADO POR ÁCIDO POR 250 nM DE ANTICORPOS ANTI-ASIC1, EM pH 5,5 E 5,0 TABELA 5: BLOQUEIO DEPENDENTE DA DOSE DO FLUXO DE CÁLCIO CELULAR MEDIADO POR ÁCIDO PELOS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 EM pH 5,5 E 5,0

[00104] Conforme mostrado na Tabela 4, dois dos 24 anticorpos, H3M6721N e H1M6718N, exibiram mais do que 30% de bloqueio do fluxo de cálcio (Pos) na concentração única de 250 nM, tanto em pH 5,5 quanto pH 5,0, e um anticorpo (H3M6760N) exibiu mais do que 30% de bloqueio somente em pH 5,5. Doze dos 24 anticorpos em pH 5,5 e 17 dos 24 anticorpos em pH 5,0, testados na concentração única de 250 nM, não exibiram bloqueio mensurável (Neg). Nove dos 24 anticorpos em pH 5,5, e 5 dos 24 anticorpos em pH 5,0, testados na concentração única de 250 nM, exibiram uma redução no fluxo de cálcio entre 10-30% (Fraco).

[00105] Conforme mostrado na Tabela 5, oito dos 10 anticorpos testados quanto ao bloqueio dependente da dose, em pH 5,5, exibiram uma porcentagem de bloqueio do fluxo de cálcio variando de 27% a 78% e valores de IC50 variando de 0,1 nM a 6 nM. Dois dos anticorpos testados quanto ao bloqueio do fluxo de cálcio dependente da dose, em pH 5,5, H4H6380P e H4H6381P, não exibiram nenhum bloqueio mensurável. Dois dos 10 anticorpos testados quanto ao bloqueio dependente da dose, em pH 5,0, H3M6721N e H1M6718N, exibiram um bloqueio de 25% e 48% do fluxo de cálcio, respectivamente, porém os valores de IC50 não puderam ser determinados (IC*), apesar de mostrar dependência da dose. Um dos 10 anticorpos testados quanto ao bloqueio dependente da dose, em pH 5,0, H3M6760N, exibiu um bloqueio de 56% do fluxo de cálcio e um valor de IC50 de 1 nM. Cinco dos 10 anticorpos testados quanto ao bloqueio do fluxo de cálcio dependente da dose, em pH 5,0, não exibiram nenhum bloqueio dependente da dose, porém bloquearam entre 10% e 25% do fluxo de cálcio em cada uma das concentrações de anticorpo testadas. Dois dos 10 anticorpos testados quanto ao bloqueio dependente da dose, em pH 5,0, H4H6380P e H4H6381P, não exibiram nenhum bloqueio mensurável.

EXEMPLO 5. OS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 BLOQUEIAM AS CORRENTES IÔNICAS DE ASIC1 INDUZIDAS POR ÁCIDOS EM UM ENSAIO AUTOMATIZADO DE FIXAÇÃO DE VOLTAGEM FIXAÇÃO DE PLACA [Q-PATCH]

[00106] O Q-patch (Sophion Bioscience, Inc., Ballerup, Dinamarca), um sistema automatizado de fixação de placa, foi usado para determinar a capacidade dos anticorpos anti-ASIC1 de inibirem a corrente de ASIC1 humano em uma linhagem celular HEK293 estavelmente transfectada, expressando o canal ASIC1 humano de tamanho natural (HEK/hASIC1; aminoácidos 1-528 de número de acesso do NCBI NP_001086.2), ou a corrente de ASIC1a de camundongo em uma linhagem celular 3T3 estavelmente transfectada, expressando o canal ASIC1a de camundongo de tamanho natural (3T3/mASIC1a; aminoácidos 1-526 de número de acesso do NCBI NP_033727).

[00107] As células HEK/hASIC1 foram cultivadas em meio DMEM com alto teor de glicose, 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos não essenciais e 500 μg/mL de Geneticin® (Invitrogen, no. 10131). As células 3T3/mASIC1a foram cultivadas em meio DMEM com alto teor de glicose, 10% de FBS, 1% de penicilina / estrepto- micina / glutamina (Invitrogen, no. 10378-016), e 400 ug/mL de Geneticin®. No dia dos registros, as células foram coletadas com a solução de separação de células Detachin (Genlantis, San Diego, CA, no. T100100), centrifugadas e suspensas novamente em 1,4 mL de solução sem soro [meio CHO-SFM-II (Invitrogen, no. 31033), HEPES 25 mM e penicilina/estreptomicina 100 unidades/mL]. A suspensão de células foi então incubada sobre um agitador, por 40 minutos, na temperatura ambiente (TA). Dois ou três anticorpos anti-ASIC1 e um anticorpo de controle foram corridos em paralelo em um experimento. Desse modo, no final da incubação, a suspensão de células foi distribuída para 4 tubos (aproximadamente 5x105 células em 300 μL/tubo) e os anticorpos foram diluídos até uma concentração final de 100 nM, diretamente nos tubos, para os experimentos de um único ponto, ou em uma faixa de concentrações para os experimentos de resposta à dose, e então incubados sobre um agitador, por 20 minutos, na TA. No final da incubação, as células foram carregadas no Q-Patch.

[00108] As células sofreram primeiramente perfusão com um tampão em pH 7,4 (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glicose 5 mM e HEPES 10 mM) contendo 0,2% (p/v) de soro albumina bovina (tampão extracelular) e o anticorpo de interesse, em uma concentração final de 100 nM para os experimentos de um único ponto, ou em uma faixa de concentrações para os experimentos de resposta à dose, foi adicionado e deixado incubar por cerca de 3 minutos. Então, a corrente de ASIC1 humano foi provocada por um segundo pela adição do tampão extracelular ajustado para pH 6,0, enquanto as células eram mantidas em um potencial de retenção de - 80 mV. Trinta μM de amilorida foram adicionados após cada registro no Q-Patch, para demonstrar que as células eram sensíveis pela duração do ensaio. A composição da solução de registro intracelular era CsCl 140 mM, MgCl2 4 mM, EGTA 10 mM e HEPES 10 mM; ajustada para pH 7,3 com CsOH.

[00109] Todos os anticorpos anti-ASIC1 foram testados em quadruplicata, em paralelo com o anticorpo de controle irrelevante. O bloqueio do canal foi medido como a porcentagem de inibição do fluxo de corrente na presença do anticorpo anti-ASIC1, em relação ao fluxo de corrente na presença do anticorpo de controle irrelevante, calculando-se a média sobre os múltiplos experimentos de bloqueio. Os resultados são resumidos na Tabela 6. TABELA 6: PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DAS CORRENTES DE ASIC1 HUMANO INDUZIDAS POR ÁCIDOS PELOS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 A 100 nM

[00110] Conforme mostrado na Tabela 6, dezessete dos 23 anticorpos testados a 100 nM no Q-Patch demonstraram inibição funcional da corrente de ASIC1 humano, com 9 dos 17 anticorpos mostrando um bloqueio maior do que 70%. Onze anticorpos (H1M6718N, H3M6720N, H3M6721N, H3M6726N, H4H6366P, H1M7101N, H3M7102N, H2bM7103N, H3M7118N, H4H6718N, e H4H6721N2) foram adicionalmente testados quanto à sua capacidade de inibir a corrente de ASIC1 humano em diferentes concentrações, no Q-Patch, e nove anticorpos (H4H6718N, H3M6720N, H3M6721N, H1M7101N, H3M7102N, H2bM7103N, H3M6726N, H4H6366P, e H3M7118N) foram testados quanto à sua capacidade de inibir a corrente de ASIC1 de camundongo. A porcentagem de bloqueio observado para estes anticorpos é resumida na Tabela 7 (ASIC1 humano) e na Tabela 8 (ASIC1 de camundongo). TABELA 7: PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DAS CORRENTES DE ASIC1 HUMANO INDUZIDAS POR ÁCIDOS PELOS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 EM DIVERSAS CONCENTRAÇÕES DE ANTICORPO TABELA 8: PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DAS CORRENTES DE ASIC1a DE CAMUNDONGO INDUZIDAS POR ÁCIDOS PELOS ANTICORPOS ANTI-ASIC1 EM DIVERSAS CONCENTRAÇÕES DE ANTICORPO

[00111] Conforme mostrado na Tabela 7, um anticorpo, H3M6726N, bloqueou a corrente de ASIC1 humano com uma IC50 aparente maior do que 10 nM, enquanto seis anticorpos (H3M6720N, H3M6721N, H4H6366P, H3M7102N, H2bM7103N e H3M7118N) bloquearam a corrente de ASIC1 humano com uma IC50 aparente de 10 nM ou menos. Quatro dos anticorpos, H1M6718N, H1M7101N, H4H6718N, e H4H6721N2, bloquearam a corrente de ASIC1 humano com uma IC50 aparente menor do que 1 nM.

[00112] Conforme mostrado na Tabela 8, seis dos 10 anticorpos anti-ASIC1 (H4H6718N, H3M6721N, H4H6721N2, H1M7101N, H3M7102N e H3M7118N) testados nas células que expressam o ASIC1 de camundongo inibiram 90 a 100% da corrente de ASIC1 de camundongo na maior concentração de anticorpo testada, enquanto quatro anticorpos (H3M6720N, H3M6726N, H4H6366P, e H2bM7103N) somente inibiram a corrente em aproximadamente 80% ou menos. H3M7118N, H2bM7103N, H3M6720N e H3M6721N bloquearam a corrente de ASIC1 de camundongo com uma IC50 aparente menor do que 25 nM. H4H6718N bloqueou a corrente de ASIC1 humano com uma IC50 aparente menor do que 1 nM.

[00113] O Q-Patch foi também usado para determinar a capacidade do anticorpo anti-ASIC1 H4H6718N de inibir a corrente de ASIC1 na linhagem celular ND7/23 (ECACC, no. 92090903), que é uma linhagem celular de fusão de neuroblastoma de camundongo e gânglios da raiz dorsal de rato que expressa de modo endógeno o ASIC1 de rato.

[00114] As células ND7/23 foram cultivadas em meio DMEM com alto teor de glicose contendo 10% de FBS, glutamina a 2 mM, 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, no. 10378-016). No dia após a semeadura, as células ND7/23 foram diferenciadas substituindo-se o meio de cultura por meio com baixo teor de soro (0,5% de FBS) contendo 1 mM de dibutiril-cAMP (Santa Cruz, no. sc-201567A). No dia dos registros, as células foram coletadas usando o reagente de dissociação de células StemPro Accutase (Invitrogen, no. A11105-01), centrifugadas, e suspensas novamente em 1 mL de solução de tampão extracelular. A suspensão de células foi então carregada no Q- Patch.

[00115] As células sofreram primeiramente perfusão com uma solução de tampão extracelular em pH 7,4 (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glicose 5 mM e HEPES 10 mM, ajustada para pH 7,4 com NaOH) contendo 0,2% (p/v) de soro albumina bovina por 6 minutos, para estabilizar a placa. A corrente de ASIC1 de rato foi então provocada por um segundo pela adição do tampão extracelular, que foi ajustado para pH 6,0, enquanto as células eram mantidas em um potencial de retenção de - 80 mV. A corrente de ASIC1 de rato foi provocada 2 vezes no tampão extracelular em pH 6 e então 2 vezes adicionais no mesmo tampão extracelular contendo 10 nM de um anticorpo de controle de isótipo ou 10 nM do anticorpo anti-ASIC1 (H4H6718N, H3M6720N, H2bM7103N, H3M6726N, H4H6366P e H3M7118N). Após os registros do anticorpo anti-ASIC1, 10 nM do antagonista de ASIC1 seletivo PcTx1 (Alomone Labs, no. STP-200) foram adicionados às células, para avaliar a contribuição das correntes específicas de ASIC1 para a corrente provocada pelo tampão extracelular em pH 6. A composição da solução de registro intracelular era CsF 120 mM, NaCl 15 mM, EGTA 10 mM e HEPES 10 mM; ajustada para pH 7,3 com CsOH.

[00116] O bloqueio do canal foi medido como a porcentagem de inibição do fluxo de corrente na presença do anticorpo anti-ASIC1, em relação ao fluxo de corrente medido antes da aplicação do anticorpo, e comparou-se com a porcentagem de inibição do fluxo na presença de PcTx1, que foi usado para definir o bloqueio de corrente específico de ASIC1 máximo. Os resultados são mostrados na Tabela 9. TABELA 9: PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DAS CORRENTES DE ASIC1a DE RATO INDUZIDAS POR ÁCIDOS NAS CÉLULAS ND7 PELOS ANTICORPOS ANTI-ASIC1

[00117] Conforme mostrado na Tabela 9, o H4H6718N demostrou uma inibição de 100% das correntes de ASIC1 de rato nas células ND7/23 diferenciadas, em uma concentração de 10 nM (n = 9), enquanto o H3M6720N e o H3M7118N inibiram a corrente em aproximadamente 43% e 65%, respectivamente. Três anticorpos (H2bM7103N, H3M6726N e H4H6366P) não demonstraram inibição significativa das correntes de ASIC1 de rato a 10 nM nestes experimentos.

EXEMPLO 6: UM ANTICORPO ANTI-ASIC1 BLOQUEIA AS CORRENTES IÔNICAS DE ASIC1 INDUZIDAS POR ÁCIDOS EM UM ENSAIO AUTOMATIZADO DE FIXAÇÃO DE VOLTAGEM FIXAÇÃO DE PLACA [PORT-A-PATCH]

[00118] O Port-a-Patch (Nanion Technologies Inc., North Brunswick, NJ), um sistema automatizado de fixação de placa baseado em microchips, foi usado para determinar a concentração semi-inibitória máxima (IC50) do anticorpo anti-ASIC1 H1M6718N, necessária para inibir a corrente de ASIC1 humano em uma linhagem celular HEK293 estavelmente transfectada, que expressa o canal ASIC1 humano de tamanho natural (HEK/hASIC1; aminoácidos 1-528 de número de acesso do NCBI NP_001086.2).

[00119] As células HEK/hASIC1 foram cultivadas em meio DMEM com alto teor de glicose, 10% de soro bovino fetal, 1% de aminoácidos não essenciais e 500 μg/mL de Geneticin® (Invitrogen, no. 10131). No dia dos registros, as células foram coletadas com a solução de separação de células Detachin (Genlantis, San Diego, CA, no. T100100), centrifugadas, e suspensas novamente em 500 uL de solução de tampão extracelular (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, glicose 5 mM e HEPES 10 mM, pH 7,4 com NaOH). A suspensão de células foi então carregada no Port-a-Patch.

[00120] As células sofreram primeiramente perfusão com um tampão extracelular em pH 7,4 contendo 0,1% (p/v) de soro albumina bovina, por cerca de 5 minutos, para estabilizar a placa. Então a corrente de ASIC1 humano foi provocada por três segundos pela adição do tampão extracelular ajustado para pH 6,0, enquanto as células eram mantidas em um potencial de retenção de -80 mV. A corrente de ASIC1 humano foi provocada 3 vezes (2 minutos separadamente) no tampão extracelular em pH 6,0 e 3 vezes no tampão extracelular em pH 6,0 contendo 100 nM de um anticorpo de controle de isótipo ou 10, 3, 1, 0,8 ou 0,6 nM do anticorpo anti-ASIC1 H1M6718N. Trinta μM de amilorida no tampão extracelular em pH 6 foram adicionados após o término das medições estimuladas pelo pH, para demonstrar que as células eram sensíveis pela duração do ensaio. A composição da solução de registro intracelular era CsF 120 mM, NaCl2 15 mM, EGTA 10 mM e HEPES 10 mM; ajustada para pH 7,3 com CsOH.

[00121] O bloqueio do canal foi medido como porcentagem de inibição do fluxo de corrente na presença do anticorpo anti-ASIC1, em relação ao fluxo de corrente antes da aplicação do anticorpo. Calculou- se a média disto sobre múltiplos experimentos de bloqueio.

[00122] A porcentagem de bloqueio da corrente de ASIC1 humano em 10, 3, 1, 0,8 e 0,6 nM de H1M6718N é resumida na Tabela 10. TABELA 10: PORCENTAGEM DE INIBIÇÃO DA CORRENTE DE ASIC1 HUMANO POR UM ANTICORPO ANTI-ASIC1 EM DIVERSAS CONCENTRAÇÕES

[00123] O H1M6718N mostrou uma inibição dependente da dose da corrente de ASIC1 humano com uma IC50 calculada de 860 pM, enquanto o anticorpo de controle de isótipo não mostrou nenhuma inibição da corrente em uma concentração de 100 nM.

EXEMPLO 7. UM ANTICORPO ANTI-ASIC1 REDUZ AS RESPOSTAS ÀS DORES VISCERAIS EM UM MODELO DE CAMUNDONGO

[00124] Neste exemplo, avaliou-se a capacidade do anticorpo anti- ASIC1 H1M6718N de atenuar a dor visceral em um modelo de constrições abdominais induzidas por ácido acético. Os camundongos C57BL/6 do tipo selvagem do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) foram usados neste experimento. Grupos separados de camundongos (n = 10) receberam 10 mg/kg (s.c.) de um mAb de controle de isótipo ou 1 ou 10 mg/kg (s.c.) de H1M6718N. Vinte e quatro horas após a dosagem do anticorpo, todos os grupos receberam uma injeção intraperitoneal de 0,6% de ácido acético, que produziu comportamentos de estiramentos abdominais estereotípicos (por exemplo, constrições) que foram contados por um observador às cegas por até 30 minutos após a injeção. Os resultados deste experimento, expressos em termos da porcentagem de mudança no número total de constrições abdominais, são mostrados na Tabela 11 (todos os dados são representados como média ± SEM). TABELA 11: EFEITO DO ANTICORPO ANTI-ASIC1 SOBRE AS CONSTRIÇÕES ABDOMINAIS INDUZIDAS POR INJEÇÃO DE ÁCIDO ACÉTICO

[00125] Este exemplo demonstra que o anticorpo anti-ASIC1 (H1M6718N), o qual foi mostrado bloquear de modo potente as correntes iônicas de ASIC1 induzidas por ácidos (vide os Exemplos 4 até 6), era efetivo no alívio das respostas às dores viscerais induzidas por ácidos em um modelo de camundongo.

EXEMPLO 8. UM ANTICORPO ANTI-ASIC1 PRODUZ ANALGESIA A UM ESTÍMULO MECÂNICO NOCIVO EM UM MODELO DE CAMUNDONGO

[00126] Neste Exemplo, avaliou-se a capacidade de um anticorpo anti-ASIC1 (H1M6718N) de produzir analgesia em resposta aos estímulos nocivos de aperto/pressão.

[00127] Utilizaram-se camundongos C57BL/6 do tipo selvagem do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) neste experimento. Grupos separados de camundongos receberam 1, 10, ou 40 mg/kg (s.c.) de H1M6718N, ou 10 mg/kg (s.c.) de um anticorpo de controle de isótipo. Vinte e quatro horas após a dosagem de anticorpo, os grupos separados (n = 10) foram testados quanto aos seus começos de nocicepção mecânica, que foram medidos pelo começo de retraimento a um aperto do músculo gastrocnêmio ou da cauda (Modelo no. 2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). A nocicepção mecânica na cauda foi medida nos camundongos tratados com 1 mg/kg e 10 mg/kg de H1M61718N, além daqueles tratados com um controle de isótipo. A nocicepção mecânica no músculo gastrocnêmio foi medida nos camundongos tratados com 10 mg/kg e 40 mg/kg de H1M6718N, além daqueles tratados com um controle de isótipo. Os resultados destes experimentos, expressos como começo de retraimento ao aperto em gramas (média ± SEM para cada grupo de camundongos), são mostrados na Figura 1, painéis A e B.

[00128] Para ambos os experimentos, o tratamento com H1M6718N resultou em um aumento significativo no começo de retraimento na mais alta dose de anticorpo testada (10 mg/kg no experimento da cauda [Figura 1, painel A] e 40 mg/kg no experimento do músculo gastrocnêmio [Figura 1, painel B]), em comparação com o controle de isótipo, como determinado por ANOVA (p = 0,0015 para a cauda e 0,0228 para o músculo gastrocnêmio) e pelo teste de Bonferonni post- hoc (* = p < 0,05).

EXEMPLO 9. UM ANTICORPO ANTI-ASIC1 ATENUA A DOR MUSCULAR EM MODELOS DE CAMUNDONGOS

[00129] Neste Exemplo, avaliou-se a capacidade dos anticorpos anti-ASIC1 H1M6718N e H4H6721N2 de atenuar a dor muscular resultante da injeção de solução salina ácida (pH 5,5) ou 3% de carragenina. Os camundongos C57BL/6 do tipo selvagem do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) foram usados nestes experimentos.

[00130] Em um primeiro experimento, os grupos separados de camundongos receberam 10 mg/kg (s.c.) de um anticorpo de controle de isótipo ou 10 mg/kg (s.c.) de H1M6718N. Vinte e quatro horas após a dosagem de anticorpo, todos os camundongos receberam uma injeção intramuscular de solução salina ácida (pH 5,5) no músculo gastrocnêmio, o que produziu hiperalgesia mecânica primária forte de diversos dias, como medida pelo começo de retraimento a um aperto do músculo (Modelo no. 2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). Os resultados são mostrados na Figura 2.

[00131] Em um segundo experimento, os grupos separados de camundongos receberam 10 mg/kg (s.c.) de um mAb de controle de isótipo; 10, ou 40 mg/kg (s.c.) de H1M6718N; ou 10 ou 30 mg/kg (s.c.) de H4H6721N2. Vinte e quatro horas após a dosagem de anticorpo, todos os camundongos receberam uma injeção intramuscular de 3% de carragenina (p/v) no músculo gastrocnêmio, o que produziu hiperalgesia mecânica primária forte de diversos dias, como medida pelo começo de retraimento a um aperto do músculo (Modelo no. 2455, IITC Life Science, Woodland Hills, CA). Os resultados são mostrados nas Figuras 3A (10 e 40 mg/kg de H1M6718N) e 3B (10 e 30 mg/kg de H4H6721N2).

[00132] Os resultados destes experimentos, como mostrados nas Figuras 2 e 3, são expressos em termos da porcentagem de mudança no começo de retraimento a partir da linha de base (todos os dados são representados como média ± SEM). Para ambos os experimentos, foi observado um efeito principal significativo do tratamento com H1M6718N por ANOVA com medições repetidas (p = 0,0363 para a solução salina ácida e 0,0193 para a carragenina). Para o segundo experimento, foi observado um efeito principal significativo do tratamento com H1M6721N2 por ANOVA com medições repetidas (p = 0,0018), * = p < 0,05 e ** = p < 0,01 pelo teste de Bonferonni post-hoc para o ponto de tempo dado. Desse modo, ambos os anticorpos demonstram eficácia substancial em aliviar a dor muscular nos sistemas experimentais usados neste documento.

EXEMPLO 10. EFICÁCIA DO ANTICORPO ANTI-ASIC1 EM UM MODELO DE DOR DO TIPO NEUROPÁTICA INDUZIDA POR QUIMIOTERAPIA

[00133] Neste Exemplo, avaliou-se a capacidade do anticorpo anti- ASIC1 H4M6718N de atenuar a dor do tipo neuropática resultante da exposição sistêmica ao agente quimioterápico taxol. Os camundongos machos C57BL/6 do tipo selvagem do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) foram usados nestes experimentos. Após o teste comportamental de linha de base, todos os camundongos receberam um regime de taxol (4 mg/kg, dia sim, dia não, por um total de 4 doses), antes de iniciar a dosagem terapêutica. Os grupos separados de camundongos receberam 30 mg/kg (s.c.) de um mAb de controle de isótipo, 30 mg/kg (s.c.) de H1M6718N, ou 100 mg/kg (s.c.) de gabapentina. Os anticorpos foram administrados 24 horas antes de cada teste comportamental semanal e a gabapentina foi administrada 2 horas antes de cada teste comportamental semanal. A alodinia táctil foi medida em todos os grupos usando as fibras von Frey (no. 58011, Stoelting Co., Wood Dale, IL) de acordo com o método up/down de Dixon (Chaplan et al., J Neurosci Methods. 53(1):55-63). Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 4 (todos os dados são representados como média ± SEM).

[00134] Conforme ilustrado na Figura 4, foi observado um efeito principal significativo tanto do tratamento com H1M6718N quanto do tratamento com gabapentina, em comparação com o grupo de controle de isótipo, por ANOVA com medições repetidas (p=0,0003 para H4H6718N, p < 0,00001 para gabapentina). Desse modo, este Exemplo sugere que os anticorpos anti-ASIC1 da presente invenção são altamente efetivos no alívio das respostas de dor induzidas por quimioterapia.

[00135] Coletivamente, os resultados dos Exemplos precedentes suportam o uso dos anticorpos de bloqueio anti-ASIC1 para o tratamento de uma variedade de condições de dor.

[00136] A presente invenção não está limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas neste documento. De fato, diversas modificações da invenção, além daquelas descritas aqui, tornar-se-ão aparentes para aqueles versados na técnica, a partir da descrição precedente e das figuras que acompanham. Pretende-se que tais modificações incidam no escopo das reivindicações em anexo.

Claims (12)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao canal iônico sensível ao ácido 1 (ASIC1) expresso na superfície da célula (SEQ ID NO: 401), conforme medido usando um ensaio de leitor de placa de imagiologia fluorométrica (FLIPR), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: três CDRs de cadeia pesada e três de cadeia leve de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 2/10; 34/42; 50/58; 66/74; 114/122; 130/138; 146/154; 162/170; 194/202; 210/218; 242/250; 258/266 e 274/282.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente ao ASIC1 expresso na superfície da célula com uma EC50 de 1 nM ou menos, como medida usando a classificação das células ativada por fluorescência (FACS).

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe as correntes iônicas mediadas pelo ASIC1, induzidas por ácidos, nas células que expressam o ASIC1 humano.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe o fluxo de cálcio celular induzido por ácido nas células que expressam o ASIC1 em pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 com uma IC50 de 6 nM ou menos, como medido usando um ensaio de FLIPR.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo inibe as correntes iônicas induzidas por ácidos em pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 com uma IC50 de 10 nM ou menos, como medido usando um ensaio de fixação de placa.

6. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno compreende os domínios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2- LCDR3, respectivamente, selecionados dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-6264; 68-70-72-76-78-80; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 196198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 244-246-248-252 254-256; 260-262-264-268-270-272 e 276-278-280-284-286-288.

7. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a ASIC1 expresso na superfície celular (SEQ ID NO: 401), em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende as CDRs de cadeia pesada e leve de um par de sequência de aminoácidos HCVR/LCVR com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 34 e 42.

8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

9. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou atenuação de dor.

10. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dor é dor nociceptiva ou dor visceral.

11. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dor está associada a uma condição selecionada dentre o grupo que consiste em inflamação, incisão pós-operatória, neuropatia, fratura óssea, queimadura, fratura osteoporótica, câncer ósseo, gota, enxaqueca, e fibromialgia.

12. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dor é dor associada ao câncer ou dor induzida por quimioterapia.