JP6548631B2 - ドナー特異的抗体を検出する方法及び該方法を実施するためのシステム - Google Patents

Description

本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／７８２，００３号の出願日に対する優先権を主張するものであり、本出願の開示は参照として本明細書に全体が組み込まれる。

米国で実施される年間数万件を含め、世界中で年間１００，０００件を越える固形臓器移植が実施される。免疫抑制および移植後ケアは有意に改善したが、移植片の長期的な機能は最適とは言えない。米国では、献腎移植および生体腎移植の調整１０年同種移植片生存率は各々わずか約４０％および６０％である。抗体関連型拒絶反応（ＡＭＲ）に続発する初期および末期移植片不全は、移植片生存不良の重大な原因である。

ヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）に対する抗体は、移植前の感作事象（輸血、過去の移植、または妊娠）の結果発生する、移植候補者またはレシピエントの血液に存在する血流抗体である。移植前に存在するドナー特異的抗体（ＤＳＡ）が超急性拒絶反応および即時移植片損失を引き起こす可能性があるので、移植前適合試験により評価する。さらに近年では、ドナー特異的ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ不適合に対する臨床的に意味のある抗体の移植後発生を監視するという概念が、移植コミュニティ内で重大な関心領域となっている。ドナー臓器に発生した抗原に対する抗体の存在は、検出されたのが移植前であろうと移植後であろうと、臨床的に治療しない場合には移植した臓器への免疫攻撃を起こし、移植片損失および／または拒絶反応のリスクを増大させる。とりわけＤＳＡは同種移植片の内皮を攻撃し、その後生検で立証されるＡＭＲおよび急性障害を引き起こし、免疫抑制の増強が必要となる可能性がある。ＤＳＡ発現の進行および対応する臨床事象が複合して同種移植片を損傷し、経時的な慢性的変化を引き起こして最終的に移植片機能および生存を損なう。

抗体媒介型拒絶反応は、既往性応答または新生抗体産生により起きる早期急性反応、または新生抗体産生による遅発性および慢性反応として現れる可能性がある。急性期では、それは早期拒絶反応を惹き起こす事前に形成された抗体であることが多いが、移植後早期にも新生ＤＳＡが発現して急性拒絶反応を起こすことがある。事前に形成されたＤＳＡを有する患者は急性ＡＭＲとなるリスクが有意に高く、また移植片生存率が有意に低い。

慢性拒絶反応は、生着失敗による移植片損失の主な原因の１つである。同種抗体媒介障害および修復の反復循環によって同種移植片の微小血管構造に特異的変化を起こす。ＤＳＡが事前に形成されている患者および新生ＤＳＡを発現する患者は慢性拒絶反応を起こすリスクが増大している。

生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定する方法が提供される。当該方法は、レシピエント免疫抗体が存在する場合に、これがドナー細胞表面抗原（Ａｇ）と結合して免疫抗体−Ａｇ複合体を形成するのに十分な条件下で、ドナーからの細胞試料をレシピエントからの生体試料と混合することによって混合物を形成すること、混合物を免疫抗体−Ａｇ複合体（例えば、Ａｇまたは免疫抗体）と特異的に結合する抗体を含むビーズとその表面で接触させること、ビーズと結合した免疫抗体−Ａｇ複合体と特異的に結合する検出可能標識抗体を溶解条件下で添加すること、および免疫抗体−Ａｇ複合体に結合した検出可能標識抗体の有無を検出してレシピエントからの生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定することを含む。目的の方法を実施するためのシステムおよびキットも提供される。

本発明は、添付の図面と関連づけて以下の詳細な説明を読むとき最もよく理解されるであろう。図面には以下の図が含まれる。

本開示の１つの実施形態に従って生体試料にドナー特異的抗体の存在または不存在を判定する方法を模式的に例示する。 本開示の第２の実施形態に従って生体試料ドナー特異的抗体の存在または不存在を判定する方法を模式的に例示する。 ＤＳＡの同時的捕捉および標識化を包含するＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を示す。各ビーズの内部蛍光ＩＤにより識別されるＨＬＡ−クラスＩおよびクラスＩＩビーズを用いてＤＳＡ−ＦＸＭによって４つの試料を試験した。ＨＬＡ特異的抗体によって増大した蛍光（陽性シグナル）をＸ軸に示す。図３パネルＡ：ＨＬＡ−クラスＩ（Ｃ−Ｉ）およびクラスＩＩ（Ｃ−ＩＩ）ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）はともに陰性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ−）；図３パネルＢ：Ｃ−ＩＩ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ＋）；図３パネルＣ：Ｃ−Ｉ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ−）；および図３パネルＤ：ＣＩおよびＣ−ＩＩ ＤＳＡはともに陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ＋）。 ＤＳＡの逐次的捕捉および標識化を包含するＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を示す。ＤＳＡ−ＦＸＭによって陰性ＡＢ血清（試料Ａ）１件および陽性血清３件（試料Ｂ、ＣおよびＤ）を試験した。試料Ａ：Ｃ−ＩおよびＣ−ＩＩ ＤＳＡともに陰性；試料Ｂ：Ｃ−ＩおよびＣ−ＩＩＤＳＡ ともに陽性；試料Ｃ：Ｃ−Ｉ ＤＳＡだけが陽性かつＣ−ＩＩ ＤＳＡは陰性；試料Ｄ：Ｃ−ＩＩ ＤＳＡだけが陽性およびＣ−ＩＤＳＡは陰性。 ＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を提供する。ＦＸＭ、ＤＳＡ−ＦＸＭ、およびＬＭＸ−ＩｇＧによってさまざまな細胞数に対して希釈度の異なるＨＬＡ−Ａｂ陽性血清（ＰＰＳ）をプールして試験した。結果は、ＤＳＡ−ＦＸＭはＤＳＡを検出するための最も感度の高い方法であり、かつ標準的な方法と比較してはるかに少ない細胞（例えば、わずか２５，０００細胞でＤＳＡを検出することができる）を用いることを示す。ＬＭＸ−ＩｇＧは単一抗原ビーズを用いるＬｕｍｉｎｅｘプラットフォーム上のＰＰＳ血清に含有されるＨＬＡ特異性を定義し、示される値は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。１０００ＭＦＩより大きいかまたはこれと同等の値が陽性と考えられ；５００〜９９９ＭＦＩの値は陽性の可能性あり（あいまい）と考えられる。 ＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を示す。盲検誘発試験と同時に、かつ単一抗原ビーズ（ＬＭＸ−ＩｇＧ）上で通常のフローサイトメトリークロスマッチ（ＦＸＭ）および標準的な抗体スクリーニングと平行して、ＤＳＡ−ＦＸＭによりＣＡＰ（米国病理学会）外部精度管理（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）試料２３件を試験した。ＨＬＡ−クラスＩ（Ｃ−Ｉ）および／またはＨＬＡ−ＩＩ（Ｃ−ＩＩ）のドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を同定し、大半のＤＳＡはＬＭＸ−ＩｇＧによってさらに確認した。一部のＭＣＳが低いＤＳＡのみ、特別により感度の高いＤＳＡ−ＦＸＭ方法で検出した。外部精度管理試料は、特異性が既知である血清および細胞である。全参加施設から全ての結果を受け取るまで血清の特異性は参加者に対して盲検化される。 ＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を提供する。ＬＭＸ−ＩｇＧによってＨＬＡ−ＤＱ ＤＳＡ陽性試料７件を同定し、ＤＳＡ−ＦＸＭによって確認した。歴史的に、細胞または細胞抽出物を包含するいかなる種類のＤＳＡ分析法によってもＤＱに対して特異的なＤＳＡをすべて検出することは不可能となっている。 ＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を示す。ＬＭＸ−ＩｇＧによって６つのＨＬＡ−ＤＰ ＤＳＡ陽性試料を同定し、ＤＳＡ−ＦＸＭによって確認した。 ＤＳＡ−ＦＸＭ実験の結果を提供する。ＬＭＸ−ＩｇＧによって３つのＨＬＡ−Ｃ ＤＳＡ陽性試料を同定し、ＤＳＡ−ＦＸＭによって確認した。 ＤＳＡ−ＦＸＭ試験手順による実験結果を示す。パネルＡ：ＨＬＡ−クラスＩ（Ｃ−Ｉ）およびクラスＩＩ（Ｃ−ＩＩ）ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）はともに陰性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ−）；パネルＢ：Ｃ−Ｉ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ−）；パネルＣ：Ｃ−ＩＩ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ＋）；およびパネルＤ：ＣＩおよびＣ−ＩＩ ＤＳＡともに陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ＋）。 既知のクラスＩおよびクラスＩＩＤＳＡ反応性を有する、またはこれらを欠いた、分離ＤＳＡ−ＦＸＭ試験１１７件の結果を提供し、既知のＤＳＡ特性と相関する反応性の相互排反パターンを示す。 クラスＩ特異的ＤＳＡ（Ｂ７）のＦＸＭ、ＤＳＡ−ＦＸＭ、およびＬＭＸ−ＩｇＧ単一抗原ビーズ検出法の感度比較を示し、ＤＳＡ−ＦＸＭが、他の２つの試験が陰性であっても、標的細胞上で特異的ＨＬＡクラスＩ ＤＳＡを検出することができることを示す。 クラスＩＩ特異的ＤＳＡ（ＤＲ４）のＦＸＭ、ＤＳＡ−ＦＸＭ、およびＬＭＸ−ＩｇＧ単一抗原ビーズ検出法の感度比較を示し、ＤＳＡ−ＦＸＭが、他の２つの試験が陰性であっても、標的細胞上で特異的ＨＬＡクラスＩＩ ＤＳＡを検出することができることを示す。 図１４のパネルＡおよびＢは、クラスＩ ＤＳＡ（パネルＡ）９５件およびクラスＩＩ ＤＳＡ（パネルＢ）１００件のＦＸＭ比較についてＤＳＡ−ＦＸＭおよびＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢ結果の間のピアソン相関を示す。パネルＣは、標準としてＩｇＧ ＤＳＡを用いたクラスＩおよびＩＩについての感度および特異性百分率を示す。 図１４のパネルＤは、７つの血清試料（６名）上でのＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢ、ＬＭＸ−Ｃ１ｑ ＳＡＢ、ＦＸＭ、およびＤＳＡ−ＦＸＭの比較を示す。ＬＭＸ−ＳＡＢの過剰−反応性に関連する不一致。図１５と関連づけて、結果は、ＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢが偽陽性反応をもたらす（すなわち、ＦＸＭおよびＤＳＡ−ＦＸＭがともに陰性である場合、ＤＳＡ陽性）ことを示す。これは図１５に示した特異性の低下に寄与する。 患者１５例のＦＸＭおよびＤＳＡ−ＦＸＭの比較を示し、うち１２例はＦＸＭによる特異性不明抗原に対する自己抗体を持っていた（下部パネル）。これらの患者のうちの４例（Ｐ１２〜Ｐ１５）は、ＤＳＡ−ＦＸＭで判定されたように、ＨＬＡに対する自己抗体を持っていた（上部パネル）。 ＦＸＭとＤＳＡ−ＦＸＭがＤＳＡクラス（Ｉおよび／またはＩＩ）による陽性反応を識別する能力の比較を示す。ＤＳＡ−ＦＸＭヘッダー：ＣＩビーズはクラスＩをすべて検出し、ＣＩＩａはＤＱを検出し、ＣＩＩｂはすべてのＤＲおよびＤＰを検出するもののＤＱは一部のみを検出する。４つの異なる型の結果を示す。ケース１および３ともに陽性Ｂ細胞ＦＸＭを有するが、ケース１はクラスＩ同種抗体によるものである一方、ケース３はクラスＩＩ同種抗体によるものである。ケース２および４ともに陽性ＴおよびＢＦＸＭを有するが、ケース２は自己抗体によるものである一方、ケース４はクラスＩ同種抗体によるものである。 図１７パネルＡは、緩衝液で１：２に希釈および静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）で１：２に希釈した血清上でのクラスＩ ＤＳＡのＤＳＡ−ＦＸＭ結果を示す。ＩＶＩＧはＨＬＡに対する脱感受性のために用いられ、抗体を低下させる。通常のＦＸＭは、第２ステップ抗ＩｇＧ試薬の存在および細胞表面上にある未知の標的とのＩＶＩＧの広い反応性のために、緩衝液（データは示さず）と比較してＩＶＩＧ処理した試料で増加を示す。検出がＨＬＡに対して特異的であるため、ＤＳＡ−ＦＸＭはＩＶＩＧの阻害を示す。したがって、ＤＳＡ−ＦＸＭは治療の有効性を明らかにする。パネルＢは、緩衝液で１：２に希釈したおよび静脈注射用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）で１：２希釈した血清上でクラスＩＩ ＤＳＡのＤＳＡ−ＦＸＭ結果を示す。ＩＶＩＧはＨＬＡに対する脱感受性のために用いられ、抗体を低下させる。通常のＦＸＭは、第２段階抗ＩｇＧ試薬の存在および未知の細胞表面上標的に対するＩＶＩＧの幅広い反応性のために、緩衝液（データは示さず）と比較してＩＶＩＧ処理した試料で増加を示す。ＤＳＡ−ＦＸＭは、検出がＨＬＡに対して特異的であるため、ＩＶＩＧの阻害を示す。したがって、ＤＳＡ−ＦＸＭは治療の有効性を明らかにする。 図１８のパネルＡは、５％ＩＶＩＧを加え、ＤＳＡ−ＦＸＭによって異なる希釈度で試験した陽性ＤＳＡ血清の結果を示す。結果は、ＩＶＩＧにＨＬＡクラスＩＤＳＡともに用量依存的阻害があったことを示した。パネルＢは、５％ＩＶＩＧを加え、ＤＳＡ−ＦＸＭによって異なる希釈度で試験した陽性ＤＳＡ血清の結果を示す。結果は、ＩＶＩＧは両ＨＬＡクラスＩＩＤＳＡを用量依存的に阻害することを示した。 特定されている候補生体ドナーに対するＤＳＡを前もって低下／抑制するために、ＩＶＩＧ脱感受性治療を受けている腎移植候補者からの連続試料に関するＦＸＭおよびＤＳＡ−ＦＸＭの結果を示す。ＦＸＭ結果は、ＩＶＩＧおよびＲｉｔｕｘａｎ（治療的抗ＣＤ２０、Ｂ細胞のマーカー）によるＭＣＳ値の増加を示す一方、ＤＳＡ−ＦＸＭ結果は、治療的抗体が存在しても移植に許容できる範囲でＩＶＩＧおよびＭＣＳ値の阻害（有効性）を示す。

（定義）
「ドナー特異的抗体」または「ＤＳＡ」とは、レシピエントに存在し、特異的にドナー抗原（例えばドナー細胞表面抗原）に結合する抗体を意味する。ＤＳＡは、「事前形成」（例えばドナーから移植または輸血を受ける前からレシピエントに存在する）および／または妊娠していること、または１人以上のドナーから移植または輸血を受けることに反応してレシピエントによって産生される新生ＤＳＡである可能性がある。ＤＳＡは、一部の例では、レシピエント自身の細胞の細胞表面成分に結合する自己由来ＤＳＡ（自己抗体）でありうる。特定の態様では、ＤＳＡは補体結合抗体（ＣＦＡｂ）である。特定の態様では、ＤＳＡはＨＬＡ抗原に対するものである。

対象発明の「親和性試薬」は、標的分析対象物質に対して結合親和性が高い分析対象物質結合ドメイン、部分、または成分を有する。結合親和性が高いとは、結合親和性が少なくとも約１０^−４Ｍ、通常少なくとも約１０^−６Ｍ以上、例えば、１０^−９Ｍ以上であることを意味する。親和性試薬は、標識親和性リガンドとして存在する場合に標的タンパク質に対して必須な結合親和性を示すかぎり、さまざまな異なる型の分子のいずれかとすることができる。

従って、親和性試薬は、小分子または大分子リガンドとすることができる。小分子リガンドとは、サイズの範囲が約５０〜約１０，０００ダルトン、通常約５０〜約５，０００ダルトンおよびさらに通常約１００〜約１０００ダルトンであるリガンドを意味する。大分子とは、分子量が約１０，０００ダルトン以上のサイズのリガンドを意味する。

大分子親和性リガンドとして特に興味深いものは、抗体、ならびに結合フラグメントおよびこれらの模倣物である。抗体が親和性リガンドである場合、ポリクローナル組成物から誘導することができるので、特異性の異なる抗体の不均一な集団がそれぞれ同じ標識で標識される。こうして、親和性リガンドは、モノクローナル、オリゴクロナール、および／またはポリクローナル抗体とすることができる。親和性リガンドは、フラグメントおよび模倣物が必須の標的タンパク質結合親和性を有する場合、抗体結合フラグメントまたは模倣物とすることができる。例えば、Ｆｖ、（Ｆａｂ’）_２、およびＦａｂなどの抗体フラグメントは、未修飾タンパク質の例えばプロテアーゼまたは化学的開裂などの開裂によって調製することができる。一本鎖抗体またはｓｃＦｖｓなどの組換え産生抗体フラグメントも興味深く、このような組換え産生抗体フラグメントは、上記の抗体の結合特性を保持する。このような組換え産生抗体フラグメントは、一般的に、対象抗体の結合特性を保持するよう、対象抗体の少なくともＶＨおよびＶＬドメインを含む。対象発明のこれらの組換え産生抗体フラグメントまたは模倣物は、米国特許第５，８５１，８２９号および５，９６５，３７１号に開示された方法（この開示は参照として本明細書に組み入れられる）などの都合のよい方法を用いて容易に調製することができる。

上記の抗体、フラグメントおよびその模倣物は、市販の供給源から入手、および／または任意の簡便な技術を用いて調製することができる、ポリクローナル抗体、オリゴクロナール抗体、モノクローナル抗体、フラグメントおよびその模倣物（これらの組換え誘導体を含む）を生成する方法は、当業者に既知である。

「エピトープ」とは、特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原の部位を意味する。当該用語はこのほか、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に用いられる。エピトープは、そのエピトープに特有の立体配座で、１個以上のアミノ酸、例えば、３個以上のアミノ酸を含むことができる。エピトープは、１〜１０個のアミノ酸、例えば、１〜５個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸を含むことができる。アミノ酸の立体配座を決定する方法は技術上既知であり、例えばＸ線結晶解析および２次元核磁気共鳴を含む。さらに、所与のタンパク質中のエピトープの同定は、技術上周知の技術を用いて容易に実施される。Ｇｅｙｓｅｎ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：３９９８−４００２（ペプチドを迅速に合成して所与の抗原中の免疫原性エピトープの位置を決定する一般的な方法）、米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定および化学合成する手順）、およびＧｅｙｓｅｎ他，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）２３：７０９−７１５（所与の抗体に対して親和性が高いペプチドを同定する技術）などを参照されたい。１つの抗体が他の抗体の標的抗原との結合を遮断する能力を示すという単純な免疫測定法で、同一のエピトープを識別する抗体を同定することができる。

「結合する特異的に（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」とは、特異的抗原またはエピトープに対する抗体の高い結合力および／または高親和性結合を意味する。特異的抗原上のそのエピトープとの抗体結合は、同じ抗体と別のエピトープ、特に同じ試料とともに、または同じ試料中で目的の特異抗原として分子内に存在することができる別のエピトープとの結合より結合力および／または親和性が大きい。しかし、補体結合抗体は、異なる対象抗原のさまざまなエピトープに対して同一のまたはほぼ同じ結合力および／または親和性を有することができる。このように、「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」とは、所与の補体結合抗体が１つ以上の目的の抗原に結合することを妨げることを意味しない。目的のポリペプチドと特異的に結合する抗体は、弱いが、検出可能なレベル（例えば目的のポリペプチドに示した１０％以下の結合）で他のポリペプチドを結合することができる。このような弱い結合、またはバックグラウンド結合は、例えば、しかるべきコントロールを用いて目的のポリペプチドとの特異的抗体結合と容易に識別することができる。

「検出可能に標識された」抗体とは、検出可能な標識を付けた抗体を意味し、当該抗体は特異的にもう１つの分子、例えば、もう１つの抗体（例えばＩｇＧ抗体）に結合することができる。検出可能標識抗体は、結合特異性を保持する。検出可能標識は化学的結合により結合することができるか、または標識がポリペプチドである場合は遺伝子組み換え技術により結合することができる。検出可能標識抗体を産生する方法は技術上周知である。検出可能なシグナル（例えば、放射能、蛍光、色）を発するか、または標識をその基質に曝露した後検出可能なシグナルを発する放射線同位体、発色団、蛍光団、蛍光色素、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、リンカー分子または他の部分または化合物を含む、当技術分野で周知であるさまざまなこのような標識から検出可能標識を選択されることができる。さまざまな検出可能標識／基質対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンチジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／シフェリン）、抗体に標識をつける方法、および抗原を検出するために標識二次抗体を用いる方法が技術上周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。

「単離された」とは、当該化合物が天然に生じる環境とは異なる環境にある目的の化合物を意味する。「単離された」とは、目的の化合物が相当程度濃縮され、かつ／またはその中で目的の化合物が部分的にまたは実質的に精製されている試料内にある化合物を含むことを意味する。用語「単離された」は、化合物が、通常その天然状態に関係する物質のうち少なくとも一部を伴わない場合を包含する。例えば用語「単離された」は、一般にポリペプチドについて、通常天然にポリペプチドと関係する配列の一部を欠くアミノ酸分子；または天然に存在するものと同じであるがこれと関係する異種配列を有する配列を意味する。

本明細書に用いられる「精製した」は、列挙した物質が総タンパク質の少なくとも約７５重量％、好ましくは少なくとも約８０重量％、および特に好ましくは少なくとも約９０重量％を含むことを意味する。用語「実質的に純粋（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」は、本明細書に用いられる場合、化合物がその天然環境から取り出されている、および天然に付随する他の成分が少なくとも６０％含まれない、好ましくは７５％含まれない、およびさらに好ましくは９０％含まれない化合物を意味する。

本明細書に用いられる「レシピエントからの生体試料」は、レシピエントから単離した組織または体液の試料を意味し、本発明の文脈では一般的にドナー特異的抗体を含有することができる試料（任意の工程後、インビトロ検査でこの試料を分析することができる）を意味する。目的の試料は、血液、血漿、血清、血液細胞、尿、唾液、生検組織、および粘膜を含むが、これらに限定されない。試料はたとえば組換え細胞といった細胞および組織の培地内での増殖から得られる調整培地、例えば、および細胞成分を含むがこれらに限定されないインビトロ細胞培養成分の試料も含む。

「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」とは、第６染色体の短腕内で約３５０万塩基対に及ぶ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）内の遺伝子を意味する。ＭＨＣはクラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩ遺伝子を含有する３つの独立した領域に分けられる。ヒトでは、クラスＩ ＨＬＡ複合体は約２０００ｋｂ長であり、また約２０遺伝子座を含有する。クラスＩ領域内には、十分に特性解析され、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃと命名されたクラスＩ ＭＨＣ分子をコードする遺伝子が存在する。また、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＬＡ−Ｈ、ＨＬＡ−Ｊ、ＨＬＡ−ＸおよびＭＩＣ遺伝子座によりコードされた非古典クラスＩ遺伝子がある。クラスＩＩ領域は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、３、４、５、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、およびＨＬＡ−ＤＰＡ、ＨＬＡ−ＤＰＢ遺伝子座によりコードされた６つの遺伝子ファミリーを含有する。これらの遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、３、４、５、ＤＱおよびＤＰと命名された古典クラスＩＩ ＭＨＣ分子のαおよびβ鎖をコードする。ヒトではＤＭ、ＤＮおよびＤＯ遺伝子座によりコードされた非古典遺伝子もクラスＩＩ内で同定されている。クラスＩＩＩ領域は、免疫反応と関係する３６を越える遺伝子座の不均一な集積を含有する。

用語「判定する」、「測定する」、「評価する」、「判断する」および「分析する」は、互換的に用いられ、量的および質的な判定を含む。

用語「固形基材」は、それらの上に抗原および／または抗体を固定することができる固形支持体を意味する。例示的な固形基材は、マルチウエルプレート、ニトロセルロース膜およびポリエチレン膜を含む膜、細胞および細胞膜、ビーズ、マイクロ粒子、マイクロスフェア、マイクロビーズなどを含む。マイクロ粒子、マイクロスフェア、マイクロビーズ、または任意の材質（例えば、シリカ、金、ラテックス）のビーズ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエチル、またはハイドロゲル）によって本発明の方法を実施することができる。また、マイクロ粒子、マイクロスフェア、ビーズまたはマイクロビーズは、磁性物質とすることができる。

用語「補体結合抗体」は、特異的に抗原または病原体に結合する抗体、および生体から抗原保持標的（例えば、細胞）または病原体を除去する免疫系の補体カスケードを開始する抗体を意味する。一般的に、補体結合抗体はＩｇＭまたはＩｇＧ抗体である。補体第二経路などを介して補体因子Ｃ１ｑ、補体因子Ｃ３により認識され、および特異的に結合される。

請求項は、いかなる任意の要素も除外するように記載されうることを更に記す。従って、この記述は、請求項の要素の列挙または「否定的な」限定の使用と関連して、「単独で」、「唯一の」等のような除外的用語を用いるための先行詞を提示することを意図している。

（詳細な説明）
生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定する方法が提供される。当該方法は、レシピエント免疫抗体が存在する場合に、これがドナー細胞表面抗原（Ａｇ）と結合して免疫抗体−Ａｇ複合体を形成するのに十分な条件下で、ドナーからの細胞試料をレシピエントからの生体試料と混合することによって混合物を形成すること、混合物を免疫抗体−Ａｇ複合体（例えば、Ａｇまたは免疫抗体）と特異的に結合する抗体を含むビーズとその表面で接触させること、ビーズと結合した免疫抗体−Ａｇ複合体と特異的に結合する検出可能標識抗体を溶解条件下で添加すること、および免疫抗体−Ａｇ複合体に結合した検出可能標識抗体の存在または不存在を検出してレシピエントからの生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定することを含む。目的の方法を実施するためのシステムおよびキットも提供される。

本発明の詳細をさらに記載する前に、本発明は記載した特定の実施形態に限定されず、従って、当然ながら変更できるものであることを理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求項によってのみ限定されるため、本明細書に用いる専門用語は、具体的な実施形態記載することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきである。

数値の範囲が提供される場合、文脈によって明示されない限り、中間の各値は、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限の間で具体的に開示されていると理解される。任意の記載した値の間のそれぞれのさらに小さな範囲、または記載した範囲の間の値、およびその記載した範囲内の任意の他の記載したまたは間の値が本発明に包含される。これらのさらに小さな範囲の上限および下限は、個別に範囲に含むことも除外することもでき、より小さな範囲に上限および下限のいずれかを含む、いずれも含まない、または両者とも含む各範囲も、本発明に包含され、記載した範囲で任意の具体的に除外された限度の対象となる。記載した範囲が上限および下限の一方または両者を含む場合、その含まれる上限および下限のいずれかまたは両者を除外する範囲も本発明に含まれる。

特に定義しない限り、本明細書に用いられるすべての技術および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験に本明細書に記載したものとほぼ同じまたは等しい任意の方法および材料を用いることができるが、ここで、いくつかの可能性のあるおよび例示的な方法および材料を記載することができる。本明細書に記載した任意のおよびすべての出版物は、出版物が引用されているところに関係して、方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、矛盾がある限り組み込まれる出版物の任意の開示に優先すると理解される。

文脈が明らかに別段の指示をしない限り、本明細書および添付された請求項に用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことを明記しなければならない。したがって、例えば、「電極（ａ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）」という文言は複数のその電極を含み、「そのシグナル（ｔｈｅ ｓｉｇｎａｌ）」という文言は１又はそれ以上のシグナルへの言及を含む等である。

請求項は、いかなる任意の要素も除外するように記載されうることを更に記す。従って、この記述は、請求項の要素の列挙または「否定的な」限定の使用と関連して、「単独で」、「唯一の」等のような除外的用語を用いるための先行詞を提示することを意図している。

本明細書に示した出版物は、本出願の出願日の前に開示されたものだけが提供される。本明細書中の何物も、先行発明によって本発明にこのような出版物に先行する権利がなくなることの容認として解釈すべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、別途確認を要することもある実際の出版の日付と異なることもある。このような出版物が本開示に明示的または暗示的に示された定義と対立する用語の定義を説明する場合は、本開示の定義が優先する。

本開示を読むとき当業者に明らかとなるように、本明細書に記載および例示した個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に任意の他のいくつかの実施形態の特徴から分離するかまたはこれと組み合わせることができる別の要素および特徴を有する。列挙した事象の順にまたは論理的に可能である任意の他の順にいずれの列挙した方法も実施することができる。

（方法）
上記に概要を示したように、本発明の態様は、生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定する方法を含む。当該方法は、レシピエント免疫抗体が存在する場合に、これがドナー細胞表面抗原（Ａｇ）と結合して免疫抗体−Ａｇ複合体を形成するのに十分な条件下で、ドナーからの細胞試料をレシピエントからの生体試料と混合することによって混合物を形成すること、混合物を免疫抗体−Ａｇ複合体（例えば、Ａｇまたは免疫抗体）と特異的に結合する抗体を含むビーズとその表面で接触させること、ビーズと結合した免疫抗体−Ａｇ複合体と特異的に結合する検出可能標識抗体を溶解条件下で添加すること、および免疫抗体−Ａｇ複合体に結合した検出可能標識抗体の有無を検出してレシピエントからの生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定することを含む。ここで以下にさらに詳細に方法のさまざまなステップおよび態様を記載する。

「ドナー」とは、細胞試料の採取源（例えばヒト採取源）を意味する。ドナーがレシピエントと異なっていても（例えばＤＳＡが同種抗体となりうる場合）、またはドナーとレシピエントが同じであってもよい（例えばＤＳＡが自己抗体となりうる場合）。特定の態様では、ドナーは細胞（例えば血液細胞）、組織（例えば角膜、皮膚、骨、心臓弁、腱、大腿静脈および／または伏在静脈、リンパ節、脾臓など）、臓器（例えば腎臓、心臓、肝臓、すい臓、肺、腸管、眼球など）、および任意のこれらの組み合わせをこれらが必要なレシピエントに提供する候補者とすることができる。目的のドナーは、ヒトドナー、非ヒト霊長類ドナー、哺乳類ドナー（例えばブタ）、非哺乳類ドナー、および任意の他の目的ドナー型を含む。

本明細書に用いられるドナーからの「細胞試料」は、少なくとも１つの細胞を含むドナーから得た試料である。この少なくとも１つの細胞は有核細胞（例えばリンパ球または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））、または核のない細胞（例えば、赤血球または血小板）とすることができる。特定の態様では、細胞試料は、細胞から選択されるリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＢ細胞）、ＰＢＭＣ、赤血球、血小板、および任意のこれらの組み合わせから選択される細胞を含むドナーから得た試料である。特定の実施形態に従うと、ドナーからの細胞試料は、ドナーの組織（例えばリンパ節、脾臓、角膜、皮膚、骨、心臓弁、腱、大腿静脈および／または伏在静脈など）、ドナーの臓器（例えば腎臓、心臓、すい臓、肺、肝臓、腸管、眼球など）、またはこのような組織および／または臓器の任意の組み合わせに由来する。細胞試料は、本開示の方法に用いる前に精製手順に付してもよい。例えば、細胞試料はリンパ球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、赤血球、および／または血小板の実質的に純粋な試料としてもよく、当該試料は対象方法の混合する、接触させるおよび／または検出するステップに干渉する可能性がある成分を含まない。特定の態様では、目的の方法はドナーからの細胞試料を得ることを含む。

特定の実施形態に従うと、ドナーからの細胞試料は０．００１×１０^６〜２．０×１０^６個の細胞を含む。特定の態様では、ドナーからの細胞試料は、１×１０^６個以下の細胞、例えば、０．５×１０^６個以下の細胞、０．４×１０^６個以下の細胞、０．３×１０^６個以下の細胞、０．２×１０^６個以下の細胞、０．１×１０^６個以下の細胞、または０．５×１０^５個以下の細胞を含む。特定の態様では、ドナーからの細胞試料は２５，０００〜２００，０００細胞を含む。

「レシピエント」とは生体試料の採取源を意味する。レシピエントがドナーと異なっていても（例えば、ＤＳＡが同種抗体となりうる場合）、またはレシピエントとドナーが同じであってもよい（例えば、ＤＳＡが自己抗体となりうる場合）。特定の態様では、レシピエント（例えばヒトレシピエント）は、（例えば病状を緩和するために）ドナーに由来する細胞（例えば血液細胞）、組織（例えば角膜、皮膚、骨、心臓弁、腱、大腿静脈および／または伏在静脈など）、臓器（例えば腎臓、心臓、すい臓、肺、肝臓、腸管、眼球など）、および任意のこれらの組み合わせを受ける候補者であるか、またはドナーから細胞、組織、または臓器をすでに受けた者でありうる。目的のレシピエントは、ヒトレシピエント、非ヒト霊長類レシピエント、哺乳類レシピエント、非哺乳類レシピエント、および任意の他の目的レシピエント型を含む。

レシピエントからの「生体試料」は、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を含むかまたは含む可能性がある任意のレシピエント由来生体試料とすることができる。特定の実施形態に従うと、レシピエントからの生体試料は血清、血漿、血液、唾液、組織、および任意のこれらの組み合わせから選択される。特定の態様では、生体試料は１００μＬ以下の血清、血漿、血液、唾液、または任意のこれらの組み合わせ、例えば、９０μＬ以下、８０μＬ以下、７０μＬ以下、６０μＬ以下、５０μＬ以下、４０μＬ以下、３０μＬ以下、２０μＬ以下、または１０μＬ以下の血清、血漿、血液、唾液、または任意のこれらの組み合わせである。１つの実施形態に従うと、レシピエント由来の生体試料は３０μＬ以下の血清、血漿、血液、唾液、または任意のこれらの組み合わせである。特定の態様では、目的の方法はレシピエントからの生体試料を得ることを含む。

レシピエント免疫抗体（例えばＤＳＡ）が存在する場合、これがドナー細胞表面抗原（Ａｇ）と結合して免疫抗体−Ａｇ複合体を形成するのに十分な条件下で、ドナーからの細胞試料をレシピエントからの生体試料と混合することによって混合物を形成する。特定の実施形態に従うと、レシピエント免疫抗体は同種抗体である。他の態様では、レシピエント免疫抗体は自己抗体である。レシピエント免疫抗体（例えばＤＳＡ）が存在する場合、これがドナー細胞表面抗原（Ａｇ）と結合するのに十分な条件は、適切な緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳ、など）、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ）、タンパク質（例えばＢＳＡ）、ｐＨ、温度、持続時間等の選択によって提供することができる。抗体のその標的抗原への特異的結合を可能にするのに有用な条件は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２０１３）に記載されている。特定の態様では、レシピエント免疫抗体がドナー細胞表面抗原に結合できるよう、適切な緩衝液中でドナー由来の細胞試料（例えば０．２×１０^６の細胞）およびレシピエント由来の生体試料（例えば５０μＬのレシピエント由来血清）を室温で約２０分間インキュベートする。特定の態様では、室温で混合する、接触させる、および／または検出するステップを実施する。

特定の態様では、ドナー特異的抗体は、実際のドナー特異的抗体である。

特定の実施形態に従うと、ドナー細胞表面抗原はＨＬＡ抗原であるのでドナー特異的抗体は抗−ＨＬＡ抗体である。特定の態様では、ドナー特異的抗体は抗−ＨＬＡクラスＩおよび／または抗−ＨＬＡクラスＩＩ抗体である。特定の実施形態に従うと、ドナー特異的抗体は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、およびＨＬＡ−ＤＰＢから選択されるドナー細胞表面抗原に結合する。

ドナー特異的抗体が存在する場合、これは補体結合抗体（ＣＦＡｂ）でありうる。特定の態様では、本発明の方法は生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定することを含むだけではなく、ＤＳＡがＣＦＡｂまたは非ＣＦＡｂであるかどうか判定することを含む。例えば、特異的にＣＦＡｂ（および／または非ＣＦＡｂ）に結合する直接または間接標識結合剤を用いてＤＳＡをＣＦＡｂと同定することができる。特定の実施形態に従うと、結合剤は単離した補体成分Ｃ１ｑである。Ｃ１ｑは、複合体中の任意の他の蛍光標識と識別することができる蛍光標識を有する直接的または間接的に標識することができる。特定の態様では、単離したＣ１ｑはビオチンコンジュゲート化され（「Ｂｉｏ−Ｃ１ｑ」）、かつ蛍光標識ストレプトアビジン（例えば、Ｒ−フィコエリトリンコンジュゲート化ストレプトアビジン（ＳＡ−ＰＥ））の添加により検出することができる。上記の実施形態に従うと、Ｃ１ｑタンパク質は、ＤＳＡが補体結合抗体である場合、Ａｇ−ＡｂＤＳＡに結合し、さらに本方法の下流検出ステップの間に（例えば、フローサイトメーターで）、複合体中の直接または間接標識Ｃ１ｑを検出することができ（ＤＳＡに結合した識別検出可能標識抗体とともに）、ＤＳＡがＣＦＡｂであることを示す。

混合物を形成したのちに、抗体−Ａｇ複合体のドナー細胞表面抗原（例えば、ＨＬＡ抗原）と特異的に結合する抗体を含むビーズと混合物を接触させる。目的のドナー細胞表面抗原によっては、このようなビーズは市販されていることがある。そうでない場合は、技術上既知のコンジュゲート化戦略を用いて、目的の抗原を結合する抗体で所望の種類のビーズ（例えばアガロース、ラテックス、ポリスチレン、磁気、または他の種類のビーズ）をコンジュゲート化することができる。例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，２００８を参照されたい。さらに、目的の抗体をビーズとコンジュゲート化するための試薬および指示書を含むキットが市販されている（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｕｐｌｉｎｇキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。ビーズは、平均ビーズ直径が０．１〜２０ミクロン、例えば０．５〜１０ミクロン、例えば５ミクロン以下（例えば２．５〜５ミクロン）であるマイクロビーズとすることができる。接触させることは、典型的には、レシピエント免疫抗体（例えばＤＳＡ）とすでに結合しているドナー細胞表面抗原（例えばＨＬＡ抗原）とビーズ上に含まれる抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で実施される。このような条件を提供することは、適切な緩衝液（例えばＰＢＳ、ＴＢＳなど）、洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ）、タンパク質（例えばＢＳＡ）、ｐＨ、温度、持続時間等の選択を含むことがある。抗体のその標的抗原への特異的結合を可能にするのに有用な条件は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，他編，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２０１３）に記載されている。任意に、混合するステップと接触させるステップの間に混合物を洗浄する。

接触させるステップはドナー細胞表面抗原を含む免疫抗体−Ａｇ複合体をもたらし、それは、存在する場合はレシピエント免疫抗体（例えば、ＤＳＡ）；およびビーズ上に存在する抗体が結合している。細胞試料のドナー細胞も、ドナー細胞の表面に残っている複合体のドナー細胞表面抗原によってこの複合体と関係している。接触させるステップの後、溶解条件下で特異的に複合体（例えば、複合体のレシピエント免疫抗体（例えば、ＤＳＡ））と結合する検出可能標識抗体を添加する。任意に、接触させるステップおよび溶解条件下での検出可能標識抗体添加の間に１回以上の洗浄ステップを実施する。溶解条件は複合体と関係がある細胞を溶解させるのに十分であり、これによりドナー細胞から複合体を遊離させ、複合体の下流分析（例えば、フローサイトメトリーによる）を可能にする。特定の態様では、溶解条件はトレーサ、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、およびＢＳＡを含む溶解緩衝液を投与することを含む。

検出可能標識抗体および溶解条件は、接触させるステップの後に「溶解混合物」（溶解混合物は溶解緩衝液中に検出可能標識抗体を含む）を混合物に添加することによって提供することができる。任意の適切な溶解緩衝液を用いてもよく、かつ溶解緩衝液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＳＤＳ、デオキシコレート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ＮＰ−４０、および／または任意の他の望ましい溶解緩衝液成分のうち１つ以上を含むことができる。溶解緩衝液は、このような免疫抗体−Ａｇ複合体が未変化のままであるような緩衝液である。溶解緩衝液は、本開示の特定の態様によれば非変性である。免疫抗体−Ａｇ複合体は、ここでドナー細胞表面抗原に結合したビーズ随伴抗体、ドナー細胞表面抗原に結合したレシピエント免疫抗体（例えばＤＳＡ）（存在する場合）、およびレシピエント免疫抗体（例えばＤＳＡ）に結合した検出可能標識抗体（存在する場合）を含む。複合体の検出可能標識抗体から検出可能なシグナルは測定し、さらにレシピエント由来の生体試料中のレシピエント免疫抗体（例えばＤＳＡ）の量と比例的に相関させることができる。

上記に記載したように、本開示の方法は、レシピエントからの生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定するために、免疫抗体−Ａｇ複合体に結合した検出可能標識抗体の有無を検出すること（例えば定量的に検出すること）を含む。採用する検出戦略は、検出可能標識抗体に存在する検出可能標識（単数または複数）の種類に従って変えることができる。標題の方法を実施する際の用途が確認されている検出可能標識は、蛍光団、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、色素、金属、または放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。

特定の実施形態に従うと、検出可能標識抗体は蛍光標識され、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、アレクサフルオロ−３５５、アレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ５３２、アレクサフルオロ５４６、アレクサフルオロ−５５５、アレクサフルオロ５６８、アレクサフルオロ５９４、アレクサフルオロ６４７、アレクサフルオロ６６０、アレクサフルオロ６８０、アレクサフルオロ７００、ＪＯＥ、リサミン、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、ＬＩＺ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、およびＲｉｂｏＧｒｅｅｎから選択される蛍光団を含む。

検出可能標識抗体が蛍光標識されている場合、検出することは１つの以上の蛍光発光を検出することを含むことがある。蛍光発光（単数または複数）は任意の有用なフォーマットで検出することができる。特定の態様では、検出することは免疫抗体−Ａｇ複合体（ビーズを含む）をフローサイトメーター内に流すことを含む。

検出することがフローサイトメーター内にレシピエント免疫抗体−Ａｇ複合体を流すことを含む場合、フローサイトメーターは、複合体を励起光に曝露することおよび１つの以上の検出チャンネルで各複合体の蛍光を所望の通り測定することによって複合体を検出し、一意に同定するよう構成される。励起光は、１つ以上の光源に由来してもよく、かつ狭帯域または広帯域のいずれかであってもよい。励起光源の例はレーザー、発光ダイオード、およびアーク灯を含む。複合体を同定するために用いられる検出チャンネルで発した蛍光は、単一光源で励起した後に測定しても、または異なる光源による励起ののち別に測定してもよい。特定の態様では、その中に混合物を流すフローサイトメーターは、蛍光励起および検出能力を含むので、フローサイトメーターにより複合体を照合した時、検出可能標識抗体の蛍光標識と、複合体の他の成分と関連する他の任意の蛍光標識は、それぞれ検出可能かつ識別可能である。

フローサイトメーターは、データ取得、分析、および、各複合体が検知領域を通ると同時に、マルチデータチャンネルが各複合体の発する光散乱および蛍光について、各検出器からのデータを記録するコンピューターなどの記録手段をさらに含む。分析システムの目的は、複合体を分類し、計数することであり、このとき各複合体はそれ自体を一組のデジタル化パラメーター値として示す。フローサイトメーターは、バックグラウンドおよび雑音から目的の複合体を識別するために、選択したパラメーターでトリガーするよう設定することができる。「トリガー」とは、パラメーターの検出のための事前設定閾値を意味する。典型的には、レーザービームを通って複合体の通過を検出する手段として用いられる。選択したパラメーターに対する閾値を越える事象の検出は、複合体についての光散乱および蛍光データの取得をトリガーする。閾値以下の応答を引き起こす分析されている培地中の複合体または他の成分については、データを取得しない。トリガーパラメーターは、光ビームを経た複合体の通過によって発生する前方散乱光の検出とすることができる。フローサイトメーターはその後複合体についての光散乱および蛍光データを検出および収集する。

複合体のフローサイトメトリー分析は、上述のように、複合体についての定性的および定量的な情報をもたらす。所望場合、前記分析は、混合物中の目的の複合体の計数をもたらす。このように、フローサイトメトリー分析は混合物中の１つ以上の異なる型の複合体の数に関するデータを提供する。

混合する、接触させるおよび検出するステップは、任意の都合のよい時間の長さで一括して実施することができる。特定の実施形態に従うと、本開示の方法は、１２時間以下、例えば、１１時間以下、１０時間以下、９時間以下、８時間以下、７時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、または２時間以下で実施される。

特定の実施形態に従うと、本開示の方法は、ドナー特異的抗体がレシピエントからの生体試料に存在するかを示す報告を作成することを含む。ＤＳＡが存在する場合、報告にはレシピエントからの生体試料中のＤＳＡの量に関する情報を含めることができる。報告はコンピューターによって作成することができ、この場合任意ではコンピューターから遠隔の場所の出力装置に報告を表示する。

特定の実施形態では、本開示の方法は、ドナー由来の細胞試料中の細胞に存在するドナーＨＬＡ抗原（例えば、ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ抗原）に結合するＤＳＡを検出するために用いられる。１つの実施形態に従うと、ＨＬＡ抗原含有ドナー細胞を含む細胞試料とレシピエント由来の血清または血漿を混合することによって混合物を形成することで、ドナーＨＬＡに特異的に結合することができる任意のＤＳＡがドナーＨＬＡに結合することができる。接触させるステップの前に得られたＤＳＡ−ＨＬＡ複合体含有混合物を１回以上（例えば、３回）洗浄することができる。本実施形態に従うと、接触させるステップは、抗ＨＬＡ抗体被覆マイクロビーズを添加することにより、ビーズに結合した抗−ＨＬＡ抗体がドナー細胞の表面でドナーＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子の定常領域に結合することを含む。本方法を進める前にここでドナーＨＬＡ抗原に結合した捕捉ビーズを含む得られた複合体を１回以上（例えば、３回）洗浄することができる。本実施形態に従うと、溶解条件下で蛍光標識抗ＩｇＧ抗体（例えば、ＰＥ抗ＩｇＧ抗体）を添加した結果、抗ＩｇＧ抗体は複合体のＤＳＡと結合する。ドナー細胞の溶解が混合物に存在する他の物質から複合体の分離を促進する。次に、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体からの蛍光を検出、および任意に定量して、レシピエントの血清または血漿中の、ドナーＨＬＡと結合するＤＳＡの存在または不存在（および任意に量／濃度）を判定することができる。特定の態様では、本方法は、ＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩ、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＰＡ、およびＨＬＡ−ＤＰＢに結合するＤＳＡの存在または不存在についてレシピエントの血清または血漿を調べるために用いられる。

本開示の１つの実施形態に従った方法を図１に模式的に例示する。本実施形態に従って、フローサイトメーターまたはＬｕｍｉｎｅｘ機器によって免疫抗体−Ａｇ複合体を検出する。反応では、ドナー細胞がレシピエント血清と混合される。ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）は、存在する場合ドナー細胞の抗原（Ａｇ）と特異的に結合し、ＤＳＡ−Ａｇ複合体を形成する。溶解条件下で、ＤＳＡ−Ａｇ複合体は、ＤＳＡ−Ａｇ複合体中と同じＡｇに対する抗体でコンジュゲート化したビーズによって特異的に捕捉される。フローサイトメーターまたはＬｕｍｉｎｅｘ機器を通じて蛍光標識二次抗体によって捕捉されたＤＳＡ−Ａｇを検出する。

本開示の第２の実施形態に従った方法を図２に模式的に例示する。本実施形態に従って、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって免疫抗体−Ａｇ複合体を検出する。反応では、ドナー細胞がレシピエント血清と混合される。ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）は、存在する場合、ドナー細胞の抗原（Ａｇ）と特異的に結合し、ＤＳＡ−Ａｇ複合体を形成する。細胞溶解後、ＤＳＡ−Ａｇ複合体はＤＳＡ−Ａｇ複合体中のものと同じＡｇに対する抗体を介して基質上で特異的に捕捉される。酵素結合二次抗ＩｇＧ抗体がＤＳＡに結合し、さらにＤＳＡは酵素と基質の反応で検出可能である。本開示によって本方法の変法（例えば、発光分析）も提供される。

（システム）
本開示の方法を実施するシステムも提供される。本開示のシステムは、プロセッサと、そこにプログラミングを記憶させ、プロセッサと操作可能に接続したコンピューター可読媒体を含む試料液サブシステムを含む。記憶されたプログラミングは、プロセッサによって実行されると、レシピエント免疫抗体が存在する場合、これがドナー細胞表面抗原（Ａｇ）と結合して免疫抗体−Ａｇ複合体を形成するのに十分な条件下で、ドナーからの細胞試料とレシピエントからの生体試料を混合することによって混合物を形成するよう、プロセッサをプログラムする。また記憶されたプログラミングは、プロセッサによって実行されると、その表面で免疫抗体−Ａｇ複合体と特異的に結合する抗体を含むビーズと混合物を接触させ、かつ溶解条件下で特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体と結合する検出可能標識抗体を添加するようにプロセッサをプログラムする。目的のシステムは、免疫抗体−Ａｇ複合体に結合した検出可能標識抗体の有無について試料を分析し、ドナー特異的抗体の存在または不存在を判定するように構成されたフローサイトメーターも含む。特定の態様では、フローサイトメーターの流路は試料液サブシステムに接続される。

プロセッサは、記憶されたプログラミングを実行するのに適した任意のプロセッサとすることができる。特定の実施形態に従うと、プロセッサは、サブシステムがその表面で特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体を結合する抗体を含むビーズと混合物を接触させる前に、試料液サブシステムが混合物を洗浄するようにプログラムされる。その代わりに、または追加的に、プロセッサは、サブシステムが特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体を結合する抗体を含むビーズと混合物を接触させた後であるが、フローサイトメーターが複合体に結合した検出可能標識の有無について試料を分析する前に、試料液サブシステムが混合物を洗浄するようにプログラムされてもよい。

コンピューター可読媒体は、コンピューター可読シグナル媒体またはコンピューター可読記憶媒体とすることができる。コンピューター可読記憶媒体は、これらに限定されないが、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、赤外線、または半導体システム、器具、またはデバイス、または前記の任意の適切な組み合わせとすることができる。コンピューター可読記憶媒体のより具体的な例（非網羅的リスト）は、以下：１つ以上の電線を有する電気的接続、ポータブルコンピューターディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリー（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリ）、光ファイバー、ポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、光学記憶装置、磁気記憶装置、または前記の任意の好適な組み合わせを含むであろう。コンピューター可読記憶媒体は、本開示のシステムの試料液サブシステムによりまたはこれと関連付けて用いるプログラムを収容または記憶することができる任意の有形的媒体とすることができる。

ドナーからの細胞試料、ドナー細胞表面抗原、レシピエントからの生体試料、レシピエント免疫抗体（例えば抗ＨＬＡＤＳＡ）、その表面で免疫抗体−Ａｇ複合体と特異的に結合する抗体を含むビーズ、検出可能標識抗体、緩衝液、結合および溶解条件、およびフローサイトメーターは、本開示の方法に関して上に記載したとおりとすることができる。

本開示のシステムは、都合の良い時間の長さでＤＳＡの有無を検出するように構成することができる。特定の実施形態に従うと、目的のシステムは、１２時間以下、例えば、１１時間以下、１０時間以下、９時間以下、８時間以下、７時間以下、６時間以下、５時間以下、４時間以下、３時間以下、または２時間以下でレシピエントの生体試料にＤＳＡの有無を検出するように構成される。

（キット）
本開示の方法を実施するのに有用な１つ以上の試薬を含むキットも提供される。１つの実施形態に従って、その表面で特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体と結合する抗体を含む複数のビーズ、特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体と結合する検出可能標識抗体、およびドナーからの細胞試料およびレシピエントからの生体試料を分析し、生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定するために複数のビーズおよび検出可能標識抗体を用いるための指示書を含むキットが提供される。対象キットは、さらに他の有用な構成要素、例えば、溶解緩衝液、対照血清または血漿、対照細胞試料などを含むことができる。その表面で特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体と結合する抗体、および特異的に免疫抗体−Ａｇ複合体と結合する検出可能標識抗体を含むビーズは、本開示の方法に関して上に記載したとおりとすることができる。

対象キットに含まれる試薬を個別のチューブで提供することも、または２つ以上の試薬を単一のチューブで提供することもできる。１つの実施形態では、ビーズおよび検出可能標識抗体は分離チューブで提供される。特定の態様では、検出可能標識抗体は溶解緩衝液に入れて提供される。

１つの実施形態では、対象キットに含まれる指示書がコンピューター可読媒体で提供され、プロセッサによって実行される時、ドナーからの細胞試料およびレシピエントからの生体試料を分析して生体試料中のＤＳＡの存在または不存在を判定するようプロセッサをプログラムする。

（有用性）
対象方法、システムおよびキットは、レシピエントの生体試料中にドナー特異的抗体を検出することが望ましい任意の用途に用いられている。目的のレシピエントは、臓器または組織ドナーからの臓器（例えば腎臓、肝臓、心臓等）または組織移植が必要である、またはこれをすでに受けたヒトレシピエントを含むが、これらに限定されない。目的の用途は、レシピエントの生体試料中のＤＳＡの濃度を検出および／または定量することに基づく移植前リスクアセスメントおよび／または移植後モニタリングを含む。

本開示の方法は、ドナー細胞に反応性の抗体とドナー細胞上のＨＬＡ分子に反応性の抗体の間の識別を可能にする。過去のフロークロスマッチ技術は、この重要な識別を行うことができず、フロークロスマッチが陽性であるという結果が、ＨＬＡとの抗体相互作用と完全に無関係かもしれないという点で不完全であった。

対象方法は、多くの異なるＤＳＡ検査法を開発するために広く用いることができるプラットフォームを提供する。ＤＳＡが存在するか存在しないか判定するために、任意の型のレシピエントからの生体試料および任意の目的の標的細胞を用いることができる。既存の方法と比較して、対象方法は、いかなる修飾もなくかつ高検出特異性および高スループットで、レシピエント抗体がその未変性立体配置でドナー抗原に結合することを可能にする。さらに、本方法は既存のＤＳＡ検出方法よりも短時間で完了することができ、必要なドナー細胞が少ない。対象標的抗原と無関係な抗体によって生じたバックグラウンドシグナルは、対象抗原に結合したＤＳＡを含む複合体の特異的抗体媒介固相捕捉によって除去される。

上に提供した開示から理解することができるように、本開示には幅広い用途がある。したがって、以下の実施例は、当業者に本発明の実施方法および使用方法の完全な開示および記述を提供するために記載され、発明者らがその発明と考えるものの範囲を制限することを意図せず、以下の実験が実施された全実験または唯一の実験であることを示すことも意図しない。当業者は、さまざまな重要でないパラメーターを変化させ、または修正しても本質的にほぼ同じ結果を与えることができると容易に認識するであろう。用いられる数値（例えば量、温度等）に関して正確さを確保するために努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差および逸脱を考慮しなければならない。

（実施例１）
（ＤＳＡ−ＦＭ試験手順）
以下の手順を用いてドナー特異的抗体フローサイトメトリークロスマッチ（「ＤＳＡ−ＦＸＭ」）と呼ばれる対象方法の１つの実施形態を実施することができる。本実施例の手順は、同時捕捉および標識化を含み、２時間以下で完了することができる。

第１に、試験するＦＸＭ試料を配置するための９６ウェルレイアウトフォーマットを準備する。第２に、プレートレイアウトに従って９６ウェルプレートの事前に選択した全てのウェルに０．２×１０^６（２５０μＬ未満の容量）ドナー細胞を分注する。２、０００×ｇで３分間遠心分離する。積み重ねたペーパータワーの上でプレートおよびブロットを２回指ではじいた後プレートを裏返す。穏やかにボルテックスして細胞を再懸濁させる。プレートレイアウトに従って事前に選択したウェルに各血清を５０μＬ／ウェル添加する。プレートを穏やかにボルテックスし、ＲＴインキュベーター（２２℃）で２０分間インキュベートする。インキュベート中に溶解混合物（各ウェルに総体積２３μＬのＰＥ−抗ｈＩｇＧおよび溶解緩衝液）を調製する。インキュベート後、各ウェルに３％ＨＢＳＡ２５０μＬを添加し、前と同じようにプレートを回転する。積み重ねたペーパータワーの上でプレートおよびブロットを２回指ではじいた後、プレートを裏返す。各洗浄につき３％ＨＢＳＡ２５０μＬを添加することによってさらに２回洗浄ステップを繰り返す。

最後の洗浄の際（３回目の洗浄）、各ウェルに捕捉ビーズ混合物５μＬを添加し、３％ＨＢＳＡ２５０μＬを用いる前までの洗浄手順を再度実施する。各ウェルに２３μＬの溶解混合物（細胞溶解緩衝液および蛍光抗体）を添加し、プレートを穏やかにボルテックスする。１枚のホイルでプレートを覆い、穏やかに振り混ぜながら３０分間暗所でプレートをインキュベートする。インキュベート中にＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を以下の通りに調製する：ＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を１０ｍＬ生成するために、１×ＴＢＳ洗浄緩衝液９．５ｍＬに界面活性剤０．５ｍＬを添加し、試験管を５回倒置させて混合する。

各ウェルにＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を２５０μＬ添加し、前と同じように洗浄することによって２回洗浄する。ＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を２５０μＬ添加し、前と同じように洗浄する。２００μＬのＦｌｏｗ Ｆｉｘａｔｉｖｅで各ウェルのビーズを再懸濁させ、プレートを穏やかにボルテックスする。フローサイトメーターの上にプレートを置き、ビーズを得る。図３、図５〜９、図１１〜１４、および図１６に実験結果を示す。

図３に示した実験では、ＤＳＡ−ＦＸＭ（同時捕捉および標識化実施形態）によって４つの試料を試験し、各ビーズ上の蛍光ＩＤによってＨＬＡ−クラスＩおよびクラスＩＩビーズを識別した。ＨＬＡ特異的抗体による増大蛍光（陽性シグナル）をＸ軸に示す（ＦＬ１チャンネル）。図３パネルＡ：ＨＬＡ−クラスＩ（Ｃ−Ｉ）およびクラスＩＩ（Ｃ−ＩＩ）ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）はともに陰性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ−）；図３パネルＢ：Ｃ−ＩＩ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ＋）；図３パネルＣ：Ｃ−Ｉ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ−）；および図３パネルＤ：ＣＩおよびＣ−ＩＩＤＳＡはともに陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ＋）。

図５に示したとおり、ＦＸＭ、ＤＳＡ−ＦＸＭ、およびＬＭＸ−ＩｇＧによってさまざまな細胞数に対して異なる希釈度のＨＬＡ−Ａｂ陽性血清（ＰＰＳ）のプールを試験した。結果は、ＤＳＡ−ＦＸＭがＤＳＡを検出する最も感度の高い方法であり、また標準的な方法と比較してきわめて少ない細胞（例えば、わずか２５，０００細胞でＤＳＡを検出することができる）を用いることを示す。ＬＭＸ−ＩｇＧは単一抗原ビーズを用いるＬｕｍｉｎｅｘプラットフォーム上でＰＰＳ血清に含有されるＨＬＡ特異性を定義し、示した数値は平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。

図６に示したとおり、盲検化誘発試験と同時に、かつ単一抗原ビーズ（ＬＭＸ−ＩｇＧ）上での通常のフローサイトメトリークロスマッチ（ＦＸＭ）および標準的なＬｕｍｉｎｅｘ抗体スクリーニングと平行して、ＤＳＡ−ＦＸＭによって外部精度管理ＣＡＰ（米国病理学会）試料２３件を試験した。ＨＬＡ−クラスＩ（Ｃ−Ｉ）および／またはＨＬＡ−ＩＩ（Ｃ−ＩＩ）のドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を同定し、また大半のＤＳＡはＬＭＸ−ＩｇＧによって確認した。一部のＭＣＳが低いＤＳＡのみ、特別により感度の高いＤＳＡ−ＦＸＭ方法で検出した。外部精度管理試料は、特異性が既知である血清および細胞である。全参加施設から全ての結果を受け取るまで血清の特異性は参加者に対して盲検化されている。図７に示したデータは、ＬＭＸ−ＩｇＧによって７つのＨＬＡ−ＤＱ ＤＳＡ陽性試料を同定し、ＤＳＡ−ＦＸＭによって確認したことを示す。図８に示したとおり、ＬＭＸ−ＩｇＧによって６つのＨＬＡ−ＤＰ ＤＳＡ陽性試料を同定し、ＤＳＡ−ＦＸＭによって確認した。図９に示したとおり、ＬＭＸ−ＩｇＧによって３つのＨＬＡ−Ｃ ＤＳＡ陽性試料を同定し、ＤＳＡ−ＦＸＭによって確認した。

図１１に示したとおり、ＨＬＡ型試薬を含む１１７件の血清、ネガティブコントロール、および臨床的な試料の集合を試験し、そのＤＳＡ特異性はＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢ試験によって判明した。排反する陽性または陰性反応を得た。ＤＳＡ−ＦＸＭの結果をＦＸＭおよびＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢ結果と比較する時、ＤＳＡ−ＦＸＭのクラスＩ（図１２）およびクラスＩＩ（図１３）の感度は他の試験のいずれかより優れていた。図１４のパネルＡおよびＢは、それぞれ９５件のクラスＩ ＤＳＡおよび１００件のクラスＩＩ ＤＳＡとの全体的相関を示す。図１４のパネルＣは、ＬＭＸ−ＩｇＧＳＡＢ分析法と比較したＤＳＡ−ＦＸＭの感度および特異性を要約する。図１４のパネルＤに示したとおり、図１４のパネルＣ比較で得た特異性の減少は、ＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢ分析法の偽陽性反応によるものであり、ＤＳＡ−ＦＸＭ分析法の偽陰性反応によるものではない。

図１５に示したとおり、ＴおよびＢ細胞ＦＸＭ分析法は、自己抗体の存在について非特異的（すなわちＨＬＡによるものではなく、標的は不明）陽性結果を示す一方で、ＤＳＡ−ＦＸＭは明白にＨＬＡに対する自己抗体を識別し、かつ自己抗体が抗クラスＩに対するものであるかまたはクラスＩＩに対するものであるか判別する。

図１６に示したとおり、ＤＳＡ−ＦＸＭは、フローサイトメトリーの結果がクラスＩおよび／またはクラスＩＩ同種抗体によるものか、さらには現在一般的に用いられるＦＸＭ法では識別できない自己抗体によるものか識別することができる。ＤＳＡ−ＦＸＭによって試験した場合には、ＦＸＭでみられるほぼ同じ結果（例えば例１および３、または２および４）は説明および解釈が完全に異なる。ＤＳＡ−ＦＸＭは、ＬＭＸ−ＩｇＧ ＳＡＢによって得た特異的クラスＩおよび／またはＩＩ ＤＳＡプロフィールと相関させて移植前または移植後に拒絶反応のリスクについて予後判定することができるが、一方ＦＸＭ結果ではこれができない。

クラスＩ（パネルＡ）およびクラスＩＩ（パネルＢ）について図１７に示したとおり、ＤＳＡ−ＦＸＭは、緩衝液処理と比較したＩＶＩＧ処理によるクラス特異的ＤＳＡの阻害を示すことができる。これは、ＩＶＩＧ点滴前後にインビボでみられるものに対応している。

クラスＩ（パネルＡ）およびクラスＩＩ（パネルＢ）について図１８に示したとおり、ＤＳＡ特異的血清はＩＶＩＧによる用量依存的阻害を示し、これによりインビボでの有効性も予測される。

図１に示したとおり、特定されている候補生体ドナーに対するＤＳＡを前もって低下／抑制するために、ＩＶＩＧ脱感受性治療を受けている腎臓移植候補者からの連続試料を用いて、ＦＸＭおよびＤＳＡ−ＦＸＭを実施した。ＦＸＭの結果は、ＩＶＩＧ点滴のアーチファクトによるＭＣＳ値の増加（すなわち、より陽性となった）を示す。アーチファクトは、測定法においてシグナルとして用いられる第２ステップの抗体（抗ヒトＩｇＧ）によるものである。ＩＶＩＧ生成物はすべて精製ＩｇＧであるため、ＦＸＭの結果は、ＤＳＡではなくＩＶＩＧによる偽陽性の増大を示す。Ｂ細胞表面上にＣＤ２０があるため、Ｒｉｔｕｘａｎ（治療的抗ＣＤ２０、Ｂ細胞マーカー）もＢ細胞ＦＸＭのＭＣＳ値を増大させる。これはアーチファクトではないが、ＦＸＭは天然細胞特異的標的ではなく、ＨＬＡ抗体を検出するように設計されている。ＤＳＡ−ＦＸＭ結果は、それに反して、治療的（抗ＣＤ２０）抗体が存在しても移植について許容できる範囲でＩＶＩＧおよびＭＣＳ値の阻害（有効性）を示す。

（結果の計算）
計算を記録および実行するためにＤＳＡ−ＦＸＭ分析ワークシートを用いる。患者の血清およびポジティブコントロールについてのＭｅｄｉａｎ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｈｉｆｔ（ＭＣＳ）を決定する。ＭＣＳの計算：ＭＣＳ＝患者血清（またはＰｏｓコントロール）のＭｅｄｉａｎ Ｃｈａｎｎｅｌ値（ＭＣＶ）−ＮｅｇコントロールのＭｅｄｉａｎ Ｃｈａｎｎｅｌ値（ＭＣＶ）。ワークシートおよびコンピューターにＭＣＳとして結果を記録する。ネガティブまたはポジティブＤＳＡ−ＦＸＭを定義するＦＸＭカットオフに従って報告する。

（結果および解釈）
異なる５つの標的細胞（新鮮／凍結ＰＢＭＣ、凍結リンパ節、および凍結脾臓細胞）採取源に対して事前に試験したＡＢ男性血清（通常約２０）からの結果（ＭＣＳ）によってＦＸＭのカットオフを判定した。ＡＢ血清ＭＣＶから陰性コントロールＭＣＶを引くことによって、試験した各ＡＢ血清のＭＣＳを計算し、得られた全ＭＣＳからＤＳＡ−ＦＸＭＭＣＳの平均値を計算した（Ｎ＝１３８）。以下のとおりＤＳＡ−ＦＸＭカットオフの評価基準を設定した。ＭＣＳ値＜ＡＢｎｅｇＭＣＳ＋３ＳＤを「陰性」と解釈した。；ＭＣＳ値＞＝ＡＢｎｅｇＭＣＳ＋３ＳＤを「陽性」と解釈した。ＨＬＡ−Ｉ ＤＳＡ−ＦＸＭ陽性：ＭＣＳ＞＝６１。ＨＬＡ−ＩＩ ＤＳＡ−ＦＸＭ陽性：ＭＣＳ＞＝６０。

（材料および方法）
ＦＸＭ手順では、９６ウェルプレートの各ウェルに０．１×１０^６個のＰＢＭＣ細胞を分注し、１，３００×ｇで３分間遠心分離する。上清を除去するためにプレートを指ではじく；５０μＬの試験血清に細胞を再懸濁させ、ＲＴインキュベーター（２２℃）で２０分間インキュベートする。インキュベート後、３％ＨＢＳＡ２５０μＬずつ用いて４回細胞を洗浄する。ＦＩＴＣ−抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を０．５μｇ、ＰｅｒＣＰ−ＣＤ３およびＰＥ−ＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を０．２μｇ含有する検出試薬混合物１００μＬを添加する。さらに３０分間室温でインキュベートした後、３％ＨＢＳＡを２５０μＬずつ用いて細胞を２回洗浄し、さらに０．２％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液２００μＬに再懸濁させる。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）上で細胞を取得する。取得したデータはＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエアによって分析する。

ＬＭＸ−ＩｇＧ手順では、製造者の指示書（Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ、Ｃａｎｏｇａ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従って実験を実施した。結果より、さまざまな条件でＤＳＡ−ＦＸＭによってＨＬＡクラスＩおよびＩＩＤＳＡともに検出されることが示される（図５）。

（実施例２）
（ＤＳＡ−ＦＸＭ試験）
代替的に、以下の手順を用いてドナー特異的抗体フローサイトメトリークロスマッチ（「ＤＳＡ−ＦＸＭ」）と呼ばれる対象方法の１つの実施形態を実施することができる。本実施例の手順は、逐次捕捉および標識化を包含する。

第１に、ＦＸＭ設定を配置するために９６ウェルレイアウトフォーマットを準備する。第２に、プレートレイアウトに従って９６ウェルプレートの事前に選択した全ウェルにドナー細胞０．２×１０^６個（体積２５０μＬ未満）を分注する。３分間２、０００×ｇで遠心分離する。上清を除去するためにプレートを指ではじく。プレートを穏やかにボルテックスし、プレートレイアウトに従って事前に選択したウェルに各血清を５０μＬ／ウェル添加する。プレートを穏やかにボルテックスし、さらにＲＴインキュベーター（２２℃）で２０分間インキュベートする。インキュベート後、各ウェルに３％ＨＢＳＡを２５０μＬ添加し、前と同じようにプレートを回転させる。積み重ねたペーパータワーの上で２回プレートおよびブロットを指ではじいた後プレートを裏返す。各洗浄につき３％ＨＢＳＡを２５０μＬ添加してさらに２回洗浄ステップを繰り返す。

最後の洗浄（第３の洗浄）で各ウェルに５μＬのＨＬＡ−クラスＩおよびＩＩ捕捉ビーズを含んだ捕捉ビーズ混合物を添加し、再度３％ＨＢＳＡ２５０μＬを用いる前と同じように洗浄する。各ウェルに細胞溶解緩衝液２３μＬを添加し、プレートを穏やかにボルテックスする。１枚のホイルでプレートを覆い、穏やかに振り混ぜながら３０分間暗所でプレートをインキュベートする。前と同じようにＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を２５０μＬずつ用いて２回ビーズを洗浄する。蛍光抗ＩｇＧ洗浄緩衝液溶液１００ｕｌにビーズを再懸濁し、さらに３０分間室温でプレートをインキュベートする。前と同じようにＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を２５０μＬずつ用いて２回ビーズを洗浄し、各ウェルでＦｌｏｗーＦｉｘａｔｉｖｅ２００μＬにビーズを再懸濁させ、プレートを穏やかにボルテックスする。フローサイトメーターの上にプレートを置き、ビーズを得る。上記の方法でＦＸＭおよびＬＭＸ−ＩｇＧ手順を実施した。図４に実験結果を示す。図４に示したとおり、ＤＳＡ−ＦＸＭ（逐次捕捉および標識化）によって、陰性ＡＢ血清（試料Ａ）および３つの陽性血清（試料Ｂ、ＣおよびＤ）を試験した。試料Ａ：Ｃ−ＩおよびＣ−ＩＩ ＤＳＡともに陰性；試料Ｂ：Ｃ−ＩおよびＣ−ＩＩ ＤＳＡともに陽性；試料Ｃ：Ｃ−Ｉ ＤＳＡだけが陽性およびＣ−ＩＩ ＤＳＡは陰性；試料Ｄ：Ｃ−ＩＩ ＤＳＡだけが陽性およびＣ−ＩＤＳＡは陰性。

（実施例３）
（ＤＳＡ−ＦＸＭ試験）
代替的に、以下の手順を用いてドナー特異的抗体フローサイトメトリークロスマッチ（「ＤＳＡ−ＦＸＭ」）と呼ばれる目的の方法の１つの実施形態を実施することができる。本実施例の手順は、逐次捕捉および標識化を包含する。

第１に、ＦＸＭ設定を配置するために９６ウェルレイアウトフォーマットを準備する。第２に、プレートレイアウトに従って９６ウェルプレートの事前に選択した全ウェルにドナー細胞０．２×１０^６個（体積２５０μＬ未満）を分注する。３分間２、０００×ｇで遠心分離する。上清を除去するためにプレート指ではじく。プレートを穏やかにボルテックスし、プレートレイアウトに従って事前に選択したウェルに各血清を５０μＬ／ウェル添加する。プレートを穏やかにボルテックスし、さらにＲＴインキュベーター（２２℃）で２０分間インキュベートする。インキュベート後、各ウェルに３％ＨＢＳＡを２５０μＬ添加し、前と同じようにプレートを回転させる。積み重ねたペーパータワーの上で２回プレートおよびブロット指ではじいた後プレートを裏返す。各洗浄につき３％ＨＢＳＡを２５０μＬ添加してさらに２回洗浄ステップを繰り返す。

蛍光抗ＩｇＧを１００μＬ添加して細胞を再懸濁し、１枚のホイルでプレートを覆い；さらに穏やかに振り混ぜながら３０分間暗所でプレートをインキュベートする。前と同じようにＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を２５０μＬずつ用いて２回細胞を洗浄する。２５μＬの溶解緩衝液に細胞を再懸濁させ、さらに各ウェルにＨＬＡ−クラスＩおよびＩＩ捕捉ビーズを含有する捕捉ビーズ混合物５μＬを添加する。さらに３０分間プレートを室温でインキュベートする。前と同じようにＤＳＡ−ＦＸＭ洗浄緩衝液を２５０μＬずつ用いて２回ビーズを洗浄し、各ウェルでのＦｌｏｗーＦｉｘａｔｉｖｅ２００μＬにビーズを再懸濁させ、プレートを穏やかにボルテックスする。フローサイトメーターの上にプレートを置き、ビーズを得る。上記の方法でＦＸＭおよびＬＭＸ−ＩｇＧ手順を実施した。図１０および図１１に実験結果を示す：図１０パネルＡ：ＨＬＡ−クラスＩ（Ｃ−Ｉ）およびクラスＩＩ（Ｃ−ＩＩ）ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）はともに陰性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ−）；図１０パネルＢ：Ｃ−Ｉ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ−）；図１０パネルＣ：Ｃ−ＩＩ ＤＳＡだけが陽性であった（ＣＩ−／ＣＩＩ＋）；および図１０パネルＤ：ＣＩおよびＣ−ＩＩ ＤＳＡともに陽性であった（ＣＩ＋／ＣＩＩ＋）。

（実施例４）
（自己−ＤＳＡ−ＦＸＭ試験）
実施例１に記載したＤＳＡ−ＦＸＭ手順と平行して、ＦＸＭによりレシピエント１５例由来の自己由来血清をレシピエント自身のＰＢＭＣ細胞に対して試験した。図１５に実験結果を示す：自己クロスマッチ１５例中、ＤＳＡ−ＦＸＭとＦＸＭでともに陰性が３例、またともに陽性が４例であり；ＦＸＭのみ陽性は８例であり、またＦＸＭによって検出されたＤＳＡはＨＬＡ抗原に対するＤＳＡでないと立証された。

（実施例５）
（静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）脱感受性ＤＳＡ−ＦＸＭ試験）
実施例１に記載したＤＳＡ−ＦＸＭ試験手順によってＨＬＡ−ＤＳＡに対するＩＶＩＧの阻害効果を評価した。図１７〜１９に実験結果を示す。

図１７に示した実験では、２つのＨＬＡＤＳＡ陽性血清にＩＶＩＧを５％加え、ＤＳＡ−ＦＸＭによってインビトロで試験した。ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ ＤＳＡの両者に対するＩＶＩＧの阻害効果を測定することができた。

図１８に示したとおり、異なる希釈度の陽性ＤＳＡ血清にＩＶＩＧを５％加え、ＤＳＡ−ＦＸＭによって試験した。結果より、ＩＶＩＧはＨＬＡクラスＩおよびＩＩ ＤＳＡのいずれに対しても用量依存的阻害があったことが示された。

ＤＳＡ−ＦＸＭおよびＦＸＭの両者によって、ＩＶＩＧ脱感受性治療を受けている腎移植候補者に由来する連続試料を、候補である（しかし不適合である）生体ドナーの細胞に対して試験した。図１９に示したとおり、ＤＳＡ−ＦＸＭによってＩＶＩＧのＨＬＡ−ＤＳＡに対する阻害効果が確認されたが、ＦＸＭではみることができなかった。Ｒｉｔｕｘａｎ（治療的抗−ＣＤ２０）はＤＳＡ−ＦＸＭ試験による試験結果に干渉しなかった。

前記の発明は理解を明確にするために図および実施例によっていくつかの詳細について記載されたが、付属の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、これに一定の変更および修正を行うことができることが、本発明の教示を踏まえると当業者に容易に明らかになる。本発明の範囲は添付した請求項だけによって限定されるため、本明細書に用いる専門用語は、特定の実施形態だけを記載する目的のためにあり、限定することを意図しないものとする。

したがって、前記は単に本発明の原理を例示する。本明細書に明確に記載または示されなくとも、当業者は、本発明の原理を具体化するとともにその趣旨および範囲内に含まれるさまざまな仕組みを考案することができると認識されるであろう。さらに、本明細書に列挙した全実施例および条件付き文言は、読者が本発明の原理および当技術分野を促進するために発明者によって与えられた概念を理解するのを助けること、およびこのような具体的に列挙した実施例および条件を制限することはないと解釈すべきであることを主に意図している。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態ならびにその具体的実施例を列挙する本明細書のすべての記載は、その構造的および機能的等価物を包含することを意図している。さらに、このような等価物が現在既知である等価物および将来開発される等価物の両者、すなわち、構造と無関係に同一の機能を実施する任意の開発された要素を含むことを意図している。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示しかつ記載する例示的な実施形態を制限されることを意図していない。むしろ本発明の範囲および趣旨は添付の請求項によって具体化される。

Claims (14)

1. 生体試料中のドナー特異的抗体の存在または不存在を判定する方法であって、
   レシピエント免疫抗体が存在するならば、ドナー細胞表面抗原（Ａｇ）を介してレシピエント免疫抗体と結合するドナー細胞を含む、免疫抗体−Ａｇ複合体を形成するために、レシピエント免疫抗体がドナー細胞表面Ａｇと結合するのに十分な条件下で、ドナーからの細胞試料とレシピエントからの生体試料とを混合することによって混合物を形成する工程；
   前記混合物を、前記免疫抗体−Ａｇ複合体中のドナー細胞表面Ａｇに特異的に結合する抗体をその表面に固定化したビーズと接触させる工程;
   前記ビーズと接触させた前記混合物に、前記ビーズに結合した前記免疫抗体−Ａｇ複合体中のレシピエント免疫抗体に特異的に結合する検出可能標識抗体を溶解条件下で添加する工程;および
   前記ビーズに結合した前記免疫抗体−Ａｇ複合体中のレシピエント免疫抗体と結合した検出可能標識抗体の存在または非存在を検知し、前記レシピエントからの生体試料中のドナー特異的抗体の存在または非存在を判定する工程；を含む前記方法。
2. 前記検知が半定量的である、請求項１に記載の方法。
3. 前記免疫抗体が同種抗体、自己抗体、または補体結合抗体（ＣＦＡｂ）である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記検知が、フローサイトメーター中に前記複合体を流すこと、または酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって前記複合体を検出することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記検出可能な標識が蛍光色素、発色団、酵素、リンカー分子、ビオチン分子、電子供与体、電子受容体、染料、金属、または放射性核種を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ドナー特異的抗体が実際のドナー特異的抗体である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＡｇがＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰから成る群から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記生体試料が血清、血液、唾液、または血漿を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記ドナーからの細胞試料が０．００１×１０⁶〜２．０×１０⁶個の細胞を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ドナーからの細胞試料が０．２×１０⁶個未満の細胞を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ビーズがアガロースビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、またはポリスチレンビーズである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記方法が１２時間以下で実施される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記溶解条件がトレーサ、洗浄剤、およびＤＮアーゼを含む溶解緩衝液を与えることを含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. ドナー特異的抗体が前記レシピエントからの前記生体試料に存在するか示す報告を作成することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。